KR20030066748A - Ｕｄｐ-ｎ-아세틸갈락토사민 및 ｎ-아세틸갈락토사민 함유사카라이드의 제조법 - Google Patents

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교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명에 따라, UDP-N-아세틸갈락토사민 및 N-아세틸갈락토사민 함유 카르보히드레이트를 UDP-N-아세틸글루코사민 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 이용하여 생산할 수 있다.

Description

ＵＤＰ-Ｎ-아세틸갈락토사민 및 Ｎ-아세틸갈락토사민 함유 사카라이드의 제조법 {PROCESS FOR PRODUCING UDP-N-ACETYLGALACTOSAMINE AND SACCHARIDE CONTAINING N-ACETYLGALACTOSAMINE}
UDP-N-아세틸갈락토사민 (이하 UDP-GalNAc 로 약칭)의 제조법과 관련하여, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 무세포추출물 또는 부분정제효소를 이용한 제조방법이 공지되어 있다 [U.S. Patent No. 4,569,909; J. Biol. Chem.,234, 2801 (1959); Agr. Biol. Chem.,37, 1741 (1973); Appl. Environ. Microbiol.,41, 392 (1981); Microbiol. Immunol.,30, 1085 (1986); Agr. Biol. Chem.,49, 603 (1985)]. 그러나, 상기 방법에 의한 UDP-GalNAc 의 생산성은 낮으며, 바실러스 서브틸리스 유래의 UDP-N-아세틸글루코사민 4-에피머라제 (EC 5.1.3.7, 이하 UDP-GlcNAc 4-에피머라제로 약칭) 또는 UDP-GlcNAc 4-에피머라제를 코딩하는 유전자는 아직 특정되지 않았다.
미생물 유래의 UDP-GlcNAc 4-에피머라제와 관련하여서는, 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)유래의 WbpP 단백질이 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가짐이 보고되어 있으나 [J. Biol. Chem.,275, 19060 (2000)], 상기 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 DNA 를 이용한 UDP-GalNAc 의 생산에 대해서는 보고되어 있지 않다.
한편, UDP-글루코오스 4-에피머라제 5 (EC 5.1.3.2)와 관련하여서는, 햄스터 및 인간 유래의 효소가 또한 기질로서 UDP-GlcNAc 을 사용함이 공지되어 있으나 [Cell,44,749 (1986)], 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli) 유래의 UDP-글루코오스 4-에피머라제 [Nucleic Acid Res.,14, 7705 (1986)] 는 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가짐은 보고되어 있지 않다. 또한, 전술한 슈도모나스 아에루기노사 유래의 WbpP 단백질은 공지된 UDP-글루코오스 4-에피머라제에 대한 상동성은 없다.
공지의 UDP-글루코오스 4-에피머라제의 아미노산 서열에 대한 높은 상동성으로 인해 UDP-글루코오스 4-에피머라제 (galE) 로 간주되는, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 할로두란스 (Bacillus halodurans), 바실러스 스테아로써모필러스 (Bacillus stearothermophilus), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 부르셀라 아보르투스 (Brucella abortus), 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 나이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis), 나이세리아 고노르호에아 (Neisseria gonorrhoeae), 에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 예르시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 모락셀라 카타할리스 (Moraxella catarrhalis), 피숨 사티붐 (Pisum sativum), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi), 살모넬라 티피무리윰 (Salmonella typhimurium), 시아몹시스 테트라고노로바 (Cyamopsis tetragonoloba), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis), 아퀴이펙스 아에올리커스 (Aquifex aeolicus), 시네코시스티스 에스피. (Synechocystis sp.), 아조스피리윰 브라실렌스 (Azospirium brasilense), 시노리조비윰 멜리로티 (Sinorhizobium meliloti), 리조비윰 레구미노사룸 (Rhizobium leguminosarum), 메타노박테리윰 써모아우토트로피쿰 (Methanobacterium thermoautotrophicum), 코리네박테리윰 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 로도코커스 에리트로폴리스 (Rhodococcus erythropolis), 로도코커스 에퀴이 (Rhodococcus equi), 스트렙토마이세스 코엘리컬러 (Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans), 데이노코커스 라디오두란스 (Deinococcus radiodurans), 브라디리조비윰 자포니쿰 (Bradyrhizobium japonicum), 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 메타노코커스 자나쉬이 (Methanococcus jannaschii), 할로박테리윰 에스피. NRC-1(Halobacterium sp.NRC-1), 피로코커스 호리코쉬이(Pyrococcus horikoshii), 피로코커스 아비시 (Pyrococcus abyssi), 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 클로스트리디윰 퍼프린겐스 (Clostridium perfringens), 데이노코커스 라디오두란스 (Deinococcus radiodurans), 아카오글로버스 풀기두스 (Archaeoglobus fulgidus), 스타필로코커스 카르노수스 (Staphylococcus carnosus) 및 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 유래의 단백질이 공지되어 있다. 또한 공지된 UDP-글루코오스 4-에피머라제의 아미노산 서열에 대해 높은 상동성을 갖는 바실러스 메카테리윰(Bacillus megaterium), 헤모필러스 두크레이(Haemophilus ducreyi), 코리네박테리윰 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 및 스트렙토코커스 아갈락티아 (Streptococcus agalactiae)와 같은 미생물유래의 단백질이 공지되어 있으나, 이의 기능은 아직까지 명확하지 않다. 그러나, 이러한 단백질은 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가지며, UDP-GalNAc 의 생산에 유용함은 공지되어 있지 않다.
본 발명은 UDP-N-아세틸갈락토사민 및 N-아세틸갈락토사민 함유 카르보히드레이트의 제조 방법에 관한 것이다. 일부 N-아세틸갈락토사민 함유 카르보히드레이트는 종양 세포 등에서 특이적으로 발현되어, 항종양 치료를 위한 항종양 백신 등으로 유용하다. 또한, N-아세틸갈락토사민 함유 카르보히드레이트는 뇌에 풍부하게 존재하기 때문에, 이는 뇌기능의 향상에 응용할 수 있을 것으로 기대된다. UDP-N-아세틸갈락토사민은 N-아세틸갈락토사민 함유 카르보히드레이트의 합성 기질로서 유용하다.
도 1 은 바실러스 서브틸리스로부터 유래된 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 플라스미드 pGT73 를 구축하는 과정을 보여준다.
도 2 는 나이세리아 고노르호에아 유래의 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 플라스미드 pGT24 를 구축하는 과정을 보여준다.
도 3 은 캄필로박터 제주니 유래의 β1,4-N-아세틸갈락토사민 트랜스퍼라제 유전자를 발현시키는 플라스미드 pGT87 를 구축하는 과정을 보여준다.
도 4 는 캄필로박터 제주니 유래의 α1,4-N-아세틸갈락토사민 트랜스퍼라제 유전자를 발현시키는 플라스미드 pCJ2 를 구축하는 과정을 보여준다.
도 1 내지 4 의 기호는 하기를 의미한다.
PL: PL프로모터
cI857: cI857 리프레서 유전자
Ampr: 암피실린 내성 유전자
galE(비. 서브틸리스): 바실러스 서브틸리스 유래의 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 유전자
galE(엔. 고노르호에아): 나이세리아 고노르호에아 유래의 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 유전자
beta 1,4 GalNAc 트랜스퍼라제: 캄필로박터 제주니 유래의 βl,4-N-아세틸갈락토사민 트랜스퍼라제 유전자
alpha 1,4 GalNAc 트랜스퍼라제: 캄필로박터 제주니 유래의 αl,4-N-아세틸갈락토사민 트랜스퍼라제 유전자
본 발명의 목적은 UDP-N-아세틸갈락토사민 및 N-아세틸갈락토사민 함유 카르보히드레이트를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자는 공지의 UDP-글루코오스 4-에피머라제의 아미노산 서열에 대한 높은 상동성으로 인해 UDP-글루코오스 4-에피머라제 (galE)로 간주되는 단백질 또는 그 기능은 아직까지 명확하지 않지만 공지의 UDP-글루코오스 4-에피머라제의 아미노산 서열에 대해 높은 상동성을 갖는 단백질은 UDP-N-아세틸글루코사민 4-에피머라제 활성을 가지며, 이 효소는 UDP-N-아세틸갈락토사민 및 N-아세틸갈락토사민 함유 카르보히드레이트를 효율적으로 생산하는데 유용함을 발견하였다. 본 발명은 이러한 발견에 기초하여 완성되었다.
본 발명은 하기의 (1) 내지 (35) 에 관한 것이다.
(1) 하기 단계를 포함하는 UDP-N-아세틸갈락토사민 (이하 UDP-GalNAc 로 약칭)의 제조 방법 :
UDP-N-아세틸글루코사민 4-에피머라제 (이하 UDP-GlcNAc 4-에피머라제로 약칭)활성을 갖는 단백질을 생산하는 형질전환체의 배양물 또는 이 배양물의 처리물인 효소원 및 UDP-N-아세틸글루코사민 (이하 UDP-GlcNAc로 약칭)을 수성 배지에 존재케하는 단계;
UDP-GalNAc 를 수성 배지에 생성축적시키는 단계; 및
수성 배지로부터 UDP-GalNAc 를 회수하는 단계.
(2) 하기 단계를 포함하는 N-아세틸갈락토사민 (이하 GalNAc로 약칭) 함유 카르보히드레이트의 제조 방법 :
UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 생산하는 형질전환체의 배양물 또는 이 배양물의 처리물인 효소원, 수용체 카르보히드레이트, GalNAc 트랜스퍼라제 및 UDP-GlcNAc 를 수성 배지에 존재케 하는 단계;
GalNAc함유 카르보히드레이트를 수성배지에 생성축적시키는 단계; 및
수성 배지로부터 GalNAc함유 카르보히드레이트를 회수하는 단계.
(3) 하기 단계를 포함하는 UDP-GalNAc 의 제조 방법 :
우리딘-5'-트리포스페이트 (이하 UTP 로 약칭)의 전구체 및 당으로부터 UDP-GlcNAc 을 생성시키는 능력을 가진 미생물의 배양물 또는 이 배양물의 처리물 및 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 생산하는 형질전환체의 배양물 또는 이 배양물의 처리물인 효소원, UTP 의 전구체 및 당을 수성 배지에 존재케 하는 단계; 및
UDP-GalNAc 를 수성배지에 생성축적시키는 단계; 및
수성배지로부터 UDP-GalNAc 를 회수하는 단계.
(4) 하기 단계를 포함하는 GalNAc함유 카르보히드레이트의 제조 방법 :
UTP 의 전구체 및 당으로부터 UDP-GlcNAc 을 생성시키는 능력을 가진 미생물의 배양물 또는 이 배양물의 처리물, GalNAc 트랜스퍼라제 및 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 생산하는 형질전환체의 배양물 또는 이 배양물의 처리물인 효소원, UTP 의 전구체, 당 및 수용체 카르보히드레이트를 수성배지에 존재케하는 단계;
GalNAc함유 카르보히드레이트를 수성배지에 생성축적케하는 단계; 및
수성배지로부터 GalNAc함유 카르보히드레이트를 회수하는 단계.
(5)배양물의 처리물은 농축 배양물, 건조 배양물, 배양물을 원심분리하여 수득한 균체, 균체를 건조처리, 동결건조처리, 계면활성제 처리, 초음파처리, 기계적 마모처리, 용매 처리, 효소 처리, 단백질 분획화 처리 및 단백질 고정화처리하여 수득한 생성물 또는 균체를 추출하여 수득한 효소 제제인 상기 (1) 내지 (4) 항중 어느 한 항에 따른 방법.
(6) 수용체 카르보히드레이트는 비환원성 말단에 시알산, 갈락토오스, GalNAc, N-아세틸글루코사민, 푸코오스, 글루쿠론산 또는 이두론산을 갖는 올리고사카라이드를 포함하는 복합 카르보히드레이트인 상기 (2) 또는 (4) 항에 따른 방법.
(7) 비환원성 말단에 시알산, 갈락토오스, GalNAc, N-아세틸글루코사민, 푸코오스, 글루쿠론산 또는 이두론산을 갖는 올리고사카라이드가 락토오스, N-아세틸락토사민, 글로보트리오스, 시알릴락토오스, 시알릴 N-아세틸락토사민, 루이스 X, 루이스 a, 시알릴 루이스 X, 시알릴 루이스 a, 콘드로이틴 술페이트, 더마탄 술페이트, H 형 1 (Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc) 또는 H 형 2 (Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc) 인 (6) 항에 따른 방법.
(8) 수용체 카르보히드레이트가 락토오스, N-아세틸락토사민, 글로보트리오스, 시알릴락토오스, 시알릴 N-아세틸락토사민, 루이스 X, 루이스 a, 시알릴 루이스 X, 시알릴 루이스 a, 콘드로이틴 술페이트, 더마탄 술페이트, H 형 1 (Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc) 또는 H 형 2 (Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc) 인 (2) 또는 (4) 항에 따른 방법.
(9) 전구체는 오로트산, 오로티딘, 우라실, 우리딘 또는 우리딘-5'-모노포스페이트인 (3) 또는 (4) 항에 따른 방법.
(10) 당은 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민인 (3) 또는 (4) 항에 따른 방법.
(11) UTP 의 전구체 및 당으로부터 UDP-GlcNAc 를 생성시키는 능력을 가진 미생물은 에스케리키아(Escherichia), 코리네박테리윰(Corynebacterium) 및 사카로마이세스 (Saccharomyces)속에 속하는 미생물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 미생물인 (3) 또는 (4) 항에 따른 방법.
(12) 에스케리키아속에 속하는 미생물은 에스케리키아 콜리인 (11) 항에 따른 방법.
(13) 코리네박테리윰속에 속하는 미생물은 코리네박테리윰 암모니아게네스인 (11) 항에 따른 방법.
(14) 사카로마이세스속에 속하는 미생물은 사카로마이세스 세레비시아인 (11) 항에 따른 방법.
(15) 형질전환체는 재조합 DNA 를 미생물에 도입시켜 수득한 형질전환체인 (1) 내지 (4) 항중 어느 한 항에 따른 방법.
(16) 미생물은 에스케리키아, 코리네박테리윰 및 사카로마이세스속에 속하는 미생물로 구성된 군에서 선택되는 (15) 항에 따른 방법.
(17) 에스케리키아속에 속하는 미생물은 에스케리키아 콜리인 (16) 항에 따른 방법.
(18) 코리네박테리윰속에 속하는 미생물은 코리네박테리윰 글루타미쿰인 (16) 항에 따른 방법.
(19) 사카로마이세스속에 속하는 미생물은 사카로마이세스 세레비시아인 (16) 항에 따른 방법.
(20) UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질은 바실러스 또는 나이세리아속에 속하는 미생물로부터 유래된 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질인 (1) 내지 (4) 항중 어느 한 항에 따른 방법.
(21) 바실러스속에 속하는 미생물은 바실러스 서브틸리스, 바실러스 메가테리움 및 바실러스 스테아로써모필러스로 구성된 군에서 선택되는 (20) 항에 따른 방법.
(22) 나이세리아속에 속하는 미생물은 나이세리아 고노르호에아 또는 나이세리아 메닝기티디스인 (20) 항에 따른 방법.
(23) UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질인 (1) 내지 (4) 및 (20) 내지 (22) 항중 어느 한 항에 따른 방법.
(24) UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 구성되며, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질인 (1) 내지 (4) 및 (20) 내지 (22) 항중 어느 한 항에 따른 방법.
(25) UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열에 50% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 단백질인 (1) 내지 (4) 및 (20) 내지 (22) 항중 어느 한 항에 따른 방법.
(26) 재조합 DNA 는 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함하는 (15) 항에 따른 방법.
(27) 재조합 DNA 는 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 UDP-글루코오스 4-에피머라제 (이하 galE 단백질로 약칭) 을 코딩하는 DNA 를 포함하는 (15) 항에 따른 방법.
(28) galE 단백질은 바실러스 또는 나이세리아속에 속하는 미생물로부터 유래되는 (27) 항에 따른 방법.
(29) 바실러스속에 속하는 미생물은 바실러스 서브틸리스, 바실러스 메가테리움 및 바실러스 스테아로써모필러스로 구성된 군에서 선택되는 (28) 항에 따른 방법.
(30) 나이세리아속에 속하는 미생물은 나이세리아 고노르호에아 또는 나이세리아 메닝기티디스인 (28) 항에 따른 방법.
(31) 재조합 DNA 는 SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함하는 (15) 항에 따른 방법.
(32)재조합 DNA 는 SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 구성되며, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함하는 (15) 항에 따른 방법.
(33) 재조합 DNA 는 SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열에 50% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성되며, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함하는 (15) 항에 따른 방법.
(34) 재조합 DNA 는 SEQ ID NO: 3 또는 4 에 나타낸 뉴클레오티드 서열을갖는 DNA 를 포함하는 (15) 항에 따른 방법.
(35) 재조합 DNA 는 엄격한 조건하 SEQ ID NO: 3 또는 4 에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 구성된 DNA 와 하이브리다이즈하며, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함하는 (15) 항에 따른 방법.
UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 임의의 단백질을 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다. 적합한 예는 하기의 (1) 내지 (6) 이다.
(1) UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 galE 단백질.
(2) galE 단백질의 아미노산 서열에 대한 높은 상동성으로 인해 galE 단백질의 기능을 갖는 것으로 생각되며, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질.
(3) galE 단백질의 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열을 갖고, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질.
(4) SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질.
(5) 하나 이상의 아미노산 잔기가 SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열에서 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 구성되고, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질.
(6) SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열에 50% 이상의 상동성을 갖는 아미노산으로 구성되며, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질.
UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 galE 단백질의 예는 바실러스 서브틸리스 (GenBank accession No. X99339) 및 나이세리아 고노르호에아 (GenBank accession No. Z2l5508) 유래의 단백질들이다.
공지의 galE 단백질의 아미노산 서열에 대한 높은 상동성으로 인하여 galE 단백질로 간주되는 단백질의 예는 하기 유래의 단백질들이다 : 바실러스 할로두란스 (GenBank accession No. APOO151O), 헤모필러스 인플루엔자 (GenBank accession No. X57315), 부르셀라 아보르투스 (GenBank accession No. U78089), 아라비돕시스 탈리아나 (GenBank accession No. AL078468), 나이세리아 메닝기티디스 (GenBank accession No. AF083467), 에르위니아 아밀로보라 (GenBank accession No. X76172), 예르시니아 엔테로콜리티카 (GenBank accession No. Z47767), 캄필로박터 제주니 (GenBank accession No. CJ11168X4), 헬리코박터 필로리 (GenBank accession No. AF016844), 비브리오 콜레라 (GenBank accession No. AE004405), 모락셀라 카타할리스 (GenBank accession No. AF248584), 피숨 사티붐 (GenBank accession No. U3l544), 살모넬라 티피 (GenBank accession No.X83927), 살모넬라 티피무리윰 (GenBank accession No.M3368l), 시아몹시스 테트라고노로바 (GenBank accession No.AJ005081), 슈도모나스 아에루기노사 (GenBank accession No.AE004568), 락토코커스 락티스 (GenBank accession No. AJ011653), 아퀴이펙스 아에올리커스 (GenBank accession No.AE000721), 시네코시스티스 에스피. (GenBank accession No.D909l0), 아조스피리윰 브라실렌스 (GenBank accession No.U09349), 시노리조비윰 멜리로티 (GenBank accession No.X58126), 리조비윰 레구미노사룸 (GenBank accession No.X96507), 메타노박텍리윰 써모아우토트로피쿰 (GenBank accession No. AE000844), 코리네박테리윰 글루타미쿰 (GenBank accession No. Z49823), 로도코커스 에리트로폴리스 (GenBank accession No. AF22l95l), 로도코커스 에퀴이 (GenBank accession No. AF277002), 스트렙토마이세스 코엘리컬러 (GenBank accession No. AL359989), 스트렙토마이세스 리비단스 (GenBank accession No. Ml8953), 데이노코커스 라디오두란스 (GenBank accession No. AE002053), 브라디리조비윰 자포니쿰 (GenBank accession No. AF253311), 써모토가 마리티마 (GenBank accession No. AE001727), 클렙시엘라 뉴모니아 (GenBank accession No. M94964), 메타노코커스 자나쉬이 (GenBank accession No. U67477), 할로박테리윰 에스피. NRC-1 (GenBank accession No. AEOO4975), 피로코커스 호리코쉬이 (GenBank accession No. AP000007), 피로코커스 아비시 (GenBank accession No. AJ248284), 리스테리아 모노시토게네스 (GenBank accession No. AF0099622), 클로스트리디윰 퍼프린겐스 (GenBank accession No. X86505), 데이노코커스 라디오두란스 (GenBank accession No. AE001927), 아카오글로버스 풀기두스 (GenBank accession No. AE001079), 스타필로코커스 카르노수스 (GenBank accession No. AF109295) 및 스트렙토코커스 써모필러스 (GenBank accession No. M38175).
galE 단백질의 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 갖고, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질의 예는 코리네박테리윰 디프테리아 (GenBank accession No. M80338)유래의 단백질 및 바실러스 메카테리윰, 바실러스 스테아로써머필러스, 헤모필러스 두크레이, 스트렙토코커스 뉴모니아 및 스트렙토코커스 아갈락티아와 같은 미생물로부터 유래된 단백질이다.
galE 단백질의 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 예는 galE 단백질의 아미노산 서열에 대해 적어도 50% 이상,바람직하게는 60% 이상, 좀더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 단백질이다.
아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열중의 상동성은 Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci. USA,90, 5873 (1993)] 및 FASTA [Methods Enzymol.,183, 63 (1990)] 로 측정할 수 있다. 알고리즘 BLAST 에 기초하여, BLASTN 및 BLASTX 과 같은 프로그램을 개발시켜왔다 [J. Mol. Biol.,215, 403 (1990)]. 뉴클레오티드 서열을 BLAST 에 기초하여 BLASTN 으로 분석하는 경우, 파라미터는, 예컨대, 하기와 같다: 스코어=l00 및 워드길이 (wordlength)=12. 아미노산 서열을 BLAST 에 기초하여 BLASTX 로 분석하는 경우, 파라미터는, 예컨대, 하기와 같다: 스코어=50 및 워드길이=3. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다. 이러한 분석에 대한 구체적 기술은 공지되어 있다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).
본 발명의 방법에서 유용한 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질의 좀더 구체적인 예는 바실러스 서브틸리스, 바실러스 메가테리윰 및 바실러스 스테아로써모필러스와 같은 바실러스속에 속한 미생물 및 나이세리아 고노르호에아 및 나이세리아 메닝기티디스와 같은 나이세리아속에 속하는 미생물로부터 유래된 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질이다.
하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 구성되고, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질은, 예컨대, SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 에 문헌 MolecularCloning, A Laboratory Manual, Second Edition (1989) (이하 Molecular Cloning, Second Edition 로 약칭); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (이하 Current protocols in Molecular Biology로 약칭); Nucleic Acids Res.,10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA,79, 6409 (1982) ; Gene,34, 315 (1985); Nucleic Acids Res.,13, 4431 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 488 (1985), 등에 기재된 부위특이적돌연변이화로 돌연변이를 도입하여 수득할 수 있다.
결실, 치환, 삽입 또는 부가되는 아미노산 잔기의 수는 특별히 제한되지 않으나, 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 전술한 부위특이적돌연변이화와 같은 공지의 방법으로 가능한 범위내이다. 적합한 수는 1 내지 12, 바람직하게는 1 내지 20, 좀더 바람직하게는 1 내지 10, 더욱 바람직하게는 1 내지 5 이다.
"하나 이상의 아미노산 잔기는 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 결실, 치환, 삽입 또는 부가된다"라는 표현은 아미노산 서열이 단일 또는 복수의 임의의 위치에서 단일 또는 복수의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함함을 의미한다. 결실, 치환, 삽입 및 부가는 하나의 서열에 동시에 포함될 수 있으며, 치환, 삽입 또는 부가되는 아미노산 잔기는 천연형 또는 비천연형일 수 있다. 천연형 아미노산 잔기의 예는 L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루타민, L-글루탐산, L-글리신, L-히스티딘, L-이소루신, L-루신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린 및 L-시스테인이다.
하기는 상호치환이 가능한 아미노산 잔기의 예이다. 동일 그룹내 아미노산 잔기는 상호 치환될 수 있다.
그룹 A: 루신, 이소루신, 노르루신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌
그룹 B: 아스파르트산, 글루탐산, 이소아스파르트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산.
그룹 C: 아스파라긴, 글루타민
그룹 D: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산
그룹 E: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린
그룹 F: 세린, 트레오닌, 호모세린
그룹 G: 페닐알라닌, 티로신
본 발명의 방법에서 사용하는 단백질이 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가질 수 있기 위해서는, SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열에 대한 이의 아미노산 서열의 상동성이 상기의 조건하 BLAST, FASTA, 등으로 계산시, 적어도 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 좀더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에서 유용한 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 의 예는 상기 단백질 (1) 내지 (6)을 코딩하는 단백질이다.
구체적인 예에는 SEQ ID NO: 3 또는 4 에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는DNA 및 엄격한 조건하 상기 DNA 와 하이브리다이즈하고, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA 가 포함된다.
엄격한 조건하에서 하이브리드제이션할 수 있는 상기 DNA 는 상기 (1) 내지 (6) 항중 어느 한 항에 따른 단백질을 코딩하는 DNA 의 일부 또는 전체를 프로브로 이용하여 콜로니 하이브리드제이션, 플라크 하이브리드제이션, 서던 블롯 하이브리드제이션 등으로 수득된 DNA 를 의미한다. 이러한 DNA 의 구체적 예는 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA 가 고정화된 필터를 이용하여 0.7 내지 1.0 mol/l 염화나트륨 의 존재하 65℃ 에서 하이브리드제이션을 수행한 후, 필터를 65℃ 에서 0.1 내지 2 배의 진한 SSC 용액 (1 배의 진한 SSC 용액: 150 mmol/l 염화나트륨 및 15 mmol/l 시트르산나트륨)으로 세정하여 동정할 수 있는 DNA 이다. 하이브리드제이션은 문헌 Molecular Cloning, Second Edition; Current Protocols in Molecular Biology; DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995), 등에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다. 구체적으로는, 하이브리드성 DNA 에는 상기 조건하 BLAST 또는 FASTA 를 이용하여 계산시 SEQ ID NO: 3 또는 4 에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 60% 이상의 상동성, 바람직하게는 80% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA 가 포함된다.
본 발명의 방법에서 사용하는 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 생산하는 형질전환체는, 예컨대, 전술한 방법에 의해 제조된 단백질을 코딩하는 DNA 를 문헌 [Molecular Cloning, Second Edition]에 기재된 방법에 따라 벡터 DNA에 연결시켜 재조합 DNA 를 제조한 후, 문헌 [Molecular Cloning, Second Edition]에 기재된 방법에 따라 상기 재조합 DNA 로 숙주세포를 형질전환시켜 수득할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하는 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 발현시키는 형질전환체의 제조는 후술되어 있다.
(1)UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA 의 제조
UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA 는 상기 효소 활성을 가진 임의의 유기체로부터 유래된 DNA 로부터 제조할 수 있다. 적합한 DNA 의 예는 미생물, 바람직하게는 바실러스 또는 나이세리아속에 속한 미생물, 좀더 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 MIl12 (ATCC 33712) 및 나이세리아 고노르호에아 (ATCC 33084) 로부터 유래된 DNA 이다.
바실러스 및 나이세리아속에 속하는 미생물은 공지의 방법으로 배양할 수 있다. 배양후, 미생물의 염색체 DNA 는 공지의 방법 (예컨대, Current Protocols in Molecular Biology)으로 단리 및 정제시킨다.
UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA 을 포함하는 단편은 UDP-글루코오스 4-에피머라제 (EC 5.1.3.2) 활성을 갖는 것으로 생각되는 단백질을 코딩하는 공지의 DNA 의 뉴클레오티드 서열을 기초하여 제조된 한 쌍의 프라이머 및 주형으로 염색체 DNA 를 이용하여 PCR [PCR Protocols, Hamana Press (1993)] 로 수득할 수 있다. 적합한 뉴클레오티드 서열의 예는 SEQ ID NO: 1 에 나타낸 바실러스 서브틸리스 및 SEQ ID NO: 2 에 나타낸 나이세리아 고노르호에아유래의 서열이다.
목적하는 DNA 는 또한 공지된 뉴클레오티드 서열을 기초로 설계된 합성 DNA 를 프로브로 사용하여 하이브리드제이션에 의해 수득할 수 있다.
또한 통상의 방법 [PCR Protocols, Hamana Press (1993)] 에 따라 합성 DNA 를 이용하여 PCR 로 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA 를 인공적으로 합성할 수 있다.
(2) UDP-GlcNAc 4- 에피머라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA 의 클로닝 및 뉴클레오티드 서열의 확인
상기(1) 에서 제조한 본 발명의 방법에서 사용할 DNA 는 그자체로 또는 적당한 제한효소로 절단한 후, 통상의 방법으로 벡터에 연결시킨다.
DNA 를 연결시킬 벡터로서는, 에스케리키아 콜리 K12 에서 자가 복제할 수 있는 임의의 파아지 벡터, 플라스미드 벡터, 등을 사용할 수 있다. 적합한 벡터의 예는 ZAP Express [STRATAGENE; Strategies,5, 58 (1992)], pBluescript II SK(+) [STRATAGENE; Nucleic Acids Res.,17, 9494 (1989)], λzap II (STRATAGENE), λgt1O, λgtll [DNA Cloning, A Practical Approach,1, 49 (1985)], λ TriplEx (Clontech), λExCell (Amersham Pharmacia Biotech) 및 pUC18 [Gene,33, 103 (1985)]이다.
(1) 에서 수득한 본 발명의 방법에서 사용하는 DNA 를 벡터에 연결하여 수득한 재조합 DNA 에 대한 숙주 세포로서 사용하는 에스케리키아 콜리로는, 에스케리키아 콜리에 속한 임의의 미생물을 사용할 수 있다. 적합한 미생물의 예는 에스케리키아 콜리 XL1-Blue MRF' [STRATAGENE; Strategies,5, 81 (1992)], 에스케리키아 콜리 C600 [Genetics,39, 440 (1954)], 에스케리키아 콜리 Yl088 [Science,222, 778 (1983)], 에스케리키아 콜리 Y1090 [Science,222, 778 (1983)], 에스케리키아 콜리 NM522 [J. Mol. Biol.,166, 1 (1983)], 에스케리키아 콜리 K802 [J. Mol. Biol.,16, 118 (1966)] 및 에스케리키아 콜리 JM1O5 [Gene,38, 275 (1985)] 이다.
재조합 DNA 의 도입은 DNA 를 상기의 숙주 세포에 도입하기 위한 임의의 방법, 예컨대, 칼슘이온을 이용한 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69, 2110 (1972)], 프로토플라스트 방법 (특개소 No. 248394/88) 및 일렉트로포레이션 [Nucleic Acids Res.,16, 6127 (1988)] 으로 수행할 수 있다.
재조합 DNA 내 포함된 본 발명의 DNA 의 뉴클레오티드 서열은 상기 방법으로 수득한 형질전환체로부터 재조합 DNA 를 추출한 후 결정할 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 결정은 디데옥시법과 같은 통상의 서열결정 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74, 5463 (1977)] 또는 373A DNA 시퀀서 (Perkin-Elmer Corp.) 와 같은 뉴클레오티드 시퀀서를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 방법으로 수득한 재조합 DNA 를 보유한 형질전환체의 예는 SEQ ID NO: 3 에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 플라스미드 DNA 를 보유한 에스케리키아 콜리 NM522/pGT73 및 SEQ ID NO: 4 에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 플라스미드 DNA 를 보유한 에스케리키아 콜리 NM522/pGT24 이다.
(3) UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 생산하는 형질전환체의제조
UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 생산하는 형질전환체의 제조는, 예컨대, 문헌 [Molecular Cloning, Second Edition] 및 [Current Protocols in Molecular Biology]에 기재된 방법을 사용하여 하기의 방법으로 수행할 수 있다.
즉, 상기에서 수득한 DNA 에 기초하여, 단백질을 코딩하는 영역을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편은 필요에 따라 제조하고, DNA 단편을 적당한 발현 벡터내 프로모터의 하류에 삽입하여 재조합 DNA 를 제조한다. 이어서, 재조합 DNA 을 발현 벡터로 적합한 숙주 세포에 도입하여 형질전환체를 제조한다.
숙주 세포로서, 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 임의의 박테리아 세포, 이스트 세포 등을 사용할 수 있다.
사용할 수 있는 발현 벡터는 상기 숙주 세포에서 자가 복제가능하거나 염색체 DNA 에 통합될 수 있으며, 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 의 전사에 적합한 위치에 프로모터를 포함하는 벡터이다.
박테리아와 같은 원핵생물을 숙주 세포로 사용하는 경우, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함하는 재조합 DNA 는 원핵생물에서 자가복제할 수 있고, 프로모터, 리보좀 결합 서열, 본 발명의 DNA 및 전사 종결 서열을 포함하는 벡터인 것이 바람직하다. 벡터는 추가로 프로머터 조절 유전자를 포함할 수 있다.
적합한 발현 벡터의 예는 pHelix1 (Roche Diagnostics), pKK233-2 (Amersham Pharmacia Biotech), pSE28O (Invitrogen), pGEMEX-l (Promega), pQE-8 (QIAGEN),pKYP1O (특개소 No. 110600/83), pKYP200 [Agric. Biol. Chem.,48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem.,53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 4306 (1985)], pBluescriptII SK(-) (STRATAGENE), pTrs3O [에스케리키아 콜리 JM1O9/pTrS3O (FERM BP-5407)로부터 제조], pTrs32 [에스케리키아 콜리 JM1O9/pTrS32 (FERM BP-5408)로부터 제조], pPAC31 (W098/l2343), pGHA2 [에스케리키아 콜리 IGHA2 (FERM B-400)로부터 제조]; 특개소 No. 221091/85, pGKA2 [ 에스케리키아 콜리IGKA2 (FERM BP-6798)로부터 제조]; 특개소 No. 221091/85, pTerm2 (US4686191, US4939094 및 US5160735), pSupex, pUB11O, pTP5, pC194, pEG400 [J. Bacteriol.,172, 2392 (1990)], pGEX (Amersham Pharmacia Biotech) 및 pET 시스템 (Novagen) 이다.
프로모터로는, 숙주 세포에서 기능할 수 있는 임의의 프로모터를 사용할 수 있다. 예컨대, 에스케리키아 콜리 또는 파아지로부터 유래된 프로모터, 예컨대, trp 프로모터 (Ptrp), lac 프로모터, PL프로모터, PR프로모터 및 T7 프로모터를 사용할 수 있다. 두개의 PtrpS 을 직렬로 결합시킨 프로모터(Ptrpx 2), tac 프로모터, lacT7 프로모터 및 letI 프로모터 등의 인공적으로 설계 및 수정된 프로모터를 또한 사용할 수 있다.
샤인 달가노 서열 (리보좀 결합 서열) 및 개시 코돈 사이의 거리를 적당한 길이 (예컨대, 6 내지 18 염기) 으로 조정한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 재조합 DNA 에서, 전사 종결 서열은 본 발명의 DNA 의 발현에 필수적이지 않으나, 구조 유전자의 직하에 전사 종결 서열을 위치시키는 것이 바람직하다.
적합한 숙주 세포의 예는 에스케리키아, 세라티아, 바실러스, 브레비박테리윰, 코리네박테리윰, 마이크로박테리윰 및 슈도모나스속에 속하는 미생물이다. 구체적 예는 에스케리키아 콜리 XL1-Blue, 에스케리키아 콜리 XL2-Blue, 에스케리키아 콜리 DH1, 에스케리키아 콜리 MC1000, 에스케리키아 콜리 KY3276, 에스케리키아 콜리 W1485, 에스케리키아 콜리 JM1O9, 에스케리키아 콜리 HB1O1, 에스케리키아 콜리 No. 49, 에스케리키아 콜리 W3110, 에스케리키아 콜리 NY49, 에스케리키아 콜리 GI698, 에스케리키아 콜리 TB1, 세라티아 피카리아(Serratia ficaria), 세라티아 폰티콜라(Serratia fonticola), 세라티아 리퀘퍼시언스(Serratia liquefaciens), 세라티아 마르세신(Serratia marcescens), 바실러스 서브틸리스, 바실러스 마가테리윰, 바실러스 아밀로리퀘퍼시언스, 코리네박테리윰 암모니아게네스, 브레비박테리윰 임마리오필룸 (Brevibacterium immariophilum) ATCC 14068, 브레비박테리윰 사카롤리티쿰 (Brevibacterium saccharolyticum) ATCC 14066, 브레비박테리윰 플라븀 (Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리윰 락토퍼멘툼 (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869, 코리네박테리윰 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리윰 글루타미쿰 ATCC 13869, 코리네박테리윰 아세토액시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC 13870, 마이크로박테리윰 암모니아필룸 (Microbacterium ammoniaphilum) ATCC 15354, 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 및 슈도모나스 에스피. D-0110 이다.
재조합 DNA 의 도입은 상기 숙주 세포에 DNA 를 도입하는 임의의 방법, 예컨대, 칼슘 이온을 이용한 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69, 2110 (1972)], 프로토플라스트 방법 (특개소 No. 248394/88) 및 문헌 [Gene,17, 107 (1982)] 및 [Mol. Gen. Genet.,168, 111 (1979)]에 기재된 방법으로 수행할 수 있다.
이스트를 숙주세포로 사용하는 경우, YEP13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp5O (ATCC 37419), pHS19, pHS15, 등을 발현 벡터로 사용할 수 있다.
프로모터로서, 이스트에서 기능할 수 있는 임의의 프로모터를 사용할 수 있다. 적합한 프로모터에는 헥소오스 키나아제, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 열충격 폴리펩티드 프로모터, MFα1 프로모터 및 CUP 1 프로모터와 같은 해당계(glycolytic)유전자의 프로모터가 포함된다.
적합한 숙주 세포의 예는 사카로마이세스(Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 트리코스포론(Trichosporon), 쉬와니오마이세스(Schwanniomyces), 피키아(Pichia) 및 캔디다(Candida)속에 속하는 미생물, 구체적으로는, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀루란(Trichosporon pullulans), 쉬와니오마이세스 알루비어스 (Schwanniomyces alluvius) 및 캔디다 우틸리스(Candida utilis)이다.
재조합 DNA 의 도입은 DNA 를 이스트에 도입하는 임의의 방법, 예컨대, 일렉트로포레이션 [Methods Enzymol.,194, 182 (1990)], 스페로플라스트 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75, 1929 (1978)], 아세트산리튬 방법 [J. Bacteriol.,153, 163 (1983)] 및 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75, 1929 (1978)]에 기재된 방법으로 수행할 수 있다.
UDP-GalNAc 및 GalNAc 함유 카르보히드레이트의 제조를 위해 사용한 상기 제조된 형질전환체의 배양은 숙주를 배양하기 위한 통상의 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하는 형질전환체를 숙주로서 에스케리키아 콜리와 같은 원핵생물 또는 이스트와 같은 진핵생물을 이용하여 제조하는 경우, 형질전환체에 의해서 동화될 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염 등을 함유하는 형질전환체의 효과적인 배양에 적합한 배지인 한, 천연배지 및 합성배지 어느 것도 형질전환체의 배양용 배지로 사용할 수 있다.
탄소원으로서, 형질전환체에 의해서 동화될 수 있는 탄소원은 어느 것도 사용할 수 있다. 적합한 탄소원의 예에는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 이들을 함유한 당밀, 전분 및 전분 가수분해물과 같은 카르보히드레이트; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산; 및 에탄올 및 프로판올과 같은 알코올이 포함된다.
질소원으로는, 암모니아, 암모늄 클로라이드, 암모늄 술페이트, 암모늄 아세테이트 및 암모늄 포스페이트와 같은 유기 또는 무기산의 암모늄염 및 기타 질소함유 화합물을 펩톤, 육추출물, 이스트 추출물, 옥수수 스팁 리퀴어, 카제인 가수분해물, 대두 케이크, 대두 케이크 가수분해물 및 다양한 발효 미생물 균체 및 이의분해산물과 더불어 사용할 수 있다.
무기염의 예에는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산구리 및 탄산칼슘이 포함된다.
배양은 호기 조건, 예컨대, 진탕배양 또는 심부통기교반배양으로, 15 내지 40℃ 에서 통상적으로 16 시간 내지 7 일간 수행한다. pH 는 바람직하게는 배양동안 3.0 내지 9.0 로 유지시킨다. pH 조정은 유기 또는 무기산, 알칼리 용액, 우레아, 탄산칼슘, 암모니아, 등을 이용하여 수행한다.
필요하면, 암피실린, 테트라사이클린 및 클로르암페니콜과 같은 항생제를 배양동안 배지에 첨가할 수 있다.
유도성 프로모터를 함유하는 재조합 DNA 로 형질전환된 미생물을 배양하는 경우에는, 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가할 수 있다. 예컨대,lac프로모터를 포함하는 재조합 DNA 로 형질전환된 미생물의 경우는, 이소프로필-β-D-티오칼락토피라노시드 등을 배지에 첨가할 수 있고;trp프로모터를 함유하는 재조합 DNA 로 형질전환된 미생물의 경우에는 인돌아크릴산 등을 첨가할 수 있다.
형질전환체의 상기 수득된 배양물 및 이 배양물의 다양한 처리물은 수성 배지에서 UDP-GalNAc 또는 GalNAc함유 카르보히드레이트의 생산을 위한 효소원으로서사용할 수 있다.
배양 처리물에는 농축 배양물, 건조 배양물, 배양물을 원심분리하여 수득한 균체, 다양한 수단, 예컨대, 건조, 동결건조, 계면활성제처리, 초음파처리, 기계적 마모, 용매처리, 효소처리, 단백질분획화 및 고정화로 균체를 처리하여 수득한 생성물, 균체를 추출하여 수득한 효소 제제 등이 포함된다.
UDP-GalNAc 또는 GalNAc함유 카르보히드레이트의 형성에서, 효소원은 0.1 mU/l 내지 10,000 U/l, 바람직하게는 1 mU/l 내지 1,000 U/l 의 농도로 사용되며, 1 단위 (U) 는 37℃ 에서 1 분내 1μmol 의 UDP-GalNAc 또는 GalNAc 함유 카르보히드레이트를 생성시키는 활성으로 정의한다.
UDP-GalNAc 또는 GalNAc함유 카르보히드레이트의 생성시 유용한 수성 배지에는 물, 포스페이트 버퍼, 카르보네이트 버퍼, 아세테이트 버퍼, 보레이트 버퍼, 시트레이트 버퍼 및 Tris 버퍼와 같은 버퍼, 메탄올 및 에탄올과 같은 알코올, 에틸 아세테이트와 같은 에스테르, 아세톤과 같은 케톤, 아세트아미드와 같은 아미드 등이 포함된다. 효소원으로 사용하는 미생물의 배양물을 또한 수성 배지로 사용할 수 있다.
필요하면, 계면활성제 또는 유기용매를 UDP-GalNAc 또는 GalNAc함유 카르보히드레이트의 생성시에 첨가할 수 있다. GalNAc함유 카르보히드레이트의 생성을 촉진하는 것이면 어느 계면활성제도 사용할 수 있다. 적합한 계면활성제에는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 옥타데실아민 (예컨대, Nymeen S-215, NOF Corporation), 양이온성 계면활성제, 예컨대, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 및 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드 (예컨대, Cation F2-40E, NOF Corporation), 음이온성 계면활성제, 예컨대, 라우로일 사코시네이트 및 삼차 아민, 예컨대, 알킬디메틸아민 (예컨대, Tertiary Amine FB, NOF Corporation)이 포함되며, 이는 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
계면활성제는 통상적으로 0.1 내지 50 g/l 의 농도로 사용한다. 유기용매로서, 자일렌, 톨루엔, 지방족 알코올, 아세톤, 에틸 아세테이트 등을 통상적으로 0.1 내지 50 ml/l 의 농도로 사용할 수 있다.
UDP-GalNAc 및 GalNAc함유 카르보히드레이트의 생성시 유용한 UDP-GlcNAc 에는 시판품, 미생물 등의 활성을 이용하여 생성시킨 반응 용액, 및 반응 용액으로부터 정제된 것이 포함된다. 적합한 미생물의 예에는 에스케리키아, 코리네박테리윰 및 사카로마이세스속에 속하는 미생물, 특히, 에스케리키아 콜리, 코리네박테리윰 암모니아게네스 및 사카로마이세스 세레비시아가 포함된다. 이러한 미생물은 단독 또는 조합하여 사용할 수 있다. 당 뉴클레오티드 기질은 0.1 내지 500 mmol/l 의 농도로 사용한다.
UDP-GalNAc 은 상기 효소원, 추가의 효소원으로서 UTP 의 전구체 및 당으로부터 UDP-GlcNAc 를 생성시킬 수 있는 능력을 가진 미생물의 배양물 또는 이 배양물의 처리물, UTP 의 전구체 및 당을 수성배지에 존재케하고, UDP-GalNAc 를 수성배지내에 생성 축적시켜 수성배지로부터 UDP-GalNAc 를 회수하여 생산할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 UTP 의 전구체의 예에는 오로트산, 오로티딘, 우리딘, 우라실 및 우리딘-5'-모노포스페이트가 포함된다. 전구체는 정제물, 전구체의 염, 또는 미생물로부터 생성된 전구체를 함유하는 배양물 또는 함유된 오염물이 반응을 저해하지 않는 한 배양물로부터 수득한 부분 정제 생성물일 수 있다. 전구체는 0.1 mmol/l 내지 1.0 mol/l, 바람직하게는 0.01 내지 0.5 mol/l 의 농도에서 사용한다.
본 발명의 방법에서 사용하는 당의 예에는 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민이 포함된다. 당은 정제물 또는 함유된 오염물이 반응을 저해하지 않는 한 당을 함유하는 임의의 생성물일 수 있다. 당은 반응의 개시시 일괄 첨가하거나, 반응중 분할 또는 연속하여 첨가할 수 있고, 0.1 mmol/l 내지 2.0 mol/l 의 농도에서 사용한다.
GalNAc 함유 카르보히드레이트는 상기 효소원, 추가의 효소원으로서 UTP 의 전구체 및 당으로부터 UDP-GlcNAc 를 생성시키는 능력을 가진 미생물의 배양물 또는 이 배양물의 처리물 및 GalNAc 트랜스퍼라제, UTP의 전구체, 당 및 수용체 카르보히드레이트를 수성배지에 존재케하고, GalNAc함유 카르보히드레이트를 수성배지에서 생성 축적시켜, 수성배지로부터 GalNAc 함유 카르보히드레이트를 회수하여 생산할 수 있다.
GalNAc 함유 카르보히드레이트의 생성시에 사용하는 수용체 카르보히드레이트는 GalNAc 트랜스퍼라제용 기질로 작용하는 임의의 수용체 카르보히드레이트일 수 있다. 적합한 수용체 카르보히드레이트의 예는 비환원 말단에 시알산, 갈락토오스, GalNAc, N-아세틸글루코사민, 푸코오스, 글루쿠론산 또는 이두론산을 갖는 올리고사카라이드를 함유하는 수용체 카르보히드레이트이다. 비환원 말단에 시알산, 갈락토오스, GalNAc, N-아세틸글루코사민, 푸코오스, 글루쿠론산 또는 이두론산을 갖는 올리고사카라이드의 예에는 락토오스, N-아세틸락토사민, 글로보트리오스, 시알릴락토오스, 시알릴 N-아세틸락토사민, 루이스 X, 루이스 a, 시알릴 루이스 X, 시알릴 루이스 a, 콘드로이틴 술페이트, 더마탄 술페이트, H 형 1 (Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc) 및 H 형 2 (Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc) 이 포함된다. 바람직한 수용체 카르보히드레이트는 락토오스, N-아세틸락토사민, 글로보트리오스, 시알릴락토오스, 시알릴 N-아세틸락토사민, 루이스 X, 루이스 a, 시알릴 루이스 X, 시알릴 루이스 a, 콘드로이틴 술페이트, 더마탄 술페이트, H 형 1 (Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc) 및 H 형 2 (Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc) 이다.
수용체 카르보히드레이트는 0.1 내지 500 mmol/l 의 농도로 사용한다.
필요하면, MnCl2, β-머캅토에탄올 등과 같은 무기염을 UDP-GalNAc 및 GalNAc 함유 카르보히드레이트를 생성시키기 위한 상기 반응에 첨가할 수 있다.
UDP-GalNAc 및 GalNAc함유 카르보히드레이트의 생성을 위한 반응은 pH 5 내지 10, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 20 내지 50℃, 1 내지 96 시간동안 수성 배지에서 수행한다.
수성 배지에서 생성된 UDP-GalNAc 및 GalNAc 함유 카르보히드레이트의 측정은 공지의 방법에 따라 수행할 수 있다 [Microbiol. Immunol.,30, 1085 (1986); Kagaku to Kogyo (Chemistry and Chemical Industry),43, 953 (1990)]
반응 혼합물에서 생성된 UDP-GalNAc 및 GalNAc함유 카르보히드레이트의 회수는 활성탄소, 이온교환 수지 등을 이용하여 통상의 방법으로 수행할 수 있다. 예컨대, UDP-GalNAc 는 문헌 [Agr. Biol. Chem.,37, 1741 (1973)]에 기재된 방법으로 회수하고, GalNAc함유 카르보히드레이트는 문헌 [J. Org. Chem.,47, 5416 (1982)]에 기재된 방법으로 회수할 수 있다.
본 발명의 실시예를 하기에 나타내었다. 이 실시예는 본 발명의 범위를 제한코자 하는 것은 아니다.
실시예 1
바실러스 서브틸리스 유래의 UDP-글루코오스 4-에피머라제를 생성시키는 형질전환체의 구축
바실러스 서브틸리스 MI112 (ATCC 33712) 을 20 ml 의 LB 배지 (10 g/l 박토-트립톤, 10 g/l 이스트 추출물 및 5 g/l 염화나트륨)가 들어있는 300-ml 플라스크에 접종하여, 37℃ 에서 16 시간동안 배양시켰다. 배양후, 미생물의 염색체 DNA 를 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology]에 기재된 방법에 따라 제조하였다.
바실러스 서브틸리스 유래의 UDP-글루코오스 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 것으로 생각되는galE유전자의 뉴클레오티드 서열 [Microbiology,142, 3113 (1996)]을 기초하여, SEQ ID NOS: 5 및 6 에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA 를 DNA 합성기 (Model 8905, PerSeptive Biosystems)를 이용하여 합성시켰다. 주형으로 바실러스 서브틸리스 MI112 의 염색체 DNA 및 한 쌍의 프라이머로 합성 DNA 를 이용하여 하기 방법으로 PCR 을 수행하였다. 즉, 0.1 ㎍ 의 염색체 DNA, 각각 0.5 μmol/1 의 프라이머, 2.5 unit 의 Pfu DNA 폴리머라아제 (STRATAGENE), 4 ㎕ 의 Pfu DNA 폴리머라아제 (10 x) (STRATAGENE)용 버퍼 및 각각 200 μmol/l 의 데옥시NTP 을 함유하는 40 ㎕ 의 반응 혼합물을 이용하여, PCR 을 30 사이클 (1 사이클은 94℃ 에서 1 분, 37℃ 에서 2 분 및 72℃ 에서 3 분간의 반응으로 구성된다) 수행하여, 약 1.0 kb PCR 산물을 수득하였다.
생성된 반응 혼합물의 1/10 을 아가로오스 겔 전기영동시켜 목적하는 단편이 증폭되었음을 확인하였다. 이어서, 나머지 반응 혼합물을 동량의 TE 로 포화시킨 페놀/클로로포름과 혼합하였다.
생성된 혼합물을 원심분리시키고, 수득한 상층액을 두 배 부피의 냉 에탄올과 혼합하여 -80℃ 에서 30 분간 정치시켰다. 생성된 혼합물을 원심분리하여 DNA 침전물을 수득하였다.
DNA 침전물을 20 ㎕ 의 TE [10 mmol/l Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA (pH 8.0)]에 용해시키고, 이 용해액 5 ㎕ 을 사용하여, DNA 를 제한효소ClaI 및BamHI 로 절단하였다. DNA 단편을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리시키고, UDP-글루코오스 4-에피머라제 유전자를 함유하는 1.0 kb DNA 단편을 Gene Clean II 키트 (Funakoshi)를 이용하여 회수하였다.
pPAC31 (0.2 ㎍) 을 제한효소ClaI 및BamHI 로 절단하였다. DNA 단편은 아가로오스 겔 전기영동으로 분리시키고, 5.5 kb DNA 단편을 동일한 방법으로 회수하였다.
상기에서 수득한 1.0 kb 단편 및 5.5 kb DNA 단편을 라이게이션 키트 (Takara Shuzo Co., Ltd.)를 이용하여 16℃ 에서 16 시간동안 라이게이션 반응을 시켰다.
에스케리키아 콜리 NM522 를 전술한 공지의 방법에 따라 라이게이션 혼합물을 이용하여 형질전환시키고, 50 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 아가 배지에 도포후, 30℃ 에서 밤새 배양시켰다.
플라스미드를 전술한 공지의 방법에 따라 배지상에 생육된 형질전환체의 콜로니로부터 추출하여, 발현 플라스미드 pGT73 를 수득하였다. 수득한 플라스미드의 구조는 제한효소로 절단하여 확인하였다 (도 1).
실시예 2
나이세리아 고노르호에아 유래의 UDP-글루코오스 4-에피머라제를 생산하는 형질전환체의 구축
나이세리아 고노르호에아 (ATCC 33084) 를 공지의 방법 (USP 5,545,553)에 따라 배양하였다. 배양후, 미생물의 염색체 DNA 를 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology]에 기재된 방법에 따라 제조하였다.
나이세리아 고노르호에아 유래의 UDP-글루코오스 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 것으로 생각되는galE 의 뉴클레오티드 서열 [Mol. Microbiol.,8, 891 (1993)]에 기초하여, SEQ ID NOS: 7 및 8 에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 DNA 합성기 (Model 8905, PerSeptive Biosystems)를 이용하여 합성하였다. PCR 은 한 쌍의 프라이머로는 합성된 DNA 및 주형으로는 나이세리아 고노르호에아 (ATCC 33084)의 염색체 DNA 를 이용하여 전술한 바와 같은 조건하에서 수행하여, 약 1.0 kb 의 PCR 산물을 수득하였다.
생성된 반응 혼합물의 1/10 을 아가로오스 겔 전기영동시켜 목적하는 단편이 증폭되었는지에 대하여 확인하였다. 이어서, 나머지 반응 혼합물을 동량의 TE 로 포화된 페놀/클로로포름과 혼합하였다.
생성된 혼합물을 원심분리시키고, 수득된 상층을 두 배 부피의 냉 에탄올과 혼합하고, -80℃ 에서 30 분간 정치시켰다. 생성된 혼합물을 원심분리시켜, DNA 침전물을 수득하였다.
DNA 침전물을 20 ㎕ 의 TE 에 용해시키고, 이 용해액 5 ㎕ 를 이용하여 DNA 를 제한효소ClaI 및BamHI 로 절단하였다. DNA 단편을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리시키고, UDP-글루코오스 4-에피머라제 유전자를 함유하는 1.0 kb DNA 단편을 Gene Clean II Kit 를 이용하여 회수하였다.
pPAC31 (0.2 ㎍) 를 제한효소ClaI 및BamHI 로 절단하였다. DNA 단편을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리하여, 5.5 kb DNA 단편을 동일한 방식으로 회수하였다.
상기에서 수득한 1.0 kb 단편 및 5.5 kb 단편을 라이게이션 키트를 이용하여 16℃ 에서 16 시간동안 라이게이션 반응시켰다.
에스케리키아 콜리 NM522 를 전술한 공지의 방법에 따라 라이게이션 혼합물을 이용하여 형질전환시키고, 50 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 아가 배지상에 도포하고, 30℃ 에서 밤새 배양하였다.
플라스미드를 전술한 공지의 방법에 따라 배지상에서 생육된 형질전환체의 콜로니로부터 추출하여, 발현 플라스미드 pGT24 를 수득하였다. 수득된 플라스미드의 구조는 제한효소에 의한 분해로 확인하였다 (도 2)
실시예 3
캄필로박터 제주니 유래의 β1,4-N-아세틸갈락토사민 트랜스퍼라제를 생산하는 형질전환체의 구축
캄필로박터 제주니 (ATCC 43446) 를 공지의 방법 [Microbiology,144, 2049 (1998)]에 따라 배양하였다. 배양후, 미생물의 염색체 DNA 를 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology]에 기재된 방법에 따라 제조하였다.
캄필로박터 제주니 (ATCC 43446) 유래의 β1,4-N-아세틸갈락토사민 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열 [J. Biol. Chem.,275, 3896 (2000)]에 기초하여, SEQ ID NOS: 9 및 10 에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 DNA 합성기 (Model 8905, PerSeptive Biosystems)를 이용하여 합성하였다. PCR 을 한 쌍의 프라이머로는 합성된 DNA 및 주형으로는 캄필로박터 제주니 (ATCC 43446)의 염색체 DNA 를 이용하여 전술한 바와 같은 조건하에서 수행하여, 약 1.0 kb 의 PCR 산물을 수득하였다.
생성된 반응 혼합물의 1/10 을 아가로오스 겔 전기영동시켜 목적하는 단편이 증폭되었는지에 대하여 확인하였다. 이어서, 나머지 반응 혼합물을 동량의 TE 로 포화된 페놀/클로로포름과 혼합하였다.
생성된 혼합물을 원심분리시키고, 수득된 상층을 두 배 부피의 냉 에탄올과혼합하고, -80℃ 에서 30 분간 정치시켰다. 생성된 혼합물을 원심분리시켜, DNA 침전물을 수득하였다.
DNA 침전물을 20 ㎕ 의 TE 에 용해시키고, 이 용해액 5 ㎕ 를 이용하여 DNA를 제한효소XhoI 및BamHI 로 절단하였다. DNA 단편을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리시키고, β1,4-N-아세틸갈락토사민 트랜스퍼라제 유전자를 함유하는 1.0 kb DNA 단편을 Gene Clean II Kit (Funakoshi)를 이용하여 회수하였다.
별도로, 전술한 조건과 동일한 조건하에서 한 쌍의 프라이머로는 SEQ ID NOS: 11 및 12 에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 및 주형으로는 pPAC31 을 이용하여 PCR 을 수행하였다.
생성된 반응 혼합물의 1/10 을 아가로오스 겔 전기영동시켜 목적하는 단편이 증폭되었는지에 대하여 확인하였다. 이어서, 나머지 반응 혼합물을 동량의 TE 로 포화된 페놀/클로로포름과 혼합하였다.
생성된 혼합물을 원심분리시키고, 수득된 상층을 두 배 부피의 냉 에탄올과 혼합하여, -80℃ 에서 30 분간 정치시켰다. 생성된 혼합물을 원심분리시켜, DNA 침전물을 수득하였다.
DNA 침전물을 20 ㎕ 의 TE 에 용해시키고, 이 용해액 5 ㎕ 를 이용하여 DNA 를 제한효소XhoI 및EcoRI 로 절단하였다. DNA 단편을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리시키고, PL프로모터를 함유하는 0.3 kb DNA 단편을 Gene Clean II Kit 를 이용하여 회수하였다.
pPAC31 (0.2 ㎍) 를 제한효소EcoRI 및BamHI 로 절단하였다. DNA 단편을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리하여, 5.2 kb DNA 단편을 동일한 방식으로 회수하였다.
상기에서 수득한 1.0 kb 단편, 0.3 kb 단편 및 5.2 kb 단편을 라이게이션 키트를 이용하여 16℃ 에서 16 시간동안 라이게이션 반응시켰다.
에스케리키아 콜리 NM522 를 전술한 공지의 방법에 따라 라이게이션 혼합물을 이용하여 형질전환시키고, 50 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 아가 배지상에 도포하고, 30℃ 에서 밤새 배양하였다.
플라스미드를 전술한 공지의 방법에 따라 배지상에서 생육된 형질전환체의 콜로니로부터 추출하여, 발현 플라스미드 pGT87 를 수득하였다. 수득된 플라스미드의 구조는 제한효소에 의한 분해로 확인하였다 (도 3)
실시예 4
캄필로박터 제주니 유래의 α1,4-N-아세틸갈락토사민 트랜스퍼라제를 생산하는 형질전환체의 구축
캄필로박터 제주니 (ATCC 43446) 유래의 α1,4-N-아세틸갈락토사민 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열 [Microbiology,144, 2049 (1998)]에 기초하여, SEQ ID NOS: 13 및 14 에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 DNA 합성기 (Model 8905, PerSeptive Biosystems)를 이용하여 합성하였다. 한 쌍의 프라이머로는 합성된 DNA 및 주형으로는 캄필로박터 제주니 (ATCC 43446)의 염색체 DNA 를 이용하여 실시예 3 에서와 같은 조건하에서 PCR 을 수행하여, 약 1.0 kb 의PCR 산물을 수득하였다.
생성된 반응 혼합물의 1/10 을 아가로오스 겔 전기영동시켜 목적하는 단편이 증폭되었는지에 대하여 확인하였다. 이어서, 나머지 반응 혼합물을 동량의 TE 로 포화된 페놀/클로로포름과 혼합하였다.
생성된 혼합물을 원심분리시키고, 수득된 상층을 두 배 부피의 냉 에탄올과 혼합하고, -80℃ 에서 30 분간 정치시켰다. 생성된 혼합물을 원심분리시켜, DNA 침전물을 수득하였다.
DNA 침전물을 20 ㎕ 의 TE 에 용해시키고, 이 용해액 5 ㎕ 를 이용하여 DNA를 제한효소ClaI 및BamHI 로 절단하였다. DNA 단편을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리시키고, α1,4-N-아세틸갈락토사민 트랜스퍼라제 유전자를 함유하는 1.0 kb DNA 단편을 Gene Clean II Kit 를 이용하여 회수하였다.
pPAC31 (0.2 ㎍) 를 제한효소ClaI 및BamHI 로 절단하였다. DNA 단편을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리하여, 5.5 kb DNA 단편을 동일한 방식으로 회수하였다.
상기에서 수득한 1.0 kb 단편 및 5.5 kb 단편을 라이게이션 키트를 이용하여 16℃ 에서 16 시간동안 라이게이션 반응시켰다.
에스케리키아 콜리 NM522 를 전술한 공지의 방법에 따라 라이게이션 혼합물을 이용하여 형질전환시키고, 50 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 아가 배지상에 도포하고, 30℃ 에서 밤새 배양하였다.
플라스미드를 전술한 공지의 방법에 따라 배지상에서 생육된 형질전환체의콜로니로부터 추출하여, 발현 플라스미드 pCJ2 를 수득하였다. 수득된 플라스미드의 구조는 제한효소에 의한 절단으로 확인하였다 (도 4)
실시예 5
UDP-GalNAc (1) 의 생산
실시예 1 에서 수득한 에스케리키아 콜리 NM522/pGT73 및 갈락토키나아제 및 갈락토오스-1-포스페이트 우리딜일트랜스퍼라제를 생산하는 에스케리키아 콜리 NM522/pNT25 (WO98/12343) 을 50 ㎍/ml 암피실린이 함유된 125 ml 의 LB 배지가 들어있는 1-ℓ의 배플이 장착된 삼각 플라스크에 접종시켜, 220 rpm, 28℃에서 17 시간동안 배양시켰다. 생성된 배양물 (125 ml) 을 50 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 2.5 ℓ의 TB 배지 [10 g/l 글루코오스, 12 g/l 박토-트립톤 (Difco), 24 g/l 이스트 추출물 (Difco), 2.3 g/l KH2PO4및 12.5 g/l K2HPO4(pH 비조정)] 가 들어있는 5-ℓ 발효기에 접종하고, 600 rpm, 통기량 (2.5 l/min)의 조건하 30℃ 에서 4 시간동안 배양한 후, 추가로 40℃ 에서 3 시간동안 배양하였다. 배양 동안, 28% 암모니아수를 이용하여 배양물을 pH 7.0 로 유지시키고, 여기에 필요에 따라 글루코오스를 첨가하였다. 생성된 배양물을 원심분리하여 습균체를 수득하였다. 필요에 따라 -20℃ 에서 저장하는 것이 가능하며, 습균체는 해동후 사용할 수 있다.
코리네박테리윰 암모니아게네스 ATCC 21170 을 50 g/1 글루코오스, 10 g/l 폴리펩톤 (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 10 g/l 이스트 추출물 (Oriental Yeast Co., Ltd.), 5 g/l 우레아, 5 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 3 g/l K2HPO4, 1g/l MgSO4ㆍ7H2O, 0.1 g/l CaCl2ㆍ2H2O, 10 mg/l FeSO4ㆍ7H2O, 10 mg/l ZnSO4ㆍ7H2O, 20 mg/l MnSO4ㆍ4-6H20, 20 mg/l L-시스테인, 10 mg/l 칼슘 D-판토테네이트, 5 mg/l 비타민 Bl, 5 mg/l 니코틴산 및 30 mg/l 바이오틴 (10 mol/l NaOH 를 이용하여 pH 7.2 로 조정)을 함유하는 25ml 의 액체 배지가 들어있는 300-ml 의 배플이 장착된 삼각 플라스크에 접종하고, 220 rpm, 28℃ 에서 24 시간동안 배양시켰다.
생성된 배양물 (20 ml)을 전술한 바와 동일한 조성을 가진 250 ml 의 액체 배지가 들어있는 2-ℓ의 배플 장착의 삼각 플라스크에 접종하고, 220 rpm, 28℃ 에서 24 시간동안 배양하였다. 수득한 배양물을 종배양물로 사용하였다.
종배양물 (250 ml) 을 150 g/l 글루코오스, 5 g/l 육추출물 (Kyokuto Pharmaceutical Ind. Co., Ltd.), 10 g/l KH2PO4, 10 g/l K2HPO4, 10 g/l MgSO4ㆍ7H2O, 0.1 g/l CaCl2ㆍ2H2O, 20 mg/l FeSO4ㆍ7H2O, 10 mg/l ZnSO4ㆍ7H2O, 20 mg/l MnSO4ㆍ4-6H20 (별도로 살균), 15 mg/l β-알라닌 (별도로 살균), 20 mg/l L-시스테인, 100 mg/l 바이오틴, 2 g/l 우레아 및 5 mg/l 비타민 B1 (별도로 살균) (10 mol/l NaOH 를 이용하여 pH 7.2 로 조정)을 함유하는 2.25 l 의 액체 배지가 들어있는 5-l 의 발효기에 접종하고, 600 rpm, 통기량 (2.5 l/min)의 조건하 32℃ 에서 24 시간동안 배양하였다. 배양 동안, 배양물을 28% 암모니아수를 이용하여 pH 6.8 에서 유지시켰다.
생성된 배양물을 원심분리시켜 습균체를 수득하였다. 필요에 따라 -20℃ 에서 저장하는 것이 가능하며, 습균체는 해동후 사용할 수 있다.
50 g/l 의 에스케리키아 콜리 NM522/pNT25의 습균체, 50 g/l 의 에스케리키아 콜리 NM522/pGT73 의 습균체, 150 g/l 의 코리네박테리윰 암모니아게네스 ATCC 21170 의 습균체, 100 g/l 의 프룩토오스, 50 g/l 의 N-아세틸글루코사민, 10 g/l 의 오로트산, 25 g/l 의 KH2PO4, 5 g/l MgSO4ㆍ7H2O, 5 g/l 피트산, 4 g/l Nymeen S-215 및 10 ml/l 의 크실렌을 함유하는 반응 혼합물 (30 ml) 을 200-ml 비이커에 넣고, 자기 교반기를 이용하여 900 rpm 에서 교반하면서 32℃ 에서 27 시간동안 반응을 수행하였다. 반응 동안, 4 mol/l NaOH 를 이용하여 반응 혼합물을 pH 7.2 로 유지시키고, 여기에 프룩토오스, N-아세틸글루코사민 및 KH2PO4를 필요에 따라 첨가하였다.
반응의 종결후, 반응 생성물을 HPLC 로 분석하여, 9.6 g/l 의 UDP-GalNAc 가 반응혼합물내 생성 및 축적된 것을 확인하였다.
실시예 6
UDP-GalNAc (2)의 생산
실시예 2 에서 수득한 에스케리키아 콜리 NM522/pGT24 및 에스케리키아 콜리 NM522/pNT25 (W098/12343) 를 실시예 5 와 동일한 방식으로 배양하여 습균체를 수득하였다. 필요에 따라 -20℃ 에서 저장가능하며, 습균체는 해동후 사용할 수 있다.
코리네박테리윰 암모니아게네스 ATCC 21170 를 실시예 5 와 동일한 방식으로배양하여 습균체를 수득하였다. 필요에 따라 -20℃ 에서 저장가능하며, 습균체는 해동후 사용할 수 있다.
50 g/l 의 에스케리키아 콜리 NM522/pNT25의 습균체, 50 g/l 의 에스케리키아 콜리 NM522/pGT24 의 습균체, 150 g/l 의 코리네박테리윰 암모니아게네스 ATCC 21170 의 습균체, 100 g/l 의 프룩토오스, 50 g/l 의 N-아세틸글루코사민, 10 g/l 의 오로트산, 25 g/l 의 KH2PO4, 5 g/l 의 MgSO4ㆍ7H2O, 5 g/l 의 피트산, 4 g/l 의 Nymeen S-215 및 10 ml/l 자일렌을 함유하는 반응 혼합물 (30 ml)을 200-ml 비이커에 넣고, 자기 교반기를 이용하여 900 rpm 으로 교반하면서 32℃ 에서 27 시간동안 반응을 수행하였다. 반응 동안, 반응 혼합물을 4 mol/l NaOH 를 이용하여 pH 7.2 로 유지시키고, 여기에 프룩토오스, N-아세틸글루코사민 및 KH2PO4를 필요에 따라 첨가하였다.
반응의 종결후, 반응 생성물을 HPLC 로 분석하여, 5.5 g/l UDP-GalNAc 가 반응 혼합물내 생성 및 축적된 것을 확인하였다.
실시예 7
GM2 카르보히드레이트 사슬 [GalNAcβ1,4(NeuAcα2,3)Galβ1,4Glc] 의 생산
실시예 1 에서 수득한 에스케리키아 콜리 NM522/pGT73, 에스케리키아 콜리 NM522/pNT25 (WO98/12343) 및 실시예 4 에서 수득한 에스케리키아 콜리 NM522/pGT87 을 실시예 5 와 동일한 방식으로 배양하여 습균체를 수득하였다. 필요에 따라 -20℃ 에서 저장하는 것이 가능하며, 습균체는 해동후 사용할 수 있다.
코리네박테리윰 암모니아게네스 ATCC 21170 을 실시예 5 와 동일한 방식으로 배양하여 습균체를 수득하였다. 필요에 따라 -20℃ 에서 저장하는 것이 가능하며, 습균체는 해동후 사용할 수 있다.
50 g/l 의 에스케리키아 콜리 NM522/pNT25의 습균체, 50 g/l 의 에스케리키아 콜리 NM522/pGT73 습균체, 100 g/l 의 에스케리키아 콜리 NM522/pGT87 습균체, 150 g/l 의 코리네박테리윰 암모니아게네스 ATCC 21170 의 습균체, 100 g/l 의 프룩토오스, 50 g/l 의 N-아세틸글루코사민, 50 g/l 의 UDP-N-아세틸글루코사민, 33 g/l 의 3'-시알릴락토오스, 25 g/l 의 KH2PO4, 5 g/l 의 MgSO4ㆍ7H2O, 5 g/l 의 피트산, 4 g/l 의 Nymeen S-215 및 10 ml/l 자일렌을 함유하는 반응 혼합물 (30 ml)을 200-ml 비이커에 넣고, 자기 교반기를 이용하여 900 rpm 으로 교반하면서 32℃ 에서 27 시간동안 반응을 수행하였다. 반응 동안, 반응 혼합물을 4 mol/l NaOH 를 이용하여 pH 7.2 로 유지시키고, 여기에 프룩토오스, N-아세틸글루코사민, 1.3'-시알릴락토오스 및 KH2PO4를 필요에 따라 첨가하였다.
반응의 종결후, 반응 생성물을 HPLC 로 분석하여, 7.7 g/l GM2 카르보히드레이트 사슬이 반응 혼합물내 생성 및 축적된 것을 확인하였다.
실시예 8
NOS-α(GalNAcα1,4 Galβ1,4GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glc) 의 생산
실시예 2 에서 수득한 에스케리키아 콜리 NM522/pGT24, 에스케리키아 콜리 NM522/pNT25 (WO98/12343) 및 실시예 5 에서 수득한 에스케리키아 콜리 NM522/pCJ2를 실시예 5 와 동일한 방식으로 배양하여 습균체를 수득하였다. 필요에 따라 -20℃ 에서 저장하는 것이 가능하며, 습균체는 해동후 사용할 수 있다.
코리네박테리윰 암모니아게네스 ATCC 21170 을 실시예 5 와 동일한 방식으로 배양하여 습균체를 수득하였다. 필요에 따라 -20℃ 에서 저장하는 것이 가능하며, 습균체는 해동후 사용할 수 있다.
50 g/l 의 에스케리키아 콜리 NM522/pNT25의 습균체, 25 g/l 의 에스케리키아 콜리 NM522/pGT24 의 습균체, 50 g/l 의 에스케리키아 콜리 NM522/pCJ2 습균체, 150 g/l 의 코리네박테리윰 암모니아게네스 ATCC 21170 의 습균체, 100 g/l 의 프룩토오스, 100 g/l 의 N-아세틸글루코사민, 200 g/l 의 락토-N-네오테트라오스, 5 g/l 의 오르트산, 25 g/l 의 KH2PO4, 5 g/l 의 MgSO4ㆍ7H2O, 5 g/l 의 피트산, 4 g/l 의 Nymeen S-215 및 10 ml/l 자일렌을 함유하는 반응 혼합물 (30 ml)을 200-ml 비이커에 넣고, 자기 교반기를 이용하여 900 rpm 으로 교반하면서 32℃ 에서 35 시간동안 반응을 수행하였다. 반응 동안, 반응 혼합물을 4 mol/l NaOH 를 이용하여 pH 7.2 로 유지시키고, 여기에 프룩토오스 및 KH2PO4를 필요에 따라 첨가하였다.
반응의 종결후, 반응 생성물을 HPLC 로 분석하여, 2.4 g/l 의 NOS-α가 반응 혼합물내 생성 및 축적된 것을 확인하였다.
본 발명에 따라, UDP-GalNAc 및 N-아세틸갈락토사민 함유 카르보히드레이트 를 효과적으로 생산할 수 있다.
[서열 목록 프리 텍스트]
SEQ ID NO: 5 - 인공서열의 설명: 합성 DNA
SEQ ID NO: 6 - 인공서열의 설명: 합성 DNA
SEQ ID NO: 7 - 인공서열의 설명: 합성 DNA
SEQ ID NO: 8 - 인공서열의 설명: 합성 DNA
SEQ ID NO: 9 - 인공서열의 설명: 합성 DNA
SEQ ID NO: 10 - 인공서열의 설명: 합성 DNA
SEQ ID NO: 11 - 인공서열의 설명: 합성 DNA
SEQ ID NO: 12 - 인공서열의 설명: 합성 DNA
SEQ ID NO: 13 - 인공서열의 설명: 합성 DNA
SEQ ID NO: 14 - 인공서열의 설명: 합성 DNA

Claims (35)

  1. 하기 단계를 포함하는 UDP-N-아세틸갈락토사민 (이하 UDP-GalNAc 로 약칭)의 제조 방법 :
    UDP-N-아세틸글루코사민 4-에피머라제 (이하 UDP-GlcNAc 4-에피머라제로 약칭)활성을 갖는 단백질을 생산하는 형질전환체의 배양물 또는 이 배양물의 처리물인 효소원 및 UDP-N-아세틸글루코사민 (이하 UDP-GlcNAc로 약칭)을 수성 배지에 존재케하는 단계;
    UDP-GalNAc 를 수성 배지에 생성축적시키는 단계; 및
    수성 배지로부터 UDP-GalNAc 를 회수하는 단계.
  2. 하기 단계를 포함하는 N-아세틸갈락토사민 (이하 GalNAc로 약칭) 함유 카르보히드레이트의 제조 방법 :
    UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 생산하는 형질전환체의 배양물 또는 이 배양물의 처리물인 효소원, 수용체 카르보히드레이트, GalNAc 트랜스퍼라제 및 UDP-GlcNAc 를 수성 배지에 존재케 하는 단계;
    GalNAc함유 카르보히드레이트를 수성배지에 생성축적시키는 단계; 및
    수성 배지로부터 GalNAc함유 카르보히드레이트를 회수하는 단계.
  3. 하기 단계를 포함하는 UDP-GalNAc 의 제조 방법 :
    우리딘-5'-트리포스페이트 (이하 UTP 로 약칭)의 전구체 및 당으로부터 UDP-GlcNAc 을 생성시키는 능력을 가진 미생물의 배양물 또는 이 배양물의 처리물 및 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 생산하는 형질전환체의 배양물 또는 이 배양물의 처리물인 효소원, UTP 의 전구체 및 당을 수성 배지에 존재케 하는 단계; 및
    UDP-GalNAc 를 수성배지에 생성축적시키는 단계; 및
    수성배지로부터 UDP-GalNAc 를 회수하는 단계.
  4. 하기 단계를 포함하는 GalNAc함유 카르보히드레이트의 제조 방법 :
    UTP 의 전구체 및 당으로부터 UDP-GlcNAc 을 생성시키는 능력을 가진 미생물의 배양물 또는 이 배양물의 처리물, GalNAc 트랜스퍼라제 및 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 생산하는 형질전환체의 배양물 또는 이 배양물의 처리물인 효소원, UTP 의 전구체, 당 및 수용체 카르보히드레이트를 수성배지에 존재케하는 단계;
    GalNAc함유 카르보히드레이트를 수성배지에 생성축적케하는 단계; 및
    수성배지로부터 GalNAc함유 카르보히드레이트를 회수하는 단계.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, 배양물의 처리물은 농축 배양물, 건조 배양물, 배양물을 원심분리하여 수득한 균체, 균체를 건조처리, 동결건조처리, 계면활성제 처리, 초음파처리, 기계적 마모처리, 용매 처리, 효소 처리, 단백질 분획화 처리 및 단백질 고정화처리하여 수득한 생성물 또는 균체를 추출하여 수득한 효소 제제인 방법.
  6. 제 2 항 또는 제 4 항에 있어서, 수용체 카르보히드레이트는 비환원성 말단에 시알산, 갈락토오스, GalNAc, N-아세틸글루코사민, 푸코오스, 글루쿠론산 또는 이두론산을 갖는 올리고사카라이드를 포함하는 복합 카르보히드레이트인 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 비환원성 말단에 시알산, 갈락토오스, GalNAc, N-아세틸글루코사민, 푸코오스, 글루쿠론산 또는 이두론산을 갖는 올리고사카라이드가 락토오스, N-아세틸락토사민, 글로보트리오스, 시알릴락토오스, 시알릴 N-아세틸락토사민, 루이스 X, 루이스 a, 시알릴 루이스 X, 시알릴 루이스 a, 콘드로이틴 술페이트, 더마탄 술페이트, H 형 1 (Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc) 또는 H 형 2 (Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc) 인 방법.
  8. 제 2 항 또는 제 4 항에 있어서, 수용체 카르보히드레이트가 락토오스, N-아세틸락토사민, 글로보트리오스, 시알릴락토오스, 시알릴 N-아세틸락토사민, 루이스 X, 루이스 a, 시알릴 루이스 X, 시알릴 루이스 a, 콘드로이틴 술페이트, 더마탄 술페이트, H 형 1 (Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc) 또는 H 형 2 (Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc) 인 방법.
  9. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 전구체는 오로트산, 오로티딘, 우라실, 우리딘 또는 우리딘-5'-모노포스페이트인 방법.
  10. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 당은 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민인 방법.
  11. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, UTP 의 전구체 및 당으로부터 UDP-GlcNAc 를 생성시키는 능력을 가진 미생물은 에스케리키아(Escherichia), 코리네박테리윰(Corynebacterium) 및 사카로마이세스 (Saccharomyces)속에 속하는 미생물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 미생물인 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 에스케리키아속에 속하는 미생물은 에스케리키아 콜리인 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 코리네박테리윰속에 속하는 미생물은 코리네박테리윰 암모니아게네스인 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 사카로마이세스속에 속하는 미생물은 사카로마이세스 세레비시아인 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, 형질전환체는 재조합 DNA 를 미생물에 도입시켜 수득한 형질전환체인 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 미생물은 에스케리키아, 코리네박테리윰 및 사카로마이세스속에 속하는 미생물로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 에스케리키아속에 속하는 미생물은 에스케리키아 콜리인 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 코리네박테리윰속에 속하는 미생물은 코리네박테리윰 글루타미쿰인 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 사카로마이세스속에 속하는 미생물은 사카로마이세스 세레비시아인 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질은 바실러스 또는 나이세리아속에 속하는 미생물로부터 유래된 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질인 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 바실러스속에 속하는 미생물은 바실러스 서브틸리스, 바실러스 메가테리움 및 바실러스 스테아로써모필러스로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  22. 제 20 항에 있어서, 나이세리아속에 속하는 미생물은 나이세리아 고노르호에아 또는 나이세리아 메닝기티디스인 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 20 항 내지 제 22 항중 어느 한 항에 있어서, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질인 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 20 항 내지 제 22 항중 어느 한 항에 있어서, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 구성되며, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질인 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 20 항 내지 제 22 항중 어느 한 항에 있어서, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열에 50% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 단백질인 방법.
  26. 제 15 항에 있어서, 재조합 DNA 는 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함하는 방법.
  27. 제 15 항에 있어서, 재조합 DNA 는 UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 UDP-글루코오스 4-에피머라제 (이하 galE 단백질로 약칭) 을 코딩하는 DNA 를 포함하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, galE 단백질은 바실러스 또는 나이세리아속에 속하는 미생물로부터 유래되는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 바실러스속에 속하는 미생물은 바실러스 서브틸리스, 바실러스 메가테리움 및 바실러스 스테아로써모필러스로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  30. 제 28 항에 있어서, 나이세리아속에 속하는 미생물은 나이세리아 고노르호에아 또는 나이세리아 메닝기티디스인 방법.
  31. 제 15 항에 있어서, 재조합 DNA 는 SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함하는 방법.
  32. 제 15 항에 있어서, 재조합 DNA 는 SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 구성되며, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함하는 방법.
  33. 제 15 항에 있어서, 재조합 DNA 는 SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열에 50% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성되며, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함하는 방법.
  34. 제 15 항에 있어서, 재조합 DNA 는 SEQ ID NO: 3 또는 4 에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하는 방법.
  35. 제 15 항에 있어서, 재조합 DNA 는 엄격한 조건하 SEQ ID NO: 3 또는 4 에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 구성된 DNA 와 하이브리다이즈하며, UDP-GlcNAc 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함하는 방법.
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