KR20030058495A - Novel ansamycin compound produced by Streptomyces sp. 91614 and a method for preparation thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 신규한 안사마이신(ansamycin) 계 화합물 및 약학적으로 허용가능한 그의 염, 상기 화합물을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 91614(Streptomycessp. 91614), 상기 균주를 이용하여 안사마이신 계 화합물을 제조하는 방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성 저해제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하기화학식 1또는화학식 2로 표시되는 신규한 안사마이신 계 화합물 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그들의 염, 상기 화합물을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 91614, 상기 균주의 배양액 또는 균체를 유기용매 및 에틸아세테이트 추출과 크로마토그래피를 수행하여 안사마이신 계 화합물을 제조하는 방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성 저해제에 관한 것이다.The present invention provides a novel ansamycin-based compound and a pharmaceutically acceptable salt thereof, a novel Streptomyces 91614 ( Streptomyces sp. 91614) producing the compound, using the strain to prepare an ansamycin-based compound The present invention relates to a method for inhibiting nitrogen monoxide production containing the compound as an active ingredient, and more particularly, novel anzamycin-based compound derivatives represented by the following Chemical Formula 1 or Chemical Formula 2 and pharmaceutically acceptable salts thereof, the compounds Novel Streptomyces 91614, a method for preparing ansamycin-based compounds by extraction and chromatography with an organic solvent and ethyl acetate in a culture medium or cells of the strain, and a nitrogen monoxide production inhibitor containing the compound as an active ingredient It is about.
<화학식 1><Formula 1>
<화학식 2><Formula 2>
일산화질소는 최근에 각종 세포에 의해 생산되어 이들 세포에 작용하며, 염증 및 자가면역-중재된 조직 파괴에 관여하는 다기능 중재자인 것으로 인식되고 있다. 일산화질소 생산은 일산화질소 생성효소(nitric oxide synthase; 이하 "NOS"라 약칭한다)라 불리는 편재하는 효소 군에 의해 촉매된다. NOS는 L-아르기닌(일반적인 아미노산)의 L-시트룰린 및 일산화질소로의 혼합 작용적 산화를 촉매하는, 포유 동물에서 천연적으로 발현되는 효소이다. 이 효소는 L-아르기닌의 구아니디노 질소를 제거하여 일산화질소를 형성시킨다. 몇몇의 동형 NOS 효소가 확인되었으며, 이들은 일반적으로 2개의 유형으로 분리된다: 구성적 NOS(이후 cNOS라고 칭함) 및 유도성 NOS(이후 iNOS라고 칭함). 일부 NOS 효소의 유형 및 작용에 관한 추가의 세부 사항이 예를 들어, 미국 특허 제5,478,946호 및 제5,468,630호에 밝혀져 있으며, 이들 전체의 기술은 본원에서 참조로 인용된다. 사람 유도성 NOS를 발현시킬 수 있는 cDNA 클론은 미국 특허 제5,468,630호에 기술되어 있다.Nitrogen monoxide has recently been produced by various cells and acts on these cells and is recognized as a multifunctional mediator involved in inflammation and autoimmune-mediated tissue destruction. Nitric oxide production is catalyzed by a group of ubiquitous enzymes called nitric oxide synthase (hereinafter abbreviated as "NOS"). NOS is an enzyme that is naturally expressed in mammals that catalyzes the mixed functional oxidation of L-arginine (common amino acid) to L-citrulline and nitrogen monoxide. This enzyme removes guanidino nitrogen from L-arginine to form nitrogen monoxide. Several isotype NOS enzymes have been identified, and they are generally separated into two types: constitutive NOS (hereinafter referred to as cNOS) and inducible NOS (hereinafter referred to as iNOS). Further details regarding the type and function of some NOS enzymes are found, for example, in US Pat. Nos. 5,478,946 and 5,468,630, the entirety of which is incorporated herein by reference. CDNA clones capable of expressing human inducible NOS are described in US Pat. No. 5,468,630.
NOS 효소의 일산화질소 생성물은 형성시 관련되는 동형 NOS 효소에 따라 신호 분자 또는 유효기 분자로서 작용하는 것으로 여겨진다. 구성적 형태의 NOS는 소량의 일산화질소를 생산하며, 이는 구아닐레이트 사이클라제를 활성화시켜 사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP)를 형성시킨다. 결국, cGMP는 내피-의존성 근육 이완 및 신경 전달을 포함하는 몇가지 특이적 작용을 중재한다. 대조적으로, 일산화질소는 유도성 일산화질소 생성효소(이하 "iNOS"라 약칭한다)로 지명된 유도성의 동형 효소에 의해 다량 생산된다. iNOS에 의해 생산된 NO는 대식구의 세포독성 활성을 중재하는 것으로 여겨진다. iNOS를 생산하는 다른 세포는 내피세포, 신경망, 쿠퍼 세포(Kupffer cell) 및 간 세포, 및 사이토킨에 의해 자극된 뮤린 섬유아세포를 포함한다. 일산화질소는 또한뇌에서의 화학적 전령자(messenger)이며, 별개의 동형 NOS에 의해 생산되는 것으로 여겨진다.The nitric oxide product of the NOS enzyme is believed to act as a signal molecule or an effective group molecule, depending on the isoform NOS enzyme involved in formation. The constitutive form of NOS produces a small amount of nitrogen monoxide, which activates guanylate cyclase to form cyclic guanosine monophosphate (cGMP). In turn, cGMP mediates several specific actions, including endothelial-dependent muscle relaxation and neurotransmission. In contrast, nitric oxide is produced in large quantities by inducible isozymes called inducible nitric oxide synthase (hereinafter abbreviated as "iNOS"). NO produced by iNOS is believed to mediate the cytotoxic activity of macrophages. Other cells producing iNOS include endothelial cells, neural networks, Kupffer cells and liver cells, and murine fibroblasts stimulated by cytokines. Nitric oxide is also a chemical messenger in the brain and is believed to be produced by separate isoform NOS.
몇몇의 생리학적 활성은 일산화 질소에 기인하고 있다. 히스타민 및 브래디키닌과 같은 혈관 활성제는 일산화질소 생산을 자극한다. 일산화질소는 혈류 및 혈관 투과성을 증가시키는 강력한 혈관확장제이다. 인터루킨-1(IL-1)은 췌장 섬(pancreatic islet)에서 iNOS의발현을 유도한다. 일산화질소는 췌장 섬 작용에 있어 IL-1의 억제 효과의 중재자인 것으로 여겨진다. iNOS의 다른 유도자는 세균 내독소이며, 이는 일산화질소가 내독소 쇼크 또는 패혈성 쇼크의 중재자로서 관여함을 나타낸다. 효소의 다른 유도자는 감마 인터페론, 종양 괴사 인자 및 기타 염증성 사이토카인을 포함한다. 예를 들어, 종양 괴사 인자는 패혈성 쇼크와 관련된 전신계적 저혈압에 관련되는 것으로 여겨진다.Some physiological activities are due to nitrogen monoxide. Vascular activators such as histamine and bradykinin stimulate nitric oxide production. Nitric oxide is a potent vasodilator that increases blood flow and vascular permeability. Interleukin-1 (IL-1) induces the expression of iNOS in pancreatic islets. Nitric oxide is believed to be a mediator of the inhibitory effect of IL-1 on pancreatic islet action. Another inducer of iNOS is bacterial endotoxins, indicating that nitric oxide is involved as a mediator of endotoxin shock or septic shock. Other inducers of the enzyme include gamma interferon, tumor necrosis factor and other inflammatory cytokines. For example, tumor necrosis factor is believed to be involved in systemic hypotension associated with septic shock.
NOS는 또한 다양한 염증 조직에서 과발현(증가된 양으로 및 종종 비정상적인 양으로 발현)되며, 일산화질소 합성 및 작용의 중재가 염증 및 자가면역 상태의 치료에 있어 새로운 시도를 제공할 수 있다는 가설을 가져왔다(Vane et al. 1994, Schmidt et al. 1994). 반(Vane) 및 공동 연구자는 일산화질소가 동물 모델에서 염증의 중요한 중재자임을 암시하였다(Vane et al. 1994). 시험하는 경우, 일산화질소 형성은 자가면역 질환(즉, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 궤양성 대장염및 크론 질환)에서 증가되는 것으로 밝혀졌으며, 몇몇의 전통적인 염증 증상(홍반 및 혈관 누출)은 NOS 억제제에 의해 회복된다(Schmidt et al. 1994, Nathan et al. 1994, Marletta 1994). 조직 손상의 중재자로서 일산화질소에 대한 가장 필적된 현상은 이러한 질환의 동물 모델을 수행한 연구(McCartney-Francis et al. 1993, Stefanovic-Racic et al.1994) 및 사람 골관절염의 연구(OA)(Amin et al. 1995a)와 류마티스 관절염(RA)의 연구(Sakurai et al.1995)를 포함하는 관절염 연구에서 밝혀졌다.NOS is also overexpressed (in increased amounts and often in abnormal amounts) in various inflammatory tissues, and has been hypothesized that mediation of nitric oxide synthesis and action may provide new trials in the treatment of inflammatory and autoimmune conditions. (Vane et al. 1994, Schmidt et al. 1994). Van and co-workers suggest that nitric oxide is an important mediator of inflammation in animal models (Vane et al. 1994). When tested, nitric oxide formation has been found to be increased in autoimmune diseases (ie, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, ulcerative colitis and Crohn's disease), and some traditional inflammatory symptoms (erythema and vascular leakage) are NOS inhibitors. It is recovered by (Schmidt et al. 1994, Nathan et al. 1994, Marletta 1994). The most comparable phenomena for nitric oxide as mediators of tissue damage are studies conducted with animal models of these diseases (McCartney-Francis et al. 1993, Stefanovic-Racic et al. 1994) and studies of human osteoarthritis (OA) (Amin et al. 1995a) and arthritis studies, including studies of rheumatoid arthritis (RA) (Sakurai et al. 1995).
상기와 같이 일산화 질소는 일산화질소 생성효소에 의해 생성되어 중추신경계, 혈관계, 면역계에서 신경전달, 기억 및 학습, 혈관 이완, 외부 물질로부터의 방어기능 등 중요한 생리적 기능을 가진다. 그러나 유도성 일산화질소에 의해 일산화질소가 과도하게 생성되면, 과도한 일산화질소는 세포독성을 나타내어 여러 가지 염증관련질환을 일으킨다. 마크로파지, 모노사이트, 마이클로글리아 등에서 유도성 일산화질소 생성효소에 의해 생성되는 일산화 질소는 패혈증, 류마티즘 관절염, 염증성 대장염을 비롯하여 뇌졸중, 치매, 파킨슨병 등 퇴행성신경질환의 발병에 관련되어 있다. 활성화형 마이크로글리아는 후 허혈성 뇌졸중(post-ischemic stroke), 치매, 파킨슨, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 에이즈성 치매질환에서의 중요한 병리적 현상이며, 활성화형 마이크로글리아 세포는 일산화질소, COX-2, TNF-α, IL-1-β등 염증매개인자를 생산하여 퇴행성 염증질환을 유발하는 것으로 알려져 있다.As described above, nitrogen monoxide is produced by nitric oxide synthase and has important physiological functions such as neurotransmission, memory and learning in the central nervous system, the vascular system, the immune system, vascular relaxation, and defense from foreign substances. However, when excessive nitrogen monoxide is produced by inducible nitrogen monoxide, excessive nitrogen monoxide is cytotoxic and causes various inflammation-related diseases. Nitrogen monoxide produced by inducible nitric oxide synthase in macrophages, monosite, and Michaeloglia is associated with the development of sepsis, rheumatoid arthritis, inflammatory colitis, and degenerative neurological diseases such as stroke, dementia, and Parkinson's disease. Activated microglia are important pathological phenomena in post-ischemic stroke, dementia, Parkinson's, multiple sclerosis, and AIDS dementia, and activated microglia cells are called nitric oxide, COX. Inflammatory mediators such as -2, TNF-α and IL-1-β are known to cause degenerative inflammatory diseases.
이에, 많은 연구자들에 의해 일산화질소 생성효소의 억제제가 개발되었다. 이들 억제제의 대부분은 L-아르기닌의 유도체 및 NOS 효소의 천연기질이다. 예를 들어, NG-메틸-L-아르기닌 및 L-Nω-니트로아르기닌은 일산화질소 합성의 경쟁적 억제제이다. 미국 특허 제5,358,969호는 급성 또는 만성 염증 질환에 있어서의 일산화질소 형성의 억제를 기술하고 있다. 이 방법은 포유 동물에게 일산화질소-억제량의 메틸-, 1,1-디메틸- 또는 아미노-치환된 구아니딘 화합물을 투여함을 포함한다(미국 특허 제5,246,970호 및 제5,246,971호).Thus, many researchers have developed inhibitors of nitric oxide synthase. Most of these inhibitors are derivatives of L-arginine and natural substrates of NOS enzymes. For example, NG-methyl-L-arginine and L-Nω-nitroarginine are competitive inhibitors of nitric oxide synthesis. U. S. Patent 5,358, 969 describes the inhibition of nitric oxide formation in acute or chronic inflammatory diseases. The method comprises administering to the mammal a nitrogen monoxide-inhibited amount of methyl-, 1,1-dimethyl- or amino-substituted guanidine compound (US Pat. Nos. 5,246,970 and 5,246,971).
미국 특허 제5,216,025호는 특정의 저혈압 환자에 있어서 승압제를 효능화시키기 위한 일산화질소 억제제로서의 용도를 기술하고있다. 이들 억제제는 NG-치환된 아르기닌을 포함하며, 여기서, 아르기닌의 구아니디노 아미노 그룹상의 수소는 다른 원자 또는 분자종에 의해 대체된다.U. S. Patent No. 5,216, 025 describes use as a nitric oxide inhibitor to potentiate boosters in certain hypotensive patients. These inhibitors include NG-substituted arginine, wherein hydrogen on the guanidino amino group of arginine is replaced by another atom or molecular species.
미국 특허 제5,478,946호는 일산화질소 신타제를 조절함으로써 cGMP의 수준을 간접적으로 조절하는 것으로 언급되는 불포화된 구아니디노 화합물을 기술하고 있다. 이들 화합물은 불포화된 구아니디노 골격내 다양한 부위에서 C6-C12 아릴 그룹을 포함하는 각종 치환체를 포함할 수 있다.U. S. Patent No. 5,478, 946 describes unsaturated guanidino compounds, which are said to indirectly regulate the level of cGMP by regulating nitric oxide synthase. These compounds may include various substituents containing C6-C12 aryl groups at various sites in the unsaturated guanidino skeleton.
상기와 같이 최근에 일산화질소 억제제에 대한 많은 연구가 진행되어 오고 있으며 일산화질소를 특이적으로 억제할 수 있는 화합물을 찾아내어 이를 이용하여 일산화질소에 의해 발병되는 질환을 치료할 수 있는 치료제를 개발하는 것이 시급한 실정이다.Recently, many researches on nitrogen monoxide inhibitors have been conducted, and finding a compound capable of specifically inhibiting nitrogen monoxide and using it to develop a therapeutic agent that can treat diseases caused by nitric oxide. It is urgent.
이에, 본 발명자들은 미생물, 식물 등 천연물로부터 활성형 마이크로글리아 세포를 이용하여 일산화질소 생성 저해활성 물질을 탐색하는 연구를 수행하던 중, 일산화질소 생성을 강하게 억제하는 물질을 생산하는 방선균을 발견하고 상기균주의 미생물학적 특성을 규명함과 동시에 그 균주의 배양액으로부터 신규한 안사마이신 계 물질을 순수하게 분리 정제한 후 화학구조를 결정하고 상기 화합물이 일산화질소 생성 저해 활성을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the inventors of the present invention, while conducting a study to search for a nitrogen monoxide production inhibitory active substance using active microglia cells from microorganisms, plants, and other natural products, found an actinomycete that produces a substance that strongly inhibits nitrogen monoxide production. By identifying the microbiological characteristics of the strain and at the same time purely separating and purifying the novel ansamycin-based material from the culture medium of the strain, determining the chemical structure and confirming that the compound exhibits nitrogen monoxide production inhibitory activity. Completed.
본 발명의 목적은 신규한 안사마이신 계 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide novel ansamycin derivatives and pharmaceutically acceptable salts thereof.
또한, 본 발명의 목적은 상기 안사마이신 계 유도체를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 91614를 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a novel Streptomyces 91614 to produce the ansamycin derivatives.
또한, 본 발명의 목적은 상기 균주의 배양액으로부터 신규한 안사마이신 계 유도체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a method for producing a novel ansamycin derivative from the culture of the strain.
또한, 본 발명의 목적은 상기 안사마이신 계 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성 저해제를 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a nitrogen monoxide production inhibitor containing the ansamycin derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
도 1은 본 발명의 이소트리에노마이신 A의 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 및 탄소핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이고, 1 shows hydrogen nuclear magnetic resonance ( 1 H-NMR) and carbon nuclear magnetic resonance ( 13 C-NMR) spectra of isotrienomycin A of the present invention,
도 2는 본 발명의 트리에노마이신 A의 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 및 탄소핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이고, Figure 2 shows the hydrogen nuclear magnetic resonance ( 1 H-NMR) and carbon nuclear magnetic resonance ( 13 C-NMR) spectrum of the trienomycin A of the present invention,
도 3은 본 발명의 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A의 일산화질소 생성 저해활성을 나타낸 그래프이고, 3 is a graph showing the nitrogen monoxide production inhibitory activity of isotrienomycin A and trienomycin A of the present invention,
●: 이소트리에노마이신 A, □: 트리에노마이신 A,●: isotrienomycin A, □: trienomycin A,
도 4는 본 발명의 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A의 세포 생존력에 대한 효과를 나타낸 그래프이다. Figure 4 is a graph showing the effect on the cell viability of isotrienomycin A and trienomycin A of the present invention.
●: 이소트리에노마이신 A, □: 트리에노마이신 A●: isotrienomycin A, □: trienomycin A
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 안사마이신 계 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides novel ansamycin derivatives and pharmaceutically acceptable salts thereof.
또한, 본 발명은 상기 안사마이신 계 유도체를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 91614(Streptomycessp. 91614)를 제공한다.The present invention also provides a novel Streptomyces sp. 91614 to produce the ansamycin derivatives.
또한, 본 발명은 상기 균주의 배양액으로부터 신규한 안사마이신 계 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a novel ansamycin derivative from the culture of the strain.
또한, 본 발명은 상기 안사마이신 계 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성 저해제를 제공한다.In addition, the present invention provides a nitrogen monoxide production inhibitor containing the ansamycin derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 신규한 안사마이신 계 유도체 및 그의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.The present invention provides novel ansamycin derivatives and pharmaceutically acceptable salts thereof.
상기 신규한 안사마이신 계 유도체는 하기화학식 1로 표시되는 이소트리에노마이신 A 또는 하기화학식 2로 표시되는 트리에노마이신 A이다.The novel ansamycin derivatives are isotrienomycin A represented by the following formula (1 ) or trienomycin A represented by the following formula (2 ).
상기화학식 1및화학식 2로 표시되는 본 발명의 신규한 화합물에 대하여수소 핵자기 공명 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 등의 방법을 이용하여 이화학적 특성을 분석한 결과, 본 발명의 화합물은 하기와 같은 이화학적 특성을 갖는다.As a result of analyzing physicochemical properties of the novel compounds of the present invention represented by Chemical Formulas 1 and 2 using methods such as hydrogen nuclear magnetic resonance and carbon nuclear magnetic resonance spectra, the compounds of the present invention are catabolic Has a peculiar character.
이상과 같이 정제된 본 발명의 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A 의 이화학적 특성 및 화학구조는 다음과 같다.Physicochemical properties and chemical structures of the isotrienomycin A and trienomycin A of the present invention purified as described above are as follows.
1. 이소트리에노마이신 A(화학식 1)1.Isotrienomycin A ( Formula 1 )
1) 물질의 성상 : 흰색 분말, 2) 분자량 : 622,1) Property of substance: White powder, 2) Molecular weight: 622,
3) 분자식 : C36H50N2O7, 3) Molecular formula: C 36 H 50 N 2 O 7,
4) 자외선흡수스펙트럼 [UVλmaxnm(logε)] : 250(4.16), 262 (4.17), 271 (4.24), 283(4.13),4) UV absorption spectrum [UVλ max nm (logε)]: 250 (4.16), 262 (4.17), 271 (4.24), 283 (4.13),
5) 적외선 흡수스펙트럼[IR(KBr)υ cm-1] : 3312, 2927, 1730, 1654, 1549, 1449, 1096,5) Infrared absorption spectrum [IR (KBr) υ cm -1 ]: 3312, 2927, 1730, 1654, 1549, 1449, 1096,
6) 핵자기 공명(NMR) 흡수스펙트럼 : 클로로포름 (CDCl3)을 용매로 하고 테트라메칠실란(TMS)을 표준물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 및 탄소 핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼은도 1에 나타내었다.6) NMR absorption spectra: Hydrogen magnetic resonance ( 1 H-NMR) and carbon nuclear magnetic resonance ( 13 H-NMR) measured using chloroform (CDCl 3 ) as a solvent and tetramethylsilane (TMS) as standard. C-NMR) spectrum is shown in FIG. 1 .
2. 트리에노마이신 A(화학식 2)2. Trienomycin A ( Formula 2 )
1) 물질의 성상 : 흰색 분말, 2) 분자량 : 6221) Property: White Powder, 2) Molecular Weight: 622
3) 분자식 : C36H50N2O7, 3) Molecular formula: C 36 H 50 N 2 O 7,
4) 자외선흡수스펙트럼 [UVλmaxnm(logε)] : 250(4.16), 262 (4.17), 271 (4.24), 283(4.13),4) UV absorption spectrum [UVλ max nm (logε)]: 250 (4.16), 262 (4.17), 271 (4.24), 283 (4.13),
5) 적외선 흡수스펙트럼[IR(KBr)υ cm-1] : 3312, 2927, 1730, 1654, 1549, 1449, 1096,5) Infrared absorption spectrum [IR (KBr) υ cm -1 ]: 3312, 2927, 1730, 1654, 1549, 1449, 1096,
6) 핵자기 공명 흡수스펙트럼 : 클로로포름(CDCl3)을 용매로 하고, 테트라메칠실란(TMS)을 표준물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 및 탄소 핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼은도 2에 나타내었다.6) Nuclear magnetic resonance absorption spectra: Hydrogen magnetic resonance ( 1 H-NMR) and carbon nuclear magnetic resonance ( 13 C-) measured using chloroform (CDCl 3 ) as a solvent and tetramethylsilane (TMS) as a standard. NMR) spectrum is shown in FIG. 2 .
본 발명은 상기의 이화학적 특성을 갖는 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A는 물론 이들의 무기 또는 유기염, 에스테르, 수화물 및 용매화물과 이성질체를 포함한 모든 유도체까지도 포함한다.The present invention encompasses isotrienomycin A and trienomycin A having the above physicochemical properties as well as all derivatives thereof including inorganic or organic salts, esters, hydrates and solvates and isomers thereof.
또한, 본 발명은 상기 안사마이신 계 유도체를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 91614를 제공한다.The present invention also provides a novel Streptomyces 91614 to produce the ansamycin derivatives.
본 발명에서는 토양으로부터 분리한 균주들에 대하여 활성형 마이크로글리아 세포를 이용하여 일산화질소 생성 저해활성 물질을 스크리닝하는 과정에서 일산화질소 생성 저해활성을 신규한 안사마이신 계 물질을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 균주를 분리하였다.In the present invention, a novel streptomycin producing novel ansamycin-based substances having a nitric oxide production inhibitory activity in the process of screening nitric oxide production inhibitory active substances using active microglia cells against strains isolated from soil. Seth strains were isolated.
상기 안사마이신 계 물질을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 균주는 아이·에스·피(ISP, International Streptomyces Project) 규정에 따라 28℃에서 14일간 배양한 후 형태적 특성을 조사한 결과, 포자의 연쇄상은 곡선형태(retinacultiaperti) 또는 나선(spiral) 형태의 전형적인 스트렙토마이세스 형태를 나타내었다. 상기 균주의 포자는 보통 50개 정도의 연쇄상으로 되어 있었고, 기균사의 색상은 대부분의 배지에서 회색이었으며 배지 뒷면의 색상은 엷은 노란색을 나타내었고 수용성 색소는 모든 배지에서 무색을 나타내었다. 상기 균주의 균체 세포벽 성분을 벡커의 방법(B. Becker et al.,Applied Microbiology,1964, 12,421-423)에 의해 조사한 결과 본 균주의 균체 가수분해 성분인 디아미노피멜린산(diaminopimellic acid)은 L(levorotatory).L(levorotatory)형 이었다.The novel Streptomyces strain producing the anzamycin-based material was cultured at 28 ° C. for 14 days according to the International Streptomyces Project (ISP) regulations, and then examined the morphological characteristics. Typical streptomyces morphology, either in retinacultiaperti or spiral form, is shown. The spores of the strain were usually about 50 chains, the color of the mycelia was gray in most of the medium, the color of the back side of the medium was pale yellow, and the water-soluble pigment was colorless in all the medium. The bacterial cell wall component of the strain was investigated by Becker's method (B. Becker et al., Applied Microbiology, 1964, 12,421-423), and the amino acid hydrolysis component diaminopimellic acid (diaminopimellic acid) of the strain was L. (levorotatory). L (levorotatory) type.
상기와 같이 형태학적, 배양학적 특성을 분석한 결과, 상기 균주를 스트렙토마이세스 속 균주로 동정하였고 이를 스트렙토마이세스 91614(Streptomycessp. 91614)로 명명하였다. 본 발명자들은 상기 균주를 2001년 12월 6일자로 한국생명공학연구원 유전자원센터에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10133BP).As a result of analyzing the morphological and culture characteristics as described above, the strain was identified as the strain of the genus Streptomyces and named it Streptomyces 91614 ( Streptomyces sp. 91614). The present inventors deposited the strain at the Genetic Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, December 6, 2001 (Accession No .: KCTC 10133BP).
또한, 본 발명은 상기 균주의 배양액으로부터 신규한 안사마이신 계 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a novel ansamycin derivative from the culture of the strain.
본 발명의 제조방법은The manufacturing method of the present invention
1) 스트렙토마이세스 91614 또는 그의 돌연변이주를 배양하는 단계;1) culturing Streptomyces 91614 or a mutant thereof;
2) 상기 단계 1의 균체 또는 배양액을 유기용매로 추출한 후 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세테이트 추출물을 얻는 단계;2) extracting the cells or culture medium of step 1 with an organic solvent and then extracting with ethyl acetate to obtain an ethyl acetate extract;
3) 상기 단계 2의 에틸아세테이트 추출물을 농축하고 소량의 혼합용매에 용해시킨 후 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 농축하여 농축액을 얻는 단계;3) concentrating the ethyl acetate extract of step 2, dissolving it in a small amount of mixed solvent and performing chromatography to concentrate the active fraction to obtain a concentrate;
4) 상기 단계 3의 농축액을 메탄올에 용해시킨 후 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 모으는 단계; 및4) collecting the active fraction by dissolving the concentrate of step 3 in methanol and performing chromatography; And
5) 상기 활성분획을 크로마토그래피로 분리하고 용매를 감압건조기로 제거한 후 냉동건조하여 목적 화합물을 얻는 단계로 구성된다.5) The active fraction is separated by chromatography, the solvent is removed with a reduced pressure dryer, and freeze-dried to obtain the target compound.
상기 단계 1을 구체적으로 설명하면, 곰팡이의 제반성질은 일정한 것이 아니라 자연적으로 혹은 인공적으로 용이하게 변화되는 것이 일반적인 성질이며, 본 발명의 스트렙토마이세스 91614 균주도 그 성상이 변화하기 쉽다. 따라서, 상기의 균주는 스트렙토마이세스 91614는 물론, 상기 균주에서 유래하는 돌연변이주(자연돌연변이 또는 인공돌연변이주), 형질접합체 또는 유전공학적인 방법에 의해 새롭게 만들어진 균주도 포함한다.Referring to step 1 in detail, the general properties of the mold is not a constant, it is a general property that is easily changed naturally or artificially, the Streptomyces 91614 strain of the present invention is also easy to change its properties. Thus, the above strains include Streptomyces 91614, as well as strains newly generated by mutant strains (natural or mutagenic strains) derived from the strains, conjugates or genetic engineering methods.
상기 스트렙토마이세스 91614 균주의 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양한다. 영양원으로는 종래 방선균의 배양에 이용되고 있는 공지의 영양원을 사용한다. 예를 들면 탄소원으로서는 글루코스, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유, 식물유 등을 사용할 수 있으며, 질소원으로서는 밀기울, 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 효모추출물, 황산암모니움, 질산소다, 요소 등을 사용할 수 있다. 필요에 따라서는, 식염, 칼륨, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온생성을 촉진하는 무기염류를 첨가하면 매우 효과적이다. 또한, 균의 생육을 촉진하며 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A 물질의 생산을 촉진시키기 위하여, 유기물 및 무기물을 적당히 첨가하면 효과가 있다. 배양 방법으로는 호기적 조건에서는 진탕배양 혹은 통기교반 배양하는 것이 좋다. 배양온도는 상기의 각 조건들에서 배양할 경우 조건에 따라 약간씩 상이하기는 하나 보통 20-37℃에서 배양하는 것이 적당하며, 대부분의 경우에는 26-30℃에서 배양한다. 또한, 배양기간은 진탕배양, 탱크배양의 경우 모두 통상 4 일 내지 7일간 배양할 때 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A물질의 생산이 최고에 달하였다.Culture of the Streptomyces 91614 strain is cultured in a medium containing nutrients that can be used by conventional microorganisms. As a nutrient source, the well-known nutrient source conventionally used for the culturing of actinomycetes is used. For example, as a carbon source, glucose, starch syrup, dextrin, starch, molasses, animal oil, vegetable oil, etc. may be used, and as nitrogen sources, bran, soybean meal, wheat, malt, cottonseed gourd, fishmeal, corn stew ricker, gravy, yeast extract, sulfuric acid Ammonium, sodium nitrate, urea and the like can be used. If desired, it is very effective to add salts, potassium, magnesium, cobalt, chlorine, phosphoric acid, sulfuric acid and other inorganic salts that promote ion generation. In addition, in order to promote the growth of bacteria and to promote the production of isotrienomycin A and trienomycin A substances, it is effective to add an organic substance and an inorganic substance appropriately. As a cultivation method, it is preferable to carry out shaking culture or aeration stirring under aerobic conditions. The culture temperature is slightly different depending on the conditions when incubated in each of the above conditions, but it is usually appropriate to incubate at 20-37 ℃, in most cases it is incubated at 26-30 ℃. In addition, in the culture period of the shaking culture and tank culture, the production of isotrienomycin A and trienomycin A material reached the highest when cultured for 4 days to 7 days.
상기 단계 2를 구체적으로 설명하면, 상기에서 기술한 바와 같은 조건으로 배양하면 안사마이신 계 물질을 얻을 수 있는데, 본 물질은 배양액 뿐만 아니라 균체 부분에도 존재하므로 다음의 방법에 따라 효율적으로 추출, 정제를 실시할 수 있다. 즉, 배양액 및 균사체에 아세톤등의 유기용매를 가하여 교반하여 균체로부터도 유효성분을 추출한후 아세톤을 증발시키고 에틸아세테이트로 추출한다.Specifically, the step 2, when cultured under the conditions described above can be obtained ansamycin-based material, this material is present not only in the culture medium but also the cell part, so that the extraction and purification efficiently according to the following method It can be carried out. That is, an organic solvent such as acetone is added to the culture solution and the mycelium, followed by stirring to extract the active ingredient from the cell, and then the acetone is evaporated and extracted with ethyl acetate.
상기 단계 3을 구체적으로 설명하면, 상기 단계 2의 에틸아세테이트 추출물을 농축하고 클로로포름:메탄올를 50:1-10:1인 용매를 사용한 실리카젤 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 상기 과정에서 얻은 활성분획을 농축한다.Specifically, step 3, the ethyl acetate extract of step 2 is concentrated, chloroform: methanol is performed silica gel column chromatography using a solvent of 50: 1-10: 1 and the active fraction obtained in the process is concentrated. .
상기 단계 4를 구체적으로 설명하면, 상기 단계 3의 농축액을 메탄올을 용매로 한 세파덱스 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 모은다.Referring to step 4 specifically, the concentrate of step 3 is subjected to Sephadex column chromatography using methanol as a solvent to collect the active fractions.
상기 단계 5를 구체적으로 설명하면, 상기 단계 4의 활성분획을 물-아세토나이트릴 용출 용매를 이용하는 고압액체 크로마토그래피(high pressure liquid chromatography)로 활성분획을 분리하여 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물을 얻는다.Specifically, step 5, the active fraction of step 4 is separated by the active fraction by high pressure liquid chromatography (high pressure liquid chromatography) using a water-acetonitrile eluting solvent compound represented by the formula (2) or (3) Get
또한, 본 발명은 상기 안사마이신 계 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성 저해제를 제공한다.In addition, the present invention provides a nitrogen monoxide production inhibitor containing the ansamycin derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
상기에서 안사마이신 계 유도체는화학식 1로 표시되는 이소트리에노마이신 A 또는화학식 2로 표시되는 트리에노마이신 A이다.Ansamycin derivatives are isotrienomycin A represented by the formula (1 ) or trienomycin A represented by the formula (2 ).
본 발명의화학식 1및화학식 2으로 표시되는 화합의 일산화 질소 생성에 대한 저해활성은 면역자극제(immustimulant)로서 LPS(lipopolysaccharide)를 마이크로글리아 세포주에 처리하여 생성된 일산화 질소를 측정하여 조사해 보면, 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A는 LPS에 의해 활성화된 세포가 생성하는 아질산염(nitrite)의 생성을 농도 의존적으로 저해하고, 50%의 저해활성을 나타낸는 유효농도(IC50)는 0.29 및 0.025 uM이었다. 한편, 이소트리에노 마이신 A 및 트리에노마이신 A는 세포 생존력에 대한 영향을 조사한 결과 50% 생존력 저해활성을 나타내는 유효농도(IC50)는 각각 6.2 및 1.2 uM로 나타났다. 따라서 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A의 일산화질소 생성 저해활성은 세포 독성에 의한 것이 아닌 것을 나타낸다.Inhibitory activity of the compounds represented by the formulas (1) and (2 ) on the nitrogen monoxide production was determined by measuring nitrogen monoxide produced by treating LPS (lipopolysaccharide) as a microglia cell line as an immunostimulant. Trienomycin A and trienomycin A concentration-dependently inhibited the production of nitrite produced by cells activated by LPS, and an effective concentration (IC 50 ) showing an inhibitory activity of 50% was 0.29 and 0.025 uM. On the other hand, isotrienomycin A and trienomycin A were examined for the effect on cell viability, the effective concentration (IC 50 ) showing 50% viability inhibitory activity was 6.2 and 1.2 uM, respectively. Therefore, the nitric oxide production inhibitory activity of isotrienomycin A and trienomycin A indicates that it is not due to cytotoxicity.
본 발명의 일산화질소 생성 저해제는화학식 1로 표시되는 이소트리에노마이신 A 또는화학식 2로 표시되는 트리에노마이신 또는 그들의 염을 유효성분으로 함유한다. 상기 유도체는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 상기 유도체는 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 혼합 생약재 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.The nitrogen monoxide production inhibitor of the present invention contains isotrienomycin A represented by the formula (1 ) or trienomycin represented by the formula (2 ) or salts thereof as an active ingredient. The derivative may be administered orally or parenterally during clinical administration and may be used in the form of a general pharmaceutical formulation. That is, the derivative may be administered in various oral and parenteral dosage forms in actual clinical administration, and when formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, humectants, disintegrating agents, and surfactants are commonly used. It is prepared by. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules and capsules, and the like, which may be used in mixed herbal extracts, including at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose and gelatin, and the like. Are mixed to prepare. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions and syrups, and may include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. have. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories. As the non-aqueous solvent and the suspension solvent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerol and gelatin may be used.
상기 유도체의 유효용량은 0.005 내지 0.05 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 0.01내지 0.03 mg/kg이며, 하루 1-6 회 투여될 수 있다.An effective dose of the derivative is 0.005 to 0.05 mg / kg, preferably 0.01 to 0.03 mg / kg, and may be administered 1-6 times a day.
본 발명의 이소트리에노마이신 A 또는 트리에노마이신 A 유도체를 랫트에 경구 투여, 복강 내 투여시 및 피하 주사시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD50)은 적어도 5 mg/kg 이상인 안전한 물질로 판명되었다.Toxicity of the isotrienomycin A or trienomycin A derivative of the present invention to rats by oral administration, intraperitoneal administration, and subcutaneous injection was determined by 50% lethal dose (LD 50). ) Has been found to be a safe substance that is at least 5 mg / kg or more.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1> 스트렙토마이세스 91614 균주의 분리Example 1 Isolation of Streptomyces 91614 Strain
본 발명자들은 일산화질소 생성 저해활성을 갖는 물질을 생산하는 균주를 스크리닝하기 위하여, 전국 토양으로부터 곰팡이를 분리한 후 활성형 마이크로글리아 세포를 이용하여 일산화질소 생성 저해활성을 갖는 신규한 스트렙토마이세스 균주를 분리하였다.In order to screen a strain producing a substance having a nitrogen monoxide production inhibitory activity, the present inventors isolated a fungus from soils nationwide, and then a novel Streptomyces strain having a nitrogen monoxide production inhibitory activity using active microglia cells. Was separated.
본 발명자들은 상기에서 분리한 일산화질소 생성 저해활성을 갖는 균주를 아이·에스·피(ISP, International Streptomyces Project)규정에 따라 28℃에서 14일간 배양한 후 형태적 특성을 조사하였다.The present inventors investigated the morphological characteristics of the isolated strain having a nitrogen monoxide production inhibitory activity after incubation at 28 ℃ for 14 days in accordance with the International Streptomyces Project (ISP).
그 결과, 포자의 연쇄상은 곡선형태(retinacultiaperti) 또는 나선형 형태의 전형적인 스트렙토마이세스 형태를 나타내었다. 기균사의 생육은 양호하였으며, 착생 포자의 형성정도도 매우 풍부하였다. 상기 균주의 포자는 보통 50개 정도의 연쇄상으로 되어있었고, 생육정도는 양호하였으며, 기균사의 색상은 대부분의 배지에서 회색이었으며 배지 뒷면의 색상은 엷은 노란색을 나타내었고 수용성색소는 모든 배지에서 무색을 나타내었다. 상기 균주의 균체 세포벽 성분을 벡커의 방법(B. Becker et al.,Applied Microbiology, 1964, 12:421-423)에 의해 조사한 결과 본 균주의 균체 가수분해 성분인 디아미노피멜린산(diaminopimellic acid)은 L.L 형 이었다.As a result, the chain of spores showed a typical Streptomyces morphology in a retinacultiaperti or spiral form. The mycelial growth was good and the formation of engraftment spores was also very rich. The spores of the strain were usually about 50 chains, the growth was good, the color of the mycelia was gray in most of the medium, the color of the back of the medium was pale yellow, and the water-soluble pigment was colorless in all the medium. Indicated. The cell wall component of the strain was investigated by Becker's method (B. Becker et al., Applied Microbiology , 1964, 12: 421-423), and the amino acid hydrolysis component of the strain was diaminopimellic acid. Was LL type.
상기와 같이 형태학적, 배양학적 특성을 분석한 결과, 본 발명자들은 상기 균주를 스트렙토마이세스 속으로 동정하였고, 이를 스트렙토마이세스 91614(Streptomycessp. 91614)로 명명하였다. 본 발명자들은 상기 균주를 2001년 12월 6일자로 한국생명공학연구원 유전자원센터에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10133BP).As a result of analyzing the morphological and culture characteristics as described above, the present inventors identified the strain as Streptomyces genus, named it as Streptomyces sp. 91614. The present inventors deposited the strain to the Genetic Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on December 6, 2001 (Accession No .: KCTC 10133BP).
<실시예 2> 스트렙토마이세스 91614 균주로부터 일산화질소 생성 저해물질의 분리 및 정제Example 2 Isolation and Purification of Nitric Oxide Production Inhibitors from Streptomyces 91614 Strain
<2-1> 스트렙토마이세스 91614 균주의 배양<2-1> Culture of Streptomyces 91614 Strain
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 스트렙토마이세스 91614 균주를 이용하여 일산화질소 생성 저해물질을 분리하기 위하여, 우선 상기 균주를 배양하였다. 상기 균주를 배양하기 위하여, 종 배지 및 생산배지로는 가용성 전분 1%, 글루코스 2%., 대두박 2.5% 육즙 0.1% 효모추출액 0.4% 소금 0.2% 인산 제 2 칼리 극소량을 함유한 배지를 멸균전에 pH를 7.3 으로 조절한 후 사용하여 배양하였다.The present inventors first cultured the strain in order to isolate the nitrogen monoxide production inhibitor using the Streptomyces 91614 strain isolated in Example 1. In order to culture the strain, the seed medium and the production medium include 1% of soluble starch, 2% of glucose, soybean meal 2.5% juicy 0.1% yeast extract 0.4% salt 0.2% 2nd Kali Phosphate medium before sterilization Was adjusted to 7.3 and then cultured using.
상기의 종배지 20 ㎖가 담긴 100 ㎖ 용량의 삼각 플라스크를 121℃에서 20분간 멸균한 후 스트렙토마이세스 91614 균주의 사면배양 시험관으로부터 1 백금이를 접종하여 28℃에서 3 일간 진탕배양하여 이것을 1차 종배양액으로 사용하였다. 그런 다음에 멸균된 종배지 100 ㎖가 들어 있는 500 ㎖ 용량의 삼각플라스크에 상기 1 차 종배양액 5 ㎖를 접종하여 28℃에서 3일간 배양하여서 이것을 2차 종배양액으로 하였다. 이어서, 18 ℓ의 생산배지가 들어있는 30 ℓ용량의 발효조를 미리 멸균시킨 후 제 2차 종배양액 800 ㎖를 접종하여 28℃ 에서 7일간 배양하였다. 이때 배양조건으로는 통기 18 ℓ/분, 각반은 초기 200 rpm, 후기 300 rpm 으로 하였다.The 100 ml Erlenmeyer flask containing 20 ml of the above seed medium was sterilized at 121 ° C. for 20 minutes, inoculated with platinum from a slope-cultivation test tube of Streptomyces 91614 strain, and shaken at 28 ° C. for 3 days to inoculate it. Used as a seed culture solution. Then, 5 ml of the primary seed culture solution was inoculated into a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of sterilized seed medium and incubated at 28 ° C. for 3 days to obtain a secondary seed culture solution. Subsequently, the 30 L fermentation tank containing 18 L of the production medium was sterilized in advance, and then 800 ml of the secondary seed culture solution was inoculated and incubated at 28 ° C. for 7 days. At this time, the culture conditions were aeration 18 L / min, gaiters were set to the initial 200 rpm, later 300 rpm.
<2-2> 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A의 분리 및 정제<2-2> Isolation and Purification of Isotrienomycin A and Trienomycin A
본 발명자들은 상기의 실시예 <2-1>에서 배양한 배양액 5 ℓ에 5 ℓ 아세톤를 가하여 교반하여 균체로부터도 유효성분을 추출한 후 아세톤을 증발시키고 1 ℓ의 에틸아세테이트로 3번 용매 추출하였다. 상기에서 얻어진 유효성분을 함유하고 있는 에틸아세테이트 용매를 감압농축하여 에틸아세테이트를 제거한 후 클로로포름:메탄올를 15:1인 용매를 사용한 전개용매로 하여 실리카젤 컬럼크로마토그래피를 실시하였다. 상기에서 얻어진 활성분획으로부터 감압농축하여 오일성 조유효성분을 얻은 뒤 메탄올을 용매로 한 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피에서 정제하였고, 재차 아세토나이트닐:물 = 60:40인 용매조건에서 고압액체 크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 순수한 활성분획 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A를 얻었다.The present inventors 5 L acetone was added to 5 L of the culture medium cultured in Example <2-1> and stirred to extract the active ingredient from the cells, and then acetone was evaporated and solvent extracted three times with 1 L of ethyl acetate. The ethyl acetate solvent containing the active ingredient obtained above was concentrated under reduced pressure to remove ethyl acetate, and then silica gel column chromatography was performed using chloroform: methanol as a developing solvent using a solvent of 15: 1. Concentrated under reduced pressure from the active fraction obtained above to obtain an oily crude active ingredient, and purified by Sephadex LH-20 column chromatography using methanol as a solvent, high-pressure liquid chromatography under acetonitrile: water = 60: 40 solvent conditions again Photography (HPLC) was carried out to obtain pure active fractions isotrienomycin A and trienomycin A.
<실시예 3> 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A의 이화학적 성질 분석Example 3 Analysis of Physicochemical Properties of Isotrienomycin A and Trienomycin A
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 얻어진 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A의 이화학적 특성을 분석하기 위하여, 수소 핵자기 공명 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 등의 방법을 이용하였다. 수소 핵자기 공명 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼은 클로로포름을 용매로하여 600MHz 및 125 MHz에서 각각 측정하였다.The present inventors used methods such as hydrogen nuclear magnetic resonance and carbon nuclear magnetic resonance spectra to analyze the physicochemical characteristics of isotrienomycin A and trienomycin A obtained in Example 2. Hydrogen nuclear magnetic resonance and carbon nuclear magnetic resonance spectra were measured at 600 MHz and 125 MHz, respectively, using chloroform as a solvent.
그 결과,화학식 1로 표시되는 이소트리에노마이신 A의 물질성상은 흰색 분말이고, 분자량은 622이며, 분자식은 C36H50N2O7로 확인되었다. 상기 이소트리에노마이신 A의 자외선흡수스펙트럼 [UVλmaxnm(logε)]은 250(4.16), 262 (4.17), 271 (4.24), 283(4.13)이었고, 적외선 흡수스펙트럼[IR(KBr)υ cm-1] : 3312, 2927, 1730, 1654, 1549, 1449, 1096이었다. 또한, 클로로포름 (CDCl3)을 용매로 하고 테트라메칠실란(TMS)을 표준물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 및 탄소 핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼은도 1에 나타내었다.As a result, the physical property of the isotrienomycin A represented by the general formula (1 ) is white powder, the molecular weight is 622, the molecular formula was confirmed as C 36 H 50 N 2 O 7 . UV absorption spectrum [UVλ max nm (logε)] of the isotrienomycin A was 250 (4.16), 262 (4.17), 271 (4.24), 283 (4.13), and infrared absorption spectrum [IR (KBr) υ cm −1 ]: 3312, 2927, 1730, 1654, 1549, 1449, 1096. In addition, hydrogen nuclear magnetic resonance ( 1 H-NMR) and carbon nuclear magnetic resonance ( 13 C-NMR) spectra measured using chloroform (CDCl 3 ) as a solvent and tetramethylsilane (TMS) as a reference material are shown in FIG. 1 . Indicated.
또한, 화학식 2로 표시되는 트리에노마이신 A의 물질성상은 흰색분말이고, 분자량은 622이고, 분자식은 C36H50N2O7로 확인되었다. 상기 트리에노마이신 A의 자외선흡수스펙트럼 [UVλmaxnm(logε)]은 250(4.16), 262 (4.17), 271 (4.24), 283(4.13)이고, 적외선 흡수스펙트럼[IR(KBr)υ cm-1] : 3312, 2927, 1730, 1654, 1549, 1449, 1096이었다. 또한, 클로로포름을 용매로 하고, 테트라메칠실란을 표준물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 및 탄소 핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼은도 2에 나타내었다.In addition, the material phase of the trienomycin A represented by the formula (2) is a white powder, the molecular weight is 622, the molecular formula was confirmed as C 36 H 50 N 2 O 7 . The UV absorption spectrum [UVλ max nm (logε)] of the trienomycin A is 250 (4.16), 262 (4.17), 271 (4.24), 283 (4.13), and infrared absorption spectrum [IR (KBr) υ cm -1 ]: 3312, 2927, 1730, 1654, 1549, 1449, 1096. Also, hydrogen nuclear magnetic resonance ( 1 H-NMR) and carbon nuclear magnetic resonance ( 13 C-NMR) spectra measured using chloroform as a solvent and tetramethylsilane as a reference material are shown in FIG. 2 .
<실험예 1> 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A의 일산화질소 생성 저해 분석Experimental Example 1 Analysis of Nitric Oxide Production Inhibition of Isotrienomycin A and Trienomycin A
본 발명자들은 상기에서 분리한 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A의 일산화질소 생성 저해활성을 알아보기 위하여, 면역자극제(immunostimulant)로서 LPS를 마이크로글리아 세포주인 BV-2세포에 처리하여 생성된 일산화질소를 측정하였다. 일산화질소의 생성은 배지에 축적된 일산화질소의 안정된 형태인 아질산염(nitrite)을 그리스(Griess) 방법을 사용하여 측정하였다(Anal Chem126:131-138, 1982).The present inventors treated LPS as an immunostimulant to BV-2 cells, a microglia cell line, in order to investigate the nitric oxide production inhibitory activity of isotrienomycin A and trienomycin A isolated above. The produced nitrogen monoxide was measured. Nitrogen monoxide production was measured using the Gries method, nitrite, a stable form of nitrogen monoxide accumulated in the medium ( Anal Chem 126: 131-138, 1982).
그 결과, 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A는 LPS에 의해 활성화된 BV-2세포가 생성하는 아질산염의 생성을 농도 의존적으로 저해하였으며, 50%의 저해활성을 나타내는 농도는(IC50) 각각 0.29 uM, 0.025 uM 이었다. 한편, 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A물질은 세포 생존력에 대한 영향을 조사한 결과, 50%의 생존력 저해활성을 나타내는 농도는(IC50) 각각 6.2 uM, 1.2 uM로 나타났다. 따라서 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A물질의 일산화 질소 생성 저해활성은 세포 독성에 의한 것이 아닌 것으로 나타났다(도 3및도 4).As a result, isotrienomycin A and trienomycin A inhibited the production of nitrite produced by BV-2 cells activated by LPS in a concentration-dependent manner, and the concentration showing 50% inhibitory activity (IC 50 ) Were 0.29 uM and 0.025 uM, respectively. On the other hand, isotrienomycin A and trienomycin A were examined for the effect on cell viability, and the concentrations showing 50% viability inhibitory activity (IC 50 ) were 6.2 uM and 1.2 uM, respectively. Therefore, it was shown that the nitric oxide production inhibitory activity of isotrienomycin A and trienomycin A was not due to cytotoxicity ( FIGS. 3 and 4 ).
<실험예 2> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험Experimental Example 2 Oral Acute Toxicity in Rats
6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 이소트리에노마이신 A 또는 트리에노마이신 A를 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/㎏/㎖의 용량으로 1회 단회 경구투여 하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.Acute toxicity test was performed using 6-week-old specific pathogen-free (SPF) SD rats. Two animals per group were subjected to single oral administration of isotrienomycin A or trienomycin A of the present invention in 0.5% methylcellulose solution, respectively, at a dose of 1 g / kg / ml. After administration of the test substance, mortality, clinical symptoms, and changes in body weight were observed. Hematological and hematological examinations were performed. Necropsy was performed to observe abdominal and thoracic organ abnormalities.
그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 이소트리에노마이신 A 및 트리에노마이신 A는 모두 랫트에서 2 mg/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않으며 경구투여 최소치사량(LD50)은 5 mg/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.As a result, no significant clinical symptoms or dead animals were noted in all animals treated with the test substance, and no toxic changes were observed in weight changes, blood tests, blood biochemical tests, and autopsy findings. As a result, both isotrienomycin A and trienomycin A of the present invention do not show toxicological changes in rats up to 2 mg / kg, and oral administration minimum dose (LD 50 ) is determined to be a safe substance of 5 mg / kg or more. It became.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신규한 안사마이신 계 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성 저해제는 세포독성 없이 일산화질소 생성을 저해함으로써 염증 관련질환, 퇴행성 신경질환 및 자가면역 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.As described above, the nitric oxide production inhibitor containing the novel ansamycin derivative of the present invention and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient inhibits nitric oxide production without cytotoxicity, thereby causing inflammation-related and degenerative neurological diseases. And the treatment of autoimmune diseases.
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