KR20030054809A - 생물분자 고정화 조성물, 바이오칩 고정화층의 제조방법및 상기 고정화층을 포함하는 바이오칩 - Google Patents

생물분자 고정화 조성물, 바이오칩 고정화층의 제조방법및 상기 고정화층을 포함하는 바이오칩 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아미노알켄 또는 아미노알킨 화합물을 포함하는 생물분자 고정화 조성물, 이를 이용한 표면 고정화층의 제조방법 및 표면 고정화층을 포함하는 바이오칩에 관한 것이다. 본 발명의 생물분자 고정화 조성물은 열안정성 및 약품 안정성이 우수하며, 재현성 높은 균일한 관능기 밀도를 가지며, 균일한 고정화층을 짧은 시간에 형성할 수 있으며, 상기 고정화층을 포함하는 바이오칩을 제공할 수 있다.

Description

생물분자 고정화 조성물, 바이오칩 고정화층의 제조방법 및 상기 고정화층을 포함하는 바이오칩{COMPOSITION FOR FIXING BIOMOLECULE, PREPARATION METHOD FOR FIXING LAYER WITH THE SAME, AND BIOCHIP CONTAINING THE FIXING LAYER}
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 생물분자 고정화 조성물, 이를 이용한 고정화층의 제조방법 및 상기 고정화층을 포함하는 바이오칩에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 열적 안정성, 약품 안정성이 우수하며 높은 관능기 밀도를 가지며 균일한 고정화층을 짧은 시간에 형성할 수 있게 하는 아미노알켄 또는 아미노알킨 화합물을 포함하는 생물분자 고정화 조성물, 이를 이용한 고정화층의 제조방법, 및 바이오칩에 관한 것이다.
[종래기술]
바이오칩은 생물에서 유래한 효소, 단백질, 항체, DNA, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포 및 기관, 신경세포 등과 같은 생체 유기물과 반도체나 유리와 같은 무기물을 조합하여 기존의 반도체칩 형태로 만든 혼성 소자(hybrid device)이다. 생체 분자의 고유한 기능을 이용하고, 생체의 기능을 모방함으로써 감염성 질병을 진단하거나 유전자를 분석하고, 새로운 정보 처리용 신기능 소자의 역할을할 수 있는 특징이 있다. 고집적도, 분자수준의 기능구현, 병렬처리 등의 특성으로 인해 현존 반도체 기능을 초월할 수 있는 잠재적 가능성과 함께 생물체처럼 생각하고 외부자극에 반응하는 바이오 컴퓨터의 핵심소자로서 주목받고 있다.
사용되는 생물분자와 시스템화 정도에 따라 DNA 탐침(probe)이 내장된 "DNA칩", 효소나 항체/항원, 박테리오로돕신(bacteriorhodopsin) 등과 같은 단백질이 사용된 "단백질칩", 미생물을 사용한 "세포칩", 신경세포를 직접 사용한 "뉴런칩(Neuron chip)" 등으로 구분될 수 있으며, 시료의 전처리, 생화학 반응, 검출, 자료해석 기능까지 소형 집적화 되어 자동 분석기능을 갖는 "실험실칩(lab on a chip)"과 같은 각종 생화학물질의 검출 및 분석기능을 할 수 있는 "바이오센서(biosensor)"를 포함하여 광범위하게 정의될 수 있다.
이러한 바이오칩을 개발하기 위해서는 생물분자와 실리콘과 같은 반도체 사이의 분자 인터페이스를 효율적으로 실현시키고 생물분자의 고유 기능을 최대한 활용할 수 있게 하는 것이 중요하다. 특히, DNA칩이나 단백질칩 등과 같은 바이오칩에서는 관련 생물분자를 마이크로미터 스케일의 제한된 영역에 고정화시키는 일이 무엇보다 중요하다. 고정화된 DNA칩의 경우, 그 만큼 유전정보를 해독할 수 있는 능력이 향상되기 때문이다. 생물분자의 고정화는 미세 구조의 바이오칩의 개발에 중요한 역할을 담당한다. 일반적으로 고정화는 마이크로 웰플레이트(microwell plate), 튜브, 구형 입자, 슬라이드 유리, 실리콘 웨이퍼, 다공성막 표면에서 일어난다. 기질 표면과 생물분자의 말단의 접촉을 개선하기 위하여 여러 가지 방법들이 제시되고 있다. 예를 들어 DNA를 카르보디이미드와 반응시켜 5'-포스페이트를활성화시키고, 활성화된 DNA를 기질 표면의 관능기와 반응시켜 고정화시키는 방법이 있다.
미국특허 제 5,858,653호에 생물분자와 작용하는 하나 이상의 이온 그룹, 예를 들어 4차 암모늄염, 수소화 3차 아민 또는 포스포늄(phosphonium)과 기질 표면과 반응시키기 위하여 열화학적 반응 그룹 또는 광반응성 그룹을 가지는 고분자로 구성된 조성물이 기재되어 있다. 미국특허 제 5,981,734호에서는 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 겔을 이용하여 DNA를 고정시킬 경우 폴리아크릴아미드 겔이 아미노 그룹이나 알데히드 그룹을 가지고 있어 DNA와 안정한 혼성화결합(hybridization)을 형성하여 분석이 용이하다고 기재되어 있다. 미국특허 제 5,869,272호에는 박테리아 항원을 찾아내는 방법으로, 덴드리머(dendrimer), 스타 폴리머(star polymer), 분자 자기정합막(molecular self-assembly polymer), 폴리실록산, 라텍스 등으로 구성되면 실리콘웨이퍼에 아미노실란을 스핀코팅한 고정화 층과 단백질 층의 광학적 활성표면의 광특성(색상) 변화로 분석하는 방법에 관하여 기재되어 있다. 미국특허 제5,919,523호에 아미노 실란 처리 기질에 글리신(glycine) 또는 세린(serine)으로 처리하거나 아민계, 이민계, 아마이드계 유기 고분자로 코팅한 고정화 층의 형성방법에 관하여 기재하고 있다. 미국특허 제5,985,551호에 아미노 그룹을 고체기판 위에 생성시키는 방법으로 아미노 실란 처리 후 광패턴화 방법에 의해 DNA를 고정화 시키는 부분은 친수성, 그 외의 부분은 불소화 실록산을 형성하여 소수성 표면을 형성하여 일정한 모양의 DNA 스폿(spot) 생성이 가능하게 하는 방법에 관하여 기재되어 있다.
상기 특허들은 아미노 실란의 분자 자기정합막을 형성하는 방법을 적용하여 기능성 박막을 제조하는 방법으로 실란 단분자층의 형성방법이 어느 정도 확립되긴 하였지만 열적 안정성, 약품 안정성이 미약하며 단분자층의 제조시간이 길고 균일하고 높은 관능기 밀도를 얻기가 어려우며 환경오염을 유발하는 문제점이 있다.
상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 열안정성 및 약품 안정성이 우수하며 높은 관능기 밀도를 가지며 균일한 고정화층을 짧은 시간에 형성할 수 있게 하는 생물분자 고정화 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또다른 목적은 아미노알켄 또는 아미노알킨 화합물을 포함하는 고정화 조성물로 바이오칩의 표면 고정화층을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적은 바이오칩 기질에 결합된 아미노화합물을 포함하는 바이오칩을 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 아미노알켄 화합물 또는 아미노알킨 화합물을 포함하는 생물분자 고정화 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 실리콘 웨이퍼 기질 표면에 수소말단을 형성하고, (b) 상기 수소 말단이 형성된 기질에 상기 생물분자 고정화 조성물을 도포하고 자외선을 조사하거나 20~150℃ 온도로 열처리하여 기질에 아미노화합물을 결합시키고, (c) 용매로 세척하는 단계를 포함하는 바이오칩의 기질 표면에 생물분자 고정화층을 형성하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 바이오칩 기질의 표면에 아미노알켄 화합물 또는 아미노알킨 화합물을 함유하는 표면 고정화층을 포함하는 바이오칩을 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명에서 "생물분자"라 함은 생물에서 유래되거나, 이와 동등한 것이나 생체외에서 제조된 것을 모두 포함하며, 예컨대 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA 등을 포함하는 의도이다. 더욱 바람직하게는 단백질, DNA, 및 RNA일 수 있으며, 여기서, 상기 DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함하는 의도이다.
본 발명에서 "바이오칩"이라 함은 생물에서 유래된 효소, 단백질, 항체, DNA, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포 등과 같은 생물분자와 반도체나 유리와 같은 무기물 기질을 조합하여 기존의 반도체칩 형태로 만든 소자를 말한다. 사용되는 생물분자와 시스템화 정도에 따라 DNA 탐침(probe)이 내장된 "DNA칩", 효소나 항체/항원, 박테리오로돕신(bacteriorhodopsin) 등과 같은 단백질이 사용된 "단백질칩", 미생물을 사용한 "세포칩", 신경세포를 직접 사용한 "뉴런칩(Neuron chip)" 등으로 구분될 수 있으며, 시료의 전처리, 생화학 반응, 검출, 자료해석 기능까지 소형 집적화 되어 자동 분석기능을 갖는 "실험실칩(lab on a chip)"과 같은 각종 생화학물질의 검출 및 분석기능을 할 수 있는 "바이오센서(biosensor)"를 포함하는 의도이며 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "표면 고정화층"이라 함은 바이오칩의 기질 표면에 상기 생물분자의 고정화를 위한 관능기를 포함하는 화합물층을 말한다.
본 발명에서는 생물분자를 고정화시키기 위한 표면 고정화층을 제조하기 위하여, 하기 화학식 1을 갖는 아미노알켄 화합물 또는 화학식 2의 아미노알킨 화합물을 포함하는 생물분자 고정화 조성물을 제공한다.
상기 식에서, n은 0 내지 20인 정수이며, 바람직하게는 n이 12 내지 20이다. 더욱 바람직하게는, 상기 아미노알켄 화합물은 하기 화학식 3을 갖는 12-아미노도데센(12-aminododecene)이다.
상기 아미노알켄 화합물과 아미노알킨 화합물은 탄소간 이중결합 또는 삼중결합이 깨어지면서 기질 표면과 반응한다. 생물분자 고정화 조성물에는 상기 아미노알켄 화합물이 0.1 중량% 이상 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 ~ 99.9 중량%으로 포함되며, 상기 함량은 본발명에 따른 소정의 효과 및 고정화 정도를 고려하여 결정된다.
본 발명의 바람직한 일예에서, 아미노알켄 화합물의 코팅성을 확보하기 위하여 아미노알켄 화합물을 포함하는 생물분자 고정화 조성물은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등과 같은 알콜류, 메틸 셀루솔브 등과 같은 셀루솔브류, 디메틸포름아미드, 아세톤, 톨루엔, 또는 이들의 화합물의 하나이상의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 아미노알켄 화합물 및 아미노알킨 화합물을 유기용매에 섞어 기질에 코팅함에 있어서 유기용매가 너무 적거나 많은 경우 코팅특성이 너무 두껍거나 얇아지는 등 코팅특성이 충분히 균일하게 나오지 않을 수 있으므로, 아미노알켄의 함량은 전체 고정화 조성물에 대해 99.9 중량% 내지 0.1 중량%가 바람직하다.
본 발명의 바람직한 일예에서, 아미노알켄 또는 아미노알킨 화합물을 포함하는 생물분자 고정화 조성물은 라디칼반응 개시제를 0.001~20 mol%, 바람직하게는 1 ~2 mol%로 추가로 포함할 수 있으며, 바람직한 라디칼반응 개시제는 아조비스이소부티로니트릴(Azobisisobutyronitrile) 또는 포타슘 퍼설페이트일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 아미노알켄 또는 아미노알킨 화합물을 포함하는 생물분자 고정화 조성물을 바이오칩의 기질의 바람직한 일례인 실리콘 웨이퍼와 하기 반응식 1과 같이 반응하여 표면 고정화층을 형성한다.
구체적으로, 바이오칩의 기질 말단에 수소가 처리된 실리콘 웨이퍼 표면에 아미노알켄 또는 아미노알킨 화합물을 라디칼 반응으로 바이오칩의 기질 표면에 생물분자 고정화층을 형성한다. 바람직하게는, 상기 바이오칩의 기질말단을 HF로 처리하여 수소말단이 노출된 기질을 제조할 수 있다.
이 때, 아미노알켄 또는 아미노알킨 화합물에 포함된 탄소사이의 다중결합을 UV나 열과 같은 외부 에너지에 의해 끊어주고 이를 실리콘 웨이퍼 표면 말단의 수소와 결합시켜 Si-C 결합을 형성시킨다. 이러한 Si-C 결합에 의해 생성된 박막은 생물분자의 고정화 과정에서 일어나는 다양한 화학적 열적 자극에 충분히 강하여 형성된 박막의 손상을 최소화하고 안정한 특성을 제공하는 장점이 있다. 실리콘 웨이퍼상의 다양한 기능성 그룹은 생물분자를 고정화시켜 원하는 특성의 바이오칩을 형성할 수 있다
상기 생물분자 고정화 조성물을 도포하는 방법으로는 디핑법, 스핀법, 스프레이법, 및 프린팅법 등 범용 코팅 방법 중에서 어느 하나의 방법을 사용하여도 무방하다.
본 발명의 일례에서, 아미노알켄 화합물의 알켄그룹의 C=C 결합, 아미노알킨 그룹의 알킨그룹 C≡C이 끊어져 라디칼을 형성하고 이를 이용하여 실리콘 웨이퍼위의 수소와 결합하는 것을 도와주도록 UV를 쬐어주거나 20~150℃ 온도로 열을 가할 수 있다.
또한 상기 Si-C결합을 형성하는 라디칼 중합반응을 위한 개시제, 예컨대 포타슘 퍼설페이트 또는 아조비스이소부티로니트릴등을 첨가하여 반응을 진행시킨다. 반응후에 결합이 일어나지 않은 불필요한 화합물을 세정함으로써, 균일한 고정화층을 형성시킨다.
또한, 본 발명은 바이오칩의 실리콘웨이퍼 기질 표면에 기질의 규소(Si)와 본 발명에 따른 화학식 1의 아미노알켄 화합물 또는 화학식 2의 아미노알킨 화합물이 결합된 고정화층을 포함하는 바이오칩기판 또는 바이오칩을 제공한다.
본 발명은 상기 아미노알켄 또는 아미노알킨 화합물의 표면 고정화층을 포함하는 바이오칩 기판위에 생물분자를 고정화층의 반응기와 반응시켜 고정화하고, 미반응 생물분자를 세정하여 패턴을 형성하는 단계를 수행하여 바이오칩을 제조할 수 있다. 바이오칩에 생물분자를 패턴화하는 방법은 포토리소그래피 (photolithography) 방법, 압전 인쇄(piezoelectric printing) 방법, 마이크로 피펫팅, 및 스폿팅(spotting) 등의 방식 중 어느 방법을 사용해도 무관하다.
바이오칩의 기질은 실리콘 웨이퍼, 유리나 폴리카보네이트, 폴리스티렌 또는 폴리우레탄과 같은 고분자 필름이 바람직하다.
생물분자와 공유결합이 가능한 반응성 1차 아민 그룹을 가진 고정화층의 아민 그룹의 농도는 이소시오시아네이트(isothiocynate) 또는 숙신이미드에테르(succinimide ether)등으로 활성화시킨 FITC(fluorescein isothiocynate), SCN-TMR(tetraethylrhodamine isothiocynate), SIE-TMR(tetramethylrhodamine succinimide)과 같은 염색물질을 고정화층에 라벨(label)화시켜 레이져 빔을 연속적으로 조사하여 염색물질에서 유발되는 빛을 분석하여 측정할 수도 있다.
본 발명의 일례로서 DNA칩을 제조하는 방법을 간략히 기술하면 고정화층이 처리된 기질 표면 위에 생물분자 즉 DNA칩에서는 올리고핵산을 반응시켜 고정화시키는 단계를 반복한다. 여기에 형광염색물질 등으로 라벨링(labeling)시킨 시료용액을 DNA칩에 결합(hybridization) 반응조건 하에서 1 ~ 24시간 정도 반응시킨 다음, 레이져 빔을 조사하여 발광되는 빛을 검출하여 신호 처리한다.
다음의 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일뿐 본 발명의 보호범위를 한정하는 의도는 아니다.
[실시예]
실시예 1
실리콘 웨이퍼를 아세톤과 메탄올에 담가 각각 5분간 초음파를 친 후, 꺼내어 과산화수소, 암모니아 및 물을 각각 중량비 1:1:4로 섞은 수조에 75℃를 유지하며 5분간 담가 두었다. 상기 웨이퍼를 꺼내어 2% 불산(Hydrofluoric Acid)에 담가 실리콘 웨이퍼 표면에 수소 말단이 형성되도록 하였다. 30g의 12-아미노도데센을 50mL의 메탄올에 섞어 3시간 동안 교반한 후, 1.5%의 아조비스이소부티로니트릴을섞어 생물분자 고정화 코팅액을 만들고, 여기에 세정된 실리콘 웨이퍼를 담군 후, 저압 수은 증기램프을 2시간동안 조사하였다. 이 때 전체 반응은 질소 분위기에서 진행시킨다. 반응이 끝난 실리콘 웨이퍼를 꺼내어 클로로포름과 메탄올에 각각 10분씩 초음파를 쳐서 불필요한 화합물을 표면에서 제거한 후 건조시켜 생물분자 고정화층을 제조하였다.
상기 제조된 고정화층을 갖는 기판을 100 ℃의 끓는 물에 1시간 동안 끓인후, FITC를 DMF(dimethylformamide)에 용해시켜 상기 코팅 기질에 라벨링하여 발광되는 빛을 검출하였다.
또한, 상기 FITC 염색된 기판을 레이저 스캐닝 결과(Laser Power : 80, Laser PMT gain : 80), 본 실시예의 기판의 강도(intensity)는 35,500이었다.
비교예 1
3-아미노프로필트리메톡시실란 0.1g을 톨루엔 9.9g에 혼합하여 고정화층 코팅 조성물을 제조하였다. 이 용액을 슬라이드 유리에 딥 코팅한 후 유리를 꺼내어 물과 아세톤으로 세정하였다. 이 유리를 120℃에서 60분간 건조시켜 생체물질 고정화층을 형성하였다. FITC를 DMF(dimethylformamide)에 용해시켜 상기 코팅 유리에 라벨링하여 발광되는 빛을 검출하였다.
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 코팅층의 발광강도는 다음과 같으며, FITC처리하여 아민의 농도를 비교함으로써 우월한 발광강도를 측정할 수 있었다. 본 발명의 생체물질 고정용 코팅 조성물의 관능기 밀도가 종래의 생체물질 고정용 코팅 조성물보다 높아짐을 알 수 있었다.
실시예 1:21,100 a.u.
비교예 1:13,200 a.u.
본 발명에 의하여 실리콘 웨이퍼 위에 형성된 생물분자 고정용 표면코팅박막은 Si-C 결합을 이용하여 아민그룹이 실리콘 웨이퍼 표면위에 균일하게 형성되어 있으므로, 바이오칩을 형성하는 과정에서 사용되는 각종 열과 약품에서도 막이 손상되지 않는 안정성을 확보하게 되며, 재현성이 높은 균일한 아미노 그룹 밀도를 가진다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1의 아미노알켄 화합물을 포함하는 실리콘 웨이퍼에 생물분자를 고정화시키기 위한 생물분자 고정화 조성물.
    [화학식 1]
    상기 식에서, n은 0 내지 20인 정수이다.
  2. 하기 화학식 2의 아미노알킨 화합물을 포함하는 실리콘 웨이퍼에 생물분자를 고정화시키기 위한 생물분자 고정화 조성물.
    [화학식 2]
    상기 식에서, n은 0 내지 20인 정수이다.
  3. 제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 n이 12 내지 20인 조성물.
  4. 제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 아미노 화합물을 0.1 ~ 99.9 중량%로 포함하는 조성물.
  5. 제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 조성물은 알콜류, 셀루솔브류, 디메틸포름아미드, 아세톤, 및 톨루엔으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 용매를 추가로 포함하는 조성물.
  6. 제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 조성물은 0.001 ~ 20 mol%의 라디칼반응 개시제를 추가로 포함하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 라디칼반응 개시제가 아조비스이소부트로니트릴 (Azobisisobutyronitrile), 또는 포타슘 퍼설페이트인 조성물.
  8. (a) 실리콘 웨이퍼 기질 표면에 수소말단을 형성하고,
    (b) 상기 수소 말단이 형성된 기질에 제 1항 또는 2항의 생물분자 고정화 조성물을 코팅하고 자외선을 조사하거나 20~150℃ 온도로 열처리하여 기질에 아미노화합물을 결합시키고,
    (c) 용매로 세척하는 단계를 포함하는 바이오칩의 기질 표면에 생물분자 고정화층을 형성하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 단계 b)의 생물분자 고정화 조성물에 아조비스이소부트로니트릴(Azobisisobutronitril), 또는 포타슘 퍼설페이트을 첨가하여 반응시키는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 조성물 코팅방법은 침적법, 스핀법, 스프레이법, 또는 프린팅법인 방법.
  11. 바이오칩의 실리콘웨이퍼 기질 표면에 기질의 Si와 제 1항 또는 2항에 따른 아미노화합물이 결합된 고정화층을 포함하는 바이오칩.
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