KR20030046810A - 콘드로이친 황산의 분해산물을 포함하는 관절염 예방 또는치료용 약학적 조성물 - Google Patents

콘드로이친 황산의 분해산물을 포함하는 관절염 예방 또는치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20030046810A
KR20030046810A KR1020010077071A KR20010077071A KR20030046810A KR 20030046810 A KR20030046810 A KR 20030046810A KR 1020010077071 A KR1020010077071 A KR 1020010077071A KR 20010077071 A KR20010077071 A KR 20010077071A KR 20030046810 A KR20030046810 A KR 20030046810A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
chondroitin sulfate
pharmaceutical composition
arthritis
chondroitin
preventing
Prior art date
Application number
KR1020010077071A
Other languages
English (en)
Inventor
김영식
조소연
정춘식
심준수
김동현
Original Assignee
은삼제약 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 은삼제약 주식회사 filed Critical 은삼제약 주식회사
Priority to KR1020010077071A priority Critical patent/KR20030046810A/ko
Publication of KR20030046810A publication Critical patent/KR20030046810A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/306—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on bone mass, e.g. osteoporosis prevention
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/50—Polysaccharides, gums
    • A23V2250/51—Polysaccharide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 콘드로이친 황산의 분해산물을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 콘드로이친 황산을 효소적 또는 화학적으로 분해하여 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당을 제조하는 방법, 상기 콘드로이친 황산의 분해산물을 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 관절염 유발시 생기는 부종이나 발적을 감소시킬 뿐 아니라, 류마티스성 관절염 발병시 증가하는 혈청 중 항 콜라겐 항체의 수치를 낮추고, 염증 반응의 주요 사이토카인인 TNF-α의 수치를 낮춤으로써 류마티스성 관절염의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

콘드로이친 황산의 분해산물을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for prevention or treatment of arthritis containing degraded chondroitin sulfate}
본 발명은 콘드로이친 황산의 분해산물을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 콘드로이친 황산을 효소적 또는 화학적으로 분해하여 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당을 제조하는 방법, 상기 콘드로이친 황산의 분해산물을 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan, 이하 "GAG" 라고 약칭함)은 생합성 과정에서 부분적인 변화를 통해 구조적으로 다양하고 복잡한 형태를 지니게 된다. GAG류의 기본적인 골격은 우론산(uronic acid)과 글루코사민(glucosamine)의 반복이면서 부분적으로 설페이트화가 이루어져 있는데, 이러한 복잡한 화학 구조에 의해 여러 종류의 생리 활성을 나타낼 수 있게 된다.
동물의 GAG류로는 히알우론산(hyaluronic acid), 콘드로이친 황산(chondroitin sulfate), 케라틴 황산(keratin sulfate), 헤파린 황산 (heparan sulfate), 헤파린(heparin) 등이 알려져 있다. 이들 GAG류는 주로 연결조직에 분포하며 헤파린은 예외적으로 간, 허파, 피부 점막내의 동맥에 있는 마스트(mast) 세포 내의 과립에 존재한다.
의약품으로 널리 사용되는 글리코사미노글리칸으로는 헤파린이 있으며, 헤파린은 항응고제로서 혈전 치료제, 수술후, 신장투석, 인공혈관 등에 혈전 생성의 예방 및 치료 목적으로 광범위하게 사용되고 있고 최근에 들어서는 부작용을 낮춘 저분자량의 헤파린이 동일한 목적으로 사용되고 있다. 또한, 콘드로이친 황산B인 더마탄 황산(dermatan sulfate)은 항혈전제로 임상 실험중에 있고, 히알우론산은 화장품의 첨가물로 많이 쓰이고 있다.
콘드로이친은 크게 세 종류로서, 황산기의 위치와 우론산의 종류에 따라서 콘드로이친 황산 A, 콘드로이친 황산 B, 콘드로이친 황산 C로 분류하고 있다. 콘드로이친 황산 A와 C는N-아세틸-D-갈락토사민과 D-글루쿠론산이 1,3결합과 1,4결합이 번갈아가며 연결된 2당(糖)류의 중합체이며, 2당당(糖當) 한 개의 황산 에스테르기를 갖는다. 콘드로이친 황산 B는 D-글루쿠론산 대신에 L-이두론산을 함유하고 있으며, 이들을 β-헤파린 또는 더마탄 황산이라고도 한다.
콘드로이친 황산은 연골, 피부, 혈관 및 뼈 등 많은 결합 조직에 존재한다. 콘드로이친 황산은 특히 관절의 연골 조직의 주요 구성 성분이며, 관절 조직의 기능과 탄성에서 중요한 역할을 한다. 정상 관절 연골에서 콘드로이친 황산은 글루코사민으로부터 연골세포나 활막세포에 의해 생산되고, 일단 이러한 물질이 결합 조직 기질로 유리되면 프로테오글라이칸 중합체로 결합된다. 이러한 콘드로이친 프로테오글라이칸으로서 대표적인 종류가 아그리칸(aggrecan)이다. 아그리칸은 관절 연골에서 고농도로 존재하며, 연골 조직의 특정적인 물리·화학적 성질을 부여하게 된다. 이 아그리칸을 이루는 콘드로이친 황산의 정도와 그 구성에서의 변화가 골관절염이나 류마티스성 관절염 같은 관절 질환의 개시와 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Poole A.R. et al.,J. Clin. Invest., 1994, 94; 25-33). 또한, 중합체의 정전기적 특징과 이것들의 제 2형 콜라겐과의 연관성은 탄성과 점도와 같은 결합 조직의 특징을 결정짓는 중요한 요소이다.
만성 염증 질환인 류마티스성 관절염은 윤활 조직과 윤활액으로 면역계 경쟁성(immuno-competent) 세포의 침윤, 윤활액의 섬유모세포의 증식, 관절 연골과 연골 하 조직에 침윤하여 파괴하는 판누스(pannus) 조직의 형성 등을 특징으로 하고 있다. 그 병인은 아직 확실하지 않지만, 염증 반응이 기본이 되는 여러 세포나 분자 레벨의 기전과, 관절 연골과 연골하 조직의 세포 외 매트릭스의 분해와 관련이 있다는 것이 점점 더 명확해지고 있다. 류마티스성 관절염에 대한 많은 보고가 염증 반응과 관절 손상의 매개체가 될 지도 모르는 분자의 발견에 초점이 맞추어지고 있다. 이러한 분자 중 하나가 종양괴사인자(tumor necrosis factor α, TNF-α)이다. 이 염증성 사이토카인은 연골 분해와 뼈의 재흡수를 촉진하고, 콜라게나제(collagenase)나 아그리카나제(aggrecanases)를 포함한 많은 단백 분해 효소의 유리와 활성화를 유도하게 된다. 따라서 궁극적으로 이러한 TNF-α와 같은 분자들의 생성과 활성화는 관절의 통합성과 기능의 만성적 파괴로 이어진다 (Kumar S. et al.,Currrent Opinion in Pharmacology, 2001, 1; 307-313). 이러한 보고들은 류마티스성 관절염에서 TNF-α의 중요성을 입증하고 있으며, 이러한 사이토카인을 중성화할 수 있는 생물학적 제제의 개발에도 노력을 기울이고 있다.
류마티스성 관절염은 골관절염과는 매우 다른 질병이다. 골관절염은 연골조직의 마모로서 생기는 질환이며, 류마티스 관절염은 자가면역 질환의 일종이다. 즉, 백혈구가 과잉으로 생성되어 관절에 대하여 상해를 주는 것이다. 일반적으로 류마티스성 관절염은 골관절염에 비해서 급격히 일어나며 관절이 변형되어 기능이 장해를 받게되며, 통증이 심하며 경우에 따라서는 관절을 바꾸어야 할 필요도 있다.
콘드로이친 황산/글루코사민이 골관절염에만 주로 효능이 있는 것처럼 알려져 있지만 최근의 연구 결과에 따르면 콘드로이친 황산/글루코사민을 미리 10일전에 투여한 랫트에 가용성 콜라겐 II를 주사하여 관절염을 유발 시켰을 경우 염증성 관절염의 빈도가 54%만이 관절염이 발생하였다. 이에 반해 비처리군 중 96.5%가 유발되었다. 이러한 결과는 콘드로이친 황산과 글루코사민의 혼합물이 류마티스성 관절염의 예방 및 치료에도 가능성이 있다는 것을 제시한다(Beren J. et al.,Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 2001, 226:144-151).
관절은 연골 조직으로 구성되어 있으며 혈관이 없기 때문에 새로이 생성이 되지 않는다. 따라서 연골 조직의 주성분인 GAG류를 보충해 주어야만 한다. 그러나, 콘드로이친 황산의 평균 분자량이 15,000이상이므로 투여한 콘드로이친 황산의약 70%가 효소에 의해서 대사를 받아 N-아세틸갈락토사민, 글루쿠론산, 황산 이온으로 분해되어 흡수되는데, 이러한 과정을 거쳐 약 8%가 연골조직에 도달하는 것으로 알려져 있다(Palmieri L. et al.,Arzneim.-Forsh./Drug Res, 1990, 40:319-323).
그러나, 본 발명자들은 큰 분자량과 극성을 지닌 콘드로이친 황산이 경구로 투여될 경우에 흡수가 어렵다는 것을 소장세포(Caco-2 세포주)를 통해서 확인하였으며, 이에 반하여 효소로 처리하여 분자량을 감소시킨 콘드로이친 이당류와 화학적으로 분해한 콘드로이친 올리고당은 소장세포를 통하여 흡수가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이에, 본 발명자들은 콘드로이친 황산을 올리고당 또는 저분자량으로 제조한 후 구강으로 투여하는 경우 소장세포를 통해 흡수율이 좋아지는 것을 알고, 콘드로이친 황산을 분해하고 그 분해산물인 콘드로이친 황산 이당류와 올리고당이 관절염 유발시 생기는 부종이나 발적을 감소시키고, 혈청 중 항 콜라겐 항체의 수치를 낮추거나 류마티스성 관절염에 결정적인 역할을 하는 사이토카인인 TNF-α의 수치를 매우 효과적으로 낮춤으로써 류마티스성 관절염의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 관절염 예방 또는 치료에 유용한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 콘드로이친 황산 이당류 및 콘드로이친 황산 올리고당이 HLE의 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프이고,
대조군 : 반응 용액(0.05M 트리스 완충용액,pH 8.0)만 처리,
CS 이당류 : 콘드로이친 황산 이당류(50 ㎎/㎏)로 처리,
CS 올리고당 : 콘드로이친 황산 올리고당 (300 ㎎/㎏)으로 처리,
CS : 콘드로이친 황산 (1,200 ㎎/㎏)으로 처리,
도 2는 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 콘드로이친 황산 이당류 및 콘드로이친 황산 올리고당이 부종과 발적에 미치는 영향을 확인하기 위하여 뒷발 두께를 측정한 그래프이고,
● : 관절염 대조군, ▼ : 음성 대조군,
■ : 콘드로이친 황산 이당류(50 ㎎/㎏),
◆ : 콘드로이친 황산올리고당 (300 ㎎/㎏),
▲ : 콘드로이친 황산 (1,200 ㎎/㎏),
도 3은 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 콘드로이친 황산 이당류 및 콘드로이친 황산 올리고당이 항 콜라겐 항체의 생산에 미치는 영향을 측정한 그래프이고,
대조군 : 생리 식염수로 처리,
CS 이당류 : 콘드로이친 황산 이당류(50 ㎎/㎏)로 처리,
CS 올리고당 : 콘드로이친 황산 올리고당 (300 ㎎/㎏)으로 처리,
CS : 콘드로이친 황산 (1,200 ㎎/㎏)으로 처리,
도 4는 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 콘드로이친 황산 이당류 및 콘드로이친 황산 올리고당이 사이토카인인 TNF-α에 미치는 영향을 측정한 그래프이고,
대조군 : 생리 식염수로 처리,
CS 이당류 : 콘드로이친 황산 이당류(50 ㎎/㎏)로 처리,
CS 올리고당 : 콘드로이친 황산 올리고당 (300 ㎎/㎏)으로 처리,
CS : 콘드로이친 황산 (1,200 ㎎/㎏)으로 처리,
도 5는 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 콘드로이친 황산 이당류 및 콘드로이친 황산 올리고당의 관절염 개선 효과를 조직학적 소견으로 확인한 사진이고,
도 6은 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 콘드로이친 황산 이당류 및 콘드로이친 황산 올리고당이 Caco-2 세포를 통해서 흡수되어지는 양을 측정한 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콘드로이친 황산의 분해산물인 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 콘드로이친 황산의 분해산물을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 기능성 식품을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 콘드로이친 황산의 분해산물인 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서는 콘드로이친 황산을 효소적 또는 화학적으로 분해하여 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당을 제조하였다.
본 발명에서 콘드로이친 황산을 분해하여 콘드로이친 황산 이당류를 제조하기 위하여 바람직한 실시예로 박테로이드 스테르코리스(Bacteroides stercoris) HJ15 균주로부터 정제한 콘드로이티나제 AC(Ahn et al.,Canadian J. Microbiol. 1998:423-429)를 사용하였다.
본 발명의 콘드로이친 황산 이당류를 제조하는 방법은
(1) 콘드로이친 황산에 콘드로이티나제 AC를 첨가하는 단계;
(2) 상기 단계 1의 반응액을 동결 건조시킨 후 정제하는 단계로 구성된다.
또한, 본 발명에서 콘드로이친 황산을 화학적으로 분해하여 콘드로이친 황산 올리고당을 제조하였다. 대표적인 화학적인 방법은 산이나, 강염기로 분해시킬 수 있으나 황산기 등의 이탈도 나타나므로 좋은 방법이 아니다. 이에 반하여, 구리 등의 중금속을 촉매로 하여 과산화수소를 이용해 OH-라디칼을 만들어 자유기에 의해서 유래된 해중합 반응은 비교적 반응이 온화한 조건에 수행이 가능하고 반응시간을 조절할 수 있다(Volpi et al.,Analytical Biochemistry1992,200:100-107).
본 발명의 콘드로이친 황산 올리고당을 제조하는 방법은
(1) 콘드로이친 황산을 녹인 후 구리 아세테이트 모노하이드레이트(Copper acetate monohydrate)를 첨가하여 교반하는 단계,
(2) 상기 단계 1의 반응액을 중성 pH로 유지시키며 과산화수소를 첨가하는 단계,
(3) 상기 단계 2의 반응액에서 구리 이온을 제거하고, 낮은 온도 조건에서 분획을 분리하는 단계; 및
(4) 상기 단계 3에서 선택한 분획의 시료를 동결건조하고, 이를 정제하는 단계로 구성된다.
상기 콘드로이친 황산을 화학적으로 분해하여 얻어진 콘드로이친 황산 올리고당의 평균 분자량은 5,000 Da이다.
또한, 본 발명은 상기 콘드로이친 황산의 분해산물을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 기능성 식품을 제공한다.
본 발명은 콘드로이친 황산이 효소적 또는 화학적 분해산물인 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물 또는 기능석 식품은 류마티스 관절염 또는 골관절염에 모두 효과적이며, 특히 류마티스성 관절염에 더욱 효과적이다.
인간 백혈구 엘라스타제(Human Leukocyte Elastase; 이하 'HLE'라 칭한다)는 세린 프로테아제(serine protease)로 결합조직의 구성성분인 엘라스틴과 콜라젠을 포함한 여러 기질을 분해할 수 있다. HLE의 이러한 분해능으로 인하여 HLE는 류마티스성 관절염, 폐기종(pulmonary emphysema), 낭성섬유증(cystic fibrosis), 만성기관지염(chronic bronchitis), 급성호흡기병(acute respiratory distress syndrome) 및 사구체신염(glomerulonephritis)과 같은 질병과 밀접한 관계가 있다. 따라서 HLE 특이적 저해제는 류마티스성 관절염이나 낭성섬유증과 같은 염증성 질병의 치료제로 효과적이다.
본 발명자들은 상기 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당이 HLE의 활성에 미치는 영향을 살펴본 결과, 분해하지 않은 콘드로이친 황산의 경우에는 생리 식염수를 처리한 대조군과 차이를 보이지 않고 HLE 억제 활성을 거의 보이지 않으나, 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당은 HLE 활성이 감소하는 효과를 나타낸다(도 1참조).
본 발명자들은 콘드로이친 황산 이당류 및 올리고당이 관절염에 미치는 효과를 알아보기 위해 콜라겐으로 유발된 류마티스성 관절염 동물 모델을 사용하여, 콘드로이친 황산과 비교하여 그 효과를 보면, 정상 대조군은 콘드로이친 황산을 투여한 그룹과 그 부종과 발적을 비교했을 때 차이가 나타나지 않고, 육안적 소견 역시 거의 비슷한 양상을 나타낸다. 반면에 콘드로이친 황산 이당류나 올리고당을 각각 투여한 그룹에서는 부종과 발적이 감소하고, 뒷발 두께도 감소한다(도 2참조).
또한, 항 콜라겐 항체의 생성에 미치는 영향을 보면 정상 관절염 대조군과 콘드로이친 황산이나 콘드로이친 황산 이당류를 투여한 그룹에서는 그 차이가 없으나, 콘드로이친 황산 올리고당을 투여한 그룹에서는 항 콜라겐 항체의 생성이 감소한다(도 3참조).
또한, 혈청 중 사이토카인의 농도는 콘드로이친 황산의 경우에 정상 대조군과 차이가 나타나지 않으나, 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당을 투여한 두 그룹에서는 각각 혈중 TNF-α의 농도가 감소한다(도 4참조).
정상 대조군과 비교하여 관절염 유발 그룹은 관절 조직의 구조에 큰 변화가 관찰된다. 콘드로이친 황산을 투여한 그룹은 종전의 보고에서와는 달리, 판누스(pannus) 생성이나 그 중증도 면에서 관절염 유발 그룹과 별 차이를 보이지 않고, 유발된 관절염의 개선 효과를 찾아볼 수 없다. 그러나 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당을 투여한 그룹에서는 관절염의 개선 효과를 육안으로 확인할 수 있고, 특히 콘드로이친 황산 올리고당을 투약한 그룹은 정상 대조군과 거의 비슷한 양상을 나타낸다(도 5참조).
본 발명의 약학적 조성물은 경구 및 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 콘드로이친 황산 이당류 또는 올리고당의 유효용량은 주사제의 경우는 10 - 50 ㎎/㎏, 경구 투여제의 경우는 100 - 500 ㎎/㎏이고 하루 1∼2회 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 콘드로이친 황산 이당류 및 올리고당의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐 만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당 제조
<1-1> 콘드로이친 황산 이당류 제조
본 발명자들은 콘드로이친 황산으로부터 이당류를 제조하기 위하여 하기와 같이 콘드로이티나제 AC를 이용하여 콘드로이친 황산을 분해하여 본 발명의 콘드로이친 황산 이당류를 제조하였다.
박테로이드 스테르코리스(Bacteroides stercoris) HJ15 균주로부터 콘드로이티나제 AC를 QAE-셀룰로스(QAE-celluose), DEAE-셀룰로스, CM-세파덱스(CM-Sephadex), 하이드록시아파티트(Hydroxyapatite), 히트랩(Hitrap)-헤파린, 히트랩 SP 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 콘드로이티나제 AC를 얻었다. 상기 정제시에 수율은 3.96%이고 비활성도는 48.91 μmole/min/㎎이며, 초기의 효소 정제도에 비교하여 520배 증가하였다.
콘드로이친 황산 2 g을 13 ㎖의 50 mM 인산완충액(pH 7.0)에서 녹여서 상기에서 콘드로이티나제 AC 2 유니트를 첨가하여 48시간 반응시켰다. 반응액을 동결 건조시킨 후 젤 여과 크로마토그래피로 분리 정제하여 본 발명의 콘드로이친 황산 이당류를 제조하였다.
<1-2> 콘드로이친 황산 올리고당 제조
본 발명자들은 콘드로이친 황산 올리고당을 제조하기 위하여, 콘드로이친 황산을 하기와 같이 화학적으로 분해하였다.
콘드로이친 황산 1 g과 초산 나트륨(sodium acetate) 0.5 g을 37℃의 온도에서 증류수로 10 ㎖이 되도록 녹였다. 완전히 녹으면 구리 아세테이트 모노하이드레이트(Copper acetate monohydrate)를 0.46 g 넣어준 후, 50℃로 온도를 계속 유지시키면서 교반하였다. 1 M의 수산화 나트륨을 적당량 첨가하여, 반응물의 pH를 7.5로 일정하게 유지시켜주면서, 9%의 과산화수소를 15분 간격으로 250 ㎕씩 첨가해 주었다. 상기 조건 하에서 6시간 반응을 시킨 후, 키렉스(Chelex) 100 양이온 교환 컬럼을 통과시켜 구리 이온을 제거하였고, 낮은 pH를 가진 분해 산물의 안정성을 위해 낮은 온도 조건에서 분획을 분리하였다. 분획을 받는 동안에는 1 M의 수산화 나트륨을 분해 산물에 첨가하여 pH를 5.9로 일정하게 유지하게 하였다. 이렇게 해서 얻은 시료의 일부는 TSK-G3000SW GPC-HPLC에 의해서 분자량을 동정하는데 사용하였고, 나머지 시료는 동결 건조하였다.
동결 건조된 시료는 소량의 증류수에 다시 녹인 후 세파덱스 G-10 혹은 바이오-젤(Bio-Gel) P-2 컬럼을 이용한 겔 크로마토그래피에 의해 염을 제거하여 정제하였다. 상기 과정을 통해 콘드로이친 황산의 올리고당을 얻을 수 있었다. 이러한 실험 방법으로 통하여 최종적인 콘드로이친 올리고당의 수율은 70.4%이었다.
<1-3> 콘드로이친 황산 올리고당의 분자량 결정
본 발명자들은 콘드로이친 황산 올리고당의 분자량을 TSK-G3000SW GPC-HPLC 칼럼을 이용하여 결정하였다. 구체적으로, FPLC(Pharmacia,스웨덴)에 0.1 M NaCl 용액을 1 ㎖/min로 흘려주면서 210 ㎚에서 검출을 하였다. 분자량의 결정을 위하여 사용한 표준품은 평균 분자량이 15,000 Da인 콘드로이친 황산, 12,000 Da인 헤파린 및 5,000 Da인 저분자량 헤파린을 사용하였다. 상기와 같은 방법을 이용하여결정된 콘드로이친 황산 올리고당의 평균 분자량은 약 5,000 Da이었다.
<실시예 2> 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당이 HLE의 활성 억제에 미치는 영향
본 발명자들은 콘드로이친 황산 이당류 또는 올리고당이 HLE 활성 억제에 어떠한 영향을 미치는지 확인하여 보았다.
각각의 시료(콘드로이친 황산, 이당류, 올리고당)를 완충 용액에 가하여 미리 37℃에서 반응시킨 후 미리 가온한 HLE를 가하여, 37℃에서 3분간 반응시켰다. 0.5 mM의 발색 기질(Boc-Ala-Ala-Pro-Ala-p-nitroanilide)을 가하여 37℃에서 90분간 반응시킨 후 0.5 M 초산을 가하여 반응을 정지시켰고, 그 가수 분해 정도를 405 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 HLE의 활성을 %로 나타내었다.
그 결과, 대조군에 비해 콘드로이친 황산의 경우에는 그 차이가 유의성을 나타내지 않았고 HLE 억제 활성을 거의 보이지 않았으나, 콘드로이친 이당류 및 올리고당은 HLE의 활성의 약 20%의 감소 효과를 나타내었다(도 1).
<실시예 3> 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당이 관절염에 미치는 효과
본 발명자들은 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당이 관절염에 미치는 효과를 알아보기 위하여 콜라겐으로 유발된 류마티스성 관절염 동물 모델을 사용하여, 콘드로이친 황산과 비교하여 그 효과를 확인하였다.
DBA/1J 생쥐[일본의 SLC Inc.(Shizuoka, Japan)회사로부터 구입]는 5-6주령의 수컷을 사용하였으며, 서울대학교 임상의학연구소 전임상 실험실의 SPF(Specific Pathogen Free) 조건하에서 일주일간 적응시킨 후, 실험을 실시하였다. 사육장은 인공 조명에 의하여 조명 시간을 아침 8시부터 저녁 8시까지 12시간으로 조절하였으며 실내 온도는 18℃ 내지 23℃로 유지하였다.
동물군을 4그룹으로 나누어, 대조군, 콘드로이친 황산 이당류(50 ㎎/㎏), 콘드로이친 황산 올리고당(300 ㎎/㎏), 콘드로이친 황산(1,200 ㎎/㎏)을 14일간 하루 한번 경구로 투여하였다. 15일째 되는 날, 1차 항원을 주사하여 관절염을 유발시켰다. 병아리 제 2형 콜라겐(Chicken Sternal Cartilage Type II collagen)을 2 ㎎/㎖ 농도로 0.01 N 초산에 녹여서 같은 양의 프로인트 애주번트(Freund Adjuvant)를 첨가하여 에멀젼화 시켜서 항원으로 사용하였다. 각 생쥐 꼬리의 근위부를 70% 알코올로 소독한 후 항원 100 ㎕를 피내로 주사하였다. 추가 접종은 1차 항원 주사 후 21일째 되는 날, 동일 방법으로 동일량 피내 주사하였다.
<3-1> 콜라겐 유발 관절염의 발생과 중증도 평가에 미치는 영향 측정
콜라겐으로 면역시킨 후, 3-4일 간격으로 생쥐의 관절염 발생 여부를 관찰하였다. 발적과 부종이 나타나는 분명한 관절염이 있는 경우를 관절염 발생으로 정의하였으며, 뒷발의 두께를 다이얼 두께 게이지(DIAL THICKNESS GAUGE; Mitutoyo Corp., Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 양 뒷발의 두께를 잰 평균값을 이용하였으며, 뒷발 두께(Hind Paw Thickness, mm)로 표시하였다.
그 결과, 생리 식염수를 투여한 대조군은 콘드로이친 황산을 투여한 그룹과 그 부종과 발적을 비교했을시 차이를 나타내지 않았고, 육안적 소견 역시 거의 비슷한 양상을 나타내었다. 반면에 콘드로이친 이당류나 올리고당을 각각 투여한 그룹에서는 부종과 발적이 감소하였고, 뒷발 두께를 측정한 결과 역시 감소함을 확인할 수 있었다(도 2).
<3-2> 혈청 항 콜라겐 항체의 생성에 미치는 영향 측정
실험 10주째에 심장 천자를 통하여 얻은 혈액을 원심 분리하여 혈청을 구하였으며, 혈청내의 IgG 항콜라겐 항체의 양을 효소면역법(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay)으로 측정하였다. 96 마이크로플레이트 웰에 병아리 제 2형 콜라겐(10 ㎍/㎖)을 100 ㎕/웰씩 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 미리 부착시켰다. PBS-트윈 20 용액으로 3회 세척한 후, 완전히 물기를 제거하고 PBS-1% BSA를 100 ㎕/웰씩 가하여 25℃에서 1시간 반응시켰다. PBS-트윈 20 용액으로 3회 세척한 후, 혈청을 가하여 37℃에서 2시간 반응시키고, 다시 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 같은 방법으로 세척한 후, 알카라인 포스파타제가 결합된 α 생쥐 IgG(alkaline phosphatase α mouse IgG) 항체를 1/1,000으로 희석한 액을 가하여 다시 37℃에서 1시간 반응 시켰다. 세척 후, 실온에서 발색 기질을 가하여 발색 정도를 관찰하다가 반응 정지액을 가하여 405 nm에서 그 흡광도를 측정하여, 관절염 대조군과 각 그룹간의 항체 생성 차이를 확인하였다.
그 결과, 생리 식염수를 투여한 관절염 대조군과 콘드로이친 황산이나 콘드로이친 황산 이당류를 투여한 그룹에서는 그 차이를 확인할 수 없었으나, 콘드로이친 황산 올리고당을 투여한 그룹에서는 항 콜라겐 항체가 감소하는 경향을 확인할 수 있었다(도 3).
<3-3> 혈청 사이토카인에 미치는 영향 측정
관절 부위에서의 염증 반응에 의해 일어나는 사이토카인의 변화는 순환혈에 존재하는 사이토카인의 상대적 균형을 변화시킬 수 있기 때문에 순환혈에 존재하는 특정 사이토카인의 혈중 농도의 변화를 검토하였다.
실험 10주째에 얻은 혈청 중 TNF-α의 양을 쿼티킨 M(Quantikine M; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) 키트를 이용하여 효소 면역법으로 정량하였다. 96 마이크로플레이트 웰에 희석액을 50 ㎕씩 넣고 표준 용액과 측정할 혈청 샘플을 50 ㎕씩 첨가한 후 실온에서 2시간 반응시켰다. 세척용액으로 5회 세척 후 항-생쥐 TNF-α 컨쥬게이트(anti-mouse TNF-α conjugate) 용액을 100 ㎕/웰씩 가하고 실온에서 다시 반응시켰다. 2시간 후 세척용액으로 5회 세척하고 완전히 물기를 제거한 후, 발색 용액 100 ㎕/웰을 가하여 30분간 실온에서 반응시킨 후 반응 정지액 100 ㎕/웰을 첨가하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 혈중 TNF-α의 농도를 구하였다.
그 결과, 혈청 중 사이토카인의 농도 역시, 콘드로이친 황산의 경우에는 생리 식염수를 투여한 대조군과 차이를 나타내지 않았으나, 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당을 투여한 두 그룹에서는 각각 혈중 TNF-α의 농도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 4).
<3-4> 조직학적 관찰
본 발명자들은 상기 생쥐에서 채혈 후, 양쪽 다리의 관절 부위를 잘라내어 10% 포르말린 용액에 담그어 고정시켜 4℃에서 24시간 방치하였다. 10% 포름산-포르말린(formic acid-formalin) 용액에서 석회질을 제거하고, 70% 에탄올(1시간), 80% 에탄올(1시간), 95% 에탄올(1시간), 95% 에탄올(1시간), 95% 에탄올(2시간), 100% 에탄올(2시간), 자일렌(1시간), 자일렌(2시간) 및 파라핀(2시간)의 순서를 거쳤다. 이후 일정 모양의 파리핀 모형을 만들기 위해 임베딩 센터(embedding center, Lipshaw)를 사용하였다. 파라핀 침투 과정이 끝난 조직을 파라핀 가온 배양조에 넣고 기본주형에 파라핀을 채운 후 조직을 안착시키고 냉동판에 올려놓고 굳은 후 기본 주형을 떼어 놓았다. 파라핀 모형을 박절기에서 4 ㎛ 두께로 자른 후 슬라이드 글라스 위에 올려 60℃ 에서 건조 부착 시켰다. 절편이 부착된 슬라이드 글라스를 60℃의 오븐에 넣어 조직 이외의 파라핀을 녹이고 자일렌에서 10분씩 3회 처리한 후 100%, 95%, 80% 및 70% 에탄올 순으로 2회씩 2분간 처리하여 함수 시켰다. 염색은 함수과정 후 탈이온수에서 10분간 처리한 후 해리스 헤마토실린 염색 용액으로 염색하였다. 흐르는 상수로 세척하고 95% 에탄올로 8분 동안 처리한 후, 0.5% 에오진 용액으로 2분 동안 염색하였다. 95%와 100% 에탄올로 탈수한 후 말리고 자일렌으로 처리한 후 밀봉하여 모든 검경을 100배율로 하였다
그 결과, 정상 대조군과 비교하여, 관절염 유발 그룹은 관절 조직의 구조에큰 변화가 관찰되었다. 콘드로이친 황산을 투여한 그룹은 종전의 보고에서와는 달리, 판누스(pannus) 생성이나 그 중증도 면에서 관절염 유발 그룹과 별 차이를 보이지 않았고, 유발된 관절염의 개선 효과를 찾아볼 수 없었다. 그러나 콘드로이친 이당류나 올리고당을 투여한 그룹에서는 관절염의 개선 효과를 육안으로 확인할 수 있었으며, 특히 콘드로이친 올리고당을 투약한 그룹은 거의 정상 대조군과 비슷한 양상을 나타낸 것을 확인할 수 있었다(도 5).
<실시예 4> Caco-2 세포주를 이용한 콘드로이친 황산, 콘드로이친 황산 이당류, 콘드로이친 황산 올리고당의 소장세포로의 투과 조사
본 발명자들은 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당을이 소장세포에서 흡수가 잘 되는지 확인해 보기 위하여 Caco-2 세포주를 이용하여 관찰하여 보았다. 구체적으로, Caco-2 단층세포를 10 ㎖의 완전배지가 들어있는 75 cm3의 T-플라스크에 접종한 후 세포가 T-플라스크의 벽면에 약 90% 정도 차지할 때 까지 배양하였다. Caco-2 세포가 T-플라스크의 벽면에서 약 90% 정도의 포화에 도달시 트랜스웰(12 웰) 상의 점막층에 Caco-2 세포의 성장을 위한 지지체 역할을 하는 제 1형 콜라겐을 8∼10 ㎍/㎠ 의 농도가 되도록 첨가한 후 UV 램프를 켜고 4∼5 시간 정도 건조시켜 코팅을 한 후 각각 0.5 ㎖과 1.5 ㎖의 완전배지를 트랜스웰의 점막층과 장액막층에 넣어준 후 37℃, 5% CO2배양기에 넣어두었다. 그리고 90% 정도의 포화에 도달한 Caco-2 세포가 들어있는 T-플라스크는 남아있는 완전배지를 완전히 제거한 후 인산완충액를 이용하여 2분 정도 깨끗하게 세척을 해 주고, 트립신-EDTA를 1 ㎖ 첨가한 후 3분 동안 인큐베이터에서 배양하여 플라스크의 기벽에 붙은 Caco-2 세포를 접종하였다. 다음 새로운 완전배지를 첨가하고, 피펫팅을 하여 Caco-2 세포들이 뭉쳐있지 않고 따로따로 떨어져서 존재하도록 만들어주었다. 이렇게 처리한 세포들은 헤모사이토미터를 이용하여 세포 수를 측정하고, 2.5 - 3×105개의 세포수/㎖가 되도록 희석하였다. 이렇게 희석한 Caco-2 세포 용액의 500 ㎕씩을 트랜스웰의 각각의 위에 부과한 후 인큐베이터에서 배양을 하였다. 3주 동안 매일 트랜스웰의 위와 바닥 상의 배지를 갈아주면서 배양을 하여 트랜스웰상의 위의 부분에 접종한 Caco-2 세포가 단층세포를 형성하기 위한 조건을 유지시켜 주었다. 3주 동안 배양한 후 투과실험에 들어가기 앞서 배양한 Caco-2 세포의 전기저항 값을 측정하였다. 트랜스웰의 점막층과 장액층 상의 남아 있는 배지를 제거한 후 투과실험용 배지로 2번 세척을 해 준 콘드로이친 황산과 화학반응에 의해서 분해를 시킨 콘드로이친 황산 올리고당을 100 ㎎/㎖의 농도에서 10 ㎕를 취해서 490 ㎕의 투과실험용 배지와 혼합하여 트랜스웰의 점막층에 넣어준다. 그런 다음 진탕수욕조를 이용하여 37℃, 85 rpm으로 교반을 하면서 배양을 하고, 1시간 간격으로 Caco-2 세포의 전기저항을 측정하고, 콘드로이친 황산과 콘드로이친 황산 올리고당이 들어있는 트란스웰의 점막층을 신선한 투과실험용 배지가 담긴 새로운 웰로 옮겨주었다. 그리고 이전에 남은 트란스웰의 장액층에 존재하는 각각의 투과된 콘드로이친 황산이 포함된 투과실험용 배지는 따로 보관하였다. 이러한 방법을 이용하여 1시간 간격으로 전기저항 값의 측정과 투과실험용 배지를 바꿔주는 작업을 반복하고, 각각의 수치를 기입하였다. 투과실험이 끝나면 따로 보관했던 콘드로이친 황산과 화학반응에 의한 콘드로 이친 황산 올리고당이 투과된 각각의 시간대의 투과실험용 배지를 1,9-디메틸메틸렌 블루를 이용하여 정량을 하였다. 시료가 들어있는 투과실험용 배지들과 검량선 작성을 위한 각기 다른 농도의 콘드로이친 황산과 화학반응에 의한 콘드로이친 황산 올리고당 100 ㎕씩을 96-웰 마이크로플레이트에 넣어준 후 염색용액을 150 ㎕씩 첨가하여 540 nm에서 흡광도를 측정함으로써 투과된 시료의 양을 측정하였다. 한편 콘드로이친 황산 이당류의 경우에는 낮은 전하 밀도때문에 1,9-디메틸메틸렌 블루를 이용한 정량법에 의해서 정량할 수 없으므로, SAX-HPLC(Strong Anion-Exchange High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 각기 다른 농도에서의 콘드로이친 황산 이당류의 검량선을 작성하고, 이를 기준으로 해서 각기 다른 시간대의 투과된 시료들의 양을 결정하였다. 정량을 한 결과 콘드로이친 황산의 경우에는 반응 3시간까지 1 mg 중 8.70 ㎍ 정도로 약 0.87% 정도의 투과가 되었음을 확인할 수 있었고, 화학적으로 분해한 콘드로이친 황산 올리고당의 경우에는 반응 3시간까지 1 mg 중 110.36 ㎍ 정도로 약 11.04% 정도의 투과율을 보였다. 그리고 콘드로이친 황산 분해효소에 의해서 얻은 콘드로이친 황산 이당류의 경우에는 반응 3시간까지 100 ㎍ 중에서 35.08 ㎍ 정도로 약 35.08%의 투과율을 보였다.
<실시예 5> 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성실험
6주령의 특정병원체부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 콘드로이친 황산 이당류 또는 올리고당을 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 500 mg/㎏/㎖의 용량으로 단회 비경구 투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 콘드로이친 황산 이당류 또는 올리고당은 랫트에서 1,000 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 비경구투여 최소치사량(LD50)은 500 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.
본 발명의 콘드로이친 황산의 분해산물인 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 류마티스성 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물은 관절염 유발시 생기는 부종이나 발적을 감소시킬 뿐 아니라, 혈청 중 항 콜라겐 항체나 사이토카인인 TNF-α의 수치를 낮춤으로써 류마티스성 관절염의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 콘드로이친 황산의 화학적 또는 효소적 분해산물을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 콘드로이친 황산의 분해산물은 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 관절염은 류마티스성 관절염인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 HLE의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 사이토카인인 TNF-α의 수치를 낮추는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 항 콜라겐 항체의 수치를 낮추는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 콘드로이친 황산의 화학적 또는 효소적 분해산물을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 기능성 식품.
  8. 제 7항에 있어서, 콘드로이친 황산의 분해산물은 콘드로이친 황산 이당류 또는 콘드로이친 황산 올리고당인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 기능성 식품.
  9. (1) 콘드로이친 황산에 콘드로이티나제 AC를 첨가하는 단계;
    (2) 상기 단계 1의 반응액을 동결 건조시킨 후 정제하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 콘드로이친 황산 이당류의 제조방법.
  10. (1) 콘드로이친 황산을 녹인 후 구리 아세테이트 모노하이드레이트(Copper acetate monohydrate)를 첨가하여 교반하는 단계,
    (2) 상기 단계 1의 반응액을 중서 pH로 유지시키며 과산화수소를 첨가하는 단계,
    (3) 상기 단계 2의 반응액에서 구리 이온을 제거하고, 낮은 온도 조건에서 분획을 분리하는 단계; 및
    (4) 상기 단계 3에서 선택한 분획의 시료를 동결건조하고, 이를 정제하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 콘드로이친 황산 올리고당의 제조방법.
KR1020010077071A 2001-12-06 2001-12-06 콘드로이친 황산의 분해산물을 포함하는 관절염 예방 또는치료용 약학적 조성물 KR20030046810A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020010077071A KR20030046810A (ko) 2001-12-06 2001-12-06 콘드로이친 황산의 분해산물을 포함하는 관절염 예방 또는치료용 약학적 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020010077071A KR20030046810A (ko) 2001-12-06 2001-12-06 콘드로이친 황산의 분해산물을 포함하는 관절염 예방 또는치료용 약학적 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20030046810A true KR20030046810A (ko) 2003-06-18

Family

ID=29573482

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020010077071A KR20030046810A (ko) 2001-12-06 2001-12-06 콘드로이친 황산의 분해산물을 포함하는 관절염 예방 또는치료용 약학적 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20030046810A (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100906559B1 (ko) * 2007-08-27 2009-07-07 한국농축산영농조합 콘도로이틴 황산 올리고당의 제조
EP2106798A1 (en) * 2008-04-02 2009-10-07 Nestec S.A. Sulfated unsaturated disaccharidic chondroitin sulfate in connective tissue protection and repair
KR20220091992A (ko) 2020-12-24 2022-07-01 충북대학교 산학협력단 기능성이 증대된 닭뼈 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 치킨스톡 조성물
CN117646054A (zh) * 2024-01-29 2024-03-05 湖南天劲制药有限责任公司 治疗关节炎的骨多肽生产分离纯化工艺

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR940005281A (ko) * 1992-07-30 1994-03-21 야마타니 와타루 항류마티스성 조성물
KR19990008198A (ko) * 1995-04-28 1999-01-25 로빈스탠톤 황산화된 올리고사카라이드의 제조 및 그 용도
JPH11222425A (ja) * 1997-10-27 1999-08-17 Ss Pharmaceut Co Ltd 関節疾患治療用関節内投与製剤
JP2000053569A (ja) * 1998-03-19 2000-02-22 Sigma-Tau Healthscience Spa 変性または炎症性関節障害の予防的および治療的処置のための栄養補助物または医薬組成物の形態における組み合わせ組成物
KR20010046562A (ko) * 1999-11-12 2001-06-15 박명환 골 관절염 치료를 위한 건강식품 조성물

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR940005281A (ko) * 1992-07-30 1994-03-21 야마타니 와타루 항류마티스성 조성물
KR19990008198A (ko) * 1995-04-28 1999-01-25 로빈스탠톤 황산화된 올리고사카라이드의 제조 및 그 용도
JPH11222425A (ja) * 1997-10-27 1999-08-17 Ss Pharmaceut Co Ltd 関節疾患治療用関節内投与製剤
JP2000053569A (ja) * 1998-03-19 2000-02-22 Sigma-Tau Healthscience Spa 変性または炎症性関節障害の予防的および治療的処置のための栄養補助物または医薬組成物の形態における組み合わせ組成物
KR20010046562A (ko) * 1999-11-12 2001-06-15 박명환 골 관절염 치료를 위한 건강식품 조성물

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100906559B1 (ko) * 2007-08-27 2009-07-07 한국농축산영농조합 콘도로이틴 황산 올리고당의 제조
EP2106798A1 (en) * 2008-04-02 2009-10-07 Nestec S.A. Sulfated unsaturated disaccharidic chondroitin sulfate in connective tissue protection and repair
WO2009121519A1 (en) * 2008-04-02 2009-10-08 Nestec S.A. Sulfated unsaturated disaccharidic chondroitin sulfate in connective tissue protection and repair
US20110028400A1 (en) * 2008-04-02 2011-02-03 Nestec S.A. Sulfated unsaturated disaccharidic chondroitin sulfate in connective tissue protection and repair
KR20220091992A (ko) 2020-12-24 2022-07-01 충북대학교 산학협력단 기능성이 증대된 닭뼈 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 치킨스톡 조성물
CN117646054A (zh) * 2024-01-29 2024-03-05 湖南天劲制药有限责任公司 治疗关节炎的骨多肽生产分离纯化工艺
CN117646054B (zh) * 2024-01-29 2024-04-30 湖南天劲制药有限责任公司 治疗关节炎的骨多肽生产分离纯化工艺

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA032748B1 (ru) Низкомолекулярный биотехнологический хондроитин 6-сульфат для предупреждения остеоартрита
Gavva et al. Glycosaminoglycans from fresh water fish processing discard-Isolation, structural characterization, and osteogenic activity
US9908947B2 (en) Biotechnological sulphated chondroitin sulphate at position 4 or 6 on the same polysaccharide chain, and process for the preparation thereof
Garg et al. Effect of fully sulfated glycosaminoglycans on pulmonary artery smooth muscle cell proliferation
KR20030046810A (ko) 콘드로이친 황산의 분해산물을 포함하는 관절염 예방 또는치료용 약학적 조성물
JPH11269077A (ja) ホスホリパーゼａ２阻害用医薬組成物
US10632144B2 (en) Low polydispersity, low molecular weight biotechnological chondroitin sulfate with anti-inflammatory and antiarthritis activity and use thereof in the prevention of osteoarthritis
KR20090109105A (ko) 바이오틴 또는 바이오틴 유도체와의 1개 이상의 공유 결합을 포함하는 헤파린, 이의 제조 방법 및 이의 용도
CA2489862C (en) Epimerized derivatives of k5 polysaccharide with a very high degree of sulfation
JP2005290383A (ja) ６−ｏ−硫酸化ｎ−アセチルヘパロサン及び造血幹細胞増殖助剤
KR20140044826A (ko) 상어­유사 콘드로이틴 설페이트 및 이의 제조방법
US8604003B2 (en) Promoter for hard tissue formation
Pecly et al. Effects of molecular size and chemical structure on renal and hepatic removal of exogenously administered chondroitin sulfate in rats
JP2006016313A (ja) ギャップ機能抑制剤、細胞増殖促進剤及び硫酸化ポリフコース
WO2002083155A1 (en) Use of sulfated bacterial polysaccharides suitable for the inhibition of angiogenesis
CN104725532A (zh) 一种精确定量控制肝素/类肝素中硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的方法
JP4462826B2 (ja) 骨疾患治療剤
JP2006089632A (ja) 海洋生物を原料としたヘパリン様物質の調製方法
KR0170064B1 (ko) 아카란 황산을 포함하는 달팽이 엑기스
Volpi et al. Heparin from Marine Mollusks: Occurrence, Structure, and Biological Role
Yuan et al. Recent progress in marine chondroitin sulfate, dermatan sulfate, and chondroitin sulfate/dermatan sulfate hybrid chains as potential functional foods and therapeutic agents
Koźma et al. Dermatan sulfates of normal and scarred fascia
EA029370B1 (ru) Применение одипарцила в лечении мукополисахаридоза
KR20020078147A (ko) 아카란 황산을 고지혈증 예방 및 치료에 사용하는 용도
Volpi et al. chapter four Heparin from marine mollusks

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
NORF Unpaid initial registration fee