KR20030043476A

KR20030043476A - (알)-하이드록시카르복실산 생산 재조합 미생물 및 그를이용한 (알)-하이드록시카르복실산의 제조방법

Info

Publication number: KR20030043476A
Application number: KR1020010074676A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 이영
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2001-11-28
Filing date: 2001-11-28
Publication date: 2003-06-02
Also published as: GB2397819B; AU2002221164A1; GB0411423D0; KR100447532B1; WO2003046159A1; US20050069995A1; JP2005516592A; GB2397819A

Abstract

본 발명은 세포내 폴리하이드록시알칸산(PHA) 분해효소(intracellular PHA depolymerase)를 암호화하는 유전자와 PHA 생합성효소계(PHA biosynthesis related enzymes)를 암호화하는 유전자가 함께 도입된 재조합 미생물 및 전기 재조합 미생물을 배양하여, 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자 및 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 유전자로 동시에 형질전환되거나 염색체 내에 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 포함하고 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 재조합 유전자로 형질전환된 재조합 미생물 및 전기 미생물을 배양하여 (R)-3-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 전기 재조합 미생물에서 제조된 PHA는 균체 내에 남아있지 않고 대부분 (R)-하이드록시카르복실산으로 분해되어 배지 내로 방출되기 때문에, (R)-하이드록시카르복실산의 생산공정이 크게 간소화되고, 기질의 낭비를 줄여 전체 수율이 증가하므로, 본 발명을 광학적으로 순수한 다양한 (R)-하이드록시카르복실산 생산에 매우 폭넓게 응용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

(알)-하이드록시카르복실산 생산 재조합 미생물 및 그를 이용한 (알)-하이드록시카르복실산의 제조방법{(R)-Hydroxycarboxylic Acid Producing Recombinant Microorganism and Process for Preparing (R)-Hydroxycarboxylic Acid Using the Same}

본 발명은 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물 및 그를 이용하여 (Ｒ)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 세포내 폴리하이드록시알칸산(PHA) 분해효소(intracellular PHA depolymerase)를 암호화하는 유전자와 PHA 생합성효소계(PHA biosynthesis related enzymes)를 암호화하는 유전자가 함께 도입된 재조합 미생물 및 전기 재조합 미생물을 배양하여 균체 내에서 PHA 합성과 분해가 동시에 이루어지게 함으로써, 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

(R)-하이드록시카르복실산은 두개의 기능기 즉, 하이드록실기(-OH)와 카르복실기(-COOH)를 동시에 가지고 있어, 유용물질의 유기합성이 용이하고 합성물에 키랄 중심(chiral center)을 손쉽게 제공할 수 있으며, 또한 이 두 기능기는 전환이 용이하기 때문에 정밀화학분야에서 키랄성 전구체로서 다양하게 이용될 수 있다. 또한, (R)-하이드록시카르복실산은 항생제, 비타민, 향료, 페로몬(pheromone) 등의 합성을 위한 전구체와 의약품 디자인에 사용되는 비펩타이드 리간드(nonpeptide ligand) 개발 및 신규 의약품 개발을 위한 전구체 등의 폭넓은 응용이 기대되고 있으며, 특히 페니실린을 대체할 항생물질로 주목을 받고 있는 카바페넴계(carbapenem) 항생물질의 전구체로서 사용될 수 있다(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65:363-368, 1999). 예를 들면, (R)-3-하이드록시부탄산-메틸에스터(methyl-(R)-3-hydroxybutyrate)로부터 카바페넴계 항생제 중 하나인 티에나마이신((+)-thiennamycin)을 합성하는 방법이 개발되어 보고된 바 있다(참조: Chiba and Nakai, Chem. Lett., 651-654, 1985).

한편, PHA는 미생물에 의해 세포내에서 합성 및 축적되는 에너지 및 탄소원 저장물질군으로서, 하이드록시카르복실산들이 에스터(ester) 결합으로 연결된 폴리에스터이다. 생합성효소의 광학특이성으로 인해 PHA를 구성하는 단량체인 하이드록시카르복실산은 4-하이드록시부탄산(4-hydroxybutyric acid) 등의 몇몇 광학이성질체가 존재하지 않는 경우를 제외하고 모두 R-형의 광학활성을 가지므로, 생합성된 PHA를 분해함으로써 광학적으로 순수한 (R)-3-하이드록시카르복실산을 생산할 수 있다. PHA의 일종인 폴리하이드록시부탄산(poly-(3-hydroxybutyrate), PHB) 또는 폴리하이드록시부탄산/하이드록시발레르산 공중합체(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), PHB/V)를 화학적 방법으로 분해하여, (R)-3-하이드록시부탄산, (R)-3-하이드록시부탄산-알킬에스터(alkyl-(R)-3-hydroxybutyrate), 또는 (R)-3-하이드록시발레르산-알킬에스터(alkyl-(R)-3-hydroxyvalerate)를 생산하는 방법이 연구되어 보고된 바 있다(참조: Seebach et al., Org. Synth., 71:39-47, 1992; Seebach and Zuger, Helvetica Chim. Acta, 65:495-503, 1982). 그러나, 전술한 (R)-3-하이드록시카르복실산의 화학적 분해방법에 의한 제조는 미생물 배양,균체회수, 고분자 분리, 분해반응 및, 분리·정제로 이어지는 복잡한 공정으로 인한 수율의 감소와 다량의 유기용매 사용의 필요성 등의 문제점을 지니고 있다. 또한, 미생물 세포물질이 부산물로 다량 발생하게 되며, 현재까지 생산이 시도된 물질도 (R)-3-하이드록시부탄산과 (R)-3-하이드록시발레르산에 국한되어 있다.

본 발명자들은 PHA를 생산하는 미생물들이 PHA 생합성효소계와 함께 자체적으로 가지고 있는 PHA 분해효소를 이용하여 자가분해함으로써, (R)-3-하이드록시부탄산을 포함하는 다양한 (R)-3-하이드록시카르복실산들을 생산하는 방법을 연구하여 발표한 바 있다(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65:363-368, 1999; 이상엽 외, 대한민국 특허등록 제 250830호; Lee et al., PCT 국제특허출원 제 PCT/KR98/00395호, 1998). 전기 자가분해법은 종래의 화학적 방법에 비하여 훨씬 효율적인 바, 한 예로서 알칼리게네스 레이터스(Alcaligenes latus)를 사용하는 경우 배양에 의해 PHB를 과량 축적시킨 후, pH를 적절히 맞추어 37℃로 30분간 방치함으로써 축적된 PHB의 95% 이상을 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시부탄산으로 분해·방출한다. 이러한 자가분해법은 다양한 (R)-3-하이드록시카르복실산 제조에 응용될 수 있으나, 근본적으로 PHA 축적공정과 분해공정을 개별적으로 진행하는 회분식 공정을 요하고 있다. 만약, 연속적으로 PHA 축적과 분해가 동시에 일어날 수 있다면, 부산물인 미생물 세포물질을 많이 줄일 수 있으며, 결과적으로 기질로부터의 하이드록시카르복실산 수율의 증가를 기대할 수 있을 것이다. 따라서, 보다 효율적이고 경제적으로 (R)-3-하이드록시카르복실산을 생산하기 위한, 좀 더 간단하고도 연속적인 공정을 적용할 수 있는 (R)-3-하이드록시카르복실산의 제조방법을개발하여야 할 필요성이 끊임없이 요구되어 왔다.

미생물내에서 PHA의 일반적인 합성 및 분해기작은 다음과 같다. 미생물이 탄소원은 충분하나 질소, 인산염 또는 마그네슘 등의 성장에 필수적인 요소가 제한된 불균형적인 성장 환경에 처하게 되면, PHA 생합성효소계가 발현하여 여분의 탄소원으로부터 PHA를 합성, 세포내에 축적한다(참조: Lee, Biotechnol. Bioeng., 49:1-14, 1996). 이후, 환경여건이 변화하여 제한되었던 성장요소가 다시 공급되면, 세포내 PHA 분해효소와 (R)-3-하이드록시카르복실산 올리고머 가수분해효소 등의 작용으로 PHA가 그 단량체인 (R)-3-하이드록시카르복실산으로 분해된다(참조: Muller and Seebach, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32:477-502, 1993).

이들의 미생물내 대사회로에서의 재사용을 위한 기작은 (R)-3-하이드록시부탄산의 경우만이 자세하게 연구되어 다음과 같이 밝혀졌다. 제조된 (R)-3-하이드록시부탄산은 (R)-3-하이드록시부탄산 탈수소효소의 작용에 의해 아세토아세테이트(acetoacetate)로 변환되고, 이는 미생물 대사회로에 재사용된다(참조: Muller and Seebach, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32:477-502, 1993; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65:363-368, 1999). 따라서, 미생물에 의한 (R)-3-하이드록시카르복실산의 생산을 위하여 PHA 합성효소와 PHA 분해효소가 필요하며, (R)-3-하이드록시부탄산 생산의 경우, (R)-3-하이드록시부탄산 탈수소효소의 활성이 억제되거나 제거된 상황이 바람직하다.

본 발명자들을 비롯한 많은 연구진들에 의해 재조합 대장균을 이용하여 PHA를 효율적으로 생산하는 방법에 대한 연구가 진행되어 왔으며, PHB나 PHB/V의 경우건조균체 질량의 80% 이상까지도 축적할 수 있는 기술수준에 까지 이르렀다(참조: Slater et al., J. Bacteriol., 170:4431-4436, 1988; Schubert et al., J. Bacteriol., 170:5837-5847, 1988; Kim et al., Biotechnol. Lett., 14:811-816, 1992; Fidler and Dennis, FEMS Microbiol. Rev., 103:231-236, 1992; Lee et al., J. Biotechnol., 32:203-211, 1994; Lee et al., Ann. NY Acad. Sci., 721:43-53, 1994; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44:1337-1347, 1994; Lee and Chang, J. Environ. Polymer Degrad., 2:169-176, 1994; Lee and Chang, Can. J. Microbiol., 41:207-215, 1995; Yim et al., Biotechnol. Bioeng., 49:495-503, 1996; Lee and Lee, J. Environ. Polymer Degrad., 4:131-134, 1996; Wang and Lee, Appl. Environ. Microbiol., 63:4765-4769, 1997; Wang and Lee, Biotechnol. Bioeng., 58:325-328, 1998; Lee, Bioprocess Eng., 18:397-399, 1998; Choi et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:4897-4903, 1998; Wong and Lee, Appl. Microbial. Biotechnol., 50:30-33, 1998; 및, Lee et al., Int. J. Biol. Macromol., 25:31-36, 1999).

대장균은 원래 균체 내에 에너지 저장물질로서 PHA를 합성할 수 없고, 이를 분해하는 효소 또한 가지고 있지 않다. 아울러, (R)-3-하이드록시부탄산을 아세토아세테이트로 변환시키는 (R)-3-하이드록시부탄산 탈수소효소도 가지고 있지 않을 것으로 여겨진다. 다른 미생물의 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 도입하여 작제한 PHA 합성 재조합 대장균의 경우에도, PHA 생합성효소계만을 도입하였기 때문에, 균체 내에 합성, 축적된 PHA는 분해되지 않는다(참조: Lee, TrendsBiotechnol., 14:98-105, 1996; Lee, Nature Biotechnol., 15:17-18, 1997). 따라서, 본 발명자들은 이러한 효율적인 PHA 합성 재조합 대장균에 세포내 PHA 분해효소를 동시에 도입, 발현시킴으로써 (R)-3-하이드록시카르복실산, 특히 (R)-3-하이드록시부탄산을 효율적으로 생산할 수 있으며, (R)-3-하이드록시부탄산 탈수소효소가 존재하지 않거나 활성이 없으면 (R)-3-하이드록시부탄산이 아세토아세테이트로 변환되지 않기 때문에 더 이상 대사에 사용되지 않을 것이라는 점에 착안하여, PHA 생합성효소계와 세포내 PHA 분해효소를 동시에 도입한 재조합 미생물 및 이를 이용한 (R)-하이드록시카르복실산의 제조방법을 개발하였다(참조: 대한민국 특허출원 제 10-2000-0026158호). 그러나, 본 발명자들에 의하여 제공된 전기 (R)-하이드록시카르복실산의 제조방법은 배양 후 미생물 내에 분해되지 않고 남아 있는 PHA가 존재하고, 이는 수율 감소 및 기질의 낭비로 인한 생산단가의 상승을 야기할 수 있다는 문제점이 지적되어 왔다.

따라서, 제조된 PHA가 (R)-하이드록시카르복실산으로 분해되어 제조합 미생물에 의한 (R)-하이드록시카르복실산의 생산수율을 증대시키고 기질의 낭비를 감소시켜 효율적으로 (R)-하이드록시카르복실산을 제조할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, (R)-하이드록시카르복실산의 생산 수율을 증대시키고 기질의 낭비를 감소시켜 효율적으로 (R)-하이드록시카르복실산을 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자와 PHA 생합성 효소계를 암호화하는 유전자를 함께 미생물에 도입하고 배양하여 균체 내에서 PHA 합성과 분해가 동시에 이루어지고 제조된 PHA가 대부분 (R)-하이드록시카르복실산으로 분해되게함으로써, 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산의 생산수율을 증대시키고 기질의 낭비를 감소시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 재조합 미생물을 배양하고, 그로부터 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 재조합 플라스미드 pUC19Red의 유전자 지도이다.

도 2는 본 발명의 재조합 플라스미드 pUC19Red_stb의 유전자 지도이다.

도 3은 본 발명의 재조합 플라스미드 p5184의 유전자 지도이다.

도 4는 재조합 대장균 XL1-Blue/pSYL105Red의 배양 중, 시간에 따른 건조균체 농도, 폴리하이드록시부탄산(PHB) 농도, 제조된 단량체 (R)-3-하이드록시부탄산의 염기조건에서의 열분해 전 및 열분해 후의 농도, PHB 생합성 및 분해 속도, 및 PHB 생합성 속도에 대한 PHB 분해속도의 비를 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 재조합 대장균 XL1-Blue/pUC19Red;p5184의 플라스크 배양 중, 시간에 따른 건조균체 농도, PHB 농도, 제조된 단량체 (R)-3-하이드록시부탄산의 염기조건에서의 열분해 전 및 열분해 후의 농도, PHB 생합성 및 분해 속도, 그리고 PHB 생합성 속도에 대한 PHB 분해속도의 비를 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명의 재조합 대장균 B-PHA+/pUC19Red_stb의 회분식 배양 중, 시간에 따른 건조균체 농도, PHB 농도, pH, 그리고 제조된 단량체 (R)-3-하이드록시부탄산의 염기조건에서의 열분해 전 및 열분해 후의 농도를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 세포내 폴리하이드록시알칸산(PHA) 분해효소(intracellular polyhydroxyalkanoate depolymerase)를 암호화하는 유전자(서열번호 1) 및 PHA 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase, PhaC), 베타-케토티올라제(β-ketothiolase, PhaA)와 환원효소(reductase, PhaB)로 구성된 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자(서열번호 3)를 포함하는 재조합 유전자로 동시에 형질전환되거나 염색체 내에 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 포함하고 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 재조합 유전자로 형질전환된, 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물 및 전기 미생물을 배양하여 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법을 제공한다. 이때, 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자와 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자로 동시에 형질전환된 재조합 미생물은 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자를 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자보다 더 많은 복제수(high copy number)로 포함한다. 전기의 두 유전자는 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)로부터 유래된 것이 바람직하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자는 전기 유전자를 포함하는 플라스미드 형태로 존재하며, 전기 플라스미드는 대장균 플라스미드 R1 유래의parB(hok/sok) locus(서열번호 2)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자는 염색체 내로 통합되는 경우, 포스포트랜스아세틸라제(phosphotransacetylase, Pta)를 암호화하는 유전자에 통합될 수 있다. 형질전환되는 미생물은 대장균(Escherichia coli), 특히, 대장균 XL1-Blue 또는 대장균 B일 수 있다. 재조합 미생물의 배양은 연속식 또는 회분식으로 수행될 수 있고, 이때, 생산되는 (R)-하이드록시카르복실산은 단량체 혹은 이량체 형태의 (R)-3-하이드록시부탄산 및 (R)-3-하이드록시발레르산을 포함한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명자들은 미생물에서 상호 존재가 가능한 서로 다른 복제수(copy number)를 갖는 플라스미드 벡터들을 이용하여 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 상대적으로 복제수가 적은(low copy number) 플라스미드 벡터에 삽입하고, 세포내 PHA 분해효소는 많은 복제수(high copy number)를 갖는 플라스미드 벡터에 삽입하여, 이들 두 플라스미드로 동시에 형질전환된 재조합 균주 내에서 PHA 생합성효소계의 발현정도를 낮추어 상대적으로 세포내 PHA 분해효소의 발현이 우세하도록 함으로써, 전기 재조합 균주의 배양시 (R)-3-하이드록시부탄산을 포함하는 하이드록시카르복실산이 효율적으로 제조되어 배양액으로 방출되고, 균주 내에는 PHA가 거의 축적되지 않음을 확인하였다. 또한, PHA 생합성효소계의 발현정도를 낮추었음에도 불구하고, 오히려 (R)-하이드록시카르복실산의 생산성이 향상되어 수율이 급격히 증가되는, 미처 예측하지 못했던 현상을 발견하게 됨에 따라, 염색체 내에 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 통합시킨 대장균 변이주를 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 많은 복제수를 갖는 플라스미드 벡터로 형질전환시킨 재조합 대장균을 완성하고, 이를 배양함으로써 (R)-3-하이드록시부탄산을 포함하는 하이드록시카르복실산이 매우 효율적으로 제조되어, 배양액으로 방출되는 것을 확인하였다.

결국, 본 발명의 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법은 세포내 PHA 분해효소가 발현되는 많은 복제수의 재조합 플라스미드와 PHA 생합성효소계가 발현되는 상대적으로 적은 복제수의 재조합 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균, 또는 세포내 PHA 분해효소가 발현되는 많은 복제수의 재조합 플라스미드로 동시 형질전환되고 PHA 생합성효소계는 염색체 내에 통합되어 발현되는 재조합 대장균을 배양하여, 이로부터 제조되어 배양액 내로 방출된 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 수득하는 단계를 포함한다.

본 발명에 의하여, PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자와 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자를 도입한 재조합 대장균을 포도당을 기질로 사용하여 배양하면, 상기 효소들의 발현에 의해 주로 (R)-3-하이드록시부탄산 단량체와 그의 이량체가 제조되어 배양액 중으로 분비된다. 분비된 (R)-3-하이드록시부탄산과 그의 이량체는 특정조건의 LC 또는 HPLC로 분리할 수 있다. 필요한 경우 이량체를 염기조건에서 가열함으로써, (R)-3-하이드록시부탄산으로 분해할 수도 있다(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65:363-368, 1999).

본 발명자들은 랄스토니아 유트로파 염색체 DNA로부터 GenBank에 등록된 염기서열(참조: Saito and Saegusa, GenBank Sequence Database, AB017612, 2001; Saegusa et al., J. Bacteriol., 183:94-100, 2001)을 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 고유의 리보솜 결합부위(ribosome binding site)를 포함하는 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자(서열번호 1)를 얻어, 이를 높은 복제수의 플라스미드인 pUC19(New England Biolabs, USA)에 클로닝하여 pUC19Red를 작제하였다. 또한, 플라스미드의 안정성을 향상하기 위해 플라스미드 pSYL105(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44: 1337-1347, 1994)를 제한효소EcoRI과BamHI으로 절단하여 얻은parB(hok/sok)locus(서열번호 2)(참조: GenBank Sequence Data, X05813; Gedes, Bio/Technology, 6:1402-1405, 1988)를 포함하는 DNA조각을 pUC19Red에 삽입하여 pUC19Red_stb를 작제하였다.

한편, 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성효소계인 PHA 합성효소(synthase, PhaC), 베타-케토티올라제(β-ketothiolase, PhaA) 및 환원효소(reductase, PhaB)를 발현하는 오페론(operon)으로 구성된 유전자(서열번호 3)와parB(hok/sok)locus를 포함하는 DNA조각은 플라스미드 pSYL105(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44: 1337-1347, 1994)를 제한효소XbaI으로 절단하여 얻었으며, 이를 중간 복제수(medium copy number)를 가지며 pUC19 유래의 플라스미드와 상호존재가 가능한 플라스미드인 pACYC184(New England Biolabs, USA)의 제한효소XbaI위치에 삽입하여 p5184를 작제하였다.

또한, PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 염색체 내에 삽입하여 발현시키는 재조합 미생물을 작제하기 위해, 플라스미드 pSYL105(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44: 1337-1347, 1994)를 제한효소BamHI으로 절단하여 얻은 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 상동성 재조합(homologous recombination)방법(참조: Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 97:5978-5983, 2000)에 의해 대장균 B(ATCC 11303) 염색체 내에 포스포트랜스아세틸라제(phosphotransacetylase, Pta)를 암호화하는 유전자 중간에 삽입하여 PHA 합성 대장균 변이주인 대장균 B-PHA+를 작제하였다.

전기 작제한 플라스미드 pUC19Red 및 p5184를 전기용출(electroporation)에 의해 대장균 XL1-Blue(Stratagene Cloning System, USA)를 동시에 형질전환하여, PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자와 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자를 가지는 재조합 대장균 XL1-Blue/pUC19Red;p5184를 작제하였다. 또한, 전기작제한 플라스미드 pUC19Red_stb로 전기용출에 의해, 전기 작제한 PHA 합성 대장균 변이주인 대장균 B-PHA+를 형질전환하여 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자와 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자를 동시에 가지는 재조합 대장균 B-PHA+/pUC19Red_stb를 작제하였다. 이들 각각의 재조합 미생물을 적절한 탄소원을 첨가한 배지에서 배양하여 제조된 (R)-3-하이드록시부탄산의 농도를 측정하였다.

그 결과, 전기 각 재조합 균주들의 배양으로 (R)-3-하이드록시부탄산을 효율적으로 생산할 수 있음을 확인하였고, 적합한 배양조건을 확립하였다. 이렇게 결정된 (R)-3-하이드록시부탄산을 생산하기 위한 배양조건은, 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자가 알칼리게네스 레이터스 또는 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자와 동시 도입된 재조합 대장균의 경우, 배양시간이 30 내지 70시간이 바람직하였다.

본 발명은 상호존재가 가능한 플라스미드 벡터로 pUC19과 pACYC184의 조합을 사용하였으나, 상호존재가 가능한 어떠한 벡터들의 조합도 가능함은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다. PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자들 및 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자의 경우에도, 본 발명에서 사용한 랄스토니아 유트로파 유래의 것이 아닌 다른 미생물 유래의 동일한 기능의 효소 유전자들을 사용하여도 숙주 미생물로 사용하는 미생물 내에서 활성만 가진다면 동일하게 사용할 수 있음도, 이 분야의 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다. 또한, 염색체 유전자에 삽입한 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자들도 본 발명에서 사용한 포스포트랜스아세틸라제를 암호화하는 유전자뿐만아니라 미생물 대사에 큰 영향을 주지 않는 염색체 내의 다른 어떤 효소 유전자 부위에 삽입하여 통합하여도 동일하게 사용할 수 있음도, 이 분야의 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다. 이에 덧붙여, 플라스미드들의 발현을 위한 대장균 숙주미생물도 대장균 XL1-Blue 이외의 다른 어떤 대장균을 사용하여도 가능하며, PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자들이 삽입되어 통합된 대장균 변이주를 만들기 위한 대장균 숙주미생물 또한 염색체 변이가 되지 않는 변이주만 아니면 대장균 B 이외의 다른 균종을 사용하여도 무관함은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다. 또한, 본 발명의 균주는 대장균뿐만 아니라, 상기 효소들이 발현될 수 있는 미생물이라면 어떤 것을 사용하여도 무관함은 자명하다 할 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자의 클로닝

랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자를 재조합 대장균에 클로닝하기 위하여, 마머(Marmur)의 방법(참조: Marmur, J. Mol. Biol., 3:208-218, 1961)으로 분리한 랄스토니아 유트로파 염색체 유전자를 주형 DNA로 하여, 랄스토니아 유트로파의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자 서열(참조: Saito and Saegusa, GenBank Sequence Database, AB017612, 2001)로부터 작한 프라이머 1, 5'-GCTCTAGAGGATCCTTGTTTTCCGCAGCAACAGCT-3'(서열번호 4) 및 프라이머 2, 5'-CGGGATCCAAGCTTACCTGGTGGCCGAGGC-3'(서열번호 5)를 사용하여, 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 전기 중합효소 연쇄반응에서, 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 5분간 1회 수행하였고, 이후 두 번째 변성은 95℃에서 50초간, 교잡(annealing)은 55℃에서 1분 10초간, 연장(extention)은 72℃에서 3분간 수행하였으며, 이를 30회 반복하고, 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장을 1회 수행하였다. 이와 같은 방법으로 얻어진 DNA를 제한효소BamHI으로 절단한 후, 아가로즈 겔 전기영동하여 약 1.4kbp 크기의 DNA 절편을 분리하고, 이를 동일한 제한효소로 절단한 플라스미드 pUC19(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; New England Biolabs, USA)에 클로닝하여, 재조합 플라스미드 pUC19Red를 작제하였다. 아울러, pUC19Red를 전기용출방법으로 대장균 XL1-Blue에 도입하고, 엠피실린(ampicillin, 50㎎/L)과 박토-아가(bacto-agar, 15g/L)가 첨가된 LB 평판배지(이스트 추출물, 5g/L; 트립톤, 10g/L; NaCl, 10g/L)에서 선별하여, 재조합 대장균 XL1-Blue/pUC19Red를 제조하였다. 클로닝된 DNA 절편의 유전자 염기서열을분석하여, GenBank™에 등록된 염기서열과 비교해 본 결과, 고유의 항시적(constitutive) 발현 프로모터 영역과 리보솜 결합부위(ribosome binding site) 영역을 포함하는 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자임을 확인할 수 있었다. 도 1은 본 발명의 재조합 플라스미드 pUC19Red의 유전자 지도이다.

또한, 플라스미드 pSYL105(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44: 1337-1347, 1994)를 제한효소EcoRI과BamHI으로 절단하여 얻은parB(hok/sok)locus(참조: Gedes, Bio/Technology, 6:1402-1405, 1988)를 포함하는 DNA조각을 분리 수득하고, 이를 전기 pUC19Red에 삽입하여 pUC19Red_stb를 작제하였다. 도 2는 본 발명의 재조합 플라스미드 pUC19Red_stb의 유전자 지도이다.

실시예 2: 재조합 대장균 내에 동시존재 가능한 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 갖는 플라스미드의 작제

전기 실시예 1에서 작제한 플라스미드 pUC19Red 및 pUC19Red_stb는 세포내에 합성된 PHA를 단량체로 분해하는데 관여하는 효소들만을 발현할 수 있어, (R)-3-하이드록시부탄산을 재조합 대장균에 의해 생산하기 위해서는 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 같이 대장균에 도입하여야만 한다. 따라서, 대장균 내에 ColE1 호환 그룹 복제기원을 가지는 pUC19 유래 플라스미드들과 동시에 존재가 가능하고 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 갖는 플라스미드 p5184를 다음과 같이 작제하였다: 먼저, 플라스미드 pSYL105를 제한효소XbaI으로 절단한 후, 아가로즈 겔 전기영동으로 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자와 hok/sok 유전자를 포함하는 5.6kbp 크기의 DNA 절편을 분리하고, 이를 동일한 제한효소로 절단한 플라스미드 p15A 복제기원을 가지는 플라스미드 pACYC184[New England Biolabs, USA]에 클로닝하여 재조합 플라스미드 p5184를 작제하였다. 도 3은 본 발명의 재조합 플라스미드 p5184의 유전자 지도이다.

실시예 3: PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자들이 염색체 내에 삽입된 대장균의 작제

상동성 재조합(homologous recombination)방법(참조: Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 97:5978-5983, 2000)에 의해 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자들을 대장균 포스포트랜스아세틸라제(phosphotransacetylase, Pta)를 암호화하는 유전자 내에 삽입하고자, 프라이머 3, 5‘-GCGAATTCTTTAAAGACGCGCGCATTTCTAAACT-3'(서열번호 6) 및 프라이머 4, 5’-GCGGTACCGAGCTCCGGGTTGATCGCACAGTCA-3'(서열번호 7)와 프라이머 5, 5‘-GGCGAGCTCGCGCATGCCCGACCGCTGAACAGCTG-3'(서열번호 8) 및 프라이머 6, 5’-GCAAGCTTTTTAAAGCGCAGTTAAGCAAGATAATC-3'(서열번호 9)으로 대장균 B(ATCC 11303)의 염색체 유전자(chromosomal DNA)를 주형으로 하여, 중합효소 연쇄반응(polymerasechain reaction, PCR)으로 대장균 포스포트랜스아세틸라제를 암호화하는 유전자를 전반부와 후반부로 나누어 각각 증폭하고, 이들을 각각 제한효소EcoRI과KpnI, 그리고 제한효소SphI과HindIII로 절단하여 플라스미드 pUC19의 동일한 제한효소 위치에 각각 삽입하였다. 카나마이신 내성(kanamycin resistance) 유전자는 프라이머 7, 5‘-GCTCTAGAGAGCTCAAAGCCACGTTGTGTCTCAAA-3'(서열번호 10) 및 프라이머 8, 5’-GCGCATGCTTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3'(프라이머 11)으로 플라스미드 pACYC177(New England Biolabs, USA)을 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응으로 증폭한 후, 제한효소SalI과SphI으로 절단하여 전기 두 pta 유전자 조각들이 함께 삽입된 플라스미드의 동일한 제한효소 위치에 삽입하고, pSYL105를 제한효소BamHI으로 절단하여 얻은 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 포함하는 유전자 절편 또한BamHI 위치에 삽입하였다. 이 후, 제한효소 DraI으로 절단하여, 전기 모든 유전자들을 포함하는 절편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.

플라스미드 pTrcEBG(참조: 대한민국 특허출원 제 10-2001-48881호)로 형질전환된 대장균 B(ATCC 11303)를 IPTG로 유도한 후, 이를 컴피턴트 세포(competent cell)로 사용하였고, 이 균주에 전기 준비한 유전자 절편을 전기용출방법으로 넣은 후, 카나마이신이 첨가된 Luria-Bertani(LB) 평판배지에 도말하여 상기 유전자 절편이 염색체에 삽입된 균주를 선별하였다. 이어, 카나마이신이 첨가된 LB 액체배지에서 2일간 계대배양한 후 플라스미드 pTrcEBG를 상실한 균주를 선별하고, PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자의 삽입여부는 염색체 유전자를 분리하여 PCR에 의해 확인하였다. 또한, 포도당 첨가배지에서 배양하여 PHA가 합성됨을 확인함으로써 PHA 생합성효소계가 활성을 가짐을 확인하고, 상기 선별된 재조합 대장균을 '대장균(E. coli) B-PHA+'라 명명하였다.

실시예 4: (R)-하이드록시카르복실산 생산균주의 작제

전기 실시예 1와 실시예 2에서 작제한 두 플라스미드 pUC19Red와 p5184를 함께 전기용출에 의해 대장균(E. coli) XL1-Blue에 도입하여, 재조합 대장균(E. coli) XL1-Blue/pUC19Red;p5184를 작제하였다. 또한, 전기 실시예 1에서 작제한 플라스미드 pUC19Red_stb로 전기용출에 의해 전기 실시예 3에서 작제한 대장균 변이주 B-PHA+를 형질전환하여, 재조합 대장균 B-PHA+/pUC19Red_stb을 작제하였다.

실시예 5: (R)-하이드록시부탄산의 생산

재조합 대장균(E. coli) XL1-Blue/pSYL105Red(참조: 대한민국 특허출원 제 10-2000-0026158호)를 50㎎/L 엠피실린을 첨가한 LB 배지에서 12시간 배양한 후, 1㎖을 취해 20g/L 포도당과 20mg/L의 티아민(thiamin), 그리고 50㎎/L 엠피실린을 첨가한 100㎖의 R배지(참조: Choi et al., Appl. Environ. Microbiol.,64:4897-4903,

1998)를 넣은 250㎖ 플라스크에 접종하여, 37℃의 온도에서 250rpm의 속도로 교반하며 배양하였다. 또한, 전기 구축한 재조합 대장균 XL1-Blue/pUC19Red;p5184를50㎎/L 엠피실린과 50mg/L 클로람페니콜을 첨가한 LB 배지에서 12시간 배양한 후, 1㎖을 취해 20g/L 포도당, 20mg/L의 티아민, 50㎎/L 엠피실린 및 50mg/L 클로람페니콜을 첨가한 100㎖의 R배지(참조: Choi et al., Appl. Environ. Microbiol.,64:4897-4903, 1998)를 넣은 250㎖ 플라스크에 접종하여 37℃의 온도에서 250rpm의 속도로 교반하며 배양하였다. 도 4는 재조합 대장균 XL1-Blue/pSYL105Red의 배양 중, 시간에 따른 건조균체 농도, 폴리하이드록시부탄산(PHB) 농도, 제조된 단량체 (R)-3-하이드록시부탄산의 염기조건에서의 열분해 전 및 열분해 후의 농도, PHB 생합성 및 분해 속도, 및 PHB 생합성 속도에 대한 PHB 분해속도의 비를 나타낸 그래프이다. 도 5는 본 발명의 재조합 대장균 XL1-Blue/pUC19Red;p5184의 플라스크 배양 중, 시간에 따른 건조균체 농도, PHB 농도, 제조된 단량체 (R)-3-하이드록시부탄산의 염기조건에서의 열분해 전 및 열분해 후의 농도, PHB 생합성 및 분해 속도, 그리고 PHB 생합성 속도에 대한 PHB 분해속도의 비를 나타낸 그래프이다. 도 4와 도 5의 결과에서 볼 수 있듯이, 재조합 대장균 XL1-Blue/pUC19Red;p5184의 경우 PHA 생합성효소계가 상대적으로 낮은 복제수의 플라스미드에 의해 발현되므로, 이들 효소계의 발현정도도 적을 것이 분명하나 오히려 더 빠른 PHA 생합성속도를 나타내었고, 또한 PHA 분해속도도 더 향상된 현상을 보였다. PHA가 분해될 때 이량체 이하의 크기가 되면 쉽게 균체 밖으로 배출되므로 (R)-하이드록시부탄산이 대부분 이량체의 형태로 제조·배출되었으며, 이는 본 발명자들이 이미 보고한 바와 같이 염기조건에서 열분해함으로써 쉽게 단량체로 변환할 수 있다(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65:363-368,1999; 대한민국 특허등록 제 250830호; PCT 국제특허출원 제 PCT/KR98/00395호).

또한, 전기 실시예 4에서 작제한 재조합 대장균 B-PHA+/pUC19Red_stb를 20 g/L의 포도당이 첨가된 R배지(초기 pH 7.0)(참조: Choi et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:4897-4903, 1998) 1.5L가 담긴 2.5L Jar 발효기(KoBiotech, 한국)에서, 37℃의 온도와 500rpm의 속도로 회분식 배양을 수행하였으며, 배양 중 pH 조절은 하지 않았다. 도 6은 본 발명의 재조합 대장균 B-PHA+/pUC19Red_stb의 회분식 배양 중, 시간에 따른 건조균체 농도, PHB 농도, pH, 그리고 제조된 단량체 (R)-3-하이드록시부탄산의 염기조건에서의 열분해 전 및 열분해 후의 농도를 나타낸 그래프이다. 도 6에서 보듯이, 34시간의 배양만으로 총 11.8g/L의 (R)-3-하이드록시부탄산 및 그의 이량체가 제조되어 59%에 달하는 최종수율을 보였다. 또한, 배양 말기까지 플라스미드를 잃어버린 균주가 발견되지 않아 플라스미드의 안정성도 우수함을 확인하였고, 이에 따라 플라스미드의 유지를 위한 항생제의 사용도 필요하지 않았다.

실시예 6: (R)-하이드록시부탄산과 (R)-하이드록시발레르산의 동시생산

재조합 대장균 B-PHA+/pUC19Red_stb를 LB 배지에서 12시간 배양한 후, 1㎖을 취해 10g/L의 포도당과 1g/L의 프로피온산(propionic acid)이 첨가된 100㎖의 R배지(참조: Choi et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:4897-4903, 1998)를 넣은 250㎖ 플라스크에 접종하고, 37℃의 온도에서 250rpm의 속도로 교반하며 배양하였다. 48시간 배양 후 염기조건에서 열분해 한 후 HPLC로 측정한 결과, 4.1 g/L의 (R)-3-하이드록시부탄산과 0.4 g/L의 (R)-3-하이드록시부탄산이 제조되었음을 확인하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 세포내 폴리하이드록시알칸산(PHA) 분해효소(intracellular PHA depolymerase)를 암호화하는 유전자와 PHA 생합성효소계(PHA biosynthesis related enzymes)를 암호화하는 유전자가 함께 도입된 재조합 미생물 및 전기 재조합 미생물을 배양하여, 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 전기 재조합 미생물에서 제조된 PHA는 균체 내에 남아있지 않고 대부분 (R)-하이드록시카르복실산으로 분해되어 배지 내로 방출되기 때문에, (R)-하이드록시카르복실산의 생산공정이 크게 간소화되고, 기질의 낭비를 줄여 전체 수율이 증가하므로, 본 발명을 광학적으로 순수한 다양한 (R)-하이드록시카르복실산 생산에 매우 폭넓게 응용할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

세포내 PHA 분해효소(intracellular polyhydroxyalkanoate depolymerase)를 암호화하는 유전자(서열번호 1) 및 PHA 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase, PhaC), 베타-케토티올라제(β-ketothiolase, PhaA)와 환원효소(reductase, PhaB)로 구성된 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자(서열번호 3)를 포함하는 재조합 유전자로 동시에 형질전환된, 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,

세포내 폴리하이드록시알칸산 분해효소를 암호화하는 유전자 및 폴

리하이드록시알칸산 합성효소계를 암호화하는 유전자는 랄스토니아

유트로파(Ralstonia eutropha)로부터 유래된 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,

세포내 폴리하이드록시알칸산 분해효소를 암호화하는 유전자는 폴리하이드록시알칸산 생합성효소계를 암호화하는 유전자보다 더 많은 복제수로 존재하는 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,

미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,

미생물은 대장균(E. coli) XL1-Blue인 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,

(R)-하이드록시카르복실산은 (R)-3-하이드록시부탄산 및 (R)-3-하이드록시발레르산인 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물.
제 6항에 있어서,

(R)-3-하이드록시부탄산 및 (R)-3-하이드록시발레르산은 단량체 또는 이량체의 형태인 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물.
광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물인 대장균(E.coli) XL1-Blue/pUC19Red;p5184.
염색체 내에 폴리하이드록시알칸산 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 포함하고 세포내 폴리하이드록시알칸산 분해효소를 암호화하는 재조합 유전자로 형질전환된, 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물.
제 9항에 있어서,

폴리하이드록시알칸산 생합성효소계를 암호화하는 유전자는 염색체 내의 포스포트랜스아세틸라제(phosphotransacetylase, Pta)를 암호화하는 유전자 내부에 통합된 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물.
제 9항에 있어서,

세포내 폴리하이드록시알칸산 분해효소를 암호화하는 유전자는 플라스미드에 삽입된 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물.
제 9항에 있어서,

세포내 폴리하이드록시알칸산 분해효소를 암호화하는 유전자는 대장균 플라스미드 R1 유래의parB(hok/sok) locus(서열번호 2)와 동시에 플라스미드에 삽입된 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물.
제 9항에 있어서,

세포내 폴리하이드록시알칸산 분해효소를 암호화하는 유전자 및 폴리

하이드록시알칸산 합성효소계를 암호화하는 유전자는 랄스토니아 유트

로파(Ralstonia eutropha)로부터 유래된 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물.
제 9항에 있어서,

미생물은 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물.
제 9항에 있어서,

미생물은 대장균(E. coli) XL1-Blue 또는 대장균 B인 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물.
제 9항에 있어서,

(R)-하이드록시카르복실산은 (R)-3-하이드록시부탄산 및 (R)-3-하이드록시발레르산인 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물.
제 16항에 있어서,

(R)-3-하이드록시부탄산 및 (R)-3-하이드록시발레르산은 단량체 또는 이량체의 형태인 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물.
광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산하는 재조합 미생물인 대장균(E. coli) B-PHA+/pUC19Red_stb.
제 1항의 재조합 미생물을 배양하고, 그로부터 (R)-하이드록시카르복실산을 수득하는 단계를 포함하는 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법.
제 19항에 있어서,

배양은 연속식 또는 회분식 배양으로 수행됨을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법.
제 19항에 있어서,

(R)-하이드록시카르복실산은 (R)-3-하이드록시부탄산 및 (R)-3-하이드록시발레르산인 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법.
`제 21항에 있어서,

(R)-3-하이드록시부탄산 및 (R)-3-하이드록시발레르산은 단량체 또는 이량체의 형태인 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법.
제 9항의 재조합 미생물을 배양하고, 그로부터 (R)-하이드록시카르복실산을 수득하는 단계를 포함하는 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법.
제 23항에 있어서,

배양은 연속식 또는 회분식 배양으로 수행됨을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법.
제 23항에 있어서,

(R)-하이드록시카르복실산은 (R)-3-하이드록시부탄산 및 (R)-3-하이드록시발레르산인 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법.
`제 25항에 있어서,

(R)-3-하이드록시부탄산 및 (R)-3-하이드록시발레르산은 단량체 또는 이량체의 형태인 것을 특징으로 하는

광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법.
대장균(E. coli) XL1-Blue/pUC19Red;p5184를 배양하고, 그로부터 (R)-하이드록시카르복실산을 수득하는 단계를 포함하는 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법.
대장균(E. coli) B-PHA+/pUC19Red_stb를 배양하고, 그로부터 (R)-하이드록시카르복실산을 수득하는 단계를 포함하는 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법.