KR20030035047A - Use of BMP-4 gene and its gene product for treatment and diagnosis of Lichen Planus - Google Patents

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KR20030035047A
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Abstract

PURPOSE: A method of treating and diagnosing Lichen Planus using the expression of a bone morphogenic protein-4(BMP-4) gene is provided, thereby diagnosing and curing Lichen Planus by inhibiting expression of the BMP-4 gene or protein. CONSTITUTION: The BMP-4 gene has the nucleotide sequence(Genbank NM-001202) described in Fig. 1. p-53 induced by the BMP-4 gene over-expressed in the epithelial tissue of the mouth makes Lichen Planus progress. On the basis of this, Lichen Planus is treated by using anti-sense DNA or RAN of the BMP-4 gene to inhibit its expression or a monoclonal antibody to specifically bind to the BMP-4 protein.

Description

B M P - 4 유전자 발현을 이용한 편평태선 질환의 치료 및 진단방법{Use of BMP-4 gene and its gene product for treatment and diagnosis of Lichen Planus}Use of BMP-4 gene and its gene product for treatment and diagnosis of Lichen Planus}

본 발명은 BMP-4 유전자 발현을 이용한 편평태선 질환의 치료 및 진단방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 BMP-4 유전자 산물이 구강 상피세포의 분화, 사멸뿐만 아니라 구강 및 피부에서 발생하는 편평태선 질환 유발인자임을 밝히고, 상기 질환과 연관된 다양한 SNP를 규명함으로써 편평태선 질환에 대한 유전자 수준에서의 진단 및 치료가 가능함을 보여주는 BMP-4 유전자 발현을 이용한 편평태선의 치료 및 진단방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for treating and diagnosing squamous gland disease using BMP-4 gene expression. More specifically, the BMP-4 gene product is a squamous gland disease occurring in the oral cavity and skin as well as differentiation and death of oral epithelial cells. The present invention relates to a method for treating and diagnosing lichen planus using BMP-4 gene expression, which reveals that it is a trigger and identifies various SNPs associated with the disease.

편평태선(Lichen Planus; LP)은 눈, 피부, 입과 생식기의 점액질 내면에 영향을 끼치는 만성적인 염증성의 자가면역 피부질환으로, 이는 백혈구가 종종 잇몸이나 피부의 정상적인 부분과 점막, 두피, 손톱, 드물게는 눈 등을 공격하는 것을 말한다. 이런 자가면역체계의 혼란은 인체 면역시스템이 박테리아나 바이러스, 또는 다른 어떤 이물질들에 대해 인체가 방어할 목적으로 인체의 건강한 조직과 세포, 기관들을 항원으로 인식해 그것에 대한 항체를 생산하고 기능부전을 일으키는데서 야기된다. 이 질환은 피부위 또는 점액질 위에서의 발진과 같은 염증과 가려움을 동반한 수포가 나타나는 특징이 있다. 이것은 단독으로 나타나거나, 시각의 자가면역 안질환(cicatricial pemphigoid), 루푸스(lupus; 인체기관이나 혹은 어느 한부분과 연관돼 온몸에 영향을 주는 자가면역질환), 사코이도시스(sarcoidosis), 또한 몸 전체에서의 자가면역질환과 같은 다른 자가면역질환과 함께 나타나기도 한다. 이와같이 편평태선 질환은 그 지속성과 격렬함을 예측할 수 없기 때문에 완차릴 장담하기 어려운 질병으로 입안과 피부 위 둘다 나타날 수도 있는데, 어떤 환자들은 안과 밖 둘다 손상을 입기도 하고 일정기간 사라졌다가 다시 나타나기도 하는 재발성질환이다. 편평태선의 손상은 몇가지 다른 형태로 나타나며 동시에 다양한 증상을 수반하는데 그 손상은 보통 white, slender, radiating line처럼 보이기도 하고 또는 붉은 색을 띠어 궤양 비슷하게 보이기도 한다. 그러나 편평태선은 보통 white라고 특징지어지는데 이것은 바위 위에서 자라는 lichen plant의 형상과 비슷한 striae라고 불리는 상호연결된 선들 때문이다.Lichen Planus (LP) is a chronic inflammatory autoimmune skin disease that affects the mucous linings of the eyes, skin, mouth and genital organs. Leukocytes are often associated with normal parts of the gums or skin, mucous membranes, scalp, nails, Rarely it means to attack the eyes. This disruption of the autoimmune system causes the body's immune system to recognize healthy tissues, cells and organs of the body as antigens for the body's defense against bacteria, viruses, or any other foreign substance, producing antibodies against them and preventing dysfunction. It is caused by the cause. The disease is characterized by the appearance of blisters with inflammation and itching, such as a rash on the skin or mucus. It can be manifested alone or in the visual autoimmune eye disease (cicatricial pemphigoid), lupus (autoimmune disease affecting the entire body in association with human organs or parts), sarcoidosis, or the whole body. It can also be seen with other autoimmune diseases, such as Essen's autoimmune disease. This is a condition that can't be predicted because it can't predict its persistence and intensity, and it can appear both in the mouth and on the skin. Some patients have both internal and external injuries and disappear and reappear for some time. It is a recurrent disease. Injuries of the lichen planus come in several different forms and at the same time carry a variety of symptoms, which usually look like white, slender or radiating lines, or appear red and look like ulcers. But the lichen is usually characterized by white because of the interconnected lines called striae, which resemble the shape of a lichen plant growing on a rock.

현재 전체인구의 1%가 이 질환의 영향을 받으며 치과병원 내에서의 환자의약 5%가 편평태선(Lichen Planus)를 앓고 있는 것으로 추산되고 있다. 보통 손상부위는 직경 2-3mm이고 손목과 발목에서 보이며, 작고 가렵고 변색될 수 있는데, 이 질환은 보통 30-65세 사이의 중장년층에게 영향을 주는데 간혹 어린이나 젊은이들에게도 나타나기도 한다. 또한, 이 질환은 또한 성별이나 인종성향과는 관계가 없지만 특히 여성에게서 많이 나타나는 특이한 점이 있었다. 대부분의 환자들이 이 질환에 걸리고도 1년 또는 2년이상을 방치하고 있다가 조직의 진무름과 결국에는 어떤 결함까지 유발시키게 되는 극도의 가려움과 되풀이되는 병변으로 인해 만성으로까지 발전하게 되며 심지어는 손을 쓸 수 없는 지경에 이르게 되는 경우가 많다.It is estimated that 1% of the population is affected by this disease, and about 5% of patients in dental hospitals have Lichen Planus. Usually the damaged area is 2-3mm in diameter, visible on the wrists and ankles, and can be small, itchy and discolored. The disease usually affects older adults between 30 and 65 years of age, sometimes in children and young people. In addition, the disease was also unrelated to gender and racial disposition, but was particularly unique in women. Most patients have left the disease for more than one or two years, and then develop chronically due to extreme itching and recurring lesions that cause tissue sores and eventually any defects. In many cases, you can't use it.

한편, 편평태선 질환은 전염성이 없다. 상기 질환이 1869년 처음 발견된 이래 다른 사람으로의 전염사실은 없었으며, 유전된다는 가능성도 없었다. 상기 질환은 균질환, 일종의 곰팡이성 질환도 아니지만, 몇몇 편평태선 환자들에서는 칸디다증이라 불리는 질환이 나타나기도 한다. 몇몇 연구에서는 편평태선 환자군내에서 칸디다증의 비율이 높게 나타나는 것도 있었다.On the other hand, lichen planus disease is not contagious. Since the disease was first discovered in 1869, there has been no transmission to other people, nor has it been inherited. The disease is not a homogenous disease, a type of fungal disease, but in some patients with lichen planus, a disease called candidiasis occurs. Some studies have shown high rates of candidiasis in the group of patients with lichen planus.

편평태선의 원인은 일종의 자가면역질환이라는 것외에는 그 원인이 아직 뚜렷이 밝혀지지는 않았지만 몇몇 인자가 그 질환의 진행에 관련된 가능한 인자로 작용한다는 것이 알려져 있다. 최근 연구에서는 랑게르한스 세포와 상피 항원성 마크로파지뿐만 아니라 T4 와 T8 림프구의 역할에 주목하고 있는데, 면역시스템이 1형 당뇨병을 가진 환자에 있어 구강 편평태선의 진전에 비관적인 역할을 한다는 논의가 진행중이다. 또한 어떤 환자들에서는 헤파티티스 C 바이러스 감염과 편평태선 사이의 중요한 연관관계가 제시되기도 한다. 이 연관관계의 메커니즘은 아직 알려진 바가 없고 단지 변화된 상피항원의 세포-매개성 면역반응을 포함하는 가능성일 뿐이다. 편평태선의 다른 원인으로 감정적 스트레스, 유전학적인 경향, 약물민감성, 쇠약, 박테리아 또는 바이러스감염에 의한 것 등이 있다. 몇몇 환자들의 보고서에서는 스트레스를 받는 기간동안 상태가 더 나빠지거나 재발하며, 스트레스를 받지 않을때에는 상태가 진정된 것을 관찰할 수 있었다.Although the cause of the lichen planus is a type of autoimmune disease, the cause is not yet clear, but it is known that some factors act as possible factors related to the progression of the disease. Recent studies have focused on the role of T4 and T8 lymphocytes, as well as Langerhans cells and epithelial antigenic macrophages, and a discussion is underway that the immune system plays a pessimistic role in the progression of oral lichen planus in patients with type 1 diabetes. In some patients, an important link between hepatitis C virus infection and lichen planus has been suggested. The mechanism of this association is not yet known and is only a possibility to involve cell-mediated immune responses of altered epithelial antigens. Other causes of lichen planus include emotional stress, genetic trends, drug sensitivity, weakness, bacterial or viral infections. In some patients' reports, it was observed that the condition worsened or recurred during the stress period, and that the condition calmed down when not under stress.

또한, 편평태선은 구강암의 직접적인 유발요인은 아니나 전암 단계라는 몇가지 증거를 보이고 있는데, 이와 관련하여서는 붉은 병소(red area)를 동반한 손상이 가장 일반적인 증거이다. 이것은 암과 관련됐다는 점을 보여주고 있기 때문에 편평태선으로 진단된 환자들은 규칙적이고 주의깊게 증상을 관찰하고 검사하는 것이 좋다.In addition, there is some evidence that lichen planus is not a direct cause of oral cancer but is a precancerous stage. In this regard, damage with red area is the most common evidence. Since this has been shown to be associated with cancer, patients diagnosed with lichen planus should monitor their symptoms regularly and carefully.

현재 편평태선에 있어서는 코르티코스테로이드(corticosteroid)가 가장 유용한 치료법이며, 이것은 증상을 완화를 가져올 뿐 완치를 위한 치료법은 아직 알려진 것이 없다. 즉, 상기 처치는 비록 전조증상을 경험한 환자들에 있어 질환이 나타난 조직주위의 민감함과 통증 등을 완화시키는데 있어서는 중요하지만 대부분의 환자들에게 있어 구강 손상은 만성적이고 지속적이기 때문에, 질환의 지속성과 격렬함을 예측할 수 없고 완치도 장담하기 어렵다는데 문제점이 있다. 또한, 편평태선 치료를 위한 이러한 스테로이드의 사용이 단기적으로는 문제가 되지 않지만 장기간 사용시에는 부작용을 일으킬 수 있기 때문에 당뇨병, 녹내장, 다른 금기약물 조건을 가진 환자들에서는 상기 치료법을 피해야 한다는 것이다.Currently, corticosteroids are the most useful treatments for the lichen planus, which can relieve symptoms but there is no known cure for cures. In other words, although the treatment is important in alleviating the sensitivity and pain around the tissues in which the disease has occurred in patients with prognostic symptoms, the oral damage is chronic and persistent in most patients. The problem is that it is difficult to predict the excessive intensity and the cure. In addition, the use of such steroids for the treatment of lichen planus is not a problem in the short term but may cause side effects with prolonged use, which should be avoided in patients with diabetes, glaucoma and other contraindications.

또한, 대부분의 편평태선 환자들은 전조증상이 없어서 정기적인 구강검사에서 간혹 그 손상을 발견하기도 하는데, 현재 평편태선의 진단은 생체조직을 현미경검사하는 방법을 통해서 확증된다. 생검은 그 질환의 적절한 진단을 위해 손상주변 부위를 채취해서 직접 면역형광방법에 의한 연구 및 병리학 테스트를 거쳐야 하며 그 질환이 악성으로 전이되는 것을 막기 위해 1년에 한번 꾸준히 지켜봐야 한다.In addition, most patients with squamous gland have no prognostic symptoms, and sometimes the damage is detected by regular oral examination. Currently, the diagnosis of the planar gland is confirmed by microscopic examination of living tissue. Biopsies should be taken from the area around the injury to undergo proper immunofluorescence and pathological testing for proper diagnosis of the disease and should be monitored once a year to prevent the disease from spreading to malignancy.

이와 같이 편평태선은 구강 및 피부에서 발생하는 질환의 일종으로 단지 면역체계와 연관된 질환이라는 것만 알려져 있을뿐, 아직 그 질환 발병의 정확한 기전은 밝혀져 있지 않은데다가, 생검과 실험실 테스트를 수행하는 진단방법 자체가 시간을 요하고 까다로우며 치료에 있어서도 스테로이드 처방이 일시적으로는 상황을 호전시키더라도 장기적으로는 완전한 치료가 안되어 재발될 뿐만 아니라 부작용을 초래하는 문제점도 있었다. 이에, 본 발명자들은 정상 구강조직 및 환자의 구강조직을 이용하여 편평태선의 정확한 발병 기전을 밝히기 위해 면역화학염색법 및 분자생물학적 방법 등을 사용하여 연구 시험한 결과, BMP-4 유전자 산물이 편평태선을 유발하는 인자라는 것을 증명하고, 이러한 사실로부터 유전자 수준에서 편평태선의 치료 및 진단이 가능함을 밝혀 본 발명을 완성하게 되었다.As described above, it is known that squamous gland is a type of disease occurring in the oral cavity and skin. It is only known to be related to the immune system, and the exact mechanism of the disease is not known yet. In addition to the time-consuming and demanding treatment, even if the steroid regimen temporarily improves the situation, in the long term, it is not completely cured and recurs as well as causing side effects. Accordingly, the present inventors conducted studies using immunochemical staining and molecular biological methods to determine the exact pathogenesis of the lichen planus using normal oral tissue and oral tissue of the patient. The present invention proves that it is an inducing factor, and from this fact, it is possible to treat and diagnose squamous gland at the genetic level.

따라서, 본 발명의 목적은 BMP-4 유전자의 발현이나 그 유전자 산물의 활성을 억제하여 편평태선을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for treating lichen planus by inhibiting the expression of the BMP-4 gene or the activity of the gene product thereof.

본 발명의 또 다른 목적은 BMP-4 유전자산물에 대한 단일클론항체를 이용하여 편평태선을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for diagnosing lichen planus using a monoclonal antibody against a BMP-4 gene product.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다. 본 발명의 목적 및 다른 잇점들은하기 구성에 의해 보다 명백히 이해될 것이다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail. The objects and other advantages of the present invention will be more clearly understood by the following configuration.

도 1은 BMP-4유전자의 염기서열(Genbank NM_001202)을 나타낸 것이다.1 shows the nucleotide sequence of the BMP-4 gene (Genbank NM_001202).

도 2는 BMP-4 유전자(Genbank NM_001202)로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.Figure 2 shows the amino acid sequence of a protein expressed from the BMP-4 gene (Genbank NM_001202).

도 3은 BMP-4 SNP(DHPLC) 사진을 나타낸 것이다.Figure 3 shows a BMP-4 SNP (DHPLC) photograph.

도 4는 정상 구강상피 세포에서 면역화학염색법 결과를 나타낸 그림(×400)이다.4 is a diagram showing the results of immunochemical staining in normal oral epithelial cells (× 400).

도 5는 정상 구강상피에서 BMP-4에 대한 인사이투 하이브리다이제이션 결과를 나타내는 그림이다.5 is a diagram showing the results of Insait hybridization for BMP-4 in normal oral epithelium.

도 6은 편평태선에서 상피하 T-림프구 BMP-4 mRNA에 대한 양성 반응을 나타내는 그림이다.Figure 6 is a diagram showing a positive response to subepithelial T-lymphocyte BMP-4 mRNA in the lichen planus.

도 7은 편평태선에서 상피하 T-림프구 BMP-4 mRNA에 대한 양성 반응을 보다 상세히 나타낸 그림이다.Figure 7 shows in more detail the positive response to subepithelial T-lymphocyte BMP-4 mRNA in the lichen planus.

도 8은 편평태선에 대한 BMP-4의 mRNA 인사이투 하이브리다이제이션을 나타내는 그림이다.Figure 8 is a diagram showing mRNA mRNA hybridization of BMP-4 against the lichen planus.

도 9는 H＆E 염색사진이며, 화살표는 T-림프구 인필트레이션을 나타내는 그림이다.9 is an H & E stained photograph, and an arrow is a diagram showing T-lymphocyte infiltration.

도 10은 정상조직의 그림이다.10 is a picture of normal tissue.

도 11은 10ug/ml의 BMP-4 함유 비드를 이용한 장기배양 실험에서 p-53이 상피세포에서 유도됨을 보여주는 그림이다.FIG. 11 is a diagram showing that p-53 is induced in epithelial cells in a long-term culture experiment using 10 μg / ml BMP-4 containing beads.

도 12는 정상조직의 그림이다.12 is a picture of normal tissue.

도 13은 생리식염수 함유 비드를 이용한 장기배양 실험에서 p-53이 유도되지 않음을 보여주는 그림이다.FIG. 13 is a diagram showing that p-53 is not induced in long-term culture experiments using saline-containing beads.

도 14는 타액선 기원의 BMP-4가 구강상피세포의 분화에 미치는 영향에 대한 BMP-4 mRNA의 인사이투 하이브리다이제이션을 나타내는 그림이다.14 is a diagram showing the induction of BMP-4 mRNA hybridization on the effect of BMP-4 of salivary gland origin on the differentiation of oral epithelial cells.

도 15는 타액선 기원의 BMP-4가 구강상피세포의 분화에 미치는 영향에 대한 BMP-4의 mRNA의 인사이투 하이브리다이제이션을 보다 상세히 나타내는 그림이다.FIG. 15 is a diagram showing in detail the in-situ hybridization of mRNA of BMP-4 on the effect of BMP-4 of salivary gland origin on differentiation of oral epithelial cells.

본 발명은 BMP-4 유전자(Genbank NM_001202)의 발현 및 그로부터 발현된 단백질을 이용하여 편평태선을 치료 또는 진단하는 방법에 관한 것으로, 편평태선에서 항상 발현되는 BMP-4 단백질이 편평태선에서의 세포사멸 활성 및 구강함 유도작용을 가진다는 사실에 근거하여 편평태선 질환의 질환의 예방 또는 치료, 추가적으로는 구강암 치료에 BMP-4 단백질 및 그 유전자를 이용하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for treating or diagnosing lichen planus using the expression of the BMP-4 gene (Genbank NM_001202) and a protein expressed therefrom, wherein the BMP-4 protein, which is always expressed in the lichen planus, is apoptosis in the lichen planus. The present invention relates to the use of BMP-4 protein and its genes for the prevention or treatment of diseases of the lichen planus disease, and in addition to the treatment of oral cancer, based on the fact that they have activity and oral cavity induction.

현재, 신생 골 형성은 TGF-β수퍼패밀리에 속하는 뼈 형태 발생 인자(bone morphogenic protein)인 BMP-1 내지 BMP-14에 대해 보고되어 있는데(Science 150, 893-897, 1965; Science 242; 1528-1534, 1988), 이들 BMP는 여러가지 뼈 기능장애 및 뼈 질환의 치료적 및 예방적 처치에 효과적인 것으로 여겨지고 있다(U.S. Pat. No. 5,106,748; U.S. Pat. No. 5,187,076; U.S. Pat. No. 5,141,905, WO93/00432).Currently, new bone formation is reported for BMP-1 to BMP-14, bone morphogenic proteins belonging to the TGF-β superfamily (Science 150, 893-897, 1965; Science 242; 1528-). 1534, 1988), these BMPs are believed to be effective in the therapeutic and prophylactic treatment of various bone dysfunctions and bone diseases (US Pat. No. 5,106,748; US Pat. No. 5,187,076; US Pat. No. 5,141,905, WO93). / 00432).

이 중 BMP-4 단백질은 아미노산 서열이 BMP-2 단백질((U.S. Pat. No. 5,013,649; Groeneveld, E. H. J. ＆ Burger, E. H. Bone morphogenetic proteins in human bone regereration. 2000. Eur. J. Endocrinol. 142, 9-21)과 유사하며 현재까지 이들에 관한 연구도 주로 신생골의 형성과 관련된 것에 집중되어 왔고 실제로 인공뼈에 BMP-4를 첨가한 제품이 등장하여 상품화 단계에 이르고 있으며, 생체내 골 결손부에 가능한 고농도의 BMP-4를 전달하려는 시도는 현재도 계속 이루어지고 있다(U.S. Pat. No. 6,245,889).Among them, the BMP-4 protein has an amino acid sequence of BMP-2 protein (US Pat. No. 5,013,649; Groeneveld, EHJ & Burger, EH Bone morphogenetic proteins in human bone regereration. 2000. Eur. J. Endocrinol. 142, 9- 21) and the research on these has been focused mainly on the formation of new bone, and in fact, products with BMP-4 added to artificial bones have emerged in the commercialization stage, and have high concentrations possible in bone defects in vivo. Attempts to deliver BMP-4 are still ongoing (US Pat. No. 6,245,889).

그러나, 이러한 고전적인 BMP-4의 알려진 기능과는 별개로 1990년도 초반부터 발생학에서 BMP-4의 기능에 대한 연구가 시작되어 1998년에는 백서에서 BMP-4와 FGF-8의 상호작용이 치아의 형태를 결정하는 주요인자라고 네이쳐(nature)지에 발표되었고, 이후에는 여러 종에서 발생의 초기단계에 배아의 향후 발생운명을 결정하는데 중요하게 관여한다고 알려져 있는데, 이는 배아에 대한 면역화학염색법이나 인사이투 하이브리다이제이션 실험에 의해 양성신호가 편측에 치우쳐 발현됨을 보임으로써 증명되었다.However, apart from the known functions of classical BMP-4, studies of BMP-4's function in embryology began in the early 1990s, and in 1998, the white paper's interaction between BMP-4 and FGF-8 It is a major determinant of morphology and has been published in Nature and has since been known to play an important role in determining the future fate of embryos at early stages of development in several species. It was proved by the redidation experiment that the positive signal is expressed on one side.

본 발명자들은 정상구강조직 및 병적인 조직에서 발현되는 성장인자들을 조사하기 위하여 74개의 병조직(병원에 내원한 환자를 수술하고 얻은 조직)을 액화질소에 동결시킨 시편에서 전체 RNA를 추출한 후 BMP-2, BMP-4, BMP-7, BMP-8, FGF-1, FGF-2, FGF-5, FGF-7, FGF-8, PDFG-A, EGF, TGF-a, TGF-b3, GDF-1의 mRNA에 대한 프라이머를 디자인하여 RT-PCR을 시행한 결과, 해부학적인 부위에 따라서 발현되는 양상은 다양하게 나타났으나 상피를 포함한 구강조직에서 BMP-4는 항상 발현됨을 발견하였다. 또한 구강조직에서 항상 발현되는 BMP-4에 대한 SNP(single nucleotide polymorphism) 연구를 수행한 결과, 정상인은 유전자은행의 염기서열(Genbank NM_001202)에 99%가 일치하는 반면 편평태선 환자의 조직은 유전자 은행의 염기서열과의 상동성이 평균 92% 일치함을 발견하여 돌연변이된 BMP-4가 편평태선의 유발인자라는 것을 확인할 수 있었다.In order to investigate the growth factors expressed in normal oral tissues and pathological tissues, the present inventors extracted total RNA from specimens frozen in liquid nitrogen for 74 diseased tissues (surgeries obtained from patients who visited the hospital) and then extracted BMP-. 2, BMP-4, BMP-7, BMP-8, FGF-1, FGF-2, FGF-5, FGF-7, FGF-8, PDFG-A, EGF, TGF-a, TGF-b3, GDF- As a result of designing primers for mRNA of 1, RT-PCR showed that the expressions were varied according to anatomical sites, but BMP-4 was always expressed in oral tissues including epithelium. In addition, SNP (single nucleotide polymorphism) studies on BMP-4, which are always expressed in oral tissues, showed that 99% of the normal people matched the sequence of the GenBank (Genbank NM_001202), whereas the tissues of patients with planar disease were gene banks. The homology with the sequence was found to be 92% on average, confirming that the mutated BMP-4 is a trigger of the planar limb.

본 발명자들은 BMP-4가 정상 구강상피세포의 결합조직측으로 편위되어 발현되는 양상을 관찰하였는데 이는 세포분화에 BMP-4가 관여하기 때문인 것으로 판단된다. 그리고 BMP-4는 인사이투 하이브리다이제이션법에서 나타나는 것과 같이 구강상피의 기저세포층에서 만들어지는 것을 알 수 있었다.The present inventors observed that BMP-4 is biased and expressed on the side of connective tissue of normal oral epithelial cells due to the involvement of BMP-4 in cell differentiation. BMP-4 was also produced in the basal cell layer of the oral epithelium, as shown by the Insatu hybridization method.

본 발명자들은 BMP-4이 편평태선 질환과 관련하여 상피세포에서 p-53 발현을 유도하여 세포사멸 또는 돌연연이된 p-53 발현을 유도 시에는 구강암을 유발할 수도 있음을 발견하였다. 본 발명의 한 실시예에 있어서 10 μg/ml의 BMP-4 함유 비드를 이용한 장기배양실험에서 p-53이 상피세포에서 유도됨을 보여주고 있음을 확인하였으며, BMP-4가 함유되지 않고 생리적 식염수만 함유된 비드를 이용한 장기배양 실험에서는 p-53이 유도되지 않는 결과가 나타나 편평태선에서 T 림프구가 분비한 BMP-4 단백질은 상피 하방에 고농도로 축적될 시에 p-53을 상피세포에서 유도할 수 있음을 알 수 있었는데 이는 편평태선에서 관찰되는 상피세포 기저층에서 어떻게 세포사멸이 일어나는 지를 설명하는 기전이 된다. 그렇기 때문에 기저층의 세포군 중에서 p-53 돌연변이를 가지고 있는 군이 있다면 T 림프구에 의해 분비된 고농도의 BMP-4가 결국 돌연변이된 p-53을 유도할 수 있어 구강암을 유발하는 기전이 될 수도 있다는 것을 알 수 있었다.The inventors found that BMP-4 induces p-53 expression in epithelial cells in association with squamous disease and may induce oral cancer upon induction of apoptosis or mutated p-53 expression. In an example of the present invention, it was confirmed that p-53 was induced in epithelial cells in a long-term culture experiment using 10 μg / ml BMP-4-containing beads, and only physiological saline was not contained BMP-4. Long-term culture experiments with containing beads did not induce p-53. BMP-4 protein secreted by T lymphocytes in the lichen planus induced p-53 in epithelial cells when accumulated at high concentrations below the epithelium. It can be understood that this is a mechanism explaining how apoptosis occurs in the basal layer of epithelial cells observed in the lichen planus. Therefore, if there is a p-53 mutation among the cell groups in the basal layer, the high concentration of BMP-4 secreted by T lymphocytes may eventually lead to mutated p-53, which may be a mechanism for causing oral cancer. Could.

본 발명자들이 발견한 이러한 사실은 이때까지 논란이 되고 있는 편평태선이 전암병소냐는 질문에 대한 답이 될 수 있으며 T 림프구에서 분비되는 BMP-4의 역할을 차단함으로써 이 질환의 치료에 대한 해법을 제공한다. 즉, 편평태선 질환에 있어서 인간 BMP-4의 발현을 억제하는 것이 병의 진행을 차단하고 질환을 치유하는 열쇠가 될 것이며, 한편으로는 인간 BMP-4 발현의 억제를 탐지할 수 있고, 이러한 사실로부터 BMP-4 단백질의 과형성을 방지하는 물질을 탐색하는 스크리닝 방법이 개발된다면 편평태선 질환의 효율적인 진단과 치료방법도 제공할 수 있을 것이다.본 발명자들의 실험 결과로 유추할 수 있는 최대한의 효과는 BMP-4가 편평태선의 결정적인 공여인자라고 할 수 있으며 또한 이의 발현이나 활성을 억제하는 방법을 통해 편평태선 질환에 대한 유전자 수준에서의 진단 및 치료도 가능하다는 것을 보여주고 있는 것이다.The findings of the present inventors may answer the question of whether the controversial squamous line is precancerous and provide a solution to the treatment of this disease by blocking the role of BMP-4 secreted by T lymphocytes. do. In other words, suppressing the expression of human BMP-4 in lichen planus disease will be the key to blocking the progression of the disease and healing the disease, while on the other hand it can detect the suppression of human BMP-4 expression. If screening methods are developed to search for substances that prevent hyperplasia of BMP-4 protein, it would be possible to provide an efficient diagnosis and treatment of squamous disease. The maximum effect that can be inferred from the experimental results of the present inventors is BMP. -4 is a definitive donor of squamous gland, and it is shown that the method of inhibiting its expression and activity can also be used to diagnose and treat at the genetic level of the disease.

따라서, 본 발명은 BMP-4 유전자의 발현이 편평태선 질환의 발명과 진행에 중요한 요소임을 기초로 하여 편평태선 질환의 치료와 진단에 있어서의 상기 유전자의 용도를 제공한다. 즉, BMP-4 유전자, 그 일부 또는 그 돌연변이체나, 상기한 유전자 산물 또는 그에 대한 항체를 이용하여 편평태선의 진단이나 치료에 이용하는 방법을 제공한다. 편평태선 질환의 결정적 인자인 BMP-4 단백질의 활성을 억제하기 위하여 유전자 수준에서 안티센스 방법 등을 통해 유전자 발현을 억제하는 방법과 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 이용하여 단백질의 기능이나 활성을 차단하는 방법은 당업계에 충분히 공지되어 있다(Sambrock et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989).Accordingly, the present invention provides the use of the gene in the treatment and diagnosis of squamous disease on the basis that expression of the BMP-4 gene is an important factor in the development and progression of squamous disease. That is, the present invention provides a method for use in diagnosing or treating squamous gland using the BMP-4 gene, a part or mutant thereof, or the above-described gene product or antibody thereof. In order to inhibit the activity of BMP-4 protein, which is a determinant of squamous cell disease, the function or activity of the protein is suppressed by antisense method at the gene level and monoclonal antibody that specifically binds to the protein. Methods of blocking are well known in the art (Sambrock et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

본 발명의 제1측면에 있어서, 구강 상피조직에서 정상조직보다 과발현되는 BMP-4에 의해 p-53이 유도되어 편평태선 질환이 진행되는 관계를 이용하여 편평태선 질환을 치료하기 위해 BMP-4 유전자 발현을 억제할 수 있는 편평태선 치료용 안티센스 DNA 또는 RNA를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제조된 안티센스 DNA 또는 RNA는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 편평태선 치료용 조성물 형태로 제공될 수 있으며 이러한 목적의 약제형 제조방법에 대해서는 당업계에 충분히 공지되어 있다.In the first aspect of the present invention, BMP-4 gene for treating squamous line disease by using p-53 induced by BMP-4 overexpressed in normal oral epithelial tissue and progressing to squamous line disease It provides a method for producing antisense DNA or RNA for the treatment of lichen planus that can inhibit expression. The antisense DNA or RNA prepared above may be provided in the form of a planar therapeutic composition together with a pharmaceutically acceptable carrier, and a pharmaceutical preparation method for this purpose is well known in the art.

본 발명의 제2측면에 있어서, 구강 상피조직에서 정상조직보다 과발현되는 BMP-4에 의해 p-53이 유도되어 편평태선 질환이 진행되는 관계를 이용하여 편평태선 질환을 치료하기 위해 BMP-4 유전자로부터 암호화되는 단백질에 특이적으로 결합하여 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있는 편평태선 치료용 단일클론항체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제조된 단일클론항체는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 편평태선 치료용 조성물 형태로 제공될 수 있으며 이러한 목적의 약제형 제조방법에 대해서는 당업계에 충분히 공지되어 있다.In a second aspect of the present invention, the BMP-4 gene is used to treat squamous cell disease using a relationship in which p-53 is induced by BMP-4 that is overexpressed in normal oral epithelial tissues rather than normal tissues. It provides a method for producing a monoclonal antibody for the treatment of lichen planus that can specifically bind to the protein encoded by the protein activity. The prepared monoclonal antibody may be provided in the form of a composition for treating lichen planus with a pharmaceutically acceptable carrier, and a pharmaceutical preparation method for this purpose is well known in the art.

본 발명의 제3측면에 있어서, 구강 상피조직에서 정상조직보다 과발현되는 BMP-4에 의해 p-53이 유도되어 편평태선 질환이 진행되는 관계를 이용하여 편평태선 질환을 진단하기 위해 BMP-4 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 편평태선 진단용 단일클론항체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제조된 단일클론항체는 항원-항체 반응을 이용한 ELISA, EIA 등의 효소면역분석법에 이용하거나 단백질칩 등의 제조에 사용될 수 있다.In a third aspect of the present invention, BMP-4 protein for diagnosing squamous gland disease by using p-53 induced by BMP-4 overexpressed in normal oral epithelial tissue and progressing to squamous gland disease It provides a method for producing a monoclonal antibody for diagnosis of lichen planus that can specifically bind to. The prepared monoclonal antibody may be used for enzyme immunoassay such as ELISA, EIA, etc. using an antigen-antibody reaction, or may be used for preparing protein chips.

본 발명의 제4측면에 있어서, 본 발명은 BMP-4 유전자의 발현이나 그 유전자 산물의 활성을 억제하여 편평태선을 치료하는 방법을 제공한다. 이는 BMP-4 유전자 또는 그 일부에 하이브리다이제이션할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 BMP-4 유전자 발현을 억제하거나 BMP-4 유전자 산물에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체를 이용하여 BMP-4 유전자 산물의 활성을 억제함으로써 달성될 수 있다.In a fourth aspect of the present invention, the present invention provides a method for treating squamous line by inhibiting the expression of BMP-4 gene or the activity of the gene product thereof. This can be achieved by using oligonucleotides or polynucleotides that can hybridize to the BMP-4 gene or parts thereof using monoclonal antibodies that can inhibit BMP-4 gene expression or specifically bind to the BMP-4 gene product. It can be achieved by inhibiting the activity of the BMP-4 gene product.

유전자 발현을 억제하기 위한 안티센스법이 편평태선을 치료하기 위한 목적으로 사용될 수 있는데, 이는 BMP-4 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 역방향의 DNA나 RNA를 제공하여 목표로 하는 유전자를 녹아웃시킴으로써 이루어진다. 예컨대, 편평태선의 유전자 치료를 위한 BMP-4 유전자의 용도에 있어서 이 유전자 또는 그 일부에 하이브리다이제이션할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 그 자체로 BMP-4 발현을 억제하거나, 또는 이들을 발현벡터와 같이 그 예가 당업계에 잘 알려진 벡터의 일부로 병소부위 또는 치료를 필요로 하는 조직에 제공되어 BMP-4 유전자의 발현을 억제함으로써 편평태선을 치료 할 수 있다. 치료용 유전자를 투여하는 방법에 대해서는 DNA를 직접 주입하거나 바이러스 벡터 또는 리포좀을 이용하는 방법 등이 당업계에 충분히 공지되어 있다. 한편, BMP-4 발현을 억제하기 위하여 프로모터를 불활성화시킬 수도 있으며, 이 또한 편평태선 치료를 위한 BMP-4 유전자 용도에 포함된다.Antisense methods to inhibit gene expression can be used for the treatment of lichen planus, by knocking out a target gene by providing reverse DNA or RNA capable of complementary binding to BMP-4 mRNA. . For example, in the use of the BMP-4 gene for gene therapy of the lichen planus, antisense oligonucleotides or polynucleotides that can hybridize to this gene or parts thereof inhibit BMP-4 expression, or express them as expression vectors. As an example, a part of a vector well known in the art may be provided to a lesion site or a tissue in need of treatment to treat the lichen planus by inhibiting the expression of the BMP-4 gene. As for the method of administering a therapeutic gene, a method of directly injecting DNA or using a viral vector or a liposome is well known in the art. On the other hand, promoters may be inactivated to inhibit BMP-4 expression, which is also included in the use of the BMP-4 gene for the treatment of lichen planus.

또한, 특정 질병 관련 단백질에 대한 항체를 이용하여 질병을 치료하거나 진단하는 방법에 대해서는 당업계에 충분히 공지되어 있는데, 예컨대 편평태선에서 세포사멸을 유발하는 BMP-4 활성을 억제하기 위하여 정상 또는 돌연변이된 BMP-4 폴리펩티드나 이의 단편을 이용하여 이와 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체를 제조한 후 이를 환자에 투여하여 편평태선을 유발하는 BMP-4 단백질의 활성을 억제함으로써 편평태선을 치료하거나 병의 진행을 중지시킬 수도 있다.In addition, methods of treating or diagnosing a disease using antibodies to certain disease related proteins are well known in the art, for example, normal or mutated to inhibit BMP-4 activity causing apoptosis in the lichen planus. Using a BMP-4 polypeptide or a fragment thereof, a monoclonal antibody that can specifically bind to it is prepared and then administered to a patient to treat or prevent the disease. You can also stop the progress of.

본 발명의 제5측면에 있어서, 본 발명은 BMP-4 유전자 산물에 대한 단일클론항체를 이용하여 편평태선을 진단하는 방법을 제공한다. 이는 BMP-4 유전자 산물에특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체를 이용하여 BMP-4 유전자 산물의 발현양을 조사함으로써 달성될 수 있다. 특정 질병 관련 단백질에 대한 항체를 이용하여 질병을 진단하는 방법에 대해서는 당업계에 충분히 공지되어 있는데, 예컨대 편평태선에서 세포사멸을 유발하는 BMP-4 활성을 억제하기 위하여 정상 또는 변이된 BMP-4 폴리펩티드나 이의 단편을 이용하여 이와 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체를 제조한 후 이를 이용하여 병소에서 발현되는 BMP-4의 발현 및 발현양을 통해 편평태선 질환을 진단할 수도 있다. 단일클론항체는 기본적으로 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 즉, 감작 항원으로 BMP-4단백질을 이용하여 통상의 면역화 방법에 따라 이를 숙주에 면역화시킨 후에 이로부터 만들어진 면역 세포들을 수집하여 통상의 세포융합 방법에 따라 공지의 모세포, 예컨대 미엘로마 세로와 융합시킨 후에 통상의 스크리닝 방법에 따라 BMP-4에 대한 단일클론항체를 생산하는 세포를 스크리닝함으로써 제조될 수 있다.In a fifth aspect of the invention, the invention provides a method for diagnosing lichen planus using a monoclonal antibody against a BMP-4 gene product. This can be achieved by examining the expression level of the BMP-4 gene product using a monoclonal antibody that can specifically bind to the BMP-4 gene product. Methods of diagnosing diseases using antibodies to certain disease related proteins are well known in the art, including BMP-4 polypeptides that are normal or mutated to inhibit BMP-4 activity that causes apoptosis in the lichen planus, for example. By using a fragment thereof, a monoclonal antibody capable of specifically binding to the prepared monoclonal antibody may be used, and then it may be used to diagnose squamous disease through the expression and expression of BMP-4 expressed in the lesion. Monoclonal antibodies can basically be prepared by known methods. That is, by immunizing it with a host using a BMP-4 protein as a sensitizing antigen according to a conventional immunization method, immune cells produced therefrom are collected and fused with a known parental cell, such as myeloma sero, according to a conventional cell fusion method. It can then be prepared by screening cells producing monoclonal antibodies against BMP-4 according to conventional screening methods.

본 발명의 본 측면의 추가적인 실시태양은 생물학적으로, 예방적으로, 임상적으로 또는 치료적으로 유용한 BMP-4 유전자 발현 억제용 올리고뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드 또는 BMP-4 단백질 특이적 결합 단일클론항체 등을 포함하는 조성물에 관계되며, 이들을 제약학적으로 허용되는 공지된 담체 또는 담체들과 조합하여 사용할 수 있다. 또한 이용될 수 있는 올리고뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 단독으로 또는 치료를 위한 화합물과 같은 다른 화합물과 함께 사용될 수도 있으며, 편평태선 치료를 위한 제약 조성물은 상처 부위로의 표적화에 효과적인 공지된 임의의 효과적이고 편리한 방법을 통해 투여될 수 있다.Additional embodiments of this aspect of the invention include oligonucleotides / polynucleotides or BMP-4 protein specific binding monoclonal antibodies for inhibiting BMP-4 gene expression that are biologically, prophylactically, clinically or therapeutically useful. It relates to compositions comprising and can be used in combination with known pharmaceutically acceptable carriers or carriers. Oligonucleotides / polynucleotides and polypeptides that may also be used may be used alone or in combination with other compounds, such as compounds for treatment, and pharmaceutical compositions for the treatment of lichen planus are any known effect effective for targeting to the wound site. Administration may be by any convenient and convenient method.

한편, p53 유전자의 돌연변이 또는 결실로 인하여 발생한 구강암을 치료하는데 있어서, BMP-4가 구강 상피세포에서 돌연변이된 p53 발현을 유도하는 기작을 이용하여 상기와 같은 방법으로 BMP-4의 발현이나 활성을 억제시킴으로써 암 치료효과를 얻을 수도 있을 것이다.On the other hand, in the treatment of oral cancer caused by mutation or deletion of the p53 gene, BMP-4 inhibits the expression or activity of BMP-4 in the same manner by using a mechanism that induces the expression of mutated p53 in oral epithelial cells It may be possible to obtain cancer treatment effects.

편평태선 치료나 진단에 BMP-4 유전자나 그 유전자 산물을 이용하는 또 다른 추가적인 실시태양에 있어서, BMP-4 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA를 이용하여 상기 단백질 기능을 저해하는 화학물질을 스크리닝하고 그것에 얻어지는 화학물질을 유효성분으로 포함하는 의약품 제조도 가능할 것이다. 또한, BMP-4 유전자가 녹아웃되거나 또는 돌연변이된 유전자를 갖는 마우스를 제조하고 이를 유전자의 발현이나 기능, 약제의 스크리닝 등에 이용한다면 매우 유용할 것이다.In another additional embodiment in which the BMP-4 gene or its products are used for the treatment or diagnosis of lichen planus, the BMP-4 protein or DNA encoding the same can be used to screen for and inhibit chemicals that inhibit the protein function. It will also be possible to manufacture pharmaceuticals containing the substance as an active ingredient. In addition, it would be very useful if a mouse having a gene knocked out or mutated with the BMP-4 gene was prepared and used for expression, function, screening of a drug, and the like.

이하, 본 발명의 구성 및 작용효과를 실시예를 통하여 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시에는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration and operation effects of the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following embodiments are only for the purpose of illustrating the present invention and the scope of the present invention is not limited to the following examples.

실시예 1 : RNA 추출Example 1 RNA Extraction

제조사가 권하는 조건에서 TRI REAGENT(Molecular Research Center, Inc. Cincinnati, OH, USA)를 사용하여 균질화된 조직(0.1g)으로부터 전체 RNA를 추출하였다. 호모나이저를 사용하여 TRI REAGENT(1ml/100mg 조직) 내에서 골수조직 샘플을 균질화시켰다(샘플 부피는 균질화에 사용된 TRI REAGENT 부피의 10%를 초과할 수 없다). 균질물을 상온에서 10분동안 보관하여 핵질단백질(nucleoprotein)들이 완전히 분리되도록 하였다.Total RNA was extracted from homogenized tissue (0.1 g) using TRI REAGENT (Molecular Research Center, Inc. Cincinnati, OH, USA) under the manufacturer's recommendations. Homogenizers were used to homogenize the bone marrow tissue sample in TRI REAGENT (1 ml / 100 mg tissue) (sample volume cannot exceed 10% of the TRI REAGENT volume used for homogenization). The homogenate was stored at room temperature for 10 minutes to allow the nucleoproteins to be completely separated.

그 다음, 균질물을 4℃에서 15분 동안 12,000g로 원심분리시켜, 침전물을 제거하고 상층액을 수집하였다. TRI REAGENT 1ml당 0.2ml의 클로로포름을 상층액에 첨가하고 샘플 두껑을 닫은 후에 20초 동안 강하게 흔들었다. 이 혼합물을 상온에서 10분 동안 보관한 다음 4℃에서 15분 동안 12,00Og로 원심분리시켰다. 원심분리 후, 혼합물은 하단의 붉은 페놀-클로로포름층, 중간층, 및 무색의 상단 수용액층으로 분리되었다. RNA는 배타적으로 수용액층에서 발견되었으며, DNA와 단백질은 중간층 및 유기용매 층에 분포하였다. 균질화를 위해 사용된 전체 TRI REAGENT의 약 60% 부피의 수용액층을 새 튜브로 옮기고, 중간층 및 유기용매층은 다음의 DNA 및 단백질 분리를 위해서 4℃에 보관하였다. 초기 균질화에 사용된 TRI REAGENT 1ml당 0.5ml의 이소프로판올과 혼합함으로써 수용액층으로부터 RNA를 침전시켰다. 그 다음 샘플을 상온에서 5분 동안 보관한 후에 4℃에서 10분동안 12,000g에서 원심분리시켰다. RNA 침전은 튜브의 측면 및 바닥에 백색의 펠릿을 형성하였다. 상층액을 제거하고 vortexing 및 4℃에서 5분동안 7,500g로 원심분리함으로써 RNA 펠릿을 75% 에탄올(초기 균질화를 위해 사용된 TRI REAGENT 1ml당 적어도 1ml의 75% 에탄올)로 한번 세척하였다. 끝으로, RNA를 건조시켰다. 전체 RNA의 농도는 스펙트로포토메터를 사용하여 측정하였다(Ultraspec 2000 UV/Visible Spectrophotometer, Pharmacia BiotechR, Piscataway, NJ, USA).The homogenate was then centrifuged at 12,000 g for 15 minutes at 4 ° C. to remove the precipitate and collect the supernatant. 0.2 ml of chloroform per ml of TRI REAGENT was added to the supernatant and vigorously shaken for 20 seconds after the sample lid was closed. The mixture was stored at room temperature for 10 minutes and then centrifuged at 12,00Og for 15 minutes at 4 ° C. After centrifugation, the mixture was separated into a bottom red phenol-chloroform layer, an intermediate layer, and a colorless top aqueous layer. RNA was exclusively found in the aqueous layer, and DNA and protein were distributed in the intermediate and organic solvent layers. An aqueous layer of about 60% volume of the total TRI REAGENT used for homogenization was transferred to a new tube, and the intermediate and organic solvent layers were stored at 4 ° C. for subsequent DNA and protein separation. RNA was precipitated from the aqueous layer by mixing with 0.5 ml of isopropanol per 1 ml of TRI REAGENT used for initial homogenization. The samples were then stored at room temperature for 5 minutes and then centrifuged at 12,000 g for 10 minutes at 4 ° C. RNA precipitation formed white pellets on the sides and bottom of the tube. The RNA pellet was washed once with 75% ethanol (at least 1 ml of 75% ethanol per ml of TRI REAGENT used for initial homogenization) by removing the supernatant and centrifuging at 7,500 g for 5 minutes at vortexing and 4 ° C. Finally, RNA was dried. Total RNA concentration was measured using a spectrophotometer (Ultraspec 2000 UV / Visible Spectrophotometer, Pharmacia Biotech®, Piscataway, NJ, USA).

실시예 2 : RT-PCRExample 2 RT-PCR

M-MuLV 역전사효소(50U/ul, Stragene) 및 올리고 (dT) 프라이머를 사용하여 추출된 5μg의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 상기 반응물은 taq DNA중합효소(50U/ul)를 사용한 PCR에서 템플레이트로 사용하였다. 95℃에서 10분동안 전체 DNA를 변성시킨 후에, 온도는 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 58℃에서 30초 동안 각 표본에 대해 30회 사이클링하였다, 상기 PCR에서 변성 및 신장 조건은 BMP-7을 제외하고는 동일하였으며, 대신 BMP-7은 결합 및 신장을 위해 60℃에서 수행하였다. PCR 산물을 1.5% 아가로스 젤 상에서 전개시켰다.CDNA was synthesized from 5 μg of RNA extracted using M-MuLV reverse transcriptase (50 U / ul, Stragene) and oligo (dT) primers. The reaction was used as a template in PCR using taq DNA polymerase (50 U / ul). After denaturation of the entire DNA for 10 minutes at 95 ° C, the temperature was cycled 30 times for each sample for 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 56 ° C and 30 seconds at 58 ° C. The same was true except for BMP-7, instead BMP-7 was run at 60 ° C. for binding and stretching. PCR products were run on 1.5% agarose gels.

실시예 3 : DHPLCExample 3: DHPLC

아리조나대학교 돌연변이 탐지 기기실(Tuscon, AS)에서 WAVE Fragment Analysis System(Transgenomic, Santa Clara, CA, USA)으로 DHPLC(Denaturing High Performance Liquid Chromatography)를 수행하였다. 헤테로듀플렉스를 형성하도록 하이브리다이제이션된 조 PCR 산물 5 μl를 DNASep 컬럼(Transgenomic, Santa Clara, CA)에 로딩하였다. PCR 산물은 0.1M 트리에틸암모니움 아세테이트 버퍼(TEAA, pH 7)내 아세토니트릴 그래디언트를 사용하여 0.75ml/min의 일정한 유속으로 컬럼으로부터 희석되어졌다. 상기 그래디언트는 용리액 A(0.1M TEAA) 및 B(0.1M TEAA내 2% 아세토니트릴)를 혼합함으로써 생성되었다. BMP-4 분석을 위하여 컬럼 온도는 62℃로 맞추고 다음 그래디언트를 사용하였다: 용리액 B는 1분 동안 56% 내지 62% 및 2분 동안 62% 내지 66%로 증가시켰다. DHPLC 분석의 컬럼 온도는 test heterozygote를 참조하지 않고 선별하였다. 대신에, 크로마토그램은 test(wildtype) PCR은 컬럼 온도 60, 62, 64 및 66℃에서 수행함으로써 이루어졌다. 60℃ 온도에서 DNA 절편들은 그래디언트 내에서 점차적으로 DNASep 컬럼으로부터 용리되었다(도 3). 분석을 위한 최적의 온도는 경험적으로 결정하였다.Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC) was performed with the WAVE Fragment Analysis System (Transgenomic, Santa Clara, Calif., USA) in the University of Arizona Mutation Detection Instrument Room (Tuscon, AS). 5 μl of crude PCR product hybridized to form a heteroduplex was loaded onto a DNASep column (Transgenomic, Santa Clara, Calif.). PCR products were diluted from the column at a constant flow rate of 0.75 ml / min using acetonitrile gradient in 0.1 M triethylammonium acetate buffer (TEAA, pH 7). The gradient was created by mixing eluent A (0.1M TEAA) and B (2% acetonitrile in 0.1M TEAA). For BMP-4 analysis, the column temperature was set at 62 ° C. and the following gradient was used: Eluent B was increased from 56% to 62% for 1 minute and 62% to 66% for 2 minutes. The column temperature of the DHPLC assay was selected without reference to test heterozygote. Instead, chromatograms were performed by test (wildtype) PCR at column temperatures 60, 62, 64 and 66 ° C. At 60 ° C. DNA fragments eluted gradually from the DNASep column in the gradient (FIG. 3). The optimum temperature for the analysis was determined empirically.

실시예 4 : 조직분석Example 4 Structure Analysis

(1) 면역조직화학분석법(1) Immunohistochemical Analysis

11개의 병든 조직에 대해 면역조직화학분석을 수행하였다. 인체 기관의 BMP-4, BMP-7 및 FGF-7에 대해 염소 유래의 다클론항체를 만들고 Santa Cruz Biotechnology Inc.(CA, USA)로부터 구입하였다. 면역조직화학분석을 위하여 4μm두께의 절편을 준비하였다. 밤새도록 배양(incubation)하는 것을 차후의 모든 과정은 상온에서 수행하였다. 절편을 탈파라핀화 및 재수화시키고 내생 페록시다제는 7분 동안 메탄올 내 3% 과산화수소 용액으로 블락시켰다. 절편을 PBS로 세척하고 10%의 래빗 혈청과 30분 동안 전배양(preincubation)시켰다. 그 다음 4℃에서 밤새도록 1차 항체(1:10 희석)로 배양하였다. PBS 세척 후에, 절편을 항-염소 면역글로불린으로 배양한 후에 PBS 세척하고 스트렙토아비딘(Dako, Glsstrupp, Denmark)와 30분 동안 배양시켰다. 절편을 0.05% 3,3-디아미노벤지딘(3,3-diaminobenzidine) 및 0.03% 과산화수소의 50mM Tris-HCl 완충액에 침지시켜 염색을 가시화하였다. 절편을 Maver hematoxylin으로 카운터염색시켰다.Immunohistochemical analysis was performed on eleven diseased tissues. Chlorine-derived polyclonal antibodies against BMP-4, BMP-7 and FGF-7 in human organs were made and purchased from Santa Cruz Biotechnology Inc. (CA, USA). Sections of 4 μm thickness were prepared for immunohistochemical analysis. Incubation overnight was followed by all subsequent procedures at room temperature. Sections were deparaffinized and rehydrated and endogenous peroxidase was blocked with 3% hydrogen peroxide solution in methanol for 7 minutes. Sections were washed with PBS and preincubated for 30 minutes with 10% rabbit serum. It was then incubated with primary antibody (1:10 dilution) overnight at 4 ° C. After PBS washing, sections were incubated with anti-goat immunoglobulin and then PBS washed and incubated with streptoavidin (Dako, Glsstrupp, Denmark) for 30 minutes. Sections were immersed in 50mM Tris-HCl buffer of 0.05% 3,3-diaminobenzidine and 0.03% hydrogen peroxide to visualize staining. Sections were counterstained with Maver hematoxylin.

(2) 인사이투 하이브리다이제이션(2) Insait Hybridization

자일렌을 이용한 탈파라핀화 및 에탄올을 이용한 수화를 수행하였다. DEPC(디에틸피로카보네이트)-PBS 용액으로 5분동안 처리한 후에, 표본을 프로테아제 K와 상온에서 5분 동안 배양하였다. 10분 동안 4% 파라포름알데히트 용액으로 처리한 후에 1 시간동안 0.2N HCl 용액, 5분 동안 DEPC-PBS 용액 및 10분 동안 0.1M TEA(트리에탄올아민) 용액에 처리하였다. 0.1M TEA 용액 + 0.25% 아세트산에 10분 동안처리한 후 10분 동안 DEPC-PBS 용액에 처리하였다. 워터배쓰에서 용액을 가열 및 하이브리다이제이션 한 후에, 이들을 RNA 프로브로 표지된 특이적 DIG(digioxigenin)과 하이브리다이제이션 용액에서 혼합하였다.Deparaffinization with xylene and hydration with ethanol were performed. After 5 minutes of treatment with DEPC (diethylpyrocarbonate) -PBS solution, the samples were incubated with protease K for 5 minutes at room temperature. After treatment with 4% paraformaldehyde solution for 10 minutes, it was treated with 0.2N HCl solution for 1 hour, DEPC-PBS solution for 5 minutes, and 0.1M TEA (triethanolamine) solution for 10 minutes. Treatment with 0.1M TEA solution + 0.25% acetic acid for 10 minutes followed by DEPC-PBS solution for 10 minutes. After the solution was heated and hybridized in a water bath, they were mixed in a hybridization solution with a specific DIG (digioxigenin) labeled with an RNA probe.

[표2][Table 2]

인사이투 하이브리다이제이션에 사용된 프라이머Primers used for Insait Hybridization

50℃ 히트 플레이트 위 배양 및 모이스처 챔버 내 밤새 배양으로 충분하였다. 그 다음, 워트 배쓰 내 2XSSC-50% 포름아미드 용액에 방치하였다. 날카로운 핀셋으로 Hybrislip을 다시 제거하고, 50℃ 워트 배쓰내에서 30분 동안 2XSSC-50% 포름아미드 용액에 방치하였다. 30분 동안 37℃ 워트배쓰내에서 DIG 1 용액으로 처리하는 동안, 100ml의 증류수에 블락 시약 분말 10g을 천천히 용해시켜 DIG 2 용액을 제조하였다. DIG 2 용액에서 2 시간 배양동안 슬라이드를 세척하지는 않았다. 항-DIG 항체(DIG 1 용액에서 1:1000희석)를 처리한 후 파라필름으로 덥은 후 냉장고에서 밤새도록 배양하였다. DIG 1 용액에서 3시간 동안 세척한 후, DIG 1 용액으로 세 번 교환하였다. 크로모젠 용액을 제조하기 위하여 새 튜브에 DIG 3 용액 2 μl를 준비하고 2M MgCl250μl를 첨가하고 9 μl NBT(니트로블루 테트라졸리움 염) 용액 및 BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인돌일 포스페이트) 용액을 첨가하였다. 파란 색이 나타날 때까지 20분 이상 염색하고는 DIG 4 용액으로 10분 동안 세척하였다. 콘트래스트 그린(메틸 그린)으로 10분 동안 카운터 염색을 실시한 후 글리세롤 젤에 올렸다.Cultures on a 50 ° C. heat plate and overnight cultures in the moist chamber were sufficient. It was then left in a 2XSSC-50% formamide solution in the wort bath. Hybrislip was removed again with sharp tweezers and left in 2 × SSC-50% formamide solution for 30 minutes in a 50 ° C. wort bath. DIG 2 solution was prepared by slowly dissolving 10 g of block reagent powder in 100 ml of distilled water while treating with DIG 1 solution in 37 ° C. water bath for 30 minutes. The slides were not washed for 2 hours incubation in DIG 2 solution. After treatment with anti-DIG antibody (1: 1000 dilution in DIG 1 solution), the film was warmed with parafilm and incubated overnight in a refrigerator. After washing for 3 hours in DIG 1 solution, it was exchanged three times with DIG 1 solution. To prepare the chromogen solution, prepare 2 μl of DIG 3 solution in a new tube, add 50 μl of 2M MgCl 2 , 9 μl NBT (nitroblue tetrazolium salt) solution and BCIP (5-bromo-4-chloro-3- Indolyl phosphate) solution was added. Stain for at least 20 minutes until blue color appeared and wash with DIG 4 solution for 10 minutes. Counter staining was performed for 10 minutes with contrast green (methyl green) and then placed on glycerol gel.

상기 면역화학염색법 및 인사이투 하이브리다이제이션에 의한 실험 결과를 도 4 내지 도 15에 도시하였다.The results of the experiments by the immunochemical staining method and Insait hybridization are shown in FIGS. 4 to 15.

도 4는 정상 구강상피 세포에서 면역화학염색법으로 관찰한 결과를 나타낸다(×400). 도 4에 나타난 바와 같이 BMP-4는 정상 구강상피세포의 결합조직측으로 편위되어 발현되는 양상을 보여주고 있다. 이는 세포 분화에 BMP-4가 관여함을 보여주는 증거이다.Figure 4 shows the results observed by immunochemical staining in normal oral epithelial cells (× 400). As shown in Figure 4 BMP-4 is shown to be expressed by the bias toward the connective tissue side of normal oral epithelial cells. This is evidence that BMP-4 is involved in cell differentiation.

도 5는 정상 구강상피에서 BMP-4에 대한 인사이투 하이브리다이제이션한 결과를 나타낸다. 도 5에 나타난 바와 같이, BMP-4가 구강상피의 기저세포층에서 만들어지는 것을 알 수 있었다.Figure 5 shows the results of Insait hybridization for BMP-4 in normal oral epithelium. As shown in Figure 5, it can be seen that BMP-4 is made in the basal cell layer of the oral epithelium.

도 6은 편평태선에서 상피하 T-림프구에 BMP-4 mRNA에 양성 반응을 나타내는 그림으로, 이를 더욱 세밀하게 관찰한 도 6에서는 편평태선에서 BMP-4가 상피의 기저세포층을 파괴하는 것을 알 수 있다. 편평태선은 구강 및 피부에서 발생하는 질환의 일종이며 아직 정확한 기전은 모르고 있으나 면역체계와 연관된 질환이라는 것만 알려져 있다. 주로 관여하는 세포는 T-림프구이며 이 세포의 역할은 편평태선의 진행과 밀접한 관련이 있다. 도 8은 편평태선에 대한 BMP-4의 mRNA 인사이투 하이브리다이제이션을 나타내는 그림이며, 도 9는 H＆E 염색사진이며, 화살표는 병소 부위의 T-림프구 인필트레이션을 나타낸다.6 is a diagram showing a positive response to BMP-4 mRNA in the subepithelial T-lymphocytes in the lichen planus. In FIG. 6, the BMP-4 in the lichen planus destroys the basal cell layer of the epithelium. have. Squamous gland is a type of disease that occurs in the oral cavity and skin and does not yet know the exact mechanism, but only known to be associated with the immune system. The major cell involved is T-lymphocytes, whose role is closely related to the progression of lichen planus. FIG. 8 is a diagram showing mRNA assay hybridization of BMP-4 against the lichen planus, FIG. 9 is a H & E stained photograph, and the arrow shows T-lymphocyte infiltration of the lesion site.

실시예 5 : BMP-4 단백질의 p-53 유도 실험Example 5 p-53 Induction Experiment of BMP-4 Protein

상기 결과로부터 편평태선에서의 상피세포 기저층의 세포사멸과 BMP-4 발현과의 관련성을 구체적으로 조사하기 위하여 BMP-4 함유 비드를 이용하거나 BMP-4가 함유되지 않고 생리적 식염수만 함유된 비드를 이용한 장기배양 실험을 수행하고 그 결과를 도 10 내지 도 13에 도시하였다.From the above results, BMP-4-containing beads or BMP-4-containing beads and physiological saline-containing beads were used to specifically investigate the association between BMP-4 expression and apoptosis in the basal layer of the epithelium. Organ culture experiments were performed and the results are shown in FIGS. 10-13.

도 10은 면역화학분석을 실시한 정상조직의 그림을 나타내며, 도 11은 10ug/ml의 BMP-4 함유 비드를 이용한 장기배양 실험에서 p-53이 상피세포에서 유도됨을 보여주는 그림이다. 이는 1ug/ml, 0.1 ug/ml의 BMP-4 함유 비드를 이용한 실험에서도 마찬가지 결과가 나왔다. 도 12는 정상조직을 나타내는 그림이며, 도 13은 생리식염수 함유 비드를 이용한 장기배양 실험에서 p-53이 유도되지 않음을 보여주고 있다. 따라서, 편평태선에서 T-림프구가 분비한 BMP-4는 상피하방에 고동도로 축적될 시에는 p-53을 유도하여 편평태선에서 관찰되는 상피세포 기저층에서 세포사멸이 일어나게 하는 것으로 판단된다.FIG. 10 is a diagram of normal tissues subjected to immunochemical analysis, and FIG. 11 is a diagram showing that p-53 is induced in epithelial cells in a long-term culture experiment using 10 μg / ml BMP-4 containing beads. The same results were obtained in experiments using beads containing 1 ug / ml and 0.1 ug / ml of BMP-4. FIG. 12 is a diagram showing normal tissue, and FIG. 13 shows that p-53 is not induced in long-term culture experiments using saline-containing beads. Therefore, BMP-4 secreted by T-lymphocytes in the lichen planus is induced to apoptosis in the basal layer of epithelial cells observed in the lichen planus when p-53 is accumulated in the epidermis.

실시예 6 : BMP-4가 구강상피세포 분화에 미치는 영향Example 6 Effect of BMP-4 on Oral Epithelial Cell Differentiation

타액선 기원의 BMP-4가 구강상피세포의 분화에 미치는 영향에 대한 BMP-4 mRNA의 인사이투 하이브리다이제이션을 실시하고 그 결과를 도 14 및 도 15에 나타내었다. 도 14 및 도 15에 도시된 바와 같이 타액선의 선포 중 장액성 선포에서 BMP-4가 분비됨을 알 수 있는데 이는 장액선 선포가 저작시 활성화됨을 감안하면 저작시 상피가 많이 탈락되므로 이에 반응하여 많은 수의 세포가 기저층에서 분화되어 나와야 하기 때문에, 결국 장액성 선포의 BMP-4 분비는 이러한 기능적 요구에 반응하기 위해 이루어진 것으로 판단된다.Intra-hybridization of BMP-4 mRNA was performed on the effect of BMP-4 from salivary glands on the differentiation of oral epithelial cells and the results are shown in FIGS. 14 and 15. As shown in FIGS. 14 and 15, it can be seen that BMP-4 is secreted from the serous proclamation among the proclamation of the salivary glands. Since the cells of, should be differentiated from the basal layer, it is concluded that BMP-4 secretion of serous acinar is made in response to this functional requirement.

이상 살펴본 바와 같이, 정상구강조직 및 병적인 조직에서 발현되는 성장인자들을 조사한 결과, 상피를 포함한 구강조직에서 BMP-4는 항상 발현됨을 발견하였으며, BMP-4에 대한 SNP 연구수행 결과 편평태선 환자의 조직은 유전자 은행의 염기서열과의 상동성이 평균 92% 일치함을 발견하여 돌연변이된 BMP-4가 편평태선의 유발인자라는 것이 밝혀졌기 때문에, 편평태선의 결정적인 공여인자라고 할 수 있는 BMP-4 유전자 발현이나 단백질 활성을 억제하는 방법을 통해 편평태선 질환에 대한 치료 및 진단이 가능하다.As described above, as a result of examining growth factors expressed in normal or pathological tissue, it was found that BMP-4 is always expressed in oral tissue including epithelium. The tissues found 92% homology with the nucleotide sequence of the gene bank, and it turned out that the mutated BMP-4 was the trigger of the planar limb, so it is the definitive donor of the planar limb BMP-4. Inhibition of gene expression or protein activity can be used to treat and diagnose squamous disease.

Claims (9)

구강 상피조직에서 정상조직보다 과발현되는 BMP-4에 의해 p-53이 유도되어 편평태선 질환이 진행되는 관계에 근거하여 편평태선 질환을 치료하기 위해 BMP-4 유전자나 그 유전자 산물을 이용하는 방법.A method of using the BMP-4 gene or a gene product thereof for treating squamous gland disease based on the relationship between p-53 induced by BMP-4 over-expressed in normal oral epithelial tissue than normal tissue. 구강 상피조직에서 정상조직보다 과발현되는 BMP-4에 의해 p-53이 유도되어 편평태선 질환이 진행되는 관계를 이용하여 편평태선 질환을 치료하기 위해 BMP-4 유전자 발현을 억제할 수 있는 편평태선 치료용 안티센스 DNA 또는 RNA를 제조하는 방법.Treatment of lichen planus that can suppress BMP-4 gene expression to treat lichen planus disease by using p-53 induced by BMP-4 overexpression in oral epithelial tissue than normal tissue Method for preparing antisense DNA or RNA for use. 구강 상피조직에서 정상조직보다 과발현되는 BMP-4에 의해 p-53이 유도되어 편평태선 질환이 진행되는 관계를 이용하여 편평태선 질환을 치료하기 위해 BMP-4 단백질에 특이적으로 결합하여 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있는 편평태선 치료용 단일클론항체를 제조하는 방법.P-53 is induced by BMP-4 over-expressed in normal oral epithelial tissues to promote squamous disease, and specifically binds to BMP-4 protein to treat squamous disease. Method of producing a monoclonal antibody for the treatment of lichen planus that can inhibit the activity. 구강 상피조직에서 정상조직보다 과발현되는 BMP-4에 의해 p-53이 유도되어 편평태선 질환이 진행되는 관계에 근거하여 편평태선 질환을 진단하기 위해 BMP-4 유전자나 그 유전자 산물을 이용하는 방법.A method of using the BMP-4 gene or a gene product thereof for diagnosing squamous gland disease based on a relationship between p-53 induced by BMP-4 overexpressed in oral epithelial tissues and more than normal tissue. 구강 상피조직에서 정상조직보다 과발현되는 BMP-4에 의해 p-53이 유도되어 편평태선 질환이 진행되는 관계를 이용하여 편평태선 질환을 진단하기 위해 BMP-4 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 편평태선 진단용 단일클론항체를 제조하는 방법.Squamous that can specifically bind to BMP-4 protein for diagnosing squamous gland disease using p-53 induced by BMP-4 overexpressed in oral epithelial tissue than normal tissue Method of producing monoclonal antibody for diagnosis of lichen. 특정 질환 관련 유전자나 그 유전자 산물을 이용하여 질환을 치료하는 방법에 있어서, BMP-4 유전자의 발현이나 그 유전자 산물의 활성을 억제하여 편평태선을 치료하는 방법.A method for treating a disease using a specific disease-related gene or a gene product thereof, wherein the planar gland is treated by inhibiting the expression of the BMP-4 gene or the activity of the gene product. 제 6항에 있어서, BMP-4 유전자 또는 그 일부에 상보적으로 하이브리다이제이션할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 BMP-4 유전자 발현을 억제하여 편평태선을 치료하는 방법.7. The method of claim 6, wherein oligonucleotides or polynucleotides capable of complementary hybridization to the BMP-4 gene or portions thereof are used to treat the lichen planus by inhibiting BMP-4 gene expression. 제 6항에 있어서, BMP-4 유전자 산물에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체를 이용하여 BMP-4 유전자 산물의 활성을 억제함으로써 편평태선을 치료하는 방법.7. The method of claim 6, wherein the planar therapy is performed by inhibiting the activity of the BMP-4 gene product using a monoclonal antibody that can specifically bind the BMP-4 gene product. 특정 질환 관련 유전자 산물에 대한 단일클론항체를 이용하여 질환을 진단하는 방법에 있어서, BMP-4 유전자 산물에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체를 이용하여 편평태선을 진단하는 방법.A method for diagnosing a disease using a monoclonal antibody directed against a specific disease-related gene product, the method for diagnosing lichen planus using a monoclonal antibody capable of specifically binding to a BMP-4 gene product.
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