KR20030030266A - Microarray comprising probes for mycobacteria genotyping, m. tuberculosis strain differentiation and antibiotic-resistance detection - Google Patents

Microarray comprising probes for mycobacteria genotyping, m. tuberculosis strain differentiation and antibiotic-resistance detection Download PDF

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Abstract

PURPOSE: A microarray comprising probes for mycobacteria genotyping, M. tuberculosis strain differentiation and antibiotic-resistance detection is provided, thereby decreasing the time and costs required for analysis. CONSTITUTION: The microarray comprises a probe for tuberculosis or non-tuberculosis mycobacteria genotyping, a probe for M. tuberculosis strain differentiation and a probe for antibiotic-resistance detection in a support, wherein the probe for tuberculosis or non-tuberculosis mycobacteria genotyping contains an oligonucleotide of the nucleotide sequence of Mycobacteria sp. specific internal transcribed spacer(ITS), an oligonucleotide of the nucleotide sequence of tuberculosis Mycobacteria genus specific ITS, and an oligonucleotide of the nucleotide sequence of non-tuberculosis Mycobacteria genus specific ITS; the prove for M. tuberculosis strain differentiation contains an oligonucleotide of the M. tuberculosis strain specific direct repeat(DR) nucleotide sequence; and the probe for antibiotic-resistance detection contains an oligonucleotide of the nucleotide sequence of rpoB gene inducing the rifampin resistance, an oligonucleotide of the nucleotide sequence of katG gene inducing the isoniazid resistance, an oligonucleotide of the nucleotide sequence of pncA gene inducing the pyrazinamide resistance.

Description

마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 마이크로어레이와 이를 이용한 검출 방법 및 진단 키트{Microarray comprising probes for Mycobacteria genotyping, M. tuberculosis strain differentiation and antibiotic-resistance detection}Microarray comprising probes for detecting strains of Mycobacteria, strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis and antibiotic resistance, and detection methods and diagnostic kits using the same; Microarray comprising probes for Mycobacteria genotyping, M. tuberculosis strain differentiation and antibiotic-resistance detection

본 발명은 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성을 동시에 검출할 수 있는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 지지체에 부착된 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 균주 감별을 위한 프로브(probes), 결핵균의 스트레인 감별을 위한 프로브, 및 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 마이크로어레이와 이를 이용한 검출 방법 및 진단 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a method for simultaneously detecting strains of mycobacteria, strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis and antibiotic resistance, and more specifically, probes for differentiating strains of tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria attached to a support, The present invention relates to a microarray including a probe for strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis, and a probe for detecting antibiotic resistance, and a detection method and diagnostic kit using the same.

<마이코박테리아 균주 감별을 위한 종래방법><Conventional Method for Differentiating Mycobacteria Strains>

마이코박테리아는 인간에게 감염 질병을 일으키는 중요한 병원성 인자의 하나로, 매년 전세계적으로 8백만 명이 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 감염되며 3백만 명 이상의 사망자가 발생하고 있다(Raviglione, M. C., D. E. Snider, 및 A. Kochi. Global epidemiology of tuberculosis. Morbidity and mortality of a worldwide epidemic. JAMA, 273: 220-226(1995)). 최근에는 후천성면역결핍증(ADIS) 환자가 급속히 확산됨에 따라 결핵균 이외의 비결핵 마이코박테리아 (NTM: non-tuberculosis mycobacteria) 균종에 의한 감염증이 점차 증가하고 있다 (Barnes, P., A. B. Bloch, P. T. Davidson, 및 D. E. Snider, Jr. Tuberculosis in patients with immunodeficiency virus infection. N. Engl, J. Med, 324: 1644-1650(1991)). 이와 같은 이유로, 결핵균뿐만 아니라 비결핵 마이코박테리아도 신속하면서도 효율적으로 균주 감별 및 진단하는 방법을 개발할 것이 절실히 요구되고 있다.Mycobacteria are an important pathogenic agent that causes infectious diseases in humans. Each year, 8 million people are infected with Mycobacterium tuberculosis , causing more than 3 million deaths (Raviglione, MC, DE Snider, and A.). Kochi.Global epidemiology of tuberculosis.Morbidity and mortality of a worldwide epidemic.JAMA, 273: 220-226 (1995). Recently, with the rapid spread of AIDS patients, infections caused by non-tuberculosis mycobacteria (NTM) species other than Mycobacterium tuberculosis have been gradually increasing (Barnes, P., AB Bloch, PT Davidson, And DE Snider, Jr. Tuberculosis in patients with immunodeficiency virus infection.N. Engl, J. Med, 324: 1644-1650 (1991)). For this reason, there is an urgent need to develop methods for identifying and diagnosing strains quickly and efficiently as well as tuberculosis bacteria and non-tuberculosis mycobacteria.

미생물을 감별하고 분류하기 위한 이전의 방법들은 미생물의 형태학적, 생화학적, 그리고 생장 특성에 근거하고 있다. 이러한 방법들은 번거롭고 복잡하며, 장시간이 소요된다는 등의 문제점들이 있다. 결핵의 진단은 문진, 임상 증상, X선 검사, 투베르쿨린 반응 검사, 혈액검사 및 세균검사 등으로부터 종합적으로 판단하고 행해지고 있다. 종래는, 환자의 객담 시료중의 결핵균을 염색하고 현미경으로 관찰한 도말 염색 검사법과 시험관 가운데에서 결핵균을 증식시키는 배양 검사법이 실시되어 왔다. 그러나, 도말 염색 검사법으로는 시료 중에 결핵균의 수가 적을 경우 검출할 수 없다. 또, 배양 검사법으로는 결핵균의 발육이 느리기 때문에 약 6주간 정도의 기간이 필요하다는 등의 단점이 있다. 최근에는 유전자를 표적으로 하는 빠르면서도 보다 간편한 방법들이 점차 많이 사용되고, 또 새롭게 개발되고 있는데,이 방법에서는 특정 유전자를 대상으로 속 특이적(genus-specific) 혹은 균종 특이적 (species-specific) PCR 프라이머나 핵산 프로브 등을 이용하고 있다.Previous methods for identifying and classifying microorganisms are based on their morphological, biochemical, and growth characteristics. These methods are cumbersome, complicated, and take a long time. Diagnosis of tuberculosis is judged and comprehensively performed from a questionnaire, clinical symptoms, X-ray examination, tuberculin response test, blood test and bacterial test. Conventionally, the smear stain test which stained Mycobacterium tuberculosis in the sputum sample of the patient, and observed it under the microscope, and the culture test which proliferates Mycobacterium tuberculosis in the test tube have been performed. However, the smear staining test cannot detect the small number of Mycobacterium tuberculosis in the sample. In addition, the culture test method has a disadvantage that the development of tuberculosis bacteria is slow, so a period of about six weeks is required. In recent years, rapid and simpler methods of targeting genes have been increasingly used and newly developed. In this method, genus-specific or species-specific PCR primers are targeted to specific genes. And nucleic acid probes.

이러한 배경 하에서 균종 감별의 근거를 제공할 수 있는 마이코박테리아의 계통분석은 16S rRNA 또는 그 염기서열의 비교를 통하여 이루어졌다. 이는 16S rRNA 유전자가 종간에 매우 보존적이면서도 다양성을 가지고 있다는 사실에 근거한다(Stahl, D. A., 및 J. W. Urbance. The division between fast and slow-growing species corresponds to natural relaionships among the mycobacteria. J. Bacteriol. 172: 116-124(1990); Rogall, T., J. Wolters, T. Flohr 및 E. C. Bottger. Towards a phylogeny and definition of species at the molecular level within the genus Mycobacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 40: 323-30(1990b); Rogall T., T. Flohr, 및 E. C. Bottger. Differentiation of Mycobacterium species by direct sequencing of amplified DNA. J. Gen. Microbiol. 136(Pt9): 1915-1920(1990a)). 그러나, 16S rRNA 유전자는 일부 종간의 높은 염기서열 유사성을 가지고 있기 때문에 균종 감별에 어느 정도의 한계점을 가지고 있다(Fox, G. E., J. D. Wisotzkey. 및 P. J. Jurtshumk. How close is close: 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity. Int. J. Syst. Bacteriol. 42: 166-170(1992)).Phylogenetic analysis of mycobacteria, which can provide a basis for differentiation of species under this background, was made through comparison of 16S rRNA or its sequencing. This is based on the fact that 16S rRNA genes are highly conserved and diverse between species (Stahl, DA, and JW Urbance.The division between fast and slow-growing species corresponds to natural relaionships among the mycobacteria. J. Bacteriol. 172 116-124 (1990); Rogall, T., J. Wolters, T. Flohr and EC Bottger.Towards a phylogeny and definition of species at the molecular level within the genus Mycobacterium.Int. J. Syst.Bacteriol. 40: 323-30 (1990b); Rogall T., T. Flohr, and EC Bottger.Differentiation of Mycobacterium species by direct sequencing of amplified DNA.J. Gen. Microbiol. 136 (Pt9): 1915-1920 (1990a)). However, because 16S rRNA genes have high sequencing similarities between some species, they have some limitations in the differentiation of species (Fox, GE, JD Wisotzkey. And PJ Jurtshumk. How close is close: 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity.Int. J. Syst. Bacteriol. 42: 166-170 (1992).

또한, IS6110삽입 유전자(insertion element)도 마이코박테리움 투베르쿨로시스 컴플렉스(M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. microti)에서 다수의 복제수로 존재하므로 이를 표적으로 한 PCR 탐지법도 사용되고 있으나, 이 삽입 유전자를 갖지 않는 결핵균이 보고되어 위음성의 결과가 나타날 수도 있다는 것이 보고되었다(Yuen L. K., B. C. Ross, K. M. Jackson 및 B. Dwyer. Characterization ofMycobacterium tuberculosisstrains from Vietnmese patients by Southern blot hybridization. J. Clin. Microbiol. 31: 1615-1618(1993)). 이 유전자를 증폭시키는 프라이머는 현재 국내에서도 상품화되어 있지만(TB-PCR, TB Detection Kit, (주)바이오니아, 대한민국), 이들은 매우 한정적인 균종에만 국한된 것으로 TB 복합체의 존재만을 탐지하는 PCR 키트이다.In addition, the IS 6110 insertion element (insertion element) is also present in the Mycobacterium tuberculosis complex ( M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. microti ) in multiple copies, so that the PCR is targeted to this. Detection has also been used, but it has been reported that Mycobacterium tuberculosis without this insertion gene may have been reported (Yuen LK, BC Ross, KM Jackson and B. Dwyer.Characterization of Mycobacterium tuberculosis strains from Vietnmese patients by Southern blot hybridization. J. Clin. Microbiol. 31: 1615-1618 (1993)). Primers for amplifying this gene are currently commercialized in Korea (TB-PCR, TB Detection Kit, Bioneer, Korea), but these are limited to very limited species and are PCR kits that detect only the presence of TB complexes.

결핵균 이외의 비결핵균(NTM)들에 의한 감염 예가 증가하고, 비결핵균 중에서도 이전에는 알려지지 않았던 새로운 균종에 의한 인체감염증이 계속 나타남에 따라, 이들의 최선의 예방과 치료를 위해서 질병을 유발하는 균종을 정확히 규명 해야한다. 이를 위해서 각 균종에 특이적인 유전자상의 차이에 의한 새로운 균주 감별 및 진단 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.As the number of infections caused by non-tuberculosis bacteria (NTM) and other non-tuberculosis bacteria has increased, and new infections of previously unknown types of non-tuberculosis bacteria continue to appear, the disease-causing strains have been identified for their best prevention and treatment. It must be identified exactly. To this end, there is an urgent need for the development of new strain differentiation and diagnostic methods based on genetic differences specific to each strain.

<결핵균의 스트레인 감별을 위한 종래방법>Conventional Method for Differentiating Strain of Mycobacterium Tuberculosis

결핵균의 스트레인 감별은 결핵균의 아종을 감별하는 것으로 결핵 발생 시에 그 환자에게 감염된 결핵균의 스트레인을 감별하여 감염원을 찾아내고 감염된 결핵균의 스트레인 종류에 따라 환자별 특성을 분류하여 보건학적인 적절한 조치를 취할 수 있게 한다. 이는 결핵전문 의료기관과 집단 결핵 감염의 위험이 높은 의료시설의 환자를 관리하는데 매우 유효하다. 따라서, 다제내성 결핵의 발병 기원 파악과 결핵의 전파를 막기 위한 다제내성 결핵균의 역학적 연관성 발견을 위한 방법의 필요성도 절실히 요구되고 있다. 이러한 요구의 필요성에 의한 스트레인 감별 방법으로 기존에는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 DNA 단편의 PCR 증폭을 기초로하는 방법으로서 PCR로 증폭된 IS6110의 특정 제한효소 인식부위를 이용한 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 방법을 이용하였다. 그러나, DNA RFLP 방법은 정교한 기계 조작이 요구되며, 배양된 균체의 DNA를 이용하기 때문에 증식속도가 느린(slow-growing) 개체에는 부적당하다(Goyal M., Saunders N. A., van Embden J. D., Young D. B., Shaw R. J. Differentiation ofMycobacterium tuberculosisisolates by spoligotyping and IS6110restriction fragment length polymorphism.J Clin Microbiol, 35: 647-651(1997)).Strain differentiation of tuberculosis bacteria is to discriminate against subspecies of tuberculosis bacteria, and when the tuberculosis occurs, the strains of the tuberculosis bacteria infected by the patient can be identified to find the source of infection, and the characteristics of patients can be classified according to the strains of the tuberculosis bacteria and appropriate health measures can be taken. To be. This is very effective in managing patients in TB-related medical institutions and medical facilities with high risk of TB infection. Therefore, there is an urgent need for a method for determining the origin of multidrug-resistant tuberculosis and for discovering the epidemiologic association of multidrug-resistant tuberculosis to prevent the spread of tuberculosis. As a strain discrimination method based on the necessity of such a requirement, conventionally, a method based on PCR amplification of a Mycobacterium tuberculosis DNA fragment is used as an RFLP (restriction fragment length) using a specific restriction enzyme recognition site of IS 6110 amplified by PCR. polymorphism) method was used. However, the DNA RFLP method requires sophisticated mechanical manipulation and is inadequate for slow-growing individuals because of the use of cultured cells of DNA (Goyal M., Saunders NA, van Embden JD, Young DB, Shaw RJ Differentiation of Mycobacterium tuberculosis isolates by spoligotyping and IS 6110 restriction fragment length polymorphism.J Clin Microbiol, 35 : 647-651 (1997)).

그 외 마이코박테리움 투베르쿨로시스 콤플렉스를 구별하는 방법으로는 genomic DNA의 southern blotting에 의한 DNA fingerprinting, PGRS(polymorphic GC-rich sequence), 그리고 triplet multimer(GTG)등의 반복성 요소(repetitive element)를 이용한 방법들이 있으나, 이러한 방법들은 PCR 증폭을 위한 프라이머에 대한 표적 DNA의 다형성과 크기가 매우 다양하기 때문에 임상검체에서의 동시 추출과 균주감별에는 적절하지 못한 방법들이다(Kamerbeek J, Schouls L, Kolk A, van Agterveld M, van Soolingen D, Kuijper S, Bunschoten A, Molhuizen H, Shaw R, Goyal M, 및 van Embden J. Simultaneous detection and strain differentiation ofMycobacterium tuberculosisfor diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol, 35: 907-14(1997)).Other methods of distinguishing Mycobacterium tuberculosis complexes include repetitive elements such as DNA fingerprinting by southern blotting of genomic DNA, polymorphic GC-rich sequence (PGRS), and triplet multimer (GTG). However, these methods are not suitable for simultaneous extraction and differentiation of strains from clinical specimens because the polymorphism and size of target DNA for primers for PCR amplification vary widely (Kamerbeek J, Schouls L, Kolk). A, van Agterveld M, van Soolingen D, Kuijper S, Bunschoten A, Molhuizen H, Shaw R, Goyal M, and van Embden J. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology.J Clin Microbiol, 35: 907 -14 (1997).

현재, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 내에 존재하는 DR(direct repeat) locus와 DR locus내에 다양한 길이로 산재하는 비반복성 스페이서(nonrepetitivespacer)를 이용한 스트레인 감별(strain differention)을 위한 miniblotter가 상품화되어 있지만(MiniSlot apparatus, Immunetics, Inc. USA), 혼성화 반응과 검출 등 실험절차가 많고 결과를 얻는데 약 2-3일이 소요되는 번거로운 방법이다(van Embden J.D., van Gorkom T., Kremer K., Jansen R., van Der Zeijst B.A. 및 Schouls L.M. Genetic variation and evolutionary origin of the direct repeat locus ofMycobacterium tuberculosiscomplex bacteria. J. Bacteriol, 182: 2393-401(2000); Filliol I., Sola C. 및 Rastogi N. Detection of a previously unamplified spacer within the DR locus of Mycobacterium tuberculosis: epidemiological implications. J. Clin. Microbiol, 38: 1231-1234(2000)).Currently, miniblotters for strain differention using direct repeat locus in Mycobacterium tuberculosis and nonrepetitive spacers scattered in various lengths in DR locus are commercialized ( MiniSlot apparatus, Immunetics, Inc. USA), hybridization reactions and detection are cumbersome methods that take many 2-3 days to obtain results (van Embden JD, van Gorkom T., Kremer K., Jansen R.). , van Der Zeijst BA and Schouls LM Genetic variation and evolutionary origin of the direct repeat locus of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria.J. Bacteriol, 182: 2393-401 (2000); Filliol I., Sola C. and Rastogi N. Detection of a previously unamplified spacer within the DR locus of Mycobacterium tuberculosis: epidemiological implications. J. Clin.Microbiol, 38: 1231-1234 (2000)).

<결핵균의 항생제 내성을 검출을 위한 종래방법>Conventional method for detecting antibiotic resistance of Mycobacterium tuberculosis

항생제 오·남용으로 인한 다제내성 결핵은 인류가 건강한 생활을 하는데 큰 장애물이 되고 있다. 개발도상국에서는 항결핵제의 부족으로 인한 부적절한 치료로 항생제 내성균을 가진 만성 보균자가 증가되었다. 최근 5년간 35개국에서의 항생제 내성 결핵균에 대한 조사에 의하면 한가지 이상의 약제에 내성을 가지는 경우가 13%에 이르고, 아이소니아지드(isoniazid, INH)와 리팜핀(rifampin, RMP)을 포함한 2가지 이상의 항생제에 내성을 보이는 다제내성결핵(multidrug-resistantM. tuberculosis, MDR-TB)이 약 7.5%로 심각한 수준에 이르고 있다. 이처럼 결핵, 그 중에서도 항생제 내성 결핵은 인류의 건강한 생활을 영위하는데 큰 위협이 되고 있다(Musser J.M. Antimicrobial agent resistance in mycobacteria: molecular genetic insights. Clin Microbiol Rev, 8: 496-514(1995); 장철훈, 손한철, 김철민. 다제내성 결핵균과 감수성 검사. 대한화학요법학회지, 16: 187-203(1998)). 항생제 내성 결핵균의 출현과 더불어 결핵 환자와 관련된 또 다른 중요한 변화는 질병의 진행 양상이다. 1980년대 후천성 면역결핍증 환자의 증가가 결핵 환자의 급증으로 이어졌고 면역 능력이 저하된 환자가 늘어나면서, 만성 질환인 결핵이 급격하게 진행하는 경우가 많아졌다. 그리고 결핵의 유병률이 낮아짐에 따라 새로 발생하는 환자가 주로 무증상 잠복 환자의 재활성화였으나, 요즘에는 면역 능력이 저하된 환자들에서 사람 대 사람간의 전파가 다시 늘어나고 있다(Mycobacteria. In: Koneman EW, Allen SD, et al. eds. Color atlas and textbook of diagnostic microbiology. p894-895, Philadelphia, Lippincott, 1997). 따라서 결핵균의 약제 내성을 조기에 진단하는 것은 환자 개개인의 치료뿐만 아니라 내성 결핵균의 전파 예방에 매우 중요하다. 따라서 이러한 다제내성 결핵의 효과적인 치료와 다제내성균의 출현 빈도를 최대한으로 억제하기 위해서 조기 진단 방법과 항생제 감수성 여부를 신속하게 결정하기 위한 방법의 개발 필요성이 요구되고 있다.Multidrug-resistant tuberculosis caused by misuse of antibiotics is a major obstacle for humans to live healthy lives. In developing countries, chronic carriers with antibiotic-resistant bacteria have increased due to inadequate treatment due to the lack of anti-tuberculosis drugs. In the last five years, a study of antibiotic-resistant tuberculosis bacteria in 35 countries found that 13% of them were resistant to one or more drugs, and that two or more antibiotics, including isoniazid (INH) and rifampin (RMP), The resistance to multidrug-resistant M. tuberculosis (MDR-TB) is about 7.5%, reaching a severe level. Like this, tuberculosis, and antibiotic-resistant tuberculosis, among others, poses a major threat to humans' healthy lives (Musser JM Antimicrobial agent resistance in mycobacteria: molecular genetic insights.Clin Microbiol Rev, 8: 496-514 (1995); , Chul-Min Kim, Multidrug-Resistant Mycobacterium Tuberculosis and Susceptibility Testing, Korean Journal of Chemotherapy, 16: 187-203 (1998)). Along with the emergence of antibiotic-resistant Mycobacterium tuberculosis, another important change associated with tuberculosis patients is the development of the disease. In the 1980s, the increase in patients with acquired immunodeficiency led to a surge in tuberculosis patients, and as the number of patients with reduced immunity increased, tuberculosis, a chronic disease, progressed rapidly. And as the prevalence of tuberculosis decreases, newly occurring patients are mainly reactivation of asymptomatic latent patients, but nowadays, the spread of person-to-person propagation is increasing again in patients with reduced immune ability (Mycobacteria.In: Koneman EW, Allen). SD, et al. Eds.Color atlas and textbook of diagnostic microbiology.p894-895, Philadelphia, Lippincott, 1997). Therefore, early diagnosis of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis is very important not only for the treatment of individual patients but also for preventing the transmission of resistant Mycobacterium tuberculosis. Therefore, in order to effectively treat the MDR-TB and to suppress the occurrence of MDR-resistant bacteria to the maximum, there is a need for the development of an early diagnosis method and a method for quickly determining the antibiotic susceptibility.

결핵균의 항생제 감수성 검사로 현재 많은 검사실에서는 표준적인 결핵균 검출방법으로 우선 항산균(acid fast bacteria) 도말법이나 조직의 항산균 염색을 실시한 후 균 배양을 하고 배양된 균에서 결핵임을 확인하기 위한 생화학적 검사를 시행한다(Kent B.D., Kubica G. P. Public health mycobacteriology; a guide for the level III laboratory. US department of health and human services. Atlanta:Centers for Disease Control, 207(1985)). 이 과정은 검체 채취로부터 결핵균 균주 감별 시까지 4∼6주가 소요된다. 또한, 배양된 결핵균의 항생제 감수성검사는 8∼12주의 기간을 요하는 Middlebrook 배지를 이용하므로 항생제 내성 결핵균의 조기 진단에 어려움이 있다(이미애. 객담에서 중합효소연쇄반응과 Line Probe Assay를 이용한 rifampin 내성 결핵균의 직접검출법. 대한임상병리학회지, 18: 71-76(1998)).Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis As of today, many laboratories use standard fast bacterium staining or acid fast bacterial staining as a standard method for detecting Mycobacterium tuberculosis. Tests are conducted (Kent BD, Kubica GP Public health mycobacteriology; a guide for the level III laboratory.US department of health and human services.Atlanta: Centers for Disease Control, 207 (1985)). This process takes 4 to 6 weeks from sampling to screening for Mycobacterium tuberculosis strains. In addition, the antibiotic susceptibility test of cultured Mycobacterium tuberculosis is difficult for early diagnosis of antibiotic-resistant Mycobacterium tuberculosis due to the use of Middlebrook medium, which requires a period of 8 to 12 weeks (already. Rifampin resistance using polymerase chain reaction and Line Probe Assay in sputum). Direct Detection of Mycobacterium Tuberculosis, Journal of the Korean Society of Clinical Pathology, 18: 71-76 (1998).

또한, 분자생물학적 방법에 의한 항생제 내성기전에 대한 연구가 활발히 진행되어 리팜핀(rifampin, RMP), 아이소니아지드(isoniazid, INH), 피라진아마이드(pyrazinamide, PZA), 에탐부톨(ethambutol, EMB), 스트렙토마이신(streptomycin, STR), 플로퀴노론(fluoroquinolone, FQ), 카나마이신(kanamycin), 그리고 아미카신(amikacin) 내성을 유도하는 다수의 유전적 변화가 보고되었다. 그러나, 아직까지 이러한 항생제의 염기서열 변화를 이용하여 한번의 실험으로 다양한 돌연변이를 검출할 수 있는 방법은 발표되지 않고 있다.In addition, studies on antibiotic resistance mechanisms by molecular biological methods have been actively conducted, such as rifampin (RMP), isoniazid (INH), pyrazinamide (PZA), ethambutol (ETMB) and streptomycin ( A number of genetic changes have been reported that induce resistance to streptomycin (STR), fluoroquinolone (FQ), kanamycin, and amikacin. However, the method of detecting various mutations in one experiment using the sequence changes of these antibiotics has not been published yet.

이상에서 보여지듯이, 전세계적으로 마이코박테리아에 의한 많은 수의 감염 환자와 사망자가 발생하고 있으며, 최근에는 후천성면역결핍증 환자의 급속한 증가로 인해 결핵뿐만 아니라 비결핵 마이코박테리아에 의한 감염증도 점차 증가하고 있으며, 항생제의 오·남용으로 인한 다제내성 결핵의 출현으로 심각성이 증가되고 있다. 따라서, 결핵균과 비결핵 마이코박테리아의 신속하면서도 효율적인 균주감별 및 진단, 결핵균의 역학적 연관성과 항생제 내성 결핵균의 검출을 위한 방법이 절실히 요구되고 있다. 그럼에도, 현재는 마이코박테리아 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성을 조사하는 실험이 개별적으로 진행되고 있어 조속한 검사 결과를 요하는 실험에서 장시간이 소요된다는 큰 단점을 가지고 있다.As can be seen from the above, a large number of patients and deaths caused by mycobacteria are occurring worldwide. Recently, due to the rapid increase in patients with acquired immunodeficiency, not only tuberculosis but also non-tuberculosis mycobacteria are gradually increasing. Increasing severity has resulted from the emergence of MDR-TB due to misuse and abuse of antibiotics. Therefore, there is an urgent need for a method for rapid and efficient strain identification and diagnosis of Mycobacterium tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria, the epidemiologic association of Mycobacterium tuberculosis and the detection of antibiotic-resistant Mycobacterium tuberculosis. Nevertheless, at present, experiments for differentiating mycobacteria strains, strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis and antibiotic resistance have been conducted separately, which has a long disadvantage in experiments requiring prompt test results.

이에, 본 발명자들은 최소한 6주 이상의 장시간이 소요되는 기존의 균 배양 및 생화학적 동정 방법이 가지고 있던 단점과 비효율성을 개선하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성을 조사하기 위하여 각각에 대하여 특이적으로 결합 반응할 수 있는 프로브를 모두 포함하고 있는 마이크로어레이를 개발함으로써, 배양된 균뿐만 아니라 임상 검체에서도 한번의 실험으로 신속하고 정확한 진단이 가능함을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have made a thorough research to improve the disadvantages and inefficiencies of the conventional bacterial culture and biochemical identification methods that take a long time of at least 6 weeks, as a result of the differentiation of tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria, In order to investigate strain differentiation and antibiotic resistance, microarrays containing all probes that can specifically bind to each other have been developed so that rapid and accurate diagnosis can be made in one experiment not only in cultured bacteria but also in clinical specimens. The present invention was completed.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 한번의 실험으로 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성에 대한 신속하고 정확한 진단을 가능하게 하는 마이크로어레이를 제공하는 데 있다.Therefore, the main object of the present invention is to provide a microarray that enables rapid and accurate diagnosis of strains of mycobacteria, strains of Mycobacterium tuberculosis and antibiotic resistance in one experiment.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 마이크로어레이를 이용한 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 검출방법 및 진단키트를 제공하는 데 있다.In addition, another object of the present invention to provide a method for detecting tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria and diagnostic kit using the microarray.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 마이크로어레이에 사용 가능한 프로브 또는 프라이머용 올리고뉴클레오티드를 제공하는 데 있다.In addition, another object of the present invention to provide an oligonucleotide for a probe or primer that can be used in the microarray.

도 1의 a)는 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성 검출을 위한 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체에 다수 세트로 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이고, b)는 a)중 한 세트의 프로브로 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이고, c)는 b)의 마이크로어레이를 프로브 기능별로 구획을 나눈 도면이고,Figure 1 a) is a microarray composed of a plurality of sets on one support with a set of probes for differentiating strains of Mycobacteria, strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis and antibiotic resistance, and b) is a A drawing of a microarray composed of a set of probes, c) is a diagram of the microarray of b) divided by probe function,

도 2는 한번의 실험으로 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성을 동시에 검출하기 위한 각 프로브들의 특이적 혼성화 반응의 결과이고,2 is a result of specific hybridization of each probe for simultaneously detecting strains of mycobacteria, strains of Mycobacterium tuberculosis and antibiotic resistance in one experiment.

도 3은 마이코박테리아의 균주 감별을 위한 프로브의 특이적 혼성화 반응의 결과로서, a)는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 H37Rv에 대한 것이고, b)는 마이코박테리움 스크로푸레시움에 대한 것이고,Figure 3 is the result of specific hybridization of the probe for differentiation of mycobacteria strains, a) for mycobacterial tuberculosis H37Rv, b) for mycobacterial scropurium Will,

도 4는 결핵균의 스트레인 감별을 위한 프로브의 특이적 혼성화 반응의 결과로서, a)는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 H37Rv에 대한 것이고, b)는 마이코박테리움 보비스(M. bovis)에 관한 것이고,FIG. 4 is a result of specific hybridization of the probe for strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis, a) for mycobacterium tuberculosis H37Rv, and b) for mycobacterium bovis Will,

도 5는 마이코박테리아의 리팜핀, 아이소니아지드와 피라진아마이드 항생제 내성 검출을 위한 프로브의 특이적 혼성화 반응의 결과로서, a) 및 b)는 RMP 내성 검출을 위한 마이코박테리움 투베르쿨로시스 H37Rv(RMP 감수성 균주) 및 마이코박테리움 투베르쿨로시스(RMP 내성 균주)에 대한 것이고, c) 및 d)는 INH 내성 검출을 위한 마이코박테리움 투베르쿨로시스 H37Rv(INH 감수성 균주) 및 마이코박테리움 투베르쿨로시스(INH 내성 균주)에 대한 것이고, e) 및 f)는 PZA 내성 검출을 위한 마이코박테리움 투베르쿨로시스 H37Rv(PZA 감수성 균주) 및 마이코박테리움 투베르쿨로시스(PZA 내성 균주)에 대한 것이다.FIG. 5 shows the results of specific hybridization reactions of probes for detecting rifampin, isoniazid and pyrazineamide antibiotic resistance of mycobacteria, a) and b) mycobacteria tuberculosis H37Rv (RMP) for detection of RMP resistance. Susceptible strains) and mycobacterium tuberculosis (RMP resistant strains), c) and d) are mycobacterium tuberculosis H37Rv (INH sensitive strains) and mycobacteres for detection of INH resistance For tuberculosis (INH resistant strains), e) and f) are mycobacterium tuberculosis H37Rv (PZA sensitive strain) and mycobacterium tuberculosis (PZA) for detection of PZA resistance Resistant strains).

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지지체에 부착된 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 균주 감별을 위한 프로브(probes), 결핵균의 스트레인 감별을 위한 프로브, 및 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a micro probe comprising a probe for discriminating strains of tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria, a probe for strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis, and a probe for detecting antibiotic resistance. Provide an array.

본 발명에서, 지지체는 마이크로어레이의 제작에 통상적으로 사용되는 슬라이드글라스, 멤브레인, 반도체 칩(semiconductive chip) 또는 실리콘(silicon) 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.In the present invention, the support includes, but is not limited to, a slide glass, a membrane, a semiconductor chip, a silicon, or the like, which is commonly used in the fabrication of microarrays.

바람직하게는, 본 발명의 마이크로어레이는 하나의 지지체에 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성을 검출하는 프로브(probes)를 한 세트로 하는 다수의 세트로 포함하는 것을 특징으로 한다. 이로써, 단 1회의 실험으로 다수의 검체로부터 동시에 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성 검출을 신속하고 정확하게 할 수 있다.Preferably, the microarray of the present invention comprises a plurality of sets of probes for detecting strains of tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria, strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis and antibiotic resistance on one support. It features. This allows rapid and accurate detection of mycobacteria strains, strains of Mycobacterium tuberculosis and detection of antibiotic resistance from multiple specimens simultaneously in just one experiment.

본 발명에서, 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 균주 감별을 위한 프로브는 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 표적 유전자에 특이적으로 결합 반응할 수 있는 염기서열, 예를 들면, 이미 보고된 16S rRNA와 IS6110,HSP, SOD 유전자 등의 표적 염기서열을 갖는 어떤 올리고뉴클레오티드도 포함하나, 바람직하게는 마이코박테리아 속 특이적인 ITS(Internal Transcribed Spacer) 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 결핵 마이코박테리아 종 특이적인 ITS 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 및 비결핵 마이코박테리아 종 특이적인 ITS 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 내지 9의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 10 내지 16의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 및 서열번호 17 내지 89의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the probe for differentiating the tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria strains is capable of specifically binding to the target genes of tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria, for example, the previously reported 16S rRNA and IS 6110 , HSP, which oligonucleotide includes one, and preferably oligonucleotides containing mycobacterial genus-specific ITS (Internal Transcribed Spacer) sequencing oligonucleotides, tuberculosis mycobacterial species-specific ITS base sequence having a target nucleotide sequence, such as SOD gene And an oligonucleotide comprising an nucleotide sequence specific to a non-tuberculosis mycobacterial species-specific ITS, and more preferably one or more oligonucleotides comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 9. At least one nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 10 to 16 Oligonucleotides, and characterized in that it comprises one or more oligonucleotides comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 17 to 89.

본 발명에서, 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 균주 감별을 위한 표적 유전자인 ITS(Internal Transcribed Spacer region)는 마이코박테리아의 16S rRNA와 23S rRNA 사이에 존재하는 것으로서 균주의 종류에 따라 크기에 차이가 있어 약 300∼500 bp 크기이며, 마이코박테리아에만 존재하는 보존적인 염기서열 지역과 속에 따라 특이적인 염기 서열 지역이 고르게 분포하고 있어 이를 표적 염기서열로 하여 동정 프라이머(프로브) 제작에 좋은 조건을 갖추고 있는 내부전사부위이다(Roth A, Fischer M, Hamid ME, Michalke S, Ludwig W 및 Mauch H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. J. Clin. Microbiol. 36: 139(1998); Park H.K., Jang H.J., Kim C.M., Chung B.S., Chang C.H., Park S.K., 및 Song S.D. Detection and identification of mycobacteria by amplification of the internal transcribed spacer regions with genus- and species-specific PCR primers. J. Clin. Microbiol. 38: 4080-4085(2000)).In the present invention, ITS (Internal Transcribed Spacer region), which is a target gene for discriminating between tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria, is present between 16S rRNA and 23S rRNA of mycobacteria and varies in size depending on the type of strain. 300 to 500 bp in size, and evenly distributed within the conservative sequencing region and genus specific nucleotide regions present only in mycobacteria, the internal transcript having good conditions for the production of identification primers (probes) (Roth A, Fischer M, Hamid ME, Michalke S, Ludwig W and Mauch H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences.J. Clin. Microbiol. 36: 139 ( Park HK, Jang HJ, Kim CM, Chung BS, Chang CH, Park SK, and Song SD Detection and identification of mycobacteria by amplification of the internal transcribed spacer regions with genus- and species-specific PCR primers.J. Clin.Microbiol. 38: 4080-4085 (2000).

본 발명의 마이코박테리아 균주 감별을 위한 마이크로어레이(microarray)는 다형성(polymorphism) 정도가 높은 지역인 ITS를 표적 염기서열로 각각의 마이코박테리아 속 특이적이며 종 특이적인 프로브를 제작하여 이를 지지체에 부착하여 제작하였다. ITS를 포함할 수 있는 양쪽 보존지역(conserved sequence)에서 프라이머를 정하여 중합효소연쇄반응으로 증폭시켜 마이크로어레이에서 혼성화 반응에 의해 나타나는 신호를 분석하여 동정하였다. 또한 중복감염의 경우에도 다수의 균주가 동시에 동정될 수 있으므로 기존의 검사법에서는 동정이 어려운 중복감염의 진단이가능하다.The microarray for differentiating mycobacteria strains of the present invention is to produce specific and species-specific probes of each mycobacteria as a target sequence of ITS, a region of high polymorphism, and attach them to a support. Produced. Primers were selected from both conserved sequences that could contain ITS, amplified by polymerase chain reaction, and identified by analyzing signals exhibited by hybridization in microarrays. In addition, even in the case of overlapping infection, since multiple strains can be identified at the same time, it is possible to diagnose duplicate infection that is difficult to identify by the existing test method.

본 발명에서, 결핵균의 스트레인 감별을 위한 프로브는 결핵균의 스트레인의 표적 유전자에 특이적으로 결합 반응할 수 있는 염기서열, 예를 들면, 이미 보고된 IS6110,반복성 요소인 PGRS(polymorphic GC-rich sequence)와 GTG(triplet multimer) 등의 표적 염기서열을 갖는 어떤 올리고뉴클레오티드도 포함하나, 바람직하게는 결핵균의 스트레인 특이적 DR(direct repeat) 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 90 내지 134의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the probe for strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis is a sequence capable of specifically binding to the target gene of the strain of Mycobacterium tuberculosis, for example, the already reported IS 6110, a repeating element PGRS (polymorphic GC-rich sequence ) And any oligonucleotide having a target sequence such as GTG (triplet multimer), but preferably comprises an oligonucleotide comprising a strain specific direct repeat (DR) sequence of Mycobacterium tuberculosis. Preferably it comprises one or more oligonucleotides comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 90 to 134.

본 발명에서의 결핵균의 스트레인 감별 방법은 마이코박테리움 투베르쿨로시스 내에 존재하는 DR(direct repeat) locus와 DRs 내에 다양한 길이로 존재하는 비반복적 스페이서(nonrepetitive spacer)를 표적으로 하여 마이크로어레이를 제작하여 이루어졌다. 스폴리고타이핑 방법처럼 결핵균의 스트레인별 DR locus의 다양성에 기초하였다. PCR을 이용하여 in vitro에서 증폭한 결핵균의 스트레인에 의존한 혼성화 반응에 기초한 방법으로 기존의 상품화된 방법보다 단시간에 정확하고 편리한 방법으로 결핵균의 스트레인을 감별할 수 있다.The strain discrimination method of Mycobacterium tuberculosis in the present invention targets a direct repeat (DR) locus present in Mycobacterium tuberculosis and a nonrepetitive spacer present in various lengths in the DRs to produce a microarray. Was done. Like the spoligotyping method, it was based on the variation of DR locus by strain of Mycobacterium tuberculosis. Based on hybridization reactions based on strains of tuberculosis bacteria amplified in vitro using PCR, strains of Mycobacterium tuberculosis can be discriminated in an accurate and convenient manner in a shorter time than conventional commercialized methods.

본 발명에서, 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브는 항생제 내성을 유도하는 표적 유전자에 특이적으로 결합 반응할 수 있는 염기서열, 예를 들면, 리팜핀(rifampin, RMP), 아이소니아지드(isoniazid, INH), 피라진아마이드(pyrazinamide, PZA), 에탐부톨(ethambutol, EMB),스트렙토마이신(streptomycin, STR), 플로퀴노론(fluoroquinolone, FQ), 카나마이신(kanamycin), 그리고 아미카신(amikacin) 등에 대한 내성을 유도하는 표적 염기서열을 갖는 어떤 올리고뉴클레오티드도 포함하나, 바람직하게는 리팜핀 내성을 유도하는rpoB유전자의 점돌연변이 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 아이소니아지드 내성을 유도하는katG유전자의 점돌연변이 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 피라진아마이드 내성을 유도하는pncA유전자의 점돌연변이 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 135 내지 160의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 161 내지 169의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 170 내지 173의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the probe for detecting antibiotic resistance may include a sequence capable of specifically binding to a target gene inducing antibiotic resistance, for example, rifampin (RMP), isoniazid (INH), Induces resistance to pyrazinamide (PZA), etahambutol (EMB), streptomycin (STR), fluoroquinolone (FQ), kanamycin, and amikacin Oligonucleotides comprising any oligonucleotide having a target sequence, but preferably an oligonucleotide comprising a point mutation sequence of the rpoB gene that induces rifampin resistance, and an oligonucleotide comprising the point mutation sequence of the katG gene that induces isoniazid resistance nucleotides, oligonucleotides containing the point mutation in the pncA gene nucleotide sequence to induce immunity pyrazinamide nyukeul Characterized in that it comprises an or more, more preferably at least one oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 135 to 160, at least one oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 161 to 169, SEQ ID NO It is characterized by comprising one or more oligonucleotides comprising the base sequence of 170 to 173.

RMP와 INH 모두에 내성을 보이는 다제내성 결핵균 중 RMP 내성 균주의 94∼98%가rpoB유전자에 의해 암호화되는 DNA 의존성 RNA 중합효소 β subunit의 제한된 지역 내의 점돌연변이(point mutation)에 의해 생기므로 DNA 혼성화 반응(hybridization)과 역 혼성화 반응(reverse hybridization)을 이용하여 쉽게 확인할 수 있다(이민기, 김윤성, 이효진, 전두수, 윤상명, 박삼석, 김철민, 및 박순규. 염기서열결정과 Line Probe 분석법에 의한 리팜핀 내성 결핵균의rpoB유전자 분석. 결핵 및 호흡기 질환, 44: 251-263(1997); Rossau R., Traore H., De Beenhouwer H., Mijs W., Jannes G., De Rijk P., Portaels F. Evaluation of the INNO-LiPA Rif. TB assay, a reverse hybridization assay for the simultaneousdetection ofMycobacterium tuberculosiscomplex and its resistance to rifampin. Antimicrob Agents Chemother, 41: 2093-2098(1997) 참조).DNA hybridization occurs because 94-98% of RMP-resistant strains of MDR-TB that are resistant to both RMP and INH are caused by point mutations within a restricted region of the DNA-dependent RNA polymerase β subunit encoded by the rpoB gene. It can be easily identified by using hybridization and reverse hybridization (Lee Min Ki, Yoon Sung Kim, Hyo Jin Lee, Chun Doo Soo, Yoon Sang Myung, Sam Sam Seok, Kim Chul Min, and Park Soon Kyu. Reaction of Rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis by Sequencing and Line Probe Analysis rpoB gene analysis, tuberculosis and respiratory disease, 44: 251-263 (1997); Rossau R., Traore H., De Beenhouwer H., Mijs W., Jannes G., De Rijk P., Portaels F. Evaluation of the INNO-LiPA Rif.TB assay, a reverse hybridization assay for the simultaneous detection of Mycobacterium tuberculosis complex and its resistance to rifampin.Antimicrob Agents Chemother, 41: 2093-2098 (1997).

또 다른 항생제인 INH는 주로 마이코박테리움 투베르쿨로시스 콤플렉스에 의한 감염 치료에 주로 이용되는 항생제로 비결핵 마이코박테리아와 원핵생물(prokaryote)에서는 내성을 나타낸다. INH 내성 결핵균의 약 84%가katG돌연변이 또는inhA의 상류 뉴클레오티드(upstream nucleotide) 치환에 의한 것으로 75%가 catalase-peroxidase 효소의 유전자인katG유전자 일부의 구조 변화에 의한 기능 저하 또는 기능 상실이 주로 발견되고 있다. 그중 코돈 315 부위의 serine(AGC)이 threonine(ACC)과 asparagine(AAC)으로, 코돈 463 부위의 arginine(CGG)이 leucine(CTG)으로 치환된 돌연변이가 INH 내성에 중요한 기전으로 밝혀지고 있다(Musser J.M., Kapur V., Williams D.L., Kreiswirth B.N., van Soolingen D., van Embden J.D. Characterization of the catalase-peroxidase gene (katG) andinhAlocus in isoniazid-resistant and -susceptible strains ofMycobacterium tuberculosisby automated DNA sequencing: restricted array of mutations associated with drug resistance. J Infect Dis. 173: 196-202(1996); Ramaswamy S., Musser J. M. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance inMycobacterium tuberculosis: 1998 update. Tuber Lung Dis, 79: 3-29(1998) 참조).Another antibiotic, INH, is an antibiotic mainly used to treat infections caused by the Mycobacterium tuberculosis complex, which is resistant to non-tuberculosis mycobacteria and prokaryote. About 84% of INH resistant tuberculosis bacteria are caused by katG mutations or upstream nucleotide substitutions of inhA . 75% are mainly due to structural changes in the katG gene, a gene of catalase-peroxidase enzymes, or loss of function. have. Among them, mutations in which serine (AGC) at codon 315 was replaced with threonine (ACC) and asparagine (AAC), and arginine (CGG) at codon 463 were replaced with leucine (CTG) were identified as important mechanisms for INH resistance (Musser). JM, Kapur V., Williams DL, Kreiswirth BN, van Soolingen D., van Embden JD Characterization of the catalase-peroxidase gene (katG) and inhA locus in isoniazid-resistant and -susceptible strains of Mycobacterium tuberculosis by automated DNA sequencing: restricted array of mutations associated with drug resistance.J Infect Dis. 173: 196-202 (1996); Ramaswamy S., Musser JM Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis : 1998 update.Tuber Lung Dis, 79: 3-29 (1998).

다제내성 결핵에서 PZA 내성을 보이게 되면 치료가 어렵기 때문에 INH와 RMP의 내성뿐만 아니라 PZA의 내성에 대한 검출도 매우 중요하다. PZA는 결핵을 치료하는 1차 약제 중의 하나로, 피라진아미데이즈(pyrazinamidase, PZase)에 의해서 활성형인 피라지노익 액시드(pyrazinoic acid, POA)로 전환되어 살균 효과를 나타내고, 결핵균이 갖고 있는 PZase의 활성이 소실되면 그 결핵균은 PZA에 내성을 갖게 된다(Konno K., Feldmann F. M., McDermott W. Pyrazinamide susceptibility and amidase activity of tubercle bacilli. Am Rev Respir Dis 95: 461-469(1967)). PZA 내성에는 PZase를 만들어내는 유전자인pncA유전자 프로모터의 -11에 A가 G로 치환된 돌연변이가 중요한 PZA 내성 기전으로 보고되었다(Park S.K., Lee J.Y., Chang C.L., Lee M.K., Son H.C., Kim C.M., Jang H.J., Park H.K., 및 Jeong S.H. pncA mutations in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Korea. BMC Infectious Diseases 1: 4-8(2001) 참조).Because PZA resistance in MDR-TB is difficult to treat, detection of PZA resistance as well as INH and RMP resistance is very important. PZA is one of the primary drugs for treating tuberculosis. It is converted into pyrazinoic acid (POA), which is active by pyrazinamidase (PZase), and shows bactericidal effect. This loss causes the tuberculosis to become resistant to PZA (Konno K., Feldmann FM, McDermott W. Pyrazinamide susceptibility and amidase activity of tubercle bacilli. Am Rev Respir Dis 95: 461-469 (1967)). In PZA resistance, mutations in which A is substituted for G by -11 of the pncA gene promoter, a gene that produces PZase, have been reported as important PZA resistance mechanisms (Park SK, Lee JY, Chang CL, Lee MK, Son HC, Kim CM, Jang HJ, Park HK, and Jeong SH pncA mutations in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Korea.See BMC Infectious Diseases 1: 4-8 (2001).

본 발명에서의 항생제 내성 결핵균의 검출 방법은 분자유전학에 기초하여 각 항생제의 염기서열 변화에 의한 돌연변이 검출에 기초하였다. 각 항생제에서 표적 염기서열의 야생형과 돌연변이 검출을 위한 프로브를 고형지지체에 부착하여 마이크로어레이를 제작하였다. 한번의 실험으로 다양한 돌연변이 검출이 가능하며, 장시간이 소요되는 기존의 항생제 내성 결핵균 검출 방법에 비해 단시간에 정확한 돌연변이를 검출함으로서 조속한 항생제 내성 여부 확인으로 효과적인 결핵치료를 가능하게 하는 검사법이다.The detection method of the antibiotic resistant tuberculosis bacterium in the present invention was based on the detection of mutations by the change of the nucleotide sequence of each antibiotic based on molecular genetics. In each antibiotic, a microarray was prepared by attaching a probe for detecting wild type and mutation of a target sequence to a solid support. It is possible to detect a variety of mutations in one experiment, and it is a test method that enables effective tuberculosis treatment by quickly detecting antibiotic resistance by detecting accurate mutations in a short time compared to conventional antibiotic-resistant tuberculosis detection methods that take a long time.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 마이크로어레이를 이용하여 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별, 및 항생제의 내성 검출을 동시에 수행하는 검출 방법을 제공한다. 즉, 본 발명의마이크로어레이를 제작하고, 여기에 배양된 균 또는 임상 검체로부터 분리된 표적 DNA를 혼성화 반응시킨 후, 표적 DNA와 프로브의 결합유무를 확인함으로써 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별, 및 항생제의 내성 검출을 동시에 수행할 수 있다.In order to achieve the above another object, the present invention provides a detection method for simultaneously performing strain discrimination of tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria, strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis, and detection of antibiotic resistance using the microarray of the present invention. That is, the microarray of the present invention was prepared, hybridized with the target DNA isolated from the cultured bacteria or clinical specimens thereafter, and then identified whether the target DNA and the probe binding, to discriminate against the strains of tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria, Strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis and detection of resistance of antibiotics can be performed simultaneously.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 마이크로어레이를 포함하는 결핵 및 비결핵 마이코박테리아 감염 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 진단 키트에는 본 발명의 마이크로어레이외에 혼성화 반응용액, 표적유전자를 증폭하기 위한 프라이머가 포함된 PCR 키트, 비혼성화 반응 DNA 세척용 용액, 커버슬립, 염료, 비염료 결합 세척용 용액 및 사용설명서 등을 더 포함할 수 있다.In order to achieve the above another object, the present invention provides a tuberculosis and non-tuberculosis mycobacterial infection diagnostic kit comprising a microarray of the present invention. In the diagnostic kit of the present invention, in addition to the microarray of the present invention, a hybridization reaction solution, a PCR kit including a primer for amplifying a target gene, a solution for washing a non-hybridization reaction DNA, a cover slip, a dye, a solution for non-dye binding, and use It may further include instructions.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열 번호 1 내지 89의 염기서열을 포함한 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 균주 감별을 위한 프라이머 또는 프로브용 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 90 내지 134의 염기서열을 포함한 결핵균의 스트레인 감별을 위한 프라이머 또는 프로브용 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 135 내지 173의 염기서열을 포함한 항생제 내성을 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브용 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 균주 감별용 올리고뉴클레오티드는 마이크로어레이에 부착되는 프로브(probes)로서 뿐만 아니라 마이코박테리아 속 특이적이며 종 특이적인 표적 DNA의 PCR 증폭을 위한 프라이머(primers)로서도 사용이 가능하다. 따라서 본 발명의 균주 감별용 올리고뉴클레오티드는 상기 서열번호들의 센스(sense) 또는 안티센스(antisense) 염기서열을 모두 포함할 수 있다.In order to achieve the above another object, the present invention provides a primer or probe oligonucleotide for discriminating tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria, including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to 89, the base sequence of SEQ ID NO: 90 to 134 Provided are oligonucleotides for primers or probes for strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis and oligonucleotides for primers or probes for detecting antibiotic resistance, including the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 135 to 173. Oligonucleotides for differentiation of strains of the present invention can be used not only as probes attached to microarrays, but also as primers for PCR amplification of specific and species-specific target DNAs of mycobacteria. Therefore, the strain discriminating oligonucleotide of the present invention may include both the sense (sense) or antisense (sense) base sequence of the sequence numbers.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예인 마이크로어레이의 도면으로서, a)는 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성 검출을 위한 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체에 다수 세트로 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이며, b)는 a)중 한 세트로서 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성을 검출하는 프로브 모두를 포함하는 마이크로어레이의 도면이며, c)는 b)의 마이크로어레이를 프로브 기능별로 구획을 나눈 도면이다. 도 1c에서, 마이크로어레이의 좌측상단에 마이코박테리아 균주 감별을 위한 프로브를 부착하고, 우측상단에 결핵균 스트레인 감별을 위한 프로브를 부착하고, 좌측중단, 좌측하단 및 우측하단에 각각 RMP 내성 검출, INH 내성 검출 및 PZA 내성 검출을 위한 프로브를 부착하고 있으나, 이것은 본 발명에 따른 프로브 구획의 한 예에 불과하므로 각 프로브 구획의 위치(layout)는 변동될 수 있다.1 is a diagram of a microarray which is a preferred embodiment of the present invention, a) comprising a set of probes for differentiating strains of mycobacteria, strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis, and detection of antibiotic resistance in a plurality of sets on one support. A diagram of a microarray, b) is a set of a), a diagram of a microarray comprising both strain discrimination of tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria, strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis, and probes for detecting antibiotic resistance, and c) is b The microarray of) is divided by the probe function. In FIG. 1C, a probe for differentiating mycobacteria strains is attached to the upper left of the microarray, a probe for discriminating Mycobacterium tuberculosis strains is attached to the upper right, and RMP resistance detection and INH resistance are respectively detected on the left, bottom and right bottoms. Although probes for detection and PZA resistance detection are attached, this is only one example of the probe compartment according to the present invention, so the layout of each probe compartment may vary.

본 발명에서 개발된 마이코박테리아 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별 및 항생제 내성 검출을 위한 프라이머 및 프로브는 각각 표1, 표2 및 표3과 같다.Primers and probes for differentiating mycobacteria strains, strains for Mycobacterium tuberculosis, and detection of antibiotic resistance developed in the present invention are shown in Tables 1, 2, and 3, respectively.

<표1> 마이코박테리아 균주 감별을 위한 프라이머Table 1: Primers for differentiating mycobacteria strains

<표2> 결핵균의 스트레인 감별을 위한 프라이머Table 2 Primers for Strain Differentiation of Mycobacterium Tuberculosis

<표3> 항생제 내성 검출을 위한 프라이머Table 3: Primers for Antibiotic Resistance Detection

이하, 실시 예를 기초로 하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시 예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. However, these examples are only illustrative of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

실시 예 1: 마이코박테리아 균주의 배양 및 제놈 DNA 분리Example 1 Culture of Mycobacteria Strains and Genome DNA Isolation

마이코박테리아 표준 균주는 유전자은행(Korean Collection for Type Culture, KCTC)과 ATCC(American Type Culture Collection)에서 확보하고 대한결핵협회와 마산결핵병원을 통해서 임상 검체를 확보하였으며 이들의 DNA를 추출하기 위해서는 인스타진 매트릭스(InstaGene matrix, Bio-Rad Co., USA)를 사용하였다.Mycobacteria standard strains were obtained from the Korean Collection for Type Culture (KCTC) and the American Type Culture Collection (ATCC), and clinical samples were obtained through the Korean Tuberculosis Association and Masan Tuberculosis Hospital. Matrix (InstaGene matrix, Bio-Rad Co., USA) was used.

균주 및 임상 검체는 1.5 ㎖ 튜브에 인스타진 매트릭스 200 ㎕를 가하였다. 그리고, 본 실험에 사용할 균주를 고체 배지(Ogawa 배지)에서 배양한 후 1 백금이를 따서 인스타진 매트릭스가 들어 있는 튜브에 넣어 부유시켰다. 이것을 56 ℃에서 30 분 동안 반응시킨 후 10 초 동안 잘 혼합되도록 섞고, 다시 100 ℃에서 8 분 동안 열처리한 후 10 초 동안 잘 섞었다. 혼합물을 12,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 분리된 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다. 이를 PCR 반응의 주형 DNA로 사용하였다.Strains and clinical specimens were added 200 [mu] l of Instagin matrix to a 1.5 ml tube. In addition, the strain to be used in this experiment was incubated in a solid medium (Ogawa medium) and then suspended in a tube containing an Instagin matrix named after 1 platinum. The mixture was reacted at 56 ° C. for 30 minutes, mixed well for 10 seconds, heat-treated at 100 ° C. for 8 minutes, and mixed well for 10 seconds. The mixture was centrifuged at 12,000 rpm for 3 minutes to transfer the separated supernatant to a new tube. This was used as template DNA of the PCR reaction.

사용된 표준 균주는 다음과 같다:Standard strains used were as follows:

마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv (ATCC 27294)Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294)

마이코박테리움 포튜이툼(M. fortutium) (ATCC 6841) M. fortutium (ATCC 6841)

마이코박테리움 플라베센스(M. flavescence) (ATCC 14474)Mycobacterium Plata bay Sense (M. flavescence) (ATCC 14474)

마이코박테리움 아비움(M. avium) (ATCC 25291)Mycobacterium Avium ( M. avium ) (ATCC 25291)

마이코박테리움 인트라셀룰라(M. intracellulare) (ATCC 13950)Mycobacterium intracellulare (ATCC 13950)

마이코박테리움 칸사시(M. kansasii) (ATCC 12478)Mycobacterium Kansasii (ATCC 12478)

마이코박테리움 첼로네(M. chelonae) (ATCC 35752)Mycobacterium cellone ( M. chelonae ) (ATCC 35752)

마이코박테리움 엠서수스(M. abscessus) (ATCC 19977)Mycobacterium M. abscessus (ATCC 19977)

마이코박테리움 스줄가이(M. szulgai) (ATCC 35799)Mycobacterium Szulgai (ATCC 35799)

마이코박테리움 스크로푸레시움(M. scrofulaceum) (ATCC 19981)Mycobacterium scrofulaceum (ATCC 19981)

마이코박테리움 고도네(M. gordonae) (ATCC 14470)Mycobacterium Godone (ATCC 14470)

마이코박테리움 베체(M. vaccae) (ATCC 15483) M. vaccae (ATCC 15483)

마이코박테리움 제노피(M. xenopi) (ATCC 19250)Mycobacterium xenopi (ATCC 19250)

마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis) (ATCC 21701)Mycobacterium smegmatis (ATCC 21701)

마이코박테리움 제네벤스(M. genavense) (ATCC 51233)Mycobacterium Geneva Bence (M. genavense) (ATCC 51233)

마이코박테리움 말모엔스(M. malmoense) (ATCC 29571)Mycobacterium malmoense (ATCC 29571 )

마이코박테리움 시미에(M. simiae) (ATCC 25275)Mycobacterium simiee (ATCC 25275)

마이코박테리움 마리넘(M. marinum) (ATCC 927)Mycobacterium marinum (ATCC 927)

마이코박테리움 울세란스(M. ulcerans) (ATCC 19423)Mycobacterium ulcerans (ATCC 19423)

마이코박테리움 가스트리(M. gastri) (ATCC 15754)Mycobacterium gastri (ATCC 15754)

마이코박테리움 테레(M. terrae) (ATCC 15755)Mycobacterium terephthalate (M. terrae) (ATCC 15755)

마이코박테리움 레프레 임상검체(M. lepraeclinical isolates)Mycobacterium lepree clinical isolates

마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)Mycobacterium tuberculosis clinical isolates

마이코박테리움 보비스(M. bovis) BCG F117392Mycobacterium bovis BCG F117392

실시 예 2: 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성 검출을 위한 프로브 제작Example 2: Strain Differentiation of Mycobacteria, Strain Differentiation of Mycobacterium Tuberculosis and Probe Preparation for Antibiotic Resistance Detection

본 발명에 사용된 균주 감별, 항생제 내성 검사, 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 스트레인 감별을 위한 올리고뉴클레오타이드 프로브 제작을 위해 각 유전자에 대해 특이적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드는 퍼킨-엘머 DNA 합성기(Perkin Elmer DNA Synthesis, USA)를 사용해 5' 말단에 15개의 염기를 갖는 길이의 dT 스페이서 및 15-25개의 염기서열을 갖는 프로브를 합성하여 PAGE 정제하였다. 마이코박테리아 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성 검출을 위한 프라이머 및 프로브는 표1, 2, 3의 염기서열에 한정된 것이 아니라 이를 포함한 염기서열로 이루어진 프라이머 및 프로브를 제작하여 이용할 수 있다.Oligonucleotides specifically synthesized for each gene for the strain discrimination, antibiotic resistance test, strain production of Mycobacterium tuberculosis strains used in the present invention is a Perkin-Elmer DNA synthesizer (Perkin Elmer DNA Synthesis, USA) was synthesized by PAGE purification by synthesizing a probe having a length of 15 bases at a 5 'end and a 15-25 base sequence. Primers and probes for differentiating mycobacteria strains, strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis and detection of antibiotic resistance are not limited to the nucleotide sequences of Tables 1, 2 and 3, but may be prepared by using primers and probes consisting of nucleotide sequences including the same.

1. 마이코박테리아 균 균주 감별을 위한 프로브 제작1. Preparation of probe for differentiating mycobacteria strains

① 마이코박테리아 속 균주 감별을 위한 프로브 제작① Probe preparation for differentiating mycobacteria strains

모든 마이코박테리아에서만 혼성화 반응을 하도록 마이코박테리아의 ITS를 표적으로 하여 마이코박테리아에 보존적인 염기서열로 마이코박테리아 균주와 혼성화 반응을 하고 다른 병원성 미생물에 대해서는 혼성화 반응을 하지 않는 마이코박테리아 속 특이적인 ITS 염기서열을 선택하여, 표1의 서열 번호 3에서 9의 MYC-01에서 MYC-07까지의 프로브를 제작하였다.Specific ITS sequence of mycobacteria that hybridizes with mycobacteria strains by targeting ITS of mycobacteria to hybridize only to all mycobacteria and hybridizes with mycobacteria strains and does not hybridize to other pathogenic microorganisms Was selected to prepare probes from MYC-01 to MYC-07 in SEQ ID NOs: 3 to 9 in Table 1.

② 결핵균 균주 감별을 위한 프로브 제작② Probe for tuberculosis strain differentiation

마이코박테리아 속 중에서도 마이코박테리움 투베르쿨로시스 컴플렉스에서만 혼성화 반응을 하는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 콤플렉스 종 특이적인 프로브는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 컴플렉스와 비결핵 마이크로박테리아의 ITS 부분의 염기서열을 근거로 하여 표1의 서열 번호 10에서 16의 MTB-01에서 MTB-02,MTB-03, MTB-04, MTB-05, MTB-06, 그리고 MTB-07 프로브를 제작하였다.Among the mycobacteria, Mycobacteria tuberculosis Mycobacterium tuberculosis complex species-specific probes that hybridize only in the complex are mycobacterium tuberculosis MTB-02, MTB-03, MTB-04, MTB-05, MTB-06, MTB-01 to MTB-01 of SEQ ID NOs: 10 to 16, based on the nucleotide sequence of the ITS portion of the complex and non-tuberculosis microbacteria MTB-07 probes were constructed.

③ 비결핵균 균주 감별을 위한 프로브 제작③ Probe preparation for non-tuberculous strain differentiation

비결핵 마이코박테리아 각각의 균에서만 특이적으로 혼성화 반응을 하는 프로브는, 각각의 비결핵 마이크로박테리아의 ITS 부분의 종 특이적인 염기서열을 근거로 하여 표 1의 서열번호 17부터 89의 MAC-01부터 LEP-04까지 모두 21종의 비결핵 마이크로박테리아를 균주 감별하는 73종류의 프로브를 제작하였다.Probes that hybridize specifically to each of the non-tuberculosis mycobacteria strains, based on the species-specific nucleotide sequence of the ITS portion of each non-tuberculosis microbacteria bacterium, from SEQ-01 to 17 of MAC-01 Up to LEP-04, 73 types of probes were prepared for differentiating 21 non-tuberculosis microbacteria.

2. 결핵균의 스트레인 감별을 위한 프로브 제작2. Probe Preparation for Strain Differentiation of Mycobacterium Tuberculosis

마이코박테리움 투베르쿨로시스 내의 direct repeat(DR) locus와 DRs 내에 35∼41 bp의 다양한 길이로 존재하는 비반복적 스페이서(nonrepetitive spacer)를 바탕으로 표2의 서열번호 92부터 134까지의 SPO-01부터 SPO-43까지 모두 43개의 결핵균을 구별하는 프로브를 제작하였다. 마이코박테리움 투베르쿨로시스 스트레인 감별을 위한 43개의 염기서열은 이미 다수의 인용문헌을 통해 보고되었다(van Embden J.D., van Gorkom T., Kremer K., Jansen R., van Der Zeijst B.A., Schouls L.M. Genetic variation and evolutionary origin of the direct repeat locus ofMycobacterium tuberculosiscomplex bacteria. J Bacteriol 182: 2393-2401(2000); Kamerbeek J., Schouls L., Kolk A., van Agterveld M., van Soolingen D., Kuijper S., Bunschoten A., Molhuizen H., Shaw R., Goyal M., van Embden J. Simultaneous detection and strain differentiation ofMycobacterium tuberculosisfor diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol 35: 907-914(1997)).SPOs from SEQ ID NOs: 92 to 134 in Table 2 based on direct repeat (DR) locus in Mycobacterium tuberculosis and nonrepetitive spacers present in variable lengths ranging from 35 to 41 bp in DRs From 01 to SPO-43, a probe was distinguished from 43 tuberculosis bacteria. Forty-three sequences for differentiating Mycobacterium tuberculosis strains have already been reported in a number of citations (van Embden JD, van Gorkom T., Kremer K., Jansen R., van Der Zeijst BA, Schouls). LM Genetic variation and evolutionary origin of the direct repeat locus of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria.J Bacteriol 182: 2393-2401 (2000); Kamerbeek J., Schouls L., Kolk A., van Agterveld M., van Soolingen D., Kuijper S., Bunschoten A., Molhuizen H., Shaw R., Goyal M., van Embden J. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology.J Clin Microbiol 35: 907-914 (1997)).

3. 항생제 내성 검출을 위한 프로브 제작3. Probe Preparation for Antibiotic Resistance Detection

① 리팜핀 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 검출을 위한 프로브 제작① Preparation of probe for the detection of rifampin-resistant mycobacterium tuberculosis

리팜핀 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 검출을 위해rpoB유전자에서 리팜핀 내성 결핵균의 90% 이상에서 원인이 된다고 보고된 돌연변이 출현빈도가 높은 코돈 511에서 코돈 533의 69 bp 염기서열을 바탕으로 각각의 돌연변이 검출 프로브에서 점돌연변이 염기서열이 프로브의 중앙부위에 오도록 디자인하였다. (Musser J.M. Antimicrobial agent resistance in mycobacteria: molecular genetic insights. Clin Microbiol Rev 8: 496-514(1995); 이민기, 김윤성, 이효진, 전두수, 윤상명, 박삼석, 김철민, 및 박순규. 염기서열결정과 Line Probe 분석법에 의한 리팜핀 내성 결핵균의rpoB유전자 분석. 결핵 및 호흡기 질환, 44: 251-263(1997); Valim A.R., Rossetti M.L., Ribeiro M.O., Zaha A. Mutations in therpoBgene of multidrug-resistantMycobacterium tuberculosisisolates from Brazil. J Clin Microbiol 38: 3119-3122(2000)). 그중 코돈 511 부위의 leucine(CTG)이 proline(CCG)으로, 코돈 513 부위의 glutamine(CAA)이 leucine(CTA)으로, 코돈 516 부위의 aspartic acid(GAC)이 valine(GTC)과 tyrosine(TAC)으로, 코돈 522 부위의 serine(TCG)이 leucine(TTG)으로, 코돈 526 부위의 histidine(CAC)이 tyrosine(TAC), aspartic acid(GAC), arginine(CGC), leucine(CTC)과 proline(CCC)으로, 돌연변이 빈도가 가장 높은 코돈 531 부위의 serine(TCG)이 leucine(TTG)과 tryptophan(TGG)으로의 치환과 코돈 533 부위의 leucine(CTG)이 proline(CCG)으로 치환된 점돌연변이를 바탕으로 디자인하여 7종류의 야생형과 총 13종류의 돌연변이를 검출하도록 표 3의 서열번호 137에서 160의 총 24종류의 프로브를 제작하였다.For the detection of rifampin-resistant mycobacterium tuberculosis, the rpoB gene was reported to be responsible for more than 90% of the rifampin-resistant tuberculosis bacteria, based on the 69 bp sequences of codons 511 to codon 533. In mutation detection probes, the point mutation sequences were designed to be in the center of the probe. (Musser JM Antimicrobial agent resistance in mycobacteria: molecular genetic insights.Clin Microbiol Rev 8: 496-514 (1995); Lee Min-Ki, Kim Yun-Sung, Hyo-Jin Lee, Doo-Soo Yoon, Sang-Myung Yoon, Sam-Suk Park, Chul-Min Kim, and Soon-Kyu Park. analysis rpoB gene of M. tuberculosis rifampin-resistant by tuberculosis and respiratory diseases, 44:. 251-263 (1997) ; Valim AR, Rossetti ML, Ribeiro MO, Zaha A. Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Brazil. J Clin Microbiol 38: 3119-3122 (2000). Among them, leucine (CTG) at codon 511 is proline (CCG), glutamine (CAA) at codon 513 is leucine (CTA), and aspartic acid (GAC) at codon 516 is valine (GTC) and tyrosine (TAC). Serine (TCG) at codon 522 was leucine (TTG), and histidine (CAC) at codon 526 was tyrosine (TAC), aspartic acid (GAC), arginine (CGC), leucine (CTC) and proline (CCC). ), Based on point mutations in which serine (TCG) at the codon 531 site with the highest mutation frequency was replaced with leucine (TTG) and tryptophan (TGG), and leucine (CTG) at codon 533 was replaced with proline (CCG). In order to detect 7 wild type and 13 kinds of mutations, a total of 24 probes of 160 in SEQ ID NO: 137 of Table 3 were prepared.

② 아이소니아지드 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 검출을 위한 프로브 제작② Preparation of probe for detection of isoniazid-resistant mycobacterium tuberculosis

아이소니아지드 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 검출을 위해 아이소니아지드 내성균의 약 70%를 차지하는katG유전자에서의 돌연변이 출현빈도가 높은 코돈 315와 463의 염기서열을 바탕으로 점돌연변이 염기서열이 중앙에 오도록 프로브를 디자인하였다(Musser J.M., Kapur V., Williams D.L., Kreiswirth B.N., van Soolingen D., van Embden J.D. Characterization of the catalase-peroxidase gene (katG) andinhAlocus in isoniazid-resistant and -susceptible strains of Mycobacterium tuberculosis by automated DNA sequencing: restricted array of mutations associated with drug resistance. J Infect Dis 173: 196-202(1996)). 코돈 315 부위의 serine(AGC)이 threonine(ACC)과 asparagine(AAC)으로, 코돈 463 부위의 arginine(CGG)이 leucine(CTG)으로 치환된 점돌연변이를 바탕으로 디자인하여 표 3의 서열번호 165에서 169의 프로브를 제작하여 2종류의 야생형(wild type)과 3종류의 돌연변이를 검출하도록 하였다.Based on the base sequences of codons 315 and 463 with high frequency of mutations in the katG gene, which accounts for about 70% of isoniazid resistant bacteria, for detection of isoniazid-resistant mycobacterium tuberculosis , was designed so that the probe (Musser JM, Kapur V., Williams DL, Kreiswirth BN, van Soolingen D., van Embden JD Characterization of the catalase-peroxidase gene (katG) and inhA locus in isoniazid-resistant and -susceptible strains of Mycobacterium tuberculosis by automated DNA sequencing: restricted array of mutations associated with drug resistance.J Infect Dis 173: 196-202 (1996)). The serine (AGC) at codon 315 was threonine (ACC) and asparagine (AAC), and the design was based on point mutations in which arginine (CGG) at codon 463 was replaced with leucine (CTG). 169 probes were constructed to detect two wild and three mutations.

③ 피라진아마이드 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 검출을 위한 프로브 제작③ Preparation of a probe for detection of pyrazineamide-resistant mycobacterium tuberculosis

피라진아마이드 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 경우 돌연변이가pncA염기서열 전반에 걸쳐 산재되어 있다. 따라서 프로브 선정시 점돌연변이인 경우로서 상대적으로 돌연변이 출현빈도가 높은 부위인 프로모터의 -11 부위의 A가 G로의치환을 검출하기위해 디자인하여 표 3의 서열번호 172에서 173의 프라이머 및 프로브를 제작하여 1종류의 야생형과 1종류의 돌연변이를 검출하도록 하였다.In pyrazineamide-resistant mycobacterium tuberculosis, mutations are scattered throughout the pncA sequence. Therefore, in the case of point mutations when selecting probes, a -11 region of the promoter, which is a relatively high mutation occurrence region, was designed to detect substitution with G. Thus, primers and probes of SEQ ID NOs 172 in Table 3 and 173 were prepared. One wild type and one mutation were detected.

실시 예 3: 표적 DNA 준비Example 3: Target DNA Preparation

1. 마이코박테리아 균 균주 감별을 위한 표적 DNA 준비1. Preparation of Target DNA for the Differentiation of Mycobacterial Strains

마이코박테리아 균 균주 감별을 위한 표적 DNA의 증폭을 위해 각각 바이오틴이 표지화된 ITSF 5'biotin-CGA AGC CAG TGG CCT AAC CC-3'(서열번호1), MYC-02 5'-biotin-ATG CTC GCA ACC ACT ATC CA-3'(서열번호 3)과 ITSR 5'-biotin-TGG ATC CTG CCA AGG CAT CCA CCA T-3'(서열번호2)를 사용하여 16S rRNA와 23S rRNA 일부를 포함하는 300∼500 bp 크기의 ITS부위를 선택적으로 증폭하도록 고안된 프라이머를 통상의 방법으로 제작하였다. 실시 예 1에서 분리된 각종 마이코박테리아 표준 균주와 임상 균주를 위의 프라이머를 이용하여 PCR 기법을 실시하였다. PCR은 퍼킨-엘머 시터스 써모사이클러 모델 9600(Perkin-Elmer Cetus Thermocycler Model 9600)에서 충분히 변성시키기 위해 94℃에서 3 분간 열처리한 후 94 ℃에서 1 분, 62 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 1 분씩 30 회 반응시킨 후, 마지막으로 72 ℃에서 10 분간 연장하였다. 반응 후 2 % 아가로스 젤로 전기영동을 실시하여 PCR 반응 산물의 크기를 확인하였다. 이 방법은 인용 문헌으로 개시하고 있는 Park H.K. 등에 의한 문헌 J. Clin. Microbiol. 38: 4080-4085(2000)에 상세히 기재되어 있다.Biotin-labeled ITSF 5'biotin-CGA AGC CAG TGG CCT AAC CC-3 '(SEQ ID NO: 1) and MYC-02 5'-biotin-ATG CTC GCA, respectively, for amplification of target DNA for differentiation of Mycobacteria strains ACC ACT ATC CA-3 '(SEQ ID NO: 3) and ITSR 5'-biotin-TGG ATC CTG CCA AGG CAT CCA CCA T-3' (SEQ ID NO: 2) using 300 to include portions of 16S rRNA and 23S rRNA Primers designed to selectively amplify 500 bp ITS sites were prepared in a conventional manner. Various mycobacterial standard strains and clinical strains isolated in Example 1 were subjected to PCR using the above primers. PCR was performed for 3 minutes at 94 ° C for 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 62 ° C, and 1 minute at 72 ° C for sufficient denaturation in Perkin-Elmer Cetus Thermocycler Model 9600. After reacting 30 times, it extended for 10 minutes at 72 degreeC finally. After the reaction, electrophoresis was performed on 2% agarose gel to confirm the size of the PCR reaction product. This method is described in Park H.K. In J. Clin. Microbiol. 38: 4080-4085 (2000).

2. 결핵균의 스트레인 감별을 위한 표적 DNA 준비2. Preparation of Target DNA for Strain Differentiation of Mycobacterium Tuberculosis

마이코박테리움 투베르쿨로시스 스트레인(strain)의 균주감별을 위한 표적 DNA의 증폭을 위해 여러 논문에 기재된 한쌍의 프라이머를 각각 바이오틴이 표지화된 DRa 5'-biotin-GGT TTT GGG TCT GAC GAC-3'(서열번호90)와 DRb 5'-biotin-CCG AGA GGG GAC GGA AAC-3'(서열번호91)을 사용하여 다양한 크기의 PCR 산물을 증폭하도록 프라이머를 제작하였다. 실시예 1에서 분리된 마이코박테리움 투베르쿨로시스 H37Rv 표준 균주와 임상 균주를 위의 프라이머를 이용하여 PCR 기법을 실시하였다. PCR은 퍼킨-엘머 시터스 써모사이클러 모델 9600(Perkin-Elmer Cetus Thermocycler Model 9600)에서 충분히 변성시키기 위해 96 ℃에서 3 분간 열처리한 후 96 ℃에서 1 분, 55 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 30초씩 25 회 반응시킨 후, 마지막으로 72 ℃에서 10 분간 연장하였다. 반응 후 2 % 아가로스 젤로 전기영동을 실시하여 PCR 반응 산물을 확인하였다.For the amplification of target DNA for strain identification of Mycobacterium tuberculosis strains, a pair of primers described in several articles were each biotin-labeled DRa 5'-biotin-GGT TTT GGG TCT GAC GAC-3 Primers were prepared to amplify PCR products of various sizes using '(SEQ ID NO: 90) and DRb 5'-biotin-CCG AGA GGG GAC GGA AAC-3' (SEQ ID NO: 91). Mycobacterium tuberculosis H37Rv standard strain and clinical strain isolated in Example 1 were subjected to PCR using the above primers. PCR was performed for 3 minutes at 96 ° C. for 1 minute at 96 ° C., 1 minute at 55 ° C., and 30 seconds at 72 ° C. for sufficient denaturation in Perkin-Elmer Cetus Thermocycler Model 9600. After 25 reactions, the mixture was finally extended at 72 ° C. for 10 minutes. After the reaction, electrophoresis was performed on 2% agarose gel to confirm the PCR reaction product.

3. 항생제 내성 결핵균의 검출을 위한 표적 DNA 준비3. Preparation of Target DNA for Detection of Antibiotic Resistant Mycobacterium Tuberculosis

RMP 내성 검사를 위한rpoB유전자의 돌연변이 검출을 위한 표적 DNA 증폭을 위해 각각 바이오틴이 부착된 rpoF 5'-biotin-TGC ACG TCG CGG ACC TCC A-3'(서열번호135)와 rpoR 5'-biotin-TCG CCG CGA TCA AGG AGT-3'(서열번호136) 프라이머를 약 160 bp 산물을 증폭하도록 고안하여 통상의 방법으로 제작하고, 이를 이용하여 표준 균주인 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv, RMP 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)와 RMP 감수성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)를 대상으로 PCR 기법을 실시하였다. 반응 조건은 94℃에서 3분간 반응시켜 충분히 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 62℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 35회 반응시켰으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 연장하였다. INH 내성 검사를 위한katG돌연변이 검출을 위한 프라이머는 2쌍으로 각각 150 bp의 산물을 증폭하도록 디자인하였다. 바이오틴이 부착된katG프라이머는 코돈 315 부위의 PCR 반응을 위하여 kat1F 5'-biotin-AAG AGC TCG TAT GGC ACC GG-3'(서열번호161)과 kat2R 5'-biotin-AGC GCC AGC AGG GCT CTT C-3'(서열번호162), 코돈 463 부위의 PCR 반응을 위하여 kat3F 5'-biotin-GGC GAA GCC GAG ATT GCC AG-3'(서열번호163)과 kat4R 5'-biotin-CTG CAG GCG GAT GCG ACC A-3'(서열번호164)을 제작하여 표준 균주인 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv, INH 내성의 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)와 INH 감수성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)를 대상으로 PCR 기법을 실시하였으며, PZA 내성 검사를 위한pncA의 프로모터 -11 지역의 돌연변이 검출에 사용한 프라이머는 표적 DNA를 약 200 bp 크기로 증폭하는 바이오틴이 부착된 pncF 5'-biotin-GCT GGT CAT GTT CGC GAT CG-3'(서열번호170)과 pncR 5'-biotin-ACC GGT TAC CGC CAG CGA G-3'(서열번호171) 프라이머를 제작하여 표준 균주인 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv, PZA 내성의 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)와 PZA 감수성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)를 대상으로 PCR 기법을 실시하였다. 반응 조건은 94 ℃에서 3분간 충분히 변성시킨 후 94℃에서 1분, 62℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 30회 반응시켰으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 연장하였다. 반응이 끝난 후 각각의 증폭 산물은 2% 아가로스 젤에 전기영동 하여 각각 150 bp와 180 bp 크기의 PCR 산물을 확인하였다.Biotinylated rpoF 5'-biotin-TGC ACG TCG CGG ACC TCC A-3 '(SEQ ID NO: 135) and rpoR 5'-biotin-, respectively, for target DNA amplification for mutation detection of the rpoB gene for RMP resistance testing TCG CCG CGA TCA AGG AGT-3 '(SEQ ID NO: 136) primers were designed to amplify about 160 bp product and prepared in a conventional manner, using the standard strain Mycobacterium tuberculosis ( M. tuberculosis) PCR was performed on H37Rv, RMP-resistant mycobacterium tuberculosis clinical isolates and RMP-sensitive mycobacterium tuberculosis clinical isolates. . After the reaction conditions were sufficiently modified by reacting at 94 ° C for 3 minutes, the reaction was carried out 35 times at 94 ° C for 30 seconds, at 62 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 1 minute, and finally extended at 72 ° C for 10 minutes. Primers for the detection of katG mutations for INH resistance testing were designed to amplify products of 150 bp in two pairs each. The biotinylated katG primers were used for the PCR reaction at the codon 315 site kat1F 5'-biotin-AAG AGC TCG TAT GGC ACC GG-3 '(SEQ ID NO: 161) and kat2R 5'-biotin-AGC GCC AGC AGG GCT CTT C -3 '(SEQ ID NO: 162), kat3F 5'-biotin-GGC GAA GCC GAG ATT GCC AG-3' (SEQ ID NO: 163) and kat4R 5'-biotin-CTG CAG GC GAT GCG for PCR reaction of codon 463 site ACC A-3 '(SEQ ID NO: 164) was prepared using the standard strain Mycobacterium tuberculosis H37Rv, INH resistant mycobacterium tuberculosis clinical isolates ) And INH-sensitive mycobacterium tuberculosis clinical isolates (PCA) were performed.The primers used to detect mutations in the promoter-11 region of pncA for PZA resistance testing were used as target DNA. PncF 5'-biotin-GCT GGT CAT GTT CGC GAT CG-3 'with biotin attached to amplify to about 200 bp Column No. 170) and pncR 5'-biotin-ACC GGT TAC CGC CAG CGA G-3 '( SEQ ID NO: 171), the Mycobacterium tuberculosis-to Bell Cool (M. tuberculosis produce a primer to type strain) H37Rv, PZA-resistant PCR was performed on M. tuberculosis clinical isolates and PZA-sensitive mycobacterium tuberculosis clinical isolates. The reaction conditions were sufficiently denatured at 94 ° C. for 3 minutes, and then reacted 30 times for 1 minute at 94 ° C., 1 minute at 62 ° C., and 1 minute at 72 ° C., and finally extended at 72 ° C. for 10 minutes. After the reaction, each amplification product was electrophoresed on 2% agarose gel to identify 150 bp and 180 bp PCR products, respectively.

실시 예 4: 지지체에 프로브 부착Example 4: Attaching a Probe to a Support

실시 예 2에서 제작된 프로브는 100 pmol로 희석하여 96-well 마이크로플레이트에 옮겨서 Micro-spotting 용액을 첨가하여 30 pmol로 잘 섞었다. 슬라이드 글라스 또는 멤브레인(membrane) 등의 지지체에 프로브를 마이크로어레이어(Cartesian Technologies, PLXSYS 7500 SQXL Microarryer, USA)를 이용하여 부착시켰다. 사용된 프로브는 각각에 대해 대표적인 한 종류의 프로브를 선정한 것으로, 도 1의 1에서 21에 해당하는 마이코박테리아 균주 감별 프로브는 순서대로 각각 서열번호 4, 13, 17, 25, 27, 31, 38, 43, 44, 49, 51, 54, 59, 62, 65, 71, 75, 77, 81, 88 및 4에 해당되며, 도 1의 49에서 93에 해당하는 결핵균 스트레인 감별 프로브는 차례대로 양성 대조군 프로브, 서열번호 92에서 134와 양성 대조군 프로브에 해당된다. 항생제 내성 검출용 프로브 중 RMP 내성 검출 프로브는 도 1의 22에서 42에 해당되는 것으로 차례대로 양성 대조군 프로브, 서열번호 137에서 153, 156, 159 및 160이며, INH 내성 검출 프로브는 도 1의 43에서 48로 양성 대조군 프로브와 서열번호 165에서 169에 해당되고, PZA 내성 검출 프로브는 도 1의 94에서 96으로 양성 대조군 프로브와 서열번호 172와 173에 해당된다. 한 종류의 프로브 당 두 개의 점(spot)을 지지체에 부착시킨 후, 실온의 슬라이드 박스에서 24시간 정도 정치 또는 50℃의 건조기(dry oven)에 약 5시간 방치하여 지지체 위의 표면에 고정시켰다.The probe prepared in Example 2 was diluted to 100 pmol, transferred to a 96-well microplate, and mixed well at 30 pmol by adding a micro-spotting solution. The probe was attached to a support such as a slide glass or a membrane using a microarray (Cartesian Technologies, PLXSYS 7500 SQXL Microarryer, USA). The probes used were selected one representative probe for each, and the mycobacterial strain differentiation probes corresponding to 1 to 21 of FIG. 1 were sequence numbers 4, 13, 17, 25, 27, 31, 38, Mycobacterium tuberculosis strain differential probes corresponding to 43, 44, 49, 51, 54, 59, 62, 65, 71, 75, 77, 81, 88, and 4, and 49 to 93 in FIG. , SEQ ID NO: 92 corresponds to 134 and a positive control probe. Among the antibiotic resistance detection probes, RMP resistance detection probes correspond to 22 to 42 of FIG. 1, and are positive control probes, 153 to 156, 159 and 160, respectively, SEQ ID NOs. 137, and INH resistance detection probes to 43 of FIG. 48 corresponds to the positive control probe and SEQ ID NOs: 165 to 169, and PZA resistance detection probe corresponds to 94 to 96 of Figure 1 corresponds to the positive control probe and SEQ ID NOs: 172 and 173. After attaching two spots per probe to the support, they were allowed to stand on a slide box at room temperature for about 24 hours or in a dry oven at 50 ° C. for about 5 hours to be fixed to the surface on the support.

실시 예 5: 고정되지 않은 프로브의 세척Example 5: Washing of Unfixed Probes

지지체 표면에 부착되지 않은 프로브를 제거하기 위해 실온에서 0.2% SDS(Sodium dodecyl sulfate) 용액에 세척한 후, 증류수로 2회 세척하였다. Sodium borohydride 용액으로 세척하고 다시 끓는 증류수에 세척하였다. 실온에서 0.2% SDS와 증류수를 이용하여 세척한 후 원심분리기를 이용하여 지지체 표면을 완전하게 건조시켜 마이크로어레이 제작을 완료하였다.In order to remove the probes not attached to the surface of the support, the solution was washed with 0.2% sodium dodecyl sulfate (SDS) solution at room temperature and then washed twice with distilled water. Washed with sodium borohydride solution and again washed with boiling distilled water. After washing with 0.2% SDS and distilled water at room temperature, the support surface was completely dried using a centrifuge to complete the microarray fabrication.

실시 예 6: 혼성화 반응 (Hybridization)Example 6: Hybridization

실시 예3에서 제조된 바이오틴으로 표지화된 표적 DNA를 단일 가닥으로 사용하기 위해 끓인 후, 4℃로 냉각시켰다. 1∼5 ㎕의 표적 DNA를 포함하는 혼성화 반응 용액 10 ㎕를 제작하였다. 프로브 부착과 세척을 마친 슬라이드에 혼성화 반응 용액을 분주하고 기포가 생기지 않도록 커버 슬립을 덮은 뒤 40℃에서 30분간 반응시켰다.The biotin-labeled target DNA prepared in Example 3 was boiled for use as a single strand and then cooled to 4 ° C. 10 µl of the hybridization reaction solution containing 1 to 5 µl of target DNA was prepared. The hybridization reaction solution was dispensed on the slide after the attachment and washing of the probe and the cover slip was covered to prevent bubbles, and then reacted at 40 ° C. for 30 minutes.

실시 예 7: 결합되지 않은 DNA의 세척Example 7: Washing of Unbound DNA

혼성화 반응을 하지 않은 잔여의 DNA를 세척하기 위해 2× SSC(300mM NaCl, 30mM Na-Citrate, pH 7.0)와 0.2% SDS를 혼합한 용액을 이용하여 커버 슬립을 제거한 후에 2× SSC/ 0.2% SDS 세척 용액과 2× SSC, 그리고 0.2× SSC 용액 순으로 슬라이드를 세척하였다. 마지막으로 원심분리기를 이용하여 세척한 슬라이드를 완전하게 건조시켰다.2 × SSC / 0.2% SDS after removing the cover slip using a solution of 2 × SSC (300mM NaCl, 30mM Na-Citrate, pH 7.0) and 0.2% SDS to wash the remaining unhybridized DNA. Slides were washed in the order of washing solution, 2 × SSC, and 0.2 × SSC solution. Finally, the washed slides were completely dried using a centrifuge.

실시 예 8: 염료 결합 및 분석Example 8: Dye Binding and Analysis

PCR 산물과 프로브와의 결합유무를 확인하기 위해, Cy5-streptavidin 또는 Cy3-streptavidin(Amersham pharmacia biotech, USA)을 6 × SSC와 BSA(BovineSerum Albumin)를 이용하여 희석한 후 약 40 ㎕를 슬라이드에 분주하여 커버 슬립을 덮고 빛을 차단한 후 50℃에서 약 20분간 반응시켰다. 반응 후 슬라이드를 2× SSC 용액을 이용하여 커버 슬립을 제거한 후, 2× SSC, 그리고 0.2 × SSC 용액을 사용하여 세척하였다. 분석을 위해 비공초점 레이져 스캐너(non-confocoal laser scanner)인 GenePix 4000A(Axon Instruments, USA)를 이용하여 결과를 분석하였다.To confirm the binding of the PCR product to the probe, dilute Cy5-streptavidin or Cy3-streptavidin (Amersham pharmacia biotech, USA) with 6 × SSC and BSA (BovineSerum Albumin) and dispense approximately 40 μl onto slides. After covering the cover slip and blocking the light was reacted for about 20 minutes at 50 ℃. After the reaction, the slides were removed using 2 × SSC solution, and then washed with 2 × SSC, and 0.2 × SSC solution. For analysis, the results were analyzed using a GenePix 4000A (Axon Instruments, USA), a non-confocoal laser scanner.

도 2는 하나의 검체로부터 한번의 실험으로 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성을 동시에 검출하기 위한 각 프로브들의 특이적 혼성화 반응의 결과를 스캐너로 분석한 그림으로 각 프로브에 대해 마이코박테리아 튜베르쿨로시스 H37Rv를 표적 DNA로 하여 본 발명을 위한 마이크로어레이와의 혼성화 반응을 실시한 결과, 마이코박테리아 균주 감별 결과 도 1에서 1과 21에 해당하는 마이코박테리아 속 검출용 프로브 MYC-02와 2의 위치에 해당하는 마이코박테리아 튜베르쿨로시스 콤플렉스 검출용 프로브 MTB-04에서만 특이적으로 혼성화 반응이 일어났음을 확인할 수 있었다. 결핵균 스트레인 감별 결과 도 1의 49와 93 위치의 양성 대조군 프로브와 도 1에서 50에서 92 위치의 SPO-01, SPO-03, 04, 05, 06, 08, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 그리고 SPO-43의 프로브에서 반응이 일어났으며, 항생제 내성 검출 실험에서는 모든 항생제에 감수성을 가진 표준 균주 마이코박테리아 튜베르쿨로시스 H37Rv을 이용한 결과 RMP, INH, PZA 내성 프로브에서 각각 도 1의 22, 43과 94 위치의 양성 대조군 프로브와 RMP는 도 1에서 각각 23, 25, 27, 29, 35와 38에 해당하는 rpo 511-WL, rpo 513-WQ, rpo 516-WD, rpo 522-WS, rpo526-WH, rpo 531-WD와 rpo 533-WL에서 반응이 일어났다. 또 다른 항생제인 INH는 도 1에서 각각 44와 47에 해당하는 kat 315-WS와 kat 463-WR에서 반응이 일어났으며, PZA는 도 1의 95에 해당하는 pnc-11-W에서 반응이 일어났다.FIG. 2 is a diagram showing the analysis of the specific hybridization reaction of each probe for the detection of mycobacteria strains, strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis and antibiotic resistance in one experiment. As a result of hybridization with a microarray for the present invention using the bacterium tuberculosis H37Rv as a target DNA, the results of differentiation of mycobacteria strains were used to detect the mycobacteria genus MYC-02 and 2 corresponding to 1 and 21 in FIG. 1. It was confirmed that hybridization reaction occurred specifically only in the MTB-04 probe for detecting Mycobacteria tuberculosis complex corresponding to the position of. Mycobacterium tuberculosis strain discrimination results of positive control probes at positions 49 and 93 of FIG. 1 and SPO-01, SPO-03, 04, 05, 06, 08, 11, 12, 14, 15, 16, Reactions occurred in probes of 17, 18, 19, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 40, 41, 42, and SPO-43. In the antibiotic resistance detection experiment, the standard strain Mycobacteria tuberculosis H37Rv with susceptibility to all antibiotics was used for the RMP, INH, and PZA resistance probes, respectively. Rpo 511-WL, rpo 513-WQ, rpo 516-WD, rpo 522-WS, rpo526-WH, rpo 531-WD and rpo 533-WL corresponding to 23, 25, 27, 29, 35, and 38 in 1, respectively The reaction occurred at. Another antibiotic INH reacted at kat 315-WS and kat 463-WR corresponding to 44 and 47 in FIG. 1, and PZA reacted at pnc-11-W corresponding to 95 in FIG. 1. .

도 3은 마이코박테리아의 균주 감별을 위한 프로브의 특이적 혼성화 반응의 결과를 스캐너로 분석한 그림으로, a)는 마이코박테리아 튜베르쿨로시스 H37Rv를 표적 DNA로 하여 본 발명을 위한 마이크로어레이와의 혼성화 반응을 실시한 결과, 도 1의 1과 21에 해당하는 마이코박테리아 속에 특이적으로 반응하는 프로브인 MYC-02와 도 1의 2에 해당하는 결핵균에 특이적으로 반응하는 프로브 MTB-04에서만 혼성화 반응이 일어났음을 확인할 수 있었다.Figure 3 is a picture of the analysis of the specific hybridization reaction of the probe for differentiation of mycobacteria strain with a scanner, a) hybridization with a microarray for the present invention using mycobacteria tuberculosis H37Rv as a target DNA As a result of the reaction, hybridization reaction was performed only with MYC-02, a probe that specifically reacts with mycobacteria corresponding to 1 and 21 of FIG. 1, and with MTB-04, a probe that specifically reacts with Mycobacterium tuberculosis that corresponds to 2 of FIG. It could be confirmed that it happened.

b)는 비결핵 마이코박테리아인 마이코박테리움 스크로푸레시움을 표적 DNA로 하여 마이크로어레이와의 혼성화 반응을 실시한 결과를 나타내는 것으로, 도 1의 1과 21에 해당하는 마이코박테리아 속에만 특이적으로 반응하는 프로브 MYC-02와 도 1의 9에 해당하는 마이코박테리움 스크로푸레시움 종 특이적인 프로브 SCO-01에서만 혼성화 반응이 일어났음을 확인할 수 있었다.b) shows the result of hybridization with a microarray using mycobacterium scropuresium, a non-tuberculosis mycobacteria, as a target DNA, and is specific only in the mycobacteria corresponding to FIGS. 1 and 21 of FIG. 1. It was confirmed that the hybridization reaction occurred only with the probe MYC-02 reacting with the mycobacterium scropuresium species-specific probe SCO-01 corresponding to 9 of FIG. 1.

도 4는 결핵균의 스트레인 감별을 위한 프로브의 특이적 혼성화 반응의 결과를 나타내는 그림으로, a) 마이코박테리움 튜베르쿨로시스 H37Rv와 b) 마이코박테리움 보비스(M. bovis)를 표적 DNA로 하여 혼성화 반응한 결과 도 1의 49와 93에 해당하는 양성 대조군 프로브와 마이코박테리움 튜베르쿨로시스 H37Rv는 도 1에서 각각 차례대로 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 86, 87, 88, 89, 90, 91과 92에해당하는 프로브인 SPO-01, SPO-02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 그리고 SPO-43의 프로브에서 반응이 일어났으며, 마이코박테리움 보비스(M. bovis)는 도 1에서 각각 차례대로 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 86와 87에 해당하는 프로브인 SPO-01, SPO-03, 04, 05, 06, 07, 08, 11, 12, 13, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 37와 SPO-38 프로브에서만 혼성화 반응이 나타났다.Figure 4 shows the results of specific hybridization of the probe for strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis, a) Mycobacterium tuberculosis H37Rv and b) Mycobacterium bovis ( M. bovis ) as the target DNA As a result of the hybridization reaction, positive control probes corresponding to 49 and 93 of FIG. 1 and mycobacterium tuberculosis H37Rv were sequentially 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 86, 87, 88, 89, 90, SPO-01, SPO-02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 22, Reactions occurred in probes of 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 37, 38, 39, 40, 41, 42, and SPO-43, and Mycobacterium bovis ( M bovis ) is 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 86 SPO-01, SPO-03, 04, 05, 06, 07, 08, 11, 12, 13, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 37 and SPO-38 probes showed hybridization.

도 5는 마이코박테리아의 항생제 내성을 위한 프로브의 특이적 혼성화 반응의 결과를 나타내는 그림으로, a) 및 b)는 RMP 내성 검사를 위해 RMP에 대해 감수성(야생형)을 가지는 마이코박테리움 튜베르쿨로시스와 rpoB 유전자의 코돈 526 부위의 histidine(CAC)이 tyrosine(TAC)으로 치환된 내성 균주를 표적 DNA로 하여 실험한 결과 두 균주 모두에서 각각의 프로브를 혼합하여 부착시킨 양성 대조군 프로브에서 혼성화 반응이 일어났으며, RMP 감수성 균주인 마이코박테리움 튜베르쿨로시스 H37Rv의 경우 각 코돈의 야생형 프로브인 도 1의 23, 25, 27, 30, 32, 38와 41에 각각 해당하는 rpo 511-WL, rpo 513-WQ, rpo 516-WD, rpo 522-WS, rpo 526-WH, rpo 531-WD와 rpo 533-WL에서 반응이 일어나고, 코돈 526 부위의 histidine(CAC)이 tyrosine(TAC)으로 치환된 내성 균주는 도 1의 23, 25, 27, 30, 38, 41과 30에 각각 해당하는 rpo 511-WL, rpo 513-WQ, rpo 516-WD, rpo 522-WS, rpo 531-WD, rpo 533-WL과 rpo 526-MY에서 특이적인 혼성화 반응 결과를 확인할 수있었다.Figure 5 is a diagram showing the results of specific hybridization reaction of the probe for antibiotic resistance of mycobacteria, a) and b) mycobacteria tubeberkul susceptibility (wild-type) to RMP for RMP resistance test Experiments were carried out using a resistant DNA strain in which the histidine (CAC) of tyrosine (TAC) in the codon 526 region of the Rossis and rpoB genes was the target DNA. In the case of the RMP susceptible strain Mycobacterium tuberculosis H37Rv, rpo 511-WL corresponding to wild-type probe of each codon 23, 25, 27, 30, 32, 38 and 41 of FIG. Reaction occurs at rpo 513-WQ, rpo 516-WD, rpo 522-WS, rpo 526-WH, rpo 531-WD and rpo 533-WL, and histidine (CAC) at the codon 526 site is substituted with tyrosine (TAC) Resistant strains correspond to 23, 25, 27, 30, 38, 41 and 30 of FIG. 1, respectively. It is confirmed the rpo 511-WL, rpo 513-WQ, rpo 516-WD, rpo 522-WS, rpo 531-WD, rpo 533-WL and rpo specific hybridization results in a 526-MY.

c) 및 d)는 INH 내성 검사를 위해 INH에 대해 감수성을 나타내는 마이코박테리움 튜베르쿨로시스와katG유전자의 코돈 315 부위의 serine(AGC)이 threonine(ACC)으로 치환된 내성 균주를 표적 DNA로 하여 실험한 결과 모두에서 각각의 프로브 모두를 혼합한 양성 대조군 프로브에서 혼성화 반응이 일어났으며 INH 감수성 균주는 코돈 315와 463의 야생형 프로브인 도 1의 44와 47에 해당하는 kat 315-WS와 kat 463-WR에서만, 내성 균주는 도 1의 45와 47에 해당하는 kat 315-MT와 kat 463-WR 프로브에서 특이적인 혼성화 반응 결과를 확인할 수 있었다.c) and d) target DNAs resistant to strains where serine (AGC) at the codon 315 of the katG gene was replaced with threonine (ACC) for mycobacterium tuberculosis and katG genes that were sensitive to INH for INH resistance testing. As a result of the experiment, hybridization reaction occurred in the positive control probe mixed with all probes, and the INH susceptible strains were Kat 315-WS corresponding to 44 and 47 of FIGS. 1 and 44 of wild type probes of codons 315 and 463. Only in kat 463-WR, the resistant strain was able to confirm specific hybridization results in kat 315-MT and kat 463-WR probes corresponding to 45 and 47 of FIG. 1.

e) 및 f)는 PZA 감수성의 마이코박테리움 투베르쿨로시스 H37Rv와pncA프로모터의 -11 부위의 A가 G로의 치환된 내성 균주를 표적 DNA로 하여 실험한 결과로 감수성 균주는 각 프로브 모두를 혼합한 양성 대조군 프로브와 도 1의 95에 해당하는 pnc-11-W의 야생형 프로브에서만 반응이 일어났으며 감수성의 경우 양성 대조군 프로브와 도 1의 96에 해당하는 pnc-11-M의 돌연변이 검출 프로브에서 특이적인 혼성화 반응 결과를 확인할 수 있었다.e) and f) were tested using a target DNA of the AZ-substituted mycobacterium tuberculosis H37Rv and -11 region of the pncA promoter as a target DNA. The reaction occurred only in the mixed positive control probe and the wild type probe of pnc-11-W corresponding to 95 of FIG. 1, and in the case of sensitivity, the positive control probe and the mutation detection probe of pnc-11-M corresponding to 96 of FIG. 1. Specific hybridization reaction results were confirmed at.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 마이크로어레이는, 하나의 지지체 위에 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성을 검사할 수 있는 프로브 모두를 포함하고 있어서 단 1회의 혼성화 반응으로 마이코박테리아 속 여부와 결핵균과 비결핵균 21 종을 동시에 검출할 수 있다. 또한 마이코박테리움 투베르쿨로시스 스트레인을 감별할 수 있으며, 항생제 내성 중 RMP, INH와 PZA 내성 결핵균의일부를 검출할 수 있다. 또한 하나의 고형지지체 위에 다수의 세트로 부착하여 한번의 실험으로 다수의 검체로부터 동시에 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성에 대한 실험이 가능하여 검사 시간과 비용 면에서도 매우 경제적이다. 이는 기존의 배양 균주 뿐만 아니라 임상 검체를 직접 표적으로 이용하므로 진단에 필요한 시간을 기존의 상품화 된 방법보다 훨씬 단축시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 마이크로어레이는 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성 검사를 단시간에 결과를 얻을 수 있어 경제적이며 효과적으로 사용될 수 있다.As described above, the microarray of the present invention includes both probes capable of screening strains, strains of Mycobacterium tuberculosis, and antibiotic resistance on a single support. Mycobacterium tuberculosis and 21 non-tuberculosis bacteria can be detected simultaneously. In addition, the Mycobacterium tuberculosis strain can be discriminated, and some of the antibiotic-resistant RMP, INH and PZA resistant tuberculosis bacteria can be detected. In addition, by attaching a large number of sets on one solid support, it is very economical in terms of test time and cost as it is possible to simultaneously test the mycobacteria strains, strains of Mycobacterium tuberculosis, and antibiotic resistance from multiple samples at once. This allows direct use of clinical specimens as well as existing culture strains, which can significantly shorten the time required for diagnosis than conventional commercialized methods. Therefore, the microarray of the present invention can be used economically and effectively because it is possible to obtain mycobacteria strain strain, strain strain of Mycobacterium tuberculosis and antibiotic resistance test in a short time.

Claims (14)

지지체에 부착된 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 균주 감별을 위한 프로브(probes), 결핵균의 스트레인 감별을 위한 프로브, 및 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 마이크로어레이.A microarray comprising a probe for discriminating strains of tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria attached to a support, a strain for strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis, and a probe for detecting antibiotic resistance. 제1항에 있어서, 하나의 지지체에 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과 항생제 내성을 검출하는 프로브(probes)를 한 세트로 하는 다수의 세트로 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.The microorganism of claim 1, wherein the microorganism is characterized in that the microorganism is characterized in that it comprises a plurality of sets of probes for detecting strains of tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria, strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis and antibiotic resistance. Array. 제1항 또는 제2항에 있어서, 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 균주 감별을 위한 프로브는 마이코박테리아 속 특이적인 ITS(Internal Transcribed Spacer) 염기서열의 올리고뉴클레오티드, 결핵 마이코박테리아 종 특이적인 ITS 염기서열의 올리고뉴클레오티드, 및 비결핵 마이코박테리아 종 특이적인 ITS 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.The method according to claim 1 or 2, wherein the probe for discriminating tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria strains is oligonucleotides of the internal scribe sequence of Mycobacteria, nucleotide sequence of tuberculosis mycobacteria species A microarray comprising an oligonucleotide, and an oligonucleotide of a nontuberculous mycobacterial species specific ITS sequence. 제1항 또는 제2항에 있어서, 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 균주 감별을 위한 프로브는 서열번호 1 내지 9의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 10 내지 16의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 및 서열번호 17 내지 89의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.The method according to claim 1 or 2, wherein the probe for discriminating the tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria strains comprises at least one oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to 9, the base sequence of SEQ ID NO: 10 to 16 Microarray comprising at least one oligonucleotide, and at least one oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 17-89. 제1항 또는 제2항에 있어서, 결핵균의 스트레인 감별을 위한 프로브는 결핵균의 스트레인 특이적 DR(direct repeat) 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.The microarray of claim 1 or 2, wherein the probe for strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis comprises an oligonucleotide comprising a strain specific direct repeat (DR) sequence of Mycobacterium tuberculosis. 제1항 또는 제2항에 있어서, 결핵균의 스트레인 감별을 위한 프로브는 서열번호 90 내지 134의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.The microarray of claim 1 or 2, wherein the probe for strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis comprises one or more oligonucleotides comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 90 to 134. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브는 리팜핀, 아이소니아지드 및 피라진아마이드에 대한 내성을 동시에 검출하기 위한 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.The microarray of claim 1 or 2, wherein the probe for detecting antibiotic resistance is used for simultaneously detecting resistance to rifampin, isoniazid and pyrazineamide. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브는 리팜핀 내성을 유도하는rpoB유전자의 점돌연변이 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 아이소니아지드 내성을 유도하는katG유전자의 점돌연변이 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 피라진아마이드 내성을 유도하는pncA유전자의 점돌연변이 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이The method of claim 1 or claim 2, wherein the probe for detecting antibiotic resistance oligonucleotide comprising the point mutation sequence of the rpoB gene inducing rifampin resistance, the point mutation sequence of the katG gene inducing isoniazid resistance Microarray comprising an oligonucleotide comprising, oligonucleotide comprising a point mutation sequence of pncA gene inducing pyrazineamide resistance 제1항 또는 제2항에 있어서, 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브는 서열번호 135 내지 160의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 161 내지 169의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 170 내지 173의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.The method of claim 1 or 2, wherein the probe for detecting antibiotic resistance comprises at least one oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 135 to 160, at least one oligo comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 161 to 169 Microarray comprising at least one oligonucleotide comprising a nucleotide, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 170 to 173. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 마이크로어레이를 이용하여 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별, 및 항생제의 내성 검출을 동시에 수행하는 검출 방법.A detection method for simultaneously performing strain discrimination of tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria, strain discrimination of Mycobacterium tuberculosis, and detection of antibiotic resistance using the microarray according to any one of claims 1 to 9. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 마이크로어레이를 포함하는 결핵 및비결핵 마이코박테리아 감염 진단 키트.Tuberculosis and non-tuberculosis mycobacterial infection diagnostic kit comprising the microarray according to any one of claims 1 to 9. 서열 번호 1 내지 89의 염기서열을 포함한 결핵 및 비결핵 마이코박테리아의 균주 감별을 위한 프라이머 또는 프로브용 올리고뉴클레오티드.Oligonucleotides for primers or probes for the discrimination of tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria, including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to 89. 서열 번호 90 내지 134의 염기서열을 포함한 결핵균의 스트레인 감별을 위한 프라이머 또는 프로브용 올리고뉴클레오티드.Oligonucleotides for primers or probes for strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 90 to 134. 서열 번호 135 내지 173의 염기서열을 포함한 항생제 내성을 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브용 올리고뉴클레오티드.Oligonucleotides for primers or probes for detecting antibiotic resistance, including the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 135 to 173.
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