KR20030028855A

KR20030028855A - 렉틴으로 강화된 겨우살이 추출물을 유효성분으로 하는항암제용 조성물

Info

Publication number: KR20030028855A
Application number: KR1020010061118A
Authority: KR
Inventors: 박원봉; 유수연
Original assignee: (주)바이오메디팜; 박원봉
Priority date: 2001-10-04
Filing date: 2001-10-04
Publication date: 2003-04-11

Abstract

본 발명은 렉틴으로 강화된 겨우살이 추출물을 유효성분으로 하는 항암제용 조성물에 관한 것으로, 겨우살이(Viscum album및Viscum albumvar. coloratum)로부터 분리 정제한 렉틴과 증류수로 추출한 수추출물 및 상기의 렉틴과 수추출물을 혼합한 조성물은 신생혈관억제활성이 있어 암의 전이억제에 뛰어난 효과가 있고, 아폽토시스 유도활성, 텔로메라제 억제활성, 항암활성이 뛰어나며, 국소적으로 환부투여가 가능한 피부암, 구강암, 인두암 등의 치료에 효과적이고, 특히 겨우살이로부터 분리·정제한 렉틴과 수추출물을 혼합하여 제조한 본 발명 조성물은 부작용이 적고 항암활성이 강화되는 뛰어난 효과가 있다.

Description

렉틴으로 강화된 겨우살이 추출물을 유효성분으로 하는 항암제용 조성물{Anti-cancer composition containing mistletoe extract intensified with lectin}

본 발명은 렉틴으로 강화된 겨우살이 추출물을 유효성분으로 하는 항암제용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 겨우살이(Viscum album및Viscum albumvar. coloratum)로부터 분리 정제한 렉틴과 증류수로 추출한 수추출물 및 상기의 렉틴과 수추출물을 혼합함으로써 신생혈관억제 활성, 암의 전이억제, 아폽토시스 유도활성, 텔로메라제 억제활성, 항암활성이 강화된 약학조성물에 관한 것이다.

과학기술의 발전에 따른 의료수준의 급진적인 향상에도 불구하고 악성종양은 발생 및 진행기전이 완전히 밝혀지지 않아 인류의 건강을 위협하는 매우 중요한 요인이 되고 있다. 현재, 암치료법에는 외과적 수술요법, 방사선 요법, 화학요법이 주종을 이루나 전이성 암 및 재발암에 대한 치료는 대부분 불가능한 상태이다. 또한, 지금까지 개발된 항암제는 임상적으로 사용할 때 치명적인 부작용, 내성발현, 임파구 및 골수세포의 파괴 등의 문제점이 있어 보다 효과가 탁월한 암치료제를 개발하는 것이 절실히 요구되고 있는 실정이다. 그러므로 정상세포에는 독성을 나타내지 않고 면역체계를 활성화시킴으로서 암을 치료하려는 노력이 다각도에서 이루어지고 있으며 이를 약으로 개발하는 것은 암 치료 분야에서 중요한 목표가 되고 있다. 이에 따라 최근에는 각종 천연자원으로부터 새로운 항암 성분을 탐색하고 이를 이용하여 항암제를 개발하려는 많은 노력이 진행되고 있다.

오래 전부터 암치료제로 사용되어 온 유럽산 겨우살이 (Viscum album)는 부작용이 거의 없으면서 우수한 항암효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다(Hajto 등, Cancer Research 50:3322-3326, 1990., Jassen 등 Drug Research 43(11) 1221-1227, 1993., Am. Soc. for Biochem. and Molc. Biol. 267(33)23722- 23727, 1992). 이 식물은 직접적인 암세포의 살해 및 면역활성화 등의 복합작용에 의하여 효과를 발휘하는데, 체액성 및 세포성 면역체계를 자극하며, 대식세포 및 자연살해(natural killer, NK)세포의 활성을 증가시켜 종양세포의 성장을 억제하고, 암환자의 생존율을 증진시키는 효과가 있는 것으로 보고되었다 (Jassen 등, Drug Research 43(11) 1221-1227, 1993).

이 식물에는 렉틴, 비스코톡신(viscotoxin), 다당류 등 각종 활성성분이 함유되어 있는데, 항암활성에 가장 중요한 성분은 렉틴이다 (Bussing 등, Cancer Lett. 94: 199-205, 1995., Cancer Lett. 99: 59-72, 1996., Jung 등. Cancer Letters 51:103-108, 1990). 그러나, 주된 항암성분이 렉틴임에도 불구하고 현재 생산되고 있는 겨우살이 약물은 여러 성분이 복합적으로 함유되어 있는 수추출물이며, 임상적으로도 복합추출물이 렉틴 단일성분보다 효과가 더 우수한 것으로 알려져 있다. 복합추출물이 주성분인 렉틴 단일 성분보다 효과가 우수한 것은 비스코톡신, 알칼로이드(alkaloid) 등 렉틴 이외에 겨우살이에 함유되어 있는 활성성분과의 상승효과 때문인 것으로 추측되고 있다. 또한, 복합추출물에 함유되어있는 렉틴이 순수하게 정제된 형태의 단일성분보다 훨씬 안정성이 높은 것도 중요한 요인인 것으로 추측되고 있다.

항암제에 의한 항암효과는 암세포의 비정상적인 증식을 억제하거나 암세포를 죽음으로 유도함으로써 나타난다. 최근, 여러 종류의 항암제나 DNA 손상물질에 의한 종양 퇴행현상이 아폽토시스(apoptosis)라는 특이한 형태의 죽음을 통하여 이루어진다고 밝혀지고 있다. 아폽토시스는 죽음의 신호에 반응하여 일어나는 능동적 죽음의 과정으로서 핵의 응축(nuclear condensation), 막의 기포형성(membrane blebbing) 등의 형태학적 변화와 DNA 분절(fragmentation) 현상이 나타난다. 아폽토시스는 비정상적인 세포의 제거를 위한 방어적인 기전의 역할을 하며 이 과정이 손상되면 항암제에 대한 내성이 생기는 경우도 보고되고 있다. 따라서 항암제의 아폽토시스 유도기전을 밝히는 것이 효율적인 항암제 개발에 매우 중요하다. 겨우살이의 암세포와 백혈구세포에 대한 강력한 세포독성효과는 아폽토시스의 유도의 결과이며, 겨우살이 성분 중, 렉틴(lectin)만이 아폽토시스에 의한 살해과정을 유도했다고 보고된 바 있다 (Busing 등, Cancer Lett. 94: 199-205, 1995., Cancer Lett. 99: 59-72, 1996).

혈관형성은 종양형성에 있어서 매우 중요한 역할을 담당한다. 혈관형성이 중요한 것은 종양이 형성되어 자라기 위해서는 영양분이 공급되어야 하며, 이 영양분은 바로 혈관을 통하여 수송되기 때문이다. 이에 혈관형성을 억제함으로써 종양세포를 기아상태에서 굶어죽게 하자는 것이 종양치료 전략 중의 하나이다. 지금까지의 아드리아마이신(adriamycin), 시스플라틴(cisplatin), 탁솔(taxol)등의 기존의 항암제는 대부분의 경우가 암세포에 직접 작용하여 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이들 화학요법제의 가장 큰 문제점은 암세포가 유전학적으로 불안정하기 때문에 각각의 암세포의 항암제에 대한 내성 세포들이 빈번하게 출현하게 되어 항암제가 효과를 발휘할 수 없게 된다. 더구나 이들 항암제들은 선택성이 결여되어 정상세포나 암세포 모두에 독성을 나타내어 심각한 부작용을 나타내게 된다. 반면 혈관형성저해제는 기존의 항암제와는 다른 양식의 항암제로서 다음과 같은 장점들을 지니고 있다 (Chang 등 Biochem. Biophys. Res Commun., 232: 323-327, 1997). 첫째, 혈관신생은 1차 암의 성장이나 암의 전이에 필수불가결하기 때문에 암의 성장과 전이를 동시에 치료할 수 있다. 둘째, 혈관형성 저해제는 홀배수체(aneuploid)인 암세포가 아니라 정상 이배체(diploid)인 혈관내피세포를 표적으로 하기 때문에 암세포와는 달리 이질성(heterogeneity)과 유전적 불안정성(genetic instability)로 인한 내성 등의 문제점이 일어나지 않을 것이다. 셋째, 혈관형성 저해제는 기존의 항암제와는 달리 특정, 또는 몇몇의 암에만 효능을 나타내는 것이 아니라 혈관형성이 불가결한 모든 고형암에 유효할 것이다. 넷째, 혈관신생은 정상 성인의 경우, 몇몇 특별한 경우, 즉 상처의 치유, 여성의 생리 등을 제외하고는 매우 드문 현상으로 알려져 있다. 따라서 기존의 항암제에서 볼 수 있는 부작용이 크게 감소할 것이다. 이상에서 살펴본 바와 같이 혈관신생은 암의, 특히 고형암의 성장이나 전이에 필수 불가결한 현상이며 항암제로서의 혈관신생 저해제는 기존의 항암제의 큰 문제점인 내성, 부작용 등의 문제를 해결하여 인류의 난치병 중의 하나인 암, 특히 고형암을 보다 효과적으로 치료할 수 있는 매우 희망적인 치료제이므로, 현재 세계 각국에서 angiostatin이나 endostatin과 같은 선택적인 혈관신생저해제의 개발에 많은 노력을 하고 있다.

한편, 최근 관심이 집중되고 있는 텔로미어(telomere) 가설은 복제노화현상과 암세포 불멸화를 이해하는데 중요한 분자생물학적인 기전을 제공하고 있다. 대부분의 암조직에서 세포의 불멸화는 텔로머라제(telomerase) 활성을 요구하며 암세포의 성장에 필수적으로 작용하기 때문에 텔로머라제는 암치료에 새로운 세포 내 표적으로 사용될 수 있다. 다양한 암세포 내에서의 텔로머라제의 존재와 정상세포내의 비존재가 이 효소를 항암제의 좋은 목표로 만들었다. 현재 사용 중인 항암제는 암세포는 물론 정상세포도 죽이기 때문에 독성을 보이는 반면, 텔로머라제는 많은 암세포에서 나타나기 때문에 텔로머라제를 파괴할 수 있는 약품은 우수한 항암제가 될 수 있는 것으로 여겨지고 있다. 또한, 텔로머라제에 특이적으로 작용하는억제제는 정상 체세포의 성장이나 분화에 거의 영향을 미치지 않기 때문에 현재 사용하고 있는 암치료제보다 더 높은 효율의 항암효과를 가지며 부작용의 문제점을 해결할 수 있을 것이다(Holt 등, Mol. Carcinog. 25: 241-248, 1999., Sato 등, Br. J. Cancer. 82: 1819-1826, 2000).

유럽산의 변종인 한국산 겨우살이(Viscum album,L. var. coloratum)는 유럽산에 비하여 그 효능이 우수하다고 알려져 있으나 유럽산에 비해서는 연구가 미비한 상태이다 (Park 등 Yakhak Hoeji, 38(4) 418-424, 1994., Yakhak Hoeji, 39(1) 24-30, 1995., Arch. Pharm. Res.: 20 (4) : 306-312, 1997., Arch. Pharm. Res. : 21(4) 429-435, 1998., Foods and Biotechnology : 8 (4) 232-237, 1999). 한국산 겨우살이의 항암효과에 대한 보고에 의하면, 여러 종류의 겨우살이 추출물 중 한국산이 가장 강력한 항암활성을 나타냈으며, 특히 한국산의 알카로이드(alkaloid) 분획은 매우 높은 항암활성을 나타냈다(Khwaja 등. Experientia 36:599-600. 1980., Tasneem 등. Oncolgy 43 :suppl. 1. 42-50, 1986). 이 결과는 한국산은 유럽산과는 달리 렉틴 이외의 항암물질의 존재 가능성을 강력하게 시사하고 있으나 그 이상의 연구보고는 없는 실정이다. 한편, 본 연구팀은 한국산으로부터 효과적으로 렉틴을 분리하였으며, 유럽산 렉틴과 유사한 세포독성효과가 있는 것으로 나타났으며, 렉틴을 제거한 추출물 분획은 활성이 거의 없는 것으로 나타났다(Park 등 Food Sci. and Biotechnol.: 8 391-396, 1999., Foods and Biotechnology : 8 (4) 232-237, 1999). 한편, 겨우살이 제제가 직접적인 세포독성작용과 면역활성화에 의한 복합작용에 의하여 그 효능을 발휘한다고 알려져 있으나, 임상적으로 암환자에게 피하주사로 투여하는 용량 (0.1∼100 mg)으로는 직접적인 세포독성효과는 발휘할 수 없고, 주로 면역활성화에 의한 항암효과가 주된 항암작용기전인 것으로 추측되고 있다. 그러나 만일 이 제제를 환부에 국소적으로 직접투여(intratumoral adminstration)시는 직접적인 세포독성작용과 면역활성화에 의한 복합작용에 의하여 우수한 항암 효과를 발휘할 수 있는 것으로 추측되고 있다.

본 발명자는 한국산 겨우살이(Viscum albumL. var. coloratum) 유래의 렉틴 단백질의 유전자 및 그 아미노산 서열을 분석하였으며, 컬럼 크로마토그래피를 하여 렉틴을 순수하게 분리하고 상기 분리한 렉틴 단백질이 생체 면역기능을 증강시키고 세포면역능을 유도하는 항암기능이 있음을 확인하고, 효소결합 렉틴 검출법 (ELLA)을 이용한 겨우살이 렉틴의 정량법을 개발하여 특허를 출원하였다(대한민국 특허 제2000-83383).

겨우살이는 각종 암세포주에 비교적 강력한 항암활성을 나타냄에도 불구하고 피부흑색종 세포주에는 저항성이 매우 큰 것으로 알려져 있다. 그러나, 현재 사용되고 있는 겨우살이는 추출물의 농도를 50 mg/㎖ 보다 높게 할 경우 침전이 형성되는 문제점이 있다. 또한, 순수하게 정제된 렉틴은 추출물에 함유된 렉틴보다 안정성이 떨어지고, 생체 내에서 내성획득이 더욱 큰 것으로 알려져 있어 이의 개선이 요구되었다.

본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여, 안정성이 있으며, 활성이 강화된 약물을 개발하던 중 겨우살이를 증류수로 추출한 수추출물에 정제된 렉틴을 첨가하여 항암활성을 강화시킨 제제가 부작용이 적고 피부암을 포함한 각종 암과 암의 전이억제에 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다. 특히, 렉틴으로 강화된 제제(VCES)는 수추출물을 고농도로 제조 시 발생하는 침전 형성문제를 해결하는 동시에 순수하게 정제된 렉틴의 안정성 저하 및 내성획득 등의 문제점을 해결할 수 있는 뛰어난 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 겨우살이 추출물 및 정제된 렉틴이 신생혈관 억제활성 및 텔로메라제 활성 억제능을 갖고 있음을 최초로 밝혀냄으로써 본 발명을 달성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 아폽토시스에 의한 세포독성, 신생혈관형성억제, 텔로메라제 활성억제에 의하여 항암작용을 하는 렉틴으로 강화된 겨우살이 추출물 및 이를 포함하는 항암제용 조성물을 제공함에 있다. 또한, 약제를 피부암, 구강암, 방광암, 자궁경부암 등 환부에 직접 투여함으로써 항암효과를 발휘할 수 있는 용도를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 겨우살이 수추출물 및 렉틴으로 강화된 겨우살이 추출물의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 겨우살이(Viscum album및Viscum albumvar. coloratum)로부터의 렉틴을 정제하고, 증류수로 추출하여 수추출물을 제조하며 그리고 상기 정제된 렉틴을 수추출물과 혼합하여 항암활성이 강화된 제제를 제조하고, 세포독성활성도, 아폽토시스 유도효과, 종양전이 억제효과, 신생혈관 억제효과, 텔로메라제 억제효과 및 항암효과를 확인함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

도 1은In vitro에서 B16-BL6 melanoma 세포에 대한 한국산 겨우살이 렉틴(VCA), 수추출물(VCE), 렉틴으로 강화된 수추출물(VCES)의 아폽토시스 유도효과를 확인하기 위하여 세포핵 Hoechst 33258 염색에 의한 현미경 관찰을 한 결과이다.

도 2은In vitro에서 B16-BL6 melanoma 세포에 대한 한국산 겨우살이 렉틴(VCA), 수추출물(VCE), 렉틴으로 강화된 수추출물(VCES)의 아폽토시스 유도효과를 확인하기 위하여 DNA 분절(fragmentation)을 전기영동으로 확인한 결과이다.

도 3은 겨우살이 렉틴(VCA)의 구강암세포(A253) 및 간암세포(HEP3B)에 대한 아폽토시스 유도효과를 형광분석법으로 확인한 결과이다.

도 4는 구강암 간암, 인두암 세포주에서 한국산 겨우살이 렉틴(VCA)의 텔로메라제 억제효과와 피부암 세포주에서 렉틴으로 강화한 수추출물(VCES)의 텔로메라제 억제효과를 확인한 결과이다.

도 5는In vivo에서 한국산 겨우살이 렉틴(VCA)의 신생혈관억제 효과 확인하기 위하여 CAM assay를 실시한 결과이다.

도 6은In vivo에서 한국산 겨우살이 수추출물(VCE)의 신생혈관억제 효과 확인하기 위하여 CAM assay를 실시한 결과이다.

도 7은In vivo에서 한국산 겨우살이 렉틴으로 강화된 수추출물(VCES)의 신생혈관억제 효과 확인하기 위하여 CAM assay를 실시한 결과이다.

도 8은In vivo에서 한국산 겨우살이 렉틴(VCA)의 B16-BL6 melanoma 세포를 접종한 동물에 대한 항암효과를 확인하기 위하여 생존률의 변화를 측정한 결과이다.

도 9는In vivo에서 한국산 겨우살이 수추출물(VCE), 렉틴으로 강화된 수추출물(VCES)의 B16-BL6 melanoma 세포를 접종한 동물에 대한 항암효과를 확인하기 위하여 생존률의 변화를 측정한 결과이다.

아시알로페투인-세파로스 (asialofetuin-Sepharose) 4B를 이용한 한국산 겨우살이 (Viscum albumL. var.coloratum) 렉틴(이하 'VCA'라 약칭한다)을 추출·정제하는 단계; 증류수를 사용하여 한국산 겨우살이 수추출물(이하 'VCE'라 약칭한다) 및 유럽산 겨우살이 수추출물(이하 'VAE'라 약칭한다)을 제조하는 단계; 상기 제조한 수추출물에 정제한 렉틴을 첨가하여 항암활성이 강화된 한국산 수추출물(이하 'VCES'라 약칭한다) 및 유럽산 수추출물(이하 'VAES'라 약칭한다)을 제조하는 단계; 환부에 직접도포가 가능한 암세포주(피부암, 구강암, 인두암, 자궁경부암, 방광암)에 대한 VCA, VCE, VCES, VAES의 세포독성 활성도를 측정하는 단계; 한국인에게 빈발하는 암세포주(간암, 위암, 유방암, 혈액암)에 대한 VCA, VCE, VCES의 세포독성 활성도를 측정하는 단계;in vitro에서 상기 제제들의 암세포주에서의 아폽토시스 유도효과, 텔로메라제 활성 억제효과 확인하는 단계;In vivo에서 종양전이 억제효과, 신생혈관억제 효과를 확인하는 단계; 암을 마우스에 미리 접종하고 상기 제조한 VCA와 VCES를 각각 주입하여 생존률 측정에 의한 항암효과를 확인하는 단계; 렉틴으로 강화된 제제 VCES를 생리식염수와 혼합하여 방광암의 말기환자에게 주입, 암세포변화를 조사하고, 피부암이 발병된 환부에 수시로 도포하여 항암효과를 조사하는 단계로 구성된다.

본 발명에 있어서, 렉틴의 정제 시에 사용되는 리간드는 아시알로페투인-세파로스 4B, 산처리-세파로스 4B, 락토스, 또는 갈락토스로 고정시킨 세파로스 4B 컬럼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징하며, 바람직하기로는 아시알로페투인-세파로스 4B를 리간드로 사용한다.

본 발명 한국산 겨우살이 수추출물의 제조에 있어서, 증류수를 시료중량에 대하여 5∼20배, 바람직하게는 10 배로 첨가하면서 저속분쇄기로 갈고, 4℃에서 24시간 동안 교반한 다음 거즈로 걸러낸 후 원심분리하고, 상등액을 공극 크기를 달리 하는 막여과기(membrane filter)에 의해 순차적으로 여과(20㎛, 0.45㎛ 및 0.22㎛)하여 균을 제거한 한 후에 최종농도가 50∼200㎎/㎖, 바람직하기로는 100 ㎎/㎖ 가 되도록 멸균된 인산염 완충액으로 조절하여 수추출물을 제조한다.

본 발명 렉틴으로 강화된 추출물(VCES)의 제조에 있어서, 겨우살이로부터 추출·정제한 렉틴과 상기 수추출물은 1∼1000:1∼1000의 비율로, 바람직하게는 1:9의 비율로 혼합하여 제조한다.

본 발명 겨우살이로부터 분리 정제된 추출물을 통상적인 방법에 의해 주사제와 같은 단위 투여형 또는 수 회 투여형 제제로 제형화하여 아폽토시스에 의한 세포독성효과와 암세포전이 억제, 신생혈관형성 억제 및 텔로메라제 활성 억제에 의한 암치료 및 예방제로 사용할 수 있다.

본 발명에서 제조한 겨우살이 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 주사제로 투여할 수 있으며, 1회 투여량 체중 1kg당 1ug 내지 200 mg으로 주 3회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한, 피부암, 구강암 등에 연고제, 로션제 등으로 환부에 직접 수시 도포할 수 있다. 특정 환자에 대한투여용량은 사용될 특정화합물, 체중, 연령, 건강상태, 투여방법, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예와 실험예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예와 실험예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 아시알로페투인-세파로스 (asialofetuin-Sepharose) 4B를 이용한 한국산 겨우살이 ( Viscum album L. var. coloratum ) 렉틴(VCA)의 추출 및 정제

본 발명자에 의해 개발된 정제방법(대한민국 특허 제2000-83383)에 따라 겨우살이로부터 렉틴을 정제한다. 즉, 겨우살이의 새순 세 마디의 잎, 열매 및 줄기를 분류하여 세절한 후 증류수로 세척한 다음 동결 건조시켰다. 상기 동결 건조된 겨우살이 1 kg을 0.1M 아세테이트 (acetate) 완충용액 (pH 4.0) 4ℓ와 함께 저속 분쇄기로 마쇄하고, 8,000 rpm에서 30분간 냉장 원심분리한 1ℓ의 상등액에 양이온 교환수지인 SP-세파덱스 (Sephadex) C-50 3.5 g을 첨가한 후 4℃에서 교반하여 12시간 방치시켰다. 이 겔을 크로마토그래피 컬럼 (chromatography column)에 충전시킨 후 0.1M 아세테이트 완충용액(pH 4.0)으로 세척하고, 수용액 속의 단백질을 0.1M Tris-HCl 완충용액 (pH 8.0. 0.5M NaCl)으로 용출시켰다. 용출시킨 단백질 분획을 모아서 초여과막 (ultrafiltration membrane, MW=10,000 Da, Amicon Corp, USA)으로 농축하였다. 아시알로페투인-세파로스 (asialofetuin-Sepharose) 4B로 채워진 컬럼에 상기 단백질 용액을 주입시키고 컬럼을 PBS 완충용액 (pH 8.7)으로 세척하였다. 컬럼에 흡착된 단백질을 0.2 M의 아세트산으로 용출시킨 물질을 UV(λmax=280nm)로 확인하여 피크 (peak)를 나타내는 분획을 모아 초여과막으로 농축하여 정제된 렉틴을 획득하였다. 적혈구 응집반응 및 당 저해 반응에 의한 렉틴의 당 특이성 측정결과, 한국산 겨우살이 렉틴은 D-갈락토즈와 N-아세틸-D-갈락토사민에 대해 특이성을 가지는 단백질임을 알 수 있었다. 상기 분리한 한국산 겨우살이 렉틴(VCA)의 분자량과 순도를 확인하기 위하여 12.5% SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 전기영동을 실시하였다. 정제된 유럽산 VAAs와 아시알로페투인-세파로스 4B로 분리한 VCA를 비교한 결과, 환원제의 존재 하에서 Mr=34 kDa과 Mr=31 kDa에서 두 개의 밴드가 나타났다. 환원제 (2-mercaptoethanol)가 없는 상태에서는 Mr=60 kDa에서 밴드가 나타났다.

실시예 2: 한국산 겨우살이 수추출물(VCE) 및 유럽산 겨우살이 수추출물(VAE)의 제조

각각의 한국산과 유럽산 겨우살이 새순 세 마디의 잎, 열매 및 줄기를 분류하여 세절한 후 증류수로 세척한 후에 -70℃에서 보관하였다. 증류수를 시료중량에 대하여 10 배로 첨가하면서 저속분쇄기로 갈고, 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 거즈로 걸러낸 후 12,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 얻은 상등액을 공극 크기를 달리 하는 막여과기(membrane filter)에 의해 순차적으로 여과(20㎛, 0.45㎛ 및 0.22㎛)하여 균을 제거한 후에 최종농도가 100 ㎎/㎖ 가 되도록 멸균된 인산염 완충액(PBS)으로 조절하여 원액(VCE, VAE)으로 사용하였다. 이 때 농도의 표시 100 ㎎/㎖ 는 신선한 겨우살이 100 ㎎으로 추출한 용액 1 ㎖를 뜻한다. 그리고, 효소결합 렉틴 검출법 (ELLA)을 이용하여 겨우살이 수추출물 중의 렉틴을 정량한 결과, 1 ㎎/㎖ 농도의 VCE 1 ㎖에는 30 ng의 VCA가 함유되어 있는 것으로 확인되었다.

실시예 3 : 렉틴으로 강화된 한국산 수추출물(VCES) 및 유럽산 수추출물(VAES)의 제조

상기 실시예 2에서 제조한 한국산 및 유럽산 수추출물(100 ㎎/㎖) 9 ㎖에 실시예 1에서 순수하게 분리한 렉틴(1 ㎎/㎖) 1 ㎖를 첨가하여 추출물의 효능을 강화한 시료(VCES, VAES)를 사용하였다. 이 때 농도의 표시 100 ㎎/㎖ 는 신선한 겨우살이 100 ㎎으로 추출하여 렉틴으로 강화한 용액 1 ㎖를 뜻한다. 따라서, 1 ㎎/㎖ 농도의 VCES 1 ㎖에는 1,030 ng의 VCA가 함유되어 있다.

실험예 1 : In vitro 에서 각종 암세포주에 대한 VCA, VCE, VCES의 세포독성 활성도 측정

(1) 환부에 직접 도포가 가능한 피부암, 구강암, 인두암, 자궁경부암, 방광암 세포주에 대한 VCA, VCE, VCES의 세포독성 활성도 측정

In vitro에서의 시료를 환부에 국소적으로 직접 투여하여 항암효과를 발휘할 수 있는 각종 암세포에 대한 VCA, VCE, VCES의 세포독성 활성도를 측정하기 위하여 MTT분석을 실시하였다. 즉, 이들 암은 절개하지 않고, 직접 환부에 약제를 도포하여 치료할 수 있는 부위의 암이라는 특징이 있다. 따라서 전신작용이 아닌 국소작용에 의한 항암효과를 기대할 수 있기 때문에 종래의 기술과는 다른 새로운 투여방법이라고 할 수 있다. 암세포주는 피부암 시험 대상으로는in vivo시험을 수행하기 위하여 mouse로부터 유래한 B16-BL6 melanoma 세포를 사용하였으며 구강암, 인두암, 자궁경부암, 방광암 시험 대상으로는 사람으로부터 유래된 암세포주를 사용하였다. 암세포 일정량을 96 well plate에 넣고 다양한 농도의 시료를 첨가하고 48시간 후에 MTT법에 의한 세포의 성장을 조사하여 각 종양세포주의 성장을 50% 억제한 시료의 농도인 IC₅₀(inhibitory concentration)값으로 나타내었다.

실험결과 표 1에 나타난 바와 같이, 수추출물(VCE)은 B16-BL6 melanoma 세포주에서 비교적 높은 저항성을 나타낸 반면, 렉틴으로 강화된 겨우살이 수추출물(VCES)은 수추출물(VCE)보다 훨씬 낮은 농도에서 활성을 나타내는 것으로 보아 효능이 증강된 것으로 판단되었다. 즉, B16-BL6 melanoma 세포에 대한 VCA의 세포 독성 활성도 (IC₅₀)는 30.0 ng/㎖, VCE는 120 ㎍/㎖(VCA 함량: 3.6 ng/㎖), 그리고 VCES는 15 ㎍/㎖ (VCA 함량: 15.5 ng/㎖)이었다. VCA의 함량으로 환산한 항암활성(IC₅₀)을 고려해 볼 때, 수추출물(VCE)은 VCA 단독으로 사용할 때보다 낮은 농도의 렉틴에 의하여 활성을 발휘하는 것으로 보아 VCA 이외의 성분과 상승효과가 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 렉틴으로 강화한 수추출물(VCES)의 IC₅₀는 수추출물보다 0.125배 감소한 것으로 보아, 이와 같은 방법은 항암효과를 강화시키면서 수추출물을 고농도로 제조시 침전이 형성되는 문제를 해결할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 그리고, 피부암 외에 국소작용에 의한 항암효과를 기대할 수 있는 구강암,인두암, 자궁경부암, 방광암세포에 대한 VCA, VCE, VCE의 IC₅₀를 측정한 결과, 암세포에 따라 활성이 다른 것을 알 수 있었다. 렉틴(VCA)으로 강화된 제제(VCES)의 경우, 피부암 세포주와 유사하게 수추출물보다 훨씬 낮은 농도에서 활성을 나타내며, 특히, 방광암 세포주인 T24의 경우 VCE에 대하여 높은 저항성을 나타내나 VCES에 대하여는 저농도에서 활성이 나타나는 것으로 보아 효능이 증강된 것으로 판단되었다. 또한, VCA로 강화한 유럽산 수추출물(VAES)의 경우, 한국산인 VCES보다 전반적으로 약간 높은 농도에서 활성이 나타났으나, 수추출물(VCE)의 경우보다는 낮은 농도에서 활성이 나타나는 것으로 보아 유럽산 추출물도 한국산과 동일하게 VCA로 강화하면 직접 도포에 의한 피부암, 구강암, 인두암, 자궁경부암, 방광암세포에 대한 항암효과를 강화할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

In vitro에서 환부에 직접 도포가 가능한 암세포주에 대한 VCA, VCE, VCES의 세포독성 활성도 IC₅₀

암세포주 시료	VCA (ng)	VCE (㎍/㎖)	VCES (㎍/㎖)	VAES (㎍/㎖)
피부암	B16-BL6	30.0	120.0	15.0	20.0
구강암	A253	3.0	5.0	0.7	1.2
구강암	KB	4.0	5.0	0.8	1.5
인두암	Fadu	2.0	10.0	0.8	2.5
자궁경부암	SNU17	7.0	5.0	0.3	1.2
자궁경부암	SNU778	8.0	23.0	1.0	3.5
방광암	T24	10.0	150.0	20.0	25.0
방광암	J82	8.0	80.0	2.5	3.0
VCA: 한국산 겨우살이 렉틴, VCE: 한국산 겨우살이 수추출물, VCES: VCA로 강화한 한국산 겨우살이 수추출물, VAES: VCA로 강화한 유럽산 겨우살이 수추출물

(2) 간암, 위암, 유방암, 혈액암 세포주에 대한 VCA, VCE, VCES의 세포독성 활성도 측정

한국인에게 빈발하는 간암 및 위암, 그리고, 유방암, 혈액암에 대한 시료의 항암활성을 측정하기 위하여 MTT분석을 실시하였다. 사람으로부터 유래된 암세포 일정량을 96 well plate에 넣고 다양한 농도의 시료를 첨가하고 48시간 후에 MTT법에 의한 세포의 성장을 조사하여 각 종양세포주의 성장을 50% 억제한 시료의 농도인 IC₅₀(inhibitory concentration)값으로 나타내었다. 실험결과 표 2에 나타난 바와 같이, 수추출물(VCE)은 각종 암세포주에서 비교적 높은 저항성을 나타낸 반면, 렉틴으로 강화된 겨우살이 수추출물(VCES)은 수추출물(VCE)보다 훨씬 낮은 농도에서 활성을 나타내는 것으로 보아 효능이 증강된 것으로 판단되었다. 특히, 간암 세포주인 SK-Hep-1의 경우 VCE에 대하여 높은 저항성을 나타내나 VCES에 대하여는 저농도에서 활성이 나타나는 것으로 보아 효능이 증강된 것으로 판단되었다.

시료에 의한 각종 암세포주에 대한 세포독성 활성도(IC₅₀)

암세포주 시료	VCA(ng)	VCE(㎍/㎖)	VCES(㎍/㎖)
간암	SK-Hep-1	8.0	120.0	12.0
간암	Hep-3B	5.0	14.0	1.5
위암	SNU-1	7.0	20.0	2.5
유방암	Hs 578T	7.0	10.0	0.8
혈액암	HL-60	3.0	7.0	0.7
혈액암	Molt-4	2.0	3.0	0.5
VCA: 한국산 겨우살이 렉틴, VCE: 한국산 겨우살이 수추출물, VCES: VCA로 강화한 한국산 겨우살이 수추출물

실험예 2: 아폽토시스 유도효과 측정

(1) B16-BL-6 melanoma cell에 대한 세포핵 염색 및 DNA 분절(fragmentation)에 의한 아폽토시스 유도효과 측정

시료에 의한 B16-BL-6 melanoma cell의 아폽토시스 유도효과를 확인하기 위하여 세포핵 Hoechst 33258 염색에 의한 현미경 관찰과 DNA 분절을 확인하였다. 시료를 48시간동안 처리한 B16-BL6 melanoma 세포를 PBS 완충용액으로 세척 후 추출용 완충액을 가하여 배양한 후, 단백질을 제거하고 얻어진 수층에 암모늄 아세테이트(ammonium acetate)와 무수 에탄올을 넣어 DNA 침전물을 얻었다. TE 완충액으로 다시 현탁하고, RNA를 제거후 아가로즈 겔에 시료를 loading 후 DNA 분절을 관찰하였다. 현미경 관찰 결과(도 1)에 의하면 VCA 처리(도 1B) 혹은 VCES (도 1C)에 의하여 전형적인 아폽토시스 모양인, 세포의 위축, 염색체의 응축, 그리고 아폽토시스 체(apoptotic body)들이 관찰되었다. 도 2는 DNA 분절 관찰 결과이며, 농도 의존적으로 DNA 분절이 증가하며, VCES (도 2D)의 경우가 VCE (도 2C)의 경우보다 낮은 농도에서 뚜렷이 나타나는 것이 관찰되었다.

(2) 겨우살이 렉틴(VCA)의 구강암 및 간암세포에 대한 형광분석법(FACS)에 의한 아폽토시스 유도효과 확인

시료 처리에 의한 A253 구강암 세포 및 Hep3B 간암세포의 아폽토시스 유도효과를 확인하기 위하여 형광분석(FACS)을 실시하였다. 시료를 처리한 세포를 냉 70% 에탄올에서 24시간동안 고정하고, 인산완충액(PBS)으로 철저하게 세척하였다. 50㎍/㎖의 propidium iodide 와 100 ㎍/㎖의 RNAase가 함유된 DNA 염색용액과 함께 실온에서 30분간 배양시킨 후, FACS flow cytometer (Becton Dickinson Instruments)에 의하여 분석하였다. 아폽토시스는 각 세포주기에서의 백분율로 나타내었다. 도 3은 A253 구강암세포및 Hep3B 간암세포의 형광분석 결과이다. VCA를 48시간동안 처리한 A253 구강암 세포의 경우 25%의 아폽토시스가 나타났으며, Hep3B 간암세포의 경우 64.6%의 아폽토시스가 나타났다. 따라서 겨우살이 렉틴(VCA)의 항암효과는 아폽토시스 유도효과에 의한 것을 확인할 수 있었으며, 아폽토시스 유도는 세포주에 따라 차이가 큰 것을 알 수 있었다.

실험예 3 : 겨우살이 렉틴(VCA)의 암세포에 대한 텔로메라제 (telomerase) 억제효과 확인

시료의 텔로메라제 억제효과에 의한 항암효과의 가능성을 확인하기 위하여 TRAP_EZEtelomerase detection kit를 사용하여 DNA를 검색하였다. PCR 산물은 12% 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 겔에서 전기영동을 실시한 후 SYBR GREEN DNA 염색시약으로 확인하였다. 각 레인에서 텔로메라제의 양을 확인하기 위하여 전체 ladder의 농도를 NIH-image software로 측정하였다. 도 4는 구강암(A253, KB), 인두암(FaDu), 간암(SK-Hep-1, Hep3B)세포에 대한 겨우살이 렉틴(VCA)의 텔로메라제 억제효과 측정결과와 피부암(B16-BL6 melanoma)세포에 대한 렉틴으로 강화한 수추출물(VCES)의 텔로메라제 억제효과 측정결과이다. 시험한 모든 세포주에서 시료처리 시간이 길어질수록 텔로메라제 억제효과가 현저히 나타났다. 구강암 세포주인 KB의 경우, 48 시간 처리 시는 효과가 크게 나타나지 않았으나 72 시간 처리 시 대조군에 비하여 텔로메라제가 10%로 감소하는 것으로 나타났다. 그러나, 인두암 세포주인 FaDu 및 간암 세포주인 SK-Hep-1 그리고 Hep3B의 경우 렉틴 처리 후 12시간부터 텔로메라제 억제효과가 나타났다. 특히, 간암의 경우 VCA의 SK-Hep-1 세포에 대한 텔로메라제 억제효과는 Hep3B 세포에 비하여 현저히 큰 것으로 나타났다. 또한, 피부암 세포주(B16-BL6)의 경우 VCES 처리후 24시간부터 텔로메라제 억제효과가 현저히 나타났다. 결과적으로 겨우살이의 주된 항암물질인 렉틴(VCA)은 텔로메라제 억제효과에 의한 항암효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 렉틴으로 강화된 수추출물(VCES)의 항암효과도 텔로메라제 억제효과에 의한 항암효과를 발휘하는 뛰어난 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4: In vivo 에서 종양전이 억제효과 측정

시험물질의 종양전이에 미치는 효과는 폐에 대하여 전이력을 획득한 고전이성 종양세포주인 B16-BL6 melanoma를 사용하였다. 종양전이를 위한 실험동물은 C57BL/6 마우스를 사용하였으며, in vitro에서 배양된 종양세포주를 정맥주사로 접종하였다. 시험물질에 의한 종양의 전이억제 효과의 조사는 group당 5마리의 마우스에 여러 농도의 시험물질을 종양접종 2일 전과 1일 후 주사하였으며, 시료에 의한 종양전이의 억제효과 측정은 종양만 접종한 시료 무처리의 대조군에 전이된 종양의 군집(colony) 수와 비교함으로서 판단하였다(표 3). 전이된 종양의 판정은 종양접종 14일 후에 마우스를 희생시켜 종양의 표적기관인 폐를 적출한 후 Bouin's 용액에서 전이된 종양을 고정 후 종양의 군집 수를 셈하였다. VCA 투여군은 마리 당 200 ng 이상, VCE 투여군은 1 ㎎ 이상, 그리고 VCES 투여군은 1 ㎎ 이상 투여 시는 80% 이상 폐사하는 것으로 보아 각 시료를 높은 농도로 투여 시는 독성이 있는 것으로 판단되었다. 그러나, 각각 그 이하의 농도에서는 농도 의존적인 유의할만한 전이억제효과를 나타냈다. 특히 VCES 투여군은 VCA 및 VCE에 비하여 독성은 감소한 반면, 전이억제효과는 훨씬 증가하는 것으로 나타났다.

B16-BL6 melanoma 세포에 대한 시료의 전이억제 효과

시료	투여량	전이된 수
대조군	0	65.9±5.5

VCA	ng/마리
	10	63.9±8.0
	50	57.8±9.4
	100	49.6±7.5

VCE	㎍/마리
	125	62.4±10.3
	250	55.6±9.8
	500	50.4±8.1

VCES	㎍/마리
	125	40.3±7.1
	250	30.1±4.3
	500	26.8±3.2

실험예 5: In vivo 에서 신생혈관억제 효과 측정

CAM assay (Oikawa, 1998)를 이용하여 신생혈관억제효과를 확인하였다. 수정란을 37℃에서 3.5일 동안 배양 후, 계란의 좁은 끝 부분에 만들어진 작은 구멍을 통하여 CAM(막)과 노른자위 주머니가 계란껍질 부분으로부터 떨어져 나오도록 하면서 알부민(albumin) 3 ㎖를 주입하였다. 공기주머니를 덮고있는 껍질 부분은 구멍을 내고 제거한 후 바깥부분에 있는 막은 벗겨내었다. 4.5일에 1 ㎕의 시료로 덮은 커버 글래스(cover glass)를 CAM에 놓는다. 병아리 배아를 2일동안 배양 후, 10% 지방 현탁액 적량을 배아 장요막(奬尿膜; embryo chorioallantois)에 주입한 후, 6.5일이 되면 계란을 현미경으로 관찰하였다. 각 농도마다 20개의 수정란을 사용하였다. 음성 대조군에는 인산 완충액(PBS)을 처리하였으며 양성 대조군에는 레티노산 (RA;retinoic acid)을 처리하였다.

실험결과 표 4 및 도 5(VCA 경우), 도 6(VCE 경우), 도 7(VCES 경우)에 나타난 바와 같이, VCA는 25 ng/㎖에서, 그리고 VCE는 50 ㎍/㎖에서 양성 대조군보다 높은 활성을 나타냈다. VCES의 경우에는 20 ㎍/㎖에서 양성 대조군보다 높은 활성을 나타냈으며, 그 이상의 농도에서도 VCE보다 높은 활성을 나타냈다.

CAM 분석법에 의한 신생혈관 억제효과

시료	농도	생존한 계란의 수	양성반응의 계란의 수	상대활성도
양성대조군(Retinoic acid)		17	13	76
음성대조군(PBS)		20	0	0

VCA (ng/㎖)	6.3	19	12	63
	12.5	19	13	68
	25.0	19	15	79
	50.0	11	11	100
	100.0	10	10	100

VCE (㎍/㎖)	12.5	15	6	40
	25	15	9	60
	50	15	11	73
	100	12	9	75

VCES (㎍/㎖)	10	15	10	67
	20	14	10	71
	50	15	12	80
	100	11	9	81
	200	10	9	90
[주]% 상대활성도 = (양성반응의 계란의 수 / 생존한 계란의 수)×100

실험예 6: 생존률 측정에 의한 항암효과 측정

항암효과를 확인하기 위하여 암을 생체내에 미리 접종하여 암의 성장을 억제하는지의 여부를 검색하였다. 1×10⁵의 B16-BL6 melanoma 세포를 syngeneic mice에 피하주사로 접종하였다. 2주 후 각각 10 마리의 실험군에게 1주일에 3회씩 복강으로 시료를 주사하였으며, 대조군에게는 인산완충액을 주사하였다.

실험결과, 도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, 모든 실험동물에게서 암의 발생이 확인되었으며 시료의 처리는 종양의 발생을 정지시키지는 못하였다. 그러나,시료를 처리한 군은 대조군에 비하여 생존기간이 증가하였으며, 특히, VCES의 처리군은 효능이 현저하게 증가하는 것으로 나타났다. 도 8은 VCA를 마리 당 10 ng, 100 ng을 각각 투여한 결과이며, 10 ng 처리군이 100 ng 처리군보다 생존률이 약간 높은 것으로 나타났다. 도 9는 VCE 및 VCES를 마리당 100 ㎍를 투여한 결과이며, VCES를 처리한 군의 생존률이 가장 큰 것으로 나타났다. 따라서 렉틴으로 강화한 추출물인 VCES는 부작용은 감소하면서 효능은 강화된 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 7: 겨우살이 렉틴(VCA)으로 강화한 수추출물의 임상적인 항암효과 확인

본 실험의 대상은 1998년 4월 연세대학교 신촌 세브란스 병원에서 방광암 진단을 받고 방사선치료를 받았으나 악화되어 식욕부진, 체중감소, 통증, 혈뇨 등으로 심한 고통을 받고 있던 박원문씨이다. 본 발명자는 박원문씨에게 실시예3에서 제조한 렉틴을 강화한 수추출물(100 ㎎/㎖) 10 ㎖를 생리식염수 100 ㎖에 혼합하여 카테타를 통하여 방광에 주입한 후 1 시간동안 안정을 취하도록 하였다. 2일에 한번씩 3회 투여 후 환자는 통증 및 혈뇨가 현저하게 감소하였다. 한달 후, 식욕부진, 체중감소, 통증, 혈뇨 등 암으로 인한 모든 고통이 사라졌고, 부작용은 전혀 나타나지 않았다. 그 후 지속적인 처치를 계속하였고, 병원에서 방광의 종양이 거의 사라진 것을 확인할 수 있었으며, 현재, 정상적인 생활을 영위하고 있다.

또한, 투병과정에서 동일환자는 오른손등의 심한 가려움을 호소하였고, 피부가 심하게 손상되도록 긁어 출혈, 궤양 등을 유발하였다. 병원에서 피부암으로 진단하였고, 방사선 조사 후 약간 호전되었으나 도로 재발되는 등 치유가 되지 않았다. 역시 본 발명자가 고안한 렉틴을 강화한 수추출물(100 ㎎/㎖)을 환부에 수시로 도포한 결과, 가려움증이 사라지고 수 주 후 궤양의 흔적도 거의 사라졌다.

상기와 같은 결과는 본 발명자가 고안한 렉틴을 강화한 수추출물(100 ㎎/㎖)을 방광암, 피부암 등의 환부에 직접 도포함으로써 부작용이 없이 항암효과를 발휘할 수 있는 뛰어난 효과가 있는 것을 임상적으로 확인할 수 있었다.

이상의 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명 한국산 겨우살이로부터 분리 정제한 렉틴, 증류수로 추출한 수추출물 및 렉틴과 수추출물의 혼합한 조성물은 신생혈관억제 활성이 있어 암의 전이억제에 뛰어난 효과가 있고, 아폽토시스 유도활성, 텔로메라제 억제활성, 항암활성이 뛰어나며, 국소적으로 환부에 투여가 가능한 피부암, 구강암, 방광암, 자궁경부암 등의 치료에 효과적이고, 특히 한국산 겨우살이로부터 분리·정제한 렉틴과 수추출물을 혼합하여 제조한 추출물은 부작용이 적고 항암활성이 강화되는 효과가 있으므로 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

(a) 겨우살이에 증류수를 시료중량에 대하여 5∼20 배로 첨가하면서 마쇄하고 원심분리하는 단계;

(b) 상기 (a)단계에서 얻은 상등액을 공극 크기를 달리하는 0.22㎛∼20㎛의 막여과기(membrane filter)에 의해 순차적으로 여과하여 최종농도가 50∼200 ㎎/㎖ 가 되도록 멸균된 인산염 완충액으로 조절하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 겨우살이 수추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제용 조성물.
겨우살이로부터 추출·정제한 렉틴과 제1항 기재의 수추출물을 혼합하여 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 항암제용 조성물.
제1항 내지 제2항에 있어서, 제형이 외용제임을 특징으로 하는 항암제용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항암제용 조성물이 암세포전이 혈관형성억제용 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항암제용 조성물이 텔로메라제 활성억제용 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.