KR20030024653A

KR20030024653A - 신규 생물살진균제

Info

Publication number: KR20030024653A
Application number: KR1020027005447A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 제이. 드라호스; 리 쥐. 웨스트
Original assignee: 데이비드 제이. 드라호스; 리 쥐. 웨스트
Priority date: 2001-06-22
Filing date: 2002-03-08
Publication date: 2003-03-26
Also published as: WO2003000051B1; WO2003000051A2; JP4362561B2; CA2451555A1; US20030082164A1; WO2003000051A3; EP1404179B1; EP1404179A2; MXPA03012034A; KR100487451B1; JP2004533468A; US20030082165A1; CA2451555C; ATE397385T1; DE60226979D1; AU2002252240B2; US6824772B2; US6569425B2; EP1404179A4

Abstract

본 발명은 환경적으로 바람직한 생물살진균제로 사용하기 위한 미생물인 바실러스 리케니포르미스 균주 SB3086의 단리된, 생물학적으로 순수한 배양물을 개시한다. 또한, 본 발명은 미생물 작용제의 생물살진균 활성을 증진시키기 위한 방법을 개시한다. 본 발명은 미생물 작용제를 포함하는 영양제 조성물, 및 상기 균주를 사용하여 식물 진균성 질병 및 아스페르길리스 니게르의 감염을 방제하는 방법을 추가로 개시한다.

Description

신규 생물살진균제 {Novel Biofungicide}

본 출원은 2001년 7월 22일자로 출원되어 현재 계류 중인 출원 제09/887,379호의 일부 계속 출원이다.

진균 종에 의해 유발되는 질병은 전세계 식물들에 손상을 입히며 가장 흔한 질병에 속한다. 최근, 식물 진균성 질병의 방제는 주로 특정 화학물질들을 적용하는 것에 의존하고 있다. 상기 화학물질들 중 일부는 환경 및 인간 건강에 문제를 일으키는 것으로 공지되어 있지만, 이러한 화학 작용제들은 중요 진균성 질병에 대한 활성이 강하여 여전히 널리 이용되고 있어서, 환경적으로 더 안전하게 이용될 수 있고 효과적인 대안물이 요구된다.

통상적으로, 보통 뿌리 지대 (근권(根圈)) 및 잎 지대 (필로플레인 (phylloplane))에서 식물을 감염시키는 질병을 생물학적으로 방제하는 것이 통상의합성 화학물질에 의한 방제 방법보다 바람직하다. 통상적으로, 이러한 생물방제용 (biocontrol) 작용제들은 식물 숙주 또는 환경에 가하는 위해가 거의 없거나 전혀 없으며, 일부는 정상적인 식물 발생에 이로울 수도 있다. 그러나, 이러한 생물방제용 유기체는 대부분이 진균성 질병에 대한 이들의 효과 범위에 있어서나, 또는 실제의 야생 (field) 조건하에서 및 처리 적용 동안의 생존력에 있어서 매우 제한되어 있는 것이 전형적이다.

특정 미생물을 사용하여 식물 진균성 질병을 방제하려는 시도가 있었다. 예를 들어, 미국 특허 제5,589,381호 [Neyra and Sadasivan, 1996]는 바실러스 리케니포르미스 균주 PR1-36a에 특정 식물 병원체에 대한 억제력이 약간 있다고 기재하였다. 그러나, 특정 생(生) 생물학적 방제용 유기체를 적용하려는 노력은 식물 병원체에 대한 좁은 효과 범위, 또는 이들 유기체 고유의 불안정성으로 인해 크게 제한되어 왔다. 많은 균주들이 종종 표준 저장 조건에서 수 주내에 사멸하거나, 활발하게 성장하는 유기체에 대한 자외선 (UV)의 해로운 영향, 비교적 높은 온도, 및 분무 후의 건조 등을 포함하는 전형적인 야생 상태의 조건에서 수 시간 이내에 사멸했다. 이러한 유기체를 생물방제용 균주가 적용될 위치에서 현장 (on-site) 배양하려는 시도는 약간의 유용성이 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 배양물이 오염되는 심각한 난점, 및 온도 및 UV 영향을 피하기 위해 저녁에 적용해야 할 필요성은 종종 어려운 일이며, 이는 노동 집약적이고, 고가이며, 비실용적임이 판명되었다. 그러므로, 이제까지 달성되지 못했던, 현재 이용되고 있는 위험한 화학물질보다 환경적으로 안전하고 효과적으로 진균성 질병에 의해 유발된 식물 손상을 억제하는 생물학적 방제 방법이 농업에 오랫동안 요구되어 왔다.

발명의 요약

그러므로, 본 발명의 목적은 넓은 범위의 식물 진균성 질병 및 다른 진균의 방제를 위한 환경 친화적이고 효과적인 생물학적 작용제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 바실러스 리케니포르미스 SB3086이라는 독특한 균주를 사용하여 식물 진균성 질병을 방제하기 위한 생물학적 방법 및 제제를 제공하는 것이다. 이러한 균주 SB3086의 사용으로 표준 생체이물성 화학 작용제에 대한 실용적이고 천연의 대안물을 제공하게 되어, 식물에서 진균성 질병의 방제 또는 제거를 달성하기 위한 환경적으로 더욱 안전한 수단이 제공된다.

본 발명의 다른 목적은 식물에 적용하기 적합한 형태로 상기 SB3086 균주를 함유하는 조성물을 제공하는 것이다. 그러한 조성물은 무독성 계면활성제, 무독성 양의 식물 영양제, 방부제, 생물보충제 등을 포함하며, 활성 영양 포자, 액제, 분산성 (flowable) 산제, 과립제, 분무 건조 물질의 형태일 수 있고, 또는 다른 담체 물질과 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 생물살진균제를 이용한 식물 진균성 질병의 방제 방법을 제공하는 것이다. 상기 생물살진균제는 새싹 (shoot), 뿌리, 종자, 영양 번식체에 적용되거나, 활성 영양 세포를 함유하는 임의의 적합한 형태, 예를 들면, 액제, 분무제, 산제, 침근제 (root dip), 과립제, 분제 등의 형태로 토양 또는 식물에 처리할 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 생물살진균제를 생산할 수 있는 미생물과 상기 미생물의 생물살진균 활성을 증진시키는 영양 제제를 함께 적용하는 것을 포함하는, 미생물 작용제의 생물살진균 활성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 여러가지 다른 목적 및 이점은 하기하는 도면의 간단한 설명 및 본 발명의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.

도면의 간단한 설명

도면에서, 도 1은 스클레로티니아 호모에오카르파 (Sclerotinia homoeocarpa) 질병 (달러 스폿 (Dollar spot) 질병) 방제를 위해 바실러스 리케니포르미스 SB3086 균주를 함유하는 여러가지 작용제를 사용한 연구의 비교 결과를 나타낸다.

도 2는 자연적으로 감염된 잔디에 대한 야생 상태에서의 실험에서, 바람직한 710-140 제제 중 바실러스 리케니포르미스 SB3086 균주의 달러 스폿 질병 (스클레로티니아 호모에오카르파)에 대한 방제력을 나타낸다.

본 발명은 생물살진균제 (biofungicide)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 진균에 의해 유발된 식물 질병 등을 포함하는 진균의 성장을 방제하는 미생물인 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) 균주 SB3086, 및 상기 균주 SB3086을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 상기 및 여러가지 다른 목적 및 이점은 ATCC 기탁 번호 55406의 확인된 특성을 갖는 바실러스 리케니포르미스 균주 SB3086의 생물학적으로 순수한 배양물 및 미생물 작용제의 생물살진균 활성을 증진시키는 조성물에 의해 달성된다.

본 발명의 중요한 측면은 질병을 유발하는 진균류에 대한 천연 길항제로 기능하거나 이의 성장을 억제하는 생물학적 유기체를 사용하여 식물 병원성 진균 종을 방제함으로써, 유해한 질병의 전파 및 손상을 제한하는 것이다. 특히, 본 발명은 신규 박테리아성 토양 단리물인 바실러스 리케니포르미스 SB3086이 넓은 스펙트럼의 진균성 질병에 대해 드물게 강력한 억제 효과가 있을 뿐 아니라, 장기간의 저장시 및 실제적인 야생 상태로의 적용 공정 또는 조건하에서의 자연적인 생존력도 보유한다는 예기치 못한 발견에 관한 것이다.

본 발명에서는 바실러스 리케니포르미스 SB3086이 태양 자외선 (UV)에 의한 손상에 대해 저항성이 비교적 높은 조밀한 포자 코트를 형성하는 드물고 놀라운 특성이 있다는 사실을 발견했다. 또한, 야생 상태의 조건하에서 종종 마주치는 건조 및 고온에 기인한 생존력의 상실에 대한 저항성이 있다는 것도 밝혀냈다. 또한, 본 발명은 양질의 SB3086 포자를 약 10⁴내지 약 10¹²CFU/ml 범위의 고농도의 액체 제제 형태로 실용적이고 대규모적인 산업적 성장을 달성했다. 또한, 농축 포자는 분무 건조시킬 수도 있고, 약 10⁵내지 약 10¹³CFU/g 농도 범위의 분산성 산제로 사용되거나, 또는 일부의 다른 적합한 형태로 사용될 수도 있다.

별도로 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다는 것을 이해해야 한다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질을 사용하여 본 발명을 실행하거나 시험할 수 있지만, 본원에 기재된 방법 및 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 달리 언급되지 않는다면, 본원에서 이용되거나 고려된 기술들은 당업자에게 공지된 표준 방법들이다. 상기 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시하려는 것일 뿐이며, 제한하는 것이 아니다.

본원에서 사용된 바와 같이, "생물방제" 또는 "생물살진균제"라는 용어는 합성 화학 작용제와는 반대로, 박테리아 사용 등의 생물학적 수단으로 진균 활성을 방제하거나 제거하는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "생물살진균 활성의 증진"이라는 용어는 미생물 작용제가 영양 제제와 함께 또는 조합하여 적용되는 경우, 이의 생물살진균 활성이 상기 영양 제제를 사용하지 않은 경우보다 현저히 또는 실질적으로 더 크다는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "생물보충제"라는 용어는 통상적으로 인식하고 있는 무기 영양제 및 미량영양소가 아닌, 식물 성장, 강장 (hardiness), 수확량, 또는 품질에 직접 또는 간접적으로 이득이 되는 것이라 인식되는 천연 물질로 정의된다. 상기 생물보충제의 예는 하기와 같다: i) 노르웨이산 켈프 (kelp) 식물인 아스코필룸 노도숨 (Ascophyllum nodosum) 등으로부터 얻은 해초 추출물; ii) 동물 비료 및 가공된 하수 침전물 (sewage sludge); iii) 동물에서 유래된 생성물, 예를 들면, 뼈, 깃털, 털, 및 어분(魚粉); iv) 채취된 레오르나르다이트 (leornardite), 토탄(土炭) 등으로부터의 후민산 및 풀브산 물질; v) 종이 가공 부산물 (예를 들면, 리그닌 술포네이트); vi) 식물 및 동물 배설물이 미생물 대사 및 부분적 분해되어 얻어지는 퇴비 물질 등.

본원에서 사용된 바와 같이, "번식체"라는 용어는 완전한 식물로의 재생 및(또는) 원하는 식물 성분의 증식을 가능하게 하기 위한 모든 필수 성분을 함유하는 식물 절편 또는 성분을 지칭한다. 이러한 번식체의 예는 하기와 같다: i) 종자;ii) 감자 등로부터의 눈 또는 "씨눈 (seedpiece)"; iii) 적합한 성장 조건하에 놓이면 새로운 뿌리를 형성할 수 있는 줄기 절단물; iv) 뿌리 또는 뿌리줄기 절편 등.

천연 토양 미생물인 바실러스 리케니포르미스 SB3086은 스클레로티니아 호모에오카르파 (달러 스폿 질병), 리조크토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) (리조크토니아 블라이트 (Rhizoctonia blight)), 리조크토니아 오리자애 (Rhizoctonia oryzae) (리조크토니아 쉬쓰 스폿 (Rhizoctonia Sheath Spot)), 피리쿨라리아 그리세아 (Pyricularia grisea) (그레이 리프 스폿 (Gray Leaf Spot)), 마이크로도키움 니발레 (Microdochium nivale) (핑크 스노우 몰드 (Pink Snow Mold)), 및 바이폴라리스 소로키니아나 (Bipolaris sorokiniana) (헬민토스포리움 블라이트 (Helminthosporium blight)) 등을 포함하는 넓은 범위의 중요 식물 병원성 진균에 대해 효과적인 것으로 밝혀졌다. 상기 독특한 유기체의 비교적 대규모 성장 및 전달에의 이용가능성 및 효능의 범위가 넓은 것으로 입증되었기 때문에, 이제 당업자는 진균 감염에 생물학적 방제 방법을 사용할 수 있게 되었다. SB3086의 독특한 특성으로는 다음을 포함한다: 표준 대규모 발효 조건 및 배지하에서의 효율적이고 급속한 성장; 최적 성장을 위한 넓은 온도 범위 (18℃ 내지 50℃); 공지된 발효 공정하에 높은 비율의 영양 박테리아 집단 내에서 안정한 포자를 형성하는 성향; 극단적 온도 및 건조 등과 같은 준-최적 조건하에서 포자의 장기간 생존력; UV 일광에 대한 포자의 고유한 저항성; 토양 및 뿌리 환경에 전형적인 저산소 조건하에서의 성장력; 식물의 뿌리 및 잎 표면에서의 콜로니화력; 및 표준 독물학 연구 및 병원성 연구를 기반으로 동물 및 식물에 대해 입증된 안전성.

바실러스 리케니포르미스 SB3086의 분류학적 특성을 바실러스 리케니포르미스 및 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) 종의 표준 특성과 비교하여 표 1에 나열했다.

바실러스 리케니포르미스 SB3086을 미국 20110 버지니아주 만나사스 10801 유니버시티 블레버드 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 수탁번호 ATCC 55406으로 기탁했다. 상기 기탁물은 특허 계류 중인 전체 기간 동안 ATCC에서 생존가능한 조건으로 유지될 것이고, 비상업적 용도를 위해서는 어떠한 개인 또는 단체라도 제한없이 이용가능하지만, 상기 기탁물을 관리하는 주의 규정에 따른다.

본 발명의 여러가지 실시양태를 하기에 기재했다.

실시예 1: 바실러스 리케니포르미스 SB3086의 단리

건강한 식물 및 잔디 뿌리 및 인접한 지역으로부터 토양 샘플 및 뿌리 세척 물질을 얻었다. 다양한 고체 성장 배지 상에서의 플레이트 희석 분석법을 통해 개개의 단리물을 얻어 포자를 형성할 수 있는 박테리아 균주를 선별했다. 구체적으로, 채소 및 잔디식물 (turfgrass)의 식물 뿌리를 멸균 인산염 완충액 중에서 세척한 후, 80 ℃에서 10분 동안 가열했다. 이어서, 상기 가열 충격된 세척물을 새로운 완충액 중에서 10배로 희석하고, 표준 방법 아가 플레이트에 도말하여 32℃에서 밤새 인큐베이션했다. 개개의 콜로니를 따로 배양하고, 지시 (indicator) 진균인지오트리쿰 (Geotrichum), 및 기타 특정 식물 병원성 진균에 대한 억제력에 관해 스크리닝했다. 다른 식물 병원성 진균 종에 대한 추가의 비교 실험을 위해, 이러한 지시 진균을 억제할 수 있는 것을 선별했다.

지시 플레이트 상에서 항-진균 활성을 평가하기 위해서, 시판하는 포테이토 덱스트로스 아가 (Potato Dextrose Agar)를 함유하는 멸균 15 cm 페트리 플레이트의 중앙에 표적 진균 (반-고체 배지 상에서 성장시킨 배양물로부터 취함)의 작은 원형 플러그 (plug) (4 mm)를 위치시켰다. 동시에, 시험할 개개의 후보 박테리아 단리물의 철야 배양물 (LB 브로스 (broth)에서 성장시킴) 5 ㎕를 상기 진균성 플러그에서 대략 3 cm 떨어진 곳에 위치시켰다. 23℃에서 3 내지 4일 동안 인큐베이션 한 후, 억제 흔적을 기록했다.

실시예 2: 바실러스 리케니포르미스 SB3086와 기타 유형의 바실러스 리케니포르미스 균주의 수행능 비교

바실러스 리케니포르미스 SB3086은 공공 공급처 (예를 들면, ATCC)로부터 입수가능한 다른 공지된 바실러스 리케니포르미스 균주와 공통된 성질을 공유하지만, 적어도, 광범위하게 다양한 식물 병원성 진균의 성장 억제에 대해 예기치 못할만큼 강한 능력면에서는 독특하다. 이러한 놀라운 특성은 하기와 같이 측정되었다.

실시예 1에 기재된 바와 같이, 하기 식물 진균성 질병 병원체가 활발하게 성장하고 있는 배양물로부터 작은 원형 플러그를 취했다: 스클레로티니아 호모에오카르파 (달러 스폿), 리조크토니아 솔라니 (리조크토니아 블라이트), 리조크토니아 오리자애 (리조크토니아 쉬쓰 스폿), 피리쿨라리아 그리세아 (그레이 리프 스폿),마이크로도키움 니발레 (핑크 스노우 몰드), 및 드레크슬레라 딕티오이데스 (Drechslera dictyoides) (헬민토스포리움 블라이트). 이러한 원형 플러그를 표준 성장 배지 (예를 들면, 포테이토 덱스트로스 아가)를 함유하는 페트리 디쉬의 중앙에 위치시켰다. 4종의 상이한 바실러스 리케니포르미스 균주에 의한 이러한 진균의 성장 억제를 평가하고, 규모를 늘여가면서 5 (= 강한 억제) 내지 0 (= 억제 없음)으로 기록했다 (실시예 1에 기재한 바와 같음). 이 결과를 표 2에 제시했다. 이러한 결과는 넓은 스펙트럼의 식물 질병 유형에 대한 바실러스 리케니포르미스 SB3086의 탁월한 수행능을 명백히 입증하는 것이다. 이는 특히 달러 스폿 (스클레로티니아 호모에오카르파)에 대해 탁월했는데, 상기 질병에 대한 기존의 박테리아 균주 바실러스 리케니포르미스 PR1-36a [미국 특허 제5,589,381호, Neyra and Sadasivan]의 수행능은 SB3086에 비하면 매우 미약했다.

실시예 3: 바실러스 리케니포르미스 SB3086와 기타의 다양한 토양 미생물 단리물의 수행능 비교

여러가지 속 및 종의 다양한 미생물에 의한 뚜렷한 항-진균 활성을 SB3086의 경우와 비교한 표 4에 제시된 결과로 입증되는 바와 같이, 바실러스 리케니포르미스 SB3086과 같은 단일 토양 미생물의 광범위하게 다양한 표적 진균에 대한 강한 항-진균 활성 능력은 상기 토양 박테리아의 놀랍고도 특이한 성질이다. 구체적으로, 2가지 뚜렷한 진균 억제 특성을 기준으로 조사했다. 제1 특성 (A)은 확산되고 있는 질병 진균성 균사체와 시험 박테리아 콜로니의 항-진균제의 계면에서의, 상기 질병 진균성 균사체의 퇴색성 변색 (darkening discoloration)이다. 이러한 퇴색은 종종 진균에 의한 멜라닌 생성 증가와 관련되어 있으며, 진균성 방어 메카니즘의 일부라고 여겨진다. 제2 특성 (B)은 상기 생물방제용 박테리아의 진균성 균사의 성장 및 확산에 대한 억제력을 평가한다. 이는 성장하는 박테리아 콜로니와 확산하는 진균 사이의 명백한 억제 지대에 의해 지시된다.

일부의 균주가 SB3086과 공통적인 특정 항-진균 특성을 나타냈지만, 대부분은 활성이 제한되었고, SB3086만큼 광대하거나 강한 활성을 나타내는 것은 전혀 없었다.

실시예 4: 기타의 바람직하지 못한 진균 성장에 대한 바실러스 리케니포르미스 SB3086의 억제력

또한, 바실러스 리케니포르미스 SB3086의 항-진균 능력은 다른 상황에서 중요할 수 있는 기타의 바람직하지 못한 진균에까지 확장된다. 예를 들어, SB3086은 욕실 타일과 그라우트의 퇴색 및 변색을 초래하는 통상적 진균인 아스페르길리스 니게르 (Aspergillis niger)의 성장을 억제할 수 있다. 표 4에 나타난 바와 같이, SB3086은 악취 감소 및 다른 관리에 유용하다고 공지된 유기체와 비교할 때, 상기 균주의 성장 감소에 탁월하다.

실시예 5: 야생 상태에서 진균성 질병을 방제하기 위한 바실러스 리케니포르미스 SB3086의 수행능

SB3086의 넓은 범위의 항-진균 효능을 실험실에서 시험하였으며, 또한, 실제 야생 상태의 조건하에서 이 생물방제용 미생물의 기능 및 강장을 입증하기 위한 연구를 수행하였다. 바실러스 리케니포르미스 SB3086의 이러한 야생 상태에서의 수행 능력은 천연 서식지에서 성장하고 있는, 천연 진균성 질병 병원체에 감염된 식물에서 입증되었다.

이러한 연구를 위해, 골프장 및 경기장에 널리 이용되는 경제적으로 중요한 잔디 식물인 펜크로스 벤트그라스 (Penncross Bentgrass)를 대표적인 시험 대상으로 선택했다. 스클레로티니아 호모에오카르파 (달러 스폿 질병)는 이 잔디식물을 심각하게 손상시켜 골프장 및 경기장을 파괴하는 진균성 병원체이다. 그 결과, SB3086의 포자 현탁액을 자리잡은 잔디식물에 분무 적용한 후, 이 곳에서는 스클레로티니아 호모에오카르파의 침해가 강하게 억제된 것으로 나타났다. SB3086을 대략 1.0 x 10⁹CFU/ml 함유하는 농축 포자 제제를 달러 스폿 질병으로 균일하게 감염된 자리잡은 펜크로스 벤트그라스의 잎에 18 oz./1000 피트²(약 5.493 g/m²)의 비율로 분무하였다. 이러한 처리를 유사하게 감염된 잔디식물 플롯 중에 무작위로 2 피트 ×4 피트 (약 0.610 m ×약 1.219 m) 플롯씩 4곳을 골라 적용했다. 비료 (페터 (Peter's) 20-20-20, 0.2 lbs. 질소/1000 피트²(약 0.976 g 질소/m²)), 화학 방제제인 클로로탈로닐 (다코닐 (Daconil) WS, 8 oz./1000 피트²(약 2.441 g/m²)), 또는 물 (대조용)을 사용하여 위와 동일한 방식으로 비교용 플롯에 처리하였다. 처리는 다음과 같았다: 제0일 및 제7일에 SB3086 처리; 제0일, 제3일, 제7일, 및 제10일에 SB3086 처리; 제0일 및 제7일에 페터 (등록상표) 비료 처리; 및 제0일에 클로로탈로닐 처리 (제조업자의 지시에 따라 수행). 개개의 플롯에 처리한 적용범위를 기초로, 질병 침해를 제0일, 제7일, 및 제14일에 평가했다.

상기 결과를 도 1에 제시했다. 이 데이타로부터, SB3086의 포자 현탁액의 분무 적용이 처리 개시 후 2주 이내에 식물 표면 상에서 질병 징후를 강하게 감소시켰음이 명백하다. 주목할 만한 것은, 상기 질병 징후가 처리 개시 이전에 이미 매우 분명했다는 것이다. 대조구 (미처리) 플롯의 70％ 초과에서는 14일 후에도 가시적인 질병 상해 (decay)를 계속 나타냈지만, 바실러스 리케니포르미스 SB3086을 처리한 식물의 플롯 지역은 15％ 미만이 동일 기간 동안 임의의 가시적인 질병 징후를 나타냈다. 화학적 질병 방제제인 클로로탈로닐의 적용만이 SB3086의 질병 치유력에 근접할 수 있었다. 물론, 클래스 II의 발암물질일 뿐 아니라, 물고기 및 수중 생태계에도 독성을 보이는 클로로탈로닐을 이용하는 통상의 화학적 방제 방법에 비해, SB3086의 사용이 식물에서의 진균성 질병 치료를 위한 훨씬 더 환경적으로 안전한 접근법을 제공한다는 사실에 주목해야 한다.

실시예 6: 바실러스 리케니포르미스 SB3086에 의한 리조크토니아 블라이트 질병 (브라운 패치)의 야생 상태에서의 방제

식물 질병 방제에 관한 바실러스 리케니포르미스 SB3086의 야생 상태에서의 수행능의 범위를 추가로 입증하기 위해, SB3086의 리조크토니아 블라이트 질병에 대한 야생 상태에서의 실험을 이 질병으로 자연 감염된 식물의 3곳의 상이한 위치에서 야생 상태 및 기후 조건을 바꿔가며 수행했다. 전형적으로, 리조크토니아 블라이트는 진균인 리조크토니아 솔라니에 의해 유발되며, 잔디식물, 밀, 옥수수, 관목, 나무 (trees), 대부분의 채소 및 다년생 관상수를 포함하는 많은 식물에 통상적인 질병이다. 이러한 실험에서, 현저한 리조크토니아 블라이트 징후를 보이던 2가지 자리잡은 잔디식물 페스큐 (Fescue) 및 벤트그라스 변종 둘다에서 3 피트 ×5 피트 (약 0.914 m ×약 1.524 m)의 무작위 플롯 여러 곳 (3곳)의 잎에 약 1.0 ×10⁹CFU/ml을 함유하는 SB3086 포자 현탁액을 18 oz./1000 피트²(약 5.493 g/m²)의 비율로 7일마다 분무했다. 시험 지역의 유사한 플롯에 2가지 화학 방제제 다코닐 (등록상표) (클로로탈로닐; 제네카 프로페셔날 프로덕츠 (Zeneca Professional Products) 제품) 또는 헤리테이지 (Heritage) (등록상표) (아족시스트로빈; 제네카 프로페셔날 프로덕츠 제품) 중 하나를 지시된 비율 및 시간 간격에 따라 처리하거나, 미처리 대조구 플롯으로 유지시켰다. 미처리 대조군 플롯에 대한 각 처리물의 질병 감소율(％)을 표 5에 제시했다.

이러한 데이타는 바실러스 리케니포르미스 SB3086을 사용했을 경우의 리조크토니아 블라이트 (브라운 패치 (Brown Patch)) 감소 수준은 화학 작용제를 사용한 경우의 수준에 미치지는 못하지만, 이 질병에 대한 바실러스 리케니포르미스 SB3086의 현저한 질병 방제를 보여준다. 그러나, 이러한 실험은 다양한 위치 및 기후 조건에서 여러가지 식물 유형에 대한 야생 상태의 SB3086의 질병 표적 효능의 범위를 명백히 입증한다.

물론, 상기 생물살진균제는 분무제, 산제, 과립제, 액제 등과 같은 임의의 적합한 형태로 식물에게 적용할 수 있다. 또한, 본 발명의 생물살진균제를 함유하는 제제는 계면활성제, 무독성 양의 식물 영양제 (예를 들면, 비료 및 미량영양소)등과 같이 당업자에게 제안될 수 있는 통상적인 성분을 포함할 수도 있다.

실시예 7: 제제의 조성

본 발명에 따른 조성물은 무독성 양의 식물 영양제 및 미량영양소, 예를 들면, 유기 질소, 킬레이팅된 아연, 킬레이팅된 철, 및 천연 유기 성장 증진제, 예를 들면, 해초 추출물을 포함하는 농축 액체 제제이다. 제제 중에는 활성 성분인 바실러스 리케니포르미스 SB3086 뿐 아니라 언급한 성분을 포함시킴으로써, 식물이 발병 동안의 손상 및 스트레스로부터 회복되도록 보조할 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 제제는 표 6에 제시되어 있다. 물론, 당업자에게 제안될 수 있는 바와 같이, 제제 중의 영양제, 유기 물질 등의 양 및 종류를 대체하거나, 첨가할 수 있다.

상기 농축물은 통상적으로 약 2 내지 300배 부피의 물 중에 희석되어 잎에 분무함으로써 적용된다. 잔디식물 상에의 적용 비율은 통상적으로 잔디 표면 1000 피트²(약 92.902 m²) 당 물 2 갤론 (약 7.571 L) 중 상기 바람직한 제제 18 온스 (약 510.291 g)이며, 적합한 액체 분무 장치를 사용하여 분무한다. 이러한 장치는 표준 관개 시스템을 통한 적용을 포함할 수 있다. 상기 바람직한 제제의 적용량은 질병 정도 및 전반적인 식물 건강에 따라 약 2 내지 약 36 oz/1000 피트²(약 10.986 g/m²)로 달라질 수 있다. 별법으로, 바실러스 리케니포르미스 SB3086 포자를 분산성 분말로 분무-건조함으로써 본 발명의 건조 제제를 제조할 수 있다. 그 다음, 이를 건조 영양제, 미량영양소, 및 유기 성장제와 블렌드할 수 있다. 적용하기 위해, 분무-건조된 SB3086 포자를 함유하는 상기 건조 제제를 약 8.0 ×10⁷CFU/ml의 바람직한 포자 농도로 물 중에 현탁한다. 그 다음, 기재한 바와 같이, 이 현탁액 2 갤론 (약 7.571 L)을 식물 표면 1000 피트²(약 92.902 m²)에 적용한다. 단위 지역당 적용되는 현탁된 포자 농도는 질병 정도 및 유형에 따라 약 5 ×10⁷CFU/피트²내지 약 1 ×10¹¹CFU/피트²(약 5.382 ×10⁸CFU/m²내지 약 1.076 ×10¹²CFU/m²) 로 달라질 수 있다.

야생 상태에서의 실험

야생 연구를 통해, 진균성 질병 방제를 위한 바실러스 리케니포르미스 SB3086 균주의 현저한 효과는 본원의 표 6에 기재된 바람직한 유기 영양 보충제와 함께 사용되는 경우 가장 잘 달성된다는 것이 입증되었다. 상기 미생물을 단독 적용하거나 (농축 형태라 할 지라도), SB3086 균주 없는 영양 제제 (710-140 뉴트리언트 베이스 (Nutrient Base)라 지칭)를 적용하는 것은 상업적으로 바람직한 수준의 질병 방제를 제공하기에 아주 효과적이지 않았다. 작용에 관한 어떠한 이론이나 메카니즘 등에 구애받는 것은 아니지만, 이러한 현상은 안정한 시판 제품들이 흔히 그렇듯이 포자 형태의 SB3086 적용은 박테리아 포자의 발아를 유도하기 위해 식물을 삼출시킨 물질을 필요로 하기 때문일 수 있다. 물론, 활발하게 성장 중인 영양 세포로 발아한 후에만, 상기 박테리아 균주 (예를 들면, SB3086 등)는 질병 방제를 담당하는 항진균성 작용제를 생성할 수 있을 것이다. 상기 제제 중의 주의해서 선별된 영양제는 식물이 핵심 아미노산 및 당과 같은 물질을 생성하고 분비하도록 촉발하고, 이러한 물질은 박테리아 포자의 발아를 유도한다. 이러한 발견으로, 실험실 조건하에서는 약간 효과가 있는 많은 생물살진균제들을 효과적인 영양 제제 없이 야생 조건하에 적용한 경우, 이로 인한 현저한 질병 방제를 입증할 수 없는 이유를 설명할 수 있다.

도 2에 나타난 결과로 입증되는 바와 같이, 본 발명의 제제에 의한 평균 질병 병소 개수에 대한 감소력은 표준 화학적 살진균제 (클로로탈로닐)를 사용하여 얻어진 질병 감소 범위 내에 있다. 야생 조건하에서 710-140 뉴트리언트 베이스 (SB3086 균주 없음) 또는 SB3086 포자를 단독 처리한 경우는 이러한 질병의 방제에 현저히 덜 효과적이었다. 이러한 야생 연구에서, 클로로탈로닐 (1.82 oz 다코닐 울트렉스 (Daconil Ultrex) (등록상표) 82.5SDG)을 처리한 플롯을 제외하고, 상기 지시된 물질을 4 피트 ×5 피트 (약 1.219 m ×약 1.524 m)의 무작위 플롯 4 곳의 잎에 표준 표지된 비율 및 빈도로 1주일에 2회씩 분무했다. SB3086 및 710-140 뉴트리언트 베이스 (SB3086 균주 없음)를 포함하는 바람직한 710-140 제제를 20 oz./1000 피트²(약 6.103 g/m²)의 비율로 적용했다. SB3086 단독 처리 (뉴트리언트 베이스 없이)는 바람직한 710-140 제제를 적용한 경우와 적어도 동일한 단위 지역 당 포자 개수를 수용했다. 도 2에 나타난 결과는 (i) 바람직한 영양 제제, 예를 들면, 710-140 중 SB3086이 현저한 효능이 있으며; (ii) SB3086 균주가 없는 영양 제제 또는 바람직한 영양 제제와는 별도로 사용된 경우의 SB3086 균주 자체는훨씬 덜 효과적인 수행능을 나타낸다는 사실을 명백히 확립한다.

예시한 실시양태는 본 발명의 목적 및 이점에 따라 기재되었다. 이들 예시는 단지 설명하기 위해서일 뿐, 본 발명을 제한하는 것이 아님을 알 것이다. 당업자라면, 많은 변형과 개조가 가능하며, 그러한 변형 및 개조 모두 청구항의 영역 및 그 범위에 속한다는 것이 명백할 것이다.

바실러스 리케니포르미스 SB3086의 분류학적 특성 비교
특성	바실러스 리케니포르미스 SB3086	바실러스 리케니포르미스 (전형적인 특성)^1,2	바실러스 섭틸리스 (전형적인 특성)^1,2
그람 (Gram) 반응	+	+	+
세포 너비 (㎛)	0.8	0.8	0.8
타원형 포자	+	+	+
운동성	+	+	+
혐기성 성장(< 1.5 ppm O₂)	+	+	-
ONPG	+	+	+/-
55℃에서의 성장	+	+	-
젤라틴 가수분해	+	+	+
V-P 반응	+	+	+
질산염 환원	+	+	+
7％ NaCl 중에서의 성장	+	+	+
전분 가수분해	+	+	+
시트르산염 이용	-	+/-	+
카탈라제 양성	+	+	+
카제인 분해	+	+	+
글루코스로부터의 산	+	+	+
만니톨로부터의 산	+	+	+
아라비노스로부터의 산	+	+	+
난황 레시티나제	-	-	-
¹문헌 [Berkeley,R.C.W., Logan,N.A., Shute,L.A., and Capey,A.G., Methods in Microbiology Vol. 16, Academic Press, London, pp.291-308 (1984)].
²문헌 [Bergey's Manual of Systemic Microbiology. 1986. (Sneath,P., Mair,N., Sharpe,M.E., and Holt,J., eds.), Williams and Wilkins, Baltimore, pp.1123-1131].

SB3086 및 다른 바실러스 리케니포르미스 균주의 항-질병 활성 비교
바실러스 리케니포르미스 균주	달러 스폿¹	그레이 리프 스폿²	리조크토니아 블라이트³	콜렉토트리쿰 (Colletotrichum)	헬민토스포리움 블라이트⁵	핑크 스노우 몰드⁴
SB3086	5⁶	5	5	5	5	4
ATCC 25972	2	1	3	1	3	1
ATCC 53757	1	0	1	0	0	1
ATCC 14580	1	0	1	1	0	1
ATCC 11946	1	NA⁷	1	1	0	NA
PR1-36a	1	NA	4	5	5	NA
¹스클레로티니아 호모에오카르파
²피리쿨라리아 그리세아
³리조크토니아 솔라니
⁴마이크로도키움 니발레
⁵바이폴라리스 소로키니아나
⁶규모를 늘여가면서 5 (= 강한 억제) 내지 0 (= 억제 없음)으로 기록
⁷평가하지 않음

바실러스 리케니포르미스 SB3086 및 다른 토양 박테리아 균주에 의한 진균 억제 비교
배양물	유형	마이크로도키움 니발레	리조크토니아 오리자애	스클레로티니아 호모에오카르파
		특성 A	특성 B	특성 A	특성 B	특성 A	특성 B
SB3086	바실러스 리케니포르미스	+	+	+	+	+	+
SB3002	바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquifaciens)	-	-	-	-	-	-
SB3003	바실러스 패스튜리이(Bacillus pasteurii)	-	-	-	-	-	-
SB3006	바실러스 라에볼락티쿠스(Bacillus laevolacticus)	+	+	-	+	-	+/-
Soy130	바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)	-	-	-	+/-	-	-
UW8	바실러스 종 (Bacillus sp.)	+	+	+	+	+/-	-
3PMN	슈도모나스 플루오레슨스 (Pseudomonas fluorescens)	-	-	-	-	+	-
HC	슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida)	-	-	-	-	+	-
SB3013	엔테로박터 클로아사애 (Enterobacter cloacae)	+	-	+/-	+/-	+	-
S1-B	슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.)	-	+	NA	NA	-	-
BJ-2	슈도모나스 아에레오파시엔스 (Pseudomonas aeureofaciens)	-	+	+	+	-	+
G11	바실러스 종	+	-	NA	NA	-	-
VT-5	바실러스 섭틸리스	-	-	NA	NA	+	-
S1	에르비니아 종 (Erwinia sp.)	-	-	-	-	-	-
DS1	파에네바실러스 종 (Paenebacillus sp.)	-	-	-	-	-	-

특성 A

+ = 배양물이 계면에서 균사체 변색을 유발함

- = 배양물이 진균에 대한 뚜렷한 변색 효과를 전혀 나타내지 않음

특성 B

+ = 배양물이 투명한 억제 지대를 유발함

- = 배양물이 뚜렷한 억제 지대를 전혀 유발하지 않음

바실러스 리케니포르미스 SB3086에 의한, 아스페르길리스 니게르 (욕실 타일과 그라우트의 퇴색을 유발하는 통상적인 진균)의 성장 억제 능력 비교
박테리아 균주	아스페르길리스 니게르
바실러스 리케니포르미스 SB3086	5
파에니바실러스 아조토픽산스(Paenibacillus azotofixans)	0
바실러스 아밀로리퀴파시엔스	1
바실러스 라에볼락티쿠스	0
바실러스 세레우스	4

바실러스 리케니포르미스 SB3086에 의한, 리조크토니아 블라이트 (브라운 패치)의 야생 상태에서의 방제
		질병 방제율(％) (리조크토니아 블라이트)
위치	식물 유형	바실러스 리케니포르미스 SB3086	다코닐 (등록상표) (클로로탈로닐)	헤리테이지 (등록상표) (아족시스트로빈)	미처리 대조군
오하이오 주립 대학	벤트그라스	78	89	81	0
클렘손 (Clemson) 대학	페스큐	43	81	90	0
버지니아 폴리테크. 인스티튜트	페스큐	58	100	100	0

710-140 제제의 성분
성분	양 (w/v)	범위 (L 당) (w/v)	케이스 번호 (CAS No.)	목적
바실러스 리케니포르미스 SB3086	0.14％(1.1 ×10⁹CFU/ml)¹	0.001 - 12％(1.0 ×10⁶- 1.0 ×10¹¹CFU/ml)	N/A	활성 성분
해초 추출 분말	3.0％	0.2 - 10.0％	EPA 제조 번호 67016-2	유기 생물보충제
우레아	25.2％	1.0 - 48.0％	57-13-6	영양 보충제
철 EDTA 킬레이트, Fe 13％ 분말	1.95％	0.2 - 8.0％	15708-41-5	미량영양 보충제
염화 칼륨 (KCl)	0.24％	0.05 - 10.0％	7447-40-7	영양 보충제
이나트륨 디히드로몰리브데이트 ( Na₂MoO₄·2H₂O)	0.00024％	0.00005 - 0.002％	10102-40-6	미량영양 보충제
염화 코발트 헥사히드레이트 (CoCl₂·6H₂O)	1.0 ×10^-5％	1 ×10^-7- 1 ×10^-3％	7791-13-1	미량영양 보충제
염화 니켈 헥사히드레이트 (NiCl₂·6H₂O)	1.0 ×10^-5％	1 ×10^-7- 1 ×10^-3％	7791-20-0	미량영양 보충제
카톤 CG/ICP: 5-클로로-2-메틸-4-이소스티아졸린-3-온	5.52 ppm	0.2 - 500 ppm	26172-55-4	농축물 저장을 위한 방부제
¹ml 당 콜로니 형성 단위

Claims

ATCC 균주 55406의 확인된 특성을 갖는 미생물 접종물인 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) 균주 SB3086을 포함하는 제제를 적용하는 것을 포함하는, 진균의 방제 방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물 접종물이 농축 포자 형태인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물 접종물이 활성 영양 세포 형태인 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 균주가 약 1 ×10⁴내지 약 1 ×10¹²CFU/ml 범위의 농축 액체 포자로서 존재하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 균주가 약 1 ×10⁵내지 약 1 ×10¹³CFU/g 범위의 농축 건조 포자로서 존재하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 무독성 양의 계면활성제, 방부제, 식물 영양제 및 경우에 따라 생물보충제를 추가로 포함하는 제제를 적용하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 제제를 식물, 종자, 또는 영양 번식체에 적용하기에 적합한 형태로 적용하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 균주가 진균성 질병에 의한 식물 손상에 효과적인 양으로 존재하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 제제를 분제, 분무제, 과립제, 산제 또는 액제로 적용하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 제제를 새싹 (shoot), 잎, 종자, 영양 번식체 또는 뿌리에 적용하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 제제를 토양 처리제로서 적용하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 식물 병원성 진균이 아닌 진균에 대해 효과적인 양으로 존재하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 식물 병원성 진균이 아닌 진균이 아스페르길리스 니게르 (Aspergillis niger)인 것인 방법.
제13항에 있어서, 상기 제제를 분제, 분무제, 과립제, 산제 또는 액제로 적용하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 제제를 아스페르길리스 니게르에 의한 표면 오염에 대해 효과적인 양으로 적용하는 것인 방법.
살진균제를 생산할 수 있는 미생물과 상기 미생물의 생물살진균 (biofungicidal) 활성을 증진시키는 영양 제제를 함께 적용하는 것을 포함하는, 미생물 작용제의 생물살진균 활성을 증진시키는 방법.
제16항에 있어서, 상기 제제가 무독성 양의 계면활성제, 방부제, 식물 영양제 및 경우에 따라 생물보충제를 추가로 포함하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 영양 제제가 SB3086이 없는 710-140인 것인 방법.