KR20030022293A - 난소암의 치료 및 진단용 조성물 및 방법 - Google Patents

난소암의 치료 및 진단용 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 난소암과 같은 암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 당해 조성물은 하나 이상의 난소 암종 단백질, 이의 면역원성 부분, 이러한 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이러한 단백질에 특이적인 항체 또는 면역계 세포를 포함할 수 있다. 당해 조성물은, 예를 들어, 난소암과 같은 질환의 예방 및 치료에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 난소 암종 및/또는 기타 종양으로부터 분비된 종양 항원을 동정하는 방법을 제공한다. 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 또한 난소암의 진단 및 모니터링에 사용할 수 있다.

Description

난소암의 치료 및 진단용 조성물 및 방법{Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer}
난소암은 미국을 포함한 전세계적으로 여성에게 중요한 건강상 문제이다. 비록 난소암의 검출 및 치료에 진전이 있었지만, 난소암의 예방 또는 치료를 위한 백신이나 기타 보편적으로 성공한 방법으로 현재 이용되고 있는 것은 없다. 당해 질환의 치료는 현재 초기 진단 및 수술, 방사선요법, 화학요법 및 호르몬요법과 같은 여러가지 치료법 가운데 하나 이상을 포함할 수 있는 적극적인 치료의 병용에 의존하고 있다. 특정 암을 위한 치료 과정은 종종 특이적인 종양 마커의 분석을포함하는 다양한 예후 변수를 기초로 하여 선택된다. 그러나, 확립된 마커의 이용은 종종 설명하기 어려운 결과를 초래하며, 다수의 암 환자에게서 높은 사망률이 계속적으로 관찰되고 있다.
면역요법은 암 치료 및 생존을 실질적으로 개선시켜 줄 수 있는 잠재력을 갖는다. 이와 같은 요법은 난소 암종 항원에 대한 면역 반응의 생성 또는 증강을 포함할 수 있다. 그러나, 지금까지 비교적 적은 수의 난소 암종 항원이 알려져 있으며, 이와 같은 항원에 대한 면역 반응의 생성은 치료학적으로 이로운 것으로 제시된 바 없다.
따라서, 당해 분야에서는 난소 종양 항원을 동정하고, 이러한 항원을 난소암의 치료에 사용하기 위한 개선된 방법이 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족하며, 추가로 다른 관련된 이점들을 제공한다.
발명의 요약
간략하게 설명하면, 본 발명은 난소암과 같은 암의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 국면에 있어서, 본 발명은 난소 암종 단백질 또는 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입으로 상이하나 난소 암종 단백질-특이적 항혈청과 반응하는 능력이 실질적으로 감소되지 않은 난소 암종 단백질 변이체의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 특정 양태에서, 난소 암종 단백질은 서열 456-457, 460-477, 512-570 및 이들 폴리뉴클레오타이드의 보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기한 폴리펩타이드 또는 이의 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열 394-455, 458-459, 478-511 및 571-596에 제시된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 조성물을 제공한다.
다른 국면에서, 본 발명은 약제학적 조성물 및 백신을 제공한다. 약제학적 조성물은 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 (i) 서열 456-457, 460-477 및 512-570 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 난소 암종 단백질 또는 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입으로 상이하나 난소 암종 단백질-특이적 항혈청과 반응하는 능력이 실질적으로 감소되지 않은 난소 암종 단백질 변이체의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드, (ii) 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, (iii) 이러한 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, (iv) 이러한 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제시 세포 및/또는 (v) 이러한 폴리펩타이드와 특이적으로 반응하는 T 세포 중의 하나 이상과 함께 포함할 수 있다. 백신은 비특이적 면역 반응 증강제를 (i) 서열 394-455, 458-459, 478-511 및 571-596에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 456-457, 460-477 및 512-570 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 난소암종 단백질 또는 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입으로 상이하나 난소 암종 단백질-특이적 항혈청과 반응하는 능력이 실질적으로 감소되지 않은 난소 암종 단백질 변이체의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드, (ii) 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, (iii) 이러한 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합하는 항이디오타입 항체, (iv) 이러한 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제시 세포 및/또는 (v) 이러한 폴리펩타이드와 특이적으로 반응하는 T 세포 중의 하나 이상과 함께 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 국면에서 상기한 바와 같은 하나 이상의 폴리펩타이드 를 포함하는 융합 단백질 뿐만 아니라, 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
관련된 국면에서, 융합 단백질 또는 당해 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 생리학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 다른 국면에서, 융합 단백질 또는 당해 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 비특이적 면역 반응 증강제와 함께 포함하는 백신을 제공한다.
추가의 국면에서, 본 발명은 상기한 바와 같은 약제학적 조성물 또는 백신을 환자에게 투여함을 포함하여, 당해 환자에서 암의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 다른 국면에서 T 세포를 (a) 서열 394-455, 458-459, 478-511 및 571-596에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 456-457, 460-477 및 512-570중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 난소 암종 단백질 또는 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입으로 상이하나 난소 암종 단백질-특이적 항혈청과 반응하는 능력이 실질적으로 감소되지 않은 난소 암종 단백질 변이체의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드, (b) 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 (c) 이러한 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제시 세포와 T 세포의 자극 및/또는 증식을 허용하기에 충분한 조건하에 및 시간 동안 접촉시킴을 포함하여, T 세포를 자극하고/하거나 증식시키는 방법을 제공한다. 상기 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 항원 제시 세포(들)는 포유동물에서 T 세포를 자극하고/하거나 증식시키는데 사용하기 위한 약제학적 조성물 또는 백신내에 존재할 수 있다.
다른 국면에서, 본 발명은 상기한 바와 같이 제조된 T 세포를 환자에게 투여함을 포함하여, 환자로부터 난소암의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
추가의 국면에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 분리된 CD4+및/또는 CD8+T 세포를 (i) 서열 456-457, 460-477 및 512-570 중의 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 난소 암종 단백질 또는 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입으로 상이하나 난소 암종 단백질-특이적 항혈청과 반응하는 능력이 실질적으로 감소되지 않은 난소 암종 단백질 변이체의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드, (ii) 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 (iii) 이러한 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제시 세포 중의 하나 이상과 함께 배양시키는 단계 및 (b) 환자에게 유효량의 증식된 T 세포를 투여하여, 환자에서 난소암의 발현을 억제하는 단계를 포함하여, 환자에서 난소암의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 증식된 세포는 환자에게 투여하기 전에 클로닝시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 국면에서 분비된 종양 항원을 동정하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (a) 종양 세포를 면역결핍 포유동물에 이식하는 단계, (b) 종양 항원이 혈청내로 분비되도록 하기에 충분한 시간 후에 면역결핍 포유동물로부터 혈청을 수득하는 단계, (c) 면역적격 포유동물을 혈청으로 면역화시키는 단계, (d) 면역적격 포유동물로부터 항혈청을 수득하는 단계 및 (e) 종양 발현 라이브러리를 항혈청으로 선별하여, 이로부터 분비된 종양 항원을 동정하는 단계를 포함한다. 분비된 난소 암종 항원을 동정하는 바람직한 방법은 (a) 난소 암종 세포를 SCID 마우스에 이식하는 단계, (b) 난소 암종 항원이 혈청내로 분비되도록 하기에 충분한 시간 후에 SCID 마우스로부터 혈청을 수득하는 단계, (c) 면역적격 마우스를 혈청으로 면역화시키는 단계, (d) 면역적격 포유동물로부터 항혈청을 수득하는 단계 및 (e) 난소 암종 발현 라이브러리를 항혈청으로 선별하여, 이로부터 분비된 난소 암종 항원을 동정하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 서열 394-415로서 본원에 제시된, O8E 폴리클로날 항혈청에 의해 인식되는 항체 에피토프를 개시한다.
각각 서열 416-435 및 서열 436-455로서 본원에 개시된, HLA-0201에 결합하는 것으로 추정되는 10량체 및 9량체 펩타이드가 본 발명에 의해 추가로 개시된다.
본 발명의 상기 및 다른 국면은 이하의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참고하면 명백해질 것이다. 본원에 개시된 모든 참고 문헌은 각각이 개별적으로 인용된 것처럼 이의 전체 내용이 본원에 참고로 인용되어 있다.
본 발명의 또 다른 국면에 있어서, 본 발명자들은 예기치 않게 O772P를 암호화하는 유전자의 5'-말단에서 일련의 신규한 반복 서열 요소를 동정하였다. 따라서, 본 발명은 Xn-Y(여기서, X는 서열 596에 제시된 O772P 반복 서열과 50% 이상의 동일성, 바람직하게는 70% 이상의 동일성, 및 보다 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다)로 제시된 구조식을 갖는 O772P 폴리펩타이드를 제공한다. Y는 전형적으로는 서열 594에 제시된 O772P 불변 영역 서열과 80% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 동일성 및 보다 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 당해 양태에 따라서, n은 일반적으로는 1 내지 35의 정수, 바람직하게는 15 내지 25의 정수일 수 있고, X는 동일하거나 상이할 수 있다.
한 바람직한 양태에 있어서, X는 서열 574-593 중의 어느 하나로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하고, Y는 서열 594에 제시된 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 양태에 있어서, 예시적인 O772P 폴리펩타이드는 20개의 반복 서열 요소(즉, X20)을 함유하는, 서열 595에 제시된 서열을 포함하며, 여기서, X 요소는 다음의 순서로 배열되어 있다(O772P 반복 영역에서 N-말단에서 C-말단으로 이동): 서열 574-서열 575-서열 576-서열 577-서열 578-서열 579-서열 580-서열 581-서열 582-서열 583-서열 584-서열 585-서열 586-서열 587-서열 588-서열 589-서열 590-서열 591-서열 592-서열 593.
본 발명의 또 다른 국면에 따라서, 구조식 Xn-Y(여기서, X는 서열 512-540, 542-546 및 548-567 중의 어느 하나로 이루어진 그룹으로부터 선택된 O772P 반복 서열을 포함한다)를 갖는 O772P 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. Y는 일반적으로는 서열 568에 제시된 O772P 불변 영역 서열과 80% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 동일성 및 보다 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 당해 양태에 있어서, n은 전형적으로는 1 내지 35의 정수, 바람직하게는 15 내지 25의 정수일 수 있고, X는 동일하거나 상이할 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 예시적인 O772P 폴리뉴클레오타이드는 20개의 반복 서열 요소(즉, X20)을 함유하는, 서열 596에 제시된 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 국면에 따라서, 서열 490-511 중의 어느 하나에 제시된 항체 에피토프 서열을 적어도 포함하는 O772P 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 국면에 따라서, 서열 394-415 중의 어느 하나에 제시된 항체 에피토프 서열을 적어도 포함하는 O8E 폴리펩타이드를 제공한다.
서열 목록 및 도면의 간단한 설명
서열 1-71은 도 1A 내지 1S에 제시된 난소 암종 항원 폴리뉴클레오타이드이다.
서열 72-74는 도 2A 내지 2C에 제시된 난소 암종 항원 폴리뉴클레오타이드이다.
서열 75는 난소 암종 폴리뉴클레오타이드 3g(도 4)이다.
서열 76은 난소 암종 폴리뉴클레오타이드 3f(도 5)이다.
서열 77은 난소 암종 폴리뉴클레오타이드 6b(도 6)이다.
서열 78은 난소 암종 폴리뉴클레오타이드 8e(도 7A)이다.
서열 79는 난소 암종 폴리뉴클레오타이드 8h(도 7B)이다.
서열 80은 난소 암종 폴리뉴클레오타이드 12e(도 8)이다.
서열 81은 난소 암종 폴리뉴클레오타이드 12h(도 9)이다.
서열 82-310은 도 15A 내지 15EEE에 제시된 난소 암종 항원 폴리뉴클레오타이드이다.
서열 311은 난소 암종 폴리뉴클레오타이드 O772P의 전장 서열이다.
서열 312는 O772P 아미노산 서열이다.
서열 313-384는 난소 암종 항원 폴리뉴클레오타이드이다.
서열 385는 21013으로 명명된 클론 O772P의 형태의 cDNA 서열을 제시한다.
서열 386은 21003으로 명명된 클론 O772P의 형태의 cDNA 서열을 제시한다.
서열 387은 21008로 명명된 클론 O772P의 형태의 cDNA 서열을 제시한다.
서열 388은 서열 385에 상응하는 아미노산 서열이다.
서열 389는 서열 386에 상응하는 아미노산 서열이다. 서열 390은 서열 387에 상응하는 아미노산 서열이다.
서열 391은 난소 암종 폴리뉴클레오타이드 O8E의 전장 서열이다.
서열 392-393은 O8E에 의해 암호화된 단백질 서열이다.
서열 394-415는 OE8 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 서열이다.
서열 416-435는 OE8로부터의 전장 오픈-리딩 프레임을 사용하여 추정된 잠재적 HLA-A2 10량체 결합 펩타이드이다.
서열 436-455는 OE8로부터의 전장 오픈-리딩 프레임을 사용하여 추정된 잠재적 HLA-A2 9량체 결합 펩타이드이다.
서열 456은 O772P에 상동성을 나타내는 전장 Genbank 서열의 절단된 뉴클레오타이드 서열이다.
서열 457은 O772P에 상당한 상동성을 나타내는 전장 Genbank 서열이다.
서열 458은 O772P에 상동성을 나타내는 전장 Genbank 서열의 절단된 변형을 암호화하는 단백질이다.
서열 459는 O772P에 대한 단백질 서열에 상당한 상동성을 나타내는 Genbank로부터의 전장 단백질 서열이다.
서열 460은 잔기 1-70에 함유된 O772P의 특유한 N-말단 부분을 암호화한다.
서열 461은 특유한 서열을 함유하고, 서열 456의 잔기 1-313을 암호화한다.
서열 462는 클론 O772P에 대한 추정 서열이다.
서열 463은 클론 FLJ14303에 대한 cDNA 서열이다.
서열 464는 클론 O772P에 대한 부분 cDNA 서열이다.
서열 465는 클론 O772P에 대한 부분 cDNA 서열이다.
서열 466은 클론 O772P에 대한 부분 cDNA 서열이다.
서열 467은 클론 O772P에 대한 부분 cDNA 서열이다.
서열 468은 클론 O772P에 대한 부분 cDNA 서열이다.
서열 469는 클론 O772P에 대한 부분 cDNA 서열이다.
서열 470은 클론 O772P에 대한 부분 cDNA 서열이다.
서열 471은 클론 O772P에 대한 부분 cDNA 서열이다.
서열 472는 클론 O772P에 대한 부분 cDNA 서열이다.
서열 473은 클론 O772P에 대한 부분 cDNA 서열이다.
서열 474는 클론 O772P에 대한 부분 cDNA 서열이다.
서열 475는 클론 O772P에 대한 부분 cDNA 서열이다.
서열 476은 클론 O772P에 대한 부분 cDNA 서열이다.
서열 477은 난소 종양 항원 O772P의 신규한 5'-말단을 제시한다.
서열 478은 서열 462에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 479는 서열 463에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 480은 서열 472에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 481은 서열 471의 가능한 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된 부분 아미노산 서열이다.
서열 482는 서열 471의 제2의 가능한 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된 부분 아미노산 서열이다.
서열 483은 서열 467에 의해 암호화된 부분 아미노산 서열이다.
서열 484는 서열 466의 가능한 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된 부분 아미노산 서열이다.
서열 485는 서열 466의 제2의 가능한 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된 부분 아미노산 서열이다.
서열 486은 서열 465에 의해 암호화된 부분 아미노산 서열이다.
서열 487은 서열 464에 의해 암호화된 부분 아미노산 서열이다.
서열 488은 O772P의 세포외, 경막 및 세포질 영역을 제시한다.
서열 489는 O772P의 추정 세포외 도메인을 제시한다.
서열 490은 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 491은 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #6의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 492는 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #7의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 493은 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #8의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 494는 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #9의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 495는 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #11의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 496은 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #13의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 497은 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #22의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 498은 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #24의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 499는 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #27의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 500은 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #40의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 501은 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #41의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 502은 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #47의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 503은 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #50의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 504는 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #51의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 505는 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #52의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 506은 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #53의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 507은 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #58의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 508은 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #59의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 509는 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #60의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 510은 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #61의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 511은 O772P 특이적 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드 #71의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 512(O772P 반복물 1)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 21에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 513(O772P 반복물 2)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 20에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 514(O772P 반복물 3)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 19에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 515(O772P 반복물 4)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 18에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 516(O772P 반복물 5)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호17에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 517(HP 반복물 1)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 21에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 518(HP 반복물 2)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 20에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 519(HP 반복물 3)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 19에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 520(HP 반복물 4)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 18에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 521(HP 반복물 5)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 17에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 522(HP 반복물 6 5'-말단)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 16에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 523(1043400.1 반복물 1)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 9에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 524(1043400.1 반복물 2)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 10에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 525(1043400.1 반복물 3)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 10/11에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 526(1043400.1 반복물 4)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 11에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 527(1043400.1 반복물 5)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 14에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 528(1043400.1 반복물 6)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 17에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 529(1043400.3 반복물 1)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 20에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 530(1043400.3 반복물 2)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 21에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 531(1043400.5 반복물 1)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 8에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 532(1043400.5 반복물 2)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 9에 상응하고, 또한 인트론 서열을 함유하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 533(1043400.5 반복물 2)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 9에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 534(1043400.8 반복물 1)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 17에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 535(1043400.8 반복물 2)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 18에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 536(1043400.8 반복물 3)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 19에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 537(1043400.9 반복물 1)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 4에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 538(1043400.9 반복물 2)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 5에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 539(1043400.9 반복물 3)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 7에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 540(1043400.9 반복물 4)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 8에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 541(1043400.11 반복물 1)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 1에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 542(1043400.11 반복물 2)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 2에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 543(1043400.11 반복물 3)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 3에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 544(1043400.11 반복물 4)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 11에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 545(1043400.11 반복물 5)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 12에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 546(1043400.12 반복물 1)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물번호 20에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 547(PB 반복물 A)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 1에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 548(PB 반복물 B)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 2에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 549(PB 반복물 E)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 3에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 550(PB 반복물 G)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 4에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 551(PB 반복물 C)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 4에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 552(PB 반복물 H)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 6에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 553(PB 반복물 J)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 7에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 554(PB 반복물 K)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 8에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 555(PB 반복물 D)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 9에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 556(PB 반복물 I)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 10에상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 557(PB 반복물 M)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 11에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 558(PB 반복물 9)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 12에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 559(PB 반복물 8.5)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 13에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 560(PB 반복물 8)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 14에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 561(PB 반복물 7)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 15에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 562(PB 반복물 6)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 16에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 563(PB 반복물 5)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 17에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 564(PB 반복물 4)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 18에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 565(PB 반복물 3)는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 19에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 566(PB 반복물 2)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 20에상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 567(PB 반복물 1)은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 21에 상응하는 cDNA 서열의 예를 제시한다.
서열 568은 3' 불변 영역으로부터의 cDNA 서열을 제시한다.
서열 569는 21개의 반복물의 컨센서스 서열, 3' 불변 영역 및 3' 비해독된 영역을 함유하는 cDNA 서열을 제시한다.
서열 570은 컨센서스 반복 서열의 cDNA 서열을 제시한다.
서열 571은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 1의 제1의 잠재적 오픈 리딩 프레임의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 572는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 1의 제2의 잠재적 오픈 리딩 프레임의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 573은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 1의 제3의 잠재적 오픈 리딩 프레임의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 574는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 2의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 575는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 3의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 576은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 4의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 577은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 5의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 578은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 6의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 579는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 7의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 580은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 8의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 581은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 9의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 582는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 10의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 583은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 11의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 584는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 12의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 585는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 13의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 586은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 14의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 587은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 15의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 588은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 16의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 589는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 17의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 590은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 18의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 591은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 19의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 592는 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 20의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 593은 O772P의 5' 가변 영역으로부터의 반복물 번호 21의 컨센서스 아미노산 서열을 제시한다.
서열 594는 3' 불변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열 595는 21개의 반복물의 컨센서스 서열 및 3' 불변 영역을 함유하는 아미노산 서열을 제시한다.
서열 596은 컨센서스 반복 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
도 1A 내지 1S(서열 1-71)는 대표적인 분비된 난소 암종 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 부분 서열을 도시한다.
도 2A 내지 2C는 도 1의 클론 중 3개에 대한 전체 삽입물 서열을 도시한다.도 2A는 O7E로 명명된 서열(11731; 서열 72)을 나타낸 것이다. 도 2B는 O9E로 명명된 서열(11785; 서열 73)을 제시하고, 도 2C는 O8E로 명명된 서열(13695; 서열 74)을 제시한다.
도 3은 O8E로 명명된 난소 암종 서열의 마이크로어레이 발현 분석의 결과를 제시한다.
도 4는 사람 T-세포 백혈병 바이러스 I형 발암 단백질 TAX와 오스테오넥틴 사이의 스플라이스 융합물인 난소 암종 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(3g로 명명; 서열 75)의 부분 서열을 제시한다.
도 5는 3f로 명명된 난소 암종 폴리뉴클레오타이드(서열 76)를 제시한다.
도 6은 6b로 명명된 난소 암종 폴리뉴클레오타이드(서열 77)를 제시한다.
도 7A 및 도 7B는 8e 및 8h로 명명된 난소 암종 폴리뉴클레오타이드(각각 서열 78 및 79)를 제시한다.
도 8은 12c로 명명된 난소 암종 폴리뉴클레오타이드(서열 80)를 제시한다.
도 9는 12h로 명명된 난소 암종 폴리뉴클레오타이드(서열 81)를 제시한다.
도 10은 3f로 명명된 난소 암종 서열의 마이크로어레이 발현 분석의 결과를 도시한다.
도 11은 6b로 명명된 난소 암종 서열의 마이크로어레이 발현 분석의 결과를 도시한다.
도 12는 8e로 명명된 난소 암종 서열의 마이크로어레이 발현 분석의 결과를 도시한다.
도 13은 12c로 명명된 난소 암종 서열의 마이크로어레이 발현 분석의 결과를 도시한다.
도 14는 12h로 명명된 난소 암종 서열의 마이크로어레이 발현 분석의 결과를 도시한다.
도 15A 내지 15EEE는 대표적인 분비된 난소 암종 항원을 암호화하는 추가의 폴리뉴클레오타이드(서열 82 내지 310)의 부분 서열을 도시한다.
도 16은 전장 서열내에서 여러 부분적인 O8E 서열의 위치를 도해한 다이아그램이다.
도 17은 O8E 단백질 상에서의 에피토프 지도화 연구 결과를 도시하는 그래프이다.
도 18은 OE8 세포 표면 발현의 형광 활성화 세포 분류(FACS: fluorescence activated cell sorting) 분석의 그래프이다.
도 19는 OE8 세포 표면 발현의 FACS 분석의 그래프이다.
도 20은 OE8의 세포 표면 발현을 입증하는 O8E 형질감염된 HEK293 세포에 대한 FACS 분석 결과를 제시한다.
도 21은 OE8의 세포 표면 발현을 입증하는 SKBR3 유방 종양 세포에 대한 FACS 분석 결과를 제시한다.
도 22는 HEK 293 세포내에서의 OE8 발현을 제시한다. 세포를 항-OE8 토끼 폴리클로날 항혈청 #2333L로 프로빙시킨다.
도 23은 항-OE8 토끼 혈청의 ELISA 분석 결과를 제시한다.
도 24는 친화성 정제된 토끼 항-OE8 폴리클로날 항체의 ELISA 분석 결과를 제시한다.
도 25는 아미노산 61-80에 대한 mAb가 리간드 내재화를 제시하는 항-OE8 mAb의 항체 내재화를 측정하는 그래프이다.
본 발명은 일반적으로 난소암 치료법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 난소 암종 단백질의 적어도 일부분을 포함하는 폴리펩타이드 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 상기 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 항체 및 면역계 세포에 관한 것이다. 이러한 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 항체 및 세포를 난소암 치료용 백신 및 약제학적 조성물에서 사용할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 일반적으로 난소암과 같은 암의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본원에 기술된 조성물은 면역원성 폴리펩타이드, 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드에 결합하는 항체와 같은 결합제, 항원 제시 세포(APC) 및/또는 면역계 세포(예, T 세포)를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 일반적으로 난소 암종 단백질 또는 이의 변이체의 적어도 면역원성 부분을 포함한다. 특정 난소 암종 단백질은 면역검정 기술을 사용하여 동정되었으며, 본원에서는 난소 암종 항원으로 인용된다. "난소 암종 항원"은 난소암 세포(바람직하게는 사람 세포)에 의해 정상적인 난소 세포에서의 수준보다 2배 이상 높은 수준으로 발현되는 단백질이다. 특정 난소 암종 항원은 사람 난소암이 이식된 면역결핍 동물로부터의 혈청에 대해 생성된 항혈청과 (ELISA 또는 웨스턴 블롯과 같은 면역검정에서) 검출가능한 정도로 반응한다. 이러한 난소 암종 항원은 난소암으로부터 면역결핍 동물의 혈청내로 유출되거나 분비된다. 따라서, 본원에 제공된 특정 난소 암종 항원은 분비된 항원이다. 본 발명의 특정핵산 서열은 일반적으로 이러한 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열, 또는 이러한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 난소암내에서의 변형된 발현을 평가하는 기술을 사용하여 동정된 난소 암종 서열을 제공한다. 상기 서열은 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 서열일 수 있다. 난소 암종 서열은 일반적으로 본원에 제공된 대표적인 검정을 사용하여 측정한 바와 같이, 난소암에서 정상적인 난소 조직에서의 발현 수준보다 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상 높은 수준으로 발현된다. 특정한 부분적인 난소 암종 폴리뉴클레오타이드 서열이 본원에 제시되어 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열(또는 이의 보체)을 포함하는 유전자에 의해 암호화된 단백질은 또한 난소 암종 단백질로 고려된다.
항체는 일반적으로 본원에 기술된 바와 같은 난소 암종 폴리펩타이드의 적어도 일부분에 결합할 수 있는 면역계 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이다. 본원에 제공된 조성물에 사용될 수 있는 T 세포는 이러한 폴리펩타이드에 대해 특이적인 T 세포(예, CD4+및/또는 CD8+)이다. 본원에 기술된 특정 방법은 추가로 본원에서 제공된 바와 같은 난소 암종 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제시 세포(예, 수지상 세포 또는 대식세포)를 이용한다.
난소 암종 폴리뉴클레오타이드
본원에 기술된 바와 같은 난소 암종 단백질 또는 이의 일부분 또는 기타 변이체를 암호화하는 임의의 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 포함된다. 바람직한 폴리뉴클레오타이드는 난소 암종 단백질의 일부분을 암호화하는 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드, 바람직하게는 30개 이상의 연속 뉴클레오타이드, 및 보다 바람직하게는 45개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. 보다 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 난소 암종 항원과 같은 난소 암종 단백질의 면역원성 부분을 암호화한다. 이러한 서열에 상보적인 임의의 폴리뉴클레오타이드도 또한 본 발명에 포함된다. 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄(암호화 또는 안티센스) 또는 이본쇄일 수 있으며, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. 추가의 암호화 또는 비암호화 서열은 반드시 필요한 것은 아니지만, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드내에 존재할 수 있으며, 폴리뉴클레오타이드는 반드시 필요한 것은 아니지만, 다른 분자 및/또는 지지재에 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 천연 서열(즉, 난소 암종 단백질 또는 이의 부분을 암호화하는 내인성 서열)을 포함하거나 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 암호화된 폴리펩타이드의 면역원성이 천연 난소 암종 단백질에 비하여 감소되지 않도록 하는 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 수 있다. 암호화된 폴리펩타이드의 면역원성에 대한 영향은 일반적으로 본원에 기술된 바와 같이 평가할 수 있다. 변이체는 바람직하게는 천연 난소 암종 단백질 또는 이의 일부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 약 70% 이상의 동일성을 나타내며, 보다 바람직하게는 약 80% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성을 나타낸다.
2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열에 대한 동일성 비율은 데폴트 변수를 사용하여 Megalign과 같이 당업자에게 익히 공지된 컴퓨터 알고리듬을 사용하여 서열을 비교함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 2개 서열 사이의 비교는 전형적으로는 비교 창에서 서열을 비교하여 서열 유사성의 국부 영역을 동정 및 비교함으로써 수행한다. 본원에 사용된 바와 같은 "비교 창"은 2개 서열을 최적으로 정렬한 후, 한 서열을 동일한 수의 연속 위치의 참조 서열과 비교할 수 있는 약 20개 이상, 보통 30 내지 약 75개, 또는 40 내지 약 50개 연속 위치의 단편을 가리킨다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, 데폴트 변수를 사용하여 바이오인포매틱스 소프트웨어(DNASTAR, Inc., Madison, WI)의 Lasergene 스위트내의 Megalign 프로그램을 사용하여 실시할 수 있다. 바람직하게는, 서열 동일성의 비율은 약 20개 위치 이상의 비교 창을 통해 최적으로 정렬된 2개 서열을 비교함으로써 결정하며, 여기서, 비교 창에서 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 일부분은 (부가 또는 결실을 함유하지 않는) 참조 서열과 비교하여 20% 이하, 보통 5 내지 15% 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 서열 동일성의 비율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 2개 서열에서 존재하는 위치의 수를 결정하여 정합된 위치의 수를 산출하고, 정합된 위치의 수를 참조 서열내 위치의 총수(즉, 창 크기)로 나누며, 이 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 비율을 산출함으로써 산정할 수 있다.
변이체는 또한 또는 달리, 천연 유전자 또는 이의 일부분 또는 보체와 실질적으로 상동성일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 변이체는 천연 난소 암종단백질을 암호화하는 천연 DNA 서열(또는 상보적인 서열)과 중간 정도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있다. 적합한 중간 정도의 엄격한 조건은 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 용액에서 예비 세척하고, 50℃ 내지 65℃, 5 X SSC에서 밤새 하이브리드화한 후, 매회 65℃에서 20분 동안 0.1% SDS를 함유한 2X, 0.5X 및 0.2X SSC로 2회 세척함을 포함한다.
유전자 암호의 축퇴 결과로서 본원에서 기술된 바와 같이 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 다수 존재한다는 것은 당업자라면 인지할 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드 가운데 일부는 모든 천연 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 최소의 상동성을 보유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈 용법에서의 차이로 인해 변화하는 폴리뉴클레오타이드는 특이적으로 본 발명에 의해 고려된다. 또한, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 대립형질은 본 발명의 범주에 속한다. 대립형질은 뉴클레오타이드의 결실, 부가 및/또는 치환과 같은 하나 이상의 변이 결과로서 변형되는 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은 반드시 필요한 것은 아니지만, 변형된 구조 또는 기능을 가질 수 있다. 대립형질은 표준 기술(예를 들어, 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 동정할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 임의의 여러 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 난소 암종 폴리뉴클레오타이드는 이하에 보다 자세히 설명된 바와 같이 말기 진행 난소암 발현 라이브러리를 말기 진행 난소암이 이식된 SCID 마우스로부터의 혈청을 마우스에 주사한 후에 면역적격 마우스의 혈청에 대해 생성된 항혈청으로선별함으로써 동정할 수 있다. 난소 암종 폴리뉴클레오타이드는 또한 차별적인 유전자 발현을 평가하기 위해 디자인된 임의의 여러 기술을 사용하여 동정할 수 있다. 다른 방법으로서, 폴리뉴클레오타이드는 난소암 세포로부터 제조된 cDNA로부터 증폭시킬 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통해 증폭시킬 수 있다. 이 방법의 경우, 서열-특이적 프라이머는 본원에 제공된 서열을 기초로 하여 디자인할 수 있으며, 구입하거나 합성할 수 있다.
증폭된 부분은 익히 공지된 기술을 사용하여 적합한 라이브러리(예, 난소 암종 cDNA 라이브러리)로부터 전장 유전자를 분리하는데 사용할 수 있다. 이러한 기술내에서, 라이브러리(cDNA 또는 게놈)는 증폭에 적합한 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 사용하여 선별한다. 바람직하게는, 라이브러리는 좀더 큰 분자를 포함하도록 크기별로 선별한다. 랜덤 프라이밍된 라이브러리가 또한 유전자의 5' 및 상류 영역을 동정하는데 바람직할 수 있다. 게놈 라이브러리는 인트론을 수득하고 5' 서열을 신장하는데 바람직하다.
하이브리드화 기술의 경우, 익히 공지된 기술을 사용하여 부분 서열을 (예를 들어,32P를 사용한 닉(nick)-해독 또는 말단-표지에 의해) 표지시킬 수 있다. 다음, 변성된 세균 콜로니를 함유한 필터(또는 파아지 플라그를 함유한 론)를 표지된 프로브와 하이브리드화하여 세균 또는 박테리오파아지 라이브러리를 선별한다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989]. 하이브리드화하는 콜로니또는 플라그를 선별하고 증식시킨 다음, 추가의 분석을 위해 DNA를 분리한다. cDNA 클론은, 예를 들어, 벡터로부터의 프라이머 및 부분 서열로부터의 프라이머를 사용하여 PCR을 실시함으로써 추가 서열의 양을 결정하여 분석할 수 있다. 제한 지도 및 부분 서열을 생성시켜, 하나 이상의 중복 클론을 동정할 수 있다. 이어서, 일련의 결실 클론을 생성시킴을 포함할 수 있는 표준 기술을 사용하여 완전한 서열을 결정할 수 있다. 다음, 생성된 중복 서열을 하나의 연속 서열로 어셈블링시킨다. 전장 cDNA 분자는 익히 공지된 기술을 사용하여 적합한 단편을 연결시킴으로써 생성시킬 수 있다.
달리, 부분적인 cDNA 서열로부터 전장 암호화 서열을 수득하기 위한 다수의 증폭 기술이 있다. 이러한 기술내에서, 증폭은 일반적으로 PCR을 통해 수행한다. 임의의 다양한 키트 시판품을 사용하여 증폭 단계를 수행할 수 있다. 프라이머는, 예를 들어, 당해 분야에 익히 공지된 소프트웨어를 사용하여 디자인할 수 있다. 프라이머는 바람직하게는 길이가 22 내지 30개의 뉴클레오타이드이고, 50% 이상의 GC 함량을 갖고 있으며, 약 68℃ 내지 72℃의 온도에서 표적 서열에 어닐링한다. 증폭된 영역을 상기한 바와 같이 서열분석하고, 중복 서열을 연속 서열로 어셈블링시킬 수 있다.
이러한 한가지 증폭 기술은 제한 효소를 사용하여 유전자의 공지된 영역에서 단편을 생성하는 역 PCR[참조: Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186, 1988]이다. 다음, 단편을 분자내 연결에 의해 폐환시키고, 공지된 영역으로부터 유도된 상이한 프라이머로 PCR을 하기 위한 주형으로서 사용한다. 별법에서, 부분 서열에인접한 서열은 링커 서열에 대한 프라이머 및 공지된 영역에 특이적인 프라이머로 증폭시켜 복구할 수 있다. 증폭된 서열은 전형적으로 동일한 링커 프라이머 및 공지된 영역에 대해 특이적인 제2 프라이머로 이차 증폭에 적용시킨다. 공지된 서열로부터 반대 방향으로 신장을 개시하는 2개의 프라이머를 사용하는 이와 같은 방법에 대한 변형은 WO 제96/38591호에 기술되어 있다. 추가의 기술은 포획 PCR[참조: Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19, 1991] 및 워킹 PCR[참조: Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60, 1991]을 포함한다. 증폭을 이용하는 다른 방법을 또한 사용하여 전장 cDNA 서열을 수득할 수 있다.
특정 예에 있어서, GenBank로부터 입수가능한 것과 같은 발현된 서열 태그(EST) 데이터베이스에서 제공된 서열의 분석에 의해 전장 cDNA 서열을 수득할 수 있다. 중복 EST에 대한 조사는 일반적으로 익히 공지된 프로그램(예, NCBI BLAST 조사)을 사용하여 실시할 수 있으며, 이러한 EST는 연속적인 전장 서열을 생성시키는데 사용할 수 있다.
난소 암종 항원의 일부를 암호화하는 cDNA 분자의 특정 핵산 서열이 도 1A 내지 1S(서열 1 내지 71) 및 도 15A 내지 15EEE(서열 82 내지 310)에 제시되어 있다. 도 1A 내지 1S에 제시된 서열은 신규한 것으로 보인다. 도 15A 내지 15EEE에 제시된 서열의 경우, 데이터베이스 조사 결과 실질적인 동일성을 갖는 정합이 드러난다. 이들 폴리뉴클레오타이드는 분비된 종양 항원을 동정하기 위해 디자인된 기술을 사용한 난소암 cDNA 발현 라이브러리의 혈청학적 선별에 의해 분리한다. 간략하게, 말기 진행 난소암 발현 라이브러리를 벡터 λ-스크린(제조원: Novagen)에서 SCID-유도된 사람 난소암(OV9334)으로부터 제조한다. 선별을 위해 사용된 혈청은 말기 진행 난소암이 이식된 SCID 마우스로부터의 혈청을 면역적격 마우스에 주사하여 수득한다. 이러한 기술은 분비된 종양 항원의 면역원성 부분을 암호화하는 cDNA 분자를 동정하는 것을 가능하게 한다.
본원에 제시된 폴리뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 이러한 서열을 포함하는 전장 폴리뉴클레오타이드, 이러한 전장 폴리뉴클레오타이드의 다른 부분 및 이러한 전장 분자의 전부 또는 일부에 상보적인 서열이 본 발명에 특이적으로 포함된다. 상기 기술은 또한 다른 유형의 종양으로부터 분비되는 항원을 동정하는데 적용될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
난소 암종 단백질의 부분을 암호화하는 cDNA 분자의 다른 핵산 서열이 도 4 내지 9(서열 75 내지 81) 및 서열 313 내지 384에 제공되어 있다. 이들 서열은 종양-연관된 발현(즉, 본원에서 제공된 대표적인 검정을 사용하여 측정한 바, 정상 난소 조직에 비하여 난소암에서 5배 이상 높은 발현)에 대한 cDNA의 마이크로어레이를 선별함으로써 동정한다. 이러한 선별은 제조업자의 지침에 따라 및 필수적으로 문헌[참조: Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996 and Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155, 1997]에 기술된 바에 따라 Synteni 마이크로어레이(Palo Alto, CA)를 사용하여 실시한다. 서열 311 및 391은 이들 핵산 서열 일부가 혼입된 전장 서열이다.
임의의 다양한 익히 공지된 기술을 사용하여 cDNA의 종양-연관된 발현을 평가할 수 있다. 예를 들어, 표지된 폴리뉴클레오타이드 프로브를 사용한 하이브리드화 기술을 이용할 수 있다. 달리 또는 또한, 실시간 PCR과 같은 증폭 기술을 사용할 수 있다[참조: Gibson et al., Genome Research 6:995-1001, 1996; Heid et al., Genome Research 6:986-994, 1996]. 실시간 PCR은 증폭 동안에 PCR 산물의 축적 수준을 평가하는 기술이다. 이 기술에 의해 다수의 샘플에서 mRNA 수준의 정량적 평가가 가능하다. 간략하게, mRNA를 종양 및 정상 조직으로부터 추출하고, cDNA를 표준 기술을 사용하여 제조한다. 실시간 PCR은, 예를 들어, 7700 프리즘 장비(제조원: Perkin Elmer/Applied Biosystems; Foster City, CA)를 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 프라이머 발현 프로그램(공급원: Perkin Elmer/Applied Biosystems; Foster City, CA)을 사용하여 정합 프라이머 및 형광 프로브를 해당 유전자에 대해 디자인할 수 있다. 프라이머 및 프로브의 최적 농도는 처음에 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 대조군(예, β-액틴) 프라이머 및 프로브는, 예를 들어, 제조원(Perkin Elmer/Applied Biosystems; Foster City, CA)으로부터 구입할 수 있다. 샘플 중의 특정 RNA의 양을 정량화하기 위해, 해당 유전자를 함유한 플라스미드를 사용하여 표준 곡선을 나란히 생성시킨다. 표준 곡선은 검정에서 사용된 최초 cDNA 농도와 연관이 있는 실시간 PCR에서 생성된 Ct 값을 사용하여 생성시킬 수 있다. 해당 유전자의 10 내지 106개 복사체 범위의 표준 희석률이 일반적으로 충분하다. 또한, 표준 곡선을 대조군 서열에 대해 생성시킨다. 이것은 비교 목적상 대조군 양에 대한 조직 샘플의 초기 RNA 함량의 표준화를 가능하게 한다.
폴리뉴클레오타이드 변이체는 일반적으로 고체 상 포스포르아미다이트 화학합성에 의한 화학적 합성을 포함하여 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열에서의 변형은 또한 올리고뉴클레오타이드-지시된 부위-특이적 돌연변이 유발과 같은 표준 돌연변이 유발 기술을 사용하여 달성할 수 있다[참조: Adelman et al., DNA 2:183, 1983]. 달리, RNA 분자는 DNA가 적합한 RNA 폴리머라제 프로모터(T7 또는 SP6)를 갖는 벡터내로 삽입되는 한, 난소 암종 항원을 암호화하는 DNA 서열 또는 이의 일부분의 시험관내 또는 생체내 전사에 의해 생성시킬 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 특정 부분을 사용하여 암호화된 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 또한 또는 달리, 일부분을 환자에 투여하여 암호화된 폴리펩타이드를 생체내에서 생성시킬 수 있다.
암호화 서열에 상보적인 서열(즉, 안티센스 폴리뉴클레오타이드)의 일부분은 또한 프로브로서 또는 유전자 발현을 조절하기 위해 사용할 수 있다. 안티센스 RNA로 전사될 수 있는 cDNA 작제물이 또한 세포 또는 조직내로 도입되어 안티센스 RNA의 생성을 촉진시킬 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기술된 바와 같이 사용되어 난소 암종 단백질의 발현을 억제할 수 있다. 안티센스 기술은 삼중-나선 형성을 통해 유전자 발현을 조절하는데 사용할 수 있으며, 삼중-나선 형성은 이중 나선이 폴리머라제, 전사 인자 또는 조절 분자의 결합을 위해 충분히 개열하는 능력을 저해한다[참조: Gee et al., In Huber and Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY; 1994]. 달리, 안티센스 분자는 유전자의 조절 영역(예, 프로모터, 인핸서 또는 전사 개시 부위)과 하이브리드화하고, 유전자의 전사를 차단하거나; 리보좀에 대한 전사체의 결합을 억제함으로써 해독을 차단하도록 디자인할 수 있다.
임의의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 생체내에서 안정성이 증가하도록 변형시킬 수 있다. 가능한 변형으로는 5' 및/또는 3'-말단에 플랭킹 서열의 부가, 골격에서 포스포디에스터라제 결합이 아닌 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용, 및/또는 이노신, 큐에오신 및 와이부토신과 같은 비전통적인 염기뿐만 아니라 아데닌, 시티딘, 구아닌 및 우리딘의 아세틸-, 메틸-, 티오- 및 기타 변형된 형태의 삽입을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 기술된 뉴클레오타이드 서열은 확립된 재조합 DNA 기술을 사용하여 다른 여러 뉴클레오타이드 서열에 연결시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드를 플라스미드, 파아지미드, 람다 파아지 유도체 및 코스미드를 포함한 다양한 클로닝 벡터내로 클로닝시킬 수 있다. 특정 해당 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 서열분석 벡터를 포함한다. 일반적으로, 벡터는 하나 이상의 유기체에서 작용하는 복제 기점, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선별 마커를 함유한다. 다른 요소들이 목적하는 용도에 따라 사용될 수 있으며, 이들은 당업자에게 자명할 것이다.
특정한 양태에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 포유동물의 세포내로 도입되어 발현이 이루어질 수 있도록 제형화시킬 수 있다. 이러한 제형은 하기된 바와 같이 치료 목적에 특히 유용하다. 표적 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 달성하기 위한 다수의 방법이 있으며, 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다는 것은 당업자는 인지할 것이다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 레트로바이러스 또는 백시니아 또는 기타 수두 바이러스(예, 조류 수두 바이러스)와 같은 바이러스 벡터내로 삽입시킬 수 있다. DNA를 이러한 벡터내로 삽입하기 위한 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 레트로바이러스 벡터는 추가로 선별 마커용 유전자(형질도입된 세포의 동정 또는 선별을 보조하기 위해) 및/또는 특정 표적 세포상의 수용체에 대한 리간드를 암호화하는 유전자와 같은 표적화 잔기를 전이시키거나 삽입하여 벡터가 표적에 대해 특이적이 되도록 만들 수 있다. 표적화는 또한 당업자에게 공지된 방법에 의해 항체를 사용하여 달성할 수 있다.
치료 목적을 위한 다른 제형은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미세구, 비드와 같은 교질성 분산 시스템 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질계 시스템을 포함한다. 시험관내 또는 생체내에서 전달 비히클로서 사용하기에 바람직한 교질성 시스템은 리포좀(즉, 인공적인 막 소포)이다. 이러한 시스템의 제조 및 사용은 당해 분야에 익히 공지되어 있다.
난소 암종 폴리펩타이드
본 발명의 맥락내에서, 폴리펩타이드는 본원에 기술된 바와 같이 난소 암종 단백질 또는 이의 변이체의 적어도 면역원성 부분을 포함할 수 있다. 상기한 바와 같이, 특정 난소 암종 단백질은 난소암 세포에 의해 발현되고 면역검정(예, ELISA)에서 난소 암종이 이식된 면역결핍 동물로부터의 혈청에 대해 생성된 항혈청과 검출가능한 정도로 반응하는 난소 암종 항원이다. 다른 난소 암종 단백질이 본원에서 제공된 난소 암종 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다. 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩타이드는 임의의 길이일 수 있다. 천연 단백질로부터 유래된 추가의 서열 및/또는 이종 서열이 존재할 수 있으며, 이러한 서열은 추가의 면역원성 또는 항원성 특성을 보유할 수 있다(하지만, 반드시 보유하는 것은 아니다).
본원에 사용된 바와 같은 "면역원성 부분"은 B-세포 및/또는 T-세포 표면 항원 수용체에 의해 인식되는(즉, 특이적으로 결합되는) 항원의 부분이다. 이와 같은 면역원성 부분은 일반적으로 난소 암종 단백질 또는 이의 변이체 중 5개 이상의 아미노산 잔기를 포함하며, 보다 바람직하게는 10개 이상, 및 보다 더 바람직하게는 20개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직한 면역원성 부분은 본원에 기술된 바와 같이 분리된 cDNA 분자에 의해 암호화된다. 또한, 면역원성 부분은 일반적으로 문헌[참조: Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993)] 및 본원에 인용된 참조 문헌에 요약된 바와 같은 익히 공지된 기술을 사용하여 동정할 수 있다. 이러한 기술은 난소 암종 단백질-특이적 항체, 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력에 대해 폴리펩타이드를 선별함을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 항혈청 및 항체는 이들이 난소 암종 단백질과 특이적으로 결합하는 경우(즉, 이들이 ELISA 또는 다른 면역검정에서 난소 암종 단백질과 반응하고 비관련된 단백질과 검출가능한 정도로 반응하지 않는 경우) "난소 암종 단백질-특이적"이다. 이러한 항혈청, 항체 및 T 세포는 본원에 기술된 바와 같이 및 익히 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 천연 난소 암종 단백질의 면역원성 부분은 (예를 들어, ELISA 및/또는 T-세포 반응성 검정에서) 이러한항혈청, 항체 및/또는 T-세포와 전장 폴리펩타이드의 반응성보다 실질적으로 적지 않은 수준으로 반응하는 부분이다. 이러한 면역원성 부분은 이러한 검정에서 전장 단백질의 반응성과 비슷하거나, 이보다 큰 수준으로 반응할 수 있다. 이러한 선별은 일반적으로 문헌[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 기술된 방법과 같은 당업자에게 익히 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드를 고체 지지체 상에 고정하고, 환자의 혈청과 접촉시켜 혈청내의 항체가 고정된 폴리펩타이드에 결합하도록 할 수 있다. 다음, 비결합된 혈청을 제거하고, 결합된 항체를, 예를 들어,125I-표지된 단백질 A를 사용하여 검출할 수 있다.
상기한 바와 같이, 조성물은 천연 난소 암종 단백질의 변이체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드 "변이체"는 천연 난소 암종 단백질과 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 의해 상이하나 폴리펩타이드의 면역원성이 실질적으로 감소되지 않은 폴리펩타이드이다. 즉, 변이체가 난소 암종 단백질-특이적 항혈청과 반응하는 능력은 천연 난소 암종 단백질에 비해 증가되거나 불변일 수 있거나, 천연 난소 암종 단백질에 비해 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만으로 감소할 수 있다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩타이드 서열 가운데 하나를 변형시켜, 변형된 폴리펩타이드와 난소 암종 단백질-특이적 항체 또는 항혈청과의 반응을 본원에 기술된 바와 같이 평가함으로써 동정할 수 있다. 바람직한 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 경막 도메인과 같은 하나 이상의 부분이제거된 변이체를 포함한다. 다른 바람직한 변이체는 소형 부분(예, 1 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 5 내지 15개 아미노산)이 성숙 단백질의 N- 및/또는 C-말단으로부터 제거된 변이체를 포함한다.
폴리펩타이드 변이체는 천연 폴리펩타이드와 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 동일성을 나타낸다. 바람직하게는, 변이체는 보존적 치환을 함유한다. "보존적 치환"은 아미노산이 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환되어 결과적으로 펩타이드 화학 분야의 숙련자가 폴리펩타이드의 2차 구조 및 수화도 특성이 실질적으로 불변임을 예상할 수 있는 치환이다. 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성을 기초로 달성할 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산은 아스파트산 및 글루탐산을 포함하고, 양으로 하전된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하고, 유사한 친수성 값을 나타내는 하전되지 않은 극성 헤드 그룹을 갖는 아미노산은 루이신, 이소루이신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다. 보존적 변형을 나타낼 수 있는 아미노산의 다른 그룹은 (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his를 포함한다. 변이체는 또한 또는 달리, 비보존적 변형을 함유할 수 있다. 변이체는 또한(또는 달리), 예를 들어, 폴리펩타이드의 면역원성, 2차 구조 및 수화도에 최소로 영향을 미치는 아미노산의 결실 또는 부가에 의해 변형될 수 있다.
상기한 바와 같이, 폴리펩타이드는 단백질의 전이를 해독과 동시에 또는 해독 후에 지시하는 단백질의 N-말단에서 시그널(또는 리더) 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 이의 편리한 합성, 정제 또는 동정을 위해(예, 폴리-His), 또는 고체 지지체에 폴리펩타이드의 결합을 증가시키기 위해 링커 또는 다른 서열에 결합시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드를 면역글로불린 Fc 영역에 결합시킬 수 있다.
폴리펩타이드는 임의의 익히 공지된 여러 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 상기한 바와 같은 DNA 서열에 의해 암호화된 재조합 폴리펩타이드는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 발현 벡터를 사용하여 DNA 서열로부터 용이하게 제조할 수 있다. 발현은 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 임의의 적합한 숙주 세포에서 달성할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵세포, 효모 및 고등 진핵 세포를 포함한다. 바람직하게는, 사용된 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli), 효모 또는 포유동물 세포주, 예를 들어, COS 또는 CHO이다. 배양 배지내로 재조합 단백질 또는 폴리펩타이드를 분비하는 적합한 숙주/벡터 시스템으로부터의 상청액은 시판되고 있는 필터를 사용하여 우선 농축시킬 수 있다. 농축 후, 농축물은 친화성 매트릭스 또는 이온 교환 수지와 같은 적합한 정제 매트릭스에 적용시킬 수 있다. 마지막으로, 하나 이상의 역상 HPLC 단계를 사용하여 추가로 재조합 폴리펩타이드를 정제할 수 있다.
약 100개 이하의 아미노산, 일반적으로 약 50개 이하의 아미노산을 갖는 부분 및 다른 변이체는 또한 당업자에게 익히 공지된 기술을 사용한 합성 수단에 의해 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리펩타이드는 아미노산이 순차적으로 성장하는 아미노산 쇄에 부가되는 메리필드(Merrifield) 고체 상 합성 방법과 같은 시판중인 임의의 고체 상 기술을 사용하여 합성할 수 있다[참조: Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963]. 폴리펩타이드의 자동 합성 장비는 제조원(Applied BioSystems; Foster City, CA)과 같은 공급업체로부터 구입가능하며, 제조업체의 지침에 따라 작동시킬 수 있다.
특정한 특수 양태에서, 폴리펩타이드는 본원에 기술된 바와 같이 복수의 폴리펩타이드를 포함하거나, 본원에 기술된 바와 같은 하나의 폴리펩타이드 및 난소 암종 단백질 또는 이러한 단백질의 변이체와 같은 공지된 종양 항원을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 융합 파트너는, 예를 들어, T 헬퍼 에피토프, 바람직하게는 사람에 의해 인식된 T 헬퍼 에피토프를 제공하는 것을 보조하거나(면역학적 융합 파트너), 단백질을 천연 재조합 단백질보다 높은 수준으로 발현시키는 것을 보조할 수 있다(발현 인핸서). 특정의 바람직한 융합 파트너는 면역학적이고 발현을 증강시키는 융합 파트너이다. 다른 융합 파트너는 단백질의 용해성을 증가시키거나 단백질이 목적하는 세포내 구획을 표적화할 수 있도록 선택할 수 있다. 또 다른 추가의 융합 파트너는 단백질의 정제를 촉진시키는 친화성 태그를 포함한다.
융합 단백질은 일반적으로 화학적 결합을 포함한 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는, 융합 단백질은 재조합 단백질로서 발현되며, 이로써 발현 시스템에서 비융합된 단백질에 비해 증가된 수준으로 생성되게 한다. 간략하게, 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열은 별도로 어셈블링시키고, 적합한발현 벡터내로 연결시킬 수 있다. 한 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 3'-말단을 펩타이드 링커의 존재 또는 부재하에 제2 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 5'-말단에 연결시켜, 서열의 판독 프레임이 상내에 존재하도록 한다. 이로 인해 양쪽 성분 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 유지시키는 하나의 융합 단백질로의 해독이 가능해진다.
각각의 폴리펩타이드가 이의 2차 및 3차 구조로 확실하게 폴딩하도록 충분한 간격을 두고 제1 및 제2 폴리펩타이드 성분이 분리되도록 펩타이드 링커 서열을 사용할 수 있다. 이러한 펩타이드 링커 서열은 당해 분야에 익히 공지된 표준 기술을 사용하여 융합 단백질내로 삽입한다. 적합한 펩타이드 링커 서열은 다음의 요소를 기준으로 선택될 수 있다: (1) 가요성 연장된 구조를 수용하는 능력; (2) 제1 및 제2 폴리펩타이드 상의 작용성 에피토프와 상호작용할 수 있는 2차 구조를 수용할 수 없는 능력; 및 (3) 폴리펩타이드 작용성 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 또는 하전된 잔기의 결여. 바람직한 펩타이드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 함유한다. 또한, Thr 및 Ala와 같은 거의 중성의 다른 아미노산이 링커 서열에 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열은 문헌[참조: Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8562, 1986; 및 미국 특허 제4,935,233호 및 미국 특허 제4,751,180호]에 기술된 것을 포함한다. 링커 서열의 길이는 1 내지 약 50개의 아미노산일 수 있다. 링커 서열은 제1 및 제2 폴리펩타이드가 작용성 도메인을 분리하고 입체 장애를 방해하는데 사용할 수 있는 비필수 N-말단 아미노산 영역을 갖는 경우에는필요하지 않다.
연결된 DNA 서열은 적합한 전사 또는 해독 조절 요소에 작동적으로 연결된다. DNA의 발현을 맡고 있는 조절 요소는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 5'에만 위치한다. 유사하게는, 해독 및 전사 종결 시그널을 종료하는데 필요한 종결 코돈이 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 3'에만 존재한다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드를 비관련 면역원성 단백질과 함께 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 면역원성 단백질은 면역회상 반응을 나타낼 수 있다. 이러한 단백질의 예는 파상풍, 결핵 및 간염 단백질을 포함한다[참조예: Stoute et al., New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997].
바람직한 양태에서, 면역학적 융합 파트너는 그람-음성 세균 헤모필러스 인플루엔자 B의 표면 단백질인 단백질 D로부터 유도된다[참조: WO 제91/18926호]. 바람직하게는, 단백질 D 유도체는 단백질의 최초 약 1/3(예, 처음 N-말단 100-110개 아미노산)을 포함하며, 단백질 D 유도체는 지질화시킬 수 있다. 특정한 바람직한 양태에서, 지단백질 D 융합 파트너의 처음 109개 잔기가 N-말단에 포함되어 추가의 외인성 T-세포 에피토프를 갖는 폴리펩타이드를 제공하고, 이. 콜라이에서 발현 수준을 증가시킨다(따라서, 발현 인핸서로서 작용함). 지질 꼬리는 항원 제시 세포에 항원의 최적 제시를 보장한다. 다른 융합 파트너는 인플루엔자 바이러스로부터의 비구조적 단백질인 NS1(헤마글루티닌)을 포함한다. 전형적으로는, T-헬퍼 에피토프를 포함하는 상이한 단편을 사용할 수 있더라도, N-말단 81개 아미노산을 사용한다.
또 다른 양태에서, 면역학적 융합 파트너는 LYTA로서 공지된 단백질 또는 이의 부분(바람직하게는 C-말단 부분)이다. LYTA는 아미다제 LYTA[LytA 유전자에 의해 암호화됨; 참조: Gene 43:265-292, 1986]로서 공지된 N-아세틸-L-알라닌 아미다제를 합성하는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터 유도된다. LYTA는 펩티도글리칸 골격에서 특정 결합을 특이적으로 분해하는 자가융해소이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린에 대한 친화성 또는 DEAE와 같은 몇몇 콜린 유사체에 대한 친화성에 관여한다. 이러한 특성은 융합 단백질의 발현에 유용한 플라스미드를 발현시키는 이. 콜라이 C-LYTA의 개발을 위해 연구되어져 왔다. 아미노 말단에 C-LYTA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제는 기술되어 있다[참조: Biotechnology 10:795-798, 1992]. 바람직한 양태에서, LYTA의 반복 부분을 융합 단백질내로 삽입할 수 있다. 반복 부분은 잔기 178에서 시작하는 C-말단 영역에서 발견된다. 특히 바람직한 반복 부분은 잔기 188-305를 포함한다.
일반적으로는, 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩타이드(융합 단백질을 포함) 및 폴리뉴클레오타이드를 분리한다. "분리된" 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 이의 천연 환경으로부터 제거된 것이다. 예를 들어, 천연 단백질은 만일 이것이 자연계에서 함께 존재하는 물질 가운데 일부 또는 전부로부터 분리된 경우 분리된 것이다. 이러한 폴리펩타이드는 바람직하게는 순도가 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 99% 이상이다. 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 이것이 천연 환경의 일부가 아닌 벡터내로 클로닝된 경우에 분리된 것으로 고려된다.
결합제
본 발명은 또한 난소 암종 단백질과 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편과 같은 제제를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 만일 이것이 (예를 들어, ELISA에서) 검출가능한 수준으로 난소 암종 단백질과 반응하고, 유사한 조건하에서 비관련된 단백질과 검출가능한 정도로 반응하지 않는다면 난소 암종 단백질과 "특이적으로 결합하는" 것이라고 말한다. 본원에 사용된 바와 같이, "결합"은 "복합체"가 형성되게 하는 개별적인 두 분자 사이의 비공유 결합을 가리킨다. 결합 능력은, 예를 들어, 복합체의 형성에 대한 결합 상수를 결정함으로써 평가할 수 있다. 결합 상수는 복합체의 농도를 성분 농도의 값으로 나눈 값이다. 일반적으로, 2종의 성분은 본원에 있어서, 복합체 형성의 결합 상수가 약 103L/mol을 초과할 때 "결합한다"라고 말한다. 결합 상수는 당해 분야에 익히 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
결합제는 또한 본원에 제공된 대표적인 검정을 사용하여 난소암과 같은 암을 앓고 있거나 앓고 있지 않은 환자를 구별할 수 있다. 즉, 난소 암종 항원과 결합하는 항체 또는 다른 결합제는 질환을 앓고 있는 환자의 약 20% 이상에서 암의 존재를 나타내는 시그널을 발생하고, 암을 앓고 있지 않은 개체의 약 90% 이상에서 당해 질환의 부재를 가리키는 음성 시그널을 발생한다. 결합제가 이러한 요건을 충족하는지를 결정하기 위해 (표준 임상 시험을 사용하여 결정된 바와 같이) 암을앓고 있지 않는 환자 및 암을 앓고 있는 개체로부터의 생물학적 샘플(예, 혈액, 혈청, 백혈구, 뇨 및/또는 종양 생검)을 결합제와 결합하는 폴리펩타이드의 존재에 대해 본원에 기술된 바와 같이 검정할 수 있다. 질환을 앓고 있는 환자 및 질환을 앓고 있지 않는 개체는 통계학적으로 유의적인 수만큼 검정해야한다는 것은 명백할 것이다. 각 결합제는 상기 기준을 충족해야 한다. 그러나, 당업자는 민감성을 향상시키기 위해 결합제를 배합하여 사용할 수 있음을 인지할 것이다.
상기 요건을 충족하는 임의의 제제는 결합제일 수 있다. 예를 들어, 결합제는 펩타이드 성분, RNA 분자 또는 폴리펩타이드의 유무에 상관없이 리보좀일 수 있다. 바람직한 양태에서, 결합제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 항체는 당업자에게 공지된 임의의 여러 기술에 의해 제조할 수 있다[참조예: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 일반적으로, 항체는 본원에 기술된 바와 같은 모노클로날 항체의 생성을 포함한 세포 배양 기술, 또는 재조합 항체의 생성이 이루어지도록 적합한 세균 또는 포유동물 세포 숙주내로의 항체 유전자의 형질감염을 통해 제조할 수 있다. 한가지 기술로서, 처음에 폴리펩타이드를 포함한 면역원을 다양한 포유동물(예, 마우스, 랫트, 토끼, 양 또는 염소)내로 주사한다. 이 단계에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 변형없이 면역원으로서 작용할 수 있다. 다른 방법으로서, 특히 비교적 짧은 폴리펩타이드의 경우, 이 폴리펩타이드가 소 혈청 알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌과 같은 담체 단백질에 연결된 경우 우수한 면역 반응을 나타낼 수 있다. 면역원은 바람직하게는 1회 이상의 추가 면역화를 포함한 예정된 일정에 따라 동물 숙주에 주사하고, 동물로부터 주기적으로 채혈한다. 이어서, 폴리펩타이드에 대해 특이적인 폴리클로날 항체는 혈청으로부터, 예를 들어, 적합한 고체 지지체에 연결된 폴리펩타이드를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
해당 항원성 폴리펩타이드에 대해 특이적인 모노클로날 항체는, 예를 들어, 문헌[참조: Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976]의 기술 및 이의 개선된 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 간략하게, 이들 방법은 목적하는 특이성(즉, 해당 폴리펩타이드와의 반응성)을 갖는 항체를 생성할 수 있는 불멸 세포주의 제조를 포함한다. 이러한 세포주는, 예를 들어, 상기한 바와 같이 면역화된 동물로부터 수득된 비장 세포로부터 생성될 수 있다. 다음, 비장 세포를, 예를 들어, 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역화 동물과 유전적 동계인 것과의 융합에 의해 불멸화된다. 다양한 융합 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 비장 세포 및 골수종 세포를 수분 동안 비이온성 세제와 배합한 다음, 골수종 세포는 아니지만 하이브리드 세포의 성장을 지지하는 선택 배지에 저밀도로 플레이팅할 수 있다. 바람직한 선택 기술은 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 선택을 사용한다. 충분한 시간, 통상적으로 약 1 내지 2주 후 하이브리드의 콜로니가 관찰된다. 단일 콜로니를 선택하고, 이들의 배양 상청액을 폴리펩타이드에 대한 결합 활성에 대해 시험한다. 고 반응성 및 특이성을 갖는 하이브리도마가 바람직하다.
모노클로날 항체는 성장하는 하이브리도마 콜로니의 상청액으로부터 분리할 수 있다. 또한, 마우스와 같은 적합한 척추동물 숙주의 복강내로 하이브리도마 세포주를 주사하는 것과 같이 여러 기술을 이용하여 수율을 증대시킬 수 있다. 이어서, 복수액 또는 혈액으로부터 모노클로날 항체를 수확할 수 있다. 오염물은 크로마토그래피, 겔 여과, 침전 및 추출과 같은 통상적인 기술에 의해 항체로부터 제거할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 단계의 정제 과정에 사용할 수 있다.
특정한 양태에서, 항체의 항원-결합 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 단편은 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있는 Fab 단편을 포함한다. 간략하게, 면역글로불린을 단백질 A 비드 컬럼 상에서 친화성 크로마토그래피[참조: Harlow and Lane, Antiodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]하여 토끼 혈청으로부터 정제하고, 파파인으로 분해하여 Fab 및 Fc 단편을 수득할 수 있다. Fab 및 Fc 단편은 단백질 A 비드 컬럼상에서 친화성 크로마토그래피하여 분리할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는 하나 이상의 치료제에 결합시킬 수 있다. 이러한 관점에서 적합한 제제는 방사성핵종, 분화 유도제, 약물, 독소 및 이들의 유도체를 포함한다. 바람직한 방사성핵종은90Y,123I,125I,131I,186Re,188Re,211At 및212Bi를 포함한다. 바람직한 약물은 메토트렉세이트 및 피리미딘 및 퓨린 유사체를 포함한다. 바람직한 분화 유도제는 포르볼 에스테르 및 부티르산을 포함한다. 바람직한 독소는 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 젤로닌, 슈도모나스 외독소, 쉬겔라 독소 및 미국자리공 항바이러스 단백질을 포함한다.
치료제는 적합한 모노클로날 항체에 직접적으로 또는 간접적으로(예, 링커그룹을 통해) 연결(예, 공유 결합)될 수 있다. 제제와 항체 사이의 직접적인 반응은 각각이 다른 것과 반응할 수 있는 치환체를 보유할 때 가능하다. 예를 들어, 한쪽 상의 아미노 또는 설프하이드릴 그룹과 같은 친핵성 그룹은 다른 쪽 상의 양호한 이탈 그룹(예, 할라이드)을 함유한 알킬 그룹, 또는 무수물 또는 산 할라이드와 같은 카보닐-함유 그룹과 반응할 수 있다.
달리, 치료제와 항체는 링커 그룹을 통해 결합시키는 것이 바람직할 수 있다. 링커 그룹은 결합에 대한 간섭을 피하기 위해 제제로부터 항체를 격리시키기 위해 스페이서로서 작용할 수 있다. 또한, 링커 그룹은 제제 또는 항체상의 치환체의 화학적 반응성을 증대시키는 작용을 할 수 있으며, 이에 따라 결합능을 증가시켜 준다. 화학 반응성의 증가는 또한 그밖의 경우에는 불가능한 제제 또는 제제상의 작용 그룹의 사용을 촉진할 수 있다.
호모 및 헤테로 작용성에 상관없이 여러 이작용성 또는 다작용성 시약(예, Pierce Chemical Co.(Rockford, IL)의 카달로그에 기술되어 있는 것)이 링커 그룹으로 사용될 수 있음은 당업자에게는 자명할 것이다. 결합은, 예를 들어, 아미노 그룹, 카복실 그룹, 설프하이드릴 그룹 또는 산화된 탄수화물 잔기를 통해 이루어질 수 있다. 이와 같은 방법에 관한 참고 문헌은 다수 있으며, 예로써 로드웰(Rodwell) 등에게 허여된 미국 특허 제4,671,958호를 들 수 있다.
치료제가 본 발명의 면역결합제의 항체 부분으로부터 유리될 때 보다 더 효과적인 경우, 세포내로 내재화하는 동안 또는 내재화할 때 절단가능한 링커 그룹을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 다수의 상이한 절단가능한 링커 그룹이 공개되어 있다. 이들 링커 그룹으로부터 제제의 세포내 방출에 대한 메카니즘은 디설파이드 결합의 환원[예, 스피틀러(Spitler)에게 허여된 미국 특허 제4,489,710호], 광분해성 결합의 방사[예, 센터(Senter) 등에게 허여된 미국 특허 제4,625,014호], 유도체화된 아미노산 측쇄의 가수분해[예, 콘(Kohn) 등에게 허여된 미국 특허 제4,638,045호], 혈청 보체-매개된 가수분해[예, 로드웰 등에게 허여된 미국 특허 제4,671,958호] 및 산-촉매된 가수분해[예, 블라틀러(Blattler) 등에게 허여된 미국 특허 제4,569,789호]에 의한 분해를 포함한다.
하나 이상의 제제를 항체에 결합시키는 것이 바람직할 수 있다. 한 양태에서, 제제의 복수 분자를 하나의 항체 분자에 결합시킨다. 또 다른 국면에서, 제제의 1종 이상의 유형을 하나의 항체에 결합시킬 수 있다. 특정 양태와 상관없이, 하나 이상의 제제를 가진 면역결합체는 다양한 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 제제를 항체 분자에 직접 결합시키거나, 다수의 결합 부위를 제공하는 링커를 사용할 수 있다. 달리, 담체를 사용할 수 있다.
담체는 직접적으로 또는 링커 그룹을 통해 공유 결합을 포함한 여러 방법으로 제제를 보유할 수 있다. 적합한 담체는 알부민[예, 카토(Kato) 등에게 허여된 미국 특허 제4,507,234호]과 같은 단백질, 펩타이드 및 아미노덱스트란[예, 시흐(Shih) 등에게 허여된 미국 특허 제4,699,784호]과 같은 다당류를 포함한다. 담체는 또한 리포좀 소포내에서와 같은 캡슐화 또는 비공유 결합에 의해 제제를 함유할 수 있다[참조예: 미국 특허 제4,429,008호 및 제4,873,088호]. 방사성핵종 제제에 특이적인 담체는 방사능 할로겐화 소분자 및 킬레이트화 화합물을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,735,792호에는 대표적인 방사능 할로겐화 소분자 및 이들의 합성이 기술되어 있다. 방사성핵종 킬레이트제는 금속 또는 금속 산화물, 방사성핵종을 결합시키기 위한 공여 원자로서 질소 및 황 원자를 함유하는 것을 포함하는 킬레이트화 화합물로부터 형성될 수 있다. 예를 들어, 데이비슨(Davison) 등에게 허여된 미국 특허 제4,673,562호에는 대표적인 킬레이트화 화합물 및 이들의 합성이 기술되어 있다.
항체 및 면역결합체를 투여하기 위한 여러 경로를 사용할 수 있다. 전형적으로, 투여는 정맥내, 근육내, 피하 또는 절개된 종양내일 수 있다. 항체/면역결합체의 정확한 용량은 사용된 항체, 종양 상의 항원 밀도 및 항체의 제거율에 따라 변할 수 있음은 명백하다.
또한, 난소 암종 단백질의 면역원성 부분을 모사하는 항이디오타입 항체가 본 발명에서 제공된다. 이러한 항체는 익히 공지된 기술을 사용하여 난소 암종 단백질의 항원성 부분과 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대해 유도할 수 있다. 난소 암종 단백질의 면역원성 부분을 모사하는 항이디오타입 항체는 본원에 기술된 바와 같이, 난소 암종 단백질의 면역원성 부분과 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 결합하는 항체이다.
T 세포
면역치료 조성물은 또한 또는 달리, 난소 암종 단백질에 대해 특이적인 T 세포를 포함한다. 이러한 세포는 일반적으로 표준 절차를 사용하여 시험관내 또는생체내에서 제조할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 CEPRATE™ 시스템(구입원: CellPro Inc., Botell WA)과 같은 세포 분리 시스템 시판품을 사용하여 환자와 같은 포유동물의 골수, 말초혈 또는 이들의 분획내에 존재하거나 이들로부터 분리할 수 있다[참조: 미국 특허 제5,240,856호, 미국 특허 제5,215,926호, WO 제89/06280호, WO 제91/16116호 및 WO 제92/07243호]. 달리, T 세포는 관련되거나 비관련된 사람, 비사람 동물, 세포주 또는 배양물로부터 유도할 수 있다.
T 세포는 난소 암종 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이러한 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제시 세포(APC)로 자극할 수 있다. 이러한 자극은 폴리펩타이드에 대해 특이적인 T 세포를 생성시키기에 충분한 조건하에 및 시간 동안 실시한다. 바람직하게는, 난소 암종 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 미소구와 같은 전달 비히클내에 존재하여 특이적인 T 세포의 생성을 촉진시킨다.
T 세포가 만일 난소 암종 폴리펩타이드로 피복된 표적 세포 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 발현시키는 표적 세포를 사멸시킨다면 이는 난소 암종 폴리펩타이드에 대해 특이적인 것으로 고려된다. T 세포 특이성은 임의의 다양한 표준 기술을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 크롬 방출 검정 또는 증식 검정에서, 용해 및/또는 증식에 있어서 네가티브 대조군에 비하여 2배 이상 증가의 자극 지수는 T 세포 특이성을 가리킨다. 이와 같은 검정은, 예를 들어, 문헌[참조: Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994]에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 달리, T 세포 증식의 검출은 다양한 공지된 기술에 의해 달성할 수있다. 예를 들어, T 세포 증식은 DNA 합성의 증가 속도를 측정함으로써(예, T 세포의 배양물을 삼중수소 티미딘으로 펄스-표지시키고, DNA내로 삽입된 삼중수소 티미딘의 양을 측정함으로써) 검출할 수 있다. 3 내지 7일 동안 난소 암종 폴리펩타이드(200ng/ml 내지 100㎍/ml, 바람직하게는 100ng/ml 내지 25 ㎍/ml)와의 접촉은 T 세포의 증식을 2배 이상 증가시켜야 하고/하거나 상기한 바와 같이 2 내지 3일 동안의 접촉은 표준 사이토킨 검정을 사용하여 측정한 바와 같이, T 세포의 활성화 결과를 초래하며, 이때, 사이토킨(예, TNF 또는 IFN-γ) 방출의 수준이 2배 증가한 것은 T 세포 활성화를 지시한다[참조: Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998)]. 난소 암종 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 난소 암종 폴리펩타이드-발현 APC에 대한 반응으로 활성화된 T 세포는 CD4+및/또는 CD8+일 수 있다. 난소 암종 폴리펩타이드-특이적 T 세포는 표준 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, T 세포는 환자 또는 관련되거나 비관련된 공여자로부터 유도시켜, 자극 및 증식 후에 환자에게 투여한다.
치료 목적상, 난소 암종 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 APC에 반응하여 증식하는 CD4+또는 CD8+T 세포는 시험관내 또는 생체내에서 수적으로 증식시킬 수 있다. 이러한 T 세포의 시험관내 증식은 여러 방법으로 달성할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 난소 암종 폴리펩타이드를 합성하는 자극 세포 및/또는 인터루킨-2와 같은 T 세포 성장 인자를 첨가하거나 첨가하지 않고서 난소 암종 폴리펩타이드에 재노출시킬 수 있다. 달리, 난소 암종 폴리펩타이드의 존재하에 증식하는 하나 이상의 T 세포는 클로닝에 의해 수적으로 증식시킬 수 있다. 세포를 클로닝시키는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 제한 희석을 포함한다. 증식 후 세포는, 예를 들어, 문헌[참조: Chang et al., Crit Rev. Oncol. Hemato. 22:213, 1996]에 기술된 바와 같이 환자에게 재투여할 수 있다.
약제학적 조성물 및 백신
특정 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 결합제 및/또는 면역계 세포를 약제학적 조성물 또는 백신내로 혼입시킬 수 있다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 상기 화합물 또는 세포 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 백신은 하나 이상의 상기 화합물 또는 세포 및 비특이적 면역 반응 증강제를 포함할 수 있다. 비특이적 면역 반응 증강제는 외래 항원에 대해 면역 반응을 증강시키는 임의의 물질일 수 있다. 비특이적 면역 반응 증강제의 예로는 애주번트, 생체분해성 미소구(예, 폴리락트산 갈락타이드) 및 리포좀이 포함된다[화합물은 이들내로 혼입된다; 참조예: 풀러턴(Fullerton), 미국 특허 제4,235,877호]. 백신 제제는 일반적으로 문헌[참조예: M.F. Powell and M.J. Newman, eds., "Vaccine Design(the subunit and adjuvant approach)", Plenum Press (NY, 1995)]에 기술되어 있다. 본 발명의 범주내에 속하는 약제학적 조성물 및 백신은 또한 생물학적으로 활성을 나타내거나 불활성일 수 있는 다른 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 다른 종양 항원의 면역원성 부분 하나 이상이 조성물또는 백신내에서 융합 폴리펩타이드내로 혼입되어 있거나 별도의 화합물로서 존재할 수 있다.
약제학적 조성물 또는 백신은 상기한 바와 같은 폴리펩타이드 중의 하나 이상을 암호화하는 DNA를 함유할 수 있으며, 이에 따라 폴리펩타이드는 원 위치에서 생성된다. 상기한 바와 같이, DNA는 핵산 발현 시스템, 세균 및 바이러스 발현 시스템을 포함하여 당업자에게 공지된 여러 전달 시스템내에 존재할 수 있다. 적합한 핵산 발현 시스템은 환자에게서 발현하기 위해 필요한 DNA 서열(예, 적합한 프로모터 및 종결 시그널)을 함유한다. 세균 전달 시스템은 세포 표면 상에 폴리펩타이드의 면역원성 부분을 발현시키는 세균(예, 바실러스-칼메트-게랑(Bacillus-Calmette-Guerrin))의 투여를 포함한다. 바람직한 양태에서, DNA는 비병원성(결손) 복제적격 바이러스의 사용을 포함할 수 있는 바이러스 발현 시스템(예, 백시니아 또는 다른 수두 바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스)을 사용하여 도입할 수 있다. 적합한 시스템은, 예를 들어, 문헌[참조: Fisher-Hoch et al., PNAS 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; 미국 특허 제4,603,112호, 제4,769,330호 및 제5,017,487호; WO 제89/01973호; 미국 특허 제4,777,127호; 영국 특허 제2,200,651호; 유럽 특허 제0,345,242호; WO 제91/02805호; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., PNAS 91:215-219, 1994; Kass-Eisler et al., PNAS 90:11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; 및 Guzman et al., Cir.Res. 73:1202-1207, 1993]에 기술되어 있다. DNA를 상기 발현 시스템내로 혼입시키는 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 또한, DNA는, 예를 들어, 문헌[참조: Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993]에 기술되어 있고, 문헌[참조: Cohen, Science 259: 1691-1692, 1993]에서 검토된 바와 같이 "나출형"일 수 있다. 나출형 DNA의 흡수는 DNA를 세포내로 효율적으로 이송되는 생체분해성 비드 상에 피복시킴으로써 증가시킬 수 있다.
당업자에게 공지된 임의의 적합한 담체도 본 발명의 약제학적 조성물에 사용할 수 있는 한편, 담체의 유형은 투여 방식에 따라 다양할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 국소, 경구, 비내, 정맥내, 두개골내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여를 포함하여 적합한 투여 방식을 위해 제형화시킬 수 있다. 피하 주사와 같은 비경구 투여의 경우, 담체는 바람직하게는 물, 염수, 알콜, 지방, 왁스 또는 완충액을 포함한다. 경구 투여의 경우에는 상기 담체 또는 고체 담체, 예를 들어, 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로즈, 글루코즈, 수크로즈 및 탄산마그네슘을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 약제 조성물을 위한 담체로서 생체분해성 미소구(예, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)를 사용할 수 있다. 적합한 생체분해성 미소구는 문헌[참조예: 미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호]에 기술되어 있다.
이러한 조성물은 또한 완충액(예, 중성 완충 염수 또는 인산염 완충 염수), 탄수화물(예, 글루코즈, 만노즈, 수크로즈 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예를 들어, 글리신, 산화방지제, 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA 또는 글루타티온, 애주번트, 예를 들어, 수산화알루미늄 및/또는 보존제를 포함할 수 있다. 달리, 본 발명의 조성물은 동결건조물로서 제형화시킬 수 있다. 화합물은 또한 익히 공지된 기술을 사용하여 리포좀내로 캡슐화시킬 수 있다.
임의의 다양한 비특이적 면역 반응 증강제를 본 발명의 백신에 사용할 수 있다. 예를 들어, 애주번트를 포함시킬 수 있다. 대부분의 애주번트는 수산화알루미늄 또는 광유와 같이 급속한 이화작용으로부터 항원을 보호하도록 고안된 물질 및 면역 반응의 자극제[예, 지질 A, 보르타델라 페르투시스(Bortadella pertussis) 또는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유도된 단백질]를 함유한다. 적합한 애주번트는, 예를 들어, 프로인트 불완전 애주번트 및 완전 애주번트(제조원: Difco Laboratories; Detroit, MI), 머크 애주번트 65(제조원: Merck and Company, Inc.; Rahway, NJ), 알룸, 생체분해성 미소구, 모노포스포릴 지질 A 및 퀼 A로서 시판되고 있다. GM-CSF 또는 인터루킨-2, -7 또는 -12와 같은 사이토킨을 또한 애주번트로서 사용할 수 있다.
본원에 제공된 백신에서, 애주번트 조성물은 Th1 유형의 면역 반응을 우점적으로 유도하도록 디자인할 수 있다. 고수준의 Th1-유형 사이토킨(예, IFN-γ, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대한 세포 매개된 면역 반응의 유도를 조력하는 경향이 있다. 대조적으로, 고수준의 Th2-유형 사이토킨(예, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 TNF-β)은 체액성 면역 반응의 유도를 조력하는 경향이 있다. 본원에 제공된 바와 같은 백신의 적용 후 환자는 Th1- 및 Th2-유형 반응을 포함하는 면역 반응을 유지할 것이다. 반응이 우세하게 Th1-유형인 바람직한 양태에서, Th1-유형 사이토킨의 수준은 Th2-유형 사이토킨의 수준보다 큰 정도로 증가할 것이다. 이들 사이토킨의 수준은 표준 검정을 사용하여 용이하게 평가할 수 있다. 사이토킨의 부류를 개관하기 위해 문헌[Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989]을 참조할 수 있다.
우세한 Th1-유형 반응을 유도하기 위해 사용하기에 바람직한 애주번트는, 예를 들어, 알루미늄 염과 함께 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)의 배합물을 포함한다. MPL 애주번트는 제조원(Ribi ImmunoChem Research Inc.; Hamilton, MT)으로부터 구입가능하다[참조: 미국 특허 제4,436,727호; 제4,877,611호; 제4,866,034호 및 제4,912,094호]. AS-2(제조원: SmithKline Beecham)가 또한 바람직하다. (CpG 디뉴클레오타이드가 비메틸화된) CpG-함유 올리고뉴클레오타이드가 또한 우세한 Th1 반응을 유도한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, WO 제96/02555호에 기술되어 있다. 또 다른 바람직한 애주번트는 다른 애주번트와 배합하여 또는 단독으로 사용할 수 있는 사포닌, 바람직하게는 QS21이다. 예를 들어, 증강된 시스템은 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체의 배합물, 예를 들어, WO 제94/00153호에 기술된 바와 같은 QS21과 3D-MPL의 배합물 또는 WO 제96/33739호에 기술된 바와 같이 QS21이 콜레스테롤로 억제된 보다 낮은 반응원성 조성물을 포함한다. 다른 바람직한 제형은 수중유 에멀젼 및 토코페롤을 포함한다. 수중유 에멀젼 중에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함한 특히 강력한 애주번트 제제는 WO 제95/17210호에 기술되어 있다. 본원에 제공된 임의의 백신도 항원, 면역 반응 증강제 및 적합한 담체또는 애주번트의 배합물을 생성시키는 익히 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
본원에 기술된 조성물은 서방성 제형(투여 후 화합물을 서서히 방출시켜 주는 캡슐제 또는 스폰지와 같은 제형)의 일부로서 투여할 수 있다. 이러한 제형은 일반적으로 익히 공지된 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 예를 들어, 경구, 직장 또는 피하 이식에 의해 또는 목적하는 표적 부위에의 이식에 의해 투여할 수 있다. 서방성 제형은 담체 매트릭스에 분산되고/되거나, 속도 조절 막으로 둘러싸인 저장소내에 함유된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체를 함유할 수 있다. 이러한 제형내에 사용하기 위한 담체는 생체혼화성이며, 또한 생체분해성일 수 있으며; 바람직하게는, 당해 제형은 비교적 일정한 수준의 활성 성분 방출을 제공한다. 서방성 제제내에 함유된 활성 화합물의 양은 이식 부위, 방출 속도 및 예상된 방출 지속성 및 치료 또는 예방하고자 하는 상태의 특성에 의존한다.
종양 세포를 표적화하는 항원-특이적 면역 반응의 생성을 촉진시키기 위해 약제 조성물 및 백신내에 임의의 여러 전달 비히클을 사용할 수 있다. 전달 비히클은 항원 제시 세포(APC), 예를 들어, 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 단핵세포 및 효율적인 APC가 되도록 공학적으로 조작될 수 있는 기타 세포를 포함한다. 이러한 세포는 반드시 필요한 것은 아니지만, 항원을 제시하는 능력을 증가시키고, T 세포 반응의 활성화 및/또는 유지를 향상시키며, 항-종양 효과를 가지고/가지거나 접종자에게 면역학적으로 적합할 수 있도록(즉, 정합된 HLA 일배체형) 변형시킬 수 있다. APC는 일반적으로 여러 생물학적 체액 및 기관으로부터 분리할 수 있으며,자가, 동종이형, 유전자동계형 또는 이종 세포일 수 있다.
본 발명의 특정한 바람직한 양태는 항원 제시 세포로서 수지상 세포 또는 이의 선조 세포를 이용한다. 수지상 세포는 고도로 효능적인 APC이며[참조: Banchereau and Steinman, Nature 392:245-251, 1998], 예방 또는 치료학적 항종양 면역성을 나타내기 위한 생리학적 애주번트로서 효과적인 것으로 제시되어 있다[참조: Timmerman and Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529, 1999]. 일반적으로, 수지상 세포는 이들의 전형적인 모양[원 위치에서 방사상, 시험관내에서 뚜렷한 세포질 돌기(수지상 돌기)가 가시화] 및 표준 검정을 사용하여 측정한 바와 같이 B 세포(CD19 및 CD20), T 세포(CD3), 단핵세포(CD14) 및 천연 킬러 세포(CD56)의 분화 마커의 결여를 기초로 하여 동정할 수 있다. 수지상 세포는 물론 생체내 또는 생체외에서 수지상 세포에서 흔히 발견되지 않는 특이적 세포-표면 수용체 또는 리간드를 발현시키도록 공학적으로 조작할 수 있으며, 이와 같이 변형된 수지상 세포는 본 발명에 포함된다. 수지상 세포의 대안으로서, 분비된 소포 항원-적재된 수지상 세포(소위 엑소좀)를 백신내에서 사용할 수 있다[참조: Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600, 1998].
수지상 세포 및 선조 세포는 말초혈, 골수, 종양-침윤 세포, 종양 주변 조직-침윤 세포, 림프절, 비장, 피부, 제대혈 또는 기타 다른 적합한 조직 또는 체액으로부터 채취할 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포는 말초혈로부터 수확된 단핵세포의 배양물에 GM-CSF, IL-4, IL-13 및/또는 TNFα와 같은 사이토킨의 배합물을 가함으로써 생체외에서 분화시킬 수 있다. 달리, 말초혈, 제대혈 또는 골수로부터수확한 CD34 양성 세포를 GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 리간드, LPS, flt3 리간드 및/또는 수지상 세포의 성숙 및 증식을 유도하는 기타 화합물의 배합물을 배양 배지에 첨가함으로써 수지상 세포로 분화시킬 수 있다.
수지상 세포는 통상적으로 "미성숙" 및 "성숙" 세포로 분류되는데, 이러한 분류는 2개의 잘 특성화된 표현형을 구분할 수 있는 간단한 방법을 가능하게 한다. 그러나, 이러한 명명법이 분화의 모든 가능한 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다. 미성숙 수지상 세포는 항원 흡수 및 처리에 대한 고도의 능력을 가진 APC로서 특징화되며, 이는 Fcγ 수용체, 만노즈 수용체 및 DEC-205 마커의 고도의 발현과 상관관계가 있다. 성숙 표현형은 전형적으로 이러한 마커의 보다 낮은 발현 및 I형 및 II형 MHC, 흡착 분자(예, CD54 및 CD11) 및 공자극 분자(예, CD40, CD80 및 CD86)와 같이 T 세포 활성화를 담당하는 세포 표면 분자의 높은 발현에 의해 특징화된다.
APC는 일반적으로 난소 암종 항원(또는 이의 부분 또는 다른 변이체)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시킬 수 있으며, 이에 따라 항원 또는 이의 면역원성 부분이 세포 표면 상에서 발현된다. 이와 같은 형질감염은 생체외에서 일어날 수 있으며, 이러한 형질감염 세포를 함유한 조성물 또는 백신은 본원에 기술된 바와 같이 치료용으로 사용할 수 있다. 달리, 수지상 또는 다른 항원 제시 세포를 표적화하는 유전자 전달 비히클을 환자에게 투여할 수 있으며, 결과적으로 생체내에서 형질감염이 이루어진다. 수지상 세포의 생체내 또는 생체외 형질감염은, 예를 들어, 일반적으로 WO 제97/24447호에 기술된 방법 또는 문헌[참조: Mahviet al., Immunology and cell Biology 75:456-460, 1997]에 기술된 유전자 건 방법과 같은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 수지상 세포의 항원 적재는 수지상 세포 또는 선조 세포를 폴리펩타이드, DNA(나출형 또는 플라스미드 벡터내) 또는 RNA와 함께 배양하거나 항원-발현 재조합 세균 또는 바이러스(예, 백시니아, 계두, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 벡터)와 함께 배양하여 달성할 수 있다. 적재하기 전에 폴리펩타이드는 T 세포 조력을 제공하는 면역학적 파트너(예, 담체 분자)에 공유적으로 연결시킬 수 있다. 달리, 수지상 세포를 비결합된 면역학적 파트너로 별도로 또는 폴리펩타이드의 존재하에서 펄스시킬 수 있다.
암 요법
본 발명의 추가의 국면에 있어서, 본원에 기술된 조성물은 난소암과 같은 암의 면역요법을 위해 사용할 수 있다. 이러한 방법에서는, 약제학적 조성물 및 백신을 전형적으로 환자에게 투여한다. 본원에 사용된 바와 같이, "환자"는 모든 온혈 동물, 바람직하게는 사람을 가리킨다. 환자는 암을 앓고 있거나 앓고 있지 않을 수 있다. 따라서, 상기 약제학적 조성물 및 백신은 암의 발현을 예방하거나 암환자를 치료하는데 사용할 수 있다. 특정한 바람직한 양태에서, 환자는 난소암 환자이다. 이러한 암은 악성 종양의 존재를 포함하여, 당해 분야에서 일반적으로 허용되는 기준을 사용하여 진단할 수 있다. 약제학적 조성물 및 백신은 초기 종양의 제거 수술 전 또는 후에 및/또는 방사선요법 또는 통상적인 화학요법 약물의 투여와 같은 치료 전 또는 후에 투여할 수 있다.
특정 양태에서, 면역요법은 치료가 면역 반응-변형제(예, 종양 백신, 세균 애주번트 및/또는 사이토킨)의 투여로 종양에 대항하여 반응하는 내인성 숙주 면역계의 생체내 자극에 의존하는 능동 면역요법일 수 있다.
다른 양태에서, 면역요법은 수동 면역요법일 수 있으며, 여기서, 치료는 항종양 효과를 직간접적으로 매개할 수 있는 확립된 종양 면역 반응성을 갖는 시약(예, 이펙터 세포 또는 항체)의 전달을 포함하며, 반드시 완전한 숙주 면역계에 의해 좌우되는 것은 아니다. 이펙터 세포의 예는 본원에 제공된 폴리펩타이드를 발현시키는 T 임파구(예, CD8+세포독성 T 임파구, CD4+T-헬퍼 종양-침윤 임파구), 킬러 세포(예, 천연 킬러 세포, 림포카인-활성화된 킬러 세포), B 세포 또는 항원 제시 세포(예, 수지상 세포 및 대식세포)를 포함한다. 본원에 제공된 폴리펩타이드에 대해 특이적인 T 세포 수용체 및 항체 수용체는 양자 면역요법을 위해 다른 벡터 또는 이펙터 세포내로 클로닝, 발현 및 전이될 수 있다. 또한, 수동 면역요법을 위해 (위에서 기술하고 미국 특허 제4,918,164호에서와 같이) 본원에 제공된 폴리펩타이드를 사용하여 항체 또는 항이디오타입 항체를 생성시킬 수 있다.
이펙터 세포는 일반적으로 본원에 기술된 바와 같이 시험관내 성장에 의해 양자 면역요법을 위해 충분한 양으로 수득할 수 있다. 생체내 항원 인식을 유지하면서 단일의 항원-특이적 이펙터 세포를 수십억개로 증식시키기 위한 배양 조건은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 이들 시험관내 배양 조건은 전형적으로 흔히 사이토킨(예, IL-2) 및 비분열성 영양 세포의 존재하에서 항원을 사용한 간헐적 자극을 이용한다. 상기한 바와 같이, 면역요법에 충분한 수의 세포를 생성시키기 위해 본원에 제공된 면역반응성 폴리펩타이드를 사용하여 항원-특이적 T 세포 배양물 급속히 증식시킬 수 있다. 특히, 당해 분야에 숙지된 표준 기술을 사용하여 수지상 세포, 대식세포 또는 B 세포와 같은 항원 제시 세포를 면역반응성 폴리펩타이드로 펄스시키거나 폴리뉴클레오타이드 서열 하나 이상으로 형질감염시킬 수 있다. 예를 들어, 항원 제시 세포는 재조합 바이러스 또는 기타 발현 시스템에서 발현을 증가시키기에 적합한 프로모터를 갖는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시킬 수 있다. 치료에 사용하기 위한 배양된 이펙터 세포는 폭넓게 성장하고 분포할 수 있으며, 생체내에서 장기간 생존할 수 있어야 한다. 연구 결과, 배양된 이펙터 세포는 IL-2로 보충된 항원으로 반복된 자극을 받았을 때 생체내에서 성장하고 실질적인 수를 유지하면서 장기간 생존하도록 유도될 수 있는 것으로 증명되었다[참조예: Cheever, et al., Immunological Reviews, 157:177, 1997].
달리, 본원에 제공된 폴리펩타이드를 발현시키는 벡터는 환자로부터 채취된 줄기 세포내로 도입하고, 동일한 환자에게로 자가 이식을 하기 위해, 시험관내에서 클론적으로 증식시킬 수 있다.
투여 경로 및 횟수 뿐만 아니라 용량은 개인간에 따라 다양하며, 표준 기술을 사용하여 용이하게 확립시킬 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물 및 백신은 주사(예, 피내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비내(예, 흡입) 또는 경구로 또는 절개된 종양내로 투여할 수 있다. 1 내지 10회 용량을 52주 기간 동안 투여할 수 있다. 바람직하게는 6회 용량을 1개월의 간격으로 투여하며, 이후에 주기적으로 추가 접종을 제공할 수 있다. 또 다른 프로토콜이 개개의 환자에 따라 적합할 수 있다. 적합한 용량은 상기한 바와 같이 투여되었을 때 항종양 면역 반응을 촉진시킬 수 있으며, 기본(즉, 미처리된) 수준보다 10 내지 50% 이상인 화합물의 양이다. 이러한 반응은 환자체내에서 항-종양 항체를 측정하거나 시험관내에서 환자의 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 세포용해성 이펙터 세포의 백신-의존 생성에 의해 모니터링할 수 있다. 이러한 백신은 또한 비백신화 환자에 비하여 백신화 환자에게서 향상된 임상 결과(예, 보다 빈번한 완화, 완전하거나 부분적이거나 보다 장기적인 무질환 생존)를 초래하는 면역 반응을 일으킬 수 있어야 한다. 일반적으로, 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물 및 백신의 경우, 용량에 존재하는 각 폴리펩타이드의 양은 숙주의 kg당 약 100㎍ 내지 약 5mg이다. 적합한 용량 크기는 환자의 크기에 따라 다양하지만, 전형적인 범위는 약 0.1ml 내지 약 5ml이다.
일반적으로, 적합한 용량 및 치료 섭생은 치료 및/또는 예방 잇점을 제공하기에 충분한 양으로 활성 화합물(들)을 제공한다. 이러한 반응은 비처리된 환자에 비하여 처리된 환자에게서 향상된 임상 결과(예, 보다 빈번한 완화, 완전하거나 부분적이거나 보다 장기적인 무질환 생존)를 확립함으로써 모니터링할 수 있다. 난소 암종 항원에 대하여 이미 존재하는 면역 반응의 증가는 일반적으로 향상된 임상 결과와 상호관련이 있다. 이러한 면역 반응은 일반적으로 치료 전후에 환자로부터 채취된 샘플을 사용하여 수행할 수 있는 표준 증식, 세포독성 또는 사이토킨 검정을 사용하여 평가할 수 있다.
분비된 난소 암종 항원을 동정하기 위한 선별
본 발명은 분비된 종양 항원을 동정하는 방법을 제공한다. 이러한 방법내에서, 종양은 SCID 마우스와 같은 면역결핍 동물내로 이식하고, 종양 항원이 혈청내로 분비되기에 충분한 시간 동안 유지시킨다. 일반적으로, 종양은 면역결핍 동물에 피하로 또는 생식선 지방 패드내로 이식하여 1 내지 9개월, 바람직하게는 1 내지 4개월 동안 유지시킬 수 있다. 이식은 일반적으로, WO 제97/18300호에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 다음, 표준 기술을 사용하고 본원에 기술된 바에 따라 분비된 항원을 함유하는 혈청을 사용하여 면역적격 마우스에서 항혈청을 제조한다. 간략하게, 50 내지 100㎕의 혈청(각 세트는 상이한 SCID-유도된 사람 난소암을 함유하는 3세트의 면역결핍 마우스로부터 수거된 것임)을 RIBI-MPL 또는 MPL + TDM(제조원: Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO)과 같은 적합한 애주번트와 1:1(용적:용적)로 혼합하고, 5개월 동안 매월 동계의 면역적격 동물에 복강내로 주사할 수 있다. 이러한 방식으로 면역화된 동물로부터의 항혈청을 3차, 4차 및 5차 면역화 후 혈액을 채취하여 수득할 수 있다. 생성된 항혈청은 일반적으로 이. 콜라이 및 파아지 항원에 대해 안전성을 검증하고, 혈청학적 발현 스크린에 사용한다(일반적으로 1:200과 같이 희석한 후).
라이브러리는 전형적으로 SCID 마우스에 이식된 유형의 종양 하나 이상으로부터의 cDNA를 함유한 발현 라이브러리이다. 이러한 발현 라이브러리는 λ-스크린(제조원: Novagen)과 같이 임의의 적합한 벡터로 제조할 수 있다. 항혈청과 반응하는 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA는 표준 기술을 사용하여 동정하고 서열분석할 수 있다. 이러한 cDNA 분자를 좀더 특성화하여 종양 및 정상 조직에서의 발현을 평가하고, 환자에게서의 항원 분비를 평가할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 종양 항원 개발을 위한 다른 방법에 비해 잇점을 가지고 있다. 특히, 이러한 방법에 의해 동정된 모든 항원은 종양 세포의 괴사를 통해 분비 또는 방출되어야 한다. 이러한 항원은 백신화 후 면역계에 의해 표적화되고 사멸되기에 충분한 시간 동안에 종양 세포의 표면 상에 존재할 수 있다.
암의 검출 방법
일반적으로, 암은 환자로부터 채취된 생물학적 샘플(예, 혈액, 혈청, 뇨 및/또는 종양 생검) 중에 하나 이상의 난소 암종 단백질 및/또는 이러한 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 존재를 근거로 하여 환자로부터 검출할 수 있다. 즉, 이러한 단백질은 난소암과 같은 암의 존재 또는 부재를 나타내는 마커로서 사용할 수 있다. 또한, 이러한 단백질은 다른 암의 검출에 유용할 수 있다. 본원에 제공된 결합제는 일반적으로 생물학적 샘플 중에서 제제와 결합하는 단백질의 수준의 검출을 가능하게 한다. 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브를 사용하여 종양 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출할 수 있으며, 이는 또한 암의 존재 또는 부재를 지시한다. 일반적으로, 난소 암종-연관된 서열은 정상 조직에서 보다 종양 조직에서 3배 이상 높은 수준으로 존재하여야 한다.
결합제를 사용하여 샘플 중에서 폴리펩타이드 마커를 검출하는 다양한 검정방법이 당업자에게 공지되어 있다[참조예: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 일반적으로, 환자에게서 암의 유무는 (a) 환자로부터 채취된 생물학적 샘플을 결합제와 접촉시키고, (b) 샘플 중에서 결합제와 결합하는 폴리펩타이드의 수준을 검출하고, (c) 폴리펩타이드의 수준을 미리 측정된 컷오프 값과 비교함으로써 측정할 수 있다.
바람직한 양태에서, 검정법은 고체 지지체상에 고정된 결합제를 사용하여 샘플의 잔류물로부터 폴리펩타이드와 결합시키고, 이를 제거함을 포함한다. 다음, 리포터 그룹을 함유하고, 결합제/폴리펩타이드 복합체와 특이적으로 결합하는 검출제를 사용하여 결합된 폴리펩타이드를 검출할 수 있다. 이러한 검출 시약은, 예를 들어, 폴리펩타이드와 특이적으로 결합하는 결합제 또는 항-면역글로불린, 단백질 G, 단백질 A 또는 렉틴과 같은 결합제에 특이적으로 결합하는 항체 또는 기타 제제를 포함할 수 있다. 달리, 경쟁 검정법을 이용할 수 있는데, 여기서 폴리펩타이드는 리포터 그룹으로 표지되고, 샘플과 결합제의 배양 후 고정된 결합제에 결합이 이루어진다. 샘플의 성분이 결합제에 표지된 폴리펩타이드의 결합을 억제하는 정도는 고정된 결합제와 샘플의 반응성을 지시한다. 이러한 검정에서 사용하기에 적합한 폴리펩타이드는 상기한 바와 같이 결합제가 결합하는 전장 난소 암종 단백질 및 이의 부분을 포함한다.
고체 지지체는 당업자에게 공지된 것으로 종양 단백질이 부착될 수 있는 임의의 재료일 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 미세역가 플레이트에서의 시험 웰이거나 니트로셀룰로즈 또는 기타 적합한 막일 수 있다. 달리, 지지체는 비드또는 디스크, 예를 들어, 유리, 섬유 유리, 라텍스 또는 플라스틱 재료, 예를 들어, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드일 수 있다. 지지체는 또한, 예를 들어, 미국 특허 제5,359,681호에 기술된 것과 같은 자석 입자 또는 섬유 광 센서일 수 있다. 결합제는 특허 및 과학 문헌에 광범위하게 기술되어 당업자에게 공지된 여러 기술을 사용하여 고체 지지체에 고정화시킬 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "고정화"는 흡착과 같은 비공유 결합 및 공유적 부착(제제와 지지체 상의 작용 그룹 사이의 직접적인 연결이거나 가교제를 통한 연결일 수 있다)을 가리킨다. 미세역가 플레이트 중의 웰 또는 막에의 흡착에 의한 고정화가 바람직하다. 이러한 경우, 흡착은 적합한 완충액 중의 결합제를 고체 지지체와 적합한 시간 동안 접촉시킴으로써 달성할 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 다양하지만, 전형적으로는 약 1시간 내지 1일이다. 일반적으로, 약 10ng 내지 약 10㎍, 바람직하게는 약 100ng 내지 약 1㎍의 결합제의 양과 플라스틱 미세역가 플레이트의 웰(예, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드)과 접촉시키는 것이 적합한 양의 결합제를 고정시키기에 충분하다.
고체 지지체에 대한 결합제의 공유 결합은 일반적으로 지지체를 결합제 상에서 하이드록실 또는 아미노 그룹과 같은 작용 그룹 및 지지체 둘 모두와 반응하는 이작용성 시약과 우선 반응시킴으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 결합제는 벤조퀴논을 사용하거나 지지체상의 알데하이드 그룹을 결합 파트너상의 활성 수소 및 아민과 축합시킴으로써 적합한 중합체 피복물을 갖는 지지체에 공유적으로 결합시킬 수 있다[참조예: Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, atA12-A13].
특정 양태에서, 검정법은 2개-항체 샌드위치 검정법이다. 이러한 검정법은 우선 고체 지지체, 흔히 미세역가 플레이트의 웰 상에 고정된 항체를 샘플과 접촉시켜, 샘플내의 폴리펩타이드가 고정된 항체와 결합되도록 함으로써 수행할 수 있다. 다음, 미결합된 샘플을 고정된 폴리펩타이드-항체 복합체로부터 제거하고, 리포터 그룹을 함유한 검출 시약(바람직하게는 폴리펩타이드상의 다른 부위에 결합할 수 있는 제2 항체)을 첨가한다. 이어서, 고체 지지체 상에 결합된 채로 남아 있는 검출 시약의 양을 특정 리포터 그룹에 적합한 방법을 사용하여 측정한다.
보다 구체적으로는, 일단 항체가 상기한 바와 같이 지지체 상에 고정되면, 지지체 상에 잔류하는 단백질 결합 부위를 전형적으로 차단시킨다. 소 혈청 알부민(BSA) 또는 Tween 20™(제조원: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)과 같이 당업자에게 공지된 임의의 적합한 차단제를 사용할 수 있다. 이어서, 고정된 항체를 샘플과 함께 배양하여, 폴리펩타이드를 항체와 결합하도록 한다. 샘플은 배양하기 전에 인산염-완충 염수(PBS)와 같은 적합한 희석제로 희석시킬 수 있다. 일반적으로, 적합한 접촉 시간(즉, 배양 시간)은 난소암 환자로부터 채취된 샘플내에 폴리펩타이드의 존재를 검출하기에 충분한 시간이다. 바람직하게는, 접촉 시간은 결합된 폴리펩타이드와 미결합된 폴리펩타이드 사이의 평형에 도달된 결합 수준의 95% 이상인 결합 수준을 달성하기에 충분하다. 당업자는 평형을 달성하기에 필요한 시간을 일정 시간에 발생하는 결합의 수준을 검정함으로써 용이하게 측정할 수 있음을 인지할 것이다. 실온에서, 약 30분의 배양 시간이 일반적으로 충분하다.
다음, 미결합된 샘플은 고체 지지체를 0.1% Tween 20™이 함유된 PBS와 같은 적합한 완충액으로 세척함으로써 제거할 수 있다. 이어서, 리포터 그룹을 함유하는 제2 항체를 고체 지지체에 첨가할 수 있다. 바람직한 리포터 그룹은 상기한 그룹을 포함한다.
이어서, 검출 시약을 고정된 항체-폴리펩타이드 복합체와 결합된 폴리펩타이드를 검출하기에 충분한 시간 동안 배양한다. 적합한 시간 양은 일반적으로 일정 시간 동안 발생하는 결합 수준을 검정함으로써 측정할 수 있다. 이어서, 미결합된 검출 시약을 제거하고, 결합된 검출 시약을 리포터 그룹을 사용하여 검출한다. 리포터 그룹을 검출하기 위해 사용되는 방법은 리포터 그룹의 특성에 의해 좌우된다. 방사성 그룹의 경우, 신틸레이션 계수 또는 자가방사선촬영술이 일반적으로 적합하다. 분광 방법을 사용하여 염료, 발광 그룹 및 형광 그룹을 검출할 수 있다. 비오틴은 상이한 리포터 그룹(흔히 방사성 또는 형광 그룹 또는 효소)에 연결된 아비딘을 사용하여 검출할 수 있다. 효소 리포터 그룹은 일반적으로 기질을 (일반적으로 특정 기간 동안) 첨가한 후, 반응 산물을 분광분석하거나 다른 분석을 통해 검출할 수 있다.
난소 암과 같은 암의 존재 유무를 측정하기 위해, 고체 지지체에 결합되어 있는 리포터 그룹으로부터 검출된 시그널을 일반적으로 미리 측정된 컷오프 값에 상응하는 시그널과 비교한다. 한가지 바람직한 양태에서, 암의 검출을 위한 컷오프 값은 고정된 항체를 암이 없는 환자로부터의 샘플과 함께 배양하는 경우, 수득되는 평균 시그널이다. 일반적으로, 미리 측정된 컷오프 값 이상으로 3회의 표준편차를 보이는 시그널을 발생하는 샘플은 암에 대해 양성인 것으로 판단된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 컷오프 값은 문헌[참조: Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, pp. 106-107]의 방법에 따라 리시버 오퍼레이터 커브를 사용하여 측정한다. 간략하게, 이러한 양태에서, 컷오프 값은 진단 시험 결과에 대해 각각의 가능한 컷오프에 상응하는 진 양성율(즉, 민감성) 및 위 양성율(100%-특이성)의 플롯팅으로부터 측정할 수 있다. 상부 좌측 코너에 가장 근접한 플롯팅 상의 컷오프 값(즉, 가장 큰 면적을 차지하는 값)이 가장 정밀한 컷오프 값이며, 이 방법에 의해 결정된 컷오프 값보다 큰 시그널을 발생하는 시그널은 양성으로 고려될 수 있다. 달리, 컷오프 값은 위 양성율을 최소화할 경우 플롯팅을 따라 좌측으로 이동하거나 위 네가티브 비율을 최소화할 경우엔 우측으로 이동할 수 있다. 일반적으로, 이 방법에 의해 결정된 컷오프 값보다 큰 시그널을 발생하는 샘플은 암에 대해 양성으로 판단된다.
관련된 양태에서, 검정법은 결합제를 니트로셀룰로즈와 같은 막에 고정시키는 플로우-쓰루(flow-through) 또는 스트립 시험 방법으로 실시한다. 플로우-쓰루 시험에서, 샘플내의 폴리펩타이드는 샘플이 막을 통과하면서 고정된 결합제에 결합한다. 이어서, 제2의 표지된 결합제를 함유한 용액을 막을 통과시키면서 제2의 표지된 결합제를 결합제-폴리펩타이드 복합체에 결합시킨다. 다음, 결합된 제2 결합제의 검출을 상기한 바와 같이 수행할 수 있다. 스트립 시험 방법에서, 결합제가 결합되는 막의 한쪽 끝을 샘플을 함유한 용액에 침지시킨다. 샘플은 제2 결합제를함유한 영역을 통해 막을 따라 이동시키고, 고정된 결합제의 영역으로 이동시킨다. 고정된 항체의 영역에서 제2 결합제의 농도는 암의 존재를 지시한다. 전형적으로, 이 부위에 제2 결합제의 농도는 시각적으로 판독할 수 있는 선과 같은 패턴을 형성한다. 이와 같은 패턴의 부재는 음성 결과를 지시한다. 일반적으로, 막에 고정된 결합제의 양은 생물학적 샘플이 2개-항체 샌드위치 검정, 즉 상기한 논의된 방법에서 양성 시그널을 발생하기에 충분한 폴리펩타이드의 수준을 함유할 때 시각적으로 식별가능한 패턴을 형성하도록 선택한다. 이와 같은 검정에서 사용하기에 바람직한 결합제는 항체 및 이의 항원-결합 단편이다. 바람직하게는, 막 상에 고정된 항체의 양은 약 25ng 내지 약 1㎍이며, 보다 바람직하게는 약 50ng 내지 약 500ng이다. 이러한 시험은 전형적으로 극소량의 생물학적 샘플로 수행할 수 있다.
물론, 본 발명의 종양 단백질 또는 결합제와 사용하기에 적합한 다수의 다른 검정 프로토콜이 존재한다. 상기 기술 내용은 단지 예시하는데 불과하다. 예를 들어, 당업자에게 있어서 상기 프로토콜을 용이하게 변형시켜, 난소 암종 폴리펩타이드를 사용하여 생물학적 샘플에서 폴리펩타이드와 결합하는 항체를 검출할 수 있음은 명백할 것이다. 이러한 난소 암종 단백질 특이적 항체의 검출은 암의 존재와 상호관련이 있을 수 있다.
암은 또한 또는 달리, 생물학적 샘플에서 난소 암종 단백질과 특이적으로 반응하는 T 세포의 존재를 근거로 검출할 수 있다. 특정 방법에서, 환자로부터 분리된 CD4+및/또는 CD8+T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 난소 암종 단백질, 이러한폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이러한 폴리펩타이드의 적어도 면역원성 부분을 발현시키는 APC와 함께 배양하고, T 세포의 특정 활성화의 존재 유무를 검출한다. 적합한 생물학적 샘플은 이들에 한정되는 것은 아니지만, 분리된 T 세포를 포함한다. 예를 들어, T 세포는 통상적인 기술(예, 말초혈 임파구의 Ficoll/Hypaque 밀도 구배 원심분리)에 의해 환자로부터 분리할 수 있다. T 세포는 난소 암종 단백질(예, 5 내지 25㎍/ml)과 함께 37℃에서 2 내지 9일 동안(전형적으로 4일 동안) 시험관내에서 배양할 수 있다. 대조군으로서 작용하는 난소 암종 단백질의 부재하에 다른 분취량의 T 세포 샘플을 배양하는 것이 바람직할 수 있다. CD4+T 세포의 경우, 활성화는 바람직하게는 T 세포의 증식을 평가함으로써 검출한다. CD8+T 세포의 경우에는, 바람직하게는 세포용해 활성을 평가함으로써 활성화를 검출한다. 무질환 환자에서 보다 2배 이상 높은 증식 수준 및/또는 20% 이상 큰 세포용해 활성의 수준은 환자에게서 암의 존재를 나타낸다.
상기한 바와 같이, 암은 또한 또는 달리, 생물학적 샘플에서 난소 암종 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 근거로 하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기본 검정에 사용하여 생물학적 샘플로부터 유도된 난소 암종 단백질 cDNA의 부분을 증폭시킬 수 있으며, 여기서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 중의 하나 이상은 난소 암종 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대해 특이적이다(즉, 하이브리드화한다). 다음, 겔 전기영동과 같이 당해 분야에 익히 공지된 기술을 사용하여 증폭된 cDNA를 분리하고 검출한다. 유사하게는, 난소 암종 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 하이브리드화 검정에 사용하여 생물학적 샘플에서 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출할 수 있다.
검정 조건하에서 하이브리드화가 이루어지기 위해서는, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브는 길이가 10개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 20개 이상의 뉴클레오타이드인 난소 암종 단백질 암호화 폴리뉴클레오타이드의 부분과 약 60% 이상, 바람직하게는 약 75% 이상, 및 보다 바람직하게는 약 90% 이상 동일성을 갖는 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하여야 한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 프로브는 본원에 정의된 바와 같이 중간 정도의 엄격한 조건하에서 본원에 기술된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화한다. 본원에 기술된 진단 방법에 유용하게 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 프로브는 바람직하게는 길이가 적어도 10 내지 40개 뉴클레오타이드이다. 바람직한 양태에서, 올리뉴클레오타이드 프라이머는 본원에 제공된 서열을 갖는 DNA 분자의 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. PCR 기초 검정 및 하이브리드화 검정에 대한 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있다[참조예: Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, 1987; Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989].
한가지 바람직한 검정은 PCR이 역전사와 병용하여 응용된 RT-PCR을 사용한다. 전형적으로, RNA를 생검 조직과 같은 생물학적 샘플로부터 추출하고, 역전사시켜 cDNA 분자를 생성시킨다. 하나 이상의 특이적 프라이머를 이용한 PCR 증폭으로 cDNA 분자가 생성되며, 이 분자는, 예를 들어, 겔 전기영동을 사용하여 분리 및 가시화할 수 있다. 증폭은 피검 환자 및 암을 앓고 있지 않은 개체로부터 채취된 생물학적 샘플에 대해 수행할 수 있다. 증폭 반응은 2배 범위내에서 cDNA 희석물 수가지에 대해 수행할 수 있다. 비암 샘플의 동일한 희석물에 비하여 피검 환자 샘플의 수가지 희석물에서 발현이 2배 이상 증가한 경우 전형적으로 양성으로 고려된다.
다른 양태에서, 난소 암종 단백질 및 이러한 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 암의 진행을 모니터링하는 마커로서 사용할 수 있다. 이러한 양태에서, 암의 진단을 위한 상기한 검정은 시간이 경과하면서 수행할 수 있으며, 반응성 폴리펩타이드(들)의 수준이 변화하는 것을 평가할 수 있다. 예를 들어, 6개월 내지 1년의 기간 동안 24 내지 72시간마다 검정을 수행할 수 있으며, 이후에도 필요에 따라 수행할 수 있다. 일반적으로, 시간이 경과하면서 결합제에 의해 검출된 폴리펩타이드의 수준이 증가하는 환자에게서는 암이 진행되고 있는 것이다. 대조적으로, 반응성 폴리펩타이드의 수준이 시간이 경과하면서 일정하거나 감소할 때 암은 진행되지 않는 것이다.
특정한 생체내 진단 검정을 종양에 대해 직접적으로 수행할 수 있다. 이러한 한가지 검정은 종양 세포를 결합제와 접촉시키는 것을 포함한다. 다음, 결합된 결합제를 직접적으로 또는 리포터 그룹을 통해 간접적으로 검출할 수 있다. 이러한 결합제는 또한 조직학에 응용시킬 수 있다. 달리, 이러한 응용에 폴리뉴클레오타이드 프로브를 사용할 수 있다.
상기한 바와 같이, 민감성을 개선하기 위해, 다수의 난소 암종 단백질 마커를 제공된 샘플내에서 검정할 수 있다. 본원에 제공된 상이한 단백질에 대해 특이적인 결합제들이 단일 검정에서 조합될 수 있음은 명백할 것이다. 또한, 다수의 프라이머 또는 프로브를 동시에 사용할 수 있다. 종양 단백질 마커의 선택은 최적의 민감성을 도출하는 조합을 결정하는 통상적인 실험을 기초로 하여 이루어질 수 있다. 또한 또는 달리, 본원에 제공된 종양 단백질에 대한 검정을 다른 공지된 종양 항원에 대한 검정법과 조합할 수 있다.
진단 키트
본 발명은 또한 임의의 상기 진단 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 전형적으로 진단 검정을 수행하는데 필요한 2종 이상의 성분을 포함한다. 성분은 화합물, 시약, 용기 및/또는 장비일 수 있다. 예를 들어, 키트내의 하나의 용기는 난소 암종 단백질과 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 함유할 수 있다. 이러한 항체 또는 단편은 상기한 지지체 물질에 부착되어 제공될 수 있다. 하나 이상의 추가의 용기는 검정에서 사용될 시약 또는 완충액과 같은 요소를 함유할 수 있다. 이러한 키트는 또한 또는 달리, 항체 결합의 직접적인 또는 간접적인 검출에 적합한 리포터 그룹을 함유한 상기한 검출 시약을 함유할 수 있다.
달리, 키트는 생물학적 샘플에서 난소 암종 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출하도록 디자인할 수 있다. 이러한 키트는 일반적으로 난소 암종 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 상기한 바와 같은 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, PCR 또는 하이브리드화 검정에서 사용할 수 있다. 이러한 키트내에 존재할 수 있는 추가의 성분은 난소 암종 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 검출을 촉진시키기 위한 제2 올리고뉴클레오타이드 및/또는 진단 시약 또는 용기를 포함한다.
하기 실시예는 본 발명의 예시를 위해 제공하는 것이지, 이를 제한하기 위해 제공하는 것은 아니다.
실시예 1
대표적인 난소 암종 단백질 cDNA의 동정
본 실시예는 난소 암종 단백질을 암호화하는 cDNA 분자의 동정을 예시한다.
항-SCID 마우스 혈청(말기 난소 암종을 보유한 SCID 마우스로부터의 혈청에 대해 생성됨)을 이. 콜라이 및 파아지 항원에 대해 안전성을 사전에 검증하고, 혈청학적 발현 스크린에서 1:200 희석율로 사용한다. 지향성 RH 올리고(dT) 프라이밍 cDNA 라이브러리 작제 키트 및 λScreen 벡터(제조원: Novagen)를 사용하여 SCID-유도된 사람 난소 종양(OV9334)으로부터 선별된 라이브러리를 제조한다. 박테리오파아지 람다 스크린을 사용한다. 약 400,000pfu의 증폭된 OV9334 라이브러리를 선별한다.
196개의 양성 클론을 분리한다. 신규한 것으로 보이는 특정 서열을 도 1A 내지 1S 및 서열 1 내지 71에 제공한다. 3개의 완전한 삽입물 서열이 도 2A 내지 2C(서열 72 내지 74)에 제시되어 있다. 공지된 서열을 갖는 다른 클론이 도 15A 내지 15EEE(서열 82 내지 310)에 제시되어 있다. 데이터베이스 조사로 도 15A 내지 15EEE에 제시된 서열과 실질적으로 동일한 하기 서열을 동정한다.
이들 클론은 추가로 마이크로어레이 기술을 사용하여 특성화함으로써, 다양한 종양 및 정상 조직에서 mRNA 발현 수준을 측정한다. 이러한 분석은 Synteni(Palo alto, CA) 마이크로어레이를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 수행한다. PCR 증폭 산물을 슬라이드 상에 정렬하고, 각 산물은 정렬에서 특정 위치를 점유한다. 피검 조직 샘플로부터 mRNA를 추출하고 역전사시켜, 형광-표지된 cDNA 프로브를 생성시킨다. 마이크로어레이를 표지된 cDNA 프로브로 프로빙시키고, 슬라이드를 스캐닝하여 형광 강도를 측정한다. Synteni로부터 제공된 GEMtools 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. 특정한 클론(13695, 또한 O8E로 명명)에 대한 결과를 도 3에 제시한다.
실시예 2
마이크로어레이 기술을 사용한 난소 암종 cDNA의 동정
본 실시예는 PCR 공제 및 마이크로어레이 분석에 의한 난소 암종 폴리뉴클레오타이드의 동정을 예시한 것이다. cDNA의 마이크로어레이를 난소암-특이적 발현에 대해 Synteni(Palo alto, CA) 마이크로어레이를 제조업체의 지침에 따라 및 필수적으로 문헌[참조: Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996 및 Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155, 1997]에 기술된 바와 같이 사용하여 분석한다.
4개 난소 종양(이 중 3개는 전이성 종양이다)의 cDNA를 포함하는 테스터 및 5개 정상 조직(부신, 폐, 췌장, 비장 및 뇌)으로부터의 cDNA의 드라이버를 사용하여 PCR 공제를 수행한다. 이 공제로부터 회수된 cDNA 단편을 DNA 마이크로어레이 분석에 적용하며, 이때, 단편을 PCR 증폭시키고, 칩에 부착시킨 후, 사람 난소 종양 및 여러 정상 사람 조직의 mRNA로부터 유도된 형광 표지된 프로브와 하이브리드화시킨다. 이 분석에서, 슬라이드를 스캐닝하고 형광 강도를 측정한 다음, Synteni GEMtools 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. 일반적으로, 종양 세포에서 (정상 세포에 비하여) 5배 이상의 발현 증가를 나타내는 서열은 난소 종양 항원으로 고려된다. 형광 결과를 분석하고, 난소암에서 증가된 발현을 나타낸 클론을 DNA 서열분석 및 데이터베이스 조사에 의해 추가로 특성화하여 서열의 신규성을 결정한다.
상기 검정법을 사용하여, 사람 T 세포 백혈병 바이러스 I형 발암 단백질 TAX[참조: Jin et al., Cell 93:81-91, 1998]과 오스테오넥틴으로 불리우는 세포외 매트릭스 단백질 사이의 스플라이스 융합물인 난소암 항원을 동정한다. 스플라이스 접합 서열이 융합점에 존재한다. 이 클론의 서열은 도 4 및 서열 75에 제시한다. 이러한 검정으로부터 독립적으로 스플라이싱되지 않고 변형되지 않은 오스테오넥틴을 또한 동정한다.
이 방법에 의해 동정된 추가의 클론은 본원에서 3f, 6b, 8e, 8h, 12c 및 12h로 명명한다. 이들 클론의 서열은 도 5 내지 9 및 서열 76 내지 81로 제시한다. 마이크로어레이 분석을 상기한 바와 같이 수행하고, 이를 도 10 내지 14에 도시한다. 난소 종양(SCID-유도된) cDNA 라이브러리를 선별함으로써, 클론 3f, 6b, 8e 및 12h를 포함한 전장 서열을 수득한다. 이러한 2996개 염기쌍 서열(O772P로 명명)은 서열 311에 제시하고, 암호화된 914개 아미노산 단백질 서열은 서열 312에 제시한다. PSORT 분석은 혈장 막에 위치된 1a형 경막 단백질을 지시한다.
상기 특정 서열 이외에, 이러한 선별에 의해 표 1에 상세하게 기술된 하기 서열을 동정한다.
서열 주석
OV4vG11(서열 313) 염색체 20p12 상의 사람 클론 1119D9
OV4vB11(서열 314) 염색체 6p21로부터의 사람 UWGC:y14c094
OV4vD9 (서열 315) 사람 클론 1049G16 염색체 20q12-13.2
OV4vD5 (서열 316) 사람 KIAA0014 유전자
OV4vC2 (서열 317) 사람 KIAA0084 유전자
OV4vF3 (서열 318) 사람 염색체 19 코스미드 R31167
OV4VC1 (서열 319) 신규
OV4vH3 (서열 320) 신규
OV4vD2 (서열 321) 신규
O815P (서열 322) 신규
OV4vC12(서열 323) 신규
OV4vA4 (서열 324) 신규
OV4vA3 (서열 325) 신규
OV4v2A5(서열 326) 신규
O819P (서열 327) 신규
O818P (서열 328) 신규
O817P (서열 329) 신규
O816P (서열 330) 신규
OV4vC5 (서열 331) 신규
21721 (서열 332) 사람 루미칸
21719 (서열 333) 사람 레티노산-결합 단백질 II
21717 (서열 334) 사람 26S 프로테아좀 ATPase 서브유니트
21654 (서열 335) 사람 코파인 I
21627 (서열 336) 사람 뉴런 특이적 감마-2 에놀라제
21623 (서열 337) 사람 게라닐게라닐 트랜스퍼라제 II
21621 (서열 338) 사람 사이클린-의존성 단백질 키나제
21616 (서열 339) 사람 프리프로-거핵세포 강화 인자
21612 (서열 340) 사람 UPH1
21558 (서열 341) 사람 RalGDS-유형 2(RGL2)
21555 (서열 342) 사람 자가항원 P542
서열 설명
21548 (서열 343) 사람 액틴-관련 단백질(ARP2)
21462 (서열 344) 사람 헌팅틴 상호작용 단백질
21441 (서열 345) 사람 90K 생성물(종양 관련 항원)
21439 (서열 346) 사람 구아닌 뉴클레오타이드 조절 단백질(tim1)
21438 (서열 347) 사람 Ku 자가면역(p70/p80) 항원
21237 (서열 348) 사람 S-라미닌
21436 (서열 349) 사람 리보포린 I
21435 (서열 350) 사람 세포질 샤페로닌 hTRiC5
21425 (서열 351) 사람 EMX2
21423 (서열 352) 사람 p87/p89 유전자
21419 (서열 353) 사람 HPBRII-7
21252 (서열 354) 사람 T1-227H
21251 (서열 355) 사람 쿨린 I
21247 (서열 356) 쿠니츠형 프로테아제 억제제(KOP)
21244-1(서열 357) 사람 단백질 티로신 포스파타제 수용체 F(PTPRE)
21718 (서열 358) 사람 LTR 반복물
OV2-90 (서열 359) 신규
사람 아연 핑거 (서열 360)
사람 폴리A 결합 단백질 (서열 361)
사람 플레이트로핀 (서열 362)
사람 PAC 클론 278C19 (서열 363)
사람 LLRep3 (서열 364)
사람 쿠니츠형 프로테아제 억제제 (서열 365)
사람 KIAA0106 유전자 (서열 366)
사람 케라틴 (서열 367)
사람 HIV-1TAR (서열 368)
사람 신경교 유도된 넥신 (서열 369)
사람 피브로넥틴 (서열 370)
사람 ECM프로BM40 (서열 371)
사람 콜라겐 (서열 372)
사람 알파 에놀라제 (서열 373)
사람 알돌라제 (서열 374)
사람 전환 성장 인자 BIG H3 (서열 375)
사람 SPARC 오스테오넥틴 (서열 376)
사람 SLP1 백혈구 프로테아제 (서열 377)
사람 미토콘드리아 ATP 신테타제 (서열 378)
사람 DNA 서열 클론 461P17 (서열 379)
사람 dpbB 프로 Y 박스 (서열 380)
사람 40kDa 케라틴 (서열 381)
사람 아르기노석시네이트 신테타제 (서열 382)
사람 산성 리보좀성 인단백질 (서열 383)
사람 결장 암종 라미닌 결합 단백질 (서열 384)
상기 선별에 의해 추가로 클론 O772P의 다수 형태(본원에서 21013, 21003 및 21008로 명명)를 동정한다. PSORT 분석은 21003(서열 386; 서열 389로 해독) 및21008(서열 387; 서열 390으로 해독)이 O772P의 1a형 경막 단백질 형태를 나타냄을 지시한다. 21013(서열 385; 서열 388로 해독)은 말단 절단된 형태의 단백질인 것으로 나타나며, PSORT 분석 결과 분비된 단백질인 것으로 추정된다.
추가의 서열 분석 결과, O8E에 대한 전장 클론(노던 분석에 의해 관찰된 메시지 크기와 일치하는 2627bp; 서열 391)을 수득한다. 이러한 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같이 수득한다: 최초 O8E 서열(OrigO8Econs)은 EST 클론(IMAGE#1987589)으로부터의 서열과 33개 정도의 뉴클레오타이드가 중복하는 것으로 밝혀졌다. 이 클론은 최초 O8E 서열 상류의 1042개 추가 뉴클레오타이드를 제공한다. EST와 O8E 사이의 연결은 특정 EST 및 O8E 서열에 대한 프라이머(ESTxO8EPCR)를 사용하여 난소 초기 종양 라이브러리로부터 생성된 다수의 PCR 단편을 서열분석함으로써 검증한다. 난소암 라이브러리로부터 고정된 PCR이 추정 출발 메티오닌의 상류에서 종결된 수개의 클론(AnchoredPCR cons)을 제공하는 경우, 전장 상태가 추가로 나타나지만, 더 이상의 어떠한 서열 정보도 수득되지 않는다. 도 16은 전장 O8E 서열내에 각 부분 서열의 위치를 도시하는 다이아그램을 제시한다.
2개 단백질 서열을 전장 O8E로부터 해독할 수 있다. "a"(서열 393)는 추정 출발 메티오닌으로 시작한다. 두 번째 형태 "b"(서열 392)는 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단에 27개의 추가의 상류 잔기를 포함한다.
실시예 3
본 실시예는 O8E 폴리클로날 항혈청에 의해 인식되는 항체 에피토프의 동정 및 특성화를 개시한다.
이. 콜라이 유래의 O8E 재조합 단백질에 대한 토끼 항혈청을 생성시켜, O8E 아미노산 서열에 상응하는 20량체 또는 21량체 펩타이드에 대해 항체의 에피토프 인식 반응을 시험한다. 전장 O8E 단백질 중 아미노산 영역 31 내지 65, 76 내지 110, 136 내지 200 및 226 내지 245에 걸쳐있는 펩타이드가 친화성 정제된 항-O8E 혈청으로부터의 산 용출된 피크 및/또는 염 용출된 피크에 의해 인식된다. 이와 같이, 상기 펩타이드에 상응하는 아미노산 서열은 친화성 정제된 항-O8E 항체에 의해 인식되는 항체 에피토프를 구성한다.
항-O8E 토끼 혈청의 ELISA 분석 결과는 도 23에 제시하고, 친화성 정제된 토끼 항-O8E 폴리클로날 항체의 ELISA 분석 결과는 도 24에 제시한다.
에피토프 지도화를 위해, O8E 단백질에 상응하는 20량체 또는 21량체 펩타이드를 합성한다. 항체 친화성 정제를 위해, 토끼의 항-O8E 혈청을 O8E 세파로스 컬럼 상에 유출시킨 다음, 항체를 0.5M NaCl 및 20mM PO4를 함유하는 염 완충액으로 용출시킨 후, 0.2M 글리신(pH 2.3)을 사용하는 산 용출 단계에 적용시킨다. 정제된 항체를 1M Tris(pH 8)를 첨가하여 중화시키고, 완충액을 인산염 완충 식염수(PBS)로 교환시킨다. 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 분석을 위해, O8E 펩타이드 및 O8E 재조합 단백질을 2㎍/ml로 실온(RT)에서 2시간 동안 96웰 평저 플레이트에 피복시킨다. 다음, 플레이트를 PBS + 0.1% Tween 20으로 5회 세척하고,PBS + 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 1시간 동안 차단시킨다. 친화성 정제된 항-O8E 항체의 산 또는 염 용출된 분획을 웰에 1㎍/ml로 첨가한 다음, RT에서 1시간 동안 배양한다. 플레이트를 다시 세척한 후, 당나귀 항-토끼-Ig-양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 항체를 첨가하여 RT에서 1시간 동안 반응시킨다. 플레이트를 세척하고, 발색원성 기질인 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 첨가하여 발색시킨다[참조: Bos et al., J. of Immunoassay2:187-204(1981); 구입원: Sigma(St. Louis, MO)]. 반응물을 RT에서 15분 동안 배양한 다음, 1N H2SO4를 첨가하여 정지시킨다. 자동 플레이트 판독기를 사용하여 광학 밀도 450(OD450)에서 플레이트를 판독한다. O8E 항체 에피토프에 상응하는 펩타이드의 서열은 서열 394-415로서 본원에 개시한다. O8E 폴리클로날 항혈청이 인식하는 항체 에피토프는 도 17에 개시한다.
실시예 4
본 실시예는 난소암 조직 샘플에서의 O8E 발현의 IHC 분석을 개시한다.
면역조직화학 연구를 위해, 파라핀-매봉 포르말린 고정된 난소암 조직을 8마이크론 절편으로 분할한다. 최적의 염색 조건을 위해 0.1M 시트르산나트륨 완충액(pH 6.0) 중의 증기열 유도된 에피토프 회수물(SHIER)을 사용한다. 절편을 10% 혈청/PBS와 함께 5분 동안 배양한다. 1차 항체(항-O8E 토끼 친화성 정제 폴리클로날 항체)를 각 절편에 25분 동안 첨가한 다음, 항-토끼 비오티닐화 항체와 함께 25분 동안 배양한다. 내인성 퍼옥시다제 활성을 수소 퍼옥시다제와 함께 1.5분씩 3회 배양하여 차단시킨다. 아비딘 비오틴 복합체/양고추냉이 퍼옥시다제 시스템을 DAB 발색원과 함께 사용하여 항원의 발현을 가시화한다. 다음, 슬라이드를 헤마톡실린으로 대비 염색한다. 6개의 난소암 조직 절편 중 하나(장액성 유두 암종)가 O8E 면역반응성을 나타낸다. 염색 조건의 최적화시, O8E 폴리클로날 항체를 사용하면 4/5 난소암 샘플이 양성으로 염색된다. O8E 발현은 혈장 막에 국재화된다.
6개의 난소암 조직을 항-O8E 토끼 폴리클로날 항체로 분석한다. 6개의 난소암 조직 샘플 중 하나(장액성 유두 암종)가 O8E 발현에 대해 양성으로 염색된다. O8E 발현은 표면 막에 국재화된다.
실시예 5
본 실시예는 HLA-A2에 결합하고 사람에서의 CD8 T 세포 반응에 대해 면역원성인 것으로 추정되는 O8E 펩타이드를 개시한다.
O8E의 잠재적 HLA-A2 결합 펩타이드는 O8E로부터의 전장 오픈-리딩 프레임(ORF)을 사용하고, 이를 MHC 결합 펩타이드 추정에 사용되는 프로그램인 "Episeek"을 통해 작업함으로써 추정한다. 사용된 프로그램은 문헌[참조: Parker, K.C. et al., J. Immunol.152(1):163-175 (1994), 이의 전체 내용이 본원에 참고로 인용됨]에 공개된 알고리듬에 기초한 것이다. HLA-0201에 결합하는 것으로 추정되는 10량체 및 9량체 펩타이드를 각각 서열 416-435 및 서열 436-455로서 본원에 개시한다.
실시예 6
본 실시예는 형광 활성화 세포 분류법에 의해 측정된 O8E 세포 표면 발현을 개시한다.
FACS 분석을 위해, 세포를 빙냉 염색 완충액(PBS/1% BSA/아지드)으로 세척한다. 다음, 세포를 친화성 정제된 토끼 항-B305D 폴리클로날 항체 10㎍/ml와 함께 빙상에서 30분 동안 배양한다. 세포를 염색 완충액으로 3회 세척하고, 염소 항-토끼 Ig(H+L)-FITC 시약(Southern Biotechnology) 1:100 희석액과 함께 빙상에서 30분 동안 배양한다. 3회 세척한 후, 세포를 투과성 세포의 동정을 가능하게 하는 생체 염색약인 요오드화프로듐을 함유하는 염색 완충액에 재현탁시키고, FACS에 의해 분석한다. O8E 표면 발현은 O8E에 대해 cDNA를 안정적으로 과발현시키는 SKBR3 유방암 세포와 HEK293 세포 상에서 확인한다. 대조용으로 비관련 플라스미드 DNA로 안정하게 형질감염된 MB415 세포 또는 HEK293 세포는 어느 것도 O8E의 표면 발현을 나타내지 않는다(도 18 및 도 19).
실시예 7
본 실시예는 O8E의 발현 및 표면 국재화를 추가로 평가한다.
면역화에 사용되는 항원의 발현 및 정제를 위해, 이. 콜라이 재조합 발현 시스템에서 발현시킨 O8E를 적합한 항생제를 첨가한 LB 배지에 첨가하여 진탕 배양기에서 37℃하에 하룻밤 동안 증식시킨다. 다음날 아침, 밤새 배양한 배양물 10ml를 2L-배플 장착된 에를렌마이어 플라스크 중의 2x YT + 적합한 항생제 500ml에 첨가한다. 배양물의 광학 밀도(560nm에서)가 0.4 내지 0.6에 도달할 경우, 세포를 IPTG(1mM)로 유도한다. IPTG로 4시간 동안 유도한 후, 세포를 원심분리하여 수거한다. 다음, 세포를 인산염 완충 식염수로 세척하고, 다시 원심분리한다. 상청액을 폐기하고, 세포를 이후 사용을 위해 동결시키거나 즉시 처리한다. 용해 완충액 20ml를 세포 펠릿에 첨가하고, 와동시킨다. 다음, 이. 콜라이 세포를 개열시키기 위해, 혼합물을 16,000psi의 압력하에 후렌치 프레스(French Press)를 통과시킨다. 다음, 다시 세포를 원심분리하고, 상청액과 펠릿을 SDS-PAGE에 의해 재조합 단백질의 분획화를 조사한다. 세포 펠릿에 국재화된 단백질을 위해, 펠릿을 10mM Tris pH 8.0, 1% CHAPS에 재현탁시키고, 봉입체 펠릿을 세척한 다음, 다시 원심분리한다. 이 과정을 2회 이상 반복한다. 세척된 봉입체 펠릿을 8M 우레아 또는 6M 구아니딘 HCL + 10mM Tris pH 8.0 + 10mM 이미다졸로 가용화시킨다. 가용화된 단백질을 니켈-킬레이트 수지(Qiagen) 5ml에 첨가하고, 연속 진탕하에 실온에서 45분 내지 1시간 동안 배양한다. 배양 후, 수지와 단백질 혼합물을 1회용 컬럼을 통해 주입한 후, 유출물을 수거한다. 다음, 컬럼을 가용화 완충액 10 내지 20컬럼 용적으로 세척한다. 8M 우레아, 10mM Tris pH 8.0 및 300mM 이미다졸을 사용하여 컬럼으로부터 항원을 용출시키고, 3ml 분획으로 수거한다. 다음, SDS-PAGE 겔을 통해 진행시켜 컬럼으로부터 추가의 정제를 위해 풀링시킬 분획을 결정한다. 최종 정제 단계로서, Hi-Prep Q(Biorad)와 같은 강한 음이온 교환 수지를 적합한 완충액으로평형화시키고, 상기로부터 풀링된 분획을 컬럼 상에 충전시킨다. 염 구배를 증가시키면서 각각의 항원을 컬럼으로부터 용출시킨다. 컬럼을 진행시키면서 분획을 수집하고, 별도로 SDS-PAGE 겔을 진행시켜 컬럼으로부터 풀링시킬 분획을 결정한다. 풀링된 분획은 10mM Tris pH 8.0에 대하여 투석한다. 다음, 당해 물질을 SDS-PAGE 또는 HPLC에 의해 측정된 바와 같은 허용가능한 순도, Lowry 검정법 또는 아미노산 분석에 의해 측정된 바와 같은 농도, 아미노 말단 단백질 서열분석에 의해 측정된 바와 같은 동일성 및 Limulus(LAL) 검정에 의해 측정된 바와 같은 내독소 수준에 대해 평가한다. 다음, 단백질을 0.22마이크론 필터를 통해 여과한 후, 바이알에 담고, 면역화에 필요할 때까지 동결시켜 둔다.
폴리클로날 항혈청의 생성을 위해, 각 전립선 항원 400㎍을 뮤라밀디펩타이드(MDP) 100㎍과 혼합한다. 동량의 불완전 프로인트 애주번트(IFA)를 첨가한 다음, 혼합한다. 동량의 IFA와 혼합한 항원 100㎍을 4주마다 동물에게 추가 주사한다. 각 추가 주사 후 7일째 동물의 혈액을 채취한다. 혈액을 4℃에서 12 내지 24시간 동안 배양한 후 원심분리하여 혈청을 수득한다.
폴리클로날 항혈청의 특성화를 위해, 96웰 플레이트를 항원 50㎕(전형적으로는 1㎍)와 4℃에서 20시간 동안 배양하여 피복시킨다. 다음, BSA 차단 완충액 250㎕를 웰에 첨가하고, RT에서 2시간 동안 배양한다. 플레이트를 PBS/0.01% Tween으로 6회 세척한다. 항-O8E 토끼 혈청 또는 친화성 정제된 항-O8E 항체를 PBS로 희석한다. 희석된 항체 50㎕를 각 웰에 첨가하고, RT에서 30분 동안 배양한다. 플레이트를 전술한 바와 같이 세척한 다음, 1:10000 희석률의 염소 항-토끼 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 50㎕를 첨가하여, 실온에서 30분 동안 배양한다. 플레이트를 전술한 바와 같이 세척하고, TMB 마이크로웰 퍼옥시다제 기질 100㎕를 각 웰에 첨가한다. 실온의 암실에서 15분간 배양한 후, 발색 반응을 1N H2SO4100㎕로 정지시키고, 즉시 450nm에서 판독한다. 모든 폴리클로날 항체는 O8E 항원에 대한 면역반응성을 나타낸다.
포유동물 HEK293 세포에서의 재조합 발현을 위해, 전장 O8E cDNA를, 각각 His 및 FLAG 에피토프 태그를 포함하도록 변형시킨 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1+ 및 pCEP4(Invitrogen)에 서브클로닝시킨다. 이들 작제물을 Fugene 6 시약(Roche)을 사용하여 HEK293 세포(ATCC)에 형질감염시킨다. 간략하게, HEK293 세포를 10% FBS(Hyclone)를 함유하는 DMEM(Gibco) 중에 100,000개 세포/ml의 밀도로 플레이팅시켜, 하룻밤 동안 증식시킨다. 다음날, Fugene 6 2㎕를 FBS를 함유하지 않는 DMEM 100㎕에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 배양한다. 다음, Fugene 6/DMEM 혼합물을 O8E/pCEP4 또는 O8E/pcDNAA3.1 플라스미드 DNA 1㎍에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 배양한다. 다음, Fugene/DNA 혼합물을 HEK293 세포에 첨가하고, 7% CO2하에 37℃에서 48 내지 72시간 동안 배양한다. 세포를 PBS로 세정한 다음, 수거하여 원심분리에 의해 펠릿화한다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 세포를 빙상의 Triton-X100을 함유하는 용해 완충액에서 30분 동안 배양하여, 전세포 용해물을 제조한다. 다음, 용해물을 4℃에서 10,000rpm으로 5분 동안 원심분리에 의해 청정화한다. 샘플을 베타-머캅토에탄올을 함유하는 SDS-PAGE 충전 완충액으로 희석한 다음, SDS-PAGE 겔에 충전하기 전에 10분 동안 가열한다. 단백질을 니트로셀룰로스로 전이시키고, 1:750 희석률의 항-O8E 토끼 폴리클로날 혈청 #2333L을 사용하여 프로빙시킨다. 블롯은 HRP에 결합되어 ECL 기질 중에서 배양된 염소 항-토끼 Ig로 발현된다.
FACS 분석을 위해, 세포를 빙냉시킨 염색 완충액(PBS + 1% BSA + 아지드)으로 추가 세척한다. 다음, 세포를 프로테인 A 정제된 항-O8E 폴리클로날 혈청 10㎍/ml와 빙상에서 30분 동안 배양한다. 당해 세포를 염색 완충액으로 3회 세척한 다음, 1:100 희석률의 염소 항토끼 Ig(H+L)-FITC 시약(Southern Biotechnology)과 빙상에서 30분 동안 배양한다. 3회 세척한 후, 세포를 투과성 세포의 동정을 가능하게 하는 생체 염색약인 요오드화프로피듐(PI)을 함유하는 염색 완충액에 재현탁시키고, FACS에 의해 분석한다.
이들 실험으로부터, 도 20 및 21에 제시된 결과와 같이 O8E 발현은 토끼 항-O8E 혈청을 사용한 FACS 분석에 의해 형질감염된 HEK293 세포 및 SKBR3 세포의 표면 상에서 검출된다. 또한, 발현은 형질감염된 HEK293 세포 용해물에서 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출된다(도 22).
실시예 8
항-O8E mAb의 생성 및 특성화
이. 콜라이 유래의 O8E 단백질에 대하여 다음과 같이 마우스 모노클로날 항체를 생성시킨다. 재조합 O8E 50㎍를 함유하는 완전 프로인트 애주번트(CFA)를 복강내(IP) 주사한 다음, 재조합 O8E 단백질 10㎍을 함유하는 불완전 프로인트 애주번트(IFA)를 후속적인 복강내 추가 주사하여 A/J 마우스를 면역화시킨다. 비장을 제거하기 3일 전에, 가용성 O8E 재조합 단백질 약 50㎍을 정맥내로 주사하여 마우스를 면역화시킨다. O8E에 대해 양성 역가를 갖는 마우스의 비장을 분리하고, 단세포 현탁액을 제조한 다음, SP2/0 골수종 세포와 융합시켜, B 세포 하이브리도마를 생성시킨다. 하이브리드 클론 유래의 상청액을 ELISA에 의해 재조합 O8E에 대한 특이성을 시험하고, 전체 O8E 서열에 걸쳐있는 펩타이드를 사용하여 에피토프를 지도화한다. 또한, mAb를 유동 세포 분석기에 의해 O8E로 안정하게 형질감염된 세포 표면 및 유방 종양 세포주의 표면 상에 존재하는 O8E를 검출하는 이들의 활성에 대해 시험한다.
ELISA 분석을 위해, 96웰 플레이트를 재조합 O8E 단백질 또는 전체 O8E 분자에 걸쳐있는 중복 20량체 펩타이드, 각각 1 내지 2㎍/ml 또는 10㎍/ml의 농도로 피복시킨다. 피복 후, 플레이트를 세척 완충액(PBS + 0.1% Tween-20)으로 5회 세척하고, 0.5% BSA, 0.4% Tween-20을 함유하는 PBS로 차단시킨다. 다음, 하이브리드 상청액 또는 정제된 mAb를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 60분 동안 배양한다. 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척하고, 2차 항체인 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)가 결합된 당나귀 항마우스 Ig(Jackson ImmunoResearch)를 첨가하여 60분 동안 반응시킨다. 플레이트를 다시 세척 완충액으로 5회 세척한 다음, 퍼옥시다제 기질을 첨가한다. 생성된 하이브리도마 클론 중에서 15개의 클론이 전체 O8E 단백질을 인식하는 mAb를 분비한다. 에피토프 지도화 결과, 이와 같은 15개의클론 중에서 14개의 클론이 O8E 아미노산 잔기 61-80을 인식하는 mAb를 분비하고, 하나의 클론이 아미노산 잔기 151-170을 인식하는 mAb를 분비하는 것으로 밝혀졌다.
유동 세포 분석을 위해, O8E mRNA을 발현시키는 O8E 및 SKBR3 세포로 안정하게 형질감염된 HEK293 세포를 수거하여 유동 염색 완충액(PBS + 1% BSA + 아지드)으로 세척한다. 세포를 mAb 하이브리드 유래의 상청액과 빙상에서 30분 동안 배양한 다음, 염색 완충액으로 3회 세척한다. 세포를 빙상에서 염소-항 마우스 Ig-FITC와 30분 동안 배양한 다음, 염색 완충액으로 3회 세척한 후, 요오드화프로피듐을 함유하는 세척 완충액에 재현탁시킨다. 유동 세포 분석 결과, 15/15 mAb가 O8E 형질감염된 HEK293 세포 표면 상에 발현된 O8E 단백질을 검출할 수 있는 것으로 밝혀졌다. SKBR3 세포에 대해 시험된 6/6 mAb는 표면 발현된 O8E를 인식할 수 있다.
실시예 9
서열 O772P의 신장된 DNA 및 단백질 서열 분석
클론 3f, 6b, 8e 및 12를 포함하는 전장 서열은 실시예 2에 상세하게 기술된 난소 종양(SCID 유래) cDNA 라이브러리를 선별함으로써 수득한다. O772P로 명명된 2996개 염기쌍 서열은 서열 311에 제시하고, 암호화된 914개 아미노산 단백질 서열은 서열 312에 제시한다. DNA 서열 O772P를 Genbank를 포함한 공개 데이터베이스에서 검색한 결과, Genbank 수탁 번호 AK024365(서열 457)와 유의적인 히트를 나타낸다. 이러한 Genbank 서열은 길이가 3557개 염기쌍이고, 1156개 아미노산 길이의단백질(서열 459)을 암호화하는 것으로 밝혀졌다. 이 서열의 절단형 잔기 25-3471(잔기 25는 Genbank 서열(서열 456)의 첫 ATG 개시 코돈에 상응함)이 길이가 1148개 아미노산인 단백질(서열 458)을 암호화한다. 공개된 DNA 서열(서열 457)은 서열 457의 염기 958-962에 상응하는 5개 염기쌍 삽입물을 갖는다는 점에서 O772P와 상이하다. 이러한 삽입물은 서열 457이 O772P에 대한 부가의 N-말단 단백질 서열(서열 312)을 암호화하도록 프레임 이동을 발생시킨다. 또한, O772P는 잔기 1-79(서열 460)에 함유된 특유한 N-말단부를 암호화한다. 또한, 서열 456의 N-말단부인 잔기 1-313은 특유한 서열을 함유하며, 서열 461로서 기재한다.
실시예 10
분자 O772P의 세포 관련 발현 패턴의 면역조직화학 및 유동 세포분석을 위한 폴리클로날 항체의 생성
O772P 분자는 본 명세서의 실시예 2와 9에서 동정한다. 다양한 조직에서의 항원 발현의 아세포 국재화 및 특이성을 조사하기 위해, O772P에 대해 폴리클로날 항체를 생성시킨다. 항체 제조를 위하여 O772P-1(서열 312의 아미노산 44-772) 및 O772P-2(서열 312의 477-914)를 이. 콜라이 재조합 발현 시스템에서 발현시키고, LB 배지에서 37℃하에 하룻밤 동안 증식시킨다. 다음날, 하룻밤 배양한 배양물 10ml를 적합한 항생제를 함유하는 2x YT 500ml에 첨가한다. 배양물의 광학 밀도(560nm)가 0.4 내지 0.6에 도달할 경우, 세포를 IPTG로 유도한다. 유도 후, 세포를 수거하고, 세척한 다음, 용해시키고, 16000psi의 압력하에 후렌치 프레스를통과시킨다. 다음, 세포를 원심분리하고, 펠릿을 SDS-PAGE로 재조합 단백질의 분획화에 대하여 조사한다. 세포 펠릿에 국재하는 단백질을 위해, 펠릿을 10mM Tris, pH 8.0, 1% CHAPS에 재현탁시키고, 봉입체 펠릿을 세척한 다음, 원심분리한다. 세척된 봉입체는 10mM Tris, pH 8.0 + 10mM 이미다졸을 함유하는 8M 우레아 또는 6M 구아니딘 HCl로 가용화시킨다. 다음, 가용화된 단백질을 니켈-킬레이트 수지(Qiagen) 5ml에 첨가하고, 실온에서 45분 동안 배양한다.
배양 후, 수지와 단백질 혼합물을 컬럼을 통해 통과시키고, 유출물을 수거한다. 컬럼을 10 내지 20컬럼 용적의 완충액으로 세척하고, 항원을 8M 우레아, 10mM Tris, pH 8.0 및 300mM 이미다졸을 사용하여 용출시켜, 3ml 분획들로 수거한다. 다음, 추가 정제를 위해 풀링시킬 분획을 결정하기 위하여 SDS-PAGE를 실시한다. 최종 정제 단계로서, 강한 음이온 교환 수지를 적합한 완충액으로 평형화시키고, 수집된 분획을 컬럼 상에 충전시킨다. 염 구배를 증가시키면서 컬럼으로부터 각 항원을 용출시킨다. 분획을 수집하고, SDS-PAGE에 의해 분석하여, 컬럼으로부터 풀링시킬 분획을 결정한다. 풀링된 분획을 10mM Tris, pH 8.0으로 투석시키고, 생성된 단백질을 최종 발매를 위해 품질 관리에 적용시킨다. 발매 기준은 다음과 같다: (a) SDS-PAGE 또는 HPLC에 측정된 바와 같은 순도, (b) Lowry 분석 또는 아미노산 분석에 의해 측정된 바와 같은 농도, (c) 아미노 말단 단백질에 의해 측정된 바와 같은 동일성 및 (d) Limulus(LAL) 검정에 의해 측정된 바와 같은 내독소 수준. 다음, 단백질은 0.22μM 필터를 통해 여과시키고, 면역화에 필요할 때까지 동결시켜 둔다.
폴리클로날 항혈청을 생성시키기 위해, O772P-1 또는 O772P-2 400㎍을 뮤라밀디펩타이드(MDP) 100㎍과 혼합한다. 동량의 불완전 프로인트 애주번트(IFA)와 혼합한 항원 100㎍으로 4주마다 토끼를 면역화시킨다. 추가 항원 주사 후 7일째, 동물의 혈액을 채취하고, 혈액을 4℃에서 12 내지 24시간 동안 배양한 다음, 원심분리하여 혈청을 수득한다.
당해 항혈청을 특성화하기 위해, 96웰 플레이트를 항원으로 피복시킨 다음, BSA로 차단시킨다. 토끼 혈청을 PBS로 희석하고, 각 웰에 첨가한다. 다음, 플레이트를 세척하고, 염소 항-토끼 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)를 첨가한다. 플레이트를 다시 세척하고, TMB 마이크로웰 퍼옥시다제 기질을 첨가한다. 배양 후, 발색 반응을 정지시키고, 플레이트를 450nm에서 즉시 판독한다. 모든 폴리클로날 항체는 적합한 항원에 대해 면역반응성을 나타낸다.
O772P 발현의 면역조직화학 분석은 파라핀-매봉 포르말린으로 고정시킨 조직 상에서 수행한다. O772P는 정상 난소와 난소 종양에서는 발현되나, 정상 심장, 신장, 결장, 폐 또는 간에서는 발현되지 않는 것으로 관찰된다. 또한, 면역조직화학 및 유동 세포 분석 결과, O772P가 혈장 막에 결합된 분자인 것으로 나타난다. O772P는 아미노산 859-880에 의해 암호화되는 것으로 추정되는 하나의 혈장 경막 도메인을 포함한다. O772P의 N-말단은 세포외에 존재하고, 아미노산 1-859에 의해 암호화되는 반면, C-말단은 세포내에 존재한다. 서열 분석 결과, 17개의 잠재적 N-결합된 글리코실화 부위가 존재하는 것으로 나타난다.
실시예 11
O772P는 원발성 난소 종양 세포의 표면 상에서 발현된다
포유동물 세포에서의 재조합 발현을 위해, O772P-21008(서열 387) 및 O772P 전장 cDNA(서열 312의 단백질을 암호화하는 서열 311)를 각각 포유동물 발현 벡터 pBIB 또는 pCEP4에 서브클로닝시킨다. 이들 작제물을 Fugene 6(Roche)으로 HEK293 세포에 형질감염시킨다. 다음, HEK 세포를 태아 송아지 혈청(FBS)을 함유하는 DMEM 중에 100,000개 세포/ml의 밀도로 플레이팅시키고, 하룻밤 동안 증식시킨다. 다음날, Fugene 6 2㎕를 FBS를 함유하지 않는 DMEM 100㎕에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 배양한다. 다음, Fugene 6/DMEM 혼합물을 O772P/pBIB 또는 O772P/pCEP4 플라스미드 DNA 1㎍에 첨가하고, 실온에서 추가의 15분 동안 배양한다. 다음, Fugene 6/DNA 혼합물을 HEK293 세포에 첨가하고, 7% CO2하에 37℃에서 48 내지 72시간 동안 배양한다. 세포를 세정하고, 원심분리로 펠릿화한다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, 용해 완충액 중의 세포를 배양한 다음, 원심분리로 청정화함으로써 전세포 용해물을 생성시킨다. 당해 샘플을 희석하고, SDS-PAGE 상에서 분석한다. 다음, 겔을 니트로셀룰로스에 전이시키고, 정제된 항-O772P-2 토끼 폴리클로날 항체를 사용하여 프로빙시킨다. 블롯은 HRP가 결합된 염소 항-토끼 Ig과 반응시킨 다음, ECL 기질 중에서 배양하여 발현시킨다. 웨스턴 블롯 분석 결과, O772P-21008을 O772P로 형질감염된 HEK293 세포에서 검출할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
세포에서 O772P의 세포 발현 프로필을 측정하기 위해, 원발성 난소 종양 세포를 SCID 마우스에서 증식시킨다. 당해 마우스로부터 세포를 회수하고, 유동 세포 분석기로 분석한다. 간략하게, 세포를 PBS, 1% BSA 및 Na 아지드를 함유하는 냉 염색 완충액으로 세척한다. 세포를 정제된 항-O772P-1 및 O772P-2 폴리클로날 혈청 10㎍/ml과 30분 동안 배양한다. 배양한 후, 세포를 염색 완충액으로 3회 세척하고, FITC(Southern Biotechnology)에 결합된 염소 항-토끼 Ig(H+L)와 함께 배양한다. 세포를 세척하고, 비-생존 세포를 동정하는 생체 염색약인 요오드화프로피듐(PI)을 함유하는 염색 완충액에 재현탁시킨다. 다음, 세포를 형광 활성화 세포 분류기(FACS)를 사용하여 분석한다. FACS 분석 결과, O772P가 세포 표면에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 종양 세포 상의 O772P의 표면 발현은 치료용 항체의 면역 표적화에 도움을 줄 것이다.
실시예 12
항-O8E 모노클로날 항체의 기능적 특성화
실시예 8에 기술된 바와 같이 이. 콜라이 유래의 O8E에 대하여 생성된 마우스 모노클로날 항체(mAb)를 O8E 항원 국재화를 촉진시키는 능력에 대해 시험한다. 항체의 국재화는 시험관내 세포독성 검정법으로 측정한다. 간략하게, 정제된 항-O8E 항체 또는 대조 항체 50ng/웰의 존재하에 DME + 10% 열-불활성화 FBS를 함유하는 96웰 플레이트에 HEK293 및 O8E/HEK 형질감염된 세포를 플레이팅시킨다. 항-O8E mAb의 아이소타입은 다음과 같다: 11A6-IgG1/카파, 15C6-IgG2b/카파, 18A8-IgG2b/카파 및 14F1-IgG2a/카파. 양성 대조군으로서 작용하는 W6/32는 범 항-사람 MHC I군 마우스 모노클로날 항체이고, 음성 대조군으로서는 2개의 비관련 mAb인 Ir-Pharm과 Ir-Crxa가 포함된다. O8E 특이적 항체 또는 관련 대조 항체와 함께 배양한 후, 염소 항-마우스 Ig-사포린 결합된 2차 항체(Advanced Targeting Systems)인 mAb-zap을 웰의 절반에 100ng/웰의 농도로 첨가하고, 플레이트를 7% CO2배양기에서 37℃하에 48 내지 72시간 동안 배양한다. 이러한 분석은 내재화시 세포독성 효과를 나타내는 리보자임 불활성화 단백질인 사포린의 독성을 이용하는 것이다. mAb-zap과 함께 배양한 후, MTS 시약을 첨가한 다음, 플레이트의 OD490을 마이크로플레이트 ELISA 판독기로 판독하여 내재성을 정량화한다. 도 25는 이들 검정으로부터의 결과를 제시한다. 상부 패널은 O8E에 의해 형질감염되지 않은 HEK 세포를 제시하며, 따라서 O8E 항체는 결합하지 않고 내재되어 있어야 한다. 이들을 mAb-zap의 존재 또는 부재하에 배양하든 간에, 양성 대조 항체인 W6/32를 제외하고는 모든 샘플에서 동일한 증식 수준을 나타낸다. 하부 패널은 O8E로 형질감염되어 O8E 특이적 항체에 결합하는 세포를 제시한다. mAb-zap의 독성으로 인한 감소된 증식 수준에 의해 측정된 바와 같이 O8E의 아미노산 61-80을 인식하는 하이브리도마 11H6, 14F1 및 15C6 유래의 항체는 O8E 표면 단백질의 내재화를 촉진시킬 수 있다(도 25 참조). O8E의 아미노산 151-170을 인식하는 하이브리도마 18A8에 의해 생성된 항체는 mAb-zap의 존재 또는 부재하에 증식의 정상 수준에 의해 측정된 바와 같이 내재화를 촉진시킬 수 없다.
실시예 13
난소 종양 항원, O772P의 특성화
다양한 형태의 난소 종양 항원, O772P의 cDNA 및 단백질 서열은 위에서 기술되어 있다(예, 실시예 2 및 9). Genbank 조사 결과, O772P는 FLJ14303(수탁 번호 AK024365; 서열 457 및 463)과 고도의 유사성이 있는 것으로 나타난다. O772P 및 FLJ14303에 상응하는 단백질 서열은 각각 서열 478 및 479에 개시한다. FLJ14303은 O772P와 대부분 동일하고, 3'-말단의 대부분은 100% 상동성을 나타낸다. 그러나, FLJ14303의 5'-말단은 O772P보다 5'에 추가로 신장된 것으로 관찰된다. 또한, FLJ14303은 5bp 삽입물(서열 457)을 함유하여, FLJ14303이 O772P와는 다른 출발 메티오닌을 이용하여 상이한 단백질을 암호하게 되는 아미노 말단 단백질 서열의 프레임 이동을 나타낸다. 이와 같은 삽입물은 게놈 서열에 존재하고, 이 영역과 동일성을 나타내는 모든 EST 클론에서 관찰되어 FLJ14303(서열 457)이 신장되어, 다른 아미노 말단을 함유하는 ORF를 갖는 O772P의 스플라이스 변이체임을 암시한다. 추가의 5'-뉴클레오타이드 서열은 O772P의 게놈 지도화 동안 동정되는 반복 서열을 포함하고, O772P의 5'-말단과 FLJ14303의 상응하는 영역은 90 내지 100% 사이의 상동성을 나타낸다. 종합하면, O772P와 FLJ14303은 동일 유전자의 상이한 스플라이스 변이체로서 유전자의 5'-말단에 상이한 고유 반복 서열이 스플라이싱된 것임을 암시한다.
염색체 19의 동일 영역에서 나타나는 또 다른 10개 이상의 반복 서열은 다양한 형태의 O772P가 존재할 수 있음을 시사하는 것으로서, 각각 상이한 반복 서열의 상이한 스플라이스로 인한 상이한 5'-말단을 갖는다. O772P의 노던 블롯 분석을 통해, 상이한 크기, 몇몇 경우에는 10kb 이상의 다수의 O772P 하이브리드화 전사체를 확인한다.
추가 분석시, 13개의 추가의 O772P 관련 서열을 동정하고, 이들의 cDNA 및 아미노산 서열을 표 2에 제시한다.
서열 기술 경막 도메인
464 LS#1043400.1(cDNA) nd
465 LS#1043400.10(cDNA) 0
466 LS#1043400.11(cDNA) 2
467 LS#1043400.12(cDNA) 2
468 LS#1043400.2(cDNA) nd
469 LS#1043400.3(cDNA)
470 LS#1043400.5(cDNA) nd
471 LS#1043400.8(cDNA) 1
472 LS#1043400.9(cDNA) 0
473 LS#1043400.6(cDNA) nd
474 LS#1043400.7(cDNA) nd
475 LS#1043400.4(cDNA) nd
476 LS#1043400.1(cDNA) 0
477 1043400.10 신규 5'(cDNA) -
480 LS#1043400.9(아미노산) -
481 LS#1043400.8B(아미노산)는 경막 도메인을 함유한다 -
482 LS#1043400.8A(아미노산) -
483 LS#1043400.12(아미노산)는 경막 도메인을 함유한다 -
484 LS#1043400.11B(아미노산)는 경막 도메인을 함유한다 -
485 LS#1043400.11A(아미노산) -
486 LS#1043400.10(아미노산) -
487 LS#1043400.1(아미노산) -
nd = 측정되지 않음
먼저, 이들 서열은 특정한 스플라이스 형태의 O772P 고유의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 O772P 스플라이스 형태의 중복 및/또는 별개의 서열을 나타낸다. 그러나, 이들 서열의 뉴클레오타이드 정렬 결과, 반복 인자들내에 어떤 동일한 영역도 확인되지 않았다. 이는 이들 서열이 16개 또는 그 이상의 반복 도메인을 포함하는 한 O772P 유전자의 상이한 특정 영역을 나타낼 수 있고, 이들 모두 한 선형 전사체를 형성함을 나타낸다. 서열 LS #1043400.10(표 2; 서열 465)의 5'-말단은 O772P 및 FLJ14303 둘 모두에 대해 특유한 것으로서, 반복 요소를 전혀 포함하지 않으며, 이 서열이 O772P의 5'-말단을 나타낼 수 있음을 시사한다.
이전에, 경막 추정 분석 결과, O772P가 1 내지 3개의 경막 도메인을 포함하는 것으로 나타났다. 이는 면역조직화학 및 유동 세포 분석의 이용에 의해 O772P를 나타내는 혈장 막 결합 분자의 존재를 증명함으로써 입증된다. 그러나, 면역조직화학은 또한 O772P의 분비형의 존재를 시사하고, 아마도 이것은 O772P의 대안적인 스플라이스 형태 또는 해독후 절단 과정에 의한 것으로 추정된다. 표 2에 제시된 몇몇 서열을 분석한 결과, 서열 1043400B.12, 1043400.8B 및 1043400.11B는 모두 경막 영역을 함유하는 반면, 1043400.8A, 104300.10, 1043400.1, 1043400.11A 및 1043400.9는 모두 경막 서열이 결여된 것으로 이들 단백질들이 분비형임을 암시한다.
분석 결과, O772P의 일부는 혈장 막에서 발현되고/되거나 보유되어 O772P가 이들 단백질에 대한 특이적인 면역요법을 유도하기에 바람직한 표적, 예를 들어, 치료용 항체를 제조할 수 있는 것으로 나타난다. O772P의 추정된 세포외 도메인은 서열 489에 제시하고, 다음과 같은 서열내의 절단 반응의 결과로서 O772P의 분비가 발생할 것으로 예상된다:
SLVEQVFLD K TLNASFHWLGSTYQLVDIHVTEMESSVYQP.
단백분해적 절단은 서열 489의 위치 10에 있는 라이신(K)에서 일어날 가능성이 가장 크다. O772P의 세포외, 경막 및 세포질 영역은 모두 서열 488에 제시한다.
세포외:
SLVEQVFLDKTLNASFHWLGSTYQLVDIHVTEMESSVYQPTSSSSTQHFYLNFTITNLPYSQDKAQPGTTNYQRNKRNIEDALNQLFRNSSIKSYFSDCQVSTFRSVPNRHHTGVDSLCNFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYFPNRNEPLTGNSDLPF
경막:
WAVILIGLAGLLGLITCLICGVLVTT
세포질:
RRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ
실시예 14
난소암 및 정상 조직에서의 O8E 발현의 면역조직화학(IHC) 분석
난소암 항원 O8E를 발현하는 조직을 조사하기 위해, 다양한 범위의 조직 절편에 대하여 IHC 분석을 O8E에 대해 특이적인 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체를 사용하여 수행한다. O8E 특이적 폴리클로날 항체의 생성은 실시예 8에 상세하게 기술되어 있다. 염색에 사용되는 모노클로날 항체는 O8E의 아미노산 151-170을 인식하는 O8E 및 18A8의 아미노산 61-80에 특이적인 11A6과 14F1이다(생성에 관한 상세한 설명은 실시예 12 참조).
염색을 수행하기 위해, 조직 샘플을 포르말린 용액에 12 내지 24시간 동안 고정시키고, 파라핀에 매봉시킨 다음, 8마이크론의 분획들로 분할한다. 최적의 염색 조건을 위하여 0.1M 시트르산나트륨 완충액(pH 6.0) 중의 증기열 유도된 에피토프 회수물(SHIER)을 사용한다. 절편은 10% 혈청/PBS와 함께 5분 동안 배양한다. 1차 항체를 각 분획에 첨가하여 25분 동안 반응시킨 다음, 항-토끼 또는 항체 또는 항-마우스 비오티닐화 항체와 함께 25분 동안 배양한다. 내인성 퍼옥시다제 활성은 수소 퍼옥시다제로 1.5분씩 3회 처리하여 차단시킨다. 아비딘 비오틴 복합체/양고추냉이 퍼옥시다제(ABC/HRP) 시스템은 DAB 발색원과 함께 사용하여 항원의 발현을 가시화한다. 다음, 슬라이드를 헤마톡실린으로 대비 염색하여, 세포 핵을 가시화한다.
O8E에 대한 토끼 친화성 정제된 폴리클로날 항체를 사용한 결과(아미노산 29-283; 당해 항체의 생성에 대한 상세한 설명은 실시예 3 참조)는 표 3에 제시한다. 3개의 모노클로날 항체를 사용한 결과는 표 4에 제시한다.
폴리클로날 항체를 사용한 O8E의 면역조직화학 분석
조직 O8E 발현
난소암 양성
유방암 양성
정상 난소 양성
정상 유방 양성
혈관 양성
신장 음성
폐 음성
결장 음성
간 음성
심장 음성
모노클로날 항체를 사용한 O8E의 면역조직화학 분석
정상 조직 11A6 18A8 14F1
내피 상피 내피 상피 내피 상피
피부 2 2 0 0 1 1
피부 1 1 0 0 1 1
유방 0 1 n/a n/a 1 1
결장 0 0 0 0 0 0
공장 0 0 0 0 0 0
결장 0 0 0 0 0 0
결장 0 0 0 0 0 0
난소 0 0 0 0 1 0
결장 0 0 0 0 0 1
간 0 0 0 0 1 2
피부 0 0 0 0 1 0
십이지장 및 췌장 0 0 0 0 0 0
충수 0 0 0 0 0 0
회장 0 0 0 0 0 0
0 = 염색 안됨, 1 = 약한 염색, 2 = 중간 염색, n/a = 유효하지 않음.
실시예 15
O772P 폴리클로날 항체의 에피토프 지도화
O772P의 에피토프의 지도화를 수행하기 위해, O772P의 서열로부터 유래되는 서열을 갖는 펩타이드를 생성시킨다. 이들 펩타이드는 5개의 아미노산이 중복되고 막 지지체 상에서 화학적 합성을 통해 제조된 15량체이다. 당해 펩타이드를 이의 C 말단을 통해 Whatman 50 셀룰로스 지지체에 공유 결합시키고, N 말단은 미결합 상태로 둔다. 에피토프 특이성을 조사하기 위해, 막을 100% 에탄올로 1분 동안 적신 후, TBS/Tween/Triton 완충액(50mM Tris, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 0.5% BSA, 0.05% Tween 20, 0.05% Triton X-100, pH 7.5)에서 16시간 동안 차단시킨다. 다음, 펩타이드를 2종의 O772P 특이적 항체인 O772P-1(서열 312의 아미노산 44-772)와 O772P-2(서열 312의 477-914; 항체 제조에 대한 상세한 설명은 실시예 10 참조)는 물론 대조용 비관련 토끼 항체로 프로빙시킨다. 항체는 1㎍/ml로 희석시키고, 막과 실온에서 2시간 동안 배양한다. 다음, 막을 TBS/Tween/Triton 완충액으로 30분 동안 세척한 다음, 1:10,000 희석률의 HRP-결합된 항-토끼 2차 항체와 함께 2시간 동안 배양한다. 막을 다시 TBS/Tween/Triton으로 30분 동안 세척하고, ECL을 사용하여 항-펩타이드 반응성을 가시화한다. O772P-폴리클로날 항체 각각에 대한 특이적 에피토프 결합 특이성은 표 5에 기술한다.
서열 번호 펩타이드 # 항-O772P1 항-O772P2 펩타이드 서열
490 2 *** - TCGMRRTCSTLAPGS
491 6 * */- CRLTLLRPEKDGTAT
492 7 * - DGTATGVDAICTHHP
493 8 - - CTHHPDPKSPRLDRE
494 9 *** *** RLDREQLYWELSQLT
495 11 */- - LGPYALDNDSLFVNG
496 13 **** - SVSTTSTPGTPTYVL
497 22 - - LRPEKDGEATGVDAI
498 24 ** */- DPTGPGLDREQLYLE
499 27 */- - LDRDSLYVNGFTHRS
500 40 */- - GPYSLDKDSLYLNGY
501 41 - - YLNGYNEPGPDEPPT
502 47 *** *** ATFNSTEGVLQHLLR
503 50 - *** QLISLRPEKDGAATG
504 51 - ** GAATGVDTTCTYHPD
505 52 - */- TYHPDPVGPGLDIQQ
506 53 - * LDIQQLYWELSQLTH
507 58 - * HIVNWNLSNPDPTSS
508 59 - * DPTSSEYITLLRDIQ
509 60 - * LRDIQDKVTTLYKGS
510 61 - *** LYKGSQLHDTFRFCL
511 71 - ** DKAQPGTTNYQRNKR
*=상대적 반응성 수준, -; 결합 안됨, ****; 최대 결합
실시예 16
O772P와 관련된 새로운 N-말단 반복 구조의 동정
다양한 형태의 O772P cDNA 및 단백질을 전술한 바와 같이(예, 실시예 1, 2, 9 및 14) 동정하고 특성화한다. 중요하게는, O772P RNA와 단백질은 정상 조직에 비해 난소암 조직에서 과발현되어, 난소암 진단 및 치료 용도의 흥미로운 표적을 제공하는 것으로 입증되었다.
O772P와 상동성이 있는 것으로서 전술한 바와 같이 동정된 게놈 뉴클레오타이드 서열 유래의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 생물정보 분석으로 조사한 결과, O772P 단백질을 암호화하는 유전자의 5' 영역에서 다수의 뉴클레오타이드 반복 서열을 동정한다. 이와 같은 다수의 반복 서열은 각 반복물들에 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 통해 확인된다. 다수의 반복물을 포함하는 단편을 cDNA로부터 증폭시켜 특정 반복물들의 존재를 확인하고, 이들 반복물들의 순서를 정한다.
예상치 않게, 여러 데이터베이스와 실험 자료들로부터 수득된 다양한 O772P 서열 세트를 분석할 경우, 서로 유의적인 수준의 동일성을 갖는 20개 이상의 상이한 반복 서열(표 6 참조)이 O772P 유전자의 5' 영역과 이에 상응하는 O772P 단백질의 N-말단 영역에서 동정된다. 각 반복물은 하나 이상의 다른 반복물과 스플라이싱시킬 수 있어 반복물의 콘카토머(concatomer)가 다양한 수와 순서로 형성하게 되는 폴리펩타이드 단위를 암호화하는 인접 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 흥미롭게는, 본 명세서에서 O772P과 관련하여 기술한 것과 유사한 반복 구조 도메인을 갖는 다른 분자들이 과학지에 기술된 바 있다. 예를 들어, 호흡관, 소화관 및 비뇨생식관의 내면에서 세포 표면을 덮는 점액질의 주요 당단백질 성분인 뮤신계의 단백질은 뮤신마다 수, 길이 및 아미노산 서열이 상이한 직렬 반복 서열로 이루어진 것으로 제시되어 있다[참조: Perez-Vilar and Hill, J. Biol. Chem. 274(45):31751-31754, 1999].
본 명세서에 기술된 동정된 다양한 반복 구조는 가장 가능성이 있는 것으로 대체 스플라이싱에 의해 다수의 O772P 형태를 생성하는 것으로 예상된다. 동정된 반복물의 cDNA 서열은 서열 513-540, 542-546 및 548-567에 제시한다. 이들 반복물의 암호화된 아미노산 서열은 서열 574-593에 제시한다. 다수의 경우, 이들 아미노산 서열은 1회 이상의 실험으로 유도된 서열의 정렬로부터 유래되는 컨센서스 서열을 나타낸다.
이들 스플라이스 형태는 각각 경막 영역을 포함하는 O772P의 카복시 말단 단백질 불변부에 다수의 반복 도메인들이 부착되어 있는 고유 O772P 단백질을 암호화할 수 있다. 이러한 O772P 불변 영역의 cDNA 서열은 서열 568에 제시하고, 암호화된 아미노산 서열은 서열 594에 제시한다.
구입된 유용한 O772P 서열을 동정가능한 반복물로 분해하고, 이들 서열을 가중 잔기 중량표를 이용하는 Clustal 방법(DNASTAR 서열분석 패키지 중의 MegAlign 소프트웨어)으로 비교하여 반복 서열간의 관계를 동정한다. 이들 정보와 RT-PCR을 통해 제공되는 순서 데이터 및 SeqMan(DNASTAR)을 통한 서열 정렬(자동 및 수동)을 이용하여, 20개의 독특한 반복 단위를 포함하는 하나의 예시적인 컨센서스 전장 O772P 콘티그 서열을 동정한다. 이들 O772P cDNA 콘티그에 대한 cDNA는 서열 569에 제시하고, 암호화된 아미노산 서열은 서열 595에 제시한다. 이와 같은 형태의 O772P 단백질은 다음과 같은 순서로 다음의 컨센서스 반복 구조를 포함한다:
서열 572-서열 574-서열 575-서열 576-서열 577-서열 578-서열 579-서열 580-서열 581-서열 582-서열 583-서열 584-서열 585-서열 586-서열 587-서열 588-서열 589-서열 590-서열 591-서열 592-서열 593.
따라서, 서열 595는 O772P 단백질에 대한 하나의 예시적인 전장 컨센서스 서열을 나타낸다. 그러나, 전술한 바와 같이 현재 통상적으로 알고 있는 이들 단백질에 대한 지식과 유사한 반복 구조를 포함하는 단백질에 대하여 기술하고 있는 과학지의 설명을 기초로 하여 볼 때 O772P의 다수의 다른 형태들은 많거나 적은 반복물들을 갖는 것들로 존재할 것으로 예상된다. 또한, O772P의 다수의 형태는 이들 N-말단 반복 구조의 상이한 배열, 예를 들어, 상이한 순서들에 의해 나타나는 것으로 추정된다. 상이한 수의 반복물을 갖는 O772P의 다양한 형태들의 존재는 O772P의 노던 분석을 통해 입증된다. 본 연구에서, O772P-특이적 프로브를 이용한 노던 하이브리드화 결과, 다수의 O772P-하이브리드 전사체들의 스미어 현상이 발생하고, 일부는 10kb를 초과한다.
따라서, O772P 단백질의 가변 반복 영역은 구조식 Xn-Y으로 예시적으로 표현할 수 있으며, 여기서 X는 서열 596에 기술된 컨센서스 반복 서열과 50% 이상의 동일성을 갖는 반복 구조를 포함하고; n은 단백질에 존재하는 반복물의 수로서, 일반적으로 1 내지 약 35의 정수일 것으로 예상되며; Y는 서열 594에 제시된 O772P 불변 영역 서열 또는 서열 594와 80% 이상의 동일성을 갖는 서열들을 포함한다. O772P 분자의 Xn 반복 영역에 존재하는 각각의 X는 상이하다.
각각의 20개 반복 영역의 컨센서스 서열을 조사하기 위해, 별개의 반복 영역에 대해 실험적으로 결정된 서열을 정렬시키고, 컨센서스 서열을 결정한다. 각 반복 영역들의 컨센서스 서열을 조사하는 것 외에, 컨센서스 반복 서열도 조사한다. 이들 서열은 20개의 별개의 컨센서스 서열을 정렬시켜 수득한다. 반복물의 가변성은 각 반복 영역들에서 수득된 컨센서스 아미노산 서열을 전체 반복 컨센서스 서열과 정렬시킴으로써 측정한다. 동일성 데이터는 표 6에 제시한다.
컨센서스 반복 서열을 참조로 한 반복 서열의 동일성 퍼센트
반복물 번호(아미노산) 서열 번호 컨센서스 반복 서열에 대한 동일성 퍼센트
2 574 88
3 575 84
4 576 88
5 577 89
6 578 93
7 579 90
8 580 91
9 581 88
10 582 85
11 583 86
12 584 87
13 585 87
14 586 89
15 587 89
16 588 89
17 589 83
18 590 84
19 591 83
20 592 57
21 593 68
상기한 바로부터, 본 발명의 특정 양태가 예시의 목적으로 본원에 기술되어 있으나, 다양한 변형이 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 이루어질수 있음은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구의 범위에 의해서만 한정된다.

Claims (35)

  1. 구조식 Xn-Y(여기서, X는 서열 596에 기술된 컨센서스 O772P 반복 서열과 50% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 폴리펩타이드내에 존재하는 각각의 X는 상이하며; Y는 서열 594에 제시된 O772P 불변 영역 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; n은 1 내지 35의 정수이다)를 갖는 O772P 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, X가 서열 574-593 중의 어느 하나로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, Y가 서열 594에 제시된 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, n이 15 내지 25의 정수인 폴리펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, n이 20인 폴리펩타이드.
  6. 제1항에 있어서, 서열 595를 포함하는 폴리펩타이드.
  7. 제1항에 있어서, 정상 조직과 비교하여 난소암 세포에서 과발현되는 폴리펩타이드.
  8. 구조식 Xn-Y(여기서, X는 서열 574 내지 593 중의 어느 하나로 이루어진 그룹으로부터 선택된 O772P 반복 서열을 포함하고, 폴리펩타이드내에 존재하는 각각의 X는 상이하며; Y는 서열 594에 제시된 O772P 불변 영역 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; n은 15 내지 25의 정수이다)를 갖는 O772P 폴리펩타이드.
  9. 제8항에 있어서, n이 20인 폴리펩타이드.
  10. 제8항에 있어서, 서열 595를 포함하는 폴리펩타이드.
  11. 제8항에 있어서, 정상 조직과 비교하여 난소암 세포에서 과발현되는 폴리펩타이드.
  12. 구조식 Xn-Y(여기서, n은 20이고, X는 서열 574-서열 575-서열 576-서열 577-서열 578-서열 579-서열 580-서열 581-서열 582-서열 583-서열 584-서열 585-서열 586-서열 587-서열 588-서열 589-서열 590-서열 591-서열 592-서열 593의 O772P 반복 서열을 포함하고; Y는 서열 594에 제시된 서열을 포함한다)를 갖는O772P 폴리펩타이드.
  13. 제12항에 있어서, 서열 595를 포함하는 폴리펩타이드.
  14. 제12항에 있어서, 정상 조직과 비교하여 난소암 세포에서 과발현되는 폴리펩타이드.
  15. 구조식 Xn-Y(여기서, X는 서열 512-540, 542-546 및 548-567 중의 어느 하나로 이루어진 그룹으로부터 선택된 O772P 반복 서열을 포함하고, 폴리뉴클레오타이드내에 존재하는 각각의 X는 상이하며; Y는 서열 568에 제시된 O772P 불변 영역 서열과 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; n은 1 내지 35의 정수이다)를 갖는 O772P 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제15항에 있어서, 서열 569에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제15항에 있어서, n이 15 내지 25인 폴리뉴클레오타이드.
  18. 제15항에 있어서, n이 20인 폴리뉴클레오타이드.
  19. 제15항에 있어서, 정상 조직과 비교하여 난소암 세포에서 과발현되는 폴리뉴클레오타이드.
  20. (a) 서열 464-477 및 512-569에 제시된 서열;
    (b) 서열 464-477 및 512-569에 제시된 서열의 보체;
    (c) 서열 464-477 및 512-569에 제시된 서열의 20개 이상의 연속 잔기로 이루어진 서열;
    (d) 고도의 엄격한 조건하에 서열 464-477 및 512-569에 제시된 서열과 하이브리드하는 서열;
    (e) 서열 464-477 및 512-569의 서열과 75% 이상의 동일성을 갖는 서열;
    (f) 서열 464-477 및 서열 512-569의 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열; 및
    (g) 서열 464-477 및 512-569에 제시된 서열의 축퇴성 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  21. (a) 제20항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 서열;
    (b) 제20항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 서열; 및
    (c) 제20항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된폴리펩타이드.
  22. 발현 조절 서열에 작동가능하게 결합된 제20항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  23. 제22항에 따르는 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포.
  24. 제21항의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  25. (a) 생물학적 샘플을 환자로부터 수득하는 단계;
    (b) 생물학적 샘플을 제21항의 폴리펩타이드에 결합하는 결합제와 접촉시키는 단계;
    (c) 결합제에 결합하는 폴리펩타이드의 양을 샘플 중에서 측정하는 단계;
    (d) 폴리펩타이드의 양을 미리 측정된 컷오프 값과 비교하여, 이로부터 환자에서의 암의 존재를 결정하는 단계를 포함하여,
    환자에서의 암의 존재를 검출하는 방법.
  26. 제21항에 따르는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질.
  27. T 세포를
    (a) 제21항에 따르는 폴리펩타이드;
    (b) 제20항에 따르는 폴리뉴클레오타이드; 및
    (c) 제20항에 따르는 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 항원 제시 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 성분과
    T 세포의 자극 및/또는 증식을 허용하기에 충분한 조건하에 및 시간 동안 접촉시킴을 포함하여,
    종양 단백질에 특이적인 T 세포를 자극하고/하거나 증식시키는 방법.
  28. 제27항의 방법에 따라 제조된 T 세포를 포함하는 분리된 T 세포 집단.
  29. 생리학적으로 허용되는 담체 및 면역자극제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제1 성분과
    (a) 제21항에 따르는 폴리펩타이드;
    (b) 제20항에 따르는 폴리뉴클레오타이드;
    (c) 제24항에 따르는 항체;
    (d) 제26항에 따르는 융합 단백질;
    (e) 제28항에 따르는 T 세포 집단; 및
    (f) 제21항에 따르는 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제시 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제2 성분을 포함하는 조성물.
  30. 제29항의 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  31. 제29항의 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 난소암을 치료하는 방법.
  32. (a) 생물학적 샘플을 환자로부터 수득하는 단계;
    (b) 생물학적 샘플을 제21항에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열에 하이브리드하는 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계;
    (c) 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 샘플 중에서 측정하는 단계;
    (d) 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 미리 측정된 컷오프 값과 비교하여, 이로부터 환자에서의 암의 존재를 측정하는 단계를 포함하여,
    환자에서의 암의 존재를 측정하는 방법.
  33. 서열 490-511 중의 어느 하나에 제시된 하나 이상의 항체 에피토프 서열을 포함하는 O772P 폴리펩타이드.
  34. 서열 394-415 중의 어느 하나에 제시된 하나 이상의 항체 에피토프 서열을 포함하는 O8E 폴리펩타이드.
  35. 제1항의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
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