KR20030013462A - ｃＤＮＡ로 부터 개 홍역 바이러스의 구출 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 비-절편화된 네가티브-센스의 일본쇄 RNA 바이러스인 개 홍역 바이러스를 구출을 통해 재조합에 의해 생산하는 방법, 및 이로부터 형성된 면역원성 조성물에 관한 것이다. 또 다른 태양은 개 홍역 바이러스를 약독화된 바이러스 및/또는 감염성 바이러스로서 생산하는 방법에 관한 것이다. 재조합 바이러스는 cDNA 클론으로 부터 제조될 수 있으므로, 게놈내에 한정된 변화, 예를 들면 뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드 결실, 삽입, 치환 및 재배열을 지닌 바이러스가 수득될 수 있다.

Description

ｃＤＮＡ로 부터 개 홍역 바이러스의 구출{Rescue of canine distemper virus from cDNA}

외피를 갖는, 네가티브-센스의 일본쇄 RNA 바이러스는 특유하게 조직화되고 발현된다. 네가티브-센스의 일본쇄 바이러스의 게놈 RNA는 뉴클레오캡시드내에서 두 가지 주형 기능을 발휘한다: 즉, 메신저 RNA(mRNA)의 합성을 위한 주형 및 안티게놈(+) 쇄의 합성을 위한 주형. 네가티브-센스의 일본쇄 바이러스 RNA는 자신의 RNA-의존형 RNA 중합효소를 암호화하고 패키징한다. 일단, 바이러스가 감염된 세포의 세포질내로 들어가면, 단지 메신저 RNA가 합성된다. 바이러스 복제는 mRNA의 합성 후에 일어나며, 바이러스 단백질의 계속적인 합성을 필요로 한다. 새로이 합성된 안티게놈(+) 쇄는 (-)쇄 게놈 RNA의 복사체를 추가로 생성하기 위한 주형으로서 작용한다.

개 홍역 바이러스(CDV)는 모르빌리바이러스(Morbillivirus) 속의 일원이다[참조 문헌: 30]. 다른 것중에서도 홍역 바이러스, 우역 바이러스 및 페이스트 데스 페티츠(Peste des petits) 반추동물 바이러스를 포함하여, 이러한 그룹의 다른 일원과 마찬가지로, CDV는 약 16kb의 네가티브-센스 게놈의 일본쇄를 함유하는 외피를 갖는 RNA 바이러스이다[참조 문헌: 4, 18, 25]. 당해 게놈은 6개의 비-중첩 유전자 영역인, 감염된 세포에서 공지된 8개의 바이러스 폴리펩티드를 암호화하는 조직화된 3'-N-P-M-F-H-L-5'를 함유한다. 당해 바이러스 폴리펩티드는, 바이러스 게놈 RNA를 둘러싸는 뉴클레오캡시드 단백질(N), 비리온의 구조 성분인 매트릭스 단백질(M), 융합(F) 및 헤마글루틴(H) 외피 당단백질, 촉매적 중합효소 아단위(L), 및 P 유전자에 의해 암호화되는 3개의 단백질을 포함한다. P 유전자는 인단백질(P) 중합효소 아단위, 및 하류의 해독 개시 코돈으로 부터 이용되는 또 다른 판독 프레임을 이용하거나(C) mRNA 편집에 의해 생성된 프레임쉬프트(frameshift)를 이용하여(V) 형성된 비구조 단백질(C 및 V)를 포함한다.

CDV는 개에서 질병을 일으키는 것으로서 가장 잘 알려져 있다[참조 문헌: 4, 18]. 당해 바이러스는 통상 에어로졸에 의해 전파되고 초기 감염은 상기도 상피에서 일어난다. 이어서, 감염이 림프계 조직으로 전파되어, 면역억제를 일으키고 또한 당해 바이러스를 여러 기관 및 세포 유형으로 유포시킨다. 일부 동물은 수일 내지 수주 내에 상기 질병으로 부터 회복되고, 비교적 다수의 동물은 신경학적 증상을 수반하는 진행성 탈수초 질환을 유발하는 중추신경계의 활성 감염을 발병시킬 것이다. 이러한 질병은 사람 탈수초 질환에 대한 모델로서 연구된다[참조 문헌: 52, 57].

비록 전통적으로 개의 감염증과 관련이 있었지만, 개량된 검출 기법을 이용한 최근의 연구로 부터, CDV가 광범위한 숙주를 감염시킨다는 것이 증명되었다[참조 문헌: 4, 11, 18, 52]. 사육 개와 야생 개, 여우, 늑대 및 코요테를 포함한 모든 개과 동물이 감염될 수 있다. 또한, CDV가 미국내 동물원 및 아프리카에 사는 사자 및 호랑이를 포함한 큰 고양이류 동물의 사망과도 연관이 있다. 물범과 동물에서의 CDV 발병도 또한 보고되었으며, 또한 당해 바이러스는 밍크, 담비 및 너구리와 같은 작은 육식동물에서도 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. CDV는 파제트병 및 다발성 경화증과 같은 일부 사람 질환에서 감염을 일으킬 수 있는 것으로 생각되어왔다[참조 문헌: 14, 19, 28]. 모르빌리바이러스 그룹의 다른 일원은 제한된 숙주 범위를 나타내기 때문에, 이러한 비교적 넓은 숙주 범위는 모빌리바이러스중에서는 오히려 독특한 것이다.

약독화된 CDV 생 백신은 사육 개 집단에서 질병을 통제하는데 효과적이나,추가적 백신 연구를 필요로 한다. 3종의 통용되는 백신이 감염될 수 있는 모든 동물 집단에서 사용될 수는 없다[참조 문헌: 4, 18, 52]. 담비, 여우, 일부 큰고양이류, 붉은 펜더, 및 아프리카 야생 개는 백신 계통에 의한 질병에 걸릴수 있으며, 이 때문에 CDV 감염으로 부터 동물을 보호하고자 하는 동물원 및 야생생물 공원은 특별한 문제를 갖게되었다. 또한, CDV의 넓은 숙주 범위는, 항원성 변이 및 추가적 새로운 숙주에 대한 적응성에 대한 상당한 잠재성이 있을 수 있다는 점을 제시한다. 따라서, 보다 넓은 범위의 동물에의 투여에 안전한 백신이 유용하며, 이들 백신을 용이하게 조작할 수 있다면, 미래의 항원성 변이를 고려하여 하는 것이 유익할 것이다.

새로운 CDV 백신이 연구되고 있다. 예를 들면, CDV 당단백질을 발현하는 재조합 백시니아(vaccina) 바이러스 또는 캐나리폭스(canaryfox) 계의 백신이 개 및 담비에서 시험되었으며[참조 문헌: 34, 51], 이들 백신은 성공적으로 보호 면역 반응을 유도한다. 그러나, 이러한 면역 반응의 지속이 통상의 CDV 생 백신에 의해 유도되는 반응과 동등한 것인지는 아직 측정되지 않았다[참조 문헌: 4]. CDV 당단백질계 DNA 백신이 마우스에서 시험되었다. 면역화된 마우스는 CDV의 신경독성주를 뇌내 챌린지(challenge)하여도 생존하였으나, 일부 마우스는 감염으로 부터 완전히 보호되지 않을 수 있다[참조 문헌: 48]. 이들 기술을 시험하는 것외에, 광범위한 숙주에서의 안전성을 향상시키기 위하여, 약독화된 CDV 생 백신을 개량하려는 시도가 바람직할 수 있다. 사육 개 집단에서 홍역을 통제하는데 있어서 현재 약독화된 CDV 생 백신의 성공이 입증됨으로써[참조 문헌: 4, 18, 52], 변형되고 개량된약독화된 살아있는 CDV주가 여전히 백신 개발을 위해 선택할 수 있는 중요한 것중 하나 일 수 있다는 것이 제안된다.

약독화된 CDV 생 백신의 개발을 추가로 촉진할 수 있는 중요한 기술중 하나는 비절편화된 네가티브-쇄의 RNA 바이러스를 클로닝된 DNA로 부터 회수할 수 있는 cDNA 구출 기법이다[참조 문헌: 10, 31, 40, 42]. 이는 처음 기재된 이래[참조 문헌: 38, 44], 이러한 기술을 점차 자주 사용하여, 약독화된 바이러스주를 유도하고, 유전자 분석을 수행하고, 각종 네가티브 쇄의 바이러스내에 외래 유전자를 삽입할 수 있었다[참조 문헌: 10, 31, 40, 42]. 요약하면, 비록 네가티브 쇄의 RNA 바이러스 게놈이 감염성이 아니더라도, 상기 기술에 의해 네가티브 쇄의 RNA 바이러스를 구출할 수 있다. T7 RNA 중합효소를 발현하는 형질감염된 세포에서 바이러스 게놈의 정확한 복사체를 생성하기 위하여 고안된 플라스미드 벡터내로 바이러스 게놈 cDNA를 클로닝함으로써, 구출이 이루어질 수 있다. 이러한 플라스미드는 일반적으로 포지티브 게놈 쇄의 5'말단에서 T7 RNA 중합효소 프로모터와 플랭킹되고 3'말단에서 리보자임 서열과 플랭킹된 cDNA를 함유한다. T7 RNA 중합효소에 의한 전사 개시로 바이러스 게놈의 5'말단이 형성되는 반면, T7 RNA 중합효소-유도된 1차 전사체의 리보자임 절단으로 3'말단이 형성된다. 플라스미드로 부터의 게놈을 세포내에서 합성하는 것 외에, N, P 및 L 유전자를 함유하는 T7 발현 벡터를 세포내로 도입하여, 바이러스 구출의 개시에 필요한 트랜스-작용 인자의 최소 상보체를 제공한다. 게놈 cDNA 클론 및 N, P 및 L용 발현 벡터로 공동형질감염된 세포의 적은 비율에서, 게놈 전사체가 N 단백질로 패키징되어 뉴클레캡시드 입자가 형성되면, 이는 P 및 L 단백질로 구성된 바이러스 중합효소에 대한 기질로서 작용한다. 이 단계 후, 바이러스 복제 사이클이 개시될 수 있다.

중합효소 복합체는 게놈의 3'말단, 특히 프로모터 영역에서 시스-작용 시그날을 이용하여 전사 및 복제를 개시하여 완료시킨다. 이어서, 바이러스 유전자가 게놈 주형으로 부터 3'에서 5'로의 일방향으로 전사된다. 일반적으로, 이들의 상류의 인접유전자(즉, 핵단백질 유전자(N))에 비해 하류의 유전자(예: 중합효소 유전자(L))로 부터 보다 적은 mRNA가 제조된다. 따라서, 게놈의 3'말단에 대한 상대적인 유전자의 위치에 따라 mRNA 물량의 기울기가 항상 존재한다.

이러한 비절편화된 RNA 바이러스의 유전자를 분자적 수준에서 분석하는 것이 최근까지 곤란하였는데, 그 이유는 형질감염된 플라스미드로 부터 세포내에서 생성된 RNA 또는 나출형 게놈 RNA가 감염성이 아니기 때문이다. 현재, 비절편화된 네가티브-쇄의 RNA 바이러스중 일부를 분리할 수 있는 방법을 기술하고 있는 문헌이 존재한다[참조: Schnell et al., 1994]. 본원에서는 이들 방법을 "구출"이라 칭한다. 이들 상이한 네가티브-쇄의 바이러스를 구출하기 위한 방법은 통상의 테마를 따른다; 그러나 각각의 바이러스는 성공적인 구출에 필수적인 특징적 성분을 갖는다[참조 문헌: 41, 43, 44, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 70 및 73]. 게놈 cDNA 플라스미드의 형질감염 후, RNA를 절단하여 3'말단을 형성시키는 벡터-암호화된 리보자임 서열과 파아지 T7 RNA 중합효소의 합동 작용으로 게놈 RNA의 정확한 복사체가 생성된다. 이러한 RNA는, 공동형질감염된 발현 플라스미드에 의해 초기에 공급된 바이러스 단백질에 의해 패키징되고 복제된다. 개 홍역 바이러스의 경우에, 구출방법이 아직 정립되지 않았으므로, 개 홍역 바이러스 구출 방법을 고안할 필요가 있다. 다른 RNA 바이러스에 관한 연구에 비해 개 홍역 바이러스의 생물학에 관한 광범위한 연구가 부족하기 때문에, 개 홍역 바이러스의 구출 방법을 고안하는 것이 곤란하다. 명백히, CDV 미니레플리콘 연구는 공개되지 않았으며, 미니레플리콘 시스템은 실질적으로 바이러스 구출 방법을 개발하기 위한 출발점을 제공한다. 따라서, 어떠한 시약도 구출 시스템, 예를 들면 N, P 및 L 단백질-발현 클론 또는 전체-길이의 게놈 cDNA 서열을 정립하는데 이용될 수 없었다. 추가로, 효과적인 미니레플리콘 발현에 요구되는 세포 배양 조건 및 형질감염 조건이 CDV에 대하여는 공지되지 않았다. 이들 변수의 이해가 임의의 재조합 바이러스의 성공적인 구출에 있어 중요하다. 또한, 일부 개 홍역 바이러스주는 조직 배양 시스템에서는 효율적으로 성장하지 못한다. 수정된 게놈 서열(GenBank 수탁번호 제AF014953호)(본원에 참조로 인용됨)을 1998년 이래로 이용할 수 있었음에도 불구하고, 미니레플리콘 또는 바이러스 구출 시스템이 전혀 보고되지 않았다.

개 홍역 바이러스의 성공적인 cDNA 구출을 위해, 해독 후, 예를 들어 아래와 같은 수 많은 분자적 현상이 일어나야 한다: 1) T7 RNA 중합효소에 의한 전체 길이의 게놈 또는 안티게놈 RNA의 정확한 합성 및 리보자임 서열에 의한 3'말단 프로세싱, 2) 바이러스 N, P 및 L 단백질을 복제를 개시하는데 적당한 수준으로의 합성, 3) 전사기능이 활성이고 복제-적격능(competent)을 갖춘 뉴클레오캡시드 구조로의 게놈 RNA의 데 노보(de novo) 패키징, 및 4) 새로이 형성된 뉴클레오캡시드로 부터 바이러스 유전자를 복제를 진행하는데 충분한 수준으로의 발현.

본 발명은 재조합에 의해 생산된 개 홍역 바이러스를 구출하는 방법을 제공한다. 구출된 개 홍역 바이러스는, 예를 들면 항체 생성, 진단적, 예방적 및 치료적 적용, 세포 표적화 뿐 아니라 돌연변이 바이러스의 제조 및 면역원성 조성물 및 약제학적 조성물의 제조에서 수 많은 용도를 갖는다.

발명의 개요

본 발명은, (i) 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사 벡터 및 (ii) 캡시드형성, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 하나 이상의 분리된 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 구출 조성물의 형질감염을 하나 이상의 숙주 세포에서 수행함을 포함하여, 재조합 개 홍역 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다. 형질감염은 이들 벡터의 공동발현 및 재조합 바이러스의 생산이 허용되기에 충분한 조건하에 수행한다. 이어서, 재조합 바이러스를 수거한다.

또 다른 태양은, mRNA 전사시, 개 홍역 바이러스의 다음 단백질의 하나 이상, 또는 이의 임의의 조합을 발현하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다: N, P, M, F, H, L 및 P, C 및 V 단백질(P, C 및 V 단백질은 상기한 바와 같이 개 홍역 바이러스의 P 유전자로 부터 생성된다). 관련 태양은 이러한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 태양은 GenBank에 기탁된 개 홍역 바이러스의 뉴클레오티드 서열(수탁 번호 제AF014953-서열 번호 1)을 사용한다. 또다른 태양은 이들 뉴클레오티드, 상기 개 홍역 바이러스 단백질의 아미노산 서열 및 이의 변이체에 관한 것이다.

본 발명의 단백질 및 뉴클레오티드 서열은 개 홍역 바이러스에 대한 진단적, 예방적 및 치료적 용도를 가진다. 이들 서열을 사용하여, 캡시드형성, 복제 또는 증폭을 통한 정상적인 바이러스 발달을 방해하거나 중단시키는 화합물에 대한 스크리닝 시스템을 고안할 수 있다. 또한, 당해 뉴클레오티드 서열은, 외래 유전자를 발현시키는데 사용하는 경우, 개 홍역 바이러스 및/또는 다른 병원체에 대한 면역원성 조성물에 사용될 수 있다.

바람직한 태양에서, 감염성 재조합 바이러스는 개 홍역 바이러스에 의한 감염 및/또는 다른 병원체에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 면역원성 조성물 및 이러한 면역원성 조성물을 사용하는 방법에 사용하기 위하여 생산된다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 약독화되거나 감염성이거나 이 둘 모두인 재조합 개 홍역 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다. 재조합 바이러스는 cDNA 클론으로부터 제조되므로, 게놈내에서 한정된 변화를 갖는 바이러스가 수득될 수 있다. 또 다른 태양은 외래 유전자를 발현시키기 위하여 본원에서 사용된 게놈 서열을 사용한다. 본 발명자들이 본원에서 개 홍역 바이러스의 온데르스테프르트(Onderstepoort) 주의 전체 cDNA 클론을 완전히 클로닝하고 서열분석하였기 때문에, 당해 서열도 또한 본 발명의 일 태양이다.

또한, 본 발명은 이와 같이 형성된 재조합 바이러스의 외래 유전 정보, 예를 들면 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서, 개 홍역 바이러스외의 다른 병원체에대한 면역원성 또는 약제학적 조성물, 유전자 요법 및 세포 표적화를 포함한 다수의 적용을 위한 용도에 관한 것이다.

개 홍역 바이러스의 성공적 구출이 기술 및 잠재적 치료를 발전시키는데 매우 중요한 주목할 만한 몇몇 이유가 있다. 재조합 CDV를 제조할 수 있는 능력은 개선된 면역원성 조성물의 개발을 촉진할 것이다. 재조합 CDV를 제조할 수 있는 능력은 CDV 벡터의 개발을 촉진할 것이다. 또한, CDV계 면역원성 및 약제학적 조성물 및 CDV계 바이러스 벡터를 연구하는데 이용가능한 동물 모델이 있다. 천연 숙주인, 개 및 담비는, 천연 숙주 생물체내에서의 CDV 약독화의 유전자적 원리를 연구하기 위한 실험 모델로서 사용될 수 있다. 재조합 CDV의 또 다른 이점은, CDV가 향신경성 바이러스이기 때문에 재조합 CDV를 제조할 수 있는 경우에 향신경성(neurotropism)의 유전자적 분석이 가능하다는 점이다. 또한, CDV가 급성 및 지속성 감염을 초래하기 때문에, 연구자는 지속성 감염의 유전자적 분석을 연구할 수 있다. 따라서, 재조합 CDV를 사용하여, 사람의 중추신경계의 탈수초 질환의 특징적인 증상을 초래할 수 있는 바이러스 능력을 세밀히 조사할 수 있다.

특정 태양은 개 홍역 바이러스중의 온데르스테포르트의 실험실-적응된 바이러스주[참조 문헌: 17]를 사용한다. 개 홍역 바이러스를 구출하기 위한 초기 모델로서 실험실-적응된 바이러스주를 사용하는 이점이 몇가지 있다. 첫째, 실험실-적응된 바이러스주는 배양된 세포에서 잘 성장한다. 이러한 특징은 재조합체의 성공적 구출을 촉진하는데 도움이 될 것이다. 둘째, 실험실-적응된 바이러스주는 백신 생산하는데 적격인 세포주, 예를 들면 베로(Vero) 세포에서 잘 성장할 수 있다.세째, 실험실-적응된 바이러스주는 개에서 안전하게 사용되어온 백신 바이러스(온데르스테포르트)와 밀접한 관련이 있으므로, 재조합 바이러스가 약독화된 표현형을 가질 수 있는 가능성을 제공한다. 네째, 실험실-적응된 재조합 바이러스가 추가적 약독화를 요구하는 경우, 온데르스테프르트 바이러스주의 게놈의 특징을 분석하여 약독화 돌연변이를 용이하게 확인할 수 있다. 다섯째, 실험실-적응된 바이러스주는 배양된 세포에서 성장할 수 있는 능력을 보유하며, 이러한 양상은 연구자가 동물 모델 시스템에 전적으로 의존하기 보다는 시험관내에서 필요한 초기 연구를 수행할 수 있도록 한다.

상기 태양 및 추가적 태양이 본원에서 상세히 기술되어 있으며, 본 발명의 목적을 나타낸다.

본 발명은, 비절편화된 네가티브-센스의 일본쇄 RNA 바이러스인, 개 홍역 바이러스를 재조합에 의해 생산하는 방법 및 이로 부터 형성된 면역원성 조성물에 관한 것이다. 추가적 태양은 개 홍역 바이러스를 약독화된 바이러스 및/또는 감염성 바이러스로서 생산하는 방법에 관한 것이다. 재조합 바이러스는 cDNA 클론으로 부터 제조되므로, 게놈내에서 한정된 변화를 갖는 바이러스가 수득된다. 또한, 본 발명은, 이와 같이 형성된 재조합 바이러스의 외래 유전 정보, 예를 들면 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서, 개 홍역 바이러스외의 다른 병원체를 위한 면역원성 또는 약제학적 조성물, 유전자 요법 및 세포 표적화를 포함한 다수의 적용을 위한 용도에 관한 것이다.

도 1은 CDV 구출을 위해 제조된 플라스미드 DNA의 구조를 보여주는 도면이다. 도 1A는 전체 길이의 CDV 클론 pBS-rCDV의 개략도이다. CDV 게놈내의 유전자 영역은 흰색 글자와 유전자 경계를 포함한 검은색 박스로서 도시되어 있다. CDV 리더(leader) 및 트레일러(trailer) 서열은 CDV 게놈의 말단에 흰색 박스로서 도시되어 있다. 게놈의 5'말단에 플랭킹되어 T7 RNA 중합효소 프로모터(회색 박스)로 부터 포지티브-센스 RNA의 합성을 유도하도록, 당해 게놈이 플라스미드 벡터내에 배향되어 있다. 디형 간염 바이러스 리보자임 서열(도 1A에서 빗금친 박스; Been et al., 1997 (5) 참조) 및 두 개의 T7 RNA 중합효소 터미네이터(회색 박스)는 포지티브-센스 cDNA의 3'말단에 플랭킹되어 있다. 클로닝에 사용되는 제한 효소 분해 부위는 이탤릭체로 표시되어 있다.

도 1B는 CDV 미니레플리콘(pCDV-CAT)를 도시한다. 미니레플리콘은 바이러스 cDNA 클론의 제조에 사용된 동일한 벡터에서 제조되었다. 107개 뉴클레오티드 CDV 리더와 106개 뉴클레오티드 트레일러(흰색 박스)에 플랭킹되어 있는 CAT 레포터 유전자를 NotI와 NarI 부위 사이에 삽입하였다(방법편 참조). 미니레플리콘 cDNA의 배향은 T7 RNA 중합효소 전사 후 네가티브-센스 미니레플리콘 RNA을 생성시킨다.

도 1C는 MVA/T7[참조 문헌: 61]으로 감염된 세포에서 N, P 또는 L 유전자의 발현을 유도하기 위하여 제조된 T7 RNA 중합효소-의존형 벡터[참조 문헌: 29]를 도시한다. cDNA 삽입체를 내부 리보좀 도입 부위(IRES)의 3'에 클로닝하여 T7 RNA 중합효소 전사체의 해독을 촉진한다. 50개 길이의 아데노신 잔기가 3'말단에 위치하고, 그 뒤에 T7 RNA 중합효소 터미네이터가 위치한다.

도 2A는, 실시예 3.1.1에 기술된 바와 같은, CDV-CAT 미니레플리콘 발현 실험을 정량화하기 위하여 수행된 CAT 분석 결과를 나타내는 자가방사선상이다. 도 2A에서, 세포를 미니레플리콘 RNA 20㎍로 형질감염시키고, CDV-CAT 미니레플리콘 활성을 CDV에 의한 감염에 의해 유도하였다. 레인 1중의 분석물은 CDV로 감염시키지 않은 음성 대조군으로 부터 제공된 것이었다. 레인 2는 CDV 감염에 의해 유도된 특이적 미니레플리콘 활성의 수준을 보여준다.

도 2B는, 실시예 3.1.2에 기술된 바와 같은, CDV-CAT 미니레플리콘 발현 실험을 정량화하기 위하여 수행된 CAT 분석 결과를 나타내는 자가방사선상이다. 도2B에서, 세포를 CDV 미니레플리콘 RNA(20㎍) 및 T7 발현 플라스미드 pCDV-N(1㎍). pCDV-P 단백질(1㎍) 및 pCDV-L(도면에 표시된 질량)로 형질감염시켰다. 음성 대조군은 레인 1(N, P 또는 L 발현 벡터 부존재) 및 레인 2(L 발현 벡터 부존재)에 보여진다. 레인 3 내지 5는, 이들 형질감염에 사용된 L 발현 벡터의 양이 증가되는 점을 제외하고는 동일한 형질감염으로 부터 제공된 것이다.

도 3A는, 실시예 3.1.3에 기술된 바와 같은, pCDV-CAT 플라스미드 DNA의 형질감염 후 CDV-CAT 미니레플리콘 활성에 대한 CAT 분석 결과를 나타내는 형광 상이다. 도 3A의 결과는 항온처리 온도가 미니레플리콘 활성에 미치는 효과를 입증하였다. 도 3A의 상대 활성은 레인 8에 주어진 값에 상대적인 값으로서 표현된다.

도 3B는, 실시예 3.1.4에 기술된 바와 같은, pCDV-CAT 플라스미드 DNA의 형질감염 후 CDV-CAT 미니레플리콘 활성에 대한 CAT 분석 결과를 나타내는 자가방사선상이다. 도 3B는 열 쇽크가 미니레플리콘 발현에 미치는 유익한 효과를 보여준다. 도 3B의 CAT 활성 값은 레인 2 값에 상대적인 값으로 표현된다.

도 4A는, 실시예 4.1에 기술된 바와 같은, 재조합 rCDV의 구출로 부터 수득된 2개의 대표적인 플라크를 도시한다. 첫번째(왼쪽) 플라크는 온데르스테포르트 바이러스주 게놈 cDNA(pBS-rCDV)로 부터 구출된 rCDV이었다. 두번째(오른쪽) 플라크 표지된 rCDV-P/Lus/M은 도 5A에 기술된 루시퍼라제 유전자를 함유하는 재조합 바이러스주이다.

도 4B는, 실시예 4.2에 기술된 바와 같은, 상기 실험으로 부터 구출된 바이러스주로 부터 유래된 RT/PCR-증폭된 생성물의 분석 결과를 보여준다. 레인 1 내지 7은 CDV 게놈상의 1978 내지 2604사이의 영역으로 부터 증폭된 RT/PCR 반응의 생성물을 보여준다. 레인 1의 음성 대조군(-L)은, pCDV-L 벡터 DNA의 부재하에 수행된 구출 실험으로 부터 수득된 공동배양물로 부터 유도된 RNA를 사용하여 수득된 RT/PCR 결과이다. 레인 3, 5 및 7은 RT-PCR의 RT 단계가 생략된 음성 대조군이다. 레인 8 내지 10은 레인 2, 4 및 6의 DNA와 동일한 샘플을 BstBI으로 분해한 결과를 보여준다. PCR 단편의 분해로 약 315개 염기쌍의 중복체가 수득되고 분해되지 않은 단편은 630개 염기쌍이다.

도 5는 6개의 예(A 내지 F)를 포함한다. 도 5A는 전체 길이의 cDNA 클론으로 존재하는 CDV 게놈의 구조를 도시한다. 도 5B에서, M/F 유전자간(intergenic) 영역 부분을 제시하여(뉴클레오티드 3320 내지 3380), 이 영역이 플라스미드 prCDV-mcs에서 발견된 다중 클로닝 부위를 형성하기 위하여 어떻게 변형되는지를 보여준다. 굵은활자로 제시된 뉴클레오티드는 제한 부위를 형성하도록 변경되었다. 도 5C 내지 E는 외래 유전자가 어떻게 prCDV-mcs내의 FseI과 MluI 부위 사이에 삽입되는 지를 도시한다. M/F 유전자-종결/유전자-개시 시그날의 합성 복사체를 PCR 증폭중에 외래 유전자의 5'말단에 부가하였다. 도 5F에서, 외래 유전자(X)의 게놈 위치는 CDV 게놈상에 제시되언다. 명명법: rCDV는 재조합 바이러스주를 의미하고; prCDV는 바이러스 cDNA 서열을 함유하는 플라스미드(pBS-rCDV)를 의미한다.

도 6은 CDV의 cDNA 클론에 대한 전체 뉴클레오티드 서열(서열 번호 2)을 도시한다.

도 7은 CDV 전체 길이의 게놈 클론에 대한 전체 서열(CDV 게놈 및 벡터; CDV 서열 2199 내지 17888; 총 길이 18826개 염기쌍)(서열 번호 3)을 도시한다.

도 8은, 실시예 5(c)에 따른 rCDV 및 rCDV-HBsAg 주로 감염된 세포로 부터의 추출물에서 발견된 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. rCDV-HBsAg-1, 2 및 3은 플라스미드 prCDV-HBsAg를 사용하여 수행된 독립적인 형질감염물으로 부터 분리되었음에 주목한다.

도 9는 CPV VP2 암호화 영역의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 4)를 도시한다.

도 10은 CPV VP2-예견된 아미노산 서열(서열 번호 5)를 도시한다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 재조합 개 홍역 바이러스(CDV)를 생산하는 방법에 관한 것이다. 당업계에서 이러한 방법은 "구출" 또는 역 유전자적 방법이라고 칭한다. 상이한 비절편화된 네가티브-쇄의 바이러스에 대한 여러 구출 방법이 기술되어 있다[참조 문헌: 40, 41, 43, 44, 63, 64, 65, 66, 67, 68 및 70]. 구출에 관한 또 다른 공보는 공개된 국제특허 출원 WO 97/06270(홍역 바이러스 및 하위계열 파라믹소바이러스아과의 다른 바이러스 구출) 및 공개된 국제특허 출원 WO 97/12032(RSV 구출)을 포함한다.

본 발명의 또 다른 태양은, 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단백질 뿐만 아니라 이러한 서열의 변이체를 사용하는 구출 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이들 변이체 서열은 바람직하게는 고도의 엄격한 조건하에서 하나 이상의 개 홍역 바이러스 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 GenBank 수탁번호 AF014953의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1(도 6)와 하이브리드를 형성한다. 고도로 엄격한 서던 하이브리드화 조건을 정의하고자 하는 경우, 본원에 참조로 인용된 문헌[Sambrook et al. (1989) pp. 387-389]을 편리하게 참조할 수 있으며, 상기 문헌에서 문단 11의 세척 단계가 고도로 엄격한 것으로 간주된다. 또한, 본 발명은, 폴리뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 삼중자의 세번째 뉴클레오티드의 변화에 의해 참조 서열과 상이한 보존적 변이체에 관한 것이다. 바람직하게는, 이들 보존적 변이체는 개 홍역 바이러스의 참조 폴리뉴클레오티드 서열과 생물학적 동등물로서 작용한다.

또한, 본 발명은 하나 이상의 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 상기한 바와 같이, 주어진 뉴클레오티드 재조합 서열은 다양한 개 홍역 바이러스주의 하나 이상의 게놈을 함유할 수 있다. 특정 태양은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열, 또는 전사시 하나 이상의 개 홍역 바이러스 단백질(N, P-P/C/V, M, F, H 및 L)을 발현하는 뉴클레오티드 서열을 사용한다.

또 다른 태양은 개 홍역 바이러스 단백질(N, P-P/C/V, M, F, H 및 L)의 아미노산 서열(이에 대한 해독된 서열은 GenBank AF014953이다), 및 이의 단편 또는 변이체를 사용한다. 바람직하게는, 아미노산 서열의 단편 및 변이체 및 개 홍역 바이러스 단백질을 발현하는 뉴클레오티드의 변이체는 생물학적 동등물이다. 즉, 이들은 실질적으로 단백질의 동일한 기능을 보유하여, 약독화되거나 감염성이거나 또는 이둘 모두인 목적하는 재조합 개 홍역 바이러스가 수득될 수 있다. 이러한 변이체 아미노산 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 이러한 변이체 아미노산 서열은 개 홍역 바이러스 단백질의 아미노산 서열과 전체적으로 약 70% 내지 약 80%, 바람직하게는 약 90% 유사성을 가질 수 있다. 변이체 뉴클레오티드 서열은, 전사시 개 홍역 바이러스 단백질의 아미노산 서열 또는 개 홍역 바이러스 단백질의 아미노산 서열의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 전체적으로 약 70% 내지 약 80%, 바람직하게는 약 90% 유사성을 가질 수 있다. 개 홍역 바이러스 단백질, N, P-P/C/V, M, F, H 및 L에 대한 뉴클레오티드 서열의 예로는, 해독된 서열이 Genbank AF014953인 본원에서 인용된 서열이 있다.

생물학적 동등물은 뉴클레오티드 서열 또는 단백질 서열의 변이체를 제조함으로써 수득될 수 있다. 당해 변이체는 주형 서열의 삽입, 치환, 결실 또는 재배열일 수 있다. 개 홍역 바이러스 폴리뉴클레오티드 서열의 변이체는 통상의 방법, 예를 들면 PCR 돌연변이유발, 아미노산(알라닌) 스크리닝, 및 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다. 개 홍역 바이러스를 구출할 수 있는 능력을 차단 할 수 있는 능력이 평가될 수 있다면, 목적하는 재조합 개 홍역 바이러스가 수득되거나 목적하는 생물학적 효과가 수득되는지를 평가하기 위하여 변이체를 이용하여 구출을 수행하여 변이체의 표현형을 평가할 수 있다. 또한, 당해 변이체는, 목적하는 용도가 면역원성 조성물이라면, 항원성에 대하여 평가될 수 있다.

아미노산 변화는 뉴클레오티드 서열의 코돈을 변화시킴으로써 수득될 수 있다. 이러한 변화가 당해 아미노산 서열의 다른 아미노산 서열을 특정 아미노산으로 치환시킴을 통해 수득될 수 있음이 공지되었다. 예를 들면, 선택적인 아미노산의 치환을 통하여, 작은 입체형태 변화가 단백질에 일어날 수 있으며, 이는 개 홍역 바이러스의 다른 단백질과 결합하거나 상호작용할 수 있는 능력의 감소를 초래할 수 있다. 추가적 변화가 재조합 개 홍역 바이러스의 약독화 수준을 변화시킬 수 있다.

폴리펩티드에 상호작용 생물학적 기능을 부여하는데 아미노산의 수치(hydropathic) 지수를 사용할 있으며[참조 문헌: 69], 이 경우에 유사한 수치 지수를 갖는 다른 아미노산이 특정 아미노산으로 치환되어도 여전히 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 달리, 특히 제조될 폴리펩티드에서 원하는 생물학적 기능을 면역학적 태양에서 사용하고자 하는 경우, 유사한 아미노산의 치환을 친수성을 토대로 수행할 수 있다. 예를 들면, 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제4,554,101호에는 인접 아미노산의 친수성에 의해 결정되는 "단백질"의 최대 국소 평균 친수성이 이의 면역원성과 상호관련이 있음이 기재되어 있다. 따라서, 치환이 각 아미노산에 부여된 친수성을 토대로 이루어질 수 있음을 알 수 있다.

각 아미노산에 값을 부여하는 친수성 지수 또는 수치 지수를 사용하는 경우에, 바람직하게는 이들 값이 ±2인 아미노산, 특히 바람직하게는 이들 값이 ±1인 아미노산, 가장 바람직하게는 이들 값이 ±0.5 이내인 아미노산의 치환을 도입하는 것이 바람직하다.

본 발명의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는, 개 홍역 바이러스 단백질의 바람직한 특징은 다음중 하나 이상을 포함한다: (a) 막 단백질 또는 막과 직접 결합된 단백질인 특징, (b) SDS 아크릴아미드(10%) 겔을 사용하여 단백질로서 분리될 수 있는 특징; 및 (C) 다른 적당한 개 홍역 바이러스 단백질의 존재하에 목적하는 재조합 개 홍역 바이러스의 구출 생성에 기여하는 이의 생물학적 기능을 보유하는 특징.

소유하고 있는 상기 뉴클레오티드 및 아미노산을 사용하여, 개 홍역 바이러스의 구출을 진행할 수 있다. 개 홍역 바이러스 구출은, 구출 조성물을 사용하여 배지에서 하나 이상의 숙주 세포의 형질감염 또는 형질전환을 수행하여 달성할 수 있다. 구출 조성물은 (i) 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열을 포함하는 전사 벡터, 및 (ii) 캡시드형성, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 하나 이상의 분리된 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터를, 상기 벡터들의 공동발현 및 재조합 바이러스의 생산이 허용되기에 충분한 조건하에서 포함한다. 안티게놈은 자손 게놈의 합성을 위한 주형으로서 사용되는 분리된 포지티브 메시지 센스의 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 바람직하게는, 전사성, 복제성 뉴클레오캡시드를 제조하는데 필요한 단백질을 암호화하는 서열과 상보적인 포지티브 센스 전사체와 하이브리드를 형성할 가능성을 최소화하기 위하여, 폴리뉴클레오티드 서열은 전사시 복제 중간체 RNA에 상응하는 개 홍역 바이러스 게놈의 포지티브 센스 형을 제공하도록 작제된 cDNA이다. 전사 벡터는, 개 홍역 바이러스 발현에서 조절 역할을 하는 유전자 요소(들), 예를 들면 프로모터, 개 홍역 바이러스 RNA로 전사되는 구조 유전자 또는 암호화 유전자, 및 적당한 전사 개시 및 종결 서열의 집합체를 포함하는, 작동가능하게 연결된 전사 단위를 포함한다.

전사 벡터는, RNA를 복제할 수 있는 뉴클레오캡시드를 제조하고 또한 자손 뉴클레오캡시드에 RNA 복제 및 전사 모두에 대한 적격능을 부여하는데 필요한 개 홍역 바이러스 단백질, N, P 및 L과 공동발현된다. N, P 및 L 단백질은 요구된 단백질을 암호화하는 하나 이상의 발현 벡터(예: 플라스미드)로 부터 제조되지만, 이들 요구된 단백질의 하나 이상이, 이들 바이러스-특이적 유전자 및 유전자 생성물을 함유하고 발현하도록 유전자조작된, 안정한 형질전환체로서 선택된 숙주 세포내에서 생산될 수 있다. 바람직한 태양에서, N, P 및 N 단백질은 발현 벡터로 부터 발현된다. 보다 바람직하게는, N, P 및 L 단백질은 별개의 발현 벡터, 예를 들면 플라스미드로 부터 각각 발현된다. 후자의 경우에, 형질감염 또는 형질전환 동안에 제공되는 각 단백질의 상대적 양을 보다 쉽게 조절할 수 있다. 추가적 개 홍역 바이러스 단백질은 N, P 또는 L을 발현하는 플라스미드로 부터 발현될 수 있거나, 추가적 단백질은 추가적 플라스미드를 사용하여 발현할 수 있다.

비록 N, P 및 L의 양이 숙주 세포가 이들의 발현을 허용하는 정도에 따라 달라지지만, N, P 및 L을 발현하는 플라스미드를 조정하여, 세포내에서 N, P 및 L의 유효 몰비가 달성되도록 한다. 유효 몰비는 목적하는 재조합 개 홍역 바이러스의 성공적인 구출을 제공하기에 충분한 N, P 및 L의 비이다. 이들 비는 미니레플리콘(CAT/레포터) 분석에서 관찰된 바와 같은 발현 플라스미드의 비를 기준으로 수득될 수 있다. 일 태양에서, 형질감염성 플라스미드 pCDVN:pCDVP의 분자비는 약 5:1 미만이고, pCDVP:pCDVL은 약 15:1이다. 바람직하게는, pCDVN:pCDVP의 분자비는 약 3:1 내지 약 1:3이고, pCDVP:pCDVL은 약 10:1 내지 약 1:5이다. 보다바람직하게는, pCDVN:pCDVP의 비는 약 2:1이고, pCDVP:pCDVL은 약 8:1 내지 약 1:1이고, 가장 바람직하게는, pCDVN:pCDVP의 비는 약 1.2:1이고, pCDVP:pCDVL의 비는 약 5:1이다.

개 홍역 바이러스 발현 플라스미드 pCDVN, pCDVP 및 pCDVL과 함께 게놈 cDNA 플라스미드의 형질감염 또는 형질전환 후, 게놈 RNA의 정확한 복사체는 파아지 T7 RNA 중합효소, 및 RNA를 절단하여 3'말단을 형성시키는 벡터-암호화된 리보자임 서열의 합동 작용에 의해 생산된다. 이러한 RNA는 공동형질감염된 발현 플라스미드에 의해 초기에 공급된 바이러스 단백질에 의해 패키징되고 복제된다. 개 홍역 바이러스 구출의 경우에, T7 RNA 중합효소를 발현하는 공급원을, N, P 및 L에 대한 공급원(들)과 함께 숙주 세포(또는 세포주)에 가한다. 개 홍역 바이러스 구출은, 이러한 세포주를 적당히 위치된 T7 RNA 중합효소 프로모터를 함유하는 개 홍역 바이러스 게놈 cDNA 클론 및 개 홍역 바이러스 단백질 N, P 및 L을 암호화하는 발현 플라스미드로 공동형질감염시킴으로써 달성된다.

개 홍역 바이러스의 구출의 경우, 목적하는 바이러스 게놈과 동등한 클로닝된 DNA를, 적합한 DNA-의존형 RNA 중합효소 프로모터(예: T7 RNA 중합효소 프로모터)와 적당한 전사 벡터(예: 세균 플라스미드)속에 삽입된 자가-절단성 리보자임 서열(예: 디형 간염 리보자임) 사이에 배치한다. 이러한 전사 벡터는 용이하게 조작가능한 DNA 주형을 제공하고, 이러한 주형으로 부터 RNA 중합효소(예: T7 RNA 중합효소)가 정확한 또는 거의 정확한 5' 및 3' 말단을 가진 바이러스 안티게놈(또는 게놈)의 일본쇄 RNA 복사체를 전사한다. 바이러스 게놈 DNA 복사체, 플랭킹 프로모터 및 리보자임 서열의 배향이 안티게놈 또는 게놈 RNA 동등물이 전사하는지를 결정한다.

따라서, 구출 방법에서, 구출 조성물이 사용된다. 구출 조성물은 특정 필요 또는 적용에 따라 달라질 수 있다. 구출 조성물의 예는, (i) 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사 벡터, 및 (ii) 캡시드형성, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 하나 이상의 분리된 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 조성물이다. 전사 및 발현 벡터를 선택하여, 숙주 세포에서 구출 조성물의 형질감염으로 이들 벡터의 공동발현 및 개 홍역 바이러스의 생산이 이루어지도록 한다.

상기한 바와 같이, 분리된 핵산 분자는 개 홍역 바이러스의 하나 이상의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 서열을 포함한다. 분리된 핵산 분자는 게놈, 안티게놈 또는 이의 변형체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일 태양에서, 당해 폴리뉴클레오티드는 작동가능하게 연결된 프로모터, 목적하는 게놈 또는 안티게놈, 자가-절단성 리보자임 서열 및 전사 터미네이터를 암호화한다.

본 발명의 바람직한 태양에서, 폴리뉴클레오티드는, 야생형 개 홍역 바이러스로 부터 뉴클레오티드 삽입, 재배열, 결실 또는 치환에 의해 변형된 게놈 또는 안티게놈을 암호화한다. 천연 게놈 및 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 점증적으로 변형되어짐에 따라 구출로 부터 복제성 바이러스를 수득할 수 있는 능력이 감소될 수 있음이 제안되었다. 당해 게놈 또는 안티게놈 서열은 임의의 개 홍역 바이러스주의 게놈 또는 안티게놈으로 부터 유래될 수 있다. 또한, 당해 폴리뉴클레오티드 서열은, 하나 이상의 이종 공급원으로 부터의 게놈 또는 안티게놈 또는 유전자를 재조합에 의해 연결함으로써 형성된 키메라 게놈을 암호화한다.

본 발명의 방법에 의해 형성된 재조합 바이러스가 진단 조사 연구에서의 도구로서 또는 치료적 또는 예방학적 면역원성 및 약제학적 조성물로서 사용될 수 있기 때문에, 당해 폴리뉴클레오티드는 개 홍역 바이러스의 야생형 또는 변형된 임의의 형을 암호화할 수 있다. 다수의 태양에서, 당해 폴리뉴클레오티드는 개 홍역 바이러스의 약독화된, 감염성 형을 암호화한다. 당해 바이러스의 약독화된 형은, 하나 이상의 유전자의 암호화 영역내 뿐만 아니라 하나 이상의 비-암호화 영역, 즉 게놈의 유전자간(intergenic) 영역내에서 일어나는 돌연변이에 의해 생성될 수 있다. 여러 약독화 돌연변이가 보다 상세히 상기 참조 문헌에 기술되어 있다. 예를 들면, 약독화된 형은 3'게놈 프로모터 영역내에 하나 이상의 약독화 돌연변이를 갖고 RNA 중합효소 유전자내에 하나 이상의 약독화 돌연변이를 갖는 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다[참조 문헌: 공개된 국제 특허 출원: WO 98/13501].

폴리뉴클레오티드의 변형된 형은 또한 결함 바이러스를 암호화할 수 있다. 결함 바이러스는, 재조합에 의해 생산된 바이러스가 복제 적격능(competent)이 없도록, CDV를 암호화하는 폴리뉴클레오티드중에 변경을 함유한다. 종종, 돌연변이는 바이러스의 복제에 필수적인 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자에서 발생한다. 복제를 달성하기 위하여, 결함 바이러스는 바이러스가 결함되도록 하기 위하여 변경시킬 수 있는 뉴클레오티드 서열의 비변형된 형(비변경된 형)을 함유하는 숙주 세포로 보완되어야 한다. 이러한 숙주 세포 및 세포주는 보완성 새포 또는 보완성 세포주라 명명된다. 복제 부적격능의 바이러스를 수득하기 위하여는, 결함 바이러스를 바람직하게는 보완성 세포주에서 증식한다.

또한, 본 발명은 CDV 폴리뉴클레오티드 서열의 비-감염성 변형물에 관한 것이다. CDV의 경우, 감염성 바이러스의 생산에는 관여하나, 바이러스 게놈의 복제를 방지하는데는 관여하지 않는 유전자인 뉴클레오티드 서열을 변경시키는 것이 바람직하다. 이들 변형물 및 이를 함유하는 CDV 폴리뉴클레오티드는 "비-감염성 변형물 및 비-감염성 CDV 폴리뉴클레오티드"라고 명명된다. 복제 결함성이거나 비-감염성인 적당한 변형물은 사용 의도, 예를 들면 사람 세포에서 복제 결함을 위한 경우나 개 또는 말 세포에서 복제 결함을 위한 경우에 따라 달라질 수 있다.

변경된 서열이 재조합에 의해 생산된 결함성 또는 비-감염성 바이러스에 보완에 의해 제공될 수 있다. 이러한 보완된 재조합 바이러스는 또한 약제학적 적용, 예를 들면 유전자 치료를 위한 유전자 전달을 위해 또는 면역원성 조성물의 일부로서 사용될 수 있다.

상기한 바와 같은 목적하는 개 홍역 바이러스 게놈 및 안티게놈의 변형된 형을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 부가하여, 당해 폴리뉴클레오티드 서열이 또한 하나 이상의 이종성 유전자 또는 목적하는 이종성 뉴클레오티드 서열과 함께 목적하는 게놈 또는 안티게놈을 암호화할 수 있다. '이종성'이란 삽입된 유전자또는 뉴클레오티드 서열이 수령체 CDV주에 존재하지 않는 것을 의미하거나, 유전자또는 뉴클레오티드 서열이 CDV 폴리뉴클레오티드 서열에 삽입되는 방식으로 통상적으로 존재하지 않는 것을 의미한다. 이들 변이체는 선택된 이종성 뉴클레오티드 서열을 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열속에 도입함으로써 수득될 수 있다. 목적하는 이종성 서열은 개 홍역 바이러스의 폴리뉴클레오티드 서열의 비-필수 또는 비-암호화 영역내에 삽입되거나, 비-암호화 영역과 암호화 영역사이에 삽입되거나, 당해 폴리뉴클레오티드 서열의 임의의 말단에 삽입될 수 있다. 또 다른 태양에서, 목적하는 이종성 서열은 비-암호화 영역내에 삽입되거나 비-필수 유전자의 암호화 영역 대신에 삽입될 수 있다. 삽입 부위는 개 홍역 바이러스의 구배 발현 특징을 이용할 수 있다[참조 문헌: 25]. 외래 항원 발현의 상이한 수준은, 개 홍역 바이러스의 3'에서 5'로 감소하는 자연적인 구배를 이용하는 상이한 게놈 위치에 이종성 서열을 삽입하는 방법으로 상기 유형의 구출 시스템에서 용이하게 조사된다.

이종성 뉴클레오티드 서열(예: 유전자)는 원하는 바에 따라 달라질 수 있다. 목적하는 재조합 바이러스의 적용에 따라, 이종성 뉴클레오티드 서열은 보조인자, 사이토킨(예: 인터루킨), T-헬퍼 에피토프, 제한 마커, 애쥬번트, 상이한 미생물 병원체(예: 바이러스, 세균, 진균 또는 기생충)의 단백질, 특히 보호 면역 반응을 유도할 수 있는 단백질을 암호화할 수 있다. 목적하는 개 홍역 바이러스, 또는 미니레플리콘 바이러스 벡터의 구출 가능성을 최대화하기 위하여, 보조인자, 사이토킨(예: 인터루킨), T-헬퍼 에피토프, 제한 마커, 애쥬번트 또는 상이한 미생물 병원체(예: 바이러스, 세균, 진균)의 단백질의 면역원성 부분을 암호화하는 이종성 서열을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 특정 태양에서, 이종성 유전자는, 재조합 바이러스 또는 이로부터 발현된 항원의 예방적 또는 치료적 특징을 향상시키기 위하여 선택된 사이토킨, 예를 들면 인터루킨-12를 암호화한다.

본 발명에서 사용하기 위한 항원은 목적하는 징후에 유용한 임의의 항원중에서 선택될 수 있다. 당해 항원은 본 발명의 조성물에 첨가되거나, 상기한 바와 같이 재조합에 의해 생산된 개 홍역 바이러스로 부터 이종성 서열로서 발현될 수 있다. 하나 이상의 병원체, 예를 들면 바이러스, 세균 또는 진균에 대해 유용한 항원을 선택할 수 있다. 잠재적 병원체의 상세한 목록은 아래에 보여진 바와 같다.

상기와 같은 바이러스의 예로는 사람 면역결핍 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 1형 내지 3형 파라인플루엔자(Parainfluenza) 바이러스, 단순포진(Herpes simplex) 바이러스, 사람 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 사람 파필로마바이러스(papillomavirus), 폴리오바이러스(poliovirus), 로타바이러스(rotavirus), 칼리시바이러스(calicivirus), 홍역 바이러스, 멈프스(Mumps) 바이러스, 풍진 바이러스, 아데노바이러스, 광견병 바이러스, 우역 바이러스, 코로나바이러스, 파르보바이러스(parvovirus), 감염성 비기관지염 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 조류 감염성 점액낭 질환 바이러스, 뉴캐슬(Newcastle) 질환 바이러스, 마르엑(Marek) 질환 바이러스, 돼지 호흡기 및생식기 증후군 바이러스, 말 동맥염 바이러스 및 각종 뇌염 바이러스가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기와 같은 세균의 예로는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) (유형성 및 비유형성 모두), 헤모필루스 솜누스(Haemophilus somnus), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 스트렙토코코스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코코스 피로게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코코스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코코스 파에칼리스(Streptococcus faecalis), 헬리코박터 필로리(Heicobacter pylori), 네이쎄리아 메닝이티디스(Neisseria meningitidis), 네이쎄리라 고노르호에아(Neisseria gonorrhoeae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci), 보르데텔라 페르투씨스(Bordetella pertussis), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 살모넬라 클레라에수이스(Salmonella choleraesuis), 에스체리키아 콜리(Escherichia coli), 쉬겔라(Shigella), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 미코박테리움 투베르쿠로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 아비움-미코박테리움 인트라셀룰러 콤플렉스(Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare complex), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 스타필로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus),클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 보르레리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 파스테우렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 악티노바실루스 플레우로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae) 및 미코플라즈마 칼리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum)이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기와 같은 진균의 예로는 아스페르길리스(Aspergillis), 블르스토마이세스(Blastomyces), 칸디다(Candida), 콕시디오데스(Coccidiodes), 크립토코쿠스(Cryptococcus) 및 히스토플라즈마(Histoplasma)가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기와 같은 기생충의 예로는 리슈마니아 메이저(Leishmania major), 아스카리스(Ascaris), 트리쿠리스(Trichuris), 기아르디아(Giardia), 쉬스토소마(Schistosoma), 크립토스포리디움(Cryptosporidium), 트리코모나스(Trichomonas), 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii) 및 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii)가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

다른 유형의 이종성 서열은, 암 세포 또는 종양 세포등을 포함한 질환 세포, 알레르기항원, 아밀로이드 펩티드 단백질 또는 기타 거대분자 성분을 제거하거나 감소시키는데 유용한 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.

상기와 같은 암 세포 또는 종양 세포의 예로는 전립선 특이적 항원, 카르시노-배아 항원, MUC-1, Her2, CA-125 및 MAGE-3이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기와 같은 알레르기항원의 예로는 참조로서 본원에 인용된 미국 특허 제5,830,877호 및 공개된 국제특허 출원 제WO 99/51259호에 기재되어 있는 것들, 예를 들어 화분, 곤충 독, 동물 비듬, 진균 포자 및 약물(예: 페니실린)이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

아밀로이드 펩티드 단백질(APP)은 알츠하이머 질환, 아밀로이드증 또는 아밀로이드원성 질환과 같은 각종 질환과 연관이 있다. β-아밀로이드 펩티드(Aβ펩티드로서 지칭됨)는, β 및 γ세크리타제(secretase) 효소에 의한 APP의 프로세싱에 의해 생성된 42개 아미노산의 APP 단편이고, 다음 서열을 가진다: Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala.

일부 환자에서, 아밀로이드 축적은 집합된 Aβ펩티드 형을 취한다. 놀랍게도, 작금에 이르러, 분리된 Aβ펩티드의 투여가 척추동물 숙주에서 아밀로이드 축적의 Aβ펩티드 성분에 대해 면역 반응을 유도한다는 것이 밝혀졌다[참조 문헌: 공개된 국제특허 출원 제WO 99/27944호]. 이러한 Aβ펩티드는 관련없는 잔기에 연결되어졌다. 따라서, 본 발명의 이종성 뉴클레오티드 서열은 이러한 Aβ펩티드 뿐 아니라 Aβ 펩티드의 단편, 및 Aβ펩티드에 대한 항체 또는 이의 단편의 발현을 포함한다. Aβ펩티드의 이러한 단편은 아래의 서열을 갖는 28개 아미노산 펩티드이다(참조: 미국 특허 제4,666,829호): Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys.

이종성 서열을 발현시킴으로써, 개 홍역 바이러스의 재조합 형이, 다양한 RNA, 아미노산 서열, 폴리펩티드 및 단백질 형태의 다양한 활성 성분을 동물 또는 사람에게 전달하기 위한 발현 벡터로서 동일한 방법으로 사용될 수 있다. 재조합 개 홍역 바이러스는 바이러스 전사 프로모터의 조절하에 하나 이상의 이종성 유전자(및 3, 4 또는 5 유전자)를 발현시키는데 사용될 수 있다. 또 다른 태양에서, 추가적 이종성 핵산 서열은 단일 특별 전사 단위로서 전사되는 7 내지 10kb 이하의 단일 서열일 수 있다. 바람직하게는, 6의 규칙(Rule of Six)(ref.6)이 적용된다. 특정 바람직한 태양에서, 이러한 서열은 4 내지 6kb 이하일 수 있다. 추가적 모노시스트론(monocistron) 전사 단위 및 폴리시스트론(polycistron) 전사 단위의 형태로 이종성 유전자 정보를 삽입할 수 있다. 추가적 모노시스트론 전사 단위 및 폴리시스트론 전사 단위의 사용은 보다 많은 유전자 정보의 삽입을 허용한다. 바람직한 태양에서, 이종성 서열은, 하나 이상의 리보좀 도입 부위를 함유할 수 있는 하나 이상의 폴리시스트론 전사 단위로서 개 홍역 바이러스 게놈 서열내에 삽입된다.

또 다른 바람직한 태양에서, 이종성 뉴클레오티드 서열은 다단백질, 및 당해 다단백질을 절단하여 다단백질의 개개의 폴리펩티드를 생성시키는 충분한 수의 프로테아제를 암호화한다.

이종성 뉴클레오티드 서열은, 기도를 통하여 체내로 들어가서 각종 조직 및 세포, 예를 들면 침샘, 림프계 조직, 젖샘, 고환 및 뇌 세포를 감염시킬 수 있는, 개 홍역 바이러스의 통상의 감염 경로를 이용할 수 있도록 선택될 수 있다. 또한,이종성 유전자는 유전자 치료 또는 특정 세포의 표적화에 사용될 수 있는 제제를 제공하는데 사용될 수 있다. 개 홍역 바이러스의 통상의 감염 경로중에 노출된 정상 세포의 이용에 대한 대안으로서, 이종성 유전자 또는 단편은 상이한 병원체로 부터의 또 다른 단백질 또는 아미노산 서열을 암호화할 수 있으며, 이는 재조합 개 홍역 바이러스의 일부로서 사용되는 경우, 재조합 개 홍역 바이러스를 개 홍역 바이러스의 통상의 경로에 있지 아니한 세포 또는 조직으로 유도한다. 이러한 경우에, 재조합 개 홍역 바이러스는 광범위한 각종 외래 유전자의 전달을 위한 벡터가 되므로, 따라서 수 많은 유형의 항원의 전달을 위한 벡터가 될 수 있다. 본원의 실시예는, 재조합 개 홍역 바이러스가 발현 벡터로서 사용될 수 있음을 입증한다. 재조합 개 홍역 바이러스 발현 벡터는 하나 이상의 항원을 전달하는데 사용될 수 있다. 각종 감염성 제제[참조 문헌: 1, 7]로 부터의 항원이 목적하는 적용을 위해 선택될 수 있다. 아래의 병원체에 대해 유용한 항원을 선택할 수 있다:

소 경우: BRSV, BVD, 캄피로박터(Campylobacter), 헤모필루스 솜누스, IBR, 렙토스피라 종(Leptospira spp), 파라인플루엔자, 파스테우렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), PI3, 파상풍 항독소(Tetanus Antitoxin), 파상풍 변형독소(Tetanus Toxoid), 트리코모나스(Trichomonas).

말의 경우: 에를리키아 리스티시(Ehrlichia risticii), 뇌척수염(서양, 동양, 베네수엘라), 인플루엔자, 광견병, 비폐렴(rhinopneumonitis), 로타바이러스( Rotavirus), 스트렙토코코스 종(Streptococcus spp), 파상풍 항독소, 파상풍 변형독소, 바이러스 동맥염.

개의 경우: 보르데텔라(Bordetella), 보르렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), CAV-2, 코로나바이러스(Coronavirus), 디스펨퍼(Distemper), 렙토스피라 종(Leptospira spp), 파라인플루엔자, 파르보바이러스, 광견병, 보르데텔라, 보르렐리아 부르그도르페리, CAV-2, 코로나바이러스, 디스템퍼, 렙토스피라 종, 파라인플루엔자, 파르보바이러스, 광견병.

고양이의 경우: 칼리시바이러스(Calicivirus), 클라미디아(Chlamydia), 백혈병, 개 소포자균(Microsporum canis), 범백혈구감소증(panleukopenia), 광견병, 비기관지염.

돼지의 경우: 흉막폐렴, 보르데텔라, 이 콜라이, 단독(erysipelas), 헤모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 렙토스피라 종, 미코플라즈마, 파르보바이러스, 파르스테우렐라 물토시다, 허위광견병(Pseudorabies), 파상폭 항독소, 파상풍 변형독소.

바람직한 태양에서, 수의학 적용을 위한 항원은 광견병 바이러스, 개 파르보바이러스(심각한 위장 질환), 개 파르보바이러스 2(심각한 위장염), 개 코로나 바이러스(위장염), 개 아데노바이러스 1형(감염성 간염) 및 개 아데노바이러스 2형(케넬(kennel) 기침), 개 파라인플루엔자 바이러스(기관기관지염, 케닐 기침), 및 다수의 기타 동물 병원체에 대해 사용하기 위하여 선택된다.

본 발명자들의 연구 결과는, CDV의 분자수준의 유전자 조작이 실현가능하며, 미래의 약독화된 CDV주 및 CDV 발현 벡터의 합리적인 고안이 cDNA 구출 기술을 사용하여 달성될 수 있음을 나타낸다.

rCDV의 구출은 개 홍역 바이러스를 위한 보다 안전한 살아있는 약독화된 면역원성 조성물을 개발하기 위한 수단을 제공한다. 만일 또 다른 약독화된 바이러스가 개의 면역화에 대해 효과적이며, 다른 동물, 예를 들면 큰 고양이, 작은 육식동물 및 물범에서 사용하는데 있어 안전하고 효과적이라면, 당해 약독화된 바이러스가 이상적일 것이다. 약독화된 개 홍역 바이러스를 사용하는 태양의 경우, 약독화 돌연변이를 도입하여 변형된 바이러스를 수득하기 위하여, 통상의 수단, 예를 들면 화학적 돌연변이원을 첨가한 세포 배양물에서 바이러스를 성장시켜 화학적 돌연변이유발을 수행한 후, 온도 감수성 및/또는 냉온 적응된 돌연변이를 선별하기 위하여 최적이하의 온도에서 계대배양한 바이러스를 선별하고, 세포 배양물에서 작은 플라크를 생성하는 돌연변이 바이러스를 동정하고, 숙주 범위 돌연변이를 선별하기 위하여 이종성 숙주를 통해 계대배양하는 과정을 사용한다. 약독화 돌연변이를 도입하기 위한 또 다른 수단은, 부위-지정된 돌연변이유발을 사용하여 예정된 돌연변이를 일으키는 단계를 포함한다. 하나 이상의 돌연변이가 도입될 수 있다. 이어서, 이들 바이러스를 동물 모델에서 이들의 생물학적 활성의 약화에 대해 스크리닝한다. 약독화된 개 홍역 바이러스의 뉴클레오티드 서열을 분석하여 약독화 돌연변이의 부위를 결정한다.

상기 목표를 달성하기 위한 또 다른 방법은 합리적인 백신 설계 전략을 사용하는 것이다. 개 홍역 바이러스에서 시험될 수 있는 약독화 아미노산 치환 및 시스-작용 시그날 변화를 확인하는데 유용한 수 많은 연구가 수행되었다. 예를 들면, 사람 파라인플루엔자 바이러스 3형 및 호흡기 합포체 바이러스의 재조합 바이러스주의 연구를 통해, CDV와 상당한 관련이 있는 수 많은 약독화 돌연변이가 확인되었다. 이들은 L 단백질에서의 아미노산 치환[참조 문헌: 49, 50, 60]을 포함하고, 리더 및 GE/GS 시그날중의 시스-작용 서열내의 돌연변이[참조 문헌: 21, 50, 59]를 포함한다. 또한, 홍역 바이러스 백신의 게놈 서열을 연구하여 야생형 분리물과 비교한다. 어느 정도의 약독화를 나타내는 C 또는 V 단백질 발현에 대해 결함인 바이러스의 예가 존재한다[참조 문헌: 12, 13, 15, 22, 31, 37, 53, 56]. 구체적으로, 모노네가바이러스(Mononegavirales) 목의 또 다른 비절편화된 네가티브-센스의 일본쇄 RNA 바이러스, 바람직하게는 파로믹소바이러스과(Paromyxoviridae), 예를 PIV, RSV, 멈프스 및 홍역 바이러스로 부터의 바이러스의 암호화 또는 비암호화 영역중의 약독화 돌연변이에 상응하는 하나 이상의 돌연변이를 CDV 게놈속에 삽입할 수 있다. 다른 바이러스에 대한 다양한 돌연변이가 익히 공지되어 있고 계속하여 생성되어질 수 있다. 모노네가바이러스 목의 바이러스를 약독화시키는 것으로서 확인된 돌연변이에는 아래의 것이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다: 홍역 바이러스 3'게놈 프로모터 및 RNA 중합효소 유전자(WO 98/13501), 홍역 바이러스 N, P 및 C 유전자, 및 F 유전자-종결 시그날(WO 99/49017), 호흡기 합포체 바이러스 3'게놈 프로모터 및 RNA 중합효소 유전자(WO 98/13501), 호흡기 합포체 바이러스 M 유전자-종결 시그날(WO 99/49017), 호흡기 합포체 바이러스 RNA 중합효소 유전자(미국 특허 제5,993,824호), 호흡기 합포체 바이러스 N 및 F 유전자(WO 00/61611), 및 파라인플루엔자 바이러스 3형 3'게놈 프로모터 및 RNA 중합효소 유전자(WO 98/13501). 일단 CDV 게놈을 이용하여 돌연변이를 생성시킨 경우, 본 발명의 방법을 재조합에 의해 생산된 재조합 바이러스에 사용할 수 있다. 또한, 유전자 불활성화 방법이 유용할 수 있다. 최종적으로, 면역원성 및 약제학적 조성물에 사용하기 위한 개 홍역 바이러스의 보다 안전한 약독화된 바이러스주를 개발하기 위하여, 새로운 유전자 서플링(shuffling) 방법[참조 문헌: 3, 58]을 이용할 수 있다.

구출된 재조합 개 홍역 바이러스를, 먼저 시험관내 수단, 예를 들어 서열 동정, 서열 태그(tag)의 확인, 및 항체-이용 분석에 의해 목적하는 표현형(온도 감수성, 냉온 적응, 플라크 형태학, 및 전사 및 복제 약화)에 대해 시험한다. 구출된된 바이러스의 약독화된 표현형이 존재하는 경우, 적당한 동물 모델 또는 표적 동물을 사용하여 챌린지(challenge) 실험을 수행할 수 있다. 이들 동물을 먼저 약독화된 재조합에 의해 생산된 바이러스로 면역화시킨 다음, 바이러스의 야생형을 챌린지한다. 재조합에 의해 생산된 CDV의 약독화 수준을, 약독화된 바이러스의 독성을 야생형 CDV 또는 다른 표준물(예: 허용된 CDV의 약독화 형)의 독성과 비교하여 정립한다. 바람직하게는, 이러한 비교를 통해, 약독화된 재조합 바이러스가 야생형에 비해 상당히 감소된 독성을 나타냄이 정립되었다. 약독화된 재조합 바이러스에 대한 독성 수준은, 사람을 치료하거나 사람을 제외한 동물중 선택된 부류를 치료하는데 재조합 바이러스를 사용할 수 있도록 충분해야 한다.

발현 벡터의 선택 뿐 아니라 캡시드형성, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자는 목적하는 바이러스의 선택에 따라 달라질 수 있다. 숙주 세포에서의 전사 벡터(들)를 이용한 공동발현 및 선택된 조건하에서의 재조합 바이러스의 생산이 가능할 수 있도록. 발현 벡터를 제조한다.

개 홍역 바이러스 구출은, 바이러스 게놈 cDNA-함유 전사 벡터로 부터 안티게놈(또는 게놈)의 일본쇄 RNA의 전사를 유도하는 T7 RNA 중합효소가 존재하는 적당한 세포 환경을 포함한다. 전사와 동시에 또는 전사 직후에, 이러한 바이러스 안티게놈(또는 게놈) RNA 전사체는 뉴클레오캡시드 단백질에 의해 캡시드로 피복되어 작용성 주형이되고, 필수 바이러스-특이적 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 공동형질감염된 발현 플라스미드로 부터 동시에 생성되는 필수 중합효소 성분에 의해 이용된다. 이들 현상 및 과정은 바이러스 mRNA의 예비필수적 전사, 새로운 게놈의 복제 및 증폭을 유도함으로써, 새로운 바이러스 자손의 생산, 즉 구출을 유도한다.

본 발명의 구출 방법에서, T7 RNA 중합효소가 재조합 백시니아 바이러스에 의해 제공될 수 있다. 그러나, 이러한 시스템은, 구출된 바이러스가 물리적 또는 생화학적 수단에 의해, 또는 폭스바이러스(poxvirus)에 대한 양호한 숙주가 아닌 세포 또는 조직에서 반복하여 계대배양함으로써 백시니아 바이러스로 부터 분리되어질 것을 요구한다. 이러한 요구는 포유동물 세포에서 증식하지 않는 백시니아 바이러스중의 숙주 세포 제한된 바이러스주(예: MVA-T7)를 사용함으로써 피할 수 있다. 박테리오파아지 T7 RNA 중합효소를 발현하는 두 개의 재조합 MVA가 보고되었다. MVA/T7 재조합 바이러스는, 7.5K 약한 초기/후기 프로모터[참조 문헌: Sutter et al., 1995] 또는 11K 강한 후기 프로모터[참조 문헌: 74]의 조절하에 T7 RNA 중합효소의 하나의 통합된 복사체를 함유한다.

구출 조성물의 형질감염에서 사용되는 숙주 세포 또는 세포주는 구출을 위해 선택된 조건하에서 광범위하게 다양할 수 있다. 숙주 세포를, 구출 조성물의 벡터의 공동발현을 허용하는 조건하에서 배양하여, 목적하는 재조합 개 홍역 바이러스를 생산할 수 있다. 이러한 숙주 세포는 진핵 세포, 및 바람직하게는 척추동물 세포를 포함한 매우 다양한 세포중에서 선택될 수 있다. 조류 세포가 사용될 수 있으나, 경우에 따라 숙주 세포가 다른 세포, 심지어 사람 배아 신장 세포와 같은 사람 세포로 부터 유래될 수 있다. 숙주 세포의 예로는 사람 293 세포, A549 세포(폐 암종) 및 Hep2 세포(경부 암종)이 있다. 베로(Vero) 세포(원숭이 신장 세포) 및 많은 다른 유형의 세포가 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 적합한 숙주 세포의 다른 예로는 (1) 사람 이배체 일차 세포주: 예) WI-38 및 MRC5 세포; (2) 원숭이 이배체 세포주: 예) FRhL-태아 붉은털 원숭이 폐 세포; (3) 유사-일차 무한증식 세포주: 예) AGMK-아프리카 녹새 원숭이 신장 세포; (4) 다른 잠재적 세포주: 예) CHO, MDCK(Madin-Darby Canine Kindey; 마딘-다비 개 신장), DK(Dog Kidney;개 신장) 및 일차 병아리 배 섬유아세포(CEF)가 있다. 몇몇 진핵 세포주는 바이러스를 증식하는데 있어서 다른 것 보다 적합하고, 몇몇 세포주는 어떤 바이러스에는 전혀 적합하지 않다. 생존가능한 바이러스의 구출을 용이하게 검출하기 위하여, 검출가능한 세포병변 효과를 나타내는 세포주를 사용한다. 개 홍역 바이러스의 경우, 당해 바이러스가 베로 세포상에서 급속히 증식하여 용이하게 검출가능한 플라크를 형성하기 때문에, 형질감염된 세포를 베로 세포상에서 공동배양할 수 있다. 일반적으로, 선택된 바이러스의 성장을 허용하는 숙주 세포가 사용된다.

또 다른 바람직한 태양에서, 형질감염-촉진 시약을 첨가하여 세포에 의한 DNA의 섭취를 증가시킬 수 있다. 다수의 이들 시약이 당업계에 공지되어 있다. 리포펙탁(LIPOFECTACE: Life Technologies, Gaithersburg, MD) 및 이펙텐(EFFECTENE: Qiagen, Valencia, CA)가 통상적인 예이다. 리포펙탁 및 이펙텐은 둘다 양이온성 지질이다. 이들은 둘다 DNA를 피복하여 세포에 의한 DNA의 섭치를 증가시킨다. 리포펙탁은 DNA를 에워싸는 리포좀을 형성하는 반면, 이펙텐은 DNA를 피복하지만 리포좀을 형성하지는 않는다.

전사 벡터 및 발현 벡터는 숙주 세포에서 발현시키기 위해 설계된 플라스미드 벡터일 수 있다. 캡시드형성, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 하나 이상의 분리된 핵산을 포함하는 발현 벡터는 동일한 발현 벡터 또는 2이상의 상이한 벡터로 부터 이들 단백질을 발현할 수 있다. 일반적으로 이들 벡터는 기본적 구출 방법으로 부터 알려졌으며, 이들은 본 발명의 개량된 방법에 사용하기 위하여 변경되어질 필요가 없다.

본 발명의 방법에서, 구출을 위한 표준 온도 범위(약 32℃ 내지 약 37℃)가 사용될 수 있으나; 승온에서의 구출이 재조합 RNA 바이러스의 회수를 향상시킨다는 것이 밝혀졌다. 승온이란 열 쇽크 온도로서 지칭된다[참조 문헌: 1999년 12월 9일에 공개된 국제특허 공보 제WO 99/63064호; 이는 본원에 참조로서 인용된다]. 효과적인 열 쇽크 온도는 재조합 바이러스의 구출을 수행하는데 제안되는 표준 온도 이상의 온도로서, 이 온도에서 재조합 바이러스의 회수 수준이 향상된다. 온도 범위의 예는 다음과 같다: 약 38℃ 내지 약 47℃, 바람직하게는 약 42℃ 내지 약 46℃. 달리, 43℃, 44℃ 및 45℃의 열 쇽크 온도가 특히 바람직하다.

목적하는 재조합 개 홍역 바이러스의 회수 수준을 측정하는데 수 많은 수단이 사용된다. 본원의 실시예에 기술된 바와 같이, 클로르암페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 레포터 유전자를 사용하여 재조합 바이러스의 구출을 위한 조건을 모니터링하고 최적화한다. 레포터 유전자의 상응하는 활성은 재조합 바이러스의 발현의 기준선 및 시험 수준을 확립한다. 다른 방법은 수득된 재조합 바이러스의 플라크 수를 검출하는 단계 및 구출된 바이러스의 생산을 서열분석에 의해 확인하는 단계를 포함한다.

바람직한 태양에서, 숙주 세포(들)에 존재하는 형질감염된 구출 조성물을 플라크 발현 단계(즉, 증폭 단계)에 적용한다. 형질감염된 구출 조성물을 플라크 증대 세포(PE 세포)의 하나 이상의 층위에 옮긴다. 형질감염된 세포로 부터 재조합 바이러스의 회수는, 개 홍역 바이러스 또는 재조합 개 홍역 바이러스가 향상된 성장을 나타내는 플라크 증대 세포를 선택함으로써 향상된다. 바람직하게는, 구출 조성물을 함유하는 형질감염된 세포를 실질적으로 컨플루언스(confluence)를 이루는 PE 세포의 단층위에 옮긴다. 플라크 증대를 포함하여 구출 기법의 각종 변형이 1999년 12월 9일 공개된 국제특허 공보 제WO 99/63064호에 기재되어 있다.

또한, 37℃에서 보다는 30℃ 내지 35℃의 온도에서 세포를 항온처리하는 것이 미니레플리콘 발현을 증가시킨다는 것이 밝혀졌다(도 3B 참조). 이러한 관찰은 저온에서 개 홍역 바이러스 구출을 수행하는데 있어서 유용한 가치를 갖는다. 비록 보다 낮은 항온처리 온도가 미니레플리콘 활성을 증가시키지만, 승온에서의 일시적 항온처리가 CDV 미니레플리콘 활성을 증가시킨다는 것이 밝혀졌다. 열 쇽크가 미니레플리콘 활성에 미치는 긍정적인 효과를 고려하여, 열 쇽크 단계를 본 발명의 개 홍역 바이러스 구출 프로토콜에 도입하는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 구출 방법은 형질감염 방법으로 칼슘-포스페이트 기법을 사용한다. 일반적으로, 칼슘-포스페이트 방법은 형질감염 실험에서 CDV-양성 웰의 수를 리포좀 방법에 비해 약 2배 증가시킨다(자료는 제시되지 않음). 이는 매우 약독화된 바이러스주를 분리하는 경우 중요할 수 있다. 다음 사항에 구애됨이 없이, 칼슘-포스페이트는 리포좀 시약 보다 세포막에 덜 손상을 줄 수 있으며, 보다 건강한 세포막이 비교적 드물게 구출된 바이러스의 출아를 촉진한다. 또한, 칼슘-포스페이트 침전법이 수개의 상이한 플라스미드를 동일한 세포에 도입하는데 있어서 보다 다소 효과적인 것이 사실이고, 이에 의해 실제로 게놈 cDNA와 함께 N, P 및 L 발현 플라스미드의 전체 셋트를 함유하는 세포가 보다 많이 생산된다.

바람직한 바이러스 구출 방법은 전술한 여러 기법, 예를 들면 플라크 증대, 열 쇽크, 칼슘 침전 기법[참조 문헌: 10, 31, 40, 42] 뿐 아니라, 여러 중요한 변형, 예를 들면 저온 항온처리를 포함한다.

다양하게 조합된 기법을 미니레플리콘을 사용한 구출 방법의 최적화에 대해 시험할 수 있으며, 이는 일시적 분석에서 유전자 발현 수준에 영향을 주는 각종 변수를 신속하게 평가할 수 있도록 해준다. 예를 들면, 각 발현 벡터를 포함한 각종 구출용 성분 뿐만 아니라 레플리콘 벡터중의 시스-작용 시그날을 신속히 시험하여 구출 시스템내의 이들의 활성을 평가할 수 있다. 최대 미니레플리콘 발현에 요구되는 발현 벡터의 최적량을 결정하기 위하여 미니레플리콘 시스템을 사용할 수 있다[참조: 도 2 및 도 3; 자료는 제시되지 않음]. 이들 최적화 단계는 각각 미니레플리콘 발현에서 유익한 증가를 일으키고, 또한 이들은 함께 구출에 상당한 효과를 미칠 수 있다. 2이상의 최적화된 변수 및 기법을 조합하여, 성공적으로 구출된 바이러스 %를 실질적으로 향상시킬 수 있다. 성공률은 웰 플레이트 당 양성 웰의 수를 측정함으로써 결정될 수 잇다. 성공률은 약 50% 이상, 심지어 60% 초과이다. 또 다른 바람직한 태양에서, 성공률은 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 약 80% 이상이다. 이는 구출에 대해 공개된 기법[참조: 공개된 국제특허출원 제WO 99/63064호]에 비해 상당히 향상된 것이다.

개 홍역 바이러스의 경우, 최적화된 구출 방법은, 변형된 프로토콜을 사용하여 형질감염된 6개의 웰 플레이트로 부터 일관되게 4 내지 6개의 CDV-양성 플레이트 웰을 생성시킨다. 대조적으로, 면역원성 조성물은 후보 바이러스주, 특히 바람직한 약독화 돌연변이를 함유하는, 매우 저조하게 복제하고/하거나 구출하기에 곤란한 바이러스주를 형성한다. 구출 효율을 증가시키기 위해 선택된 기법은 임의의 비절편화된 네가티브-센스의 일본쇄 RNA 바이러스의 구출에 적용될 수 있다. 비절편화된 네가티브-센스의 일본쇄 RNA 바이러스에 대한 현재의 분류학적 분류는 각각의 예와 함께 아래에 제시된다.

모노네가바이러스 목의 비절편화된 네가티브-센스의 일본쇄 RNA 바이러스의 분류

파라믹소바이러스과

파라믹소바이러스아과 하위계열

레스피로바이러스(Respirovirus) 속 (종전에는 파라믹소바이러스로서 공지됨)

센다이(Sendai) 바이러스(마우스 파라인플루엔자 바이러스 1형)

사람 파라인플루엔자 바이러스(PIV) 1형 및 3형

소 파라인플루엔자 바이러스(BPV) 3형

루불라바이러스(Rubulavirus) 속

원숭이 바이러스 5(SV5)(개 파라인플루엔자 바이러스 2형)

멈프스 바이러스

뉴캐슬 질환 바이러스(NDV)(조류 파라믹소바이러스 1)

사람 파라인플루엔자 바이러스(PIV-2, 4a 및 4b형)

모르빌리바이러스 속

홍역 바이러스(MV)

돌고래 모르빌리바이러스

개 홍역 바이러스(CDV)

페이스트 데스 페티츠(Peste des petits) 반추동물 바이러스

포신 디스템퍼(Phocine distemper) 바이러스

우역 바이러스

뉴모바이러스아과(Pneumovirinae) 하위계열

뉴모바이러스 속

사람 호흡기 합포체 바이러스(RSV)

소 호흡기 합포체 바이러스

마우스의 폐렴 바이러스

칠면조 비기관지염 바이러스

라브도바이러스과(Rhaboviridae)

리싸바이러스(Lyssavirus) 속

광견병 바이러스

베시쿠로바이러스(Vesiculovirus) 속

수포성 구내염 바이러스(VSV)

에페메로바이러스(Ephemerovirus) 속

소 일시열 바이러스

필로바이러스과(Filovirdae)

필로바이러스(Filovirus) 속

마르부르그(Marburg) 바이러스

임의의 상기 바이러스에 대한 바이러스 구출의 효율을 향상시키기 위하여, N, P 및 L 발현 벡터의 질량 및 전체 길이의 cDNA의 미니레플리콘의 질량을 변화시켜, 재조합 바이러스를 구출할 수 있는 양을 수득한다. 이후, 구출 효율을 증가시키기 위하여, 2 이상의 다음 단계 및/또는 기법을 이용할 수 있다: (1) 형질감염용 세포 유형의 선택(바람직하게는, 베로 세포, Hep2 또는 A549 세포); (2) 형질감염 시약의 선택(바람직하게는, 칼슘 포스페이트 시약을 사용함); (3) 플라크 증대 단계를 수행하기 위한 최적 세포 유형의 선택; 및 (4) 형질감염을 향상시키는 세포 유형의 선택. 또한, 구출 효율은 하나 이상의 다음 단계 및/또는 기법을 사용함으로써 더욱 향상된다: (1) 주어진 세포 유형 및 구출 시스템에 대한 항온처리 온도를 변화시킴; (2) 열 쇽크 적용의 시기를 변화시킴(바람직하게는, 형질감염 개시 후 약 2 내지 약 4 시간째에 열 쇽크를 적용하기 시작함); (3) 열 쇽크 온도를 변화시킴(바람직하게는, 약 42 내지 약 44℃); 및 (4) 열 쇽크 기간을 변화시킴(약 2 내지 약 3시간이 바람직하다). 또한, 구출 효율의 추가적 증가는, 적당한 양의 T7 RNA 중합효소 공급원, 예를 들면 MVA/T7 또는 재조합 백시니아 바이러스를 선택하고/하거나 형질감염중의 DNA 및 형질감염 시약에 세포를 노출시킨 시간을 조정함으로써 수득된다.

본 발명의 발명으로 부터 수득된 재조합 개 홍역 바이러스를 진단적, 예방적 및 치료적 적용에 사용한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법으로 부터 수득된 재조합 바이러스는 약독화된다. 약독화된 재조합 바이러스는, 사람 및 동물 숙주를 감염시키는 야생형 바이러스에 비해 상당히 감소된 독성을 나타낸다. 약독화 정도는, 감염 증상이 대부분의 개체에서 나타나지 않으나, 바이러스가 감염성을 나타내고 목적하는 면역원성 조성물에 대해 면역 반응 프로파일을 유도할 수 있기에 충분한 복제 적격능을 보유하는 정도이다. 약독화된 재조합 바이러스는 질환의 예방 또는 경감을 위한 면역원성 조성물로서 단독으로 사용되거나 약제, 항원, 면역화제 또는 애쥬번트와 함께 사용될 수 있다. 이들 활성제는 통상의 수단, 즉 희석제 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 제형화되고 전달될 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양에서, 비-약독화된 또는 약독화된 재조합에 의해 생산된 개 홍역 바이러스가, (i) 재조합에 의해 생산된 하나 이상의 개 홍역 바이러스 및 (ii) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 완충제 또는 희석제, 애쥬번트 또는 담체를 포함하는 면역원성 조성물중에 사용된다. 바람직하게는, 이들 조성물은 개 홍역 바이러스 감염을 예방하고/하거나 경감하기 위한 면역원성 조성물로서 치료적 및 예방적 용도를 갖는다. 이러한 용도에서, 본 발명의 하나 이상의 재조합 개 홍역 바이러스의 면역학적 유효량은 정상적 개 홍역 바이러스 감염 과정에서 실질적인 감소를 일으키는 양으로 사용된다.

이러한 면역학적 조성물의 제형은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 본 발명의 면역학적 조성물은 추가적 항원성 성분(예: 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 항원을 암호화하는 핵산 또는 이의 단편)을 포함하고, 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 적당한 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제에는 임의의 모든 통상의 용매, 분산 매질, 충전제, 고체 담체, 수용액, 피복제, 항균제, 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 당해 담체가 투여된 환자에게서 알레르기 반응 또는 다른 불리한 효과를 유발하지 않는 담체를 의미한다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체의 예로는 하나 이상의 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등 뿐 아니라 이의 배합물이 포함된다. 약제학적으로 허용되는 담체는 항원의 저장 수명 또는 효과를 증가시키는 소량의 보조 물질, 예를 들면 습윤화제, 유화제, 보존제 또는 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적 활성 물질을 위한 상기와 같은매질 및 제제의 용도가 당업계에 익히 공지되어 있다. 임의의 통상의 매질 또는 제제가 활성 성분과 부적합한 경우를 제외하고는, 본 발명의 면역원성 조성물중에 이를 사용하는 것이 고려된다.

이러한 면역원성 조성물은 임의의 통상의 효과적인 형태로, 예를 들면 비내, 비경구, 경구로, 또는 예를 들면 에어로솔 분무에 의해 비강내, 구강, 눈, 폐, 질 또는 직장 표면과 같은 점막 표면에의 국소 적용으로 투여될 수 있다. 바람직한 투여 수단은 비경구 또는 비내 투여이다.

경구용 제형은 통상적으로 사용되는 부형제, 예를 들면 약제 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 삭카린, 셀룰로즈, 탄산마그네슘 등을 포함한다.

본 발명의 면역원성 조성물은 애쥬번트, 예를 들면 수산화알루미늄; 인산알루미늄; Stimulon^TMQS-21(Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA); MPL^TM(3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A; RIBI ImmunoChem Research, Hamilton, MT); IL-12(Genetics Institute, Cambridge, MA); N-아세틸-무라밀-L-테로닐-D-이소글루타민(thr-MDP); N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (CGP 11637, 노르-MDP로 지칭됨); N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스-포릴옥시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE로 지칭됨); 및 콜레라 독소 등을 포함할 수 있다. 기타 사용될 수 있는 것으로는 콜레라 독소의 비-독성 유도체, 예를 들어 이의 B 아단위(예컨대, 본원에참조로서 인용된 공개된 특허 출원 제WO 00/18434호에 기재된 바와 같은, 아미노산 위치 20에서 글루탐산이 다른 아미노산, 바람직하게는 히스티딘으로 치환된 경우), 및/또는 콜레라 독소 또는 이의 B 아단위, 프로콜레라게노이드(procholeragenoid), 진균 다당류와 비-개 홍역 바이러스 폴리펩디드의 접합체 또는 유전자 조작된 융합체가 있다.

재조합에 의해 생산된 본 발명의 약독화된 개 홍역 바이러스는 면역원성 조성물중의 유일한 활성 면역원으로서 투여될 수 있다. 그러나, 달리, 면역원성 조성물은 다른 활성 면역원, 예를 들면 상기한 바와 같이, 다른 병원성 종에 대해 면역학적으로 활성인 다른 항원을 포함할 수 있다. 다른 면역학적 활성 항원은 복제성 제제 또는 비-복제성 제제일 수 있다. 다른 면역학적 활성 항원은 각종 감염성 제제에 대해 유도된 것들일 수 있다[참조 문헌: 1, 7]. 당해 면역원성 조성물을 사용하여, 각종 동물, 예를 들면 개(개과류) 및 고양이(고양이과류)와 같은 애완 동물, 및 소, 돼지 및 말과 같은 사육 동물을 치료할 수 있다.

본 발명의 중요한 양상중 하나는 본 발명의 면역원성 조성물을 포유동물에게 제공하는 단계를 포함하여, 당해 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 면역원성 조성물은, 당해 조성물중에 함유된 폴리펩티드(들)의 면역학적 유효량이 개 홍역 바이러스 감염에 대해 목적하는 반응을 야기할 수 있도록, 치료된 동물 또는 사람에게서 면역원성인 조성물이다. 바람직한 태양은, 당해 항원성 조성물의 면역학적 유효량을 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에게서 개 홍역 바이러스 감염의 예방 또는 경감을 포함한 치료 방법에 관한 것이다. 투여량은 개체의 구체적 조건에 따라 달라질 수 있다. 이러한 양은 당업자에게 공지된 수단에 의하여 통상의 시험에서 결정될 수 있다. 동물 및 심지어 사람을 본 발명의 면역원성 조성물로 치료할 수 있다. 분명히, 매우 다양한 동물이 치료될 수 있다. 치료되는 동물에는 애완용 개와 같은 애완 동물 뿐만 아니라 여우, 늑대 및 코요테와 같은 야생 동물이 포함된다. 붉은 펜더가 개 홍역 바이러스에 의한 감염에 걸릴 수 있다고 보고되었기 때문에, 동물원 또는 야생생물 공원과 같은 지역 또는 환경에 놓인 모든 동물을 치료할 수 있다. 개 홍역 바이러스 발병이 밍크, 담비 및 너구리와 같은 육식동물 및 물범에서 보고되었으며, 이들은 모두 본원에서 상기된 바와 같은 치료를 위한 표적 동물일 수 있다.

아래의 실시예는 본 발명의 특정 태양을 설명하기 위하여 포함된다. 그러나, 당업자는, 본원의 내용을 통해 본 발명의 취지와 범위를 벗어남이 없이, 기술된 구체적 태양에 많은 변화가 가해질 수 있으며 동등한 또는 유사한 결과가 수득될 수 있다는 것을 인지한다.

실시예 1

재료 및 방법

세포 및 바이러스.HEp2, A549, 베로, B95-8, 및 병아리 배아 섬유아세포(CEF) 세포를, 10% 태아 소 혈청(FBS)이 보충된 둘베코(Dulbecco) 변형 배지(DMEM)에서 유지시켰다. HeLa 현탁 세포를, 5% FBS가 보충된 변형된 최소 필수 배지(SMEM)에서 성장시켰다. 실험실-적응된 온데르스테포르트(Onderstepoort) CDV주[참조 문헌: 17]를 앞서 기술된 HeLa 세포에서 증식시켰다[참조 문헌: 46]. 제2의 실험실--적응된 온데르스테포르트주는 주리히(Zurich) 대학교의 마틴 빌레터(Martin Billeter) 박사에 의해 제공되고 B95-8 세포에서 증식되었다. T7 RNA 중합효소를 발현하도록 설계된 재조합체인 약독화된 백시니아 바이러스주 MVA/T7[공급원: Dr. B. Moss, National Institutes of Health, Bethesda, MD; 참조 문헌: Wyatt et al., 1995; ref. 61]를 CEF 세포에서 증식시켰다. MVA/T7 스톡의 역가를 CEF상에서 측정하였다. 홍역 바이러스(MV)의 실험실-적응된 에드만스톤(Edmonston)주를 HeLa 현탁 세포에서 성장시켰다[참조 문헌: 55].

재조합 DNA

분자 클로닝 과정을 표준 프로토콜에 따라 수행하였다[참조 문헌: 2, 26, 71].

1A. 전체 길이의 CDV cDNA 클론

전체 길이의 CDV cDNA 클론을, 게놈에서 발견된 편리한 제한 부위를 이용한 6개의 RT/PCR 단편으로 부터 조립하였다[도 1A]. 바이러스 cDNA를 포지티브 게놈 쇄의 5'말단에 융합된 T7 RNA 중합효소 프로모터로 클로닝하고, 3'말단에 디형 간염 바이러스 리보자임 및 두 개의 T7 전사 터미네이터를 플랭킹시켰다. T7 RNA 중합효소 프로모터는, 통상적으로 바람직한 T7 중합효소 개시 부위를 제공하는 3개의 G 잔기가 제거되어 3' 말단에서 절두(truncation)되었으며, 이로써 전사체의 상당부분이 포지티브 게놈 쇄중의 첫번째 A 잔기에서 개시될 것이다.

CDV 전체 길이의 게놈 클론의 클로닝을 수월하게 하기 위하여, 특유의 NotI 및 NarI 부위를 함유하는 플라스미드 벡터를 제조하였다. NotI 및 NarI 제한 부위는 CDV 게놈에는 부존재하므로, 이들은 벡터 주쇄에 사용하기에 편리한 부위이다. 이러한 변형된 벡터 DNA를 PCR로 제조하였다. 앞서 보고된 홍역 바이러스 미니레플리콘 플라스미드(도 1, p802, ref 45)로 부터 벡터 주쇄를 증폭하기 위한 프라이머를 설계하였다. 이들 프라이머는 벡터 주쇄의 증폭을 유도하고 홍역 바이러스 미니레플리콘 서열을 배제하였다. 증폭된 DNA에는 리보자임 서열중에 위치한 NarI 부위가 유지되었으며 NotI 부위가 생성되었다(참조: 도 1의 NotI 및 NarI 부위). 당해 프라이머는 또한 NotI과 NarI 부위 사이에 폴리링커를 형성시키기 위하여 설계된 5' 연장부를 함유하며, 일단 증폭된 DNA를 연결하여 증폭된 벡터 주쇄를 환상화하고 이를 세균 형질전환에 이용하였다. 바이러스 게놈으로 부터 증폭된 단편의 클로닝을 용이하게 하기 위하여, 당해 폴리링커에 SalI, NdeI, DraIII, BsiWI 및 SgrA1 부위를 포함시켰다(도 1A).

전체 길이의 게놈 DNA를 상기한 벡터(도 1a)에 클로닝하였다. 완전한 상태의 CDV cDNA 서열은 15,690개의 염기로 이루어지며, 이 염기 수자는 6에 의해 나누어질 수 있는 수로서, 6의 규칙(rule-of-six)과 일치한다[참조 문헌: 6, 23]. pBS-rCDV(도 1A)중의 바이러스 cDNA는, T7 RNA 중합효소에 의해 CDV 게놈의 포지티브-센스 복사체가 합성될 수 있도록 배향되었다. 게놈 cDNA 플라스미드를 제조하기 위하여, CDV 게놈의 6개의 단편(도 1A)을 역전사 및 PCR 증폭(RT/PCR) 후 정제된 바이러스 RNA로 부터 연속적으로 클로닝하였다[참조 문헌: 46].

증폭된 제1 게놈 cDNA는 도 1A의 NarI/SgrAI 단편(서열번호 2의 CDV 뉴클레오티드 13089 내지 15690)에 해당한다. CDV cDNA의 3'말단을 증폭시키는데 사용되는 프라이머는 CDV의 말단부에 상보적이며, NarI 부위에 걸쳐있는 리보자임 서열을 포함하는 연장부를 함유한다(cagccggcgccagcgaggaggctgggaccatgccggccACCAGACAAA GCTGGGT, 서열번호 6, 여기서, CDV 서열은 대문자로 표시하였다). 제2 프라이머는 바이러스 게놈내의 SgrAI 부위에 걸쳐있다(TACTCAAGTCAAATACTCAGGGAC, 서열번호 7). 증폭된 단편을 NarI 및 SgrAI으로 분해하고, 벡터 주쇄내에 클로닝하였다. 이어서, 이러한 플라스미드를 사용하여 SgrAI과 BsiWI 부위에 걸쳐있는 다음 단편(10136-13088; 프라이머 CAGGGGTGCTTTTCTGAGTCACTGC, 서열번호 8 및 ACGACCTTTCTGAGCCCTGGGACTC, 서열번호 9)에 클로닝하였다. 유사하게, BsiWI-DraIII 단편(뉴클레오티드 8666-13015; 프라이머 AGAGGAGACCAGTTCACTGTACTCC, 서열번호 10 및 TGATTCCCTCCCCTGAGGCATGAGC, 서열번호 11), NdeI/DraIII 단편(뉴클레오티드 5845-8665; 프라이머 GCAATCCAATCTCTTAGAACCAGCC, 서열번호 12 및 TCGAATCTGTAAAATTGGTGACACC, 서열번호 13) 및 SalI/NdeI 단편(뉴클레오티드 2962-5844; 프라이머 GCCATTACTAAACTAACTG, 서열번호 14 및 ATCTTATGAATTTCTCCTCC, 서열번호 15)을 증폭시키고, 성장중인 cDNA 클론에 연속적으로 부가하였다. 최종적으로, T7 프로모터 및 CDV 뉴클레오티드 1-2961을 함유하는 NotI/SalI 단편을 증폭시키고(프라이머 ATGGGTTTCAGCTGGAGGTCTCTC, 서열번호 16 및cggcggccgcgtaatacgactcactataACCAGACAAAGTTGGCT, 서열번호 17, 여기서 CDV 뉴클레오티드는 대문자로 표시하였다), 게놈 cDNA 클론에 부가하였다.

완전한 상태의 게놈 cDNA 플라스미드의 서열을 분석하고 CDV 게놈의 컨센수스(consensus) 서열과 비교하였다. 이로써, RT/PCT 증폭에 의해 도입되었을 다수의 뉴클레오티드 변화가 밝혀졌다. 단백질 암호화 영역내의 몇몇 염기 변화는 아미노산 코돈 특이성과 관련해서 무발현성(silent) 이었다. 이들 염기 치환은 회복되지 않았다; 이들은 재조합 바이러스를 동정하기 위한 "태그(tag)"로서 유용하다. 또한, 비암호화 영역의 하나의 염기 변화가 M과 F 유전자 사이의 유전자간 영역(M/F 유전자간 영역)의 뉴클레오티드 6837에서 발견되었으며, 이 염기 치환은 회복되지 않았다. 코돈 특이성에 영향을 주는 염기 치환은 올리고뉴클레오티드 돌연변이유발법에 의해 회복되거나, 돌연변이 영역을 독립적으로 RT/PCR-증폭된 DAN 단편으로 대체함으로써 회복되었다. 올리고뉴클레오티드 돌연변이유발법은, 먼저 염기 교정을 필요로 하는 영역을 서브클로닝한 다음, QuickChange(Stratagene) 또는 Morph(5 prime-3 prime, Inc) 돌연변이유발 키트를 사용하여 교정하는 방법으로 수행하였다. 이어서, 교정된 단편을 전체 길이의 클론에 다시 삽입하였다. 회복된 전체 길이의 클론의 서열을 분석하여 돌연변이의 교정을 확인하였다.

1B. CDV 미니레플리콘

전체 길이의 cDNA 클론에 사용된 플라스미드 벡터를 사용하여, CDV 미니레플리콘(CDV-CAT) 서열을 함유하는 pCDV-CAT를 제조하였다. CDV 미니레플리콘을 구성하는 서열은, 레포터 유전자의 5'말단에 CDV 리더가 플랭킹되어 있고 3'말단에 CDV트레일러가 플랭킹되어 있는 CAT 유전자를 포함한다(도 1B). CDV 미니레플리콘을 전체 길이의 클론과 반대 방향으로 T7 중합효소 프로모터와 리보자임 사이에 삽입하였다. 따라서, T7 RNA 중합효소 전사에 의해 네가티브-쇄의 미니게놈 RNA의 동등물이 생성된다.

CDV 미니레플리콘을 상기한 벡터 주쇄내에 클로닝하였다. 클로닝에 사용된 미니레플리콘 DNA을 PCR로 제조하였다. 5'말단에 CDV 리더와 리보자임 서열(NarI 부위 포함)이 플랭킹되어있고 3'말단에 CDV 트레일러 및 T7 프로모터가 플랭킹되어 있는 CAT 서열을 4개의 중첩된(nested) PCR 반응으로 제조하였다(도 1B). 요약하면, CAT 유전자를, 4개의 상이한 프라이머 셋트를 사용하여 상이하게 4회 증폭시켰다. 제1 프라이머 셋트는, CAT 유전자-특이적 프라이머의 5'말단에 도입된 서열을 이용하여 PCR 생성물에 리더와 트레일러 부분을 부가하면서 CAT 유전자를 증폭시키는데 이용하였다. PCR의 다음 회에서, 제1 프라이머 셋트와 중첩하는 프라이머를 사용하면서, CDV 리더 및 트레일러로 부터 추가 서열을 부가하였다. 5' 연장부와 중첩하는 프라이머를 사용하는 이러한 방법을 아래에 제시된 프라이머를 사용하여 4회 반복하였다:

4회의 중첩된 PCR 증폭을 통해, 5'-NarI 부위-33bp의 리보자임 서열-CDV 리더-CAT 유전자-CDV 트레일러-T7 프로머터-HinIII 부위로 이루어진 미니레플리콘 단편이 생성된다. 4회의 중첩된 PCR 증폭을 다음 프라이머 쌍을 사용하여 수행하였다:1회: 프라이머 A + F; 2회: 프라이머 B + G; 3회: 프라이머 C + H; 4회: 프라이머 D + I.

프라이머 F가 CAT 유전자의 3' 말단에 2개의 종결 코돈을 명확히 보여줌에 주의한다. 하나는 CAT 유전자 종결 코돈이고, 다른 하나는 CDV 게놈중의 L 유전자로 부터 유래되었다. 미니게놈이 6의 규칙[참조 문헌: 6, 23]에 일치하도록 단지 3개의 추가적 뉴클레오티드(제2의 종결 코돈)를 도입하기 위하여, 2개의 종결 코돈을 삽입하였다.

이점에서, 처음 초기 계획은 도 1B의 NotI 부위의 위치에 HindIII 부위를 함유하는 벡터를 사용하는 것이었다. 따라서, 위에 제시된 프라이머는 HindIII 부위를 함유하였다. 벡터중 NotI 부위를 사용하고자 5회째의 PCR를 수행하여, NotI 부위를 함유하는 미니레플리콘 단편을 제조하였다. NotI 부위를 도입하기 위하여, 미니레플리콘 DNA를 프라이머 E 및 J(J는 NotI 부위를 함유한다)로 증폭시켰다.

최종적으로, 위에서 사용된 프라이머에서, CDV 미니레플리콘중에 야생형 T7 프로모터 서열(TAATACGACTCACTATAGGG, 서열번호 28, 프라이머 H, I, 및 J 참조)을 도입되었다. 형질감염 실험에서 저조한 미니레플리콘 활성 때문에, T7 프로모터의 3' 말단으로 부터 3개의 G 잔기(이탤릭체)를 제거하여 당해 미니레플리콘를 추가로 변형시켰다. T7 프로모터중의 이들 잔기는 중합효소에 의해 실제로 복사되고 미니레플리콘 전사체에 도입된다. 이로써, 6의 규칙[참조 문헌: 6, 23]과 일치하지 않는 미니레플리콘 RNA가 생성된다. T7 프로머터의 절두는 프로모터의 활성을 감소시키지만, 6의 규칙을 따르는 미니레플리콘 전사체를 생성시킨다. 이러한 변형된 미니레플리콘을, 3개의 G 잔기를 잭킹(jacking)한 변형된 프라이머 J를 포함하여 프라이머 E 및 J에 유사한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭으로 제조하였다.

1C. 이종성 핵산 또는 유전자 서열을 발현하기 위한 CDV 작제물

게놈 cDNA 클론을, 외래 유전자의 삽입이 가능하도록 P와 M 유전자 사이에서 변형시켰다. CDV 서열을 최소한으로 변형시키면서 수개의 특유한 제한 부위가 도입될 수 있도록 변형을 선택하였다. 8개의 뉴클레오티드 치환을 도입하여 3개의 특유한 제한 부위를 생성시켰다(3330 G →A, 3331 G →A, 3335 T →C, 3348 A →G,3349 A →G, 3355, G →C, 3373 T →A, 및 3377 T →G). 이들 변형으로 CDV 뉴클레오티드 위치 3329 내지 3377 사이에 3개의 특유한 제한 부위(AatII, FseI 및 MluI, 도 5A)가 생성되었다. 9번째 염기 변화(3337, A →T)를 AatlI 부위의 3' 바로 옆에 가하여, AatlI 부위를 생성시키는데 사용된 뉴클레오티드 변화에 의해 생성된 SalI 부위를 제거하였다.

당해 뉴클레오티드 치환을, P 및 M 유전자간 영역을 함유하는 플라스미드 서브클론(SalI 위치 2961 내지 NdeI 위치 5849)내에 생성시켰다. 서브클론으로 부터의 변형된 단편을 전체 길이의 게놈 클론속에 교체 삽입하여 새로운 제한 부위를 P 유전자 개방형 판독 프레임의 3' 및 P/M 유전자-종결/유전자-개시 시그날의 5'에 위치시켰다. 이러한 클론(pBS-rCDV+)이 성공적으로 구출됨으로써, 염기 치환이 바이러스에 대해 뚜렷하게 유해한 효과를 주지 않음이 입증되었다.

이어서, 클론 pBS-rCDV+를 외래 유전자의 삽입을 위한 벡터로서 사용하였다. pGL2-luc(Promega)로 부터의 루시페라제 유전자를 프라이머(5'말단, TACTGGCCGGCCATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGCCTAAGTCCGCTGCCACCATGGAAGACGCCAAAAA CAT, 서열번호 29; 3'말단, TTTTACGCGTTTACAATTTGGACTTTCCGC, 서열번호 30)을 사용하여 증폭시켜, 당해 루시페라제 유전자속에 5' FseI 및 3' MluI 부위를 도입하였다. 루시페라제의 암호화 영역의 아미노 말단에 특이적인 5'말단 프라이머는 또한 FseI 부위외에 P/M 유전자간 영역으로 부터의 GE/GS 시그날의 복사체를 포함하는 5' 연장부를 함유한다(도 5A). 루시페라제 유전자를 증폭하는데 사용된 프라이머는, 수득하고자 하는 단편이 최종적으로 pBS-rCDV+속에 삽입되어 pBS-rCDV-P/luc/M이 생성되어질 경우에 6의 규칙[참조 문헌: 23]이 참작된 단편이 수득되도록 설계되었다.

1D. 발현 벡터 pCDV-N, pCDV-P, pCDV-L

도 1C에 도시된 바와 같이, N(뉴클레오티드 108-1679), P(1801-3324) 또는 L(9029-15584) 암호화 서열을 pTM-1[참조 문헌: 29, 41]을 기본으로 하는 벡터속에 삽입하여, 발현 벡터 pCDV-N, pCDV-P, pCDV-L를 제조하였다. 이러한 벡터는 뇌심근염 바이러스 내부 리보좀 도입 부위(IRES)의 상류에 T7 RNA 중합효소 프로모터를 함유한다. IRES의 3'말단에 위치한 NcoI 부위는 클로닝에 사용되고, 또한 ATG 개시 코돈을 함유한다. 합성 폴리아데노신 잔기가 암호화 영역의 3'에 바로 위치하고, 그 뒤에 T7 RNA 중합효소 테미네이터가 위치한다. N, P 및 L 유전자 삽입체를 PCR 증폭으로 제조하였다. N 및 P 유전자를 감염된-세포 RNA로 부터 RT/PCR로 증폭하였다. L 유전자를 전체 길이의 CDV cDNA 클론으로 부터 PCR-증폭시켰다. PCR중에 도입된 오류를, 돌연변이된 서열을 독립적 PCR 증폭으로 부터 생성된 단편으로 대체하여 회복시키거나 올리고뉴클레오티드-지정된 돌연변이유발에 의해 회복시켰다. 실험실-적응된 에드몬스톤(Edmonston)주[참조 문헌: 55]로 부터의 MV N, P 및 L 유전자를, 감염된 세포 RNA로 부터 RT/PCR 증폭 후, T7 벡터내에 클로닝하였다.

1E. DNA 서열분석 및 서열 확인

발현 벡터내에 클로닝된 유전자의 서열, pCDV-CAT의 서열, 및 전체 길이의 게놈 클론의 서열을, 염료-터미네이터(dye-terminator)/Taq DNA 중합효소 키트(ABI)을 사용하여 사이클-서열분석[참조 문헌: 16, 24]으로 결정하였다. 서열분석 반응물을 마이크로스핀 G50 칼럼(Amersham-Pharmacia Biotech)상에서 정제하고, ABI 377 자동 서열분석기(ABI)로 분석하였다. 서열 자료를 MacVector(Oxford Molecular)를 이용한 컴퓨터 분석으로 분석하였다.

CDV 온데르스테포르트 주의 게놈 서열을, 증폭된 RT/PCR 생성물로 부터 직접 컨센수스 서열을 생성시켜 확인하였다[참조 문헌: 36]. 요약하면, 감염된 세포로 부터 RNA를, Trizol 시약(Life Technologies)를 사용하여 구아니디늄-페놀-클로로포름 추출 과정[참조 문헌: 9]으로 추출하였다. 정제된 RNA를, 유전자-특이적 프라이머 및 Superscript II 역전사효소(Life Technologies)를 사용하여 역전사시켰다. 이어서, 유전자-특이적 프라이머 및 Taq DNA 중합효소(ABI)를 사용하여 게놈 단편을 증폭시킨 후, 이를 겔-정제하였다. 정제된 PCR 단편을 상기한 바와 같이 사이클-서열분석하고 분석하였다.

구출된 CDV의 확인

재조합 CDV(rCDV) 분리물의 게놈중의 서열 태그를, DNA 서열분석으로 분석하거나 제한 효소 부위 마커의 존재에 대해 분석하였다. 14개의 뉴클레오티드 위치를, 실험실에서 사용된 rCDV와 CDV 주를 구별하는데 사용하였다. 감염된-세포 RNA를 상기한 바와 같은 구아니디늄-페놀-클로로포름 추출 방법에 의해 분리하였다.적당한 서열 태그를 함유하는 게놈 영역을 타이탄(Titan) 1-튜브 PCR 키트(Roche Molecular Biology)를 사용하여 RT/PCR로 증폭하였다. 플라스미드 DNA의 오염이 존재하는지를 시험하는 네가티브 조절(-RT)을, 1-튜브 시험 시스템에서 RT 단계가 완료된 후, RNA를 첨가하여 수행하였다. PCR 단편을 상기한 바와 같이 서열분석하거나, 증폭된 단편을 적당한 제한 효소로 분해하였다(도 4B).

루시페라제 유전자를 함유하는 rCDV 게놈(rCDV-P/luc/M)을 서열분석으로 분석하여, 루시페라제 유전자가 정확하게 삽입되었는지를 확인한다. 또한, rCDV-P/luc/M 분리물로 감염된 세포를 루시페라제 발현에 대해 분석하였다. 감염된 세포 추출물을 레포터 용해 완충제(Promega: Madison, Wisc.)로 제조하고, 시약(공급원: Pharmingen) 및 분석적 발광 실험실(Analytical Luminescence Laboratories) 조도계(Pharmingen, San Diego, CA)를 사용하여 루시페라제 활성을 분석하였다.

실시예 2

CAT 분석 및 바이러스 구출에 의한 일시적 발현 분석을 위한 일반적 방법

미니레플리콘 형질감염을 여러 방법에 의해 수행하였다. CDV 미니레플리콘이 RNA로서 형질감염되는 실험의 경우, 293 세포를 리포펙탁(Lipofectace)(Life Technologies)으로 형질감염시켰다. 미니레플리콘 RNA를, pCDV-CAT DNA(도 1B)를 전사 주형으로서 사용하여 T7 RNA 중합효소[참조 문헌: 2]로 시험관내에서 제조하였다. RNA를, Megascript 키트(Ambion)의 시약 및 프로토콜을 사용하여 합성하고 정제하였다. CDV 감염이 보완성을 제공하는 미니레플리콘 실험(도 2A)에서, RNA형질감염 혼합물의 성분을 2개의 튜브에서 제조하였다. 하나의 튜브는 정제된 미니레플리콘 RNA 20㎍ 및 무혈청 OptiMEM(Life Technologies) 100㎕를 함유하였다. 다른 튜브는 무혈청 OptiMEM(Life Technologies) 100㎕와 리포펙탁(Life Technologies) 9 내지 12㎕로 제조하였다. 이어서, 두 개의 튜브의 함유물을 혼합하고 30 내지 40분 동안 실온에서 항온처리하였다. 형질감염 전에, 배양 배지를 293 세포 단층(60mm 디쉬중의 약 80% 컨플루언스 상태)으로 부터 제거하고, 세포를 무혈청 OptiMEM으로 1회 세척하였다. 이어서, RNA 형질감염 혼합물을, 세포당 약 2 플라크-형성 단위(pfu)의 감염다중도(moi)로 단층을 감염시키기에 충분한 CDV(온데르스테프로트)를 함유하는 무혈청 OptiMEM 0.8ml와 혼합하였다. 이어서, 이러한 1ml 형질감염 혼합물을 세포 단층에 가하고, 5시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 5시간의 항온처리 후, 20% FBS가 보충된 DMEM 1ml를 세포에 가하고, 밤새 계속하여 항온처리하였다. 형질감염 후 약 20시간 째에, 세포 단층의 70% 이상이 세포 융합을 나타내는 경우, 세포 추출물을 제조하였다. CAT 분석을 기본적으로 상기한 바와 같이 수행하였다[참조 문헌: 35]. 일부 실험(도 3)에서, C¹⁴-표지된 클로르암페니콜 기질을 형광성 기질로 치환하고[참조 문헌: 20, 62], 당해 분석을 기질 제조자의 프로토콜에 따라 변형시켰다[FAST CAT Yellow 또는 Fast CAT Green; Molecular Probes]. 형광성 CAT 분석의 생성물을 FlourImager(Molecular Dynamics)으로 분석하고, ImageQuant 소프트웨어(Molecular Dynamics)를 사용하여 정량하였다.

또한, RNA 미니게놈을 N, P 및 L 발현 플라스미드와 공동형질감염시켰다. 형질감염을 상기한 바와 실질적으로 동일하게 수행하였으나, RNA를 적당한 플라스미드 DNA(1㎍ pCDV-N 및 pCDV-P, 200ng pCDV-L), 100㎕의 무혈청 OptiMEM, 및 20㎕ 의 리포펙탁(Life Technologies)과 배합하였다. 형질감염 1시간 전에, 293 세포 단층을 세포당 5pfu의 moi로 MVA/T7로 감염시켜, T7 RNA 중합효소를 제공하여 발현 플라스미드를 전사시켰다.

상기한 바와 같은 형질감염 프로토콜을 DNA 미니레플리콘 형질감염을 위해 변형시키고, 문헌[Whitehead et al. (59)]에 기술된 바와 유사한 프로토콜에 따랐다. 이들 실험에서, 본 발명자들은 293 세포를 HEp2 또는 A549 세포로 교체하였는데, 그 이유는 이들이 MVA/T7 감염의 효과에 대해 보다 뚜렷하게 내성을 갖는 것을 발견하였기 때문이다. 형질감염에 사용된 세포는 통상적으로 약 70 내지 90% 컨플루언스 상태이였다. 형질감염 혼합물을, 무혈청 OptiMEM 200㎕중에 미니레플리콘 DNA(10ng pCDV-CAT) 및 발현 플라스미드(400ng pCDV-N, 300ng pCDV-P, 50 내지 100ng pCDV-L)을 배합한 후, 15㎕의 리포펙탁(Life Technologies)을 가하여 제조하였다. 이러한 혼합물을 20 내지 30분간 실온에서 항온처리하였다. 6개-웰 플레이트의 각 웰이 세포당 약 2 내지 5의 pfu를 나타내도록 감염시키기에 충분한 MVA/T7를 함유하는 무혈청 OptiMEM 0.8ml를 제공하기에 충분한 양으로 별도의 MVA/T7 혼합물을 제조하였다. 형질감염을 개시하기 전에, 배양 배지를 단층으로 부터 제거하고, 형질감염 혼합물을 800㎕의 MVA/T7 혼합물에 가하고, 배합된 1ml 혼합물을 세포에 가하였다. 밤새 항온처리한 후, 형질감염 배지를 10% FBS가 보충된 DMEM으로 교체하고, 세포를 추가로 하루 동안 항온처리하였다. 형질감염을 개시한지 48시간 후, 세포를 수거하고 CAT 활성을 분석하기 위해 상기한 바와 같이 추출물을 제조하였다. 기호 설명표에 나타난 바와 같이, 일부 미니레플리콘 실험(도 3B)을, 바이러스 구출을 위한 아래에 기술된 바와 실질적으로 같은 칼슘-포스페이트 형질감염 과정을 사용하여 수행하였다.

바이러스 구출을 위한 세포의 형질감염을 칼슘-포스페이트 방법을 사용하여 1차적으로 수행하였다. 또한 본 발명자들은 상기된 리포펙탁 프로토콜을 사용하였지만, 열 쇽크 단계[참조 문헌: 35]가 합해진 칼슘-포스페이트 방법이 보다 효과적이라는 것을 알았다. 6개-웰 플레이트내의 A549 세포 또는 HEp2 단층은 형질감염 전에는 75 내지 90% 컨플루언스 상태이었다. 형질감염 1 내지 2시간 전에, 당해 세포에 10% FBS를 함유하는 DMEM 4.5ml를 공급하고, 3% CO₂로 설정된 항온처리기로 옮겼다. 통상적으로, 이러한 항온처리기를 37℃ 보다는 32℃로 설정하는데, 그 이유는 미니레플리콘 실험에 나타난 바에 따르면 이러한 보다 낮은 온도가 구출 수준을 보다 더 높일 가능성이 있기 때문이다(도 3A). 칼슘-포스페이트-DNA 침전물을, 먼저 전체 길이의 CDV 플라스미드(5㎍)를 pCDV-N 400ng, pCDV-P 300ng, 및 pCDV-L 100ng과 배합하고, 5ml 폴리프로필렌 튜브에서 물로 최종 용적을 225㎕로 조정하였다. 다음, 2.5M 염화칼슘 25㎕를 DNA 용액에 가하였다. 최종적으로, 2xBES-완충 염수(50mM BES[pH 6.95 내지 6.98], 1.5mM Na₂HPO₄, 280mM NaCl) 250㎕를 적가하는 동안 당해 혼합물을 부드럽게 와동시켰다. 실온에서 20 내지 30분 동안 침전물이형성되도록 할 수 있다. 이어서, 침전물을 배양 배지에 적가한 후, 1 내지 3의 MOI를 제공하기에 충분한 MVA/T7을 가하였다. 당해 플레이트를, 배지, 칼슘-포스페이트-DNA 침전물 및 MVA/T7이 균일하게 혼합되도록 부드럽게 흔든 후, 당해 세포를 3% CO₂로 설정된 항온처리기로 다시 넣는다. 형질감염을 개시한 후 3시간 동안, 6개 웰 플레이트를 지퍼-락(zip-lock) 플리스틱 백속에 넣어 밀봉하고, 43 내지 44℃로 설정된 수욕에 2시간 동안 침지시켰다. 열 쇽크 후, 당해 세포를 3% CO₂로 설정된 32℃의 항온처리기에 다시 넣는다. 다음 날, 형질 감염 배지를 제거하고, 당해 세포를 헤페스(hepes)-완충 염수 용액(10mM 헤페스[pH 7.9], 150mM NaCl, 1mM MgCl₂)로 세척하고, 10% FBS가 보충된 DMEM 2 내지 3ml를 공급하였다. 당해 세포를 32℃에서 추가로 24 내지 48시간 동안 항온처리하였다. 형질감염 개시 48 내지 72 시간 후, 당해 세포를 배지 속에 스크래핑하고, 베로 세포의 70 내지 80% 컨플루언스 상태의 단층 및 배지 10ml를 함유하는 10cm의 플레이트로 옮기어 공동배양을 시작하였다[참조 문헌: 35]. 공동배양을 개시한지 3 내지 5시간째에, 당해 배지를 10% FBS를 함유하는 10ml의 DMEM과 교체하였다. 4 내지 6일 후, 플라크가 분명하게 나타났다. 후에 분석하기 위하여 당해 세포를 배지 속에 스크래핑하고 -80℃에서 동결하는 방법으로 구출된 바이러스를 수거하였다.

실시예 3

CDV 미니레플리콘 발현

미니레플리콘 레포터 시스템을 이용한 일시적 발현 연구는 바이러스 구출 시스템을 개발하는데 있어 중요하다. 미니레플리콘 레포터로 부터의 일시적 발현을 분석하여 비교적 신속하게 형질감염 파리미터를 평가하여 최적 조건을 결정할 수 있고, 또한 이러한 분석은 N, P 및 L용 발현 벡터가 기능 단백질 합성을 유도하는 지를 판정하는데 유용한 수단이다.

3.1 바이러스에 의한 CDV 미니레플리콘 구출

3.1.1이 미니레플리콘 실험은 CDV-CAT 미니레플리콘이 바이러스 보완에 의해 구출될 수 있는 이의 능력에 의한 기능이 있는지를 시험한다. 시험관내에서 합성된 CDV-CAT 미니레플리콘 RNA(20㎍)를 293 세포의 60mm 디쉬에 형질감염시켰다. 또한, 형질감염이 개시된 경우, 당해 세포를 CDV로 약 2의 moi로 감염시켰다. 형질감염시키고 약 24 시간 후, 세포의 약 70%가 신시티아(syncytia) 속으로 도입되면, 세포 추출물을 수득하고 CAT 활성에 대해 분석하였다(도 2A). CAT 분석 결과를 보여주는 자가방사선상은 도 2A에 도시되어 있다. CAT 활성이 미니레플리콘 RNA로 형질감염된 CDV-감염된 세포에서 쉽게 검출되었으므로, 미니레플리콘이 기능성임이 입증되었다(도 2A, 레인 2). RNA로 형질감염시켰으나 CDV로 감염시키지 않은 대조군 세포는 검출될 수 있는 CAT 활성을 나타내지 않았으므로(도 2A, 레인 1), CAT 활성이 분명히 미니레플리콘의 복제 및 발현에 의한 것임이 증명되었다.

3.1.2보완 바이러스로 부터 발현된 트랜스-작용 단백질이 제공되는 경우CDV 미니레플리콘 RNA가 기능성이라는 것이 정립된 후, 본발명자들은 N, P, L 단백질 발현 벡터(도 1C)의 보완성 제공 능력을 시험하였다. 따라서, 미니레플리콘 RNA(20㎍)를 pCDV-N(1㎍), pCDV-P(1㎍) 및 pCDV-L(도 2B에 제시된 양)과 함께 공동형질감염시켰다. 형질감염 1 시간 전에, 본 실혐에서 사용된 293 세포를 5의 moi로 MVA-T7으로 감염시켜, 플라스미드 벡터로 부터 N, P 및 L 단백질을 발현하는데 필요한 T7 RNA 중합효소를 제공하였다. 형질감염된 세포로 부터의 추출물을 CAT 활성에 대해 분석하여, 발현 플라스미드가 보완성을 효율적으로 제공함을 입증하였다(도 2B). 미니레플리콘 복제 및 발현을 나타내는 CAT 활성이 pCDV-L 발현 플라스미드 50 내지 100ng을 사용하는 경우 검출될 수 있고(도 2B), 100ng에서 최대이었다. 100ng을 넘는 발현 플라스미드는 억제성이었다(도 2B, 레인 5). 기대한 바와 같이, 단지 미니레플리콘 RNA만을 수여받거나(도 2B, 레인 1), L 단백질 발현 벡터를 전혀 수여받지 않은(도 2B, 레인 2) 음성 대조군 형질감염물에서 CAT 활성이 거의 검출되지 않거나 전혀 검출되지 않았다.

3.13 CDV 미니레플리콘 DNA의 구출

RNA 보다 차라리 미니레플리콘 플라스미드 DNA를 N, P 및 I용 발현 벡터와 함께 세포에 형질감염시키기 때문에, 최종 미니레플리콘 실험에서 사용된 조건은 전체 길이의 바이러스를 구출하는데 사용된 조건과 매우 흡사하다. 따라서, 레플리콘 RNA의 합성은 T7 RNA 중합효소에 의한 세포내 전사에 의존적이다. 도 3A의 결과는 미니레플리콘 활성이 미니레플리콘 DNA의 형질감염 후 수득될 수 있음을 입증하였다. 또한, 미니레플리콘의 활성이 약간의 온도 감수성을 나타낼 수 있는 가능성을 시험하기 위하여, 본발명자들은 형질감염된 세포를 상이한 온도에서 항온처리하였다(도 3A). 6개-웰 플레이트중의 A549 세포를 형질감염시키고, 32℃ 또는 37℃에서 항온처리하였다. 플라스미드 미니레플리콘 pCDV-CAT(50ng)을, 리포좀 형질감염 시약을 사용하여 발현 플라스미드(pCDV-N 400ng, pCDV-P 300ng 또는 pCDV-L 50 내지 100ng)와 함께 A549 세포에 형질감염시켰다. 유사하게, 홍역 바이러스 미니레플리콘(pMV107-CAT 100ng)을 홍역 바이러스 단백질 발현 벡터(pMV-N 400ng, pMV-P 300ng 및 pMV-L 100ng)와 함께 공동형질감염시켰다. 형질감염시킴과 동시에, 세포를 약 2의 moi로 MVA/T7으로 감염시켰다. 형질감염시킨지 약 48시간 후 세포 추출물을 수득하고, CAT 활성을 분석하였다. 도면에 제시된 실험에서, CAT 분석은 형광성 클로르암페니콜 기질을 사용하여 수행하고, 반응 생성물을 플루어르이미저(flourimager)를 사용하여 정량하였다. 도 3A에서 상대적 CAT 활성은 레인 8에 주어진 값에 상대적인 것이다.

도 3에 제시된 결과는, CDV-CAT 미니레플리콘 활성(도 3A, 레인 2 및 3)이 pCDV-L DNA가 생략된 음성 대조군 형질감염(도 3A, 레인 1)에 비해 상당한 수준임을 입증하였다. pCDV-L 벡터의 부존재하에 관찰된 낮지만 검출가능한 백그라운드 시그날이 있으며, 이는 아마도 잠재적(cryptic) 백시니아 바이러스 프로모터 또는 CDV 리더내의 세포 RNA 중합효소 II 프로모터로 부터 발생한다. MV 리더와 트레일러가 존재하는 점을 제외하고는 동일한 미니레플리콘은, 훨씬 더 많은 양의 MV를 사용하는 경우(도 3A, 레인 5), 거의 검출될 수 없는 백그라운드를 생성시킨다[참조 문헌: 35, 41]. 또한, 이들 결과는, 37℃ 보다는 차라리 32℃에서의 항온처리가 일반적으로 2 내지 3배 더 높은 수준의 CDV-CAT 활성을 생성시킨다는 것이 입증되었다. 따라서, 32℃의 온도가 바이러스 구출에 사용되었다.

또한, 본발명자들이 A549 또는 HEp2 세포가 293 세포 보다도 MVA/T7에 의한 감염에 보다 잘 견딜 수 있다는 것을 관찰하였기 때문에, 이들 실험(도 3)을 A549 또는 HEp2(도 3의 A549; HEp2, 자료가 제시되지 않음)을 사용하여 수행하였다. 몇몇 이들 실험의 경우, 리포좀 형질감염 프로토콜(도 3A)을 칼슘-포스페이트 방법으로 대체하였다(도 3B). 추가 변수를 조사하여 후술하였다.

3.1.4 CDV 미니레플리콘에 대한 열 쇽크 적용

6개-웰 플레이트중의 A549 세포를, 방법편에 기술된 칼슘-포스페이트 방법을 사용하여, pCDV-CAT 미니레플리콘(10ng) 및 N(400ng), P(300ng) 및 L(50 내지 100ng)용 발현 벡터로 공동형질감염시켰다. 형질감염을 개시한지 3시간 후, 당해 세포를 2시간 동안 43℃ 상태에 두고나서, 다시 밤새 32℃ 상태에 둔다. 열쇽크가 CDV 미니레플리콘의 발현에 미치는 효과는 도 3B에 도시되었다. 열 쇽크 처리는 CDV-CAT 활성을 4 내지 16배 증가시켰는데, 이는 이러한 처리가 CDV의 구출에 유익할 가능성이 있다는 것을 나타낸다.

실시예 4

4.1 rCDV의 구출

미니레플리콘 활성의 최대 수준을 조장하는 상기한 형질감염 및 배양 조건을 CDV의 구출에 적용하였다. 즉, A549 또는 Hep2 세포를, 칼슘-포스페이트 방법(방법편 참조)을 사용하여, 전체 길이의 cDNA 플라스미드 및 pCDV-N, pCDV-P, 및 pCDV-L 발현 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염을 개시한지 3시간 후, 당해 세포를 2시간 동안 43 내지 44℃로 열 쇽크를 준 후, 32℃의 항온처리기에 다시 넣었다. 다음 날, 배지를 교체하고 형질감염된 세포를 추가로 하루 동안 항온처리하였다. 형질감염된 세포 배양물이 바이러스를 생산하고 소량의 임의의 rCDV를 증대시키는 지를 확인하기 위하여, 형질감염된 세포를 베로 세포의 새로운 단층과 공동배양하였다(방법편; ref.35). 32℃에서 공동배양한지 4 내지 6일 후, 합포체가 관찰되었다(도 4A 참조).

대부분의 실험에서, 본 발명의 구출 조건에 의해, 베로 세포와 공동배양한 후 검출가능한, 형질감염된 6개 웰 플레이트중 4 내지 6개의 rCDV-양성 웰이 관찰되었다. 또한, 본발명자들은, 칼슘-포스페이트 또는 리포좀 형질감염 시약을 사용하는 경우, 구출 효율의 제한된 비교를 수행하였다. 방법편에서 기술된 칼슘 포스페이트 방법에 의해, 리포좀 시약을 사용한 경우 보다도 약 2배 많은 CDV-형질감염이 이루어졌다(자료는 제시되지 않음).

4.2 구출된 바이러스의 특징

rCDV의 두개의 분리물(rCDV1 및 rCDV2) 또는 마틴 빌레스터(Martin Billester)로 부터 구입된 온데르스테프로트주(Ond)로 감염시킨 세포로 부터의 RNA를 사용하여 P 유전자로 부터 DNA 단편을 증폭시켰다. 재조합 바이러스주로 부터 RT/PCR-증폭된 단편은 BstBI에 대한 제한 효소 분해 부위 "태그"를 함유한다. 비-재조합(Ond) 바이러스주는 이러한 부위가 결핍되어 있다. 수회 실험으로 부터의 CDV 분리물의 특징을 분석하여 재조합 바이러스가 구출되었음을 확인하였다. 재조합 CDV는 cDNA 클로닝중에 도입되어 회복되지 않은 뉴클레오티드 변화(서열 "태그")를 함유해야 한다. 예를 들면, 아미노산 코돈 특이성에 있어서는 무발현성(silent)이지만 BstBI 제한 효소 분해 부위를 생성시키는, P 유전자내의 근접한 위치의 두 개의 염기 변화(뉴클레오티드 2295 및 2298)가 있다. 재조합 cDNA중의 BstBI 태그(이는 바이러스를 오염시키는 원인으로서 잠재적으로 작용할 것이다)는 실험실에서 사용된 두 개의 CDV주(본발명자들의 실험실-적응된 온데르스테포르트주 및 쥬리히 대학교의 마틴 빌레터에 의해 제공된 실험실-적응된 온데르스테포르트주)에서 부존재해야 한다. 예를 들면, P 유전자의 영역(위치 1978 내지 2804)을 감염된-세포 RNA로 부터 RT/PCR로 증폭시키고, 이어서 BstBI으로 분해시켰다. 당해 결과로 부터, 재조합 바이러스가 BstBI 태그를 함유하는 반면, 비-재조합 바이러스주는 그러하지 않다는 것이 분명히 밝혀졌다(도 4B 참조, 레인 2, 3, 6을 레인 8, 9, 10과 비교). 재조합 바이러스로 부터 유래된 PCR 생성물을 BstBI로 절단하여, 분해에 내성이 있는 DNA 보다도 더 빠르게 이동하는 이중체(doublet)를 생성시킨다(도 4B). 이들 결과를, PCR-증폭된 DNA 단편의 서열을 직접 분석하여 확인하였다. 11개의 추가적 서열 태그를 유사하게 분석하였고, 그 결과는 결정적으로 CDV의 재조합 바이러스주가 구출에 의해 생산됨을 보여주었다. 서열 태그의분석이 형질감염된 세포로 부터 유래된 게놈 cDNA를 오염시킴으로써 복잡해질 가능성이 두 개의 음성 대조군에서는 배제될 수 있다. pCDV-L 발현 벡터를 제외한 모든 플라스미드 DNA를 수여받은 음성 대조군 형질감염으로 부터 유래하는 세포로 부터 수득된 RNA는 검출가능한 양의 PCR 생성물을 생성시키지 않았다(도 4B, 레인 1 참조). 또한, 역전사 단계가 생략된 경우 PCR 생성물이 전혀 생성되지 않았다(도 4B, 레인 3, 5, 7 참조).

실시예 5

상기 구출 방법을 사용하여 구출된 CDV로 부터 이종성 유전자의 발현

a) 루시페라제 유전자의 발현

잠재적 벡터로서 CDV를 추가로 평가하기 위하여, CDV 게놈 cDNA를 외래 유전자를 수용하도록 변형시켰다. 먼저, 9개의 뉴클레오티드 치환을 위치 3330과 3370사이의 영역에 도입하였다(도 5A, 5B). 이로써, P와 M 유전자사이의 유전자간 영역(P/M 유전자간 영역)내에 3개의 제한 효소 부위(AatII, FseI 및 MluI)가 도입되었다. 이들 부위는 게놈 cDNA 클론 pBS-rCDV+에서는 특유한 것이다(도 5B). 이들 염기 치환을 함유하는 바이러스(rCDV+)가 구출됨으로써, 이들 변형이 바이러스의 생존력에 현저한 영향을 주지 못했다는 것이 입증되었다(자료는 제시되지 않음). 이어서, FseI 및 MluI 부위를 루시페라제 유전자를 삽입하는데 사용하였다. 도 5B는, 본래의 rCDV 플리스미드 벡터(pBS-rCDV)에 가해져서 플라스미드 pBS-rCDV+를 생성시키는 뉴클레오티드 치환을 보여준다. 루시페라제 유전자를 변형시키고 플라스미드 prCDV-mcs에 삽입시켰다(도 5B). 먼저, 플라스미드 pGL2-대조군(Promega of Madison, WS)을 주형으로서 사용하여 암호화 서열을 증폭시키는 PCR을 수행하여, 클로닝을 위한 루시페라제 유전자를 제조하였다. 당해 PCR 프라이머(아래의 플라스미드 목록중 프라이머 1 및 2 참조)는 말단부에 제한 효소 절단 부위를 함유하여, prCDV-mcs내의 FseI과 MluI 부위사이에 증폭된 레포터 유전자가 삽입될 수 있다(도 5B). 또한, 5' PCR 프라이머(프라이머 1)는, CDV P/M 유전자간 전사 조절 영역의 합성 복사체에 상당하는 추가 서열을 함유한다. 이들 프라이머를 사용한 루시페라제 암호화 영역의 PCR 증폭을 통해, P/M 유전자간 전사 조절 서열을 함유하고 5'말단에 Fsel 부위가 융합되고 3'말단에 MluI 부위가 융합된 루시페라제 유전자가 생성되었다. 증폭된 서열을 pBS-rCDV-msc내에 클로닝하고, 이어서, DNA 서열 분석을 수행하여, 루시페라제 유전자가 정확하게 클로닝되어 pBS-rCDV-P/Luc/M이 생성되었는지를 확인하였다(도 5C).

구출 실험에서 루시페라제 유전자를 함유한 cDNA를 사용한 후, 바이러스 플라크가 검출되었다(도 4A, rCDV-P/Luc/M). CDV 서열과 루시페라제 유전자 사이의 접합부에 걸쳐있는 RT/PCR-증폭된 단편의 서열을 분석하여, 회수된 바이러스(rCDV-P/Luc/M)의 분리물의 특성을 결정하였으며, 이로써 당해 유전자가 재조합 바이러스내에 기대한 바 대로 삽입되었음이 밝혀졌다(자료는 제시되지 않음).

rCDV-P/Luc/M 바이러스의 5개의 상이한 분리물(1번 내지 5번)에 의해 감염된 세포로 부터 수득된 추출물을 사용하여 루시페라제 분석을 수행하였다. 베로 세포를 함유하는 6개-웰 플레이트의 각 웰에 상이한 rCDV주를 감염시키고, 단층의 75%이상이 세포 융합을 나타내는 경우 감염 후 약 48시간 째에 세포 추출물을 수득하였다. 추출물을 10⁴배 희석시키고 50㎕ 를 분석하여 아래이 루시페라제 표에 제시된 결과를 수득하였다. 음성 대조군 샘플은 희석하지 않고 분석하였다. 이들은 rCDV 및 rCDVmcs 바이러스를 사용하여 수행한 모의(mock) 감염(들)을 포함한다. rCDV-P/Luc/M 바이러스가 구출된 경우, L 발현 플라스미드가 결여된(pCDV-L 부존재) 음성 대조군 형질감염을 병행하여 수행하였다. 이러한 병행된 모의 구출로 부터의 세포 용해물을 사용하여, 단지 백그라운드 수준의 루시페라제 활성을 나타내는 모의 감염을 수행하였다. 아래의 루시페라제 표에 제시된 바와 같이, 비교적 높은 수준의 루시페라제 활성이, 독립적 형질감염으로 부터 회수된 rCDV-P/Luc/M의 상이한 분리물로 감염된 세포에서 관찰되었다(표 참조, 1번 내지 5번). 음성 대조군으로 부터는, 매우 낮은 백그라운드 수준의 루시페라제가 수득되었다(rCDV, rCDV+, L 플라스미드의 부존재).

루시페라제 표

샘플	감염	루시페라제 활성(상대적 광 단위)
1	모의	0
2	pCDV-L 비함유	85
3	RCDV-P/Luc/M-1	160,909
4	RCDV-P/Luc/M-2	183,096
5	RCDV-P/Luc/M-3	170,532
6	RCDV-P/Luc/M-4	132,221
7	RCDV-P/Luc/M-5	287,520
8	RCDV-mcs	0
9	RCDV	0

b) 개 파르보바이러스(CPV) VP2 유전자의 발현

CPV VP2 유전자를 함유하는 CDV 게놈 플라스미드(도 5D 및 후술되는 플로우 차트 참조)를 제조하였다. VP2 유전자를 클로닝하는데 사용된 CPV 게놈 DNA를, 프로테인아제 K 분해 및 유기물 추출 공정에 의해 CPV 백신 주, FD99(이는 개 백신 DURAMUNE^RMAX(제조원: Fort Dodge Laboratories, Ft. Dodge, Iowa)로 부터 분리된 CPV 주이다)로 부터 수득하였다. VP2 암호화 서열을, CDV P/M 유전자간 전사 조절 서열(프라이머 3)에 상당하는 서열외에, VP2 암호화 서열의 5'말단에 상동성인 서열을 함유하는 5' 프라이머(프라이머 4)를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 5' 및 3' 프라이머(프라이머 3 및 4) 둘 모두 상기한 바와 같이 플라스미드 prCDV-mcs속에 증폭된 VP2 암호화 서열을 삽입하는데 사용되는 말단부 제한 부위를 함유하였다. 증폭된 VP2 DNA를 클로닝하기 전에, DNA 부분을 DNA 서열 분석에 직접 사용하였다. 이는 후속적인 클로닝 단계중에 도입된 어떠한 잠재적 뉴클레오티드 변화도 존재하지 않는 VP2 유전자에 관한 DNA 서열 자료를 제공하였다. 다음, VP2 PCR 생성물의 나머지를 당해 유전자를 표준 클로닝 벡터(pBSK(+))내에 클로닝하는데 사용하였다. 이어서, 클로닝된 VP2 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 부착된 CDV P/M 유전자간 전사 조절 서열을, 염료-터미네이터 사이클 서열분석(캘리포니아주 포스터 시티에 소재하는 Applied Biosystems로 부터 제공된 사이클 서열분석 시약) 및 자동화 서열분석기(Applied Biosystems 377, Foster City, CA)를 사용한 DNA 서열분석으로 결정한 후(뉴클레오티드 서열, 서열번호 39의 경우 도 9를 참조하고, 아미노산 서열, 서열번호 40의 경우 도 10을 참조한다), 이를 P와 M 유전자사이의 CDV 게놈 DNA 클론(prCDV-mcs)내로 이전시켜 플라스미드 pBS-rCDV-VP2를 제조하였다(도 8E). 수개의 바이러스 분리물을 플라스미드 pBS-rCDV-VP2를 사용한 독립적인 형질감염으로 부터 구출하였다. 프라이머 7 및 8(하기 참조)을 사용한 역전사 및 PCR 증폭(RT/PCR)에 의한 바이러스 게놈 RNA의 분석을 통해, 이들 바이러스주가 VP2 유전자를 함유함이 밝혀졌다.

rCDV-VP2 바이러스가 VP2 단백질을 발현하는 것을 확인하기 위하여, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 폴리클로날 항체를 사용할 수 있다. VP2 발현은, VP2에 대해 반응성을 보이는 웨스턴 블롯팅[참조 문헌 2]에 의해 결정한다. 요약하면, CPV로 감염시킨 양성 대조군으로서의 개 신장 세포를 라엠리(Laemmli) 완충제(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)중에서 비등시켜 용해시켰다. 조악한 세포 추출물중의 단백질을 12% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동시킨 다음, 전기영동에 의해 니트로셀룰로즈 막에 이전시켰다. 당해 막을 차단 완충제(포스페이트-완충 염수 및 5% 분유(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 처리한 다음, 항-CPV 항체를 함유하는 개 혈청과 반응시키고, 차단 완충제로 희석시켰다. 항원-항체 결합을, 퍼옥시다제-표지된 항-개 2차 항체(Sigma, St. Louis, MO) 및 화학발광 기질(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 검출하였다. 웨스턴 블롯 분석을 통해, 개 항혈청이 CPV로 감염된 세포로 부터의 65kD 단백질과 특이적으로 반응함이 밝혀졌으며, 이러한 65kD 폴리펩티드의 상대적 이동성은 VP2의 예상 크기와 일치하였다. 이러한 방법을 이용하여, 이러한 동일한 폴리펩티드 종이 rCDV-VP주로 감염된 세포에 존재하는지를 확인할 수 있다.

c) B형 간염 바이러스 항원 유전자 HBsAg의 발현

B형 간염 바이러스(HBV)로 부터의 표면 항원 유전자를 함유하는 rCDV의 분리물을 플라스미드 prCDV-HBsAg를 사용하여 구출하였다(도 8E). HBsAg 암호화 서열을, 상기 실시예 (a) 및 (b)에서와 같이 prCDV-mcs의 FseI과 MluI 부위사이에 삽입하여 플라스미드 p-BS-rCDV-HBsAg를 제조하였다. HBsAg 유전자를 클로닝된 HBV 게놈[바이러스주 ayw; Genbank 수탁번호 V01460; 참조문헌 75]으로 부터 프라이머 5 및 6(아래 참조)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다.

수개의 독립적으로 구출된, HbsAg 유전자를 함유하는 재조합 CDV 주를 플라스미드 pBS-rCDV-HBsAg을 사용하여 분리하였다. rCDV-HBsAg 분리물(rCDV-HBsAg-1, -2, 및 -3)으로 부터의 바이러스 게놈 RNA를 유전자-특이적 프라이머(프라이머 7 및 8)을 사용하여 RT-PCR로 분석하여, 재조합 분리물이 HBsAg 유전자를 함유하는 지를 확인하였다. 재조합 바이러스가 HBsAg 유전자를 함유하는 지를 확인한 후, 웨스턴 블롯 분석을 수행하여, HBsAg 유전자가 발현되었는지를 확인하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 웨스턴 블롯 분석은 24 및 27kD를 보여주었다. HbsAg주의 27kD 형은 당해 단백질의 글리코실화 형이다[참조 문헌: 76]. HBV 유전자가 결여된 재조합 CDV로 감염시킨 세포 추출물은 항체(Fitzgeraldd Industries International Inc., Concord, MA)와 반응하지 않았다. 대조군으로서, 블롯을 벗겨내고 항-CDV N 단백질 항체(VMRD, Inc, Pullman, WA)로 프로빙하여, 모든 추출물이 CDV로 감염된 세포로 부터 제조되었음을 확인하였다.

PCR 프라이머 목록

1. 루시페라제 유전자 5' 말단

5'-TACTGGCCGGCC ATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGCCTAAGTCCGCTGCCACCATGGAAGA CGCCAAAAACAT-3'(서열번호 31)

CDV 유전자-종결/유전자 개시 시그날에는 밑줄을 쳤으며 FseI 부위는 이탤릭체를 사용하였다. 코작(Kozak)[참조문헌 77] 전사 조절 컨센수스 서열(GCCACC)을 루시페라제 ATG 개시 코돈(굵은활자) 앞에 부가하였다.

2. 루시페라제 3' 말단

5'-TTTTACGCGTTTACAATTTGGACTTTCCGC-3' (서열번호 32)

MluI 부위는 이탤릭체를 사용하였다.

3. CPV VP2 5' 말단

TACTGGCCGGCC ATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGCCTAAGTCCGCTGCCACCATGAGTGATGGAGCAGTTCAAC (서열번호 33).

프라이머 1의 설명을 참조한다.

4. CPV VP2 3' 말단

TTTTACGCGTTTAATATAATTTTCTAGGTGC (서열번호 34)

MluI 부위는 이탤릭체를 사용하였다.

5. HBsAg 5' 말단

TACTGGCCGGCC ATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGCCTAAGTCCGCTGCCACCATGGAGAACATCACATCAGGAT (서열번호 35).

프라이머 1의 설명을 참조한다.

6. HBsAg 3' 말단

TTTTACGCGTTTATCAGCTGGCATAGTCAGGCACGTCATAAGGATAGCTAATGTATACCCAAAGACA (서열번호 36).

MluI 부위는 이탤릭체를 사용하였다.

7. FseI 부위의 5'

ATAACATGCTGGCTCTGCTC (서열번호 37)

재조합 CDV 주의 게놈에 삽입된 유전자의 PCR 분석에 사용된 5' 프라이머. 외래 유전자의 5' 말단에 플랭킹하는 CDV 서열에 특이적이다.

8. MluI 부위의 3'

GCTAGTCAGGAGAACCATGT (서열번호 38)

재조합 CDV 주의 게놈에 삽입된 유전자의 PCR 분석에 사용된 3' 프라이머. 외래 유전자의 3' 말단에 플랭킹하는 CDV 서열에 특이적이다.

CPV VP2 유전자를 함유하는 CDV 발현 벡터의 개발을 위한 플로우 차트

·백신 바이러스 제제로 부터의 CPV 게놈 DNA를 프로테인아제 K 분해 및 페놀-클로로포름 추출에 의해 정제한다.

↓

·VP2 암호화 서열을 PCR로 증폭한다.

(5' PCR 프라이머는 CDV P/M 유전자간 전사 조절 서열을 특정하는 부착된 서열을 함유한다. 5' 및 3' 프라이머는 둘다 클로닝을 위한 말단 제한 부위를 함유한다)

↓

·증폭된 DNA를 주형으로서 사용하여 실제 CPV VP2 서열을 측정한다(도 9).

↓

·VP2 유전자를 플라스미드 벡터 pBSK(+)내로 클로닝한다.

↓

·클로닝된 VP2 유전자의 서열을 분석하여, 당해 서열이 먼저 서열분석에 의해 측정된 서열과 일치하는지를 결정한다.

↓

·클로닝된 VP2 유전자를 CDV 게놈 클론속으로 옮긴다.

(VP2 유전자를 CDV P와 M 유전자 사이에 삽입한다)

↓

·재조합 바이러스를 구출하고 게놈 구조를 분석한다.

재조합 바이러스 주에서 발견된 유전자의 서열을 분석한다.

↓

·개 폴리클로날 항혈청을 사용한 면역블롯팅에 의해 감염된 세포 추출물을 조사하여 VP2 발현에 대해 시험한다.

본원에 인용된 참조 문헌의 목록이 아래에 제공된다:

Claims (48)

1. (i) 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사 벡터, 및 (ii) 캡시드형성, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질(N, P 및 L)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 분리된 핵산 분자(들)를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 구출 조성물의 형질감염 또는 형질전환을, 상기 벡터들의 공동발현 및 재조합 바이러스의 생산이 허용되기에 충분한 조건하에서 배지내의 하나 이상의 숙주 세포에서 수행함을 포함하여, 재조합 개 홍역 바이러스를 생산하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 재조합 바이러스를 수거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 하나 이상의 게놈 또는 안티게놈 공급원의 키메라인 방법.
4. 제1항에 있어서, 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 서열번호 1, 2 또는 3의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 약독화된 바이러스 또는 당해 바이러스의 감염성 형을 암호화하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 당해 바이러스의 감염성 형을 암호화하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 약독화된 바이러스를 암호화하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 감염성의, 약독화된 바이러스를 암호화하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 숙주 세포가 진핵 세포인 방법.
10. 제1항에 있어서, 숙주 세포가 척추동물 세포인 방법.
11. 제1항에 있어서, 숙주 세포가 조류 세포인 방법.
12. 제1항에 있어서, 숙주 세포가 사람 세포로 부터 유래된 세포인 방법.
13. 제9항에 있어서, 숙주 세포가 사람 배아 세포로 부터 유래된 세포인 방법.
14. 제12항에 있어서, 숙주 세포가 사람 배아 신장 세포, 사람 폐 암종 및 사람 경부 암종 또는 동물 신장 세포로 부터 유래된 세포인 방법.
15. 제1항의 방법으로 부터 수득된 재조합 개 홍역 바이러스.
16. (i) 제1항의 방법으로 부터 수득된 재조합 개 홍역 바이러스 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
17. 제1항에 있어서, 전사 벡터가 T7 RNA 중합효소 유전자를 추가로 포함하는 방법.
18. 분리된, 재조합에 의해 생산된 개 홍역 바이러스 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
19. 제18항의 면역원성 조성물을 동물 또는 사람에게 투여함을 포함하여, 개 홍역 바이러스에 대한 보호 반응을 유도하기 위해 동물 또는 사람을 면역화시키는 방법.
20. 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
21. 제20항에 있어서, 서열번호 1의 안티게놈 메시지 센스의 포지티브 쇄로 개 홍역 바이러스 서열을 포함하는 핵산 분자.
22. 개 홍역 바이러스의 하나 이상의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
23. 제20항 내지 제22항중의 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 하나 이상의 이종성 뉴클레오티드 서열 또는 하나 이상의 이종성 유전자를 추가로 포함하는 핵산 분자.
24. 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드.
25. 개 홍역 바이러스의 하나 이상의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드.
26. 제24항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 하나 이상의 이종성 뉴클레오티드 서열 또는 하나 이상의 이종성 유전자를 추가로 포함하는 플라스미드.
27. 제25항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 하나 이상의 이종성 뉴클레오티드 서열 또는 하나 이상의 이종성 유전자를 추가로 포함하는 플라스미드.
28. 제24항 내지 제27항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 플라스미드로 형질전환된 숙주 세포.
29. 분리된, 재조합에 의해 생산된, 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드를 발현하는 개 홍역 바이러스 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
30. 제18항에 있어서, 개 홍역 바이러스가 항원을 암호화하는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드를 발현하는, 면역원성 조성물.
31. 제18항에 있어서, 개 홍역 바이러스이외에, 병원체에 대한 하나 이상의 항원을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
32. 제31항에 있어서, 하나 이상의 항원이 약독화된 RNA 바이러스인, 면역원성 조성물.
33. 제18항에 있어서, 개과 동물을 감염시키는 병원체에 대한 하나 이상의 항원을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
34. 제31항에 있어서, 하나 이상의 항원이 광견병 바이러스, 개 파르보바이러스, 개 파르보바이러스 2, 개 코로나 바이러스, 개 아데노바이러스 1형, 개 아데노바이러스 2형 및 개 파라인플루엔자 바이러스로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 바이러스에 대한 항원인, 면역원성 조성물.
35. 제18항에 있어서, 사람을 감염시키는 병원체에 대한 하나 이상의 항원을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
36. 제31항에 있어서, 개 바이러스 이외의 병원체의 하나 이상의 항원이 재조합에 의해 생산된 개 홍역 바이러스로 부터 발현되는, 면역원성 조성물.
37. 제31항에 있어서, 하나 이상의 항원이 하나 이상의 개 파르보바이러스에 대한 항원인, 면역원성 조성물.
38. 재조합 개 홍역 바이러스의 cDNA 클론의 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열.
39. 제26항에 있어서, 이종성 뉴클레오티드 서열이 개 홍역 바이러스 게놈 서열내에 단일 전사 단위로서 삽입된 플라스미드.
40. 제26항에 있어서, 이종성 뉴클레오티드 서열이 개 홍역 바이러스 게놈 서열내에 하나 이상의 모노시스트론성 전사 단위로서 삽입된 플라스미드.
41. 제26항에 있어서, 이종성 뉴클레오티드 서열이 개 홍역 바이러스 게놈 서열내에, 하나 이상의 리보좀 도입 부위를 함유할 수 있는 하나 이상의 폴리시스트론성 전사 단위로서 삽입된 플라스미드.
42. 제28항의 숙주 세포에 의해 생산되고, 분리된, 재조합에 의해 생산된 개 홍역 바이러스 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
43. 도 6(서열번호 2) 또는 도 7(서열번호 3)의 재조합 개 홍역 바이러스의 cDNA 클론의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열.
44. 제19항에 있어서, 동물이 개, 고양이, 소, 돼지 및 말로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
45. 제18항 및 제30항 내지 제37항중의 어느 한 항의 면역원성 조성물을 동물 또는 사람에게 투여함을 포함하여, 개 홍역 바이러스에 대한 보호 반응을 유도하기 위해 동물 또는 사람을 면역화시키는 방법.
46. 제1항에 있어서, 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체 폴리뉴클레오티드 서열이 개 홍역 바이러스의 야생형 뉴클레오티드의 하나 이상의 돌연변이를 함유함으로써, 이러한 돌연변이가 모노네가바이러스 목의 또 다른 비-절편화된 네가티브-센스의 일본쇄 RNA 바이러스의 암호화 영역 또는 비-암호화 영역중의 공지된 약독화 돌연변이에 상응하게 되는 방법.
47. 제1항에 있어서, 개 홍역 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체 폴리뉴클레오티드 서열이, 재조합에 의해 생산된 바이러스의 복제 결함을 일으키는 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 방법.
48. 제46항에 있어서, RNA 바이러스가 PIV, RSV, 멈프스 및 홍역 바이러스중에서 선택되는 방법.