KR20030001163A - Recombinant adenoviral vector expressing HPV-like particles and live vaccine for cervical cancer prepared therefrom - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: Provided are a recombinant Adenovirus vector producing human Papilomavirus-like particles(HPV VLP) and vaccine containing the HPV VLP as an active ingredient for the prevention and treatment of cervix cancer. CONSTITUTION: The recombinant vector, RAdBL2, includes a human Papilomavirus(HPV) gene and the Adenovirus genome deleted from an E1 gene, and produces human Papilomavirus-like particles(HPV VLP) in both growth-permissive cells ad growth-non-permissive cells, wherein the HPV gene is characteristically one of HPV-16 L1, HPV-16 L2, HPV-18 L1 or HPV-18 L. The recombinant vector, RAdBL2, is manufactured by cotransfection of a plasmid including an HPV gene and the Adenovirus genome deleted from an E1 gene, then by in vivo recombination. The vaccine for the prevention and treatment of cervix cancer contains, as an active ingredient, the HPV VLP produced by the recombinant vector, RAdBL2.

Description

인체 파필로마 바이러스 유사 입자를 생산하는 재조합 아데노바이러스 벡터 및 자궁경부암 생백신{Recombinant adenoviral vector expressing HPV-like particles and live vaccine for cervical cancer prepared therefrom}Recombinant adenoviral vector expressing HPV-like particles and live vaccine for cervical cancer prepared therefrom

본 발명은 인체 파필로마 바이러스 유사 입자(HPV-like particles; HPV VLP)를 생산하는 재조합 아데노바이러스 벡터 및 상기 재조합 아데노바이러스 벡터 또는 이로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 유효성분으로 하는 자궁경부암 치료 및예방용 백신에 관한 것이다.The present invention is a recombinant adenovirus vector for producing human papilloma virus-like particles (HPV-like particles) and cervical cancer treatment and prevention for the recombinant adenovirus vector or virus-like particles produced therefrom as an active ingredient It relates to a vaccine.

파필로마 바이러스(papilloma virus)는 유두종 바이러스라고도 불리는 "DNA-암 바이러스"로서(Pfisteret al.,Acv. Cancer Res. 48:113-147, 1987), 사람을 포함한 개, 고양이, 토끼, 소, 양 등의 포유동물의 상피세포(epithelial cell) 및 섬유상-상피세포(fibro-epithelial cell)에 침입하여 감염부위에 사마귀나 유두종을 일으키는 파포바비리대(Papovaviridae)과의 일종이다. 파필로마 바이러스 종류는 숙주에 따라 구분되며, 서로 다른 숙주 사이에는 감염시키지 못하는 것으로 알려져 있다.Papilloma virus, also known as papilloma virus, is a "DNA-cancer virus" (Pfister et al ., Acv. Cancer Res . 48: 113-147, 1987), including humans, including dogs, cats, rabbits, cattle, It is a kind of Papovaviridae that invades mammalian epithelial cells and fibro-epithelial cells and causes warts or papillomas on the infected site. Papilloma virus types are classified according to hosts, and are not known to infect different hosts.

인체 파필로마 바이러스(human papilloma virus: HPV)는 유전자 염기서열 상동성(DNA sequence homology)에 따라 77종으로 세분되며, 그 중에서 약 20 여종이 구강이나 생식기관의 피부점막에서 종양을 유발한다고 알려져 있다(Hausenet al.,Mol. Carcinogenesis8:147-150, 1988). 이 중 HPV-16, 18, 31 및 33형 등은 생식로(genital track)의 상피세포를 통해 감염한 후, 자궁경부암(cervical cancer)으로 악성 전환(malignant transformation)되는 것으로 보고되어 있다(Hausen,Biochemica. Biophysica. Acta. 1288: 55-78, 1996).Human papilloma virus (HPV) is divided into 77 types according to DNA sequence homology, and about 20 of them are It is known to cause tumors in the skin mucosa of the oral cavity and reproductive organs (Hausenet al.,Mol. Carcinogenesis8: 147-150, 1988). Among these, HPV-16, 18, 31, and 33 are reported to be malignant transformation into cervical cancer after infection through epithelial cells of the genital track (Hausen,Biochemica. Biophysica. Acta. 1288: 55-78, 1996).

HPV의 비리온(virion)은 외피(envelope)가 없는 캡시드로 구성되며, 직경 약 55nm인 정 20면체 모양으로, 두 개의 만기 유전자(late gene) 산물인 L1 및 L2 단백질로 이루어진다. 상기 주된 캡시드 단백질인 L1과 부수적인 캡시드 단백질인 L2는 바이러스의 비리온 형성에 관계하며 상호간에는 높은 서열 상동성을 가지지만, 서로 다른 HPV 유형간에는 차이가 많다(Hausen,Microbiology and Immunology184, 1994). 또한, 아미노산 서열상 두 단백질의 분자량은 55-60kDa이지만, L2 단백질의 경우 글리코실화(glycosylation)되어 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시할 때 약 75kDa 위치에서 감지된다.The virion of HPV consists of an envelope-free capsid, a icosahedron with a diameter of about 55 nm, and consists of two late gene products, L1 and L2 proteins. The main capsid protein L1 and the ancillary capsid protein L2 are involved in the virion formation of the virus and have high sequence homology with each other, but there are many differences between different HPV types (Hausen, Microbiology and Immunology 184, 1994). . In addition, the molecular weight of the two proteins in the amino acid sequence is 55-60kDa, but for the L2 protein is glycosylated (polyacrylamide gel electrophoresis is detected at about 75kDa position).

자궁경부암은 전세계적으로 매년 50만명 이상이 감염되는 주된 여성암으로, 특히 개발도상국에서 여성 사망의 주원인이 되고 있다(Pisaniet al.,Int. J. Cancer55:891-903, 1993). 따라서, 파필로마바이러스 감염에 의한 자궁경부암의 예방 및 치료용 백신 제조를 위해 L1 및 L2 단백질을 표적으로 한 연구가 활발히 진행되어 왔다(US 5888516; US 5993821; Sapp M.et al,Intervirology, 39: 49-53, 1996; Jarrett W.F.H.et al.,Virology184: 33-42, 1991). 이러한 연구의 하나로 주된 캡시드 단백질인 L1이 바이러스 유사입자로 생산되었으며, 다양한 시스템에서 면역반응을 유도하기 위해 이용되어 왔다(Kirnbaueret al.,J. Virology67:6929-6936, 1993; Linet al.,Virology187:612-619, 1992; Roseet al.,J. Virology67:1936-1944, 1993: Volperset al.,Virology200:504-512. 1994; Xiet al.,J. of General Virology 72:2981-2988, 1991).Cervical cancer is the leading cause of cancer among more than half a million people worldwide each year, especially in developing countries (Pisani).et al.,Int. J. Cancer55: 891-903, 1993). Therefore, researches targeting L1 and L2 proteins have been actively conducted to prepare vaccines for the prevention and treatment of cervical cancer caused by papillomavirus infection (US 5888516; US 5993821; Sapp M.et al,Intervirology39: 49-53, 1996; Jarrett W.F.H.et al.,Virology184: 33-42, 1991). One of these studies, L1, the main capsid protein, was produced as a virus mimic and has been used to induce immune responses in various systems (Kirnbauer).et al.,J. Virology67: 6929-6936, 1993; Linet al.,Virology187: 612-619, 1992; Roseet al.,J. Virology67: 1936-1944, 1993: Volperset al.,Virology200: 504-512. 1994; Xiet al.,J. of General Virology 72: 2981-2988, 1991).

자궁경부암과 관련된 백신 개발의 방법으로는 크게 예방 백신(prophylactic vaccine)과 치료 백신(therapeutic vaccine)의 두가지 형태로 초점이 맞추어져 있다. 예방 백신은 HPV L1/L2 단백질에 의해 중화 항체(neutralizing antibody)가 생성되게 함으로써 숙주가 HPV에 감염되는 것을 막고, 이미 감염되었더라도 더 이상 병이 진전되지 않도록 하는데 목적을 둔다. 한편, 치료 백신은 HPV E6/E7을 이용하여 특이적인 세포성 면역을 유도시킴으로써 이미 형성된 병반이나 악성 종양을 퇴화시키는 것을 목적으로 하고 있다.There are two main types of vaccine development related to cervical cancer: prophylactic and therapeutic vaccines. The prophylactic vaccine aims to prevent the host from infecting HPV by allowing the neutralizing antibody to be produced by the HPV L1 / L2 protein and to prevent further progression of the disease even if already infected. On the other hand, therapeutic vaccines aim to degenerate previously formed lesions or malignant tumors by inducing specific cellular immunity using HPV E6 / E7.

현재까지 개발된 HPV에 의한 자궁경부암 백신으로는 박테리아, 효모, 동물 세포 등에서 HPV 구성체 단백질 일부를 재조합 기술로서 생산한 재조합 단백질 또는 직접 합성한 펩타이드가 있으며, 재조합 생 바이러스 백신(live recombinant vaccinia virus)으로서 HPV L1 바이러스 유사 입자를 유선 세포 배양을 통해 생산하는 방법이 알려져 있다(Hagenseeet al.,J. Virol. 67:315-322, 1993). 또한, 약화된 살모넬라균(attenuatedSalmonella typhimurium)에서 합성된 HPV-16 VLP가 쥐의 점막이나 전신에서 항원 특이적인 항체의 생성을 유도한다는 보고도 있다(Deniset al.,Infection and Immunity65:3328-3336, 1997).HPV cervical cancer vaccines developed to date include recombinant proteins or recombinant peptides produced by recombinant technology of a part of HPV construct proteins in bacteria, yeast, animal cells, etc., and as live recombinant vaccinia virus. Methods for producing HPV L1 virus like particles via mammary cell culture are known (Hagensee et al ., J. Virol . 67: 315-322, 1993). In addition, HPV-16 VLP synthesized in attenuated Salmonella typhimurium induces the production of antigen-specific antibodies in mucosal or systemic mice (Denis et al ., Infection and Immunity 65: 3328-). 3336, 1997).

효과적인 백신 개발을 위해서는 적당한 동물 배양 시스템이 갖춰져야 하고 이를 이용하여 바이러스 입자를 대량으로 생산, 정제할 수 있어야 하지만, HPV는 최종적으로 분화가 끝난 상피세포(keratinocytes)에서만 바이러스 비리온을 형성하기 때문에 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 바이러스 입자를 대량으로 생산하기 어려우며, 생 바이러스 백신을 이용할 경우 과다한 바이러스 복제로 인한 문제점으로 인해 상업화까지 오랜 기간과 상당한 임상 실험을 요하는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 바이러스 복제능이 저해되거나 결핍된 바이러스 벡터 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나 아직 상용화된 경우는 없다(Mosset al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA93:11341-11348, 1996).In order to develop an effective vaccine, a suitable animal culture system must be in place and able to produce and purify viral particles in large quantities. However, HPV forms viral virions only in finally differentiated keratinocytes. It is difficult to produce large quantities of virus particles ( in vitro ) or in vivo , and the use of live virus vaccines requires long periods of time and considerable clinical trials due to problems due to excessive viral replication. In order to overcome this drawback, studies on the development of viral vectors with reduced or lacking viral replication ability have been actively conducted, but there are no commercialized ones (Moss et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11341-11348 , 1996).

더구나, 현재까지 개발된 백신의 대부분은 L1 단백질 단독 또는 L1과 L2 복합체 형태로 생성되는 바이러스 유사입자를 이용하여 제조한 것이고, 이에 비해 부수적인 캡시드 단백질인 L2를 이용한 백신에 대한 연구는 미흡한 실정이다.Moreover, most of the vaccines developed to date have been prepared using L1 protein alone or virus analogue particles produced in the form of L1 and L2 complexes. However, studies on vaccines using L2, an ancillary capsid protein, have been insufficient. .

L2 단백질의 형태는 비리온으로 하여금 숙주의 면역 체계에 보다 오랜 기간 동안 노출되는 것이 가능하게 한다. 즉, L2 단백질의 외부 C-말단(C-termini)은 바이러스 감염 초기에 숙주의 점막상피세포와 접촉하며, 내부의 N-말단(N-termini)은 감염 말기에 숙주의 면역체계에 노출된다(Lin Y.L.et al.,Virology, 187: 612-619, 1992; Volpers C.et al.,J. of General Virol., 76:2661-2667, 1995; Chritensen N.D.et al.,Virology181: 572-579, 1991; Roden R.B.et al.,J. Virol., 68: 7570-7574, 1994). 따라서, HPV L2 단백질은 HPV와 관련된 자궁경부암에 대한 치료 백신은 물론 예방 백신의 제조를 위한 좋은 표적으로 이용될 수 있다. 실제로 L2 단백질이 예방 백신과 치료 백신으로서 매우 효과적이라는 연구가 다수 보고되어 있으며(Jarrett W.F.H.et al.,Virology184:33-42, 1991; Chritensen N.D.et al.,Virology181: 572-579, 1991), 제니슨 등은 자궁경부암 환자의 혈청에서 HPV-16 L2 융합 단백질에 대한 항체가 검출되었다고 보고하고 있다(Jenison S.A.et al.,J. Virol. 65: 1208-1218, 1991).The form of L2 protein allows virions to be exposed to the host's immune system for longer periods of time. That is, the outer C-termini of the L2 protein contacts the host's mucosal epithelial cells early in the virus infection, and the inner N-termini is exposed to the host's immune system at the end of infection ( Lin YL et al ., Virology , 187: 612-619, 1992; Volpers C. et al ., J. of General Virol ., 76: 2661-2667, 1995; Chritensen ND et al ., Virology 181: 572-579 , 1991; Roden RB et al ., J. Virol. , 68: 7570-7574, 1994). Thus, HPV L2 protein can be used as a good target for the production of prophylactic vaccines as well as therapeutic vaccines for cervical cancer associated with HPV. Indeed, many studies have reported that L2 protein is very effective as a prophylactic and therapeutic vaccine (Jarrett WFH et al ., Virology 184: 33-42, 1991; Chritensen ND et al ., Virology 181: 572-579, 1991). , Janiceson et al . Reported that antibodies to HPV-16 L2 fusion proteins were detected in the sera of cervical cancer patients (Jenison SA et al ., J. Virol . 65: 1208-1218, 1991).

이처럼 대부분의 파필로마바이러스에 대한 생체 외 배양 시스템이 개발되어 있지 않기 때문에, 백신 개발을 위한 천연 항원 소스로서 바이러스 유사 입자를 생산하는 것이 중요하다. 이에 주된 캡시드 단백질인 L1 단독으로 또는 L1과 L2 공동으로 유사입자로 발현되는 다양한 시스템이 알려져 있다(Kirnbaueret al.,J. of Virology67:6929-6936, 1993; Linet al.,Virology187:612-619, 1992; Roseet al.,J. Virology67:1936-1944, 1993; Volperset al.,Virology200:504-512, 1993; Xiet al.,J. of General Virology72:2981-2988, 1991). 그러나, L2 단백질이 L1 단백질로 이루어진 바이러스 유사입자 생산을 증가시킨다는 사실은 보고되어 있으나(Kimbaueret al.,J. of Virology67:6929-6936, 1993; Hangenseeet al.,J. of Virol. 67:312-315, 1993), L2 단백질이 단독으로 집합을 이루어 바이러스 유사입자를 형성할 수 있다는 보고는 아직까지 없는 실정이다.Since no in vitro culture system for most papillomaviruses has been developed, it is important to produce virus like particles as a natural antigenic source for vaccine development. To this end, various systems are known which are expressed as analogous particles, either L1 alone or in combination with L1 and L2, the main capsid proteins (Kirnbauer et al ., J. of Virology 67: 6929-6936, 1993; Lin et al ., Virology 187: 612-619, 1992; Rose et al ., J. Virology 67: 1936-1944, 1993; Volpers et al ., Virology 200: 504-512, 1993; Xi et al ., J. of General Virology 72: 2981- 2988, 1991). However, it has been reported that L2 protein increases the production of virus analogs consisting of L1 protein (Kimbauer et al ., J. of Virology 67: 6929-6936, 1993; Hangensee et al ., J. of Viro l. 67: 312-315, 1993), there are no reports that L2 proteins can be collected alone to form virus mimics.

이에 본 발명자들은 HPV 감염에 의한 자궁경부암의 예방 및 치료를 효과적으로 수행할 수 있는 생백신을 개발하기 위하여 노력한 결과, HPV L2 유전자를 코딩하는 벡터와 복제 능력이 결여된 재조합 아데노바이러스 보조벡터로부터 생체내 재조합(in vivorecombination)을 통해 HPV 구성체 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하였고, 상기 재조합 아데노바이러스에 의해 생산된 바이러스 유사입자가 마우스에서 면역반응을 유발함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have made efforts to develop a live vaccine capable of effectively preventing and treating cervical cancer caused by HPV infection. As a result, the present inventors have recombined in vivo from a vector encoding the HPV L2 gene and a recombinant adenovirus covector lacking replication ability. The recombinant adenovirus vector expressing the HPV construct protein was prepared through in vivo recombination, and the present invention was completed by confirming that the virus analog particles produced by the recombinant adenovirus induced an immune response in mice.

본 발명은 동물 세포 내에서 파필로마 바이러스 단백질을 발현할 수 있는 재조합 아데노바이러스 벡터 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a recombinant adenovirus vector capable of expressing papilloma virus protein in an animal cell and a method for producing the same.

또한, 상기 벡터를 투여해 인체 점막 면역을 유도하여, 파필로마 바이러스 감염에 의한 자궁경부암을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 생백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, by administering the vector to induce human mucosal immunity, it is an object to provide a live vaccine that can effectively prevent and treat cervical cancer caused by papilloma virus infection.

도 1은 HPV-18 L2 단백질을 생산하는 재조합 아데노바이러스 벡터 RAdBL2를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.Figure 1 is a schematic diagram showing the process of producing a recombinant adenovirus vector RAdBL2 producing HPV-18 L2 protein.

도 2는 2세대 감염된 293 세포로부터 얻은 재조합 바이러스 상등액으로 293 세포를 감염시킨 후, 감염 2일 및 4일째의 세포추출물로부터 HPV-18 L2 유전자가 발현되었는지 확인하기 위해 PCR을 수행하고32P-α-dCTP로 표지된 L2 유전자로 혼성화 반응시킨 결과를 나타낸 사진이다.FIG. 2 shows infection of 293 cells with recombinant virus supernatant from 293 infected second generation cells, followed by PCR to confirm expression of HPV-18 L2 gene from cell extracts on days 2 and 4 of infection and 32 P-α. The photograph shows the result of hybridization with L2 gene labeled with -dCTP.

도 3은 증식 허용 세포인 293 세포에서 발현된 재조합 아데노바이러스(A), 증식 불허 세포인 베로 세포에서 발현된 유사 캡시드 집합체(B) 및 재조합 아데노바이러스로 감염된 베로 세포상등액을 염화세슘 밀도구배 원심분리한 후, 분해된 L2 단백질의 유사 캡시드 집합체(C)를 투과전자현미경(transmission electronic microscope; TEM)으로 관찰한 결과로서, 도면상의 막대는 100nm를 나타낸다.Figure 3 shows the centrifugation of cesium chloride density gradient of recombinant adenovirus (A) expressed in 293 cells that are proliferative cells, pseudocapsid aggregates expressed in Vero cells that are non-proliferative cells, and Vero cell supernatants infected with recombinant adenoviruses. Afterwards, the similar capsid aggregate (C) of the degraded L2 protein was observed with a transmission electronic microscope (TEM), where the bars in the figure represent 100 nm.

도 4는 양성 대조군인 pFG140(아데노바이러스 벡터), 4세대 감염 및 6세대감염 293 세포로부터 회수한 바이러스 상등액을 염화세슘으로 밀도구배 원심분리하여 두 개의 밴드가 분리됨을 보여주는 사진이다.4 is a photograph showing that two bands are separated by density gradient centrifugation of the virus supernatant recovered from the positive control group pFG140 (adenovirus vector), 4th generation infection and 6th generation infection 293 cells.

도 5는 4세대 및 6세대 감염 후에 회수한 RAdBL2 입자를 염화세슘 밀도구배 원심분리하여 나타난 두 개의 밴드에 대한 화학발광 ELISA 결과를 pFG140, GST-L2융합단백질과 비교하여 나타낸 그래프이다.5 is a graph showing chemiluminescence ELISA results of two bands of RAdBL2 particles recovered after 4th and 6th generation infection by centrifugation of cesium chloride density gradient compared with pFG140 and GST-L2 fusion proteins.

U: 낮은 밀도(1.29g/㎖)를 갖는 상부 밴드U: upper band with low density (1.29 g / ml)

B: 높은 밀도를 갖는 하부 밴드B: lower band with high density

도 6은 염화세슘으로 분리한 재조합 아데노바이러스 입자를 10일 간격으로 5 ×108pfu씩 2회 마우스에 비강주사하여 항혈청을 얻은 뒤, GST-L2 융합 단백질과 화학발광 효소면역측정을 수행하여 상기 재조합 아데노바이러스에 의해 유도되는 HPV-18 L2 단백질에 대한 면역원성(immunogenecity)을 조사한 결과를 나타낸 그래프이다.FIG. 6 shows antiserum obtained by injecting recombinant adenovirus particles separated by cesium chloride into mice at 5 × 10 8 pfu at 10-day intervals, followed by GST-L2 fusion protein and chemiluminescent enzyme immunoassay. It is a graph showing the results of investigating immunogenicity for HPV-18 L2 protein induced by recombinant adenovirus.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인체 파필로마 바이러스(human papilloma virus ; HPV) 구성체 유전자와 E1 유전자가 결실된 아데노바이러스 게놈을 포함하며, 증식 허용 세포(permissive cell) 및 증식 불허 세포(non-permissive cell) 모두에서 HPV 구성체 단백질로 이루어진 바이러스 유사입자를 생산할 수 있는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention includes adenovirus genome in which the human papilloma virus (HPV) construct gene and the E1 gene are deleted, and include a permissive cell and a non-proliferative cell. The present invention provides recombinant adenovirus vectors capable of producing viral analogs of HPV construct proteins in both permissive cells.

구체적으로, 본 발명은 HPV-18 L2 유전자와, E1 유전자가 결실된 아데노바이러스 게놈을 포함하며, 증식 허용 세포 및 증식 불허 세포 모두에서 HPV-18 L2 단백질로 이루어진 바이러스 유사입자를 생산할 수 있는 재조합 아데노바이러스 벡터 RAdBL2를 제공한다.Specifically, the present invention comprises a recombinant adenovirus HPV-18 L2 gene, and the adenovirus genome deleted E1 gene, capable of producing a virus analogous particle consisting of HPV-18 L2 protein in both proliferation-allowed and non-proliferative cells Provide the viral vector RAdBL2.

또한, 본 발명은 상기 재조합 아데노바이러스 벡터를 유효성분으로 하는 자궁경부암 예방 및 치료용 백신을 제공한다.The present invention also provides a vaccine for preventing and treating cervical cancer comprising the recombinant adenovirus vector as an active ingredient.

한편으로 본 발명은 상기 재조합 아데노바이러스 벡터로부터 생산되는 HPV 구성체 단백질로 이루어진 바이러스 유사입자 및 상기 바이러스 유사입자를 유효성분으로 하는 자궁경부암 예방 및 치료용 백신을 제공한다.On the other hand, the present invention provides a virus like particle consisting of the HPV construct protein produced from the recombinant adenovirus vector, and a vaccine for preventing and treating cervical cancer comprising the virus like particle as an active ingredient.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명에서 "바이러스 유사 입자(virus-like particle ; VLP)","유사 파필로마바이러스 입자(HPV VLP)" 또는 "재조합 아데노바이러스 입자"라 함은 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 RAdBL2 게놈이 HPV 구성체 단백질로 패키징되어DNA-캡시드 복합체(nucleocapasid)를 형성한 비리온을 의미한다.In the present invention, "virus-like particle (VLP)", "like papillomavirus particle (HPV VLP)" or "recombinant adenovirus particle" means that the recombinant adenovirus vector RAdBL2 genome of the present invention is an HPV construct. By virion, it is packaged into a protein to form a DNA-capsid complex (nucleocapasid).

또한, "유사 캡시드 집합체(capsid-like aggregate)" 또는 "유사 캡시드 입자"라 함은 HPV의 게놈 DNA와 L1 및 L2 캡시드 단백질로 구성되는 완전한 DNA-캡시드 복합체(nucleocapsid) 형태의 파필로마 바이러스가 아니라, 1 종류 또는 2 종류의 캡시드 단백질만이 자가집합(self-aggregation)을 통해 모여 있는 일종의 바이러스 껍질에 해당하는 것으로, DNA를 포함하지 않아 증식은 될 수 없지만 야생형 바이러스와 유사한 면역 반응을 유발할 수 있는 바이러스 구성체 단백질의 집합체를 의미한다.Also, "capsid-like aggregate" or "like capsid particle" is not a papilloma virus in the form of a complete DNA-capsid complex consisting of genomic DNA of HPV and L1 and L2 capsid proteins. Only one or two capsid proteins are sorts of viral shells that are collected through self-aggregation. They do not contain DNA and cannot proliferate, but can induce an immune response similar to wild-type viruses. Refers to a collection of viral construct proteins.

또한, 본 발명에서 "아데노바이러스-HPV 키메라 단백질(Ad-HPV chimeric protein)"은 HPV 구성체 단백질과 아데노바이러스 비리온을 형성하는 구성체 단백질이 모여 있는 집합체를 나타낸다.In addition, in the present invention, "Ad-HPV chimeric protein" refers to an aggregate of HPV construct proteins and construct proteins forming adenovirus virions.

한편, "구성체" 또는 "구성체 단백질"이란 HPV를 구성하는 캡시드 단백질을 의미하는 것으로 구체적으로 L1 또는 L2 단백질이 이에 해당한다.On the other hand, "constitution" or "constitution protein" refers to the capsid protein constituting the HPV, specifically, L1 or L2 protein corresponds to this.

본 발명의 HPV 구성체 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터는 HPV 구성체 유전자를 포함하는 플라스미드와 E1 유전자가 제거된 아데노바이러스 게놈을 포함하는 바이러스 벡터를 동물 세포에 공감염(cotransfection)시켜 생체내 재조합(in vivorecombination)을 통해 제조된다.The recombinant adenovirus vector expressing HPV constituent genes of the present invention to sympathetic salt (cotransfection) a viral vector for animal cell comprising the adenoviral genome is a plasmid and the E1 gene comprises an HPV construct gene is removed in vivo recombination (in manufactured via in vivo recombination).

상기에서, HPV 구성체 유전자는 HPV-16 L1, HPV-16 L2, HPV-18 L1 또는 HPV-18 L2 유전자 중에서 선택될 수 있으며, 특히, HPV-18 L2 유전자를 사용하는 것이바람직하다.In the above, the HPV construct gene may be selected from among the HPV-16 L1, HPV-16 L2, HPV-18 L1 or HPV-18 L2 genes, and in particular, it is preferable to use the HPV-18 L2 gene.

L1 또는 L2 단백질은 비리온을 코딩하는 유전자로, L1 단백질은 단독 또는 L2 단백질과 함께 유사 캡시드 입자를 만들 수 있는 것으로 알려져 있으며, 본 발명자들의 실험에 의하여 L2 단백질 단독으로도 유사 캡시드 입자를 만들 수 있는 것으로 확인되었다. 특히, L2 단백질은 숙주 세포의 면역 체계에 보다 오랜 기간 동안 노출될 수 있으므로, L2 단백질로 이루어진 바이러스 유사입자는 효과적인 자궁경부암 치료 및 예방을 위한 백신으로 이용될 수 있다.The L1 or L2 protein is a gene encoding virion, and the L1 protein is known to be able to make pseudocapsid particles alone or in combination with L2 protein. It was confirmed that there is. In particular, since the L2 protein may be exposed to the immune system of the host cell for a longer period of time, the virus like particle composed of the L2 protein may be used as a vaccine for effective cervical cancer treatment and prevention.

상기 HPV 구성체 유전자의 전사를 위한 프로모터로는 HCMV 조기 발현 유전자(human cytomegalovirus immediate-early ; HCMV-IE) 프로모터를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.As a promoter for transcription of the HPV construct gene, it is preferable to use an HCMV early expression gene (human cytomegalovirus immediate-early; HCMV-IE) promoter, but is not limited thereto.

한편, HPV 구성체 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터를 만들기 위해서는 E1 유전자가 결손된 아데노바이러스 게놈을 포함하는 벡터가 사용되는 것이 바람직하다. 즉, 인체 파필로마 바이러스는 생식로(genital track)의 상피세포를 통해 감염되므로, 파필로마 바이러스 감염을 예방하기 위해서는 점막 면역을 유도할 수 있는 바이러스에서 유래한 벡터를 사용하는 것이 바람직하며, 점막성 면역반응 유발에 효과가 있는 것으로 알려진 아데노바이러스 벡터가 이용되는 것이 바람직하다(Randrianarison-Jewtoukoff V.et al.,Biologicals, 23: 145-157, 1995 ; Matlashewski G.et al.,Int. J. Cancer, 71: 715-718, 1997). 아데노바이러스는 구강 및 호흡기를 통해 감염되므로, 아데노바이러스에 기초한 본 발명의 HPV 구성체 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터는 효과적으로 숙주의 점막성 면역 체계를 자극할 수 있다.On the other hand, in order to make a vector containing a gene encoding a HPV construct protein, it is preferable to use a vector containing an adenovirus genome in which the E1 gene is deleted. That is, since human papillomavirus is infected through epithelial cells of the genital track, it is preferable to use a vector derived from a virus capable of inducing mucosal immunity in order to prevent papillomavirus infection. It is preferred to use adenovirus vectors known to be effective in inducing immune responses (Randrianarison-Jewtoukoff V. et al ., Biologicals , 23: 145-157, 1995; Matlashewski G. et al ., Int. J. Cancer , 71: 715-718, 1997). Since adenoviruses are infected through the oral cavity and the respiratory tract, recombinant adenovirus vectors expressing the HPV construct proteins of the invention based on adenoviruses can effectively stimulate the mucosal immune system of the host.

아데노바이러스(adenovirus) 벡터는 고역가의 바이러스액으로 조제될 수 있고, 사람, 쥐를 포함하는 다수의 동물 세포 등과 같은 증식세포 뿐만 아니라, 정지기의 세포를 감염시킬 수 있는 장점이 있어 바이러스 벡터 제조에 많이 이용되고 있다. 또한, 아데노바이러스의 E1 유전자는 다른 모든 아데노바이러스 유전자의 발현개시에 필요한 것으로 알려져 있다. 따라서, E1 유전자가 결손된 아데노바이러스 벡터는 E1 유전자 산물을 제공하는 293 세포와 같은 특정 세포주에서만 증식이 가능하고, 표적 세포에 높은 효율로 감염되며, 표적세포 내에서는 E1 유전자 산물이 공급되지 않으므로 바이러스의 증식 없이 목적 유전자만 발현되는 장점을 가진다.Adenovirus vectors can be formulated with high titer virus fluids and can infect not only proliferating cells, such as many animal cells including humans and mice, but also stationary cells. It is used a lot. In addition, the E1 gene of adenovirus is known to be required to start expression of all other adenovirus genes. Thus, adenoviral vectors lacking the E1 gene can only proliferate in certain cell lines, such as 293 cells providing the E1 gene product, infect the target cells with high efficiency, and because the E1 gene product is not supplied within the target cells, It has the advantage that only the target gene is expressed without proliferation.

본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터는 증식 허용 세포(permissive cell)는 물론 증식 불허 세포(non-permissive cell)에서도 유사 바이러스 입자를 생산할 수 있다.The recombinant adenovirus vector of the present invention can produce similar virus particles in permissive cells as well as non-permissive cells.

본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 자체를 백신으로 사용하고자 하는 경우에는 증식 허용 세포에서 상기 바이러스를 대량 생산하여 이용할 수 있으며, 상기 아데노바이러스 벡터로부터 발현되는 바이러스 유사입자만을 백신 성분으로 이용하고자 할 경우에는 증식 불허 세포에 감염시켜 아데노바이러스의 증식을 억제함으로써 아데노바이러스 비리온의 생산은 감소시키면서 바이러스 유사입자만을 대량 생산하여 이를 백신의 제조에 이용할 수도 있다.When the recombinant adenovirus vector of the present invention is to be used as a vaccine, the virus can be produced by mass production in a proliferative cell, and when a virus analogous particle expressed from the adenovirus vector is used as a vaccine component, it is propagated. By inhibiting the proliferation of adenovirus by infecting unlicensed cells, it is possible to reduce the production of adenovirus virions while mass-producing only virus-like particles and use them for the preparation of vaccines.

본 발명에서는 HCMV-IE 프로모터에 의해 발현이 조절되는 HPV-18 L2 유전자와 E1 유전자가 결실됨으로써 생체내 복제 기능을 상실한 아데노바이러스 게놈의 재조합에 의해 제조되는 재조합 아데노바이러스 벡터 RAdBL2를 제공한다.The present invention provides a recombinant adenovirus vector RAdBL2 produced by recombination of the adenovirus genome that has lost the replication function in vivo by deleting the HPV-18 L2 gene and the E1 gene whose expression is controlled by the HCMV-IE promoter.

상기 RAdBL2는 증식 허용 세포(permissive cell) 및 증식 불허 세포(non-permissive cell) 모두에서 HPV-18 L2 단백질로 이루어진 바이러스 유사입자를 생산할 수 있다. 상기 RAdBL2는 HCMV-IE 프로모터에 기능적으로 연결된 HPV-18 L2 유전자를 포함하는 pCL2 플라스미드와 E1 유전자가 결실된 아데노바이러스 게놈을 포함하는 pBHG11 플라스미드를 동물 세포에 공감염시켜 생체내 재조합을 통해 제조될 수 있다. 본 발명자들은 상기 재조합 아데노바이러스 벡터 RAdBL2의 제조에 이용되는 pCL2 벡터를 2001년 5월 22일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(기탁번호 : KCCM 10278).The RAdBL2 can produce virus like particles consisting of HPV-18 L2 protein in both permissive cells and non-permissive cells. The RAdBL2 may be prepared by in vivo recombination by co-infection with an animal cell of a pCL2 plasmid comprising an HPV-18 L2 gene functionally linked to an HCMV-IE promoter and a pBHG11 plasmid comprising an adenovirus genome deleted from an E1 gene. have. The present inventors deposited the pCL2 vector used for the production of the recombinant adenovirus vector RAdBL2 to the Korea Microbiological Conservation Center on May 22, 2001 (Accession No .: KCCM 10278).

아울러 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 또는 상기 재조합 아데노바이러스 벡터로부터 생산되는 바이러스 유사입자를 유효성분으로 하는 자궁경부암 예방 및 치료용 백신도 본 발명에 의해 제공된다.In addition, the present invention also provides a vaccine for preventing and treating cervical cancer comprising the recombinant adenovirus vector of the present invention or a virus analogous particle produced from the recombinant adenovirus vector.

본 발명의 자궁경부암 예방 및 치료용 백신은 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터로 감염된 동물 세포에서 대량 생산되는 바이러스 유사입자, 또는 HPV 구성체 유전자를 포함하는 플라스미드와 E1 유전자가 결실된 아데노바이러스 벡터를 공감염시킨 세포 배양액으로부터 회수된 바이러스 유사입자를 유효성분으로 할 수 있으며, 보다 바람직하게는 HPV 구성체 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터 자체를 사용하는 것이 좋은데, 이는 바이러스 벡터 자체를 투여하면 지속적으로 바이러스 유사입자를 발현하므로 추가적인 접종을 통한 면역반응의 유도가 필요없기 때문이다.The vaccine for preventing and treating cervical cancer of the present invention co-transfects a plasmid containing a mass of virus-like particles, or HPV construct gene, and an adenovirus vector from which the E1 gene is deleted in animal cells infected with the recombinant adenovirus vector of the present invention. The virus analog particles recovered from the cell culture medium may be used as an active ingredient, and more preferably, the recombinant adenovirus vector itself expressing the HPV construct protein is preferably used. Because it does not need to induce an immune response through additional inoculation.

상기 재조합 아데노바이러스 벡터 또는 이로부터 생산된 바이러스 유사입자는 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 특히 경구 투여를 통해 점막성 면역반응을 일으키는 것이 바람직하다.The recombinant adenovirus vector or virus-like particles produced therefrom may be administered orally or parenterally during clinical administration, and particularly, it is preferable to cause a mucosal immune response through oral administration.

상기 재조합 아데노바이러스 벡터 또는 이로부터 생산된 바이러스 유사입자를 유효성분으로 하는 자궁경부암 예방 및 치료용 백신은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴(gelatin) 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 포함되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.A vaccine for preventing and treating cervical cancer comprising the recombinant adenovirus vector or a virus like particle produced therefrom as an active ingredient is prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants. Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, and such solid form forms at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose. (lactose), gelatin (gelatin), etc. are mixed and prepared. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc. In addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. have. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories. As the non-aqueous solvent and the suspension solvent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.

본 발명의 일 실시예에서는 HPV 구성체 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터 RAdBL2를 얻기 위해, pBR322 벡터에 클로닝된 HPV-18 L2 유전자를 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머로 PCR 증폭시켜 얻은 절편을 pCA3 플라스미드에 삽입시킨 pCL2 운반 벡터와, E1 유전자가 결손된 아데노바이러스 게놈을 포함하는 pBHG11 보조 벡터를 인산칼슘 침전법으로 293 세포에 공감염시킴으로써 생체내 재조합을 유도하였다(도 1 참조).In one embodiment of the present invention, in order to obtain a recombinant adenovirus vector RAdBL2 comprising the HPV construct gene, the fragment obtained by PCR amplification of the HPV-18 L2 gene cloned in the pBR322 vector with the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 pCA3 In vivo recombination was induced by co-infection of 293 cells with calcium phosphate precipitation of the pCL2 transport vector inserted into the plasmid and the pBHG11 auxiliary vector comprising the adenovirus genome lacking the E1 gene (see FIG. 1).

상기 감염된 293 세포로부터 재조합 아데노바이러스가 생성되는지는 바이러스 플라크의 생성 유무로 확인할 수 있으며, 재조합 아데노바이러스 벡터에 L2 유전자가 안정하게 존재하는지 확인하기 위하여 제 2세대(P2), 제 4세대(P4) 및 제 6세대(P6) 감염 세포에서 획득한 DNA를 상기 프라이머로 PCR한 후32Ｐ로 표지시킨 L2 유전자와 혼성화 반응시켰다. 그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, P2 내지 P6 세대에서 모두 L2 유전자를 확인할 수 있었으며, 특히 P4 세대에서 가장 많은 L2 유전자가 확인되었다.Whether recombinant adenovirus is produced from the infected 293 cells can be confirmed by the presence of virus plaques, and to confirm whether the L2 gene is stably present in the recombinant adenovirus vector, the second generation (P2) and the fourth generation (P4). And DNA obtained from 6th generation (P6) infected cells were PCR with the primers and hybridized with the L2 gene labeled with 32 P. As a result, as shown in Figure 2, it was possible to identify the L2 gene in all P2 to P6 generation, in particular the most L2 gene was confirmed in the P4 generation.

본 발명의 다른 실시예에서는 재조합 아데노바이러스 벡터에 의해 감염된 세포가 재조합 아데노바이러스 벡터를 생산하는지 확인하기 위하여, PEG 침전법으로 정제한 P3 세대의 현탁액을 투과전자현미경(transmission electron microscope: Hitachi, 일본)으로 관찰하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, P3 현탁액을 증식 허용 세포인 293 세포에 감염시켰을 때에는 재조합 아데노바이러스 입자인 정20면체의 입자와 Ad-HPV 키메라 입자 또는 HPV L2 유사 캡시드 입자로 보이는 불규칙한형태의 이종입자가 관찰되었다. 또한, P3 현탁액을 증식 불허 세포인 베로(vero) 세포에 감염시켰을 때에는 지름이 약 40∼50㎚이고, 규칙적인 형태를 가지고 있는 유사 캡시드 입자가 생성됨을 확인하였다. 이는 증식 불허 세포인 베로 세포에서는 아데노바이러스의 감염은 일어나지만 바이러스 증식은 허용되지 않기 때문이다. 이러한 결과는 L2 단백질이 증식 불허 세포에서도 유사 캡시드 입자를 형성할 수 있음을 보여준다.In another embodiment of the present invention, in order to confirm whether the cells infected with the recombinant adenovirus vector produce the recombinant adenovirus vector, the suspension of P3 generation purified by PEG precipitation method was transferred to a transmission electron microscope (Hitachi, Japan). Observed by. As shown in FIG. 3, when the P3 suspension was infected with 293 cells, which are proliferative cells, irregular heterogeneous particles, which were shown to be tetrahedral particles, which are recombinant adenovirus particles, and Ad-HPV chimeric particles or HPV L2 like capsid particles. Was observed. In addition, when the P3 suspension was infected with vero cells, which are non-proliferative cells, it was confirmed that pseudo capsid particles having a diameter of about 40 to 50 nm and having a regular form were produced. This is because infection with adenovirus occurs in Vero cells, which are non-proliferative cells, but virus propagation is not allowed. These results show that L2 protein can form pseudo capsid particles even in non-proliferative cells.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 P4 및 P6 현탁액으로부터 공지된 방법에 따라 재조합 아데노바이러스 입자를 분리하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, P4 및 P6 바이러스 현탁액을 염화세슘 밀도구배로 원심분리한 초원심분리 튜브에서 두 종류의 밴드가 형성되는 것을 확인할 수 있었다.In another embodiment of the present invention, recombinant adenovirus particles were isolated from P4 and P6 suspensions according to known methods. As shown in FIG. 4, it was confirmed that two kinds of bands were formed in the ultracentrifuge tube in which the P4 and P6 virus suspensions were centrifuged with a cesium chloride density gradient.

한편, 상기 분리된 2개의 밴드 중 어느 밴드가 HPV-18 L2 단백질로 이루어진 유사 캡시드 집합체 및 바이러스 유사 입자 또는 Ad-HPV 키메라 단백질에 해당하는지 확인하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에서는 글루타치온 S-트랜스퍼라제-HPV-18 L2 융합 단백질(GST-HPV-18 L2 fusion protein)을 제조하고 GST-HPV-18 L2 융합 단백질에 대한 항체를 당업계에 공지된 방법에 의하여 제조하였다.On the other hand, to determine which of the two bands of the separated bands are similar to the capsid aggregate and virus-like particles or Ad-HPV chimeric protein consisting of HPV-18 L2 protein, in one embodiment of the present invention glutathione S-transfer Gase-HPV-18 L2 fusion protein was prepared and antibodies against GST-HPV-18 L2 fusion protein were prepared by methods known in the art.

상기 GST-HPV-18 L2 융합 단백질에 대한 항체를 이용하여 GST-L2 융합 단백질과 P4 및 P6 현탁액상의 바이러스에 대한 화학발광 효소면역측정(chemiluminescence ELISA)을 수행한 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 염화세슘 밀도구배 원심분리에 의해 분리된 시료의 상부 밴드 입자는 박테리아에서 생산된 GST-HPV-18 L2 융합 단백질에 대한 항체와 매우 높은 면역반응성을 보임을확인할 수 있었다.Chemiluminescence ELISA of the virus on the GST-L2 fusion protein and the P4 and P6 suspensions was performed using the antibody against the GST-HPV-18 L2 fusion protein, as shown in FIG. 5. It was confirmed that the upper band particles of the sample separated by the cesium chloride density gradient centrifugation showed very high immunoreactivity with the antibody against the GST-HPV-18 L2 fusion protein produced by bacteria.

상기의 사실들은 저밀도(1.29g/㎖) 밴드의 바이러스 입자(상부 밴드)는 L2 단백질의 자가집합에 의해 형성된 바이러스 유사 입자 또는 유사 캡시드 집합체임을 나타내며(Hangensee M.E.et al.,J.Virol., 67: 312-315, 1993; Ghim S.J.et al.,J. Gen. Virol., 77: 183-188, 1996), 이에 반해 고밀도 밴드의 바이러스 입자(하부 밴드)는 항 HPV-18 L2 항체에 대하여 면역반응성이 약하고 감염 반복횟수가 늘어날수록 밀도가 감소하는 것으로 보아 L2 단백질과 아데노바이러스 비리온 구성체 단백질의 키메라 단백질(Ad-HPV 키메라 단백질)임을 추정할 수 있다.The above facts indicate that the low density (1.29 g / ml) band of virus particles (upper band) is a virus like particle or like capsid aggregate formed by self-assembly of L2 protein (Hangensee ME et al ., J. Virol ., 67). : 312-315, 1993; Ghim SJ et al ., J. Gen. Virol ., 77: 183-188, 1996), whereas the high density band of virus particles (lower band) was immunized against anti HPV-18 L2 antibody. The weak reactivity and density decrease with increasing number of infections, suggesting that it is a chimeric protein (Ad-HPV chimeric protein) of L2 protein and adenovirus virion construct protein.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 재조합 아데노바이러스가 점막성 면역 반응(mucosal immunity)을 유도할 수 있는지 알아보기 위하여 상기 염화세슘밀도구배로 정제한 바이러스 입자를 마우스에 비강 투여하여 항혈청(antiserum) 형성여부를 확인하였다. 상기 정제된 바이러스 입자가 투여된 마우스에서 항혈청을 분리한 후, 이를 이용하여 GST-L2 융합 단백질과 반응시키고 화학발광 효소면역측정을 하였다. 그 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 저밀도의 상부 밴드에서 추출한 RAdBL2를 투여한 마우스에서 얻은 혈청이 높은 면역 활성을 나타냈다. 이러한 결과는 재조합 L2 단백질의 바이러스 유사 입자 및 유사 캡시드 집합체가 점막성 면역반응을 유발할 수 있음을 보여준다.In another embodiment of the present invention to determine whether the recombinant adenovirus of the present invention can induce mucosal immunity (mucosal immunity) antiserum (antiiserum) by nasal administration of the virus particles purified by the cesium chloride density gradient to the mouse ) Formation was confirmed. Antiserum was isolated from mice to which the purified virus particles were administered, and then reacted with the GST-L2 fusion protein and subjected to chemiluminescent enzyme immunoassay. As a result, as shown in Fig. 6, the serum obtained from the RAdBL2 mice extracted from the low-density upper band showed high immune activity. These results show that virus like particles and like capsid aggregates of recombinant L2 proteins can elicit mucosal immune responses.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1><Example 1>

HPV 구성체 단백질을 발현하는 벡터의 제조Preparation of Vectors Expressing HPV Construct Proteins

HPV-18 게놈을 포함하는 pBR322 벡터(Coleet al.,J. Mol. Biol. 193:599-608, 1987)는 시게루 야슈모트 박사(Dr. Shigeru Yashumot, Kanagawa Cancer Center Research Institute, 일본)로부터 분양받아 사용하였으며, 이를 주형으로 하여 PCR을 통해 파필로마 바이러스 L2 유전자의 전사해독틀(open reading frame)을 증폭하였다.PBR322 vector containing the HPV-18 genome (Cole et al ., J. Mol. Biol . 193: 599-608, 1987) was sold from Dr. Shigeru Yashumot, Kanagawa Cancer Center Research Institute, Japan The open reading frame of the papilloma virus L2 gene was amplified by PCR as a template.

PCR 프라이머로는EcoRI 제한효소 절단부위를 포함하는 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 정방향 시발체,XhoI 제한효소 절단부위를 포함하는 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 역방향 시발체로 이용하였다. PCR 반응 조건은 95℃에서 5분간 전처리한 후, 95℃에서 1분(denaturation), 58℃에서 90초(annealing), 72℃에서 90초(polymerization)간 30 싸이클 반응시켰으며, 72℃에서 10분간 마지막 신장반응(extension)을 수행하였다. 상기 PCR 산물을 HCMV(human cytomegalovirus)의 조기발현 유전자 프로모터(immediate early promoter; HCMV-IE)를 포함하는 플라스미드 pCA3(Microbix Biosystems Inc., 캐나다)의EcoRI-XhoI 위치에 클로닝하여 운반 벡터인 pCL2를 제조하였다(도 1 참조). 상기 pCL2 벡터는 2001년 5월 22일자로 한국미생물보존센터에 기탁되었다(기탁번호 : KCCM 10278). 본 발명에서 사용된 모든 플라스미드는 대장균(E. ColiHB101)에서 대량 증식시켜 사용하였으며, 상기 L2 유전자의 클로닝 방법과 동일한 방법을 통해 서열번호 3, 4, 5, 6, 7및 8로 표시되는 프라이머를 사용하여 HPV-16 L1, L2 유전자 및 HPV-18 L1 유전자에 대한 클로닝도 실시하였다.As the PCR primer, the oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 including the Eco RI restriction enzyme cleavage site was used as the forward primer, and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 including the Xho I restriction enzyme cleavage site was used as the reverse primer. PCR reaction conditions were pre-treated at 95 ℃ for 5 minutes, 1 cycle (denaturation) at 95 ℃, 90 seconds (annealing) at 58 ℃, 90 cycles (polymerization) at 72 ℃ 30 cycles, 10 ℃ at 72 ℃ The last extension was performed for a minute. The PCR product was cloned into the Eco RI- Xho I site of the plasmid pCA3 (Microbix Biosystems Inc., Canada) containing the early early promoter (HCMV-IE) of human cytomegalovirus (HCMV), and the pCL2, a transport vector. Was prepared (see FIG. 1). The pCL2 vector was deposited with the Korea Microbiological Conservation Center on May 22, 2001 (Accession No .: KCCM 10278). All the plasmids used in the present invention were used by mass propagation in Escherichia coli ( E. Coli HB101), and the primers represented by SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 6, 7 and 8 by the same method as the cloning method of the L2 gene. Cloning of the HPV-16 L1, L2 gene, and the HPV-18 L1 gene was also performed.

<실시예 2><Example 2>

재조합 아데노바이러스 벡터의 제조Preparation of Recombinant Adenovirus Vectors

2-1) RAdBL2 제조2-1) RAdBL2 Manufacturing

HPV 구성체 단백질 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하기 위하여, 실시예 1에서 제조된 pCL2와, 보조 벡터로서 E1 유전자가 결실된 아데노바이러스의 게놈(이하 ‘Ad5 E1-’으로 표시함)을 포함하는 플라스미드 pBHG11(Microbix Biosystems Inc. 캐나다)를 인산칼슘 침전법(calcium phosphate precipitation; Sambrooket al.,Molecular Cloning2nd, 1989)을 이용하여 293 세포에 공감염(cotransfection)시켰다. 상기 pBHG11 벡터는 크기가 커서 숙주 박테리아에서 증식시키는 동안 유전자 재배열(genetic rearrangement)이 일어나기 쉬우므로 공감염에 앞서 플라스미드 DNA를 모아 제한효소HindIII로 유전자 재배열이 일어났는지 분석을 수행한 다음 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 293 세포(Microbix Biosystems Inc., 캐나다)는 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)과 페니실린-스트렙토마이신(100㎍/100unit, Gibco BRL)을 포함하는 완전 MEMF11 배지에서 37℃, 5% 이산화탄소 존재하에 배양하였다. 70∼80%의 밀집도 (<p40)로 배양된 293 세포에 인산칼슘 침전법으로 pCL2와 보조 플라스미드(helperplasmid)인 pBHG11을 동시에 감염시키고(1세대 감염; 이하 ‘P1’으로 표시함), 10∼15일이 경과한 뒤 플라크가 형성되었음을 확인하였고, 상기 공감염된 세포를 모아 10% 글리세롤(glycerol)을 포함하는 멸균된 PBS++(phosphate-buffered saline; pH7.4, 1mM MgCl2, 1mM CaCl2)에 현탁시켰다. 현탁액을 -70℃에서 급속 냉동하고 37℃에서 해동하는 급속 냉동-해동 과정을 3회 반복하였다. 상기에서 얻은 바이러스 상등액으로 70∼80%의 밀집도로 배양된 293 세포에 실온에서 1시간 동안 감염시켰다(2세대 감염; 이하 ‘P2’로 표시함).For the production of recombinant adenoviral vectors expressing HPV constituent protein gene of Example 1 as a pCL2, and a secondary vector prepared in the genome of an adenovirus deleted the E1 gene (hereinafter 'Ad5 E1' as represented by) Plasmid pBHG11 (Microbix Biosystems Inc. Canada) was cotransfected to 293 cells using calcium phosphate precipitation (Sambrook et al. , Molecular Cloning 2nd, 1989). Since the pBHG11 vector is large in size, gene rearrangement is likely to occur during propagation in host bacteria, plasmid DNA was collected prior to co-infection and analyzed for restriction of gene rearrangement by restriction enzyme Hind III. Used. The 293 cells used in the experiment (Microbix Biosystems Inc., Canada) were 37 ° C. in complete MEMF11 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and penicillin-streptomycin (100 μg / 100 units, Gibco BRL). Incubated in the presence of 5% carbon dioxide. 293 cells cultured at a density of 70 to 80% (<p40) were simultaneously infected with pCL2 and pBHG11, a helperplasmid, by calcium phosphate precipitation (first generation infection; hereafter referred to as 'P1'). After 15 days, it was confirmed that plaques were formed, and the co-infected cells were collected and sterilized PBS ++ (phosphate-buffered saline) containing 10% glycerol (pH 7.4, 1 mM MgCl 2 , 1 mM CaCl 2). ) Is suspended. The freeze-thaw procedure was repeated three times, freezing the suspension at −70 ° C. and thawing at 37 ° C. The virus supernatant obtained above was infected with 293 cells cultured at a density of 70 to 80% for 1 hour at room temperature (second generation infection; hereafter referred to as 'P2').

상기와 같은 방법에 의해 공감염된 세포에서 생체내 재조합(in vivorecombination)에 의해 HPV-18 L2와 Ad5 E1-가 재조합된 재조합 아데노바이러스가 형성되었으며, 이를 RAdBL2라 명명하였다(도 1 참조).Recombinant adenoviruses in which HPV-18 L2 and Ad5 E1 − were recombined by in vivo recombination in the cells co-infected by the above method were named RAdBL2 (see FIG. 1).

2-2) HPV-18 L2 유전자 확인2-2) HPV-18 L2 Gene Identification

상기 바이러스 상등액을 이용한 감염 과정을 계속 반복하면서 수집한 세포 현탁액을 감염 반복 횟수에 따라 각각 P3(3세대 감염), P4(4세대 감염), P5(5세대 감염) 등으로 표시하였다. 한편, 감염된 293 세포에 HPV-18 L2 유전자가 안정적으로 도입되었는지를 확인하기 위하여 P2, P4 및 P6 세포를 대상으로 혼성화 반응을 수행하였다(도 2 참조). 재조합 아데노바이러스에 감염된 세포들을 프로나제 (pronase)가 포함된 SDS 용액(0.05% 프로나제, pH7.5 10mM Tris-HCI, 10mM EDTA, 0.5%(w/v) SDS)으로 현탁시킨 후 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였고, 페놀추출법(phenol extraction)으로 전체 DNA를 추출하였다. L2 유전자를 확인하기 위하여 P2, P4 및 P6 세포에서 추출된 유전자를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 산물을 1% 아가로스 겔에 전기영동한 후 1.5M NaCl, 0.5N NaOH 용액에서 45분간 변성시키고 증류수로 세척하였다. 1M Tris(pH 7.4), 1.5M NaCl 용액에 45분간 담궈 다시 중화시킨 후, 미리 10X SSC에서 5분 이상 담궈 두었던 나일론 막(Hybond-N, Amersham)으로 모세관 이동 방법을 이용하여 12∼16시간 동안 이동시킨 다음 6X SSC에서 5분간 세척하여 여분의 아가로스를 제거하였다. 이후, DNA를 나일론 막에 고정시키기 위하여 자외선 조사(245nm, 0.18J/Sq·㎠)하였다. DNA가 완전히 결합된 막에 6㎖ 전혼성화(prehybridization) 용액(5X SSC, % X Denhardt's reagent, 0.1% SDS, 100㎍/㎖ denatured salmon sperm DNA)을 넣어 65℃ 혼성화 반응용 오븐에서 2시간 가량 방치한 후,32P-α-dCTP로 표지된 L2 유전자를 끓는 물에서 5분간 변성하여 18시간 동안 혼성화 반응(hybridization)을 수행하였다.The cell suspension collected while repeatedly repeating the infection process using the virus supernatant was expressed as P3 (3rd generation infection), P4 (4th generation infection), P5 (5th generation infection) and the like according to the number of repeated infections. Meanwhile, hybridization reactions were performed on P2, P4, and P6 cells to confirm that the HPV-18 L2 gene was stably introduced into the infected 293 cells (see FIG. 2). Cells infected with recombinant adenovirus were suspended in SDS solution containing pronase (0.05% pronase, pH7.5 10 mM Tris-HCI, 10 mM EDTA, 0.5% (w / v) SDS) at 37 ° C. Incubated overnight, total DNA was extracted by phenol extraction. In order to identify the L2 gene, a gene extracted from P2, P4 and P6 cells was used as a template, and PCR was performed using oligonucleotides of SEQ ID NOs: 1 and 2 as primers. The PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel, denatured in 1.5M NaCl, 0.5N NaOH solution for 45 minutes and washed with distilled water. After 45 minutes in 1M Tris (pH 7.4), 1.5M NaCl solution, neutralized again, and then capillary transfer method to nylon membrane (Hybond-N, Amersham), which was previously immersed in 10X SSC for at least 5 minutes, for 12-16 hours. After removal, excess agarose was removed by washing in 6X SSC for 5 minutes. Thereafter, UV irradiation (245 nm, 0.18 J / Sq · cm 2) was used to fix the DNA onto the nylon membrane. 6 ml prehybridization solution (5X SSC,% X Denhardt's reagent, 0.1% SDS, 100µg / ml denatured salmon sperm DNA) was added to the DNA-bound membrane and left in the oven for 65 hours for hybridization reaction. Thereafter, the L2 gene labeled with 32 P-α-dCTP was denatured in boiling water for 5 minutes to perform hybridization for 18 hours.

다음날, 2X SSC, 0.1% SDS에서 나일론 막을 10분간 상온에서 씻어 주었고, 다시 0.2X SSC, 0.1% SDS로 42℃에서 20분 동안 씻어 준 다음 가이거 계수기(Geiger counter)로 신호를 측정해 가면서 온도를 65℃로 올려 씻어 주었다. 나일론 막을 랩으로 덮고 X-선 필름을 얹어 -70℃에서 감광시켰다.The next day, the nylon membrane was washed for 10 minutes at room temperature in 2X SSC, 0.1% SDS, and then washed with 0.2X SSC, 0.1% SDS for 20 minutes at 42 ° C, and then the temperature was measured by measuring the signal with a Geiger counter. It was washed up to 65 ℃. The nylon membrane was covered with a wrap and topped with an X-ray film and photosensitive at -70 ° C.

그 결과, 본 발명의 재조합 아데노바이러스에 의해 감염된 세포에서 1.4kb 크기의 L2 유전자가 발현됨을 확인할 수 있었으며, 특히 P4 세대에서 가장 많은 L2유전자가 확인되었다(도 2 참조).As a result, it was confirmed that the 1.4kb L2 gene is expressed in the cells infected by the recombinant adenovirus of the present invention, in particular, the most L2 gene was identified in the P4 generation (see Figure 2).

<실시예 3><Example 3>

투과 전자 현미경을 이용한 세포내 HPV-18 L2 단백질 발현 관찰Intracellular HPV-18 L2 Protein Expression Observed by Transmission Electron Microscopy

재조합 아데노바이러스 RAdBL2에 의해 감염된 세포가 재조합 아데노바이러스 벡터를 생산하는지를 확인하기 위하여 투과전자현미경(transmission electron microscope: Hitachi, 일본)을 이용하여 관찰하였다. 먼저, 재조합 아데노바이러스 벡터로 3세대 감염된 293 세포로부터 재조합 바이러스 입자를 공지의 방법(Beckeret al., Methods in Cell Biol.43:161-189, 1994)에 따라 분리하였다. 20,000 ×g로 원심 분리하여 세포 잔해물(debris)을 제거하고, 상등액을 1/2 부피의 20% 폴리에틸렌글리콜(PEG 8000)과 2.5M NaCl 혼합용액에 재현탁하여 4℃에서 하루 동안 정치하였다. 20,000 ×g로 10분간 원심분리하여 펠렛 형태로 얻어진 바이러스 입자를 PBS에 재현탁하여 슬라이드 글래스에 도포하고 건조시킨 후, 2% 인산화 텅스텐산(phospho ―tungstenic acid)으로 음성염색하여 투과전자현미경으로 관찰하였다(도 3 참조).In order to confirm whether the cells infected with the recombinant adenovirus RAdBL2 produced a recombinant adenovirus vector, a transmission electron microscope (Hitachi, Japan) was observed. First, recombinant virus particles were isolated from 293 cells infected with the third generation of recombinant adenovirus vectors according to known methods (Becker et al., Methods in Cell Biol. 43 : 161-189, 1994). Cell debris was removed by centrifugation at 20,000 × g, and the supernatant was resuspended in 1/2 volume of 20% polyethylene glycol (PEG 8000) and 2.5 M NaCl solution, and left at 4 ° C. for 1 day. After centrifugation at 20,000 × g for 10 minutes, the virus particles obtained in pellet form were resuspended in PBS, coated on slide glass, dried, and negatively stained with 2% phospho-tungstenic acid and observed by transmission electron microscope. (See FIG. 3).

PEG로 침전시킨 3세대 감염 세포 추출물을 투과전자현미경으로 관찰한 결과, 재조합 아데노바이러스 입자인 정20면체의 입자와 Ad-HPV 키메라 입자 또는 유사캡시드 입자로 보이는 불규칙한 형태의 이종입자가 관찰되었다. 한편, 상기 3세대 감염 293 세포 배양액으로부터 회수한 재조합 바이러스 상등액을 증식 불허 세포(non-permissive cell)인 베로 세포(vero cell)에 감염시켰다. RAdBL2로 감염된 베로 세포를 3회에 걸쳐 급속 냉동-해동한 후, 상등액을 회수하여 투과 전자 현미경으로 관찰한 결과, 규칙적인 크기와 모양을 갖는 L2 단백질의 유사 캡시드 집합체(capsid-like aggregate)가 관찰되었다. 베로 세포에서 추출된 바이러스 입자들은 지름이 약 40∼50㎚였으며, 증식 허용 세포(permissive cell)인 293 세포에서 발현된 입자들보다 규칙적인 형태를 나타내었다.As a result of observing the third-generation infected cell extract precipitated with PEG by transmission electron microscopy, heterogeneous particles of irregular morphology, which appear to be tetrahedral particles, which are recombinant adenovirus particles, and Ad-HPV chimeric particles or pseudocapsid particles, were observed. Meanwhile, the recombinant virus supernatant recovered from the third generation infected 293 cell culture was infected with vero cells, which are non-permissive cells. After rapid freeze-thawing of Vero cells infected with RAdBL2 three times, the supernatant was recovered and observed by transmission electron microscopy, and a capsid-like aggregate of L2 protein having a regular size and shape was observed. It became. Virus particles extracted from Vero cells were about 40-50 nm in diameter and showed a more regular shape than particles expressed in 293 cells, which are permissive cells.

즉, RAdBL2는 증식 허용 세포에 서와는 달리 증식 불허 세포에서 재조합 아데노바이러스 입자 또는 아데노바이러스와 HPV의 키메라 단백질 입자(Ad-HPV chimeric protein)는 생산하지 않고 단지 L2 단백질의 유사 캡시드 집합체만을 생산한다. 이는 베로 세포에서 아데노바이러스의 감염은 일어나지만, 아데노바이러스의 복제는 일어나지 않아(Grahamet al., J. Gen. Virol.36:5-72, 1977), RAdBL2로 감염된 베로 세포에서는 아데노바이러스 비리온의 생산이 감소되기 때문이다. 따라서, 상기 결과로부터 L2 단백질이 본질적으로 L2 단백질의 바이러스 유사입자 또는 유사 캡시드 집합체를 형성할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 증식 불허 세포에서도 유사 캡시드 입자로 조합될 수 있음을 알 수 있다.That is, RAdBL2 does not produce recombinant adenovirus particles or adenovirus and HPV chimeric proteins (Ad-HPV chimeric protein) in non-proliferative cells, unlike in proliferative cells, but only produces a similar capsid aggregate of L2 protein. This is because adenovirus infection occurs in Vero cells, but no replication of adenoviruses occurs (Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 5-72, 1977), and adenovirus virions in Vero cells infected with RAdBL2. Because the production of is reduced. Thus, it can be seen from the above results that the L2 protein has the ability to form essentially viral analogs or pseudocapsid aggregates of the L2 protein, and can be combined into pseudocapsid particles even in non-proliferating cells.

<실시예 4><Example 4>

재조합 아데노바이러스 입자의 분리Isolation of Recombinant Adenovirus Particles

재조합 바이러스 입자는 공지의 방법(Beckeret al., Methods in Cell Biol.43:161-189, 1994)에 따라 분리하였다. 즉, 20,000 ×g로 원심분리하여 세포 잔해물(debris)을 수거하고, 상등액은 1/2 부피의 20% 폴리에틸렌 글리콜(PEG 8000)과2.5M NaCl 혼합용액에 재현탁시킨 다음, 4℃에서 하루 동안 정치한 후 20,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 바이러스 입자를 펠렛 형태로 수거하였다. PEG에 의해 침전된 펠렛을 PBS에 재현탁시키고 여기에 염화세슘을 0.5g/㎖의 농도로 첨가하였다. 상기 용액을 베크만 원심분리기(Beckman 70.1 Ti rotor)에서 55,000rpm으로 20시간 동안 염화세슘 용액으로 밀도구배 원심분리하였다. 염화세슘 밀도구배에 의해 분리된 밴드를 주사기로 분리하고, PBS++(1mM MgCl2, 1mM CaCl2in PBS)로 희석한 다음 1,000,000 ×g로 4℃에서 90분간 침전시켰다. 얻어진 펠렛을 10% 글리세롤을 포함하는 멸균된 PBS++200㎕에 재현탁시키고, 260nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.Recombinant viral particles were isolated according to known methods (Becker et al., Methods in Cell Biol. 43: 161-189, 1994). That is, cell debris was collected by centrifugation at 20,000 × g, and the supernatant was resuspended in 1/2 volume of 20% polyethylene glycol (PEG 8000) and 2.5 M NaCl solution, and then at 4 ° C. for one day. After standing, the virus particles were collected in pellet form by centrifugation at 20,000 × g for 10 minutes. The pellet precipitated by PEG was resuspended in PBS and cesium chloride was added thereto at a concentration of 0.5 g / ml. The solution was density gradient centrifuged with cesium chloride solution for 20 hours at 55,000 rpm in a Beckman centrifuge (Beckman 70.1 Ti rotor). The band separated by the cesium chloride density gradient was separated by syringe, diluted with PBS ++ (1 mM MgCl 2 , 1 mM CaCl 2 in PBS), and then precipitated at 1,000,000 × g at 4 ° C. for 90 minutes. The resulting pellet was resuspended in 200 μl of sterile PBS ++ containing 10% glycerol and quantified by measuring absorbance at 260 nm.

바이러스 입자의 농도는 하기 식에 의해 계산하였으며(Beckeret al., Methods in Cell Biol.43:161-189, 1994), 분리된 바이러스 입자는 -70℃에서 보관하였다.The concentration of virus particles was calculated by the following formula (Becker et al., Methods in Cell Biol. 43: 161-189, 1994) and the isolated virus particles were stored at -70 ° C.

바이러스 입자의 농도(pfu/㎖) = OD260×1012 Concentration of Virus Particles (pfu / mL) = OD 260 × 10 12

염화세슘으로 밀도구배 원심분리한 결과, 각각의 초원심분리 튜브에서 두 종류의 밴드가 형성되었다. 상기 두 밴드 중 상부 밴드는 약 1.29g/㎖의 동일한 밀도를 나타냈으나, 하부 밴드는 pFG140(1.37g/㎖), P4-RAdBL2(1.31g/㎖) 및 P6-RAdBL2(1.30g/㎖) 모두 다른 밀도를 나타냈다(도 4 참조). 상부 밴드의 입자들을 투과 전자 현미경으로 관찰한 결과, 대부분의 입자들이 거의 분리되어 있었으며,매우 불규칙한 형태를 나타내었다.Density gradient centrifugation with cesium chloride produced two bands in each ultracentrifuge tube. The upper band of the two bands showed the same density of about 1.29 g / ml, while the lower bands were pFG140 (1.37 g / ml), P4-RAdBL2 (1.31 g / ml) and P6-RAdBL2 (1.30 g / ml) All showed different densities (see FIG. 4). Observation of the particles in the upper band by transmission electron microscopy showed that most of the particles were almost separated and showed a very irregular shape.

<실시예 5>Example 5

화학발광 효소면역측정(chemiluminescence Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 분석Chemiluminescence Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Analysis

5-1) GST-L2 융합 단백질 및 이에 대한 다클론 항체의 제조5-1) Preparation of GST-L2 Fusion Protein and Polyclonal Antibodies thereto

면역학적 검정을 위한 항체를 제조하기 위하여 HPV-18 L2와 글로타치온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase: GST)의 융합 단백질을 제조하였다. 먼저 pCL2로부터 제한효소EcoRI 및XhoI를 사용하여 L2 전장 유전자를 포함하는 DNA 조각을 분리한 후 pGEX-4T-1(Pharmacia Biotech) 벡터의EcoRI/XhoI위치에 서브 클로닝(sub-cloning)하고, 서열 분석(sequencing)을 통해 상기 L2 유전자가 제대로 삽입되었는지 확인하였다. 상기 벡터를 대장균(DH5a)에 화학적 형질전환 방법으로 형질전환(transformation)시킨 후 HPV-18 L2 유전자의 발현을 유도 및 정제하였다.To prepare antibodies for immunological assays, a fusion protein of HPV-18 L2 and glutathione S-transferase (GST) was prepared. First, DNA fragments containing L2 full-length genes were isolated from pCL2 using restriction enzymes Eco RI and Xho I and then sub-cloning to the Eco RI / Xho I position of the pGEX-4T-1 (Pharmacia Biotech) vector. Then, sequencing confirmed that the L2 gene was correctly inserted. The vector was transformed into E. coli (DH5a) by chemical transformation method, and the expression of HPV-18 L2 gene was induced and purified.

정제된 단백질을 마우스(ICR, 대한실험동물센터)에 2주 간격으로 100㎍씩 3회 복강주사하여 GST-L2 융합단백질에 대한 다클론 항체를 얻었다.Purified proteins were intraperitoneally injected into mice (ICR, Korea Experimental Animal Center) three times at 100 μg intervals for 2 weeks to obtain polyclonal antibodies against the GST-L2 fusion protein.

5-2) 화학발광 효소면역측정(chemiluminescence enzyme-linked immuno-sorbent assay; chemiluminescence ELISA)5-2) chemiluminescence enzyme-linked immuno-sorbent assay (chemiluminescence ELISA)

상기 실시예 4에서 나타난 두 개의 밴드 중 어느 밴드가 유사 바이러스 입자 및 유사 캡시드 집합체 혹은 Ad-HPV 키메라 단백질에 해당하는지를 확인하기 위하여, 상기 실시예 5-1)로부터 얻은 항 GST-L2 융합단백질 항체를 이용하여 화학발광 효소면역측정(chemiluminescence ELISA; Schmidet al.,BioTechnoques22:278-280, 1997)를 실시하였다. 우선 마이크로 타이터 플레이트에 염화세슘 밀도구배로 분리한 바이러스 입자(1×109pfu) 또는 GST-L2 융합단백질(0.1㎍)을 37℃ 배양기에서 2시간 동안 코팅하였다. 이후 3% 소 혈청알부민(bovine serum albumin: BSA)이 들어있는 PBS로 1시간 동안 반응을 차단(blocking)하였다. 상기 플레이트에서 실시예 5-1)에서 제조한 항 GST-L2 융합 단백질 항체와 바이러스 입자를 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)와 결합된 염소 항 마우스 IgG 항체(goat anti-mouse IgG)와 반응시켰다. 이때, 각 단계 중간에 0.5% 트리톤-X 100이 포함된 PBS 버퍼로 20분간 3회 세척하였다. 퍼옥시다제에 의해 나타나는 신호 정보 검출은 enhanced ECL system(Armersham, 미국)을 이용하였으며, 화학발광의 자가방사선사진(autoradiogram)은 영상분석기(imaging analyzer: MacBAS2000, Fuji, 일본)를 이용하여 분석하였다. 대조군으로는 인간 아데노바이러스 유형5의 DNA를 포함하는 pFG140(Grahamet al.,EMBO J. 8:2077-2085, 1989, Microbix Biosystems Inc., 캐나다)을 사용하였다.In order to identify which of the two bands shown in Example 4 corresponds to a pseudo virus particle and a pseudo capsid aggregate or an Ad-HPV chimeric protein, the anti-GST-L2 fusion protein antibody obtained in Example 5-1) was used. Chemiluminescence ELISA; Schmid et al ., BioTechnoques 22: 278-280, 1997. First, virus particles (1 × 10 9 pfu) or GST-L2 fusion protein (0.1 μg) separated by a cesium chloride density gradient were coated on a micro titer plate in a 37 ° C. incubator for 2 hours. The reaction was then blocked for 1 hour with PBS containing 3% bovine serum albumin (BSA). Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase after reacting the anti-GST-L2 fusion protein antibody prepared in Example 5-1) with the virus particles at 37 ° C. for 1 hour on the plate. Reacted with antibody (goat anti-mouse IgG). At this time, it was washed three times for 20 minutes with PBS buffer containing 0.5% Triton-X 100 in the middle of each step. Detection of signal information by peroxidase was performed using an enhanced ECL system (Armersham, USA), and autoradiograms of chemiluminescence were analyzed using an image analyzer (MacBAS2000, Fuji, Japan). As a control, pFG140 (Graham et al ., EMBO J. 8: 2077-2085, 1989, Microbix Biosystems Inc., Canada) containing DNA of human adenovirus type 5 was used.

그 결과, 염화세슘 밀도구배 원심분리에 의해 분리한 RAdBL2 샘플의 상부 밴드(1.29g/㎖) 입자는 GST-L2 융합 단백질에 대한 다클론 항체와 매우 높은 면역반응성(immuno-reactivity)을 보였으나, 대조군인 pFG140은 면역반응을 거의 나타내지 않았다(도 5 참조). 이러한 사실은 1.29g/㎖의 낮은 밀도를 갖는 상부 밴드의입자들이 HPV-18 L2 단백질의 유사 바이러스 입자 및 유사 캡시드 집합체에 해당함을 나타낸다.As a result, the upper band (1.29 g / mL) particles of the RAdBL2 sample separated by cesium chloride density gradient centrifugation showed very high immunoreactivity with polyclonal antibodies against the GST-L2 fusion protein. The control group pFG140 showed little immune response (see FIG. 5). This fact indicates that particles of the upper band with a low density of 1.29 g / ml correspond to analogous viral particles and pseudocapsid aggregates of HPV-18 L2 protein.

<실시예 6><Example 6>

HPV-18 L2 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스의 면역원성 조사Immunogenicity of Recombinant Adenovirus Expressing HPV-18 L2 Protein

HPV-18 L2를 발현하는 재조합 아데노바이러스 RAdBL2가 점막성 면역 반응(mucosal immunity)을 유발할 수 있는지 알아보기 위하여 염화세슘으로 정제한 바이러스 입자를 마우스에 투여하여 항체 형성 여부를 확인하였다.To determine whether recombinant adenovirus RAdBL2 expressing HPV-18 L2 can induce mucosal immunity, mice were administered with virus particles purified with cesium chloride to confirm antibody formation.

우선, 20㎕ PBS(pH 7.4)에 현탁시킨 RAdBL2 재조합 바이러스 입자(5 ×108pfu)를 미세피펫(micropipette)을 이용하여 마취한 마우스의 외비강(extenal nare)으로 비강투여(intranasal injection)하였다(Chengalvalaet al.,J. of General Virology72:2981-1988, 1991). 2주 뒤 같은 방법으로 추가접종(booster injection)하고 4주 뒤 심장 천자(heart puncture)하여 0.3㎖ 혈액을 얻은 후 37℃에서 1시간 방치하였고, 12,000rpm에서 5분간 원심분리하여 항혈청을 분리하였다. 상기와 같이 RAdBL2를 접종한 마우스로부터 얻은 항혈청을 이용하여 실시예 5-2)와 동일한 방법으로 GST-L2 융합단백질을 코팅한 마이크로 타이터 프레이트를 상기 항혈청과 반응시켜 화학발광 효소면역측정을 실시하였다.First, RAdBL2 recombinant virus particles (5 × 10 8 pfu) suspended in 20 μl PBS (pH 7.4) were intranasally injected into the nasal cavity of the anesthetized mouse using a micropipette. (Chengalvala et al ., J. of General Virology 72: 2981-1988, 1991). After 2 weeks, the injection was performed in the same manner, and after 4 weeks, heart puncture was performed to obtain 0.3 ml of blood, and the cells were left at 37 ° C. for 1 hour and centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes to separate antiserum. Using the antiserum obtained from RAdBL2 inoculated mice, microtiter plate coated with GST-L2 fusion protein was reacted with the antiserum in the same manner as in Example 5-2), and chemiluminescent enzyme immunoassay was performed. .

그 결과, RAdBL2의 밴드 중 낮은 밀도(1.29g/㎖)를 갖는 상부 밴드의 입자에 대한 항혈청은 GST-L2 융합단백질에 대해 매우 높은 면역 반응성을 나타내었다(도6 참조). 이러한 결과는 재조합 L2 단백질로 이루어진 유사 바이러스 입자 및 유사 캡시드 집합체가 점막성 면역 반응을 유발할 수 있음을 보여준다.As a result, antiserum against particles of the upper band with low density (1.29 g / ml) in the band of RAdBL2 showed very high immune responsiveness to the GST-L2 fusion protein (see FIG. 6). These results show that similar viral particles and similar capsid aggregates composed of recombinant L2 proteins can elicit mucosal immune responses.

본 발명의 재조합 아데노 바이러스 벡터로부터 생산된 바이러스 유사입자는 효과적으로 점막성 면역을 유발할 수 있으므로, 점막 상피 세포를 통해 감염되는 인체 파필로마 바이러스 감염을 효과적으로 차단하여 HPV로 인한 자궁경부암에 대한 생백신으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용함으로써 일반적으로 동물세포 배양에서 대량생산이 어려운 것으로 알려진 HPV 구성체 단백질을 대량으로 제조할 수 있을뿐만 아니라, 다양한 백신의 개발에 이용될 수 있다.Since the virus like particle produced from the recombinant adenovirus vector of the present invention can effectively induce mucosal immunity, it effectively blocks human papillomavirus infections infected through mucosal epithelial cells and thus can be used as a live vaccine against cervical cancer caused by HPV. Can be. In addition, by using the recombinant adenovirus vector of the present invention can not only produce a large amount of HPV construct protein known to be difficult to mass production in animal cell culture in general, it can be used for the development of various vaccines.

Claims (11)

인체 파필로마 바이러스(human papillomavirus ; HPV) 구성체 유전자와 E1 유전자가 결실된 아데노바이러스 게놈을 포함하며, 증식 허용 세포(permissive cell) 및 증식 불허 세포(non-permissive cell) 모두에서 HPV 구성체 단백질로 이루어진 바이러스 유사입자(virus-like particle ; VLP)를 생산할 수 있는 재조합 아데노바이러스 벡터.A virus comprising the human papillomavirus (HPV) construct gene and the adenovirus genome lacking the E1 gene, consisting of HPV construct proteins in both permissive and non-permissive cells Recombinant adenovirus vectors capable of producing virus-like particles (VLPs). 제 1항에 있어서, HPV 구성체 유전자를 포함하는 플라스미드와 E1 유전자가 제거된 아데노바이러스 게놈을 포함하는 바이러스 벡터를 동물 세포에 공감염(cotransfection)시켜 생체내 재조합(in vivo recombination)을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.The method according to claim 1, wherein the plasmid comprising the HPV construct gene and the viral vector comprising the adenovirus genome from which the E1 gene is removed are prepared by in vivo recombination by cotransfection into animal cells. Characterized by a recombinant adenovirus vector. 제 1항에 있어서, HPV구성체 유전자는 HPV-16 L1, HPV-16 L2, HPV-18 L1 또는 HPV-18 L2 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.The recombinant adenovirus vector according to claim 1, wherein the HPV construct gene is HPV-16 L1, HPV-16 L2, HPV-18 L1 or HPV-18 L2 gene. 제 1항에 있어서, HPV 구성체 유전자의 전사를 위한 프로모터는 HCMV 조기발현 유전자(human cytomegalovirus immediae-early ; HCMV-IE) 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.The recombinant adenovirus vector of claim 1, wherein the promoter for transcription of the HPV construct gene is a human cytomegalovirus immediae-early (HCMV-IE) promoter. 제 1항에 있어서, 증식 허용 세포는 293 세포인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.The recombinant adenovirus vector according to claim 1, wherein the proliferative cells are 293 cells. 제 1항에 있어서, 증식 불허 세포는 베로 세포인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.The recombinant adenovirus vector according to claim 1, wherein the non-proliferating cells are Vero cells. 제 1항에 있어서, HPV-18 L2 유전자와 E1 유전자가 결실된 아데노바이러스 게놈을 포함하며, 증식 허용 세포(permissive cell) 및 증식 불허 세포(non-permissive cell) 모두에서 HPV-18 L2 단백질로 이루어진 바이러스 유사 입자(virus-like particle ; VLP)를 생산할 수 있는 재조합 아데노바이러스 벡터 RAdBL2.2. The adenovirus genome of claim 1 comprising the HPV-18 L2 gene and the E1 gene deleted, comprising the HPV-18 L2 protein in both permissive and non-permissive cells. Recombinant adenovirus vector RAdBL2 capable of producing virus-like particles (VLPs). 제 1항에 있어서, HCMV-IE 프로모터에 기능적으로 연결된 HPV-18 L2 유전자를 포함하는 pCL2 플라스미드와 E1 유전자가 결실된 아데노바이러스 게놈을 포함하는 pBHG11 플라스미드를 동물 세포에 공감염시켜 생체내 재조합을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스벡터 RAdBL2.2. The method of claim 1, wherein the pCL2 plasmid comprising the HPV-18 L2 gene functionally linked to the HCMV-IE promoter and the pBHG11 plasmid containing the adenovirus genome deleted from the E1 gene are co-infected with animal cells for in vivo recombination. Recombinant adenovirus vector RAdBL2, which is prepared. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스 벡터를 유효성분으로 하는 자궁경부암 예방 및 치료용 백신.A vaccine for preventing and treating cervical cancer comprising the recombinant adenovirus vector of any one of claims 1 to 8 as an active ingredient. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스 벡터로부터 생산되는 HPV 구성체 단백질로 이루어진 HPV 바이러스 유사 입자.An HPV virus like particle consisting of the HPV construct protein produced from the recombinant adenovirus vector of claim 1. 제 10항의 바이러스 유사 입자를 유효성분으로 하는 자궁경부암 예방 및 치료용 백신.A vaccine for preventing and treating cervical cancer comprising the virus-like particle of claim 10 as an active ingredient.
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