KR20020096368A - Mass cell production method of chondrocytes by the inhibition of de-differentiation and a method for screening it - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 연골세포의 분화촉진, 연골세포의 탈분화 억제 또는 탈분화된 연골세포의 재분화 촉진제, 그것의 스크리닝 방법 및 그것을 이용한 연골세포의 제조방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 세포외 신호 조절 단백질 키나제(extracellular signal regulated protein kinase; 이하 "ERK" 라고 한다)또는 그것의 직접적인 상위 신호전달 분자인 MEK(MAP kinase) 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 연골세포의 분화촉진, 연골세포의 탈분화 억제 또는 탈분화된 연골세포의 재분화 촉진제, ERK 또는 MEK 활성 억제제의 탐색을 통한 연골세포의 분화촉진, 연골세포의 탈분화 억제 또는 탈분화된 연골세포의 재분화 촉진제의 스크리닝 방법 및 상기 촉진제를 이용하는 것을 특징으로 하는 연골세포의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to an agent for promoting differentiation of chondrocytes, inhibiting dedifferentiation of chondrocytes or re-differentiating chondrocytes, a screening method thereof, and a method for producing chondrocytes using the same, and more specifically, extracellular signal-regulating protein kinases. (Extracellular signal regulated protein kinase; hereinafter referred to as "ERK") or its direct upstream signaling molecule, MEK (MAP kinase) activity inhibitors, including the active ingredient to promote the differentiation of chondrocytes, inhibit the dedifferentiation or dedifferentiation of chondrocytes Promoting chondrocyte differentiation through detection of chondrocyte re-differentiation promoter, ERK or MEK activity inhibitor, inhibition of de-differentiation of chondrocytes or screening method for re-differentiation of de-differentiated chondrocytes and production of chondrocytes characterized by using said promoter It is about a method.
퇴행성관절염은 관절을 구성하는 연골세포(chondrocytes)에 노화 등의 퇴행이 발생하여 연골세포에서 관절의 기질물질들인 유형 Ⅱ 콜라겐(type-Ⅱ collagen) 및 프로테오글리칸(proteoglycan) 등의 합성이 저해됨과 동시에 인터루킨-1β(interleukin-1β; 이하 "IL-1β"라고 함) 및 종양괴사인자-알파 (tumor necrosis factor-α;이하 "TNF-α"라고 함)등의 염증성 사이토카인(cytokine)이 활성화됨에 따라 관절기질을 분해하는 기질 금속 단백질 분해효소(matrix metalloproteinase; 이하 "MMP"라고 함)의 합성 및 활성이 관절세포에서 증가됨으로 인해 관절조직이 파괴됨으로서 유발되는 질병이다. 또한 관절염은 염증성 사이토카인에 의한 일산화질소(NO)의 생성과 생성된 일산화질소에 의한 자가증폭적인 사이토카인의 생성으로 더욱 많은 MMP의 합성이 유발되게 되어 관절기질의 분해가 촉진됨으로써 더욱 악화된다. 이와 동시에 염증성 사이토카인은 지질대사산물인 프로스타글란딘 E2(prostagladin E2; 이하 "PGE2"라고 함)의 생성을 증가시켜 관절염에서 염증반응을 유발시킨다.Degenerative arthritis causes degeneration such as aging in chondrocytes constituting the joint, which inhibits the synthesis of type II collagen and proteoglycan, which are the matrix substances of the joint, and at the same time interleukin. As inflammatory cytokines such as -1β (interleukin-1β (hereinafter referred to as "IL-1β") and tumor necrosis factor-α (hereinafter referred to as "TNF-α") are activated, The synthesis and activity of matrix metalloproteinase (hereinafter referred to as "MMP") that breaks down the articular matrix is a disease caused by the destruction of joint tissue due to increased in the joint cells. In addition, arthritis is exacerbated by the production of nitric oxide (NO) by inflammatory cytokines and the production of self-amplifying cytokines by nitric oxide produced by the production of more MMP, thereby promoting the decomposition of the articular substrate. At the same time, inflammatory cytokines increase the production of the lipid metabolite, prostaglandin E2 (hereinafter referred to as "PGE2"), causing inflammatory reactions in arthritis.
현재 임상적으로 사용되고 있는 퇴행성관절염의 치료는 약물치료제(진통제, 스테로이드제, 비스테로이드계 항염제 등)나 연골보호제(히알루론산, 글루코사민, 콘드로이틴 등)를 이용하거나 수술적 처치(관절경 수술, 경골 근위부 절골술, 관절 부분 치환술, 슬관절 전치환술 등)에 의한다. 그러나 이들 방법은 연골세포 퇴행이나 MMP의 활성 및 합성의 제어 등의 근본적인 원인 제거와는 직접적인 연관성이 없다. 즉 약물치료제의 경우는 통증이나 염증반응 자체를 비특이적으로 완화시키는 효과만을 가지며 이러한 약물들은 체중증가, 고혈압 유발, 소화성 궤양 유발 등의 부작용도 나타내기 때문에 선택에 신중을 기하여야 한다. 히알루론산, 글루코사민, 콘드로이틴 등의 연골보호제는 단지 연골세포에 영양을 공급해 주거나 충격을 완화시킴으로써 관절을 보호해 주는 역할을 할 뿐이며, 궁극적인 연골 퇴행 및 이로 인한 관절염에 대한 저해제나 치료제는 아니다. 또한 현재 퇴행성관절염 치료에 응용되고 있는 약물 및 수술적 치료는 일시적인 통증이나 염증의 완화를 위한 것으로 근본적인 치료법이 될 수 없다.Currently, clinically used degenerative arthritis can be treated with medications (painkillers, steroids, nonsteroidal anti-inflammatory drugs), cartilage protectors (hyaluronic acid, glucosamine, chondroitin, etc.) or surgical treatment (arthroscopy, proximal tibia). Osteotomy, joint replacement, total knee arthroplasty, etc.). However, these methods are not directly related to the elimination of underlying causes such as chondrocyte degeneration or control of MMP activity and synthesis. In other words, the drug treatment only has the effect of non-specifically alleviating pain or inflammatory response itself, and these drugs also have side effects such as weight gain, hypertension, and peptic ulcer. Cartilage protectors such as hyaluronic acid, glucosamine, and chondroitin only serve to protect joints by nourishing cartilage cells or mitigating shock, and are not inhibitors or treatments for ultimate cartilage degeneration and resulting arthritis. In addition, drugs and surgical treatments currently applied to the treatment of degenerative arthritis are intended to alleviate temporary pain or inflammation and cannot be a fundamental treatment.
퇴행성관절염 등과 같은 손상된 연골조직의 재생을 위해 최근에는 세포공학(cell therapy) 및 조직공학(tissue engineering) 기술을 이용하여 손상된 연골조직을 대체하고자 하는 방법이 시도되고 있으나 세포 및 조직공학에는 대량의 연골세포가 필요하지만 연골세포를 생체외에서 증식시키는 과정에서 연골세포의 특성을 소실하는 탈분화(de-differentiation) 현상이 일어나기 때문에 연골세포의 대량획득에 어려움이 있다. 그러나 지금까지 연골세포의 생체외 증시과정에서 일어나는 탈분화에 대한 신호전달체계 등의 분자적 조절기구는 밝혀진 바 없다. 또한세포 및 조직공학적 퇴행성관절염 치료기술은 현재 태동단계이며, 담체와 연골세포를 이용한 조직공학 기법으로 3차원적 연골조직을 얻게되는 기술을 선보이고 있다. 그러나 세포 및 조직공학에 필요한 연골세포를 대량으로 획득하는 과정에서 필수적으로 수반되는 연골세포의 탈분화 즉 연골세포의 특성 소실에 대한 분자적 조절기구는 아직 알려져 있지 않으며, 탈분화된 세포를 3차원 배양에 의해 재분화 시키는 재분화 유도기술이 선보였으나 기술적인 까다로움 등으로 인해 역시 연골세포로 완전히 분화된 연골세포의 대량획득에는 어려움이 있는 실정이다.Recently, cell therapy and tissue engineering techniques have been used to replace damaged cartilage tissue for regeneration of damaged cartilage tissue such as degenerative arthritis. Cells are required, but de-differentiation of chondrocytes is lost during proliferation of chondrocytes in vitro, making it difficult to obtain large amounts of chondrocytes. However, until now, no molecular regulatory mechanisms such as signaling systems for dedifferentiation of chondrocytes in vitro have been identified. In addition, cell and histological degenerative arthritis treatment technology is in the early stages, and is showing the technology to obtain three-dimensional cartilage tissue by tissue engineering techniques using a carrier and chondrocytes. However, the molecular control mechanism for dedifferentiation of chondrocytes, that is, the loss of chondrocytes, which is essential in the process of obtaining a large amount of chondrocytes necessary for cell and tissue engineering is not known. Re-differentiation induction technology has been introduced, but due to technical difficulties, it is difficult to obtain mass of chondrocytes completely differentiated into chondrocytes.
이에, 본 발명자들은 ERK 또는 그것의 직접적인 상위 신호전달 분자인 MEK 활성억제제가 간충직세포의 연골세포로의 분화를 촉진시키고 생체외에서 연골세포의 증식과정에 수반되는 탈분화를 억제하여 손상된 연골조직의 재생에 사용되는 세포치료 및 조직공학에 필요한 연골세포를 대량으로 제조하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have found that MEK activity inhibitor, which is ERK or its direct higher-order signaling molecule, promotes the differentiation of hepatocellular cartilage into chondrocytes and inhibits the dedifferentiation associated with the proliferation of chondrocytes in vitro, thereby regenerating damaged cartilage tissue. The present invention has been confirmed that it can be usefully used in the preparation of a large amount of chondrocytes required for cell therapy and tissue engineering to be used and completed the present invention.
따라서 본 발명의 목적은 연골세포의 대량 제조에 필요한 세포외 증식과정에 수반되는 연골세포의 탈분화억제 또는 탈분화된 연골세포의 재분화 촉진제 및 그것의 스크리닝 방법과, 그것을 이용한 연골세포의 제조방법을 제공하는 데있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for inhibiting dedifferentiation or dedifferentiation of chondrocytes involved in extracellular proliferation required for mass production of chondrocytes, and a method for screening the same and a method for producing chondrocytes using the same. Having
도 1은 연골세포의 분화 및 퇴행과정을 연구하기 위한 세포배양 시스템을 나타내는 모식도이고, 1 is a schematic diagram showing a cell culture system for studying the differentiation and degeneration of chondrocytes,
도 2의A는 미세배양에 의한 간충직세포의 연골세포로의 분화를 나타내는 그림이고, A of Figure 2 is an illustration showing the differentiation into chondrocytes Mesenchymal cells of the culture by microstructure,
도 2의B는 관절연골세포의 단층계대배양에 의한 탈분화를 나타내는 그림이며, B of FIG. 2 is a figure showing the dedifferentiation of the single-layer passages of articular cartilage cells,
도 2의C는 계대배양에 의해 탈분화된 연골세포의 3차원적 배양에 의한 재분화를 나타내는 전기영동 사진이고, C of FIG. 2 is an electrophoretic picture showing the regeneration according to the three-dimensional culture of the chondrocytes by dedifferentiation passages,
M : 단층 계대배양(monolayer culture),M: monolayer culture,
A : 알지네이트 젤 비드(alginate gel bead)를 이용한 배양A: Culture using alginate gel bead
도 3의A는미세배양에 의한 연골세포의 분화과정에서 ERK의 활성억제가 유형Ⅱ 콜라겐의 발현을 증대시켜 분화를 촉진함을 나타내는 전기영동 사진이고, A of Fig. 3 is an electrophoresis image showing that the inhibition of the ERK promote differentiation by increasing the expression of collagen type Ⅱ in differentiation of cartilage cells by micro-culture,
도 3의B는 연골세포에서 ERK 활성억제제에 의한 ERK 활성의 억제를 나타내는 전기영동 사진이고,And B of Figure 3 is an electrophoresis image showing the inhibition of ERK activation by ERK inhibitors in chondrocytes,
도 3의C는 ERK 활성억제가 프로테오글리칸의 발현을 촉진하여 분화를 촉진함을 나타내는 그래프이고, C of FIG. 3 is a graph showing that ERK activity is inhibited promote differentiation by promoting the expression of the proteoglycan,
도 4의A는 연골세포의 탈분화과정에서 ERK의 활성이 증가하는 것을 나타내는 전기영동 사진이며, A of Fig. 4 is an electrophoresis image showing that the increase in activation of ERK dedifferentiation process of chondrocytes,
NB : 노던 블랏(Northern blot) 분석,NB: Northern blot analysis,
WB : 웨스턴 블랏(Western blot) 분석WB: Western blot analysis
도 4의B는 ERK 활성억제제를 이용하여 ERK의 활성을 억제하면 유형 Ⅱ 콜라겐의 합성이 증가함을 나타내는 전기영동 사진이고, B of FIG. 4 is a gel electrophoresis photograph showing that when inhibiting the activity of ERK synthesis increases in collagen type Ⅱ using ERK inhibitors,
NB : 노던 블랏 분석, WB : 웨스턴 블랏 분석NB: Northern blot analysis, WB: Western blot analysis
도 4의C는 ERK 활성억제제가 농도 의존적으로 유형 Ⅱ 콜라겐의 합성을 증가시키는 것을 나타내는 전기영동 사진이고, C in Fig. 4 is an electrophoresis image showing that ERK activity of the inhibitor increase the synthesis of collagen type Ⅱ in a concentration-dependent manner,
NB : 노던 블랏 분석, WB : 웨스턴 블랏 분석NB: Northern blot analysis, WB: Western blot analysis
도 4의D는 ERK 활성억제제가 농도 의존적으로 프로테오글리칸의 합성을 증가시키는 것을 나타내는 그래프이며, D in Fig. 4 is a graph showing the activity of an ERK inhibitor, a concentration-dependent manner to increase the synthesis of proteoglycans,
도 5는 ERK의 활성저해가 유형 Ⅱ 콜라겐 합성의 증가와 활성형 ERK의 감소를 유도함을 나타내는 사진이며, 5 is a photograph showing that inhibition of ERK induces an increase in type II collagen synthesis and a decrease in active ERK.
A: P0와 P2 단계에서의 유형 Ⅱ 콜라겐과 활성형 ERK의 분포양상,A: Distribution of type II collagen and active ERK at P0 and P2 stages,
B: P0와 P4 단계에서의 활성형 ERK의 분포양상B: Distribution of active ERK at P0 and P4 stages
도 6의A는 ERK의 활성이 탈분화된 연골세포의 재분화과정에서 감소함을 나타내는 전기영동 사진이고, A in Fig. 6 is an electrophoresis image showing that the decrease in the regeneration process of the activation of the ERK dedifferentiation chondrocytes,
M : 단층 계대배양,M: single layer subculture,
Alginate : 알지네이트 젤 비드를 이용한 배양,Alginate: incubation with alginate gel beads,
NB : 노던 블랏 분석, WB : 웨스턴 블랏 분석NB: Northern blot analysis, WB: Western blot analysis
도 6의B는 ERK 활성의 저해가 탈분화된 연골세포의 재분화를 촉진함을 나타내는 전기영동 사진이고, B of FIG. 6 is an electrophoresis image showing that the inhibition of ERK activation promoting the regeneration of dedifferentiation of chondrocytes,
M : 단층 계대배양,M: single layer subculture,
Alginate : 알지네이트 젤 비드를 이용한 배양Alginate: Culture with Alginate Gel Beads
도 7의A는 연골세포의 분화과정에서 ERK의 활성조절은 단백질 인산화효소 C(PKC)에 의함을 나타내는 전기영동 사진이고, Figure 7 A is an electrophoresis picture showing that the regulation of ERK activity in chondrocyte differentiation is due to protein kinase C (PKC),
도 7의B는 PKC 활성의 저해에 의한 연골세포 분화의 저해가 ERK 활성의 저해시는 일어나지 않음을 나타내는 전기영동 사진이며, B of FIG. 7 is an electrophoresis image showing the inhibition of chondrocyte differentiation by inhibition of PKC activity may not occur during the inhibition of ERK activity,
Con : 대조군, PMA : 10 nM의 PMA 처리군,Con: control group, PMA: 10 nM PMA treatment group,
Go : 0.5 uM의 Go6976 처리군Go: 0.569M Go6976 treatment group
도 7의C는 ERK의 증가된 활성을 억제할 경우 프로테오글리칸의 합성이 촉진됨을 나타내는 그래프이고,And the synthesis of proteoglycan graph showing the promoted if also inhibit 7 C has an increased activity of ERK in,
Con : 대조군, PMA : 10 nM의 PMA 처리군,Con: control group, PMA: 10 nM PMA treatment group,
Go : 0.5 uM의 Go6976 처리군Go: 0.569M Go6976 treatment group
도 8의A는 PKC 활성의 억제가 연골세포의 탈분화를 유도함을 나타내는 전기영동 사진이고,And A of Fig. 8 Inhibition of PKC activity induces an electrophoresis image showing the dedifferentiation of chondrocytes,
도 8의B는 ERK의 활성저해가 연골세포의 탈분화를 방지함을 나타내는 전기영동 사진이며, B of FIG. 8 is an electrophoresis image showing that the inhibition of ERK activation prevented the dedifferentiation of chondrocytes,
도 8의C는 탈분화된 연골세포의 재분화를 나타내는 전기영동 사진이고,And C of Figure 8 is an electrophoresis image showing the subdivision of the dedifferentiation chondrocytes,
C : 대조군, P : 100 nM의 PMA 처리군,C: control group, P: PMA treatment group of 100 nM,
G : 5 uM의 GF109203X 처리군, PD : 20 uM의 PD98059 처리군G: 5 uM GF109203X treatment group, PD: 20 uM PD98059 treatment group
도 8의D는 PKC에 의한 연골세포의 퇴행이 ERK 활성저해시에는 일어나지 않음을 나타내는 전기영동 사진이고,And D of Figure 8 is an electrophoresis image showing the degeneration of cartilage cells by a PKC not occur at the time of inhibiting ERK activity,
도 9은 연골세포의 탈분화 및 분화 촉진시 유형Ⅱ 콜라겐, PKC 알파, 활성형 ERK의 분포양상을 나타내는 사진이고, Figure 9 is a photograph showing the distribution of type II collagen, PKC alpha, active ERK upon dedifferentiation and differentiation of chondrocytes,
도 10는 연골세포의 분화 및 탈분화과정에서 ERK의 역할을 나타내는 모식도이다. 10 is a schematic diagram showing the role of ERK in the differentiation and dedifferentiation process of chondrocytes.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ERK 또는 그것의 직접적인 상위 신호전달 분자인 MEK 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 연골세포의 분화촉진, 연골세포의 탈분화 억제 또는 탈분화된 연골세포의 재분화 촉진제를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an agent for promoting the differentiation of chondrocytes, inhibiting the differentiation of chondrocytes or re-differentiating chondrocytes, including ERK or MEK activity inhibitor which is a direct upper signaling molecule thereof as an active ingredient. do.
또한 본 발명은 ERK 또는 그것의 직접적인 상위 신호 전달물질인 MEK의 활성억제제의 탐색을 통한 연골세포의 탈분화억제 또는 탈분화된 연골세포의 재분화 촉진제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of screening an inhibitor of dedifferentiation of chondrocytes or a promoter of re-differentiation of chondrocytes through the search for an inhibitor of activity of ERK or MEK, which is a direct upstream signal transmitter thereof.
또한 본 발명은 상기의 연골세포의 분화촉진, 연골세포의 탈분화 억제 또는 탈분화된 연골세포의 재분화 촉진제를 사용하는 것을 특징으로 하는 연골세포의 제조방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for producing chondrocytes, characterized in that the use of the above-mentioned promoting the differentiation of chondrocytes, inhibiting the dedifferentiation of chondrocytes or re-differentiation of the chondrocytes.
이하 본 발명을 상기의 순서에 따라 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail in the above order.
먼저, 본 발명은 ERK 또는 그것의 직접적인 상위 신호전달분자인 MEK의 활성억제제를 유효성분으로 함유하는 연골세포의 생체외에서의 증시과정에 수반되는 탈분화억제 또는 탈분화된 연골세포의 재분화 촉진제를 제공한다.First, the present invention provides an agent for inhibiting de-differentiation or re-differentiation of chondrocytes involved in the ex vivo process of chondrocytes containing ERK or MEK activity inhibitor, which is a direct upstream signaling molecule thereof, as an active ingredient.
본 발명의 ERK의 활성억제제 또는 MEK의 활성억제제에는 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(2-(2-amino-3-methoxyphenol)- 4H-1-benzopyran-4-one)(PD98059)과 1,4-디아미노-2,3-디시아노-1,4-비스(2-아미노페닐씨오)부타디엔(1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio)butadiene) (U-0126) 등이 있다. 그러나, 상기에서 기술한 화합물이외에도 모든 ERK의 활성억제제가 본 발명의 범주에 속하게됨은 당업자에게 있어서 당연한 것이다.ERK activity inhibitors or MEK activity inhibitors of the present invention include 2- (2-amino-3-methoxyphenol) -4H-1-benzopyran-4-one (2- (2-amino-3-methoxyphenol)- 4H-1-benzopyran-4-one) (PD98059) and 1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis (2-aminophenylthio) butadiene (1,4-diamino-2 , 3-dicyano-1,4-bis (2-aminophenylthio) butadiene) (U-0126). However, it will be apparent to those skilled in the art that all ERK activity inhibitors, in addition to the compounds described above, fall within the scope of the present invention.
ERK에는 ERK-1 또는 ERK-2가 있으며 아미노산 서열에 있어서 이와 95%이상의 상동성을 가지는 모든 ERK의 변이체가 본 발명의 범주에 포함된다. MEK에는 MEK-1 또는 MEK-2가 있으며 아미노산 서열에 있어서 이와 95%이상의 상동성을 가지는 모든 MEK의 변이체가 또한 본 발명의 범주에 포함된다.ERK는 MEK에 의해서 활성화 되기 때문에 MEK의 활성을 억제하면 ERK의 활성이 곧바로 억제되므로 MEK는 ERK의 직접적인 상위 신호전달분자가 된다.ERKs include ERK-1 or ERK-2, and variants of all ERKs having at least 95% homology with them in the amino acid sequence are included within the scope of the present invention. MEKs include MEK-1 or MEK-2, and variants of all MEKs having at least 95% homology with it in the amino acid sequence are also within the scope of the present invention. Since E RK is activated by MEK, inhibiting the activity of MEK directly inhibits the activity of ERK. Therefore, MEK becomes a direct upstream signaling molecule of ERK.
본 발명의 ERK 또는 MEK의 활성억제제를 포함하는 연골세포의 탈분화억제 및 탈분화된 연골세포의 재분화 촉진제가 어떻게 생체 외에서의 증식과정에 수반되는 탈분화를 억제하고 또한 탈분화된 연골세포의 재분화를 촉진하는가를 살펴보면 다음과 같다.How the inhibitor of dedifferentiation of chondrocytes and the promoter of redifferentiation of dedifferentiated chondrocytes including the inhibitor of ERK or MEK of the present invention inhibits the dedifferentiation involved in the proliferation process in vitro and also promotes the redifferentiation of dedifferentiated chondrocytes. Looking at it as follows.
먼저, 본 발명자들은 ERK 또는 MEK의 활성의 저해가 연골세포로의 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, 계배의 간충직 세포가 다층 세포배양으로 유지될 경우 배양 3일째부터 연골세포로의 분화가 시작되었는데, 연골세포의 분화는 웨스턴 블라팅 분석에 의해 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현을 확인함으로써 증명하였다(도 3참조). 연골세포의 분화과정에서 ERK의 발현에는 차이가 없었으나 ERK의 활성은 유형 Ⅱ 콜라겐 발현과는 반대로 현저히 감소하였다. 간충직 세포에 ERK의 상위 신호전달자인 MEK의 활성을 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(PD98059)으로 저해하였을 경우 ERK의 활성이 농도 의존적으로 감소하였고, 이때 연골세포에서 프로테오글리칸의 합성을 알시안 블루(alcian blue) 염색으로 확인하였을 때 그 합성이 현저히 증가하였으며 또한 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현도 현저히 증가하였다. 따라서 ERK 또는 MEK의 활성의 억제가 간충직 세포에서 연골세포로 분화하는데 필요하다는 것을 확인하였고, ERK 또는 MEK의 활성을 인위적으로 억제함으로써 연골세포의 분화를 촉진할 수 있다는 것을 증명하였다.First, the inventors confirmed the effect of inhibition of ERK or MEK activity on the differentiation into chondrocytes. As a result, when hepatic mesenchymal cells were maintained in multi-layered cell culture, differentiation into chondrocytes began on the third day of culture, and the differentiation of chondrocytes was confirmed by confirming the expression of type II collagen by Western blotting analysis ( 3 ). There was no difference in ERK expression during chondrocyte differentiation, but ERK activity was markedly decreased in contrast to type II collagen expression. ERK activity was concentration-dependent when the activity of MEK, an upstream signal of ERK, was inhibited by 2- (2-amino-3-methoxyphenol) -4H-1-benzopyran-4-one (PD98059) in mesenchymal cells When the synthesis of proteoglycans in chondrocytes was confirmed by alkian blue staining, the synthesis was markedly increased and the expression of type II collagen was also significantly increased. Therefore, it was confirmed that inhibition of ERK or MEK activity is necessary for differentiation from mesenchymal cells to chondrocytes, and demonstrated that the differentiation of chondrocytes can be promoted by artificially inhibiting the activity of ERK or MEK.
또한, 본 발명자들은 ERK 또는 MEK의 활성이 연골세포의 단층계대배양에 의한 생체외에서의 증식과정에 일어나는 탈분화 과정에 미치는 영향을 조사하였다. 먼저 연골세포의 증식과정에서 웨스턴 블라팅과 노던 블라팅으로 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현을 분석한 결과 그 발현정도는 P0에서 가장 높았고, P1에서 감소하기 시작하였으며, P3 이후에는 거의 나타나지 않았다(도 4의A참조). 한편 ERK의 활성도는 P0에서 매우 낮았으나, 연이은 단층 계대배양에 의해 ERK의 활성은 현저히 증가하였으며 이는 ERK 또는 MEK의 활성의 발현과는 관련이 없었다. 따라서 ERK의 활성 또는 MEK의 활성은 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현과 반비례한다는 것을 알 수 있었고 이는 세포증식과정에 수반되는 탈분화에서 ERK 활성 또는 MEK의 활성이 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.In addition, the present inventors investigated the effect of ERK or MEK activity on the dedifferentiation process that occurs in the in vitro proliferation process by monolayer subculture of chondrocytes. First, the expression of type II collagen was analyzed by Western blotting and northern blotting during the proliferation of chondrocytes. The expression level was the highest at P0, started to decrease at P1, and hardly appeared after P3 ( Fig. 4) . A ). On the other hand, the activity of ERK was very low at P0, but the activity of ERK was markedly increased by successive monolayer subculture, which was not related to the expression of ERK or MEK activity. Therefore, ERK activity or MEK activity was found to be inversely related to the expression of type II collagen, which means that ERK activity or MEK activity plays an important role in the differentiation involved in cell proliferation.
또한, 본 발명자들은 ERK 또는 MEK의 활성과 탈분화와의 연관성을 알기 위해 계대배양 중인 세포들에 ERK 또는 MEK의 활성억제제를 처리한 후 콜라겐 및 프로테오글리칸의 합성 정도를 조사하였다. 그 결과, ERK 또는 MEK의 활성억제제의 처리에 의해 ERK의 활성이 차단됨을 확인하였으며(도 4의B참조) 그 정도는 처리된 화합물의 농도에 의존적이었다(도 4의C참조). ERK 활성 또는 MEK의 활성이 저해된 P0 세포에서는 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현이 현저히 증가되었고 또한 P2 세포에서는 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현저해가 반전되는 결과를 나타내었다(도 4의B참조). 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현과 더불어 ERK또는 MEK의 활성의 저해는 프로테오글리칸의 합성을 증가시켰는데, 알시안 블루 염색법으로 확인한 결과 P0에서 2.6배, P2에서 6.4배 만큼 증가시켰다(도 4의D참조). 따라서 탈분화된 연골세포에서 ERK 또는 MEK의 활성저해는 유형 Ⅱ 콜라겐과 프로테오글리칸의 합성을 유도함을 증명하여 연골세포의 특성을 유지한채 생체외에서 연골세포를 대량증식할 수 있음을 증명하였다.In addition, the present inventors examined the degree of synthesis of collagen and proteoglycans after treatment with ERK or MEK activity inhibitors in passaged cells to know the correlation between ERK or MEK activity and dedifferentiation. The result was the activation of ERK is blocked by the check processing of the active inhibitors of ERK, or MEK that much (see B of FIG. 4) was dependent on the concentration of the treatment compound (see C in Fig. 4). In the ERK activity is inhibited or MEK activity of P0 cells was significantly increased expression of collagen type Ⅱ addition, the P2 cells and the results are shown that inhibiting the expression of collagen type Ⅱ inverted (see B of FIG. 4). Inhibition of ERK or MEK activity in combination with the expression of type II collagen increased the synthesis of proteoglycans, which was increased by 2.6-fold at P0 and 6.4-fold at P2 (see D in FIG. 4 ). Therefore, it was proved that the inhibition of ERK or MEK activity in dedifferentiated chondrocytes induced the synthesis of type II collagen and proteoglycan, thereby proliferating the chondrocytes in vitro while maintaining the properties of chondrocytes.
탈분화된 연골세포는 알지네이트(alginate) 교화체에서 3차원적으로 배양할 경우 재분화가 유도되는데(도 2C참조), 본 발명자들은 상기 특성을 이용하여 재분화 과정에서 ERK 또는 MEK의 활성의 역할을 조사하였다.Dedifferentiated chondrocytes are induced to redifferentiate when cultured in alginate hybridization three-dimensionally (see FIG. 2C ). The inventors investigated the role of ERK or MEK activity in the redifferentiation process using the above characteristics. .
그 결과, 더 이상 유형 Ⅱ 콜라겐을 발현하지 않는 계대배양 P4의 탈분화된 세포를 3차원 배양한 경우 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현이 3차원 배양 2일째부터 나타나기 시작하였고 배양기간이 길어질수록 더 많이 발현되는 것을 확인하였다(도 6의A참조). 단층배양중인 P4 세포에서 증가된 ERK 또는 MEK의 활성은 3차원 배양에 의해 ERK의 발현에는 변화없이 그 활성이 P0 세포의 정도로 감소하였다. 연골세포를 알지네이트 교화체에서 3차원적으로 배양하면서 ERK 또는 MEK의 활성억제제를 처리하여 ERK 또는 MEK의 활성을 저해하였을 경우에는 더 많은 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현이 나타났다(도 6의B참조). 따라서 증가된 ERK 또는 MEK의 활성이 연골세포의 탈분화를 유도하는 반면, ERK 활성의 감소는 연골세포의 재분화를 유도함을 증명하였다.As a result, in the case of three-dimensional culture of subdifferentiated cells of subculture P4, which no longer expresses type II collagen, expression of type II collagen began to appear on the second day of the three-dimensional culture, and the expression of the type II collagen was increased as the culture period was longer. It was confirmed (see A of FIG. 6 ). The increased activity of ERK or MEK in monolayered P4 cells decreased to the level of P0 cells with no change in ERK expression by three-dimensional culture. If while chondrocytes cultured in alginate rehabilitated body in three dimensions hayeoteul by processing the active inhibitors of ERK, or MEK inhibiting ERK or MEK activity has shown the expression of more types Ⅱ collagen (see B of FIG. 6). It was thus demonstrated that increased ERK or MEK activity induces chondrocyte dedifferentiation, while decreased ERK activity leads to chondrocyte redifferentiation.
또한, 본 발명은 ERK의 활성억제제 또는 그것의 상위 신호전달분자인 MEK의 활성억제제의 탐색을 통한 연골세포의 분화촉진, 연골세포의 탈분화 억제 또는 연골세포의 재분화 촉진제의 스크리닝 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for screening an agent for promoting the differentiation of chondrocytes, inhibiting the differentiation of chondrocytes, or promoting the regeneration of chondrocytes by searching for an inhibitor of ERK activity or an inhibitor of MEK, which is a higher signaling molecule thereof.
상기에서 상세히 살펴 본 바와 같이, ERK 또는 그것의 직접적인 상위 신호전달분자인 MEK의 활성이 억제되면 간충직세포의 연골세포로의 분화가 촉진되고 탈분화된 연골세포에서 유형 Ⅱ 콜라겐과 프로테오글리칸의 합성이 유도되며 또한 연골세포의 재분화가 유도되므로, ERK 또는 MEK의 활성억제제의 탐색을 통하여 연골세포의 분화촉진, 연골세포의 탈분화 억제 또는 연골세포의 재분화 촉진제를 스크리닝할 수 있다.As discussed in detail above, inhibition of ERK or its direct higher signaling molecule, MEK, promotes the differentiation of mesenchymal cells into chondrocytes and induces the synthesis of type II collagen and proteoglycans in dedifferentiated chondrocytes. In addition, since the regeneration of chondrocytes is induced, it can be screened for promoting the differentiation of chondrocytes, inhibiting the dedifferentiation of chondrocytes or promoting the regeneration of chondrocytes through the search for an activity inhibitor of ERK or MEK.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1> 연골세포의 분화, 탈분화 및 재분화Example 1 Differentiation, Dedifferentiation and Redifferentiation of Chondrocytes
<1-1> 연골세포의 분화<1-1> Chondrocyte Differentiation
연골세포로의 분화를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 계배기(Hamburger-Hamilton stage 24-25 chicken embryo) 병아리의 사지 말단(limb bud) 간충직세포를 사용하여 미세배양(micromass culture)하에서 연골세포로 분화하는 과정을 관찰하였다(도 1 왼쪽). 구체적으로, 간충직세포들을 10%의 우태아 혈청이 포함된 햄스 배양액(Ham's F-12 medium, GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA)에 2 x 107세포/㎖ 정도로 부유시키고 배양접시에 한 스팟(spot)당 15 ㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 배양하여 세포들을 배양접시에 부착시킨 후 10%의 우태아 혈청과 스트렙토마이신(50 ㎍/㎖), 페니실린(50 units/㎖) 등이 포함된 햄스 배양액에서 필요에 따라 여러 약제를 첨가하거나 첨가하지 않고 배양하였다. 그 결과, 연골세포의 분화는 계배의 간충직세포를 5일 동안 미세배양 하였을 경우 연골세포의 특성인 유형 Ⅱ 콜라겐의 합성이 배양 3일째부터 나타나는 것을 항체를 이용한 웨스턴 블라팅법으로 확인함으로써 증명하였고, 또한 황화형 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)의 축적도 유사한 유형으로 증가함을 알시안 블루(alcian blue) 염색을 통해 확인하여 연골세포의 특성이 배양 3일째부터 나타나기 시작하여 5일째에 완전히 연골세포로 분화됨을 확인하였다(도 2A).In order to confirm the differentiation into chondrocytes, the present inventors differentiated into chondrocytes under micromass culture using limb bud hepatomegaly cells of Hamburger-Hamilton stage 24-25 chicken embryo chicks. The process of observing ( Fig. 1 left ). Specifically, the mesenchymal cells were suspended in a hams culture solution containing 10% fetal bovine serum (Ham's F-12 medium, GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA) at about 2 × 10 7 cells / ml and spotted on a culture dish. 15 μl) were aliquoted and incubated at 37 ° C. for 2 hours to attach cells to the culture dish, followed by 10% fetal calf serum, streptomycin (50 μg / ml), and penicillin (50 units / ml). In the hams culture, the various cultures were added with or without additional agents as necessary. As a result, the differentiation of chondrocytes was proved by Western blotting using antibody that the synthesis of type II collagen, which is characteristic of chondrocytes, was observed from the 3rd day of culture when the mesenchymal cells of the germline were microcultured for 5 days. The accumulation of sulfosylated glycosaminoglycans increased in a similar manner by alcian blue staining, indicating that the characteristics of chondrocytes began to appear on the third day of culture and completely to the chondrocytes on the fifth day. Confirmed differentiation ( FIG. 2A ).
<1-2> 연골세포의 탈분화 및 퇴행<1-2> Degeneration and Degeneration of Chondrocytes
연골세포의 탈분화 및 퇴행을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 출생 2-4주된 토끼의 관절연골세포를 연속적으로 단층 계대배양 하였다(도 1 중앙). 구체적으로, 무균적으로 얇게 베어낸 토끼 관절 조각들을 0.2%의 유형 Ⅱ 콜라게나제(colagenase type Ⅱ, Sigma)를 포함하는 인산완충액에서 6시간 동안 반응시킨 후 순간적으로 원심분리하여 단일 세포(single cells)들을 획득하였다. 상기 세포들을 10%의 우태아 혈청, 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 50 units/㎖의 페니실린이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA) 배지에 현탁시킨 후 배양접시에 5 x 104세포/cm2의 농도로 분주하여 37℃에서 배양하였다. 배양액은 2일마다 교환해 주었으며 배양 5일 후에 세포들이 배양접시에 꽉 차도록 자란 것을 확인하여 이 시기의 세포들을 P0로 규정하였다. 상기 세포들을 다시 배양접시당 5 x 104세포/cm2의 밀도로 계대배양(subculture)하였으며, 세포들이 배양접시에 꽉 차도록 자랄 때마다 계속적으로 계대배양하였고 이를 각각 P1, P2 등으로 규정하였다. 계대배양은 P6 단계에 이를 때까지 계속하여 실시하였다. 그 결과, 토끼 관절의 연골세포를 P0에서부터 P6까지 단층 계대배양 할 경우 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현이 P1에서부터 감소하기 시작하여 P3부터는 전혀 나타나지 않음을 항체를 이용한 웨스턴 블라팅으로 확인하였고, 황화형 글라이코사미노글라이칸(glycosaminoglycan)의 축적도 유사한 유형으로 계대배양을 진행할수록 감소함을 알시안 블루(alcian blue) 염색을 통하여 확인하였다. 또한 연골세포의 모양이 특징적인 둥근 형태에서 퇴행된 연골세포의 특징인 섬유아세포 모양을 나타냄을 확인하여 연골세포의 탈분화 및 퇴행을 증명하였다(도 2B).In order to confirm the dedifferentiation and degeneration of chondrocytes, the present inventors serially cultured the chondrocytes of rabbits 2-4 weeks old ( middle 1 ). Specifically, aseptic thin slices of rabbit joints were reacted in phosphate buffer containing 0.2% of collagen type II (Sigma) for 6 hours, followed by instant centrifugation for single cells. ) Were obtained. The cells were suspended in Dulbecco's modified Eagle's medium, GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA (DMEM) medium containing 10% fetal calf serum, 50 μg / ml streptomycin and 50 units / ml penicillin Aliquots were made at a concentration of 5 × 10 4 cells / cm 2 and incubated at 37 ° C. The medium was exchanged every 2 days, and after 5 days of culture, the cells were grown to fill the culture dish, and cells at this time were defined as P0. The cells were subcultured again at a density of 5 × 10 4 cells / cm 2 per culture dish, each time cells were grown to fill the culture dish and defined as P1, P2, etc., respectively. Subcultures were continued until the P6 stage was reached. As a result, it was confirmed by Western blotting using antibody that the expression of type II collagen begins to decrease from P1 when the chondrocytes of rabbit joints are cultured from P0 to P6. Accumulation of glycosaminoglycan was also confirmed by alkian blue staining with similar type, which decreased with passage of passage. In addition, it was confirmed that the shape of chondrocytes showed the fibroblast shape, which is characteristic of the degenerated chondrocytes in the characteristic round shape, and demonstrated the dedifferentiation and degeneration of chondrocytes ( FIG. 2B ).
<1-3> 탈분화된 연골세포의 재분화<1-3> Redifferentiation of Dedifferentiated Chondrocytes
탈분화된 연골세포의 재분화는 탈분화된 관절연골세포를 알지네이트 젤 비드(alginate gel bead)에 삼차원 배양함으로써 유도하였다(도 1 오른쪽). P6 단계로서 섬유아세포의 특성을 가지게 된 세포들을 Guo 등의 방법에 따라 알지네이트 젤 비드에서 3차원적으로 배양하였다(Guo, et al.,Tissue. Res.,1989, 19, 277-297). 먼저, P6 세포들을 트립신으로 처리하여 부유시키고 0.15 M의 NaCl 용액으로 세척한 후 1.25%의 소디움 알지네이트(Sigma)가 포함된 HEPES(20 mM HEPES, 0.15 M NaCl, pH 7.4) 완충액에 현탁시켰다. 세포현탁액을 젤레이션 용액(102 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.4)에 서서히 가한 후 이 젤레이션 용액이 살짝 굳은 후에 CaCl2용액에서 10분간 서서히 흔들어 줌으로서 중합시키고 5배 부피의 0.15 M NaCl 용액으로 3회 세척하였다. 세포들을 포함한 상기 알지네이트 젤 비드를 DMEM에서 배양하였으며 배양액은 2일마다 교환해 주었다. 배양이 끝난 후에는 알지네이트 젤 비드를 두 배 부피의 50 mM EDTA, 10 mM HEPES(pH 7.4) 용액에서 15분간 용해시키고 400 g에서 10분간 원심분리한 후 얻어진 세포 침전물을 라이시스 버퍼(lysis buffer)로 처리하여 세포를 수확하였다. 그 결과, 연속적인 계대배양에 의해 탈분화된 연골세포(P0, P4 및 P6)를 알지네이트 젤 비드(alginate gel bead)에 4일 동안 삼차원적으로 배양한 경우 연골세포의 유형 Ⅱ 콜라겐 합성이 모든 계대배양 단계에서 증가함을 확인하였고, 삼차원 배양기간이 길어질수록 더 많은 콜라겐 합성이 일어남을 확인하여 탈분화된 연골세포가 다시 재분화 되는 것을 증명하였다(도 2C).Redifferentiation of dedifferentiated chondrocytes was induced by three-dimensional culture of dedifferentiated articular chondrocytes in alginate gel beads ( FIG. 1 right ). Cells that had the characteristics of fibroblasts as a P6 step were cultured three-dimensionally in alginate gel beads according to Guo et al. (Guo, et al., Tissue. Res ., 1989 , 19, 277-297). First, P6 cells were treated with trypsin, suspended and washed with 0.15 M NaCl solution and then suspended in HEPES (20 mM HEPES, 0.15 M NaCl, pH 7.4) buffer containing 1.25% sodium alginate (Sigma). The cell suspension is slowly added to the gelation solution (102 mM CaCl 2 , 5 mM HEPES, pH 7.4), and then the gelation solution is slightly hardened and then polymerized by gently shaking in CaCl 2 solution for 10 minutes, and then 5 times volume of 0.15 M NaCl. Wash three times with solution. The alginate gel beads containing the cells were incubated in DMEM and the cultures were changed every two days. After incubation, the alginate gel beads were dissolved in a double volume of 50 mM EDTA, 10 mM HEPES (pH 7.4) solution for 15 minutes, and centrifuged at 400 g for 10 minutes. The cells were harvested by treatment with. As a result, when subcutaneous chondrocytes (P0, P4, and P6) were three-dimensionally cultured in alginate gel beads for 4 days, the type II collagen synthesis of chondrocytes was determined in all passages. It was confirmed that the increase in the stage, the longer the three-dimensional culture period was confirmed that more collagen synthesis occurs to prove that the re-differentiated chondrocytes are re-differentiated ( Fig. 2C ).
<실시예 2> ERK 활성의 저해에 의한 연골세포로의 분화촉진Example 2 Promoting Differentiation into Chondrocytes by Inhibiting ERK Activity
본 발명자들은 ERK 활성의 저해가 연골세포로의 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로, <1-1>항에 기술한 방법으로 간충직세포를 미세배양에 의해 연골세포로의 분화를 유도하는 과정에서 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(PD98059)을 배양액에 첨가하여 ERK의 활성억제를 유도하였다. 그 결과, 계배의 간충직 세포가 다층 세포배양으로 유지될 경우 배양 3일째부터 연골세포로의 분화가 시작되었는데, 연골세포의 분화는 웨스턴 블라팅 분석에 의해 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현을 확인함으로써 증명하였다(도 3A). 연골세포의 분화과정에서 ERK의 발현에는 차이가 없었으나 ERK의 활성은 유형 Ⅱ 콜라겐 발현과는 반대로 현저히 감소하였다(도 3A). 간충직 세포에 ERK의 상위 신호전달자인 MEK-1 및 MEK-2의 활성을 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온 (PD98059)으로 저해하였을 경우 ERK의 활성이 농도 의존적으로 감소하였고(도 3B), 이때 연골세포에서 프로테오글리칸의 합성을 알시안 블루(alcian blue) 염색으로 확인하였을 때 그 합성이 현저히 증가하였으며(도 3C) 또한 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현도 현저히 증가하였다(도 3A). 따라서 ERK의 활성 감소가 간충직 세포에서 연골세포로 분화하는데 필요하다는 것을 확인하였고, ERK 활성을 인위적으로 억제함으로써 연골세포의 분화를 촉진할 수 있다는 것을 증명하였다.The inventors confirmed the effect of inhibition of ERK activity on differentiation into chondrocytes. Specifically, 2- (2-amino-3-methoxyphenol) -4H-1-benzo in the process of inducing differentiation of chondrocytes into chondrocytes by microculturing by the method described in < 1-1 >. Pyran-4-one (PD98059) was added to the culture to induce the inhibition of ERK activity. As a result, when hepatic mesenchymal cells were maintained in multi-layered cell culture, differentiation into chondrocytes began on the third day of culture, and the differentiation of chondrocytes was confirmed by confirming the expression of type II collagen by Western blotting analysis ( 3A ). There was no difference in ERK expression during chondrocyte differentiation, but ERK activity was markedly decreased in contrast to type II collagen expression ( FIG. 3A ). Inhibition of the activity of MEK-1 and MEK-2, which are high-order signalers of ERK, to mesenchymal cells by 2- (2-amino-3-methoxyphenol) -4H-1-benzopyran-4-one (PD98059) ERK activity decreased concentration dependently ( FIG. 3B ), and the synthesis of proteoglycans in chondrocytes was markedly increased by alcian blue staining ( FIG. 3C ) and also the expression of type II collagen. Also increased significantly ( FIG. 3A ). Therefore, it was confirmed that the reduction of the activity of ERK is necessary for differentiation from mesenchymal cells to chondrocytes, and proved that the differentiation of chondrocytes can be promoted by artificially inhibiting ERK activity.
<실시예 3> ERK의 활성화에 의한 연골세포의 탈분화Example 3 Dedifferentiation of Chondrocytes by Activation of ERK
<3-1> ERK 활성화와 연골세포의 탈분화<3-1> ERK Activation and Chondrocyte Dedifferentiation
ERK의 활성이 계대배양에 의한 연골세포 증식과정에서의 탈분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 토끼 관절의 연골세포를 5 x 104세포/cm2의 밀도로 배양접시에서 배양하였다. 세포들은 2일째에 증식하기 시작하였으며 5일째에 포화상태에 도달되어 이 단계의 세포를 P0로 규정하였다. 이 시기의 세포들은 둥글고 다각형인 전형적인 연골세포의 형태를 유지하였으나 P6까지의 연속적인 분주를 통해 납작하고 섬유아세포 같은 형태로 탈분화 되었다(도 2B). 웨스턴 블라팅과 노던 블라팅으로 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현을 분석한 결과 그 발현정도는 P0에서 가장 높았고, P1에서 감소하기 시작하였으며, P3 이후에는 거의 나타나지 않았다(도 4A). 한편 ERK의 활성도는 P0에서 매우 낮았으나, 연이은 단층 계대배양에 의해 ERK의 활성은 현저히 증가하였으며 이는 ERK의 발현과는 관련이 없었다(도 4A). 따라서 ERK의 활성은 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현과 반비례한다는 것을 알 수 있었고 이는 탈분화 과정에서 ERK 활성이 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.To investigate the effect of ERK activity on the differentiation of chondrocyte proliferation by subculture, chondrocytes of rabbit joints were cultured in a culture dish at a density of 5 × 10 4 cells / cm 2 . Cells began to proliferate on day 2 and reached saturation on day 5 to define cells at this stage as P0. At this time, the cells maintained the morphology of round and polygonal typical chondrocytes, but were flattened and dedifferentiated into a fibroblast-like form through continuous dispensing up to P6 ( FIG. 2B ). The expression of type II collagen was analyzed by Western blotting and Northern blotting. The expression level was the highest at P0, started to decrease at P1, and hardly appeared after P3 ( FIG. 4A ). On the other hand, the activity of ERK was very low at P0, but the activity of ERK was markedly increased by successive tomographic passage, which was not related to the expression of ERK ( FIG. 4A ). Therefore, ERK activity was found to be inversely related to the expression of type II collagen, which means that ERK activity plays an important role in the dedifferentiation process.
<3-2> ERK 활성 저해에 의한 탈분화 억제<3-2> De-differentiation inhibition by inhibition of ERK activity
ERK 활성과 탈분화와의 연관성을 알기 위해 계대배양 중인 세포들에 ERK 활성억제제인 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(PD98059)를 처리한 후 콜라겐 및 프로테오글리칸의 합성 정도를 조사하였다. 구체적으로, <1-2>항에 기술한 방법으로 관절연골세포를 연속적 계대배양에 의해 증식시켰고 세포배양과정의각 패시지에 20 μM의 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4- 온(PD98059)를 첨가하여 2일 동안 배양하였다. 그 결과, ERK 활성억제제의 처리에 의해 ERK의 활성이 차단됨을 확인하였으며(도 4B) 그 정도는 처리된 화합물의 농도에 의존적이었다(도 4C). ERK 활성이 저해된 P0 세포에서는 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현이 현저히 증가되었고 또한 P2 세포에서는 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현저해가 반전되는 결과를 나타내었다(도 4B). 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현과 더불어 ERK의 활성 저해는 프로테오글리칸의 합성을 증가시켰는데, 알시안 블루 염색법으로 확인한 결과 P0에서 2.6배, P2에서 6.4배 만큼 증가시켰다(도 4D). 따라서 세포증식과 동시에 일어나는 연골세포의 탈분화가 ERK의 활성저해에 의해 차단되어 유형 Ⅱ 콜라겐과 프로테오글리칸의 합성이 지속적으로 일어남을 증명하였다.To evaluate the association between ERK activity and dedifferentiation, cells passaged were treated with 2- (2-amino-3-methoxyphenol) -4H-1-benzopyran-4-one (PD98059), an inhibitor of ERK activity. Then, the degree of synthesis of collagen and proteoglycan was examined. Specifically, articular chondrocytes were proliferated by serial passage in the manner described in < 1-2 >, and 20 μM of 2- (2-amino-3-methoxyphenol) -4H was added to each passage of the cell culture process. -1-benzopyran-4-one (PD98059) was added and incubated for 2 days. As a result, it was confirmed that the activity of ERK was blocked by the treatment of ERK activity inhibitor ( FIG. 4B ) and the extent was dependent on the concentration of the treated compound ( FIG. 4C ). The expression of type II collagen was significantly increased in P0 cells inhibited by ERK activity, and the expression inhibition of type II collagen was reversed in P2 cells ( FIG. 4B ). Inhibition of ERK activity in combination with the expression of type II collagen increased the synthesis of proteoglycans, which was confirmed by Alsian blue staining, 2.6-fold at P0 and 6.4-fold at P2 ( FIG. 4D ). Therefore, it was demonstrated that dedifferentiation of chondrocytes occurring simultaneously with cell proliferation was blocked by the inhibition of ERK activity, resulting in the continuous synthesis of type II collagen and proteoglycans.
<3-3> 탈분화 과정에서 ERK 발현과 분포<3-3> ERK Expression and Distribution during Dedifferentiation
탈분화 과정에서 ERK의 역할을 상세히 규명하기 위하여 면역염색을 수행하였다. 구체적으로, 패시지 0 및 2의 관절연골세포에 20 μM의 ERK 활성억제제인 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(PD98059)을 첨가하여 2일 동안 배양하고, 세포를 3% 파라포말알데히드 (paraformaldehyde)로 10분간 고정하고, 0.2% 트리톤 X-100(Triton X-100)으로 세포막의 일부를 파괴한 다음, 항-유형Ⅱ 콜라겐 항체 (10 μg/ml)를 첨가하여 1시간 배양하였다. 이들 세포에 형광물질인 TRITC가 첨부된 2차항체를 첨가하여 1시간 배양한 후 형광현미경으로 유형Ⅱ 콜라겐의 분포를 확인하였다.Immunostaining was performed to elucidate the role of ERK in the dedifferentiation process. Specifically, 2- (2-amino-3-methoxyphenol) -4H-1-benzopyran-4-one (PD98059), which is 20 μM of ERK activity inhibitor, was added to articular chondrocytes of passages 0 and 2. Incubated for 1 day, fixed cells with 3% paraformaldehyde for 10 minutes, disrupted part of the cell membrane with 0.2% Triton X-100, followed by anti-type II collagen antibody (10 μg / ml) was added and incubated for 1 hour. The cells were incubated for 1 hour by adding a secondary antibody attached with TRITC, a fluorescent substance, and the distribution of type II collagen was confirmed by fluorescence microscopy.
그 결과, 대부분의 P0 연골세포들은 유형 Ⅱ 콜라겐을 발현하였으나 그 발현정도는 이질적이었다(도 5). ERK 활성억제제를 처리하여 ERK의 활성을 저해한 경우 유형 Ⅱ 콜라겐을 많이 발현하는 세포의 수가 현저히 증가되었다. 유형 Ⅱ 콜라겐의 존재에 의해 나타나는 형광의 정도는 대부분의 P2 세포에서 매우 많이 감소하였으며, ERK의 활성을 저해시킨 경우 유형 Ⅱ 콜라겐을 높게 발현하는 세포의 수가 현저히 증가되는 것을 확인하였다(도 5). 따라서 ERK의 활성 저해는 더 많은 세포에서, 더 많은 콜라겐 및 프로테오글리칸의 합성을 유도하여 연골조직의 유지에 기여함을 증명하였다.As a result, most P0 chondrocytes expressed type II collagen, but the expression level was heterogeneous ( FIG. 5 ). Inhibition of ERK activity by treatment with ERK inhibitors significantly increased the number of cells expressing type II collagen. The degree of fluorescence caused by the presence of type II collagen was greatly reduced in most P2 cells, and when the activity of ERK was inhibited, the number of cells expressing type II collagen was significantly increased ( FIG. 5 ). Thus, inhibition of ERK activity induces more collagen and proteoglycan synthesis in more cells, thereby contributing to the maintenance of cartilage tissue.
<실시예 4> ERK 활성 저해에 의한 재분화의 촉진Example 4 Promoting Regeneration by Inhibiting ERK Activity
탈분화된 연골세포는 알지네이트(alginate) 교화체에서 3차원적으로 배양할 경우 재분화가 유도되는데(도 2C), 이 특성을 이용하여 재분화 과정에서 ERK의 역할을 조사하였다. 구체적으로, <1-3>항에 서술한 방법과 동일하게 탈분화된 연골세포의 재분화를 유도하였고 이 과정에 ERK 활성억제제인 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(PD98059)을 첨가하여 재분화에 미치는 영향을 조사하였다.Dedifferentiated chondrocytes are re-differentiated when incubated in alginate hybridization three-dimensionally ( Fig. 2C ). Using this property, the role of ERK in re-differentiation process was investigated. Specifically, the re-differentiation of dedifferentiated chondrocytes was induced in the same manner as described in < 1-3 >, and 2- (2-amino-3-methoxyphenol) -4H-1-, which is an ERK inhibitor, was in the process. Benzopyran-4-one (PD98059) was added to investigate the effect on regeneration.
그 결과, 더 이상 유형 Ⅱ 콜라겐을 발현하지 않는 계대배양 P4의 탈분화된 세포를 3차원 배양한 경우 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현이 3차원 배양 2일째부터 나타나기 시작하였고 배양기간이 길어질수록 더 많이 발현되는 것을 확인하였다(도 6A). 단층배양중인 P4 세포에서 증가된 ERK의 활성은 3차원 배양에 의해 ERK의 발현에는 변화없이 그 활성이 P0 세포의 정도로 감소하였다(도 6A). 연골세포를 알지네이트교화체에서 3차원적으로 배양하면서 ERK 활성억제제를 처리하여 ERK의 활성을 저해하였을 경우에는 더 많은 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현이 나타났다(도 6B). 따라서 증가된 ERK의 활성이 연골세포의 탈분화를 유도하는 반면, ERK 활성의 감소는 연골세포의 재분화를 유도함을 증명하였다.As a result, in the case of three-dimensional culture of subdifferentiated cells of subculture P4, which no longer expresses type II collagen, expression of type II collagen began to appear on the second day of the three-dimensional culture, and the expression of the type II collagen was increased as the culture period was longer. It was confirmed ( FIG. 6A ). Increased ERK activity in monolayered P4 cells decreased to the level of P0 cells with no change in ERK expression by three-dimensional culture ( FIG. 6A ). When chondrocytes were cultured three-dimensionally in alginate hybridizers, the treatment of ERK inhibitors inhibited ERK activity, resulting in more type II collagen expression ( FIG. 6B ). Thus, it was demonstrated that increased ERK activity induces chondrocyte dedifferentiation, whereas decreased ERK activity leads to chondrocyte redifferentiation.
<실시예 5> PKC 의존적인 ERK 활성에 의한 연골세포 분화 조절Example 5 Control of Chondrocyte Differentiation by PKC-dependent ERK Activity
연골세포의 분화과정 중에 ERK의 활성은 감소하는 반면 PKC(protein kinase C) α의 발현은 분화가 진행될수록 증가되었다(도 7A). 따라서 ERK와 PKC α의 상관관계를 밝히기 위해 PKC α의 활성을 Go6976(Calbiochem, La Jolla, CA, USA)이나 포볼에스터인 PMA(Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를 처리하여 저해하였다. 구체적으로, <1-1>항에 서술한 방법으로 미세배양에 의해 연골세포분화를 유도하는 과정에서 배양액에 1 μM Go6976 혹은 10 nM PMA를 첨가하여 세포를 배양하였다.During the differentiation of chondrocytes, ERK activity was decreased while expression of PKC (protein kinase C) α increased as the differentiation progressed ( FIG. 7A ). Therefore, the activity of PKC α was inhibited by treatment with Go6976 (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) or PMA (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) or Pawbolester in order to elucidate the correlation between ERK and PKC α. Specifically, cells were cultured by adding 1 μM Go6976 or 10 nM PMA to the culture medium in the process of inducing chondrocyte differentiation by microculture by the method described in < 1-1 >.
그 결과 PKC의 활성저해는 ERK의 활성을 매우 증가시켰고 반대로 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현은 일어나지 않아 분화가 억제되었다(도 7B). PKCα의 발현 및 활성을 저해시킨 상태에서 ERK 활성억제제를 첨가하여 ERK의 증가된 활성을 억제한 경우 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현이 관찰되었고(도 7B) 프로테오글리칸의 합성도 역시 확인되었다(도 7C). 따라서 연골세포 분화과정에서 ERK의 활성은 PKCα에 의해 조절됨을 확인하였다.As a result, the inhibition of PKC greatly increased the activity of ERK and, on the contrary, expression of type II collagen did not occur and differentiation was inhibited ( FIG. 7B ). Expression of type II collagen was observed when the increased activity of ERK was inhibited by the addition of an ERK inhibitor in the state of inhibiting the expression and activity of PKCα ( FIG. 7B ) and the synthesis of proteoglycans was also confirmed ( FIG. 7C ). Therefore, it was confirmed that ERK activity is regulated by PKCα during chondrocyte differentiation.
<실시예 6> PKC 비의존적인 ERK 활성에 의한 연골세포의 탈분화 및 재분화 조절Example 6 Control of De-differentiation and Re-differentiation of Chondrocytes by PKC-Independent ERK Activity
P0 단계의 연골세포에 GF109203X와 PMA를 처리하여 PKC의 활성 및 발현저해를 유도하면 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현이 농도 의존적으로 감소하였으나 ERK의 활성에는 변화가 없었다(도 8A). 또한 P0 및 P2 세포에서 ERK 활성의 저해에 의해 콜라겐의 발현이 증가되었을 때에도 PKC α의 발현에는 큰 차이가 없었다(도 8B). 탈분화된 연골세포를 3차원 배양을 통하여 재분화를 유도하는 동안 5 uM의 GF109203 또는 10 nM의 PMA를 처리하여 PKC α의 활성을 저해시킨 경우 콜라겐의 재발현은 억제되었으나 ERK의 활성에는 큰 변화가 없었다(도 8C). 그러므로 탈분화 및 재분화에 있어서 콜라겐 발현에 대한 PKC α의 역할은 ERK 신호전달계를 경유하지 않음을 확인하였다. 또한 GF109203X와 PMA에 의해 탈분화된 세포에 ERK 활성억제제를 처리하여 ERK의 활성을 저해시키면 유형 Ⅱ 콜라겐이 재발현 되는 것을 확인하였다(도 8D). 따라서 ERK의 활성 저해는 단층 계대배양에 의한 탈분화뿐만 아니라 PKC α의 작용에 의한 탈분화도 방지할 수 있음을 증명하였다.Treatment of PKC with GF109203X and PMA induced PKC activity and expression inhibition in P0 phase, resulting in a decrease in the type II collagen expression but no change in ERK activity ( FIG. 8A ). In addition, there was no significant difference in the expression of PKC α even when collagen expression was increased by inhibition of ERK activity in P0 and P2 cells ( FIG. 8B ). If de-differentiated chondrocytes were induced to re-differentiate through three-dimensional culture, treatment of 5 uM GF109203 or 10 nM PMA inhibited PKC α activity, but collagen re-expression was inhibited but there was no significant change in ERK activity. ( FIG. 8C ). Therefore, it was confirmed that the role of PKC α on collagen expression in dedifferentiation and redifferentiation was not via ERK signaling system. In addition, it was confirmed that type II collagen was re-expressed when the ERK activity inhibitor was inhibited by GF109203X and PMA to inhibit the ERK activity ( FIG. 8D ). Therefore, it was proved that inhibition of ERK activity can prevent dedifferentiation by the action of PKC α as well as dedifferentiation by monolayer passage.
아울러, 본 발명자들은 탈분화 동안 PKC α와 활성형 ERK의 발현과 분포양상을 면역염색법으로 확인하였다. 그 결과 P0 단계의 연골세포에 100 nM의 PMA를 24시간 처리하여 PKC의 발현을 저해하면 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현이 사라지는 것을 확인하였다(도 9). 이러한 조건에서 PKC α는 예상대로 PMA의 작용에 의해 발현이 나타나지 않았고 반면에 활성형 ERK의 발현과 분포에는 큰 영향이 나타나지 않았다. 10 uM의 ERK 활성억제제를 처리하여 ERK의 발현을 억제시킨 경우에는 콜라겐을 발현하는 세포수는 증가되었으나 PKC α의 염색양상에는 큰 변화가 없었다(도9).In addition, the present inventors confirmed the expression and distribution of PKC α and active ERK during dedifferentiation by immunostaining. As a result, when inhibiting the expression of PKC by treatment of the PMA 100 nM 24 hours in chondrocytes of step P0 was confirmed that the expression of collagen type Ⅱ disappears (Fig. 9). Under these conditions, PKC α did not appear to be expressed by the action of PMA as expected, whereas there was no significant effect on the expression and distribution of active ERK. When the expression of ERK was inhibited by treatment with 10 uM of ERK inhibitor, the number of cells expressing collagen was increased, but there was no significant change in staining pattern of PKC α ( FIG. 9 ).
상기의 결과로부터 확인한 연골세포의 분화, 탈분화 및 재분화 과정에 있어서 PKC α와 ERK의 역할을 요약하면도 10에 나타난 바와 같다. 즉 PKC α의 발현과 그 활성은 연골세포의 분화와 재분화를 유도하며 반대로 ERK의 활성화는 연골세포의 분화 및 재분화를 억제하고 탈분화를 유도한다. 분화과정에서 ERK의 활성은 PKC에 의해 조절을 받지만 탈분화 및 재분화에서는 PKC와 ERK가 각각 독립적으로 작용한다. 결론적으로 ERK의 활성 저해는 연골세포로 하여금 유형 Ⅱ 콜라겐과 프로테오글리칸의 발현을 촉진토록 하여 탈분화를 방지하고, 또한 탈분화된 세포에서는 연골기질분자의 합성을 촉진하여 재분화를 유도함으로써 ERK의 활성 저해는 연골세포의 퇴행을 방지함을 증명하였다.Summarizing the role of PKC α and ERK in the differentiation, dedifferentiation and redifferentiation process of chondrocytes identified from the above results are shown in FIG . 10 . In other words, the expression and activity of PKC α induces the differentiation and re-differentiation of chondrocytes, whereas the activation of ERK inhibits the differentiation and re-differentiation of chondrocytes and induces differentiation. In the differentiation process, ERK activity is regulated by PKC, but PKC and ERK act independently in dedifferentiation and redifferentiation. In conclusion, the inhibition of ERK activity may induce chondrocytes to promote the expression of type II collagen and proteoglycans to prevent de-differentiation and to induce differentiation of cartilage substrate molecules in de-differentiated cells. Proved to prevent cell degeneration.
<실시예 7> 연골세포의 증식에 의한 연골세포의 탈분화 억제 또는 연골세포의 재분화 촉진제의 스크리닝<Example 7> Screening of inhibitors of dedifferentiation of chondrocytes or regeneration of chondrocytes by proliferation of chondrocytes
ERK의 활성화는 그 상위 신호전달분자인 MEK에 의한 인산화를 필요로 한다. 따라서 ERK의 활성화 정도는 인산화형 ERK에 선택적으로 반응하는 항체를 이용하여 웨스턴 블라팅으로 확인할 수 있음을 본 발명자들은도 3B, 도 4B, 도 6, 도 7, 도 8등에서 증명하였다. 또한 활성형 ERK를 항체를 이용한 면역형광법으로 확인할수 있음을도 5와도 9에서 증명하였다.Activation of ERK requires phosphorylation by its higher signaling molecule, MEK. Therefore, the present inventors have demonstrated that the degree of activation of ERK can be confirmed by Western blotting using an antibody that selectively reacts with phosphorylated ERK in FIGS. 3B, 4B, 6, 7, 7, and the like. 5 and 9 proved that the active ERK can be confirmed by immunofluorescence using an antibody.
ERK 또는 MEK의 활성은 계대배양에 의한 연골세포의 증식과정에서 증가하며이는 탈분화를 유도하고 저해제에 의한 ERK의 활성억제는 증식과정에 수반되는 탈분화를 억제함을도 4에서 증명하였다. 따라서 ERK 또는 MEK의 활성억제제의 탐색을 통하여 세포증식과정에 수반되는 탈분화 억제제 혹은 탈분화된 세포의 재분화 촉진제를 스크리닝 할 수 있음을 증명하였다.The activity of ERK or MEK increases in the proliferation of chondrocytes by subculture, which induces dedifferentiation, and it is demonstrated in FIG. 4 that the inhibition of ERK activity by inhibitors inhibits the dedifferentiation accompanying proliferation. Therefore, it was proved that screening of ERK or MEK activity inhibitors could screen de-differentiation inhibitors or re-differentiation promoters involved in cell proliferation.
상기에서 상세히 살펴 본 바와 같이, ERK 또는 MEK의 활성이 억제되면 연골세포의 생체외에서의 증식과정에 수반되는 탈분화를 억제하고 탈분화된 세포의 재분화를 촉진함을 증명하였다. 따라서 생체외에서 대량의 연골세포를 획득할 수 있는 기술을 제공하였고, 본 발명의 연골세포의 대량획득 기술은 손상된 연골조직의 세포치료 및 조직공학에 의한 재생에 사용될 수 있음을 증명하였다. 또한 본 발명의 연골세포의 분화촉진, 연골세포의 탈분화 억제 또는 연골세포의 재분화 촉진제 및 그것의 스크리닝 방법에 따르면 연골세포의 대량제조가 가능하고, 연골세포의 분화촉진, 연골세포의 탈분화 억제 또는 연골세포의 재분화 촉진제를 효과적으로 스크리닝할 수 있다.As described in detail above, it was proved that inhibition of ERK or MEK activity inhibited dedifferentiation associated with the proliferation of chondrocytes in vitro and promotes redifferentiation of dedifferentiated cells. Therefore, the present invention provides a technique for acquiring a large amount of chondrocytes in vitro, and demonstrated that the mass acquiring technique of the chondrocytes of the present invention can be used for cell therapy and tissue engineering of damaged chondrocytes. In addition, according to the present invention, the proliferation of chondrocytes, the inhibition of dedifferentiation of chondrocytes or the re-differentiation promoter of chondrocytes, and the screening method thereof, it is possible to mass-produce chondrocytes, promote the differentiation of chondrocytes, inhibit the differentiation of chondrocytes or the The re-differentiation promoter of the cells can be screened effectively.
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Legal Events
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| J301 | Trial decision |
Free format text: TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20040716 Effective date: 20050729 |
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Free format text: APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL |
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Free format text: JUDGMENT (PATENT COURT) FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20050902 Effective date: 20060601 |