KR20020096101A - Method for detecting analyzed materials with surface plasmon resonance sensor using colloidal gold - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 콜로이달 골드를 이용하여 표면 플라즈몬 공명 센서(surface plasmon resonance sensor, SPR 센서)로 분석 물질을 검출하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로는, 본 발명은 표면 플라즈몬 공명 센서를 이용하여 분석 대상이 되는 물질(이하 분석 물질이라 한다)을 검출하는 방법에 있어서, 그 분석 물질에 콜로이달 골드를 부착시켜 센서칩 표면의 굴절율 변화를 증가시키고, 이에 따라 표면 플라즈몬 공명 각도의 변화율이 증가됨을 이용하여 보다 효과적으로 분석 물질의 존재 또는 농도를 검출하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting an analyte with a surface plasmon resonance sensor (SPR sensor) using colloidal gold. More specifically, the present invention relates to a method for detecting a substance (hereinafter referred to as an analyte) to be analyzed by using a surface plasmon resonance sensor, by attaching colloidal gold to the analyte, thereby adjusting the refractive index of the surface of the sensor chip. It relates to a method of more effectively detecting the presence or concentration of an analyte by increasing the change and thus increasing the rate of change of the surface plasmon resonance angle.
이러한 표면 플라즈몬 공명 센서는 바이오 센서의 일종으로, 최근 민감도, 특이 반응성, 각종 유형의 시료에 대한 범용적 분석 가능성 및 소형화/자동화 용이성 등 센서 특성상의 장점 때문에 항원-항체 반응을 토대로 한 바이오 센서에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있는데, 특히 종래 잘 알려져 있는 방사선 동위 원소 표지 없이 효소, 형광, 화학/생물발광법 등을 이용하여 항원-항체 반응을 신호 변환하는 방법 외에도 본 발명에서 사용하고 있는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance: SPR) 방식을 비롯하여 표면 플라즈몬 공명의 새로운 신호 변형 형태인 공명 거울 방식(resonant mirror: RM), 그리고 광감지 전위차 센서(LAPS: Light Addressable Potentiometric Sensor) 등을 응용한 바이오 센서들이 개발, 시판되고 있다.The surface plasmon resonance sensor is a kind of biosensor. Recently, the surface plasmon resonance sensor is a biosensor based on antigen-antibody response due to the advantages of sensor characteristics such as sensitivity, specific reactivity, universal analysis of various types of samples, and ease of miniaturization / automation. Research is being actively conducted, in particular, the surface plasmon resonance used in the present invention, in addition to the method for signal-converting the antigen-antibody reaction using enzymes, fluorescence, chemical / bioluminescence, and the like without the well-known radioisotope label. biosensors using surface plasmon resonance (SPR), resonant mirror (RM), a new form of surface plasmon resonance, and Light Addressable Potentiometric Sensor (LAPS) It is marketed.
먼저 종래 기술인 표면 플라즈몬 공명 센서의 원리에 대해 살펴보면 다음과 같다.First, the principle of the surface plasmon resonance sensor according to the prior art will be described.
일반적으로 굴절율이 서로 다른 두 투명한 매질의 경계면에서 높은 굴절율을 가진 매질로부터 들어오는 광의 일부는 반사되고 나머지는 굴절된다. 그러나 임의의 특정한 입사각 이상에서 모든 광은 다른 매질로 굴절되지 않은 채 도 1과 같이 전부 반사된다. 이 때 비록 모든 광은 반사되지만 소산파(envanescent wave)라고 불리는 전자기파 성분이 굴절율이 작은 매질을 향해 매우 짧은 거리만큼 파고 들어간다. 만일 두 매질 사이가 매우 얇은 금속으로 코팅되어 있고, 입사광이 편광인 동시에 단색광일 경우, 특정한 입사 각도에서 반사되는 광의 광밀도가 현저히 줄어드는 현상이 발생하는데, 이러한 현상을 표면 플라즈몬 공명이라 부른다. 그리고 이때의 입사각을 표면 플라즈몬 공명각이라 부르는데, 표면 플라즈몬 공명각은 센서칩 표면의 유전율에 비례하고 유전율은 굴절율에 비례한다. 그런데 물의 굴절율은 1.33이고 단백질의 굴절율은 1.51이므로 센서칩의 표면에 단백질이 많이 결합할수록 표면 플라즈몬 공명각의 변화가 커짐을 알 수 있다.Generally, at the interface of two transparent media with different refractive indices, some of the light coming from the medium with the high refractive index is reflected and the others are refracted. However, above any particular angle of incidence all light is totally reflected as shown in FIG. 1 without refracting into other media. Although all light is reflected at this point, an electromagnetic wave called an evanescent wave penetrates into the medium with a small index of refraction for a very short distance. If the two media are coated with a very thin metal and the incident light is both polarized and monochromatic, then the light density of the light reflected at a particular angle of incidence decreases significantly, which is called surface plasmon resonance. The incident angle is called a surface plasmon resonance angle. The surface plasmon resonance angle is proportional to the dielectric constant of the sensor chip surface and the dielectric constant is proportional to the refractive index. However, since the refractive index of water is 1.33 and the refractive index of protein is 1.51, the more the protein is bound to the surface of the sensor chip, the greater the change in the surface plasmon resonance angle.
따라서 표면 플라즈몬 공명 센서는 센서칩 표면상에 고정된 항원 또는 리간드 등에 분석 물질을 결합시키면 질량의 변화를 가져와 표면 플라즈몬 공명 각도가 달라지는 원리를 이용하여 분석 물질을 검출하는 센서이다.Therefore, the surface plasmon resonance sensor is a sensor that detects the analyte by using a principle that changes the surface plasmon resonance angle by bringing a change in mass when the analyte is bound to an antigen or ligand fixed on the surface of the sensor chip.
이러한 원리를 이용한 표면 플라즈몬 공명 센서는 센서칩 표면의 질량 변화를 직접적으로 측정하기 때문에 항원 또는 리간드 등과 분석물질의 결합을 실시간으로 모니터링할 수 있고 분석 물질에 대한 라벨링이 불필요할 뿐만 아니라 시료 중 특정 물질의 농도 측정, 결합 상수와 해리 상수 등의 반응 속도 상수의 결정, 에피톱 맵핑(epitope mapping), 다중 결합의 결합 유형 분석, 결합체 형성에 관련된 구조상 기능 분석 등을 손쉽고 빠르게 측정할 수 있어 신호 전달 체계, 면역 반응, 분자 인식, 유전자 발현 및 조절, 단백질 공학 및 의약품 개발과 디자인 등 많은 생화학 반응의 현상 및 측정에 응용되고 있다.The surface plasmon resonance sensor using this principle directly measures mass changes on the surface of the sensor chip, so that the binding of the analyte to antigens or ligands can be monitored in real time, and the labeling of the analyte is not necessary, Signal transduction system with easy and fast measurement of concentration concentration, determination of reaction rate constants such as binding and dissociation constants, epitope mapping, analysis of binding type of multiple bonds, and structural functional analysis related to conjugate formation It is applied to the phenomenon and measurement of many biochemical reactions such as immune response, molecular recognition, gene expression and regulation, protein engineering and drug development and design.
그러나 이상과 같은 많은 장점에도 불구하고, 효소 반응에 의한 신호 증폭 효과가 있어 측정 민감도가 향상될 수 있는 효소 연계 면역고상 분석(ＥＬＩＳＡ: Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)이나 광감지 전위차 센서 등의 바이오 센서에 비하여, 표면 플라즈몬 공명 센서는 센서칩 표면의 질량 변화만을 측정하기 때문에 신호 증폭 효과를 기대할 수 없고 더욱이 분석 물질의 분자량이 작은 경우에는 민감도가 더욱 작아지는 단점 때문에 미량 성분의 측정이나 분자량이 작은 분석 물질의 측정에 이용되지 못하고 세균과 같이 크기가 ㎛대인 거대 입자의 분석에는 소산장의 제한으로 인하여 사용될 수 없는 문제점이 있다.However, in spite of many advantages as described above, it has a signal amplification effect by enzymatic reaction, and compared with biosensors such as Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) or photosensitive potentiometric sensor which can improve measurement sensitivity. However, the surface plasmon resonance sensor only measures mass changes on the surface of the sensor chip, so the signal amplification effect cannot be expected. Moreover, when the molecular weight of the analyte is small, the sensitivity becomes smaller. There is a problem that can not be used due to the limitation of the dissipation field in the analysis of large particles that are not used for the measurement and the size of the micrometer, such as bacteria.
이에 본 발명자들은, 굴절율이 큰 콜로이달 골드를 소량이라도 표면 플라즈몬 공명 센서로 측정할 분석 물질에 부착시킨다면 표면 플라즈몬 공명 각도 변화의 증가로 인하여 센서의 민감도가 향상될 것이라는 점에 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have completed the present invention by noting that even if a small amount of colloidal gold having a large refractive index is attached to an analyte to be measured by the surface plasmon resonance sensor, the sensitivity of the sensor will be improved due to the increase of the surface plasmon resonance angle change. Was done.
따라서, 본 발명의 목적은 콜로이달 골드를 분석 물질에 부착시켜 표면 플라즈몬 공명 센서의 민감도를 향상시켜 미량 성분이나 분자량이 작은 분석 물질을 검출하는 데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to improve the sensitivity of the surface plasmon resonance sensor by attaching colloidal gold to an analyte to detect analyte with a small amount or a small molecular weight.
또한 본 발명의 목적은 콜로이달 골드를 거대한 분석 물질에 부착시켜 소산장의 제한으로 표면 플라즈몬 공명 센서에서 측정이 곤란하던 크기가 큰 분석 물질을 측정하는 데 있다.In addition, an object of the present invention is to attach a colloidal gold to a large analyte to measure a large analyte, which is difficult to measure in a surface plasmon resonance sensor due to the limitation of dissipation.
도 1은 표면 플라즈몬 공명 센서의 원리를 나타낸다.1 shows the principle of a surface plasmon resonance sensor.
도 2는 표면 플라즈몬 공명 센서에서 마우스 IgG의 샌드위치 면역 분석의 원리를 나타낸다.2 shows the principle of sandwich immunoassay of mouse IgG in surface plasmon resonance sensors.
도 3은 표면 플라즈몬 공명 센서에서 콜레라 세포의 샌드위치 면역 분석의 원리를 나타낸다.3 shows the principle of sandwich immunoassay of cholera cells in a surface plasmon resonance sensor.
도 4는 CM-5 표면 플라즈몬 공명 센서칩 상에 연속적인 안티마우스 IgG의 고정에 관한 것이다.Figure 4 relates to the immobilization of continuous anti mouse IgG on CM-5 surface plasmon resonance sensor chip.
도 5는 마우스 IgG 분석에서 콜로이달 골드의 신호 증폭 효과를 나타낸다.5 shows the signal amplification effect of colloidal gold in mouse IgG analysis.
도 6은 안티마우스 IgG가 고정된 콜로이달 골드의 최적 농도 선정에 관한 것이다.Figure 6 relates to the selection of the optimal concentration of colloidal gold immobilized anti-mouse IgG.
도 7은 안티마우스 IgG가 고정된 콜로이달 골드의 최적 주입량 선정에 관한 것이다.Figure 7 relates to the selection of the optimal injection amount of colloidal gold immobilized anti-mouse IgG.
도 8은 안티마우스 IgG가 고정된 콜로이달 골드의 최적 주입 속도 선정에 관한 것이다.FIG. 8 relates to the selection of the optimal infusion rate of colloidal gold immobilized with anti-mouse IgG.
도 9은 마우스 IgG의 정량 분석에 관한 것이다.9 relates to quantitative analysis of mouse IgG.
도 10은 표면 플라즈몬 공명 센서칩 상에 콜레라 항체의 고정에 관한 것이다.10 relates to the immobilization of cholera antibodies on surface plasmon resonance sensor chips.
도 11은 콜레라 분석에서 콜로이달 골드의 신호 증폭 효과를 나타낸다.11 shows the signal amplification effect of colloidal gold in cholera analysis.
도 12는 콜레라의 정량 분석에 관한 것이다.12 relates to quantitative analysis of cholera.
도 13은 ELISA에서 콜레라 항체의 최적 농도 선정에 관한 것이다.Figure 13 relates to the selection of the optimal concentration of cholera antibody in ELISA.
도 14는 콜로이달 골드를 이용한 콜레라의 표면 플라즈몬 공명 센서 분석법과 콜레라의 ELISA법을 비교하여 나타낸다.Figure 14 shows a comparison of the surface plasmon resonance sensor analysis of cholera with colloidal gold and ELISA method of cholera.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 표면 플라즈몬 공명 센서로 분석 물질을 검출하는 방법에 있어서, (1)표면 플라즈몬 공명 센서의 센서칩을 활성화시키는 단계; (2)상기 센서칩 상에 분석 물질과 특이적으로 결합 가능한 결합 물질을 고정화시키는 단계; (3)분석 물질에 콜로이달 골드를 부착시켜 분석 물질-콜로이달 골드 결합체를 제조하는 단계; (4)상기 분석 물질-콜로이달 골드 결합체를 결합 물질이 고정되어 있는 센서칩 표면으로 주입시키는 단계; (5)결합 물질과 분석 물질을 반응시키는 단계; 및 (6)표면 플라즈몬 공명 각도의 변화를 측정하는단계를 포함하여 이루어지는 콜로이달 골드를 이용한 분석 물질의 검출 방법을 제공한다.The present invention provides a method for detecting an analyte with a surface plasmon resonance sensor in order to achieve the above object, (1) activating the sensor chip of the surface plasmon resonance sensor; (2) immobilizing a binding material that can specifically bind to an analyte on the sensor chip; (3) attaching colloidal gold to the analyte to produce analyte-colloidal gold conjugate; (4) injecting the analyte-colloidal gold conjugate to the surface of the sensor chip to which the binding substance is fixed; (5) reacting the binding material with the analyte; And (6) provides a method for detecting analyte using colloidal gold comprising the step of measuring the change in the surface plasmon resonance angle.
구체예에서, 본 발명은 분석 물질이 항원이고 분석 물질에 대한 결합 물질이 그 항원에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 콜로이달 골드를 이용한 분석 물질의 검출 방법을 제공한다.In an embodiment, the present invention provides a method for detecting an analyte using colloidal gold, wherein the analyte is an antigen and the binding agent to the analyte is an antibody to the antigen.
좀 더 구체적으로, 분석 물질이 항원이고 분석 물질에 대한 결합 물질이 그 항원에 대한 항체인 경우, 본 발명은 (가)표면 플라즈몬 공명 센서의 센서칩을 활성화시키는 단계; (나)상기 센서칩 상에 항원과 특이적으로 결합 가능한 항체 A를 고정화시키는 단계; (다)항체 B에 콜로이달 골드를 부착시켜 항체 B-콜로이달 골드 결합체를 제조하는 단계; (라)상기 항체 B-콜로이달 골드 결합체와 항원을 항체 A가 고정되어 있는 센서칩 표면으로 주입시키는 단계; (마)상기 (라)단계의 항원과 항체를 샌드위치 면역 분석법에 의하여 반응시키는 단계; (바)표면 플라즈몬 공명 각도의 변화를 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 콜로이달 골드를 이용한 분석 물질의 검출 방법을 제공한다. 덧붙여, 본 발명은 상기 (다)단계에서 항체 B는 항원과 특이적으로 결합하면 족하고 (나)단계의 항체 A와는 동일 또는 상이한 항체인 것을 특징으로 한다.More specifically, when the analyte is an antigen and the binding agent to the analyte is an antibody to the antigen, the present invention comprises the steps of: (a) activating a sensor chip of the surface plasmon resonance sensor; (B) immobilizing antibody A which can specifically bind to antigen on the sensor chip; (C) attaching colloidal gold to antibody B to prepare antibody B-colloidal gold conjugate; (D) injecting the antibody B-colloidal gold conjugate and antigen to the surface of the sensor chip to which antibody A is immobilized; (E) reacting the antigen and the antibody of step (d) by a sandwich immunoassay; (F) It provides a method for detecting analyte using colloidal gold comprising the step of measuring the change in the surface plasmon resonance angle. In addition, the present invention is characterized in that the antibody B in step (c) is bound to specifically bind to the antigen, and is the same or different antibody as the antibody A in step (b).
또 다른 구체예에서, 본 발명은 분석 물질이 리간드이고, 분석 물질에 대한 결합 물질이 그 리간드에 대한 수용체인 것을 특징으로 하는 콜로이달 골드를 이용한 분석 물질의 검출 방법을 제공한다.In another embodiment, the present invention provides a method for detecting an analyte using colloidal gold, wherein the analyte is a ligand and the binding agent to the analyte is a receptor for the ligand.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 결합 물질이 항원 또는 리간드이고, 결합 물질에 대한 분석 물질이 각각 그 항원에 대한 항체 또는 그 리간드에 대한 수용체인 것을 특징으로 하는 콜로이달 골드를 이용한 분석 물질의 검출 방법을 제공한다.In another embodiment, the present invention provides detection of analytes using colloidal gold, wherein the binding agent is an antigen or a ligand, and the analyte for the binding agent is an antibody to the antigen or a receptor for the ligand, respectively. Provide a method.
본 발명은 상기 항원이 단백질, 세균, 또는 세포인 것을 특징으로 한다.The present invention is characterized in that the antigen is a protein, bacteria, or cells.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
표면 플라즈몬 공명 센서로 본 발명에서는 BIAcore AB사의 BIAcore X를 사용하였다. BIAcore X는 SPR을 이용하여 생물 분자간의 상호작용 분석을 수행하는 기기로서, 실제로 단백질 다중 결합 형태 연구, 구조-기능 관계 연구, 농도 측정, 특정 성분의 선별, 여러 효소 과정에 관한 연구, 속도 상수 측정 등에 관한 연구를 수행할 수 있는 대표적인 표면 플라즈몬 공명 센서이다.As the surface plasmon resonance sensor, BIAcore X from BIAcore AB was used in the present invention. BIAcore X is an instrument for analyzing the interaction between biomolecules using SPR, which is actually a study of protein multiple binding morphology, structure-function relationship study, concentration measurement, selection of specific components, studies of various enzyme processes, measurement of rate constants. It is a representative surface plasmon resonance sensor capable of performing research on the back.
콜로이달 골드는 높은 굴절율을 가진 것으로 알려져 있고 초미세 크기와 넓은 표면적으로 인해 상평형 및 반응속도론의 통상적 제한을 용이하게 극복할 수 있고 풍부한 생물학적 물질과 활성 복합체를 형성할 수 있다. 본 발명에서 사용된 콜로이달 골드의 굴절율은 4.86이며, 평균 직경은 20 ±2㎚이다.Colloidal gold is known to have a high refractive index and can easily overcome the usual limitations of phase equilibrium and kinetics due to its ultrafine size and large surface area and can form active complexes with abundant biological materials. The refractive index of colloidal gold used in the present invention is 4.86, and the average diameter is 20 ± 2 nm.
표면 플라즈몬 공명에서 측정할 수 있는 센서칩 표면의 굴절율의 범위는 1.33에서 1.40까지인데 증류수의 굴절율은 1.33이고 단백질의 굴절율은 1.51로서 그 굴절율의 차이가 0.18 밖에 되지 않음에 비하여 콜로이달 골드의 굴절율은 상기한 바와 같이 4.86으로 알려져 있으므로 콜로이달 골드를 소량이나마 표면 플라즈몬 공명 센서로 측정할 분석 물질에 부착시킨다면 표면 플라즈몬 공명 각도의 변화율이 커짐으로 인해 센서의 민감도가 향상되어 분석 물질을 검출하는데 효과적이다.The refractive index of the surface of the sensor chip, which can be measured by surface plasmon resonance, ranges from 1.33 to 1.40. The refractive index of distilled water is 1.33, the refractive index of protein is 1.51, and the refractive index difference is only 0.18. As described above, since it is known as 4.86, when a small amount of colloidal gold is attached to the analyte to be measured by the surface plasmon resonance sensor, the sensitivity of the sensor is improved due to the increased rate of change of the surface plasmon resonance angle, which is effective for detecting the analyte.
본 발명에 있어 분석 물질이란 표면 플라즈몬 공명 센서를 사용하여 검출하고자 하는 목적으로 센서 표면으로 주입시키는 물질을 의미하며 결합 물질이란 상기 센서의 센서칩 상에 고정화되어 있으면서 분석 물질과 특이적으로 결합 가능한 물질을 의미한다.In the present invention, the analyte means a material injected into the surface of the sensor for the purpose of detection using a surface plasmon resonance sensor, and the binding material is a substance that can be specifically bound to the analyte while being immobilized on the sensor chip of the sensor. Means.
분석 물질이 항원 또는 리간드인 경우 결합 물질은 각각 그 항원에 대한 항체 또는 그 리간드에 대한 수용체이며, 역으로 분석 물질이 항원에 대한 항체 또는 리간드에 대한 수용체인 경우 결합 물질은 각각 그 항원 또는 그 리간드이다. 상기 항원은 단백질, 세균, 또는 세포 등을 포괄하는 의미로 이에 따라 하기 실시예에서는 단백질의 일예로 마우스 IgG를, 그리고 세균의 일예로 콜레라를 분석 물질로 하여 본 발명을 실질적으로 구체화하고 있다. 또한 상기 수용체는 리간드와 결합 가능하여야 하며, 상기 항체는 분석 물질인 항원과 특이적으로 결합 가능한 항체로, 하기 실시예에서는 마우스 IgG의 경우 안티마우스 IgG를, 콜레라 세포의 경우에는 콜레라 항체를 각각 사용하고 있다.If the analyte is an antigen or a ligand, the binding agent is an antibody to the antigen or a receptor for the ligand, respectively. Conversely, if the analyte is an antibody or a receptor for the antigen, the binding agent is an antigen or its ligand, respectively. to be. The antigen encompasses proteins, bacteria, cells, and the like, and accordingly, the following Examples substantially embody the present invention using mouse IgG as an example of a protein and cholera as an example of a bacterium. In addition, the receptor should be capable of binding to the ligand, the antibody is an antibody capable of specifically binding to the antigen as an analyte, in the following examples, anti-mouse IgG for mouse IgG and cholera antibody for cholera cells are used, respectively. Doing.
표면 플라즈몬 공명 센서로 검출하고자 하는 분석 물질의 종류에 따라 센서칩의 처리 방법에 차이가 있다. 미량 성분이나 저분자 물질이 분석 물질인 경우에는 표면 플라즈몬 공명 센서의 센서칩 표면을 카르복시메틸 덱스트란 등으로 표면 처리하는 것이 바람직하다. 이는 센서칩 표면에 처리된 카르복시메틸 덱스트란 등이 퍼져 있는 공간에 분석 물질과 특이적으로 결합하는 결합 물질이 고정화됨으로써 단순히 센서칩 표면에 결합 물질을 고정화시키는 것에 비해 다량의 결합 물질을 고정시키는 것이 가능하고 그 결과 고정화된 결합 물질과 분석 물질이 반응할 확률을 더 높이기 때문이다.The treatment method of the sensor chip varies depending on the type of analyte to be detected by the surface plasmon resonance sensor. When a trace component or a low molecular substance is an analyte, it is preferable to surface-treat the surface of the sensor chip of a surface plasmon resonance sensor with carboxymethyl dextran. This is because the binding material that binds specifically to the analyte is immobilized in the space where the treated carboxymethyl dextran is spread on the surface of the sensor chip, so that a large amount of binding material is fixed rather than simply fixing the binding material to the surface of the sensor chip. This is possible and, as a result, increases the probability that the immobilized binding material and the analyte will react.
한편 거대 입자가 분석 물질인 경우에는 센서칩 표면을 상기 카르복시메틸 덱스트란 등으로 표면 처리하는 것은 바람직하지 못하다. 이는 표면 플라즈몬 공명 신호의 증가를 위해서는 센서 표면에서 100 nm 이내에서 결합 물질과 분석 물질이 반응하여야 하는데, 카르복시메틸 덱스트란 등이 센서칩 표면에 부착되어 있음으로써 100 nm 범위 내에서 결합 물질과 분석 물질이 반응할 확률을 떨어뜨리기 때문이다.On the other hand, when the macroparticle is an analyte, it is not preferable to surface-treat the sensor chip surface with the carboxymethyl dextran. In order to increase the surface plasmon resonance signal, the binding material and the analyte must react within 100 nm at the sensor surface, and the binding material and the analyte within 100 nm range by attaching carboxymethyl dextran to the sensor chip surface. This decreases the probability of this reaction.
콜로이달 골드를 이용하여 표면 플라즈몬 공명 센서로 분석 물질을 검출하기 위해서는 우선 센서칩 상에 분석 물질과 특이적으로 결합 가능한 결합 물질을 용이하게 고정화시킬 수 있도록 센서칩을 활성화시킨다. 그런 다음, 분석 물질과 특이적으로 결합하는 결합 물질을 완충액에 녹인 후, 이를 주입하면서 센서칩 상에 결합 물질을 고정시키고 나서 결합 물질이 고정되지 않은 활성 부위는 에탄올아민을 이용하여 비활성화시킨다.In order to detect the analyte with the surface plasmon resonance sensor using colloidal gold, first, the sensor chip is activated to easily fix the binding material that can be specifically bound to the analyte on the sensor chip. Then, the binding material that specifically binds to the analyte is dissolved in a buffer, and then the binding material is immobilized on the sensor chip while injecting it, and then the active site where the binding material is not fixed is deactivated using ethanolamine.
이와 별도로 분석 물질에 콜로이달 골드를 부착시켜 분석 물질-콜로이달 골드 결합체를 제조한다. 다음으로 상기 결합 물질이 고정되어 있는 센서칩의 베이스 라인을 안정화시키고 완충액에 녹인 분석 물질-콜로이달 골드 결합체를 주입시켜 센서칩 표면에 고정된 결합 물질과 반응시킨다. 시간에 따라 표면 플라즈몬 공명 각도의 변화를 측정하면서 분석 물질을 검출한다. 검출 후에는 HCl을 주입하여 센서칩을 재생시킨다.Separately, colloidal gold is attached to the analyte to prepare analyte-colloidal gold conjugate. Next, the base line of the sensor chip on which the binding material is fixed is stabilized, and an analyte-colloidal gold conjugate dissolved in a buffer is injected to react with the binding material fixed on the sensor chip surface. The analyte is detected while measuring the change in surface plasmon resonance angle over time. After detection, HCl is injected to regenerate the sensor chip.
구체예에서, 상기 분석 물질이 항원이고 결합 물질이 그 항원에 대한 항체인경우에 있어서는 샌드위치 면역 분석법을 응용한다. 즉 활성화된 센서칩 상에 분석 물질인 항원과 특이적으로 결합 가능한 항체 A를 고정화시킨 다음, 상기 설명한 단계 이외에 항체 B에 콜로이달 골드를 부착시켜 항체 B-콜로이달 골드 결합체를 제조하는 단계가 추가된다. 좀 더 구체적으로, 카보네이트/바이카보네이트 완충액에 녹인 항체를 콜로이달 골드 용액에 첨가하고 상온에서 반응시킨 후 미세 원심 분리기(microcentrifuge)로 원심 분리하여 상등액을 제거하고 인산 완충 식염수 (phosphate buffered saline)로 분산시킨 후 원심 분리하여 상등액을 다시 제거하고 PBS로 재분산시킨 다음 희석시켜 항체 B가 결합된 콜로이달 골드를 만들고 이 콜로이달 골드를 분석 물질인 항원에 부착시켜 항원-항체 B-콜로이달 골드 결합체를 제조하는 것이다. 다음 과정은 상기한 일반적인 경우와 동일하다. 이 때 상기 항체 B는 항원과 특이적으로 결합 가능하면 족하고 센서칩 표면에 고정화되어 있는 항체 A와는 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다.In an embodiment, the sandwich immunoassay is applied when the analyte is an antigen and the binding agent is an antibody against the antigen. In other words, the step of immobilizing antibody A that can specifically bind to the antigen as analyte on the activated sensor chip, and then attaching colloidal gold to antibody B in addition to the above-described steps to prepare the antibody B-colloidal gold conjugate do. More specifically, the antibody dissolved in carbonate / bicarbonate buffer is added to the colloidal gold solution and reacted at room temperature, followed by centrifugation with a microcentrifuge to remove the supernatant and dispersed with phosphate buffered saline. After centrifugation, the supernatant is again removed, redispersed with PBS, and then diluted to form colloidal gold with antibody B conjugated, and the colloidal gold attached to the analyte antigen to prepare an antigen-antibody B-colloidal gold conjugate. To manufacture. The following procedure is the same as in the general case described above. In this case, the antibody B may be the same as or different from the antibody A which is sufficient to specifically bind to the antigen and immobilized on the surface of the sensor chip.
하기 실시예에서 마우스 IgG와 콜레라 세포를 각각 분석 물질인 항원으로 하였을 때 실제로 수행한 실험에 기초하여 본 발명을 구체적으로 설명할 것이나, 다음 실시예는 본 발명의 예시적인 것으로서 본 발명의 보호 범위를 이에 한정하려는 의도는 아니다.In the following examples, the present invention will be described in detail based on experiments actually performed when mouse IgG and cholera cells are used as antigens as analytes, but the following examples illustrate the protection scope of the present invention as an example of the present invention. It is not intended to be limited to this.
시약 및 장치Reagents and Devices
표면 플라즈몬 공명 센서와 카르복시메틸 덱스트란 매트릭스로 변형된 CM-5 센서칩은 각각 BIAcore AB사의 BIAcore X와 CM-5를 사용하였으며 마우스 IgG, 안티마우스 IgG, 안티마우스 IgG 페록시다아제, o-페닐렌디아민, 콜로이달 골드(또는스트렙타비딘이 코팅된 콜로이달 골드)와 그 외 모든 시약은 Sigma사에서 구입하였다. N-하이드록시석신이미드(NHS), N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)와 에탄올아민은 BIAcore AB사에서 공급받았고 디니트로페놀-바이오틴-N-하이드록시석신이미드(바이오틴-NHS)은 Molecular Devices사에서 구입하였다. 그리고 콜레라 세포와 콜레라에 대한 단일 클론성 항체는 국립 보건원 세균 질환부에서 공급받았다.CM-5 sensor chip modified with surface plasmon resonance sensor and carboxymethyl dextran matrix were used with BIAcore X and CM-5 from BIAcore AB, respectively. Mouse IgG, anti mouse IgG, anti mouse IgG peroxidase, o-phenyl Rendiamine, colloidal gold (or streptavidin-coated colloidal gold) and all other reagents were purchased from Sigma. N-hydroxysuccinimide (NHS), N-ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and ethanolamine were supplied by BIAcore AB, and were obtained from dinitrophenol-biotin-N. -Hydroxysuccinimide (Biotin-NHS) was purchased from Molecular Devices. Monoclonal antibodies against cholera cells and cholera were supplied by the National Institutes of Bacterial Diseases.
실시예 1 : 센서칩 위에 안티마우스 IgG의 고정Example 1 Fixation of Anti-Mouse IgG on Sensor Chips
카르복시메틸 덱스트란으로 표면 처리된 CM-5 센서칩을 활성화하기 위하여 11.5㎎/㎖의 NHS와 75㎎/㎖의 EDC를 동량 혼합한 후 35㎕를 주입하여 CM-5 센서칩을 활성화시킨다. 활성화된 센서칩에 10mM HEPES 완충 식염수(HEPES buffered saline(pH 7.4, HBS))에 25㎍/㎖ 농도로 녹인 안티마우스 IgG를 35㎕씩 4회 주입하여 센서칩에 항체를 고정화시킨다. 항체가 고정되지 않은 활성 부위는 35㎕의 1M 에탄올 아민(pH 8.5)을 이용하여 비활성화시킨다.In order to activate the CM-5 sensor chip surface-treated with carboxymethyl dextran, 35 μl was injected after activating the same amount of 11.5 mg / ml NHS and 75 mg / ml EDC to activate the CM-5 sensor chip. The antibody was immobilized on the sensor chip by injecting 35 μl of antimouse IgG dissolved in 25 μg / ml in 10 mM HEPES buffered saline (pH 7.4, HBS) into the activated sensor chip. Active sites with no antibodies immobilized are inactivated with 35 μl of 1M ethanol amine, pH 8.5.
도 4에 나타난 센서그램을 보면 안티마우스 IgG 주입 횟수에 따른 안티마우스 IgG의 고정량의 증가를 볼 수 있다. 주입 횟수가 증가함에 따라 고정량이 증가하나 주입 횟수가 많아질수록 주입에 의한 고정량의 증가치는 감소하며, 4회 주입의 고정량 증가효과는 매우 작아서 4회까지만 안티마우스 IgG를 주입한다. 4회의 안티마우스 IgG의 주입에 의한 총 안티마우스 IgG의 고정에 의한 공명가 (resonance unit: RU)의 증가치는 12,913.4이다. 표면 플라즈몬 공명 감지 구역 (detection area)은 0.224㎟(1.4㎜×0.16㎜)이고 1000RU의 증가는 보통 단백질1ng/㎟의 증가로 알려져 있으므로 안티마우스 IgG의 표면 플라즈몬 공명 감지 구역내의 총 고정량은 2.89ng(12,913.4RU×0.224㎟×1ng/㎟ㆍ1000RU)이다.Looking at the sensorgram shown in Figure 4 it can be seen that the fixed amount of anti-mouse IgG according to the number of anti-mouse IgG injection. As the number of injections increases, the fixed amount increases, but as the number of injections increases, the fixed amount increase by the injection decreases, and the effect of increasing the fixed amount of the four injections is very small, so that only four injections of anti mouse IgG are injected. The increase in resonance unit (RU) due to fixation of total antimouse IgG by 4 injections of antimouse IgG is 12,913.4. Since the surface plasmon resonance detection area is 0.224 mm2 (1.4 mm x 0.16 mm) and the increase of 1000 RU is commonly known as an increase of 1 ng / mm2 of protein, the total fixed amount in the surface plasmon resonance detection area of anti mouse IgG is 2.89 ng. (12,913.4 RU × 0.224 mm 2 × 1 ng / mm 2 · 1000 RU).
실시예 2 : 콜로이달 골드 입자와 안티마우스 IgG의 결합Example 2 Binding of Colloidal Gold Particles with Anti-Mouse IgG
콜로이달 골드의 평균직경은 20 ±2㎚이고 콜로이달 골드 용액의 농도는 ㎖당 4.6×1011/㎖이다. 1㎖ 콜로이달 골드 용액에 카보네이트/바이카보네이트 완충액(25mM, pH 9.0)에 25㎍/㎖농도로 녹인 안티마우스 IgG용액을 첨가하고 상온에서 부드럽게 흔들면서 2시간동안 반응시킨 후 탄산카보네이트/바이카보네이트 완충액(25mM, pH 9.0)에 녹인 1% BSA 용액 0.25㎖를 첨가한 후 상온에서 2시간 동안 더 반응시킨다. 4℃에서 미세 원심 분리기(microcentrifuge)를 이용하여 20분 동안 15,000rpm으로 원심 분리한 후 상등액을 제거하고 10mM 인산 완충 식염수(pH 7.4, PBS)으로 분산시킨 후 원심 분리하여 상등액을 다시 제거하고 PBS로 재분산한 후 520㎚에서의 흡광도가 1.9가 되도록 희석시킨다.The average diameter of colloidal gold is 20 ± 2 nm and the concentration of colloidal gold solution is 4.6 × 10 11 / ml per ml. To the 1 ml colloidal gold solution was added an anti-mouse IgG solution dissolved in carbonate / bicarbonate buffer (25 mM, pH 9.0) at 25 μg / ml and reacted gently at room temperature for 2 hours, followed by carbonate / bicarbonate buffer. (25 mM, pH 9.0) was added to 0.25 ml of a 1% BSA solution dissolved in the reaction at room temperature for 2 hours. After centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes using a microcentrifuge at 4 ℃, the supernatant was removed, dispersed in 10 mM phosphate buffered saline (pH 7.4, PBS) and centrifuged to remove the supernatant again and the PBS After redispersion, the absorbance at 520 nm is diluted to 1.9.
실시예 3 : 안티마우스 IgG가 결합된 콜로이달 골드의 최적조건Example 3 Optimal Condition of Colloidal Gold with Anti-Mouse IgG
안티마우스 IgG와 콜로이달 골드 입자간의 최적 비율 결정Determination of the optimal ratio between anti mouse IgG and colloidal gold particles
콜로이달 골드에 안티마우스 IgG를 고정화시키는 데 있어 안티마우스 IgG와 콜로이달 골드간의 최적 반응비율을 측정하기 위하여 콜로이달 골드 입자 하나당 안티마우스 IgG를 각각 50, 100, 200개 반응시킨다. 즉, 1㎖ 콜로이달 골드 용액에 카보네이트/바이카보네이트 완충액(25mM, pH 9.0)로 0.25㎎/㎖ 농도로 녹인 안티마우스 IgG 용액을 각각 15.2㎕, 30.4㎕, 60.8㎕ 첨가하고 반응시켜 분리 세척한 후PBS로 재분산하여 520㎚에서의 흡광도가 1.9가 되도록 희석시킨다.In order to determine the optimal reaction ratio between anti-mouse IgG and colloidal gold in immobilizing anti-mouse IgG in colloidal gold, 50, 100, and 200 anti-mouse IgGs are reacted per colloidal gold particle, respectively. That is, 15.2 μl, 30.4 μl, and 60.8 μl of antimouse IgG solution dissolved in 0.25 mg / ml in carbonate / bicarbonate buffer (25 mM, pH 9.0) were added to 1 ml colloidal gold solution, followed by reaction and washing. Redispersed in PBS and diluted so that the absorbance at 520 nm is 1.9.
비율별로 제조된 안티마우스 IgG가 결합된 콜로이달 골드를 평가하기 위하여 안티마우스 IgG가 고정된 센서칩에 20㎕/min의 유속으로 PBS(pH 7.4)에 25㎍/㎖ 농도로 녹인 마우스 IgG를 80㎕ 주입한 후 비율별로 제조된 안티마우스 IgG가 결합된 콜로이달 골드 40㎕를 주입하면서 표면 플라즈몬 공명 각도의 변화를 측정한다. 도 5는 안티마우스 IgG와 콜로이달 골드의 비율이 100:1인 시료를 80㎕ 주입할 때의 센서그램이다. 마우스 IgG만 결합될 때보다 안티마우스 IgG가 결합된 콜로이달 골드를 주입할 때 표면 플라즈몬 공명 각도의 변화가 10배 정도 증가됨을 알 수 있다. 마우스 IgG만 결합될 때의 표면 플라즈몬 공명 각도 변화량과 비교하여 안티마우스 IgG와 콜로이달 골드의 비율이 50:1, 100:1, 200:1인 시료를 각각 80㎕ 주입할 때 안티마우스 IgG와 콜로이달 골드의 결합에 의한 표면 플라즈몬 공명 각도 변화량의 증가배수를 2회 측정한다. 비율이 50:1인 경우보다 100:1인 경우가 40%정도 표면 플라즈몬 공명 각도 변화량의 증가가 있으며 비율이 200:1인 경우는 오히려 100:1인 경우보다도 표면 플라즈몬 공명 각도 변화량의 증가가 작다. 이는 안티마우스 IgG와 콜로이달 골드의 비율이 100:1 이상에서는 콜로이달 골드 표면이 포화되어 더 이상 안티마우스 IgG가 결합될 수 없음을 나타내므로 이후의 실험에서는 안티마우스 IgG와 콜로이달 골드의 비율이 100:1인 결합체만을 사용한다. 측정 후에는 0.1M HCl 10㎕을 주입하여 센서칩을 재생시킨다.In order to evaluate the anti-colloidal gold conjugated anti-mouse IgG prepared by ratio, mouse IgG dissolved in PBS (pH 7.4) at a concentration of 25 μg / ml at a flow rate of 20 μl / min on an anti-mouse IgG-fixed sensor chip was 80 After injection of 40 μl, a change of the surface plasmon resonance angle is measured while injecting 40 μl of anti-mouse IgG-coated colloidal gold. 5 is a sensorgram when 80 µl of a sample having an anti-mouse IgG and colloidal gold ratio of 100: 1 is injected. It can be seen that the change of the surface plasmon resonance angle is increased by 10 times when injecting colloidal gold with anti-mouse IgG binding than when only mouse IgG is binding. Antimicrobial IgG and Colo were injected when 80 μl of the sample of 50: 1, 100: 1, and 200: 1 antimouse IgG and colloidal gold was compared with the surface plasmon resonance angle change when only mouse IgG was bound. The increase fold of the surface plasmon resonance angle change due to the binding of gold this month is measured twice. The ratio of surface plasmon resonance angle change is increased by 40% in 100: 1 than the ratio of 50: 1, and the increase in surface plasmon resonance angle is smaller than in case of 200: 1. . This indicates that when the ratio of antimouse IgG to colloidal gold is 100: 1 or higher, the surface of the colloidal gold is saturated so that the antimouse IgG can no longer be bound. Only conjugates of 100: 1 are used. After the measurement, 10µl of 0.1M HCl is injected to regenerate the sensor chip.
안티마우스 IgG가 결합된 콜로이달 골드의 최적 농도 결정Determination of Optimal Concentration of Colloidal Gold with Anti-Mouse IgG
콜로이달 골드의 최적 반응 농도를 측정하기 위하여 25㎍/㎕ 농도의 마우스IgG를 80㎕ 주입한 후 농도별로 조제된 안티마우스 IgG가 결합된 콜로이달 골드를 40㎕ 주입하면서 표면 플라즈몬 공명각도의 변화를 측정한 결과가 도 6에 나타나 있다. 콜로이달 골드는 520nm에서의 흡광도가 각각 0.48, 0.95, 1.9가 되도록 조제하며 이때 ㎖당 콜로이달 골드 입자의 수는 각각 2.43×1011, 4.85×1011, 9.7×1011개이다.In order to determine the optimal reaction concentration of colloidal gold, 80 μl of 25 μg / μl mouse IgG was injected and 40 μl of anti-mouse IgG-coated colloidal gold was injected to change the surface plasmon resonance angle. The measured result is shown in FIG. The colloidal gold is prepared so that the absorbance at 520 nm is 0.48, 0.95, and 1.9, respectively, and the number of colloidal gold particles per ml is 2.43 × 10 11 , 4.85 × 10 11 , and 9.7 × 10 11, respectively .
콜로이달 골드의 농도 증가에 따라 표면 플라즈몬 공명 신호가 직선적으로 증가한다. 따라서 이후의 실험에서는 안티마우스 IgG가 결합된 콜로이달 골드의 농도를 9.7×1011로 고정시킨다.As the concentration of colloidal gold increases, the surface plasmon resonance signal increases linearly. Therefore, in the following experiment, the concentration of anti-mouse-bound colloidal gold is fixed at 9.7 × 10 11 .
안티마우스 IgG가 결합된 콜로이달 골드의 최적 주입량 결정Determination of Optimal Dose of Colloidal Gold Containing Anti-Mouse IgG
콜로이달 골드의 최적 주입량을 측정하기 위하여 25㎍/㎖ 농도의 마우스 IgG를 80㎕ 주입한 후 안티마우스 IgG가 결합된 콜로이달 골드를 주입량을 증가시키면서 표면 플라즈몬 공명 각도의 변화를 측정한 결과가 도 7에 나타나 있다. 콜로이달 골드의 주입량 증가에 따라 표면 플라즈몬 공명 신호가 직선적으로 증가하나 증가량은 직선적이지 않고 포화되는 현상을 보인다. 시료와 측정 시간의 절약을 위하여 이후의 실험에서는 안티마우스 IgG가 결합된 콜로이달 골드의 주입량을 80㎕로 고정시킨다.In order to measure the optimal injection amount of colloidal gold, 80 µl of 25 μg / ml mouse IgG was injected, and the change of the surface plasmon resonance angle was measured while increasing the injection amount of the colloidal gold conjugated with anti mouse IgG. It is shown in 7. As the injection amount of colloidal gold increases, the surface plasmon resonance signal increases linearly, but the increase is not linear but saturated. In order to save the sample and measurement time, the amount of colloidal gold to which anti-mouse IgG is bound is fixed to 80 µl in subsequent experiments.
안티마우스 IgG가 결합된 콜로이달 골드의 최적 주입 속도 결정Determination of the Optimal Injection Rate of Colloidal Gold with Anti-Mouse IgG
콜로이달 골드의 최적 주입유속을 측정하기 위하여 25㎍/㎖농도의 마우스 IgG를 80㎕ 주입한 후 안티마우스 IgG가 결합된 콜로이달 골드를 주입 유속을 달리하면서 표면 플라즈몬 공명 각도의 변화를 측정한 결과가 도 8에 나타나 있다.In order to measure the optimal injection velocity of colloidal gold, 80 µl of 25 µg / ml mouse IgG was injected, and then the change of the surface plasmon resonance angle was measured by varying the injection velocity of the colloidal gold conjugated with anti-mouse IgG. Is shown in FIG. 8.
콜로이달 골드의 주입유속 증가에 따라 표면 플라즈몬 공명 신호가 감소하나 감소량은 직선적이지 않다. 이는 주입유속이 작아질수록 콜로이달 골드의 센서칩 내에 머무는 시간이 증가하기 때문이다. 이러한 현상은 마우스 IgG의 주입시에도 나타날 것이다. 본 실험의 목적은 콜로이달 골드를 사용하였을 때 표면 플라즈몬 공명 신호증폭에 의한 표면 플라즈몬 공명 센서의 민감도 증가이므로 콜로이달 골드를 사용하지 않을 때와 사용할 때의 민감도 비교를 위하여 콜로이달 골드의 주입 유속을 마우스 IgG의 주입속도와 같은 20㎕/min으로 고정시킨다.As the injection velocity of colloidal gold increases, the surface plasmon resonance signal decreases, but the decrease is not linear. This is because the smaller the injection flow rate, the longer the residence time in the sensor chip of colloidal gold. This phenomenon will also appear upon injection of mouse IgG. The purpose of this experiment is to increase the sensitivity of the surface plasmon resonance sensor due to the surface plasmon resonance signal amplification when colloidal gold is used. Therefore, in order to compare the sensitivity of the colloidal gold with and without using the colloidal gold, Fix at 20 μl / min, equal to the rate of infusion of mouse IgG.
실시예 4 : 마우스 IgG 정량 분석Example 4 Mouse IgG Quantitation
마우스 IgG가 고정된 센서칩에 20㎕/min의 유속으로 러닝 완충액인 HBS(pH 7.4)를 흘려 보내주어 베이스 라인을 안정화시키고 PBS(pH 7.4)에 25㎍/㎖ 농도로 녹인 마우스 IgG를 80㎕ 주입하여 센서칩에 고정된 안티마우스 IgG에 결합시킨다. 여기에 안티마우스 IgG가 결합된 콜로이달 골드 용액 80㎕를 주입하여 콜로이달 골드가 센서칩 표면에 마우스 IgG와 안티마우스 IgG 브릿지(bridge)를 통하여 부착되도록 하면서 시간에 따른 표면 플라즈몬 공명 각도의 변화를 측정한다. 측정 후에는 10㎕의 0.1M HCl을 주입하여 센서칩을 재생시킨다.Stabilize the baseline by flowing a running buffer, HBS (pH 7.4), at a flow rate of 20 μl / min to the mouse chip immobilized with 80 μl of mouse IgG dissolved in 25 μg / ml in PBS (pH 7.4). Inject and bind to the anti-mouse IgG immobilized on the sensor chip. 80 μl of an anti-mouse IgG-bound colloidal gold solution was injected to allow the colloidal gold to adhere to the surface of the sensor chip through the mouse IgG and anti-mouse IgG bridges. Measure After the measurement, 10µl of 0.1M HCl is injected to regenerate the sensor chip.
비교예 1 : 직접 면역 분석 방법과의 비교Comparative Example 1: Comparison with direct immunoassay method
직접 면역 분석 방법과 콜로이달 골드를 이용한 샌드위치 면역 분석법의 탐지 양상과 최저 하한 농도가 도 9에 나타나 있다. 마우스 IgG의 농도가 증가할수록 표면 플라즈몬 공명 신호가 증가하며 콜로이달 골드를 사용할 때 정량 곡선이 2차수 정도 낮은 농도로 이동하는 것을 알 수 있다. 즉 표면 플라즈몬 공명 센서의 민감도가 100배 이상 향상되며 콜로이달 골드를 이용할 때 탐지 한계는 10ng/㎖ 정도로, 동일한 항원과 항체를 이용한 ELISA의 탐지 한계가 390ng/㎖인 실험 결과와 비교하면 오히려 ELISA보다도 민감도가 우수함을 알 수 있다.The detection pattern and the lowest concentration of the direct immunoassay method and the sandwich immunoassay using colloidal gold are shown in FIG. 9. As the concentration of mouse IgG increases, the surface plasmon resonance signal increases, and when the colloidal gold is used, the quantitative curve shifts to a low order of magnitude. In other words, the sensitivity of the surface plasmon resonance sensor is more than 100 times higher and the detection limit using colloidal gold is about 10 ng / ml, which is higher than that of the ELISA using the same antigen and antibody as the detection limit of 390 ng / ml. It can be seen that the sensitivity is excellent.
실시예 5 : 콜레라 단일 클론성 항체의 표지Example 5 Labeling of Cholera Monoclonal Antibodies
10mM PBS에 0.3㎎/㎖ 농도로 녹인 콜레라 단일 클론성 항체 1㎖에 단백질과 바이오틴-NHS의 몰비가 1:20이 되도록 무수 디메틸포름아미드(anhydrous dimethyl- formamide)에 5㎎/㎖ 농도로 녹인 바이오틴-NHS를 6.49㎕ 첨가하여 2시간 동안 반응시킨다. 반응이 끝난 후 탈염 칼럼(desalting column)을 이용하여 반응하지 않은 바이오틴-NHS를 제거하고 표지된 항체를 PBS로 용출하여 분리시킨다.Biotin dissolved in anhydrous dimethyl-formamide at a concentration of 5 mg / ml in 1 ml of cholera monoclonal antibody dissolved in 0.3 mM / ml in 10 mM PBS so that the molar ratio of protein and biotin-NHS is 1:20. 6.49 [mu] l of NHS is added and reacted for 2 hours. After the reaction was completed, a desalting column was used to remove unreacted biotin-NHS, and the labeled antibody was separated by eluting with PBS.
실시예 6 : 센서칩 위에 콜레라 항체의 고정Example 6 Fixation of Cholera Antibodies on a Sensor Chip
유속은 1㎕/min, 온도는 25℃로 고정시킨다. NHS로 활성화된 센서칩에 10mM HEPES 완충 식염수(HEPES buffered saline(pH 7.4, HBS))에 1㎎/㎖ 농도로 녹인 콜레라 항체를 80㎕ 주입하여 센서칩에 항체를 고정시킨다. 항체가 고정되지 않은 활성 부위는 20㎕ 1M 에탄올아민(pH 8.5)을 이용하여 비활성화시킨다.The flow rate is fixed at 1 μl / min and the temperature at 25 ° C. Into the NHS-activated sensor chip, 80 µl of cholera antibody dissolved at 10 mg HEPES buffered saline (HEPES buffered saline (pH 7.4, HBS)) at a concentration of 1 mg / ml was injected to fix the antibody to the sensor chip. Active sites with no antibody immobilized are inactivated with 20 μl 1 M ethanolamine (pH 8.5).
도 10은 제조한 센서칩을 이용하여 아민 커플링(amine coupling)방법에 의한 콜레라 항체의 고정 센서그램이다. 콜레라 항체의 고정에 의한 공명가의 증가치는 1011.7이다.10 is a fixed sensorgram of cholera antibody by the amine coupling method using the manufactured sensor chip. The increase in resonance value due to the immobilization of cholera antibody is 1011.7.
실시예 7 : 콜레라 정량 분석Example 7 Cholera Quantitative Analysis
HBS(pH 7.4)에 농도별로 희석한 콜레라 Roscha antigen, 50㎍/㎖의 바이오틴이 결합된 콜레라 항체 그리고 스트렙타비딘이 결합된 콜로이달 골드 현탁액 (5×1011입자/㎖)을 각각 80㎕씩 항체가 고정된 센서칩에 1㎕/min의 유속으로 주입하고 표면 플라즈몬 공명 신호를 측정한다.80 μl each of cholera Roscha antigen diluted in HBS (pH 7.4), 50 μg / ml biotin-bound cholera antibody and streptavidin-bound colloidal gold suspension (5 × 10 11 particles / ml) The antibody is immobilized on a sensor chip fixed at a flow rate of 1 μl / min and the surface plasmon resonance signal is measured.
도11은 콜레라 세포의 농도가 108cell/㎖일 때의 표면 플라즈몬 공명 센서그램이다. 콜레라의 결합에 의한 표면 플라즈몬 공명 신호의 증가치는 88이며 바이오틴이 결합된 콜레라 항체 그리고 스트렙타비딘이 결합된 콜로이달 골드의 결합에 의한 표면 플라즈몬 공명 신호의 증가치는 각각105.3과 421.7로 나타나서 단순히 콜레라만 결합시키는 것보다는 바이오틴이 결합된 콜레라 항체 그리고 스트렙타비딘이 결합된 콜로이달 골드를 결합시키는 것이 표면 플라즈몬 공명 신호를 크게 증가시킴을 알 수 있다.Fig. 11 is a surface plasmon resonance sensorgram when the concentration of cholera cells is 10 8 cells / ml. The increase in surface plasmon resonance signal due to cholera binding was 88 and the increase in surface plasmon resonance signal due to binding of biotin-bound cholera antibody and streptavidin-bound colloidal gold was 105.3 and 421.7, respectively. Rather than binding, binding of biotin-bound cholera antibodies and streptavidin-bound colloidal gold significantly increases surface plasmon resonance signals.
도 12는 콜레라 세포의 농도에 따른 표면 플라즈몬 공명 신호의 증가치를 나타낸다. 콜레라 세균만 결합된 경우보다 바이오틴이 결합된 콜레라 항체가 결합된 경우 콜레라 측정 민감도가 10배 정도 좋아지며, 스트렙타비딘이 결합된 콜로이달 골드가 결합된 경우에는 다시 100배 정도 민감도가 좋아진다. 따라서 바이오틴이 결합된 콜레라 항체와 스트렙타비딘이 결합된 콜로이달 골드를 사용하여 콜레라의 측정 민감도를 1000배 정도 향상시킬 수 있다.Figure 12 shows the increase in surface plasmon resonance signal with the concentration of cholera cells. Biotin-bound cholera antibody conjugated than cholera bacteria alone, the cholera measurement sensitivity is about 10 times better, when streptavidin-bound colloidal gold is bound is 100 times more sensitive. Therefore, biotin-bound cholera antibodies and streptavidin-coupled colloidal gold can be used to improve the sensitivities of cholera by 1000 times.
스트렙타비딘이 결합된 콜로이달 골드를 사용한 경우는 콜레라 세포의 농도가 108cell/㎖ 이상에서 그리고 바이오틴이 결합된 콜레라 항체만을 사용한 경우는콜레라 세포의 농도가 109cell/㎖ 이상에서 이들에 의한 표면 플라즈몬 공명 신호의 증가치가 없는데, 이는 콜레라의 농도가 높아질수록 센서 표면을 점유하는 콜레라의 양이 많아지기 때문이다. 즉, 표면 플라즈몬 공명 신호의 증가를 위해서는 센서 표면에의 100nm안에 결합되어야 하는데 이것은 고정된 콜레라 세포의 아래 부분에 해당된다. 그런데 고정된 콜레라의 양이 많아질수록 바이오틴이 결합된 콜레라 항체 그리고 스트렙타비딘이 결합된 콜로이달 골드가 고정된 콜레라의 아래 부분으로 접근하기가 용이하지 않기 때문이다.In case of using streptavidin-bound colloidal gold, the concentration of cholera cells was higher than 10 8 cell / ml, and in the case of using only biotin-bound cholera antibody, the concentration of cholera cells was higher than 10 9 cell / ml. There is no increase in the surface plasmon resonance signal due to the higher concentration of cholera, which increases the amount of cholera occupying the sensor surface. In other words, in order to increase the surface plasmon resonance signal, it must be bound within 100 nm of the sensor surface, which is the lower part of the fixed cholera cell. However, the higher the amount of cholera immobilized, the less likely it is to access the lower part of the cholera immobilized with biotin-bound cholera antibodies and streptavidin-bound colloidal gold.
비교예 2 : 효소 연계 면역고상 분석(ELISA)Comparative Example 2: Enzyme Linked Immunosolid Assay (ELISA)
표면 플라즈몬 공명과의 계측 특성을 상호 비교 분석하기 위하여 동일한 콜레라 세포와 항체를 ELISA로 분석한다. ELISA를 위한 최적 항체 사용 농도를 결정하기 위한 실험 결과가 도 13에 나타나 있다. 콜레라의 농도가 107cell/㎖일 때와 108cell/㎖일 때 모두 항체의 농도가 5㎍/㎖ 이상인 경우에는 492nm에서의 흡광도 증가치가 없어서 최적 항체 사용 농도는 5㎍/㎖ 으로 판단된다.The same cholera cells and antibodies are analyzed by ELISA to compare the quantitative properties with surface plasmon resonance. Experimental results for determining the optimal antibody use concentration for ELISA are shown in FIG. 13. When the concentration of cholera than 10 7 cell / ㎖ one time with 10 8 cell / ㎖ the concentration of antibody 5㎍ / ㎖ both when there is no absorbance increments at 492nm Optimal antibody concentrations are determined using a 5㎍ / ㎖ .
ELISA 플레이트에 희석한 콜레라를 100㎕씩 주입하고 5㎍/㎖ 농도의 콜레라 항체 용액 100㎕와 안티마우스 IgG-페록시디아제 결합체 1만배 희석 용액 100㎕를 차례로 반응시킨 후 발색시켜 492 nm에서의 흡광도를 측정한 결과가 도 14에 나타나 있다.100 µl of diluted cholera was injected into the ELISA plate, 100 µl of the 5 µg / ml cholera antibody solution and 100 µl of the 10,000-fold dilution of the anti-mouse IgG-peroxidase conjugate were reacted, and then developed and colorated at 492 nm. The result of measuring absorbance is shown in FIG.
콜레라 단일 클론성 항체-바이오틴 결합체와 스트렙타비딘이 코팅된 콜로이달 골드를 사용한 표면 플라즈몬 공명 센서의 결과와 ELISA의 결과를 비교해 보면콜레라 농도가 107인 경우 두 분석 방법의 신호는 대략 각 방법의 최대 신호치의 50% 정도로 서로 비슷하다. 그러나 세포 농도가 작은 경우에는 표면 플라즈몬 공명 센서가 높은 반면 세포 농도가 높은 경우에는 ELISA의 신호가 더 높게 나타난다. 이는 앞서 설명한 것처럼 표면 플라즈몬 공명 신호의 증가를 위해서는 분석 물질이 센서 표면의 100nm안에 결합되어야 하는데 고정된 콜레라의 양이 많아질수록 안티콜레라 단일 클론성 항체-바이오틴 결합체와 스트렙타비딘이 코팅된 콜로이달 골드가 고정된 콜레라의 아래 부분으로 접근하기가 용이하지 않기 때문에 콜레라 세포 농도가 높은 경우에는 표면 플라즈몬 공명 센서보다 ELISA의 신호치가 높게 나온 것이다. 따라서 민감도의 관점에서 본다면 표면 플라즈몬 공명 센서가 낮은 콜레라 농도에서 10배 정도 더 민감하다.Cholerae monoclonal antibody - A comparison of the results of the result and the ELISA of the surface plasmon resonance sensor using the colloidal gold biotin conjugate and streptavidin-coated if the cholera concentration of 10 7 signal of the two analytical methods is a substantially each method 50% of the maximum signal is similar. However, at low cell concentrations, the surface plasmon resonance sensor is high, whereas at high cell concentrations, ELISA signals are higher. As described above, in order to increase the surface plasmon resonance signal, the analyte must be bound within 100 nm of the sensor surface. As the amount of fixed cholera increases, the anticholera monoclonal antibody-biotin conjugate and streptavidin-coated colloidal Because gold is less accessible to the lower part of the immobilized cholera, high cholera cell concentrations result in higher ELISA signal than surface plasmon resonance sensors. Therefore, in terms of sensitivity, the surface plasmon resonance sensor is 10 times more sensitive at low cholera concentrations.
ELISA의 각 웰의 내경은 7㎜이고 사용한 반응 용액의 양이 100㎖이므로 실제 반응에 사용된 각 웰의 표면적은 95.6㎟이다. 그러나 표면 플라즈몬 공명 센서의 실제 감지 구역은 0.224㎟이므로 ELISA에 비하여 불과 1/426이지만, 탐지 한계가 10배 정도 낮기 때문에 표면 플라즈몬 공명 센서를 면역 센서로 사용하는 것이 가능한 것이다.The inner diameter of each well of the ELISA was 7 mm and the amount of the reaction solution used was 100 ml, so the surface area of each well used for the actual reaction was 95.6 mm 2. However, the actual detection area of the surface plasmon resonance sensor is 0.224 mm2, which is only 1/426 compared to the ELISA. However, since the detection limit is about 10 times lower, the surface plasmon resonance sensor can be used as an immune sensor.
본 발명은 굴절율이 큰 콜로이달 골드를 분석 물질에 부착시켜 분석 물질의 굴절율의 변화폭을 증가시키고 그 결과, 표면 플라즈몬 공명 각도의 변화율 또한 증폭시켜 표면 플라즈몬 공명 센서의 민감도를 향상시킴으로써 표면 플라즈몬 공명센서로 분석 물질을 검출하는 방법에 있어서, 측정 가능한 분석 물질의 범위를 미량 물질이나 저분자 물질뿐만 아니라 세균과 같이 큰 분석 물질로 확장시킬 수 있으므로 결과적으로 표면 플라즈몬 공명 센서의 응용성을 향상시킨 것이다.The present invention provides a surface plasmon resonance sensor by attaching colloidal gold having a high refractive index to an analyte to increase the variation of the refractive index of the analyte, thereby amplifying the rate of change of the surface plasmon resonance angle, thereby improving the sensitivity of the surface plasmon resonance sensor. In the method for detecting analytes, the range of measurable analytes can be extended to large analytes such as microorganisms as well as trace substances and low molecular weight substances, thereby improving the applicability of surface plasmon resonance sensors.
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