KR20020095793A - Coding method for identification of rice cultivars - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 다양한 농작물에 대한 품종판별을 위한 코드화 방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 작물의 품종을 판별하고 용이하게 구분 및 확인할 수 있도록 각 품종별로 고유코드번호를 부여하는 코드화 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a coding method for discriminating a variety of crops, and more particularly, to a coding method for assigning a unique code number for each variety so as to discriminate and identify the variety of the crop easily.
이에 본 발명의 품종판별을 위한 코드화방법은 선택된 마커에 대한 PCR 반응이 끝난 PCR 증폭산물을 4% 아크릴아마이드 겔에서 전기영동을 실시한 후 은염색 (silver staining)으로 염색하여 상기 PCR 증폭산물을 확인하고 결과에 따른 밴드유형에 따라 분류하여 코드번호를 부여하는 것을 특징으로 한다.In the coding method for discriminating the variety of the present invention, the PCR amplification products for the selected markers were subjected to electrophoresis on 4% acrylamide gel, and then stained with silver staining to identify the PCR amplification products. It is characterized by assigning a code number according to the band type according to the result.
당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 농작물중의 하나인 벼는 밀 다음으로 세계 제2의 식량작물이며 세계 인구의 절반 이상이 쌀을 주식으로 하고 있는 작물로서 아시아에서 90%이상 생산되고 대부분이 아시아에서 소비되고 있다. 한국도 다른 아시아 국가들과 같이 쌀을 주식으로 하고 있으며 또한 해마다 5∼6 품종씩 신품종이 육성, 보급되고 있으나 국내에 보급되고 있는 품종들은 대부분이 특정 품종(아끼바레, 추청벼)으로 소개되고 있어 국내 소비자의 대부분은 이들 품종에 대한 확인이 불가능한 실정이다. 또한 수출입 개방에 따라 일부 유통업자들은 수입 쌀을 국내산으로 또는 국내산에 수입 쌀을 혼합하여 공급하고 있으며 이러한 불법 유통을 방지하기 위하여 정부에서는 원산지 표기를 제도화하고 있으나 실제 원산지 허위 표기의 적발에는 유통경로의 추적 및 원산지 확인 등의 복잡한 절차를 거쳐야 하는 등 매우 어려움을 겪고 있는 실정이다. 더구나 최근 일부 농촌지역에서 발생하는 수확물의 도난사건 등 벼 품종과 관련된 고소, 고발 사건에 대한 보다 과학적인 수사기법이 필요한 실정이므로 국내에서 육성되어 재배되고 있는 벼 품종들을 신속하고 간편하게 판별할 수 있는 방법이나 기술의 확립이 절실하다고 하겠다.As is well known to those skilled in the art, rice, one of the crops, is the world's second-largest food crop after wheat, with more than half of the world's population being rice-based, producing more than 90% in Asia, most of which is consumed in Asia. It is becoming. Korea, like other Asian countries, uses rice as its staple food, and new varieties are being cultivated and distributed each year, with 5-6 varieties, but most of the varieties spread in Korea are introduced as specific varieties (Akibare, Chucheong rice). Most of them cannot be identified for these varieties. In addition, with the opening and export of imports and exports, some distributors supply imported rice either domestically or in a mixture of domestically imported rice.In order to prevent such illegal distribution, the government institutionalizes the country of origin labeling, but in reality, the distribution channel is The situation is very difficult, such as going through a complex process such as tracking and country of origin verification. In addition, more scientific investigation techniques are required for the accusation and accusation cases related to rice varieties, such as theft of crops occurring in some rural areas, so it is possible to quickly and easily identify rice varieties grown and cultivated in Korea. But the establishment of technology is urgently needed.
최근 벼 유전자원은 유용 형질 보존 및 신품종 창출에 매우 중요한 재료로 이용되고 있는 바 국내 고유 자원과 국외 자원의 수집과 함께 수집된 유전자원의 신속한 종간 및 아종간 품종 판별은 정확한 유전자원관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 따라서 다양한 유전자원의 유용 유전자를 탐색하고 이를 육종에 이용하는 데 있어 최근 개발된 DNA 마커(Marker)가 활용되고 있는 실정이나 기존의 국내에서 육성된 벼 품종들의 작물학적 특성 및 이화학적 방법에 따른 분류는 환경요인에 의한 변이가 발생하기 쉬워 정확한 품종판별이 어려울 뿐 아니라 많은 시간, 노력, 비용이 요구되며 장기간의 경험 및 전문성이 필요한 문제점을 가지고 있는 실정이다.Recently, the genetic resources of rice have been used as a very important material for preserving useful traits and creating new varieties. The rapid identification of species and subspecies of genetic resources collected with the collection of domestic and foreign resources can provide accurate genetic resource management and protection. It is very important to. Therefore, in the search for useful genes of various gene sources and their use in breeding, the recently developed DNA markers are used, but the classification according to the crop characteristics and physicochemical methods of rice cultivated in Korea It is difficult to accurately identify varieties due to variations in environmental factors, and it requires a lot of time, effort, and cost, and requires long-term experience and expertise.
상기와 같은 마커에 대한 선행연구들은 매우 많은 바 벼에서는 약 3,000 여개의 DNA 마커가 개발되어 있으나 농업적으로 중요한 형질과의 연계확립이 안되어 있는 실정이다.Prior studies on such markers have been developed in a very large number of about 3,000 DNA markers, but there is no established connection with agriculturally important traits.
최근 분자생물학(molecularbiology)의 급속한 발전으로 핵산(DNA) 수준에서 생물종의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류ㆍ동정 및 집단 개체군의 유연 관계 분석 등 다양한 목적으로 이용되는 핵산지문분석 기술이 개발되어 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고 간단하고 신속하게 분석할 수 있게 되었는 바, 지금까지 개발된 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용한 핵산지문법에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법과 AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 법, 그리고 SSR(simple sequence repeat)법 등이 있으나 상기 동정(fingerprinting) 방법 중RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성 검출로 각광받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다는 단점이 있다. 그러나 SSR 방법은 DNA 반복 배열인 microsatelite 영역의 염기 배열 정보를 근거로 PCR 프라이머(primer)를 제작하여 이용하는 방법으로 Wu and Tanksley(1993)에 의하여 처음 응용된 이후 microsatelite 분석이 용이하고 높은 재현성을 가지는 장점으로 인하여 생물종의 동정(fingerprinting)에 자주 사용되고 있다.Recent advances in molecular biology have enabled us to explore useful traits that enable biodiversity studies at the nucleic acid level, to identify species, to classify and identify species, and to analyze flexible relationships among populations. Nucleic acid fingerprint analysis technology, which is used for various purposes, has been developed so that it can be analyzed simply and quickly without being influenced by the external environment. Therefore, RAPD (randomly) is used for nucleic acid fingerprinting using PCR (Polymerase Chain Reaction). Although there are amplified polymorphic DNAs (AFLP) method, AFLP (amplified fragment length polymorphic DNA) method, and simple sequence repeat (SSR) method. AFLP method is spotlighted for high DNA polymorphism detection, but complicated appearance and analysis of less reproducible bands There is a disadvantage that. However, the SSR method is a method of constructing and using a PCR primer based on the sequence information of the microsatelite region, which is a DNA repeat sequence, and has the advantage of easy and reproducible microsatelite analysis since it was first applied by Wu and Tanksley (1993). Because of this, it is frequently used for fingerprinting species.
당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 통상적으로 벼의 품종판별을 위하여 벼 게놈에 반복되는 염기서열(SSR)을 매우 적은 량의 DNA로부터 분석이 가능한 많은 양의 DNA를 증폭시킬 수 있는 PCR(Polymerase Chain Reaction) 핵산지문법을 이용하여 증폭 후 벼 품종들의 유전자형을 구분하기 위한 마커조합이 선택되어지거나 특정 벼품종의 유전자형을 동정하기 위해서는 무작위적으로 선택된 마커들로 인해 표준 벼품종과 같은 대립유전자(alleles)를 갖는지의 여부를 판단하고 있는 실정이다.As is well known to those skilled in the art, PCR (Polymerase Chain Reaction) can amplify a large amount of DNA that can be analyzed from a very small amount of DNA (SSR), which is usually repeated in the rice genome for rice varieties. After amplification using nucleic acid fingerprinting, a marker combination is selected to distinguish genotypes of rice varieties, or randomly selected markers have the same alleles as standard rice varieties to identify genotypes of specific rice varieties. Judging whether or not.
그러나 이러한 품종판별에 있어서 각 품종의 특성에 대한 고유번호를 부여하여 품종판별에 이용되는 예나 방식이 없어 연구자들은 물론 관련업자간에 많은 혼란이 야기되고 있는 문제점이 상존하고 있었다.However, there is a problem that many confusions are caused between researchers and related companies because there is no example or method used for breed discrimination by assigning a unique number for each variety's characteristics.
본 발명은 상기한 바와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 창안된 것으로서, 재현성이 높으면서 대다수의 품종의 판별에 용이하게 적용시킬 수 있는 각품종별 고유번호를 부여할 수 있는 코드화 방법을 제공함으로서 통일된 방법을 통해 각 연구자 및 관련인들로 하여금 혼란을 제거하여 해당 품종의 판별을 더욱 명확하고 용이하게 하려는 데 그 목적이 있다.The present invention was devised to solve the conventional problems as described above, unified by providing a coding method that can be assigned a unique number for each type that can be easily applied to the discrimination of the majority of varieties with high reproducibility. The purpose of this method is to make each researcher and related person clear the confusion and make the identification of the variety more clear and easy.
본 발명의 다른 목적은 상기 코드화방법을 농업용만이 아닌 다방면의 산업에도 적용시켜 보다 일반화하므로서 연구기간을 단축시키려는 데 있다.Another object of the present invention is to shorten the research period by applying the coding method not only for agriculture but also for various industries.
본 발명의 또 다른 목적은 품종 동정을 위한 키트(kit) 제작 등을 통하여 국내외 벼 연구기관 및 농산물 수출입 관리국 및 쌀 관련 사업장에서 벼 품종의 판별을 신속하고 보다 정확하게 하려는 데 있다.Still another object of the present invention is to quickly and more accurately determine rice varieties in domestic and foreign rice research institutes, agricultural product import and export bureaus and rice-related workplaces through the production of kits for identification of varieties.
본 발명의 또 다른 목적은 벼의 유용형질(양질성, 도열병 내구저항성)과 연관된 DNA 마커와 연계하여 품종별 고유코드번호를 부여함으로서 육종사업에 이용토록 함으로서 품종 육성효율을 높이고자 하려는데 있다.Another object of the present invention is to increase the efficiency of breeding by giving a unique code number for each breed in connection with DNA markers associated with useful qualities of rice (quality, heat resistance).
도 1 은 본 발명의 품종판별을 위한 코드화방법을 나타내는 흐름도,1 is a flowchart showing a coding method for discriminating varieties of the present invention;
도 2 는 RM48 마커로부터 얻은 PCR 증폭 산물을 보여주는 사진,2 is a photograph showing the PCR amplification product obtained from the RM48 marker,
도 3 은 RM48 마커로부터 얻은 PCR 산물에 고유코드번호를 부여한 결과를 나타내는 도,3 is a diagram showing the result of assigning a unique code number to a PCR product obtained from the RM48 marker,
도 4 는 RM249 마커로부터 얻은 PCR 증폭 산물을 보여주는 사진,4 is a photograph showing the PCR amplification product obtained from the RM249 marker,
도 5 은 RM249 마커로부터 얻은 PCR 산물에 고유코드번호를 부여한 결과를 나타내는 도이고,5 is a diagram showing the result of assigning a unique code number to a PCR product obtained from the RM249 marker,
도 6 은 상기 RM48 및 RM249 마커를 포함하여 6개의 마커로 부터 얻은 PCR 산물에 고유코드번호를 부여한 결과를 나타내는 도이다.FIG. 6 is a diagram illustrating a result of assigning a unique code number to a PCR product obtained from six markers including the RM48 and RM249 markers.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명><Explanation of symbols for the main parts of the drawings>
상기한 목적을 달성하기 위해 본 발명을 첨부 도면에 의거하여 좀 더 상세히 설명하면 더욱 명백해질 것이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The present invention will be more apparent from the following detailed description based on the accompanying drawings in order to achieve the above object.
하기에서 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 것이다. 그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.In the following description of the present invention, if it is determined that a detailed description of a related known function or configuration may unnecessarily obscure the subject matter of the present invention, the detailed description thereof will be omitted. Terms to be described later are terms defined in consideration of functions in the present invention, and may be changed according to intentions or customs of users or operators. Therefore, the definition should be made based on the contents throughout the specification.
첨부된 도면을 간단히 설명하면, 도 1은 본 발명의 바람직한 실시예인 RM48마커로부터 얻은 한국 내 재배 벼 148품종에 대한 PCR 산물에 각 품종별로 2자리 고유코드번호를 실시한 결과를 나타내며, 도 2는 상기 RM48 마커로부터 얻은 PCR 증폭 산물을 보여주는 사진이며, 도 3은 상기 RM48 마커에 고유번호를 부여한 것을 나타내는 사진이다.Briefly attached to the accompanying drawings, Figure 1 shows the result of performing a 2-digit unique code number for each variety of PCR products for 148 varieties of rice grown in Korea obtained from the RM48 marker which is a preferred embodiment of the present invention, Figure 2 Figure 3 is a photograph showing the PCR amplification product obtained from the RM48 marker, Figure 3 is a photograph showing a unique number assigned to the RM48 marker.
본 발명의 품종판별을 위한 코드화 방법은 통상의 마커선발방법 즉, 예를들어 기지의 다수의 마커를 이용하여 각 마커를 PCR 방법에 의해 생성된 밴드를 데이터화하여 밴드유형을 살핀 후 스크리닝한 마커들 중 가장 소수의 마커조합으로부터 다수의 품종을 구별할 수 있는 마커조합을 찾는 바 상기와 같은 방법에 의해 선택된 마커에 대한 PCR 반응이 끝난 PCR 증폭산물을 4% 아크릴아마이드 겔에서 전기영동을 실시한 후 은염색 (silver staining)으로 염색하여 상기 PCR 증폭산물을 확인하고 결과에 따른 밴드유형에 따라 분류하여 코드번호를 부여하는 것을 특징으로 한다.Encoding method for breeding of the present invention is a conventional marker selection method, that is, for example, using a plurality of known markers, each marker is screened after screening the band type by the band generated by PCR method data Find a marker combination that can distinguish a large number of varieties from the fewest marker combinations. The PCR amplification product after the PCR reaction for the marker selected by the method described above was electrophoresed on a 4% acrylamide gel and then silver salt. The PCR amplification products are identified by staining with silver (silver staining) and classified according to the band type according to the result.
상기에서 PCR 증폭산물인 밴드 유형에 따른 코드번호의 부여방법에 대해서는 확인하고자 하는 대상 품종의 종류를 10가지라 하고 또 이를 판별하기 위해 통상의 방법에 의해 선택된 마커를 A, B 두개라고 하는 가정을 통해 단계적으로 설명하면,For the method of assigning a code number according to the band type, which is a PCR amplification product, 10 kinds of target varieties to be identified are identified and the markers selected by the conventional method are A and B two to determine this. If you explain step by step,
상기 선택된 마커 A 및 B에 대하여 통상적으로 사용하는 방법인 PCR 반응을 위한 반응액을 조성하고 PCR 분석을 위한 실험조건에 따라 열처리과정, DNA 변성과정, 프라이머(primer)의 접촉과정 및 DNA 합성과정을 순차적으로 복수회 반복하여 PCR 증폭을 실시한 후 상기 PCR 반응이 끝난 PCR 증폭 산물을 4% 아크릴아마이드겔에서 전기영동을 실시한 후 은염색(silver staining)으로 염색하여 상기 PCR 증폭산물을 확인하는 PCR 증폭산물단계(S100);For the selected markers A and B, a reaction solution for a PCR reaction, which is a commonly used method, is prepared, and heat treatment, DNA denaturation, primer contact, and DNA synthesis are performed according to experimental conditions for PCR analysis. PCR amplification products which are repeated a plurality of times in sequence and then PCR amplification products after the PCR reaction is electrophoresed in 4% acrylamide gel and stained with silver staining to identify the PCR amplification products Step S100;
상기 PCR 증폭산물단계(S100)를 통해 나타난 각 품종별 밴드유형을 확인하는 품종별 밴드유형 확인단계(S200);Variety band type identification step (S200) for identifying the band type of each variety shown through the PCR amplification product step (S100);
상기에서 10품종에 대한 마커 A와 마커 B의 PCR 증폭산물단계(S100)를 통해 나타난 각 품종별 대립유전자(allele)인 밴드유형을 확인하는 품종별 밴드유형이 다음 그림 1 및 2와 같다면,If the band type of each species to identify the band type of alleles for each variety shown through the PCR amplification product step (S100) of marker A and marker B for the 10 varieties as shown in Figures 1 and 2,
<그림 1><Picture 1>
마커 A의 품종별 밴드유형Variety of Band Types of Marker A
<그림 2><Picture 2>
마커 B의 품종별 밴드유형Varying Band Types of Marker B
상기 그림에서 하단 x 축 방향의 a, b, c, e, f, g, h, i 그리고 j 는 10가지 품종을 나타내며 좌단 y 축 방향의 번호는 각 품종으로부터 생긴 밴드유형을 나타낸다. 즉, 그림1에서의 마커 A에 대한 품종별 밴드유형은 5가지임을 나타내고 있으며 그림 2는 마커 B에 대한 품종별 밴드유형이 8가지임을 나타내고 있다.In the figure, a, b, c, e, f, g, h, i and j in the bottom x-axis represent 10 varieties, and the number in the left y-axis direction represents the band type from each variety. In other words, there are five varietal band types for marker A in Figure 1, and Figure 2 shows that there are eight varietal band types for marker B.
상기 확인된 밴드유형에 따라 각 마커에 따른 품종별 2자리 숫자코드를 부여하는 코드번호부여단계(S300);및Code numbering step (S300) for giving a two-digit numeric code for each kind according to each marker according to the identified band type; And
상기 그림 1에서 마커 A에 대한 품종 a 는 3번 밴드를 가지므로 2자리 숫자코드는 "03"이 되며, 그림 2에서 마커 B에 대한 품종 a 는 2번 밴드를 가지므로 2자리 숫자코드는 "02"가 된다.In Figure 1, the varieties a for marker A have band 3, so the 2-digit numeric code is "03." In Figure 2, the varieties a for marker B have band 2, so the 2-digit numeric code is " 02 ".
상기 코드번호부여단계(S300)를 통해 부여된 각 품종별 마커별 고유번호를 염색체순 등에 따른 마커순에 따라 연소적으로 코드번호를 부여하는 품종별 최종코드번호부여단계(S400)로 이루어진다.The final code numbering step for each breed (S400) is used to give a code number combustively according to the order of markers according to the chromosomal order, etc. for each variety of markers given through the code numbering step (S300).
상기에서 만일 마커의 순서를 A, B 라고 하면 A, B 마커에 의한 품종 a 의고유코드번호는 "0302"가 된다.In the above, if the order of the markers is A and B, the unique code number of the varieties a by the A and B markers is "0302".
물론 상기 마커의 순서가 B, A 라면 A, B 마커에 의한 품종 a 의 고유코드번호는 "0203"이 된다.Of course, if the order of the markers B, A, the unique code number of the varieties a by the A, B marker is "0203".
이와같이 상기에서는 단지 두개의 마커와 10개의 품종에 대해 설명하였지만 얼마든지 그 수를 늘릴 수 있으며 또한 그 수에 따른 순서에 따라 각각 고유번호를 부여함으로서 각 품종별 고유코드번호가 부여될 수 있다. 상기에서 마커조합에 의해 품종별 고유코드번호를 부여시 최초의 두자리수중 처음 한자리수인 "0"은 의미가 없으므로 제외시킨다. 상기에서 알 수 있는 것처럼 항상 그러한 것은 아니나 사용된 마커에 의해 생긴 밴드수가 2자리 이하시 n개의 마커에 대한 품종별 고유코드번호의 자릿수는 "2n - 1"이 된다.As described above, only two markers and 10 varieties have been described, but the number can be increased as much as possible, and a unique code number for each variety can be given by assigning a unique number in the order according to the number. When assigning a unique code number for each variety by the marker combination in the above, the first one of the first two digits "0" is excluded because it does not have meaning. As can be seen above, the number of digits of the unique code number for each of the n markers becomes "2n-1" when the number of bands generated by the used marker is not always the same as two digits.
상기와 같이 구성된 본 발명에 대한 바람직한 실시예를 통하여 설명하면 다음과 같다.Referring to the preferred embodiment of the present invention configured as described above are as follows.
한국내 재배 벼 148품종의 품종 판별을 위하여 이미 알려진 다수종의 마커를 이용하여 PCR 방법으로 각 마커에 의하여 생성된 밴드를 데이터화하여 밴드 유형을 살핀 후 스크리닝한 다수의 마커 중 148개의 품종을 구별할 수 있는 최소마커조합 중의 하나로 벼 염색체 2, 5번에 위치하는 마커인 RM48 및 RM249 마커를 선택하고 상기 각 마커로부터 증폭된 대립유전자(allele)의 각 품종별 두자리수의 고유번호를 부여시킨다.In order to discriminate varieties of 148 varieties of rice grown in Korea, the bands generated by each marker were data-processed by PCR using a variety of known markers to identify 148 varieties among a plurality of markers screened after screening the band type. As one of the minimum marker combinations, RM48 and RM249 markers, which are markers located on rice chromosomes 2 and 5, are selected, and two-digit unique numbers are assigned to each variety of alleles amplified from the markers.
이하의 실시예에서 PCR 반응을 위한 반응액 조성은 총 50㎕로 하여 각각의 벼 품종으로부터 분리한 게놈 DNA(50-100ng)와 네종류(dATP, dTTP, dGTP, dCTP)의dNTP(각 100㎕), Taq polymerase(1 unit, promega 사), 그리고 완충액(buffer) (pH8.3, 100mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 50mM KCl, 0.01% gelatin)이 포함되어 있으며, 상기 PCR 분석을 위한 반응은 특별한 언급이 없는 한 Thermo cycler를 이용하여 94℃에서 5분간 열처리하고, 95℃에서 1분간 DNA 변성단계, 55℃에서 1분간 프라이머(primer)의 접촉단계, 72℃에서 2분간 DNA 합성 단계로 총 35회 반복으로 PCR 증폭을 실시하였으며, 또한 상기와 같이 PCR 반응이 끝난 PCR 증폭 산물을 4% 아크릴아마이드 겔에서 전기영동을 실시한 후 Panaud 등의 보고에서와 같이 은염색(silver staining)으로 염색하여 상기 PCR 증폭산물을 확인한다.In the following examples, the composition of the reaction solution for the PCR reaction was 50 µl in total, and genomic DNA (50-100ng) isolated from each rice variety and four types (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) dNTP (100 µl each). ), Taq polymerase (1 unit, promega), and buffer (pH8.3, 100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl 2 , 50 mM KCl, 0.01% gelatin), and the reaction for PCR analysis Unless otherwise specified, heat cycle at 94 ° C for 5 minutes using a thermo cycler, DNA denaturation at 95 ° C for 1 minute, primer contact at 55 ° C for 1 minute, and DNA synthesis at 72 ° C for 2 minutes. PCR amplification was repeated 35 times, and electrophoresis was performed on 4% acrylamide gel after completing the PCR reaction as described above, and then stained with silver staining as reported by Panaud et al. Identify PCR amplification products.
<실시예 1 : RM48 마커를 이용한 품종간 PCR 핵산지문을 실시 ><Example 1: Cross-breed PCR nucleic acid fingerprints using RM48 marker>
RM48(GA479)마커를 이용한 한국 장려품종 148품종의 품종간 PCR 핵산지문을 실시하였다.PCR nucleic acid fingerprints of 148 varieties of Korean invasive varieties using RM48 (GA479) markers were performed.
첨부된 도 2는 상기 148품종에 대한 RM48 마커(GA479, 염색체2번)를 이용하여 증폭된 양상을 나타낸 사진이며, 도 3은 상기 RM48 마커로부터 얻은 고유번호를 실시한 결과를 보여준다.2 is a photograph showing an amplified pattern using the RM48 marker (GA479, chromosome 2) for the 148 cultivar, and FIG. 3 shows the result of the identification number obtained from the RM48 marker.
상기 도 2에서 A는 마커로부터 증폭된 대립유전자(allele)의 고유 번호, 1은 RM48에 의해 증폭된 1번 대립유전자(allele)(금강벼, 태백벼, 용문벼, 농안벼, 향미벼1호, 서광벼, 백양벼, 풍산벼, 신광벼, 장성벼, 밀양22호, 밀양23호, 래경, 청청벼)이며, 2는 상기 RM48에 의해 증폭된 2번 대립유전자(allele)(추청벼, 오대벼, 진부벼, 안중벼, 신선찰벼, 흑남벼, 대성벼, 화성벼, 대관벼, 농림나1호, 봉광벼,진미벼, 오봉벼, 화선찰벼, 대진벼, 서진벼, 화명벼, 흑진주벼, 대립벼1호, 풍옥, 동안벼, 낙동벼, 상남밭벼, 상주벼, 중화벼, 대산벼, 남강벼, 남평벼, 삼성벼)이며, 3은 상기 RM48에 의해 증폭된 3번 대립유전자(allele)(설악벼, 도봉벼, 삼남벼, 서남벼, 기호벼, 청명벼, 일품벼, 서안벼, 둔내벼, 안산벼, 영산벼, 만금벼, 양조벼, 화영벼, 내풍벼, 금오벼1호, 통일, 황금벼, 한강찰벼, 남풍벼, 다산벼, 호남조생, 백운찰벼, 영남조생, 밀양21호, 밀양30호, 밀양42호, 가야벼, 칠성벼)이며, 4는 상기 RM48에 의해 증폭된 4번 대립유전자(allele)(남영벼)이며, 5는 상기 RM48에 의해 증폭된 5번 대립유전자(allele)(광명벼)이며, 6은 상기 RM48에 의해 증폭된 6번 대립유전자(allele)(은구6호, 은구5호)이며, 7은 상기 RM48에 의해 증폭된 7번 대립유전자(allele)(다마금, 화진벼, 대안벼, 화동벼, 영풍벼, 탐진벼, 서해벼, 남원벼, 계화벼, 대야벼, 향남벼, 팔공벼, 상산벼, 화삼벼, 배달)이며, 8은 상기 RM48에 의해 증폭된 8번 대립유전자(allele)(아랑향찰벼)이고 9는 상기 RM48에 의해 증폭된 9번 대립유전자(allele)(조동지, 중생은방주, 팔달, 간척9호, 수원118호, 수성, 팔기, 진흥, 신풍, 풍광, 수원82호, 농백, 관악벼, 상풍벼, 치악벼, 백암벼, 금오벼, 장안벼, 진부찰벼, 진부올벼, 화중벼, 주안벼, 남선13호, 일진, 서광, 영광, 팔굉, 조광, 선서, 새나라, 만승, 호광, 동진벼, 섬진벼, 운봉벼, 화남벼, 간척벼, 신운봉벼, 운장벼, 금남벼, 화신벼, 삼천벼, 밀성, 동해벼, 일미벼, 삼백벼, 금오벼2호, 상주찰벼, 이리239호, 재건, 관옥, 팔금, 만경, 노풍, 수정벼, 남천벼)이다.In Figure 2, A is the unique number of the allele (allele) amplified from the marker, 1 is the allele (allele) No. 1 amplified by RM48 (Geumgang rice, Taebaek rice, Yongmun rice, Nongan rice, flavor rice No. 1 , Seokwang rice, Baekyang rice, Pungsan rice, Singwang rice, Jangseong rice, Miryang 22, Miryang 23, Raekyung, Cheongcheong rice), 2 is the allele 2 (allele) amplified by the RM48 , Jinbu rice, Anjung rice, Sinseonchal rice, Heuknam rice, Daeseong rice, Hwaseong rice, Daegwanp rice, Nonglimnana 1, Bonggwang rice, delicacy rice, Obong rice, Hwasunchal rice, Daejin rice, Seojin rice, Hwamyeong rice, Heukjin rice, Allele rice No. 1, Pungok, Joongpyeong, Nakdong rice, Sangnam Paddy rice, Sangju rice, Chinese rice, Daesan rice, Namgang rice, Nampyeong rice, Samsung rice), 3 is the allele 3 (allele) amplified by the RM48 ( Seorak rice, Dobong rice, Samnam rice, Seonam rice, Seobap rice, Cheongmyeong rice, One article rice, Xi'an rice, Dunnae rice, Ansan rice, Yeongsan rice, Mangeum rice, Brewed rice, Hwayeong rice, Naepung rice, Geumo rice 1, unification, Golden Rice, Han River Bridge , Nampoong rice, Dasan rice, Honam algae, Baekwoonchal rice, Yeongnam algae, Miryang 21, Miryang 30, Miryang 42, Kaya rice, Chilseong rice), 4 is the allele 4 (allele amplified by the RM48) (Namyoung rice), 5 is the allele 5 (allele) (light rice) amplified by the RM48, 6 is 6 allele (allele) (eungu 6, Eungu 5 amplified by the RM48) (7), 7 is allele (amarum, Hwajin rice, alternative rice, Hwadong rice, Yeongpung rice, Tamjin rice, Seohae rice, Namwon rice, Gyehwa rice, Daeya rice, amplified by RM48). Hyangnam rice, Palgong rice, Sangsan rice, Hwasambyeong, delivery), 8 is the allele (allele) No. 8 amplified by the RM48 (Alanghyangchalbyeo) and 9 is the allele 9 (amplified by the RM48) allele) Jangan Rice, Jinbu-rice, Jinbu Olp, Hwajungbap, Juanpang, Namseon 13, Iljin, Seogwang, Glory, Palgung, Chogwang, Oath, Saenara, Manseung, Hogwang, Dongjinbap, Seomjinbap, Unbongbap, Hwanambap, Reclaimed Rice, Sinunbongbap, Unjangbap, Geumnam rice, hwasin rice, samcheon rice, dense castle, Donghae rice, Ilmi rice, three hundred rice, Geumo rice No. 2, Sangjuchal rice, Erie239, reconstruction, Kwanok, Palgeum, Mangyeong, Nohwang, Crystal rice, Namcheon rice).
<실시예 2 : RM249 마커를 이용하여 품종간 PCR 핵산지문을 실시>Example 2 PCR Nucleic Acid Fingerprints between Varieties Using RM249 Markers
RM249마커(CT481, 염색체 5번)를 이용하여 우리나라 장려품종 148품종의 품종간 PCR 핵산지문을 실시하였다.PCR nucleic acid fingerprints of 148 varieties of Korean invasive varieties were performed using the RM249 marker (CT481, Chromosome No. 5).
첨부된 도 4는 상기 148품종에 대한 RM249 마커를 이용하여 증폭된 양상을 나타낸 사진이며, 도 5은 상기 RM249 마커로부터 얻은 고유번호를 실시한 결과를 보여준다.4 is a photograph showing an amplified pattern using the RM249 markers for the 148 varieties, and FIG. 5 shows the results of the identification numbers obtained from the RM249 markers.
상기 도 4에서 A는 마커로부터 증폭된 대립유전자(allele)의 고유 번호이며, 1은 상기 RM249에 의해 증폭된 1번 대립유전자(allele)(한강찰벼, 서광벼, 풍산벼, 청청벼)이며, 2는 상기 RM249에 의해 증폭된 2번 대립유전자(allele)(대야벼, 화신벼, 통일, 황금벼, 태백벼, 남풍벼, 용문벼, 향미벼1호, 호남조생, 삼성벼, 수정벼, 백양벼, 신광벼, 장성벼, 영남조생, 밀양22호, 밀양21호, 밀양23호, 밀양30호, 래경, 가야벼, 칠성벼, 남영벼)이며, 3은 상기 RM249에 의해 증폭된 3번 대립유전자(allele)(신선찰벼, 다산벼)이며, 4는 상기 RM249에 의해 증폭된 4번 대립유전자(allele)(은구6호, 수원118호, 풍광, 추청벼, 설악벼, 도봉벼, 상풍벼, 치악벼, 서남벼, 기호벼, 대성벼, 백암벼, 화성벼, 대관벼, 농림나1호, 금오벼, 청명벼, 오봉벼, 서안벼, 진부올벼, 안중벼, 둔내벼, 화중벼, 대안벼, 대진벼, 서진벼, 화명벼, 흑진주벼, 대립벼1호, 일진, 서광, 영광, 만승, 동진벼, 운봉벼, 영산벼, 탐진벼, 남원벼, 계화벼, 간척벼, 신운봉벼, 운장벼, 금남벼, 삼천벼, 향나벼, 밀성, 낙동벼, 팔공벼, 상남밭벼, 화영벼, 일미벼, 내풍벼, 중화벼, 금오1호, 금오벼2호, 화삼벼, 남평벼, 아랑향찰벼)이며, 5는 상기 RM249에 의해 증폭된 5번 대립유전자(allele)(진흥)이며, 6은 상기 RM249에 의해 증폭된 6번 대립유전자(allele)(화진벼, 화선찰벼, 선서, 섬진벼, 만금벼, 양조벼, 동안벼, 삼백벼, 남강벼, 배달)이며, 7은 상기 RM249에 의해 증폭된 7번 대립유전자(allele)(중생은방주, 은구5호, 팔달, 간척9호, 팔기, 주안벼, 화동벼, 남선13호, 풍옥, 조광, 이리239호, 재건, 관옥)이며, 8은 상기 RM249에 증폭된 8번 대립유전자(allele)(조동지, 수성, 농백, 봉광벼, 새나라, 호광, 금강벼, 노풍)이며, 9는 상기 RM249에 증폭된 9번 대립유전자(allele)(만경, 백운찰벼)이며, 10은 상기 RM249에 의해 증폭된 10번 대립유전자(allele)(다마금, 신풍, 수원82호, 관악벼, 광명벼, 팔굉, 영풍벼, 상산벼, 팔금, 밀양42호, 남천벼)이며, 11은 상기 RM249에 의해 증폭된 11번 대립유전자(allele)(삼남벼, 오대벼, 장안벼, 진미벼, 안산벼, 서해벼, 화남벼, 흑남벼, 상주벼, 대산벼, 농안벼)이며, 12는 상기 RM249에 의해 증폭된 12번 대립유전자(allele)(일품벼, 진부찰벼, 진부벼, 동해벼)이고 13은 상기 RM249에 의해 증폭된 13번 대립유전자(allele)(상주찰벼)이다.In FIG. 4, A is a unique number of an allele amplified from a marker, and 1 is an allele 1 (allele) (Hankangchal rice, Seogwang rice, Pungsan rice, Chungcheong rice), amplified by the RM249, 2 is the allele 2 (allele) amplified by the RM249 (large rice, Hwashin rice, unification, golden rice, Taebaek rice, Nampung rice, Yongmun rice, Hyangmi rice No. 1, Honam early bird, Samsung rice, crystal rice, Baekyang rice, Singwang rice, Jangseong rice, Yeongnam Josaeng, Miryang 22, Miryang 21, Miryang 23, Miryang 30, Raekyung, Gaya rice, Chilseong rice, Namyoung rice), 3 is amplified by RM249 No. allele (Shinseonchal rice, Dasan rice), 4 is the allele No. 4 (allele) (Eung-gu No. 6, Suwon 118, amplified by the RM249, scenery, Chucheong rice, Seorak rice, Dobong rice, Sangpung Paddy rice, Chiakpyeong, Seonambyeong, Seobapbyeong, Daeseongbap, Baekambyeong, Hwaseongbap, Daegwanbyeong, Nonglimnana No. 1, Geumobyeong, Cheongmyeongbyeong, Obongbyeong, Xi'anbap, Jinbuolbap, Anjungpung, Dunnaebap, Hwabyeongp , Alternative rice, stand Paddy rice, Seojin rice, Hwamyeong rice, Black Jinju rice, Daepyeong 1, Iljin, Seogwang, Glory, Manseung, Dongjin rice, Unbong rice, Yeongsan rice, Tamjin rice, Namwon rice, Gyehwa rice, Reclaimed rice, Sinunbong rice, Unjang rice, Geumnam rice, three thousand rice, scented rice, dense, Nakdong rice, Palgong rice, Sangnam field rice, Hwayoung rice, Ilmi rice, Naepung rice, Chinese rice, Geumo 1, Geumo rice 2, hwasam rice, Nampyeong rice, Aranghyangchal rice) Is allele (promotion) No. 5 amplified by RM249, and 6 is allele (allele) (Hwajin rice, Hwasun rice, oath, Seomjin rice, Mangeum rice, brewing) amplified by RM249 Rice, middle rice, three hundred rice, Namgang rice, delivery), 7 is the allele 7 (allele) amplified by the RM249 (rebirth ark, Eun-gu No. 5, Paldal, rec. No. 9, Palgi, Juan rice, Hwadong Rice, Namseon 13, Pungok, Chogwang, Erie239, Reconstruction, Kwanok), 8 is 8 alleles (Jodong, Suseong, Nongbaek, Bonggwang Rice, Saenara, Hogwang, Geumgang) amplified in RM249 Rice, old wind) , 9 is the allele 9 (allele) (Mankyung, Baekyunchal rice) amplified by the RM249, 10 is the allele 10 (allele) (Damaeum, Shinpung, Suwon 82, Gwanak rice, amplified by the RM249) , Gwangmyeong rice, Palung, Yeongpung rice, Sangsan rice, Palum, Miryang No. 42, Namcheon rice), 11 is the allele 11 (allele) amplified by the RM249 (Samnam rice, Odae rice, Jangan rice, Jinmi rice, Ansan, Seohae, Hwanam, Heuknam, Sangju, Daesan, Nongan), and 12 is the allele (12) amplified by the RM249 (a la carte rice, Jinbuchal rice, Jinbu rice, Donghae rice) And 13 is the allele 13 (amplified rice) amplified by the RM249.
상기와 같이 실시예 1,2를 통하여 얻은 148품종에 대하여 RM48 및 RM249의 각 마커별 2자리수의 고유번호를 부여하고 염색체번호순대로 조합시킨 마커조합(즉, RM48RM249)에 대하여 각 품종별로 고유코드번호를 부여시키면 되며 여기에서는 별도로 언급하지 않았으나 다른 4개의 마커들에 대하여 상기와 동일한 실시예를 거친후 이들 6개의 마커들을 조합시킨 결과를 도 6에 나타내었다.As described above, the 148 varieties obtained through Examples 1 and 2 are given a two-digit unique number for each marker of RM48 and RM249, and a unique code for each variety for each marker combination (ie, RM48RM249) combined in chromosome number order. Although the numbering is not mentioned here, the result of combining the six markers after the same example as above for the other four markers is shown in FIG. 6.
첨부된 도 6에서 상기 실시예 1, 2를 통하여 얻은 결과를 확인하자면, 염색체번호순인 마커 RM48, RM249에 대한 가야벼의 품종확인을 위한 고유코드번호는 "3 0 2 1 2 0 9 0 3 0 1" 임을 알 수 있다. 상기 고유코드번호의 처음 한자리수인 "3"은 RM48에 의한 밴드유형이 9 가지이므로 도 3에서 마커 RM48에 대한 가야벼의 2자리수의 고유코드번호 "03"에서 최초 사용되는 숫자에서 "0"을 뺀 "3"이며, 다음 두자리수인 "21" 은 도 5에서 마커 RM249에 대한 가야벼의 2자리수의 고유코드번호임을 확인할 수 있으며 이들을 염색체번호순대로 연속하면 "302..."이 되는 것이다. 따라서 전체 6개의 마커조합에 의한 품종별 고유코드번호는 2n - m의 자리수를 가지며 열한자리(11)수가 된다. 여기에서 n은 마커의 수이며 m은 한자리수 밴드유형을 갖는 마커의 수이다.In the attached Figure 6 to confirm the results obtained through Examples 1 and 2, the unique code number for identifying the varieties of the oyster rice for markers RM48, RM249 chromosomal number order is "3 0 2 1 2 0 9 0 3 0 1 ". Since the first one digit of the unique code number "3" has nine band types according to RM48, "0" is used in the number first used in the two-digit unique code number "03" of the field rice for the marker RM48 in FIG. Subtracted from "3", the next two digits "21" can be confirmed that the unique code number of the two-digit number of the kayak rice for the marker RM249 in Figure 5, if they are consecutive in the chromosome number will be "302 ..." . Therefore, the unique code number of each variety by the combination of six markers has the number of 2n-m and eleven (11) digits. Where n is the number of markers and m is the number of markers with single digit bandtype.
본 발명은 다양하게 변형될 수 있고 여러 가지 형태를 취할 수 있으며 상기 발명의 상세한 설명에서는 그에 따른 특별한 실시예에 대해서만 기술하였다. 하지만 본 발명은 상세한 설명에서 언급되는 특별한 형태로 한정되는 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 오히려 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.The present invention can be variously modified and can take various forms and only the specific embodiments thereof are described in the detailed description of the invention. It is to be understood, however, that the present invention is not limited to the specific forms referred to in the description, but rather includes all modifications, equivalents, and substitutions within the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Should be.
이와 같은 본 발명에 의하면 반복 DNA 염기서열을 이용한 각 프라이머에 따른 DNA 다형성 밴드에 두자리 번호를 붙여 각 마커별 품종의 코드화와 마커조합의 코드화로 품종별 2n - m 자리의 고유코드번호를 부여함으로 다수품종의 동정이 가능한 효과를 가지는 매우 유익한 발명임이 명백하다.According to the present invention, by attaching a two-digit number to the DNA polymorphism band according to each primer using the repetitive DNA nucleotide sequence, by assigning a unique code number of 2n-m digits of each varieties by coding the varieties of each marker and the coding of the marker combination It is clear that the identification of the variety is a very beneficial invention with a possible effect.
본 발명의 다른 효과로는 상기 품종판별을 위한 microsatelite 마커조합 에 의한 각 품종별 고유코드번호는 관련 연구기관 및 산업현장에서 품종판별 및 유연관계분석에 효율적으로 이용가능하다는 것이다.Another effect of the present invention is that the unique code number of each breed by the microsatelite marker combination for breed identification can be efficiently used for breed identification and flexibility analysis in related research institutes and industrial sites.
또한 본 발명은 외국기술의 국내 특허진입에 대비한 기술 선점효과와 향후 육성되는 신품종 및 외국 품종들의 유전자형 판별에도 적용할 수 있다.In addition, the present invention can be applied to the preemptive effect of the technology in preparation for the domestic patent entry of foreign technology and the genotype determination of new breeds and foreign varieties to be fostered in the future.
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