KR20020092469A

KR20020092469A - 인자 ＶＩＩａ 및 인자 ＸＩＩＩ를 포함하는 제약학적조성물

Info

Publication number: KR20020092469A
Application number: KR1020027014943A
Authority: KR
Inventors: 페테르센라르스크리스티안; 헤드네르율라; 뢰이크자에르라스무스
Original assignee: 노보 노르디스크 에이/에스
Priority date: 2000-05-10
Filing date: 2001-05-10
Publication date: 2002-12-11

Abstract

본 발명은 출혈 사건의 치료 또는 예방에서 인자 VIIa 및 인자 XIII의 사용에 관한 것이다.

Description

인자 ＶＩＩａ 및 인자 ＸＩＩＩ를 포함하는 제약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING A FACTOR VIIA AND A FACTOR XIII}

지혈은 혈관벽의 상처 후 순환중인 혈액에 노출되는 조직인자(TF)와 총 FVII 단백질 질량 중 약 1%에 해당하는 양으로 혈행에 존재하는 FVIIa 간의 복합체의 형성에 의해 개시된다. 이 복합체는 TF를 지니는 세포에 부착되어 세포 표면에서 FX를 FXa로 그리고 FIX를 FIXa로 활성화시킨다. FXa는 프로트롬빈을 트로빈으로 활성화시키며, 트롬빈은 FVIII, FV, FXI 및 FXIII를 활성화시킨다. 또한, 더욱이 이런 초기 지혈 단계에서 형성된 제한된 양의 트롬빈은 혈소판을 활성화시킨다. 혈소판에 대한 트롬빈의 작용 후, 혈소판들은 모양이 변하고 그것들의 표면에 있는 하전된 인지질에 노출된다. 이런 활성화된 혈소판 표면은 더 이상의 FX 활성화 및충분한 트롬빈 생성을 위한 주형을 형성한다. 활성화된 혈소판 표면에서 더 이상의 FX 활성화는 활성화된 혈소판의 표면에 형성된 FIXa-FVIIa 복합체를 통해 일어나며, 그후 FXa가 계속 표면에 있으면서 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시킨다. 다음에, 트롬빈은 피브리노겐을 불용성이고 초기 혈소판 플러그를 안정화시키는 피브린으로 전환시킨다. 이 과정은 구획지어지는데, 즉 TF 발현 또는 노출의 부위에 국한됨으로써 응고 시스템의 전신적 활성화의 위험을 최소화한다. 더욱이, 플러그를 형성하는 불용성 피브린은 피브린 섬유의 FXIII-촉매 교차결합에 의해 안정화된다.

FVIIa는 주로 단일-사슬 지모겐으로서 혈장에 존재하며 이것은 FXa에 의해 그것의 2-사슬 활성형 FVIIa로 절단된다. 재조합 활성형 인자 VIIa(rFVIIa)는 사전-지혈제로서 개발되었다. rFVIIa의 투여는 항체 형성으로 인한 응고 인자 생성물로 치료될 수 없는 출혈을 갖는 혈우성 피험자에서 빠르고 매우 효과적인 사전-지혈 반응을 제공한다. 또한, 인자 VII가 결핍된 출혈 피험자 또는 정상 응고 시스템을 가지지만 과다 출혈을 경험하는 피험자가 FVIIa를 사용하여 성공적으로 치료될 수 있다. 이들 연구에서 rFVIIa의 바람직하지 않은 부작용(특히 혈전색전증의 발생)은 나타나지 않았다.

가외로 외인성으로 투여된 FVIIa는 활성화된 혈소판 표면에서 트롬빈의 형성을 증가시킨다. 이것은 FIX 또는 FVIII를 결여하고 있는 혈우병 피험자에서 일어나며, 그로 인해 충분한 트롬빈 형성을 위한 가장 효능있는 경로를 잃게 된다. 또한, 저하된 수의 혈소판 또는 결함 기능을 갖는 혈소판의 존재하에서 가외의 FVIIa는 트롬빈 형성을 증가시킨다.

피브린 안정화 인자인 FXIII는 피브린 모노머를 교차결합시킴으로써 플라스민 및 다른 단백질 가수분해 효소에 의한 용해에 대해 증가된 내성을 갖는 피브린 구조를 제공하는 트랜스글루타미나제이다. 또한, 인자 XIII는 "피브리노리가제" 및 "피브린 안정화 인자"로서 알려져 있다. 활성화되었을 때인 FXIIa는 피브린 분자의 측쇄 사이와 다른 기질들 사이에서 분자간 감마-글루타밀-엡실론-리신 교차결합을 형성할 수 있다. FXIII는 혈장 및 혈소판에서 발견된다. 이 효소는 2개의 알파-서브유닛 및 2개의 베타-서브유닛으로 구성된 테트라머 지모겐(a2b2로 표시)으로서 혈장에, 그리고 2개의 알파-서브유닛으로 구성된 지모겐(a2-다이머로 표시)으로서 혈소판에 존재한다.

두 지모겐은 트롬빈 및 Ca²⁺에 의해 활성화된다. 칼슘은 상처 부위에서의 응집시 혈소판으로부터 유리된다. 트롬빈은 1에서 37의 N-말단 아미노산 잔기(a2-다이머의)를 절단시켜 없앤다. a2b2-지모겐의 경우에는 그후 베타-서브유닛이 활성화된 알파-서브유닛으로부터 해리된다. 칼슘은 지모겐 및 트롬빈 변형된 분자에 동등하게 잘 결합한다. 트롬빈 및 칼슘 활성화 후 알파 사슬 상의 활성 중심 시스테인이 노출되어 충분히 활성화된 효소가 형성된다. 심한 혈소판감소증을 갖는 피험자는 낮은 FXIII 혈장 레벨을 가진다고 밝혀졌다.

수술 또는 위험한 외상에 관련하여 과도하게 출혈하며 혈액 수혈이 필요한 피험자는 어떤 출혈도 경험하지 않은 피험자보다 더 많은 합병증을 나타낸다는 것이 잘 알려져 있다. 그러나, 사람 혈액 또는 혈액 생성물(혈소판, 백혈구, 응고 결함 치료용 혈장-유래 농축물 등)의 투여를 필요로 하는 보통 정도의 출혈도 사람 바이러스(간염, HIV, 파보바이러스 및 아직 미공지된 다른 바이러스)가 전파될 위험에 관련된 합병증을 가져올 수 있다. 대량 혈액 수혈을 필요로 하는 대규모 출혈은 폐 및 신장 기능의 손상을 포함하여 다수 기관 기능장애의 발생을 가져올 수 있다. 일단 피험자가 이들 심각한 합병증을 나타내면, 다수의 사이토카인 및 염증성 반응을 수반하는 사건들의 캐스캐이드가 극도로 어렵고 불행히도 대개 성공적이지 않은 어떤 치료를 행하기 시작한다. 그러므로, 수술 뿐만 아니라 위험한 조직 손상의 치료에서 주된 목표는 출혈을 피하거나 또는 최소화하는 것이다.

그러한 출혈을 피하거나 또는 최소화하기 위해서, 피브린 용해 효소에 의해 쉽게 용해되지 않는 안정한 고상 지혈 플러그의 형성을 확보하는 것이 중요하다. 더욱이, 그러한 플러그 또는 혈병의 빠르고 효과적인 형성을 확보하는 것이 중요하다.

일본 특허 출원 번호 2-167234는 피브리노겐, 프로트롬빈, 혈액 응고 인자 VII, 혈액 응고 인자 IX, 혈액 응고 인자 X, 혈액 응고 인자 XIII, 항트롬빈, 프로테이나제 저해제 및 칼슘 이온을 함유하는 것을 특징으로 하는 생체-조직용 유착제에 관한 것이다.

일본 특허 출원 번호 59-116213A는 활성 성분으로서 혈액 응고제를 함유하는 조직 아교로서 사용되는 에어로졸 조성물에 관한 것이다. 혈액 응고제는 혈액 응고 인자 I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII 및 XIII, 프레칼리크레인,고중합체 키니노겐 및 트롬빈으로부터 선택될 수 있다. FXIII와 트롬빈의 조합이 바람직하다.

WO 93/12813(지모지네틱스)은 수술 받은 피험자에서 수술주변적 혈액 손실을 감소시키기 위한 FXIII의 사용에 관한 것이다. 또한, 이 조성물은 아프로티닌을 포함할 수 있다. FXIII는 전형적으로 수술 하루 전에 일시 주사로서 피험자에게 투여된다.

유럽 특허 번호 225.160(노보 노르디스크)은 FVIIa의 조성물 및 혈병화 인자 결함 또는 혈병화 인자 저해제에 기인하지 않는 출혈 장애의 치료 방법에 관한 것이다.

유럽 특허 번호 82.182(박스터 트라베놀 랩.)는 피험자에서 혈액 혈병화 인자의 결핍 또는 피험자에서 혈액 혈병화 인자에 대한 저해제의 효과를 상쇄시키는데 사용되는 인자 VIIa의 조성물에 관한 것이다.

국제 특허 공보 번호 WO 93/06855(노보 노르디스크)는 FVIIa의 국소 도포에 관한 것이다.

Kjalke 등의 Thrombosis and Haemostasis, 1999 (Suppl), 0951은 혈우병 A 또는 B 상태를 의태하는 모델 시스템에서 가외의 외인성 FVIIa의 투여 및 활성화된 혈소판 표면에서 트롬빈의 형성에 대한 효과에 관한 것이다.

피험자, 특히 손상된 트롬빈 생성을 갖는 피험자에서 응고를 증진시키고, 안정한 지혈 플러그를 빠르게 형성시키고, 충분한 지혈을 달성하기 위한 개선되고 신뢰성 있으며 폭넓게 이용할 수 있는 방법에 대한 필요가 본 분야에 여전히 남아 있다. 또한, 충분한 지혈을 달성하기 위해 필요한 FVIIa의 양을 저하시키는 방법에 대한 필요가 있다.

본 발명은 인자 VIIa 및 인자 XIII을 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 출혈 사건으로 고통받는 피험자의 치료 또는 이의 예방을 위한 의약의 제조를 위한 인자 VIIa와 인자 XIII의 조합의 사용에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 피험자에서 출혈 사건을 치료하는 방법, 및 피험자에서 혈병 형성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들 화합물을 포함하는 키트에 관한 것이다.

발명의 개요

본 발명의 한 목적은 출혈 사건 및 응고 장애의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 목적은 출혈 사건의 치료 또는 예방에, 또는 전응고제로서 효과적으로 사용될 수 있는 1개 투약 형태의 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 시너지 효과를 나타내는 조성물, 치료 방법 또는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 더 이상의 목적은 응고 시스템의 높은 레벨의 전신적 활성화와 같은 실질적인 부작용을 나타내지 않는 조성물, 치료 방법 또는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 명세서를 읽으면서 명백해질 것이다.

본 발명자는 인자 VIIa와 인자 XIII의 조합이 단독의 인자 VIIa 또는 인자 XIII보다 더욱 효과적으로 정상 사람 혈장의 혈병화 시간을 단축시킬 수 있다는 것을 알았다. 또한, 인자 VIIa와 인자 XIII의 조합이 단독의 인자 VIIa 또는 인자 XIII보다 더욱 효과적으로 혈병 단단함을 증가시킬 수 있다는 것을 알았다. 혈병 단단함의 더 이상의 증가가 관찰되지 않았던 농도의 인자 VIIa와 혈병 단단함의 더 이상의 증가가 관찰되지 않았던 농도의 인자 XIII를 조합함에 의해, 예상외로 혈병단단함의 더 이상의 증가가 얻어졌다는 것을 알았다. 또한, 인자 VIIa와 인자 XIII의 조합이 단독의 인자 VIIa 또는 인자 XIII 저해제보다 더욱 효과적으로 시험관내에서의 정상 사람 혈장에서 혈병 용해 시간을 연장시킬 수 있다는 것을 알았다. 따라서, 응고를 증진시킴에 의해 피험자에서 출혈의 더 효과적인 치료가 얻어질 수 있다. 더욱이, 환자는 비교적 저농도의 인자 VIIa로 치료될 수 있으며, 이로써 인자 VIIa만을 사용한 종래의 치료와 관련한 비교적 높은 비용을 줄일 수 있다.

제 1 양태로서, 본 발명은 인자 VIIa 및 인자 XIII, 그리고 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.

다른 양태로서, 본 발명은 유일한 활성제로서 인자 VIIa 및 인자 XIII, 그리고 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.

다른 양태로서, 본 발명은 인자 VIIa 및 인자 XIII, 그리고 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 정맥내 투여를 위해 조제된 제약학적 조성물에 관한 것이다.

다른 양태로서, 본 발명은 유일한 활성제로서 인자 VIIa 및 인자 XIII, 그리고 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 정맥내 투여를 위해 조제된 제약학적 조성물에 관한 것이다.

한 구체예에서, 인자 VIIa는 재조합 인자 VIIa이고 인자 XIII는 재조합 인자 XIII이다.

본 발명의 한 구체예에서 인자 VIIa는 재조합 인자 VIIa이다. 더 이상의 구체예에서 인자 VIIa는 재조합 사람 인자 VIIa이다. 더 이상의 구체예에서 인자 VIIa는 인자 VIIa 변이체이다.

한 구체예에서, 인자 VIIa 변이체는 야생형 인자 VIIa(즉, 미국 특허 번호 4,784,950에 개시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드)와 비교하여 대체, 결실 또는 삽입된 20개 이하의 아미노산을 갖는 아미노산 서열 변이체이다. 다른 구체예에서 인자 VIIa 변이체는, 야생형 인자 VIIa와 비교하여, 대체, 결실 또는 삽입된 15개 이하의 아미노산을 가지고; 다른 구체예에서 인자 VIIa 변이체는 대체, 결실 또는 삽입된 10개 이하의 아미노산을 가지고; 다른 구체예에서 인자 VIIa 변이체는 대체, 결실 또는 삽입된 8개 이하의 아미노산을 가지고; 다른 구체예에서 인자 VIIa 변이체는 대체, 결실 또는 삽입된 6개 이하의 아미노산을 가지고; 다른 구체예에서 인자 VIIa 변이체는 대체, 결실 또는 삽입된 5개 이하의 아미노산을 가지고; 다른 구체예에서 인자 VIIa 변이체는 대체, 결실 또는 삽입된 3개 이하의 아미노산을 가진다.

한 구체예에서, 인자 VIIa 변이체는 [L305V]-FVIIa, [L305V/M306D/D309S]-FVIIa, [L3051]-FVIIa, [L305T]-FVIIa, [F374P]-FVIIa, [V158T/M298Q]-FVIIa, [V158D/E296V/M298Q]-FVIIa 및 [K337A]-FVIIa의 리스트로부터 선택된다.

한 구체예에서 인자 XIII는 FXIII a2b2이다. 더 이상의 구체예에서 인자 XIII는 FXIII a2이다. 더 이상의 구체예에서 인자 XIII는 활성형 인자 XIII(FXIIIa)이다. 한 구체예에서 인자 XIII는 인자 XIII 변이체이다. 한 구체예에서 인자 XIII는 사람 인자 XIII이다. 한 구체예에서 인자 XIII는 재조합 인자 XIII이다. 한 구체예에서 인자 XIII는 재조합 사람 인자 XIII이다. 한 구체예에서 인자 XIII는 사람 a2-다이머이다.

한 양태로서, 조성물은 TFPI 저해제를 더 함유한다. 다른 양태로서, 조성물은 인자 VIII를 더 함유한다. 다른 양태로서, 조성물은 인자 VIII 및 TFPI 저해제를 더 함유한다.

한 구체예에서, 조성물은 피브린 용해 시스템의 저해제, 예를 들어 아프로티닌, ε-아미노카프로산 또는 트라넥삼산을 더 포함한다.

다른 양태로서, 본 발명은

a) 제 1 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIIa 및 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체;

b) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 인자 XIII 및 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체; 및

c) 상기 제 1 및 제 2 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단

을 포함하는 출혈 사건용 치료제를 함유하는 키트에 관한 것이다.

한 양태로서, 키트는

b) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 인자 XIII 및 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체;

c) 제 3 단위 투약 형태로 유효량의 TFPI 저해제 및 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체; 및

d) 상기 제 1, 제 2 및 제 3 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단

을 포함한다.

다른 양태로서, 본 발명은

a) 제 1 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIIa 및 TFPI 저해제, 그리고 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체;

c) 상기 제 1 및 제 2 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단

다른 양태로서, 본 발명은

b) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 인자 XIII 및 TFPI 저해제, 그리고 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체; 및

c) 상기 제 1 및 제 2 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단

다른 양태로서, 본 발명은

a) 제 1 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIIa 및 인자 XIII, 그리고 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체;

b) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 TFPI 저해제 및 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체; 및

c) 상기 제 1 및 제 2 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단

다른 양태로서, 본 발명은

c) 제 3 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIII 및 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체; 및

d) 제 4 단위 투약 형태로 유효량의 TFPI 저해제 및 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체; 및

e) 상기 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단

다른 양태로서, 키트는

b) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIII 및 선택적으로 제약학적으로허용되는 담체;

을 포함한다.

다른 양태로서, 본 발명은

a) 제 1 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIIa 및 인자 VIII, 그리고 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체;

c) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 TFPI-저해제 및 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체; 및

다른 양태로서, 본 발명은

b) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIII 및 TFPI 저해제, 그리고 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체; 및

c) 상기 제 1 및 제 2 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단

다른 양태로서, 본 발명은

a) 제 1 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIII 및 인자 XIII, 그리고 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체;

c) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIIa 및 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체; 및

다른 양태로서, 본 발명은

a) 제 1 단위 투약 형태로 유효량의 인자 XIII 및 TFPI 저해제, 그리고 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체;

b) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIII 및 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체; 및

e) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIIa 및 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체; 및

c) 상기 제 1, 제 2 및 제 3 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단

다른 양태로서, 본 발명은

a) 제 1 단위 투약 형태로 유효량의 TFPI 저해제 및 인자 VIII, 그리고 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체;

b) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIIa 및 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체; 및

f) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 인자 XIII 및 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체; 및

다른 양태로서, 본 발명은

a) 제 1 단위 투약 형태로 유효량의 TFPI 저해제 및 인자 XIII, 그리고 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체;

b) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIII 및 인자 VIIa, 그리고 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체; 및

c) 상기 제 1 및 제 2 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단

다른 양태로서, 본 발명은

b) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIII 및 인자 XIII, 그리고 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체; 및

c) 상기 제 1 및 제 2 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단

다른 양태로서, 본 발명은 출혈 사건을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 인자 XIII와 조합한 인자 VIIa의 사용에 관한 것이다.

다른 양태로서, 본 발명은 피험자에서 혈병화 시간을 단축시키기 위한 의약의 제조를 위한 인자 XIII와 조합한 인자 VIIa의 사용에 관한 것이다.

다른 양태로서, 본 발명은 포유류 혈장에서 혈병 용해 시간을 연장시키기 위한 의약의 제조를 위한 인자 XIII와 조합한 인자 VIIa의 사용에 관한 것이다.

다른 양태로서, 본 발명은 포유류 혈장에서 혈병 강도를 증가시키기 위한 의약의 제조를 위한 인자 XIII와 조합한 인자 VIIa의 사용에 관한 것이다.

다른 양태로서, 본 발명은 포유류 혈장에서 피브린 혈병 형성을 증진시키기위한 의약의 제조를 위한 인자 XIII와 조합한 인자 VIIa의 사용에 관한 것이다.

한 구체예에서, 포유류 혈장은 사람 혈장이다. 다른 구체예에서 포유류 혈장은 정상 혈장이고; 다른 구체예에서 혈장은 정상 사람 혈장이고; 한 구체예에서 혈장은 손상된 트롬빈 생성을 갖는 피험자로부터의 혈장이다. 한 구체예에서 혈장은 저하된 농도의 피브리노겐을 갖는 피험자로부터의 혈장이다.

한 구체예에서, 인자 VIIa 및 인자 XIII는 시험관내에서의 정상 사람 혈장에서 혈병 용해 시간을 연장시킨다.

다른 양태로서, 본 발명은 피험자에서 피브린 혈병 형성을 증진시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 유효량의 인자 XIII와 조합한 유효량의 인자 VIIa를 피험자에게 투여하는 것을 포함한다.

다른 양태로서, 본 발명은 피험자에서 출혈 사건을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 유효량의 인자 XIII와 조합한 유효량의 인자 VIIa를 피험자에게 투여하는 것을 포함한다.

다른 양태로서, 본 발명은 포유류 혈장의 혈병화 시간을 단축시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 유효량의 인자 XIII와 조합한 유효량의 인자 VIIa를 혈장과 접촉시키는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 유효량의 인자 XIII와 조합한 유효량의 인자 VIIa가 그러한 치료가 필요한 피험자에게 투여된다.

다른 양태로서, 본 발명은 피험자에서 피브린의 형성을 증진시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 유효량의 인자 XIII와 조합한 유효량의 인자 VIIa를 피험자에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명 방법의 한 구체예에서, 인자 VIIa 및 인자 XIII는 피험자에게 투여되는 유일한 활성제이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 유일한 활성제로서 인자 VIIa 및 인자 XIII를 포함한다.

본 발명의 한 구체예에서, 인자 VIIa 및 인자 XIII는 동시에 1개 투약 형태로 투여된다. 다른 구체예에서, 인자 VIIa 및 인자 XIII는 연속하여 투여된다. 더 이상의 구체예에서, 인자 VIIa 및 인자 XIII는 예를 들어 제 1 단위 투약 형태로 인자 VIIa를, 그리고 제 2 단위 투약 형태로 인자 XIII를 포함하는 키트의 형태로, 서로 약 1 내지 2시간 내에, 예를 들어 서로 30분 내에, 예를 들어 서로 10분 내에 투여된다.

한 구체예에서, 유효량의 인자 VIIa는 0.05mg/일 내지 500mg/일(70kg 피험자)이다. 한 구체예에서, 유효량의 인자 XIII는 0.05mg/일 내지 500mg/일(70kg 피험자)이다.

본 발명의 한 구체예에서, 제약학적 조성물(단일-제제 형태일 때)은 필수적으로 인자 VIIa 및 인자 XIII, 그리고 선택적으로 적어도 1가지의 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체, 및/또는 안정제, 및/또는 세제, 및/또는 중성염, 및/또는 항산화제, 및/또는 보존제, 및/또는 프로테아제 저해제로 구성된다.

본 발명의 다른 구체예에서, 제약학적 조성물(단일-제제 형태일 때)은 필수적으로 인자 VIIa 및 인자 XIII, 그리고 선택적으로 적어도 1가지의 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체, 및/또는 안정제, 및/또는 세제, 및/또는 중성염, 및/또는 항산화제, 및/또는 보존제, 및/또는 프로테아제 저해제, 및/또는 TFPI 저해제로 구성된다.

본 발명의 다른 구체예에서, 제약학적 조성물(단일-제제 형태일 때)은 필수적으로 인자 VIIa 및 인자 XIII, 그리고 선택적으로 적어도 1가지의 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체, 및/또는 안정제, 및/또는 세제, 및/또는 중성염, 및/또는 항산화제, 및/또는 보존제, 및/또는 프로테아제 저해제, 및/또는 TFPI 저해제, 및/또는 인자 VIII로 구성된다.

다른 구체예에서, 제약학적 조성물(키트 형태일 때)은 필수적으로 인자 VIIa 그리고 선택적으로 적어도 1가지의 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체, 및/또는 안정제, 및/또는 세제, 및/또는 중성염, 및/또는 항산화제, 및/또는 보존제, 및/또는 프로테아제 저해제로 구성된 제 1 단위 투약 형태; 및 필수적으로 인자 XIII 그리고 선택적으로 적어도 1가지의 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체, 및/또는 안정제, 및/또는 세제, 및/또는 중성염, 및/또는 항산화제, 및/또는 보존제, 및/또는 프로테아제 저해제로 구성된 제 2 단위 투약 형태로 구성된다.

다른 구체예에서, 제약학적 조성물(키트 형태일 때)은 필수적으로 인자 VIIa 그리고 선택적으로 적어도 1가지의 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체, 및/또는 안정제, 및/또는 세제, 및/또는 중성염, 및/또는 항산화제, 및/또는 보존제, 및/또는 프로테아제 저해제, 및/또는 TFPI 저해제로 구성된 제 1 단위 투약 형태; 및 필수적으로 인자 XIII 그리고 선택적으로 적어도 1가지의 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체, 및/또는 안정제, 및/또는 세제, 및/또는 중성염, 및/또는 항산화제, 및/또는 보존제, 및/또는 프로테아제 저해제, 및/또는 TFPI 저해제, 및/또는 인자 VIII로 구성된 제 2 단위 투약 형태로 구성된다.

더 이상의 구체예에서 피험자는 사람이고; 다른 구체예에서 피험자는 손상된 트롬빈 생성을 가지고; 한 구체예에서 피험자는 저하된 피브리노겐 혈장 농도를 가진다(예를 들어, 여러번 수혈된 환자).

더 이상의 양태로서, 조성물은 인자 VIII를 더 함유한다. 한 구체예에서, 인자 VIII는 활성형 인자 VIII(인자 VIIIa)이다. 더 이상의 구체예에서 인자 VIII는 재조합 인자 VIIIa이다. 더 이상의 구체예에서 인자 VIII는 재조합 사람 인자 VIIIa이다.

더 이상의 양태로서, 조성물은 피브린 용해 시스템의 저해제, 예를 들어 아프로티닌, ε-아미노카프로산 또는 트라넥삼산을 더 포함한다.

도면의 간단한 설명

도 1은 마이크로웰(총부피 250㎕)에서의 20nM Hepes, 150mM NaCl, 및 5mM CaCl₂, pH 7.4를 함유하는 완충액중에 1/10로 희석된 시트레이트화된 정상 사람 혈장(NHP)에서 자발적 혈병 형성이 약 2500 내지 3000초에서 얻어졌음을 나타낸다. 피브린 혈병 형성은 Specramax^TM340(몰리큘라 디바이스, 캘리포니아 서니베일)에서 600nm에서의 광학 밀도의 증가에 의해 모니터되었다. 도 1은 노보 노르디스크 에이/에스(덴마크 박스바에르트)로부터의 10nM 재조합 인자 VIIa(rFVIIa)가 혈병화 시간을 1600초까지 단축시켰음을 나타낸다(n=2). 혈병화 시간의 더 이상의 단축은 아메리칸 다이아그노스티카 인코퍼레이티드(코네티컷 그린위치)로부터의 30nM 인자XIII(FXIII)를 10nM rFVIIa와 함께 첨가했을 때 얻어졌다(n=3). FXIII의 존재하에서 형성된 혈병은 그것의 부재하에서보다 더 투명했으며(더 낮은 최대 OD), 이것은 FXIII의 첨가가 더 얇은 섬유를 갖는 더 미세한 메시의 피브린 겔 구조를 가져왔다는 것을 나타낸다.

도 2는 보충된 FXIII(30nM)이 rFVIIa 및 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)의 존재하에 형성된 혈병의 피브린 혈병 용해 시간을 연장시킴을 나타낸다. 혈병 형성은 노보 노르디스크 에이/에스(덴마크 박스바에르트)로부터의 50nM rFVIIa 및 0.5nM 재조합 tPA를 함유하는 225㎕ 20nM Hepes, 150mM NaCl, 5mM CaCl₂, pH 7.4에 25㎕ NHP를 첨가함에 의해 30nM XIII의 존재 또는 부재하에서 유도되었다. tPA-매개 플라스미노겐 활성화에 의해 유도된 혈병 형성 및 후속 혈병 용해는 Spectramax340에 의해 600nm에서 OD_600nm의 증가에 이은 극미량의 기초 레벨로의 복귀로써 모니터되었다. 도 2는 이들 조건하에서의 혈병 용해 시간이 FXIII의 존재에 의해 유의하게 연장되었다는 것을 나타낸다.

도 3은 최대 혈병 단단함(MCF) 뿐만 아니라 tPA-매개 용해에 대한 혈병 내성에 대한 rFVIIa 및 FXIII의 효과를 나타낸다. rFVIIa 및/또는 FXIII를 첨가하기 전에 얻어진 MCF는 25mm였고 혈병의 반이 용해되는데 필요한 시간은 12.3분이었다(도 3). FXIII의 농도를 증가시키면서(0 내지 40nM) 첨가하는 것은 MCF를 변경시키지 않았지만, 반-혈병 용해의 용량-의존성 연장이 관찰되었으며 이것은 30nM FXIII에서 최적이었다(반-혈병 용해 시간: 14.3분, 도 3). 유사하게, rFVIIa(1nM)의 첨가는 MCF에 대한 어떤 효과도 없이 tPA-매개 피브린 용해로부터 혈병을 보호(반-혈병 용해 시간: 16.4분)했다(도 3). 그러나, FXIII(30nM)와 함께 rFVIIa(1nM)을 첨가했을 때는 MCF의 증가(29mm) 뿐만 아니라 피브린 용해로부터 충분한 보호(반-혈병 용해 시간: 27.1분)가 관찰되었다(도 3). 합쳐서 생각하면 이들 결과는 시너지 방식으로 혈장에 rFVIIa 및 FXIII를 첨가하는 것이 혈병의 기계적 강도 및 tPA-매개 피브린 용해에 대한 내성을 개선시킨다는 것을 증명한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 인자 VIIa와 인자 XIII의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 유일한 활성 성분으로서 인자 VIIa와 인자 XIII의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 단일 조성물의 형태이거나 또는 다-성분 키트의 형태일 수 있다. 본 조성물은 치료적 및 예방적 전응고제 및 피브린 혈병-안정제로서 유용하며, 사람과 같은 영장류를 포함하는 포유류에서 빠른 피브린 혈병을 형성한다.

제 1 또는 제 2 또는 제 3 등의 단위 용량이 본 명세서에서 언급될 때마다 반드시 이 용량이 바람직한 정도의 투여를 나타내는 것은 아니나 단지 편의를 위해 단위 용량이라고 언급된다.

본 발명은 사람을 포함하는 피험자에서 예를 들어 외상 또는 수술로 인한 출혈 사건, 또는 혈액 응고 인자 FIX 또는 FVIII 또는 혈소판을 결여하거나 또는 이것에 결함을 갖는 피험자에서의 출혈 사건을 치료(예방적 치료 또는 예방을 포함)하는 방법을 더 제공한다.

인자 VIIa와 인자 XIIIa의 조합이 고상의 안정하고 빠른 지혈 플러그의 형성을 확보하는 유리한 생성물이라는 것이 밝혀졌다.

충분한 트롬빈 생성이 고상의 안정한 지혈 플러그가 형성되는데 필요하다. 그러한 플러그의 피브린 구조는 형성된 트롬빈의 양 및 초기 트롬빈 생성 속도에 모두 의존한다. 손상된 트롬빈 생성의 존재하에서는 고도로 투과성인 다공성 피브린 플러그가 형성된다. 피브린 용해 효소는 보통 피브린 표면에 존재하며 그러한 피브린 플러그를 쉽게 용해시킨다. 또한, 안정한 피브린 플러그의 형성은 트롬빈에 의해 활성화되고 따라서 또한 충분한 트롬빈 생성에 의존하는 인자 XIIIa의 존재에 의존한다. 더욱이, 최근 설명된 트롬빈 활성화가능한 피브린 용해 저해제인 TAFI는 그것의 활성화를 위해 다소 높은 트롬빈 양을 필요로 한다. 따라서, 충분하지 않은 트롬빈 형성의 존재하에서 TAFI는 활성화될 수 없으며 그 결과 정상 피브린 용해 활성에 의해 통상 용해되는 것보다 더 쉽게 용해되는 지혈 플러그의 형성을 가져온다.

트롬빈 생성을 증가시킴에 의해 인자 VIIa는 충분한 인자 XIII 활성화에 대한 기초를 제공하고, 이것은 충분히 안정화된 지혈 플러그의 형성에 가장 중요하며 따라서 지혈의 유지에도 중요하다. 혈소판의 수가 저하된 상황인 혈소판감소증에서, 더 빠른 트롬빈 생성이 가외의 인자 VIIa의 외인성 투여에 의해 개시된다. 그러나, 총 트롬빈 생성은 심지어 고농도의 인자 VIIa에 의해서도 정상화되지 않는다.

인자 VIIa와 인자 XIII, 특히 인자 XIII 알파 사슬(a2-다이머)를 조합함에의해 인자 XIII의 충분한 활성화가 용이해져 인자 VIIa의 지혈 효과를 증진시킨다.

더욱이, 피브리노겐의 혈장 농도가 저하된 피험자(다수의 외상 또는 대규모 수술의 결과로서 여러번 수혈된 피험자)에서는 충분한 인자 XIII 활성화가 일어나지 않는다. 다음에, 더욱 효과적인 지혈이 인자 VIIa와 인자 XIII의 조합의 투여에 의해 얻어진다.

피브린 지혈 플러그의 안정성을 증가시키는 다른 방식은 인자 XIIIa(활성형 인자 XIII)의 충분한 존재를 확보하는 것이다.

혈소판감소증을 갖는 피험자는 손상된 트롬빈 생성 뿐만 아니라 피브린 플러그의 안정성 결함을 가지며, 그 결과 조급히 용해하는 경향이 있는 지혈 플러그를 가져온다. 더욱이, 위험한 외상 또는 기관 손상을 입어서 결국 자주 혈액을 수혈받아야 하는 피험자는 종종 혈소판 수가 저하될 뿐만 아니라, 피브리노겐, 인자 VIII, 및 다른 응고 단백질의 레벨도 저하된다. 이들 피험자는 손상된(또는 저하된) 트롬빈 생성을 경험한다. 게다가, 그들의 저하된 피브리노겐 레벨은 인자 XIII의 활성화를 부정적으로 방해한다. 따라서, 이들 피험자는 피브린 용해 효소에 의해 쉽게 그리고 조급하게 용해되는 피브린 플러그의 형성을 가져오는 결함있거나 또는 덜 효과적인 지혈을 가지며, 게다가 그러한 효소는 광범한 외상 및 기관 손상을 특징으로 하는 상황에서 광범하게 방출된다.

피험자에서 지혈을 유지할 수 있는 충분한 능력을 갖는 충분히 안정화된 플러그의 형성을 용이하게 하기 위해서, 본 발명에 따르는 조성물이 투여된다. 이 조성물은 혈소판의 수가 저하된 피험자 및 피브리노겐 및/또는 다른 응고 단백질의혈장 레벨이 저하된 피험자에서 특히 유리하다.

인자 XIII의 존재하에서는 더 낮은 농도의 인자 VIIa가 충분한 지혈을 확보하는데 충분할 수 있다.

상술된 바와 같이, 인자 XIII는 2개의 알파-서브유닛 및 2개의 베타-서브유닛으로 구성된 테트라머 지모겐(a2ba2로 표시)으로서 혈장에 존재하지만, a2-다이머로서 다른 조직(예를 들어, 혈소판)에서도 발견된다. 이들 지모겐 형태 중 어느 것 또는 활성형 인자 XIII(인자 XIIIa)가 본 발명 내에서 사용될 수 있으며, 그것의 특징적인 교차결합 활성을 보유한 인자 XIII의 유전조작된 변이체가 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있다. 한 구체예에서 인자 XIII는 사람 인자 XIII이고; 다른 구체예에서 인자 XIII는 사람 a2-다이머이고; 또 다른 구체예에서 인자 XIII는 활성형 사람 인자 XIIIa이다.

본 발명에 사용되는 인자 XIII 및 인자 VIIa는 혈액으로부터 정제되거나 또는 재조합 수단에 의해 생성될 수 있다. 본원에 설명된 방법의 실행은 정제된 인자 XIII 및 인자 VIIa가 어떻게 유래되는지에는 무관하며, 따라서 본 발명은 본원에 사용하기에 적합한 어떤 인자 XIII 및 인자 VIIa 제제의 사용을 커버하도록 고려된다는 것이 분명하다. 바람직한 것은 사람 인자 VIIa 및 사람 인자 XIII이다. 또한, 그것들의 특징적인 지혈-관련 활성을 보유하고 있는 인자 VIIa 및 인자 XIII의 유전조작된 변이체가 본 발명에 사용될 수 있다. 또한, 그것들의 특징적인 지혈-관련 활성을 보유하고 있는 인자 VIIa 또는 인자 XIII 또는 인자 VIIa- 또는 인자 XIII-변이체의 단편이 본 발명에 사용될 수 있다. 인자 VIIa의 지혈-관련 활성은 예를 들어 본 명세서에 설명된 인자 VIIa-활성 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 인자 XIII의 지혈-관련 활성은 예를 들어 본 명세서에 설명된 인자 XIII-활성 분석을 사용하여 측정될 수 있다.

야생형 인자 VIIa와 비교하여 실질적으로 동일하거나 또는 더 나은 생물학적 활성을 갖는 인자 VII 변이체의 비제한적인 예는 덴마크 특허 출원 번호 PA 2000 00734, PA 2000 01360, PA 2000 01361 및 PA 2001 00477에 설명된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 비제한적인 예는 [L305V]-FVIIa, [L305WM306D/D309S]-FVIIa, [L305I]-FVIIa, [L305T]-FVIIa, [F374P]-FVIIa, [V158T/M298Q]-FVIIa, [V158D/E296V/M298Q]-FVIIa 및 [K337A]-FVIIa를 포함한다.

본 문맥에서 아미노산의 3-문자 또는 1-문자 표시는 표 1에 나타낸 그것들의 종래의 의미대로 사용된다. 명백하게 다른 지시가 없다면 본원에 언급된 아미노산은 L-아미노산이다. 예를 들어 K337에서 첫번째 문자는 야생형 인자 VII의 지적된 위치에 천연적으로 존재하는 아미노산을 나타낸다는 것이 이해되어야 한다. 즉, 예를 들어 [K337A]-FVIIa는 지적된 위치에 천연적으로 존재하는 1-문자 코드 K로 표시한 아미노산이 1-문자 코드 A로 표시한 아미노산에 의해 대체된다는 것이다.

아미노산의 약자

아미노산	3-문자 코드	1-문자 코드
글리신	Gly	G
프롤린	Pro	P
알라닌	Ala	A
발린	Val	V
로이신	Leu	L
이소로이신	Ile	I
메티오닌	Met	M
시스테인	Cys	C
페닐알라닌	Phe	F
티로신	Tyr	Y
트립토판	Trp	W
히스티딘	His	H
리신	Lys	K
아르기닌	Arg	R
글루타민	Gln	Q
아스파라긴	Asn	N
글루탐산	Glu	E
아스파르트산	Asp	D

용어 "인자 VIIa" 또는 "FVIIa"는 상호 교환하여 사용될 수 있다. 용어 인자 VIIa는 지모겐 인자 VII(단일-사슬 인자 VII)를 포함한다. 용어 "인자 XIII" 또는 "FXIII"는 상호 교환하여 사용될 수 있다. 용어 "인자 VIII" 또는 "FVIII"는 상호 교환하여 사용될 수 있다.

인자 VIIa 또는 인자 XIII-분자의 기능에 불가결한 영역 밖에서 치환이 있을 수 있으며 그 결과도 여전히 활성 폴리펩티드라는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 인자 VIIa 또는 인자 XIII-폴리펩티드의 활성에 필수적이며 따라서 치환되지 않는 것이 바람직한 아미노산 잔기가 부위-지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발과 같은 본 분야에 공지된 과정에 따라서 확인될 수 있다(예를 들어, Cu-nningham 및 Wells, 1989, Science 244: 1081-1085 참조). 후자의 기술에서, 돌연변이는 분자에 있는 모든 양으로 하전된 잔기에 도입되며, 결과의 돌연변이 분자가 각각 교차결합 활성인 응고제에 대해 시험되어 분자의 활성에 불가결한 아미노산 잔기가 확인된다. 또한, 기질-효소 상호작용의 부위가 핵자기공명 분석, 결정학또는 광친화성 표지화와 같은 기술에 의해 측정된 3-차원 구조의 분석에 의해 측정될 수 있다(예를 들어, de Vos 등, 1992, Science 255: 306-312; Smith 등, 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver 등, 1992, FEBS Letters 309: 59-64 참조).

1개 뉴클레오티드를 다른 뉴클레오티드로 바꾸기 위한 핵산 서열로의 돌연변이의 도입은 본 분야에 공지된 방법 중 어느 것을 사용하여 부위-지정 돌연변이유발에 의해 달성될 수 있다. 특히 유용한 것은 관심의 삽입을 갖는 초선륜 이중가닥 DNA 벡터 및 원하는 돌연변이를 함유하는 2개의 합성 프라이머를 이용하는 과정이다. 벡터의 반대 가닥에 각각 상보하는 올리고뉴클레오티드 프라이머가PfuDNA 폴리머라제에 의해 온도 순환 동안 연장된다. 프라이머의 통합시 비틀린 틈을 함유하는 돌연변이된 플라스미드가 생성된다. 온도 순환 후 생성물은 메틸화 및 헤미메틸화된 DNA에 특이적인Dpnl로 처리되어 모 DNA 주형이 다이제션되고 돌연변이를 함유하는 합성된 DNA가 선택된다. 예를 들어 유전자 셔플링 또는 파지 디스플레이 기술과 같은 변이체를 만들고 확인하고 분리하는 본 분야에 공지된 다른 과정이 또한 사용될 수 있다.

용어 "인자 VIII" 또는 "FVIII"는 그것의 특징적인 응고제 활성을 보유하는 활성형 인자 VIII(인자 VIIIa로 표시), 변이체 및 절형된 형태의 인자 VIII를 포함한다. 한 구체예에서, 인자 VIII는 사람 인자 VIII이다.

용어 "TFPI 저해제"는 TFPI(조직 인자 경로 저해제)의 항-응고 활성을 저해하는 화합물을 의미한다. 이 용어는 유럽 특허 번호 558,529, WO 96/28153 및 US5,622,988에 개시된 것들과 같은 화합물을 포함한다. "TFPI" 및 "EPI"(외래 경로 저해제)는 상호 교환하여 사용될 수 있다.

본 발명 내에서, 인자 VIIa의 "유효량" 및 인자 XIII의 "유효량"은 출혈 또는 혈액 손실을 예방 또는 감소시킴으로써 질환 및 그것의 합병증을 치유, 완화 또는 부분적으로 정지시키기에 충분한 인자 VIIa 및 인자 XIII의 양으로서 정의된다.

본 발명에 따라서 투여되는 인자 VIIa의 양 및 인자 XIII의 양은 약 1:100의 비율에서 약 100:1의 비율까지 변할 수 있다(㎍ 인자 VIIa: ㎍ 인자 XIII).

본 문맥에서, "손상된 트롬빈 생성을 갖는 피험자"는 활성화된 혈소판 표면에서 충분한 트롬빈 방출을 생성할 수 없는 피험자를 의미하며, 응고 인자, 혈소판 및 피브리노겐의 정상적인 양 및 기능을 포함하여 충분히 기능중인 정상 지혈 시스템을 갖는 피험자에서의 트롬빈-생성보다 적은 트롬빈의 생성을 갖는 피험자를 포함하고, FXI 및/또는 FVIII(혈우병 A 및 B)를 결여하고 있거나 또는 결함있는 FIX 및/또는 FVIII를 가지거나 또는 FIX 및/또는 FVIII에 대한 저해제를 갖는 피험자; FXI를 결여하고 있는 피험자; 저하된 수의 혈소판 또는 결함있는 기능을 갖는 혈소판을 갖는 피험자(예를 들어, 혈소판감소증 또는 혈소판무력증 글란쯔만 또는 과도한 출혈을 갖는 피험자); 및 저하된 레벨의 프로트롬빈, FX 또는 FVII를 갖는 피험자를 포함한다.

또한, 피브리노겐의 혈장 농도가 저하된 피험자(예를 들어, 다수의 외상 또는 대규모 수술의 결과로서 여러번 수혈된 피험자)가 쉽게 용해되는 느슨하고 불안정한 피브린 플러그의 형성으로 고통받는다.

용어 "충분한 지혈"는 출혈을 효과적으로 중지시킬 수 있고 피브린 용해 시스템에 의해 쉽게 용해되지 않는 상처 부위에서의 안정한 고상 피브린 혈병 또는 플러그의 형성을 의미한다.

용어 "인자 VIIa의 활성" 또는 "인자 VIIa-활성"은 트롬빈을 생성하는 능력을 의미하며, 또한 이 용어는 조직 인자의 부재하에 활성화된 혈소판의 표면에서 트롬빈을 생성하는 능력을 포함한다.

용어 "정상 지혈 시스템의 증진"은 트롬빈을 생성하는 능력의 증진을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "출혈 장애"는 출혈시 명백해지는 세포 또는 분자 기원의 선천적, 후천적 또는 유도된 어떤 결함을 반영한다. 예는 혈병 인자 결핍(예를 들어, 혈우병 A 및 B 또는 응고 인자 XI 또는 VII의 결핍), 혈병 인자 저해제, 결함있는 혈소판 기능, 혈소판감소증 또는 폰빌레브란드병이다.

용어 "출혈 사건"는 수술 또는 어떤 형태의 조직 손상에 모두 관련된 주된 문제인 제어되지 않는 과도한 출혈을 포함하는 것을 의미한다. 제어되지 않는 과도한 출혈은 기본적으로 정상 응고 시스템을 갖는 피험자(그러나 이들 피험자는 출혈의 결과로서 응고병증을 나타낸다 - 출혈의 희석 효과로 인한 응고 단백질의 희석, 증가된 피브린 용해 및 저하된 혈소판) 및 응고 또는 출혈 장애를 갖는 피험자에서 일어날 수 있다. 혈병화 인자 결핍(혈우병 A 및 B, 응고 인자 XI 또는 VII의 결핍) 또는 혈병화 인자 저해제는 출혈 장애의 원인일 수 있다. 또한, 과도한 출혈은 정상적으로 기능중인 혈액 혈병화 캐스캐이드를 갖는 피험자(혈병화 인자 결핍 또는 응고 인자 중 어느 것에 대한 저해제가 없는)에서 발생하며, 결함있는 혈소판 기능, 혈소판감소증 또는 폰빌레브란드병에 기인할 수 있다. 그러한 경우에 출혈은 혈우병에 기인하는 출혈과 유사할 수 있으며, 이는 혈우병에서처럼 지혈 시스템이 위험한 출혈을 일으킬 수 있는 비정상적인 필수 혈병화 "화합물"(혈소판 또는 폰빌레브란드 인자 단백질과 같은)을 결여하거나 또는 이를 가지기 때문이다. 수술 또는 큰 외상에 관련된 과도한 조직 손상을 경험한 피험자에서, 정상 지혈 메카니즘은 즉각적인 지혈의 요구에 의해 압도될 수 있으며, 그것들은 기본적으로(이전-외상) 정상인 지혈 메카니즘에도 불구하고 출혈을 발생시킬 수 있다. 또한, 만족스러운 지혈을 달성하는 것은, 외과적 지혈에 대해 제한된 가능성을 갖는 뇌, 내이 영역 및 눈과 같은 기관에서 출혈이 일어날 때 문제가 된다. 동일한 문제가 여러 기관(간, 폐, 종양 조직, 위장관)으로부터 바이옵시스를 취하는 과정에서 뿐만 아니라 복강경 수술에서도 발생할 수 있다. 모든 이들 상황에 공통적인 것은 외과적 기술(봉합, 클립 등)에 의한 지혈을 제공하는 것이 어렵다는 점이며, 이것은 또한 출혈이 확산(성기 출혈 및 대량 자궁 출혈)될 때도 마찬가지다. 또한, 급성 및 대량 출혈이 항응고제 치료중인 피험자에서 발생할 수 있으며, 이 경우 결함있는 지혈이 주어진 치료법에 의해 유도된다. 그러한 피험자는 항응고제 효과가 빠르게 상쇄되지 않는 경우에 외과적 개입이 필요할 수 있다. 근치적 치골후 전립선 절제술은 국부적 전립전암을 갖는 피험자를 위해 흔하게 수행되는 과정이다. 이 수술은 유의한 언젠가의 대량 혈액 손실에 의해 자주 악화된다. 전립선 절제술 동안의 상당한 혈액 손실은 외과적 지혈을 위해 쉽게 접근할 수 없는 다양한 조밀하게 혈관화된 부위를 갖는 악화된 해부학적 상황에 주로 관계되며, 이것은 큰 영역으로부터 출혈의 확산을 가져올 수 있다. 만족스럽지 않은 지혈의 경우에 문제를 일으킬 수 있는 다른 상황은 혈전색전증 질환을 예방하기 위해서 정상적인 지혈 메카니즘을 갖는 피험자에게 항응고제 치료를 제공할 때이다. 그러한 치료법은 헤파린, 다른 형태의 프로테오글리칸, 와파린 또는 다른 형태의 비타민 K-길항제 뿐만 아니라 아스피린 및 다른 혈소판 응집 저해제를 포함한다.

본 발명의 한 구체예에서 출혈은 혈우병에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 후천적 저해제를 갖는 혈우병에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 혈소판감소증에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 폰빌레브란드병에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 심한 조직 손상에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 수술에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 복강경 수술에 관련된다. 다른 구체예에서 수술은 성기 출혈에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 대량 자궁 출혈에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 메카니즘적 지혈에 대한 제한된 가능성을 갖는 기관에서 발생한다. 다른 구체예에서 출혈은 뇌, 내이 영역 또는 눈에서 발생한다. 다른 구체예에서 출혈은 바이옵시스를 취하는 과정에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 항응고제 치료에 관련된다.

본 발명에 따르는 조성물은 TFPI 저해제를 더 포함할 수 있다. 그러한 조성물은 혈우병 A 또는 B를 갖는 피험자에게 투여되는 것이 바람직해야 한다.

본 발명에 따르는 조성물은 인자 VIII를 더 포함할 수 있다. 그러한 조성물은 인자 VIII에 대한 저해제를 갖지 않는 피험자에게 투여되는 것이 바람직해야 한다.

본 문맥에서, 용어 "치료"는 출혈의 저해 또는 최소화라는 취지에서, 예를 들어 수술에서와 같은 예상된 출혈의 예방, 및 예를 들어 혈우병 또는 외상에서와 같은 이미 발생한 출혈의 조절을 포함하는 것을 의미한다. 따라서, 인자 VIIa 및 인자 XIII의 예방적 투여가 용어 "치료"에 포함된다.

본원에 사용된 용어 "피험자"는 어떤 동물, 특히 포유류, 예를 들어 사람을 포함하도록 의도되며, 적합한 경우 용어 "환자"와 상호 교환하여 사용될 수 있다.

약자

TF 조직 인자

FVII 단일-사슬 불활성형 인자 VII

FVIIa 활성형 인자 VII

rFVIIa 활성형 재조합 인자 VII

FXIII 지모겐의 불활성형 인자 XIII

FXIIIa 활성형 인자 XIII

rFXIII 재조합 FXIII

rFXIIIa 재조합 FXIIIa

a2 FXIII 또는 rFXIII의 알파- 또는 a-사슬

b2 FXIII 또는 rFXIII의 베타- 또는 a-사슬

FXIIIa2 2개의 a-사슬을 함유하는 FXIII의 다이머 형태

FXIIIa2b2 2개의 a- 및 2개의 b-사슬을 함유하는 FXIII의 테트라머 형태

FVIII 지모겐의 불활성형 인자 VIII

rFVIII 재조합 FVIII

FVIIIa 활성형 인자 VIII

rFVIIIa 재조합 FVIIIa

TFPI 조직 인자 경로 저해제

화합물의 제조

본 발명에 사용하기에 적합한 정제된 사람 인자 VIIa는 바람직하게 DNA 재조합 기술에 의해 만들어지며, 예를 들어 Hagen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416, 1986에 설명되거나 또는 유럽 특허 번호 200.421(지모지네틱스 인코퍼레이티드)에 설명된다. 재조합 기술에 의해 생성된 인자 VIIa는 출처가 분명한 인자 VIIa 또는 더 많거나 더 적게 변형된 인자 VIIa일 수 있으며, 단 그러한 인자 VIIa는 혈액 응고에 대해 출처가 분명한 인자 VIIa(야생형 인자 VIIa)와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 가진다. 그러한 변형된 인자 VIIa는 공지된 수단, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발에 의해 천연 인자 VII를 코드하는 핵산에 있는 아미노산 코돈을 바꾸거나 또는 아미노산 코돈의 일부를 제거함으로써 야생형 인자 VII를 코드하는 핵산 서열을 변형시킴에 의해 생성될 수 있다.

또한, 인자 VII는 Broze 및 Majerus, J. Biol. Chem. 255(4): 1242-1247, 1980 및 Hedner 및 Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841, 1983에 설명된 방법에 의해 생성될 수 있다. 이들 방법으로 검출가능한 양의 다른 혈액 응고 인자를 갖지 않는 인자 VII를 얻는다. 심지어 더 정제된 인자 VII 제제가 최종 정제 단계로서 추가의 겔 여과를 포함시킴에 의해 얻어질 수 있다. 그후, 인자 VII가 공지된 수단, 예를 들어 인자 XIIa, IXa 또는 Xa와 같은 몇가지 상이한 혈장 단백질에 의해 활성형 인자 VIIa로 전환된다. 또는 달리, Bjoern 등(Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565)에 설명된 대로 인자 VII는 모노 Q(파마시아 파인 케미칼스) 등과 같은 이온-교환 크로마토그래피 칼럼을 통해 그것을 통과시킴으로써 활성화될 수 있다.

본 발명 내에서 사용되는 인자 XIII는 본원에 참고자료로 수록된 Cooke 및 Holbrook(Biochem. J. 141: 79-84, 1974) 및 Curtis 및 Lorand(Methods Enzymol, 45: 177-191, 1976)에 설명된 것들과 같은 공지된 방법에 따라 혈장으로부터 제조될 수 있다. 인자 XIII의 a2-다이머 형태는 본원에 참고자료로 수록된 미국 특허 번호 3,904,751; 3,931,399; 4,597,899 및 4,285,933에 개시된 바와 같이 태반으로부터 제조될 수 있다. 그러나, 질환 전염의 위험을 지니는 혈액- 또는 조직-유래된 생성물의 사용을 피하기 위해서 재조합 인자 XIII를 사용하는 것이 바람직하다. 재조합 인자 XIII의 제조 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 그 전체가 참고자료로 수록된 Davie 등, EP 268,772; Grundmann 등, AU-A-69896/87; Bishop 등, Biochemistry 1990, 29: 1861-1869; Board 등, Thromb. Haemost. 1990, 63: 235-240; Jagadeeswaran 등, Gene 1990, 86: 279-283; 및 Broker 등, FEBS Lett. 1989, 248: 105-110 참조. 한 구체예에서, 인자 XIII a2-다이머는 공동 계류중인 미국 특허 출원 일련 번호 07/741,263(본원에 그 전체가 참고차료로 수록됨)에 개시된 대로 이스트 사카로미세스 세레비시아에에서 세포질적으로 제조된다.세포가 수집되어 용해되며, 깨끗한 세포 용해액이 제조된다. 세포 용해액은 DEAE 패스트-플로우 세파로스^TM(파마시아)과 같은 유도된 아가로스의 칼럼을 사용하여 중성 내지 약간 알칼리성인 pH에서 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분별된다. 다음에, 인자 XIII가 용출액을 농축하고, pH를 5.2 내지 5.5로 조정함에 의해, 예를 들어 암모늄 숙시네이트 완충액에 대한 투석여과에 의한 것과 같이, 칼럼 용출액으로부터 침전된다. 다음에, 침전물이 용해되고 겔 여과 및 소수성 상호작용 크로마토그래피와 같은 종래의 크로마토그래피 기술을 사용하여 더 정제된다.

당업자에 의해 인정되는 대로, 면역 반응 유도의 위험을 줄이기 위해서 피험자와 공통 유전자인 인자 XIII 및 인자 VIIa 단백질을 사용하는 것이 바람직하다. 비-사람 인자 XIII의 제조 및 특성화는 Nakamura 등(J. Biochem. 78: 1247-1266, 1975)에 의해 개시되었다. 또한, 본 발명은 수의과적인 과정 내에서 그러한 인자 XIII 및 인자 VIIa를 사용하는 것을 포함한다.

투여 및 제약학적 조성물

의도적인 개입과 관련된 치료에 대해서, 인자 VII 및 인자 XIII는 전형적으로 개입을 수행하기 전 약 24시간 내에 투여되며, 그후 약 7일 이상 정도 투여될 것이다. 응고제로서의 투여는 본원에 설명된 여러 경로에 의할 수 있다.

인자 VII의 용량은 로딩 및 유지 용량으로서 70kg 피험자에 대해 약 0.05mg 내지 약 500mg/일의 범위이며, 예를 들어 약 1mg 내지 약 200mg/일, 또는 예를 들어 약 10mg 내지 약 175mg/일이고, 이것은 피험자의 체중, 상태 및 상태의 심함에의존한다.

인자 XIII의 용량은 로딩 및 유지 용량으로서 70kg 피험자에 대해 약 0.05mg 내지 약 500mg/일의 범위이며, 예를 들어 약 1mg 내지 약 200mg/일, 또는 예를 들어 약 10mg 내지 약 175mg/일이고, 이것은 피험자의 체중, 상태 및 상태의 심함에 의존한다.

본 발명의 조성물 및 키트는, 사람 및 수의학적 의학의 범위 내에서, 예를 들어 출혈 사건 또는 응고 장애로 고통받는 피험자의 치료 및 예방에서 유용하다. 본 발명 내에서의 사용에 대해서, 인자 VIIa 및 인자 XIII는 선택적으로 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 조제된다. 바람직하게, 제약학적 조성물은 비경구적으로, 즉 정맥내, 피하 또는 근육내적으로 투여되거나, 또는 연속 또는 박동성 주입에 의해 투여될 수 있다.

조제물은 1가지 이상의 희석제, 유화제, 보존제, 완충액, 부형제 등을 포함하며, 액체, 가루, 에멀젼, 제어 방출 등과 같은 형태로 제공될 수 있다. 당업자는 적합한 방식으로, 그리고 Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1990에 개시된 것들과 같은 용인된 기술에 따라서 본 발명의 조성물을 조제할 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게 수성 담체와 조합하여, 바람직하게는 이 중에 용해하여 인자 VII 및 인자 XIII를 포함한다. 물, 완충수, 0.4% 살린, 0.3% 글리신 등과 같은 여러 가지 수성 담체가 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 인자 VII 변이체가 상처 부위로 송달하거나 또는 상처 부위를 표적화 하기 위해 리포솜 제제로 조제될수 있다. 리포솜 제제는 일반적으로 예를 들어 U.S. 4,837,028, U.S. 4,501,728 및 U.S. 4,975,282에 설명된다.

정맥내 주입용의 전형적인 제약학적 조성물은 멸균 링거액 250ml 및 인자 VIIa 및/또는 인자 XIII 10mg을 함유하도록 만들어질 수 있다. 비경구적으로 투여할 수 있는 조성물을 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 또는 명백할 것이며, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Pubilshing Company, Easton, PA (1990)에 더욱 상세히 설명된다.

간단히 말해서, 본 발명에 따라서 사용하는데 적합한 제약학적 조성물은 바람직하게 정제된 형태의, 인자 VIIa, 또는 인자 XIII, 또는 인자 XIII와 조합한 인자 VIIa를 적합한 보조제 및 적합한 담체 또는 희석제와 혼합함에 의해 만들어진다. 적합한 생리학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 멸균수 및 살린을 포함한다. 조성물은 생리학적인 조건에 가깝게 할 필요에 따라서 pH 조정 및 완충제, 강직성 조정제 등, 예를 들어 나트륨 아세테이트, 나트륨 락테이트, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘 등과 같은 제약학적으로 허용되는 보조제 물질을 함유할 수 있다. 또한, 적합한 보조제는 정제된 인자 VIIa 및/또는 인자 XIII를 안정화시키기 위해서 칼슘, 단백질(예를 들어, 알부민), 또는 다른 불활성 펩티드(예를 들어 글리실글리신) 또는 아미노산(예를 들어, 글리신 또는 히스티딘)을 포함한다. 다른 생리학적으로 허용되는 보조제는 비-환원 당, 폴리알콜(예를 들어, 소르비톨, 만니톨 또는 글리세롤), 저분자량 덱스트린과 같은 다당, 세제(예를 들어, 폴리소르베이트) 및 항산화제(예를 들어, 중아황산염 및 아스코르베이트)이다. 보조제는 일반적으로 0.001 내지 4% w/v의 농도로 존재한다. 또한, 제약학적 조성물은 프로테아제 저해제, 예를 들어 아프로티닌 또는 트라넥삼산, 및 보존제를 함유할 수 있다. 더욱이 또한, 제제는 TFPI 저해제 및/또는 인자 VIII를 함유할 수 있다.

조성물은 종래의 잘 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 결과의 수성 용액은 사용을 위해 패키지 되거나, 또는 무균 상태에서 여과되고 동결건조되며, 이 동결건조된 제제가 투여 전에 멸균 수용액과 조합된다.

이들 조제물에 있는 인자 VIIa, 인자 XIII 또는 인자 XIII와 조합한 인자 VIIa의 농도는 광범하게 변할 수 있으며, 즉 약 0.5중량% 미만에서부터, 통상 약 1중량% 또는 적어도 1중량%, 15 또는 20중량% 정도까지이고, 이것은 선택된 특정한 투여 모드에 따라서 유체 부피, 점도 등에 의해 주로 선택될 것이다.

주사 또는 주입에 의한 투여, 특히 주입에 의한 것이 바람직하다. 따라서, 인자 VIIa 및 인자 XIII는, 1개 투약 형태에 인자 VIIa 및 인자 XIII를 모두 함유하는 용해된 동결건조 가루 또는 액체 조제물이거나, 또는 1개 투약 형태에 인자 VIIa를 함유하는 용해된 동결건조 가루 또는 액체 조제물 및 다른 투약 형태에 인자 XIII를 함유하는 용해된 동결건조 가루 또는 액체 조제물인 제제와 같은, 정맥내 투여에 적합한 형태로 제조된다.

예를 들어 국소 도포와 같은 인자 VIIa 및 인자 XIII의 국부적 송달이 예를 들어 분무, 관류, 2겹 풍선 카테테르, 스텐트, 혈관 이식편 또는 스텐트에의 결합, 풍선 카테테르를 코팅하는데 사용되는 하이드로겔, 또는 다른 잘 확립된 방법에 의해 수행될 수 있다. 일일 유지 레벨을 필요로 하는 보행가능한 피험자를 위해서,인자 VIIa 및 인자 XIII가 예를 들어 휴대용 펌프 시스템을 사용하여 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 어떤 사건에서든 제약학적 조성물은 피험자를 효과적으로 치료하는데 충분한 양의 인자 VIIa 및 인자 XIII를 제공해야 한다.

인자 VIIa와 인자 XIII의 조합은 시험관내에서의 혈병 단단함- 및 피브린 용해 시간-분석에서 시너지 효과를 나타낸다. 더욱이, 인자 VIIa 및 인자 XIII의 조합은 안정한 피브린 혈병을 형성하고, 반-혈병 용해 시간을 증가시키고, 혈병 강도를 증가시키고, 피브린 용해에 대한 내성을 증가시키는데 있어 시너지 효과를 나타낸다.

인자 VII 및 인자 XIII를 함유하는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료적 용도에서, 조성물은 상술된 바와 같은 질환으로 이미 고통받고 있는 피험자에게 이 질환 및 질환의 합병증을 치유, 완화 또는 부분적 정지시키는데 충분한 양으로 투여된다. 이것을 달성하는데 적합한 양은 "유효량" 또는 "치료적 유효량"으로 정의된다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 이 목적을 위한 효과적인 양은 질환 또는 상처의 심함 뿐만 아니라 피험자의 체중 및 일반적 상태에 의존할 것이다. 본 발명의 물질이 일반적으로 심각한 질환 또는 상처의 상태, 즉 생명을 위협하거나 또는 잠재적으로 생명을 위협하는 상황에서 사용될 수 있다는 것을 기억해야 한다. 그러한 경우, 외래적 물질 및 사람에서 인자 VIIa 및 인자 XIII에 대한 면역성의 일반적인 결여를 최소화한다는 관점에서, 치료의에 의해 이들 조성물을 실질적으로 과량 투여하는 것이 가능하며 바람직할 수 있다.

예방적 용도에서, 인자 VIIa 및 인자 XIII를 함유하는 조성물은 피험자 자신의 응고 능력을 증진시키기 위해서 질환 상태 또는 상처로 의심되거나 또는 달리 이런 위험에 처한 피험자에게 투여될 수 있다. 그러한 양은 "예방적 유효 용량"으로 정의된다.

조성물의 단일 또는 다수 투여가 치료의에 의해 선택되는 용량 레벨 및 패턴을 사용하여 수행될 수 있다. 조성물은 1일 또는 1주 당 1회 이상 투여될 수 있다. 그러한 제약학적 조성물의 유효량은 출혈 사건에 대해 임상적으로 유의한 효과를 제공하는 양이다. 그러한 양은 피험자의 치료될 특정 상태, 나이, 체중 및 일반적 건강, 및 당업자에게 명백한 다른 요인에 일부 의존할 것이다.

조성물은 일반적으로 예상된 출혈 전에 또는 출혈 시작시에 1개 단일 용량으로 투여된다. 그러나, 주어된 용량 및 피험자의 상태에 따라서, 다수 용량으로, 바람직하게 2-4-6-12시간 간격으로 제공될 수도 있다.

조성물은 적합한 농도로 인자 VIIa 및 인자 XIII를 모두 포함하는 단일-제제의 형태일 수 있다. 또한, 조성물은 인자 XIIa를 포함하는 제 1 단위 투약 형태 및 인자 XIII를 포함하는 제 2 단위 투약 형태, 및 선택적으로 인자 VIII 및/또는 TFPI 저해제를 포함하는 더 이상의 단위 투약 형태로 구성된 키트의 형태일 수 있다. 이 경우 인자 VIIa 및 인자 XIII는 연속하여 투여되어야 하며, 바람직하게 서로 약 1 내지 2시간 내에, 예를 들어 서로 30분 내에, 바람직하게 서로 10분 내에, 또는 더 바람직하게 5분 내에 투여되어야 한다.

본 발명이 따로따로 투여될 수 있는 활성 성분들의 조합을 사용하여 치료함에 의한 출혈 사건 또는 응고 치료의 예방 또는 치료에 관한 것이므로, 또한 본 발명은 개별 제약학적 조성물을 키트 형태로 조합하는 것에 관한 것이다. 키트는 적어도 2가지의 개별 제약학적 조성물을 포함한다. 키트는 분리된 병 또는 분리된 호일 꾸러미와 같은 개별 조성물을 함유하기 위한 용기 수단을 포함한다. 전형적으로, 키트는 개별 성분의 투여를 위한 지시사항을 포함한다. 키트 형태는 개별 성분이 바람직하게 상이한 투약 형태로 투여될 때, 상이한 투약 간격으로 투여될 때, 또는 조합의 개별 성분의 역가가 처방의에 의한 것이 바람직할 때 특히 유리하다.

분석

인자 VIIa 활성 시험:

인자 VIIa 활성을 시험하여 적합한 인자 VIIa 변이체를 선택하는 적합한 분석이 간단한 예비적인 시험관내 시험에 의해 수행될 수 있다.

시험관내 가수분해 분석

자생(야생형) 인자 VIIa 및 인자 VIIa 변이체(이후 모두 "인자 VIIa"로 언급)이 특이적 활성에 대해 분석될 수 있다. 또한, 그것들은 그것들의 특이적 활성을 직접 비교하기 위해서 병행하여 분석될 수 있다. 분석은 마이크로타이터 플레이트(MaxiSorp, 눈크, 덴마크)에서 수행된다. 색원체 기질 D-Ile-Pro-Arg-p-니트로아닐라이드(S-2288, 크로모제닉스, 스웨덴)을 최종 농도 1mM로 0.1M NaCl, 5mM CaCl₂및 1mg/ml 소혈청 알부민을 함유하는 50mM Hepes, pH 7.4 중의 인자 VIIa(최종 농도 100nM)에 첨가했다. 405nm에서의 흡광도가 SpectraMax^TM340 플레이트 리더(몰리큘라 디바이스, 미국)에서 연속하여 측정된다. 20분 인큐베이션 동안 전개된 흡광도에서 효소를 함유하지 않는 블랭크 웰의 흡광도를 뺀 후 변이체와 야생형 인자 VIIa의 활성의 비를 계산하는데 사용했다:

비 = (A_405nm인자 VIIa 변이체)/(A_405nm인자 VIIa 야생형)

이를 근거로, 자생 인자 VIIa와 비슷하거나 또는 더 높은 활성을 갖는 인자 VIIa 변이체, 예를 들어 도 1에 나타낸 변이체의 활성과 자생 인자 VII의 활성의 비가 1.0 근처인 경우의 변이체가 확인될 수 있다.

또한, 인자 VIIa 또는 인자 VIIa 변이체의 활성이 적합하게 100 내지 1000nM의 농도로 인자 X와 같은 생리학적인 기질을 사용하여 측정될 수 있으며, 이 경우 생성된 인자 Xa가 적합한 색원체 기질(예를 들어, S-2765)의 첨가 후 측정된다. 게다가, 활성 분석은 생리학적인 온도에서 수행될 수 있다.

또한, 트롬빈을 생성하는 인자 VIIa 또는 인자 VIIa 변이체의 능력이 생리학적인 농도의 모든 관련된 응고 인자(혈우병 A 상태를 의태하는 경우는 인자 VIII를 뺀다) 및 저해제 및 활성화된 혈소판을 포함하는 분석에서 측정될 수 있다(본원에 참고자료로 수록된 Monroe 등 (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547, p 543에 설명됨).

인자 XIII 활성 시험:

인자 XIII 트랜스글루타미나제를 시험하여 적합한 인자 XIII 변이체를 선택하는 적합한 분석이 예를 들어 Mothods of Enxymology, Vol 45(1976), ProteolyticEnzymes, Part B, pages 177-191 (Ed. Lorand, L.)에 설명된 간단한 시험관내 시험에 의해 수행될 수 있다.

본 발명은 다음의 실시예에 의해 더 예시되지만, 이것이 보호의 범위를 제한하지는 않는다. 전술한 명세서 및 다음의 실시예에 개시된 특징은 개별적으로 및그것들의 어떤 조합으로 다양한 형태로 본 발명을 실현하기 위한 재료일 수 있다.

실시예 1

인자 XIII는 인자 VIIa-유도 피브린 혈병 형성을 증진시킨다

시트레이트화된 정상 사람 혈장(NHP)을 마이크로타이터 웰(총부피 250㎕)에서 20nM Hepes, 150mM NaCl, 5mM CaCl₂, pH 7.4를 함유하는 완충액 중에 1/10 희석하고, 피브린 혈병 형성을 Spectramax^TM340(몰리큘라 디바이스, 캘리포니아 서니베일)에서 600nm에서의 광학밀도 증가로써 모니터했다.

자발적 혈병 형성이 약 2500 내지 3000초에서 얻어졌다. 도 1은 10nM 재조합 인자 VIIa(rFVIIa)(노보 노르디스크 에이/에스, 덴마크 박스바에르트)가 1600초까지 혈병화 시간을 단축시켰다는 것을 나타낸다(n=2). 혈병화 시간의 더 이상의 단축은 30nM 인자 XIII(FXIII)(아메리칸 다이아그노스티카 인코포레이티드, 코네티컷 그린위치)가 10nM rFVIIa와 함께 첨가되었을 때 얻어졌다(n=3). FXIII의 존재하에 형성된 혈병은 그것의 부재하에서보다 더욱 투명했으며(더 낮은 최대 OD), 이것은 FXIII의 첨가가 더 얇은 섬유를 갖는 더욱 미세한 메시의 피브린 겔 구조를가져왔다는 것을 나타낸다.

실시예 2

인자 VIIa-유도 혈병 형성 동안 보충된 인자 XIII의 존재는 피브린 용해 분해에 대한 내성을 증가시킨다

얇은 섬유로 구성된 피브린 혈병은 두꺼운 섬유 또는 덜 교차결합된 섬유로서 배열된 동일한 양의 피브린을 함유하는 혈병보다 기계적으로 더 강하며 분해시키기가 더욱 어렵다. 도 2에 나타낸 실험은 보충된 FXIII(30nM)가 rFVIIa 및 조직 플라스미노겐 활성제(tPA, 아메리칸 다이아그노스티카)의 존재하에 형성된 혈병의 피브린 혈병 용해 시간을 연장시킨다는 것을 나타냈다. 혈병 형성을 50nM rFVIIa 및 0.5nM 재조합 tPA를 함유하는 20nM Hepes, 150mM NaCl, 5mM CaCl₂, pH 7.4 225㎕에 NHP 25㎕를 첨가함에 의해 30nM FXIII의 존재 또는 부재하에서 유도했다. tPA-매개 플라스미노겐 활성화에 의해 유도된 혈병 형성 및 후속 혈병 용해를 600nm에서 Spectramax340에 의해 OD_600nm의 증가에 이은 극미량의 기초 레벨로의 복귀로써 모니터했다. 도 2는 이들 조건하에서 혈병 용해 시간이 FXIII의 존재에 의해 유의하게 연장되었다는 것을 나타낸다.

실시예 3

인자 XIII와 조합한 인자 VIIa는 최대 혈병 단단함을 증가시키며 피브린 용해에 대한 혈병 내성을 증가시킨다

트롬벨라스토그래프 측정을 시트레이트화된 정상 사람 혈장 첨가된 6nM 재조합 조직-형 플라스미노겐 활성제(tPA, 아메리칸 다이아그노스티카)에 대해 수행하고, 다양한 농도의 인자 XIII(FXIII, Haematologic Technologies, HCXIII-0160, Lot N1212)와 조합하여 또는 단독으로 첨가된 1nM rFVIIa(노보 노르디스크 에이/에스, 덴마크 박스바에르트)의 효과를 분석했다. 혈병화를 20mM Hepes, 150mM NaCl, pH 7.4 완충액 중의 Innovin(최종 농도 2000배 희석, Dade Behring #526945) 및 칼슘(최종 농도 15mM)을 첨가하여 개시했다.

트롬벨라스토그래프 측정을 이용하여 최대 혈병 단단함(MCF) 뿐만 아니라 tPA 매개 용해에 대한 혈병 내성에 대한 rFVIIa 및 FXIII의 효과를 분석했다. rFVIIa 및/또는 FXIII를 첨가하기 전에 얻어진 MCF는 25mm였고 혈병의 반이 용해되는데 필요한 시간은 12.3분이었다(도 3). FXIII의 농도를 증가시키면서(0 내지 40nM) 첨가하는 것은 MCF를 변경시키지 않았지만, 반-혈병 용해의 용량-의존성 연장기 관찰되었으며 이것은 30nM FXIII에서 최적이었다(반-혈병 용해 시간: 14.3분, 도 3). 유사하게, rFVIIa(1nM)의 첨가는 MCF에 대한 어떤 영향도 없이 tPA-매개 피브린 용해로부터 혈병을 보호(반-혈병 용해 시간: 16.4분)했다(도 3). 그러나, FXIII(30nM)와 함께 rFVIIa(1nM)를 첨가했을 때는 MCF(29mm)가 증가했을 뿐만 아니라, 피브린 용해로부터의 충분한 보호(반-혈병 용해 시간; 27.1분)도 관찰되었다(도 3). 합쳐서 생각하면 이들 결과는 시너지 방식으로 혈장에 rFVIIa 및 FXIII를 첨가하는 것이 혈병의 기계적 강도 및 tPA-매개 피브린 용해에 대한 내성을 개선시킨다는 것을 증명한다.

Claims

인자 VIIa 및 인자 XIII를 포함하는 제약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 인자 VIIa는 인자 VII 변이체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 인자 VIIa는 사람 인자 VIIa인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 인자 VIIa 및 인자 XIII는 재조합 사람 인자 VIIa 및 재조합 사람 인자 XIII인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 XIII는 인자 XIII의 a2-다이머인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 XIII는 활성형 인자 XIII인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 TFPI 저해제를 더함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 인자 VIII를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
a) 제 1 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIIa 및 제약학적으로 허용되는 담체;

b) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 인자 XIII 및 제약학적으로 허용되는 담체; 및

c) 상기 제 1 및 제 2 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단

을 포함하는 출혈 사건용 치료제를 함유하는 키트.
a) 제 1 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIIa 및 제약학적으로 허용되는 담체;

b) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 인자 XIII 및 제약학적으로 허용되는 담체;

c) 제 3 단위 투약 형태로 유효량의 TFPI 저해제 및 제약학적으로 허용되는 담체; 및

d) 상기 제 1, 제 2 및 제 3 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단

을 포함하는 제 9 항에 따르는 키트.
a) 제 1 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIIa 및 TFPI 저해제, 그리고 제약학적으로 허용되는 담체;

b) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 인자 XIII 및 제약학적으로 허용되는 담체; 및

c) 상기 제 1 및 제 2 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단

을 포함하는 출혈 사건용 치료제를 함유하는 키트.
a) 제 1 단위 투약 형태로 유효량의 인자 VIIa 및 제약학적으로 허용되는 담체;

b) 제 2 단위 투약 형태로 유효량의 인자 XIII 및 TFPI 저해제, 그리고 제약학적으로 허용되는 담체; 및

c) 상기 제 1 및 제 2 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단

을 포함하는 출혈 사건용 치료제를 함유하는 키트.
제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 개별 단위 투약 형태로 조제되거나, 또는 인자 VIIa, 인자 XIII 또는 TFPI 저해제의 리스트로부터 선택된 화합물 중 1가지 이상을 또한 함유하는 단위 투약 형태 내에 함유된 인자 VIII를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
피험자에서 출혈 사건을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 인자 XIII와 조합한 인자 VIIa의 사용.
피험자에서 혈병화 시간을 단축시키기 위한 의약의 제조를 위한 인자 XIII와 조합한 인자 VIIa의 사용.
정상 포유류 혈장에서 혈병 용해 시간을 연장시키기 위한 의약의 제조를 위한 인자 XIII와 조합한 인자 VIIa의 사용.
정상 포유류 혈장에서 혈병 강도를 증가시키기 위한 의약의 제조를 위한 인자 XIII와 조합한 인자 VIIa의 사용.
정상 사람 혈장에서 피브린 혈병 혈성을 증진시키기 위한 의약의 제조를 위한 인자 XIII와 조합한 인자 VIIa의 사용.
유효량의 인자 XIII와 조합한 유효량의 인자 VIIa를 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 피험자에서 피브린 혈병 형성을 증진시키는 방법.
유효량의 인자 XIII와 조합한 유효량의 인자 VIIa를 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 피험자에서 출혈 사건을 치료하는 방법.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 인자 VIIa 및 인자 XIII를 1개 투약 형태로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 인자 VIIa 및 인자 XIII를 연속하여 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.