KR20020090087A - Method for Inhibiting Injuries of Liver cells, Method for solving alcohol-hangover Method and Food Composition for Treating Hepatoma cell and Kit for Treating Hepatoma - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 간세포 손상억제방법, 숙취해소방법, 간암세포 처리방법, 간암세포 처리용 식품 조성물 및 간암 처리용 키트에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 평균 분자량이 20,000 내지 2,000,000인 고분자 수용성 키토산 혼합물을 이용한 간세포 손상억제 방법, 숙취해소방법, 간암세포 처리 방법, 평균 분자량이 20,000 내지 2,000,000인 고분자 수용성 키토산 혼합물을 포함하는 식품 조성물, 평균 분자량이 20,000 내지 2,000,000인 고분자 수용성 키토산 혼합물 함유 조성물을 포함하는 간암 치료용 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a method for inhibiting liver cell damage, a method for relieving hangovers, a method for treating liver cancer cells, a food composition for treating liver cancer cells, and a kit for treating liver cancer. More specifically, the present invention is a food composition comprising a method for inhibiting hepatocyte damage using a polymer water-soluble chitosan mixture having an average molecular weight of 20,000 to 2,000,000, a hangover method, a method for treating liver cancer cells, and a polymer water-soluble chitosan mixture having an average molecular weight of 20,000 to 2,000,000. The present invention relates to a kit for treating liver cancer comprising a polymer-soluble chitosan mixture-containing composition having an average molecular weight of 20,000 to 2,000,000.
알코올은 약한 전하를 띠는 분자로서 세포막 사이를 쉽게 이동하며, 혈액과 조직 사이에서 빠르게 평형을 이룬다. 알코올은 기본적으로 뉴런의 활성도를 감소시키는 중추신경 억제제이다. 국내에서는 간질환 중 바이러스성 간염이 가장 높은 사망률의 원인이지만, 최근에는 알코올성 간질환이 급증하고 있다. 미국과 같은 선진국에서는 바이러스성 간질환보다 알코올성 간질환에 의한 사망률이 5 내지 10배 정도로 높게 나타나고 있는 것으로 보고되고 있다. 따라서 바이러스성 간질환은 최근에 백신 사용 등으로 인해 현저히 감소하는 추세이나, 알코올성 간질환에 의한 사망률은 꾸준히 증가하고 있다. 알코올성 간질환으로는 알콜성 지방간, 알코올성 간염, 알코올성 간경화 등을 들 수 있다.Alcohol is a weakly charged molecule that moves easily between cell membranes and quickly balances blood and tissue. Alcohol is basically a CNS inhibitor that reduces neuronal activity. Viral hepatitis is the leading cause of mortality among liver diseases in Korea, but alcoholic liver disease is increasing rapidly in recent years. In developed countries such as the United States, the mortality rate from alcoholic liver disease is reported to be 5 to 10 times higher than that of viral liver disease. Therefore, viral liver disease has recently decreased considerably due to the use of vaccines, but the mortality rate from alcoholic liver disease is steadily increasing. Alcoholic liver disease includes alcoholic fatty liver, alcoholic hepatitis, alcoholic cirrhosis and the like.
상기와 같은 알코올에 의한 독성을 감소시킴으로써 숙취를 제거하고 간을 보호하기 위한 많은 방법들이 개발되어 왔다. 그 중에서도 천연물을 이용하는 방법으로서, 천궁, 감초, 갈근, 진피 등의 생약, 모과, 다시마, 녹차, 매실, 더덕 등의 자연 식품을 이용하는 방법들이 알려져 왔다. 그러나 종래의 이러한 방법들은 알코올에 의한 독성을 감소시키는 특정 성분을 이용한 것이 아니라, 식품 자체를 이용한 것이므로, 그것의 독성 감소 효과는 미미하였다. 따라서 구체적으로 어떠한 특정 성분이 알코올 자체, 아세트알데하이드와 같은 대사물질 또는 알코올 대사과정 중에 발생한 물질의 분비를 억제하거나, 알코올에 의한 면역반응을 조절할 수 있는 지에 대한 연구가 절실히 요구되고 있었다.Many methods have been developed for eliminating hangovers and protecting the liver by reducing such toxicity by alcohol. Among them, as a method of using natural products, methods of using natural foods such as medicinal herbs such as cheonggung, licorice, brown root, dermis, quince, kelp, green tea, plum, and deodeok have been known. However, these conventional methods are not using specific ingredients to reduce the toxicity by alcohol, but using the food itself, so the effect of reducing the toxicity is insignificant. Therefore, in particular, there is an urgent need for a study on whether certain components can suppress the secretion of alcohol itself, metabolites such as acetaldehyde or substances generated during alcohol metabolism, or modulate the immune response by alcohol.
세계적으로 간암의 발생율은 다른 암들보다도 높은 편이다. 특히 우리나라에서는 암 중에서 간암이 남성에 있어서는 두번째로 발생율이 높고 여성에 있어서는 여섯번째로 그 발생율이 높다. 특히 간은 통증을 느끼지 않는 "침묵의 장기"이기 때문에 증상이 나타나면 대부분은 이미 치료가 어려운 정도로 많이 진행되어 있기 때문에 간암의 조기 진단, 조기 치료 및 예방이 다른 암들에 비해 특히 어렵다. 이러한 필요성으로 인해 간암의 예방 및 치료를 위한 많은 연구가 수행되고 있다.The incidence of liver cancer worldwide is higher than in other cancers. In Korea, liver cancer is the second highest incidence among men and sixth among females. In particular, since the liver is a painless "silent organ", most of the symptoms are already difficult to treat, so early diagnosis, early treatment and prevention of liver cancer is particularly difficult compared to other cancers. Due to this necessity, many studies are being conducted for the prevention and treatment of liver cancer.
간암을 가장 확실하게 치료하는 방법은 외과적인 수술로서 암조직을 떼어내는 것이다. 그러나 문제는 간암 환자 중에서 수술이 가능한 경우는 일부에 지나지 않는다는 것이다. 대부분의 경우인 수술이 가능하지 않은 경우에 이용되는 치료법 중 하나로서 경피적 에탄올 주입술(percutaneous ethanol injection)이 있다. 경피적 에탄올 주입술이란 초음파 등으로 간암조직을 직접 보면서 피부를 통해서 주사 바늘로 간암 조직을 찔러 순수 알코올을 주입함으로써 암세포를 사멸시키는 방법이다. 순수 알코올 이외에도, 초산 용액, 끓는 생리 식염수 등을 이용할 수 있다. 그러나 이러한 경피적 에탄올 주입술은 그 효과가 미미하고 재발이 쉬운 등의 문제점이 있었다. 따라서 간암을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있는 방법이 절실히 요구되고 있었다.The best way to treat liver cancer is to remove the cancerous tissue as a surgical operation. The problem, however, is that only a few patients with liver cancer are eligible for surgery. Percutaneous ethanol injection is one of the treatments used in most cases when surgery is not possible. Percutaneous ethanol injection is a method of killing cancer cells by directly injecting pure alcohol into the liver cancer tissue with a needle through the skin while looking directly at the liver cancer tissue. In addition to pure alcohol, an acetic acid solution, boiling physiological saline, etc. can be used. However, such a percutaneous ethanol injection has a problem that the effect is insignificant and easy to relapse. Therefore, there is an urgent need for a method for effectively preventing and treating liver cancer.
키토산은 부분적으로 탈아세틸화된 키틴으로서, 무독성인 천연 고분자 양이온이다. 키토산은 그 분자 구조로 볼 때 인체 조직에 친화성이 우수하여 거부반응이 일어나지 않기 때문에 식품 및 의약품으로써 우수한 물질이다. 그러나 키토산은 그 물성인 분자량과 탈아세틸화도에 따라 그 사용 용도가 매우 다르게 적용될 수 있다. 분자량과 탈아세틸화도에 따라서 의약 및 식품 뿐만 아니라 환경 폐수 응집제, 중금속 흡착제, 생산량 증대를 위한 씨앗 코팅제, 단백질 회수제 및 창상 치료제 등의 다양한 분야에서 이용되고 있다. 그러나 키토산은 물에 거의 녹지 않으며 강산성이나 강알칼리에도 잘 녹지 않는 단점이 있었다. 다만 식초에 녹으며 타액, 위장 및 대장의 효소에 의해 미량만이 분해, 흡수되는 정도이다. 따라서 키토산의 유용성을 인식하면서도 현저히 낮은 인체 흡수율로 인해 그 사용이 제한되어 있었다. 특히, 간암의 예방 및 치료에 이용되기 위한 키토산의 물성, 즉 키토산의 분자량과 탈아세틸화도가 제시된 적이 없었기 때문에, 지금까지는 간암의 예방 및 치료에 키토산을 이용하는 것이 불가능하였다. 또한 원하는 평균 분자량을 갖는 고분자 수용성 키토산 가수분해물을 효과적으로 제조하는 방법이 없었으므로 이에 대한 요구가 절실하였다.Chitosan is a partially deacetylated chitin, a non-toxic natural polymeric cation. Chitosan is an excellent material for food and medicine because its molecular structure is excellent in affinity with human tissues and no rejection occurs. However, chitosan may be used very differently depending on its physical molecular weight and degree of deacetylation. Depending on the molecular weight and the degree of deacetylation, it is used in various fields such as pharmaceutical and food as well as environmental wastewater flocculant, heavy metal adsorbent, seed coating agent for increasing production, protein recovery agent and wound healing agent. However, chitosan was hardly soluble in water and did not dissolve well in strong acids or strong alkalis. However, it is soluble in vinegar and only a small amount is broken down and absorbed by enzymes of saliva, stomach and colon. Therefore, the use of chitosan has been limited due to its remarkably low absorption rate. In particular, since the physical properties of chitosan to be used for the prevention and treatment of liver cancer, that is, the molecular weight and the deacetylation degree of chitosan have not been suggested, it has been impossible to use chitosan for the prevention and treatment of liver cancer until now. In addition, since there was no method for effectively preparing a polymer water-soluble chitosan hydrolyzate having a desired average molecular weight, there is an urgent need for it.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 정상 세포에는 영향을 미치지 않으면서 간암세포만을 선택적으로 사멸시킴으로써 간암을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있는 수단을 제공하고자 하는 것이다. 또한알코올에 의한 간의 손상을 감소시킴으로써 궁극적으로 암으로 발전되는 것을 예방하는 수단을 제공하고자 하는 것이다. 뿐만 아니라, 알코올에 의한 숙취를 해소함으로써 숙취로 인한 두통, 불쾌감 등을 예방하며, 이로써 간의 손상을 예방할 수 있는 수단을 제공하고자 하는 것이다. 뿐만 아니라, 고분자 키토산 가수분해물의 평균 분자량을 효과적으로 조절할 수 있는 수단을 제공하고자 하는 것이다.The present invention is to solve the above problems, it is an object of the present invention to provide a means for effectively preventing and treating liver cancer by selectively killing only liver cancer cells without affecting normal cells. It is also intended to provide a means of preventing the development of cancer by ultimately reducing liver damage caused by alcohol. In addition, by eliminating the hangover caused by alcohol to prevent headaches, discomfort, etc. due to hangover, thereby to provide a means to prevent damage to the liver. In addition, it is intended to provide a means for effectively controlling the average molecular weight of the polymer chitosan hydrolyzate.
도1은 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산을 알코올과 함께 간암세포에 처리한 결과를 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing the results of treatment of hepatic cancer cells with an alcohol-soluble chitosan polymer according to the present invention.
도2는 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산을 알코올과 함께 정상 간세포에 처리한 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 2 is a graph showing the results of treatment of normal water-soluble chitosan polymers with alcohol according to the present invention.
도3은 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산에 의한 간암세포의 DNA량의 변화를 나타낸 그래프이다.Figure 3 is a graph showing the change in the DNA amount of liver cancer cells by the polymer water-soluble chitosan according to the present invention.
도4는 Hep G2 세포에서 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산이 알코올 매개성 NF-κB/Rel A 합성에 미치는 영향을 나타내는 웨스턴 블롯이다.4 is a Western blot showing the effect of the polymer-soluble chitosan according to the present invention on alcohol-mediated NF-κB / Rel A synthesis in Hep G2 cells.
도5는 Hep G2 세포에서 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산이 알코올 매개성 IκB 분해에 미치는 영향을 나타내는 웨스턴 블롯이다.Figure 5 is a Western blot showing the effect of the polymer water-soluble chitosan according to the present invention on alcohol mediated IκB degradation in Hep G2 cells.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의한 간세포 손상억제방법은, 고분자 수용성 키토산의 혼합물로서, 그 혼합물을 구성하는 고분자 수용성 키토산들의 평균 분자량이 20,000 내지 2,000,000인 키토산 혼합물을 이용하는 것을 특징으로 한다.In order to achieve the above object, the hepatocellular damage suppression method according to the present invention, as a mixture of the polymer water-soluble chitosan, characterized in that the chitosan mixture having an average molecular weight of 20,000 to 2,000,000 molecular weight of the polymer-soluble chitosan constituting the mixture. .
본 발명에 의한 숙취해소방법은, 고분자 수용성 키토산의 혼합물로서, 그 혼합물을 구성하는 고분자 수용성 키토산들의 평균 분자량이 20,000 내지 2,000,000인 키토산 혼합물을 이용하는 것을 특징으로 한다.The hangover elimination method according to the present invention is characterized by using a chitosan mixture having an average molecular weight of 20,000 to 2,000,000 as a mixture of the polymer water-soluble chitosan, constituting the mixture.
본 발명에 의한 간암세포 처리 방법은, 고분자 수용성 키토산의 혼합물로서, 그 혼합물을 구성하는 고분자 수용성 키토산들의 평균 분자량이 20,000 내지 2,000,000인 키토산 혼합물을 이용하는 것을 특징으로 한다.The method for treating liver cancer cells according to the present invention is characterized by using a chitosan mixture having an average molecular weight of 20,000 to 2,000,000 as a mixture of the polymer water-soluble chitosan constituting the mixture.
본 발명에 의한 키토산 함유 조성물은, 간암세포를 처리하기 위한 식품 조성물로서, 고분자 수용성 키토산의 혼합물로서, 그 혼합물을 구성하는 고분자 수용성 키토산들의 평균 분자량이 20,000 내지 2,000,000인 키토산 혼합물을 0.001 내지 100중량% 포함하는 것을 특징으로 한다.The chitosan-containing composition according to the present invention is a food composition for treating liver cancer cells, a mixture of polymer-soluble chitosan, 0.001 to 100% by weight of a chitosan mixture having an average molecular weight of 20,000 to 2,000,000 of the polymer-soluble chitosan constituting the mixture. It is characterized by including.
본 발명에 의한 간암 치료용 키트는, 고분자 수용성 키토산의 혼합물로서, 그 혼합물을 구성하는 고분자 수용성 키토산들의 평균 분자량이 20,000 내지 2,000,000인 키토산 혼합물을 0.001 내지 100중량% 함유하는 조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다.The kit for treating liver cancer according to the present invention is a mixture of polymer water-soluble chitosan, comprising a composition containing 0.001 to 100% by weight of a chitosan mixture having an average molecular weight of 20,000 to 2,000,000 of the polymer-soluble chitosan constituting the mixture. do.
상기 본 발명들에 있어서, 고분자 수용성 키토산들의 평균 분자량이 500,000 내지 600,000인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the average molecular weight of the polymer water-soluble chitosan is characterized in that 500,000 to 600,000.
또한, 상기 본 발명들에 있어서, 상기 고분자 수용성 키토산들은, 키토산을 가수분해효소와 반응시키면서 10 내지 40KHz에서 10 내지 90분간 초음파 처리하는 공정을 1회 이상 반복적으로 수행함으로써 제조된 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직한 초음파 처리는 10 내지 30KHz에서 10 내지 60분간 처리하는 것이다.In addition, in the present invention, the polymer water-soluble chitosan is characterized in that it is prepared by repeatedly performing one or more times the ultrasonic treatment for 10 to 90 minutes at 10 to 40KHz while reacting chitosan with a hydrolase. More preferred ultrasonic treatment is 10 to 60 minutes of treatment at 10 to 30 KHz.
상기 본 발명들에 있어서, 상기 고분자 수용성 키토산은 90% 이상이 탈아세틸화된 것임을 특징으로 한다.In the present invention, the polymer water-soluble chitosan is characterized in that more than 90% deacetylated.
이하 본 발명에 의한 간세포 손상억제방법, 숙취해소방법, 간암세포 처리방법, 간암세포 처리용 식품 조성물 및 간암 처리용 키트에 대해 더욱 구체적으로 살펴본다.It will now be described in more detail with respect to the liver cell damage suppression method, hangover relief method, liver cancer cell treatment method, liver cancer cell treatment food composition and liver cancer treatment kit according to the present invention.
에탄올은 혈중 알코올 농도가 2%(저 혈중 알코올 농도) 내지 10%(고 혈중 알코올 농도)인 경우, 직접 폐, 소변 또는 땀을 통해 배설되기도 하지만, 대부분은 간에서 아세트알데히드로 대사된다. 간에서는 3가지의 주요 경로를 통해 알코올의 대사가 이루어지는데, 그 주요 경로들은 각기 다른 에탄올 적정농도(Km)를 가지며, 결과적으로 시간당 한 잔의 알코올이 대사된다.Ethanol is sometimes excreted directly through the lungs, urine or sweat when the blood alcohol concentration is between 2% (low blood alcohol) and 10% (high blood alcohol), but most are metabolized to acetaldehyde in the liver. In the liver, alcohol is metabolized through three major pathways, each of which has a different ethanol titer (Km), which results in one metabolism of alcohol per hour.
3가지 주요 경로 중 첫째는, 임상적으로 중요한 경로로서 세포질에서 20밀리몰의 Km값에서 알코올 탈수소효소(ADH)에 의해 일어나는 경로이다. 이 반응에 의해 아세트알데히드가 생성된다. 생성된 아세트알데히드는 세포질 또는 미토콘드리아에서 알데히드 탈수소효소(ALDH)에 의해 급속히 분해된다. 상기 각 단계는 조효소로서 니코틴아미드 아데노신 디뉴클레오티드(NAD)를 필요로 한다. 음주 후에 나타나는 대사 혼란상태는 조효소인 NADH가 NAD로 변환하기 때문이다.The first of the three major pathways is a clinically important pathway that is caused by alcohol dehydrogenase (ADH) at a Km value of 20 mmol in the cytoplasm. This reaction produces acetaldehyde. The resulting acetaldehyde is rapidly degraded by aldehyde dehydrogenase (ALDH) in the cytoplasm or mitochondria. Each step requires nicotinamide adenosine dinucleotide (NAD) as a coenzyme. The metabolic disruption after drinking alcohol is due to the conversion of coenzyme NADH to NAD.
둘째, Km값이 10밀리몰인 활면소포체의 마이크로좀이 마이크로조말 에탄올 산화 체계(Microsomal ethanol oxidation system, MEOS)에 따라 총 혈중 알코올농도의 약 10% 또는 그 이상의 산화를 수행한다. 셋째, 퍼옥시좀과 미토콘드리아에 존재하는 카탈라제 등이 에탄올의 산화를 수행한다.Second, the microsomes of the surface vesicles having a Km value of 10 mmol perform oxidation of about 10% or more of the total blood alcohol concentration according to the microsomal ethanol oxidation system (MEOS). Third, peroxysomes and catalase present in the mitochondria perform oxidation of ethanol.
알코올에 의한 간손상 기전은 크게 알코올 자체에 의한 경우, 상기와 같은 대사과정 중에 생성되는 아세트알데히드와 같은 대사물질에 의한 경우, 알코올 대사과정에서 발생한 물질에 의한 경우, 면역반응에 의한 경우 등으로 분류할 수 있다.The mechanism of liver damage caused by alcohol is largely classified as being caused by alcohol itself, by metabolites such as acetaldehyde produced during metabolic processes as described above, by substances caused by alcohol metabolism, or by immune responses. can do.
특히, 아세트알데히드는 세로토닌, 도파민, 아드레날린과 반응하여 약리학적으로 활성을 갖는 물질을 생성시키고, 그 물질은 세포에서 제1 프로콜라겐 및 피브로넥틴의 합성을 촉진시키고, 섬유아세포를 자극하여 기질 단백질, 콜라겐-α1, 콜라겐-α2를 분비하게 하고, 근육섬유아세포 콜라겐의 합성을 촉진함으로써, 간 섬유화를 초래한다. 또한 단백질, 지질 및 DNA와 공유결합을 형성하여 항원으로 작용하므로, 면역원성 손상을 유발하여 간질환을 발생시킨다.In particular, acetaldehyde reacts with serotonin, dopamine, and adrenaline to produce pharmacologically active substances, which promote the synthesis of first procollagen and fibronectin in cells and stimulate fibroblasts to stimulate matrix proteins, collagen By secreting -α1 and collagen-α2 and promoting the synthesis of myofibroblast collagen, liver fibrosis is caused. In addition, it forms covalent bonds with proteins, lipids and DNA to act as an antigen, causing immunogenic damage to cause liver disease.
또한 아세트알데히드는 산화적 스트레스를 증가시키고 세포내 글루타치온(glutathion)을 고갈시킴으로써, 간손상을 더욱 심화시킨다.Acetaldehyde also aggravates liver damage by increasing oxidative stress and depleting intracellular glutathione.
알코올 섭취를 중단한 이후에도 간질환이 계속 진행되는 이유는, 면역학적 측면에서 설명될 수 있다. 알코올성 간질환에서, 혈청내 면역단백질이 상승하는 것과 간내 동양구조(sinusoid) 벽을 따라 IgA가 침착되는 것을 통해서, 체액성 면역의 손상이 입증된다. 또한 알코올에 의해 변형된 토끼의 간 세포막 항원에 대한 항체의 생성으로서 세포매개성 면역의 손상이 확인된다.The reason why liver disease continues even after stopping alcohol consumption can be explained in terms of immunological aspects. In alcoholic liver disease, impairment of humoral immunity is demonstrated by elevated serum protein and deposition of IgA along the hepatic sinusoid wall. Impairment of cell mediated immunity is also confirmed by the production of antibodies to rabbit liver membrane antigens modified by alcohol.
알코올성 간질환의 발생과 병의 진행에 세포독성 T림프구 및 간세포의 상호작용이 관여한다는 가설은, 활동성 알코올성 간질환에서 CD4, CD8 림프구의 구성비, 림프구들의 지속적인 분포, 간세포의 주조직적합복합체(MHC; Major Histocompatibility Complex)의 발현, 알코올성 유리질(hyalin) 및 세포괴사와의 관계 등에 의해 뒷받침되고 있다. 항원성 물질의 실체는 확실하지는 않지만 말로리 알코올성 유리질이 주목받고 있고, 아세트알데히드 콜라겐 복합물이 알코올성 간염의 간조직에서 발견되고 있는데, 이는 병의 활성도와 관련이 있으므로 세포매개성 면역 기전의 손상을 반영하는 것이다.The hypothesis that the interaction of cytotoxic T lymphocytes and hepatocytes is involved in the development and progression of alcoholic liver disease, suggests that the composition of CD4 and CD8 lymphocytes, the continuous distribution of lymphocytes, and the major histocompatibility complex (MHC) in active alcoholic liver disease. It is supported by the expression of Major Histocompatibility Complex, the relationship with alcoholic hyalin, and cell necrosis. Although the substance of the antigenic substance is not certain, malory alcoholic glass is attracting attention, and acetaldehyde collagen complexes are found in the liver tissue of alcoholic hepatitis, which is associated with disease activity and thus reflects impaired cell-mediated immune mechanisms. will be.
하기 실시예에 나타난 바와 같이, 알코올은 Hep G2 세포에서 TNF-α, IL-1α, IL-6의 합성 및 분비량을 현저히 증가시킨다. 뿐만 아니라, 알코올성 간질환을 가지고 있는 환자들의 혈액의 단핵구는 정상인과 비교하여, TNF-α, IL-1α 및 IL-6의 생성이 3 내지 6배 높은 것으로 나타난다. 따라서 세포활성물질인 TNF-α, IL-1α, IL-6 등이 알코올에 의한 간손상에 관여한다는 것을 알 수 있다. 그러므로TNF-α, IL-1α 및 IL-6의 발현 및 분비를 억제하는 물질을 찾는다면 이를 이용하여 알코올에 의한 간 손상을 억제할 수 있을 것이다. 본 발명은 그 물질로서 키토산을 제시하고 있다. 또한 본 발명자는 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산이 상기 TNF-α, IL-1α 및 IL-6의 발현 및 분비를 억제한다는 것을 입증하기 위해 하기 실시예의 실험들을 행하였다.As shown in the examples below, alcohol significantly increases the synthesis and secretion of TNF-α, IL-1α, IL-6 in Hep G2 cells. In addition, monocytes in the blood of patients with alcoholic liver disease appear to have three to six times higher production of TNF-α, IL-1α and IL-6, compared to normal individuals. Therefore, it can be seen that TNF-α, IL-1α, IL-6 and the like, which are cytoactive substances, are involved in liver damage caused by alcohol. Therefore, if a substance is found that inhibits the expression and secretion of TNF-α, IL-1α and IL-6, it may be used to suppress liver damage caused by alcohol. The present invention proposes chitosan as the substance. The inventors also conducted experiments of the following examples to demonstrate that the polymeric water soluble chitosan according to the present invention inhibits the expression and secretion of the TNF-α, IL-1α and IL-6.
세포활성물질은 다양한 기능을 가진 단백질 그룹으로서, 일부는 림프구 계통의 세포로부터 생성되며, 면역조절을 하고 조혈작용을 관장한다. TNF-α, IL-6 및 IL-1α를 포함하는 대부분의 세포활성물질은 표적세포의 세포표면 수용체에 결합함으로써 특정 반응을 유도하며 그 작용기전은 호르몬과 같다. 각 세포활성물질은 고유의 독성이 있으며 이를 사람에게 외부에서 주입시켰을 경우에는, 열을 발생시키며 염증 및 조직파괴를 유발하고, 드물게는 쇼크와 사망을 초래하기도 한다.Cytoactive substances are a group of proteins with a variety of functions, some of which are produced from cells of the lymphocyte lineage and regulate immune regulation and regulate hematopoiesis. Most cell activators, including TNF-α, IL-6 and IL-1α, induce specific responses by binding to cell surface receptors of target cells and their mechanism of action is like hormones. Each cytoactive substance is inherently toxic, and when injected externally into humans, it generates heat, causes inflammation and tissue destruction, and rarely causes shock and death.
염증성 세포활성물질로서 잘 알려져 있는 TNF-α는 세포내 활성산소(ROS; Reactive Oxygen Species)를 유도하는 기능이 있으며 세포자멸사(apoptosis)에도 관여한다. T 림프구 및 NK-세포(Natural Killer cell) 또한 TNF-α를 생성하는 것으로 알려져 있다. TNF-α는 생성된 수준에 따라 그것이 세포 또는 조직에 미치는 영향이 전혀 다른 양면성을 지니고 있다. 예컨대, 간에서 낮은 수준의 TNF-α는 급성기 반응(acute phase reponse)을 활성화시키고 간세포의 증식을 유도하며 망간의 초산화물 불균등화효소(superoxide dismutase) 생성의 촉진 등의 방어기작에 관여한다. 그러나 이와는 반대로, 높은 수준의 TNF-α는 간독성 반응 및 간 섬유화에 관여한다. 정상 상태에서는 TNF-α가 낮은 수준으로 유지되다가 알코올에 의해 높은 수준으로 합성 및 분비되면 간독성 반응 및 간 섬유화가 일어나 간이 손상을 입는다.TNF-α, which is well known as an inflammatory cell activator, functions to induce intracellular reactive oxygen (ROS) and is also involved in apoptosis. T lymphocytes and NK-cells (Natural Killer cells) are also known to produce TNF-α. TNF-α has a bilateral difference in how its effect on cells or tissues varies depending on the level produced. For example, low levels of TNF-α in the liver are involved in defense mechanisms such as activating acute phase reponse, inducing proliferation of hepatocytes, and promoting the production of superoxide dismutase. In contrast, however, high levels of TNF-α are involved in hepatotoxic reactions and liver fibrosis. Under normal conditions, TNF-α remains at a low level, but is synthesized and secreted at high levels by alcohol, resulting in hepatotoxic reactions and liver fibrosis, resulting in liver damage.
TNF-α와 IL-6의 증가는 서로 관련성이 없으나 TNF-α와 IL-1α는 서로 관련이 있다. 즉 TNF-α가 증가하면 IL-1α의 분비도 증가한다. 최근의 연구들은 간의 급성기 반응을 조절하는 IL-1α 활성과 TNF-α활성과의 관계에 관심이 집중되고 있다.Increases in TNF-α and IL-6 are not related to each other, but TNF-α and IL-1α are related to each other. In other words, as TNF-α increases, the secretion of IL-1α also increases. Recent studies have focused on the relationship between IL-1α activity and TNF-α activity, which regulate the acute phase of the liver.
본 발명자는 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산이 TNF-α, IL-1α 및 IL-6의 분비를 억제할 뿐만 아니라, TNF-α, IL-1α 및 IL-6 유전자의 전사를 억제한다는 것 또한 입증하였다. 구체적으로, 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산은 TNF-α, IL-1α 및 IL-6 유전자의 전사에 관여하는 전사인자인 NF-κB의 활성을 조절한다.The present inventors demonstrate that the polymer water-soluble chitosan according to the present invention not only inhibits the secretion of TNF-α, IL-1α and IL-6, but also inhibits the transcription of TNF-α, IL-1α and IL-6 genes. It was. Specifically, the polymer water-soluble chitosan according to the present invention modulates the activity of NF-κB, a transcription factor involved in the transcription of TNF-α, IL-1α and IL-6 genes.
NF-κB/RelA는 유전자 내의 일정한 결합 자리에 결합함으로써, 염증 반응에 관여하는 여러 유전자들, 예컨대, TNF-α, IL-6, IL-1, IL-8, 과립구 집락 자극인자 등과 같은 많은 세포활성물질, 막간 접착분자, 내피성 백혈구 접착분자-1, 혈관세포 접착분자-1 등의 세포접착단백질, MHC 유전자, 그리고 산화질소 합성효소, 사이클로옥시게나제, 초산화 마그네슘 불균등화효소 등의 각종 효소의 유전자들의 전사를 조절한다. 간의 쿠퍼(Kufpper) 세포에서 알코올에 의해 NF-κB/RelA가 활성화되는 것이 알려져 있다.NF-κB / Rel A binds to a constant binding site in a gene, thereby allowing many genes involved in the inflammatory response, such as TNF-α, IL-6, IL-1, IL-8, granulocyte colony stimulating factors, etc. Cell adhesion proteins such as cell activator, intercellular adhesion molecule, endothelial leukocyte adhesion molecule-1, and vascular cell adhesion molecule-1, MHC gene, and nitric oxide synthase, cyclooxygenase, magnesium acetate disproportionase, etc. Regulates transcription of genes of various enzymes. It is known that NF-κB / Rel A is activated by alcohol in Kufpper cells of the liver.
NF-κB/RelA가 평상시에는 억제인자인 IκB에 의해 불활성화 상태로 세포질내에 존재하다가 어떤 자극이 주어졌을 때 IκB가 인산화되면서 분해되어NF-κB/RelA가 자유로운 형태로 방출되어 핵속으로 이동한다. 알코올은 IκB를 인산화시켜 분해하는 자극 중의 하나이다. 본 발명자는 TNF-α, IL-1α 및 IL-6의 전사를 억제하는 기전이 NF-κB/RelA 및 IκB의 활성 조절과 관련이 있는 지를 입증하기 위하여 웨스턴 블롯팅 방법으로 하기 실시예와 같이 실험하였다.NF-κB / Rel A is normally present in the cytoplasm in an inactivated state by the inhibitory factor IκB, and when given a stimulus, IκB is phosphorylated to break down, releasing NF-κB / Rel A in a free form and moving into the nucleus. do. Alcohol is one of the stimuli that phosphorylates and decomposes IκB. In order to demonstrate whether the mechanism of inhibiting the transcription of TNF-α, IL-1α, and IL-6 is related to the regulation of NF-κB / Rel A and IκB activity, Western blotting method is as follows. Experiment.
또한, 알코올에 의해 간세포가 파괴됨에 따라 혈중 GOT(glutamic oxalacetic transaminase) 또는 GPT(glutamic pyruvate transaminase)의 농도가 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서 혈중 GOT 또는 GPT의 증가량을 분석하면 간세포 파괴의 정도를 결정할 수 있다. 본 발명자들은 알코올에 노출된 간세포에 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산을 처리하면 혈중 알코올 농도가 감소할 뿐만 아니라 혈중 GOT 및 GPT의 증가량이 감소하는 것을 발견한 것이다.In addition, as the liver cells are destroyed by alcohol, the concentration of GOT (glutamic oxalacetic transaminase) or GPT (glutamic pyruvate transaminase) is known to increase. Therefore, analyzing the increase in blood GOT or GPT can determine the extent of hepatocellular destruction. The present inventors have found that treatment of macromolecular water-soluble chitosan according to the present invention to hepatocytes exposed to alcohol not only reduces blood alcohol concentration but also decreases the amount of increase in blood GOT and GPT.
암이란 어떤 원인으로 인하여 정상 세포의 불필요한 세포분열을 억제하는 조절 기능이 제 기능을 다하지 못함으로써, 세포들이 비정상적으로 지속적인 분열을 거듭하면서 형성된 세포집단이 주위 조직 및 장기뿐만 아니라 발생부위로부터 멀리 떨어진 조직 및 장기까지에도 "전이"되어 결국에는 몸의 정상적인 기능을 마비시켜 죽음에 이르게 하는 질환을 일컫는 말이다. 현재까지 인간에게 알려진 암의 종류는 100가지가 넘는다. 연구 결과에 의하면 모든 암의 약 80%는 생활 습관 및 환경적 요인에 의해 발생하는 것으로 인정되고 있다. 그 중에서도 특히, 암의 직접적 원인으로서, 흡연, 음주, 여러가지 발암물질에의 노출, 환경 공해, 전리 방사선에의 노출, 각종 약물 또는 바이러스 등이 관여하는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 대부분의 종양 위험 인자는 개개인의 생활 습관과 밀접하게 관련이 되어 있기는 하지만, 본질적인 암의 원인에 관해서는 아직까지 명확히 밝혀지지 않은 것이 현실이다. 따라서 암에 대한 적절한 예방 조치에 많은 어려움을 겪고 있는 실정이다.Cancer is not able to function properly due to some factors that inhibit unnecessary cell division of normal cells, so that the cells formed by abnormally continuous division of cells are separated from the surrounding tissues and organs, as well as from the developmental site. And even the organ "transition" refers to a disease that eventually leads to the death of the body's normal function. To date, more than 100 types of cancer are known to humans. Studies show that about 80% of all cancers are caused by lifestyle and environmental factors. Among them, smoking, drinking, exposure to various carcinogens, environmental pollution, exposure to ionizing radiation, various drugs, viruses, and the like are known as direct causes of cancer. As such, most tumor risk factors are closely related to the individual's lifestyle, but it is not yet clear about the cause of cancer. Therefore, there are many difficulties in proper preventive measures against cancer.
간은 각종 종양이 호발하는 장기이다. 간에서 발생하는 종양은 양성 종양과 악성 종양(암)으로 나뉠 수 있다. 간에서 발생하는 암 중 간 자체에서 생겨난 암을 원발성 간암이라 하고, 다른 장기에서 발생하여 간으로 전이된 것을 간 전이암이라 한다. 간은 원발암 뿐만 아니라 전이암 발생률도 높다. 그 이유는 위장관에서 나오는 혈류가 일단 문맥을 통하여 간을 거치게 되므로, 위암, 대장암, 췌장암 등 각종 소화기 암들로부터 암이 간으로 쉽게 전이되기 때문이다.The liver is an organ where various tumors are called. Tumors that occur in the liver can be divided into benign and malignant (cancer) tumors. Among the cancers that occur in the liver, the cancer that occurs in the liver itself is called primary liver cancer, and it occurs in other organs and is metastasized to the liver. The liver has a high incidence of metastatic cancer as well as primary cancer. The reason is that blood flow from the gastrointestinal tract passes through the liver once through the portal vein, and cancer easily spreads to the liver from various gastrointestinal cancers such as gastric cancer, colon cancer, and pancreatic cancer.
간 자체에서 생겨난 원발성 간암 중 흔한 것은 간세포암(hepatocellular carcinoma, HCC)과 담관암종(cholangiocarcinoma, CC)이다. 간세포암은 간세포에서 유래한 것이며, 담관암종은 담관세포에서 유래한 것이다. 주변에서 흔히 관찰되는 만성 간질환 환자에서 많이 발생하는 간암은 간세포암이다. 담관암종은 그러한 만성 간질환과는 관련이 없다. 그런데 만성 간질환과 관련된 간세포암이 그렇지 않은 담관암종에 비해 훨씬 많다. 따라서 일반적으로 간암이라고 하면 대부분 간세포암을 의미한다.Common primary cancers of the liver itself are hepatocellular carcinoma (HCC) and cholangiocarcinoma (CC). Hepatocellular carcinoma is derived from hepatocytes, and cholangiocarcinoma is derived from bile duct cells. Hepatocellular carcinoma is a common occurrence in patients with chronic liver disease. Cholangiocarcinoma is not associated with such chronic liver disease. However, hepatocellular carcinoma associated with chronic liver disease is much higher than that of cholangiocarcinoma that is not. Therefore, generally speaking of liver cancer means hepatocellular carcinoma.
특히 우리나라는 간암 발생률이 매우 높은 편이어서 소위 "간암 왕국"으로 불리우고 있다. 우리나라에서 발생되는 간암은 대부분 만성 간질환과 관련되어 발생된다. 수술로 적출해 낸 간암 발생 주변 조직에는 대부분(60 내지 80%) 간경변증이 수반되어 있는 것으로 알려져 있다. 이렇게 우리나라에 간암이 특히 많이 발생하는 이유는 우리나라가 B형 간염 바이러스 발생율이 매우 높기 때문이다. 실제로우리나라 간암의 약 70% 정도는 B형 간염 바이러스의 감염에 기인한 것이다. B형 간염 바이러스 이외에도, C형 간염 바이러스에 의한 암발생이 약 13%정도이고, 기타가 약 18%정도이다. 우리나라 이외에도 세계적으로 간암 발생율이 높은 곳은 사하라 사막 이남의 아프리카, 중국 및 일본 등의 동아시아, 태국 등이다.In particular, Korea has a very high incidence of liver cancer, so it is called the "liver cancer kingdom". Most liver cancers in Korea are related to chronic liver disease. It is known that most (60 to 80%) liver cirrhosis is involved in the surrounding tissue of liver cancer extracted by surgery. The reason why hepatic cancer occurs especially in Korea is because the incidence of hepatitis B virus is very high in Korea. In fact, about 70% of liver cancer in our country is due to the hepatitis B virus infection. In addition to hepatitis B virus, hepatitis C virus causes about 13% of cancers and about 18% of other cancers. In addition to Korea, the world has a high incidence of liver cancer in sub-Saharan Africa, East Asia such as China, Japan, and Thailand.
우리나라 서울의 지역 통계에 의하면, 남성 암 환자 중에서 간암 환자의 비율이 위암에 이어 2번째로 높았고, 여성 암 환자 중에서는 위암, 자궁경부암, 유방암, 대장·직장암에 이어 5번째로 높았다. 따라서 우리나라에서 간암은 남성이 여성보다 약 6배가 더 높은 발생율을 나타냄을 알 수 있었다.According to the regional statistics of Seoul, Korea, the proportion of liver cancer patients was the second highest after gastric cancer and the fifth highest among female cancer patients after gastric cancer, cervical cancer, breast cancer, colon and colorectal cancer. Therefore, liver cancer in Korea is 6 times higher incidence than women.
간암은 발생 시기적으로 대개 중년 이후에 많이 발생한다. 그 이유는 시간이 지남에 따라 만성 간질환에 의해 장기간의 간세포의 괴사 및 재생이 반복되면서 간세포에 유전적 변이가 축적됨에 따라 암 발생률이 높아지기 때문이다. 이러한 경향은 B형 간염이나 C형 간염 모두에 해당된다. 이러한 경향은 간암이 장기간의 만성 간질환을 경과한 후에 발생하는 경우가 많다는 점, 그리고 대부분 간경변증이 동반되어 있는 상태에서 발생한다는 점 등에 의해 뒷받침되고 있다.Liver cancer usually occurs after middle age. The reason for this is that, as time goes on, necrosis and regeneration of hepatocytes by chronic liver disease are repeated, and as the genetic variation accumulates in hepatocytes, the incidence of cancer increases. This trend is true for both hepatitis B and hepatitis C. This tendency is supported by the fact that liver cancer often occurs after long-term chronic liver disease, and that most cases occur in the presence of cirrhosis.
간은 소위 "침묵의 장기"이다. 즉, 간암은 초기에 거의 증상이 없다. 증상이 나타난 후에 발견되는 간암은 이미 많이 진행된 상태인 경우가 대부분이다. 이 때 주로 나타나는 증상은, 우상복부 동통, 복부 팽만, 체중 감소, 식욕 부진 및 피로 등이다. 진행된 간암 환자의 배를 만져보면 간이 크고 딱딱하고 우둘두둘하게 만져지는 경우가 많다. 간암은 대부분 혈관이 풍부하다. 이로 인해 간혹 간 표면에 돌출해 있는 간암 조직에서 대량의 출혈이 발생되어 배가 갑자기 심하게 불러오면서쇼크 상태에 빠지는 경우도 있다. 이러한 쇼크는 심한 혈액량의 감소로 인하여 혈압이 급격히 저하되고 전신 혈액 순환이 안되는 위독한 상태를 말한다.The liver is the so-called "silent organ". In other words, liver cancer is initially asymptomatic. Most liver cancers that occur after symptoms appear are already advanced. The main symptoms at this time are upper right abdominal pain, abdominal bloating, weight loss, loss of appetite and fatigue. When you touch the stomach of a patient with advanced liver cancer, the liver is large and hard and often touched. Liver cancer is mostly rich in blood vessels. This can sometimes lead to massive bleeding from liver cancer tissue that protrudes from the surface of the liver, causing the abdomen to suddenly swell and fall into shock. This shock refers to a critical condition in which blood pressure drops sharply and systemic blood circulation is lost due to a severe decrease in blood volume.
요즘 한창 각광받고 있는 키토산은 갑각류, 예컨대, 새우, 게, 곤충 등의 껍질, 오징어의 뼈 등에 많이 함유되어 있다. 글루코사민 결합으로 이루어져 있는 키토산은 그 분자 구조가 우리 인체 조직과 매우 유사한 구조를 이루고 있고 친화성이 우수하여 면역학적으로 거부반응이 일어나지 않으므로 식품 및 의약품에 유용하게 이용될 수 있지만, 물에 거의 녹지 않으며 강산성이나 강알칼리에도 잘 녹지 않는 단점으로 인해 그 이용이 어렵다.Chitosan, which is in the spotlight nowadays, is contained in shellfish such as shellfish such as shrimp, crabs and insects, and squid bones. Chitosan, which is composed of glucosamine bonds, is very useful in food and medicine because its molecular structure is very similar to that of our human tissues and its excellent affinity does not cause immunological rejection, but it is almost insoluble in water. It is difficult to use due to the disadvantage that does not dissolve well in strong acid or strong alkali.
고분자는 고분자 상태를 유지하고 있을 수록 그 본래의 성질을 갖는다. 고분자가 저분자로 되면 될수록 고유한 성질을 잃는다. 따라서 키토산의 인체 흡수율을 최대한 높이면서도 키토산 고분자의 고유 성질을 잃지 않는 적정한 분자량의 범위를 설정하는 것이 어렵고도 중요하다. 본 발명에서는 그러한 키토산 혼합물의 평균 분자량의 범위가 2만 내지 200만이라는 것을 제시한다. 즉, 키토산의 인체 흡수율을 최대한 높이면서도 키토산 고분자의 고유 성질을 잃지 않는 적정한 평균 분자량의 범위는 2만 내지 200만이라는 것이다. 평균 분자량이 2만 보다 작은 키토산 혼합물은 키토산 본래의 성질이 약하기 때문에 간암의 치료 및 예방 효과가 떨어진다. 또한 평균 분자량이 200만 보다 큰 키토산 혼합물은 인체 흡수율이 떨어져서 결국 간암의 치료 및 예방 효과를 발휘하지 못한다. 인체 흡수율과 물성 유지의 두가지 상반되는 요건이 최대로 적절하게 충족되는 키토산 혼합물의 평균 분자량의 범위는 50만 내지 60만이다. 본 발명에 이용되는 키토산은 여러 분자량을 가진 다양한 단편들의 혼합물이 될 것이다. 그 혼합물을 이루는 각 단편들의 분자량 평균이 적어도 상기 범위 내에 들면 되는 것이다. 키토산 관련 학자들의 견해에 의하면, 고분자 상태의 수용성화된 키토산이어야 아미노기(NH2+)의 활성이 살아 있으므로, 키토산 본래의 효과를 기대할 수 있다. 본 발명자들은 키토산을 효소 및 초음파로 처리함으로써 분자량을 조절하고 수용성화 시킬 수 있음을 발견하였다.The more the polymer is maintained in the state of polymer, the more inherent its properties. The lower molecular weight the polymer loses its unique properties. Therefore, it is difficult and important to set an appropriate molecular weight range that does not lose the intrinsic properties of chitosan polymer while maximizing the human absorption rate of chitosan. The present invention suggests that the average molecular weight of such chitosan mixtures ranges from 20,000 to 2 million. In other words, the maximum average molecular weight range of 20,000 to 2 million, which does not lose the intrinsic properties of the chitosan polymer while increasing the human absorption rate of chitosan as much as possible. Chitosan mixtures with an average molecular weight of less than 20,000 are inferior in the effectiveness of treating and preventing liver cancer because of their weak nature of chitosan. In addition, chitosan mixtures with an average molecular weight of more than 2 million have a poor absorption of the human body and thus do not have a therapeutic and preventive effect on liver cancer. The average molecular weight of the chitosan mixture ranges from 500,000 to 600,000, at which the two opposing requirements of human uptake and physical property retention are most appropriately met. Chitosan used in the present invention will be a mixture of various fragments with different molecular weights. The molecular weight average of each of the fragments constituting the mixture falls within at least the above range. From the viewpoint of chitosan-related scholars, since the activity of the amino group (NH 2+ ) is alive only when the water-soluble chitosan in the polymer state can be expected, the original effect of chitosan can be expected. The inventors have discovered that the molecular weight can be controlled and solubilized by treating chitosan with enzymes and ultrasound.
본 발명자들은 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산이 알코올과 공동 작용하여 간암세포를 사멸시킨다는 것을 발견하였다. 더 나아가 상기와 같은 사멸 효과는 정상 간세포에는 미치지 않고 간암세포에만 선택적으로 미친다는 것을 발견하였다. 따라서 간암 치료 중에 조직의 피부를 통하여 알코올을 간암 조직에 주입시켜 암세포를 사멸시키는 방법에 있어서 알코올과 함께 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산을 처리한다면 정상 세포에 해를 입히지 않으면서도 효과적으로 간암세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있다.The inventors have found that the polymer water-soluble chitosan according to the present invention co-operates with alcohol to kill liver cancer cells. Furthermore, it was found that such killing effects selectively affect only hepatic cancer cells, not normal liver cells. Therefore, in the method of killing cancer cells by injecting alcohol into the liver cancer tissue through the skin of the tissue during the treatment of liver cancer, if the polymer-soluble chitosan according to the present invention is treated with alcohol, only the liver cancer cells can be selectively selectively without harming normal cells. Can be killed.
또한 본 발명자들은 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산이 알코올 매개성 간질환을 예방 및 치료함으로써 궁극적으로 간암 예방에 효과가 있음을 발견하였다. 구체적으로, 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산이 알코올에 의한 간세포의 파괴로 인해 증가하는 GOT(glutamic oxalacetic transaminase) 및 GPT(glutamic pyruvate transaminase)의 농도를 감소시키는 효과가 있음을 발견하였다.In addition, the present inventors have found that the polymer-soluble chitosan according to the present invention is ultimately effective in preventing liver cancer by preventing and treating alcohol-mediated liver disease. Specifically, the polymer-soluble chitosan according to the present invention was found to have an effect of reducing the concentration of GOT (glutamic oxalacetic transaminase) and GPT (glutamic pyruvate transaminase) due to the destruction of hepatocytes by alcohol.
본 발명자들은 본 발명의 효과를 입증하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산 혼합물을 제조하기 위해서 하기와 같은 과정을 수행하였다.The present inventors conducted the following experiment to prove the effect of the present invention. First, the following procedure was performed to prepare the polymer-soluble chitosan mixture according to the present invention.
고분자 수용성 키토산의 제조Preparation of Polymer Water Soluble Chitosan
새우 및 게의 껍질로부터 얻은 키토산을 산으로 처리한 후 키토사나아제, 키티나제, 셀룰라제 및 라이소자임 중 어느 하나 이상의 효소를 0.1 내지 15중량%의 농도로 처리하여 수용화시켰다. 상기 효소 처리와 병행하여, 10 내지 40KHz 범위의 주파수에서 10 내지 90분간 초음파 처리하였다. 그 다음 진공 건조시킨 후 순수한 물에 용해시켜 상기와 같은 초음파 처리 공정을 반복적으로 수행한 다음 정제하여 2만 내지 200만 범위의 평균 분자량을 갖는 키토산 혼합물을 얻었다. 그 후 상기 혼합물을 냉동 건조시켜 인체에 흡수될 수 있는 수용성 고분자 키토산을 제조하였다. 이와같이 하여 제조된 수용성 고분자 키토산을 분자량에 따라 나누면 하기 표1과 같다.Chitosan obtained from the shells of shrimp and crabs was treated with acid followed by treatment with enzymes of any one or more of chitosanase, chitinase, cellulase and lysozyme at a concentration of 0.1-15% by weight. In parallel with the enzyme treatment, sonication was performed for 10 to 90 minutes at a frequency in the range of 10 to 40 KHz. It was then dried in vacuo and then dissolved in pure water to repeatedly perform the above sonication process and then purified to obtain a chitosan mixture having an average molecular weight ranging from 20,000 to 2 million. Thereafter, the mixture was freeze-dried to prepare a water-soluble polymer chitosan that can be absorbed by the human body. The water-soluble polymer chitosan prepared in this manner is divided into the following Table 1 by molecular weight.
또한, 새우 및 게로부터 얻은 키토산에 키토사나아제를 키토산에 대하여 5중량% 주입함과 동시에 각각 10KHz, 20KHz, 30KHz로 각각 10분, 30분, 60분간 초음파로 처리하여 얻어진 키토산의 평균 분자량은 하기 표2와 같다.In addition, chitosan was injected into chitosan obtained from shrimp and crab by 5% by weight of chitosan, and the average molecular weight of chitosan obtained by ultrasonic treatment at 10KHz, 20KHz and 30KHz for 10 minutes, 30 minutes and 60 minutes, respectively, was as follows. Table 2 shows.
상기와 같은 평균 분자량을 갖는 키토산을 제조한 후 냉동건조하여 불순물이 없는 평균 분자량 20,000 내지 2,000,000인 키토산을 얻었다. 분자량은 GPC(Gel Permeation Chromatography)로 측정하였다.Chitosan having an average molecular weight as described above was prepared and then freeze-dried to obtain chitosan having an average molecular weight of 20,000 to 2,000,000 without impurities. Molecular weight was measured by Gel Permeation Chromatography (GPC).
상기 실시예 1 내지 실시예6의 제조공정으로 얻어진 최종제품의 중금속(Pb, As)을 정량 분석 하였다. 납(Pb)과 비소(As)의 정량은 자동흡수 스펙트럼(Atomic Absorption Spectrometer)(Varian Co. spectraAA-300, USA)을 사용하여 정량해본 바, 매우 양호한 구성물임을 확인하였다.Heavy metals (Pb, As) of the final product obtained in the manufacturing process of Example 1 to Example 6 were quantitatively analyzed. Determination of lead (Pb) and arsenic (As) was quantified using an automatic absorption spectrum (Atomic Absorption Spectrometer) (Varian Co. spectra AA-300, USA), and confirmed that it is a very good component.
또한 상기 초음파 공법을 통해 얻어진 고분자 수용성 키토산의 항균작용 등 황산화 효과를 대표적 황산화물인 비타민C와 비교하였다. 상기 실시예1 내지 실시예6의 최종산물을 용액(각각 0.1%, 0.5%, 1%의 농도)으로 제조하여 실험하였다. 측정은 UV 흡광기(Cary I. UV-Visible Spectrophotometer: Vanan Co. USA)로 하였다. 그 결과는 하기 표3에 나타내었다.In addition, the anti-sulfating effect such as antimicrobial activity of the polymer water-soluble chitosan obtained through the ultrasonic method was compared with the representative sulfur oxide vitamin C. The final product of Examples 1 to 6 was prepared and tested in solution (concentrations of 0.1%, 0.5% and 1%, respectively). The measurement was carried out with a UV absorber (Cary I. UV-Visible Spectrophotometer: Vanan Co. USA). The results are shown in Table 3 below.
상기 표3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산은 대표적인 황산화물인 비타민C와 동등한 수준의 황산화 효과가 있는 것을 알 수 있었다.As shown in Table 3, it was found that the polymer water-soluble chitosan according to the present invention has the same level of sulfated effect as vitamin C, which is a representative sulfur oxide.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 효과를 입증하기 위하여, 상기와 같이 하여 제조된 고분자 수용성 키토산을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.In addition, the present inventors performed the experiment as described below using the polymer water-soluble chitosan prepared as described above to prove the effect of the present invention.
<실험예1>Experimental Example 1
먼저, 알코올 매개성 간암세포 사멸에 미치는 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산의 작용을 알아보기 위한 실험을 수행하였다. 상기 제조된 평균 분자량 2만 내지 200만의 고분자 수용성 키토산 혼합물 1㎕/ml로 인간의 간암세포인 Hep G2 세포에 30분간 처리한 실험군(3), 10㎕/ml 농도의 키토산 혼합물로 인간의 간암세포인 Hep G2 세포에 30분간 처리한 실험군(4) 및 100㎕/ml농도의 키토산 혼합물로 인간의 간암세포인 Hep G2 세포에 30분간 처리한 실험군(5) 각각에 4%의 알코올을 24시간 처리하였다. 또한 어떠한 처리도 하지 않은 대조군(1)과 4%의 알코올로만 처리한 대조군(2)에 대해서도 실험하였다. 세포 생존율을 조사하기 위하여 MTT 테스트를 수행하였다. 배양된 상층액은 버리고 새로운 배지를 500㎕ 첨가한 후 5mg/ml MTT를 50㎕ 처리하였다. 3-4시간 37℃에서 배양하는 동안 생존한 세포는 보라색의 포르마잔(formazane)을 형성하며 사멸된 세포는 포르마잔을 형성하지 못하여 투명하게 보인다. 상층액과 함께 원심분리하여 디메틸술폭시드에 세포를 용해시킨 후 540nm 흡광도계에서 값을 측정하였다. 그 결과는 도1에 나타낸 그래프와 같다.First, an experiment was conducted to determine the action of the polymer-soluble chitosan according to the present invention on alcohol-mediated liver cancer cell death. Experimental group (3) treated with Hep G2 cells, which are human liver cancer cells, for 30 minutes with the average molecular weight of 20,000 to 2 million polymer water-soluble chitosan mixtures prepared above, human liver cancer cells with a chitosan mixture having a concentration of 10 μl / ml Treated with 4% alcohol for 24 hours in each experimental group (4) treated with Hep G2 cells for 30 minutes and experimental group (5) treated with Hep G2 cells, human liver cancer cells for 30 minutes, with a chitosan mixture of 100 μl / ml. It was. In addition, the control group (1) without any treatment and the control group (2) treated only with 4% alcohol were tested. MTT tests were performed to investigate cell viability. The cultured supernatant was discarded, and 500 µl of fresh medium was added, followed by 50 µl of 5 mg / ml MTT. Cells that survived incubation at 37 ° C. for 3-4 hours form purple formazan and killed cells do not form formazan and appear transparent. The cells were lysed in dimethylsulfoxide by centrifugation with the supernatant, and the values were measured on a 540 nm absorbance meter. The result is the same as the graph shown in FIG.
도1에 나타난 바와 같이, 대조군(1)의 세포 생존율이 100%인데 반해, 4%의 알코올을 처리한 세포(2)는 생존율이 70.2%로 감소한 것을 알 수 있었다. 4% 알코올과 함께 고분자 수용성 키토산을 처리한 세포는 그 키토산의 처리 농도에 따라 세포 생존율이 현저히 감소함을 알 수 있었다. 즉, 고분자 수용성 키토산 1㎍/ml처리한 실험군(3)의 경우 생존율이 59.7%로 감소하였고, 고분자 수용성 키토산 10㎍/ml 처리한 실험군(4)의 경우 생존율이 56.1%로 감소하였으며, 고분자 수용성 키토산 100㎍/ml 처리한 실험군(3)의 경우 생존율이 46.2%로 현저히 감소한 것을 알 수 있었다. 즉, 고분자 수용성의 처리에 의해 간암세포의 사멸 효과가 향상된 것을 알 수 있었다. 그러나 알코올 처리 없이 고분자 수용성 키토산만을 처리한 경우에는 효과가 없었다. 따라서 간암세포에서 고분자 수용성 키토산이 알코올과의 공동상승 작용을 통해 암세포의 사멸을 조절한다는 것을 알 수 있었다.As shown in FIG. 1, the cell viability of the control group (1) was 100%, whereas the cells (2) treated with 4% alcohol showed a decrease in survival rate of 70.2%. Cells treated with high molecular water-soluble chitosan with 4% alcohol showed a significant decrease in cell viability depending on the concentration of the chitosan. That is, in the experimental group (3) treated with 1 ㎍ / ml of polymer soluble chitosan, the survival rate was reduced to 59.7%, and the survival rate was reduced to 56.1% in the experimental group (4) treated with 10 ㎍ / ml of polymer soluble chitosan. In the experimental group (3) treated with 100 μg / ml chitosan, the survival rate was remarkably reduced to 46.2%. That is, it was found that the killing effect of liver cancer cells was improved by treatment of water-soluble polymer. However, there was no effect when only the polymer water-soluble chitosan was treated without alcohol treatment. Therefore, it was found that the polymer water-soluble chitosan regulates the death of cancer cells through co-synergism with alcohol in liver cancer cells.
<실험예2>Experimental Example 2
본 발명자들은 상기 실험예1에서와 같이 고분자 수용성 키토산이 알코올과 함께 처리되었을 때 간암세포만을 선택적으로 사멸시키고 정상 간세포에는 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.The present inventors performed the following experiment to prove that when the polymer water-soluble chitosan is treated with alcohol as in Experiment 1, it selectively kills only liver cancer cells and does not affect normal liver cells.
상기 실험예1과 같은 대조군(1, 2) 및 실험군 (3, 4, 5)의 처리를 정상 간세포인 장 리버(Chang liver) 세포에 4%의 알코올과 함께 상기 고분자 수용성 키토산 혼합물을 처리한 결과, 고분자 수용성 키토산 혼합물의 농도가 1㎍/ml인 실험군(3)의 경우 71.4%, 고분자 수용성 키토산 혼합물의 농도가 10㎍/ml인 실험군(4)의 경우 69.9%, 고분자 수용성 키토산 혼합물의 농도가 100㎍/ml인 실험군(5)의 경우 69.5%의 생존율을 나타내었다(도2). 즉, 상기 실험예1에서 고분자 수용성 키토산의 농도가 증가함에 따라 현저히 떨어졌던 간암세포의 생존율이, 정상 세포에 있어서는 생존율이 알코올만을 처리한 경우(2)와 거의 차이가 없음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 정상 간세포에서는 고분자 수용성 키토산이 알코올과의 공동상승 효과가없다는 것을 의미한다. 따라서 고분자 수용성 키토산은 알코올과의 공동상승 작용시 정상 간세포와 간암세포를 구별하여 간암세포만을 선택적으로 사멸시킨다는 결론을 내릴 수 있었다.Treatment of the control group (1, 2) and the experimental group (3, 4, 5) as in Experimental Example 1 as a result of treating the macromolecular soluble chitosan mixture with 4% alcohol to Chang liver cells, which are normal hepatocytes , 71.4% for the experimental group (3) having a concentration of 1 µg / ml of the polymer-soluble chitosan mixture, 69.9% for the experimental group (4) having a concentration of 10 µg / ml of the polymer-soluble chitosan mixture, In the experimental group (5) of 100 μg / ml, the survival rate was 69.5% (FIG. 2). That is, it was found that the survival rate of hepatocellular carcinoma cells, which significantly decreased as the concentration of the polymer water-soluble chitosan in Experimental Example 1, was significantly different from that of the alcohol-only treatment (2). These results indicate that high molecular water-soluble chitosan has no synergistic effect with alcohol in normal hepatocytes. Therefore, it was concluded that the polymer water-soluble chitosan selectively kills only liver cancer cells by distinguishing normal liver cells from normal liver cells when co- synergistic action with alcohol.
<실험예3>Experimental Example 3
본 발명자들은 간암세포의 사멸을 상기 실험예1 및 실험예2에서 MTT 테스트로 확인하는 방법 이외에도 다른 방법을 함께 수행함으로써 간암세포 사멸 상태를 더 확실히 감지하고자 하였다. 그 중 하나로서, 본 발명에서는 DNA량의 변화를 측정함으로써 간암세포의 사멸을 감지하는 방법을 이용하였다. 여러 가지 요인에 의한 세포 사멸은 초기에 형태학적 모양변화가 일어나면서 핵이 응축되고 결국에는 DNA가 산산조각이 되어 세포가 죽게 된다.The present inventors attempted to detect the liver cancer cell death more reliably by performing other methods in addition to the method of confirming the death of liver cancer cells by the MTT test in Experimental Example 1 and Experimental Example 2. As one of them, the present invention used a method of detecting the death of liver cancer cells by measuring the change in the amount of DNA. Apoptosis caused by various factors initially causes morphological shape changes, condensing the nucleus, and eventually shattering DNA, causing the cell to die.
먼저 4%의 알코올과 상기 고분자 수용성 키토산 혼합물을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 플로우 사이토메트리(flow cytometry) 분석을 시행하였다. 상층액과 트립신으로 수확한 세포를 모아서 2000rpm에서 10분간 원심 분리한 후 PBS(Phosphate-buffered saline) 용액으로 1회 세척하였다. 그 후 0.5% 트윈(tween)-20이 포함된 70%의 에탄올로 30분 고정한 후 1% BSA(bovine serum albumin)이 포함된 PBS로 1회 세척하였다. 50㎍/ml의 요오드화 프로피디움(propidium)으로 핵을 염색한 후 1% BSA가 포함된 PBS로 1회 세척한 후 플로우 사이토메트리 분석을 수행하였다. 그 결과는 도3에 나타내었다.First, 4% alcohol and the polymer water-soluble chitosan mixtures were treated by concentration, and cultured for 24 hours, followed by flow cytometry analysis. Cells harvested with supernatant and trypsin were collected and centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes and washed once with PBS (Phosphate-buffered saline) solution. After fixing for 30 minutes with 70% ethanol containing 0.5% tween-20 and washed once with PBS containing 1% BSA (bovine serum albumin). Nuclei stained with 50 μg / ml propidium iodide (propidium) and then washed once with PBS containing 1% BSA and flow cytometry analysis was performed. The results are shown in FIG.
도3에 나타난 바와 같이, Hep G2 세포에 알코올만을 처리하였을 때(2)의 세포 사멸율은 약 55%이었고, 알코올과 함께 100㎍/ml의 상기 고분자 수용성 키토산혼합물을 처리(3)하였을 때에는 90%, 알코올과 함께 10㎍/ml의 고분자 수용성 키토산 혼합물을 처리(2)하였을 때에는 73% 정도의 세포 사멸이 일어남을 알 수 있었다. "1"은 어떠한 처리도 하지 않은 대조군이고, "5"는 알코올과 함께 1㎍/ml의 고분자 수용성 키토산 혼합물을 처리한 경우의 결과이다. 따라서 DNA량 변화로서 세포 사멸을 감지하는 방법을 이용하여 고분자 수용성 키토산의 효능을 알아본 결과, 고분자 수용성 키토산은 알코올과의 공동상승 작용을 일으켜 간암세포를 선택적으로 사멸시킨다는 것이 더 강하게 입증되었다.As shown in Fig. 3, the cell death rate when Hep G2 cells were treated only with alcohol (2) was about 55%, and when the polymer-soluble chitosan mixture of 100 μg / ml with alcohol was treated (3), 90%. % And cell death of 10 μg / ml of the polymer-soluble chitosan mixture (2) was found to result in about 73% cell death. "1" is the control without any treatment, and "5" is the result when the 1 μg / ml polymer water-soluble chitosan mixture was treated with alcohol. Therefore, as a result of examining the efficacy of the polymer water-soluble chitosan using a method of detecting cell death as a change in the amount of DNA, it was more strongly demonstrated that the polymer water-soluble chitosan selectively kills liver cancer cells by synergistic action with alcohol.
또한, 본 발명자들은 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산이 알코올 매개성 물질의 분비를 억제하여 숙취를 제거하고 간손상을 억제하며, 나아가 간암을 예방하는 효과가 있다는 것을 입증하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.In addition, the present inventors conducted the following experiment to prove that the polymer water-soluble chitosan according to the present invention has the effect of suppressing the secretion of alcohol-mediated substances to remove hangovers, inhibit liver damage, and further prevent liver cancer. It was.
<실험예4>Experimental Example 4
실험방법Experiment method
1. 시약1. Reagent
에탄올은 독일의 Merck KGaA사로부터 구입하였고, TNF-α, IL-1α 및 IL-6 및 각각에 대한 항체는 미국의 R&D사로부터 구입하였다. 세포배양용 배지(DMEM)는 Gibco BRL에서 구입한 것을 사용하였고, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸륨 브롬화물(MTT)은 시그마 케미칼사(Sigma chemical co.)로부터 구입한 것을 사용하였다. 또한 세포배양용 플레이트, 효소면역측정법(ELISA; enzyme linked immunosorbent assay) 용 플레이트 및 디쉬는 Nunc(Naperville, MD)로부터 구입한 것을 사용하였다. 그리고 본 발명에 의한 평균 분자량이 20,000 내지 2,000,000인고분자 수용성 키토산 혼합물은 본 발명자가 상기 방법에 따라 제조한 것을 사용하였다.Ethanol was purchased from Merck KGaA, Germany, and antibodies from TNF-α, IL-1α and IL-6, and each from R & D, USA. Cell culture medium (DMEM) was purchased from Gibco BRL, and 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) was sigma chemical. The one purchased from Sigma chemical co. Was used. In addition, the plate for cell culture, the plate for enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), and the dish were purchased from Nunc (Naperville, MD). The polymer water-soluble chitosan mixture having an average molecular weight of 20,000 to 2,000,000 according to the present invention was prepared by the inventors according to the above method.
2. Hep G2 세포의 준비2. Preparation of Hep G2 Cells
사람의 간모세포종 세포주인 Hep G2 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 배양하였다. 4웰에 2×105셀/웰을 플레이팅하고 12시간 이상 안정화시킨 후에 실험에 이용하였다.Hep G2 cells, a human hepatoblastoma cell line, were cultured in an incubator at 37 ° C., 5% CO 2 using DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin / streptomycin. 2 × 10 5 cells / well were plated into 4 wells and used for experiments after stabilization for at least 12 hours.
3. ELISA3. ELISA
세포활성물질의 정량은 ELISA 방법을 사용하여, 96웰 ELISA 플레이트에서 중복 실행하였다. 세포활성물질에 대한 단클론 항체 1㎍/ml을 PBS(pH 7.4)로 희석하여 96웰 플레이트에 100㎕씩 각각 입힌 다음 4℃에서 12시간동안 방치하였다. 이 플레이트를 0.05% 트윈(Tween-20)이 포함된 PBS로 세척한 다음 1% BSA, 5% 수크로즈 및 0.05% NaN3가 포함된 PBS로 1시간동안 블록킹하였다. 수회 세척한 후 샘플을 첨가한 후 37℃에서 2시간동안 방치하였다. 플레이트 웰을 다시 세척한 후 비오틴이 결합된 항체 0.2㎍/ml을 첨가한 후 다시 37℃에서 2시간동안 방치하였다. 웰을 세척한 후 토끼 IgG-접합된 알칼라인 포스파타제 및 아비딘 퍼옥시다제를 첨가하고 37℃에서 20분동안 방치하였다. 웰을 다시 세척한 후 ABTS 기질을 첨가하였다. 발색반응은 ELISA 판독기를 사용하여 405nm에서 측정하였고, 표준 곡선은 순차적으로 희석된 재조합 세포활성물질을 사용하여 각각의 정량에 적용하였다.Quantification of cell activators was performed in 96-well ELISA plates in duplicate using the ELISA method. 1 μg / ml of the monoclonal antibody against the cell activator was diluted with PBS (pH 7.4), coated in 100 μl each in a 96 well plate, and left at 4 ° C. for 12 hours. The plate was washed with PBS containing 0.05% Tween-20 and then blocked for 1 hour with PBS containing 1% BSA, 5% sucrose and 0.05% NaN 3 . After washing several times, the sample was added and then left at 37 ° C. for 2 hours. The plate wells were washed again, followed by addition of 0.2 μg / ml of the biotin-bound antibody, followed by another 2 hours at 37 ° C. The wells were washed and then rabbit IgG-conjugated alkaline phosphatase and avidin peroxidase were added and left at 37 ° C. for 20 minutes. The wells were washed again and then ABTS substrate was added. The color reaction was measured at 405 nm using an ELISA reader, and standard curves were applied to each quantitation using sequentially diluted recombinant activators.
4. 웨스턴 블롯 분석4. Western Blot Analysis
처리된 세포를 용해 버퍼로 수확한 다음, BCA 용액으로 단백질을 정량하였다. 50㎍ 단백질을 10% 겔에서 전기영동한 후, 니트로셀룰로스 막으로 이동시켜 10% 탈지유로 1시간동안 블록킹시켰다. 항-NF-κB 및 항-IκB에 대한 항체를 1시간 처리하고 PBS(트윈-20)로 세척하였다. 각각에 대한 2차 항체를 30분동안 처리한 다음 세척한 후, ECL 용액 키트로 검출하였다.Treated cells were harvested with lysis buffer and then protein quantified with BCA solution. 50 μg protein was electrophoresed on a 10% gel, then transferred to nitrocellulose membrane and blocked for 1 hour with 10% skim milk. Antibodies against anti-NF-κB and anti-IκB were treated for 1 hour and washed with PBS (Tween-20). Secondary antibodies to each were treated for 30 minutes and then washed, then detected with an ECL solution kit.
5. 통계학적 분석5. Statistical Analysis
모든 자료는 평균들±S.E.로 나타내었으며, 통계학적 분석은 스투던트 t-테스트로 행하였다. 유의 수준은 P<0.05로 하였다.All data are expressed as means ± S.E. And statistical analysis was done by Student's t-test. The significance level was P <0.05.
상기 실험방법을 이용하여 본 발명자는 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산이 Hep G2 세포에서 알코올-매개 TNF-α, IL-1α 및 IL-6 합성 및 분비를 억제하는 효과에 대해서 하기와 같이 각각 실험하여 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다.Using the above experimental method, the present inventors experimented on the effects of the polymer-soluble chitosan according to the present invention to inhibit the synthesis and secretion of alcohol-mediated TNF-α, IL-1α and IL-6 in Hep G2 cells. The following results were obtained.
<실험예4-1>Experimental Example 4-1
먼저, 상기와 같은 실험 방법을 이용하여 알코올-매개 TNF-α분비에 대해 다음과 같이 실험하였다.First, the following experiment was performed on alcohol-mediated TNF-α secretion using the above experimental method.
평균 분자량이 20,000 내지 2,000,000인 고분자 수용성 키토산 혼합물을 상기 처리방법에 따라 처리하여 준비하였다. 준비된 상기 각 분자량의 고분자 수용성 키토산을 상기 준비된 Hep G2 세포 배양액에 각각 0.1, 1, 10 및 100㎍/ml로 처리하여 실험군 1-4를 준비하였다. 그리고 고분자 수용성 키토산으로 처리하지 않은 대조군인 두개의 Hep G2 세포배양액을 또한 준비하였다. 상기 고분자 수용성 키토산을 처리하고 1시간이 경과한 후 준비된 4개의 실험군과 1개의 대조군(대조군2)에 4%의 에탄올을 24시간동안 처리하였다. 처리된 배양액의 상층액 중의 TNF-α의 수준을 측정하기 위해 상기와 같이 ELISA법을 수행하였다.A polymer water-soluble chitosan mixture having an average molecular weight of 20,000 to 2,000,000 was prepared by treating it according to the above treatment method. Experimental groups 1-4 were prepared by treating each of the prepared polymer water-soluble chitosans with 0.1, 1, 10 and 100 µg / ml of the prepared Hep G2 cell culture. And two Hep G2 cell cultures were also prepared as controls not treated with polymer water soluble chitosan. After 1 hour of treatment with the polymer water-soluble chitosan, 4% of ethanol was treated in 4 experimental groups and 1 control group (control group 2) prepared for 24 hours. ELISA was performed as above to measure the level of TNF-α in the supernatant of the treated culture.
그 결과는 다음과 같다.the results are as follow.
*P<0.01* P <0.01
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 알코올을 Hep G2 세포에 처리하면 TNF-α가 많이 분비됨을 알 수 있었다. 또한 Hep G2 세포에서 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산을 처리하였을 때, 알코올에 의한 TNF-α 분비는 고분자 수용성 키토산의 농도에 따라 감소하였음을 알 수 있었다. 특히, 100㎍/ml의 농도(실험군1)에서는 약 70%까지 현저하게 억제되었다. 따라서 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산이 알코올에 의한 TNF-α의 분비를 효과적으로 억제함으로써 간세포를 보호한다는 것이 입증되었다.As shown in Table 4, the treatment of alcohol to Hep G2 cells was found to secrete a lot of TNF-α. In addition, when the polymer water-soluble chitosan of the present invention was treated in Hep G2 cells, it was found that the secretion of TNF-α by alcohol decreased with the concentration of the polymer-soluble chitosan. In particular, the concentration of 100 μg / ml (Experimental Group 1) was significantly suppressed by about 70%. Therefore, it was demonstrated that the polymer water-soluble chitosan according to the present invention protects liver cells by effectively inhibiting the secretion of TNF-α by alcohol.
<실험예4-2>Experimental Example 4-2
상기와 같은 실험 방법을 이용하여 아세트알데히드-매개 TNF-α분비에 대해 다음과 같이 실험하였다.Using the same experimental method as described above for the acetaldehyde-mediated TNF-α secretion was performed as follows.
평균 분자량이 20,000 내지 2,000,000인 고분자 수용성 키토산 혼합물을 상기 처리방법에 따라 처리하여 준비하였다. 준비된 상기 각 분자량의 고분자 수용성 키토산을 상기 준비된 Hep G2 세포 배양액에 각각 0.1, 1, 10 및 100㎍/ml로 처리하여 실험군1-4를 준비하였다. 그리고 고분자 수용성 키토산으로 처리하지 않은 대조군인 두개의 Hep G2 세포배양액을 또한 준비하였다. 상기 고분자 수용성 키토산을 처리하고 1시간이 경과한 후 준비된 모든 4개의 실험군과 1개의 대조군(대조군2)에 500μM의 아세트알데히드를 24시간동안 처리하였다. 처리된 배양액의 상층액 중의 TNF-α의 수준을 측정하기 위해 상기와 같이 ELISA법을 수행하였다.A polymer water-soluble chitosan mixture having an average molecular weight of 20,000 to 2,000,000 was prepared by treating it according to the above treatment method. Experimental groups 1-4 were prepared by treating the prepared polymer water-soluble chitosan of each molecular weight with 0.1, 1, 10 and 100 µg / ml, respectively. And two Hep G2 cell cultures were also prepared as controls not treated with polymer water soluble chitosan. After 1 hour of treatment with the polymer water-soluble chitosan, 500 μM of acetaldehyde was treated for 24 hours in all four experimental groups and one control group (control group 2) prepared. ELISA was performed as above to measure the level of TNF-α in the supernatant of the treated culture.
그 결과는 다음과 같다.the results are as follow.
*P<0.01* P <0.01
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 아세트알데히드를 Hep G2 세포에 처리하면 TNF-α가 많이 분비됨을 알 수 있었다. 또한 Hep G2 세포에서 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산을 처리하였을 때, 아세트알데히드에 의한 TNF-α 분비는 고분자 수용성 키토산의 농도에 따라 감소하였음을 알 수 있었다. 특히, 100㎍/ml의 농도(실험군1)에서 가장 많이 억제되었다. 따라서 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산이 아세트알데히드에 의한 TNF-α의 분비를 효과적으로 억제함으로써 간세포를 보호한다는 것이 입증되었다.As shown in Table 5, the treatment of acetaldehyde in Hep G2 cells was found to be secreted a lot of TNF-α. In addition, when Hep G2 cells were treated with the polymer-soluble chitosan according to the present invention, it was found that the secretion of TNF-α by acetaldehyde decreased with the concentration of the polymer-soluble chitosan. In particular, the most inhibited at a concentration of 100 μg / ml (Experimental Group 1). Therefore, it has been demonstrated that the polymer water-soluble chitosan according to the present invention protects liver cells by effectively inhibiting the secretion of TNF-α by acetaldehyde.
<실험예4-3>Experimental Example 4-3
상기와 같은 실험 방법을 이용하여 알코올-매개 IL-1α분비에 대해 다음과 같이 실험하였다.Using the same experimental method as described above for the alcohol-mediated IL-1α secretion was tested as follows.
평균 분자량이 20,000 내지 2,000,000인 고분자 수용성 키토산 혼합물을 상기 처리방법에 따라 처리하여 준비하였다. 준비된 상기 각 분자량의 고분자 수용성 키토산을 상기 준비된 Hep G2 세포 배양액에 각각 0.1, 1, 10 및 100㎍/ml로 처리하여 실험군1-4를 준비하였다. 그리고 고분자 수용성 키토산으로 처리하지 않은 대조군인 두개의 Hep G2 세포배양액을 또한 준비하였다. 상기 고분자 수용성 키토산을 처리하고 1시간이 경과한 후 준비된 실험군 4개와 대조군 1개(대조군2)에 4%의 알코올을 24시간동안 처리하였다. 처리된 배양액의 상층액 중의 IL-1α의 수준을 측정하기 위해 상기와 같이 ELISA법을 수행하였다.A polymer water-soluble chitosan mixture having an average molecular weight of 20,000 to 2,000,000 was prepared by treating it according to the above treatment method. Experimental groups 1-4 were prepared by treating the prepared polymer water-soluble chitosan of each molecular weight with 0.1, 1, 10 and 100 µg / ml, respectively. And two Hep G2 cell cultures were also prepared as controls not treated with polymer water soluble chitosan. After 1 hour of treatment with the polymer water-soluble chitosan, 4% alcohol was treated in 4 experimental groups and 1 control group (control group 2) prepared for 24 hours. ELISA was performed as above to measure the level of IL-1α in the supernatant of the treated culture.
그 결과는 다음과 같다.the results are as follow.
*P<0.01* P <0.01
상기 표 6에 나타난 바와 같이, 알코올을 Hep G2 세포에 처리하면 IL-1α 가 많이 분비됨을 알 수 있었다. 또한 Hep G2 세포에서 본 발명에 의한 고분자 수용성키토산을 처리하였을 때, 알코올에 의한 IL-1α 분비는 고분자 수용성 키토산의 농도에 따라 감소하였음을 알 수 있었다. 특히, 100㎍/ml의 농도(실험군1)에서는 약 50%까지 현저하게 억제되었다. 따라서 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산이 알코올에 의한 IL-1α의 분비를 효과적으로 억제함으로써 간세포를 보호한다는 것이 입증되었다.As shown in Table 6 above, it was found that IL-1α was secreted much when the alcohol was treated to Hep G2 cells. In addition, when the polymer water-soluble chitosan according to the present invention was treated in Hep G2 cells, IL-1α secretion by alcohol was reduced according to the concentration of the polymer water-soluble chitosan. In particular, the concentration of 100 μg / ml (Experimental Group 1) was significantly inhibited by about 50%. Therefore, it has been demonstrated that the polymer water-soluble chitosan according to the present invention protects liver cells by effectively inhibiting the secretion of IL-1α by alcohol.
<실험예4-4>Experimental Example 4-4
상기와 같은 실험 방법을 이용하여 알코올-매개 IL-6의 분비에 대해 다음과 같이 실험하였다.Using the same experimental method as described above for the secretion of alcohol-mediated IL-6.
상기 제조된 고분자 수용성 키토산을 상기 준비된 Hep G2 세포 배양액에 각각 0.1, 1, 10 및 100㎍/ml로 처리하여 실험군1-4 준비하였다. 그리고 고분자 수용성 키토산으로 처리하지 않은 대조군인 두개의 Hep G2 세포배양액을 또한 준비하였다. 상기 고분자 수용성 키토산을 처리하고 1시간이 경과한 후 준비된 4개의 실험군과 1개의 대조군(대조군2)에 4%의 알코올을 24시간동안 처리하였다. 처리된 배양액의 상층액 중의 IL-6의 수준을 측정하기 위해 상기와 같이 ELISA법을 수행하였다.The prepared polymer water-soluble chitosan was prepared in Experimental Groups 1-4 by treating 0.1, 1, 10 and 100 µg / ml to the prepared Hep G2 cell culture, respectively. And two Hep G2 cell cultures were also prepared as controls not treated with polymer water soluble chitosan. After 1 hour of treatment with the polymer water-soluble chitosan, 4% alcohol was treated in 4 experimental groups and 1 control group (control group 2) prepared for 24 hours. ELISA was performed as above to measure the level of IL-6 in the supernatant of the treated culture.
그 결과는 다음과 같다.the results are as follow.
*P<0.01* P <0.01
상기 표 7에 나타난 바와 같이, 알코올을 Hep G2 세포에 처리하면 IL-6이 많이 분비됨을 알 수 있었다. 또한 Hep G2 세포에서 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산을 처리하였을 때, 알코올에 의한 IL-6 분비는 고분자 수용성 키토산의 농도에 따라 감소하였음을 알 수 있었다. 특히, 100㎍/ml의 농도(실험군1)에서는 약 25%까지 억제되었다. 따라서 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산이 알코올에 의한 IL-6의 분비를 효과적으로 억제함으로써 간세포를 보호한다는 것이 입증되었다.As shown in Table 7, it was found that IL-6 was secreted when the alcohol was treated to Hep G2 cells. In addition, when the polymer water-soluble chitosan according to the present invention was treated in Hep G2 cells, IL-6 secretion by alcohol was reduced according to the concentration of the polymer water-soluble chitosan. In particular, the concentration of 100 μg / ml (Experimental Group 1) was suppressed to about 25%. Therefore, it has been demonstrated that the polymer water-soluble chitosan according to the present invention protects liver cells by effectively inhibiting the secretion of IL-6 by alcohol.
또한, 본 발명자는 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산의 알콜-매개 세포활성물질의 합성 억제 기전이 유전자의 전사단계에서의 전사인자인 NF-κB/Rel A과 그 억제자인 IκB의 활성 변화에 기인한 것인지를 규명하기 위하여 각각 하기와 같이 실험하였다.The present inventors also found that the mechanism of inhibiting the synthesis of the alcohol-mediated cell activator of the polymer water-soluble chitosan according to the present invention is due to the change in the activity of the transcription factor NF-κB / Rel A and its inhibitor IκB in the transcriptional phase of the gene. Each experiment was carried out as follows to determine whether or not.
<실험예4-5>Experimental Example 4-5
평균 분자량이 20,000 내지 2,000,000인 고분자 수용성 키토산 혼합물을 상기 처리방법에 따라 처리하여 준비하였다. 준비된 상기 각 분자량의 고분자 수용성 키토산을 상기 준비된 Hep G2 세포 배양액에 각각 10 및 100㎍/ml(도4의 4 및 3)로 처리하였다. 그리고 고분자 수용성 키토산으로 처리하지 않은 두개(도4의 1, 2)의 Hep G2 세포배양액을 또한 준비하였다. 상기 고분자 수용성 키토산을 처리하고 1시간이 경과한 후, 준비된 상기 키토산 처리된 배양액 2개(3, 4)와 배양액 1개(2)에 4%의 알코올을 24시간동안 처리하였다. 본 실험을 위해 총 네개의 배양액에 행해진 처리는 다음과 같이 표로 정리할 수 있다.A polymer water-soluble chitosan mixture having an average molecular weight of 20,000 to 2,000,000 was prepared by treating it according to the above treatment method. The prepared polymer water-soluble chitosan of each molecular weight was treated at 10 and 100 μg / ml (4 and 3 of FIG. 4) to the prepared Hep G2 cell culture, respectively. And two Hep G2 cell cultures were also prepared that were not treated with polymer water soluble chitosan. After 1 hour of treatment with the polymer water-soluble chitosan, 4% alcohol was treated for 2 hours (3, 4) and 1 medium (2) of the prepared chitosan treated solution for 24 hours. The treatments performed on a total of four cultures for this experiment can be summarized in the table below.
처리된 세포를 용해 버퍼로 수확한 다음, BCA 용액으로 단백질을 정량하였다. 50㎍ 단백질을 10% 겔에서 전기영동한 후, 니트로셀룰로스 막으로 이동시켜 10% 탈지유로 1시간동안 블록킹시켰다. 항-NF-κB에 대한 항체를 1시간 처리하고 PBS(트윈-20)로 세척하였다. 각각에 대한 2차 항체를 30분동안 처리한 다음 세척한 후, ECL 용액 키트로 검출하였다.Treated cells were harvested with lysis buffer and then protein quantified with BCA solution. 50 μg protein was electrophoresed on a 10% gel, then transferred to nitrocellulose membrane and blocked for 1 hour with 10% skim milk. Antibodies against anti-NF-κB were treated for 1 hour and washed with PBS (Tween-20). Secondary antibodies to each were treated for 30 minutes and then washed, then detected with an ECL solution kit.
그 결과는 도4에 나타난 바와 같다. 도4에 나타난 바와 같이, 4% 알코올을 처리(2)함으로써 NF-κB의 합성이 현저히 증가된 것을 알 수 있었다. 또한 고분자 수용성 키토산 100㎍/ml를 처리한 다음 4% 알코올을 처리한 3의 경우에 NF-κB의 양이 가장 작은 것을 알 수 있었다. 따라서 고분자 수용성 키토산은 간 손상의 원인인 세포활성물질을 발현하는 유전자의 전사인자인 NF-κB의 합성을 억제함으로써 간을 보호할 수 있다는 것이 입증되었다.The result is as shown in FIG. As shown in FIG. 4, it was found that the synthesis of NF-κB was significantly increased by treating (2) 4% alcohol. In addition, it was found that the amount of NF-κB was the smallest in the case of 3 treated with 100 μg / ml of polymer water-soluble chitosan and then treated with 4% alcohol. Therefore, it has been demonstrated that the polymer water-soluble chitosan can protect the liver by inhibiting the synthesis of NF-κB, a transcription factor of genes expressing cytoactive substances that cause liver damage.
<실험예4-6>Experimental Example 4-6
평균 분자량이 20,000 내지 2,000,000인 고분자 수용성 키토산 혼합물을 상기 처리방법에 따라 처리하여 준비하였다. 준비된 상기 각 분자량의 고분자 수용성 키토산을 상기 준비된 Hep G2 세포 배양액에 각각 10 및 100㎍/ml(도5의 4 및 3)로 처리하여 실험군을 준비하였다. 그리고 고분자 수용성 키토산으로 처리하지 않은두개(도5의 1, 2)의 Hep G2 세포배양액을 또한 준비하였다. 상기 고분자 수용성 키토산을 처리하고 1시간이 경과한 후, 준비된 상기 키토산 처리된 배양액 2개(3, 4)와 처리되지 않은 배양액 1개(2)에 4%의 알코올을 24시간동안 처리하였다. 본 실험을 위해 총 네개의 배양액에 행해진 처리는 다음과 같이 표로 정리할 수 있다.A polymer water-soluble chitosan mixture having an average molecular weight of 20,000 to 2,000,000 was prepared by treating it according to the above treatment method. The experimental groups were prepared by treating the prepared polymer water-soluble chitosan of each molecular weight at 10 and 100 μg / ml (4 and 3 of FIG. 5) to the prepared Hep G2 cell culture, respectively. And two Hep G2 cell culture fluids (1, 2 in Fig. 5) that were not treated with polymer water soluble chitosan were also prepared. After 1 hour of treatment with the polymer water-soluble chitosan, 4% alcohol was treated for 2 hours (3, 4) of the prepared chitosan-treated culture medium and 1 (2) of the untreated culture solution for 24 hours. The treatments performed on a total of four cultures for this experiment can be summarized in the table below.
처리된 세포를 용해 버퍼로 수확한 다음, BCA 용액으로 단백질을 정량하였다. 50㎍ 단백질을 10% 겔에서 전기영동한 후, 니트로셀룰로스 막으로 이동시켜 10% 탈지유로 1시간동안 블록킹시켰다. 항-IκB에 대한 항체를 1시간 처리하고 PBS(트윈-20)로 세척하였다. 각각에 대한 2차 항체를 30분동안 처리한 다음 세척한 후, ECL 용액 키트로 검출하였다.Treated cells were harvested with lysis buffer and then protein quantified with BCA solution. 50 μg protein was electrophoresed on a 10% gel, then transferred to nitrocellulose membrane and blocked for 1 hour with 10% skim milk. Antibodies against anti-IκB were treated for 1 hour and washed with PBS (Tween-20). Secondary antibodies to each were treated for 30 minutes and then washed, then detected with an ECL solution kit.
그 결과는 도 5에 나타난 바와 같다. 도 5에 나타난 바와 같이, 4% 알코올을 처리(2)함으로써 IκB의 합성이 현저히 감소하는 것을 알 수 있었다. 또한 고분자 수용성 키토산 100㎍/ml를 처리한 다음 4% 알코올을 처리한 3의 경우에 NF-κB의 양이 가장 많은 것을 알 수 있었다. 따라서 고분자 수용성 키토산은 간 손상의 원인인 세포활성물질을 발현하는 유전자의 전사인자인 NF-κB의 억제인자인 IκB의 분해를 억제함으로써 간을 보호할 수 있다는 것이 입증되었다.The result is as shown in FIG. As shown in FIG. 5, it was found that the synthesis of IκB was significantly reduced by treating 2% of 4% alcohol. In addition, it was found that the amount of NF-κB was the highest in the case of 3 treated with 100 μg / ml of polymer water-soluble chitosan and then treated with 4% alcohol. Therefore, it has been demonstrated that the polymer water-soluble chitosan can protect the liver by inhibiting the degradation of IκB, an inhibitor of NF-κB, a transcription factor of genes expressing cytoactive substances that cause liver damage.
<실험예5>Experimental Example 5
본 발명자들은 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산이 실제 인간의 간에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 임상 실험을 수행하였다.The present inventors conducted the following clinical experiment to determine the effect of the polymer water-soluble chitosan according to the present invention in the real human liver.
본 실험은 전북 익산시에 위치한 원광대학교 학생들 중 평균 주량이 소주 1병 이상으로 술을 즐겨 마시는 20명의 남녀 학생(20대 남학생 5명, 20대 여학생 5명, 30대 남학생 5명, 30대 여학생 5명)을 대상으로 이루어졌다. 이들은 모두 육체적, 정신적으로 건강한 대학생들었다. 본 실험에 들어가기 전에 임상 실험 지원 대상자들은 1주일 동안 금주시켰다. 임상 실험 지원 대상자는 음주 전 식품의 섭취를 동일하게 하기 위해 음주 2시간 전에 같은 종류의 가벼운 식사를 같이 한 후에 음주를 시작하였다. 본 실험은 개인차를 없애기 위해 2-상 교차 설계(2-phase cross-over design)로 하였다. 즉, 모든 대상자들은 한번은 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산을 섭취한 후, 위약을 복용하고 음주하였다. 두 번의 실험 사이에 7일의 간격을 두었다. 임상 실험은 2회 수행하였다. 1차 실험에서는 음주하기 30분 전에 상기 제조된 고분자 수용성 키토산 혼합물 500mg을 복용시켰다. 그리고 25% 에탄올을 함유하는 소주 360ml 한 병(에탄올 함량 90g)과 소량의 정해진 양의 마른 안주를 섭취하도록 하였다. 술은 1시간 이내에 다 마시도록 하였다(실험군). 동일한 실험 대상자에게 1주일 후 같은 시간에 빈 캡슐을 복용시킨 후 상기와 같이 실험하였다(대조군). 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산 섭취 시간을 기준으로 0시간, 2시간, 3시간 후에 혈액을 채취하였다.In this experiment, 20 male and female students (5 male students in their 20s, 5 female students in their 20s, 5 male students in their 30s, and 5 female students in their 30s) were drinking alcohol with an average amount of alcohol or more. Persons). These were both physically and mentally healthy college students. Before entering the trial, subjects for clinical trials were absent for one week. Subjects of clinical trials started drinking after eating the same type of light meal two hours before drinking to ensure the same food intake. This experiment was conducted with a 2-phase cross-over design to eliminate individual differences. That is, all subjects once ingested the polymer water-soluble chitosan according to the present invention, and then took a placebo and drank. There was a 7 day interval between two experiments. Clinical trials were performed twice. In the first experiment, 500 mg of the polymer-soluble chitosan mixture prepared above was taken 30 minutes before drinking. A bottle of 360 ml of soju (90 g of ethanol) containing 25% ethanol and a small amount of dry snacks were taken. Drinking was done within 1 hour (experimental group). The same subjects were given the empty capsule at the same time after one week and then experimented as above (control). Blood was collected after 0 hours, 2 hours, and 3 hours based on the polymer water-soluble chitosan ingestion time according to the present invention.
상기 채취된 혈액을 혈중 알코올 농도, 혈중 GOT의 농도, 혈중 GPT의 농도에 대해 분석하였다.The collected blood was analyzed for blood alcohol concentration, blood GOT concentration, and blood GPT concentration.
먼저 혈중 알코올 농도를 측정하였다. EDTA로 처리된 전혈에 함유되어 있는 알코올 함량을 Sigma사로부터 구입한 kit #332-UV를 이용하여 측정하였다. 전혈 0.2ml에 1.8ml의 트리클로로아세트산을 첨가하여 서서히 혼합한 후 교반하고, 2000rpm에서 5분동안 원심분리한 후 상층액을 분리한다. 10㎕의 상층액과 3ml의 NAD-ADH 용액을 혼합한 후 실온에서 10분간 방치한 후 색의 변화를 340nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 혈액의 알코올 농도는 표준 용액을 이용하여 계산하였다. 그 결과는 하기 표10에 나타내었다.First, blood alcohol concentration was measured. The alcohol content in the whole blood treated with EDTA was measured using kit # 332-UV purchased from Sigma. 1.8 ml of trichloroacetic acid is added to 0.2 ml of whole blood, and the mixture is slowly mixed and stirred. After centrifugation at 2000 rpm for 5 minutes, the supernatant is separated. After mixing 10 µl of the supernatant and 3 ml of the NAD-ADH solution, the mixture was left at room temperature for 10 minutes and the change of color was measured at 340 nm. At this time, the alcohol concentration of blood was calculated using a standard solution. The results are shown in Table 10 below.
상기 표10에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산을 섭취하지 않은 대조군은 고분자 수용성 키토산을 섭취한 실험군에 비해 2시간 후에는 혈중 알코올 농도가 약 11%, 3시간 후에는 약 9%가 감소되는 것을 확인할 수 있었다.As shown in Table 10, the control group not ingesting the polymer water-soluble chitosan according to the present invention had a blood alcohol concentration of about 11% after 2 hours and about 9% after 3 hours compared to the experimental group in which the polymer water-soluble chitosan was ingested. It was confirmed that the decrease.
또한 혈중 GOT 농도 및 혈중 GPT 농도의 변화를 측정하였다. 알코올의 섭취가 잦은 사람은 간세포의 파괴가 증가하고 이로 인해 혈중 GOT 농도 및 GPT 농도가 증가하는 것으로 알려져 있다. 혈중 GOT 농도 및 혈중 GPT 농도의 변화를 측정한 결과는 하기 표11 및 표12에 나타내었다.In addition, changes in blood GOT and blood GPT levels were measured. It is known that people who frequently consume alcohol increase the destruction of hepatocytes, thereby increasing blood GOT and GPT levels. The results of measuring changes in blood GOT concentration and blood GPT concentration are shown in Tables 11 and 12 below.
상기 표11 및 표12에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 고분자 수용성 키토산을 섭취한 그룹인 실험군이 그렇지 않은 대조군에 비해 GOT 및 GPT 증가량이 낮은 것을 알 수 있었다.As shown in Table 11 and Table 12, it was found that the experimental group, the group ingesting the polymer water-soluble chitosan according to the present invention, had a lower GOT and GPT increase compared to the control group.
본 발명에 의한 간세포 손상억제방법, 간암세포 처리방법, 간암세포 처리용 식품 조성물 및 간암 치료용 키트를 이용하면, 정상 세포에는 영향을 미치지 않으면서 간암세포만을 선택적으로 사멸시킴으로써 간암을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있다. 또한 알코올에 의한 간의 손상을 감소시킴으로써 궁극적으로 암으로 발전되는 것을 예방할 수 있다. 뿐만 아니라, 알코올에 의한 숙취를 해소함으로써 숙취로 인한 두통, 불쾌감 등을 예방하며, 이로써 간의 손상을 예방할 수 있다.By using the method for inhibiting liver cell damage, the method for treating liver cancer cells, the food composition for treating liver cancer cells, and the kit for treating liver cancer, the present invention can effectively prevent and treat liver cancer by selectively killing only liver cancer cells without affecting normal cells. Can be. In addition, by reducing the damage of the liver caused by alcohol can prevent the development of cancer ultimately. In addition, by eliminating the hangover caused by alcohol to prevent headaches, discomfort, etc. due to hangover, thereby preventing liver damage.
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