KR20020069627A - Phosphorothioate oligonucleotides containing modified nucleotides with six-membered azasugars and use for aids therapy thereof - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: Provided are phosphorothioate oligonucleotides containing modified nucleotides with six-membered azasugars and their use for AIDS therapy. The phosphorothioate oligonucleotides block HIV attachment, show broad spectrum of anti HIV activity to various HIV mutants and have low toxicity. CONSTITUTION: The phosphorothioate oligonucleotide is represented by the formula(1) in which five-membered ribose is substituted with six-membered azasugar. In the formula, n is an integer of 0-30; B is a natural nucleotide base or a modified nucleotide base with or without a protection group; X is hydrogen, a hydroxyl protection group, a conjugate group or an oligonucleotide; and Y is hydrogen, phosphate, activated phosphate, activated phosphite or a solid support, a conjugate group, an oligonucleotide. The pharmaceutical composition for the AIDS therapy contains the above phosphorothioate oligonucleotide as an active ingredient.

Description

육환의 아자슈거를 가진 뉴클레오타이드 유도체를 포함한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 에이즈 치료제로서의 새로운 용도{Phosphorothioate oligonucleotides containing modified nucleotides with six-membered azasugars and use for AIDS therapy thereof}Phosphorothioate oligonucleotides containing modified nucleotides with six-membered azasugars and use for AIDS therapy, including phosphothioate oligonucleotides, including nucleotide derivatives with hexasaccharides, and their use as AIDS therapy

본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 에이즈 치료제로 사용하는 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 자연형의 뉴클레오타이드의 당인 오환의 리보오스(ribose)를 육환의 아자슈거(azasugar)로 치환한 하기화학식 1의 구조를 갖는 뉴클레오타이드 유도체를 포함하고 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합으로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 에이즈 치료제로 사용하는 새로운 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the use of an antisense oligonucleotide as an AIDS treatment, and more particularly, to a structure of Formula 1 in which ribose of cyclic ring, which is a sugar of natural nucleotide, is replaced with azasugar of hexacyclic. It relates to a novel use of antisense oligonucleotides comprising nucleotide derivatives having and consisting of phosphorothioate linkages for the treatment of AIDS.

<화학식 1><Formula 1>

상기화학식 1에서In Chemical Formula 1

n은 0∼30이며,n is 0 to 30,

1) B는 보호기를 갖거나 갖지 않은 자연 뉴클레오베이스 또는 변형된 뉴클레오베이스이고,1) B is a natural nucleobase or modified nucleobase with or without protecting groups,

2) X는 수소, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트기, 또은 올리고뉴클레오타이드이며,2) X is hydrogen, a hydroxyl protecting group, a conjugate group, or an oligonucleotide,

3) Y는 수소, 포스페이트, 활성화된 포스페이트, 활성화된 포스파이트, 또는 고체지지물, 컨쥬게이트기, 올리고뉴클레오타이드이다.3) Y is hydrogen, phosphate, activated phosphate, activated phosphite, or solid support, conjugate group, oligonucleotide.

에이즈는 1982년 미국 로스안젤레스에서 후천성 면역결핍증(acquired immunodeficiency syndrom, AIDS) 환자가 최초로 발견된 이래 1999년 12월말까지 세계보건기구에 보고된 HIV 감염자 수는 3,430만명(Global summary of the HIV/AIDS epidemic, end 1999)에 달하는 것으로 추산하고 있다. 국내에서도 1985년에 미국인 에이즈 환자가 발견된 이래 꾸준한 증가를 보여 2000년 6월말 현재 HIV 감염자 수는 1,173명(에이즈 환자 186명 포함, 국립보건원 감염발생정보지 2000년 7월호)으로 치료제 개발 등의 대책이 심각하게 대두되고 있다. 급속한 HIV 감염자 및 에이즈 환자의 증가에 따라 미국, 프랑스, 캐나다, 일본 등 세계 여러나라에서 에이즈 치료제 개발에 박차를 가하여 왔으며, 지금까지 알려진 항 HIV 물질로는 미국 FDA의 허가를 얻은 2,3-아지도티미딘(2,3-azidothymidine, AZT), 디데옥시이노신(dideoxyinosine,ddI), 디데옥시시토신(dideoxycytidine, ddC) 등 몇 종 밖에 없다. 하지만, 이들도 심한 부작용과 더불어 완전한 치료 효과를 기대하기는 매우 어려운 실정으로 새로운 약제의 개발이 매우 중요한 과제로 인식되어 왔다.Since AIDS was first discovered in Los Angeles in 1982, AIDS has reported 34.3 million HIV infections reported to the World Health Organization by the end of December 1999 (Global summary of the HIV / AIDS). epidemic, end 1999). Since the discovery of American AIDS patients in Korea in 1985, the number has been steadily increasing. As of the end of June 2000, the number of HIV infected persons was 1,173 (including 186 AIDS patients, National Institutes of Health and Prevention Information Bulletin July 2000). This is seriously on the rise. In response to the rapid increase in HIV and AIDS patients, the United States, France, Canada, Japan, and other countries around the world have accelerated the development of AIDS treatments. There are only a few species, such as dozitimidine (2,3-azidothymidine (AZT), dideoxyinosine (ddI), and dideoxycytidine (ddC). However, it is also very difficult to expect a complete therapeutic effect with severe side effects, so the development of new drugs has been recognized as a very important task.

HIV는 유전 정보를 RNA 형태로 간직하는 레트로바이러스(retrovirus)의 일종이다. 상기 바이러스의 구조는, 가장 내부에 유전정보인 RNA와 이 RNA로부터 거꾸로 DNA를 만들어 낼 수 있는 역전사효소(reverse transcriptase)가 존재하고, 상기 RNA와 역전사효소는 캡시드 단백질(capsid protein)에 의해 둘러싸여 있으며, 그 바깥쪽에는 지질막이 보호막을 형성하고 있다. 상기 지질 막에는 gp120과 gp41로 불리우는 당단백질(glycoprotein)이 존재하는데, 이 gp120이 바이러스가 T-세포를인식하여 침투하는데 결정적 역할을 하는 것으로 알려져 있다.HIV is a type of retrovirus that retains genetic information in the form of RNA. In the structure of the virus, there is a genetic information RNA and reverse transcriptase that can generate DNA from the RNA in reverse, the RNA and reverse transcriptase is surrounded by a capsid protein (capsid protein) On the outside, a lipid film forms a protective film. Glycoproteins, called gp120 and gp41, are present in the lipid membrane, which is known to play a critical role in the infiltration of T-cells by viruses.

HIV는 여러 바이러스 중 가장 복잡한 형태의 복제 메카니즘을 갖고 있기 때문에 여러 형태의 치료제가 개발되었다. 현재까지 가장 잘 알려진 치료제는 역전사효소 억제제(reverse transcriptase inhibitor)이다. 역전사효소는 RNA로부터 DNA를 복제하는 효소로서, 이러한 특이성 때문에 RNA 바이러스, 즉 레트로바이러스에만 존재하는 효소이다. 이와 같이 레트로바이러스에만 존재한다는 특징 때문에 이들 역전사효소를 억제하는 화합물이 부작용을 최소화시키면서 HIV를 무력화시킬 수 있을 것으로 기대되었으며, 이에 따라 많은 역전사효소 억제제가 개발되었다. 이러한 역전사효소 억제제로서 보로-웰컴사의 아지도티미딘과 브리스톨-마이어스 스큅사의 2',3'-디데옥시이노신, 그리고 호프만 라 로슈사의 2',3'-디데옥시시토신 및 글락소사의 D4T 등이 개발되어 임상에 적용되고 있다. 그러나 현재 이용되고 있는 이들 화합물들은 대부분 세포의 감염만 억제할 뿐 이미 감염된 세포내에서의 바이러스 복제는 억제하지 못하기 때문에 질병을 완전히 치료하기보다는 생명을 연장하는 정도의 효과만 나타낼 뿐이며, 그 외에도 혈소판 수의 감소, 골수 혈구 감소 등의 부작용을 야기 시키고, 이들 화합물에 내성이 생긴 바이러스도 많이 발견되는 등 그 문제점이 지적되고 있다.Because HIV has the most complex form of replication among many viruses, several forms of treatment have been developed. The best known therapeutic agent to date is the reverse transcriptase inhibitor. Reverse transcriptase is an enzyme that replicates DNA from RNA. Because of this specificity, it is an enzyme that exists only in RNA viruses, ie retroviruses. Because of the unique presence in retroviruses, it was expected that compounds that inhibit these reverse transcriptases could neutralize HIV while minimizing side effects. Accordingly, many reverse transcriptase inhibitors have been developed. As such reverse transcriptase inhibitors, azidothymidines from Boro-Welcome and 2 ', 3'-dideoxyinosine from Bristol-Myers Squibb, and 2', 3'-dideoxycytosine from Hoffman La Roche and D4T from Glaxo are developed. It is applied to clinical. However, most of these compounds are currently used only to inhibit cell infections and not to replicate virus in already infected cells, resulting in prolonged life rather than complete treatment of the disease. The problem has been pointed out, such as causing a number of side effects, such as a decrease in the number of bone marrow, a decrease in the number of bone marrow cells.

이러한 문제점을 극복하기 위하여 개발된 중요한 또 다른 치료제가 HIV 프로테아제 억제제(protease inhibitor)이다. HIV는 캡시드 단백질과 필요한 효소를 만들 때 이들을 mRNA로부터 각각 합성해 내는 것이 아니고, 일단 캡시드 단백질과효소 등이 모두 함께 결합되어 있는 긴 형태의 프로단백질(proprotein)인 gag-단백질(p55) 또는 gag-pol 단백질(p165)을 먼저 만든 후 상기 프로단백질 내에 존재하는 프로테아제에 의하여 캡시드 단백질과 역전사효소, 인테그라제(integrase) 등의 바이러스 형성에 필요한 효소들로 분해하게 된다. 이러한 분해 과정을 담당하는 프로테아제를 억제하면 바이러스의 복제가 중단되게 되며, 프로테아제 억제제는 이러한 원리에 기초한 것이다. HIV 프로테아제는 99개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 두개의 똑같은 단위체가 이량체로 존재하고 있고, 각 단위체의 분자량은 10793 달톤이다. HIV 프로테아제는 반응 부위에 아스파르테이트-트레오닌-글리신(aspartate-threonine-glycine)의 배열을 갖는 전형적인 아스파르틱 프로테아제이다.Another important therapeutic developed to overcome this problem is the HIV protease inhibitor. HIV does not synthesize capsid proteins and necessary enzymes from mRNAs, but instead of gag-protein (p55) or gag-, a long form of proproteins in which capsid proteins and enzymes are all bound together. The pol protein (p165) is first produced and then degraded into enzymes necessary for virus formation such as capsid protein, reverse transcriptase and integrase by proteases present in the proprotein. Inhibiting the protease responsible for this degradation process stops the replication of the virus, and protease inhibitors are based on this principle. The HIV protease consists of 99 amino acids, two identical units of which are present as dimers, each of which has a molecular weight of 10793 Daltons. HIV proteases are typical aspartic proteases with an array of aspartate-threonine-glycine at the reaction site.

HIV 프로테아제 억제제의 개발은 다른 종류의 아스파르틱 프로테아제(특히 레닌)의 억제제 개발 동향을 따르고 있는데, 그 기본적인 접근 방식은 효소의 전이상태(transition state)에서와 유사한 화합물(transition state analogue,TSA)을 개발하여 효소와의 친화도를 높임으로써 효소에 대한 결합력을 높이는데 있다. 이러한 방식으로 개발한 HIV 프로테아제 억제제는 여러 문헌에 개시되어 있다. (Robert, et al.,Science,248, 358, 1990; 유럽 특허출원 공고 제0337714호; 제0346847호; 제356223호; 제352000호; 제357332호; 제362002호; 및 제361341호; Bone et al.,JACS,113, 9382, 1991).The development of HIV protease inhibitors follows the trend of developing inhibitors of other types of aspartic proteases (particularly Lenin), and the basic approach is to use compounds similar to the transition state analogues (TSAs) in the enzyme's transition state. By improving the affinity with the enzyme by developing it to increase the binding capacity to the enzyme. HIV protease inhibitors developed in this manner have been disclosed in several documents. (Robert, et al., Science, 248, 358, 1990; European Patent Application Publications 0337714; 0346847; 356223; 352000; 357332; 362002; and 361341; Bone et al., JACS, 113, 9382, 1991).

또 다른 에이즈 치료방법으로 RNA의 뉴클레오타이드 서열과 특정의 교잡을할 수 있는 안티센스(antisense) 화합물을 이용하는 방법이 각광을 받고 있다. 생체내 단백질의 합성은 그들의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자의 발현으로 이루어진다. 즉, 이중나선 구조를 가진 DNA중 한 가닥만이 mRNA로 전사(transcription)되고 이 mRNA가 단백질로 번역(translation)되는 것이다. 이러한 사실을 기초로 하여 단백질을 목표로 하는 일반적인 약물과는 달리 핵산을 목표로 하는 약물이 개발되었는데, mRNA의 서열과 상보적인 염기서열을 가진 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides)를 포함하는 약물이 그것이다. 올리고뉴클레오타이드는 mRNA의 서열에 상보적으로 결합하여 mRNA가 단백질로 번역되는 것을 억제함으로써, 질병을 일으키는 독성 단백질의 생산을 차단 또는 감소시키는 작용기전을 갖는다. 이 때, 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 서열은 유전정보서열(센스서열)과 반대(안티)를 이루므로, 이를 포함하는 약물을 안티센스 약물이라 하며 이러한 기술을 안티센스 기술이라 한다.Another AIDS treatment is the use of antisense compounds capable of specific hybridization with the nucleotide sequence of RNA. Synthesis of proteins in vivo consists of the expression of genes encoding their amino acid sequences. In other words, only one strand of DNA with a double helix structure is transcribed into mRNA and the mRNA is translated into protein. On the basis of this fact, unlike general drugs targeting proteins, drugs targeting nucleic acids have been developed, which include oligonucleotides having base sequences complementary to mRNA sequences. Oligonucleotides have a mechanism of action that complementarily binds to the sequence of mRNA and inhibits the translation of the mRNA into proteins, thereby blocking or reducing the production of toxic proteins that cause disease. At this time, since the sequence of the oligonucleotide used is opposite to the genetic information sequence (sense sequence) (anti), the drug containing the same is called an antisense drug and this technique is called an antisense technology.

1970년 후반에 스테펜슨과 자메닉은 합성 DNA 조각을 사용하여 바이러스의 단백질 생성을 저해할 수 있음을 밝혔으며(Stephenson et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95, 285,1977; Zamecnik et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 280, 1977), 또한 1980년대에는 생체시스템 자체 내에서도 안티센스 RNA가 생성되어 유전자의 발현을 조절한다는 사실이 알려졌다(Simons et al.,Cell, 34, 683, 1983; Mizuno et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1984, 1966).In late 1970, Stephenson and Jamenic used synthetic DNA fragments to inhibit viral protein production (Stephenson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 95, 285,1977). Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 95, 280, 1977), and also in the 1980s it was known that antisense RNA was produced in the biosystem itself to regulate gene expression (Simons et al. , Cell , 34, 683, 1983; Mizuno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81, 1984, 1966).

이와 같이 자연형의 올리고디옥시뉴클레오타이드(oligodeoxynucleotide)는 그 자체로도 안티센스 효과를 보이나, 이들 자연형은 생체내에서 핵산분해효소인뉴클리아제에 의해 쉽게 분해되므로, 생체에 투여하였을 때 신속히 분해되어 충분한 약리효과를 기대할 수 없다는 문제점이 있다. 이에 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 구조를 변화시켜 안정성이 증가된 안티센스 약물을 만들기 위한 연구가 활발히 진행되어 왔다.As such, oligodeoxynucleotides of natural form show antisense effects by themselves, but these natural forms are easily degraded by nuclease, a nuclease in vivo, and are therefore rapidly degraded when administered to a living body. There is a problem that a sufficient pharmacological effect cannot be expected. Accordingly, researches for making antisense drugs having increased stability by changing the structure of antisense oligonucleotides have been actively conducted.

이러한 연구의 일환으로서 개발된 제 1세대 안티센스 약물은 올리고뉴클레오타이드의 포스페이트(phosphate) 연결구조를 바꾼 올리고뉴클레오타이드로, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 메틸포스페이트(methylphosphate) 등이 알려져 있다. 포스포로티오에이트는 포스페이트의 산소 한 개가 황으로 치환된 올리고뉴클레오타이드로서, mRNA에 대한 결합력은 자연형 DNA보다 떨어지나 뉴클레아제에 대하여 강한 내성을 보이며, 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 실험에서 약리활성을 가짐이 확인되었다. 이러한 제 1세대 안티센스 약물 중, 현재 그 일부는 항바이러스제, 항암제로서 임상시험 중에 있으며, 항바이러스제로서 시판중인 것도 있다(Bennett et al.,Biochem. Pharmacol., 55, 9-19, 1998). 그러나 이들은 독성, 면역반응 유발 등의 문제점을 가지고 있어서(Stein et al.,Current Opinion in Oncology, 6, 587-594, 1994; Krieg et al,Nature, 374, 549, 1995; O'Brien et al.,Leukemia, 8, 2156, 1994) 이러한 단점을 보완할 수 있는 안티센스 약물의 개발을 위한 새로운 전략들이 대두되었는데, 올리고뉴클레오타이드의 포스페이트 골격을 아마이드나 에테르 등으로 바꾸는 방법, 뉴클레오타이드의 염기의 구조를 변화시키는 방법 및 리보오스 당의 구조를 변화시키는 방법에 관한 연구 등이 이에해당된다(De Mesmaeker et al.,Acc. Chem. Res., 28, 366-374, 1995).The first generation antisense drugs developed as part of this research are oligonucleotides that change the phosphate linkage structure of oligonucleotides, and phosphorothioate, methylphosphate, and the like are known. Phosphorothioate is an oligonucleotide in which one oxygen of phosphate is substituted with sulfur. The binding ability to mRNA is lower than that of natural DNA, but it is strong in resistance to nucleases and is in vitro or in vivo. ) It was confirmed that the experiment has pharmacological activity. Some of these first generation antisense drugs are currently in clinical trials as antiviral and anticancer agents, and some are commercially available as antiviral agents (Bennett et al., Biochem. Pharmacol. , 55, 9-19, 1998). However, they have problems such as toxicity and induction of immune response (Stein et al., Current Opinion in Oncology , 6, 587-594, 1994; Krieg et al, Nature , 374, 549, 1995; O'Brien et al. , Leukemia , 8, 2156, 1994). New strategies for the development of antisense drugs that address these shortcomings have emerged, such as changing the phosphate backbone of oligonucleotides to amides or ethers, and altering the structure of nucleotide bases. This includes research on methods and methods for changing the structure of ribose sugars (De Mesmaeker et al., Acc. Chem. Res. , 28, 366-374, 1995).

포스포로씨오에이트, 메틸포스페이트 등 포스페이트의 연결 부분을 바꾼 올리고뉴클레오타이드가 제 1세대 안티센스 약물로 불리는 반면, 제 2세대 안티센스 약물은 올리고뉴클레오타이드의 당의 구조에 변화를 준 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 이러한 당의 구조에 변화를 준 올리고뉴클레오타이드에는 2' 위치에 메톡시, 메톡시에톡시(Martin et al.,Helv. Chim. Acta., 186, 584, 1995) 또는 아미노알콕시기(Griffey et al.,J. Med. Chem., 39, 5100-5109, 1996)가 도입된 올리고뉴클레오타이드, 헥소오스(hexose) 함유 올리고뉴클레오타이드(Herdewijn et al., In Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS Symposium Series 580; Sanghvi Y.S., Cook P.D., Eds., American Chemical Society, Washington, DC, pp 80-99, 1994), 펜토오스(pentose) 함유 올리고뉴클레오타이드(Moser et al., Strategies and Chemical Approaches toward Oligonucleotide Therapeutics. In Perspectives in Medicinal Chemistry; Testa, B. et al., Eds.; Verlag Helvetica Chimica Acta: Basel, pp 275-97, 1993), 4'-아미노리보오스(4'-aminoribose) 함유 올리고뉴클레오타이드(Scharer et al.,J. Am. Chem. Soc., 117, 6623-6624, 1995), 4'-치오리보오스(4'-thioribose) 함유 올리고뉴클레오타이드(Bellonet al., 4-Thio RNA: a novel class of sugar-modified B-RNA. In Carbohydrate Modifications in Antisense Research; ACS Symposium Series 580; Sanghvi, Y. S., Cook, P. D., Eds.; American Chemical Society:Washington, DC, 1994; pp 68-79) 및 이들의 유도체 등이 있다.Oligonucleotides that replace phosphate linkages, such as phosphorothioate and methylphosphate, are called first generation antisense drugs, while second generation antisense drugs refer to oligonucleotides that have altered the sugar structure of the oligonucleotides. Oligonucleotides that change the structure of these sugars include methoxy, methoxyethoxy (Martin et al., Helv. Chim. Acta. , 186, 584, 1995) or aminoalkoxy groups (Griffey et al., J. Med. Chem ., 39, 5100-5109, 1996), introduced oligonucleotides, hexose containing oligonucleotides (Herdewijn et al., In Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS Symposium Series 580; Sanghvi YS, Cook PD, Eds., American Chemical Society, Washington, DC, pp 80-99, 1994), pentose containing oligonucleotides (Moser et al., Strategies and Chemical Approaches toward Oligonucleotide Therapeutics.In Perspectives in Medicinal Chemistry; Testa, B. et al., Eds .; Verlag Helvetica Chimica Acta: Basel, pp 275-97, 1993), 4'-aminoribose containing oligonucleotides (Scharer et al., J. Am. Chem. Soc., 117, 6623-6624 , 1995), 4'- Fuck ribose (4'-thioribose) oligonucleotide containing Nucleoside Tide (Bellon et al, 4-Thio RNA:.. A novel class of sugar-modified B-RNA In Carbohydrate Modifications in Antisense Research; ACS Symposium Series 580; Sanghvi, YS, Cook, PD, Eds .; American Chemical Society : Washington, DC, 1994; pp 68-79) and derivatives thereof.

한편, 상온(혹은 생체온도) 에서 2본쇄(duplex)로 존재하는 상보서열의 mRNA와 DNA는 온도 상승에 따라 각기 1본쇄(single strand)로 떨어지며, 온도변화에 따른 UV 흡광도 측정으로 확인할 수 있다. 1본쇄의 UV 흡광도는 2본쇄의 흡광도보다 높아서 온도의 상승에 의해 1본쇄의 양이 증가하면 흡광도도 함께 증가하는데, 이 변화곡선은 S자 곡선(sigmoid)을 이룬다. 이 S자 곡선에서 중간정도의 흡광도를 나타내는 때의 온도를 Tm(melting temperature)이라고 한다. mRNA에 대한 높은 Tm은 올리고뉴클레오타이드의 RNA에 대한 높은 친화력(결합력)을 의미하며, 이는 안티센스 분자로서 매우 중요한 요소이다. 이에 여러 연구팀에 의해 2' 위치에 다양한 치환기가 도입된 올리고뉴클레오타이드의 RNA에 대한 결합력의 성향이 측정되었다(Breslauer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 3740, 1986; Freier et al.,Nucleic Acids Res., 25, 4429-4443, 1997).On the other hand, mRNA and DNA of the complementary sequence present in the double strand (duplex) at room temperature (or biological temperature) falls into one strand (single strand), respectively, as the temperature rises, and can be confirmed by measuring the UV absorbance according to the temperature change. The UV absorbance of one strand is higher than the absorbance of two strands, so when the amount of one strand increases due to the increase in temperature, the absorbance also increases, and this change curve forms a sigmoidal curve (sigmoid). The temperature at which the absorbance is moderate in the S-shaped curve is called Tm (melting temperature). High Tm for mRNA means high affinity (binding capacity) of oligonucleotides to RNA, which is a very important factor as antisense molecule. Therefore, various research teams have determined the propensity of binding of the oligonucleotides to the RNA with various substituents in the 2 'position (Breslauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 83, 3740, 1986; Freier et. al., Nucleic Acids Res. , 25, 4429-4443, 1997).

제 2세대 안티센스 약물 중 당의 2'-위치에 메톡시기 등이 치환된 염기를 지닌 올리고뉴클레오타이드는 mRNA에 대한 높은 Tm을 나타내는데, 이는 2' 위치에 도입된 메톡시, 불소와 같은 전기음성기(electronegative group)가 RNA와의 친화도를 높이기 때문이다(Kawasaki et al.,J. Med. Chem., 36, 831-841, 1993). 또한, 2' 위치에 메톡시와 같은 알콕시기 등이 도입된 올리고뉴클레오타이드는 자연형의 DNA에 비하여 뉴클레아제에 대한 내성이 증가한다는 장점이 있다. 이 중 2'-메톡시 치환체는 포스포로치오에이트와 키메릭 올리고뉴클레오타이드를 구성하여 제 1세대안티센스 올리고뉴클레오타이드에 비해 독성이 감소되었으며(Lesnik et al.,Biochemistry, 32, 7832, 1993; Milligan et al.,J. Med. Chem., 36, 1923, 1993), 1997년에 이들에 대한 임상시험이 시작되었다(Agrawal et al.,Curr. Opin. Chem. Biol., 2, 519, 1998).Oligonucleotides having a base substituted with a methoxy group at the 2'-position of a sugar in the second generation of antisense drugs exhibit high Tm for mRNA, which is an electronegative such as methoxy and fluorine introduced at the 2 'position. group) enhances affinity with RNA (Kawasaki et al., J. Med. Chem. , 36, 831-841, 1993). In addition, oligonucleotides having an alkoxy group such as methoxy introduced at the 2 ′ position have an advantage of increased resistance to nucleases compared to natural DNA. Among these, 2'-methoxy substituents constituted phosphorothioate and chimeric oligonucleotides, reducing toxicity compared to the first generation antisense oligonucleotides (Lesnik et al., Biochemistry , 32, 7832, 1993; Milligan et al. , J. Med. Chem ., 36, 1923, 1993), and clinical trials began in 1997 (Agrawal et al., Curr. Opin. Chem. Biol. , 2, 519, 1998).

본 발명자들은 mRNA에 대한 결합력이 높고 뉴클리아제에 대한 내성이 높아 보다 안정적인 새로운 안티센스 약물을 개발하고자 연구한 결과, 오환의 리보오스 대신 육환의 아자슈거(six-membered azasugar)를 당의 기본체로 이용하여 일정한 치환기를 붙인 올리고뉴클레오타이드가 높은 결합력과 안정성을 보이는 것을 확인하였고, 이를 특허 출원한 바 있다(대한민국 특허 출원번호 제99-26947호).The inventors of the present invention have developed a new antisense drug that has high binding capacity to mRNA and high resistance to nucleases. As a result, the present inventors have found that the six-membered azasugar instead of cyclic ribose is used as a sugar base. It was confirmed that the oligonucleotide to which the substituent is attached shows a high binding force and stability, and has applied for a patent (Korean Patent Application No. 99-26947).

이에, 본 발명자들은 육환의 아자슈거를 포함하고 포스포로티오에이트 결합으로 이루어진 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 기존의 안티센스 개념과는 달리 HIV 유전자 서열과 무관하게 HIV 증식에 대해 높은 저해효과를 나타낼 뿐 아니라 세포독성이 낮아 에이즈 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have found that the oligonucleotide of the present invention including hexasaccharide and phosphothioate bonds exhibits a high inhibitory effect on HIV proliferation, regardless of the HIV gene sequence, unlike conventional antisense concepts. The present invention was completed by revealing that the toxicity is low and can be usefully used as an AIDS treatment.

본 발명의 목적은 뉴클레아제에 대한 내성이 높아 장기간 안정적이고 세포독성이 낮으며 세포 밖에서 HIV 감염을 차단하여 HIV 증식을 억제하는, 자연형의 뉴클레오타이드의 당인 오환의 리보오스(ribose)를 육환의 아자슈거(azasugar)로 치환한 뉴클레오타이드 유도체를 포함하는포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드를 에이즈 치료제로 사용하는 새로운 용도를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a long-term stable, low cytotoxicity and to inhibit HIV proliferation by inhibiting HIV proliferation by inhibiting HIV infection outside the cell, which is a sugar of natural nucleotides. It is to provide a new use of phosphothioate oligonucleotides comprising nucleotide derivatives substituted with azasugar as a therapeutic for AIDS.

도 1은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 HIV-1 복제에 대한 저해활성을 보여주는 현미경 사진으로 바이러스 감염 후 7일째에 관찰되는 세포병변 효과를 나타낸 것이고, Figure 1 is a micrograph showing the inhibitory activity of the oligonucleotide of the present invention against HIV-1 replication, showing the cytopathic effect observed 7 days after virus infection,

A ; 시료를 처리하지 않은 대조군,A; Untreated control,

B ;서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드,B; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 ,

C ;서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드,C; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 ,

D ;서열번호 6의 올리고뉴클레오타이드,D; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 6 ,

E ;서열번호 11의 올리고뉴클레오타이드,E; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 11 ,

F ;서열번호 13의 올리고뉴클레오타이드,F; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 13 ,

G ;서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드,G; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 17 ,

H ;서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드H; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 22

도 2는 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양할 때, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 HIV-1 증식에 대한 농도 의존적인 저해효과를 나타낸 결과이고, 2 is a result showing a concentration-dependent inhibitory effect on HIV-1 proliferation of the oligonucleotide of the present invention when cultured in a medium without serum,

A ;서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드,A; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 ,

B ;서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드,B; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 ,

C ;서열번호 11의 올리고뉴클레오타이드,C; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 11 ,

D ;서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드,D; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 17 ,

E ;서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드,E; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 22 ,

F ;서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드,F; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 29 ,

○ ; 0.02 μM, ● ; 0.04 μM, □ ; 0.06 μM,○; 0.02 μM, ●; 0.04 μM, □; 0.06 μM,

■ ; 0.08 μM, ◇ ; 0.1 μM■; 0.08 μM, ◇; 0.1 μM

도 3은 혈청이 첨가되지 않은 Opti-MEM 배지에서 본 발명의서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드 및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 효과를 HIV-1의 역전사효소 활성을 측정하여 나타낸 것이고, Figure 3 shows the antiviral effect of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 and oligonucleotide of SEQ ID NO: 22 by measuring the reverse transcriptase activity of HIV-1 in Opti-MEM medium without serum,

○ ; 대조군,○; Control,

● ;서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드,●; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 ,

■ ;서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드■; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 22

도 4는 10%의 소태아혈청이 포함된 RPMI1640 배지에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드들의 항 바이러스 효과를 HIV-1 역전사효소 활성을 측정하여 나타낸 것이고, Figure 4 shows the antiviral effects of oligonucleotides of the present invention in RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum by measuring HIV-1 reverse transcriptase activity,

○ ; 대조군,○; Control,

□ ;서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드,□; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 ,

● ;서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드,●; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 ,

◇ ;서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드,◇; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 17 ,

△ ;서열번호 20의 올리고뉴클레오타이드,△; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 20 ,

■ ;서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드■; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 22

도 5는 세포를 배양한 상청액 배지에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 단기간(시간별) 및 장기간(날짜별) 안정성을 보여주는 사진이고, 5 is a photograph showing the short-term (hourly) and long-term (date) stability of the oligonucleotide of the present invention in the supernatant medium in which the cells are cultured.

A ;서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드,A; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 ,

B ;서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드,B; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 ,

C ;서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드,C; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 5 ,

D ;서열번호 13의 올리고뉴클레오타이드D; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 13

도 6은 10% 소태아혈청이 첨가된 신선한 RPMI1640 배지에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 장기간 안정성을 보여주는 사진이고, 6 is a photograph showing the long-term stability of the oligonucleotide of the present invention in fresh RPMI1640 medium to which 10% fetal bovine serum is added,

A ;서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드,A; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 ,

B ;서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드B; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 22

도 7은 본 발명의서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드를단순히 배지에 첨가할 경우와 이들을 강제로 형질감염시킨 경우에 세포내의 HIV-1 LTR 활성이 억제되는지 여부를 LTR-베타-갈락토시다제(beta-galactosidase) 유전자를 가진 Magi 세포를 이용하여 조사한 사진이고, FIG. 7 shows whether or not HIV-1 LTR activity in cells is inhibited when oligonucleotides of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 22 of the present invention are simply added to the medium, and when they are forcibly transfected. The photograph was investigated using Magi cells carrying the beta-galactosidase gene,

A ; Magi 세포에 2 ㎍의 pSV2-Tat를 형질감염시킨 후 0.25 μM의 올리고뉴클레오타이드를 단순히 배지에 첨가한 경우,A; When 2 μg of pSV2-Tat was transfected into Magi cells and 0.25 μM of oligonucleotide was simply added to the medium,

B ; Magi 세포에 2 ㎍의 pSV2-Tat와 2 ㎍의 올리고뉴클레오타이드를 동시에 형질감염시킨 경우B; Simultaneous transfection of Magi cells with 2 μg of pSV2-Tat and 2 μg of oligonucleotide

도 8은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 농도별로 형질감염시 세포내의 HIV-1 LTR 활성 저해효과를 나타낸 그래프이고, 8 is a graph showing the inhibitory effect of HIV-1 LTR activity in cells upon transfection of oligonucleotides of the present invention by concentration,

◇ ;서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드,◇; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 ,

■ ;서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드,■; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 ,

○ ;서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드,○; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 17 ,

□ ;서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드□; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 22

도 9는 본 발명의서열번호 2및서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드를 단순히 배지에 첨가한 경우 세포막을 통과하여 핵내에 위치한 LTR의 활성을 억제할 수 있는지 여부를 LTR에 의해 발현이 조절되는 CAT의 활성측정을 통해 확인한 결과를 보여주는 사진이고, Figure 9 shows the activity of CAT whose expression is regulated by LTR whether or not the oligonucleotides of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 of the present invention can be added to the medium to inhibit the activity of LTR located in the nucleus through the cell membrane The picture shows the result of the measurement.

A ; LTR-CAT이 도입되지 않은 대조군,A; Control without LTR-CAT,

B ; LTR-CAT 5 ㎍ 형질감염, 올리고뉴클레오타이드를 첨가하지 않은 대조군,B; LTR-CAT 5 μg transfection, controls without addition of oligonucleotides,

C ; LTR-CAT 5 ㎍ 형질감염,서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드 처리,C; LTR-CAT 5 μg transfection, oligonucleotide treatment of SEQ ID NO: 2 ,

D ; LTR-CAT 5 ㎍ 형질감염,서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드 처리D; 5 μg transfection of LTR-CAT, oligonucleotide treatment of SEQ ID NO: 4

도 10은 본 발명의 올리고뉴글레오타이드를 LTR-CAT 플라스미드 DNA와 동시에 세포내로 형질감염시 세포내에서 HIV-1 LTR에대한 유전자서열 특이적인(sequence-specific) 항 바이러스 활성을 나타낼 수 있는지 여부를 세포내 CAT 활성측정을 통해 조사한 결과를 보여주는 사진이고, FIG. 10 shows whether oligonucleotides of the present invention can exhibit sequence-specific antiviral activity against HIV-1 LTR in cells when transfected into cells simultaneously with LTR-CAT plasmid DNA. The photo shows the results of the investigation through the intracellular CAT activity measurement,

A ; LTR-CAT 5 ㎍ 도입, 올리고뉴클레오타이드를 첨가하지 않은 대조군,A; 5 μg LTR-CAT, control without addition of oligonucleotides,

B ; LTR-CAT 5 ㎍ 형질감염,서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드 처리,B; LTR-CAT 5 μg transfection, oligonucleotide treatment of SEQ ID NO: 2 ,

C ; LTR-CAT 5 ㎍ 형질감염,서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드 처리,C; 5 μg transfection of LTR-CAT, oligonucleotide treatment of SEQ ID NO: 4 ,

D ; LTR-CAT 5 ㎍ 형질감염,서열번호 9의 올리고뉴클레오타이드 처리,D; LTR-CAT 5 μg transfection, oligonucleotide treatment of SEQ ID NO: 9 ,

E ; LTR-CAT 5 ㎍ 형질감염,서열번호 11의 올리고뉴클레오타이드 처리,E; LTR-CAT 5 μg transfection, oligonucleotide treatment of SEQ ID NO: 11 ,

F ; LTR-CAT 5 ㎍ 형질감염,서열번호 12의 올리고뉴클레오타이드 처리,F; LTR-CAT 5 μg transfection, oligonucleotide treatment of SEQ ID NO: 12 ,

G ; LTR-CAT 5 ㎍ 형질감염,서열번호 13의 올리고뉴클레오타이드 처리G; 5 μg transfection of LTR-CAT, oligonucleotide treatment of SEQ ID NO: 13

도 11은 HIV-1에 감염되어 이미 다량의 신시티아(HIV-1 감염시 특이적으로 나타나는 거대세포)가 생성된 Jurkat 세포에 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 처리시 신시티아가 제거되고 세포가 회복되는 모습을 나타내는 사진이고, 11 shows that Cynthiatia is removed and cells are recovered when the oligonucleotides of the present invention are treated with Jurkat cells infected with HIV-1, which have already produced a large amount of Cynthiatia (giant cells that are specific to HIV-1 infection). It is a picture showing the state,

A ; 정상 Jurkat 세포,A; Normal Jurkat cells,

B ; HIV-1 감염 후 5일된 Jurkat 세포,B; Jurkat cells 5 days after HIV-1 infection,

C ; HIV-1 감염 후 7일된 Jurkat 세포,C; Jurkat cells 7 days after HIV-1 infection,

D ; C에서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드를 처리하고 36시간 후,D; 36 hours after treatment of C with the oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 ,

E ; C에서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드를 처리하고 36시간 후,E; 36 hours after treatment of C with oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 ,

F ; C에서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드를 처리하고 36시간 후,F; 36 hours after treatment of C with the oligonucleotide of SEQ ID NO: 17 ,

G ; C에서열번호 20의 올리고뉴클레오타이드를 처리하고 36시간 후,G; 36 hours after treating C with the oligonucleotide of SEQ ID NO: 20 ,

H ; C에서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드를 처리하고 36시간 후H; 36 hours after treatment of C with oligonucleotide of SEQ ID NO: 22

도 12는 SIV의 증식에 대한 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 저해 효과를 나타내는 결과이고, 12 is a result showing the inhibitory effect of the oligonucleotide of the present invention on the proliferation of SIV,

○ ; 대조군,○; Control,

□ ;서열번호 6의 올리고뉴클레오타이드,□; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 6 ,

■ ;서열번호 7의 올리고뉴클레오타이드,■; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 7 ,

◇ ;서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드,◇; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 ,

◆ ;서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드,◆; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 ,

△ ;서열번호 13의 올리고뉴클레오타이드,△; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 13 ,

● ;서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드●; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 22

도 13은 폴리오바이러스의 증식에 대한 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 저해 효과를 나타내는 결과이다. Figure 13 is a result showing the inhibitory effect of the oligonucleotide of the present invention on the proliferation of poliovirus.

■ ; Sabin,■; Sabin,

□ ;서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드,□; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 ,

● ;서열번호 8의 올리고뉴클레오타이드●; Oligonucleotide of SEQ ID NO: 8

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자연형의 뉴클레오타이드의 당인 오환의 리보오스를 육환의 아자슈거로 치환한 뉴클레오타이드 유도체를 포함하고 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합으로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an oligonucleotide comprising a nucleotide derivative in which cyclic ribose, a sugar of a natural nucleotide, is substituted with azasugar of hexacyclic, and is composed of phosphorothioate bonds.

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 에이즈 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for treating AIDS containing the oligonucleotide as an active ingredient.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 자연형의 뉴클레오타이드의 당인 오환의 리보오스를 육환의 아자슈거로 치환한 뉴클레오타이드 유도체를 포함하고 포스포로티오에이트 결합으로 이루어진화학식 1의 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.The present invention provides an oligonucleotide having a structure represented by formula (1) comprising a nucleotide derivative in which a cyclic ribose, which is a sugar of a natural nucleotide, is substituted with azasugar of a hexacyclic, and is composed of phosphorothioate bonds.

상기화학식 1에서In Chemical Formula 1

n은 0∼30이며,n is 0 to 30,

1) B는 보호기를 갖거나 갖지 않은 자연 뉴클레오베이스 또는 변형된 뉴클레오베이스이고,1) B is a natural nucleobase or modified nucleobase with or without protecting groups,

2) X는 수소, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트기, 또는 올리고뉴클레오타이드이며,2) X is hydrogen, a hydroxyl protecting group, a conjugate group, or an oligonucleotide,

3) Y는 수소, 포스페이트, 활성화된 포스페이트, 활성화된 포스파이트, 또는 고체지지물, 컨쥬게이트기, 올리고뉴클레오타이드이다.3) Y is hydrogen, phosphate, activated phosphate, activated phosphite, or solid support, conjugate group, oligonucleotide.

상기화학식 1에서 n은 위와 아래의 뉴클레오타이드를 포함하여 0∼30이며, 바람직하게는 6∼21이다. 본 발명의 모노머는 올리고뉴클레오타이드의 어떤 위치에도 존재할 수 있으며, 4개 이상의 변형된 염기가 올리고뉴클레오타이드에 존재하는 것이 에이즈 치료에 사용하는데 바람직하다. 바람직한 에이즈 치료용 올리고뉴클레오타이드에는서열번호 1내지서열번호 29로 기재되는 올리고뉴클레오타이드가 있으며, 더욱 바람직하게는서열번호 2,서열번호 3,서열번호 11,서열번호 17,서열번호 18,서열번호 19,서열번호 20,서열번호 21,서열번호 22,서열번호 23및서열번호 29로 기재되는 올리고뉴클레오타이드를 사용할 수 있다.In Formula 1 , n is 0 to 30, preferably 6 to 21, including nucleotides above and below. The monomers of the present invention may be present at any position of the oligonucleotide, with four or more modified bases present in the oligonucleotides being preferred for use in the treatment of AIDS. Preferred HIV therapeutic oligonucleotides include oligonucleotides as set forth in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 29 , more preferably SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: 18 , SEQ ID NO: 19 , Oligonucleotides set forth in SEQ ID NO: 20 , SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22 , SEQ ID NO: 23, and SEQ ID NO: 29 can be used.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 고체상 또는 액체상에서 제조될 수 있으나 고체상의 방법이 바람직하다. 고체상에서의 올리고뉴클레오타이드의 구체적인 합성 방법은 Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, Gait(ed.), IRL Press, Washington D. C.(1984), Caruthers and etal., U.S. Pat. No. 4,458,066 및 4,500,707 등에 기재되어 있다.The oligonucleotides of the present invention may be prepared in solid or liquid phase, but the solid phase method is preferred. Specific methods of synthesizing oligonucleotides in the solid phase are described in Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, Gait (ed.), IRL Press, Washington D. C. (1984), Caruthers and et al., U.S. Pat. No. 4,458,066 and 4,500,707 and the like.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 하기화학식 2의 뉴클레오타이드 모노머(대한민국 특허출원 제99-26947호)를 이용하여 합성기의 축합반응을 통해 제조되는데, 이때 뉴클레오타이드 당에 연결된 한 개의 1차 알콜기는 다이메톡시트리틸기로 치환되고, 다른 한 개의 2차 알콜기는 포스포아미다이트기로 치환되어야 하며, 또한 핵염기도 티민을 제외하고는 적절한 보호기로 보호되어야 한다.Oligonucleotide of the present invention is prepared through the condensation reaction of a synthesizer using a nucleotide monomer of the formula (2 ) (Korean Patent Application No. 99-26947), wherein one primary alcohol group linked to a nucleotide sugar dimethoxytrityl Groups, the other secondary alcohol group should be substituted with a phosphoramidite group, and the nucleobase should also be protected with an appropriate protecting group except thymine.

상기화학식 2에서In Chemical Formula 2

1) B는 보호기를 갖거나 갖지 않은 자연 뉴클레오베이스 또는 변형된 뉴클레오베이스이고,1) B is a natural nucleobase or modified nucleobase with or without protecting groups,

4) X는 수소 또는 하이드록실 보호기이며,4) X is hydrogen or a hydroxyl protecting group,

5) Y는 수소, 포스페이트, 활성화된 포스페이트, 활성화된 포스파이트(phosphite) 또는 고체지지물이다.5) Y is hydrogen, phosphate, activated phosphate, activated phosphite or solid support.

상기화학식 2의 뉴클레오타이드 모노머를 올리고뉴클레오타이드의 3'-위치에 도입할 경우 고체지지물에 이 유도체를 부착하여야 한다. 상업적으로 구매할 수 있는 아미노기를 가진 콘트롤드 포어 글래스(controlled pore glass, CPG)를 이용하여 모노머를 헤미석시네이트(hemisuccinate)로 만들어 메시틸렌-2-설포닐 클로라이드/1-메틸-1H-이미다졸(mesitylene-2-sulfonylchloride/1-methyl-1H-imidazole) 하에서 축합반응시켜 완성한다.When the nucleotide monomer of Formula 2 is introduced at the 3'-position of the oligonucleotide, the derivative must be attached to the solid support. Mesitylene-2-sulfonyl chloride / 1-methyl-1H-imidazole as a hemisuccinate by converting monomers to hemisuccinate using a controlled pore glass (CPG) with commercially available amino groups Complete by condensation reaction under (mesitylene-2-sulfonylchloride / 1-methyl-1H-imidazole).

상기화학식 2의 모노머를 올리고뉴클레오타이드의 3'-끝 위치 외의 위치에 도입할 경우 DNA 합성기를 사용하여 주로 표준 포스포아미다이트 제법을 이용하여이루어진다(예를 들면 ABI 392 등). 일반적으로화학식 2의 모노머의 농도와 고체 수지와의 반응시기는 DNA 합성기의 일반적인 포스포아미다이트 시약과 동일하나, 2'-위치에 수소 이외의 작용기가 있는 경우는화학식 1에서의 모노머 축합반응 시간을 일반적인 60초에서 600초로 연장시키는 것이 바람직하다.When the monomer of Formula 2 is introduced to a position other than the 3'-end position of the oligonucleotide, it is mainly performed using a standard phosphoramidite method using a DNA synthesizer (for example, ABI 392). In general, the concentration of the monomer of Chemical Formula 2 and the reaction time of the solid resin are the same as those of the general phosphoramidite reagent of the DNA synthesizer, but the monomer condensation reaction of Chemical Formula 1 when there is a functional group other than hydrogen in the 2'-position It is desirable to extend the time from the usual 60 seconds to 600 seconds.

일단 목적하는 올리고뉴클레오타이드가 만들어지면 이는 고체 지지물로부터 분리되어야 하며 보호기 또한 제거되어야 한다. 이 두 과정은 동시에 행해질 수도 있고 따로 이루어질 수도 있다. 일반적으로 고체지지물은 암모니아수를 상온 처리하여 완성되고 보호기의 분리는 열을 가한 상태에서(일반적으로 55도에서 17시간) 암모니아수를 사용하여 완성된다. 올리고뉴클레오타이드의 5'-하이드록실기의 보호기는 다이메톡시트리틸기로서, 이의 분리는 합성의 마지막 단계에서 이루어지는데, 이는 DNA 합성기에서 내장된 프로그램을 이용하거나, 80% 초산, 다이클로로초산(dichloroacetic acid), 트리클로로초산(trichloroacetic acid)을 사용할 수 있다.Once the desired oligonucleotide is made it must be separated from the solid support and the protecting group must also be removed. These two processes can be done simultaneously or separately. In general, the solid support is completed by treatment with ammonia water at room temperature, and the separation of the protecting group is accomplished by using ammonia water under heat (generally 55 hours at 55 degrees). The protecting group of the 5'-hydroxyl group of the oligonucleotide is a dimethoxytrityl group, the separation of which takes place at the end of the synthesis, using a built-in program in the DNA synthesizer, 80% acetic acid, dichloroacetic acid (dichloroacetic) acid), trichloroacetic acid can be used.

상기화학식 1의 구조를 갖는 뉴클레오타이드 유도체를 포함하고 포스포로티오에이트 결합으로 이루어진 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 제조방법은, 육환의 아자슈거(피페리딘골격, piperidine)의 3'-탄소 위치에 핵염기(nucleobase)를 부착함으로써 제조과정을 간편하게 하였다. 즉, 아미날(aminal) 위치에 염기를 부착할 경우에는 주로 알파, 베타 위치 모두에 핵염기가 도입되어 이성체의 분리가 요구되는데, 본 발명에서는 아미날 위치가 아닌 탄소 위치에 염기를 도입함으로써원하는 베타 위치에만 염기가 도입된 뉴클레오타이드를 얻을 수 있다. 또한, 질소 위치에 여러 작용기(group)를 도입함에 있어서, 그 도입이 용이한 아자슈거를 이용함으로써 강한 염기성 시약을 사용하는 번거로움을 없앴으며, 그 생성물인 질소 위치에 각종 기가 도입된 올리고뉴클레오타이드들은 RNA에 대한 높은 Tm 값을 갖는 것으로 보아 mRNA에 대한 친화력이 높은 효과적인 안티센스 약물로 이용될 수 있다.Method for producing an oligonucleotide of the present invention comprising a nucleotide derivative having the structure of Formula 1 and consisting of phosphorothioate bonds, nucleobase at the 3'-carbon position of azasugar (piperidine skeleton, piperidine) of hexacyclic (nucleobase) was attached to simplify the manufacturing process. That is, in the case of attaching a base to an aminal position, nucleobases are mainly introduced at both alpha and beta positions, and separation of isomers is required in the present invention. Nucleotides with base introduced only in the beta position can be obtained. In addition, in the introduction of various groups at the nitrogen position, the use of azasugar, which is easy to introduce, eliminates the trouble of using a strong basic reagent, and oligonucleotides in which various groups are introduced at the nitrogen position thereof are Since it has a high Tm value for RNA, it can be used as an effective antisense drug with high affinity for mRNA.

또한, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 제조방법은 리보오스 대신 육환의 아자슈거를 사용하고 이에 소수성기를 부착시킴으로써, 세포막 친화성에 개선을 가져올 수 있다. 이러한 카르보사이클릭 뉴클레오타이드를 가진 올리고뉴클레오타이드는 효소에 대한 내성이 높아 안정한 것으로 알려져 있으며, 실제 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레아제에 대한 내성 또한 자연 DNA에 비해 월등히 우수한 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스페이트 연결부위를 일부 혹은 전부를 포스포로티오에이트로 바꿈으로써 결합력 증가 및 효소에 대한 안정성을 동시에 확보할 수 있다.In addition, the method for preparing an oligonucleotide of the present invention may bring about an improvement in cell membrane affinity by using azasugar of hexacyclic instead of ribose and attaching a hydrophobic group thereto. Oligonucleotides having such carbocyclic nucleotides are known to be stable due to their high resistance to enzymes. In fact, the oligonucleotides of the present invention have also been shown to be superior to natural DNA in terms of resistance to nucleases. In addition, the antisense oligonucleotide of the present invention can secure both binding force and enzyme stability at the same time by replacing some or all of the phosphate linkages with phosphorothioate.

한편, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 포스페이트 연결부위 중앙에 포스포다이에스터(phosphodiester) 또는 포스포로티오에이트(phosphothioate) 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 키메릭 올리고뉴클레오타이드의 형태로 제조될 수 있다.Meanwhile, the oligonucleotides of the present invention may be prepared in the form of chimeric oligonucleotides containing phosphodiester or phosphorothioate oligonucleotides in the center of the phosphate linkage.

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 에이즈 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for treating AIDS containing the oligonucleotide as an active ingredient.

본 발명자들은 상기와 같이 제조된 올리고뉴클레오타이드를 에이즈 치료를 위한 안티센스 약물로 사용할 수 있는 가능성을 확인하기 위하여, 바람직한 실시예로서 HIV-1의 TAR 유전자, SIV(simian immunodeficiency virus)의 TAR 유전자, 폴리오 바이러스(polio virus)의 IRES(internal ribosomal entry site), 그리고 HIV의 sd(splicing doner), LTR, gag 유전자 등 다양한 작용부위를 가지며, 대부분 포스페이트의 산소 한 개가 황으로 치환된포스포로티오에이트의 구조를 가지는 올리고뉴클레오타이드를 제조하였다(표 1참조).In order to confirm the possibility of using the oligonucleotides prepared as described above as antisense drugs for the treatment of AIDS, the present inventors preferred examples of the TAR gene of HIV-1, the TAR gene of simian immunodeficiency virus (SIV), and polio virus. (polio virus) IRES (internal ribosomal entry site), HIV sd (splicing doner), LTR, gag genes and a variety of sites of action, most of the structure of the phosphate is substituted with sulfur of phosphothioate Eggplants prepared oligonucleotides (see Table 1 ).

상기와 같이 제조된 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 HIV-1 증식에 대한 항 바이러스 활성을 신시티움 형성 실험으로 측정한 결과, 자연상태의 안티센스 올리고뉴클레오타이드나 포스포로티오에이트만으로 구성된 올리고뉴클레오타이드보다 항 바이러스 활성이 월등히 우수하였으며(도 1,도 2,표 2및표 4참조), 동일 농도에서의 항 바이러스 활성을 비교할 경우 현재 사용되고 있는 에이즈 치료제인 AZT보다 항 바이러스 활성이 우수하였다(표 2및표 3참조).The antiviral activity of HIV-1 proliferation of the oligonucleotides of the present invention prepared as described above was measured by synthium formation experiments. As a result, antiviral activity was higher than that of an oligonucleotide composed of only natural antisense oligonucleotides or phosphorothioates. The antiviral activity was much better (see FIGS. 1 , 2 , 2 and 4 ), and the antiviral activity at the same concentration was higher than that of AZT, an AIDS drug currently in use (see Tables 2 and 3 ). ).

본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 HIV-1을 감염시킨 세포배양액에 처리한 후 HIV-1의 증식을 역전사 효소활성으로 측정한 결과, 혈청유무나 배지에 상관없이 바이러스 증식이 완전히 억제됨을 확인하였다(도 3및도 4참조). 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 자연형의 올리고뉴클레오타이드(P=O 결합)와 비슷한 세포 독성을 나타내었으나(표 8참조) 항바이러스 효능이 상대적으로 우수하므로 자연형의 올리고뉴클레오타이드 보다 치료계수가 월등히 높아 치료시 안전성 면에서도 우수할 것으로 판단된다.After the oligonucleotides of the present invention were treated with HIV-1 infected cell culture medium, the proliferation of HIV-1 was measured by reverse transcriptase activity. As a result, it was confirmed that virus proliferation was completely suppressed regardless of serum or medium ( FIG. 3 ) . And FIG. 4 ). In addition, the oligonucleotides of the present invention exhibited similar cytotoxicity to that of the native oligonucleotide (P = O bond) (see Table 8 ), but the antiviral efficacy was relatively high, so the treatment coefficient was much higher than that of the native oligonucleotide. It is also believed to be excellent in terms of safety during treatment.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 세포 배양시 배지에 분비되는 핵산 분해 효소에 대한 안정성을 조사하기 위하여, 세포 배양에 사용한 배지 상청액(도 5참조)과 동종의 신선한 배지(도 6참조)에 올리고뉴클레오타이드를 첨가하고 이를 일정 시간 방치한 후, 시료 일부를 전기영동하여 올리고뉴클레오타이드가 분해되는 정도를 조사한 결과, 6환의 아자슈거를 가진 핵산 유도체의 포함 유무와 상관없이포스포로티오에이트(P=S) 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 세포 배양 상청액 에서도 6일 이상 분해되지 않고 안정성을 유지하였으나 P=O 결합만 존재하는 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 2시간 이내에 완전히 분해되었다(도 5참조). 또한, 안정성이 있던 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 경우 혈청이 포함된 신선한 배지에서는 15일까지 분해되지 않고 안정성을 유지하였다(도 6참조).To oligonucleotide of the present invention to investigate the stability of the nucleic acid degrading enzyme is secreted upon cell culture nucleotide medium, up to the medium supernatant was used for the cell culture (see FIG. 5) and fresh culture medium (see Fig. 6) of the same addition of nucleotides After leaving the sample for a certain period of time, the degree of degradation of oligonucleotides was examined by electrophoresis of a portion of the sample. As a result, the presence of phosphothioate (P = S) oligonucleotides was determined regardless of the presence or absence of a nucleic acid derivative having six rings of azasugar. In the case of cell culture supernatant, the stability was maintained without degradation for more than 6 days, but in the case of oligonucleotides containing only P═O bonds, they were completely degraded within 2 hours (see FIG. 5 ). In addition, the oligonucleotide of the present invention was stable in the fresh medium containing serum was not degraded until 15 days to maintain stability (see Figure 6 ).

본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 세포막 투과여부 및 세포내 항 바이러스 활성을 세포내의 HIV-1 LTR(TAR 유전자서열을 포함하고 있으며 HIV의 발현을 총괄적으로 조절하는 부분)의 활성 억제 여부로 확인하기 위하여, HIV-1 LTR에 CAT 혹은 β-갈락토시다제(galactosidase) 유전자가 리포터(reporter) 유전자로 결합된 플라스미드를 세포에 도입한 후 리포터 유전자 발현 정도로 LTR 활성을 측정하였다. LTR-β-갈락토시다제 유전자를 가진 Magi 세포에 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 처리하거나 혹은 형질감염시켜 HIV-1 LTR의 활성억제 여부를 조사한 결과,본 발명의 올리고뉴클레오타이드 처리에 의해서는 LTR 활성이 억제되지 않았으며(도 7의A참조) 형질감염시에는서열번호 4로 기재되는 올리고뉴클레오타이드만 유전자 서열 특이적으로 LTR 활성을 억제하였다(도 7의B참조). 또한서열번호 4로 기재되는 올리고뉴클레오타이드의 LTR 활성억제 효과는 처리한 올리고뉴클레오타이드의 양과 비례하였으나 다른 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 처리량을 증가시켜도 전혀 LTR 활성억제 효과를 보이지 않았다(도 8참조). 상기한 결과를 다시 확인하기 위하여 LTR-CAT 유전자를 형질감염시킨 세포를 배양하면서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 배지에 첨가한 결과 LTR에 의해 조절되는 CAT 활성에 전혀 영향을 미치지 않았다(도 9참조). 또한 각각의 올리고뉴클레오타이드를 LTR-CAT 플라스미드와 함께 세포 내에 형질감염시킨 다음 CAT 유전자 발현을 조사한 결과서열번호 4로 기재되는 올리고뉴클레오타이드에서는 비교적 강한 LTR 활성억제 효과가 나타났으나, 항 바이러스 활성이 높은 다른 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 세포 내에서 전혀 LTR 활성을 억제하지 못하였다(도 10참조).In order to confirm whether or not cell membrane permeation and intracellular antiviral activity of the oligonucleotide of the present invention is inhibited by the activity of HIV-1 LTR (the part which includes the TAR gene sequence and regulates HIV expression collectively), HIV LTR activity was measured to the extent of reporter gene expression after introducing a plasmid in which CAT or β-galactosidase gene was bound as a reporter gene to -1 LTR. Magi cells carrying the LTR-β-galactosidase gene were treated with or transfected with the oligonucleotide of the present invention to investigate the inhibition of HIV-1 LTR activity. As a result, the oligonucleotide treatment of the present invention resulted in LTR activity. It was unable to be suppressed (refer to a of FIG. 7) at the time of transfection inhibited the oligonucleotide only specific nucleotide gene sequence typically LTR activity is described in SEQ ID nO: 4 (see B in FIG. 7). In addition, the LTR activity inhibitory effect of the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 4 was proportional to the amount of oligonucleotides treated, but other oligonucleotides showed no LTR activity inhibitory effect at all even when the throughput was increased (see FIG. 8 ). In order to confirm the above results, addition of the oligonucleotide of the present invention to the medium while culturing cells transfected with the LTR-CAT gene had no effect on CAT activity regulated by LTR (see FIG. 9 ). In addition, each oligonucleotide was transfected with LTR-CAT plasmid in a cell and then examined for CAT gene expression. As a result, oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 4 showed a relatively strong inhibitory effect on LTR activity. Oligonucleotides did not inhibit LTR activity at all in the cells (see FIG. 10 ).

상기의 결과로부터, 아자슈거의 핵산 유도체를 포함한 포스포로티오에이트 결합의 올리고뉴클레오타이드가 특정 유전자 서열에 특이적으로 작용하는 기존의 안티센스와는 다른 기전으로 항 바이러스 활성을 나타낸다는 사실을 시사해 준다. 또한 특정 올리고뉴클레오타이드(서열번호 4로 기재되는 올리고뉴클레오타이드)의 LTR 활성억제 현상이 배지 첨가시는 전혀 나타나지 않다가 형질감염 방법으로 인위적으로 세포내에 주입시 크게 증가하는 것을 볼때 올리고뉴클레오타이드를 단순히배지에 첨가할 때의 세포막 투과성은 매우 낮을 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고 여타의 올리고뉴클레오타이드들에 의해 항 바이러스 활성이 나타나는 것은 이들이 세포 밖에서 작용하여 바이러스 부착을 방해함으로 1차적으로 HIV-1의 감염을 효과적으로 차단하여 나타나는 현상으로 추측된다.The above results suggest that the oligonucleotides of phosphorothioate bonds, including Azasugar's nucleic acid derivatives, exhibit antiviral activity by a mechanism different from conventional antisenses that specifically act on specific gene sequences. In addition, when the inhibition of LTR activity of a specific oligonucleotide (oligonucleotide described by SEQ ID NO: 4 ) does not appear at all when the medium is added, the oligonucleotide is simply added to the medium when it is greatly increased when it is artificially injected into the cell by a transfection method. Cell membrane permeability is considered to be very low. Nevertheless, the antiviral activity caused by other oligonucleotides is presumed to be the result of effectively blocking the infection of HIV-1 by acting outside the cell and interfering with virus adhesion.

다음으로 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 AIDS 치료제로서의 가능성을 알아보기 위하여 감염 1주일 후 상당한 세포병변이 진전된 상태에서(현미경으로 무수한 신시티아 관찰) 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 첨가한 후 세포병변의 변화를 관찰한 결과, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 첨가에 의해 신시티아의 갯수나 크기가 현저히 줄어들었으나 단순히 포스포로티오에이트로만으로 구성된 올리고뉴클레오타이드(서열번호 4로 기재되는 올리고뉴클레오타이드)의 경우에는 오히려 올리고뉴클레오타이드를 처리하지 않은 대조군보다 더 크고 많은 신시티아를 형성하였다(도 11참조). 상기 결과는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 뛰어난 항 바이러스 효과와 함께 감염된 세포에 대해서도 치료 능력을 가지고 있음을 시사한다.Next, in order to examine the possibility of the oligonucleotide of the present invention as an AIDS therapeutic agent, after a week of infection, the cell lesion was changed after the addition of the oligonucleotide of the present invention in the state of substantial cell lesion progression (observing countless Cynthiatia under a microscope). As a result, the number and size of Cynthiatia were significantly reduced by the addition of the oligonucleotide of the present invention, but in the case of oligonucleotides consisting of only phosphorothioates (oligonucleotides described by SEQ ID NO: 4 ), the oligonucleotides were treated. It formed larger and more Cynthia than the control that did not (see FIG. 11 ). The above results suggest that the oligonucleotides of the present invention have therapeutic ability against infected cells with excellent antiviral effect.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 다른 바이러스에 대한 항 바이러스 활성을 조사한 결과, SIV TAR 유전자 서열에 대한 특이성 여부와는 상관없이 어느 것도 SIV의 증식을 억제하지 못하였으며(도 12참조), 소아마비 바이러스의 IRES (internal ribosomal entry site) 부위의 유전자 서열에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 서열 비특이적인 올리고뉴클레오타이드 역시 소아마비 바이러스증식을 억제하지 못하였다(도 13참조). 상기 결과로부터, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 HIV외 다른 바이러스에 대해서는 염기서열과 상관없이 항 바이러스 효과를 나타내지 못함을 확인하였다.Investigation of the antiviral activity of the oligonucleotides of the present invention against other viruses revealed that, regardless of the specificity for the SIV TAR gene sequence, none inhibited the growth of SIV (see FIG. 12 ). Antisense oligonucleotides specific to the gene sequence of the internal ribosomal entry site) and nonspecific sequence oligonucleotides also did not inhibit poliovirus growth (see FIG. 13 ). From the above results, it was confirmed that the oligonucleotide of the present invention does not exhibit an antiviral effect regardless of the nucleotide sequence for viruses other than HIV.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성에 대한 혈청의 영향을 확인하기 위하여, 다른 종류 및 여러 농도의 혈청이 첨가된 배지에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성을 신시티움 형성 실험으로 측정한 결과, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 중 다수가 혈청의 첨가에 의해 다소간 활성이 약화되었으나 이 중 특정 올리고뉴클레오타이드(서열번호 22로 기재되는 올리고뉴클레오타이드)는 혈청 유무와 상관없이 동일한 활성을 유지하였다. 그러나 약화된 정도는 혈청의 농도나 종류에 무관하게 일정하였다(표 5참조).In order to confirm the effect of serum on the antiviral activity of the oligonucleotides of the present invention, the antiviral activity of the oligonucleotides of the present invention in a medium to which different kinds and concentrations of serum were added was measured by synthium formation experiments. However, many of the oligonucleotides of the present invention were somewhat attenuated by the addition of serum, but certain oligonucleotides (oligonucleotides set forth in SEQ ID NO: 22 ) maintained the same activity with or without serum. However, the degree of weakening was constant regardless of serum concentration or type (see Table 5 ).

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 임상투여시에 비경구 또는 경구로 투여가 가능하다. 경구투여를 위한 고형 제재에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제재는 상기화학식 1의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제재로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 캡슐, 동결건조제제, 연고제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 특히 리포좀(liposome), PEG화된 리포좀(PEGylated liposome), 혹은 양이온성 지질(cationic lipid)과 같이 올리고뉴클레오타이드를 세포내로 용이하게 전달시키는 전달체를 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.Oligonucleotides of the present invention can be administered parenterally or orally at the time of clinical administration. The solid material for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid materials are, for at least one or more excipients, for example, the compound of formula (I), starch, calcium carbonate (Calcium carbonate), can It is prepared by mixing sucrose or lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used. Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. . Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, capsules, lyophilized preparations, ointments, suppositories. As the non-aqueous solvent and the suspension solvent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used. In particular, a carrier that easily delivers oligonucleotides into cells, such as liposomes, PEGylated liposomes, or cationic lipids, can be used. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 에이즈 치료제로 사용하기 위한 유효 용량은 0.1 내지 15 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 0.5 내지 2 ㎎/㎏이다.An effective dose for the use of the antisense oligonucleotides of the present invention as an AIDS treatment is 0.1 to 15 mg / kg, preferably 0.5 to 2 mg / kg.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1> 서열번호 1의 올리고뉴클레오타이드의 합성Example 1 Synthesis of Oligonucleotide of SEQ ID NO: 1

모든 올리고뉴클레오타이드는 어플라이드 바이오시스템 392(DNA/RNA Synthesizer)를 이용하여 1 마이크로몰 스케일로 트리틸-온(trityl-on) 상태로 합성되었으며, 합성방법은 대한민국 특허 출원번호 제99-26947에 잘 나타나있다. 일반적인 올리고뉴클레오타이드의 축합시간이 1분인데 반하여, 본 발명의 안티센스올리고뉴클레오타이드와 같이 아자슈거의 4'-위치에 수소 외의 반응기가 존재하는 뉴클레오타이드 축합의 경우에는 축합시간이 10분이었다. 고체지지물과 보호기는 암모니아수를 사용하여 55℃에서 17시간 동안 가열하여 제거하였고, 디메톡시트리틸(dimethoxytrityl, DMT) 보호기의 분리를 막기 위해 1시간 마다 트리에틸아민 5방울을 가하면서 동결건조시켰다. 잔사를 1 ㎖의 100 mM 트리에틸암모니움 아세테이트(triethylammonium acetate[pH 7.0], 이하 "TEAA"라 칭함) 용액에 녹이고 이를 역상 고성능 액체 크로마토그래피(Hamilton PRP-1, 300 mm x 7 mm, 18 - 28% 아세토나이트릴/100 mM TEAA, pH 7, 260 nm에서 UV로 모니터)로 정제하였다. 원하는 분획을 동결건조하고 1 ㎖의 증류수를 두 번 가하여 다시 동결건조함으로써, 잔류하는 TEAA 염을 완전히 제거하였다. 남은 잔사에 0.3 ㎖의 80% 초산을 가하고 볼텍스(votex)하여 완전히 용해시킨 다음 20분간 상온에서 방치하여 디메톡시트리틸기를 분리하였다. 상기 용액에 0.3 ㎖의 에탄올을 가하여 과량의 초산을 제거하고 이를 동결건조하였다. 잔사에 1 ㎖의 증류수를 가하여 볼텍스로 잘 용해시키고 여기에 1 ㎖의 에테르를 가하여 볼텍스로 완전히 교반시켰다. 상층의 에테르를 피펫으로 제거하고 다시 1 ㎖의 에테르를 가한 후, 동일한 과정을 두 번 반복하였다. 이로부터 얻은 물층을 동결 건조한 후 잔사에 1 ㎖의 증류수를 가한 다음, 상기 용액을 70℃에서 UV 흡광도를 측정하여 정량하였다. 농도 계산을 위한 자연 뉴클레오타이드의 흡광 계수는 dAMP, 15200; dCMP, 7700; TMP, 8830; dGMP, 11500이다. 아자슈거를 가진 뉴클레오타이드의 흡광 계수도 자연 뉴클레오타이드와 동일한 값으로 계산되었다. 올리고뉴클레오타이드의 구성은 효소분해 후 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, Hewlett Packard, ODS hypersil, C-18; 20 mM K2HPO4, pH 5.6(A), MeOH(B), 100 % A to 40% B, 20 min)와 레이져 탈착(Laser Desorption) 질량 분석으로 확인되었다. 이로부터 염기서열 내의 여러 위치에 하기화학식 3의 새로운 구조를 가진 아데노신 유도체(ⓐ)를 포함하는서열번호 1로 기재되는 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다.All oligonucleotides were synthesized in trityl-on at 1 micromolar scale using Applied Biosystem 392 (DNA / RNA Synthesizer), the synthesis method being well described in Korean Patent Application No. 99-26947. have. While the condensation time of the general oligonucleotide was 1 minute, the condensation time was 10 minutes in the case of nucleotide condensation in which a reactor other than hydrogen is present at the 4'-position of the azasugar like the antisense oligonucleotide of the present invention. The solid support and the protecting group were removed by heating at 55 ° C. for 17 hours using ammonia water, and lyophilized with adding 5 drops of triethylamine every hour to prevent separation of the dimethoxytrityl (DMT) protecting group. The residue was dissolved in 1 ml of 100 mM triethylammonium acetate [pH 7.0] (hereinafter referred to as "TEAA") solution and reverse phase high performance liquid chromatography (Hamilton PRP-1, 300 mm x 7 mm, 18-). Purified by 28% acetonitrile / 100 mM TEAA, monitored by UV at pH 7, 260 nm). The desired fractions were lyophilized and lyophilized again by adding 1 ml of distilled water twice to completely remove the remaining TEAA salt. 0.3 ml of 80% acetic acid was added to the remaining residue, vortexed, completely dissolved, and left at room temperature for 20 minutes to separate the dimethoxytrityl group. 0.3 ml of ethanol was added to the solution to remove excess acetic acid and lyophilized. 1 ml of distilled water was added to the residue to dissolve well with vortex, and 1 ml of ether was added thereto, followed by complete stirring with vortex. The upper ether was removed by pipetting and again 1 ml of ether was added, and the same procedure was repeated twice. The water layer obtained therefrom was lyophilized, 1 mL of distilled water was added to the residue, and the solution was quantified by measuring UV absorbance at 70 ° C. The extinction coefficient of the natural nucleotide for the concentration calculation was dAMP, 15200; dCMP, 7700; TMP, 8830; dGMP, 11500. Absorption coefficients of nucleotides with azasugar were also calculated at the same values as natural nucleotides. The composition of the oligonucleotides is characterized by high performance liquid chromatography (HPLC, Hewlett Packard, ODS hypersil, C-18; 20 mM K 2 HPO 4 , pH 5.6 (A), MeOH (B), 100% A to 40% B after enzymatic degradation). , 20 min) and laser desorption mass spectrometry. From this, oligonucleotides set forth in SEQ ID NO: 1 comprising adenosine derivatives having a new structure of formula (3) at various positions in the base sequence were synthesized.

<실시예 2 ∼ 실시예 29> 서열번호 2 ∼ 서열번호 29로 기재되는 올리고뉴클레오타이드의 합성<Example 2-Example 29> Synthesis of oligonucleotides set forth in SEQ ID NO: 2-SEQ ID NO: 29

실시예 1과 동일한 방법으로화학식 3의 구조를 가지는 아데노신 유도체의 전구물질을 합성한 후 염기서열 내의 여러 위치에화학식 3의 구조를 가지는 아데노신 유도체를 포함하는서열번호 1 ∼ 서열번호 29로 기재되는 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다.Oligonucleotides of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 29 comprising adenosine derivative having the structure of Formula 3 at various positions in the nucleotide sequence after synthesizing the precursor of the adenosine derivative having the structure of Formula 3 in the same manner as in Example 1 Nucleotides were synthesized.

합성된 올리고뉴클레오타이드는 HIV-1의 TAR 유전자, SIV(simian immunodeficiency virus)의 TAR 유전자, 폴리오 바이러스(polio virus)의IRES(internal ribosomal entry site), 그리고 HIV의 sd, LTR, gag 유전자 등에 작용부위를 가진다. 그 외에도 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 대상 유전자가 없이 무작위 염기서열을 가지는 렌덤 올리고뉴클레오타이드(서열번호 20내지서열번호 23의 올리고뉴클레오타이드) 및 아자슈거의 위치는 무작위적인 렌덤 올리고뉴클레오타이드(서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드)와 비슷하나 in vivo에서 강한 면역유도능을 보이는 CpG 유전자 서열을 가진(A. M. Crieg 등Nature, 271:546, 1995; D. E. McFarlane 및 L. Manzel.J. Immunol., 160:1122, 1998; A. Yi 등,J. Immunol., 160:4755, 1998) 올리고뉴클레오타이드(서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드) 등으로 올리고뉴클레오타이드의 결합은 포스포다이에스테르 결합의 산소 한 개가 황으로 치환된포스포로티오에이트의 구조를 가진다(예외;서열번호 5,서열번호 13및서열번호 24의 올리고뉴클레오타이드는 포스포다이에스테르 결합임).Synthesized oligonucleotides act on the TAR gene of HIV-1, the TAR gene of simian immunodeficiency virus (SIV), the internal ribosomal entry site (IRES) of polio virus, and the sd, LTR, gag gene of HIV. Have In addition, the oligonucleotides of the present invention are random oligonucleotides having a random sequence without a gene of interest (an oligonucleotide of SEQ ID NO: 20 to SEQ ID NO: 23 ) and the position of Azasugar is a random random oligonucleotide (oligonucleotide of SEQ ID NO: 22) ), But with a CpG gene sequence that exhibits strong immunogenic potency in vivo (AM Crieg et al . Nature , 271: 546, 1995; DE McFarlane and L. Manzel. J. Immunol. , 160: 1122, 1998; A. Yi et al. , J. Immunol. , 160: 4755, 1998) Oligonucleotides such as oligonucleotides (oligonucleotides of SEQ ID NO: 29 ) and the like are structured of phosphothioate in which one oxygen of the phosphodiester bond is substituted with sulfur. (Exception; oligonucleotides of SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 24 are phosphodiesters) Combination).

합성된 모든 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 염기서열과 아데노신 유사체인 ⓐ의 위치 및 올리고 핵산의 유전자는표 1에 요약하였다.The base sequence of all synthesized antisense oligonucleotides and the position of the adenosine analog ⓐ and the gene of the oligonucleotide are summarized in Table 1 .

올리고뉴클레오타이드 리스트(list)Oligonucleotide List 시료번호 Sample Number 서열* Sequence * 결합 Combination 작용부위 Working area 서열목록 Sequence Listing 실시예 1Example 1 AGC TCC CⓐG GCT CⓐG ATCAGC TCC CⓐG GCT CⓐG ATC P=SP = S HIV-1 TARHIV-1 TAR 서열번호 1SEQ ID NO: 1 실시예 2Example 2 ⓐGC TCC CⓐG GCT CⓐG ATCⒶGC TCC CⓐG GCT CⓐG ATC P=SP = S HIV-1 TARHIV-1 TAR 서열번호 2SEQ ID NO: 2 실시예 3Example 3 ⓐGC TCC CⓐG GCT CAG ⓐTCⒶGC TCC CⓐG GCT CAG ⓐTC P=SP = S HIV-1 TARHIV-1 TAR 서열번호 3SEQ ID NO: 3 실시예 4Example 4 AGC TCC CAG GCT CAG ATCAGC TCC CAG GCT CAG ATC P=SP = S HIV-1 TARHIV-1 TAR 서열번호 4SEQ ID NO: 4 실시예 5Example 5 ⓐGC TCC CⓐG GCT CAG ⓐTCⒶGC TCC CⓐG GCT CAG ⓐTC P=OP = O HIV-1 TARHIV-1 TAR 서열번호 5SEQ ID NO: 5 실시예 6Example 6 ⓐTC TGC TCⓐ GAG ATA CⓐAⒶTC TGC TCⓐ GAG ATA CⓐA P=SP = S SIV TARSIV TAR 서열번호 6SEQ ID NO: 6 실시예 7Example 7 ⓐGT CⓐC TCA GGⓐ CTC TGGⒶGT CⓐC TCA GGⓐ CTC TGG P=SP = S SIV TARSIV TAR 서열번호 7SEQ ID NO: 7 실시예 8Example 8 ⓐCT CAT CⓐG CCT ⓐAG CTAⒶCT CAT CⓐG CCT ⓐAG CTA P=SP = S Polio IRESPolio IRES 서열번호 8SEQ ID NO: 8 실시예 9Example 9 ⓐGC TCC CAG GCT CAG ⓐTCⒶGC TCC CAG GCT CAG ⓐTC P=SP = S HIV-1 TARHIV-1 TAR 서열번호 9SEQ ID NO: 9 실시예 10Example 10 ⓐTT TTT GGC CTⓐ CTC ⓐCCⒶTT TTT GGC CTⓐ CTC ⓐCC P=SP = S HIV-1 sdHIV-1 sd 서열번호 10SEQ ID NO: 10 실시예 11Example 11 ⓐTT GⓐG GCT TⓐA GCⓐ GTGⒶTT GⓐG GCT TⓐA GCⓐ GTG P=SP = S HIV-1 LTRHIV-1 LTR 서열번호 11SEQ ID NO: 11 실시예 12Example 12 CⓐG AAT ⓐGA GGⓐ CTG CTⓐ TCⓐG AAT ⓐGA GGⓐ CTG CTⓐ T P=SP = S HIV-1 gagHIV-1 gag 서열번호 12SEQ ID NO: 12 실시예 13Example 13 AGC TCC CAG GCT CAG ATCAGC TCC CAG GCT CAG ATC P=OP = O HIV-1 TARHIV-1 TAR 서열번호 13SEQ ID NO: 13 실시예 14Example 14 ⓐGC TCC CⓐG GCT CAG ATCⒶGC TCC CⓐG GCT CAG ATC P=SP = S HIV-1 TARHIV-1 TAR 서열번호 14SEQ ID NO: 14 실시예 15Example 15 ⓐGC TCC CAG GCT CⓐGⒶGC TCC CAG GCT CⓐG P=SP = S HIV-1 TARHIV-1 TAR 서열번호 15SEQ ID NO: 15 실시예 16Example 16 ⓐGC TCC CⓐGⒶGC TCC CⓐG P=SP = S HIV-1 TARHIV-1 TAR 서열번호 16SEQ ID NO: 16 실시예 17Example 17 ⓐGC TCC CⓐG GCT CⓐG ⓐTCⒶGC TCC CⓐG GCT CⓐG ⓐTC P=SP = S HIV-1 TARHIV-1 TAR 서열번호 17SEQ ID NO: 17 실시예 18Example 18 ⓐ GⓐG ⓐGC TCC CⓐG GCT CⓐG ⓐTⒶ GⓐG ⓐGC TCC CⓐG GCT CⓐG ⓐT P=SP = S HIV-1 TAR(475-495)HIV-1 TAR (475-495) 서열번호 18SEQ ID NO: 18 실시예 19Example 19 ⓐGⓐ GCT CCC ⓐGG CTC ⓐGⓐ TⒶGⓐ GCT CCC ⓐGG CTC ⓐGⓐ T P=SP = S HIV-1 TARHIV-1 TAR 서열번호 19SEQ ID NO: 19 실시예 20Example 20 ⓐGC TCC ⓐGC TCC ⓐGC TCC ⓐGⒶGC TCC ⓐGC TCC ⓐGC TCC ⓐG P=SP = S Random 1Random 1 서열번호 20SEQ ID NO: 20 실시예 21Example 21 ⓐGC TCⓐ GCT CⓐG CTC ⓐGC TⓐGⒶGC TCⓐ GCT CⓐG CTC ⓐGC TⓐG P=SP = S Random 2Random 2 서열번호 21SEQ ID NO: 21 실시예 22Example 22 ⓐCT CⓐC TCⓐ CTC ⓐCT CⓐCⒶCT CⓐC TCⓐ CTC ⓐCT CⓐC P=SP = S Random 3Random 3 서열번호 22SEQ ID NO: 22 실시예 23Example 23 ⓐCG ⓐCG ⓐCG ⓐCG ⓐCG ⓐCG ⓐCⒶCG ⓐCG ⓐCG ⓐCG ⓐCG ⓐCG ⓐC P=SP = S Random 4Random 4 서열번호 23SEQ ID NO: 23 실시예 24Example 24 DMT-ⓐGGGⓐGDMT-ⓐGGGⓐG P=OP = O Random 5Random 5 서열번호 24SEQ ID NO: 24 실시예 25Example 25 ⓐTGGGGⓐTⒶTGGGGⓐT P=SP = S G-quartetG-quartet 서열번호 25SEQ ID NO: 25 실시예 26 Example 26 A0G0C0T*C*C*C*ⓐ*G*G*C*T*C*ⓐ*G0A0T0CA 0 G 0 C 0 T * C * C * C * ⓐ * G * G * C * T * C * ⓐ * G 0 A 0 T 0 C 0P=O,*P=S 0 P = O, * P = S HIV-1 TAR HIV-1 TAR 서열번호 26 SEQ ID NO: 26 실시예 27 Example 27 A*G0C*T0C*C0C*ⓐ0G*G0C*T0C*ⓐ0G*A0T*CA * G 0 C * T 0 C * C 0 C * ⓐ 0 G * G 0 C * T 0 C * ⓐ 0 G * A 0 T * C 0P=O,*P=S 0 P = O, * P = S HIV-1 TAR HIV-1 TAR 서열번호 27 SEQ ID NO: 27 실시예 28 Example 28 A0G*C*T*C*C*C*ⓐ*G*G*C*T*C*ⓐ*G*A*T0CA 0 G * C * T * C * C * C * ⓐ * G * G * C * T * C * ⓐ * G * A * T 0 C 0P=O,*P=S 0 P = O, * P = S HIV-1 TAR HIV-1 TAR 서열번호 28 SEQ ID NO: 28 실시예 29Example 29 ⓐCG CⓐC GCⓐ CTC ⓐCG CⓐCⒶCG CⓐC GCⓐ CTC ⓐCG CⓐC P=SP = S CpG-RandomCpG-Random 서열번호 29SEQ ID NO: 29

* : 올리고뉴클레오타이드의 결합이 포스포로티오에이트일 경우에는 P=S, 포스포다이에스테르일 경우에는 P=O로 표기하였으며, 이들 결합이 섞여있는 키메라의 경우에는 P=O는oP=O로, P=S는*P=S로 표기하였다.*: P = S when the bond of oligonucleotide is phosphorothioate, P = O when the phosphodiester, and P = O is o P = O in the case of chimeras containing these bonds. , P = S is denoted by * P = S.

<실험예 1> 올리고뉴클레오타이드의 HIV-1 증식에 대한 항 바이러스 활성 조사Experimental Example 1 Investigation of Antiviral Activity of HIV-1 Proliferation of Oligonucleotides

본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 HIV 바이러스의 증식에 미치는 항 바이러스 활성을 조사하기 위하여 Jurkat-Tat 세포에 HXBc2/Δtat 바이러스를 감염시킨 후 각 올리고뉴클레오타이드를 첨가한 상태에서 형성되는 신시티움(syncytium)의 개수를 조사하거나 역전사효소의 활성을 측정하여 시료 내의 바이러스를 정량하였다.The number of synthium (syncytium) formed after addition of each oligonucleotide after infection of HXBc2 / Δtat virus to Jurkat-Tat cells in order to investigate the antiviral activity of the oligonucleotide of the present invention on the proliferation of HIV virus The virus in the sample was quantified by investigating or measuring the activity of reverse transcriptase.

<1-1> 신시티움 형성 실험<1-1> Synthium Formation Experiment

본 실험을 위해 tat 유전자를 돌연변이시킨 HXBc2/Δtat 바이러스와 Tat을 발현하는 Jurkat-Tat 세포(Tat-expressing Jurkat cells)를 미국 하바드 대학교 다나-파머 암연구소 소드로스키 박사(Dr, Sodroski at Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School)로부터 분양 받아 실험에 사용하였다. HXBc2/Δtat 바이러스를 Jurkat-Tat 세포에 감염시키면 세포 표면에 바이러스 외막 단백(gp120과 gp41)이 발현되면서 이것이 인접한 비감염세포 표면항원인 CD4와 결합하여 세포융합이 일어나 다핵의 거대세포(multinucleated giant cells)인 신시티움을 형성한다. 이러한 원리를 이용하여 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 항 HIV-1 활성을 확인하기 위하여, 감염된 HIV-1의 증식 정도를 시간이 지나면서 형성되는 신시티움의 갯수를 조사하여 판단하였다.HXBc2 / Δtat virus mutated tat gene and Tat-expressing Jurkat cells were used for this experiment. Dr. Sodroski at Dana-Farber, Dana-Farmer Cancer Institute, Harvard University, USA Cancer Institute, Harvard Medical School) was used in the experiment. Infection of Jurkat-Tat cells with HXBc2 / Δtat virus results in the expression of viral envelope proteins (gp120 and gp41) on the cell surface, which bind to adjacent non-infected cell surface antigens, CD4, resulting in cell fusion resulting in multinucleated giant cells. Form a synthium. In order to confirm the anti-HIV-1 activity of the oligonucleotide of the present invention using this principle, the degree of proliferation of infected HIV-1 was determined by examining the number of syntium formed over time.

구체적으로, 왕성하게 자라는 Jurkat-Tat 세포를 수획하여 2번 인산염 완충용액으로 씻어준 다음 혈청이 첨가되지 않은 배양액에서 HXBc2/Δtat 바이러스를 1×105세포당 TCID(tissue culture infectious dose)5050이 되게 섞어 37℃ 이산화탄소 배양기에서 1시간 동안 감염시켰다. 감염이 끝나면 세포를 동일한 완충용액으로 세척하여 감염되지 않은 바이러스를 제거하고 24-웰 플레이트에 웰 당 2×105세포가 되게 10%의 소태아혈청이 첨가된 배지(RPMI10)와 혈청이 첨가되지 않은 배지(Opti-MEM)를 첨가하여 이를 각각 배양하였고, 각각의 경우에 상기 실시예 1에서 합성된 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 0.1 μM의 농도로 종류별로 배양 초기 1회 첨가한 후 날마다 플레이트를 관찰하여 초기 신시티움이 생성되는 날짜와 신시티움의 갯수를 조사하여 각 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성을 측정하였으며, 그 결과를 하기표 2및표 3에 나타내었다. 이때 AZT를 0.1 μM로 첨가한 것을 비교군으로 삼았다.Specifically, the highly grown Jurkat-Tat cells were harvested and washed with No. 2 phosphate buffer, and then 1 × 10 HXBc2 / Δtat virus was added to the medium without serum.5Tissue culture infectious dose (TCID) per cell50The mixture was mixed to 50 and infected for 1 hour in a 37 ° C. carbon dioxide incubator. At the end of infection, cells are washed with the same buffer to remove uninfected virus and placed in a 24-well plate at 2 × 10 per well.5Medium with 10% Fetal Bovine Serum (RPMI)10) And medium without serum (Opti-MEM) were added thereto, and each was incubated. In each case, the oligonucleotide of the present invention synthesized in Example 1 was added at the initial stage of the culture at a concentration of 0.1 μM. Afterwards, the plate was observed every day, and the antiviral activity of each oligonucleotide was measured by examining the date of initial synthium formation and the number of syntium.TABLE 2AndTABLE 3Shown in At this time, AZT was added as 0.1 μM as a comparison group.

혈청이 첨가되지 않은 배지(Opti-MEM)에서의 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성Antiviral Activity of Oligonucleotides in Serum-Free Medium (Opti-MEM) 감염후 경과일Days after infection 1∼31 to 3 44 55 66 77 88 99 1010 1111 1212 대조군Control ++ ++++ ++++++ ++++++ ++++++++ ++++++++ ++++++++++ ++++++++++ 비교군(AZT)Comparative group (AZT) -- -- +/-+/- ++ ++++ ++++ ++++++ ++++++ 서열번호 1SEQ ID NO: 1 -- -- +/-+/- +/-+/- ++ ++++ ++++ ++++ 서열번호 2SEQ ID NO: 2 -- -- -- +/-+/- +/-+/- ++++ ++++ ++++ 서열번호 3SEQ ID NO: 3 -- +/-+/- +/-+/- +/-+/- +/-+/- ++ ++++++ ++++++ 서열번호 4SEQ ID NO: 4 ++ ++++++ ++++++++ ++++++++ ++++++++ ++++++++ ++++++++ ++++++++++ ++++++++++ 서열번호 5SEQ ID NO: 5 ++ ++++ ++++++ ++++++ ++++++ ++++++ ++++++++ ++++++++++ ++++++++++ 서열번호 8SEQ ID NO: 8 -- +/-+/- +/-+/- ++++ ++++ ++++++ ++++++ ++++++ 서열번호 9SEQ ID NO: 9 -- +/-+/- ++ ++ ++++ ++++++ ++++++ ++++++ 서열번호 10SEQ ID NO: 10 -- -- -- +/-+/- ++++ ++++ ++++++ ++++++ 서열번호 11SEQ ID NO: 11 -- +/-+/- +/-+/- +/-+/- ++ ++++ ++++++ ++++++ 서열번호 12SEQ ID NO: 12 -- +/-+/- +/-+/- +/-+/- +/-+/- ++ ++++ ++++++ 서열번호 13SEQ ID NO: 13 ++ ++++ ++++ ++++++ ++++++++ ++++++++ ++++++++++ ++++++++++ 서열번호 14SEQ ID NO: 14 -- -- +/-+/- +/-+/- ++++ ++++++ ++++++ ++++++++ 서열번호 15SEQ ID NO: 15 -- +/-+/- +/-+/- +/-+/- +/-+/- ++ ++++ ++++++ 서열번호 16SEQ ID NO: 16 -- +/-+/- +/-+/- +/-+/- +/-+/- ++ ++++ ++++++ 서열번호 17SEQ ID NO: 17 -- -- -- +/-+/- +/-+/- +/-+/- +/-+/- +/-+/- 서열번호 18SEQ ID NO: 18 -- -- -- +/-+/- +/-+/- +/-+/- ++ ++ 서열번호 19SEQ ID NO: 19 -- -- +/-+/- +/-+/- ++ ++ ++ ++++ 서열번호 20SEQ ID NO: 20 -- -- -- +/-+/- +/-+/- +/-+/- +/-+/- ++ 서열번호 21SEQ ID NO: 21 -- -- +/-+/- +/-+/- +/-+/- ++ ++ ++ 서열번호 22SEQ ID NO: 22 -- -- -- +/-+/- +/-+/- +/-+/- +/-+/- +/-+/- 서열번호 23SEQ ID NO: 23 -- -- +/-+/- +/-+/- +/-+/- ++ ++ ++ 서열번호 24SEQ ID NO: 24 -- +/-+/- ++ ++ ++++ ++++++ ++++++ ++++++ 서열번호 25SEQ ID NO: 25 -- +/-+/- +/-+/- ++ ++++ ++++++ ++++++ ++++++ 서열번호 26SEQ ID NO: 26 -- +/-+/- +/-+/- +/-+/- +/-+/- ++++ ++++ ++++++ 서열번호 27SEQ ID NO: 27 -- +/-+/- ++ ++++ ++++++ ++++++ ++++++ ++++++++ 서열번호 28SEQ ID NO: 28 -- +/-+/- +/-+/- ++ ++++ ++++ ++++ ++++++ 서열번호 29SEQ ID NO: 29 -- -- +/-+/- +/-+/- +/-+/- +/-+/- ++ ++

* 신시티움의 수 +/-:<10, +:∼20, ++:∼50, +++:∼100, ++++:∼200, +++++:>500* Number of synthium +/-: <10, +:-20, ++:-50, +++:-100, ++++:-200, +++++:> 500

10% 혈청이 첨가된 배지(RPMI10)에서의 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성Antiviral Activity of Oligonucleotides in Medium Added 10% Serum (RPMI 10 ) 감염후 경과일Days after infection 0∼10 to 1 22 33 44 55 66 77 88 99 대조군Control -- ++ ++ ++++ ++++ ++++++++ ++++++++ ++++++++++ ++++++++++ 비교군(AZT)Comparative group (AZT) -- -- -- +/-+/- +/-+/- ++ ++++ ++++++ ++++++++ 서열번호 2SEQ ID NO: 2 -- -- -- -- +/-+/- +/-+/- +/-+/- ++ ++++ 서열번호 4SEQ ID NO: 4 -- ++++ ++++++++ ++++++++ ++++++++ ++++++++ ++++++++ ++++++++++ ++++++++++ 서열번호 11SEQ ID NO: 11 -- -- -- -- -- +/-+/- +/-+/- ++++ ++++ 서열번호 17SEQ ID NO: 17 -- -- -- -- -- -- +/-+/- ++ ++ 서열번호 22SEQ ID NO: 22 -- -- -- -- -- -- -- +/-+/- +/-+/- 서열번호 29SEQ ID NO: 29 -- -- -- -- -- -- -- +/-+/- ++

* 신시티움의 수 +/-:<10, +:∼20, ++:∼50, +++:∼100, ++++:∼200, +++++:>500* Number of synthium +/-: <10, +:-20, ++:-50, +++:-100, ++++:-200, +++++:> 500

그 결과,표 2에서 보는 바와 같이 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 중서열번호 2,서열번호 3,서열번호 11,서열번호 17내지서열번호 23및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드는 AZT보다 항 바이러스 활성이 우수하였으며, 올리고뉴클레오타이드 중에서도서열번호 17,서열번호 20및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드는 다른 것에 비해 항바이러스 활성이 현저히 뛰어난 것으로 나타났다. 항 바이러스 효과를 보이는 군들은 모두 P=S 결합으로 이루어져 있었으며 육환의 아자슈거 뉴클레오타이드 유도체를 3개 이상 포함하고 있는 것들로 이중서열번호 20내지서열번호 23및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드는 HIV의 유전자 서열 특이성과 상관없이 항 HIV-1 활성을 보여주었다. 그러나, 육환의 아자슈거 유도체가 없는 P=S 결합을 가지는서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드의 경우는 0.1 μM 농도에서 오히려 대조군보다 신시티움 생성이 빨리 나타났을 뿐 아니라 시간이 지날수록 신시티움이 대조군보다 현저히 크고 많이 생성되었다(도 1).As a result, as shown in Table 2 , oligonucleotides of SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 23, and SEQ ID NO: 29 of the oligonucleotides of the present invention had better antiviral activity than AZT. Among the oligonucleotides, the oligonucleotides of SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 22 were found to be remarkably superior in antiviral activity than others. All the antiviral groups were composed of P = S bonds, which contained three or more azasugar nucleotide derivatives of the cyclic ring, and the oligonucleotides of SEQ ID NO: 20 to SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 29 represented the gene sequence of HIV. It showed anti-HIV-1 activity regardless of specificity. However, oligonucleotides of SEQ ID NO: 4 having a P = S bond without hexasaccharide derivatives exhibited faster synthium production than the control at 0.1 μM concentration, and synthium was not the control group over time. Significantly larger and much produced ( FIG. 1 ).

한편, 육환의 아자슈거 유도체를 가지고 있을지라도 P=O 결합으로된서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드의 경우에는서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드와 같이 신시티움이 대조군보다 일찍 관찰되었으나 그 후 나타나는 신시티움의 갯수는 대조군과 비슷하였다. 상기 두 올리고뉴클레오타이드는 0.1 μM 농도에서 HIV 증식을 오히려 촉진시키는 것으로 나타났다. 육환의 아자슈거가 없으면서 P=O 결합을 가진서열번호 13의 올리고뉴클레오타이드나 그 외 부분적으로 P=O 결합을 가진 올리고뉴클레오타이드(서열번호 26내지서열번호 28의 올리고뉴클레오타이드)의경우, 어떤 것도 유의할만한 항 HIV 활성을 보이지 않았다. 항 바이러스 활성을 보이는 것들은 아자슈거 유도체의 위치나 갯수에 따라 활성이 달리 나타났으며 이에 대한 특별한 규칙을 발견하지는 못하였으나 육환의 아자슈거가 4개 이상 포함된 올리고뉴클레오타이드들이 비교적 항 바이러스 활성을 높게 나타내었다.On the other hand, even in the case of hexasaccharide derivatives, in the case of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 5 with the P = O bond, syntium was observed earlier than the control like the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 , but after The number was similar to the control. Both oligonucleotides have been shown to rather promote HIV proliferation at concentrations of 0.1 μM. Six ring-aza eopeumyeonseo the sugar oligonucleotide of SEQ ID NO: 13 with the P = O bond oligonucleotide with P = O bond with a nucleotide or other partial nucleotide (oligonucleotide of SEQ ID NO: 26 to SEQ ID NO: 28 nucleotide) uigyeong right, nothing significant worth Did not show anti-HIV activity. Antiviral activities showed different activities depending on the location and number of azasugar derivatives. Although no specific rule was found, oligonucleotides containing 4 or more azasugars showed relatively high antiviral activity. It was.

혈청이 첨가되지 않은 배지(Opti-MEM)에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 농도에 따른 HIV-1 증식 저해효과를 측정한 결과,서열번호 2,서열번호 11,서열번호 17,서열번호 22및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드의 경우에, 0.06 μM 이상의 농도에서 HIV-1의 증식을 효과적으로 억제하였다. 반면,서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 0.1 μM의 농도까지 전혀 항 바이러스 효과를 보이지 않았다(도 2).As a result of measuring the HIV-1 proliferation inhibitory effect according to the concentration of the oligonucleotide of the present invention in a medium without serum (Opti-MEM), SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: 22, and SEQ ID NO: In the case of 29 oligonucleotides, the proliferation of HIV-1 was effectively inhibited at concentrations of 0.06 μM or more. On the other hand, the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 showed no antiviral effect at all to a concentration of 0.1 μM ( FIG. 2 ).

표 2및표 3의 결과에서 대조군으로 올리고뉴클레오타이드를 첨가하지 않은 경우를 비교해 보면, 혈청이 첨가된 경우에 신시티움이 2-3일 일찍 나타나며 생성되는 신시티움의 수도 더 많은 것을 볼 때 혈청이 첨가될 때 HIV-1 바이러스의 증식이 더 빨리 일어남을 알 수 있었다. In the results of Table 2 and Table 3 , when the oligonucleotide was not added as a control group, when the serum was added, syntium appeared 2-3 days earlier and the number of generated syntium was higher. It was found that the addition of HIV-1 virus occurred faster.

한편, 혈청이 첨가된 상태에서 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성은서열번호 2,서열번호 11및서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 혈청이 없을 때에 비해 활성이 다소 떨어지는 것을 발견하였으나서열번호 22및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 혈청 첨가 여부에 별로 영향을 받지 않음을 확인하였다. 또한, 이들 5종의 올리고뉴클레오타이드 모두 혈청 존재하에서도 0.1 μM 농도에서 비교군으로 사용된 AZT보다 항 바이러스 효과가 뛰어남을 알 수 있었다. 혈청 존재하에서 올리고뉴클레오타이드의 농도별 항 바이러스 활성을 감염 후 처음 신시티움이 관찰되는 날짜로 조사한 후 그 결과를 하기표 4에 요약하였다.On the other hand, the antiviral activity of the oligonucleotides in the presence of serum was found to be somewhat less active than in the case of the oligonucleotides of SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 17 compared to the absence of serum, but SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: In the case of the oligonucleotide of 29 , it was confirmed that it was not affected by the addition of serum. In addition, all of these five oligonucleotides were found to be superior to the antiviral effect than the AZT used in the comparison group at the concentration of 0.1 μM even in the presence of serum. Antiviral activity by concentration of oligonucleotides in the presence of serum was investigated on the date when synthium was first observed after infection and the results are summarized in Table 4 below.

혈청 존재 하에서 올리고뉴클레오타이드의 농도별 항 바이러스 활성Antiviral Activity by Concentration of Oligonucleotides in the Presence of Serum 시료AS 농도Sample AS Concentration 감염 후 경과일* Days Since Infection * 서열 번호 2SEQ ID NO: 2 서열 번호 4SEQ ID NO: 4 서열 번호 11SEQ ID NO: 11 서열 번호 17SEQ ID NO: 17 서열 번호 18SEQ ID NO: 18 서열 번호 19SEQ ID NO: 19 서열 번호 20SEQ ID NO: 20 서열 번호 21SEQ ID NO: 21 서열 번호 22SEQ ID NO: 22 서열 번호 23SEQ ID NO: 23 서열 번호 28SEQ ID NO: 28 0 μM0 μM 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 0.015 μM0.015 μM 55 2~32 ~ 3 55 33 55 33 55 33 66 44 66 0.03 μM0.03 μM 55 22 55 66 44 4~54 ~ 5 55 33 6∼76 to 7 55 6∼76 to 7 0.06 μM0.06 μM 55 2∼32-3 66 6~76 ~ 7 55 55 6∼76 to 7 6∼76 to 7 6∼76 to 7 55 77 0.125 μM0.125 μM 66 2∼32-3 66 88 99 6∼76 to 7 88 8∼98 to 9 99 77 99 0.25 μM0.25 μM 8∼98 to 9 22 88 8∼98 to 9 -- 1111 -- 1111 -- 8∼98 to 9 1111 0.5 μM0.5 μM 99 2∼32-3 9∼109-10 1111 -- -- -- -- -- -- -- 1 μM1 μM -- 33 -- -- -- -- -- -- -- -- --

* : Jurkat-tat 세포에 HXBc2/Δtat 바이러스를 감염 후 10%의 소태아 혈청이 첨가된 배지(RPMI1640-10% FBS)에서 각 올리고뉴클레오타이드를 농도별로 첨가한 상태에서 최초로 신시티움이 관찰된 날.*: Day after first synthium was observed with each oligonucleotide concentration added in medium (RPMI1640-10% FBS) in which 10% fetal bovine serum was added after infection of Jurkat-tat cells with HXBc2 / Δtat virus. .

그 결과, 올리고뉴클레오타이드를 처리하지 않은 대조군의 경우 감염 3일째에 모두 신시티움이 관찰되었으나서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드를 처리한 세포에서는 0.015 μM에서도 HIV 증식이 현저히 억제되어 6일째 처음 신시티움이발견되었으며 0.25 μM 이상에서는 신시티움이 생성되지 않았다.서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드와 함께 HIV 유전자 서열과 상관없는 올리고뉴클레오타이드군들 중서열번호 20,서열번호 21및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드와 HIV-1 TAR 유전자의 안티센스 서열을 가진 것 중서열번호 11및서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드가 0.06 μM 농도에서 HIV-1 증식을 효과적으로 억제하였으며 이들이 바이러스 증식을 완전히 차단하는데는 0.5 μM 이상의 농도가 필요하였다.서열번호 18의 올리고뉴클레오타이드의 경우 EC50값은서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드보다 높게(0.12 μM) 나타났으나 바이러스 증식을 완전히 차단하는데는 0.25 μM이 필요한 것으로 나타나 오히려서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드보다 효과적인 것으로 보였다.서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 혈청이 없는 배지(Opti-MEM)에서는 0.1 μM 정도에서서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드와 비슷한 항 바이러스 활성을 보였으나 혈청이 첨가된 배지에서는 활성이 현저히 떨어져 0.125 μM 이상에서서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드의 0.015 μM과 비슷한 항 바이러스 활성을 보였다.As a result, in the control group not treated with oligonucleotide, all synthium was observed on the 3rd day of infection, but in the cells treated with the oligonucleotide of SEQ ID NO: 22 , HIV proliferation was significantly suppressed even at 0.015 μM, and thus, the first synthium was detected on the 6th day. No syntium was produced above 0.25 μM. SEQ ID NO: 11 of the oligonucleotide groups SEQ ID NO: 20 , SEQ ID NO: 21, and SEQ ID NO: 29 and the antisense sequences of the HIV-1 TAR gene with the oligonucleotide of SEQ ID NO: 22 together with the oligonucleotide of SEQ ID NO: The oligonucleotide of SEQ ID NO: 17 effectively inhibited HIV-1 proliferation at a concentration of 0.06 μM and a concentration of 0.5 μM or more was required for them to completely block virus proliferation. In the case of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 18, the EC 50 value was higher than the oligonucleotide of SEQ ID NO: 17 (0.12 μM), but 0.25 μM was required to completely block virus growth, indicating that it was more effective than the oligonucleotide of SEQ ID NO: 17 . Seemed. The oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 showed antiviral activity similar to the oligonucleotide of SEQ ID NO: 22 at about 0.1 μM in the medium without serum (Opti-MEM), but the activity was significantly lower than 0.125 μM in the medium added with serum. Showed antiviral activity similar to 0.015 μM of the oligonucleotide of SEQ ID NO .

상기 결과로부터 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 혈청에 의해 영향을 받는 정도가 유전자 서열에 따라 일정하지 않음을 시사해 주며, 이 경우 혈청의 농도에 따라서도 활성이 달라질 가능성이 있으므로 혈청의 농도별로 이들 올리고뉴클레오타이드의 활성에 미치는 영향을 조사하여 그 결과를 하기표 5에 요약하였다.The above results suggest that the degree of the influence of the oligonucleotides of the present invention by the serum is not constant according to the gene sequence.In this case, since the activity may vary depending on the concentration of the serum, these oligonucleotides by the concentration of the serum The effect on the activity of was investigated and the results are summarized in Table 5 below.

올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 효과에 대한 혈청의 저해효과Inhibitory Effect of Serum on Antiviral Effects of Oligonucleotides 시료효능혈청의종류 및 농도** Efficacy of the sample type and concentration of serum ** 감염후 경과일* Days after infection * 대조군Control 서열 번호 2SEQ ID NO: 2 서열 번호 4SEQ ID NO: 4 서열 번호 11SEQ ID NO: 11 서열 번호 20SEQ ID NO: 20 서열 번호 22SEQ ID NO: 22 서열 번호 29SEQ ID NO: 29 FBSFBS 0 %0 % 44 88 44 88 88 88 88 5 %5% 33 55 22 66 77 88 88 10 %10% 33 55 22 66 77 88 7∼87-8 50 %50% 33 55 22 5∼65 to 6 6∼76 to 7 7∼87-8 7∼87-8 Human serum 10%Human serum 10% 33 55 22 66 77 88 88 Horse serum 10%Horse serum 10% 33 55 22 66 77 88 88

* 여러 종류 및 농도의 혈청 존재하에서 HIV-1 감염 후 최초로 신시티움이 발견되는 날짜.* Date of first discovery of syntium after HIV-1 infection in the presence of different types and concentrations of serum.

** 혈청이 첨가되지 않은 경우는 Opti-MEM 배지를 사용하였으며 혈청이 첨가된 경우는 RPMI 배지를 사용.** If serum was not added, Opti-MEM medium was used. If serum was added, RPMI medium was used.

*** 올리고뉴클레오타이드의 농도 ; 0.1 μM.*** concentration of oligonucleotides; 0.1 μM.

그 결과, 혈청의 종류나 농도와는 크게 상관없이 각 올리고뉴클레오타이드의 종류별로 혈청의 존재 유무에 따라 활성에 영향을 받는 정도는 일정하였으며 이들 중서열번호 22및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드가 혈청의 존재 유무에 영향을 가장 적게 받는 것으로 나타났다.서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드는 혈청 첨가시 다른 올리고뉴클레오타이드에 비해 활성이 현저히 떨어지는 것으로 나타났다. 상기의 결과는 본 발명의서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드를 AIDS 환자에 투여하여도 항 바이러스 성질을 그대로 유지할 수 있음을 시사해 준다.As a result, irrespective of the type or concentration of serum, the degree of effect of activity was constant depending on the presence or absence of serum for each type of oligonucleotide, and among them, oligonucleotides of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 29 were present in serum. It was found to be least affected by the presence or absence. The oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 was found to be significantly less active than other oligonucleotides upon serum addition. The above results suggest that even when the oligonucleotide of SEQ ID NO: 22 of the present invention is administered to an AIDS patient, antiviral properties can be maintained.

<1-2> 역전사 효소활성 측정(reverse transcriptase assay)<1-2> Reverse Transcriptase Assay

Jurkat-Tat 세포에 상기 실험예 <1-1>과 같이 HXBc2/Δtat 바이러스를 감염시키고 3일 간격으로 세포를 포함한 배양액의 2/3를 수획하였다. 수획한 배양액만큼의 새 배양액을 용기에 첨가하여 지속적으로 배양하고 이로부터 수획한 배양액을 1분간 강하게 볼텍싱(vortexing)한 다음 15000 rpm에서 10초간 원심분리하여 세포 파쇄물을 제거하였다.Jurkat-Tat cells were infected with HXBc2 / Δtat virus as in Experimental Example <1-1>, and two-thirds of the culture solution containing the cells was harvested every three days. As much culture medium as the collected culture medium was added to the container to continuously incubate, and the culture medium collected therefrom was strongly vortexed for 1 minute, and then centrifuged at 15000 rpm for 10 seconds to remove cell debris.

역전사효소 활성은 기존의 방법을 변형시켜 측정하였다. 상등액을 새 용기에 옮기고 용액의 1/2에 해당하는 PEG/NaCl 용액(30% PEG in 0.4 M NaCl)을 첨가하여 잘 혼합한 후 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였다. 상기 용액을 15000 rpm에서 45분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후 바이러스 침전물에 분해 완충액(0.25% Triton X-100, 20% glycerol, 50 mM Tris-HCl 7.5, 0.1% DTT, 250 mM KCl) 10 ㎕를 첨가하여 침전물을 완전히 용해시켰다. 여기에 드라이아이스/에탄올 용액을 첨가하여 37℃ 항온수조에서 3회 얼림/녹임을 반복하여 침전물을 파쇄한 다음 각 용기에 50 ㎕씩 역전사효소 반응용액(1 unit/㎕ of RNasin, 1 uCi of3H-TTP, 0.025 unit Poly(A)-(dT), 50 μM Tris-HCl 7.5, 5 mM DTT, 0.1% Triton X-100)을 첨가하고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 전 용액을 DE51 필터용지(Whatman)에 흡착시켜 건조시킨 다음 2X SSC 용액(3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate, pH 7.0)으로 3회 세척하고 95% 에탄올 용액으로 2회 세척한 후 건조시켰다. 상기 필터 용지를방사선 측정용기(scintillation vial)에 넣고 3-5 ㎖ 정도의 방사선 측정용 칵테일을 첨가한 후 방사능 측정기(liquid scintillation counter)에서 삽입된 방사선 양을 측정하였고 그 결과를도 3및도 4에 나타내었다.Reverse transcriptase activity was measured by modifying existing methods. The supernatant was transferred to a new container and mixed well by adding a PEG / NaCl solution (30% PEG in 0.4 M NaCl) corresponding to 1/2 of the solution, and left overnight at 4 ° C. The solution was centrifuged at 15000 rpm for 45 minutes to remove the supernatant and 10 μl of digestion buffer (0.25% Triton X-100, 20% glycerol, 50 mM Tris-HCl 7.5, 0.1% DTT, 250 mM KCl) was added to the virus precipitate. Addition completely dissolved the precipitate. Dry ice / ethanol solution was added thereto, and the precipitate was crushed by freezing / melting three times in a constant temperature water bath at 37 ° C., and then 50 μl of the reverse transcriptase reaction solution (1 unit / μl of RNasin, 1 uCi of 3) was added to each vessel. H-TTP, 0.025 unit Poly (A)-(dT), 50 μM Tris-HCl 7.5, 5 mM DTT, 0.1% Triton X-100) were added and reacted at 37 ° C for 1 hour. After the reaction, the whole solution was adsorbed onto DE51 filter paper (Whatman) and dried, washed three times with 2X SSC solution (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate, pH 7.0), twice with 95% ethanol solution and dried. . The filter paper was placed in a scintillation vial, a cocktail for measuring radiation of 3-5 ml was added, and then the amount of radiation inserted in the liquid scintillation counter was measured . The results are shown in FIGS. 3 and 4. Shown in

그 결과,도 3및도 4에 나타낸 바와 같이 바이러스가 감염된 세포를 혈청이 첨가되지 않은 배지(Opti-MEM)에서 배양하면서 역전사효소 활성을 측정한 경우에는 6일이 지난 후부터 12일까지 시료 내의 역전사효소 활성이 급격하게 증가하였고 12일이 지난 후 다시 효소활성이 감소해서 이후 일정하게 유지되었다. 반면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(서열번호 2및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드)가 0.5 μM의 농도로 첨가된 상태에서 배양된 세포의 경우에는 시료내의 역전사효소 활성이 접종한 후 18일째까지 전혀 증가하지 않았다(도 3).As a result, as shown in FIGS . 3 and 4 , if the virus-infected cells were cultured in a medium without serum (Opti-MEM) and reverse transcriptase activity was measured, reverse transcription in the sample was performed after 6 days to 12 days. Enzyme activity rapidly increased and after 12 days the enzyme activity decreased again and then remained constant. On the other hand, in the case of cells cultured with the oligonucleotides of the present invention (the oligonucleotides of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 22 ) added at a concentration of 0.5 μM, the reverse transcriptase activity in the sample did not increase until 18 days after inoculation. ( FIG. 3 ).

상기 결과로부터 본 발명의 올리고뉴클레오타이드에 의해 감염된 세포에서 HIV-1의 증식이 완전히 억제되었음을 확인할 수 있었다.From the above results, it was confirmed that the proliferation of HIV-1 was completely inhibited in the cells infected with the oligonucleotide of the present invention.

또한, 혈청이 첨가된 배지에서도 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(서열번호 2,서열번호 17,서열번호 20및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드)의 HIV-1 역전사효소 활성 억제효과는 혈청이 없는 배지에서와 비슷한 결과를 보여 주었다(도 4). 그러나, 기존에 발표된 P=S 결합만으로 이루어진 올리고뉴클레오타이드인서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드의 경우는 동일 농도에서 대조군보다 더 빨리 역전사효소 활성이 나타났으며 항 바이러스 활성은 없는 것으로 나타났다.In addition, the inhibitory effect of the HIV-1 reverse transcriptase activity of the oligonucleotides ( SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 22 ) of the present invention in the medium to which serum was added was similar to that in the medium without serum. The results were shown ( FIG. 4 ). However, the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 , which is an oligonucleotide consisting only of P = S bonds, showed reverse transcriptase activity faster than the control at the same concentration and no antiviral activity.

<실험예 2> 올리고뉴클레오타이드의 다양한 HIV-1 주에 대한 항 바이러스 활성 조사Experimental Example 2 Investigation of Antiviral Activity of Oligonucleotides Against Various HIV-1 strains

Tat 활성을 제거한 HIV-1 실험실 주인 HXBc2/Δtat(tat-defective HIV-1 strain) 바이러스 외에 야생주인 IIIB 주(미국 NIH 에이즈 Research and Reference Reagent Program에서 분양) 및 재조합의 맹독성 균주인 SHIV89.6주(미국 NIH 에이즈 Research and Reference Reagent Program에서 플라스미드 형태(p89.6)로 분주받아 제시된 방법대로 C8166 세포에 형질감염시켜 바이러스를 수획)에 대해서도 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 항 바이러스 활성을 나타내는지를 조사하였다.In addition to the HIV-1 laboratory host HXBc2 / Δtat (tat-defective HIV-1 strain) virus with no tat activity, wild strain IIIB strain (available from the NIH AIDS Research and Reference Reagent Program) and SHIV 89.6 strain, a recombinant virulent strain (US) The oligonucleotides of the present invention were also tested for antiviral activity in the plasmid form (p89.6) of the NIH AIDS Research and Reference Reagent Program and transfecting C8166 cells according to the proposed method.

SHIV89.6바이러스 주는 C8166 세포(미국 NIH 에이즈 Research and Reference Reagent Program에서 분주받음)에 실험예 <1-1>의 방법대로 감염시키고 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 최종 농도 0.2 μM 및 0.5 μM 처리 후 시간이 지나면서 형성되는 신시티아의 수를 관찰하였고 그 결과를 하기표 6에 나타내었다.The SHIV 89.6 virus line was infected with C8166 cells (dispensed from the US NIH AIDS Research and Reference Reagent Program) according to the method of Experimental Example <1-1>, and the oligonucleotides of the present invention were treated after a final concentration of 0.2 μM and 0.5 μM. The number of Cynthia is formed while observing the results are shown in Table 6 below.

올리고뉴클레오타이드의 SHIV89.6바이러스에 대한 항 바이러스 활성Antiviral Activity of Oligonucleotides Against SHIV 89.6 Virus 시 료sample 감염후날짜농도. Date concentration after infection. 1One 22 33 44 55 66 77 대조군Control no ASno AS -- +/-+/- ++ ++++ ++++++++ ++++++++++ ++++++++++ 서열번호 2SEQ ID NO: 2 0.2 μM0.2 μM -- -- -- +/-+/- ++ ++++ ++++++++ 0.5 μM0.5 μM -- -- -- -- -- -- -- 서열번호 4SEQ ID NO: 4 0.2 μM0.2 μM -- +/-+/- ++++ ++++++++ ++++++++++ ++++++++++ ++++++++++ 0.5 μM0.5 μM -- +/-+/- ++++ ++++++++ ++++++++++ ++++++++++ ++++++++++ 서열번호 17SEQ ID NO: 17 0.2 μM0.2 μM -- -- -- +/-+/- ++ ++++++ ++++++++ 0.5 μM0.5 μM -- -- -- -- -- -- -- 서열번호 20SEQ ID NO: 20 0.2 μM0.2 μM -- -- -- -- -- -- -- 0.5 μM0.5 μM -- -- -- -- -- -- -- 서열번호 22SEQ ID NO: 22 0.2 μM0.2 μM -- -- -- -- -- -- -- 0.5 μM0.5 μM -- -- -- -- -- -- --

* 신시티아 개수; -: 없음, +/-: <10 , +: >20, ++: >40, +++: >60, ++++: >80, +++++: >100Cynthia counts; -: None, +/-: <10, +:> 20, ++:> 40, +++:> 60, ++++:> 80, +++++:> 100

표 6에 나타낸 바와 같이,서열번호 20및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드(서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드도 동일한 결과를 보임)은 0.2 μM 에서도 7일 동안 전혀 신시티아 형성이 관찰되지 않았으며서열번호 2및서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드의 경우 0.5 μM에서는 신시티아 형성이 관찰되지 않았으나 0.2 μM에서는 4일째부터 신시티아 형성이 관찰되었으며 시간이 지날수록 갯수가 증가하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드를 처리한 경우 2일째부터 신시티아가 관찰되기 시작하여 그 이후 갯수가 급속히 증가하였으며 특히서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드의 경우는 실험실 주인 HXBc2/Δtat에서 나타난 것과 비슷한 양상으로 대조군 보다 오히려 신시시아 형성이 현저히 빠르게 나타났다(표 6).As shown in Table 6, the oligonucleotide of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 22 oligonucleotide (oligonucleotide of SEQ ID NO: 29, nucleotides also show the same results) it was not at all synthesizer thiazol formation observed for at 0.2 μM 7 il SEQ ID NO: 2 and In the case of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 17 , Cynthiatia formation was not observed at 0.5 μM, but Cynthiatia formation was observed at 0.2 μM from day 4 and the number increased with time. In the case of the control without the sample and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 , Cynthiatia was observed from the second day, and the number increased rapidly thereafter. In particular, the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 in the laboratory host HXBc2 / Δtat In a similar manner to the one shown, the formation of Cynthia was significantly faster than that of the control group ( Table 6 ).

또한, 상기와 동일한 실험을 HIV-1 IIIB/MT-4 세포(미국 NIH 에이즈 Research and Reference Reagent Program에서 분주받음) 및 SHIV89.6/C8166에서 진행하고 4일 후 바이러스에 의해 파괴되고 남은 세포를 MTT 분석법으로 조사하여 대조군에 비해 바이러스 증식을 50% 저해하는 시료의 농도인 EC50값을 결정하였고 이를 HXBc2/Δtat/Jurkat-Tat에서 얻은 결과와 함께 하기표 7에 나타내었다.In addition, the same experiment as above was performed on HIV-1 IIIB / MT-4 cells (dispensed from the US NIH AIDS Research and Reference Reagent Program) and SHIV 89.6 / C8166, and after 4 days, cells left after being destroyed by the virus were analyzed by MTT assay. The EC 50 value, which is the concentration of the sample which inhibits the virus growth by 50% compared to the control group, was determined and is shown in Table 7 together with the results obtained in HXBc2 / Δtat / Jurkat-Tat.

올리고뉴클레오타이드의 여러 HIV-1 주에 대한 항 바이러스 활성Antiviral Activity of Oligonucleotides Against Several HIV-1 Weeks 시료바이러스/숙주Sample Virus / Host EC50(μM)EC 50 (μM) 서열번호 2SEQ ID NO: 2 서열번호 4SEQ ID NO: 4 서열번호 17SEQ ID NO: 17 서열번호 20SEQ ID NO: 20 서열번호 22SEQ ID NO: 22 서열번호 29SEQ ID NO: 29 AZTAZT ddCddC ddIddI HXBc2/Δtat /Jurkat-TatHXBc2 / Δtat / Jurkat-Tat 0.120.12 >10> 10 0.060.06 0.080.08 0.050.05 0.080.08 0.010.01 ND* ND * NDND HIV-1 IIIB/MT-4HIV-1 IIIB / MT-4 0.130.13 >2.0> 2.0 0.140.14 0.100.10 0.080.08 0.120.12 0.0070.007 0.6590.659 35.935.9 SHIV89.6p/C8166SHIV 89.6 p / C8166 0.230.23 >2.0> 2.0 0.160.16 0.120.12 0.100.10 0.160.16 >400> 400 2.6732.673 70.770.7

* ND ; 실험을 수행하지 않음.* ND; Do not perform experiments.

그 결과, 올리고뉴클레오타이드 중 실험실 주에 대해 효과가 있던서열번호 2,서열번호 17,서열번호 20,서열번호 22및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드 시료들은(0.05 μM < EC50< 0.12 μM) 독성주인 HIV-1 IIIB 및 HIV-189.6p 바이러스 주에 대해서도 효과적인 항 바이러스 활성을 나타내었으며(0.08 μM < EC50<0.23 μM) 이들 중서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드가 가장 효과적임을 확인하였다. 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 ddC 및 ddI와 같은 다른 핵산 유도체들에 비해서는 항 바이러스 활성이 월등히 뛰어난 것으로 나타났다.As a result, oligonucleotide samples of SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: 20 , SEQ ID NO: 22, and SEQ ID NO: 29 which were effective against the laboratory strain among the oligonucleotides (0.05 μM <EC 50 <0.12 μM) were toxic to HIV The antiviral activity was also shown to be effective against the -1 IIIB and HIV-1 89.6 p virus strains (0.08 μM <EC 50 <0.23 μM). Among them, the oligonucleotide of SEQ ID NO: 22 was found to be the most effective. In addition, the oligonucleotides of the present invention have been shown to have superior antiviral activity compared to other nucleic acid derivatives such as ddC and ddI.

한편 대조군으로 에이즈 치료제로 널리 쓰이는 AZT(Sigma, 삼천리제약)의 항바이러스 활성을 조사한 결과, HXBc2/Δtat 및 IIIB 주에 대해 단기적으로는 올리고뉴클레오타이드에 비해 10배 이상 효과적이었으나(감염 4일 후 MTT 분석 결과), 1회 처리 후 추가 투여 없이 9 내지 12일간의 장기적인 항 바이러스 활성은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 AZT보다 오히려 우수하였다(표 2 및 표 3). 또한 AZT는 SHIV-189.6p 바이러스 주에 대해서는 전혀 항 바이러스 활성을 나타내지 못하였다.On the other hand, the antiviral activity of AZT (Sigma, Samchully Pharm.), Which is widely used as a control for HIV, was 10 times more effective than oligonucleotides in the short-term for HXBc2 / Δtat and IIIB strains (MTT analysis after 4 days of infection). As a result, the long-term antiviral activity of 9 to 12 days without further administration after one treatment was superior to the oligonucleotides of the present invention rather than AZT ( Table 2 and Table 3 ). AZT also showed no antiviral activity against the SHIV-1 89.6 p virus strain.

상기의 결과는 올리고뉴클레오타이드가 AZT보다 안정하여 배지에서 비교적 오래 활성을 유지하기 때문으로 생각되며 또한 AZT가 작용하지 못하는 SHIV89.6에 대해서도 효과적인 항 바이러스 활성을 나타내는 것으로 보아 HIV-1의 변이주에 대해서 폭넓게 작용할 수 있어 기존 AIDS 치료제에 대해 내성을 보이는 환자의 치료에도 효과가 좋을 것으로 기대된다.These results suggest that oligonucleotides are more stable than AZT and thus retain their activity in the medium for a relatively long time. They also show effective antiviral activity against SHIV 89.6 , where AZT is inactive, which may act broadly against HIV-1 strains. It is expected to be effective in the treatment of patients who are resistant to existing AIDS therapeutics.

<실험예 3> 올리고뉴클레오타이드의 세포독성 실험Experimental Example 3 Cytotoxicity Experiment of Oligonucleotide

본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 세포독성을 확인하기 위하여 하기와 같은실험을 수행하였다.In order to confirm the cytotoxicity of the oligonucleotide of the present invention, the following experiment was performed.

본 발명의 세포독성을 확인하기 위하여 미국 NIH의 에이즈 Research and Reference Reagent Program에서 공급받은 C8166, 174xCEM 및 MT-4 세포와 ATCC에서 구입한 HeLa(ATCC CCL 2), Jurkat E6(TIB 152), Vero(CCL 81) 및 U-937(CRL 1593) 세포를 사용하였다. 올리고뉴클레오타이드에 대한 세포독성 실험은 이들 시료를 각 세포에 처리하고 4일 후 생존하는 세포의 양을 측정하여 비교하였다. 생존하는 세포의 양은 기존의 MTT 분석법을 조금 변형시켜 측정하였다. 96-웰 미세정량 플레이트(96-well microtiter plate)에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)이 함유된 RPMI1640(RPMI 10%) 배양액을 200 ㎕되게 채우고 각 웰당 1×105MT-4 세포와 여러 농도(0 μM부터 100 μM까지)의 올리고뉴클레오타이드를 각각 섞어 4일간 배양하였다. 각 웰에 MTT 용액(PBS에 MTT[Sigma Chem Co.]를 7.5 ㎎/㎖ 농도로 준비하여 4℃에 보관한 것) 10 ㎕를 첨가한 후 37℃에서 4시간 더 배양하고 각 웰로부터 상등액을 조심스럽게 제거한 한 다음 최종 30 ㎕ 정도의 잔여 용액이 있는 상태에서 이소프로판올(isopropanol)에 0.04 M 농도로 용해되어 있는 HCl 용액 100 ㎕을 첨가하였다. 이를 상온에서 5분간 방치한 후 570 nm 파장에서 효소항체 면역 분석기(ELISA)로 흡광도를 측정하여 생존 세포의 양을 조사함으로써 각 올리고뉴클레오타이드의 세포독성 정도를 결정하였다. 세포독성 정도는 올리고뉴클레오타이드를 처리하지 않은 대조군의 흡광도를 100%로 보았을 때 흡광도가 50% 이하로 떨어지는 시료의 양(CC50)으로 표시하였으며, 이 양이 100 μM 이상인 경우 그 이상의 농도에서는 독성을 측정하지 않았다. 실험결과 나타난 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 세포독성을 하기표 8에 요약하였다.To confirm the cytotoxicity of the present invention, HeLa (ATCC CCL 2), Jurkat E6 (TIB 152), Vero (purchased from ATCC and C8166, 174xCEM and MT-4 cells supplied from the AIDS Research and Reference Reagent Program of NIH, USA). CCL 81) and U-937 (CRL 1593) cells were used. Cytotoxicity experiments on oligonucleotides were compared by measuring the amount of viable cells 4 days after these samples were treated to each cell. The amount of viable cells was measured by slightly modifying the existing MTT assay. Fill a 96-well microtiter plate with 200 μl of RPMI1640 (RPMI 10%) containing 10% fetal bovine serum, and add 1 × 10 5 MT-4 cells per well. Oligonucleotides of various concentrations (0 μM to 100 μM) were mixed and incubated for 4 days. 10 μl of MTT solution (prepared with 7.5 mg / ml MTT [Sigma Chem Co.] in PBS and stored at 4 ° C.) was added to each well, followed by further incubation at 37 ° C. for 4 hours. After careful removal, 100 μl of HCl solution dissolved in isopropanol at a concentration of 0.04 M was added to the final solution of about 30 μl. After standing for 5 minutes at room temperature, the degree of cytotoxicity of each oligonucleotide was determined by investigating the amount of viable cells by measuring the absorbance at 570 nm with an enzyme antibody immunoassay (ELISA). The degree of cytotoxicity was expressed as the amount of the sample whose absorbance falls below 50% (CC 50 ) when the absorbance of the control group without oligonucleotides was treated as 100%. Not measured. The cytotoxicity of the antisense oligonucleotides shown in the experiments is summarized in Table 8 below.

여러 세포에서 올리고뉴클레오타이드의 세포독성Cytotoxicity of Oligonucleotides in Multiple Cells 세포시료Cell sample CC50에 의한 세포독성(μM)Cytotoxic by CC 5 0 (μM) MT-4MT-4 JurkatJurkat C8166C8166 VeroVero CEMx174CEMx174 U937U937 HeLaHeLa 서열번호 2(ⓐ:3)SEQ ID NO: 2 (ⓐ: 3) >100> 100 8080 8080 >100> 100 >100> 100 4040 >100> 100 서열번호 4(ⓐ:0)SEQ ID NO: 4 (ⓐ: 0) >100> 100 8080 9090 6060 8080 2020 >100> 100 서열번호 11(ⓐ:4)SEQ ID NO: 11 (ⓐ: 4) >100> 100 >100> 100 6060 >100> 100 >100> 100 4040 >100> 100 서열번호 13(P=O)SEQ ID NO: 13 (P = O) 8080 >100> 100 >100> 100 >100> 100 >100> 100 >100> 100 >100> 100 서열번호 17(ⓐ:4)SEQ ID NO: 17 (ⓐ: 4) >100> 100 >100> 100 5555 >100> 100 >100> 100 4545 >100> 100 서열번호 20(ⓐ:4)SEQ ID NO: 20 (ⓐ: 4) >100> 100 >100> 100 >100> 100 >100> 100 >100> 100 4040 >100> 100 서열번호 22(ⓐ:5)SEQ ID NO: 22 (ⓐ: 5) >100> 100 >100> 100 >100> 100 8080 >100> 100 5050 >100> 100 서열번호 29(ⓐ:5)SEQ ID NO: 29 (ⓐ: 5) >100> 100 8080 >100> 100 8080 >100> 100 5050 >100> 100

* 괄호안은 각 올리고뉴클레오타이드에 포함된 육환의 아자슈거의 갯수.* The number in parentheses is the number of aza sugars in the ring contained in each oligonucleotide.

* CC50; 처리하지 않은 샘플에 비해 50%의 세포가 치사하는 시료의 농도.CC 50 ; Sample concentration at which 50% of cells die compared to untreated samples.

* 세포독성은 올리고뉴클레오타이드를 일정 배율로 희석하여 세포에 처리 후 4일째에 생존하는 세포의 수를 MTT 분석법으로 계산한 것임.* Cytotoxicity is obtained by diluting oligonucleotides at a certain magnification and calculating the number of cells surviving 4 days after treatment by MTT assay.

상기표 8의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 U937 세포를 제외하고는 대부분의 세포에서 CC50값이 50 μM 이상으로, CC50/EC50으로 표현되는 치료계수(TI, Therapeutic Index)(N. Jing et al,J. Biol. Chem., 275, 3421-3430, 2000)로 볼 때 거의 100 이상으로 나타났으며, 특히서열번호 22및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드의 경우 TI 값은 U937 세포에서도 최소한250 이상으로 나타났다. 약물에 있어 TI 값은 안전성을 나타내는 수치로 TI 값이 클수록 약물의 치료농도와 치사농도의 차이가 크므로, 상기 결과로부터 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 세포독성으로 인한 부작용은 없는 것으로 판단되었다.As can be seen from the results of Table 8 , the oligonucleotide of the present invention has a CC 50 value of 50 μM or more in most cells except U937 cells, the therapeutic coefficient expressed as CC 50 / EC 50 (TI, Therapeutic Index (N. Jing et al., J. Biol. Chem. , 275, 3421-3430, 2000), the value was almost 100 or more, especially for oligonucleotides of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 29 . At least 250 were also present in U937 cells. The TI value of the drug is a value indicating safety, and the larger the TI value, the larger the difference between the therapeutic concentration and the lethal concentration of the drug. From the above results, it was determined that there are no side effects due to the cytotoxicity of the oligonucleotide of the present invention.

<실험예 4> 올리고뉴클레오타이드의 안정성 조사Experimental Example 4 Investigation of Stability of Oligonucleotides

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 안정성을 조사하기 위하여, 10% 소태아혈청이 첨가된 RPMI1640 배지 중 세포배양 후 수거한 상청액과(도 5) 세포 배양에 사용되지 않은 신선한 배지(도 6)에 최종농도 13 μM이 되도록 올리고뉴클레오타이드를 첨가하여 37℃ CO2배양기에 보존하였다. 세포 배양에 사용된 상청액의 경우에는 용액에 핵산 분해효소들이 많을 것으로 간주하여 0, 1, 2 시간 및 1, 2, 4, 6 일에서, 그리고 세포 배양에 사용되지 않은 신선한 배지에서는 0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15일에 10 ㎕씩 수획하여 20% SDS-PAGE 젤에서 전기영동하고 젤을 EtBr 용액으로 염색하여 올리고뉴클레오타이드가 분해되는 정도를 조사함으로써 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 안정성을 결정하였다.In order to investigate the stability of the antisense oligonucleotide of the present invention, the final concentration in the supernatant collected after cell culture in RPMI1640 medium to which 10% fetal bovine serum was added ( FIG. 5 ) and the final concentration in fresh medium not used for cell culture ( FIG. 6 ). Oligonucleotides were added to 13 μM and stored in 37 ° C. CO 2 incubator. For supernatants used for cell culture, the solution is considered to be high in nucleases at 0, 1, 2 hours and 1, 2, 4, 6 days, and 0, 1, 1 for fresh medium not used for cell culture. 10 μl was collected on 2, 3, 6, 9, 12, and 15 days, followed by electrophoresis on a 20% SDS-PAGE gel and staining the gel with EtBr solution to investigate the degree of degradation of the oligonucleotides of the present invention. Stability was determined.

그 결과,도 5에 나타난 바와 같이 세포 배양에 사용된 배지에서는 P=O 결합만으로 구성되고 6환의 아자슈거가 없는 올리고뉴클레오타이드인서열번호 13의 올리고뉴클레오타이드의 경우 세포에 의해서 분비되는 여러 가지 분해효소들에 의해 2시간 이내에 올리고뉴클레오타이드가 완전히 분해되었으나, P=S 결합으로 이루어진서열번호 2또는서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드 뿐 아니라 P=O 결합이지만 6환의 아자슈거 구조를 가진서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드의 경우 모두 세포배양 상청액에서 6일 이상 분해되지 않을 정도로 안정함을 확인하였다. 이는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 사람에 투여하여도 체내에서 상당기간 분해되지 않고 약효가 지속될 수 있음을 시사해 준다. 특히 P=O 결합이 매우 불안정한데 비하여 18개의 뉴클레오타이드 중 6환의 아자슈거가 3개만 포함되어도 안정성을 나타낸다는 것은 특기할 만한 사실이며 앞으로 안티센스의 안정성 연구에 필요한 좋은 자료가 될 것이다.As a result, as shown in FIG . 5 , in the medium used for cell culture, various degradation enzymes secreted by cells in the case of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 13 , which is composed of only P═O bonds and lacks 6 rings of azasugar, The oligonucleotide was completely degraded within 2 hours by, but in the case of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 consisting of P = S bonds, as well as the oligonucleotide of SEQ ID NO: 5 having a P = O bond but having a 6-ring azasugar structure All were confirmed to be stable enough not to decompose more than 6 days in the cell culture supernatant. This suggests that even when the oligonucleotide of the present invention is administered to humans, the drug can be sustained without being degraded for a long time in the body. In particular, the P = O bond is very unstable, and the stability of the six cyclic azasugars among 18 nucleotides is remarkable, and it will be a good data for antisense stability studies.

한편,도 6에서와 같이 10% 소 혈청이 포함된 신선한 배지에서는 본 발명의서열번호 2및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드 모두 15일 이상 안정성을 유지함을 알 수 있었다. 상기 결과는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 인체에서 장기간 분해되지 않고 항 바이러스 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.On the other hand, in the fresh medium containing 10% bovine serum as shown in Figure 6 it was found that both the oligonucleotides of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 22 of the present invention maintained stability for more than 15 days. The results suggest that the oligonucleotides of the present invention may exhibit antiviral effects without prolonged degradation in the human body.

<실험예 5> 올리고뉴클레오타이드의 세포막 투과여부 및 세포내 항 바이러스 활성 측정Experimental Example 5 Measurement of Cellular Permeability and Intracellular Antiviral Activity of Oligonucleotide

<5-1> 올리고뉴클레오타이드의 세포막 투과능 측정<5-1> Measurement of cell membrane permeability of oligonucleotide

올리고뉴클레오타이드의 세포막 투과능을 측정하기 위하여, MAGI 세포(LTR-β-갈락토시다제[galactosidase] 유전자를 가진 HeLa 세포로 외부에서 Tat 단백질이 들어오면 LTR 프로모터[promoter]가 Tat에 의해 활성화되어 β-갈락토시다제가발현되도록 고안된 세포)와 Tat 발현 벡터인 pSV2-Tat 플라스미드 및 LTR-CAT 플라스미드를 미국 NIH의 에이즈 Research and Reference Reagent Program에서 공급받아 사용하였다.In order to measure the cell membrane permeability of oligonucleotide, MATR cells (HeLa cells with LTR-β-galactosidase gene), when the Tat protein enters from the outside, the LTR promoter is activated by Tat and -Cells designed to express galactosidase) and pSV2-Tat plasmid and LTR-CAT plasmid, which are Tat expression vectors, were supplied from the AIDS Research and Reference Reagent Program of NIH, USA.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드에 의한 항 바이러스 활성이 세포막을 통과하여 세포내에서 일어나는지를 확인하기 위하여, 1×106MAGI 세포에 2 ㎍의 pSV2-Tat 플라스미드를 GenePorterTM키트(Gene Therapy Systerms, Inc. San Diego, CA, 미국)를 이용하여 형질감염시킨 후 배지에 올리고뉴클레오타이드를 최종농도 0.25 μM 되게 처리하거나(도 7의A), 2 μg의 pSV2-Tat 플라스미드와 여러 농도의 올리고뉴클레오타이드를 함께 형질감염시켰다(도 7의B). 형질감염 48시간 후 배지를 제거하고 세포에 1% 포름알데히드(formaldehyde)와 0.2% 글루탈알데히드(glutalaldehyde) 용액을 처리하여 5분간 고정하고 이를 인산염 완충용액으로 세척한 다음 0.04% X-gal 염색용액(인산염 완충용액에 최종농도 4 mM potassium ferricyanide, 2 mM MgCl2, 0.04% 5-bromo-4-chloro-3-indoryl-β-D-galactopyraoside를 포함)을 넣고 37℃에서 50분간 반응시켜 푸른색으로 염색되는 세포를 관찰하고 염색된 세포의 갯수를 세어 올리고뉴클레오타이드에 의한 LTR의/Tat의 활성억제 정도를 측정하였다(도 7).To determine whether antiviral activity by the oligonucleotides of the present invention occurs through the cell membrane and intracellularly, 2 μg of pSV2-Tat plasmid was added to 1 × 10 6 MAGI cells in a GenePorter ™ kit (Gene Therapy Systerms, Inc. San). after transfection using a Diego, CA, USA) up to the medium the oligonucleotide at a final concentration of pSV2-Tat plasmid with various concentrations of a) of 0.25 μM to be treated, or (Fig. 7, 2 μg were transfected with oligonucleotide with infection ( B of FIG. 7 ). After 48 hours of transfection, the medium was removed and the cells were treated with 1% formaldehyde and 0.2% glutalaldehyde solution, fixed for 5 minutes, washed with phosphate buffer, and then 0.04% X-gal stain solution. (Including the final concentration of 4 mM potassium ferricyanide, 2 mM MgCl 2 , 0.04% 5-bromo-4-chloro-3-indoryl-β-D-galactopyraoside in phosphate buffer solution) and reacted for 50 minutes at 37 ℃ blue The cells to be stained were observed and the number of stained cells was counted to determine the degree of inhibition of LTR / Tat activity by oligonucleotides ( FIG. 7 ).

그 결과,서열번호 2,서열번호 4및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드를 처리한 세포에서 파랗게 염색된 세포의 수가 대조군과 별 차이가 없는 것으로 보아 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 어느 경우도 배지에서 세포막을 통과하지 못하여 세포안의 LTR 활성을 억제하지 못하는 것으로 생각된다(도 7의A). 한편 세포 안으로 들어가서도 활성이 없기 때문에 상기와 같은 결과가 나올 가능성이 있으므로 이를 배제하기 위하여 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 pSV2-Tat(Tat 발현 벡터)와 동시 형질감염시키고 LTR/Tat 활성에 의해 세포내 β-갈락토시다제의 발현으로 푸른색을 띄게 되는 세포의 수를 조사한 결과, 6환의 아자슈거가 없는서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드는 LTR/Tat 활성을 억제하여 푸른색으로 염색되는 세포의 수가 현저히 줄어듬을 확인하였으나 6환의 아자슈거를 가진서열번호 2및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드의 경우는 푸른색을 띄는 세포의 개수가 대조군과 별차이가 없음을 관찰하였다(도 7의B).As a result, the number of blue stained cells in the cells treated with the oligonucleotides of SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 22 is not significantly different from that of the control group, so that the oligonucleotide of the present invention passes through the cell membrane in the medium in any case. It is thought that they do not inhibit LTR activity in cells ( A in FIG. 7 ). On the other hand, since there is a possibility that the above result is obtained even when entering into the cell, the oligonucleotide of the present invention is co-transfected with pSV2-Tat (Tat expression vector) and excluded by intracellular β by LTR / Tat activity. As a result of investigating the number of cells that became blue due to the expression of galactosidase, oligonucleotides of SEQ ID NO: 4 without 6 aza sugars inhibited LTR / Tat activity and significantly reduced the number of cells stained blue. However, in the case of oligonucleotides of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 22 having 6 azasugars, it was observed that the number of cells having blue color was not different from that of the control group ( B of FIG. 7 ).

상기 결과를 정량적으로 분석하기 위하여 2 ㎍의 pSV2-Tat 플라스미드와 여러 농도(0, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2.5 및 5 ㎍)의 올리고뉴클레오타이드를 동시에 형질감염시키고 48시간 후 세포를 고정하여 β-갈락토시다제를 발현하여 푸른색을 띄는 세포의 수를 세어 대조군 대비 백분율(%)로 나타내었다(도 8).To quantitatively analyze the results, 2 μg of pSV2-Tat plasmid and oligonucleotides of various concentrations (0, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2.5 and 5 μg) were simultaneously transfected and the cells were fixed after 48 hours to fix β -The number of blue-expressing cells expressing galactosidase was expressed as a percentage (%) compared to the control group ( FIG. 8 ).

그 결과,서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드은 세포 내로 주입 시 농도에 비례하여 LTR/Tat 활성을 억제하는 것을 확인하였으나, 배지에 처리하였을 때 항 바이러스 활성을 나타내는서열번호 2,서열번호 17및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드(서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드)을 세포 내로 주입 시에는 LTR/Tat의 활성을 억제하지 못하여 대조군과 비슷한 양상을 나타내었다. 상기의 결과는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 세포막을 투과하지 못하거나 혹은 항 바이러스 활성이 LTR에 특이적인 것이 아님을 시사한다. 이러한 결과는 본 발명의올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성이 세포내의 HIV-1 유전자 발현을 특이적으로 저해하여 나타나는 현상이 아니라 올리고뉴클레오타이드가 세포밖에서 단백질과 결합하여 바이러스의 부착을 방해함으로써 HIV-1 바이러스의 증식을 억제하기 때문인 것으로 해석된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 세포표면 단백질과의 결합 가능성은 몇몇 연구 결과에서도 이미 제시된 바 있다(P. Hawley et al.,Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 9, 61-69, 1999; P. Rockwell et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 6523-8, 1997; Hotoda H. et al.,J. Med.C hem., 41, 3655-3663, 1998; Jing N. et al.,J. Biol. Chem., 275, 3421,2000). 세포 표면에 작용하여 HIV-1에 대해 항 바이러스 활성을 나타낸다는 점에서는 기존의 보고된 안티센스 기작과 유사하나 6환의 아자슈거를 올리고뉴클레오타이드에 첨가하여 P=S 결합만으로 이루어진서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드보다 항 바이러스 활성이 월등히 뛰어나며 안전성 및 안정성을 현저히 증가시켰다는 점이 본 발명의 기술적 신규성이라 하겠다.As a result, it was confirmed that the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 inhibits LTR / Tat activity in proportion to the concentration at the time of injection into the cell, but the sequence of SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 22 showing antiviral activity when treated in the medium Injecting the oligonucleotide (oligonucleotide of SEQ ID NO: 29 ) into the cell did not inhibit the activity of LTR / Tat and showed a similar pattern to the control. The above results suggest that the oligonucleotides of the present invention do not penetrate the cell membrane or that the antiviral activity is not specific for LTR. These results indicate that the antiviral activity of the oligonucleotide of the present invention is not a phenomenon that specifically inhibits the expression of HIV-1 gene in cells, but that the oligonucleotide binds to proteins outside the cell and interferes with the adhesion of the virus. It is interpreted that this is because it suppresses proliferation. The possibility of binding antisense oligonucleotides to cell surface proteins has already been shown in several studies (P. Hawley et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. , 9, 61-69, 1999; P. Rockwell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 94, 6523-8, 1997; Hotoda H. et al., J. Med. Chem. , 41, 3655-3663, 1998; Jing N. et al., J. Biol. Chem. , 275, 3421, 2000). It is similar to the previously reported antisense mechanism in that it acts on the cell surface and exhibits antiviral activity against HIV-1, but a six-ring azasugar is added to the oligonucleotide to the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 consisting of only P = S bonds. The technical novelty of the present invention is that the antiviral activity is excellent and the safety and stability are significantly increased.

<5-2> 올리고뉴클레오타이드의 세포내 항 바이러스 활성 측정<5-2> Intracellular Antiviral Activity Measurement of Oligonucleotides

본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 세포막을 통과하여 세포내에서 목적한 HIV-1의 유전자 서열을 인식하며, 특이성을 가지고 해당 RNA 부위(TAR 유전자 서열)와 결합하여 항 바이러스 활성을 나타내는지 아니면 세포 밖에서 작용하여 HIV-1의 감염을 억제하는지를 확인하기 위하여 2×106Jurkat-tat 세포에 5 ㎍의 LTR-CAT만을 형질감염시키고 2 ㎍의 올리고뉴클레오타이드를 배지에 첨가하거나(도 9), 2×106Jurkat-tat 세포에 5 ㎍의 LTR-CAT과 2 ㎍의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 동시에 형질감염시키고(도 10) 48시간 후 세포 내에서 LTR/Tat 활성에 의해 발현되는 CAT(chloramphenicol acetyl transferase) 효소의 활성을 측정하였다. GenePorterTMtransfectant(Gene Therapy System Inc. Sandiage, CA, USA) 키트를 사용하여 형질감염을 시켰으며 제조사의 지침에 따라 실험을 진행하였다.The oligonucleotide of the present invention passes through the cell membrane to recognize the gene sequence of the desired HIV-1 in the cell, and has specificity to bind to the corresponding RNA site (TAR gene sequence) to exhibit antiviral activity or to act outside the cell. To confirm that it inhibits infection of HIV-1, 2 × 10 6 Jurkat-tat cells were transfected with only 5 μg of LTR-CAT and 2 μg of oligonucleotides were added to the medium ( FIG. 9 ), or 2 × 10 6 Jurkat 5 μg of LTR-CAT and 2 μg of antisense oligonucleotide were simultaneously transfected into tat cells ( FIG. 10 ) and the activity of CAT (chloramphenicol acetyl transferase) enzyme expressed by LTR / Tat activity in cells after 48 hours Measured. Transfection was performed using a GenePorter ™ transfectant (Gene Therapy System Inc. Sandiage, CA, USA) kit, and the experiment was conducted according to the manufacturer's instructions.

CAT 활성을 측정하기 위하여 형질감염된 세포를 48시간 후 수획하여 4℃ 인산염 완충용액으로 2회 세척하고 1 ㎖ TNB 용액(40 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl)을 첨가하여 혈구세포 분석기로 세포 수를 확인한 다음 드라이아이스/에탄올 수조와 37℃ 항온수조에서 얼림과 녹임을 3회 반복하여 세포를 파쇄하고 60℃ 수조에서 10분간 열처리하여 세포 자체의 CAT 활성을 제거하였다. 이렇게 준비된 시료 안의 CAT 효소활성 측정은 기존의 Promega사에서 제시하는 방법을 따랐다.To measure CAT activity, transfected cells were harvested after 48 hours, washed twice with 4 ° C. phosphate buffer, and added 1 ml TNB solution (40 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl). After confirming the cell number with a cell analyzer, the cells were crushed three times by freezing and thawing in a dry ice / ethanol bath and a 37 ° C. constant temperature water bath and heat treated in a 60 ° C. water bath for 10 minutes to remove the CAT activity of the cells themselves. CAT enzyme activity in the prepared samples was based on the method proposed by Promega.

그 결과, 올리고뉴클레오타이드를 배지에 처리한 경우 CAT 활성이 전혀 영향을 받지 않은 것으로 보아 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 세포 안의 LTR/Tat의 활성을 억제하지는 못하였음을 알 수 있었다(도 9). 또한, 올리고뉴클레오타이드를 형질감염시켜 강제로 세포내로 주입하였을 경우에는, 항 바이러스 활성이 약한 6환의 아자슈거가 없는서열번호 4및서열번호 13의 올리고뉴클레오타이드나 6환의 아자슈거가 있어도 올리고뉴클레오타이드의 양쪽 끝에 위치한서열번호 9의 올리고뉴클레오타이드를 처리한 세포에서는 LTR/Tat 활성이 억제되어 CAT 활성이 현저히 낮아지거나 대조군에 비해 상대적으로 감소한 경향을 보였다. 반면에 육환의 아자슈거를 3개 이상 포함한 것으로서 배양액에 처리시 강한 항 바이러스 효과를 보였던서열번호 2,서열번호 11및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드는 형질감염시켜 세포내로 강제로 주입하여도 LTR/Tat의 활성을 거의 억제하지 못하였다(도 10). 이는 아마도 육환의 아자슈거 갯수가 증가할수록 서열 특이적인 표적 mRNA에 친화도가 떨어져 발현을 억제하지 못하기 때문인 것으로 해석된다.As a result, when the oligonucleotide was treated in the medium, the CAT activity was not affected at all, indicating that the oligonucleotide of the present invention did not inhibit the activity of LTR / Tat in the cells ( FIG. 9 ). Further, when by transfecting a nucleotide hayeoteul injected into the force cell oligonucleotides, the antiviral activity is raised in the low 6 ring aza the SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 13 without sugar oligonucleotide may have nucleotide or 6 ring-aza sugar at both ends of the oligonucleotide In the cells treated with the oligonucleotide of SEQ ID NO: 9 located, LTR / Tat activity was suppressed, and CAT activity was significantly lowered or decreased compared with the control group. On the other hand, oligonucleotides of SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 22 , which contain three or more azasugars of hexacyclic, which showed strong antiviral effects when treated in the culture medium, were transfected and forcedly injected into the cells. It hardly inhibited the activity of ( FIG. 10 ). This is probably due to the fact that as the number of azasugars in the circulatory body increases, the affinity to the sequence-specific target mRNAs decreases and the expression cannot be suppressed.

상기의 결과를 종합하면 육환의 아자슈거가 포함된 올리고뉴클레오타이드의 HIV-1에 대한 항 바이러스 효과는 세포막을 투과하여 세포안에서 HIV-1에 대한 유전자 서열 특이적인 안티센스 기작에 의한 바이러스 증식을 억제하기 보다는 세포 밖에서 작용하여 HIV-1의 증식을 억제하는 방법으로 항 바이러스 활성을 나타내는 것으로 판단된다. 이러한 특성은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 다양한 HIV-1 바이러스 주 뿐 아니라 약제내성 돌연변이 주에 대해서도 동일한 항 바이러스 효능을 보일 가능성을 시사해 준다. 상기 실험예 2의 결과에서 본 바와 같이 본 발명의서열번호 20및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드가 실험실 주 및 야생의 IIIB 주 뿐 아니라 AZT로는 효과가 없는 맹독성의 재조합 바이러스인 SHIV89.6에 대해서도 매우 효과적으로 항 바이러스 활성을 나타내는 것도 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 이러한 세포 밖에서 감염을 차단하는 특성 때문일 것으로 생각된다.또한, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 역전사효소 억제제에 내성을 나타내는 HIV-1 주(Y181C, K103N, Y188H, L1001, 및 V106A)들에 대해서도 증식 억제효과를 조사한 결과 상기의 바이러스들과 유사하게 강력한 항 바이러스 활성을 나타내었다.Taken together, the antiviral effect of oligonucleotides containing hexasaccharides on HIV-1 is more likely to penetrate the cell membrane to inhibit viral proliferation due to gene-specific antisense mechanisms for HIV-1 in cells. It is believed to exhibit antiviral activity by acting outside the cell and inhibiting the proliferation of HIV-1. This property suggests that the oligonucleotides of the present invention may exhibit the same antiviral efficacy against various HIV-1 virus strains as well as drug resistant mutant strains. As shown in the results of Experiment 2, the oligonucleotides of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 22 of the present invention are highly effective against SHIV 89.6 , which is a highly toxic recombinant virus that is ineffective with AZT as well as in laboratory and wild IIIB strains. It is also believed that the oligonucleotides of the present invention exhibit viral activity because of their ability to block infection outside these cells. In addition, the oligonucleotides of the present invention exhibit HIV-1 strains that are resistant to reverse transcriptase inhibitors (Y181C, K103N, Y188H, L1001, and V106A) also showed a proliferative inhibitory effect, showed a strong antiviral activity similar to the above virus.

상기 결과로부터, 본 발명의 올리고뉴클에오타이드는 역전사효소 활성 억제제나 단백질 분해효소 억제제와는 달리 HIV-1 바이러스 전반에 대해 항 바이러스 효능을 보임으로써 폭넓은 AIDS 치료제로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.From the above results, the oligonucleotides of the present invention, unlike reverse transcriptase inhibitors or protease inhibitors, is expected to be used as a wide range of AIDS therapeutics by showing antiviral efficacy against the entire HIV-1 virus.

<실험예 6> 감염된 세포의 회복실험Experimental Example 6 Recovery of Infected Cells

Jurkat-Tat 세포에 상기 실험예 <1-1>과 같이 HXBc2/Δtat 바이러스를 감염시키고 10% 혈청 존재하에서 배양하며 5일 후 신시티움이 왕성하게 생성되었을 때, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 각각 최종농도 0.5 μM되게 처리하고 36시간이 지난 후 신시티움이 사라지는 정도를 관찰하였다(도 11).When the Jurkat-Tat cells were infected with HXBc2 / Δtat virus as in Experimental Example <1-1>, cultured in the presence of 10% serum, and 5 days later, synthium was vigorously produced, the oligonucleotides of the present invention were respectively finalized. Treatment with a concentration of 0.5 μM and 36 hours after the synthium was observed to disappear ( Fig. 11 ).

그 결과, 시료를 처리하지 않은 대조군의 경우 7일째에 매우 크고 왕성한 신시티움이 관찰되었으나서열번호 2,서열번호 17,서열번호 20및서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드를 첨가해 준 웰에서는 신시티움 형성이 현저히 감소되었으며 특히서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드의 경우 대부분의 신시티움이 사라지고 세포가 정상적으로 회복되었음을 확인하였다. 그러나, 6환의 아자슈거를 포함하지 않고 P=S 결합만으로 합성한서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드의 경우는 오히려대조군보다 더 왕성한 신시티움이 관찰되었다.As a result, a very large and vigorous syntium was observed on the 7th day in the control group without the sample, but in the well to which the oligonucleotides of SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: 20, and SEQ ID NO: 22 were added Formation was markedly reduced, especially in the case of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 22 , most of the synthium disappeared and confirmed that the cells recovered normally. However, in the case of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 synthesized only by P = S bond without including 6-ring azasugar, synthium was more vigorous than the control group.

상기 결과로부터, 본 발명의 6환의 아자슈거를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 초기 감염을 억제하는 효과 뿐 아니라, 감염된 세포가 주위의 정상 세포와 gp120-CD4 결합을 통해 생성하는 신시티움 형성을 효과적으로 차단하여 바이러스의 전파를 억제함으로써 에이즈 환자에 투여시 더 이상의 정상세포의 감염을 막고 기존 신시티움의 진전을 억제하여 전체적으로 회복효과를 나타낼 수 있음을 단적으로 시사해 준다.From the above results, the oligonucleotide containing the six-ring azasugar of the present invention not only inhibits the initial infection, but also effectively blocks the synthium formation that the infected cells produce through gp120-CD4 binding with surrounding normal cells. Suppressing the spread of virus prevents the infection of normal cells and prevents the progress of existing synthium when administered to AIDS patients.

<실험예 7> 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 다른 바이러스에 대한 항 바이러스 활성조사Experimental Example 7 Investigation of Antiviral Activity of Antisense Oligonucleotide Against Other Viruses

본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 HIV-1 외의 다른 바이러스에도 항 바이러스 활성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 원숭이에 감염되어 사람의 AIDS와 비슷한 증상을 일으키는 SIV 바이러스(미국 NIH 에이즈 Research and Reference Reagent Program에서 분양)의 TAR 부위에 대해 6환의 아자슈거를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(서열번호 6및서열번호 7의 올리고뉴클레오타이드)와 소아마비 바이러스의 IRES(internal ribosomal entry site) 유전자 서열에 해당하는 부분에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드(서열번호 8의 올리고뉴클레오타이드)를 이용하여 하기 실험을 수행하였다.To determine whether the oligonucleotides of the present invention exhibit antiviral activity against viruses other than HIV-1, the SIV virus (prepared from the NIH AIDS Research and Reference Reagent Program) infected with monkeys causes symptoms similar to human AIDS. antisense oligonucleotides (SEQ ID NO: for the part to an antisense oligonucleotide containing 6 ring aza sugar for the TAR region corresponding to the nucleotide (SEQ ID NO: 6 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 7 nucleotides) and IRES (internal ribosomal entry site) of the poliovirus gene sequence The following experiment was carried out using oligonucleotide of No. 8 ).

<7-1> 올리고뉴클레오타이드의 SIV에 대한 항 바이러스 활성 조사<7-1> Antiviral Activity of SIV of Oligonucleotides

CEMx174 세포를 10% 소태아 혈청이 포함된 RPMI 배지에서 배양하면서 SIV 바이러스를 0.01 MOI가 되도록 실험예 <1-1>에서와 같이 1시간 감염시키고, 감염 후 각 웰에 여러 종의 올리고뉴클레오타이드를 최종 농도가 0.5 μM 되도록 처리한 다음 2일 간격으로 상청액을 수획하여 실험예 <1-2>에서와 같은 방법으로 역전사효소 활성을 측정함으로써 항 바이러스 활성을 조사하였다(도 12).CEMx174 cells were cultured in RPMI medium containing 10% fetal bovine serum and infected with SIV virus for 1 hour as in Experimental Example <1-1>, as shown in Experimental Example <1-1>, and several kinds of oligonucleotides were added to each well after infection. After treatment to a concentration of 0.5 μM and the supernatant was harvested at intervals of 2 days, antiviral activity was investigated by measuring reverse transcriptase activity in the same manner as in Experimental Example <1-2> ( FIG .

그 결과, 본 발명의 올리고 뉴클레오타이드 중 어느 것도 SIV 증식을 억제하지 못하였으며 유전자 서열과 무관하게서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드은 HIV-1에서와 같이 SIV 증식을 오히려 촉진하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 발명의 6환의 아자슈거를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 HIV-1에만 특이적으로 항 바이러스 효과를 보임을 의미한다. SIV는 HIV-1와 유전자 구조는 비슷하나 유전자 서열상의 상동성(homology)은 50% 정도 밖에 되지 않으며 숙주 특이성도 달라 인체에는 감염되지 않는다. SIV의 기주특이성이 HIV-1와 틀린 점을 감안할 때 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 HIV-1 감염에 필요한 수용체나 바이러스 외막 단백질 중 숙주세포와의 결합에 관여하는 단백질과 결합하여 HIV-1의 감염만을 특이하게 차단하는 기작으로 항 바이러스 효과를 보이는 것으로 해석된다.As a result, none of the oligonucleotides of the present invention inhibited SIV proliferation, and irrespective of the gene sequence, the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 was found to rather promote SIV proliferation as in HIV-1. The above results indicate that the oligonucleotide including the six-ring azasugar of the present invention exhibits an antiviral effect specifically for HIV-1. SIV is similar in structure to HIV-1 but has only about 50% homology on the gene sequence. Given that the host specificity of SIV is different from that of HIV-1, the oligonucleotide of the present invention binds to a receptor necessary for HIV-1 infection or to a protein involved in binding to a host cell among viral envelope proteins. The specific blocking mechanism is interpreted as showing antiviral effect.

<7-2> 올리고뉴클레오타이드의 소아마비 바이러스에 대한 항 바이러스 활성 조사<7-2> Antiviral Activity of Poliovirus against Oligonucleotides

30 mm 세포 배양용 페트리 접시에 사람 자궁경부암 세포(HeLa cell)를 단층 배양하고 여기에 소아마비 바이러스 Sabin 1형(뉴욕 주립대학 E. Wimmer 박사로부터 분양 받음)을 MOI 0.1이 되도록 1시간 동안 감염시킨 다음 인산염 완충용액으로 세포를 2회 세척하여 감염되지 않은 소아마비 바이러스를 제거하였다. 상기 세포에 각각의 올리고뉴클레오타이드가 최종농도 1 μM이 되도록 포함된 배지(10% 소태아 혈청이 포함된 DMEM 배지: GIBCO/BRL)를 첨가하여 배양하면서 3시간 간격으로 상등액을 수획하여 TCID50법으로 생산된 바이러스의 양을 측정하였다(도 13).A single layer of human cervical cancer cells (HeLa cells) was cultured in a Petri dish for 30 mm cell culture, and the polio virus Sabin type 1 (available from Dr. E. Wimmer, New York State University) was infected for 1 hour to reach MOI 0.1. Cells were washed twice with phosphate buffer to remove uninfected poliovirus. The supernatant was harvested at 3 hour intervals by adding the medium (DMEM medium containing 10% fetal bovine serum: GIBCO / BRL) containing each oligonucleotide to a final concentration of 1 μM and culturing the supernatant by TCID 50 method. The amount of virus produced was measured ( FIG. 13 ).

그 결과, 발명의 올리고뉴클레오타이드 중 어느 것도 유전자 서열 특이성과 무관하게 소아마비 바이러스의 증식에 전혀 영향을 주지 못하였다. 상기 결과는 올리고뉴클레오타이드를 배지에 처리할 경우 리포좀을 이용한 인위적인 조작없이 세포안으로 들어가 항 바이러스 활성을 나타내지 않으며 세포 표면에 발현되는 다량의 소아마비 바이러스 수용체(poliovirus receptor)에 대해서도 전혀 영향을 미치지 않음을 보여준다.As a result, none of the oligonucleotides of the invention had any effect on the proliferation of poliovirus regardless of gene sequence specificity. The results show that when oligonucleotides are treated in the medium, they do not enter anti-viral activity into cells without artificial manipulation with liposomes and have no effect on large amounts of poliovirus receptors expressed on the cell surface.

상기 실험예 <7-1>과 <7-2>의 결과를 종합하여 볼 때, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 비록 세포 안으로 들어가 HIV 유전자의 발현을 특이적으로 억제하지는 않으나 기존의 다른 보고(P. Hawley et al.,Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 9, 61-69, 1999; P. Rockwell et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 6523-8, 1997)에서처럼 세포 표면에 작용시 HIV-1의 감염에 관련된 세포 표면단백질에 특이적으로 결합하거나, 기존의 보고(J. Suzuki et al.,Nucleic Acids Symp.Ser.,(42), 227-8, 1999; J.R. Wyatt et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 1356-1360, 1994)에서와 같이 HIV-1 외막 단백질 중 V3 부분만을 효과적으로 차단하는 등의 방법으로 항 바이러스 활성을 나타내는 것으로 생각되며, 이 경우 수용체가 상이한 다른 바이러스의 증식에는 전혀 영향을 주지 않는 것으로 보아 세포 표면의 다른 단백질에는 영향을 미치지 않아 정상적인 세포 활성에는 지장을 주지 않을 것으로 기대된다.In view of the results of the above Experimental Examples <7-1> and <7-2>, the oligonucleotide of the present invention does not specifically inhibit the expression of the HIV gene even though it enters the cell, but other reports (P. On the cell surface as in Hawley et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. , 9, 61-69, 1999; P. Rockwell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 94, 6523-8, 1997). Specifically bind to cell surface proteins involved in HIV-1 infection, or have been previously reported (J. Suzuki et al., Nucleic Acids Symp. Ser. , (42), 227-8, 1999; JR Wyatt et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 91, 1356-1360, 1994), which is thought to exhibit antiviral activity by effectively blocking only the V3 portion of the HIV-1 outer membrane protein. The receptors do not affect the proliferation of other viruses that differ, thus affecting other proteins on the cell surface. It is therefore expected to not interfere with normal cell activity.

<실험예 8> 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성에 대한 혈청의 영향Experimental Example 8 Effect of Serum on Antiviral Activity of Oligonucleotides

본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 인체에 투여할 경우 고 농도의 혈청 존재 하에서 항 바이러스 활성을 나타내어야 한다. 본 발명자들은 첨가된 혈청의 농도나 종류에 따라 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성이 영향을 받는지 조사하기 위하여, 세포 배양액을 혈청이 첨가되지 않은 배지(Opti-MEM: GIBCO/BRL)에서와 10%의 소태아 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지(GIBCO/BRL), 10%의 말 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지, 10% 사람 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지 및 농도를 달리한 소태아 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 항 바이러스 활성을 측정하였다. 상기 실험예 <1-1>과 같이 Jurkat-tat 세포에 HIV-1/Δtat 바이러스를 감염시키고 0.1 μM의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리한 후 최초로 신시티움이 분명하게 형성되는 날짜를 조사하여 그 결과를표 5에 나타내었다.When the oligonucleotide of the present invention is administered to humans, it should exhibit antiviral activity in the presence of high concentrations of serum. In order to investigate whether the antiviral activity of oligonucleotides is affected by the concentration or type of serum added, the present inventors examined cell cultures in medium without serum (Opti-MEM: GIBCO / BRL) and 10% RPMI-1640 medium with fetal serum (GIBCO / BRL), RPMI-1640 medium with 10% horse serum, RPMI-1640 medium with 10% human serum and fetal bovine serum with different concentrations Antiviral activity of antisense oligonucleotides in RPMI-1640 medium was measured. As shown in Experimental Example <1-1>, Jurkat-tat cells were infected with HIV-1 / Δtat virus, treated with 0.1 μM of antisense oligonucleotides, and then examined the date of formation of syntium for the first time. Table 5 shows.

표 5에 나타낸 바와 같이 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 혈청이 없는Opti-MEM 배지에서는서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드를 제외하고는서열번호 2,서열번호 11,서열번호 17,서열번호 22및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드 모두 처리 후 8일이 지나서야 처음 신시티움 형성이 발견되는 등 매우 효과적인 항 바이러스 활성을 보였다. 그러나 혈청이 첨가되면 종류에 따라 항 바이러스 활성이 다소 줄어들어 2-3일 일찍 신시티움이 형성됨을 관찰하였다. 특히, 이 중서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드의 활성이 혈청에 영향을 제일 크게 받았으며서열번호 22의 올리고뉴클레오타이드이 가장 영향을 적게 받는 것으로 나타났다. 그러나 혈청이 올리고뉴클레오타이드의 항바이러스 활성에 미치는 영향은 혈청의 종류나 처리 농도와는 거의 무관한 것으로 나타났으며 일단 소량이라도 혈청이 첨가되면 활성이 저해되고 그 이상 혈청의 농도를 높여도 활성의 저해 정도에는 거의 차이가 없는 것으로 나타났다. 이는 아마도 소량의 혈청만으로도 올리고뉴클레오타이드와의 반응이 포화되어 그 이상의 농도에서는 별 영향을 받지 않는 것으로 생각되며, 이 경우 체내의 고농도 혈청에서도 상기 정도 이상의 활성저해 영향은 없을 것으로 생각된다. 이러한 가운데서도서열번호 22및서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드는 혈청의 유무, 혈청의 종류나 농도에 거의 영향을 받지 않고 항 바이러스 활성을 유지하는 것으로 나타났다.As shown in Table 5 , the oligonucleotides of the present invention, except for the oligonucleotides of SEQ ID NO: 4 in the Opti-MEM medium without serum, have the sequence of SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: 22, and SEQ ID NO: 29 All of the oligonucleotides showed very effective antiviral activity, including the formation of syntium at first 8 days after treatment. However, it was observed that when serum was added, antiviral activity decreased slightly depending on the type, resulting in the formation of syntium 2-3 days earlier. In particular, the activity of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 was most affected by the serum and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 22 was shown to be least affected. However, the effect of serum on the antiviral activity of oligonucleotide was found to be almost independent of the type of serum and the concentration of treatment. Once a small amount of serum was added, the activity was inhibited. There was little difference in degree. This is probably due to the saturation of the reaction with the oligonucleotides even with a small amount of serum, which is thought to be unaffected at higher concentrations. Among these, the oligonucleotides of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 29 were shown to maintain antiviral activity with little effect on the presence or absence of serum, the type or concentration of serum.

<실험예 9> 마우스에 대한 비경구투여 급성 독성실험Experimental Example 9 Acute Toxicity in Parenteral Administration of Mice

5주령의 특정병원부재(SPF) ICR계 마우스를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 3 마리씩의 동물에 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 각각인산 완충식염수(PBS)에 녹여 100 mg/kg의 용량으로 단회 정맥에 투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 모두 마우스에서 100 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 정맥 투여 무해 용량은 100 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.Acute toxicity test was performed using SPF ICR mice at 5 weeks of age. Three animals per group were dissolved in phosphate buffered saline (PBS) and the antisense oligonucleotides of the present invention were administered to a single vein at a dose of 100 mg / kg. After administration of the test substance, mortality, clinical symptoms, and changes in body weight were observed. Hematological and hematological examinations were performed. Necropsy was performed to observe abdominal and thoracic organ abnormalities. As a result, there were no clinical symptoms or deaths in all animals treated with the test substance, and no toxicity change was observed in weight change, blood test, blood biochemistry test, autopsy findings, etc. As a result, all of the antisense oligonucleotides of the present invention did not show toxicological changes up to 100 mg / kg in mice, and the harmless dose of intravenously administered was determined to be a safe substance of 100 mg / kg or more.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 결합으로 이루어져 있으며 자연형의 뉴클레오타이드의 당인 오환의 리보오스 일부를 육환의 아자슈거로 치환하여 뉴클레아제에 대해 안정하고 세포 밖에서 항 HIV-1 활성이 높으면서 또한 세포독성이 낮아 에이즈 치료용 약물로 유용하게 사용될 수 있다.As described above, the oligonucleotide of the present invention is composed of phosphorothioate linkages and is stable to nucleases by replacing a portion of ribose of the cyclic ring, a sugar of a natural nucleotide, with azashuger of hexacycle, and anti-HIV-out of the cell. 1 High activity and low cytotoxicity can be useful as a drug for treating AIDS.

Claims (5)

오환의 라이보스(ribose)를 육환의 아자슈거(azasugar)로 치환하고 포스포로티오에이트 결합으로 이루어진 하기화학식 1의 구조를 가지는 올리고뉴클레오타이드.Oligonucleotide having a structure represented by the following formula (1) consisting of phosphorothioate bonds by replacing the cyclic ribose (ribose) with azasugar of hexacyclic (azasugar). <화학식 1><Formula 1> 상기화학식 1에서In Chemical Formula 1 n은 0∼30이며,n is 0 to 30, 1) B는 보호기를 갖거나 갖지 않은 자연 뉴클레오베이스 또는 변형된 뉴클레오베이스이고,1) B is a natural nucleobase or modified nucleobase with or without protecting groups, 2) X는 수소, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트기, 또은 올리고뉴클레오타이드이며,2) X is hydrogen, a hydroxyl protecting group, a conjugate group, or an oligonucleotide, 3) Y는 수소, 포스페이트, 활성화된 포스페이트, 활성화된 포스파이트, 또는 고체지지물, 컨쥬게이트기, 올리고뉴클레오타이드이다.3) Y is hydrogen, phosphate, activated phosphate, activated phosphite, or solid support, conjugate group, oligonucleotide. 제 1항의 올리고뉴클레오타이드를 측면에 가지고 있으며, 중앙에 포스포다이에스터(phosphodiester) 또는 포스포로치오에이트(phosphorothioate) 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 키메릭(chimeric) 올리고뉴클레오타이드.A chimeric oligonucleotide having the oligonucleotide of claim 1 on the side and containing a phosphodiester or phosphorothioate oligonucleotide in the center. 제 1항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는서열번호 2,서열번호 3,서열번호 11,서열번호 17,서열번호 18,서열번호 19,서열번호 20,서열번호 21,서열번호 22,서열번호 23및서열번호 29로 기재되는 올리고뉴클레오타이드 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.The method of claim 1, wherein the oligonucleotide is SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: 18 , SEQ ID NO: 19 , SEQ ID NO: 20 , SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22 , SEQ ID NO: 23, and SEQ ID NO: 23 Oligonucleotide, characterized in that it is selected from the group of oligonucleotides set forth in number 29 . 제 1항의 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 AIDS 치료용 약학적 조성물.Claim 1 pharmaceutical composition for treating AIDS containing the oligonucleotide as an active ingredient. 제 2항의 키메릭 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 AIDS 치료용 약학적 조성물.The pharmaceutical composition for treating AIDS containing the chimeric oligonucleotide of claim 2 as an active ingredient.
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