KR20020064896A - Method for synthesizing nucleic acid - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 신규한 구조의 올리고뉴클레오티드와, 그것을 프라이머로 하는 핵산의 합성방법이다. 이 올리고뉴클레오티드는, 프라이머의 5'측에 이 프라이머를 합성기점으로 하여 합성되는 영역과 실질적으로 동일한 염기서열을 갖춘다. 본 발명은, 단순한 시약구성으로 등온반응을 토대로 하는 핵산의 합성을 실현한다. 또 본 발명은, 이 핵산 합성방법을 토대로 하여, 높은 특이성을 갖는 핵산의 합성방법을 제공한다.The present invention is a method for synthesizing oligonucleotides having a novel structure and nucleic acids using the primers. This oligonucleotide has a nucleotide sequence substantially the same as the region synthesized on the 5 'side of the primer using the primer as a synthetic starting point. The present invention realizes the synthesis of nucleic acid based on isothermal reaction with a simple reagent configuration. The present invention also provides a method for synthesizing a nucleic acid having high specificity, based on this nucleic acid synthesis method.
Description
기술분야Technical Field
본 발명은, 핵산의 증폭방법으로서 유용한, 특정 염기서열로 구성되는 핵산을 합성하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for synthesizing a nucleic acid composed of a specific base sequence, which is useful as a method for amplifying a nucleic acid.
배경기술Background
핵산염기서열의 상보성을 토대로 하는 분석방법은, 유전적인 특징을 직접적으로 분석하는 것이 가능하다. 그 때문에, 유전적 질환, 암화(canceration), 미생물의 식별 등에는 매우 유력한 수단이다. 또 유전자 그 자체를 검출대상으로 하기 때문에, 예를 들면 배양과 같은 시간과 수고가 드는 조작을 생략할 수 있는 경우도 있다.In the analysis method based on the complementarity of nucleic acid base sequences, it is possible to directly analyze genetic characteristics. Therefore, it is a very powerful means for genetic diseases, cancerization, microorganism identification, and the like. In addition, since the gene itself is the detection target, for example, an operation that takes time and labor such as culturing may be omitted.
그렇다고는 해도 시료중에 존재하는 목적 유전자량이 적은 경우의 검출은 일반적으로 용이하지는 않아, 표적유전자 그 자체를, 또는 검출시그날 등을 증폭하는 것이 필요해진다. 표적유전자를 증폭하는 방법의 하나로서 PCR(Polymerase Chain Reaction)법이 알려져 있다(Science, 230, 1350-1354, 1985). PCR법은, in vitro에 있어서의 핵산의 증폭기술로서 현재 가장 일반적인 방법이다. 그 지수적인 증폭효과를 토대로 하는 높은 감도에 의해 우수한 검출방법으로서 정착했다. 또, 증폭생성물을 DNA로서 회수할 수 있기 때문에, 유전자클로닝이나 구조결정 등의 유전자공학적 수법을 지지하는 중요한 수단으로서 폭 넓게 응용되고 있다. 그러나 PCR법에 있어서는, 실시를 위해 특별한 온도조절장치가 필요한 것; 증폭반응이 지수적으로 진행되기 때문에 정량성에 문제가 있는 것; 시료나 반응액이 외부로부터의 오염을 받아, 잘못 혼입된 핵산이 주형으로서 기능해 버리는 오염(contamination)의 영향을 받기쉬운 것 등의 문제점이 지적되고 있다.Nevertheless, detection of a small amount of the target gene present in a sample is generally not easy, and it is necessary to amplify the target gene itself, a detection signal, and the like. PCR (Polymerase Chain Reaction) is known as a method of amplifying a target gene (Science, 230, 1350-1354, 1985). The PCR method is currently the most common method for amplifying nucleic acids in vitro. It settled as an excellent detection method by the high sensitivity based on the exponential amplification effect. Moreover, since the amplification product can be recovered as DNA, it has been widely applied as an important means for supporting genetic engineering methods such as gene cloning and structural determination. However, in the PCR method, a special temperature control device is required for the implementation; Quantitative problems because the amplification proceeds exponentially; Problems such as being susceptible to contamination caused by contamination of a sample or a reaction solution from the outside and erroneously mixed nucleic acids function as a template have been pointed out.
게놈정보의 축적에 동반하여, 1염기 다형(SNPs; single nucleotide polymorphism)의 해석이 주목되고 있다. 프라이머의 염기서열에 SNPs를 포함하도록 설계함으로써 PCR을 이용한 SNPs의 검출이 가능하다. 즉, 반응생성물의 유무에 의해 프라이머에 상보적인 염기서열의 유무를 알 수 있다. 그러나 PCR에 있어서는, 만일 잘못하여 상보사슬 합성이 행해져 버린 경우에는, 그 생성물이 이후 반응의 주형으로서 기능하여 잘못된 결과를 부여하는 원인이 된다. 현실적으로는, 프라이머의 말단에 있어서의 1염기의 상이함 만으로는, PCR을 엄밀하게 제어하는 것은 어렵다고 한다. 따라서, PCR을 SPNs의 검출에 이용하기 위해서는 특이성의 개선이 필요로 되어 있다.Along with the accumulation of genomic information, the interpretation of single nucleotide polymorphisms (SNPs) is drawing attention. SNPs can be detected by PCR by designing the primers to include SNPs. That is, the presence or absence of the base sequence complementary to the primer can be determined by the presence or absence of the reaction product. However, in PCR, if the complementary chain synthesis is performed by mistake, the product functions as a template for subsequent reactions, which causes a wrong result. In reality, it is said that it is difficult to strictly control PCR only by the difference of one base at the terminal of the primer. Therefore, in order to use PCR for detecting SPNs, specificity needs to be improved.
한편 리가아제를 토대로 하는 핵산 합성방법도 실용화되어 있다. LCR법(Ligase Chain Reaction, Laffler TG; Carrino JJ; Marshall RL; Ann. Biol. Clin. (Paris), 1993, 51:9, 821-6)은, 검출대상이 되는 서열상에 있어서 인접하는 2개의 프로브를 하이브리다이즈시켜, 리가아제에 의해 양자를 연결하는 반응이 기본원리로 되어 있다. 표적염기서열이 존재하지 않는 경우에는 2개의 프로브를 연결하는 것은 불가능하기 때문에, 연결생성물의 존재는 표적염기서열의 지표가 된다. LCR법도 합성한 상보사슬과 주형과의 분리에 온도제어가 필요해지기 때문에, PCR법과 동일한 문제점을 동반하고 있다. LCR에 대해서는, 인접하는 프로브 사이에 갭을 설치하여, 이것을 DNA 폴리머라아제로 충전하는 공정을 가하여 특이성을 개선하는 방법도 보고되어 있다. 그러나, 이 개량방법에 의해 기대할 수 있는 것은 특이성 뿐으로, 온도제어를 요구하는 점에 대해서는 여전히 과제를 남기고 있다. 또한, 필요한 효소가 늘어나기 때문에, 비용이 증가한다는 문제점이 있다.On the other hand, nucleic acid synthesis methods based on ligase have also been put to practical use. The LCR method (Ligase Chain Reaction, Laffler TG; Carrino JJ; Marshall RL; Ann. Biol. Clin. (Paris), 1993, 51: 9, 821-6) includes two contiguous on the sequence to be detected. The basic principle is the reaction of hybridizing a probe to link both by ligase. Since it is impossible to link two probes when there is no target base sequence, the presence of the linkage product is an index of the target base sequence. The LCR method also has the same problem as the PCR method because temperature control is required for separation between the synthesized complementary chain and the template. As for LCR, a method of improving specificity by providing a gap between adjacent probes and filling them with DNA polymerase has also been reported. However, only the specificity that can be expected by this improvement method remains a problem in terms of requiring temperature control. In addition, since the required enzyme is increased, there is a problem that the cost increases.
검출대상서열을 주형으로 하여 상보적인 서열을 갖는 DNA를 증폭하는 방법에는, SDA법(Strand Displacement Amplification)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392-396;1992][Nucleic Acid. Res., 20, 1691-1696; 1992]라고 불리는 방법도 알려져 있다. SDA법은, 어느 염기서열의 3'측에 상보적인 프라이머를 합성기점으로 하여 상보사슬 합성을 행할 때에, 5'측에 이중가닥 사슬의 영역이 있으면 그 사슬을 치환하면서 상보사슬의 합성을 행하는 특수한 DNA 폴리머라아제를 이용하는 방법이다. 또한 이하 본 명세서에 있어서 간단히 5'측, 또는 3'측이라고 표현할 때에는, 모두 주형으로 되어 있는 쪽의 사슬에 있어서의 방향을 의미하고 있다. 5'측의 이중가닥 사슬부분이 새롭게 합성된 상보사슬에 의해 치환(displacement)되기 때문에 SDA법이라 불리고 있다. SDA법에서는, 프라이머로서 어닐링시킨 서열에 미리 제한효소 인식서열을 삽입해 둠으로써, PCR법에 있어서는 필수로 되어 있는 온도변화공정의 생략을 실현할 수 있다. 즉, 제한효소에 의해 초래되는 닉(nick)이 상보사슬의 합성기점이 되는 3'-OH기를 부여하고, 거기서부터 사슬 치환합성을 행함으로써먼저 합성된 상보사슬이 단일가닥 사슬로서 유리되어 다음의 상보사슬 합성의 주형으로서 재이용된다. 이와 같이 SDA법은 PCR법에서 필수로 되어 있었던 복잡한 온도제어를 불필요하게 했다.As a method for amplifying DNA having a complementary sequence using a sequence to be detected as a template, SDA method (Strand Displacement Amplification) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392-396; 1992] Nucleic Acid. Res., 20, 1691-1696; 1992 is also known. In the SDA method, when a complementary chain is synthesized using a primer complementary to the 3 'side of a nucleotide sequence as a synthetic starting point, if there is a double-stranded chain region on the 5' side, the SDA method performs a special synthesis of the complementary chain while replacing the chain. It is a method using DNA polymerase. In addition, below, when expressing simply as 5 'side or 3' side in this specification, all mean the direction in the chain of the side which becomes a template. The double-stranded chain portion on the 5 'side is called the SDA method because it is replaced by a newly synthesized complementary chain. In the SDA method, by inserting a restriction enzyme recognition sequence into a sequence annealed as a primer in advance, it is possible to omit the temperature change step, which is essential in the PCR method. That is, the nicks caused by restriction enzymes give the 3'-OH group, which is the starting point of the complementary chain, and then perform the chain substitution synthesis therefrom, whereby the synthesized complementary chain is released as a single-stranded chain. It is reused as a template of chain synthesis. In this way, the SDA method eliminated the complicated temperature control required for the PCR method.
그러나, SDA법에서는 사슬 치환형 DNA 폴리머라아제에 가하여, 반드시 닉을 초래하는 제한효소를 조합시킬 필요가 있다. 필요한 효소가 늘어난다고 하는 것은, 비용 증가의 요인이다. 또한, 사용하는 제한효소에 의해 이중가닥 사슬의 절단이 아니라 닉의 도입(즉 한쪽 사슬만 절단)을 행하기 위해, 한쪽 사슬에는 효소소화에 내성을 가지도록 합성시의 기질로서 α티오 dNTP와 같은 dNTP 유도체를 이용하지 않으면 안 된다. 이 때문에, SDA에 의한 증폭산물은 천연 핵산과는 다른 구조가 되어, 제한효소에 의한 절단이나, 증폭산물의 유전자 클로닝으로의 응용이라고 하는 이용은 제한된다. 또한 이 점에 있어서도 비용 증가의 요인을 동반하고 있다고 할 수 있다. 더하여, 미지의 서열에 SDA법을 응용할 때에는, 합성되는 영역 중에 닉 도입을 위한 제한효소 인식서열과 동일한 염기서열이 존재할 가능성을 부정할 수 없다. 이러한 케이스에서는 완전한 상보사슬의 합성이 방해될 우려가 있다.However, in the SDA method, it is necessary to add a restriction enzyme which causes nicking in addition to the chain substitution type DNA polymerase. The increase in required enzyme is a factor of the increase in cost. In addition, in order to perform nick introduction (that is, cleavage of only one chain) rather than cleavage of double-stranded chains by restriction enzymes used, one substrate, such as αthio dNTP, is used as a substrate during synthesis so as to be resistant to enzymatic digestion. dNTP derivatives must be used. For this reason, the amplification product by SDA has a structure different from a natural nucleic acid, and the use of restriction | strength by restriction enzyme and application to the gene cloning of an amplification product is restrict | limited. In this regard, it can be said that the cost increase is accompanied. In addition, when the SDA method is applied to an unknown sequence, it is impossible to deny the possibility that there is a base sequence identical to the restriction enzyme recognition sequence for nick introduction in the synthesized region. In such cases, there is a fear that the synthesis of the complete complementary chain may be disturbed.
복잡한 온도제어가 불필요한 핵산의 증폭방법으로서, NASBA(Nucleic Acid Sequence-based Amplification, TMA/Transcription Mediated Amplification법으로도 불린다)가 공지이다. NASBA는, 표적 RNA를 주형으로 하여 T7 프로모터를 부가한 프로브로 DNA 폴리머라아제에 의한 DNA 합성을 행하고, 이것을 더욱이 제2 프로브로 이중가닥 사슬로 하여, 생성되는 이중가닥 사슬 DNA를 주형으로 하여 T7 RNA 폴리머라아제에 의한 전사를 행하게 하여 다량의 RNA를 증폭하는 반응계이다(Nature,350, 91-92, 1991). NASBA는 이중가닥 사슬 DNA를 완성할 때까지 몇개의 가열변성공정을 요구하지만, 이후의 T7 RNA 폴리머라아제에 의한 전사반응은 등온에서 진행한다. 그러나, 역전사효소, RNaseH, DNA 폴리머라아제, 그리고 T7 RNA 폴리머라아제라고 하는 복수 효소의 조합이 필수가 되기 때문에, SDA와 동일하게 비용면에서는 불리하다. 또 복수의 효소반응을 행하게 하기 위한 조건설정이 복잡하기 때문에, 일반적인 분석방법으로서 보급시키는 것이 어렵다. 이와 같이 공지의 핵산 증폭반응에 있어서는, 복잡한 온도제어의 문제점, 또는 복수의 효소가 필요로 해진다고 하는 과제가 남겨져 있다.As a nucleic acid amplification method that does not require complicated temperature control, NASBA (Nucleic Acid Sequence-based Amplification, also called TMA / Transcription Mediated Amplification method) is known. NASBA performs DNA synthesis by DNA polymerase with a probe to which a target RNA is used as a template and to which a T7 promoter is added, which is further double stranded with a second probe, and the resulting double stranded DNA is used as a template. It is a reaction system that amplifies a large amount of RNA by causing transcription by RNA polymerase (Nature, 350, 91-92, 1991). NASBA requires several heat denaturation steps to complete the double-stranded DNA, but subsequent transcription by T7 RNA polymerase proceeds isothermally. However, since a combination of plural enzymes called reverse transcriptase, RNaseH, DNA polymerase, and T7 RNA polymerase is essential, it is disadvantageous in terms of cost as well as SDA. Moreover, since the setting of conditions for performing a plurality of enzyme reactions is complicated, it is difficult to spread as a general analysis method. As described above, in the known nucleic acid amplification reaction, a problem of complicated temperature control or a plurality of enzymes remains.
더욱이, 이들 공지의 핵산 합성반응에 대해서, 특이성이나 비용을 희생으로 하지 않고 핵산의 합성효율을 더욱 향상시키는 시도에 대해서는, 거의 보고가 없다. 예를 들면, RCA(Rolling-circle amplification)라 불리는 방법에서는, 표적염기서열의 존재하에서 패드록 프로브(padlock probe)에 상보적인 염기서열이 연속된 단일가닥 사슬의 DNA를 계속해서 합성할 수 있는 것이 나타내어졌다(Paul M.Lizardi et al, Nature Genetics 19, 225-232, July, 1998). RCA에서는, 단일가닥의 올리고뉴클레오티드의 5'말단과 3'말단이 LCR에 있어서의 인접 프로브를 구성하는 특수한 구조의 패드록 프로브가 이용된다. 그리고 사슬 치환형 상보사슬 합성반응을 촉매하는 폴리머라아제를 조합시킴으로써, 표적염기서열의 존재하에서 라이게이션되어 고리화한 패드록 프로브를 주형으로 하는 연속적인 상보사슬 합성반응이 트리거된다. 동일한 염기서열로 된 영역이 반복하여 연속된 구조를 갖는 단일가닥 사슬 핵산이 생성된다. 이 단일가닥 핵산에 대해 더욱이 프라이머를 어닐링시켜그 상보사슬의 합성을 행하여, 고도의 증폭을 실현하고 있다. 그러나, 복수의 효소가 필요한 점은 여전히 남겨진 과제이다. 또한, 상보사슬 합성의 트리거는, 2개의 인접영역의 연결반응에 의존하고 있어, 그 특이성은 원리적으로 LCR과 동일한 레벨이다.Moreover, few attempts have been made on these known nucleic acid synthesis reactions to further improve the nucleic acid synthesis efficiency without sacrificing specificity or cost. For example, in a method called rolling-circle amplification (RCA), it is possible to continuously synthesize DNA of a single-stranded chain of sequential sequences complementary to a padlock probe in the presence of a target base sequence. (Paul M. Lizardi et al, Nature Genetics 19, 225-232, July, 1998). In RCA, a padlock probe having a special structure in which the 5 'end and the 3' end of the single-stranded oligonucleotide constitute an adjacent probe in the LCR is used. By combining the polymerase catalyzing the chain substitution type complementary chain synthesis reaction, a continuous complementary chain synthesis reaction is triggered by using a padlock probe ligated in the presence of the target base sequence. Regions of the same base sequence are repeated to form single stranded chain nucleic acids having a contiguous structure. The single-stranded nucleic acid is further annealed to synthesize a complementary chain thereof to achieve high amplification. However, the need for multiple enzymes remains a challenge. Moreover, the trigger of complementary chain synthesis depends on the linking reaction of two adjacent regions, and its specificity is in principle the same level as LCR.
3'-OH의 공급이라고 하는 과제에 대해서는, 3'말단에 동일 사슬 상의 염기서열에 상보적인 서열을 갖게 하여, 말단에서 헤어핀 루프를 형성시키는 방법이 공지이다(Gene 71, 29-40, 1988). 이와 같은 헤어핀 루프(hair pin loop)로부터는, 자신을 주형으로 한 상보사슬 합성이 행해지고, 상보적인 염기서열로 구성된 단일가닥 사슬의 핵산을 생성한다. 예를 들면, PCT/FR95/00891에서는, 상보적인 염기서열을 연결한 말단부분에서 동일 사슬 상에 어닐링하는 구조를 실현하고 있다. 그러나 이 방법에서는, 말단이 상보사슬과의 염기쌍 결합(base pairing)을 해소하여 새롭게 동일 사슬 상에서 염기쌍 결합을 구성하는 스텝이 필수이다. 이 스텝은 염기쌍 결합을 동반하는 상보적인 염기서열 끼리의 말단에 있어서의 미묘한 평형상태에 의존하여 진행하는 것으로 되어 있다. 즉, 상보사슬과의 염기쌍 결합과, 동일 사슬 상에서의 염기쌍 결합과의 사이에서 유지되는 평형상태를 이용하여, 동일 사슬 상의 염기서열과 어닐링한 것 만이 상보사슬의 합성기점이 된다. 따라서, 고도의 반응효율을 달성하기 위해서는, 엄밀한 반응조건의 설정이 요구되는 것으로 생각된다. 더욱이 이 선행기술에 있어서는, 프라이머 자신이 루프 구조를 만들고 있다. 그 때문에 프라이머 다이머(primer dimer)가 일단 생성되면, 표적염기서열의 유무에 상관 없이 자동적으로 증폭반응이 개시되어 비특이적인 합성산물을 형성해 버린다. 이것은 중대한 문제점이라고 할 수 있다. 더욱이, 프라이머 다이머의 생성과 그것에 동반되는 비특이적인 합성반응에 의한 프라이머의 소비가, 목적으로 하는 반응의 증폭효율의 저하로 이어진다.For the problem of supplying 3'-OH, a method is known in which a hairpin loop is formed at the end by having a sequence complementary to the base sequence on the same chain at the 3 'end (Gene 71, 29-40, 1988). . From such a hair pin loop, complementary chain synthesis using the template as a template is carried out to generate a single stranded nucleic acid composed of complementary nucleotide sequences. For example, in PCT / FR95 / 00891, the structure which anneals on the same chain in the terminal part which connected complementary base sequences is implement | achieved. However, in this method, the step of eliminating base pairing with the complementary chain at the terminal and forming a new base pair bond on the same chain is essential. This step is supposed to proceed depending on the delicate equilibrium at the ends of the complementary base sequences with base pair bonds. That is, only the annealing with the base sequence on the same chain using the equilibrium state maintained between the base pair bond with the complementary chain and the base pair bond on the same chain becomes the starting point of the synthesis of the complementary chain. Therefore, in order to achieve a high reaction efficiency, it is considered that exact setting of reaction conditions is required. Moreover, in this prior art, the primer itself is making a loop structure. Therefore, once a primer dimer is produced, an amplification reaction is automatically started with or without the target base sequence to form a nonspecific synthetic product. This is a major problem. Moreover, the consumption of the primers by the production of primer dimers and the nonspecific synthetic reactions accompanying them leads to a decrease in the amplification efficiency of the target reaction.
그 밖에, DNA 폴리머라아제에 대해 주형이 되지 않는 영역을 이용하여 동일 사슬에 어닐링하는 3'말단구조를 실현한 보고(EP713922)가 있다. 이 보고도 말단부분에 있어서의 동적 평형을 이용하고 있는 점, 또한 프라이머 다이머 형성에 동반되는 비특이적인 합성반응의 가능성에 있어서는 앞선 PCT/FR95/00891과 동일한 문제점을 갖는다. 더욱이, DNA 폴리머라아제의 주형이 되지 않는 특수한 영역을 프라이머로서 준비하지 않으면 안 된다.In addition, there is a report (EP713922) that realizes a 3 'terminal structure that anneals to the same chain using a region that is not a template for DNA polymerase. This report also has the same problems as the previous PCT / FR95 / 00891 in using the dynamic equilibrium at the end and the possibility of nonspecific synthetic reactions accompanied by primer dimer formation. Moreover, special regions that do not serve as templates for DNA polymerase must be prepared as primers.
또한 상기 NASBA의 원리를 응용한 각종 시그날 증폭반응에 있어서는, 이중가닥 사슬의 프로모터영역을 공급하기 위해 종종 말단에서 헤어핀상의 구조를 동반한 올리고뉴클레오티드가 이용된다(일본국 특개평5-211873). 그러나 이들은, 상보사슬 합성의 3'-OH의 연속적인 공급을 가능하게 하는 것은 아니다. 더욱이 일본국 특표평10-510161(WO96/17079)에 있어서는, RNA 폴리머라아제에 의해 전사되는 DNA 주형을 얻는 것을 목적으로 동일 사슬 상에 3'말단을 어닐링시킨 헤어핀 루프구조가 이용되고 있다. 이 방법에서는, RNA로의 전사와, RNA에서 DNA로의 역전사를 이용하여 주형의 증폭이 행해진다. 그러나, 이 방법도 복수의 효소를 조합시키지 않으면 반응계를 구성할 수 없다.Also, in various signal amplification reactions applying the principle of NASBA, oligonucleotides having a hairpin structure at the end are often used to supply a promoter region of a double-stranded chain (Japanese Patent Laid-Open No. Hei 5-211873). However, these do not enable the continuous supply of 3'-OH of complementary chain synthesis. Moreover, in Japanese Patent Application Laid-open No. 10-510161 (WO96 / 17079), a hairpin loop structure in which the 3 'end is annealed on the same chain is used for the purpose of obtaining a DNA template that is transcribed by RNA polymerase. In this method, template amplification is carried out using transcription to RNA and reverse transcription from RNA to DNA. However, this method also cannot constitute a reaction system without combining a plurality of enzymes.
발명의 개시Disclosure of the Invention
본 발명의 과제는, 신규한 원리를 토대로 하는 핵산의 합성방법을 제공하는 것이다. 보다 구체적으로는, 저비용으로 효율적으로 서열에 의존한 핵산의 합성을 실현할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 즉, 단일 효소를 사용하고, 또한 등온 반응 조건하에서도 핵산의 합성과 증폭을 달성할 수 있는 방법의 제공이, 본 발명의 과제이다. 더욱이 본 발명은, 공지의 핵산 합성반응 원리로는 달성하는 것이 곤란한 높은 특이성을 실현할 수 있는 핵산의 합성방법 및 이 합성방법을 응용한 핵산 증폭방법의 제공을 과제로 한다.An object of the present invention is to provide a method for synthesizing nucleic acids based on novel principles. More specifically, the present invention provides a method capable of efficiently and efficiently synthesizing a nucleic acid depending on a sequence at low cost. That is, it is a subject of the present invention to provide a method that can achieve the synthesis and amplification of nucleic acids even under the use of a single enzyme and under isothermal reaction conditions. Further, the present invention has an object to provide a method for synthesizing a nucleic acid capable of realizing high specificity which is difficult to achieve by known nucleic acid synthesis reaction principles, and a nucleic acid amplification method applying the synthesis method.
본 발명자 등은, 먼저 사슬 치환형 상보사슬 합성을 촉매하는 폴리머라아제의 이용이, 복잡한 온도제어에 의존하지 않는 핵산합성에 유용한 것에 착안했다. 이러한 DNA 폴리머라아제는, SDA나 RCA에서도 이용되는 효소이다. 그러나, 설령 이러한 효소를 사용했다고 하더라도, 공지의 프라이머를 토대로 하는 수법에서는, 예를 들면 SDA와 같이 합성기점이 되는 3'-OH를 공급하기 위해 항상 다른 효소반응이 요구된다.The present inventors first focused on the use of a polymerase that catalyzes the chain substitution type complementary chain synthesis, which is useful for nucleic acid synthesis that does not depend on complicated temperature control. Such DNA polymerase is an enzyme used also in SDA and RCA. However, even if such an enzyme is used, another enzyme reaction is always required in order to supply 3'-OH, which is a synthetic starting point, for example, SDA, based on known primers.
따라서 본 발명자 등은, 공지의 어프로치와는 전혀 다른 각도로부터 3'-OH의 공급에 대해서 검토했다. 그 결과, 특수한 구조를 가진 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써, 부가적인 효소반응에 의존하지 않고도 3'-OH의 공급이 가능해지는 것을 발견하고 본 발명을 완성했다. 즉 본 발명은, 아래 핵산의 합성방법, 더 나아가서는 이 핵산 합성방법을 응용한 핵산의 증폭방법 및 이들의 방법을 가능하게 하는 신규한 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.Therefore, the present inventors examined supply of 3'-OH from an angle completely different from a known approach. As a result, the inventors have found that by using oligonucleotides having a special structure, 3'-OH can be supplied without resorting to additional enzymatic reactions. That is, the present invention relates to a method for synthesizing a nucleic acid described below, further to a nucleic acid amplification method to which the nucleic acid synthesis method is applied, and a novel oligonucleotide which enables these methods.
[1] 아래의 공정을 포함하는 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 합성방법.[1] A method for synthesizing nucleic acids in which complementary nucleotide sequences are alternately linked on a single-stranded chain comprising the following steps.
a) 동일 사슬 상의 일부 F1c에 어닐링할 수 있는 영역 F1을 3'말단에 갖추고, 이 영역 F1이 F1c에 어닐링함으로써, 염기쌍 결합이 가능한 영역 F2c를 포함하는 루프를 형성할 수 있는 핵산을 부여하는 공정a) a step of providing a nucleic acid capable of forming a loop comprising a region F2c capable of base pair binding by having a region F1 that can anneal to some F1c on the same chain at the 3 'end and the region F1 annealed to F1c
b) F1c에 어닐링한 F1의 3'말단을 합성기점으로 하여 상보사슬 합성을 행하는 공정b) A step of performing complementary chain synthesis using the 3 'end of F1 annealed to F1c as a synthetic starting point.
c) 영역 F2c에 상보적인 서열로 된 F2를 3'말단에 포함하는 올리고뉴클레오티드를 어닐링시키고, 이것을 합성기점으로 하여 사슬 치환 상보사슬 합성반응을 촉매하는 폴리머라아제에 의한 상보사슬 합성을 행하여, 공정 b)에서 합성된 상보사슬을 치환하는 공정c) annealing the oligonucleotide comprising the F2 having the sequence complementary to the region F2c at the 3 'end, and synthesizing the complementary chain by a polymerase which catalyzes the chain substitution complementary chain synthesis reaction using the synthesis starting point; Substituting the complementary chain synthesized in b)
d) 공정 c)에서 치환되어 염기쌍 결합이 가능해진 상보사슬에 있어서의 임의의 영역에 상보적인 서열을 3'말단에 포함하는 폴리뉴클레오티드를 어닐링시키고, 그 3'말단을 합성기점으로 하여 사슬 치환 상보사슬 합성반응을 촉매하는 폴리머라아제에 의한 상보사슬 합성을 행하여, 공정 c)에서 합성된 상보사슬을 치환하는 공정d) annealing polynucleotides comprising a sequence complementary to any region in the complementary chain substituted in step c) to enable base pair bonding at the 3 'end, and the chain substitution complement using the 3' end as a synthetic starting point. A step of substituting the complementary chain synthesized in step c) by performing a complementary chain synthesis by a polymerase catalyzing the chain synthesis reaction
[2] [1]에 있어서, 공정 d)에 있어서, 합성기점이 영역 R1c에 어닐링할 수 있는 동일 사슬 상의 3'말단에 존재하는 영역 R1이고, R1이 R1c에 어닐링함으로써 염기쌍 결합이 가능한 영역 R2c를 포함하는 루프가 형성되는 방법.[2] In the step [1], in step d), the synthetic starting point is a region R1 present at the 3 'end of the same chain that can be annealed to the region R1c, and R1 is a region R2c capable of base pair bonding by annealing to R1c. How the loop comprising is formed.
[3] 적어도 아래 2개의 영역 X2 및 X1c로 구성되고, X2의 5'측에 X1c가 연결된 올리고뉴클레오티드.[3] An oligonucleotide consisting of at least two regions X2 and X1c below and linked to X1c on the 5 'side of X2.
X2 : 특정 염기서열을 갖는 핵산의 임의의 영역 X2c에 상보적인 염기서열을 갖는 영역X2: region having a nucleotide sequence complementary to any region X2c of a nucleic acid having a specific nucleotide sequence
X1c : 특정 염기서열을 갖는 핵산에 있어서의 영역 X2c의 5'측에 위치하는 영역 X1c와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 영역X1c: region having a base sequence substantially the same as region X1c located on the 5 'side of region X2c in a nucleic acid having a specific base sequence
[4] [1]에 있어서, 공정 a)에 있어서의 핵산이, 아래의 공정에 의해 제공되는 제2 핵산인 방법.[4] The method of [1], wherein the nucleic acid in step a) is a second nucleic acid provided by the following step.
i) 영역 X2가 영역 F2이고, 영역 X1c가 영역 F1c인 [3]의 올리고뉴클레오티드의 영역 F2를 주형으로 하는 핵산의 영역 F2c에 어닐링시키는 공정,i) annealing the region F2c of the nucleic acid having the region F2 of the oligonucleotide of [3], in which region X2 is region F2 and region X1c is region F1c,
ii) 올리고뉴클레오티드의 F2를 합성기점으로 하여, 주형에 상보적인 염기서열을 갖는 제1 핵산을 합성하는 공정ii) a step of synthesizing a first nucleic acid having a nucleotide sequence complementary to a template using F2 of the oligonucleotide as a synthetic starting point;
iii) 공정 ii)에서 합성된 제1 핵산의 임의의 영역을 염기쌍 결합이 가능한 상태로 하는 공정,iii) allowing any pair of the first nucleic acid synthesized in step ii) to be capable of base pair binding,
iv) 공정 iii)에 있어서의 제1 핵산의 염기쌍 결합을 가능하게 한 영역에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 어닐링시키고, 그것을 합성기점으로 하여 제2 핵산을 합성하여, 그 3'말단의 F1을 염기쌍 결합이 가능한 상태로 하는 공정iv) An oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to the region that enables base pair binding of the first nucleic acid in step iii) is annealed, and a second nucleic acid is synthesized using the synthesis starting point and F1 at the 3 'end. To make base-pair binding possible
[5] [4]에 있어서, 공정 iii)의 염기쌍 결합을 가능하게 하는 영역이 R2c이고, 또한 공정 iv)에 있어서의 올리고뉴클레오티드가, 영역 X2c가 영역 R2c이고, 영역 X1c가 영역 R1c인 [3]의 올리고뉴클레오티드인 방법.[5] The region [3], wherein the region allowing base pair bonding in step iii) is R2c, and in the oligonucleotide in step iv), region X2c is region R2c, and region X1c is region R1c. ] Oligonucleotide.
[6] [4] 또는 [5]에 있어서, 공정 iii) 및 iv)에 있어서의 염기쌍 결합이 가능한 상태로 하는 공정을, 주형에 있어서의 F2c의 더욱이 3'측에 어닐링하는 아웃터 프라이머(outer primer) 및 제1 핵산에 있어서의 공정 iv)에서 합성기점으로 한 영역의 더욱이 3'측에 어닐링하는 아웃터 프라이머를 합성기점으로 하는 사슬 치환 상보사슬 합성반응을 촉매하는 폴리머라아제에 의한 사슬 치환 상보사슬 합성에 의해 행하는 방법.[6] An outer primer according to [4] or [5], which anneals to the 3 'side of F2c in the mold, wherein the step of allowing base pair bonding in steps iii) and iv) is possible. Chain substitution complement chain by polymerase which catalyzes the chain substitution complement chain chain synthesis reaction using the outer primer annealed on the 3 'side of the region as the starting point of the synthesis in step iv) and the first nucleic acid. How to do it by synthesis.
[7] [6]에 있어서, 반응에 사용하는 각 올리고뉴클레오티드와 주형에 있어서의 그 상보영역과의 융해온도가, 동일한 스트린젠시하에서 다음의 관계에 있는 방법.[7] The method of [6], wherein the melting temperature of each oligonucleotide used for the reaction and its complementary region in the template is in the following relationship under the same stringency.
(아웃터 프라이머/주형에 있어서의 3'측의 영역)≤(F2c/F2 및 R2c/R2)≤(F1c/F1 및 R1c/R1)(Region on the 3 'side in the outer primer / template) ≤ (F2c / F2 and R2c / R2) ≤ (F1c / F1 and R1c / R1)
[8] [4] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 주형이 되는 핵산이 RNA이고, 공정 ii)에 있어서의 상보사슬 합성을 역전사 효소활성을 갖는 효소로 행하는 방법.[8] The method according to any one of [4] to [7], wherein the nucleic acid serving as a template is RNA, and the complementary chain synthesis in step ii) is performed with an enzyme having reverse transcriptase activity.
[9] 다음의 공정을 반복하는 것에 의한 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 증폭방법.[9] Amplification of nucleic acids in which complementary nucleotide sequences are alternately linked on a single-stranded chain by repeating the following steps.
A) 3'말단과 5'말단에 있어서, 각각 말단영역에 상보적인 염기서열로 된 영역을 동일 사슬 상에 갖추고, 이 서로 상보적인 염기서열이 어닐링했을 때에 양자 사이에 염기쌍 결합이 가능해지는 루프가 형성되는 주형을 제공하는 공정A) At the 3 'end and the 5' end, a loop having a base sequence complementary to the terminal region on the same chain and allowing base pair bonding between both when the complementary base sequences are annealed Process of providing the mold to be formed
B) 동일 사슬에 어닐링시킨 상기 주형의 3'말단을 합성기점으로 하여 상보사슬 합성을 행하는 공정,B) a step of performing complementary chain synthesis using the 3 'end of the template annealed in the same chain as a synthetic starting point,
C) 상기 루프 중 3'말단측에 위치하는 루프내에 상보적인 염기서열을 3'말단에 포함하는 올리고뉴클레오티드를, 루프부분에 어닐링시키고, 이것을 합성기점으로 하여 사슬 치환 상보사슬 합성반응을 촉매하는 폴리머라아제에 의한 상보사슬 합성을 행하여, 공정 B)에서 합성된 상보사슬을 치환하여 그 3'말단을 염기쌍 결합이 가능한 상태로 하는 공정, 및C) A polymer which anneals an oligonucleotide comprising a complementary base sequence at the 3 'end in the loop located at the 3' end side of the loop at the loop portion, and catalyzes the chain substitution complementary chain synthesis reaction using this as a synthetic starting point. Synthesizing the complementary chain by laase, replacing the complementary chain synthesized in step B), and leaving the 3 'end in a state capable of base pair bonding; and
D) 공정 C)에 있어서 3'말단을 염기쌍 결합이 가능한 상태로 한 사슬을 공정 A)에 있어서의 새로운 주형으로 하는 공정D) The process of making the new mold in process A) the chain | strand which made the 3 'terminal into base pair bonding possible in the process C)
[10] [9]에 있어서, 공정 C)에 있어서의 올리고뉴클레오티드가, 그의 5'측 말단에 공정 B)에 있어서 합성기점이 된 3'말단에 상보적인 염기서열을 갖춘 것인 증폭방법.[10] The amplification method according to [9], wherein the oligonucleotide in step C) has a nucleotide sequence complementary to the 3 'end that is the synthetic starting point in step B) at its 5' side.
[11] [10]에 있어서, 더욱이 공정 C)에 있어서의 올리고뉴클레오티드를 합성기점으로 하여 합성된 상보사슬을 공정 A)에 있어서의 주형으로 하는 공정을 포함하는 증폭방법.[11] The amplification method according to [10], further comprising a step in which the complementary chain synthesized using the oligonucleotide in step C) as a synthetic starting point is used as a template in step A).
[12] [9]에 있어서, 공정 A)에 있어서의 주형이 [5]의 방법에 의해 합성된 것인 증폭방법.[12] The amplification method according to [9], wherein the template in step A) is synthesized by the method of [5].
[13] [1] 또는 [9]에 있어서, 융해온도 조정제의 존재하에서 사슬 치환 상보사슬 합성반응을 행하는 방법.[13] The method of [1] or [9], wherein the chain substitution complementary chain synthesis reaction is performed in the presence of a melting temperature regulator.
[14] [13]에 있어서, 융해온도 조정제가 베타인인 방법.[14] The method of [13], wherein the melting temperature modifier is betaine.
[15] [14]에 있어서, 반응액중에 0.2~3.0 M의 베타인을 존재시키는 방법.[15] The method of [14], wherein 0.2 to 3.0 M of betaine is present in the reaction solution.
[16] [9] 내지 [15] 중 어느 하나의 증폭방법을 행하여, 증폭반응 생성물이 생겼는지의 여부를 관찰함으로써 시료중의 표적염기서열을 검출하는 방법.[16] A method for detecting a target base sequence in a sample by performing the amplification method according to any one of [9] to [15], and observing whether an amplification reaction product has occurred.
[17] [16]에 있어서, 증폭반응 생성물에, 루프에 상보적인 염기서열을 포함하는 프로브를 가하여, 양자의 하이브리다이즈를 관찰하는 방법.[17] The method of [16], wherein the hybridization is observed by adding a probe containing a nucleotide sequence complementary to the loop to the amplification reaction product.
[18] [17]에 있어서, 프로브가 입자표지되어 있어, 하이브리다이즈에 의해 생기는 응집반응을 관찰하는 방법.[18] The method of [17], wherein the probe is labeled with particles and the aggregation reaction caused by hybridization is observed.
[19] [16]에 있어서, 핵산의 검출제 존재하에서 [9] 내지 [15] 중 어느 하나의 증폭방법을 행하여, 검출제의 시그날변화를 토대로 하여 증폭반응 생성물이 생겼는지의 여부를 관찰하는 방법.[19] The method of [16], wherein the amplification method according to any one of [9] to [15] is carried out in the presence of a nucleic acid detection agent to observe whether an amplification reaction product has been generated based on the signal change of the detection agent. .
[20] [16]의 검출방법에 의해 표적염기서열의 변이를 검출하는 방법으로서, 증폭대상인 염기서열에 있어서의 변이가, 증폭방법을 구성하는 어느 하나의 상보사슬 합성을 방해하는 것인 방법.[20] A method for detecting a variation in a target base sequence by the detection method according to [16], wherein the variation in the nucleotide sequence to be amplified interferes with the synthesis of any complementary chain constituting the amplification method.
[21] 아래의 요소를 포함하는, 단일가닥 사슬상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 합성용 키트.[21] A kit for synthesizing nucleic acids, in which complementary sequences are alternately linked on a single-stranded chain, including the following elements.
i) [3]에 있어서, 주형이 되는 핵산의 영역 F2c를 X2c로 하고, F2c의 5'측에 위치하는 F1c를 X1c로 하는 올리고뉴클레오티드i) Oligonucleotide as described in [3], wherein region F2c of the nucleic acid serving as a template is X2c, and F1c located on the 5 'side of F2c is X1c.
ii) i)의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 합성된 상보사슬에 있어서의 임의의 영역에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드ii) an oligonucleotide comprising a base sequence complementary to any region in the complementary chain synthesized using the oligonucleotide of i) as a primer
iii) 주형이 되는 핵산의 영역 F2c의 3'측에 위치하는 영역 F3c에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드iii) an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to region F3c located on the 3 'side of region F2c of the nucleic acid as a template
iv) 사슬 치환형 상보사슬 합성반응을 촉매하는 DNA 폴리머라아제 및iv) a DNA polymerase that catalyzes chain substitution type complementary chain synthesis and
v) 요소 iv)의 기질이 되는 뉴클레오티드v) nucleotides as substrate of element iv)
[22] [21]에 있어서, ii)의 올리고뉴클레오티드가 i)의 올리고뉴클레오티드를 합성기점으로 하여 합성된 상보사슬에 있어서의 임의의 영역 R2c를 X2c로 하고, R2c의 5'에 위치하는 R1c를 X1c로 하는 [3]의 올리고뉴클레오티드인 키트.[22] The method of [21], wherein the oligonucleotide of ii) is an oligonucleotide of i) as a starting point, and any region R2c in the complementary chain synthesized is X2c, and R1c positioned at 5 'of R2c. The kit is an oligonucleotide of [3], which is referred to as X1c.
[23] [22]에 있어서, 더욱이 부가적으로 아래의 요소를 포함하는 키트.[23] The kit of [22], further comprising the following elements.
vi) i)의 올리고뉴클레오티드를 합성기점으로 하여 합성된 상보사슬에 있어서의 임의의 영역 R2c의 3'측에 위치하는 영역 R3c에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.vi) an oligonucleotide having a base sequence complementary to region R3c located on the 3 'side of any region R2c in the complementary chain synthesized using the oligonucleotide of i) as a synthetic starting point.
[24] [21] 내지 [23] 중 어느 하나의 키트에, 더욱이 부가적으로 핵산 합성반응의 생성물을 검출하기 위한 검출제를 포함하는, 표적염기서열의 검출용 키트.[24] A kit for detecting a target base sequence, further comprising a detection agent for detecting a product of a nucleic acid synthesis reaction, further comprising the kit of any of [21] to [23].
본 발명에 있어서 합성의 목적으로 하고 있는 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산이란, 단일가닥 사슬 상에 서로 상보적인 염기서열을 나란히 연결한 핵산을 의미한다. 더욱이 본 발명에 있어서는, 상보적인 염기서열 사이에 루프를 형성하기 위한 염기서열을 포함하지 않으면 안 된다. 본 발명에 있어서는, 이 서열을 루프 형성서열이라고 부른다. 그리고 본 발명에 의해 합성되는 핵산은, 실질적으로 상기 루프 형성서열에 의해 연결된 서로 상보적인 염기서열로 구성된다. 또한 일반적으로는, 그것이 부분적으로 염기쌍 결합을 동반하고 있는지의 여부에 상관 없이, 염기쌍 결합을 해리시켰을 때에 2개 이상의 분자로 분리되지 않는 것을 단일가닥 사슬이라고 부른다. 상보적인 염기서열은, 동일 사슬 상에서 염기쌍 결합을 형성할 수 있다. 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산을, 동일 사슬 상에서 염기쌍 결합시킴으로써 얻을 수 있는 분자내 염기쌍 결합 생성물은, 외관상 이중가닥 사슬을 구성하는 영역과, 염기쌍 결합을 동반하지 않는 루프부분을 부여한다.In the present invention, a nucleic acid in which complementary nucleotide sequences are alternately linked on a single-stranded chain intended for synthesis means a nucleic acid in which complementary nucleotide sequences are linked to each other on a single-stranded chain. Furthermore, in the present invention, a base sequence for forming a loop between complementary base sequences must be included. In the present invention, this sequence is called a loop formation sequence. The nucleic acid synthesized by the present invention is composed of complementary base sequences linked to each other by the loop forming sequences. In general, regardless of whether or not it partially carries base pair bonds, those which do not separate into two or more molecules when dissociating base pair bonds are called single-stranded chains. Complementary base sequences can form base pair bonds on the same chain. The intramolecular base pairing product obtained by base pairing a nucleic acid alternately complementary with a base sequence on a single-stranded chain according to the present invention is not accompanied by the region constituting the double-stranded chain and the base pairing. Gives the loop part
즉, 본 발명에 있어서의 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산이란, 동일 사슬 상에서 어닐링하는 것이 가능한 상보적인 염기서열을 포함하여, 그 어닐링 생성물은 구부러진 힌지부분에 염기쌍 결합을 동반하지 않는 루프를 구성하는 단일가닥 사슬 핵산이라고 정의할 수도 있다. 그리고 염기쌍 결합을 동반하지 않는 루프에는, 상보적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드를 어닐링할 수 있다. 루프 형성서열은 임의의 염기서열일 수 있다. 치환을 위한 상보사슬 합성을 개시할 수 있도록 염기쌍 결합이 가능하고, 바람직하게는 특이적인 어닐링을 달성하기 위해 다른 영역에 존재하는 염기서열로부터 식별 가능한 서열을 갖춘다. 예를 들면 바람직한 태양에 있어서는, 주형이 되는 핵산에 유래하여 동일 사슬 상에서 어닐링하는 영역(즉 F1c나 R1c)의 더욱이 3'측에 위치하는 영역 F2c(또는 R2c)와 실질적으로 동일한 염기서열을 포함한다.That is, the nucleic acid in which the complementary base sequences are alternately linked on the single-stranded chain in the present invention includes complementary base sequences that can be annealed on the same chain, and the annealing product does not have a base pair bond to the bent hinge portion. It can also be defined as a single-stranded chain nucleic acid constituting a non-loop. In a loop not accompanied by a base pair bond, nucleotides having complementary base sequences can be annealed. The loop formation sequence may be any base sequence. Base pair binding is possible to initiate complementary chain synthesis for substitution, and preferably has a sequence identifiable from base sequences present in other regions to achieve specific annealing. For example, in a preferred embodiment, the base sequence includes substantially the same base sequence as the region F2c (or R2c) located on the 3 'side of the region (ie, F1c or R1c) annealed on the same chain derived from the nucleic acid that is the template. .
본 발명에 있어서, 실질적으로 동일한 염기서열이란, 다음과 같이 정의된다. 즉, 어느 한 서열을 주형으로 하여 합성된 상보사슬이, 목적의 염기서열에 대해 어닐링하여 상보사슬의 합성기점을 부여할 때, 이 어느 한 서열은 목적의 염기서열에 대해 실질적으로 동일하다. 예를 들면 F2에 대해 실질적으로 동일한 염기서열이란, F2와 완전히 동일한 염기서열에 더하여, F2에 어닐링하여 상보사슬의 합성기점이 될 수 있는 염기서열을 부여하는 주형으로서 기능하는 염기서열을 포함한다. 본 발명에 있어서의 용어 「어닐링」은, 핵산이 와트슨-크릭(Watson-Crick)의 법칙을 토대로 하는 염기쌍 결합에 의해 이중가닥 사슬 구조를 형성하는 것을 의미한다. 따라서, 염기쌍 결합을 구성하는 핵산사슬이 단일가닥 사슬이더라도, 분자내의 상보적인 염기서열이 염기쌍 결합을 형성하면, 어닐링이다. 본 발명에 있어서, 어닐링과 하이브리다이즈는, 핵산이 염기쌍 결합에 의한 이중가닥 사슬 구조를 형성하는점에서 같은 뜻이다.In the present invention, substantially identical nucleotide sequences are defined as follows. In other words, when the complementary chain synthesized using any sequence as a template anneals to the target base sequence to give the starting point of the complementary chain, the sequence is substantially identical to the target base sequence. For example, a substantially identical nucleotide sequence to F2 includes a nucleotide sequence that functions as a template that gives an nucleotide sequence that can be an annealing chain of the complementary chain by annealing to F2 in addition to a nucleotide sequence that is exactly the same as F2. The term "annealing" in the present invention means that the nucleic acid forms a double-stranded chain structure by base pair bonds based on Watson-Crick's law. Therefore, even if the nucleic acid chain constituting the base pair bond is a single stranded chain, annealing is performed when the complementary base sequences in the molecule form the base pair bond. In the present invention, annealing and hybridization have the same meaning in that a nucleic acid forms a double-stranded chain structure by base pair bonds.
본 발명에 의한 핵산을 구성하는 상보적인 염기서열의 수는, 적어도 1쌍이다. 본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 이 정수배가 되는 경우도 있다. 그리고 이 경우, 이론적으로는 본 발명에 있어서의 상기 핵산을 구성하는 상보적인 염기서열쌍의 수에 상한은 없다. 본 발명의 합성 생성물인 핵산이 복수쌍의 상보적인 염기서열로 구성될 때, 이 핵산은 동일한 염기서열의 반복으로 된다.The number of complementary base sequences constituting the nucleic acid according to the present invention is at least one pair. According to the preferable aspect of this invention, this integer multiple may be sufficient. In this case, theoretically, there is no upper limit to the number of complementary base sequence pairs constituting the nucleic acid in the present invention. When a nucleic acid that is a synthetic product of the present invention is composed of a plurality of pairs of complementary base sequences, the nucleic acids are repeated in the same base sequence.
본 발명에 의해 합성되는 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산은, 반드시 천연 핵산과 동일한 구조를 취할 필요는 없다. 핵산 중합화효소의 작용에 의해 핵산을 합성할 때에 기질로서 뉴클레오티드 유도체를 이용하면, 핵산 유도체의 합성이 가능한 것은 공지이다. 이러한 뉴클레오티드 유도체에는, 방사성동위원소(radioisotope)로 표지한 뉴클레오티드나, 비오틴(biotin)이나 디곡신(digoxin)과 같은 결합성 리간드로 표지한 뉴클레오티드 유도체 등을 사용할 수 있다. 이들 뉴클레오티드 유도체를 사용함으로써, 생성물인 핵산 유도체의 표지가 달성된다. 또한, 형광성 뉴클레오티드를 기질로서 사용함으로써, 생성물인 핵산을 형광성 유도체로 할 수 있다. 더욱이 이 생성물은, DNA일 수도 있고, RNA로 할 수도 있다. 어느 것을 생성하는 가는, 프라이머의 구조, 중합을 위한 기질의 종류, 그리고 핵산의 중합을 행하는 중합화 시약과의 조합에 의해 결정된다.A nucleic acid in which complementary nucleotide sequences are alternately linked on a single-stranded chain synthesized by the present invention does not necessarily have to have the same structure as a natural nucleic acid. It is known that a nucleic acid derivative can be synthesized by using a nucleotide derivative as a substrate when synthesizing the nucleic acid by the action of the nucleic acid polymerase. As such nucleotide derivatives, nucleotides labeled with radioisotope, nucleotide derivatives labeled with a binding ligand such as biotin or digoxin can be used. By using these nucleotide derivatives, labeling of the nucleic acid derivative as a product is achieved. In addition, by using fluorescent nucleotides as a substrate, a nucleic acid as a product can be used as a fluorescent derivative. Furthermore, this product may be DNA or RNA. Which is produced is determined by the structure of the primer, the type of substrate for the polymerization, and the combination with the polymerization reagent for polymerizing the nucleic acid.
상기의 구조를 가진 핵산의 합성은, 사슬 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제와, 3'말단에 동일 사슬 상의 일부 F1c에 어닐링할 수 있는 영역 F1을 갖추고, 이 영역 F1이 동일 사슬 상의 F1c에 어닐링함으로써, 염기쌍 결합이 가능한 영역F2c를 포함하는 루프를 형성할 수 있는 핵산에 의해 개시할 수 있다. 헤어핀 루프를 형성시켜 자신을 주형(template)으로 하는 상보사슬 합성반응의 보고는 많지만, 본 발명에 있어서는 헤어핀 루프부분에 염기쌍 결합을 가능하게 하는 영역을 갖추고 있어, 이 영역을 상보사슬 합성에 이용하고 있는 점에 있어서 신규하다. 이 영역을 합성기점으로 함으로써, 먼저 자신을 주형으로 하여 합성된 상보사슬이 치환된다. 그리고 치환된 사슬의 3'측에 존재하는 영역 R1c(임의의 영역)가 염기쌍 결합 가능한 상태로 된다. 이 R1c에 상보적인 염기서열을 갖는 영역이 어닐링하여 상보사슬 합성을 행할 수 있고, 결과로서 F1에서 R1c에 이르는 염기서열과 그 상보사슬이 루프 형성서열을 매개로 하여 번갈아 결합한 핵산(2분자)이 생성된다. 본 발명에 있어서, 예를 들면 상기 R1c와 같이 임의로 선택되는 영역은, 그 영역에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 어닐링할 수 있고, 그리고 그 폴리뉴클레오티드를 합성기점으로 하여 합성되는 상보사슬이 본 발명에 필요한 기능을 갖추고 있는 한, 임의의 영역으로부터 선택할 수 있다.The synthesis of the nucleic acid having the above structure comprises a DNA polymerase having chain substitution activity and a region F1 capable of annealing to some F1c on the same chain at the 3 'end, and this region F1 is annealed to F1c on the same chain. In this way, it is possible to start with a nucleic acid capable of forming a loop including the region F2c capable of base pair binding. Although there are many reports of complementary chain synthesis reactions in which a hairpin loop is formed to form a template, the present invention includes a region for allowing base pair bonding to the hairpin loop portion, and this region is used for the complementary chain synthesis. It is new in that it is. By using this region as a starting point for synthesis, the complementary chain synthesized using itself as a template is first substituted. The region R1c (optional region) present on the 3 'side of the substituted chain is in a state capable of base pair bonding. The region having a base sequence complementary to R1c can be annealed to perform complementary chain synthesis. As a result, the nucleotide sequence from F1 to R1c and its complementary chain are alternately bound to each other via a loop forming sequence. Is generated. In the present invention, for example, a region arbitrarily selected such as R1c can anneal a polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to the region, and a complementary chain synthesized using the polynucleotide as a synthetic starting point is seen. As long as it has the function required for invention, it can select from arbitrary areas.
더욱이 본 발명에서는, 핵산이라고 하는 용어를 사용한다. 본 발명에 있어서 핵산이란, 일반적으로는 DNA와 RNA 양쪽을 포함한다. 그러나, 구성 뉴클레오티드가 인공적인 유도체로 치환되어 있는 것이나, 또는 천연 DNA나 RNA가 수식된 것이더라도, 상보사슬 합성을 위한 주형으로서 기능하는 한, 본 발명의 핵산에 포함된다. 본 발명의 핵산은, 일반적으로 생물학적인 시료에 포함된다. 생물학적 시료란, 동물, 식물, 또는 미생물의 조직, 세포, 배양물, 배설물 또는 그들의 추출물을 나타낼 수 있다. 본 발명의 생물학적 시료에는, 바이러스나 마이코플라즈마(mycoplasma)와 같은 세포내 기생체의 게놈 DNA, 또는 RNA가 포함된다. 또 본 발명의 핵산은, 상기 생물학적 시료에 포함되는 핵산으로부터 유도된 것이더라도 좋다. 예를 들면, mRNA를 토대로 합성된 cDNA나, 생물학적 시료에 유래하는 핵산을 토대로 증폭된 핵산은, 본 발명에 있어서의 핵산의 대표적인 것이다.Furthermore, in the present invention, the term nucleic acid is used. In the present invention, a nucleic acid generally includes both DNA and RNA. However, even if constituent nucleotides are substituted with artificial derivatives or natural DNA or RNA is modified, they are included in the nucleic acid of the present invention as long as they function as templates for complementary chain synthesis. The nucleic acid of the present invention is generally included in a biological sample. Biological samples may refer to tissues, cells, cultures, feces or extracts of animals, plants or microorganisms. The biological sample of the present invention includes genomic DNA or RNA of an intracellular parasite such as a virus or mycoplasma. The nucleic acid of the present invention may be derived from a nucleic acid contained in the biological sample. For example, cDNA synthesized on the basis of mRNA and nucleic acid amplified based on a nucleic acid derived from a biological sample are typical of nucleic acids in the present invention.
본 발명의 특징으로 되어 있는, 3'말단에 동일 사슬 상의 일부 F1c에 어닐링할 수 있는 영역 F1을 갖추고, 이 영역 F1이 동일 사슬 상의 F1c에 어닐링함으로써, 염기쌍 결합이 가능한 영역 F2c를 포함하는 루프를 형성할 수 있는 핵산은, 여러 방법에 의해 얻을 수 있다. 가장 바람직한 태양에 있어서는, 다음의 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용한 상보사슬 합성반응을 토대로 그 구조를 부여할 수 있다.A loop comprising a region F2c capable of base pair bonding by having a region F1 at the 3 'end capable of annealing to some F1c on the same chain and annealing to F1c on the same chain, characterized by the present invention Nucleic acid that can be formed can be obtained by various methods. In the most preferable aspect, the structure can be provided based on the complementary chain synthesis reaction using the oligonucleotide which has the following structure.
즉 본 발명에 있어서 유용한 올리고뉴클레오티드란, 적어도 아래의 2개의 영역 X2 및 X1c로 구성되고, X2의 5'측에 X1c가 연결된 올리고뉴클레오티드로 된다.In other words, an oligonucleotide useful in the present invention is an oligonucleotide composed of at least two regions X2 and X1c below and X1c is linked to the 5 'side of X2.
X2 : 특정 염기서열을 갖는 핵산의 영역 X2c에 상보적인 염기서열을 갖는 영역X2: region of nucleic acid having a specific nucleotide sequence region having a nucleotide sequence complementary to X2c
X1c : 특정 염기서열을 갖는 핵산에 있어서의 영역 X2c의 5'측에 위치하는 영역 X1c와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 영역X1c: region having a base sequence substantially the same as region X1c located on the 5 'side of region X2c in a nucleic acid having a specific base sequence
여기에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 구조를 결정하는 특정 염기서열을 갖는 핵산이란, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 이용할 때에, 그 주형이 되는 핵산을 의미한다. 본 발명의 합성방법을 토대로 핵산의 검출을 행하는 경우에는, 특정 염기서열을 갖는 핵산이란, 검출대상, 또는 검출대상으로부터 유도된 핵산이다. 특정 염기서열을 갖는 핵산은, 적어도 그 일부의 염기서열이 명확해져 있거나. 또는 추측이 가능한 상태에 있는 핵산을 의미한다. 염기서열을 명확하게 해야할 부분이란, 상기 영역 X2c 및 그 5'측에 위치하는 영역 X1c이다. 이 2개의 영역은, 연속하는 경우, 그리고 떨어져 존재하는 경우를 상정할 수 있다. 양자의 상대적인 위치관계에 의해, 생성물인 핵산이 자기 어닐링했을 때에 형성되는 루프부분의 상태가 결정된다. 또한, 생성물인 핵산이 분자간의 어닐링이 아니라 자기 어닐링을 우선적으로 행하기 위해서는, 양자의 거리가 불필요하게 떨어지지 않는 쪽이 바람직하다. 따라서, 양자의 위치관계는, 통상 0-500염기분의 거리를 사이에 두고 연속하도록 하는 것이 바람직하다. 단, 뒤에 기술하는 자기 어닐링에 의한 루프의 형성에 있어서, 양자가 지나치게 접근해 있는 경우에는 바람직한 상태의 루프의 형성을 행하기에는 불리해지는 케이스도 예상된다. 루프에 있어서는, 새로운 올리고뉴클레오티드의 어닐링과, 그것을 합성기점으로 하는 사슬 치환을 동반하는 상보사슬 합성반응을 순조롭게 개시할 수 있는 구조가 요구된다. 따라서 보다 바람직하게는, 영역 X2c 및 그 5'측에 위치하는 영역 X1c와의 거리가, 0~100염기, 더욱 바람직하게는 10~70염기가 되도록 설계한다. 또한 이 수치는 X1c와 X2를 포함하지 않은 길이를 나타내고 있다. 루프부분을 구성하는 염기수는, 더욱이 X2에 상당하는 영역을 가한 길이가 된다.Here, the nucleic acid which has a specific base sequence which determines the structure of the oligonucleotide of this invention means the nucleic acid used as the template when using the oligonucleotide of this invention as a primer. In the case of detecting a nucleic acid based on the synthesis method of the present invention, a nucleic acid having a specific nucleotide sequence is a nucleic acid derived from or to be detected. Nucleic acid having a specific base sequence is at least a part of the base sequence is clear. Or nucleic acid in a state where speculation is possible. The part which should make clear the nucleotide sequence is the said area | region X2c and the area | region X1c located in the 5 'side. These two regions can assume the case where they are continuous and when they exist apart. The relative positional relationship between the two determines the state of the loop portion formed when the product nucleic acid is self-annealed. Moreover, in order that the nucleic acid which is a product preferentially performs magnetic annealing rather than intermolecular annealing, it is preferable that the distance of both does not unnecessarily fall. Therefore, it is preferable that the positional relationship between the two is usually continued with a distance of 0-500 bases therebetween. However, in the formation of a loop by magnetic annealing described later, in a case where both approaches too much, a case which is disadvantageous to form a loop in a preferable state is also expected. In the loop, a structure capable of smoothly initiating a complementary chain synthesis reaction involving annealing of new oligonucleotides and chain substitution using the synthetic oligonucleotide as a starting point thereof is required. Therefore, More preferably, the distance between the area X2c and the area X1c located on the 5 'side is designed to be 0 to 100 bases, and more preferably 10 to 70 bases. In addition, this figure has shown the length which does not contain X1c and X2. The number of bases constituting the loop portion is further the length of the region corresponding to X2.
또한 본 발명을 토대로 하는 올리고뉴클레오티드를 구성하는 염기서열의 특징부여를 위해 사용되는 동일, 또는 상보적이라고 하는 용어는, 모두 완전하게 동일, 또는 완전히 상보적인 것을 의미하지 않는다. 즉, 어느 서열과 동일하다고 하는 것은, 어느 서열에 대해 어닐링할 수 있는 염기서열에 대해 상보적인 서열도 포함할 수 있다. 한편, 상보적이란, 스트린젠트한 조건하에서 어닐링할 수 있고, 상보사슬의 합성기점이 되는 3'말단을 제공할 수 있는 서열을 의미한다.In addition, the same or complementary terms used for characterizing the nucleotide sequences constituting the oligonucleotide based on the present invention do not mean to be completely identical or completely complementary. That is, the same as any sequence may include a sequence complementary to the base sequence that can be annealed to any sequence. On the other hand, complementary means a sequence that can be annealed under stringent conditions and can provide a 3 'end that is a synthetic starting point of the complementary chain.
상기 특정 염기서열을 갖는 핵산에 대해 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드를 구성하는 영역 X2 및 X1c는, 통상은 중복되지 않게 연속하여 배치된다. 또는 만일 양자의 염기서열에 공통 부분이 있는 것이라면, 부분적으로 양자를 겹쳐 배치할 수도 있다. X2는 프라이머로서 기능할 필요가 있기 때문에, 항상 3'말단이 되도록 하지 않으면 안 된다. 한편 X1c는 뒤에 기술하는 바와 같이, 이것을 주형으로 하여 합성된 상보사슬의 3'말단에 프라이머로서의 기능을 부여할 필요가 있기 때문에, 5'말단에 배치한다. 이 올리고뉴클레오티드를 합성기점으로 하여 얻어지는 상보사슬은, 다음의 스텝에 있어서는 역방향으로부터의 상보사슬 합성의 주형으로 되고, 최종적으로는 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드부분도 주형으로서 상보사슬에 카피된다. 카피됨으로써 생기는 3'말단은 염기서열 X1을 갖추고 있어, 동일 사슬 상의 X1c에 어닐링하는 동시에, 루프를 형성한다.The regions X2 and X1c constituting the oligonucleotide according to the present invention with respect to the nucleic acid having the specific nucleotide sequence are usually arranged continuously so as not to overlap. Alternatively, if there is a common part in the nucleotide sequence of both, it may be arranged partially overlapping. Since X2 needs to function as a primer, it must always be at the 3 'end. On the other hand, X1c is arranged at the 5 'end because it is necessary to impart the function as a primer to the 3' end of the complementary chain synthesized as a template, as described later. The complementary chain obtained by using this oligonucleotide as a synthetic starting point forms a template for synthesis of the complementary chain from the reverse side in the next step, and finally the oligonucleotide portion according to the present invention is also copied into the complementary chain as a template. The 3 'end produced by copying has the base sequence X1, anneals to X1c on the same chain, and forms a loop.
본 발명에 있어서 올리고뉴클레오티드란, 상보적인 염기쌍 결합을 형성할 수 있는 것, 그리고 그 3'말단에 있어서 상보사슬의 합성기점이 되는 -OH기를 부여하는 것의 2개의 조건을 충족하는 것을 의미한다. 따라서, 그 백본은 반드시 포스포디에스테르결합에 의한 것에 한정되지 않는다. 예를 들면 O가 아니라 S를 백본으로 한 포스포티오에이트체 및 펩티드결합을 토대로 하는 펩티드핵산으로 된 것인 것일 수도 있다. 또한, 염기는, 상보적인 염기쌍 결합을 가능하게 하는 것이라면 좋다. 천연 상태에서는, 일반적으로는 ACTG 및 U의 5종류가 되지만, 예를 들면 브로모데옥시우리딘(bromodeoxyuridine)이라고 하는 유사체일 수도 있다. 본 발명에 사용하는 올리고뉴클레오티드는, 합성의 기점이 될 뿐 아니라, 상보사슬 합성의 주형으로서도 기능하는 것인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 용어로서 폴리뉴클레오티드를 사용한다. 용어 폴리뉴클레오티드는, 그 사슬길이를 제한하지 않는 경우에 사용하고, 올리고뉴클레오티드는 비교적 짧은 사슬길이의 뉴클레오티드 중합체를 의미하는 용어로서 사용된다.In the present invention, an oligonucleotide means that two conditions are satisfied: one capable of forming complementary base pair bonds and giving -OH groups, which are the synthetic starting point of the complementary chain, at the 3 'end thereof. Therefore, the backbone is not necessarily limited to those by phosphodiester bonds. For example, the phosphothioate body using S as the backbone and the peptide nucleic acid based on peptide bonds may be used instead of O. The base may be any one that enables complementary base pair bonding. In the natural state, there are generally five kinds of ACTG and U, but an analogue such as bromodeoxyuridine may be used. It is preferable that the oligonucleotide used for this invention not only becomes a starting point of a synthesis, but also functions as a template of a complementary chain synthesis. In addition, in this invention, polynucleotide is used as a term containing an oligonucleotide. The term polynucleotide is used when the chain length is not limited, and oligonucleotide is used as a term meaning a nucleotide polymer having a relatively short chain length.
본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드는, 아래에 기술하는 각종 핵산 합성반응에 있어서, 주어진 환경하에서 필요한 특이성을 유지하면서 상보사슬과의 염기쌍 결합을 행할 수 있는 정도의 사슬길이를 갖는다. 구체적으로는, 5-200염기, 보다 바람직하게는 10-50염기쌍으로 한다. 서열 의존적인 핵산 합성반응을 촉매하는 공지의 폴리머라아제가 인식하는 프라이머의 사슬길이가, 최저 5염기 전후이기 때문에, 어닐링하는 부분의 사슬길이는 그 이상일 필요가 있다. 더하여, 염기서열로서의 특이성을 기대하기 위해서는, 확률적으로 10염기 이상의 길이를 이용하는 것이 바람직하다. 한편, 지나치게 긴 염기서열은 화학합성에 의해 조제하는 것이 곤란하기 때문에, 상기와 같은 사슬길이가 바람직한 범위로서 예시된다. 또한, 여기에서 예시한 사슬길이는 어디까지나 상보사슬과 어닐링하는 부분의 사슬길이다. 뒤에 기술하는 바와 같이, 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드는 최종적으로는 적어도 2개의 영역에 개별적으로 어닐링할 수 있다. 따라서, 여기에 예시하는 사슬길이는, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 각 영역의 사슬길이로 이해해야 할 것이다.In the various nucleic acid synthesis reactions described below, the oligonucleotides of the present invention have a chain length such that base pair bonds with the complementary chain can be performed while maintaining the required specificity under a given environment. Specifically, it is 5-200 bases, More preferably, it is 10-50 base pairs. Since the chain length of the primer recognized by a known polymerase catalyzing the sequence dependent nucleic acid synthesis reaction is about 5 bases, the chain length of the annealing portion needs to be more than that. In addition, in order to expect specificity as a nucleotide sequence, it is preferable to use the length more than 10 bases. On the other hand, since an excessively long base sequence is difficult to prepare by chemical synthesis, such a chain length is illustrated as a preferable range. In addition, the chain length illustrated here is the chain length of the part which anneals with a complementary chain to the last. As will be described later, oligonucleotides according to the invention can finally anneal individually to at least two regions. Therefore, the chain length exemplified herein should be understood as the chain length of each region constituting the oligonucleotide.
더욱이, 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드는, 공지의 표지물질에 의해 표지할 수 있다. 표지물로서는, 디곡신이나 비오틴과 같은 결합성 리간드, 효소, 형광물질이나 발광물질, 또는 방사성 동위원소 등을 나타낼 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 염기를 형광성 아날로그로 치환하는 기술(WO95/05391, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6644-6648, 1994)도 공지이다.Furthermore, the oligonucleotide of the present invention can be labeled with a known labeling substance. As the label, a binding ligand such as digoxin or biotin, an enzyme, a fluorescent substance or a luminescent substance, a radioisotope, or the like can be represented. In addition, a technique for replacing the base constituting the oligonucleotide with a fluorescent analog (WO 95/05391, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6644-6648, 1994) is also known.
이 밖에 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드는, 그 자신을 고상으로 결합시켜 둘 수도 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드의 임의의 부분에 비오틴과 같은 결합성 리간드로 표지해 두고, 이것을 고상화 아비딘과 같은 결합 파트너에 의해 간접적으로 고상화할 수도 있다. 고상화 올리고뉴클레오티드를 합성 개시점으로 하는 경우에는, 핵산의 합성반응 생성물이 고상으로 포착되기 때문에, 분리가 용이해진다. 분리된 생성물에 대해, 핵산 특이적인 지시약이나, 또는 더욱이 표지 프로브를 하이브리다이즈시킴으로써, 검출을 행하는 것도 가능하다. 또한, 임의의 제한효소로 소화함으로써, 목적으로 하는 핵산의 단편을 회수할 수도 있다.In addition, the oligonucleotide according to the present invention may be bound to itself in a solid phase. In addition, any part of the oligonucleotide may be labeled with a binding ligand such as biotin, and this may be indirectly solidified by a binding partner such as solidifying avidin. In the case where the solidified oligonucleotide is used as the starting point of the synthesis, since the reaction product of the nucleic acid synthesis reaction is trapped in the solid phase, the separation becomes easy. Detection of the isolated product can be performed by hybridizing a nucleic acid specific indicator or a labeled probe. In addition, by digesting with any restriction enzyme, a fragment of the nucleic acid of interest can also be recovered.
본 발명에 있어서 사용되는 주형이라는 용어는, 상보사슬 합성의 주형이 되는 측의 핵산을 의미한다. 주형에 상보적인 염기서열을 갖는 상보사슬은, 주형에 대응하는 사슬로서의 의미를 갖지만, 양자의 관계는 어디까지나 상대적인 것에 지나지 않는다. 즉, 상보사슬로서 합성된 사슬은, 다시 주형으로서 기능할 수 있다. 즉, 상보사슬은 주형이 될 수 있다.The term template used in the present invention means a nucleic acid on the side of the template for complementary chain synthesis. The complementary chain having a nucleotide sequence complementary to the template has a meaning as a chain corresponding to the template, but the relationship between the two is only relative. That is, the chain synthesize | combined as a complementary chain can function as a template again. That is, the complementary chain can be a template.
본 발명에 유용한 올리고뉴클레오티드는 상기 2개의 영역 뿐 아니라, 더욱이 부가적인 영역을 포함할 수 있다. X2와 X1c가 각각 3'말단과 5'말단에 배치되는 한편, 양자 사이에 임의의 서열을 개재시키는 것이 가능하다. 그것은, 예를 들면 제한효소 인식서열, RNA 폴리머라아제가 인식하는 프로모터, 또는 리보자임을 코드하는 DNA 등일 수 있다. 제한효소 인식서열로 함으로써, 본 발명의 합성산물인 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산을 동일한 길이를 가진 이중가닥 사슬 핵산으로 자를 수 있게 된다. RNA 폴리머라아제가 인식하는 프로모터서열을 배치하면, 본 발명의 합성 생성물을 주형으로 하여 더욱이 RNA로의 전사가 행해진다. 이 때에, 더욱이 리보자임을 코드하는 DNA를 배치하면, 전사생성물을 자신이 절단하는 계가 실현된다. 또한, 이들 부수적인 염기서열은 모두 이중가닥 사슬로 된 경우에 기능하는 것이다. 따라서, 본 발명에 의한 단일가닥 사슬의 핵산이 루프를 형성하고 있을 때에는, 이들 서열은 기능하지 않는다. 핵산의 신장이 진행되어, 루프를 포함하지 않는 상태에서 상보적인 염기서열을 갖는 사슬과 어닐링한 상태가 되었을 때에 비로소 기능한다.Oligonucleotides useful in the present invention may comprise not only these two regions, but also additional regions. While X2 and X1c are arranged at the 3 'end and the 5' end, respectively, it is possible to intervene any sequence between them. It may be, for example, a restriction enzyme recognition sequence, a promoter recognized by an RNA polymerase, or a DNA encoding a ribozyme. By using the restriction enzyme recognition sequence, nucleic acids complementarily linked with complementary nucleotide sequences on a single stranded chain which is a synthetic product of the present invention can be cut into double stranded chain nucleic acids having the same length. By arranging the promoter sequences recognized by the RNA polymerase, transcription to RNA is further performed using the synthetic product of the present invention as a template. At this time, by arranging the DNA encoding the ribozyme, a system for cutting the transcription product by itself is realized. In addition, these subsidiary nucleotide sequences function when they are all double stranded chains. Therefore, when the nucleic acid of the single-stranded chain according to the present invention forms a loop, these sequences do not function. When the nucleic acid is elongated and annealed with a chain having complementary nucleotide sequences in a state that does not include a loop, it functions.
본 발명을 토대로 하는 올리고뉴클레오티드에 대해, 합성된 영역의 전사를 가능하게 하는 방향으로 프로모터를 조합시킨 경우, 동일한 염기서열을 반복하는 본 발명을 토대로 하는 반응생성물은, 고도로 효율적인 전사계를 실현한다. 이것을 적당한 발현계와 조합시킴으로써, 단백질로의 번역도 가능하다. 즉, 세균이나 동물세포내에서 또는 in vitro에서의 전사와 단백질로의 번역에 이용할 수 있다.When the promoter is combined with the oligonucleotide based on the present invention in a direction that enables the transcription of the synthesized region, the reaction product based on the present invention repeating the same nucleotide sequence realizes a highly efficient transcription system. By combining this with a suitable expression system, translation into a protein is also possible. That is, it can be used for transcription and translation into proteins in bacteria or animal cells or in vitro.
상기와 같은 구조의 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드는, 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 천연 핵산을 제한효소 등에 의해 절단하여, 상기와 같은 염기서열로 구성되도록 개변하거나 또는 연결하는 것도 가능하다.The oligonucleotide according to the present invention having the above structure can be synthesized chemically. In addition, the natural nucleic acid can be cleaved with a restriction enzyme or the like, and modified or linked to be composed of the above nucleotide sequences.
본 발명에 의한 핵산의 합성방법에 있어서 유용한 상기 올리고뉴클레오티드를 이용하여, 사슬 치환 활성을 가진 DNA 폴리머라아제와 조합시켜 합성을 행하는 반응에 대해서, 기본적인 원리를 도 5-6을 참고로 하면서 아래에 설명한다. 상기 올리고뉴클레오티드(도 5에 있어서의 FA)는, 먼저 X2(F2에 상당)가 주형이 되는 핵산에 어닐링하여 상보사슬의 합성기점이 된다. 도 5에 있어서는 FA를 기점으로 하여 합성된 상보사슬이 아웃터 프라이머(F3)로부터의 상보사슬 합성(후술)에 의해 치환되어, 단일가닥 사슬(도 5-A)로 되어 있다. 얻어진 상보사슬에 대해 더욱이 상보사슬 합성을 행하면, 이 때 도 5-A의 상보사슬로서 합성되는 핵산의 3'말단부분은, 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는다. 즉, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 그 5'말단부분에 영역 X1c(F1c에 상당)와 동일한 서열을 갖기 때문에, 이 때 합성되는 핵산의 3'말단부분은 그 상보서열 X1(F1)을 갖게 된다. 도 5는, R1을 기점으로 하여 합성된 상보사슬이 아웃터 프라이머 R3을 기점으로 하는 상보사슬 합성에 의해 치환되는 모습을 나타내고 있다. 치환에 의해 3'말단부분이 염기쌍 결합이 가능한 상태로 되면, 3'말단의 X1(F1)은, 동일 사슬 상의 X1c(F1c)에 어닐링하여, 자기를 주형으로 한 신장반응이 진행된다(도 5-B). 그리고 그 3'측에 위치하는 X2c(F2c)를 염기쌍 결합을 동반하지 않는 루프로서 남긴다. 이 루프에는 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드의 X2(F2)가 어닐링하여, 이것을 합성 기점으로 하는 상보사슬 합성이 행해진다(도 5-B). 이 때, 먼저 합성된 자신을 주형으로 하는 상보사슬 합성반응의 생성물이, 사슬 치환반응에 의해 치환되어 염기쌍 결합이 가능한 상태가 된다.Using the oligonucleotides useful in the method for synthesizing the nucleic acid according to the present invention, a reaction is performed in combination with a DNA polymerase having a chain substitution activity. Explain. The oligonucleotide (FA in Fig. 5) is first annealed to a nucleic acid on which X2 (corresponding to F2) is a template to form a starting point of the complementary chain. In Fig. 5, the complementary chain synthesized from FA is replaced by the complementary chain synthesis (described later) from the outer primer (F3) to form a single stranded chain (Fig. 5-A). When the complementary chain synthesis is further performed on the obtained complementary chain, the 3 'terminal portion of the nucleic acid synthesized as the complementary chain in Fig. 5-A has a nucleotide sequence complementary to the oligonucleotide of the present invention. That is, since the oligonucleotide of the present invention has the same sequence as the region X1c (corresponding to F1c) at its 5 'end, the 3' end of the nucleic acid synthesized at this time has its complementary sequence X1 (F1). . Fig. 5 shows a state in which the complementary chain synthesized from R1 is replaced by the complementary chain synthesis starting from the outer primer R3. When the 3 'end becomes a state capable of base pair bonding by substitution, X1 (F1) at the 3' end is annealed to X1c (F1c) on the same chain, and an elongation reaction using magnetization proceeds (Fig. 5). -B). And X2c (F2c) located in the 3 'side is left as a loop which does not accompany base pair bond. In this loop, X2 (F2) of the oligonucleotide of the present invention is annealed, and a complementary chain synthesis is performed using this as a starting point for synthesis (Fig. 5-B). At this time, the product of the complementary chain synthesis reaction which uses the synthesize | combined self as a template first is substituted by chain substitution reaction, and it becomes a state which can base-pair bond.
본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드를 1종류, 그리고 이 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 합성된 상보사슬을 주형으로 하여 핵산합성을 행하는 것이 가능한 임의의 리버스 프라이머를 사용한 기본적인 구성에 의해, 도 6에 나타내는 바와 같은 복수의 핵산 합성 생성물을 얻을 수 있다. 도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, (D)가 본 발명에 있어서 합성의 목적으로 되어 있는 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산이다. 다른쪽 생성물(E)는, 가열변성 등의 처리에 의해 단일가닥 사슬로 하면 다시 (D)를 생성하기 위한 주형으로 된다. 또 이중가닥 사슬 상태에 있는 핵산인 생성물(D)는, 만일 가열변성 등에 의해 단일가닥 사슬로 된 경우, 원래의 이중가닥 사슬은 되지 않고 높은 확률로 동일 사슬 내부에서의 어닐링이 일어난다. 왜냐하면, 동일한 융해온도(Tm)를 갖는 상보서열이라면, 분자간(intermolecular)반응 보다도 분자내(intramolecular)반응 쪽이 훨씬 우선적으로 진행되기 때문이다. 동일 사슬 상에서 어닐링한 생성물(D)에 유래하는 단일가닥 사슬은, 각각이 동일 사슬 내에서 어닐링하여 (B)의 상태로 되돌아가기 때문에, 더욱이 각각이 1분자씩의 (D)와 (E)를 부여한다. 이들 공정을 반복함으로써, 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산을 차례로 합성해 가는 것이 가능하다. 1사이클로 생성되는 주형과 생성물이 지수적으로 늘어가기 때문에, 대단히 효율적인 반응이 된다.A plurality of oligonucleotides according to the present invention, and a plurality of as shown in Fig. 6 by a basic configuration using any reverse primer capable of performing nucleic acid synthesis using the complementary chain synthesized using the oligonucleotide as a primer as a template. Nucleic acid synthesis products can be obtained. As can be seen from FIG. 6, (D) is a nucleic acid in which complementary nucleotide sequences are alternately linked on a single-stranded chain for synthesis purposes in the present invention. The other product (E) becomes a template for producing (D) again when it becomes single stranded chain by processing, such as heat denaturation. Also, if the product (D), which is a nucleic acid in a double-stranded chain, becomes a single-stranded chain by heat denaturation or the like, the original double-stranded chain does not become the original double-stranded chain, and annealing occurs in the same chain with a high probability. This is because in the complementary sequence having the same melting temperature (Tm), the intramolecular reaction proceeds more preferentially than the intermolecular reaction. Single-stranded chains derived from the product (D) annealed on the same chain are each annealed in the same chain and return to the state of (B), so that each molecule (D) and (E) Grant. By repeating these steps, it is possible to sequentially synthesize nucleic acids in which complementary nucleotide sequences are alternately linked on a single-stranded chain. The exponential increase in the template and product produced in one cycle results in a very efficient reaction.
그런데 도 5-(A)의 상태를 실현하기 위해서는, 처음에 합성된 상보사슬을 적어도 리버스 프라이머가 어닐링하는 부분에 있어서 염기쌍 결합이 가능한 상태로 하지 않으면 안 된다. 이 스텝은 임의의 방법에 의해 달성할 수 있다. 즉, 최초의 주형에 대해 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 어닐링하는 영역 F2c 보다도 더욱이주형상에서 3'측의 영역 F3c에 어닐링하는 아웃터 프라이머(F3)를 별도로 준비한다. 이 아웃터 프라이머를 합성기점으로 하여 사슬 치환형 상보사슬 합성을 촉매하는 폴리머라아제에 의해 상보사슬 합성을 행하면, 본 발명의 상기 F2c를 합성 개시점으로 하여 합성된 상보사슬은 치환되고, 이윽고 R1이 어닐링해야 할 영역 R1c를 염기쌍 결합이 가능한 상태로 한다(도 5). 사슬 치환반응을 이용함으로써, 지금까지의 반응을 등온 조건하에서 진행시킬 수 있다.By the way, in order to implement | achieve the state of FIG. 5- (A), a base pair coupling | bonding must be enabled at least in the part which the reverse primer anneals the complementary chain synthesize | combined initially. This step can be achieved by any method. That is, an outer primer (F3) annealed to the region F3c on the 3 'side is prepared separately from the region F2c to which the oligonucleotide of the present invention anneals to the first template. When the complementary chain is synthesized by a polymerase that catalyzes the chain substitution type complementary chain synthesis using the outer primer as a synthetic starting point, the complementary chain synthesized using the F2c of the present invention as the synthesis starting point is replaced, and then R1 is The region R1c to be annealed is allowed to have a base pair bond (FIG. 5). By using a chain substitution reaction, the reaction so far can be advanced under isothermal conditions.
아웃터 프라이머를 이용하는 경우에는, F2c로부터의 합성 보다도 나중에 아웃터 프라이머(F3)로부터의 합성이 개시될 필요가 있다. 가장 단순한 방법은 인너 프라이머의 농도를 아웃터 프라이머의 농도 보다도 높게 하는 것이다. 구체적으로는, 통상 2~50배, 바람직하게는 4~10배의 농도차로 프라이머를 사용함으로써, 기대한 대로의 반응을 행하게 할 수 있다. 또 아웃터 프라이머의 융해온도(Tm)를 인너 프라이머의 X1(F1이나 R1에 상당)영역의 Tm 보다 낮아지도록 설정함으로써 합성 시기를 조절할 수도 있다. 즉, (아웃터 프라이머 F3 : F3c)≤(F2c/F2)≤(F1c/F1), 또는 (아웃터 프라이머/주형에 있어서의 3'측의 영역)≤(X2c : X2)≤(X1c : X1)이다. 또한 여기서 (F2c/F2)≤(F1c/F1)로 한 것은, F2가 루프부분에 어닐링하는 것 보다도 먼저 F1c/F1 사이의 어닐링을 행하게 하기 위해서이다. F1c/F1 사이의 어닐링은 분자내의 반응이기 때문에 우선적으로 진행할 가능성이 높다. 그러나 보다 바람직한 반응조건을 주기 위해 Tm을 고려하는 것에는 의미가 있다. 동일한 조건은, 리버스 프라이머의 설계에 있어서도 고려해야 할 것은 말할 것도 없다. 이러한 관계로 함으로써, 확률적으로 이상적인 반응조건을 달성할 수 있다. 융해온도(Tm)는, 다른조건이 일정하다면 어닐링하는 상보사슬의 길이와 염기쌍 결합을 구성하는 염기의 조합에 의해 이론적으로 산출할 수 있다. 따라서 당업자는, 본 명세서의 개시를 토대로 바람직한 조건을 용이하게 이끌 수 있다.In the case of using an outer primer, the synthesis from the outer primer (F3) needs to be started after the synthesis from F2c. The simplest method is to make the inner primer concentration higher than the outer primer concentration. Specifically, by using a primer at a concentration difference of 2 to 50 times, preferably 4 to 10 times, the reaction as expected can be performed. The synthesis timing can also be adjusted by setting the melting temperature (Tm) of the outer primer to be lower than the Tm of the X1 (corresponding to F1 or R1) region of the inner primer. That is, (outer primer F3: F3c) ≤ (F2c / F2) ≤ (F1c / F1) or (region on the 3 'side in the outer primer / template) ≤ (X2c: X2) ≤ (X1c: X1) . Note that (F2c / F2) ≤ (F1c / F1) is used to allow annealing between F1c / F1 before F2 anneals to the loop portion. Annealing between F1c / F1 is likely to proceed preferentially because it is an intramolecular reaction. However, it is meaningful to consider Tm to give more desirable reaction conditions. It goes without saying that the same conditions should be considered in the design of the reverse primer. By setting it as such a relationship, it is possible to achieve ideally ideal reaction conditions. The melting temperature (Tm) can be theoretically calculated by the combination of the length of the complementary chain to be annealed and the base constituting the base pair bond, if other conditions are constant. Thus, those skilled in the art can easily lead to the preferred conditions based on the disclosure herein.
더욱이 아웃터 프라이머의 어닐링 시기를 조정하기 위해, 콘티규어스 스태킹(contiguous stacking)이라 불리는 현상을 응용할 수도 있다. 콘티규어스 스태킹이란, 단독으로는 어닐링할 수 없는 올리고뉴클레오티드가 이중가닥 사슬부분에 인접함으로써 어닐링이 가능해지는 현상이다(Chiara Borghesi-Nicoletti et al. Bio Techniques 12, 474-477(1992)). 즉, 아웃터 프라이머를 F2c(X2c)에 인접시켜, 단독으로는 어닐링할 수 없도록 설계해 두는 것이다. 이렇게 하면, F2c(X2c)가 어닐링했을 때에 처음 아웃터 프라이머의 어닐링이 가능해지기 때문에, 필연적으로 F2c(X2c)의 어닐링이 우선되어진다. 이 원리를 토대로 하여, 일련의 반응에 프라이머로서 필요한 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 설정한 예가 실시예에 기재되어 있다. 또한, 이 공정은 가온에 의한 변성이나, DNA 헬리카아제(helicase)에 의해 달성할 수도 있다.Furthermore, in order to adjust the annealing timing of the outer primer, a phenomenon called contiguous stacking may be applied. Contiguous stacking is a phenomenon in which annealing is possible by adjoining a double-stranded chain portion of an oligonucleotide that cannot be annealed alone (Chiara Borghesi-Nicoletti et al. Bio Techniques 12, 474-477 (1992)). In other words, the outer primer is adjacent to F2c (X2c) and designed so that it cannot be annealed alone. This makes it possible to anneal the outer primer for the first time when F2c (X2c) is annealed, so that annealing of F2c (X2c) is inevitably given priority. Based on this principle, the example which set the base sequence of the oligonucleotide required as a primer for a series of reaction is described in the Example. This process can also be accomplished by warming denaturation or DNA helicase.
F2c(X2c)를 갖는 주형 핵산이 RNA인 경우에는, 다른 방법에 의해 도 5-(A)의 상태를 실현할 수도 있다. 예를 들면, 이 RNA 사슬을 분해해 버리면, R1은 염기쌍 결합이 가능한 상태가 된다. 즉, F2를 RNA의 F2c에 어닐링시켜, 역전사효소에 의해 DNA로서 상보사슬 합성을 행한다. 이어서 주형이 된 RNA를 알칼리 변성이나 DNA/RNA 이중가닥 사슬의 RNA에 작용하는 리보뉴클레아제에 의한 효소처리에 의해 분해하면, F2로부터 합성한 DNA는 단일가닥 사슬로 된다. DNA/RNA 이중가닥 사슬의RNA를 선택적으로 분해하는 효소에는, RNaseH나, 일부의 역전사효소가 갖춰져 있는 리보뉴클레아제 활성을 이용할 수 있다. 이렇게 하여 염기쌍 결합을 가능하게 한 R1c에 리버스 프라이머를 어닐링시킬 수 있다. 따라서 R1c를 염기결합 가능한 상태로 하기 위한 아웃터 프라이머가 필요없게 된다.When the template nucleic acid having F2c (X2c) is RNA, the state of Fig. 5- (A) can be realized by another method. For example, when this RNA chain is decomposed, R1 is in a state capable of base pair binding. That is, F2 is annealed to F2c of RNA and complementary chain synthesis | combination is performed as DNA by reverse transcriptase. Subsequently, when RNA that has been templated is degraded by alkali denaturation or enzymatic treatment with a ribonuclease that acts on the RNA of the DNA / RNA double stranded chain, the DNA synthesized from F2 becomes a single stranded chain. As an enzyme that selectively degrades RNA of DNA / RNA double-stranded chains, ribonuclease activity provided with RNaseH and some reverse transcriptases can be used. In this way, the reverse primer can be annealed to R1c which enabled base pair bonding. Therefore, there is no need for an outer primer to make R1c base-bondable.
또는 역전사효소가 갖추고 있는 사슬 치환 활성을 이용하여, 앞서 기술한 아웃터 프라이머에 의한 사슬 치환을 행할 수도 있다. 이 경우는 역전사효소 만으로 반응계를 구성할 수 있다. 즉, RNA를 주형으로 하여, 그 F2c에 어닐링하는 F2로부터의 상보사슬 합성, 더욱이 그 3'측에 위치하는 F3c에 어닐링하는 아웃터 프라이머 F3을 합성기점으로 하는 상보사슬 합성과 치환이, 역전사효소로 가능해진다. 역전사효소가 DNA를 주형으로 하는 상보사슬 합성반응을 행하는 것이라면, 치환된 상보사슬을 주형으로 하여 그 R1c에 어닐링하는 R1을 합성기점으로 하는 상보사슬 합성, 그리고 3'측에 위치하는 R3c에 어닐링하는 R3을 합성기점으로 하는 상보사슬 합성과 치환반응도 포함하여 모든 상보사슬 합성반응이 역전사효소에 의해 진행한다. 또는, 얻어진 반응조건하에서 역전사효소에 DNA/DNA사슬의 치환 활성을 기대할 수 없을 때에는, 앞서 기술한 사슬 치환 활성을 가진 DNA 폴리머라아제를 조합시켜 사용하더라도 좋다. 이상과 같이, RNA를 주형으로 하여 제1의 단일가닥 사슬 핵산을 얻는다고 하는 태양은, 본 발명에 있어서의 바람직한 태양을 구성한다. 반대로, 사슬 치환 활성을 가지고, 역전사효소 활성을 함께 갖는 Bca DNA 폴리머라아제와 같은 DNA 폴리머라아제를 이용하더라도, 동일하게 RNA로부터의 제1의 단일가닥 사슬 핵산의 합성 뿐 아니라, 이후의 DNA를 주형으로 하는 반응도 동일한 효소에 의해 행할 수 있다.Alternatively, the chain substitution by the outer primer described above can be performed using the chain substitution activity of the reverse transcriptase. In this case, only the reverse transcriptase can constitute the reaction system. That is, the complementary chain synthesis from F2 annealed to the F2c using RNA as a template, and the complementary chain synthesis and substitution using the outer primer F3 annealed to F3c located on the 3 'side as the starting point, are reverse transcriptases. It becomes possible. If the reverse transcriptase performs the complementary chain synthesis reaction using DNA as a template, the complementary chain synthesis using R1 annealed to the R1c using the substituted complementary chain as a template and the annealing to R3c located on the 3 'side All complementary chain synthesis reactions are carried out by reverse transcriptase, including complementary chain synthesis and substitution reactions based on R3. Alternatively, when the DNA / DNA chain substitution activity cannot be expected from the reverse transcriptase under the obtained reaction conditions, the above-described DNA polymerase having a chain substitution activity may be used in combination. As mentioned above, the aspect which obtains a 1st single-stranded chain nucleic acid using RNA as a template comprises the preferable aspect in this invention. Conversely, even if a DNA polymerase such as Bca DNA polymerase having chain substitution activity and reverse transcriptase activity is used, not only the synthesis of the first single-stranded chain nucleic acid from RNA but also the subsequent DNA The reaction used as a template can also be performed by the same enzyme.
이상과 같은 반응계는 상기 리버스 프라이머로서 특정 구조를 갖는 것을 이용함으로써, 본 발명에 고유의 여러 변이(variation)를 초래한다. 가장 효과적인 변이에 대해 아래에 기술한다. 즉, 본 발명의 가장 유리한 태양에 있어서는, 상기 리버스 프라이머로서, [5]에 기술한 바와 같은 구성으로 된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이다. [5]의 올리고뉴클레오티드란, 즉 F2를 프라이머로 하여 합성되는 상보사슬에 있어서의 임의의 영역 R2c를 X2c로 하고, R1c를 X1c로 하는 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 리버스 프라이머의 이용에 의해, 루프의 형성과 이 루프부분으로부터의 상보사슬 합성과 치환이라고 하는 일련의 반응이, 센스사슬과 안티센스사슬(포워드측과 리버스측) 양쪽에서 일어나게 된다. 그 결과, 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 합성방법의 합성효율이 비약적으로 향상되는 동시에, 일련의 반응을 등온으로 실시 가능하게 하는 것이다. 아래에, 이 태양을 정리한 도 1-도 3을 토대로 하여, 구체적으로 설명한다.The reaction system described above causes various variations inherent in the present invention by using those having a specific structure as the reverse primer. The most effective variations are described below. In other words, in the most advantageous aspect of the present invention, an oligonucleotide having a structure as described in [5] is used as the reverse primer. The oligonucleotide of [5] is an oligonucleotide in which arbitrary region R2c in the complementary chain synthesized with F2 as a primer is X2c and R1c is X1c. By using such a reverse primer, a series of reactions, such as formation of a loop and complementary chain synthesis and substitution from the loop portion, occur in both the sense chain and the antisense chain (forward side and reverse side). As a result, the synthesis efficiency of the nucleic acid synthesis method in which complementary nucleotide sequences are alternately linked on the single-stranded chain according to the present invention is remarkably improved, and a series of reactions can be performed isothermally. Below, it demonstrates concretely based on FIG. 1-3 which summarized this aspect.
아래의 태양에 있어서는, 본 발명을 토대로 하는 올리고뉴클레오티드로서 2종류를 준비한다. 이것을 설명하기 위해 FA와 RA라고 이름 붙인다. FA와 RA를 구성하는 영역은, 아래와 같다.In the following aspect, two types are prepared as an oligonucleotide based on this invention. To illustrate this, we call them FA and RA. The area constituting FA and RA is as follows.
X2X1cX2X1c
FAF2F1cFAF2F1c
RAR2R1cRAR2R1c
여기에서, F2는 주형이 되는 핵산의 영역 F2c에 상보적인 염기서열이다. 또한 R2는 F2를 프라이머로 하여 합성되는 상보사슬에 포함되는 임의의 영역 R2c에 상보적인 염기서열이다. F1c와 R1c는 각각, F2c 및 R2c의 각각 하류에 위치하는 임의의 염기서열이다. 여기에서 F2-R2 사이의 거리는 임의더라도 좋다. 상보사슬 합성을 행하는 DNA 폴리머라아제의 합성능력에도 의존하지만, 적합한 조건에서는 1 kbp 정도의 길이더라도 충분히 합성이 가능하다. 보다 구체적으로는, Bst DNA 폴리머라아제를 사용한 경우, F2/R2c 사이에서 800 bp, 바람직하게는 500 bp 이하의 길이라면 확실하게 합성된다. 온도 사이클을 동반하는 PCR에서는, 온도변화 스트레스에 의한 효소활성의 저하가 긴 염기서열의 합성효율을 낮추는 것으로 되어 있다. 본 발명에 있어서의 바람직한 태양으로는, 핵산 증폭공정에 있어서의 온도 사이클이 필요없게 되기 때문에, 긴 염기서열이더라도 합성 및 증폭을 확실하게 달성할 수 있다.Here, F2 is a nucleotide sequence complementary to the region F2c of the nucleic acid to be a template. R2 is a base sequence complementary to any region R2c included in the complementary chain synthesized with F2 as a primer. F1c and R1c are any base sequences located downstream of F2c and R2c, respectively. The distance between F2-R2 may be arbitrary here. Although it depends on the synthesis | combining ability of the DNA polymerase which performs a complementary chain synthesis, even if it is about 1 kbp in length, it can fully synthesize | combine. More specifically, when Bst DNA polymerase is used, it is surely synthesized if it is 800 bp, preferably 500 bp or less, between F2 / R2c. In PCR with a temperature cycle, the degradation of enzyme activity due to temperature change stress lowers the synthesis efficiency of long sequences. In a preferred embodiment of the present invention, since the temperature cycle in the nucleic acid amplification step is not necessary, synthesis and amplification can be reliably achieved even with a long base sequence.
먼저 주형이 되는 핵산에 대해 FA의 F2를 어닐링시키고, 이것을 합성기점으로 하여 상보사슬 합성을 행한다. 이하, 도 1의 (4)에 이르기까지는 먼저 설명한 본 발명의 기본적인 태양(도 5)과 동일한 반응공정으로 되어 있다. 도 1의 (2)에서 F3으로서 어닐링하고 있는 서열은, 먼저 설명한 아웃터 프라이머이다. 이 프라이머를 합성기점으로 하여 사슬 치환형 상보사슬 합성을 행하는 DNA 폴리머라아제로 행함으로써, FA로부터 합성한 상보사슬은 치환되어, 염기쌍 결합이 가능한 상태가 된다.First, F2 of FA is annealed to the nucleic acid used as a template, and complementary chain synthesis is performed using this as a synthetic starting point. Hereinafter, up to (4) of FIG. 1, the reaction process is the same as that of the basic aspect (FIG. 5) of this invention demonstrated previously. The sequence annealed as F3 in FIG. 1 (2) is the outer primer demonstrated previously. By carrying out this primer with the DNA polymerase which synthesize | combines a chain substitution type complementary chain synthesis from a synthetic origin, the complementary chain synthesize | combined from FA is substituted and it becomes the state which can base-pair bond.
(4)에서 R2c가 염기쌍 결합이 가능한 상태가 된 시점에서, 리버스 프라이머로서의 RA가 R2c/R2의 조합으로 어닐링한다. 이것을 합성기점으로 하는 상보사슬합성은, FA의 5'측 말단인 F1c에 이르는 부분까지 행해진다. 이 상보사슬 합성반응에 이어, 역시 치환용 아웃터 프라이머 R3가 어닐링하여, 사슬 치환을 동반하여 상보사슬 합성을 행함으로써, RA를 합성기점으로 하여 합성된 상보사슬이 치환된다. 이 때 치환되는 상보사슬은, RA를 5'측에 가지고 FA에 상보적인 서열이 3'말단에 위치한다.When R2c is in a state where base pair bond is possible in (4), RA as a reverse primer is annealed by a combination of R2c / R2. Complementary chain synthesis which uses this as a synthetic starting point is performed to the part which reaches F1c which is the 5 'side terminal of FA. Subsequent to this complementary chain synthesis reaction, the replacement outer primer R3 is also annealed, and the complementary chain synthesis is performed with chain substitution, thereby replacing the complementary chain synthesized using RA as a synthetic starting point. The complementary chain substituted at this time has RA at the 5 'side, and the sequence complementary to FA is located at the 3' end.
이렇게 치환된 단일가닥 사슬 핵산의 3'측에는, 동일 사슬 상의 F1c에 상보적인 서열 F1이 존재한다. F1은, 동일 분자내에 늘어선 F1c에 신속하게 어닐링하여, 상보사슬 합성이 시작된다. 3'말단(F1)이 동일 사슬 상의 F1c에 어닐링할 때에, F2c를 포함하는 루프가 형성되어 있다. 이 루프부분은 염기쌍 결합이 가능한 상태로 유지되어 있는 것은, 도 2-(7)로부터도 명백하다. F2c에 상보적인 염기서열을 갖는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 FA는, 이 루프부분에 어닐링하여 상보사슬의 합성기점이 된다(7). 루프부분으로부터의 상보사슬 합성은, 먼저 개시한 F1로부터의 상보사슬 합성의 반응생성물을 치환하면서 진행된다. 그 결과, 자신을 주형으로 하여 합성된 상보사슬은, 다시 3'말단에 있어서 염기쌍 결합이 가능한 상태가 된다. 이 3'말단은, 동일 사슬 상의 R1c에 어닐링할 수 있는 영역 R1을 3'말단에 갖추고 있어, 역시 동일 분자내에의 신속한 반응에 의해 양자는 우선적으로 어닐링한다. 이렇게 하여, 먼저 설명한 FA를 주형으로 하여 합성된 3'말단으로부터의 반응과 동일한 반응이, 이 영역에서도 진행한다. 결과로서, 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산은 차례로 상보사슬 합성과 치환을 계속하여, 그 3'말단 R1을 기점으로 하는 신장을 계속하게 된다. 3'말단 R1의동일 사슬로의 어닐링에 의해 형성되는 루프에는 항상 R2c가 포함되기 때문에, 이후의 반응에서 3'말단의 루프부분에 어닐링하는 것은 항상 R2를 갖춘 올리고뉴클레오티드(즉 RA)가 된다.On the 3 'side of the substituted single-stranded nucleic acid, there is a sequence F1 complementary to F1c on the same chain. F1 anneals rapidly to F1c arranged in the same molecule, and the complementary chain synthesis starts. When the 3 'end (F1) is annealed to F1c on the same chain, a loop including F2c is formed. It is also apparent from Fig. 2- (7) that the loop portion remains in a state capable of base pair bonding. The oligonucleotide FA of the present invention having a base sequence complementary to F2c is annealed to this loop portion to be the starting point of the complementary chain (7). The complementary chain synthesis from the loop portion proceeds while substituting the reaction product of the complementary chain synthesis from F1 described above. As a result, the complementary chain synthesize | combined using itself as a template will be in the state which can base-bond couple at the 3 'end again. This 3 'end has a region R1 that can anneal to R1c on the same chain at the 3' end, and both are preferentially annealed by rapid reaction in the same molecule. In this way, the reaction similar to the reaction from the 3 'terminal synthesize | combined using the FA demonstrated previously as a template advances also in this area | region. As a result, nucleic acids in which complementary nucleotide sequences are alternately linked on the single-stranded chain according to the present invention continue to complement and synthesize complementary chains, and continue to elongate at the 3 'terminal R1. Since the loop formed by annealing to the same chain of the 3 'terminal R1 always includes R2c, annealing to the loop portion of the 3' terminal in subsequent reactions always results in an oligonucleotide with R2 (ie RA).
한편, 자기 자신을 주형으로 하여 신장을 계속하는 단일가닥 사슬의 핵산에 대해, 그 루프부분에 어닐링하는 올리고뉴클레오티드를 합성기점으로 하여 상보사슬 합성되는 핵산에 주목하면, 여기에서도 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 합성이 진행되고 있다. 즉, 루프부분으로부터의 상보사슬 합성은, 예를 들면 도 2-(7)에 있어서는, RA에 달한 시점에서 완료된다. 그리고, 이 핵산의 합성에 의해 치환된 핵산이 상보사슬 합성을 개시(도 3-(8))하면, 이윽고 그 반응은 이전에 합성기점이었던 루프부분에 달하여 다시 치환이 시작된다. 이렇게 하여 루프부분으로부터 합성을 개시한 핵산도 치환되고, 그 결과 동일 사슬 상에 어닐링할 수 있는 3'말단 R1을 얻는다(도 3-(10)). 이 3'말단 R1은 동일 사슬의 R1c에 어닐링하여 상보사슬 합성을 개시한다. 이 반응의 F와 R을 바꿔 읽으면, 도 2-(7)에서 일어나고 있는 반응과 동일하다. 따라서 도 3-(10)에 나타내는 구조는, 자신의 신장과 새로운 핵산의 생성을 계속하는 새로운 핵산으로서 기능할 수 있다.On the other hand, with respect to a nucleic acid of a single-stranded chain that continues elongation using itself as a template, and focuses on a nucleic acid synthesized from a complementary chain by synthesizing an oligonucleotide that is annealed to the loop portion thereof as a synthetic starting point, the single-stranded according to the present invention Synthesis of nucleic acids in which complementary nucleotide sequences are alternately linked on a chain is progressing. That is, the complementary chain synthesis from the loop portion is completed, for example, in FIG. 2- (7) when the RA reaches. Then, when the nucleic acid substituted by the synthesis of the nucleic acid initiates the complementary chain synthesis (Fig. 3- (8)), the reaction reaches the loop portion that was previously the starting point of synthesis, and the substitution starts again. In this way, the nucleic acid which started synthesis | combination from a loop part is also substituted and, as a result, the 3 'terminal R1 which can be annealed on the same chain is obtained (FIG. 3- (10)). This 3 'terminal R1 anneals to R1c of the same chain to initiate the complementary chain synthesis. Rereading F and R of this reaction is the same as the reaction occurring in Fig. 2- (7). Therefore, the structure shown in FIG. 3- (10) can function as a new nucleic acid which continues its kidney and production | generation of a new nucleic acid.
또한 도 3-(10)에 나타내는 핵산으로부터 개시하는 핵산의 합성반응은, 지금까지 기술해 온 것과는 반대로 항상 3'말단 F1을 합성기점으로 하는 신장이 된다. 즉 본 발명에 있어서는, 하나의 핵산의 신장에 동반하여, 이와는 별도로 신장을 개시하는 새로운 핵산을 계속해서 공급하는 반응이 진행된다. 더욱이 사슬이 신장됨에 따라 말단 뿐 아니라, 동일 사슬 상에 복수의 루프 형성서열이 초래된다. 이들 루프 형성서열은, 사슬 치환 합성반응에 의해 염기쌍 형성 가능한 상태가 되면, 올리고뉴클레오티드가 어닐링하여, 새로운 핵산의 생성반응의 기점이 된다. 말단 뿐 아니라 사슬의 도중으로부터의 합성반응도 조합시킴으로써, 더욱 효율이 좋은 증폭반응이 달성되는 것이다. 이상과 같이 리버스 프라이머로서 본 발명을 토대로 하는 올리고뉴클레오티드 RA를 조합시킴으로써, 신장과 그것에 동반되는 새로운 핵산의 생성이 일어난다. 더욱이 본 발명에 있어서는, 이 새롭게 생성된 핵산 자신이 신장되어, 그것에 부수되는 더욱이 새로운 핵산의 생성을 초래한다. 일련의 반응은, 이론적으로는 영구히 계속되어, 지극히 효율적인 핵산의 증폭을 달성할 수 있다. 또한 본 발명의 반응은, 등온 조건하에서 행할 수 있다.In addition, the synthesis reaction of the nucleic acid starting from the nucleic acid shown in Fig. 3- (10) always results in elongation having the 3'-terminal F1 as the starting point of synthesis, as opposed to that described above. In other words, in the present invention, the reaction of continuously supplying a new nucleic acid which starts elongation separately with the extension of one nucleic acid proceeds. Moreover, as the chain is stretched, a plurality of loop formation sequences are caused on the same chain as well as the ends. When the loop formation sequence is in a state where base pairs can be formed by a chain substitution synthesis reaction, the oligonucleotides are annealed to become a starting point for a reaction for generating a new nucleic acid. By combining not only the terminal but also the synthetic reaction from the middle of the chain, a more efficient amplification reaction is achieved. As described above, by combining the oligonucleotide RA based on the present invention as a reverse primer, generation of the kidney and a new nucleic acid accompanying it occur. Furthermore, in the present invention, this newly generated nucleic acid itself is elongated, resulting in the production of further new nucleic acid accompanying it. The series of reactions can, in theory, continue permanently to achieve extremely efficient amplification of the nucleic acid. In addition, the reaction of the present invention can be carried out under isothermal conditions.
이 때 축적되는 반응생성물은, F1-R1 사이의 염기서열과 그 상보서열이 번갈아 연결된 구조를 갖는다. 단 반복단위로 되어 있는 서열의 양단에는, F2-F1(F2c-F1c), 또는 R2-R1(R2c-R1c)의 염기서열로 구성되는 영역이 연속되고 있다. 예를 들면 도 3-(9)에서는, 5'측으로부터(R2-F2c)-(F1-R2c)-(R1-F1c)-(F2-R2c)라고 하는 순서로 연결된 상태가 된다. 이것은, 본 발명을 토대로 하는 증폭반응이, 올리고뉴클레오티드를 합성기점으로 하여 F2(또는 R2)로부터 개시하여, 계속해서 자신의 3'말단을 합성기점으로 하는 F1(또는 R1)로부터의 상보사슬 합성반응에 의해 신장된다고 하는 원리하에 진행하고 있기 때문이다.The reaction product accumulated at this time has a structure in which the base sequence between F1-R1 and its complementary sequence are alternately connected. However, at both ends of the sequence of repeating units, a region consisting of the base sequence of F2-F1 (F2c-F1c) or R2-R1 (R2c-R1c) is contiguous. For example, in FIG. 3- (9), the state is connected from the 5 'side in order of (R2-F2c)-(F1-R2c)-(R1-F1c)-(F2-R2c). This is because the amplification reaction based on the present invention starts from F2 (or R2) with the oligonucleotide as the synthetic starting point, and then the complementary chain synthesis reaction from F1 (or R1) with its 3 'end as the starting point. This is because the process proceeds under the principle of being elongated by.
여기에서는 가장 바람직한 태양으로서 루프부분에 어닐링하는 올리고뉴클레오티드에 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드 FA 및 RA를 사용했다. 그러나 본 발명에 의한 핵산의 증폭반응은, 이들의 한정된 구조를 가진 올리고뉴클레오티드 뿐 아니라, 루프로부터의 상보사슬 합성을 개시할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 이용하기만 하면 실시할 수 있다. 즉, 신장을 계속하는 3'말단은 루프로부터의 상보사슬 합성에 의해 치환되기만 하면, 다시 루프부분을 부여한다. 루프부분으로부터 개시하는 상보사슬 합성은, 항상 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산을 주형으로 하고 있기 때문에, 본 발명에서 목적으로 하고 있는 핵산의 합성이 가능한 것은 자명하다. 단, 여기에서 합성되는 핵산은, 치환 후에 루프를 형성하여 상보사슬 합성은 행하지만, 이후의 루프를 형성하기 위한 3'말단을 가지지 않기 때문에, 새로운 주형으로서는 기능할 수 없게 된다. 따라서, FA 또는 RA에 의해 합성을 개시한 핵산과 달라서 지수적인 증폭은 기대할 수 없다. 이러한 이유로부터, FA나 RA와 같은 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드는, 본 발명을 토대로 하는 고도로 효율적인 핵산의 합성에 유용한 것이다.As the most preferred embodiment, the oligonucleotides FA and RA according to the present invention were used for the oligonucleotides annealed to the loop portion. However, the amplification reaction of nucleic acids according to the present invention can be carried out by using not only oligonucleotides having these limited structures but also oligonucleotides capable of initiating complementary chain synthesis from loops. That is, the 3 'end which continues to stretch is given a loop part again only if it is replaced by the complementary chain synthesis | combination from a loop. Complementary chain synthesis starting from the loop portion always uses a nucleic acid whose complementary nucleotide sequences are alternately linked on a single-stranded chain, and thus, it is obvious that the nucleic acid of the present invention can be synthesized. However, the nucleic acid synthesized here forms a loop after substitution and performs complementary chain synthesis. However, since the nucleic acid does not have a 3 'end for forming a subsequent loop, it cannot function as a new template. Therefore, exponential amplification cannot be expected unlike nucleic acids that have been synthesized by FA or RA. For this reason, oligonucleotides having structures such as FA and RA are useful for the synthesis of highly efficient nucleic acids based on the present invention.
일련의 반응은, 주형이 되는 단일가닥 사슬의 핵산에 대해, 아래의 성분을 가하여, FA 및 RA를 구성하는 염기서열이 상보적인 염기서열에 대해 안정적인 염기쌍 결합을 형성할 수 있고, 또한 효소활성을 유지할 수 있는 온도에서 인큐베이트하는 것 만으로 진행한다.In a series of reactions, the following components are added to a nucleic acid of a single-stranded chain serving as a template to form a base pair bond that is stable to a base sequence complementary to the base sequences constituting FA and RA, and further enhances enzymatic activity. Proceed with incubation at sustainable temperatures.
·4종류의 올리고뉴클레오티드:Four kinds of oligonucleotides:
FA,FA,
RA,RA,
아웃터 프라이머 F3,Outer primer F3,
및 아웃터 프라이머 R3,And outer primer R3,
·사슬 치환형 상보사슬 합성을 행하는 DNA 폴리머라아제,DNA polymerase which performs chain substitution type complementary chain synthesis,
·DNA 폴리머라아제의 기질이 되는 뉴클레오티드Nucleotide as a substrate of DNA polymerase
따라서, PCR과 같은 온도 사이클은 불필요하다. 또한 여기에서 말하는 안정적인 염기쌍 결합이란, 반응계에 존재하는 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부가 상보사슬의 합성기점을 부여할 수 있는 상태를 의미한다. 안정적인 염기쌍 결합을 초래하는 바람직한 조건은, 예를 들면 융해온도(Tm) 이하로 설정하는 것이다. 일반적으로 융해온도(Tm)는, 서로 상보적인 염기서열을 갖는 핵산의 50%가 염기쌍 결합한 상태가 되는 온도로 되어 있다. 융해온도(Tm) 이하로 설정하는 것은 본 발명의 필수의 조건은 아니지만, 고도의 합성효율을 달성하기 위해서는 고려해야 할 반응조건의 하나이다. 주형으로 할 핵산이 이중가닥 사슬인 경우에는, 적어도 올리고뉴클레오티드가 어닐링하는 영역을 염기쌍 결합이 가능한 상태로 할 필요가 있다. 그를 위해서는 일반적으로 가열변성이 행해지지만, 이것은 반응개시 전의 전처리로서 한번만 행하면 된다.Thus, temperature cycles such as PCR are unnecessary. In addition, the stable base pair bond here means the state in which at least one part of the oligonucleotide which exists in a reaction system can give a synthetic origin of a complementary chain. Preferred conditions that result in stable base pair bonding are, for example, set below the melting temperature (Tm). In general, the melting temperature (Tm) is a temperature at which 50% of nucleic acids having base sequences complementary to each other are in base-coupled state. Setting below the melting temperature (Tm) is not an essential condition of the present invention, but is one of the reaction conditions to be considered in order to achieve a high synthesis efficiency. In the case where the nucleic acid to be a template is a double-stranded chain, it is necessary to at least make the base-pairing possible in the region to be annealed by the oligonucleotide. For this purpose, heat modification is generally performed, but this may be done only once as a pretreatment before the start of the reaction.
이 반응은, 효소반응에 적절한 pH를 주는 완충제, 효소의 촉매활성의 유지나 어닐링을 위해 필요한 염류, 효소의 보호제, 더 나아가서는 필요에 따라 융해온도(Tm)의 조정제 등의 공존하에서 행한다. 완충제로서는, Tris-HCl 등의 중성으로부터 약알칼리성에서 완충작용을 갖는 것이 사용된다. pH는 사용하는 DNA 폴리머라아제에 따라 조정한다. 염류로서는 KCl, NaCl, 또는 (NH4)2SO4등이, 효소의활성유지와 핵산의 융해온도(Tm) 조정을 위해 적절히 첨가된다. 효소의 보호제로서는, 소혈청 알부민이나 당류가 이용된다. 더욱이 융해온도(Tm)의 조정제에는, 디메틸설폭시드(DMSO)나 포름아미드가 일반적으로 이용된다. 융해온도(Tm)의 조정제를 이용함으로써, 상기 올리고뉴클레오티드의 어닐링을 한정된 온도조건하에서 조정할 수 있다. 더욱이 베타인(N,N,N,-trimethylglycine)이나 테트라알킬암모늄염은, 그 isostabilize 작용에 의해 사슬 치환효율의 향상에도 유효하다. 베타인은, 반응액 중 0.2~3.0 M, 바람직하게는 0.5~1.5 M 정도의 첨가에 의해, 본 발명의 핵산 증폭반응의 촉진작용을 기대할 수 있다. 이들 융해온도의 조정제는, 융해온도를 낮추는 방향으로 작용하기 때문에, 염농도나 반응온도 등의 그 밖의 반응조건을 고려하여, 적절한 스트린젠시와 반응성을 부여하는 조건을 경험적으로 설정한다.This reaction is carried out in the presence of a buffer which gives a suitable pH for the enzymatic reaction, salts necessary for maintaining or annealing the catalytic activity of the enzyme, protecting agent of the enzyme, and furthermore, adjusting agent of melting temperature (Tm) as necessary. As the buffer, those having a neutral to weak alkaline to buffering effect such as Tris-HCl are used. pH is adjusted according to the DNA polymerase used. As the salts, KCl, NaCl, or (NH 4 ) 2 SO 4 and the like are appropriately added to maintain the activity of the enzyme and to adjust the melting temperature (Tm) of the nucleic acid. As the protection agent of the enzyme, bovine serum albumin and sugars are used. Moreover, dimethyl sulfoxide (DMSO) and formamide are generally used as a modifier of melting temperature (Tm). By using a melting temperature (Tm) modifier, the annealing of the oligonucleotide can be adjusted under limited temperature conditions. Furthermore, betaine (N, N, N, -trimethylglycine) and tetraalkylammonium salts are effective for improving chain substitution efficiency by the isostabilize action. Betaine can be expected to promote the nucleic acid amplification reaction of the present invention by addition of 0.2 to 3.0 M, preferably about 0.5 to 1.5 M in the reaction solution. These melting temperature regulators act in the direction of lowering the melting temperature, and empirically set conditions for imparting appropriate stringency and reactivity in consideration of other reaction conditions such as salt concentration and reaction temperature.
본 발명에 있어서는, 일련의 반응이 항상 복수 영역의 위치관계를 유지한 상태가 아니면 진행하지 않는 것이 중요한 특징이다. 이 특징에 의해, 비특이적인 상보사슬 합성에 동반되는 비특이적인 합성반응을 효과적으로 방지할 수 있는 것이다. 즉, 설령 어떠한 비특이적인 반응이 일어났다고 해도, 그 생성물이 이후의 증폭공정에 대해 출발재료가 될 가능성을 낮게 억제하는 것으로 이어지는 것이다. 또한 보다 많은 영역에 의해 반응의 진행이 제어되고 있다고 하는 것은, 유사한 염기서열의 엄밀한 식별을 가능하게 하는 검출계를 자유롭게 구성할 수 있는 가능성을 초래한다.In the present invention, it is an important feature that a series of reactions do not proceed unless the positional relationship of a plurality of regions is always maintained. This feature can effectively prevent nonspecific synthesis reactions accompanied by nonspecific complementary chain synthesis. In other words, even if any non-specific reaction has occurred, it leads to a low suppression of the possibility that the product will be a starting material for the subsequent amplification process. In addition, the fact that the progress of the reaction is controlled by more regions leads to the possibility of freely configuring a detection system that enables the precise identification of similar sequences.
이 특징을 유전자 변이의 검출에 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서의 아웃터 프라이머를 사용하는 태양에 있어서는, 이 아웃터 프라이머 2종, 본 발명의 올리고뉴클레오티드로부터 된 프라이머 2종의 합계 4종의 프라이머가 사용되고 있다. 즉 4종의 올리고뉴클레오티드에 포함되는 6영역이 설계 대로 작용하지 않으면 본 발명의 합성반응은 진행하지 않는다. 특히, 상보사슬의 합성기점이 되는 각 올리고뉴클레오티드의 3'말단 및 상보서열이 합성기점이 되는 X1c 영역의 5'말단의 서열은 중요하다. 따라서, 이 중요한 서열을 검출해야 할 변이에 대응하도록 설계하면, 본 발명에 의한 합성반응 생성물을 관찰함으로써, 염기의 결실이나 삽입이라는 변이의 유무, 또는 SNPs와 같은 유전자 다형을 종합적으로 분석할 수 있다. 보다 구체적으로는, 변이나 다형이 예상되는 염기가, 상보사슬의 합성기점이 되는 올리고뉴클레오티드의 3'말단 부근(상보사슬이 기점이 되는 경우에는 5'말단 부근)에 상당하도록 설계하는 것이다. 상보사슬의 합성기점이 되는 3'말단이나, 그 부근에 미스매치(mismatch)가 존재하면 핵산의 상보사슬 합성반응은 현저히 저해된다. 본 발명에 있어서는, 반응초기의 생성물에 있어서의 말단구조가 반복되어 반응을 행하지 않으면 고도의 증폭반응으로 연결되지 않는다. 따라서, 설령 잘못된 합성이 행해졌다고 하더라도, 증폭반응을 구성하는 상보사슬 합성이 어느 하나의 단계에서 항상 방해되기 때문에 미스매치를 포함한 채로는 고도의 증폭은 일어나지 않는다. 결과적으로 미스매치가 증폭반응을 효과적으로 억제하고, 최종적으로는 정확한 효과를 초래하게 된다. 즉 본 발명을 토대로 하는 핵산의 증폭반응은, 보다 완성도가 높은 염기서열의 체크 기구를 갖추고 있다고 할 수 있다. 이들 특징은, 예를 들면 단순하게 2개의 영역에서 증폭반응을 행하고 있는 PCR법 등에서는 기대하기 어려운 이점이다.This feature can be used to detect genetic variation. In the aspect using the outer primer in this invention, 4 primers in total of 2 types of this outer primer and 2 types of primers which consist of the oligonucleotide of this invention are used. That is, if the six regions included in the four oligonucleotides do not function as designed, the synthesis reaction of the present invention does not proceed. In particular, the sequence of the 3 'end of each oligonucleotide which is a synthetic starting point of a complementary chain, and the 5' end of the X1c region whose complementary sequence is a synthetic starting point is important. Therefore, by designing for the mutation to detect this important sequence, by observing the synthesis reaction product according to the present invention, it is possible to comprehensively analyze the presence or absence of mutations such as deletion or insertion of bases or gene polymorphisms such as SNPs. . More specifically, it is designed so that the base to which a mutation and a polymorphism are anticipated corresponds to the 3 'terminal vicinity of the oligonucleotide used as a synthetic starting point of a complementary chain (in a 5' terminal vicinity when a complementary chain becomes a starting point). If there is a mismatch near or near the 3 'end of the complementary chain synthesis, the complementary chain synthesis of the nucleic acid is significantly inhibited. In the present invention, if the terminal structure in the initial product of the reaction is repeated and the reaction is not carried out, it is not linked to a high amplification reaction. Therefore, even if incorrect synthesis is performed, high amplification does not occur with mismatches because the complementary chain synthesis constituting the amplification reaction is always hindered at any one step. As a result, mismatch effectively suppresses the amplification reaction and finally leads to an accurate effect. That is, the nucleic acid amplification reaction based on the present invention can be said to have a more complete base sequence check mechanism. These features are advantages that are difficult to expect in, for example, the PCR method which performs the amplification reaction in two regions simply.
더욱이 본 발명에 사용하는 올리고뉴클레오티드를 특징짓는 영역 X1c는, 상보서열이 합성되어 비로소 합성기점으로 되어, 이 상보서열이 새롭게 합성된 동일 사슬 내의 서열 X1에 어닐링함으로써, 자기를 주형으로 하는 합성반응이 진행된다. 이 때문에, 설령 선행기술에서 종종 중요한 문제가 되는 소위 프라이머 다이머를 생성하더라도, 본 올리고뉴클레오티드는 루프를 형성하지 않는다. 따라서, 프라이머 다이머에 기인하는 비특이적인 증폭은 원리적으로 생길 수 없어, 반응의 특이성 향상에 공헌하고 있다.Furthermore, the region X1c, which characterizes the oligonucleotide used in the present invention, is a synthesis starting point after the complementary sequence is synthesized, and the synthesis reaction using the self as a template is achieved by annealing the sequence X1 in the same chain newly synthesized. Proceed. For this reason, the oligonucleotides do not form a loop, even if they produce so-called primer dimers, which are often a significant problem in the prior art. Therefore, nonspecific amplification due to primer dimer cannot occur in principle, contributing to improvement of reaction specificity.
더욱이 본 발명에 의하면, F3(도 1-(2))이나 R3(도 2-(5))으로 나타낸 아웃터 프라이머를 조합시킴으로써, 상기 일련의 반응을 등온 조건하에서 행할 수 있다. 즉 본 발명은, 상기 [9]에 나타낸 공정을 포함하는 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산을 증폭하는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법으로는, F2c/F2 사이, R2c/R2 사이, F1c/F1 사이, 그리고 R1c/R1 사이에서 안정적인 어닐링이 일어나는 온도조건이 선택되고, 그리고 바람직하게는 F3c/F3 사이 및 R3c/R3 사이는, 각각 F2c/F2 사이 및 R2c/R2 사이의 어닐링에 의해 촉진되는 콘티규어스 스태킹 현상에 의해 어닐링하도록 설정된다.Further, according to the present invention, the above series of reactions can be performed under isothermal conditions by combining the outer primers represented by F3 (Fig. 1- (2)) or R3 (Fig. 2- (5)). In other words, the present invention provides a method for amplifying a nucleic acid in which complementary nucleotide sequences are alternately linked on a single-stranded chain including the step shown in [9] above. In this way, temperature conditions at which stable annealing occurs between F2c / F2, between R2c / R2, between F1c / F1, and between R1c / R1 are selected, and preferably between F3c / F3 and between R3c / R3 , Annealed by a consortium stacking phenomenon promoted by annealing between F2c / F2 and R2c / R2, respectively.
본 발명에 있어서는 핵산의 합성(synthesis)과 증폭(amplification)이라고 하는 용어를 사용한다. 본 발명에 있어서의 핵산의 합성이란, 합성기점이 된 올리고뉴클레오티드로부터의 핵산의 신장을 의미한다. 합성에 더하여, 더욱이 다른 핵산의 생성과, 이 생성된 핵산의 신장반응이 연속해서 일어날 때, 일련의 반응을 종합하여 증폭이라고 한다.In the present invention, terms such as synthesis and amplification of nucleic acids are used. Synthesis of a nucleic acid in the present invention means extension of a nucleic acid from an oligonucleotide that has become a synthetic starting point. In addition to the synthesis, when the production of another nucleic acid and the extension reaction of the generated nucleic acid occur continuously, a series of reactions are collectively called amplification.
3'말단에 동일 사슬 상의 일부 F1c에 어닐링할 수 있는 영역 F1을 갖추고, 이 영역 F1이 동일 사슬 상의 F1c에 어닐링함으로써, 염기쌍 결합이 가능한 영역 F2c를 포함하는 루프를 형성할 수 있는 단일가닥 사슬 핵산은, 본 발명의 중요한 구성요소이다. 이러한 단일가닥 사슬 핵산은, 다음과 같은 원리를 토대로 하여 공급할 수도 있다. 즉, 미리 다음과 같은 구조를 가진 프라이머를 토대로 하여 상보사슬 합성을 진행하는 것이다.A single-stranded chain nucleic acid having a region F1 capable of annealing to some F1c on the same chain at the 3 'end, whereby the region F1 is annealed to F1c on the same chain, thereby forming a loop comprising a region F2c capable of base pair binding Is an important component of the present invention. Such single-stranded chain nucleic acid can also be supplied based on the following principle. That is, the complementary chain synthesis is performed based on the primer having the following structure in advance.
5'-[프라이머 내에 위치하는 영역 X1c에 어닐링하는 영역 X1]-[염기쌍 결합이 가능한 상태에 있는 루프 형성서열]-[영역 X1c]-[주형에 상보적인 서열을 갖는 영역]-3'5 '-[region X1c annealed to region X1c located in the primer]-[loop forming sequence in base pair bonding possible]-[region X1c]-[region having sequence complementary to template] -3'
주형에 상보적인 서열을 갖는 영역에는, F1에 상보적인 염기서열(프라이머-FA) 및 R1c에 상보적인 염기서열(프라이머 RA)의 2종류를 준비한다. 또한, 이 때 합성해야 할 핵산을 구성하는 염기서열은, 영역 F1에서 영역 R1c에 이르는 염기서열과, 이 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 영역 R1에서 영역 F1c에 이르는 염기서열을 포함하는 것이다. 한편, 프라이머 내부에서 어닐링할 수 있는 X1c와 X1은, 임의의 서열로 할 수 있다. 단 프라이머 FA와 RA 사이에서는, 영역 X1c/X1의 서열을 다른 것으로 하는 것이 바람직하다.In the region having a sequence complementary to the template, two kinds of nucleotide sequences complementary to F1 (primer-FA) and nucleotide sequences complementary to R1c (primer RA) are prepared. The nucleotide sequence constituting the nucleic acid to be synthesized at this time includes a nucleotide sequence from the region F1 to the region R1c and a nucleotide sequence from the region R1 to the region F1c having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence. In addition, X1c and X1 which can be annealed inside a primer can be made into arbitrary sequences. However, it is preferable that the sequence of the region X1c / X1 be different between the primers FA and RA.
먼저 주형 핵산의 영역 F1으로부터 상기 프라이머 FA에 의한 상보사슬 합성을 행한다. 이어서 합성된 상보사슬의 영역 R1c를 염기쌍 결합이 가능한 상태로 하여, 여기에 한쪽 프라이머를 어닐링시켜 상보사슬의 합성기점으로 한다. 이 때 합성된 상보사슬의 3'말단은, 최초에 합성된 사슬의 5'말단부분을 구성하는 프라이머FA에 상보적인 염기서열을 갖기 때문에, 3'말단에는 영역 X1을 갖고, 이것이 동일 사슬 상의 영역 X1c에 어닐링하는 동시에 루프를 형성한다. 이렇게 하여, 상기 본 발명에 의한 특징적인 3'말단구조가 제공되어, 이후의 반응은 가장 바람직한 형태로서 나타낸 앞의 반응계 그것이 된다. 또한 이 때 루프부분에 어닐링하는 올리고뉴클레오티드는, 3'말단에 루프 내에 존재하는 영역 X2c에 상보적인 영역 X2를 가지고, 5'측에는 영역 X1을 갖는 것으로 한다. 앞의 반응계에서는 프라이머 FA와 RA를 사용하여 주형 핵산에 상보적인 사슬을 합성함으로써 핵산의 3'말단에 루프구조를 초래했다. 이 방법은, 짧은 프라이머로 효과적으로 본 발명에 특징적인 말단구조를 제공한다. 한편, 본 태양에 있어서는, 프라이머로서 처음부터 루프를 구성하는 염기서열 전체를 제공하고 있어, 보다 긴 프라이머의 합성이 필요해진다.First, the complementary chain synthesis | combination by the said primer FA is performed from region F1 of template nucleic acid. Subsequently, the region R1c of the synthesized complementary chain is in a state capable of base pair binding, and one primer is annealed thereto to be the starting point of the synthesis of the complementary chain. At this time, since the 3 'end of the synthesized complementary chain has a base sequence complementary to the primer FA constituting the 5' end of the first synthesized chain, it has a region X1 at the 3 'end, which is a region on the same chain. Anneal to X1c and form a loop at the same time. In this way, the characteristic 3 'terminal structure according to the present invention is provided, and the subsequent reaction is that of the previous reaction system shown as the most preferred form. In this case, the oligonucleotide annealed to the loop portion is assumed to have a region X2 complementary to the region X2c existing in the loop at the 3 'end and a region X1 on the 5' side. In the previous reaction system, primers FA and RA were used to synthesize a chain complementary to the template nucleic acid, resulting in a loop structure at the 3 'end of the nucleic acid. This method effectively provides terminal structures characteristic of the present invention with short primers. On the other hand, in this aspect, the whole base sequence which comprises a loop from the beginning as a primer is provided, and the synthesis | combination of a longer primer is needed.
리버스 프라이머에 제한효소 인식영역을 포함하는 염기서열을 이용하면, 본 발명에 의한 다른 태양을 구성할 수 있다. 도 6을 토대로 하여, 리버스 프라이머가 제한효소 인식서열을 포함하는 경우에 대해서 구체적으로 설명한다. 도 6-(D)가 완성한 시점에서, 리버스 프라이머 내의 제한효소 인식부위에 대응하는 제한효소에 의해 닉이 생긴다. 이 닉을 합성기점으로 하여 사슬 치환형 상보사슬 합성반응이 개시된다. 리버스 프라이머는 (D)를 구성하는 이중가닥 사슬 핵산의 양단에 위치하고 있기 때문에, 상보사슬 합성반응도 양단으로부터 개시하게 된다. 기본적으로는 선행기술로서 기재한 SDA법의 원리를 토대로 하지만, 주형이 되는 염기서열이 본 발명에 의해 상보적인 염기서열을 번갈아 연결된 구조로 되어 있기 때문에, 본 발명에 특유의 핵산 합성계가 구성되는 것이다. 또한, 닉을 넣는 리버스 프라이머의상보사슬로 된 부분에는 제한효소에 의한 이중가닥 사슬의 절단이 생기지 않도록 뉴클레아제 내성이 되도록 dNTP 유도체가 삽입되도록 설계하지 않으며 안 된다.If a nucleotide sequence including a restriction enzyme recognition region is used as the reverse primer, another embodiment according to the present invention can be configured. Based on FIG. 6, the case where a reverse primer contains a restriction enzyme recognition sequence is demonstrated concretely. At the time point of Fig. 6- (D), the nick is generated by the restriction enzyme corresponding to the restriction enzyme recognition site in the reverse primer. Using this nick as a starting point, a chain substitution type complementary chain synthesis reaction is started. Since the reverse primer is located at both ends of the double-stranded chain nucleic acid constituting (D), the complementary chain synthesis reaction is also started at both ends. It is basically based on the principle of the SDA method described in the prior art, but since the base sequence serving as the template has a structure in which the base sequences complementary by the present invention are alternately connected, a nucleic acid synthesis system specific to the present invention is constructed. . In addition, the complementary chain portion of the reverse primer containing the nick should not be designed such that the dNTP derivative is inserted so that it is nuclease resistant so that the double strand chain is not cleaved by restriction enzymes.
리버스 프라이머에 RNA 폴리머라아제의 프로모터를 삽입해 둘 수 있다. 이 경우도 SDA법을 응용한 앞의 태양과 동일하게, 도 6-(D)의 양단으로부터 이 프로모터를 인식하는 RNA 폴리머라아제에 의해 전사가 행해진다.The promoter of RNA polymerase can be inserted into the reverse primer. Also in this case, transcription is performed by RNA polymerase that recognizes this promoter from both ends of Fig. 6- (D), similarly to the previous embodiment in which the SDA method is applied.
본 발명에 의해 합성된 핵산은, 단일가닥 사슬이라고는 해도 상보적인 염기서열로부터 구성되기 때문에, 그 대부분이 염기쌍 결합을 형성하고 있다. 이 특징을 이용하여, 합성 생성물의 검출이 가능하다. 에티디움브로마이드 (ethidiumbromide), SYBR Green I, 또는 Pico Green과 같은 이중가닥 사슬 특이 인터칼레이터(intercalater)인 형광색소의 존재하에서 본 발명에 의한 핵산의 합성방법을 실시하면, 생성물의 증가에 동반하여 형광강도의 증대가 관찰된다. 이것을 모니터하면, 폐쇄계에서 리얼타임 합성반응의 추적이 가능하다. 이 종의 검출계는 PCR법으로의 응용도 생각되고 있지만, 프라이머 다이머 등에 의한 시그날의 발생과 구별이 되지 않기 때문에 문제가 많은 것으로 되고 있다. 그러나 본 발명에 응용한 경우에는, 비특이적인 염기쌍 결합이 증가할 가능성이 매우 낮기 때문에, 높은 감도와 적은 노이즈를 동시에 기대할 수 있다. 이중가닥 사슬 특이 인터칼레이터와 동일하게, 균일계의 검출계를 실현하는 방법으로서, 형광에너지 전이의 이용이 가능하다.Since the nucleic acid synthesized according to the present invention is composed of nucleotide sequences complementary to each other even as a single stranded chain, most of them form base pair bonds. Using this feature, detection of synthetic products is possible. When the nucleic acid synthesis method according to the present invention is carried out in the presence of a fluorescent dye which is a double-stranded chain-specific intercalater such as ethidiumbromide, SYBR Green I, or Pico Green, An increase in fluorescence intensity is observed. Monitoring this allows tracking of real-time synthesis reactions in closed systems. Although the detection system of this species is also considered to be applied by the PCR method, there are many problems because it is indistinguishable from generation of a signal by a primer dimer or the like. However, when applied to the present invention, it is very unlikely that nonspecific base pair binding will increase, so high sensitivity and low noise can be expected at the same time. Similarly to the double-stranded chain specific intercalator, as a method of realizing a homogeneous detection system, fluorescence energy transfer can be used.
본 발명에 의한 핵산의 합성방법을 지지하고 있는 것은, 사슬 치환형 상보사슬 합성반응을 촉매하는 DNA 폴리머라아제이다. 상기 반응중에는, 반드시 사슬 치환형 폴리머라아제를 필요로 하지 않는 반응 스텝도 포함되어 있기는 하다. 그러나, 구성시약의 단순화, 그리고 경제성면에서, 1종류의 DNA 폴리머라아제를 이용하는 것이 유리하다. 이 종의 DNA 폴리머라아제에는, 아래와 같은 것이 알려져 있다. 또한, 이들 효소의 각종 변이체에 대해서도, 그것이 서열의존형 상보사슬 합성활성과 사슬 치환 활성을 갖는 한, 본 발명에 이용할 수 있다. 여기에서 말하는 변이체란, 효소가 필요로 하는 촉매활성을 초래하는 구조만을 꺼낸 것, 또는 아미노산의 변이 등에 의해 촉매활성, 안정성, 또는 내열성을 개변한 것 등을 나타낼 수 있다.Supporting the nucleic acid synthesis method of the present invention is a DNA polymerase which catalyzes a chain substitution type complementary chain synthesis reaction. The reaction also includes a reaction step that does not necessarily require a chain substituted polymerase. However, it is advantageous to use one kind of DNA polymerase in terms of simplification and economical efficiency of the constituent reagent. As the DNA polymerase of this species, the followings are known. Various variants of these enzymes can also be used in the present invention as long as they have sequence-dependent complementary chain synthesis activity and chain substitution activity. The variant herein may refer to one obtained only by a structure that results in the catalytic activity required by an enzyme, or one that changes catalytic activity, stability, or heat resistance due to amino acid variation or the like.
Bst DNA 폴리머라아제Bst DNA Polymerase
Bca(exo-)DNA 폴리머라아제Bca (exo-) DNA polymerase
DNA 폴리머라아제 I의 클레노우 ·프래그먼트(Klenow fragment)Klenow fragment of DNA polymerase I
Vent DNA 폴리머라아제Vent DNA Polymerase
Vent(Exo-)DNA 폴리머라아제(Vent DNA 폴리머라아제로부터 엑소 뉴클레아제 활성을 제거한 것)Vent (Exo-) DNA polymerase (depletion of exo nuclease activity from Vent DNA polymerase)
DeepVent DNA 폴리머라아제DeepVent DNA Polymerase
DeepVent(Exo-)DNA 폴리머라아제(DeepVent DNA 폴리머라아제로부터 엑소 뉴클레아제 활성을 제거한 것)DeepVent (Exo-) DNA polymerase (depletion of exo nuclease activity from DeepVent DNA polymerase)
φ29 파지 DNA 폴리머라아제φ29 phage DNA polymerase
MS-2 파지 DNA 폴리머라아제MS-2 Phage DNA Polymerase
Z-Taq DNA 폴리머라아제(다까라주조)Z-Taq DNA polymerase (casting)
KOD DNA 폴리머라아제(도요보세키)KOD DNA Polymerase (Toyo Boseki)
이들 효소 중에서도 Bst DNA 폴리머라아제나 Bca(exo-)DNA 폴리머라아제는, 어느 정도의 내열성을 가지고, 촉매활성도 높기 때문에 특히 바람직한 효소이다. 본 발명의 반응은, 바람직한 태양에 있어서는 등온에서 실시할 수 있지만, 융해온도(Tm)의 조정 등을 위해 반드시 효소의 안정성에 적합한 온도조건을 이용할 수 있다고는 한정할 수 없다. 따라서, 효소가 내열성인 것은 바람직한 조건의 하나이다. 또한, 등온반응이 가능하다고는 해도, 최초의 주형이 되는 핵산의 제공을 위해서도 가열변성은 행해질 가능성이 있어, 그 점에 있어서도 내열성 효소의 이용은 어세이 프로토콜(assay protocol)의 선택의 폭을 넓힌다.Among these enzymes, Bst DNA polymerase and Bca (exo-) DNA polymerase are particularly preferred enzymes because they have some heat resistance and high catalytic activity. Although the reaction of this invention can be performed at isothermal temperature in a preferable aspect, it cannot necessarily limit that temperature conditions suitable for the stability of an enzyme can always be used for adjustment of melting temperature (Tm). Therefore, it is one of preferable conditions that an enzyme is heat resistant. In addition, even if the isothermal reaction is possible, heat denaturation may also be performed to provide the nucleic acid which is the first template, and in that regard, the use of the heat-resistant enzyme expands the choice of assay protocol. .
Vent(Exo-)DNA 폴리머라아제는, 사슬 치환 활성과 함께 고도의 내열성을 갖춘 효소이다. 그런데 DNA 폴리머라아제에 의한 사슬 치환을 동반하는 상보사슬 합성반응은, 단일가닥 사슬 결합단백질(single strand binding protein)의 첨가에 의해 촉진되는 것이 알려져 있다(Paul M. Lizardi et al, Nature Genetics 19, 225-232, July, 1998). 이 작용을 본 발명에 응용하여, 단일가닥 사슬 결합단백질을 첨가함으로써 상보사슬 합성의 촉진효과를 기대할 수 있다. 예를 들면 Vent(Exo-)DNA 폴리머라아제에 대해서는, 단일가닥 사슬 결합단백질로서 T4 gene 32가 유효하다.Vent (Exo-) DNA polymerase is an enzyme with high heat resistance along with chain substitution activity. However, it is known that the complementary chain synthesis reaction involving chain substitution by DNA polymerase is promoted by the addition of a single strand binding protein (Paul M. Lizardi et al, Nature Genetics 19, 225-232, July, 1998). By applying this action to the present invention, the effect of promoting the complementary chain synthesis can be expected by adding a single-stranded chain binding protein. For example, for Vent (Exo-) DNA polymerase, T4 gene 32 is effective as a single-stranded chain binding protein.
또한 3'-5' 엑소 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 DNA 폴리머라아제에는, 상보사슬 합성이 주형의 5'말단에 달한 부분에서 정지하지 않고, 1염기 돌출시킨 상태까지 합성을 진행하는 현상이 알려져 있다. 본 발명에서는, 상보사슬 합성이 말단에 이르렀을 때의 3'말단의 서열이 다음의 상보사슬 합성의 개시로 이어지기 때문에, 이러한 현상은 바람직하지 않다. 그러나, DNA 폴리머라아제에 의한 3'말단으로의 염기의 부가는, 높은 확률로 A가 된다. 따라서, dATP가 잘못해서 1염기 부가되더라도 문제가 되지 않도록, 3'말단으로부터의 합성이 A에서 개시하도록 서열을 선택하면 좋다. 또한, 상보사슬 합성시에 3'말단이 설령 돌출되어 버려도, 이것을 소화하여 blunt end로 하는 3'→5' 엑소뉴클레아제활성을 이용할 수도 있다. 예를 들면, 천연형 VentDNA 폴리머라아제는 이 활성을 갖는 것으로부터, Vent(Exo-)DNA 폴리머라아제와 혼합하여 이용함으로써, 이 문제를 회피할 수 있다.In addition, in the DNA polymerase having no 3'-5 'exonuclease activity, the phenomenon in which the complementary chain synthesis does not stop at the 5' end of the template but proceeds to the state where one base is extruded is known. have. In the present invention, this phenomenon is not preferable because the sequence at the 3 'end when the complementary chain synthesis reaches the end leads to the start of the next complementary chain synthesis. However, addition of the base to the 3 'end by DNA polymerase becomes A with high probability. Therefore, the sequence may be selected so that the synthesis from the 3 'end starts at A so that dATP is not a problem even if one base is added by mistake. In addition, even if the 3 'end protrudes during the synthesis of the complementary chain, the 3' → 5 'exonuclease activity can be used to digest this to make the blunt end. For example, since a natural VentDNA polymerase has this activity, this problem can be avoided by using in combination with Vent (Exo-) DNA polymerase.
본 발명에 의한 핵산의 합성방법, 또는 증폭방법에 필요한 각종 시약류는, 미리 팩키징하여 키트로서 공급할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명을 위해, 상보사슬 합성의 프라이머로서, 또는 치환용 아웃터 프라이머로서 필요한 각종 올리고뉴클레오티드, 상보사슬 합성의 기질이 되는 dNTP, 사슬 치환형 상보사슬 합성을 행하는 DNA 폴리머라아제, 효소반응에 적합한 조건을 부여하는 완충액, 더욱이 필요에 따라 합성반응 생성물의 검출을 위해 필요한 시약류로 구성되는 키트가 제공된다. 특히, 본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, 반응액중에서 시약의 첨가가 불필요하기 때문에, 1회의 반응에 필요한 시약을 반응용기에 분주한 상태에서 공급함으로써, 샘플의 첨가 만으로 반응을 개시할 수 있는 상태로 할 수 있다. 발광 시그날이나 형광 시그날을 이용하여, 반응생성물의 검출을 반응용기 그대로 행할 수 있는 시스템으로 하면, 반응 후 용기의 개봉을 전면적으로 폐지할 수 있다. 이것은, 오염의 방지상, 대단히 바람직한 것이다.Various reagents required for the method for synthesizing or amplifying the nucleic acid according to the present invention can be packaged in advance and supplied as a kit. Specifically, for the present invention, various oligonucleotides required as primers for complementary chain synthesis or as replacement outer primers, dNTPs as substrates for complementary chain synthesis, DNA polymerases for synthesizing chain substituted complementary chains, and enzymes Kits are provided which consist of buffers which impart suitable conditions for the reaction, and furthermore, reagents necessary for the detection of the synthesis reaction products, as required. In particular, in a preferred embodiment of the present invention, since the addition of reagents is not necessary in the reaction solution, the reagents required for one reaction are supplied in a state in which the reagents are dispensed into the reaction vessel, so that the reaction can be started only by the addition of the sample. can do. By using a light emitting signal or a fluorescence signal, a system capable of detecting a reaction product as it is can be completely abolished after the reaction. This is very preferable for the prevention of contamination.
본 발명에 의해 합성되는, 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산에는, 예를 들면 다음과 같은 유용성이 있다. 첫째로는, 상보적인 염기서열을 1분자 내에 갖춘 특수한 구조에 동반되는 이점의 활용이다. 이 특징에 의해, 검출이 용이해지는 것이 기대된다. 즉, 상보적인 염기서열과의 염기쌍 결합에 동반하여, 시그날을 증감하는 핵산의 검출계가 공지이다. 예를 들면 앞서 기술한 바와 같은 이중가닥 사슬 특이 인터칼레이터를 검출제로서 이용하는 방법 등을 조합시키면, 본 발명 합성 생성물의 특징을 살린 검출계를 실현할 수 있다. 이러한 검출계에 있어서 본 발명의 합성반응 생성물을 한번 열변성하여 원래의 온도로 되돌리면, 분자내의 어닐링이 우선적으로 일어나기 때문에 신속하게 상보적 서열 사이에서 염기쌍 결합을 구성한다. 한편, 만일 비특이적 반응생성물이 존재하고 있더라도, 그것은 분자내에 상보적 서열을 가지고 있지 않기 때문에 열변성에 의해 2분자 이상으로 분리되어 버려, 곧바로 원래의 이중가닥 사슬로 돌아갈 수는 없다. 이렇게 하여 검출 전에 가열변성공정을 추가함으로써, 비특이반응에 동반되는 노이즈를 줄일 수 있다. 열에 대해 내성을 갖지 않는 DNA 폴리머라아제를 사용하고 있을 때에는, 가열변성공정은 반응정지의 의미도 가져, 반응시간의 제어면에서 유리하다.Nucleic acid synthesized by the present invention, the complementary nucleotide sequence alternately linked on a single-stranded chain, for example, has the following usefulness. First, the advantage is accompanied by a special structure with complementary sequences in one molecule. This feature is expected to facilitate detection. That is, a detection system of nucleic acid which increases or decreases a signal in association with base pair binding to a complementary base sequence is known. For example, a combination of a method using a double-stranded chain-specific intercalator as described above as a detection agent and the like can realize a detection system utilizing the characteristics of the synthetic product of the present invention. In such a detection system, once the synthetic reaction product of the present invention is thermally denatured and returned to the original temperature, intramolecular annealing occurs preferentially, thereby rapidly forming base pair bonds between complementary sequences. On the other hand, even if a nonspecific reaction product is present, since it does not have a complementary sequence in the molecule, it is separated into two or more molecules by thermal denaturation and cannot immediately return to the original double-stranded chain. By adding a heat denaturation step before detection in this way, the noise accompanying the non-specific reaction can be reduced. When a DNA polymerase that is not resistant to heat is used, the heat denaturation step also has the meaning of stopping the reaction, which is advantageous in terms of controlling the reaction time.
두번째 특징은, 염기쌍 결합이 가능한 상태에 있는 루프를 항상 형성하는 것이다. 염기쌍 결합이 가능한 상태에 있는 루프의 구조를, 도 4에 나타냈다. 도 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 루프는 프라이머의 어닐링이 가능한 염기서열 F2c(X2c)와, F2c-F1c(X1c) 사이에 개재하는 염기서열로 구성된다. F2c-F1c 사이(보편적으로 나타내면 X2c-X1c 사이)의 서열은, 주형에 유래하는 염기서열이다. 따라서 이 영역에 대해 상보적인 염기서열을 갖는 프로브를 하이브리다이즈시키면, 주형 특이적인 검출을 행할 수 있다. 또한, 이 영역은 항상 염기쌍 결합이 가능한 상태에 있기 때문에, 하이브리다이즈에 앞서 가열변성할 필요가 없다. 또한 본 발명의 증폭반응 생성물에 있어서의 루프를 구성하는 염기서열은, 임의의 길이로 할 수 있다. 따라서, 프로브의 하이브리다이즈를 목적으로 하는 경우에는, 프라이머가 어닐링해야 할 영역과 프로브가 하이브리다이즈해야 할 영역을 따로 해서 양자의 경합을 피함으로써 이상적인 반응조건을 구성할 수 있다.The second feature is that it always forms a loop that is in a state capable of base pair binding. The structure of the loop in the state which can base-bond is shown in FIG. As can be seen from FIG. 4, the loop is composed of a base sequence F2c (X2c) capable of annealing primers and a base sequence interposed between F2c-F1c (X1c). The sequence between F2c-F1c (generally, between X2c-X1c) is a nucleotide sequence derived from a template. Therefore, template specific detection can be performed by hybridizing a probe having a nucleotide sequence complementary to this region. In addition, since this region is always in a state capable of base pair bonding, it is not necessary to heat-denature before hybridization. In addition, the base sequence which comprises a loop in the amplification reaction product of this invention can be arbitrary length. Therefore, in the case of hybridizing the probe, ideal reaction conditions can be constructed by avoiding contention between the region to be annealed and the region to be hybridized to the probe.
본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 단일가닥 핵산사슬 상에 염기쌍 결합이 가능한 다수의 루프가 초래된다. 이것은, 핵산 1분자에 다수의 프로브가 하이브리다이즈 가능한 것을 의미하고 있어, 감도 높은 검출을 가능하게 한다. 또한 감도 뿐 아니라, 예를 들면 응집반응과 같은 특수한 반응원리를 토대로 하는 핵산의 검출방법을 가능하게 하는 것이기도 하다. 예를 들면 폴리스티렌라텍스와 같은 미립자에 고정한 프로브를 본 발명에 의한 반응생성물에 가하면, 프로브와의 하이브리다이제이션에 동반하여 라텍스입자의 응집이 관찰된다. 응집의 강도를 광학적으로 측정하면, 높은 감도로, 또한 정량적인 관찰이 가능하다. 또한, 응집반응을 육안으로 관찰할 수도 있기 때문에, 광학적인 측정장치를 사용하지 않는 반응계를 구성할 수도 있다.According to a preferred aspect of the present invention, multiple loops capable of base pair binding on a single stranded nucleic acid chain are brought about. This means that a large number of probes can be hybridized to one molecule of nucleic acid, thereby enabling highly sensitive detection. In addition to sensitivity, it is also possible to detect a nucleic acid based on a special reaction principle such as, for example, an aggregation reaction. For example, when a probe fixed to fine particles such as polystyrene latex is added to the reaction product according to the present invention, aggregation of latex particles is observed in conjunction with hybridization with the probe. By measuring the intensity of aggregation optically, high sensitivity and quantitative observation are possible. In addition, since the aggregation reaction can be visually observed, a reaction system without using an optical measuring device can be configured.
더욱이, 1핵산분자 당 많은 표지를 결합할 수 있는 본 발명의 반응생성물은, 크로마토그래피 검출도 가능하게 한다. 이뮤노 어세이 분야에서는, 육안으로 검출 가능한 표지를 이용한 크로마토 매체를 사용한 분석방법(이뮤노 크로마토그래피법)이 실용화되어 있다. 이 방법은, 크로마토매채에 고정한 항체와 표지항체에서 아날라이트(analyte)를 샌드위치하여, 미반응 표지성분을 씻어내는 원리를 토대로 하고 있다. 본 발명의 반응생성물은, 이 원리를 핵산의 분석에도 응용 가능하게 한다. 즉, 루프부분에 대한 표지 프로브를 준비하여, 이것을 크로마토 매체에 고정화한 포착용 프로브로 트랩함으로써 크로마토 매체중에서의 분석이 행해진다. 포착용 프로브에는, 루프부분에 대한 상보서열을 이용할 수 있다. 본 발명의 반응생성물은, 다수의 루프부분을 동반하고 있기 때문에, 다수의 표지 프로브를 결합하여, 육안으로 인식 가능한 시그날을 초래한다.Moreover, the reaction product of the present invention, which can bind many labels per molecule of nucleic acid, also enables chromatographic detection. In the field of immunoassay, the analysis method (immunochromatography method) using the chromatographic medium using the label which can be detected visually is put to practical use. This method is based on the principle of washing an unreacted label component by sandwiching analyte from an antibody immobilized on a chromatographic solution and a label antibody. The reaction product of the present invention makes this principle applicable to the analysis of nucleic acids. In other words, analysis in a chromatographic medium is performed by preparing a labeled probe for a loop portion and trapping it with a capture probe immobilized on a chromatographic medium. The complementary sequence for the loop portion can be used for the capture probe. Since the reaction product of the present invention has a plurality of loop portions, it combines a plurality of labeled probes, resulting in a signal that can be visually recognized.
루프로서 항상 염기쌍 결합이 가능한 영역을 부여하는 본 발명에 의한 반응생성물은, 이 밖에도 여러 검출계를 가능하게 한다. 예를 들면, 이 루프부분에 대한 프로브를 고정한 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)을 이용한 검출계가 가능하다. 또한, 루프부분에 대한 프로브를 이중가닥 사슬 특이적인 인터칼레이터로 표지해 두면, 보다 고감도의 형광분석을 행할 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 합성되는 핵산이 3'측과 5'측 양쪽에 염기쌍 결합이 가능한 루프를 형성하는 것을 적극적으로 이용할 수도 있다. 예를 들면, 한쪽 루프를 정상형과 이상형에서 공통의 염기서열로 된 부분으로 하여, 다른 쪽 루프에 양자의 차이가 생기는 영역으로 되도록 설계해 두는 것이다. 공통부분에 대한 프로브에서 유전자의 존재를 확인하여, 다른쪽 영역에서 이상의 유무를 확인한다고 하는 특징적인 분석계를 구성할 수 있다. 본 발명에 의한 핵산의 합성반응은, 등온에서 진행하는 것도 가능하기 때문에, 일반적인 형광광도계에 의해 리얼 타임 분석이 가능해지는 것도 특필할 만한 이점이다. 지금까지도 동일 사슬 상에 어닐링하는 핵산의 구조는 공지이다. 그러나 본 발명에 의해 얻을 수 있는 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산은, 다른 올리고뉴클레오티드가 염기쌍 결합할 수 있는 다수의 루프부분을 포함하는 점에 있어서 신규하다.The reaction product according to the present invention, which always provides a region capable of base pair bonding as a loop, enables various detection systems. For example, a detection system using surface plasmon resonance in which a probe with respect to the loop portion is fixed is possible. In addition, if the probe for the loop portion is labeled with a double-stranded chain specific intercalator, more sensitive fluorescence analysis can be performed. Moreover, the nucleic acid synthesize | combined by this invention can also actively use what forms the loop which can couple base pair to both 3 'side and 5' side. For example, it is designed so that one loop is a part consisting of a common sequence in the normal type and the ideal type, and the other loop is an area in which the difference occurs. By identifying the presence of genes in the probe for the common region, a characteristic assay system can be constructed that checks for abnormalities in the other region. Since the synthesis reaction of the nucleic acid according to the present invention can also proceed at isothermal temperature, it is also an advantage that real time analysis can be performed by a general fluorescent photometer. Until now, the structure of a nucleic acid annealed on the same chain is known. However, nucleic acids having alternating complementary nucleotide sequences on a single-stranded chain obtainable by the present invention are novel in that they include a plurality of loop moieties to which other oligonucleotides can bind base pairs.
한편, 본 발명에 의한 반응생성물에 의해 부여되는 다수의 루프부분 그 자체를 프로브로 하여 이용하는 것도 가능하다. 예를 들면, DNA 칩에 있어서는, 한정된 영역에 높은 밀도로 프로브를 집적할 필요가 있다. 그러나 현재의 기술로는, 일정 면적에 고정할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 수는 제한된다. 따라서 본 발명의 반응생성물을 이용하면, 어닐링이 가능한 다수의 프로브를 높은 밀도로 고정화할 수 있다. 즉, 본 발명에 의한 반응생성물을 프로브로 하여 DNA 칩상에 고정하면 좋다. 반응생성물은, 증폭후에 공지의 수법에 의해 고정할 수도 있고, 또한 고정화한 올리고뉴클레오티드를 본 발명의 증폭반응에 있어서의 올리고뉴클레오티드로서 이용함으로써 결과적으로 고정화된 반응생성물로 할 수도 있다. 이렇게 하여 고정화된 프로브를 사용하면, 한정된 영역 속에 많은 시료 DNA를 하이브리다이즈할 수 있어, 결과적으로 높은 시그날을 기대할 수 있다.On the other hand, it is also possible to use a plurality of loop portions themselves provided by the reaction product according to the present invention as a probe. For example, in a DNA chip, it is necessary to integrate a probe with a high density in a limited region. However, with the current technology, the number of oligonucleotides that can be fixed in a certain area is limited. Therefore, by using the reaction product of the present invention, a plurality of probes capable of annealing can be immobilized at a high density. That is, the reaction product according to the present invention may be fixed on a DNA chip using a probe. After amplification, the reaction product may be fixed by a known method, or the immobilized oligonucleotide may be used as an oligonucleotide in the amplification reaction of the present invention, resulting in an immobilized reaction product. By using the immobilized probe in this way, a large number of sample DNAs can be hybridized in a limited region, and as a result, a high signal can be expected.
도면의 간단한 설명Brief description of the drawings
도 1은, 본 발명의 바람직한 태양의 반응원리의 일부(1)-(4)를 나타내는 모식도이다.FIG. 1: is a schematic diagram which shows a part (1)-(4) of the reaction principle of a preferable aspect of this invention.
도 2는, 본 발명의 바람직한 태양의 반응원리의 일부(5)-(7)을 나타내는 모식도이다.Fig. 2 is a schematic diagram showing a part (5)-(7) of the reaction principle of a preferred embodiment of the present invention.
도 3은, 본 발명의 바람직한 태양의 반응원리의 일부(8)-(10)을 나타내는 모식도이다.3 is a schematic diagram showing a part (8)-(10) of the reaction principle of a preferred embodiment of the present invention.
도 4는, 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 핵산이 형성하는 루프의 구조를 나타내는 모식도이다.4 is a schematic diagram showing the structure of a loop formed by the single-stranded chain nucleic acid according to the present invention.
도 5는, 본 발명에 의한 기초적인 태양의 일부(A)-(B)를 나타내는 모식도이다.FIG. 5: is a schematic diagram which shows a part (A)-(B) of the basic aspect by this invention.
도 6은, 본 발명에 의한 기초적인 태양의 일부(C)-(D)를 나타내는 모식도이다.FIG. 6: is a schematic diagram which shows the part (C)-(D) of the basic aspect which concerns on this invention.
도 7은, M13mp18의 표적 염기서열에 있어서의, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 각 염기서열의 위치관계를 나타내는 도이다.Fig. 7 is a diagram showing the positional relationship of the respective nucleotide sequences constituting the oligonucleotide in the target nucleotide sequence of M13mp18.
도 8은, M13mp18을 주형으로 하여 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 핵산의 합성방법에 의해 얻어진 생성물의 아가로우즈 전기영동의 결과를 나타내는 사진이다.Fig. 8 is a photograph showing the results of agarose electrophoresis of the product obtained by the method for synthesizing a single stranded chain nucleic acid according to the present invention, using M13mp18 as a template.
레인 1 : XIV size markerLane 1: XIV size marker
레인 2 : 1 fmol M13mp18 dsDNALane 2: 1 fmol M13mp18 dsDNA
레인 3 : target 없음Lane 3: no target
도 9는, 실시예 1에 의해 얻어진 본 발명에 의한 핵산 합성반응의 생성물을 제한효소로 소화하여 아가로우즈 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.9 is a photograph showing the result of agarose electrophoresis by digesting the product of the nucleic acid synthesis reaction according to the present invention obtained in Example 1 with a restriction enzyme.
레인 1 : XIV size markerLane 1: XIV size marker
레인 2 : 정제물의 BamHI 소화물Lane 2: BamHI digest of the purified
레인 3 : 정제물의 PvuII 소화물Lane 3: PvuII digests of the purified
레인 4 : 정제물의 HindIII 소화물Lane 4: HindIII digest of the purified
도 10은, M13mp18을 주형으로 하여, 베타인 첨가에 의한 본 발명의 단일가닥 사슬 핵산의 합성방법에 의해 얻어진 생성물의 아가로우즈 전기영동의 결과를 나타내는 사진이다. 0, 0.5, 1, 2는 반응액중에 첨가한 베타인 농도(M)를 나타낸다. 또, N은 음성대조를, -21은 주형 DNA의 농도 10-21mol을 나타낸다.Fig. 10 is a photograph showing the results of agarose electrophoresis of the product obtained by the method for synthesizing the single-stranded chain nucleic acid of the present invention by adding betaine using M13mp18 as a template. 0, 0.5, 1, and 2 represent the betaine concentration (M) added to the reaction liquid. N represents a negative control and -21 represents a concentration of template DNA of 10 -21 mol.
도 11은, HBV 유래의 표적염기서열에 있어서의, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 각 염기서열의 위치관계를 나타내는 도이다.Fig. 11 is a diagram showing the positional relationship of each base sequence constituting the oligonucleotide in the target base sequence derived from HBV.
도 12는, M13mp18에 삽입된 HBV-M13mp18을 주형으로 하여 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 핵산의 합성방법에 의해 얻어진 생성물의 아가로우즈 전기영동의 결과를 나타내는 사진이다.Fig. 12 is a photograph showing the results of agarose electrophoresis of a product obtained by the method for synthesizing a single stranded chain nucleic acid according to the present invention, using HBV-M13mp18 inserted in M13mp18 as a template.
레인 1 : XIV size markerLane 1: XIV size marker
레인 2 : 1 fmol HBV-M13mp18 dsDNALane 2: 1 fmol HBV-M13mp18 dsDNA
레인 3 : target 없음Lane 3: no target
도 13은, 본 발명에 의한 단일가닥 사슬핵산의 합성방법에 의해 얻어진 생성물의 알칼리 변성 겔전기영동의 결과를 나타내는 사진이다.Fig. 13 is a photograph showing the result of alkali-modified gel electrophoresis of the product obtained by the method for synthesizing a single stranded chain nucleic acid according to the present invention.
레인 1 : 람다 파지(lambda phage)의 HindIII 소화단편Lane 1: HindIII digestion fragment of lambda phage
레인 2 : 실시예 1의 반응생성물Lane 2: the reaction product of Example 1
레인 3 : 실시예 3의 반응생성물Lane 3: reaction product of Example 3
도 14는, 타겟인 M13mp18의 농도를 바꿨을 때에, 본 발명에 의한 단일가닥사슬 핵산의 합성방법에 의해 얻어진 생성물의 아가로우즈 전기영동의 결과를 나타내는 사진이다. 위는 반응시간 1시간, 아래는 반응시간 3시간의 결과이다.Fig. 14 is a photograph showing the results of agarose electrophoresis of the product obtained by the method for synthesizing a single stranded nucleic acid according to the present invention when the concentration of the target M13mp18 is changed. Above is the result of 1 hour of reaction time and below is 3 hours of reaction time.
레인 1 : M13mp18 dsDNA 1×10-15mol/tubeLane 1: M13mp18 dsDNA 1 × 10 -15 mol / tube
레인 2 : M13mp18 dsDNA 1×10-16mol/tubeLane 2: M13mp18 dsDNA 1 × 10 -16 mol / tube
레인 3 : M13mp18 dsDNA 1×10-17mol/tubeLane 3: M13mp18 dsDNA 1 × 10 -17 mol / tube
레인 4 : M13mp18 dsDNA 1×10-18mol/tubeLane 4: M13mp18 dsDNA 1 × 10 -18 mol / tube
레인 5 : M13mp18 dsDNA 1×10-19mol/tubeLane 5: M13mp18 dsDNA 1 × 10 -19 mol / tube
레인 6 : M13mp18 dsDNA 1×10-20mol/tubeLane 6: M13mp18 dsDNA 1 × 10 -20 mol / tube
레인 7 : M13mp18 dsDNA 1×10-21mol/tubeLane 7: M13mp18 dsDNA 1 × 10 -21 mol / tube
레인 8 : M13mp18 dsDNA 1×10-22mol/tubeLane 8: M13mp18 dsDNA 1 × 10 -22 mol / tube
레인 9 : target 없음Lane 9: no target
레인 10 : XIV size markerLane 10: XIV size marker
도 15는, 변이의 위치 및 표적염기서열(target)에 대한 각 영역의 위치관계를 나타내는 도이다. 밑줄로 나타낸 구아닌(guanine)이, 변이형에서는 아데닌(adenine)으로 치환되어 있다.Fig. 15 is a diagram showing the positional relationship of each region with respect to the position of the mutation and the target base sequence. Underlined guanine is substituted with adenine in the variant.
도 16은, 본 발명의 증폭반응에 의한 생성물의 아가로우즈 전기영동의 결과를 나타내는 사진이다.Figure 16 is a photograph showing the result of agarose electrophoresis of the product by the amplification reaction of the present invention.
M : 100 bp ladder(New England Biolabs)M: 100 bp ladder (New England Biolabs)
N : 주형 없음(정제수)N: No mold (purified water)
WT : 야생형 주형 M13mp18 1 fmolWT: Wild mold M13mp18 1 fmol
MT : 변이형 주형 M13mp18FM 1 fmolMT: variant mold M13mp18FM 1 fmol
도 17은, 표적 mRNA를 코드하는 염기서열에 있어서의, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 각 염기서열의 위치관계를 나타내는 도이다.Fig. 17 is a diagram showing the positional relationship of each base sequence constituting the oligonucleotide in the base sequence encoding the target mRNA.
도 18은, mRNA를 타겟으로 하여 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 핵산의 합성방법에 의해 얻어진 생성물의 아가로우즈 전기영동의 결과를 나타내는 사진이다.Fig. 18 is a photograph showing the result of agarose electrophoresis of a product obtained by the method for synthesizing a single stranded chain nucleic acid according to the present invention targeting mRNA.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태Best Mode for Carrying Out the Invention
실시예 1 M13mp18내 영역의 증폭Example 1 Amplification of the Region in M13mp18
M13mp18을 주형으로 하여, 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 합성방법을 시도했다. 실험에 사용한 프라이머는, M13FA, M13RA, M13F3, 그리고 M13R3의 4종류이다. M13F3과 M13R3은, 각각 M13FA와 M13RA를 합성기점으로 하여 얻어진 제1 핵산을 치환하기 위한 아웃터 프라이머이다. 아웃터 프라이머는 M13FA(또는 M13RA) 보다도 뒤에서 상보사슬의 합성기점이 될 프라이머이기 때문에, M13FA(또는 M13RA)와 인접하는 영역에 콘티규어스 스태킹 현상을 이용하여 어닐링하도록 설계했다. 또한, M13FA(또는 M13RA)의 어닐링이 우선적으로 일어남으로써 이들 프라이머 농도를 높게 설정했다.Using M13mp18 as a template, a method for synthesizing nucleic acids in which complementary nucleotide sequences are alternately linked on a single-stranded chain according to the present invention was attempted. The primers used for the experiment are four types of M13FA, M13RA, M13F3, and M13R3. M13F3 and M13R3 are outer primers for substituting the first nucleic acid obtained using M13FA and M13RA as a synthetic starting point, respectively. Since the outer primer is a primer which will be the starting point of the complementary chain after M13FA (or M13RA), the outer primer is designed to anneal using the constipation stacking phenomenon in the region adjacent to M13FA (or M13RA). In addition, annealing of M13FA (or M13RA) occurs preferentially, and these primer concentrations were set high.
각 프라이머를 구성하는 염기서열은 서열표에 나타낸 바와 같다. 프라이머의구조적인 특징을 아래에 정리했다. 또 표적염기서열(target)에 대한 각 영역의 위치관계를 도 7에 나타냈다.The base sequences constituting each primer are as shown in the sequence table. The structural features of the primers are summarized below. Moreover, the positional relationship of each area | region with respect to the target base sequence is shown in FIG.
프라이머5'측의 영역 /3'측의 영역Area on primer 5 'side / 3' area
M13FAM13FA에 의한 합성 상보사슬의 영역 F1c와 동일Same as region F1c of the synthetic complementary chain by M13FAM13FA
/ M13mp18의 영역 F2c에 상보Complement to the area F2c / M13mp18
M13RAM13RA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R1c와 동일Same as the region R1c of the synthetic complementary chain by M13RAM13RA
/ M13FA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R2c에 상보Complementary to region R2c of the synthetic complementary chain by C / M13FA
M13F3M13mp18의 영역 F2c의 3'측에 인접하는 F3c에 상보Complementary to F3c adjacent to 3 'side of region F2c of M13F3M13mp18
M13R3M13FA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R2c의 3'측에 인접하는 R3c에 상보Complementary to R3c adjacent to 3 'side of region R2c of the synthetic complementary chain by M13R3M13FA
이와 같은 프라이머에 의해, M13mp18의 영역 F1c에서 R1c에 이르는 영역과 그 상보적인 염기서열이, F2c를 포함하는 루프 형성서열을 통하여 단일가닥 사슬 상에 번갈아 연결된 핵산이 합성된다. 이들 프라이머에 의한 본 발명에 의한 핵산의 합성방법을 위한 반응액조성을 아래에 나타낸다.Such primers synthesize a nucleic acid in which the region from M1mp18 region F1c to R1c and its complementary nucleotide sequence are alternately linked on a single stranded chain through a loop forming sequence including F2c. The reaction solution composition for the synthesis method of the nucleic acid according to the present invention by these primers is shown below.
반응액조성(25 μL 중)Composition of reaction solution (in 25 μL)
20 mM Tris-HCl pH8.820 mM Tris-HCl pH8.8
10 mM KCl10 mM KCl
10 mM (NH4)2SO4 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4
6 mM MgSO4 6 mM MgSO 4
0.1% Triton X-1000.1% Triton X-100
5% 디메틸설폭시드(DMSO)5% Dimethylsulfoxide (DMSO)
0.4 mM dNTP0.4 mM dNTP
프라이머 :primer :
800 nM M13FA/서열번호 : 1800 nM M13FA / SEQ ID NO: 1
800 nM M13RA/서열번호 : 2800 nM M13RA / SEQ ID NO: 2
200 nM M13F3/서열번호 : 3200 nM M13F3 / SEQ ID NO: 3
200 nM M13R3/서열번호 : 4200 nM M13R3 / SEQ ID NO: 4
타겟 : M13mp18 dsDNA/서열번호 : 5Target: M13mp18 dsDNA / SEQ ID NO: 5
반응 : 상기 반응액을 95℃에서 5분간 가열하여, 타겟을 변성시켜 단일가닥 사슬로 했다. 반응액을 빙수로 옮겨, Bst DNA 폴리머라아제(NEW ENGLAND BioLabs)를 4U 첨가하고, 65℃에서 1시간 반응시켰다. 반응후, 80℃ 10분간에서 반응을 정지하고 다시 빙수로 옮겼다.Reaction: The said reaction liquid was heated at 95 degreeC for 5 minutes, the target was denatured and it was set as single stranded chain. The reaction solution was transferred to ice-water, 4U of Bst DNA polymerase (NEW ENGLAND BioLabs) was added, and it was made to react at 65 degreeC for 1 hour. After the reaction, the reaction was stopped at 80 ° C. for 10 minutes and transferred to ice water again.
반응의 확인 : 상기 반응액의 5 μL에 1 μL의 loading buffer를 첨가하고, 2% 아가로우즈 겔(0.5% TBE)을 사용하여, 1시간, 80 mV로 전기영동했다. 분자 사이즈 마커로서, XIV(100 bp ladder, Boehringer Mannheim제)를 사용했다. 영동 후의 겔을 SYBR Green I(Molecular Probes, Inc.)로 염색하여 핵산을 확인했다. 결과는 도 8에 나타내는 바와 같다. 각 레인은 다음의 샘플에 대응하고 있다.Confirmation of reaction: 1 μL of loading buffer was added to 5 μL of the reaction solution, and electrophoresis was performed at 80 mV for 1 hour using 2% agarose gel (0.5% TBE). As the molecular size marker, XIV (100 bp ladder, manufactured by Boehringer Mannheim) was used. After gelation, the gel was stained with SYBR Green I (Molecular Probes, Inc.) to confirm the nucleic acid. The results are as shown in FIG. Each lane corresponds to the following sample.
1. XIV size marker1.XIV size marker
2. 1 fmol M13mp18 dsDNA2. 1 fmol M13mp18 dsDNA
3. target 없음3. No target
레인 3에서는 미반응 프라이머가 염색되어 있는 것 이외에는 밴드는 확인되지 않았다. 레인 2는 타겟이 존재하는 경우, 저사이즈 밴드의 래더와 고사이즈에서의 스메어한 염색(smeared staining) 및 겔 내에서 거의 영동되어 있지 않는 밴드로서 생성물이 확인되었다. 저사이즈의 밴드 중, 290 bp, 450 bp 부근의 밴드는, 각각 본 발명의 합성반응에 의해 예상되는 산물인, 서열번호: 11 및 서열번호: 12가 이중가닥 사슬로 된 것(도 2-(7) 및 도 2-(10)이 이중가닥 사슬로 된 것에 상당) 및 서열번호: 13(도 3-(9)에 있는 긴 단일가닥 사슬에 상당)과 사이즈가 일치하기 때문에, 반응이 예상되는 바와 같이 진행하고 있는 것이 확인되었다. 고사이즈의 스메어한 패턴(smeared pattern) 및 영동되어 있지 않은 밴드는, 본 반응이 기본적으로 연속적인 반응이기 때문에, 반응산물이 일정 사이즈로는 되지 않는 것, 그리고 부분적인 단일가닥 사슬, 또는 이중가닥 사슬의 복합체를 형성한 복잡한 구조를 동반하고 있기 때문에, 결과로서 이러한 영동결과를 부여하는 것으로 생각되었다.In lane 3, no band was identified except that the unreacted primers were stained. Lane 2 identified the product as a band of little or no smeared staining at high size and ladder of low size bands when the target was present. Among the low-sized bands, the bands around 290 bp and 450 bp each consisted of double-stranded chains of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, which are products expected by the synthesis reaction of the present invention (Fig. 2- ( 7) and FIG. 2- (10) correspond to double stranded chains) and SEQ ID NO: 13 (corresponds to the long single stranded chain in FIG. 3- (9)), so the reaction is expected. It was confirmed that it is progressing as mentioned. High-sized smeared patterns and non-phoretic bands are those in which the reaction product does not have a constant size, and the partial single-stranded chain, or double, because the present reaction is basically a continuous reaction. Since it is accompanied by a complex structure that forms a complex of strand chains, it was thought to give such a result of electrophoresis as a result.
실시예 2 반응산물의 제한효소 소화 확인Example 2 Confirmation of Restriction Enzyme Digestion of Reaction Products
실시예 1에서 얻어진 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 구조를 명확하게 하는 것을 목적으로 하여, 제한효소에의한 소화를 행했다. 제한효소를 사용한 소화에 의해 이론 대로의 단편이 생기는 한편, 실시예 1에서 관찰된 고사이즈의 스메어한 패턴이나 영동되지 않는 밴드가 소멸되면, 이들이 모두 본 발명에 의해 합성된 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열을 번갈아 연결된 핵산인 것을 추정할 수 있다.Digestion by restriction enzymes was carried out for the purpose of clarifying the structure of nucleic acids in which complementary nucleotide sequences were alternately linked on the single-stranded chain according to the present invention obtained in Example 1. Digestion with restriction enzymes resulted in the fragments of theory, while the high size smear pattern or non-phoretic bands observed in Example 1 disappeared, all of them on the single-stranded chain synthesized by the present invention. It can be assumed that the nucleic acid is alternately linked to the complementary base sequence.
실시예 1의 반응액을 8 튜브(200 μL)로부터 풀(pool)하여, 페놀처리 후, 에탄올 침전을 행하여 정제했다. 이 침전을 회수하여 200 μL의 TE 완충액으로 재용해하여, 그 10 μL를 제한효소 BamHI, PvuII 및 HindIII로 각각 37℃에서 2시간 소화했다. 소화물을 2% 아가로우즈 겔(0.5% TBE)을 사용하여, 1시간, 80 mV로 전기영동했다. 분자 사이즈 마커로서, SUPER LADDER-LOW(100 bp ladder)(Gensura Laboratories, Inc.제)를 사용했다. 영동 후의 겔을 SYBR Green I(Molecular Probes, Inc.)로 염색하여 핵산을 확인했다. 결과를 도 9에 나타내는 바와 같다. 각 레인은 다음의 샘플에 대응하고 있다.The reaction solution of Example 1 was pooled from 8 tubes (200 µL), and purified after phenol treatment by ethanol precipitation. The precipitate was recovered and redissolved in 200 μL of TE buffer, and the 10 μL was digested with restriction enzymes BamHI, PvuII and HindIII at 37 ° C. for 2 hours. The digest was electrophoresed at 80 mV for 1 hour using 2% agarose gel (0.5% TBE). As the molecular size marker, SUPER LADDER-LOW (100 bp ladder) (manufactured by Gensura Laboratories, Inc.) was used. After gelation, the gel was stained with SYBR Green I (Molecular Probes, Inc.) to confirm the nucleic acid. The results are as shown in FIG. Each lane corresponds to the following sample.
1. XIV size marker1.XIV size marker
2. 정제물의 BamHI 소화물2. BamHI Digest of Purified
3. 정제물의 PvuII 소화물3. PvuII Digestion of Purified
4. 정제물의 HindIII 소화물4. HindIII Dihydrate of Purified
여기에서 비교적 사슬 길이가 짧은 증폭 생성물을 구성하고 있는 염기서열은, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 15 및 서열번호:16 등으로 추정된다. 이들 염기서열로부터, 추측되는 각 제한효소 소화단편의 사이즈는 표 1과 같다. 표중 L은, 루프(단일가닥 사슬)를 포함하는 단편이기 때문에 영동위치가 미확정인 것을 나타낸다.Here, the nucleotide sequences constituting the amplification product having a relatively short chain length are estimated to be SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and the like. From these base sequences, the size of each restriction enzyme digestion fragment to be estimated is shown in Table 1. L in the table indicates that the phoretic position is undetermined because it is a fragment including a loop (single strand chain).
미소화에서의 밴드의 대부분이 소화후에는 추정되는 사이즈의 밴드로 변화되었기 때문에, 목적 반응산물이 증폭되어 있는 것이 확인되었다. 또한 비특이적 산물은 거의 없는 것도 나타내어졌다.Since most of the bands in the micronization changed to the bands of the estimated size after digestion, it was confirmed that the target reaction product was amplified. It has also been shown that there are few nonspecific products.
실시예 3 베타인 첨가에 의한 증폭반응의 촉진Example 3 Promotion of Amplification by Addition of Betaine
증폭반응액 속으로의 베타인(betaine: N,N,N,-trimethylglycine, SIGMA) 첨가에 의한, 핵산의 증폭반응에 대한 효과를 조사하는 실험을 행했다. 실시예 1과 동일하게, M13mp18을 주형으로 하여, 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 상에 상대적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 합성방법을, 여러 농도의 베타인 존재하에서 행했다. 실험에 사용한 프라이머는, 실시예 1에서 사용한 것과 동일하다. 주형 DNA량은, 10-21mol(M13mp18)이고, 음성 대조로서 물을 사용했다. 첨가하는 베타인은, 0, 0.5, 1, 2 M의 농도가 되도록 반응액에 가했다. 반응액 조성을 아래에 나타낸다.An experiment was conducted to investigate the effect of nucleic acid amplification by addition of betaine (N, N, N, -trimethylglycine, SIGMA) into the amplification reaction solution. In the same manner as in Example 1, using M13mp18 as a template, a method for synthesizing nucleic acids in which relative base sequences were alternately linked on a single-stranded chain according to the present invention was performed in the presence of various concentrations of betaine. The primer used for the experiment is the same as that used in Example 1. The template DNA amount was 10-21 mol (M13mp18), and water was used as a negative control. Betaine to be added was added to the reaction solution so as to have a concentration of 0, 0.5, 1, and 2 M. The reaction liquid composition is shown below.
반응액조성(25 μL 중)Composition of reaction solution (in 25 μL)
20 mM Tris-HCl pH8.820 mM Tris-HCl pH8.8
4 mM MgSO4 4 mM MgSO 4
0.4 mM dNTPs0.4 mM dNTPs
10 mM KCl10 mM KCl
10 mM (NH4)2SO4 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4
0.1% Triton X-1000.1% Triton X-100
프라이머 :primer :
800 nM M13FA/서열번호: 1800 nM M13FA / SEQ ID NO: 1
800 nM M13RA/서열번호: 2800 nM M13RA / SEQ ID NO: 2
200 nM M13F3/서열번호: 3200 nM M13F3 / SEQ ID NO: 3
200 nM M13R3/서열번호: 4200 nM M13R3 / SEQ ID NO: 4
타겟 : M13mp18 dsDNA/서열번호: 5Target: M13mp18 dsDNA / SEQ ID NO: 5
사용한 폴리머라아제, 반응조건, 반응후의 전기영동조건은, 실시예 1에 기재한 것과 동일하다.The polymerase used, reaction conditions, and electrophoresis conditions after the reaction were the same as those described in Example 1.
결과를 도 10에 나타낸다. 베타인농도 0.5, 1.0 M 존재하에서의 반응에서는, 증폭산물량이 증대되었다. 또한 2.0 M까지 늘리면 증폭산물은 확인되지 않았다. 이것에 의해, 적절한 베타인 존재로, 증폭반응이 촉진되는 것이 나타내어졌다. 베타인농도 2 M의 경우에, 증폭산물이 저하된 것은, Tm이 지나치게 저하된 것이 원인이라고 생각되었다.The results are shown in FIG. In the reaction in the presence of betaine concentration 0.5 and 1.0 M, the amount of amplification products increased. In addition, the amplification product was not confirmed when increasing to 2.0 M. As a result, it has been shown that the amplification reaction is promoted in the presence of appropriate betaine. In the case of betaine concentration 2M, it was thought that the reason why the amplification product fell was because Tm fell too much.
실시예 4 HBV 유전자서열의 증폭Example 4 Amplification of HBV Gene Sequence
HBV 유전자의 부분서열을 삽입한 M13mp18 dsDNA를 주형으로 하여, 본 발명에 의한 핵산의 합성방법을 시도했다. 실험에 사용한 프라이머는, HB65FA(서열번호: 6), HB65RA(서열번호: 7), HBF3(서열번호: 8), 그리고 HBR3(서열번호: 9)의 4종류이다. HBF3과 HBR3은, 각각 HB65FA와 HB65RA를 합성기점으로 하여 얻어진 제1 핵산을 치환하기 위한 아웃터 프라이머이다. 아웃터 프라이머는 HB65FA(또는 HB65RA) 보다도 뒤로부터 상보사슬의 합성기점이 될 프라이머이기 때문에, HB65FA(또는 HB65RA)와 인접하는 영역에 콘티규어스 스태킹 현상을 이용하여 어닐링하도록 설계했다. 또한, HB65FA(또는 HB65RA)의 어닐링이 우선적으로 일어나도록 이들 프라이머 농도를 높게 설정했다. M13mp18에 삽입된 HBV에 유래하는 본 실시예의 타겟서열(430 bp)을 서열 10에 나타냈다.Using the M13mp18 dsDNA in which the partial sequence of the HBV gene was inserted as a template, the nucleic acid synthesis method according to the present invention was tried. The primers used for the experiment are four types of HB65FA (SEQ ID NO: 6), HB65RA (SEQ ID NO: 7), HBF3 (SEQ ID NO: 8), and HBR3 (SEQ ID NO: 9). HBF3 and HBR3 are outer primers for substituting the first nucleic acid obtained using HB65FA and HB65RA as a synthetic starting point, respectively. Since the outer primer is a primer which will be the starting point of the complementary chain from the back of the HB65FA (or HB65RA), the outer primer is designed to anneal using the contiguous stacking phenomenon in the region adjacent to the HB65FA (or HB65RA). In addition, these primer concentrations were set high so that annealing of HB65FA (or HB65RA) would occur preferentially. The target sequence (430 bp) of the present Example derived from HBV inserted into M13mp18 is shown in SEQ ID NO: 10.
각 프라이머를 구성하는 염기서열은 서열표에 나타낸 바와 같다. 프라이머의 구조적인 특징을 아래에 정리했다. 또 표적염기서열(target)에 대한 각 영역의 위치관계를 도 11에 나타냈다.The base sequences constituting each primer are as shown in the sequence table. The structural features of the primers are summarized below. Moreover, the positional relationship of each area | region with respect to the target base sequence is shown in FIG.
프라이머5'측의 영역 /3'측의 영역Area on primer 5 'side / 3' area
HB65FAHB65FA에 의한 합성 상보사슬의 영역 F1c와 동일Same as the region F1c of the synthetic complementary chain by HB65FAHB65FA
/ HBV-M13mp18의 영역 F2c에 상보/ Complementary to area F2c of HBV-M13mp18
HB65RAHB65RA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R1c와 동일Same as the region R1c of the synthetic complementary chain by HB65RAHB65RA
/ HB65FA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R2c에 상보Complementary to region R2c of the synthetic complementary chain by HB65FA
HBF3HBV-M13mp18의 영역 F2c의 3'측에 인접하는 F3c에 상보Complementary to F3c adjacent to 3 'side of region F2c of HBF3HBV-M13mp18
HBR3HB65FA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R2c의 3'측에 인접하는 R3c에 상보Complementary to R3c adjacent to 3 'side of region R2c of the synthetic complementary chain by HBR3HB65FA
이러한 프라이머에 의해, HBV 유전자의 부분서열을 삽입한 M13mp18(HBV-M13mp18)의 영역 F1c에서 R1c에 이르는 영역과 그의 상보적인 염기서열이, F2c를 포함하는 루프 형성서열을 통하여 단일가닥 사슬 상에서 번갈아 연결된 핵산이 합성된다. 상기 프라이머를 사용하는 것 이외에는 실시예 1과 동일한 조건으로 반응시켜, 그 반응액을 아가로우즈 전기영동에 의해 분석했다. 결과는 도 12에 나타내는 바와 같다. 각 레인은 다음의 샘플에 대응하고 있다.By such primers, regions F1c to R1c and their complementary sequences of M13mp18 (HBV-M13mp18) in which partial sequences of the HBV gene were inserted are alternately connected on a single stranded chain through a loop formation sequence including F2c. Nucleic acid is synthesized. The reaction solution was reacted under the same conditions as in Example 1 except for using the primers, and the reaction solution was analyzed by agarose electrophoresis. The results are as shown in FIG. Each lane corresponds to the following sample.
1. XIV size marker1.XIV size marker
2. 1 fmol HBV-M13mp18 dsDNA2. 1 fmol HBV-M13mp18 dsDNA
3. target 없음3. No target
실시예 1과 동일하게, target이 존재할 때에만, 저사이즈의 밴드의 래더와 고사이즈에서의 스메어한 염색 및 겔 내에서 거의 영동되어 있지 않는 밴드로서 생성물이 확인되었다(레인 2). 저사이즈의 밴드 중, 310 bp 및 480 bp 부근의 밴드는 각각, 본 반응에 의해 예상되는 산물인, 서열번호: 17 및 서열번호: 18의 이중가닥 사슬과 사이즈가 일치하기 때문에, 반응이 예상되는 대로 진행하고 있는 것이 확인되었다. 고사이즈의 스메어한 패턴 및 영동되어 있지 않은 밴드는, 실시예 1의 결과에서 기술한 바와 같이, 본 발명에 특징적인 합성 생성물의 구조가 원인이 되어 있는 것으로 추정되었다. 이 실험에 의해, 증폭하는 서열(target)이 다르더라도 본발명을 실시 가능한 것이 확인되었다.Similarly to Example 1, only when the target was present, the product was identified as a ladder of low-sized bands and smeared stains at high sizes and bands that were hardly run in the gel (lane 2). Among the low-sized bands, bands near 310 bp and 480 bp, respectively, match the size of the double-stranded chains of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, which are expected products of the present reaction, so that a reaction is expected. It was confirmed that it is going as it is. The large sized smeared pattern and the unmoved band were presumed to be caused by the structure of the synthetic product characteristic of the present invention, as described in the results of Example 1. This experiment confirmed that the present invention can be carried out even if the targets to be amplified are different.
실시예 5 합성반응 생성물 사이즈의 확인Example 5 Identification of Synthesis Reaction Product Size
본 발명을 토대로 하여 합성된 핵산의 구조를 확인하기 위해, 그 길이를 알칼리 변성 조건하에서의 전기영동에 의해 분석했다. 실시예 1과 실시예 4의 타겟 존재하에서의 반응액의 5 μL에, 각각 1 μL의 alkaline loading buffer를 첨가하여, 0.7% 아가로우즈 겔(50 mM NaOH, 1 mM EDTA)을 사용하여, 14시간, 50 mA로 전기영동했다. 분자 사이즈 마커로서, 람다 파지의 HindIII 소화단편을 사용했다. 영동후의 겔을 1 M Tris pH 8로 중화후, SYBR Green I(Molecular Probes, Inc.)로 염색하여 핵산을 확인했다. 결과는 도 13에 나타낸다. 각 레인은 아래의 샘플에 대응하고 있다.In order to confirm the structure of the synthesized nucleic acid based on the present invention, the length was analyzed by electrophoresis under alkaline denaturation conditions. To 5 μL of the reaction solution in the presence of the targets of Examples 1 and 4, 1 μL of alkaline loading buffer was added, respectively, using a 0.7% agarose gel (50 mM NaOH, 1 mM EDTA) for 14 hours. , Electrophoresis at 50 mA. As molecular size markers, lambda phage HindIII digestive fragments were used. After gelation, the gel was neutralized with 1 M Tris pH 8 and stained with SYBR Green I (Molecular Probes, Inc.) to confirm the nucleic acid. The results are shown in FIG. Each lane corresponds to the following sample.
1. 람다 파지의 HindIII 소화단편1. HindIII digestive fragment of lambda phage
2. 실시예 1의 반응생성물2. Reaction product of Example 1
3. 실시예 4의 반응생성물3. Reaction product of Example 4
반응생성물을 알칼리 변성조건으로 영동하면 단일가닥 사슬 상태에서의 사이즈확인이 가능하다. 실시예 1(레인 2), 실시예 4(레인 3) 모두 주된 생성물은 2 kbase 내인 것이 확인되었다. 또한, 본 발명에 의한 생성물은 이 분석에 의해 확인할 수 있는 범위에서 적어도 6 kbase 이상으로까지 신장되어 있는 것이 판명되었다. 더하여, 실시예 1이나 실시예 4의 미변성 조건하에서 영동되지 않은 밴드는, 변성상태에서는 개개의 단일가닥 사슬로 분리되어 사이즈가 작아지는 것이 새롭게확인되었다.When the reaction product is run under alkaline denaturation conditions, it is possible to check the size in a single-stranded chain state. In Example 1 (lane 2) and Example 4 (lane 3), it was confirmed that the main product is in 2 kbase. In addition, the product according to the present invention was found to extend to at least 6 kbase or more in the range that can be confirmed by this analysis. In addition, it was newly confirmed that the bands which were not run under the undenatured conditions of Example 1 and Example 4 were separated into individual single-stranded chains in a denatured state, and were reduced in size.
실시예 6 M-13mp13내 영역의 증폭에 있어서의 타겟 농도 의존적 증폭의 확인Example 6 Confirmation of Target Concentration-dependent Amplification in Amplification of the Region in M-13mp13
본 발명에 의한 핵산의 합성방법에 미치는, 타겟의 농도변화의 영향을 관찰했다. 타겟인 M13mp18 dsDNA를 0~1 fmol로 하고, 반응시간을 1시간 및 3시간으로 한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 조건으로 본 발명에 의한 핵산의 합성방법을 실시했다. 실시예 1과 동일하게, 2% 아가로우즈 겔(0.5% TBE)로 전기영동하여, SYBR Green I(Molecular Probes, Inc.)염색에 의해 핵산을 확인했다. 분자 사이즈 마커로서, XIV(100 bp ladder, Boehringer Mannheim)를 사용했다. 결과는 도 14(위: 반응시간 1시간, 아래: 반응시간 3시간)에 나타냈다. 각 레인은, 다음의 샘플에 대응한다.The effect of the concentration change of the target on the method for synthesizing the nucleic acid according to the present invention was observed. The nucleic acid synthesis method according to the present invention was carried out under the same conditions as in Example 1 except that the target M13mp18 dsDNA was 0 to 1 fmol and the reaction time was 1 hour and 3 hours. In the same manner as in Example 1, by electrophoresis on 2% agarose gel (0.5% TBE), the nucleic acid was confirmed by SYBR Green I (Molecular Probes, Inc.) staining. As the molecular size marker, XIV (100 bp ladder, Boehringer Mannheim) was used. The results are shown in FIG. 14 (top: reaction time 1 hour, bottom: reaction time 3 hours). Each lane corresponds to the following sample.
1 : M13mp18 dsDNA 1×10-15mol/tube1: M13mp18 dsDNA 1 × 10 -15 mol / tube
2 : M13mp18 dsDNA 1×10-16mol/tube2: M13mp18 dsDNA 1 × 10 -16 mol / tube
3 : M13mp18 dsDNA 1×10-17mol/tube3: M13mp18 dsDNA 1 × 10 -17 mol / tube
4 : M13mp18 dsDNA 1×10-18mol/tube4: M13mp18 dsDNA 1 × 10 -18 mol / tube
5 : M13mp18 dsDNA 1×10-19mol/tube5: M13mp18 dsDNA 1 × 10 -19 mol / tube
6 : M13mp18 dsDNA 1×10-20mol/tube6: M13mp18 dsDNA 1 × 10 -20 mol / tube
7 : M13mp18 dsDNA 1×10-21mol/tube7: M13mp18 dsDNA 1 × 10 -21 mol / tube
8 : M13mp18 dsDNA 1×10-22mol/tube8: M13mp18 dsDNA 1 × 10 -22 mol / tube
9 : target 없음9: no target
10 : XIV size marker10: XIV size marker
영동후의 하부에 보이는 각 레인에 공통의 밴드는 미반응 프라이머가 염색된 것이다. 반응시간에 상관 없이, 타겟이 존재하지 않을 때에는 전혀 증폭산물은 관찰되지 않는다. 타겟 존재하에서만, 타겟의 농도 의존적으로 증폭산물의 염색 패턴이 얻어졌다. 또한, 반응시간을 길게 함으로써, 보다 저농도까지 증폭산물을 확인할 수 있었다.The bands common to each lane seen after the run were stained with unreacted primers. Regardless of the reaction time, no amplification products were observed at all when no target was present. Only in the presence of the target, a staining pattern of the amplified product was obtained, depending on the concentration of the target. In addition, by lengthening the reaction time, it was possible to confirm the amplified product to a lower concentration.
실시예 7 점변이(point mutation)의 검출Example 7 Detection of Point Mutations
(1) M13mp18FM(변이형)의 제작(1) Preparation of M13mp18FM (variant type)
타겟 DNA로서, M13mp18(야생형) 및 M13mp18FM(변이형)을 사용했다. 변이형인 M13mp18FM의 제작은, LA PCR™ in vitro Mutagenesis Kit(다까라주조)를 사용하여, 1염기 치환을 도입했다. 그 후, 시퀀싱에 의해 서열을 확인했다. F1 영역에서의 서열을 아래에 나타낸다.As target DNA, M13mp18 (wild type) and M13mp18FM (variant type) were used. The production of the mutant M13mp18FM introduced monobasic substitution using LA PCR ™ in vitro Mutagenesis Kit. Then, the sequence was confirmed by sequencing. The sequence in the F1 region is shown below.
야생형 : CCGGGGATCCTCTAGAGTCG(서열번호: 19)Wild type: CCGGGGATCCTCTAGAGTCG (SEQ ID NO .: 19)
변이형 : CCGGGGATCCTCTAGAGTCA(서열번호 :20)Variant: CCGGGGATCCTCTAGAGTCA (SEQ ID NO: 20)
(2) 프라이머의 디자인(2) design of primer
사용하는 프라이머는, FA 프라이머의 F1c 영역의 5'말단에 야생형, 변이형에서 서열이 다른 염기가 되도록 했다. 변이의 위치 및 표적염기서열(target)에 대한 각 영역의 위치관계를 도 15에 나타낸다.The primer to be used was made to have a base different in sequence from the wild type and the mutant type at the 5 'end of the F1c region of the FA primer. The positional relationship of each region with respect to the position of the variation and the target base sequence is shown in FIG. 15.
(3) 증폭반응(3) amplification reaction
M13mp18(야생형) 및 M13mp18FM(변이형)을 주형으로 하여, 아래에 나타내는 각각에 특이적인 프라이머의 조합으로 주형 특이적인 증폭반응이 일어나는지의 여부의 실험을 행했다.Using M13mp18 (wild type) and M13mp18FM (variant) as templates, experiments were conducted to determine whether a template-specific amplification reaction occurred with a combination of primers specific for each of the following.
야생형 증폭용 프라이머 세트 : FAd4, RAd4, F3, R3Primer set for wild type amplification: FAd4, RAd4, F3, R3
변이형 증폭용 프라이머 세트 : FAMd4, RAd4, F3, R3Primer set for variant amplification: FAMd4, RAd4, F3, R3
각 프라이머의 염기서열은 아래와 같다.The base sequence of each primer is as follows.
FAd4 : CGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT(서열번호: 21)FAd4: CGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT (SEQ ID NO: 21)
FAMd4 : TGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT(서열번호: 22)FAMd4: TGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT (SEQ ID NO: 22)
RAd4 : CGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC(서열번호: 23)RAd4: CGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC (SEQ ID NO: 23)
F3 : ACTTTATGCTTCCGGCTCGTA(서열번호: 24)F3: ACTTTATGCTTCCGGCTCGTA (SEQ ID NO .: 24)
R3 : GTTGGGAAGGGCGATCG(서열번호: 25)R3: GTTGGGAAGGGCGATCG (SEQ ID NO: 25)
(4) M13mp18의 점돌연변이의 검출(4) Detection of point mutations in M13mp18
반응액의 조성은 아래와 같다.The composition of the reaction solution is as follows.
상기 반응액에 타겟 M13mp18, 또는 M13mp18FM 1 fmol(2 ㎕)를 첨가하고, 95℃에서 5분간 가열하여, 타겟을 변성시켜 단일가닥 사슬로 했다. 반응액을 빙수로 옮겨, Bst DNA 폴리머라아제(NEW ENGLAND BioLabs)를 1 μL(8U) 첨가하여, 68℃ 또는 68.5℃에서 1시간 반응시켰다. 반응후, 80℃ 10분간에서 반응을 정지하여 다시 빙수로 옮겼다.1 fmol (2 µl) of target M13mp18 or M13mp18FM was added to the reaction solution, and heated at 95 ° C for 5 minutes to denature the target to form a single stranded chain. The reaction solution was transferred to ice water, and 1 µL (8 U) of Bst DNA polymerase (NEW ENGLAND BioLabs) was added, followed by reaction at 68 ° C or 68.5 ° C for 1 hour. After the reaction, the reaction was stopped at 80 ° C. for 10 minutes and transferred again to ice water.
도 16에서 나타내는 바와 같이, FA 프라이머로서 야생형용 FAd4를 사용했을 때는, 야생형 주형 존재만 효과적으로 증폭이 관찰되었다. 한편, FA 프라이머로서변이형용 FAMd4를 사용했을 때는, 야생형 주형 존재만 효과적으로 증폭이 관찰되었다.As shown in Fig. 16, when wild type FAd4 was used as the FA primer, amplification was effectively observed only in the presence of the wild type template. On the other hand, when mutant FAMd4 was used as the FA primer, amplification was effectively observed only in the presence of the wild type template.
이상의 결과로부터, 본 발명의 증폭반응을 이용함으로써, 점변이를 효율적으로 검출할 수 있는 것이 나타내어졌다.From the above results, it was shown that the point mutation can be efficiently detected by using the amplification reaction of the present invention.
실시예 8 mRNA를 타겟으로 한 증폭반응Example 8 Amplification Reaction Targeting mRNA
타겟이 되는 핵산을 mRNA로서, 본 발명에 의한 핵산의 합성방법을 시도했다. 타겟이 되는 mRNA는, 전립선 특이항원(Prostate specific antigen; PSA)을 발현한 세포인 전립선암 세포주 LNCaP cell(ATCC No. CRL-1740)과, 비발현세포인 만성 골수성 백혈병 세포주 K562 cell(ATCC No. CCL-243)을, 1:106~100:106으로 혼합하여, Qiagen사(독일)의 RNeasy Mini kit를 사용하여 전 RNA를 추출했다. 실험에 사용한 프라이머는, PSAFA, PSARA, PSAF3 그리고 PSAR3의 4종류이다. PSAF3과 PSAR3은, 각각 PSAFA와 PSARA를 합성기점으로 하여 얻어지는 제1 핵산을 치환하기 위한 아웃터 프라이머이다. 또한, PSAFA(또는 PSARA)의 어닐링이 우선적으로 일어나도록 이들 프라이머 농도를 높게 설정했다. 각 프라이머를 구성하는 염기서열은 아래와 같다.A nucleic acid synthesis method according to the present invention was attempted as a target nucleic acid as mRNA. The target mRNA is a prostate cancer cell line LNCaP cell (ATCC No. CRL-1740), a cell expressing prostate specific antigen (PSA), and a chronic myeloid leukemia cell line K562 cell (ATCC No. CCL-243) was mixed at 1:10 6 to 100: 10 6 , and total RNA was extracted using RNeasy Mini kit from Qiagen (Germany). The primers used for the experiment are four types, PSAFA, PSARA, PSAF3, and PSAR3. PSAF3 and PSAR3 are outer primers for substituting the first nucleic acid obtained using PSAFA and PSARA as a synthetic starting point, respectively. In addition, these primer concentrations were set high so that annealing of PSAFA (or PSARA) would occur preferentially. The base sequences constituting each primer are as follows.
프라이머 :primer :
PSAFA: TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG(서열번호: 26)PSAFA: TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG (SEQ ID NO .: 26)
PSARA: TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG(서열번호: 27)PSARA: TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG (SEQ ID NO: 27)
PSAF3: TGCTTGTGGCCTCTCGTG(서열번호: 28)PSAF3: TGCTTGTGGCCTCTCGTG (SEQ ID NO: 28)
PSAR3: GGGTGTGGGAAGCTGTG(서열번호: 29)PSAR3: GGGTGTGGGAAGCTGTG (SEQ ID NO .: 29)
프라이머의 구조적인 특징을 아래에 정리했다. 또한, 표적의 mRNA를 코드하는 DNA 염기서열에 대한 각 프라이머의 위치관계 및 제한효소 Sau3AI의 인식부위를 도 17에 나타냈다.The structural features of the primers are summarized below. In addition, the positional relationship of each primer with respect to the DNA sequence encoding the target mRNA and the recognition site of restriction enzyme Sau3AI are shown in FIG. 17.
프라이머5'측의 영역 /3'측의 영역Area on primer 5 'side / 3' area
PSAFAPSAFA에 의한 합성 상보사슬의 영역 F1c와 동일Same as region F1c of the synthetic complementary chain by PSAFAPSAFA
/ 표적염기서열의 영역 F2c에 상보/ Complementary to region F2c of the target base sequence
PSARAPSARA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R1c와 동일Same as the region R1c of the synthetic complementary chain by PSARAPSARA
/ PSAFA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R2c에 상보/ Complementary to region R2c of the synthetic complementary chain by PSAFA
PSAF3표적염기서열의 영역 F2c의 3'측에 인접하는 F3c에 상보Complementary to F3c adjacent to 3 'side of region F2c of PSAF3 target nucleotide sequence
PSAR3PSAFA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R2c의 3'측에 인접하는 R3c에 상보Complementary to R3c adjacent to 3 'side of region R2c of the synthetic complementary chain by PSAR3PSAFA
본 발명에 의한 핵산의 합성방법을 위한 반응액조성을 아래에 나타낸다.The reaction solution composition for the method for synthesizing the nucleic acid according to the present invention is shown below.
반응액조성(25 μL 중)Composition of reaction solution (in 25 μL)
20 mM Tris-HCl pH8.820 mM Tris-HCl pH8.8
4 mM MgSO4 4 mM MgSO 4
0.4mM dNTPs0.4mM dNTPs
10 mM KCl10 mM KCl
10 mM (NH4)2SO4 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4
0.1% Triton X-1000.1% Triton X-100
0.8 M betaine0.8 M betaine
5 mM DTT5 mM DTT
1600 nM PSAFA & PSARA 프라이머1600 nM PSAFA & PSARA Primer
200 nM PSAF3 & PSAR3 프라이머200 nM PSAF3 & PSAR3 Primer
8U Bst DNA 폴리머라아제8U Bst DNA Polymerase
100U ReverTra Ace(TOYOBO, 일본)100U ReverTra Ace (TOYOBO, Japan)
5 ㎍ 전 RNA5 μg pre RNA
모든 성분은 빙상에서 혼합했다. 본 실험에 있어서는 mRNA(단일가닥 사슬)를 target으로 하고 있기 때문에, 가열변성에 의해 단일가닥 사슬로 하는 공정은 불필요하다. 반응은, 65℃에서 45분간 행하고, 85℃에서 5분간, 반응을 정지시켰다. 반응종료후, 5 μL의 반응액을 2% 아가로우즈를 사용하여 전기영동하여, SYBR Green I로 검출했다.All ingredients were mixed on ice. In this experiment, since a target is mRNA (single stranded chain), the process of forming a single stranded chain by heat denaturation is unnecessary. Reaction was performed at 65 degreeC for 45 minutes, and reaction was stopped at 85 degreeC for 5 minutes. After completion of the reaction, 5 μL of the reaction solution was electrophoresed using 2% agarose and detected by SYBR Green I.
결과를 도 18에 나타낸다. 각 레인은, 아래의 샘플에 대응하고 있다.The results are shown in FIG. Each lane corresponds to the following sample.
레인 BstRTLNCaP 세포수/106개의 K562Lane BstRTLNCaP cell count / 10 6 K562
1-+01- + 0
2-+102- + 10
3+-03 + -0
4+-104 + -10
5++05 ++ 0
6++16 ++ 1
7++107 ++ 10
8레인 6의 반응액 1 μL분을 Sau3AI로 소화한 것Digested 1 μL of the reaction solution of 8 lane 6 into Sau3AI.
9레인 7의 반응액 1 μL분을 Sau3AI로 소화한 것Digested 1 μL of the reaction solution of 9 lane 7 into Sau3AI
10사이즈 마커 100 bp 래더(New England Biolabs)10 size marker 100 bp ladder (New England Biolabs)
Bst DNA 폴리머라아제, ReverTra Ace의 어느 한쪽이 없으면, 증폭산물이 얻어지지 않았다(레인 1~4). 양쪽 효소 존재하에서는, LNCaP 유래의 RNA가 존재하면, 증폭산물이 검출되었다(레인 5~7). 100만개의 K562 세포에 1개의 LNCaP로부터의 추출 RNA로도 검출 가능했다(레인 6). 증폭산물은, 타겟 내부의 서열에 있는 제한효소부위 Sau3AI로 소화한 바, 예상되는 크기의 단편으로 소화되었다(레인 8, 9).Without either Bst DNA polymerase or ReverTra Ace, amplification products were not obtained (lanes 1-4). In the presence of both enzymes, amplification products were detected in the presence of LNCaP-derived RNA (lanes 5 to 7). One million K562 cells were also detectable with extracted RNA from one LNCaP (lane 6). The amplified product was digested into fragments of expected size when digested with the restriction enzyme site Sau3AI in the sequence inside the target (lanes 8 and 9).
이상의 결과로부터, 본 발명에 의한 핵산의 합성방법에 있어서, 타겟으로서 RNA를 사용한 경우에도, 목적의 반응산물이 얻어지는 것이 확인되었다.From the above results, it was confirmed that the target reaction product was obtained even when RNA was used as a target in the method for synthesizing the nucleic acid according to the present invention.
산업상이용가능성Industrial availability
본 발명에 의한 신규한 올리고뉴클레오티드와 그것을 사용한 핵산의 합성방법에 의해 복잡한 온도제어가 불필요한 단일가닥 사슬 상에 번갈아 상보적인 염기서열이 연결된 핵산의 합성방법에 제공된다. 본 발명을 토대로 하는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 합성되는 상보사슬은, 항상 그 3'말단이 자신을 주형으로 하는 새로운 상보사슬 합성의 합성기점이 된다. 이 때, 새로운 프라이머의 어닐링을 초래하는 루프의 형성을 동반하여, 이 부분으로부터의 상보사슬 합성에 의해 먼저 합성된 자신을 주형으로 하는 상보사슬 합성반응의 생성물은 다시 치환되어 염기쌍 결합이 가능한 상태가 된다. 이와 같이하여 얻을 수 있는 자신을 주형으로 하여 합성된 핵산은, 예를 들면 SDA와 같은 공지의 핵산 합성방법과 조합하여, 그들의 핵산합성의 효율향상에 공헌한다.A novel oligonucleotide and a method for synthesizing a nucleic acid using the same according to the present invention are provided for a method for synthesizing nucleic acids in which complementary base sequences are alternately connected on a single-stranded chain without complicated temperature control. Complementary chains synthesized using oligonucleotides based on the present invention as primers are always the starting point for synthesizing new complementary chains whose 3 'end is used as a template. At this time, the formation of a loop that causes annealing of a new primer, and the product of the complementary chain synthesis reaction, which is first synthesized by the complementary chain synthesis from this part, is replaced again, thus making it possible to bond base pairs. do. The nucleic acid synthesized using the self as a template thus obtained contributes to the improvement of their nucleic acid synthesis efficiency in combination with, for example, a known nucleic acid synthesis method such as SDA.
더욱이 본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 단순히 공지의 핵산 합성방법의 효율향상을 달성할 뿐 아니라, 복잡한 온도제어를 필요로 하지 않고, 또한 고도의 증폭효율을 기대할 수 있으며, 더 나아가서는 높은 특이성을 달성할 수 있는 신규한 핵산의 합성방법이 제공된다. 즉, 본 발명을 토대로 하는 올리고뉴클레오티드를 주형사슬과 그 상보사슬에 대해 적용함으로써, 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산이 연속하여 합성되어진다. 이 반응은, 원리적으로는 합성에 필요한 출발재료가 고갈될 때까지 계속되고, 그 사이에 루프부분으로부터 합성을 개시한 새로운 핵산을 계속해서 생성한다. 이렇게 하여, 루프에 어닐링한 올리고뉴클레오티드로부터의 신장이, 긴 단일가닥 사슬 핵산(즉, 복수쌍의 상보적인 염기서열이 연결된 것)의 신장을 위한 3'-OH를 공급하는 사슬 치환을 행한다. 한편, 긴 단일가닥 사슬의 3'-OH는 자신을 주형으로 하는 상보사슬 합성반응을 행함으로써 자신의 신장을 달성하는 동시에, 루프로부터 합성개시한 새로운 상보사슬의 치환을 행한다. 이러한 증폭반응공정이, 높은 특이성을 유지하면서 등온 조건하에서 진행한다.Furthermore, according to the preferred aspect of the present invention, not only can achieve the efficiency improvement of the known nucleic acid synthesis method, but also does not require complicated temperature control, and can also expect a high amplification efficiency, furthermore, high specificity A novel method for synthesizing nucleic acids is provided. In other words, by applying the oligonucleotide based on the present invention to the template chain and its complementary chain, nucleic acids in which complementary nucleotide sequences are alternately linked on a single-stranded chain are continuously synthesized. This reaction, in principle, continues until the starting material required for synthesis is depleted, in the meantime continuing to produce new nucleic acid that has begun synthesis from the loop portion. In this way, the elongation from the oligonucleotides annealed in the loop performs chain substitution to supply 3'-OH for elongation of long single-stranded chain nucleic acids (i.e., plural pairs of complementary sequences linked). On the other hand, 3'-OH of a long single-stranded chain achieves elongation by performing a complementary chain synthesis reaction using itself as a template, and replaces a new complementary chain synthesized from the loop. This amplification reaction proceeds under isothermal conditions while maintaining high specificity.
본 발명에 있어서의 올리고뉴클레오티드는, 2개의 연속된 영역이 설계와 같이 배치되어 있을 때 비로소 본 발명에 의한 핵산 합성반응을 위한 프라이머로서 기능한다. 이것이, 특이성 유지에 크게 공헌한다. 예를 들면 PCR에서는, 2개의 프라이머가 의도한 위치관계와는 관계 없이, 비특이적인 미스어닐링 (missannealing)에 의해, 비특이적 증폭반응이 개시되어 버리는 것과 비교하면, 본 발명에서는 높은 특이성을 기대할 수 있는 것은 용이하게 설명할 수 있다. 이 특징을 이용하여 SNPs를 높은 감도로 정확하게 검출할 수 있다.The oligonucleotide in the present invention functions as a primer for the nucleic acid synthesis reaction according to the present invention when two contiguous regions are arranged as designed. This greatly contributes to maintaining specificity. For example, in PCR, high specificity can be expected in the present invention as compared with the initiation of a nonspecific amplification reaction by nonspecific missannealing regardless of the intended positional relationship of the two primers. It can be easily explained. This feature can be used to accurately detect SNPs with high sensitivity.
본 발명의 특징은, 이러한 반응이 극히 단순한 시약구성으로 용이하게 달성할 수 있는 것에 있다. 예를 들면 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드는, 특수한 구조를 갖는다고는 해도 그것은 염기서열의 선택의 문제로서, 물질로서는 단순한 올리고뉴클레오티드이다. 또한, 바람직한 태양에 있어서는, 사슬 치환형 상보사슬 합성반응을 촉매하는 DNA 폴리머라아제 만으로 반응을 진행시킬 수 있다. 더욱이, RNA를 주형으로 하여 본 발명을 실시하는 경우에는, Bca DNA 폴리머라아제와 같은 역전사 효소활성과 사슬 치환형 DNA 폴리머라아제 활성을 함께 갖는 DNA 폴리머라아제를 이용함으로써, 모든 효소반응을 단일 효소에 의해 행할 수 있다. 이러한 심플한 효소반응으로 고도의 핵산의 증폭반응을 실현하는 반응원리는 지금까지 알려져 있지 않다. 또한, SDA 등의 공지의 핵산 합성반응에 적용한다고 해도, 본 발명과의 조합에 의해 새로운 효소를 필요로 하지 않고, 단순히 본 발명을 토대로 하는 올리고뉴클레오티드를 조합하는 것 만으로 각종 반응계로의 적응이 가능하다. 따라서, 본 발명에 의한 핵산 합성방법은, 비용면에 있어서도 유리하다고 할 수 있다.A feature of the present invention is that such a reaction can be easily achieved with an extremely simple reagent configuration. For example, although the oligonucleotide according to the present invention has a special structure, it is a matter of selection of a nucleotide sequence, and is a simple oligonucleotide as a substance. Moreover, in a preferable aspect, reaction can be advanced only with DNA polymerase which catalyzes a chain substitution type complementary chain synthesis reaction. Furthermore, in carrying out the present invention using RNA as a template, all enzymatic reactions can be carried out by using a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity such as Bca DNA polymerase and a chain substituted DNA polymerase activity. It can be performed by an enzyme. The reaction principle of realizing amplification reaction of high nucleic acid by such a simple enzyme reaction is not known until now. Moreover, even if it is applied to well-known nucleic acid synthesis reactions, such as SDA, it does not need a new enzyme by the combination with this invention, and can adapt to various reaction systems only by combining oligonucleotide based on this invention. Do. Therefore, the nucleic acid synthesis method according to the present invention can be said to be advantageous also in terms of cost.
이상 기술한 바와 같이, 본 발명의 핵산의 합성방법과 그를 위한 올리고뉴클레오티드는, 조작성(온도제어 불필요), 합성효율의 향상, 경제성, 그리고 높은 특이성이라고 하는, 복수의 곤란한 과제를 동시에 해결하는 새로운 원리를 제공한다.As described above, the method for synthesizing the nucleic acid of the present invention and the oligonucleotide therefor are a new principle that simultaneously solves a plurality of difficult problems such as operability (no temperature control), improvement of synthesis efficiency, economical efficiency, and high specificity. To provide.
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