KR20020059645A - Nucleic acids of the human abc1 gene and their therapeutic and diagnostic application - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아테롬성동맥경화증과 같은 콜레스테롤 대사 기능장애 유도 질환, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤 역수송의 붕괴, 및 좀더 구체적으로는 탠지어병과 같은 가족성 HDL 결핍(FHD)과 연관된 병리의 원인 유전자인 ABC1 유전자의 다양한 엑손과 인트론에 상응하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 신규한 완전 길이 ABC1 단백질을 암호화하는 ABC1 cDNA에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 일반적으로 ABC1 유전자에서 또는 ABC1 유전자의 대립유전자형에 의해 생성된 상응하는 단백질에서의 다형성, 특히 돌연변이의 검출수단에 관한 것이다.The present invention relates to the ABC1 gene, which is the cause of cholesterol metabolic dysfunction disorders such as atherosclerosis, more specifically the breakdown of cholesterol reverse transport, and more specifically pathologies associated with familial HDL deficiency (FHD), such as Tangier disease. It relates to nucleic acids corresponding to various exons and introns. The present invention also relates to ABC1 cDNA encoding the novel full length ABC1 protein. The invention also relates generally to means for detecting polymorphisms, in particular mutations, in the ABC1 gene or in the corresponding protein produced by the allele of the ABC1 gene.

Description

인간 에이비씨1 유전자의 핵산과 이의 치료적 및 진단적 적용{NUCLEIC ACIDS OF THE HUMAN ABC1 GENE AND THEIR THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC APPLICATION}Nucleic Acids of Human ABC1 Genes and Their Therapeutic and Diagnostic Applications TECHNICAL ACIDS OF THE HUMAN ABC1 GENE AND THEIR THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC APPLICATION

지질은 에너지의 저장, 수송과 대사, 및 막 구조와 유동성을 포함한 다양한 생물학적 기능의 필수 성분인 수-불용성 유기 생체분자이다. 지질은 인간과 타 동물에서 두 공급원으로부터 유래된다: 일부 지질은 식이지방과 오일로서 섭취되고 다른 지질은 인간이나 동물에 의해 생합성된다. 포유동물에서 체중의 적어도 10%는 지질이고, 이중 대부분은 트리아실글리세롤 형태로 있다.Lipids are water-insoluble organic biomolecules that are essential components of various biological functions, including energy storage, transport and metabolism, and membrane structure and fluidity. Lipids are derived from two sources in humans and other animals: some lipids are consumed as dietary fats and oils and others are biosynthesized by humans or animals. In mammals at least 10% of body weight is lipids, most of which are in the form of triacylglycerols.

트리글리세라이드 및 트리아실글리세라이드로 알려져 있는 트리아실글리세롤은 글리세롤과 에스테르화된 세 개의 지방산으로 구성된다. 식이성 트리아실글리세롤은 에너지원으로서 지방 조직으로 저장되거나, 트리아실글리세롤 리파제에 의해 소화관에서 가수분해되며 이 중에서 가장 중요한 것은 췌장 리파제이다. 트리아실글리세롤은 지방단백질 형태로 조직 사이로 수송된다.Triacylglycerols, also known as triglycerides and triacylglycerides, consist of glycerol and three fatty acids esterified. Dietary triacylglycerols are stored as adipose tissue as an energy source or hydrolyzed in the digestive tract by triacylglycerol lipases, the most important of which is pancreatic lipase. Triacylglycerols are transported between tissues in the form of lipoproteins.

지방단백질은 혈장에서 발견되는 미셀형 조립체이며 지질과 단백질(아포단백질로 불림)의 상이한 유형의 다양한 비율을 함유한다. 혈장 지방단백질에는 5 가지의 주된 부류가 있는데, 이의 주기능은 지질 수송이다. 이들 부류는 밀도 증가순으로 하여, 킬로마이크론, 극저밀도 지방단백질(VLDL), 중간-밀도 지방단백질(IDL), 저밀도 지방단백질(LDL), 및 고밀도 지방단백질(HDL)이다. 비록 지질의 주종이 각 지방단백질 부류와 결합된 채로 발견되지만, 각각의 부류는 주로 지질의 한 유형을 수송하며: 트리아실글리세롤은 킬로마이크론, VLDL, 및 IDL로 수송되는 반면에; 인지질과 콜레스테롤 에스테르는 각각 HDL과 LDL로 수송된다.Lipoproteins are micellar assemblies found in plasma and contain various proportions of different types of lipids and proteins (called apoproteins). There are five main classes of plasma lipoproteins, the main function of which is lipid transport. These classes are kilomicrons, ultra low density lipoproteins (VLDL), medium-density lipoproteins (IDL), low density lipoproteins (LDL), and high density lipoproteins (HDL), in increasing order of density. Although the dominant species of lipids are found associated with each lipoprotein class, each class mainly transports one type of lipid: while triacylglycerols are transported in kilomicrons, VLDL, and IDL; Phospholipids and cholesterol esters are transported to HDL and LDL, respectively.

인지질은 또한 포스페이트에 커플링된 극성 그룹을 함유하는 글리세롤 포스페이트의 이지방산 에스테르이다. 인지질은 포스포리파제로 불리는 효소에 의해 가수분해된다. 예시적인 인지질인 포스파티딜콜린은 대부분의 진핵세포 막의 주성분이다.Phospholipids are also difatty acid esters of glycerol phosphate containing polar groups coupled to phosphates. Phospholipids are hydrolyzed by an enzyme called phospholipase. Phosphatidylcholine, an exemplary phospholipid, is a major component of most eukaryotic membranes.

콜레스테롤은 스테로이드 호르몬과 담즙산의 대사 전구체 및 세포막의 필수 성분이다. 인간과 타 동물에서, 콜레스테롤은 음식으로 섭취되고 또한 간과 타 조직에 의해 합성된다. 콜레스테롤은 LDL과 타 지방단백질에서 콜레스테릴 에스테르의 형태로 조직 사이로 수송된다.Cholesterol is an essential component of cell membranes and metabolic precursors of steroid hormones and bile acids. In humans and other animals, cholesterol is consumed in food and also synthesized by the liver and other tissues. Cholesterol is transported between tissues in the form of cholesteryl esters in LDL and other lipoproteins.

막은 모든 생세포를 둘러싸고 있으며, 세포내 및 세포외 구획간의 장벽으로작용한다. 막은 또한 진핵세포의 핵을 동봉하고, 소포체를 구성하며, 액손을 둘러싸는 마이엘린초에서와 같이 특화된 기능을 담당한다. 전형적인 막은 약 40% 지질과 60% 단백질을 함유하지만, 상당히 변동적이다. 주된 지질 성분은 인지질, 구체적으로는 포스파티딜콜린과 포스파티딜에탄올아민, 및 콜레스테롤이다. 유동성과 같은 막의 이화학적 성질은 인지질의 지방산 프로필이나 콜레스테롤 함량의 변성에 의해 변화될 수 있다. 막 지질의 조성과 구성의 변조는 또한 수용체 활성, 엔도사이토시스, 및 콜레스테롤 플럭스와 같은 막-의존형 세포 기능을 변조시킨다.The membrane surrounds all living cells and acts as a barrier between intracellular and extracellular compartments. The membrane also encloses the nucleus of the eukaryotic cell, forms the endoplasmic reticulum, and plays a specialized function as in myelin sheath surrounding the axon. Typical membranes contain about 40% lipid and 60% protein, but are quite variable. Main lipid components are phospholipids, specifically phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine, and cholesterol. Physicochemical properties, such as fluidity, can be altered by alteration of the fatty acid profile or cholesterol content of phospholipids. Modulation of the composition and composition of membrane lipids also modulates membrane-dependent cellular functions such as receptor activity, endocytosis, and cholesterol flux.

고밀도 지방단백질(HDL)은 혈장에서 순환하는 지방단백질의 4종의 주된 부류 중 하나이다. 이들 지방단백질은 지질 수송, 담즙산의 형성, 스테로이드생성, 세포 증식과 같은 각종 대사경로에 관여하며, 아울러 혈장 프로테이나제 시스템을 방해한다.High density lipoprotein (HDL) is one of four major classes of lipoproteins circulating in plasma. These lipoproteins are involved in various metabolic pathways such as lipid transport, bile acid formation, steroid production, cell proliferation, and also interfere with the plasma proteinase system.

HDL은 완전한 무-콜레스테롤 수용체이고, 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질(CETP), 지방단백질 리파제(LPL), 간염 리파제(HL) 및 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT)와 함께, 콜레스테롤의 역수송, 즉 담즙산 형태로 신체로부터 제거를 위해 간으로 말초 세포내의 과잉 콜레스테롤을 수송하는 주된 역할을 담당한다. HDL은 말초 조직으로부터 간으로의 콜레스테롤 수송에서 중추적인 역할을 담당한다.HDL is a complete cholesterol-free receptor and, together with cholesterol ester transfer protein (CETP), lipoprotein lipase (LPL), hepatitis lipase (HL) and lecithin: cholesterol acyltransferase (LCAT), in the transport of cholesterol, ie bile acid form It plays a major role in transporting excess cholesterol in peripheral cells to the liver for removal from the body. HDL plays a pivotal role in the transport of cholesterol from peripheral tissues to the liver.

탠지어병 및/또는 FHD병, HDL 결핍, 및 LCAT 결핍을 포함하여, HDL 결핍과 연관된 각종 질환이 기술되었다. 또한, HDL 콜레스테롤 결핍은 말라리아 및 당뇨병 환자에서 관찰되었다(Kittl et al., 1992; Nilsson et al., 1990; Djoumessi,1989; Mohanty et al., 1992; Maurois et al., 1985; Grellier et al., 1997; Agbedana et al., 1990; Erel et al., 1998; Cuisinier et al., 1990; Chander et al., 1998; Efthimiou et al., 1992; Baptista et al., 1996; Davis et al., 1993; Davis et al, 1995; Pirich et al., 1993; Tomlinson and Raper, 1996; Hager and Hajduk, 1997, Kwiterovich, 1995, Syvanne et al., 1995a, Syvanne et al., 1995b, and French et al., 1993). 탠지어병 및/또는 FHD병에 수반된 결핍은 HDL의 분해를 일으키고 지방단백질 대사의 붕괴를 초래하는 세포 콜레스테롤의 전좌에 있어서 세포 결함과 연관되어 있다. 그럼에도 불구하고, 탠지어병 및/또는 FHD병의 경우에, 결함의 정확한 성질은 아직 정확하게 규정되지 않았다.Various diseases associated with HDL deficiency have been described, including Tangier disease and / or FHD disease, HDL deficiency, and LCAT deficiency. In addition, HDL cholesterol deficiency has been observed in malaria and diabetic patients (Kittl et al., 1992; Nilsson et al., 1990; Djoumessi, 1989; Mohanty et al., 1992; Maurois et al., 1985; Grellier et al. , 1997; Agbedana et al., 1990; Erel et al., 1998; Cuisinier et al., 1990; Chander et al., 1998; Efthimiou et al., 1992; Baptista et al., 1996; Davis et al., 1993; Davis et al, 1995; Pirich et al., 1993; Tomlinson and Raper, 1996; Hager and Hajduk, 1997, Kwiterovich, 1995, Syvanne et al., 1995a, Syvanne et al., 1995b, and French et al. , 1993). Deficiencies associated with tangerine disease and / or FHD disease are associated with cellular defects in the translocation of cellular cholesterol, leading to degradation of HDL and disruption of lipoprotein metabolism. Nevertheless, in the case of Tangier disease and / or FHD disease, the exact nature of the defect is not yet precisely defined.

탠지어병은 혈장으로부터 HDL-콜레스테롤(HDL-C)의 부재에 의한 동형접합 상태, 간비종, 말초 신경병, 및 빈번하게 때이른 관상동맥 질환(CAD)에 특징이 있는 상염색체 공동-우점 증상이다. 이형접합체에서, HDL-C 수준은 정상 개체의 약 절반이다. 대식구로부터 손상된 콜레스테롤 유출은 신체 전역에 걸쳐서 포말세포의 존재를 이끄는데, 이는 일부 탠지어병 가족에서 CAD의 증가된 위험을 설명해줄 수 있다.Tangier's disease is an autosomal co-dominant symptom characterized by homozygous conditions, hepatomegaly, peripheral neuropathy, and frequent premature coronary artery disease (CAD) due to the absence of HDL-cholesterol (HDL-C) from plasma . In heterozygotes, HDL-C levels are about half of normal individuals. Impaired cholesterol outflow from macrophages leads to the presence of foam cells throughout the body, which may explain the increased risk of CAD in some Tangier families.

탠지어병 환자에서, HDL 입자는 말초 세포로부터 콜레스테롤을 혼입하지 않으며, 정확하게 대사되지 않으며, 신체로부터 신속히 제거된다. 따라서, 이들 환자에서 혈장 HDL 농도는 극도로 감소되고 HDL은 더 이상 콜레스테롤의 간으로의 복귀를 보장하지 않는다. 콜레스테롤은 이들 말초 세포에 축적되고 오렌지색 편도선의 형성과 같은 특징적인 임상적 징후를 야기한다. 더군다나, 트리글리세라이드의 과잉생산 및 인지질의 증가된 합성 및 세포내 이화작용과 같은 다른 지방단백질 붕괴도 탠지어병 환자에서 관찰된다.In patients with Tangier disease, HDL particles do not incorporate cholesterol from peripheral cells, are not metabolized correctly, and are quickly removed from the body. Thus, plasma HDL concentrations are extremely reduced in these patients and HDL no longer guarantees the return of cholesterol to the liver. Cholesterol accumulates in these peripheral cells and causes characteristic clinical signs such as the formation of an orange tonsil. Furthermore, other lipoprotein breakdowns, such as overproduction of triglycerides and increased synthesis of phospholipids and intracellular catabolism, are also observed in patients with Tangier disease.

증후가 전술한 바와 같은 탠지어병은 관상동맥 질환에 걸린 환자에서 가장 통상적으로 검출되는 것이 HDL의 대사와 연관된 가족성 질환으로 분류된다. 다수의 연구는 HDL 콜레스테롤의 감소된 수준이 심혈관 질환이 발병하거나 이미 걸려있는 개체 위험의 탁월한 지표이다. 이러한 맥락에서, HDL 결핍과 연관된 증후는 이들이 아테로제네시스(atherogenesis)에서 HDL의 역할 이해를 증가시킬 수 있게 하기 때문에 관심이 증가되어 왔다.Tangier's disease, as described above, is classified as a family disease most commonly detected in patients with coronary artery disease associated with metabolism of HDL. Many studies have shown that reduced levels of HDL cholesterol are excellent indicators of individual risk of developing or already suffering from cardiovascular disease. In this context, there has been a growing interest as symptoms associated with HDL deficiency allow them to increase their understanding of the role of HDL in atheroogenesis.

아테롬성동맥경화증은 지질(지질 또는 섬유지질 플라크) 및 다른 혈액 유도체의 혈관벽, 특히 대형 동맥(대동맥, 관상동맥, 카로티드)내 침착에 의해 조직학적 용어로 정의된다. 아테롬성동맥경화 과정의 진행 정도에 따라 다소간 석회화되는 이들 플라크는 병변과 커플링될 수 있고 본질적으로 콜레스테롤 에스테르로 구성되는 지방 침착물의 혈관내 축적과 관련된다. 이들 플라크는 혈관벽의 비후화, 평활근의 비대, 포말세포(소집된 대식구에 의한 콜레스테롤의 통제되지 않은 흡수로부터 생기는 지질-적재 세포)의 출현 및 섬유 조직의 축적을 수반한다. 죽종성 플라크는 벽으로부터 현저히 돌출하여, 대부분 병에 걸린 환자에서 일어나는, 죽종증, 혈전증 또는 색전증에 의한 혈관 교합의 원인이 되는 협착 형질을 부여한다. 이들 병변은 경색, 돌연사, 심부전, 및 발작과 같은 중증의 심혈관 병리를 초래할 수 있다.Atherosclerosis is defined in histological terms by deposition in the blood vessel walls of lipids (lipid or fibrolipid plaques) and other blood derivatives, in particular large arteries (aorta, coronary artery, carotened). Depending on the progress of the atherosclerotic process, these plaques, which are somewhat calcified, can be coupled to the lesion and are associated with the vascular accumulation of fatty deposits, which are essentially composed of cholesterol esters. These plaques involve thickening of the blood vessel wall, enlargement of smooth muscle, the appearance of foam cells (lipid-loaded cells resulting from uncontrolled uptake of cholesterol by the assembled macrophages) and accumulation of fibrous tissue. Atheromatous plaques prominently protrude from the wall, imparting a narrowing trait that causes vascular occlusion by atherosclerosis, thrombosis or embolism, which occurs in most diseased patients. These lesions can lead to severe cardiovascular pathologies such as infarction, sudden death, heart failure, and seizures.

지방단백질 대사에서 소정의 역할을 하는 유전자에서의 돌연변이가 동정되었다. 구체적으로 말해서, 아포지방단백질 apo A-I에서의 수종의 돌연변이가 특징규명되었다. 이러한 돌연변이는 희귀하며 apo A-I의 생산 부족을 초래할 수 있다. LPL 또는 이의 활성자 apo C-II를 암호화하는 유전자에서의 돌연변이는 심각한 고트리글리세라이드혈증과 연관되어 있으며 HDL-C 수준을 상당히 감소시켰다. 효소 LCAT를 암호화하는 유전자에서의 돌연변이도 심각한 HDL 결핍과 연관되어 있다.Mutations in genes that play a role in lipoprotein metabolism have been identified. Specifically, several mutations in the apo lipoprotein apo A-I have been characterized. Such mutations are rare and can result in a lack of production of apo A-I. Mutations in the gene encoding LPL or its activator apo C-II are associated with severe hypertriglyceridemia and significantly reduced HDL-C levels. Mutations in the gene encoding the enzyme LCAT are also associated with severe HDL deficiency.

또한, 콜레스테롤의 역수송 기능장애는 세포내 소포로부터 HDL에 의해 받아들여지는 막 표면으로, 저장된 콜레스테롤의 수송에서 하나 이상의 단계에 영향을 미치는 생리학적 결핍에 의해 유도될 수 있다.In addition, reverse transport dysfunction of cholesterol can be induced by physiological deficiencies that affect one or more steps in the transport of stored cholesterol from intracellular vesicles to the membrane surface that is accepted by HDL.

따라서, 콜레스테롤 및/또는 지방단백질의 대사에서 단계에 관여된 유전자, 특히 말초 세포로부터 간으로의 콜레스테롤 역수송에 있어 기능장애와 연관된 유전자를 동정하기 위한 최신기술의 필요가 증가하고 있다.Thus, there is an increasing need for state-of-the-art techniques to identify genes involved in stages in the metabolism of cholesterol and / or lipoproteins, particularly those associated with dysfunction in the transport of cholesterol from peripheral cells to the liver.

최근에 와서, 전체 게놈에 걸쳐서 분포되어 있고 평균적으로 10.3 cM만큼 서로 떨어져 있는 343 마이크로부수체 마커의 상이한 대립유전자 형태의 분리에 대한 연구가 수행되었다(Rust et al., 1998). 이러한 연관 연구는 5 혈족을 포함하는 가족에 대해 수행되었고 11 세대에 걸쳐 잘 특징규명 되었으며, 여기에서 다수의 멤버는 탠지어병에 걸려 있다. 이 연구는 탠지어병과 통계적으로 연관되어 있는 인간 염색체 9번의 9q31 좌위에 위치한 영역을 동정하였다.Recently, studies have been conducted on the separation of different allelic forms of 343 microsatellite markers distributed over the entire genome and on average 10.3 cM apart from each other (Rust et al., 1998). This linkage study was conducted on families containing five blood relatives and well characterized over 11 generations, where many members have Tangier's disease. This study identified a region located at the 9q31 locus of human chromosome 9 that is statistically associated with tangerine disease.

그러나, Rust 등의 연구(1998)는 단지 손상이 탠지어병과 관련됨직한 게놈의 광범위한 영역을 규명하는데 그쳤으며, 관련 9q31-34 영역이 EST를 함유한다고 하였을 뿐, 아무런 유전자도 밝히지 못하였다. 그 이후로 인간의 9q31 좌에 위치한약 1cM 영역이 가족성 HDL 결핍과 일반적으로 관련되었음이 나타났다(Rust et al., 1999 and Brooks-Wilson et al., 1999). 좀더 정확하게 말해서, 9q31 좌의 1 cM 영역에 정확하게 위치되어 있는 ABC 트랜스포터의 단백질을 암호화하는 유전자가 콜레스테롤의 역수송 결핍과 연관된 병리에 관여되어 있음이 드러났다. 구체적으로는, 콜레스테롤의 역수송이 손상된 환자, 특히 탠지어병과 FHD병에 걸린 환자에서 ABC-1 트랜스포터를 암호화하는 유전자에서의 돌연변이가 기술되었다(Rust et al., 1999, Brooks-Wilson et al., 1999, Bodzioch et al., 1999, Marcil et al., 1999b, and Lawn et al., 1999).However, Rust et al. (1998) merely identified a broad region of the genome where damage is likely to be associated with Tangier disease, and found that the related 9q31-34 region contained EST, and did not reveal any genes. Since then, about 1 cM region located at the 9q31 locus in humans has been shown to be generally associated with familial HDL deficiency (Rust et al., 1999 and Brooks-Wilson et al., 1999). More precisely, the gene encoding the protein of the ABC transporter, which is precisely located in the 1 cM region of the 9q31 locus, has been shown to be involved in the pathology associated with the lack of back transport of cholesterol. Specifically, mutations in genes encoding the ABC-1 transporter have been described in patients with impaired cholesterol transport, particularly in patients with Tangier and FHD (Rust et al., 1999, Brooks-Wilson et al. , 1999, Bodzioch et al., 1999, Marcil et al., 1999b, and Lawn et al., 1999).

ABC("ATP-결합 카세트") 수송 단백질은 박테리아에서부터 인간에 이르기까지 진화과정 동안 극도로 잘 보존되어온 단백질 계열을 구성한다. ABC 수송 단백질은 예를 들면, 이온, 아미노산, 펩타이드, 당, 비타민 또는 스테로이드 호르몬과 같은 다양한 기질의 막수송에 관련되어 있다.ABC ("ATP-binding cassette") transport proteins make up a family of proteins that have been extremely conserved during evolution, from bacteria to humans. ABC transport proteins are involved in the transport of various substrates such as, for example, ions, amino acids, peptides, sugars, vitamins or steroid hormones.

일부 ABC 트랜스포터의 완전한 아미노산 서열의 특징규명은 이들 단백질이 공통의 일반 구조, 특히 워커(Walker) A 및 B형 단위와 각각이 여섯개의 나선으로 이루어진 두 개의 막횡단 도메인을 가진 두 개의 뉴클레오타이드 결합 폴드 (NBF) 를 가졌음을 결정하는 것을 가능케 하였다. 다양한 수송된 분자에 대한 ABC 트랜스포터의 특이성은 막횡단 도메인의 구조에 의해 결정되는 것으로 보임에 반해, 수송 활성에 필요한 에너지는 NBF 폴드의 수준에서 ATP의 분해에 의해 제공된다.Characterization of the complete amino acid sequence of some ABC transporters suggests that these proteins have a common general structure, in particular two nucleotide binding folds with Walker A and B units and two transmembrane domains each consisting of six helices. It was possible to determine that it had (NBF). While the specificity of ABC transporters for various transported molecules appears to be determined by the structure of the transmembrane domain, the energy required for transport activity is provided by the degradation of ATP at the level of the NBF fold.

인간에게서 동정된 수종의 ABC 수송 단백질은 다양한 질환과 연관되어 있다. 예를 들면, 낭포성 섬유증은 CFTR(낭포성 섬유증 막횡단 전도성 조절자) 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된다. 더군다나, 종양 세포에서 몇몇 다중 내약성 표현형은 MDR (다중-내약성) 단백질을 암호화하는 유전자에서의 돌연변이와 연관되어 있는데, 상기 단백질도 ABC 트랜스포터 구조를 갖는다. ABC-3 단백질과 같은 다른 ABC 트랜스포터도 신경 및 종양 질환과 연관되어 있거나(미국 특허 제 5,858,719 호) 금속의 생체항상성의 손상에 의해 야기되는 질환에 잠재적으로 연루되어 있다. 마찬가지로, PFIC2로 명명된 또다른 수송 ABC는 진행성인 가족성 간내 담즙분비정지 형태에 관련된 것으로 보이는데, 이 단백질은 인간에서 담즙산 염의 배출수송을 잠재적으로 담당한다.Several ABC transport proteins identified in humans are associated with various diseases. For example, cystic fibrosis is caused by mutations in the CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductivity regulator) gene. Furthermore, several multiple tolerant phenotypes in tumor cells are associated with mutations in genes encoding MDR (multi-tolerant) proteins, which also have ABC transporter structures. Other ABC transporters, such as the ABC-3 protein, are also associated with neurological and tumor diseases (US Pat. No. 5,858,719) or potentially implicated in diseases caused by impaired bioalways of metal. Similarly, another transport ABC, named PFIC2, appears to be involved in the progressive familial hepatic biliary arrest form, which is potentially responsible for the transport of bile salts in humans.

1994년에 새로운 마우스 ABC 트랜스포터를 암호화하는 cDNA가 동정되어 ABC1으로 명명되었다(Luciani et al., 1994). 이 단백질은 고도의 소수성 단편에 연결된 두 개의 막횡단 도메인과 두 개의 NBF 단위를 포함하는 대칭 구조를 가진다는 점에서 ABC 트랜스포터의 특징을 가진다.In 1994, a cDNA encoding a new mouse ABC transporter was identified and named ABC1 (Luciani et al., 1994). The protein is characterized by an ABC transporter in that it has a symmetrical structure comprising two transmembrane domains and two NBF units linked to highly hydrophobic fragments.

인간에서, 인간 ABC1 트랜스포터의 6603 염기쌍(bp) 개방 판독 프레임(ORF)을 포함하는 부분 cDNA가 동정되었다(Langmann et al., 1999). 이러한 cDNA를 기초로 하여, 인간 ABC1 유전자는 대략 220 kDa 크기의 단백질을 생성하는 2201 아미노산(aa)을 포함하는 것으로 예상된다(상기 문헌). 이 연구는 이러한 인간 ABC1 단백질 이소형을 암호화하는 유전자가 각종 조직에서 발현되고, 특히 태반, 간, 폐, 부신 및 여러 태아 조직에서 높은 수준으로 발현됨을 보여 주었다. 이들 저자는 또한 인간 ABC1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 시험관내에서 단핵구의 대식세포로의 분화과정 동안에 유도되었다고 밝히고 있다. 또한, 연구는 ABC1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 인간 대식구가 아세틸화된 저밀도 지방단백질(AcLDL)의 존재하에서 배양될 때 증가됨을 보고 하였다. 그러나, 탠지어병과 FHD병에 걸린 환자가 돌연변이된 ABC1 유전자를 지니고 있음이 밝혀졌지만(Rust et al., 1999, Brooks-Wilson et al., 1999, Bodzioch et al., 1999, Marcil et al., 1999b, and Lawn et al., 1999), 지질 수송 시스템에서 인간 ABC1 단백질의 정확한 역할은 알려져 있지 않다. 단지 ABC1 단백질이 막 인지질 수송에 대한 트랜스로카제 활성을 갖는 것으로 추측될 뿐이다.In humans, partial cDNAs containing 6603 base pair (bp) open reading frames (ORFs) of human ABC1 transporters have been identified (Langmann et al., 1999). Based on this cDNA, the human ABC1 gene is expected to contain 2201 amino acids (aa), producing a protein of approximately 220 kDa size (see above). The study showed that genes encoding these human ABC1 protein isotypes are expressed in various tissues, particularly at high levels in the placenta, liver, lung, adrenal gland and several fetal tissues. The authors also found that expression of the gene encoding human ABC1 protein was induced during the differentiation of monocytes into macrophages in vitro. The study also reported that expression of the gene encoding ABC1 protein is increased when human macrophages are cultured in the presence of acetylated low density lipoprotein (AcLDL). However, it has been found that patients with Tangier and FHD disease have a mutated ABC1 gene (Rust et al., 1999, Brooks-Wilson et al., 1999, Bodzioch et al., 1999, Marcil et al., 1999b, and Lawn et al., 1999), the exact role of human ABC1 protein in lipid transport systems is unknown. It is only assumed that ABC1 protein has translocase activity on membrane phospholipid transport.

최근에 와서, 부분적인 엑손 및 인트론 ABC1 게놈 DNA 및 인간 ABC1 cDNA의 3′비해독 영역(UTR)의 부가적인 부분이 분리되고 동정되었다(Rust et al., 1999).Recently, additional portions of the partial exon and intron ABC1 genomic DNA and the 3 ′ untranslated region (UTR) of human ABC1 cDNA have been isolated and identified (Rust et al., 1999).

탠지어병 및 FHD병에 걸린 환자가 돌연변이된 ABC1 유전자를 운반하고 있는 것으로 나타났기 때문에(Rust et al., 1999, Brooks-Wilson et al., 1999, Bodzioch et al., 1999, Marcil et al., 1999b, and Lawn et al., 1999), 막 지질 수송에 대한 인간 ABC1 단백질의 트랜스로카제 활성이 조사되었다.Because patients with Tangier's disease and FHD disease were carrying mutated ABC1 genes (Rust et al., 1999, Brooks-Wilson et al., 1999, Bodzioch et al., 1999, Marcil et al., 1999b, and Lawn et al., 1999), the translocase activity of human ABC1 protein on membrane lipid transport was investigated.

본 출원인은 5′및 3′UTR(비해독 영역)에 부수적인 서열을 함유하고 ABC1 단백질을 암호화하는 인간 ABC1 완전 길이 cDNA를 발견하고 분리해 내었으며, 이는 Langmann 등(1999)의 것에 비해 좀더 긴 아미노산 서열을 제시한다. 완전 길이 인간 ABC1 cDNA를 사용하여 콜레스테롤 및 인지질 유출 메커니즘을 조사하였으며, 그 결과 특이적 활성 및 완전 길이 ABC1 단백질과 각종 지질 수용체의 상호작용이 세포 지질 유출을 촉진함을 입증하였다.Applicants have discovered and isolated human ABC1 full length cDNAs containing sequences incidental to 5 ′ and 3 ′ UTR (non-detox region) and encoding ABC1 protein, which is longer than that of Langmann et al. (1999). The amino acid sequence is shown. Cholesterol and phospholipid efflux mechanisms were investigated using full length human ABC1 cDNA, demonstrating that specific activity and interaction of full length ABC1 protein with various lipid receptors promote cellular lipid efflux.

발명의 요약Summary of the Invention

본 발명은 동맥경화증과 같은 콜레스테롤 대사 기능장애 유도 질환과 연관된 병리, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송의 붕괴, 및 가족성 HDL 결핍, 예를 들면, 탠지어병 및/또는 FHD병의 원인 유전자인, 인간 ABC1 유전자의 다양한 엑소 및 인트론에 상응하는 핵산에 관한 것이다.The present invention relates to pathologies associated with cholesterol metabolic dysfunction-induced diseases such as atherosclerosis, more specifically the disruption of the reverse transport of cholesterol, and the causative genes of familial HDL deficiency, such as tangerine disease and / or FHD disease. It relates to nucleic acids corresponding to various exo and introns of the human ABC1 gene.

따라서, 본 발명의 제 1 주제는 서열번호 1, 4-65, 68, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이다.Thus, a first subject of the invention is a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한, a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산에 관한 것이다.The invention also provides a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or complementary polynucleotide sequences; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; Or g) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a nucleic acid comprising at least eight consecutive nucleotides of the polynucleotide sequence of the complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한, a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산에 관한 것이다.The invention also provides a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or complementary polynucleotide sequences; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; Or g) a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid comprising a nucleotide 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a polynucleotide sequence of a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한, a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 한층 더 바람직하게는 98% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산에 관한 것이다.The invention also provides a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or complementary polynucleotide sequences; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; Or g) at least 85%, preferably 90%, more preferably 95%, even more preferably 98% of the nucleic acid comprising the nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or the polynucleotide sequence of the complementary polynucleotide sequence; It relates to a nucleic acid having nucleotide identity.

본 발명은 또한, a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드와 고엄격 조건하에서 하이브리드화하는 핵산에 관한 것이다.The invention also provides a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or complementary polynucleotide sequences; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; Or g) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a nucleic acid which hybridizes under high stringency conditions with a polynucleotide of a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한, 완전 길이 ABC1 단백질을 암호화하는, 핵산, 특히 cDNA 분자에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 서열번호 69 또는 서열번호 70의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to nucleic acids, in particular cDNA molecules, which encode the full length ABC1 protein. Accordingly, the present invention relates to a nucleic acid comprising the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 69 or SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한, 서열번호 69 또는 서열번호 70으로 표시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 69 or SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한, 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to nucleic acids comprising nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or complementary polynucleotide sequences.

본 발명은 또한, 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to a nucleic acid comprising at least eight consecutive nucleotides of nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or complementary polynucleotide sequences.

본 발명의 주제는 또한, 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산이다.Subject of the invention is also a nucleic acid having at least 80% identity with a nucleic acid comprising a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한, 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 한층 더 바람직하게는 98% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to nucleic acids comprising nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or complementary polynucleotide sequences, and at least 85%, preferably 90%, more preferably 95%, Even more preferably, it relates to a nucleic acid having 98% nucleotide identity.

본 발명의 또다른 주제는 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 고엄격 조건하에서 하이브리드화하는 핵산이다.Another subject of the invention is a nucleic acid that hybridizes under high stringency conditions with a nucleic acid comprising a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명에 따라, 서열번호 69 또는 서열번호 70의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 2261 아미노산의 완전 길이 ABC1 폴리펩타이드를 암호화한다.According to the present invention, a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 69 or SEQ ID NO: 70 encodes a full length ABC1 polypeptide of 2261 amino acids comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71.

따라서, 본 발명은 또한, 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.Thus, the present invention also relates to nucleic acids encoding polypeptides comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71.

특정 양태에서, 본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.In certain embodiments, the invention also relates to nucleic acids encoding polypeptides comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

따라서, 본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.Accordingly, the present invention also relates to a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71.

본 발명은 또한 서열번호 71로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.The invention also relates to a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 71.

본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.The invention also relates to a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

본 발명은 또한, 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.The invention also relates to a polypeptide comprising an amino acid having at least 80% amino acid identity with a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 한층 더 바람직하게는 98% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드에 관한 것이다.The invention also relates to a polypeptide having at least 85%, preferably 90%, more preferably 95% and even more preferably 98% amino acid identity with a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71. will be.

바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 특히 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 15, 18 또는 20 내지 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100 또는 200개의 연속 아미노산 길이를 갖게 될 것이다.Preferably, the polypeptide according to the invention comprises 15, 18 or 20 to 25, 35, 40, of a polypeptide according to the invention, in particular a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71; It will have 50, 70, 80, 100 or 200 consecutive amino acids in length.

이와 달리, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 특히 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100 또는 200개의 연속 아미노산 길이를 갖는 단편을 포함하게 될 것이다.In contrast, a polypeptide according to the invention comprises a polypeptide according to the invention, in particular 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50 of a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71. , 100 or 200 contiguous amino acids in length.

본 발명은 또한, ABC1 유전자에서 또는 ABC1 유전자의 대립유전자형에 의해 생성된 상응하는 단백질내, 일반적으로 다형성, 특히 돌연변이의 검출수단에 관한 것이다. 최근에 와서, 탠지어병 및 FHD병에 걸린 환자가 돌연변이된 ABC1 유전자를 지니고 있음이 나타났다(Rust et al., 1999, Brooks-Wilson et al., 1999, Bodzioch et al., 1999, and Marcil et al., 1999b). 본 발명에 따라, ABC1 유전자의 상이한 엑손에 분포된 수 개의 추가 돌연변이가 다양한 환자, 특히 심혈관 장애와 관련된 질환의 중증 형태로 앓고 있는 환자에서 동정되었다. 또한, 다양한 다형성이 온화한 형태의 질환을 앓고 있는 환자에서의 ABC1 유전자의 인트론에서 발견되었으며, 이는 이들 환자가 "야생형" 대립유전자와는 구별되는, 유전자의 특정 대립유전자를 운반함을 시사한다. 부분적으로는 이들 다형성을 특징으로 하는 이러한 대립유전자는 유전자의 최초 엑손의 5′사이드상에 각각 또는 최종 엑손의 3′사이드상에 번갈아 위치한 비암호화 영역에, 특히 결함을 유도하는 유형의 조절 영역에, 예를 들면 프로모터 서열에 또는 인핸서 서열에 뉴클레오타이드의 치환, 첨가 또는 결실을 함유하는 것 같다. 이러한 결함은 ABC1 폴리펩타이드의 합성에 있어 증가 또는 감소를 일으킬 수 있다.The invention also relates to means of detection of polymorphisms, in particular mutations, in the corresponding proteins produced in the ABC1 gene or by the allele of the ABC1 gene. Recently, it has been shown that patients with Tangier and FHD disease carry a mutated ABC1 gene (Rust et al., 1999, Brooks-Wilson et al., 1999, Bodzioch et al., 1999, and Marcil et al., 1999b). In accordance with the present invention, several additional mutations distributed in different exons of the ABC1 gene have been identified in various patients, especially those suffering from severe forms of diseases associated with cardiovascular disorders. In addition, various polymorphisms have been found in the introns of the ABC1 gene in patients with mild forms of the disease, suggesting that these patients carry certain alleles of the gene, distinct from "wild-type" alleles. These alleles, in part characterized by these polymorphisms, are located in alternating non-coding regions, respectively on the 5 'side of the first exon of the gene or on the 3' side of the final exon, in particular in the regulatory region of the type inducing defects. For example, a substitution, addition or deletion of a nucleotide in a promoter sequence or in an enhancer sequence. Such defects can cause an increase or decrease in the synthesis of the ABC1 polypeptide.

따라서, 본 발명은 또한 돌연변이된 ABC1 유전자, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 결핍을 앓고 있는 환자, 특히 탠지어병에 걸린 환자에서의 돌연변이된 ABC1 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 관한 것이다.Thus, the present invention also relates to polypeptides encoded by the mutated ABC1 gene, more particularly in patients suffering from a reverse transport deficiency of cholesterol, in particular in patients with Tangier disease.

따라서, 본 발명은 서열번호 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.Accordingly, the present invention relates to a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 89-102.

본 발명은 또한 서열번호 89-102 중 임의 하나로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.The invention also relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 89-102.

따라서, 본 발명의 다른 주제는 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이며, 여기에서 핵산은 서열번호 72-88 중 임의 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.Accordingly, another subject of the invention is a nucleic acid encoding a mutated ABC1 polypeptide, wherein the nucleic acid comprises a polynucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 72-88, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 관한 것이고, 여기에서 핵산은 서열번호 72-88 중 임의 하나로 표시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.The invention also relates to a nucleic acid encoding a mutated ABC1 polypeptide, wherein the nucleic acid comprises a polynucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 72-88, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한 서열번호 89-102 중 임의 하나를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to a nucleic acid encoding a polypeptide comprising any one of SEQ ID NOs: 89-102.

다른 양태에 따라, 본 발명은 또한 적어도 하나의 복대립유전자 다형성을 포함하는 ABC1 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 주제는 서열번호 103 및 109-118 중 임의 하나의 폴리뉴클레오타이드, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이다.According to another aspect, the invention also relates to the nucleotide sequence of the ABC1 gene comprising at least one biele allele polymorphism. Accordingly, another subject of the invention is a nucleic acid comprising a polynucleotide of any one of SEQ ID NOs: 103 and 109-118, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한 서열번호 103 및 109-118 중 임의 하나를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence or a complementary polynucleotide sequence comprising any one of SEQ ID NOs: 103 and 109-118.

본 발명은 또한, 서열번호 103 및 109-118의 임의 하나로 표시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 103 and 109-118, or a complementary polynucleotide sequence.

ABC1 핵산의 영역에 위치된 핵산 서열, 특히 전술한 돌연변이 또는 다형성 중 임의 하나를 포함하는 핵산 서열과 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 탐침과 프라이머(게놈 DNA, 메신저 RNA, cDNA)도 본 발명의 일부를 형성한다.Nucleotide probes and primers (genomic DNA, messenger RNA, cDNA) that hybridize with nucleic acid sequences located in the region of the ABC1 nucleic acid, in particular nucleic acid sequences comprising any one of the aforementioned mutations or polymorphisms, also form part of the invention.

본 발명에 따라, a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로부터 유도된 핵산 단편은 샘플내 ABC1 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 하나의 카피 또는 이의 단편 또는 변이체(돌연변이 또는 다형성 함유) 존재 검출에 유용하다.According to the invention, a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; g) a nucleic acid fragment derived from a nucleic acid comprising a nucleotide 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a complementary polynucleotide sequence, or h) a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69, or a polynucleotide sequence of a complementary polynucleotide sequence; Useful for detecting the presence of at least one copy or fragment or variant (containing mutations or polymorphisms) of the nucleotide sequence of the ABC1 gene.

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.Nucleotide probes or primers according to the invention are a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or complementary poly Nucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; Or g) at least a nucleic acid comprising a nucleotide 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a complementary polynucleotide sequence, or h) a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence It contains eight consecutive nucleotides.

바람직하게는, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 10, 12, 15, 18 또는 20 내지 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500개의 연속 뉴클레오타이드 길이를 가질 것이다.Preferably, the nucleotide probe or primer according to the invention is a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137 Or complementary polynucleotide sequences; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; Or g) the nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or the complementary polynucleotide sequence, or h) the nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or the nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or 10 of the nucleic acid comprising the complementary polynucleotide sequence , 12, 15, 18 or 20 to 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500 consecutive nucleotides in length.

이와 달리, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 본 발명에 따른 핵산, 특히 a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500개의 연속 뉴클레오타이드 길이를 가지는 단편을 포함할 것이다.In contrast, nucleotide probes or primers according to the invention can be used for nucleic acids according to the invention, in particular a) SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68 And any one of 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; g) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or the complementary polynucleotide sequence, or h) nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or 12 of the nucleic acid comprising the complementary polynucleotide sequence; And fragments having 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500 consecutive nucleotides in length.

따라서, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 고엄격 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.Thus, a nucleotide probe or primer according to the present invention may comprise a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or Complementary polynucleotide sequences; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; Or g) a nucleotide 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a complementary polynucleotide sequence, or h) a nucleic acid comprising a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence; Oligonucleotides that hybridize under stringent hybridization conditions.

본 발명에 따른 바람직한 탐침 및 프라이머는 서열번호 119-136, 138, 및 141-152, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열 중 임의 하나를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부를 포함한다.Preferred probes and primers according to the invention comprise all or part of a polynucleotide sequence comprising any one of SEQ ID NOs: 119-136, 138, and 141-152, or complementary polynucleotide sequences.

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 프라이머는 본 발명에 따른 핵산, 좀더 구체적으로는 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 증폭에 사용될 수 있다. 이와 달리, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 프라이머는 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드의 핵산 단편 또는 변이체 증폭에 사용될 수 있다.Nucleotide primers according to the invention are nucleic acids according to the invention, more specifically any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or complementary polynucleotide sequences It can be used for amplification of a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence of. Alternatively, the nucleotide primers according to the invention can be used for amplifying any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or nucleic acid fragments or variants of complementary polynucleotides. Can be.

특정 양태로서, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 프라이머는 a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 i)서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열로 표시된 핵산의 증폭에 사용될 수 있다.In certain embodiments, the nucleotide primers according to the invention comprise a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or Complementary polynucleotide sequences; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; g) a nucleotide 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a complementary polynucleotide sequence, h) a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence, or i) a sequence Any one of Nos. 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a nucleic acid represented by a complementary polynucleotide sequence.

본 발명의 또다른 주제는 샘플에 함유된 본 발명에 따른 핵산, 좀더 구체적으로 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 또는핵산 단편 또는 이의 변이체의 증폭방법에 관한 것으로, 이 방법은 a)표적 핵산의 존재가 추정되는 샘플을 증폭반응에 필요한 시약의 존재하에, 증폭시키고자 하는 표적 핵산 영역의 5′사이드와 3′사이드상에 각각 하이브리드화 위치가 위치하는 한 쌍의 뉴클레오타이드 프라이머와 접촉시킨 다음; b)증폭된 핵산을 검출하는 단계를 포함한다.Another subject of the invention is a nucleic acid according to the invention contained in a sample, more specifically a polynucleotide of any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137 A method of amplifying a nucleic acid, or nucleic acid fragment or variant thereof, comprising a sequence or complementary polynucleotide sequence, the method comprising: a) amplifying a sample in which the presence of the target nucleic acid is estimated, in the presence of a reagent required for the amplification reaction, and Contacting with a pair of nucleotide primers each having a hybridization position on the 5 'side and the 3' side of the target nucleic acid region of interest; b) detecting the amplified nucleic acid.

본 발명의 또다른 주제는 샘플에 함유된, 본 발명에 따른 핵산, 특히 a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 i)서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열로 표시된 핵산의 증폭방법에 관한 것으로, 이 방법은 a)표적 핵산의 존재가 추정되는 샘플을 증폭반응에 필요한 시약의 존재하에, 증폭시키고자 하는 표적 핵산 영역의 5′사이드와 3′사이드상에 각각 하이브리드화 위치가 위치하는 한 쌍의 뉴클레오타이드 프라이머와 접촉시킨 다음; b)증폭된 핵산을 검출하는단계를 포함한다.Another subject of the invention is a nucleic acid according to the invention contained in a sample, in particular a) SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68 And any one of 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; g) a nucleotide 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a complementary polynucleotide sequence, h) a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence, or i) a sequence Any one of Nos. 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a nucleic acid represented by a complementary polynucleotide sequence, the method comprising: a) Contacting the presumed sample with a pair of nucleotide primers each having a hybridization site located on the 5 'side and the 3' side of the target nucleic acid region to be amplified in the presence of the reagents required for the amplification reaction; b) detecting the amplified nucleic acid.

본 발명은 또한 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 또는 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 핵산 단편 또는 변이체의 샘플내 존재 검출방법에 관한 것으로, 이 방법은 1)본 발명에 따른 하나 이상의 뉴클레오타이드 탐침을 시험하고자 하는 샘플과 접촉시키고; 2)샘플에 존재하는 핵산과 탐침간에 형성될 수 있는 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.The invention also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a complementary polynucleotide sequence, or SEQ ID NO: 1 , 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or methods for detecting the presence of a nucleic acid fragment or variant of a complementary polynucleotide sequence in a sample, comprising: 1) Contacting one or more nucleotide probes according to the invention with a sample to be tested; 2) detecting a complex that may be formed between the nucleic acid present in the sample and the probe.

본 발명에 따른 검출방법의 특정 양태에 따라, 올리고뉴클레오타이드 탐침은 지지체상에 고정화된다.According to a particular aspect of the detection method according to the invention, the oligonucleotide probe is immobilized on a support.

다른 양태에 따라, 올리고뉴클레오타이드 탐침은 검출 가능한 마커를 포함한다.According to another aspect, the oligonucleotide probe comprises a detectable marker.

본 발명의 또다른 주제는 a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68-70, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 h)서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열로 표시된 핵산의 증폭 박스 또는 키트이며, 이 박스 또는 키트는 1)증폭시키고자 하는 표적 핵산 영역의 5′사이드와 3′사이드상에 각각 하이브리드화 위치가 위치하는 본 발명에 따른 한 쌍의 뉴클레오타이드 프라이머; 및 임의로 2)증폭반응에 필요한 시약을 포함한다.Another subject of the invention is a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68-70, and 137, or complementary poly Nucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; g) a nucleotide 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a complementary polynucleotide sequence, or h) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137 Or an amplification box or kit of nucleic acid represented by a complementary polynucleotide sequence, wherein the box or kit comprises: 1) hybridization sites located on the 5 'and 3' sides of the target nucleic acid region to be amplified, respectively. A pair of nucleotide primers along; And optionally 2) reagents required for the amplification reaction.

이러한 증폭 박스 또는 키트는 바람직하게는 전술한 바와 같은 적어도 한 쌍의 뉴클레오타이드 프라이머를 포함할 것이다.Such amplification boxes or kits will preferably comprise at least one pair of nucleotide primers as described above.

추가로, 본 발명의 주제는, a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 전부 또는 일부 증폭 박스 또는 키트이며, 이 박스 또는 키트는 1)증폭시키고자 하는 표적 핵산 영역의 5′사이드와 3′사이드상에 각각 하이브리드화 위치가 위치하는 본 발명에 따른 한 쌍의 뉴클레오타이드 프라이머; 및 임의로 2)증폭반응에 필요한 시약을 포함한다.In addition, subject matter of the present invention may include a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or complementary poly Nucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; g) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or complementary polynucleotide sequences, or h) all or part of an amplification box or kit of nucleic acid comprising a nucleotide of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence; This box or kit comprises: 1) a pair of nucleotide primers according to the invention wherein hybridization sites are located on the 5 'and 3' sides of the target nucleic acid region to be amplified; And optionally 2) reagents required for the amplification reaction.

이러한 증폭 박스 또는 키트는 바람직하게는 전술한 바와 같은 적어도 한 쌍의 뉴클레오타이드 프라이머를 포함할 것이다.Such amplification boxes or kits will preferably comprise at least one pair of nucleotide primers as described above.

본 발명은 또한, 샘플내 본 발명에 따른 핵산의 존재 검출 박스 또는 키트에 관한 것이며, 이 박스 또는 키트는 a)본 발명에 따른 하나 이상의 뉴클레오타이드 탐침; b)경우에 따라, 하이브리드화 반응에 필요한 시약을 포함한다.The invention also relates to a detection box or kit for the presence of a nucleic acid according to the invention in a sample, said box or kit comprising: a) at least one nucleotide probe according to the invention; b) optionally, reagents necessary for the hybridization reaction.

제 1 양태에 따라, 검출 박스 또는 키트는 뉴클레오타이드 탐침 및 프라이머가 지지체상에 고정됨을 특징으로 한다.According to a first aspect, the detection box or kit is characterized in that the nucleotide probe and primer are immobilized on the support.

제 2 양태에 따라, 검출 박스 또는 키트는 뉴클레오타이드 탐침 및 프라이머가 검출 가능한 마커를 포함함을 특징으로 한다.According to a second aspect, the detection box or kit is characterized in that the nucleotide probe and the primer comprise a marker detectable.

전술한 검출 키트의 특정 양태에 따라, 이러한 키트는 해당 표적 핵산의 검출 또는 이와 달리 본 발명에 따른 핵산의 비-암호화 영역 또는 암호화 영역내 돌연변이 검출에 사용될 수 있는 본 발명에 따른 복수의 올리고뉴클레오타이드 탐침 및/또는 프라이머를 포함할 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에 따라, 표적 핵산은 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 핵산 서열을 포함한다. 이와 달리, 표적 핵산은 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 핵산 단편 또는 변이체이다.According to certain embodiments of the above-described detection kits, such kits can be used for the detection of a corresponding target nucleic acid or alternatively for the detection of mutations in non-coding or coding regions of nucleic acids according to the invention. And / or primers. According to a preferred embodiment of the invention, the target nucleic acid comprises a polynucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a complementary nucleic acid sequence. . In contrast, the target nucleic acid is a nucleic acid fragment or variant of a nucleic acid comprising any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a complementary polynucleotide sequence.

바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 두 프라이머는 전술한 서열번호 72에 표시된 바와 같이 돌연변이를 운반하는 ABC1 유전자의 엑손 5 영역의 증폭을 가능케 하는 서열번호 125 및 126의 전부 또는 일부, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함한다.According to a preferred embodiment, the two primers according to the invention are all or part of SEQ ID NOs: 125 and 126, or complementary polynucleotides which allow for amplification of the exon 5 region of the ABC1 gene carrying a mutation as indicated in SEQ ID NO: 72 above Nucleic acids having a sequence.

제 2 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 두 프라이머는 전술한 바와 같이 서열번호 73 또는 74에 표시된 바와 같은 돌연변이를 운반하는 ABC1 유전자의 엑손 6의 영역을 증폭 가능케 하는 서열번호 127 및 128의 전부 또는 일부, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함한다.According to a second preferred embodiment, the two primers according to the invention are all of SEQ ID NOs: 127 and 128 which enable amplification of the region of exon 6 of the ABC1 gene carrying a mutation as indicated above in SEQ ID NOS: 73 or 74, or Nucleic acids having some, or complementary, polynucleotide sequences.

제 3 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 두 프라이머는 전술한 바와 같이 서열번호 75-77에 표시된 바와 같은 돌연변이를 운반하는 ABC1 유전자의 엑손 8의 영역을 증폭 가능케 하는 서열번호 131 및 132의 전부 또는 일부, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함한다.According to a third preferred embodiment, the two primers according to the invention are all of SEQ ID NOs 131 and 132 which enable amplification of the region of exon 8 of the ABC1 gene carrying a mutation as indicated above in SEQ ID NOs 75-77 or Nucleic acids having some, or complementary, polynucleotide sequences.

제 4 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 두 프라이머는 전술한 바와 같이 서열번호 84에 표시된 바와 같은 돌연변이를 운반하는 ABC1 유전자의 엑손 27의 영역을 증폭 가능케 하는 서열번호 155 및 156의 전부 또는 일부, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함한다.According to a fourth preferred embodiment, the two primers according to the invention are all or part of SEQ ID NOs. 155 and 156 which enable amplification of the region of exon 27 of the ABC1 gene carrying a mutation as indicated in SEQ ID NO: 84, as described above, Or nucleic acids having complementary polynucleotide sequences.

제 5 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 두 프라이머는 전술한 바와 같이 서열번호 85로 표시된 바와 같은 돌연변이를 운반하는 ABC1 유전자의 엑손 32의 영역을 증폭 가능케 하는 서열번호 159 및 160의 전부 또는 일부, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함한다.According to a fifth preferred embodiment, the two primers according to the invention are all or part of SEQ ID NOs: 159 and 160 which enable amplification of the region of exon 32 of the ABC1 gene carrying a mutation as indicated by SEQ ID NO: 85, as described above, Or nucleic acids having complementary polynucleotide sequences.

제 6 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 두 프라이머는 전술한 바와 같이 서열번호 87 또는 88로 표시된 바와 같은 돌연변이를 운반하는 ABC1 유전자의 엑손 47의 영역을 증폭 가능케 하는 서열번호 175 및 176의 전부 또는 일부, 또는상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함한다.According to a sixth preferred embodiment, the two primers according to the invention are all of SEQ ID NOs 175 and 176 which enable amplification of the region of exon 47 of the ABC1 gene carrying a mutation as indicated above in SEQ ID NOs 87 or 88 or Nucleic acids having some, or complementary, polynucleotide sequences.

또다른 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 프라이머는 일반적으로, 서열번호 119-136, 138, 및 141-152 중 임의 하나의 전부 또는 일부, 또는 상보 서열을 포함한다.According to another preferred embodiment, the primers according to the invention generally comprise all or part of any one of SEQ ID NOs: 119-136, 138, and 141-152, or complementary sequences.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 재조합 벡터는 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택된 핵산을 포함할 것이다:The invention also relates to a recombinant vector comprising a nucleic acid according to the invention. Preferably such recombinant vector will comprise a nucleic acid selected from the group consisting of:

a)서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산,a) a nucleic acid comprising the polynucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a complementary polynucleotide sequence,

b)서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열로 표시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산,b) a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a polynucleotide sequence represented by a complementary polynucleotide sequence,

c)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산,c) a nucleic acid comprising a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence,

d) 1)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 2)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 3)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 4)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 5)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 6)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 7)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 8)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 핵산;d) 1) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; 2) nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; 3) the nucleotide 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; 4) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; 5) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; 6) nucleotide 1-1657, or the complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; 7) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or the complementary polynucleotide sequence, or 8) nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or polynucleotide sequences of the complementary polynucleotide sequence Nucleic acids having at least 8 consecutive nucleotides of nucleic acid;

e) 1)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 2)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 3)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 4)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 5)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 6)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 7)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 8)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산;e) 1) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; 2) nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; 3) the nucleotide 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; 4) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; 5) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; 6) nucleotide 1-1657, or the complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; 7) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or the complementary polynucleotide sequence, or 8) nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or polynucleotide sequences of the complementary polynucleotide sequence Nucleic acids having at least 80% nucleotide identity with the nucleic acid;

f) 1)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 2)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 3)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 4)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 5)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 6)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 7)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 8)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 85%, 90%, 95%, 또는 98% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산;f) 1) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; 2) nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; 3) the nucleotide 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; 4) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; 5) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; 6) nucleotide 1-1657, or the complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; 7) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or the complementary polynucleotide sequence, or 8) nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or polynucleotide sequences of the complementary polynucleotide sequence Nucleic acids having 85%, 90%, 95%, or 98% nucleotide identity with the nucleic acid;

g) 1)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 2)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 3)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 4)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 5)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 6)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 7)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 8)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 고엄격 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화하는 핵산;g) 1) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; 2) nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; 3) the nucleotide 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; 4) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; 5) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; 6) nucleotide 1-1657, or the complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; 7) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or the complementary polynucleotide sequence, or 8) nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or polynucleotide sequences of the complementary polynucleotide sequence Nucleic acids that hybridize with nucleic acids under high stringency hybridization conditions;

h)서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; 및h) a nucleic acid encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71; And

i)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.i) a nucleic acid encoding a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

제 1 양태에 따라, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 원하는 세포 숙주의 형질전환 또는 형질감염에 따라, 삽입된 핵산의 증폭에 사용된다.According to a first aspect, the recombinant vector according to the invention is used for amplification of the inserted nucleic acid following transformation or transfection of the desired cell host.

제 2 양태에 따라, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 본 발명에 따른 핵산 외에, 핵산의 전사 및/또는 해독을 지시하거나 조절하는 조절 시그널 또는 뉴클레오타이드 서열 및 이의 암호화된 mRNA를 포함하는 발현벡터에 상응한다.According to a second aspect, the recombinant vector according to the present invention corresponds to an expression vector comprising, in addition to the nucleic acid according to the present invention, a regulatory signal or nucleotide sequence that directs or regulates the transcription and / or translation of the nucleic acid and its encoded mRNA. .

바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 특히 하기 성분을 포함할 것이다:According to a preferred embodiment, the recombinant vector according to the invention will in particular comprise the following components:

(1)프로모터 및/또는 인핸서 서열과 같이, 삽입시킬 핵산의 발현을 조절하기 위한 요소 또는 시그널;(1) elements or signals for regulating the expression of the nucleic acid to be inserted, such as promoter and / or enhancer sequences;

(2)상기 벡터 중으로 삽입시킬 본 발명에 따른 핵산 안에 포함된 뉴클레오타이드 암호화 영역(암호화 영역은 (1)에서 기술한 조절 요소 또는 시그널과 동 위상으로 배치된다); 및(2) the nucleotide coding region contained in the nucleic acid according to the present invention to be inserted into the vector (the coding region is arranged in phase with the regulatory element or signal described in (1)); And

(3)(2)에서 기술한 핵산의 뉴클레오타이드 암호화 영역의 전사 개시와 종결을 위한 적당한 핵산.(3) A suitable nucleic acid for initiation and termination of transcription of the nucleotide coding region of the nucleic acid described in (2).

본 발명은 또한 콜레스테롤의 수송 및 대사에 관여된 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA 핵산을 포함하는 결손형 재조합 바이러스에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 바람직한 양태에서, 결손형 재조합 바이러스는 콜레스테롤의 수송과 대사에 관여된 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 gDNA 핵산을 포함한다. 바람직하게는, ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다.The invention also relates to a defective recombinant virus comprising a cDNA nucleic acid encoding the ABC1 polypeptide involved in the transport and metabolism of cholesterol. In another preferred embodiment of the invention, the defective recombinant virus comprises a gDNA nucleic acid encoding an ABC1 polypeptide involved in the transport and metabolism of cholesterol. Preferably, the ABC1 polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID 71. More preferably, the ABC1 polypeptide comprises amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 RSV-LTR 또는 CMV 초기 프로모터로부터 선택된 프로모터의 조절하에 콜레스테롤의 수송과 대사에 관여된 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 결손형 재조합 바이러스에 관한 것이다.In another preferred aspect, the invention relates to a defective recombinant virus comprising a nucleic acid encoding ABC1 protein involved in the transport and metabolism of cholesterol under the control of a promoter selected from the RSV-LTR or CMV early promoter.

특정 양태에 따라, 본 발명에 따른 핵산을 숙주세포 중으로, 특히 포유동물에서 수득된 숙주세포 중으로 생체내에서 도입하는 방법은, 적당한 조절 서열의 조절하에 배치된, 약학적으로 적합한 벡터 및 본 발명에 따른 "네이키드" 핵산을 포함하는 제제가 국소 주사에 의해 선택된 조직, 예를 들면 평활근 조직의 수준에서 도입되는 동안, "네이키드" 핵산이 상기 조직의 세포에 의해 흡수되는 단계를 포함한다.According to certain embodiments, the method of introducing a nucleic acid according to the invention into a host cell, in particular into a host cell obtained from a mammal, is carried out in a pharmaceutically suitable vector and under the control of an appropriate regulatory sequence. While an agent comprising a "naked" nucleic acid according to the present invention is introduced at the level of a selected tissue, for example smooth muscle tissue, by topical injection, the "naked" nucleic acid is taken up by the cells of said tissue.

본 발명의 특정 양태에 따라, 조성물은 ABC1 단백질의 생체내 생산을 위해 제공된다. 본 조성물은 생리학적으로 허용되는 비히클 및/또는 부형제 중의 용액에서, 적당한 조절 서열의 조절하에 배치된 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다.According to certain embodiments of the invention, the composition is provided for in vivo production of ABC1 protein. The composition comprises a nucleic acid encoding an ABC1 polypeptide disposed under the control of appropriate regulatory sequences, in solution in a physiologically acceptable vehicle and / or excipient.

따라서, 본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기에서 핵산은 적당한 조절 요소의 조절하에 배치된다.Accordingly, the present invention also relates to compositions comprising nucleic acids encoding polypeptides comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71, wherein the nucleic acids are arranged under the control of appropriate regulatory elements.

본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 핵산은 적당한 조절 요소의 조절하에배치된다.The invention also relates to a composition comprising a nucleic acid encoding a polypeptide comprising a amino acid of SEQ ID NO: 71, wherein the nucleic acid is placed under the control of appropriate regulatory elements.

따라서, 본 발명은 또한, 하나 이상의 생리학적으로 적합한 부형제와 함께, ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 환자 또는 피검자의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것이다.Accordingly, the present invention also relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of a patient or subject with a back transport dysfunction of cholesterol comprising a nucleic acid encoding ABC1 protein, together with one or more physiologically suitable excipients.

바람직하게는, 이러한 조성물은 서열번호 69 또는 서열번호 70의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함할 것이고, 핵산은 적당한 조절 요소 또는 시그널의 조절하에 배치된다.Preferably such composition will comprise a nucleic acid comprising the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 69 or SEQ ID NO: 70, wherein the nucleic acid is placed under the control of an appropriate regulatory element or signal.

추가로, 본 발명의 주제는 본 발명에 따른 재조합 벡터를 하나 이상의 생리학적으로 적합한 부형제와 함께 포함하는 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 환자 또는 피검자의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물이다.In addition, a subject of the invention is a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of a patient or subject with a reverse transport dysfunction of cholesterol comprising a recombinant vector according to the invention with one or more physiologically suitable excipients.

본 발명은 또한 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증의 예방 또는 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 피검자 치료용 약제의 제조를 위한 ABC1 단백질을 암호화하는 본 발명에 따른 핵산의 용도에 관한 것이다.The present invention also relates to the use of a nucleic acid according to the invention encoding the ABC1 protein for the preparation of a medicament for the prevention of various forms of atherosclerosis or more specifically for the treatment of a subject suffering from reverse transport dysfunction of cholesterol.

본 발명은 또한 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증의 예방 또는 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 피검자 치료용 약제의 제조를 위한 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 본 발명에 따른 재조합 벡터의 용도에 관한 것이다.The invention also relates to the use of a recombinant vector according to the invention comprising a nucleic acid encoding ABC1 protein for the preparation of various forms of atherosclerosis or more specifically for the treatment of a subject suffering from reverse transport dysfunction of cholesterol. It is about.

따라서, 본 발명의 주제는 콜레스테롤의 대사에 관여된 ABC1 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터이다.Accordingly, the subject of the present invention is a recombinant vector comprising a nucleic acid according to the present invention encoding an ABC1 protein or polypeptide involved in the metabolism of cholesterol.

본 발명은 또한, 탠지어병 및/또는 FHD병과 연관된 HDL 결핍, HDL 결핍,LCAT 결핍, 말라리아, 및 당뇨병과 같이, HDL 결핍과 연관된 심혈관 질환 또는 증상의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한 상기 재조합 벡터의 용도에 관한 것이다.The invention also provides for the preparation of pharmaceutical compositions for the treatment and / or prophylaxis of cardiovascular diseases or symptoms associated with HDL deficiency, such as HDL deficiency, HDL deficiency, LCAT deficiency, malaria, and diabetes associated with Tangerine disease and / or FHD disease. It relates to the use of said recombinant vector for.

본 발명은 또한, 생물학적 활성 ABC1 폴리펩타이드의 장기적이고 효과적인 생체내 발현을 허용하도록, 본 발명에 따른 상기 재조합 벡터로 생체외에서 유전자 변형시킨 세포, 또는 재조합 벡터를 생성하는 세포의 용도에 관한 것으로, 세포는 체내에 이식된다.The invention also relates to the use of cells which have been genetically modified ex vivo with said recombinant vector according to the invention, or cells which produce a recombinant vector, to allow long-term and effective in vivo expression of a biologically active ABC1 polypeptide. Is implanted in the body.

본 발명은 또한, 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증의 예방이나 치료 또는 구체적으로 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 피검자의 치료용 약제의 제조를 위한 ABC1 단백질을 암호화하는 본 발명에 따른 핵산의 용도에 관한 것이다.The present invention further relates to the use of the nucleic acid according to the invention encoding the ABC1 protein for the prevention or treatment of various forms of atherosclerosis or specifically for the preparation of a medicament for the treatment of a subject with a reverse transport dysfunction of cholesterol.

본 발명은 또한, 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증의 예방 또는 구체적으로 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 피검자의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 본 발명에 따른 재조합 벡터의 용도에 관한 것이다.The present invention also provides a nucleic acid encoding the ABC1 polypeptide according to the invention for the preparation of a medicament for the prevention of various forms of atherosclerosis or specifically for the treatment of a subject suffering from reverse transport of cholesterol. It relates to the use of recombinant vectors.

본 발명은 또한, 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증의 예방 또는 구체적으로 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 피검자의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 본 발명에 따른 재조합 숙주세포의 용도에 관한 것이다.The present invention also provides a nucleic acid encoding the ABC1 polypeptide according to the invention for the preparation of a medicament for the prevention of various forms of atherosclerosis or specifically for the treatment of a subject suffering from reverse transport of cholesterol. It relates to the use of recombinant host cells.

본 발명은 또한, 콜레스테롤의 수송과 연관된 병리의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한, 본 발명에 따른 재조합 벡터, 바람직하게는 결손형 재조합 바이러스의 용도에 관한 것이다.The invention also relates to the use of a recombinant vector, preferably a defective recombinant virus, according to the invention for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prophylaxis of pathologies associated with the transport of cholesterol.

본 발명은 콜레스테롤 역수송 결핍과 연관된 심혈관 질환의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한 재조합 벡터 또는 결손형 재조합 바이러스의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 하나 이상의 재조합 벡터 또는 결손형 재조합 바이러스를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to the use of recombinant vectors or defective recombinant viruses for the preparation of pharmaceutical compositions for the treatment and / or prevention of cardiovascular diseases associated with cholesterol back transport deficiency. Accordingly, the invention also relates to pharmaceutical compositions comprising one or more recombinant vectors or defective recombinant viruses according to the invention.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 바이러스로 생체외에서 유전자 변형시키고, 체내에 이식되며, 생물학적 활성 ABC1 단백질의 지속적이고 효과적인 생체내 발현을 허용하는 세포의 용도에 관한 것이다.The invention also relates to the use of cells which are genetically modified ex vivo with the virus according to the invention, transplanted into the body, and which permit the sustained and effective in vivo expression of biologically active ABC1 protein.

본 발명은 본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 바이러스 벡터 중으로 혼입시킬 수 있고, 이들 벡터가 생물학적으로 활성이고 성숙한 폴리펩타이드를 효과적으로 발현시킬 수 있게 함을 보여준다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 ABC1의 생체내 발현이 아데노바이러스의 직접 투여에 의해 또는 생산 세포 또는 아데노바이러스에 의해 유전자 변형된 세포의 이식에 의해 또는 이러한 핵산을 혼입하는 레트로바이러스에 의해 달성될 수 있다.The present invention shows that nucleic acids encoding ABC1 polypeptides according to the present invention can be incorporated into viral vectors and that these vectors can effectively express biologically active and mature polypeptides. More specifically, the present invention can be achieved by the in vivo expression of ABC1 by direct administration of adenoviruses or by transplantation of genes modified by production cells or adenoviruses or by retroviruses incorporating such nucleic acids. have.

이와 관련하여, 본 발명의 다른 주제는 본 발명에 따른 하나 이상의 결손형 재조합 바이러스로 감염시킨 포유동물 세포에 관한 것이다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 이들 바이러스로 감염시킨 인간 세포의 임의 집단에 관한 것이다. 이들은 혈액 기원의 특정 세포(분화 전능성 줄기 세포 또는 전구체), 섬유아세포, 근원세포, 간세포, 케라틴생성세포, 평활근 및 내피 세포, 신경교 세포 등일 수 있다.In this regard, another subject of the invention relates to mammalian cells infected with one or more defective recombinant viruses according to the invention. More specifically, the present invention relates to any population of human cells infected with these viruses. These may be certain cells of blood origin (differentiated pluripotent stem cells or precursors), fibroblasts, myoblasts, hepatocytes, keratinocytes, smooth muscle and endothelial cells, glial cells and the like.

본 발명의 다른 주제는 본 발명에 따른 하나 이상의 결손형 재조합 바이러스로 감염시킨 포유동물 세포 또는 재조합 바이러스를 생산하는 세포, 및 세포외 매트릭스를 포함하는 이식편에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이식편은 105내지 1010세포를 포함한다. 좀더 바람직하게는, 이들은 106내지 108세포를 포함한다.Another subject of the invention relates to a graft comprising a mammalian cell or a cell producing a recombinant virus infected with one or more defective recombinant viruses according to the invention, and an extracellular matrix. Preferably, the graft according to the invention comprises 10 5 to 10 10 cells. More preferably, they comprise 10 6 to 10 8 cells.

좀더 구체적으로, 본 발명의 이식편에서, 세포외 매트릭스는 겔화 화합물 및 임의로 세포의 고정을 허용하는 지지체를 포함한다.More specifically, in the graft of the present invention, the extracellular matrix comprises a gelling compound and optionally a support that allows fixation of cells.

본 발명은 또한 본 발명의 핵산, 좀더 구체적으로는 서열번호 69 또는 서열번호 70의 핵산, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also relates to a recombinant host cell comprising a nucleic acid of the invention, more specifically a nucleic acid of SEQ ID NO: 69 or SEQ ID NO: 70, or a nucleic acid of a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한 본 발명의 핵산, 좀더 구체적으로는 서열번호 69 또는 서열번호 70으로 표시된 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also relates to a recombinant host cell comprising a nucleic acid of the invention, more specifically a nucleic acid comprising a nucleotide represented by SEQ ID NO: 69 or SEQ ID NO: 70, or a nucleic acid of a complementary polynucleotide sequence.

구체적으로, 본 발명은 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나를 포함하는 핵산, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.Specifically, the present invention provides a recombinant host comprising a nucleic acid comprising any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a nucleic acid of a complementary polynucleotide sequence. It is about a cell.

본 발명은 또한 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 핵산 중 임의 하나로 표시된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also provides a recombinant comprising a nucleic acid comprising a polynucleotide represented by any of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a nucleic acid of a complementary polynucleotide sequence. It relates to a host cell.

본 발명은 또한 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357을 포함하는 핵산, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The present invention also relates to a recombinant host cell comprising a nucleic acid comprising nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or nucleic acids of complementary polynucleotide sequences.

본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also relates to a recombinant host cell comprising a nucleic acid encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71.

본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also relates to a recombinant host cell comprising a nucleic acid encoding a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

또다른 양태에 따라, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 핵산, 특히 서열번호 69 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 또는 상보 폴리뉴클레오타이드의 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.According to another aspect, the invention also relates to a recombinant host cell comprising the recombinant vector according to the invention. Accordingly, the present invention also relates to recombinant host cells comprising a nucleic acid of the invention, in particular a recombinant vector comprising a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 69 or SEQ ID NO: 70 or a nucleic acid of complementary polynucleotide.

구체적으로, 본 발명은 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의의 하나를 포함하는 핵산, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.Specifically, the present invention provides a recombinant comprising a nucleic acid comprising any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a nucleic acid of a complementary polynucleotide sequence. It relates to a recombinant host cell comprising a vector.

본 발명은 또한 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의의 하나로 표시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also includes nucleic acids comprising polynucleotide sequences represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or nucleic acids of complementary polynucleotide sequences. It relates to a recombinant host cell comprising a recombinant vector.

본 발명은 또한 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357을 포함하는 핵산, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also relates to a recombinant host cell comprising a nucleic acid comprising nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a recombinant vector comprising a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한, 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also relates to a recombinant host cell comprising a recombinant vector comprising a nucleic acid encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID 71.

본 발명은 또한, 서열번호 71의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also relates to a recombinant host cell comprising a recombinant vector comprising a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid of SEQ ID 71.

본 발명은 또한 서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 이들의 펩타이드 단편 또는 이들의 변이체의 제조방법에 관한 것이며, 여기에서 펩타이드 단편 또는 변이체는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하고, 상기 방법은The present invention also relates to a method for preparing a polypeptide comprising an amino acid of any one of SEQ ID NOs: 71 and 89-102, or a peptide fragment thereof or a variant thereof, wherein the peptide fragment or variant is an amino acid of SEQ ID NO: 71 1-60, wherein the method

a)폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 적당한 벡터 중으로 삽입시키고;a) inserting the nucleic acid encoding the polypeptide into a suitable vector;

b)적당한 배양 배지 중에서, 사전에 형질전환된 숙주세포를 배양하거나 숙주세포를 단계 a)의 재조합 벡터로 형질감염시키며;b) in a suitable culture medium, culturing the previously transformed host cell or transfecting the host cell with the recombinant vector of step a);

c)조건부 배양 배지를 회수하거나 숙주세포를 예를 들면, 초음파 처리나 삼투 쇼크에 의해 용해시키며;c) recovering the conditional culture medium or lysing the host cells, for example by sonication or osmotic shock;

d)배양 배지로부터 또는 이와 달리 단계 c)에서 수득한 세포 용해물로부터 폴리펩타이드를 분리 정제한 다음;d) separating and purifying the polypeptide from the culture medium or otherwise from the cell lysate obtained in step c);

e)경우에 따라, 생성된 재조합 폴리펩타이드를 특징규명하는 단계를 포함한다.e) optionally, characterizing the resulting recombinant polypeptide.

본 발명의 특정 양태는 서열번호 71의 아미노산 1-60의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.Certain embodiments of the present invention relate to a method for preparing a polypeptide comprising the amino acid sequence of amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 "상동성"으로 불리는 폴리펩타이드도 본 발명의 일부를 구성한다. 이러한 상동성 폴리펩타이드는 서열번호 71의 아미노산 1-60에 대해, 등가 아미노산에 의한 하나 이상의 아미노산 치환을 보유하는 아미노산 서열을 포함한다.Polypeptides having an amino acid sequence comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71 and polypeptides referred to as “homology” also form part of the invention. Such homologous polypeptides comprise an amino acid sequence that retains one or more amino acid substitutions by equivalent amino acids, relative to amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드는 특히 1)서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 2)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드, 3)서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 단편 또는 변이체(여기에서, 폴리펩타이드 단편 또는 변이체는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다), 또는 4)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드에 "상동성"으로 불리는 폴리펩타이드를 포함한다.ABC1 polypeptide according to the present invention in particular 1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 71 and 89-102, 2) a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, 3) SEQ ID NO: Polypeptide fragment or variant of the polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of 71 and 89-102, wherein the polypeptide fragment or variant comprises amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, or 4) SEQ ID NO: Polypeptides comprising amino acids 1-60 of 71 include polypeptides referred to as “homology”.

특정 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 1)서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 2)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드, 3)서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 단편 또는 변이체(여기에서, 폴리펩타이드 단편 또는 변이체는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다), 또는 4)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드에 "상동성"으로 불리는 폴리펩타이드에 대한 것이다.In certain embodiments, an antibody according to the invention comprises: 1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 71 and 89-102, 2) a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, 3) a sequence Polypeptide fragment or variant of the polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of Nos. 71 and 89-102, wherein the polypeptide fragments or variants include amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, or 4) To a polypeptide called “homology” to a polypeptide comprising amino acids 1-60 of number 71.

본 발명은 1)서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 2)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드, 3)서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 단편 또는 변이체(여기에서, 폴리펩타이드 단편 또는 변이체는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다), 또는 4)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드에 "상동성"으로 불리는 폴리펩타이드에 대한 항체에 대한 것으로, 본 발명의 일부를 형성하며, 트리오마 기술로 또는 Kozbor 등(1983b)에 의해 기술된 하이브리도마 기술로 생성된다.The present invention relates to a polypeptide comprising: 1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 71 and 89-102, 2) a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, 3) of SEQ ID NOs: 71 and 89-102 Polypeptide fragment or variant of a polypeptide comprising any one amino acid sequence, wherein the polypeptide fragment or variant comprises amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, or 4) amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71 An antibody against a polypeptide called “homology” to a polypeptide comprising: forms part of the invention and is produced by a trioma technique or by a hybridoma technique described by Kozbor et al. (1983b). .

따라서, 본 발명의 주제는 또한, 샘플내 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 존재 검출방법이며, 방법은Accordingly, the subject of the invention is also a method for detecting the presence of a polypeptide according to the invention in a sample, the method of

a)시험하고자 하는 샘플을 1)서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 2)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드, 3)서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 단편 또는 변이체(여기에서, 폴리펩타이드 단편 또는 변이체는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다), 또는 4)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드에 "상동성"으로 불리는 폴리펩타이드에 대한 항체와 접촉시킨 다음,a) a sample to be tested comprises 1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 71 and 89-102, 2) a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, 3) SEQ ID NO: 71 and Polypeptide fragment or variant of the polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of 89-102, wherein the polypeptide fragment or variant comprises amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, or 4) of SEQ ID NO: 71 Contacting a polypeptide comprising amino acids 1-60 with an antibody against a polypeptide called " homology "

b)형성된 항원/항체 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.b) detecting the formed antigen / antibody complex.

본 발명은 또한 샘플내 본 발명에 따른 폴리펩타이드 존재의 진단 또는 검출용 박스 또는 키트에 관한 것으로, 박스는The invention also relates to a box or kit for diagnosing or detecting the presence of a polypeptide according to the invention in a sample, wherein the box is

a) 1)서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 2)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드, 3)서열번호71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 단편 또는 변이체(여기에서, 폴리펩타이드 단편 또는 변이체는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다), 또는 4)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드에 "상동성"으로 불리는 폴리펩타이드에 대한 항체, 및a) a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 71 and 89-102, 2) a polypeptide comprising the amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, 3) any of SEQ ID NOs: 71 and 89-102 Polypeptide fragments or variants of the polypeptide comprising one amino acid sequence, wherein the polypeptide fragments or variants include amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, or 4) amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71 An antibody against a polypeptide referred to as "homology" to a containing polypeptide, and

b)형성된 항원/항체 복합체의 검출을 허용하는 시약을 포함한다.b) reagents that allow detection of the formed antigen / antibody complex.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid according to the invention.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 약학 조성물 및 탠지어병 및/또는 FHD병과 같은 콜레스테롤 역수송 결핍과 연관된 질환의 치료를 위한 본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.The invention also includes a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid encoding an ABC1 polypeptide according to the invention and an ABC1 polypeptide according to the invention for the treatment of diseases associated with cholesterol back transport deficiency such as tangerine disease and / or FHD disease. It provides a pharmaceutical composition.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 생체내에서 전달 및 발현하는, 콜레스테롤 수송과 연관된 병리의 치료를 위한 새로운 치료법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 탠지어병 및/또는 FHD병과 연관된 HDL 결핍, HDL 결핍, LCAT 결핍, 말라리아, 및 당뇨병과 같은, HDL 결핍의 치료 및/또는 예방을 위한 새로운 치료법을 제공한다.The present invention also relates to novel therapies for the treatment of pathologies associated with cholesterol transport, in vivo delivery and expression of nucleic acids encoding the ABC1 protein according to the invention. In particular, the present invention provides new therapies for the treatment and / or prevention of HDL deficiencies, such as HDL deficiency, HDL deficiency, LCAT deficiency, malaria, and diabetes associated with Tangerine disease and / or FHD disease.

따라서, 본 발명은 콜레스테롤의 수송 및 대사의 이상과 연관된 심혈관 및 신경학적 병리의 치료 및 예방을 위한 새로운 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 환자 또는 피검자의 콜레스테롤의 향상된 역수송을 복구하거나 촉진하는 방법을 제공한다.Accordingly, the present invention provides new methods for the treatment and prevention of cardiovascular and neurological pathologies associated with abnormalities in the transport and metabolism of cholesterol. In particular, the present invention provides a method for repairing or promoting enhanced back transport of cholesterol in a patient or subject.

결과적으로, 본 발명은 또한 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 하나 이상의 생리학적으로 적합한 비히클 및/또는 부형제와 함께 포함하는, 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 피검자의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.As a result, the present invention also relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating a subject suffering from reverse transport dysfunction of cholesterol, comprising a nucleic acid encoding the ABC1 protein together with one or more physiologically suitable vehicles and / or excipients.

본 발명의 특정 양태에 따라, ABC1 단백질의 생체내 생산을 위한 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 생리학적으로 적합한 비히클 및/또는 부형제 중의 용액으로, 적당한 조절 서열의 조절하에 놓인 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다.According to certain embodiments of the present invention, a composition for in vivo production of ABC1 protein is provided. Such compositions comprise nucleic acids encoding ABC1 polypeptides that are placed under the control of appropriate regulatory sequences, in solution in a physiologically suitable vehicle and / or excipient.

따라서, 본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 핵산은 적당한 조절 요소의 조절하에 배치된다.Accordingly, the present invention also relates to a composition comprising a nucleic acid encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71, wherein the nucleic acid is arranged under the control of appropriate regulatory elements.

본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 핵산은 적당한 조절 요소의 조절하에 배치된다.The invention also relates to a composition comprising a nucleic acid encoding a polypeptide comprising a amino acid of SEQ ID NO: 71, wherein the nucleic acid is arranged under the control of an appropriate regulatory element.

바람직하게는, 그러한 조성물은 적당한 조절 요소의 조절하에 배치된, 서열번호 69 또는 서열번호 70의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함할 것이다.Preferably such compositions will comprise nucleic acids comprising the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 69 or SEQ ID NO: 70, arranged under the control of appropriate regulatory elements.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 하나 이상의 생리학적으로 적합한 비히클 및/또는 부형제와 함께 포함하는, 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 피검자의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.The invention also relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of a subject suffering from reverse transport dysfunction of cholesterol, comprising the recombinant vector according to the invention together with one or more physiologically suitable vehicles and / or excipients.

또다른 양태에 따라, 본 발명의 주제는 또한 콜레스테롤 대사, 구체적으로는콜레스테롤의 수송, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송에 있어서의 결핍에 의해 야기된 질환의 에방적 또는 치유적 치료방법이며, 이러한 방법은 본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 환자에 투여하는 단계를 포함하며, 핵산은 경우에 따라 하나 이상의 생리학적으로 적합한 비히클 및/또는 부형제와 배합된다.According to another aspect, the subject of the present invention is also a method for the prevention or curative treatment of diseases caused by deficiency in cholesterol metabolism, specifically in the transport of cholesterol, more specifically in the transport of cholesterol. Administering to the patient a nucleic acid encoding an ABC1 polypeptide according to the invention, wherein the nucleic acid is optionally combined with one or more physiologically suitable vehicles and / or excipients.

본 발명은 하나 이상의 생리학적으로 적합한 비히클 및/또는 부형제와 배합된, 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드 치료 유효량을 포함하는, 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 환자 또는 피검자의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention provides a method for treating cholesterol, comprising a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 71 or a polypeptide therapeutically effective amount comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71 in combination with one or more physiologically suitable vehicles and / or excipients. The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating a patient or a subject suffering from reverse transport dysfunction.

구체적 양태에 따라, 본 발명에 따른 핵산을 숙주세포, 특히 포유동물로부터 생체내에서 수득한 숙주세포에 도입하는 방법은, 적당한 조절 서열의 조절하에 놓인, 약학적으로 적합한 벡터 및 본 발명에 따른 "네이키드" 핵산을 포함하는 제제를 국소 주사에 의해 선택된 조직, 예를 들면 평활근 조직 수준에서 도입시키는 단계를 포함하며, "네이키드" 핵산은 상기 조직의 세포에 의해 흡수된다.According to a specific embodiment, a method for introducing a nucleic acid according to the invention into a host cell, in particular a host cell obtained in vivo from a mammal, comprises a pharmaceutically suitable vector and according to the invention under the control of appropriate regulatory sequences. Introducing an agent comprising a naked "nucleic acid at the level of a selected tissue, eg, smooth muscle tissue, by topical injection, wherein the" naked "nucleic acid is taken up by cells of said tissue.

또다른 양태에 따라, 본 발명의 주제는 또한 콜레스테롤 대사, 구체적으로는 콜레스테롤의 수송, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송에 있어서의 결핍에 의해 야기된 질환의 예방적 또는 치유적 치료방법이며, 이러한 방법은 본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드 치료 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함하며, 폴리펩타이드는 경우에 따라 하나 이상의 생리학적으로 적합한 비히클 및/또는 부형제와 배합된다.According to another aspect, the subject matter is also a prophylactic or curative treatment of a disease caused by deficiency in cholesterol metabolism, specifically in the transport of cholesterol, more specifically in the transport of cholesterol. Administering to a patient a therapeutically effective amount of an ABC1 polypeptide according to the invention, wherein the polypeptide is optionally combined with one or more physiologically suitable vehicles and / or excipients.

바람직하게는, 본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물이 환자에 투여될 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 아테롬성동맥경화증과 같은 콜레스테롤 대사, 특히 콜레스테롤의 수송, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 결핍의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 이들은 정상 ABC1 폴리펩타이드, 특히 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 치료 유효량을 포함함을 특징으로 한다. 특정 양태에서, ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다.Preferably, the pharmaceutical composition comprising the ABC1 polypeptide according to the present invention will be administered to a patient. Accordingly, the present invention also relates to pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of cholesterol metabolism such as atherosclerosis, in particular the transport of cholesterol, more particularly the deficiency of the reverse transport of cholesterol, which are normal ABC1 polypeptides, in particular amino acids of SEQ ID NO: 71 A therapeutically effective amount of a nucleic acid encoding an ABC1 polypeptide having a sequence. In certain embodiments, the ABC1 polypeptide comprises amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

본 발명의 주제는 또한 아테롬성동맥경화증과 같은 콜레스테롤 대사, 특히 콜레스테롤의 수송, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 결핍의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 이들은 정상 ABC1 폴리펩타이드, 특히 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 치료 유효량을 포함함을 특징으로 한다. 특정 양태에서, ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다.The subject matter also relates to pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of cholesterol metabolism such as atherosclerosis, in particular the transport of cholesterol, more specifically the deficiency of the transport of cholesterol, which is a normal ABC1 polypeptide, in particular the amino acid of SEQ ID 71 A therapeutically effective amount of a polypeptide having a sequence. In certain embodiments, the ABC1 polypeptide comprises amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

본 발명은 또한, 치료적인 관점에서 아테롬성동맥경화증에 효과적으로 대처하도록 콜레스테롤의 향상된 역수송을 복구하거나 촉진할 수 있는 ABC1 폴리펩타이드의 효능제 및 길항제를 동정하기 위해 ABC1 단백질상에 작용하는 소형 분자 및 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 콜레스테롤의 대사, 특히 콜레스테롤의 수송, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송에 있어서의 결핍으로 인한 질환, 예를 들면, 탠지어병, 좀더 일반적으로는 FHD형 증상의 치료에 있어 치료적 사용을 위한 소형 분자 및 화합물의 동정에 유용하다.The present invention also provides small molecules and compounds that act on ABC1 protein to identify agonists and antagonists of the ABC1 polypeptide that are capable of repairing or promoting enhanced back transport of cholesterol to effectively cope with atherosclerosis from a therapeutic standpoint. It provides a method of screening. This method has been used therapeutically in the treatment of diseases caused by deficiencies in the metabolism of cholesterol, in particular the transport of cholesterol, more specifically the reverse transport of cholesterol, such as tangerine disease, and more generally FHD type symptoms. It is useful for the identification of small molecules and compounds.

따라서, 본 발명은 또한, 콜레스테롤의 역수송 기능장애로부터 연유하는 질환의 예방 또는 치료를 위한 활성 성분을 스크리닝하기 위한, ABC1 폴리펩타이드 또는 본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 용도에 관한 것이다.Accordingly, the present invention also relates to the use of ABC1 polypeptides or cells expressing ABC1 polypeptides according to the invention for the screening of active ingredients for the prevention or treatment of diseases resulting from the reverse transport dysfunction of cholesterol.

본 발명은 또한, 콜레스테롤의 대사에 활성을 보이는 화합물 또는 소형 분자, ABC1 폴리펩타이드의 효능제 또는 길항제를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:The present invention also relates to a method for screening a compound or small molecule, an agonist or antagonist of ABC1 polypeptide, which is active in the metabolism of cholesterol, the method comprising the following steps:

a)ABC1 폴리펩타이드 및 검출 가능한 마커를 포함하는 지질 기질을 포함하는 막 소포의 제조 단계;a) preparing a membrane vesicle comprising a lipid substrate comprising an ABC1 polypeptide and a detectable marker;

b)단계 a)에서 수득한 소포를 효능제 또는 길항제 후보 화합물과 배양 단계;b) culturing the vesicle obtained in step a) with an agonist or antagonist candidate compound;

c)검출 가능한 마커를 포함하는 지질 기질 방출의 정성적 및/또는 정량적 측정 단계; 및c) qualitative and / or quantitative measurement of lipid substrate release comprising a detectable marker; And

d)효능제 또는 길항제 후보 화합물과 사전에 배양하지 않은 소포에 의한 표지 지질 기질의 방출 측정과 단계 b)에서 수득한 방출 측정치의 비교 단계.d) measuring the release of the labeled lipid substrate by vesicles not previously cultured with the agonist or antagonist candidate compound and comparing the release measurements obtained in step b).

제 1 특정 양태에서, ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 71을 포함한다.In a first specific embodiment, the ABC1 polypeptide comprises SEQ ID NO: 71.

제 2 특정 양태에서, ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다.In a second specific embodiment, the ABC1 polypeptide comprises amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

본 발명은 또한, 콜레스테롤의 대사에 활성을 띠는 화합물 또는 소형 분자, ABC1 폴리펩타이드의 효능제 또는 길항제를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 방법은 하기 단계를 포함한다:The invention also relates to a method for screening a compound or small molecule active in the metabolism of cholesterol, an agonist or antagonist of ABC1 polypeptide, the method comprising the following steps:

a)본래부터 또는 ABC1 암호화 핵산으로 세포를 형질감염시킨 후, ABC1 폴리펩타이드를 발현하는 세포, 예를 들면 세포주를 수득하는 단계;a) transfecting cells natively or with ABC1 encoding nucleic acid, followed by obtaining cells expressing ABC1 polypeptide, eg, cell lines;

b)검출 가능한 마커로 표지된 음이온의 존재하에 단계 a)의 세포 배양 단계;b) culturing the cell of step a) in the presence of an anion labeled with a detectable marker;

c)단계 b)의 세포를 세척하여 이들 세포 중으로 침투하지 않은 과량의 표지 음이온 제거 단계;c) washing the cells of step b) to remove excess labeled anions that did not penetrate into these cells;

d)단계 c)에서 수득한 세포를 ABC1 폴리펩타이드를 위한 효능제 또는 길항제 후보 화합물과 배양하는 단계;d) culturing the cells obtained in step c) with an agonist or antagonist candidate compound for ABC1 polypeptide;

e)표지된 음이온의 유출 측정 단계; 및e) measuring the outflow of labeled anions; And

f)ABC1 폴리펩타이드에 대한 효능제 또는 길항제 후보 화합물의 존재하에 사전에 배양하지 않은 세포로 측정한 표지 음이온의 유출치와 단계 e)에서 측정된 표지 음이온의 유출치의 비교 단계.f) comparing the outflow of the labeling anion measured with cells not previously cultured in the presence of an agonist or antagonist candidate compound for the ABC1 polypeptide and the outflow of the labeling anion measured in step e).

제 1 특정 양태에서, ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 71을 포함한다.In a first specific embodiment, the ABC1 polypeptide comprises SEQ ID NO: 71.

제 2 특정 양태에서, ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다.In a second specific embodiment, the ABC1 polypeptide comprises amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

본 발명의 주제는 콜레스테롤의 대사에 활성을 띠는 화합물 또는 소형 분자, ABC1 폴리펩타이드의 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법이며, 이러한 방법은 하기의 단계를 포함한다:Subject of the invention is a method of screening for compounds or small molecules active in the metabolism of cholesterol, agonists or antagonists of the ABC1 polypeptide, the method comprising the following steps:

a)정제된 인간 알부민의 존재하에, 적당한 배양 배지에서 인간 단핵구 세포주의 세포 배양 단계;a) cell culturing the human monocyte cell line in a suitable culture medium in the presence of purified human albumin;

b)동시에 IL-1 베타의 생성을 자극하는 화합물 및 효능제 또는 길항제 후보화합물의 존재하에 단계 a)의 세포 배양 단계;b) the cell culture step of step a) in the presence of a compound which simultaneously stimulates the production of IL-1 beta and an agonist or antagonist candidate compound;

c)적정 농도의 ATP 존재하에 단계 b)에서 수득한 세포의 배양;c) culturing the cells obtained in step b) in the presence of appropriate concentrations of ATP;

d)세포 배양 상등액 중으로 방출된 IL-1 베타의 측정; 및d) measurement of IL-1 beta released into cell culture supernatant; And

e)효능제 또는 길항제 후보 화합물의 존재하에 사전에 배양하지 않은 세포의 배양 상등액 중으로 방출된 IL-1 베타의 값과 단계 d)에서 수득한 IL-1 베타의 방출치를 비교하는 단계.e) comparing the value of IL-1 beta released into the culture supernatant of cells not previously cultured in the presence of an agonist or antagonist candidate compound with the release of IL-1 beta obtained in step d).

본 발명은 동맥경화증과 같은 콜레스테롤 대사 기능장애 유도 질환, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤 역수송의 붕괴, 및 좀더 구체적으로는 탠지어병과 같은 가족성 HDL 결핍(FHD)과 연관된 병리의 원인 유전자인 ABC1 유전자의 다양한 엑손과 인트론에 상응하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 신규의 완전 길이 ABC1 단백질을 암호화하는 ABC1 cDNA에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 일반적으로 ABC1 유전자에서 또는 ABC1 유전자의 대립유전자형에 의해 생성된 상응하는 단백질에서의 다형성, 특히 돌연변이의 검출수단에 관한 것이다.The present invention relates to a variety of ABC1 genes, which are causes of cholesterol metabolic dysfunction disorders such as atherosclerosis, more specifically, disruption of cholesterol back transport, and more specifically pathologies associated with familial HDL deficiency (FHD), such as Tangier disease. It relates to nucleic acids corresponding to exons and introns. The present invention also relates to ABC1 cDNA encoding the novel full length ABC1 protein. The invention also relates generally to means for detecting polymorphisms, in particular mutations, in the ABC1 gene or in the corresponding protein produced by the allele of the ABC1 gene.

도 1: ABC1 5′cDNA 연장 전략;1: ABC1 5 ′ cDNA extension strategy;

도 2: 1차 및 2차 인간 ABC1 5′cDNA 연장 PCR 반응의 아가로스 겔 분석;Figure 2: Agarose gel analysis of primary and secondary human ABC1 5'cDNA extension PCR reactions;

도 3: 네스팅(nested) 2차 인간 ABC1 5′cDNA 연장 네스팅 PCR 반응의 아가로스 겔 분석;Figure 3: Agarose gel analysis of nested secondary human ABC1 5'cDNA extended nesting PCR reactions;

도 4: 아포지방단백질의 부재하 ■또는 존재하 □인간 완전 길이 ABC1 단백질을 발현하는 헬라 세포주에서 콜레스테롤 유출의 측정;Figure 4: Determination of cholesterol efflux in HeLa cell lines expressing human full length ABC1 protein in the absence or presence of apolipoproteins;

도 5: 아포지방단백질의 부재하 ■또는 존재하 □인간 완전 길이 ABC1 단백질을 발현하는 헬라 세포주에서 인지질 유출의 측정;Figure 5: Determination of phospholipid efflux in HeLa cell lines expressing human full length ABC1 protein in the absence or presence of apolipoproteins;

도 6a: 아포지방단백질 A-I(AI)의 부재하 ■또는 존재하 □콜레스테롤 유출의 측정;Figure 6a: Determination of Cholesterol Runoff in the absence or presence of apo lipoprotein A-I (AI);

도 6b: 아포지방단백질 A-I(AI)의 부재하 ■또는 존재하 □인지질 유출의 측정;Figure 6b: Measurement of phospholipid outflow in the absence or presence of apo lipoprotein A-I (AI);

도 6c: HDL의 부재하 ■또는 존재하 □콜레스테롤 유출의 측정;FIG. 6C: Measurement of Cholesterol efflux with or without HDL;

도 6d: 포스파티딜콜린(PC)의 부재하 ■또는 존재하 □콜레스테롤 유출의 측정;Figure 6D: Measurement of Cholesterol efflux in the absence or presence of phosphatidylcholine (PC);

도 7: 〔125I〕apoA-I 배양된 ABC1 세포가 아포지방단백질의 부재하 □, 아포지방단백질 A-I(apoA-I)의 존재하 ■또는 아포지방단백질 A-II(apo-II)의 존재하 ▣에 배치된다.Fig. 7: [ 125 I] apoA-I cultured ABC1 cells in the absence of apofatty protein □, in the presence of apofatty protein AI (apoA-I) or the presence of apofatty protein A-II (apo-II) Is placed in Ha.

일반적 정의General definition

본 발명은 ABC1의 완전 길이형, 또는 천연형, 및 동물, 특히 포유동물 또는 조류, 좀더 구체적으로는 인간 기원으로부터의 항원 단편을 포함하여, 본 발명의 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자의 분리를 고려한다.The present invention contemplates the isolation of genes encoding the ABC1 polypeptides of the invention, including antigenic fragments from the full length, or native form, of ABC1, and from animals, particularly mammals or birds, more specifically of human origin. do.

본 발명에 따라, 통상의 분자생물학, 미생물학, 및 당업계 기술내의 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al., 1989; Glover, 1985; Gait, 1984; Hames and Higgins, 1985; Hames and Higgins, 1984; Freshney, 1986; Perbal, 1984; and F. Ausubel et al., 1994].According to the present invention, conventional molecular biology, microbiology, and recombinant DNA techniques within the art can be used. Such techniques are described in detail in the literature. See, eg, Sambrook et al., 1989; Glover, 1985; Gait, 1984; Hames and Higgins, 1985; Hames and Higgins, 1984; Freshney, 1986; Perbal, 1984; and F. Ausubel et al., 1994].

따라서, 본원에서 나타날 경우, 하기의 용어는 후술되는 정의를 갖는다.Thus, when appearing herein, the following terms have the definitions set forth below.

본원에서 사용되는 "유전자"란 용어는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드의 조립체를 의미하고, cDNA 및 게놈 DNA 핵산을 포함한다.As used herein, the term "gene" refers to an assembly of nucleotides encoding a polypeptide and includes cDNA and genomic DNA nucleic acids.

본 발명의 목적상 "분리된"이란 용어는 최초 환경(본래 존재하던 환경)으로부터 제거되어진 생물학적 물질(핵산 또는 단백질)을 지칭한다.For the purposes of the present invention, the term "isolated" refers to a biological material (nucleic acid or protein) that has been removed from its original environment (the environment in which it originally existed).

예를 들면, 식물 또는 동물 내에 자연상태로 존재하는 폴리뉴클레오타이드는 분리되어 있지 않다. 식물 또는 동물의 게놈에 자연적으로 삽입되어 있는 인접 핵산으로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드는 "분리된"으로 간주된다.For example, polynucleotides that exist naturally in plants or animals are not isolated. Identical polynucleotides isolated from adjacent nucleic acids that are naturally inserted into the genome of a plant or animal are considered "isolated".

그러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터에 포함될 수도 있고/있거나 그러한 폴리뉴클레오타이드는 조성물에 포함될 수도 있으나, 그럼에도 불구하고 벡터나 조성물이 자연 환경을 구성하지 않는다는 사실 때문에 분리된 상태로 남아있다.Such polynucleotides may be included in the vector and / or such polynucleotides may be included in the composition but nevertheless remain separated due to the fact that the vector or composition does not constitute a natural environment.

"정제된"이란 용어는 다른 화합물의 존재를 배제하여 절대 순도를 보이는 형태로 물질이 존재할 것을 요하지는 않는다. 이것은 오히려 상대적 정의이다.The term "purified" does not require the presence of a substance in a form that exhibits absolute purity, excluding the presence of other compounds. This is rather a relative definition.

폴리뉴클레오타이드는 적어도 1, 바람직하게는 2 또는 3 및 바람직하게는 4 또는 5배 크기 순서에 의해 출발 물질 또는 자연 물질의 정제 후에 "정제된" 상태로 있다.The polynucleotides are in a "purified" state after purification of the starting material or natural material by at least one, preferably two or three and preferably four or five fold order of magnitude.

본 발명의 목적상, "뉴클레오타이드 서열"이란 표현은 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산을 지칭하는 데 사용될 수 있다. "뉴클레오타이드 서열"이란 표현은 유전 물질 자체를 포함하며, 따라서 이의 서열에 관한 정보에 국한되지 않는다.For the purposes of the present invention, the expression “nucleotide sequence” can be used to refer to a polynucleotide or nucleic acid. The expression "nucleotide sequence" includes the genetic material itself and is therefore not limited to information about its sequence.

"핵산", "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드 서열"이란 용어는 RNA, DNA, gDNA 또는 cDNA 서열, 또는 대안적으로 한 종 이상의 뉴클레오타이드의 RNA/DNA 하이브리드 서열을 포함하며, 일본쇄형 또는 이중나선, 이본쇄형일 수 있다.The terms “nucleic acid”, “polynucleotide”, “oligonucleotide” or “nucleotide sequence” include RNA, DNA, gDNA or cDNA sequences, or alternatively RNA / DNA hybrid sequences of one or more nucleotides, and are single-chain Or double helix, double-stranded.

"핵산"은 뉴클레오타이드로 불리는 공유결합된 서브유닛으로 구성된 중합체 화합물이다. 핵산은 폴리리보핵산(RNA) 및 폴리데옥시리보핵산(DNA)을 포함하며,양자 모두 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA, 반합성 DNA일 수 있다. 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 센스 서열 또는 암호화 서열로 불린다."Nucleic acid" is a polymeric compound composed of covalently bonded subunits called nucleotides. Nucleic acids include polyribonucleic acid (RNA) and polydeoxyribonucleic acid (DNA), both of which may be single or double stranded. DNA may be cDNA, genomic DNA, synthetic DNA, semisynthetic DNA. The sequence of nucleotides encoding a protein is called a sense sequence or coding sequence.

"뉴클레오타이드"란 용어는 천연 뉴클레오타이드 (A, T, G, C) 및, (1)퓨린의 동족체, (2)피리미딘의 동족체, 또는 (3)유사 당과 같은 적어도 하나의 변형을 포함하는 변형된 뉴클레오타이드 모두를 지칭하며, 상기 변형된 뉴클레오타이드의 실례는, 예를 들면, PCT 출원번호 제 WO95/04 064 호에 기술되어 있다.The term “nucleotide” includes modifications comprising at least one modification, such as natural nucleotides (A, T, G, C) and (1) homologues of purine, (2) homologues of pyrimidine, or (3) analogous sugars. And all modified nucleotides, examples of such modified nucleotides are described, for example, in PCT Application No. WO95 / 04 064.

본 발명의 목적상, 첫번째 폴리뉴클레오타이드는, 첫번째 뉴클레오타이드의 각 염기가 반대의 배향을 가진 두번째 폴리뉴클레오타이드의 상보적 염기와 쌍을 이룰 때, 두번째 폴리뉴클레오타이드에 "상보적"이라고 간주된다. 상보적 염기는 A와 T (또는 A와 U), 또는 C와 G 이다.For the purposes of the present invention, the first polynucleotide is considered "complementary" to the second polynucleotide when each base of the first nucleotide is paired with the complementary base of the second polynucleotide with the opposite orientation. Complementary bases are A and T (or A and U), or C and G.

"이종" DNA란 세포에, 또는 세포의 염색체 부위에는 본래적으로 위치하지 않는 DNA를 의미한다. 바람직하게는, 이종 DNA는 세포에 대한 외래성 유전자를 포함한다."Heterologous" DNA refers to DNA that is not natively located in a cell or in a chromosomal site of a cell. Preferably, the heterologous DNA comprises a foreign gene for the cell.

본원에서 사용되는, 문법적인 형태 및 철자 변형 모두에서의 "상동성"이란 용어는 수퍼훼밀리로부터의 단백질(예를 들면, 면역글로불린 수퍼훼밀리) 및 상이한 종으로부터의 상동성 단백질(예를 들면, 마이오신 경쇄 등)(Reeck et al., 1987)을 포함하여, "공통 진화 기원"을 갖는 단백질간의 관계를 말한다. 높은 서열유사도가 반영하듯이, 그러한 단백질 (및 이들의 암호화 유전자)는 서열 상동성을 갖는다.As used herein, the term “homology” in both grammatical form and spelling modifications refers to proteins from the superfamily (eg, immunoglobulin superfamily) and homologous proteins from different species (eg, Light chains, etc. (Reeck et al., 1987), and the relationship between proteins having a "common evolutionary origin". As high sequence similarity reflects, such proteins (and their coding genes) have sequence homology.

따라서, 모든 문법적 형태에서의 "서열 유사성"이란 용어는 공통 진화 기원을 공유하거나 공유하지 않을 수 있는 단백질의 아미노산 서열 또는 핵산간의 동일성 또는 상응성 정도를 말한다(Reeck et al., 상기문헌 참조). 그러나, 공통 용법 및 본 출원에서, "상동성"이란 용어는 "고도로"와 같은 부사로 변형될 때, 서열 유사성을 의미할 수도 있으며, 공통 진화 기원을 의미하지는 않는다.Thus, the term "sequence similarity" in all grammatical forms refers to the degree of identity or correspondence between amino acid sequences or nucleic acids of a protein that may or may not share a common evolutionary origin (Reeck et al., Supra). However, in common usage and the present application, the term “homology” may mean sequence similarity when modified with an adverb such as “highly” and does not mean a common evolutionary origin.

특정 양태에서, 뉴클레오타이드의 적어도 약 50%(바람직하게는 적어도 약 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90 또는 95%)가 DNA 서열의 규정된 길이에 걸쳐서 매치될 때 두 DNA 서열은 "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"하다. 실질적으로 상동한 서열은 서열 데이터 뱅크에서 이용 가능한 표준 소프트웨어를 사용하여 서열을 비교하거나, 또는 예를 들면, 특정 시스템에 대해 정의된 바와 같은 엄중 조건하에서의 서던 하이브리드화 실험에서 동정될 수 있다. 적당한 하이브리드화 조건의 정의는 당업계 기술 안에 있다. 예를 들면, 문헌 Maniatis et al., supra; Glover et al., 1985; Hames and Higgins, 1985 참조.In certain embodiments, two DNA sequences are “substantially homologous” when at least about 50% (preferably at least about 75%, more preferably at least about 90 or 95%) of the nucleotides are matched over a defined length of the DNA sequence. "Or" substantially similar ". Substantially homologous sequences can be compared using standard software available in the Sequence Data Bank, or identified in Southern hybridization experiments under stringent conditions, eg, as defined for a particular system. The definition of suitable hybridization conditions is within the skill of the art. See, eg, Maniatis et al., Supra; Glover et al., 1985; See Hames and Higgins, 1985.

이와 마찬가지로, 특정 양태에서, 아미노산의 30% 이상이 동일할 때 또는 약 60% 이상이 유사할 때(기능상 동일) 두 아미노산 서열은 "실질적으로 상동성" 또는 "실질적으로 유사"하다. 바람직하게는, 유사하거나 상동성인 서열은 예를 들면, GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) 파일업 프로그램을 이용하여 정렬시킴으로써 동정된다.Likewise, in certain embodiments, two or more amino acid sequences are "substantially homologous" or "substantially similar" when at least 30% of the amino acids are identical or at least about 60% are similar (functionally identical). Preferably, similar or homologous sequences are identified by alignment using, for example, a Genetic Computer Group, Program Manual for GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin (GCG) fileup program.

본 발명의 목적상 두 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열간의 "% 동일성"은 비교창을 통해, 최적으로 정렬된 두 서열을 비교함으로써 측정될 수 있다.For the purposes of the present invention, "% identity" between two nucleotide or amino acid sequences can be determined by comparing two optimally aligned sequences through a comparison window.

따라서, 비교창에서 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 부분은 두 서열의 최적 정렬을 수득하기 위해 기준 서열에 대하여 첨가 또는 결실(예를 들면, "갭")을 포함할 수 있다(상기 기준 서열은 이러한 첨가 또는 결실을 포함하지 않는다).Thus, the nucleotide or polypeptide sequence portion in the comparison window may include additions or deletions (eg, “gaps”) relative to the reference sequence to obtain an optimal alignment of the two sequences (the reference sequence may be such an addition or Does not include fruiting).

퍼센트는 비교된 두 서열에 대해 동일한 핵산 염기 또는 동일한 아미노산 잔기가 관찰되는 위치의 수를 측정한 다음, 두 염기 또는 아미노산 잔기 사이의 동일성이 있는 위치의 수를 비교창에서의 총 위치의 수로 나누고 퍼센트 서열 동일성을 수득하기 위해 나온 결과를 100배 함으로써 계산된다.Percent measures the number of positions where the same nucleic acid base or the same amino acid residue is observed for two compared sequences, then divides the number of positions with identity between the two bases or amino acid residues by the total number of positions in the comparison window and percent It is calculated by doubling the results obtained to obtain sequence identity.

비교용 최적 서열 정렬은 WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN사로부터의 패키지에 함유된 공지된 알고리듬의 도움으로 컴퓨터를 사용하여 달성될 수 있다.Optimal sequence alignment for comparison can be achieved using a computer with the aid of known algorithms contained in packages from WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN.

예시로써, BLAST 소프트웨어(version BLAST 1.4.9 of March 1996, BALST 2.0.4 of February 1998 and BLAST 2.0.6 of September 1998)의 도움으로, 배타적으로 디폴트 파라미터(Altschul et al. 1990; Altschul et al, 1997)를 이용하여 퍼센트 서열 동일성을 산출하는 것이 가능할 것이다. 블라스트는 Altschul et al. 알고리듬의 도움으로 기준 "청구" 서열에 대한 유사/상동 서열을 검색한다. 청구 서열과 사용된 데이터베이스는 펩타이드형 또는 핵산형일 수 있으며, 임의 조합도 가능하다.By way of example, with the help of BLAST software (version BLAST 1.4.9 of March 1996, BALST 2.0.4 of February 1998 and BLAST 2.0.6 of September 1998), exclusive default parameters (Altschul et al. 1990; Altschul et al, 1997) it will be possible to calculate percent sequence identity. Blast is described in Altschul et al. With the aid of the algorithm the similar / homologous sequences for the reference “billing” sequences are searched. The database used with the claimed sequence can be peptide or nucleic acid, and any combination.

"상응하는"이란 용어는 유사 또는 상동 서열을 의미하는 것으로 본원에서 사용되며, 정확한 위치는 유사성 또는 상동성이 측정되는 분자와 동일하거나 상이하다. 핵산 또는 아미노산 서열 정렬은 스페이스를 포함할 수 있다. 따라서, "상응하는"이란 용어는 서열 유사성을 의미하며, 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드 염기의 넘버링을 의미하지 않는다.The term "corresponding" is used herein to mean similar or homologous sequences, and the exact position is the same or different from the molecule for which similarity or homology is measured. Nucleic acid or amino acid sequence alignments can include spaces. Thus, the term "corresponding" means sequence similarity and does not mean numbering amino acid residues or nucleotide bases.

게놈 DNA든 cDNA든 본 발명의 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 임의 공급원, 특히 인간 cDNA 또는 게놈 라일브러리로부터 분리될 수 있다. 유전자 수득 방법은 전술한 바와 같이 당업계에 익히 공지되어 있다(예를 들면, Sambrook et al., 1989 참조).The genes encoding the ABC1 polypeptides of the invention, whether genomic DNA or cDNA, can be isolated from any source, in particular human cDNA or genomic rybraries. Gene harvesting methods are well known in the art as described above (see, eg, Sambrook et al., 1989).

따라서, 동물 세포는 잠재적으로 ABC1 유전자의 분자 클로닝을 위한 핵산원으로 작용할 수 있다. DNA는 클로닝된 DNA(예를 들면, DNA "라이브러리")로부터 당업계에 공지된 표준 절차에 의해 수득될 수 있고, 바람직하게는 단백질의 고수준 발현 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터, 화학 합성에 의해, cDNA 클로닝에 의해, 목적 세포로부터 정제된 게놈 DNA, 또는 이의 단편의 클로닝에 의해 수득된다(예를 들면, Sambrook et al., 1989; Glover, 1985 참조). 게놈 DNA로부터 유도된 클론은 암호화 영역 외에도 조절 및 인트론 DNA 영역을 함유할 수 있으며; cDNA로부터 유도된 클론은 인트론 서열을 함유하지 않을 것이다. 어떠한 공급원이든, 유전자는 유전자 전파를 위해 적당한 벡터 중으로 분자적으로 클로닝되어야 한다.Thus, animal cells can potentially serve as a nucleic acid source for molecular cloning of the ABC1 gene. DNA can be obtained from cloned DNA (eg, DNA "library") by standard procedures known in the art, preferably by chemical synthesis, from cDNA libraries prepared from high-level expressing tissue of proteins, by cDNA cloning, cloning of purified genomic DNA, or fragments thereof, from cells of interest (see, eg, Sambrook et al., 1989; Glover, 1985). Clones derived from genomic DNA may contain regulatory and intron DNA regions in addition to coding regions; Clones derived from cDNA will not contain intron sequences. Any source, the gene must be molecularly cloned into a vector suitable for gene propagation.

게놈 DNA로부터 유전자의 분자 클로닝에서, 일부가 목적하는 유전자를 암호화하게 될 DNA 단편이 생성된다. DNA는 다양한 제한효소를 사용하여 특정 부위에서 절단될 수 있다. 이와 달리, DNA를 단편으로 만들기 위해 망간 존재하에 DNAse를사용할 수도 있으며, 또는 DNA를 예를 들면, 초음파처리에 의해 물리적으로 전단시킬 수 있다. 이어서, 선형 DNA 단편은 아가로스 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 칼럼 크로마토그래피를 포함한(이에 국한되지 않음) 표준기술에 의해 크기별로 분리해낼 수 있다.In molecular cloning of a gene from genomic DNA, a DNA fragment is produced in which some will encode the gene of interest. DNA can be cleaved at specific sites using various restriction enzymes. Alternatively, DNAse may be used in the presence of manganese to fragment the DNA, or the DNA may be physically sheared, for example by sonication. The linear DNA fragments can then be separated by size by standard techniques, including but not limited to agarose and polyacrylamide gel electrophoresis and column chromatography.

일단 DNA 단편이 생성되면, 목적하는 ABC1 유전자를 함유하는 특정 DNA 단편의 동정은 다수의 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들면, ABC1 유전자 또는 이의 특이적 RNA, 또는 이의 단편의 일부의 양이 이용 가능하고 정제 및 표지될 수 있으면, 생성된 DNA 단편은 표지된 탐침과의 핵산 하이브리드화에 의해 스크리닝될 수 있다(Benton and Davis, 1977; Grunstein and Hogness, 1975). 예를 들면, 특정 실시예에서(후술) 수행되는 바와 같이, 또는 cDNA 또는 mRNA로서(예를 들면, RT-PCR을 위한 폴리-T 프라이머와 병용하여), ABC1 단백질에 대해 수득된 부분적인 아미노산 서열 정보에 상응하는 올리고뉴클레오타이드의 세트를 제조하여 ABC1을 암호화하는 DNA에 대한 탐침으로 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 ABC1 핵산 또는 폴리펩타이드에 고도로 특유한 단편이 선택된다. 탐침과 실질적으로 상동성인 이들 DNA 단편이 하이브리드화 하게 된다. 전술한 바와 같이, 상동성이 클수록, 더 엄격한 하이브리드화 조건이 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 엄격 하이브리드화 조건을 사용하여 상동성 ABC1 유전자를 동정한다.Once the DNA fragments are generated, identification of specific DNA fragments containing the desired ABC1 gene can be accomplished in a number of ways. For example, if the amount of a portion of the ABC1 gene or specific RNA thereof, or fragment thereof, is available and can be purified and labeled, the resulting DNA fragment can be screened by nucleic acid hybridization with a labeled probe ( Benton and Davis, 1977; Grunstein and Hogness, 1975). For example, partial amino acid sequences obtained for ABC1 protein, as performed in certain examples (described below), or as cDNA or mRNA (eg, in combination with poly-T primers for RT-PCR). A set of oligonucleotides corresponding to the information can be prepared and used as a probe for DNA encoding ABC1. Preferably, highly specific fragments of the ABC1 nucleic acid or polypeptide of the invention are selected. These DNA fragments, which are substantially homologous to the probe, will hybridize. As mentioned above, the greater the homology, the more stringent hybridization conditions can be used. In certain embodiments, stringent hybridization conditions are used to identify homologous ABC1 genes.

예를 들면, 유전자가 등전적, 전기영동적, 아미노산 조성을 갖는 단백질 산물, 또는 본원에서 개시되는 ABC1 단백질의 부분 아미노산 서열을 암호화할 경우, 유전자의 특성을 기초로 하여 추가 선택이 수행될 수 있다. 따라서, 유전자의 존재는 이의 발현 산물의 물리적, 화학적, 또는 면역학적 특성에 기초한 분석에 의해 검출될 수 있다. 예를 들면, 적당한 mRNA를 하이브리드 선택하는 cDNA 클론, 또는 DNA 클론이 선택될 수 있는데, 이는 예를 들면 유사하거나 동일한 등전점 이동, 전기영동 포커싱 또는 비-평형 pH 겔 전기영동 행동, 단백질 분해 지도, 또는 ABC1에 대해 알려진 항원 특성을 갖는 단백질을 생성한다.For example, if a gene encodes a protein product having an isoelectric, electrophoretic, amino acid composition, or a partial amino acid sequence of the ABC1 protein disclosed herein, further selection may be made based on the characteristics of the gene. Thus, the presence of a gene can be detected by analysis based on the physical, chemical, or immunological properties of its expression product. For example, cDNA clones, or DNA clones, may be selected that hybridly select the appropriate mRNA, for example similar or identical isoelectric shifts, electrophoretic focusing or non-equilibrium pH gel electrophoresis behavior, proteolytic maps, or Produce proteins with known antigenic properties for ABC1.

본 발명의 ABC1 유전자는 mRNA 선별에 의해, 즉 핵산 하이브리드화에 이은 시험관내 해독에 의해 동정될 수 있다. 이러한 절차에서, 뉴클레오타이드 단편은 하이브리드화에 의해 상보 mRNA를 분리하는 데 사용된다. 이러한 DNA 단편은 이용 가능한 정제된 ABC1 DNA를 나타낼 수 있거나, 부분 아미노산 서열 정보로부터 디자인된 합성 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 분리된 mRNA의 산물의 시험관내 해독 산물의 면역침전 분석 또는 기능 분석(예를 들면, 타이로신 포스파타제 활성)은 mRNA, 따라서 목적 서열을 함유하는 상보 DNA 단편을 동정한다. 또한, 특정 mRNA는 세포로부터 분리된 폴리솜이 본 발명의 ABC1 폴리펩타이드에 대해 특이적인 고정화된 항체에 흡착됨으로써 선별될 수 있다.ABC1 genes of the invention can be identified by mRNA selection, ie by nucleic acid hybridization followed by in vitro translation. In this procedure, nucleotide fragments are used to separate complementary mRNAs by hybridization. Such DNA fragments may represent the purified ABC1 DNA available, or may be synthetic oligonucleotides designed from partial amino acid sequence information. Immunoprecipitation assays or functional assays (eg tyrosine phosphatase activity) of the in vitro translation products of the isolated mRNA products identify the complementary DNA fragments containing the mRNA, and thus the desired sequence. In addition, certain mRNAs can be selected by adsorbing a polysome isolated from a cell to an immobilized antibody specific for the ABC1 polypeptide of the invention.

방사능표지된 ABC1 cDNA는 주형으로서 선택된 mRNA(흡착된 폴리솜으로부터)를 사용하여 합성될 수 있다. 이어서, 방사능표지된 mRNA 또는 cDNA를 탐침으로 사용하여 다른 게놈 DNA 단편으로부터 상동 ABC1 DNA 단편을 동정할 수 있다.Radiolabeled ABC1 cDNA can be synthesized using selected mRNA (from adsorbed polysomes) as a template. The radiolabeled mRNA or cDNA can then be used as a probe to identify homologous ABC1 DNA fragments from other genomic DNA fragments.

본 발명에 따른 핵산의 "변이체"는 기준 폴리뉴클레오타이드에 대하여 하나 이상의 염기가 다른 핵산을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 변이체 핵산은 자연적으로 존재하는 대립유전자 변이체와 같이 자연산일 수도 있거나, 예를 들면 돌연변이 기술에 의해 수득되는 비-자연적 변이체일 수도 있다.A “variant” of a nucleic acid according to the invention will be understood to mean a nucleic acid which differs from one or more bases relative to the reference polynucleotide. Variant nucleic acids may be naturally occurring, such as naturally occurring allelic variants, or may be, for example, non-natural variants obtained by mutation techniques.

일반적으로, 기준(일반적으로, 야생형) 핵산과 변이체 핵산간의 차이는, 기준 핵산과 변이체 핵산의 뉴클레오타이드 서열이 거의 유사하고 많은 영역에서 동일할 정도로 작다. 변이체 핵산에 존재하는 뉴클레오타이드 변형은 상기 변이체 핵산에 의해 암호화된 아미노산 서열을 바꾸지 않는 것을 의미하는 "사일런트"일 수도 있다.In general, the difference between a reference (generally wild-type) nucleic acid and a variant nucleic acid is so small that the nucleotide sequences of the reference nucleic acid and the variant nucleic acid are nearly similar and identical in many regions. Nucleotide modifications present in variant nucleic acids may be "silent" which means not altering the amino acid sequence encoded by the variant nucleic acid.

그러나, 변이체 핵산에서의 뉴클레오타이드의 변화가, 기준 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 대하여 변이체 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드에서의 치환, 첨가 또는 결실을 야기할 수도 있다. 덧붙여, 암호화 영역에서의 뉴클레오타이드 변형은 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 보존적 또는 비보존적 치환을 일으킬 수 있다.However, changes in nucleotides in variant nucleic acids may result in substitutions, additions or deletions in polypeptides encoded by variant nucleic acids relative to polypeptides encoded by reference nucleic acids. In addition, nucleotide modifications in the coding region can result in conservative or non-conservative substitutions of the amino acid sequence of the polypeptide.

바람직하게는, 본 발명에 따른 변이체 핵산은 기준 핵산의 폴리펩타이드와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 실질적으로 보존하거나 또는 초기의 기준 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 대한 항체에 의한 피인식능을 보존하는 폴리펩타이드를 암호화한다.Preferably, the variant nucleic acid according to the present invention is a polynucleotide which substantially preserves the same function or biological activity as the polypeptide of the reference nucleic acid or which is recognized by the antibody against the polypeptide encoded by the initial reference nucleic acid. Encode the peptide.

이렇게 해서 몇몇 변이체 핵산은 이의 구조적 연구가 당해 단백질의 구조-활성 관계를 추론할 수 있게끔 하는 폴리펩타이드의 돌연변이형을 암호화할 것이다. 연구된 질환에 대한 이들 변이체의 지식은, 병리의 분자적 원인을 이해할 수 있게 하므로 필수적이다.In this way some variant nucleic acids will encode a mutant type of polypeptide that allows its structural studies to infer the structure-activity relationship of the protein. Knowledge of these variants about the disease studied is essential as it allows us to understand the molecular cause of the pathology.

"단편"은 기준 핵산에 비해 감소된 길이를 갖고 공통 부분에 걸쳐서 기준 핵산과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열로 이해될 것이다. 본 발명에 따른 그러한 핵산 "단편"은 경우에 따라 그것이 구성성분이 되는 보다 더 큰 폴리뉴클레오타이드에 포함될 수도 있다. 그러한 단편은 본 발명에 따른 핵산의 보존적 뉴클레오타이드를 8, 10, 12, 15, 18, 20-25, 30, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000 또는 1500개까지의 길이에 이르는 올리고뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 이로 구성된다.A “fragment” will be understood as a nucleotide sequence having a reduced length relative to the reference nucleic acid and comprising the same nucleotide sequence as the reference nucleic acid over a consensus portion. Such nucleic acid “fragments” according to the invention may optionally be included in larger polynucleotides from which it is a constituent. Such fragments may contain up to 8, 10, 12, 15, 18, 20-25, 30, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000 or 1500 conservative nucleotides of a nucleic acid according to the present invention. Or comprise an oligonucleotide leading to

"핵산 분자"란 뉴클레오사이드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오사이드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자"), 또는 포스포로티오에이트 및 티오에스테르와 같은 이들의 포스포에스테르 동족체의 포스페이트 에스테르 중합체 형태(일본쇄형 또는 이본쇄 나선)를 의미한다. 이본쇄 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선이 가능하다. 핵산 분자 및 특히 DNA 또는 RNA 분자라는 용어는 분자의 1차 및 2차 구조를 말하며, 특정의 3차형에 제한되지 않는다. 따라서, 이 용어는 특히, 선형 또는 환상 DNA 분자(예를 들면, 제한 단편), 플라스미드, 및 염색체에서 발견되는 이본쇄 DNA를 포함한다. 특정의 이본쇄 DNA 분자의 구조를 논함에 있어서, 서열은 DNA의 비전사 본쇄(즉, mRNA에 상동한 서열을 갖는 본쇄)를 따라 5′에서 3′방향으로의 서열만을 부여하는 일반 약정에 따라 본원에서 기술될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 거친 DNA 분자이다."Nucleic acid molecule" means a nucleoside (adenosine, guanosine, uridine or cytidine; "RNA molecule") or deoxyribonucleoside (deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxythymidine, or deoxy Cytidine; "DNA molecule"), or phosphate ester polymer forms (single- or double-stranded helices) of their phosphoester homologues, such as phosphorothioates and thioesters. Double stranded DNA-DNA, DNA-RNA and RNA-RNA helices are possible. The terms nucleic acid molecule and especially DNA or RNA molecule refer to the primary and secondary structures of the molecule and are not limited to any particular tertiary type. Thus, the term specifically includes linear or cyclic DNA molecules (eg, restriction fragments), plasmids, and double-stranded DNA found in chromosomes. In discussing the structure of a particular double-stranded DNA molecule, the sequence is in accordance with the general arrangement of giving only 5 'to 3' sequences along the non-transcribed strand of DNA (ie, the strand with the sequence homologous to the mRNA). It may be described herein. A "recombinant DNA molecule" is a DNA molecule that has undergone molecular biological manipulation.

핵산의 일본쇄 형태가 온도와 용액 이온 강도의 적당한 조건하에서 타 핵산 분자와 어닐링될 수 있을 때, 핵산 분자는 cDNA, 게놈 DNA, 또는 RNA와 같은 다른핵산 분자와 "하이브리드화 가능"하다(Sambrook et al., 상기 참조). 온도와 이온 강도의 조건은 하이브리드화의 "엄격성"을 결정한다. 상동성 핵산의 예비 스크리닝을 위해, 55℃의 Tm에 상응하는 저엄격 하이브리드화 조건, 예를 들면, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.25% 밀크, 및 무 포름아미드; 또는 30% 포름아미드, 5x SSC, 0.5% SDS가 사용될 수 있다. 중간 정도의 엄격성 하이브리드화 조건은 좀더 높은 Tm, 예를 들면 40% 포름아미드, 5x 또는 6x SCC에 상응한다. 고엄격 하이브리드화 조건은 최대 Tm, 예를 들면 50% 포름아미드, 5x 또는 6x SCC에 상응한다. 하이브리드화는 두 핵산이 상보 서열을 함유할 것을 요하지만, 하이브리드화의 엄격성에 따라, 염기간의 미스매치가 가능하다. 핵산의 하이브리드화를 위한 적당한 엄격성은 당업계에 잘 알려진 변수인 핵산의 길이와 상보성 정도에 좌우된다. 두 뉴클레오타이드 서열간의 유사성 또는 상동성의 정도가 클수록, 이들 서열을 갖는 핵산의 하이브리드에 대한 Tm 값이 커진다. 핵산 하이브리드화의 상대적인 안정성(더 높은 Tm에 상응)은 다음과 같은 순서로 감소한다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100 뉴클레오타이드보다 큰 하이브리드의 경우, Tm 계산을 위한 공식이 추론된다(Sambrook et al., supra, 9.50-0.51 참조). 더 짧은 핵산, 즉 올리고뉴클레오타이드와의 하이브리드화를 위해서는, 미스매치의 위치가 더욱 중요하며, 올리고뉴클레오타이드의 길이는 이의 특이성을 결정한다(Sambrook et al., supra,11.7-11.8 참조). 바람직하게는, 하이브리드화 가능한 핵산에 대한 최소 길이는 적어도 약 10 뉴클레오타이드; 바람직하게는 적어도 약 15 뉴클레오타이드; 더욱 바람직하게는 길이는 적어도 약 20 뉴클레오타이드이다.When the single stranded form of a nucleic acid can be annealed with other nucleic acid molecules under suitable conditions of temperature and solution ionic strength, the nucleic acid molecule is "hybridizable" with other nucleic acid molecules such as cDNA, genomic DNA, or RNA (Sambrook et. al., supra). The conditions of temperature and ionic strength determine the "stringency" of hybridization. For preliminary screening of homologous nucleic acids, low stringency hybridization conditions corresponding to Tm of 55 ° C., such as 5 × SSC, 0.1% SDS, 0.25% milk, and formamide free; Or 30% formamide, 5x SSC, 0.5% SDS can be used. Moderate stringency hybridization conditions correspond to higher Tm, for example 40% formamide, 5x or 6x SCC. High stringency hybridization conditions correspond to a maximum Tm, for example 50% formamide, 5x or 6x SCC. Hybridization requires that both nucleic acids contain complementary sequences, but depending on the stringency of the hybridization, mismatches between bases are possible. Proper stringency for hybridization of nucleic acids depends on the length and degree of complementarity of the nucleic acids, variables well known in the art. The greater the degree of similarity or homology between two nucleotide sequences, the greater the Tm value for hybrids of nucleic acids having these sequences. The relative stability (corresponding to higher Tm) of nucleic acid hybridization decreases in the following order: RNA: RNA, DNA: RNA, DNA: DNA. For hybrids with lengths greater than 100 nucleotides, the formula for calculating Tm is deduced (see Sambrook et al., Supra, 9.50-0.51). For hybridization with shorter nucleic acids, ie oligonucleotides, the location of mismatches is more important, and the length of the oligonucleotides determines its specificity (see Sambrook et al., Supra, 11.7-11.8). Preferably, the minimum length for the hybridizable nucleic acid is at least about 10 nucleotides; Preferably at least about 15 nucleotides; More preferably, the length is at least about 20 nucleotides.

특정 양태에서, "표준 하이브리드화 조건"이란 용어는 55℃의 Tm을 말하며, 전술한 조건을 사용한다. 바람직한 양태에서, Tm은 60℃이며; 가장 바람직한 양태에서, Tm은 65℃이다.In certain embodiments, the term "standard hybridization conditions" refers to a Tm of 55 ° C and uses the conditions described above. In a preferred embodiment, Tm is 60 ° C .; In the most preferred embodiment, Tm is 65 ° C.

본 발명의 목적상 "고엄격 하이브리드화 조건"은 다음의 조건을 의미하는 것으로 이해될 것이다:For the purposes of the present invention "high stringency hybridization conditions" will be understood to mean the following conditions:

1-막 경쟁 및 예비하이브리드화: 1- Membrane Competition and Prehybridization:

- 혼합: 40㎕ 연어 정충 DNA (10㎎/㎖)Mix: 40 μl salmon sperm DNA (10 mg / ml)

+ 40㎕ 인간 태반 DNA (10㎎/㎖)+ 40 μl human placental DNA (10 mg / ml)

- 96℃에서 5분간 변성한 다음 혼합물을 얼음에 침지.Denature at 96 ° C. for 5 min and then immerse the mixture in ice.

- 2X SSC를 제거하고 막을 함유한 하이브리드화 튜브에 포름아미드 믹스 4 ㎖ 붓기.Remove 2X SSC and pour 4 ml of formamide mix into hybridization tube containing membrane.

- 두 개의 변성된 DNA의 혼합물 첨가.Addition of a mixture of two denatured DNAs.

- 회전하면서 5 내지 6 시간 동안 42℃에서 배양.Incubate at 42 ° C. for 5-6 hours with rotation.

2-표지된 탐침 경쟁: 2- labeled probe competition:

- 반복량에 따라, 표지되고 정제된 탐침에 10 내지 50 ㎕ Cot 1 DNA 첨가.-Depending on the repetition, add 10-50 μl Cot 1 DNA to the labeled and purified probes.

- 95℃에서 7 내지 10분 동안 변성.Denaturation at 95 ° C. for 7-10 minutes.

- 2 내지 5시간 동안 65℃에서 배양.Incubate at 65 ° C. for 2 to 5 hours.

3-하이브리드화 3- hybridization

- 예비하이브리드화 믹스 제거.Remove the prehybridized mix.

- 40㎕ 연어 정충 DNA + 40㎕ 인간 태반 DNA 혼합; 96℃에서 5분간 변성; 및나서 얼음에 침지.40 μl salmon sperm DNA + 40 μl human placental DNA mix; Denaturation at 96 ° C. for 5 minutes; And then immersed in ice.

- 하이브리드화 튜브에 포름아미드 믹스 4 ml, 두 DNA 혼합물 및 변성되고 표지된 탐침/Cot 1 DNA 첨가.Add 4 ml of formamide mix, two DNA mixtures and denatured and labeled probe / Cot 1 DNA to the hybridization tube.

- 회전하면서 15 내지 20 시간 동안 42℃에서 배양.Incubate at 42 ° C. for 15-20 hours with rotation.

4-세척: 4- washing:

- 세정하기 위해 2X SSC에서 실온에서 1회 세척.Wash once at room temperature in 2X SSC for cleaning.

- 실온에서 2X SSC와 65℃에서 0.1% SDS로 5분간 2회.Twice 5 minutes with 2X SSC at room temperature and 0.1% SDS at 65 ° C.

- 65℃에서 1X SSC 및 65℃에서 0.1% SDS로 15분간 2회.2x for 15 min with 1X SSC at 65 ° C. and 0.1% SDS at 65 ° C.

막을 투명한 플라스틱 랩에 봉하여 노출.Expose the membrane in a transparent plastic wrap.

전술한 하이브리드화 조건은 20개 뉴클레오타이드 내지 수백 개 뉴클레오타이드의 길이에 이르는 한 분자의 핵산과, 고엄격 조건 하에서, 하이브리드화되도록 조정되어졌다. 전술한 하이브리드화 조건이 당업자에게 알려진 기술에 따라, 하이브리드화를 원하는 핵산의 길이 또는 선택된 표지 유형의 함수로서 조정될 수 있음은 더 말할 나위가 없다. 적당한 하이브리드화 조건은 예를 들면, Hames and Higgins(1985)에 의한 매뉴얼에 또는 F. Ausubel 등(1999)에 의한 매뉴얼에 있는 교시내용에 따라 조정될 수 있다.The aforementioned hybridization conditions were adjusted to hybridize under high stringency conditions with one molecule of nucleic acid, ranging in length from 20 nucleotides to hundreds of nucleotides. It goes without saying that the above-mentioned hybridization conditions can be adjusted as a function of the length of the nucleic acid desired or the type of label selected for hybridization, according to techniques known to those skilled in the art. Suitable hybridization conditions can be adjusted, for example, according to the teachings in the manual by Hames and Higgins (1985) or in the manual by F. Ausubel et al. (1999).

본원에서 사용되는 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 적어도 15 뉴클레오타이드의 핵산, 즉 본 발명에 따른 핵산과 하이브리드화 가능한 핵산을 말한다. 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면, 바이오틴과 같은 표지물이 공유 접합된32P-뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드로 표지될 수 있다. 일 양태로서, 표지된 올리고뉴클레오타이드는 본 발명의 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 존재 검출을 위한 탐침으로 사용될 수 있다. 다른 양태로서, 올리고뉴클레오타이드(표지될 수 있는 하나 또는 양자 모두)는 ABC1 핵산의 완전한 길이 또는 단편을 클로닝하기 위한 PCR 프라이머로, 또는 ABC1 암호화 핵산의 존재 검출에 사용될 수 있다. 추가 양태로서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 ABC1 DNA 분자와 삼중나선을 형성할 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 핵산 합성기상에서 합성 제조된다. 따라서, 티오에스테르 결합 등과 같은 비-자연 발생 포스포에스테르 동족체 결합을 갖는 올리고뉴클레오타이드가 제조될 수 있다.As used herein, "oligonucleotide" generally refers to a nucleic acid of at least 15 nucleotides, that is, a nucleic acid capable of hybridizing with the nucleic acid according to the present invention. Oligonucleotides may, for example, be labeled with 32 P-nucleotides or nucleotides to which a label such as biotin is covalently conjugated. In one aspect, labeled oligonucleotides can be used as probes for the presence of nucleic acids encoding the ABC1 polypeptides of the invention. In another embodiment, oligonucleotides (one or both that can be labeled) can be used as PCR primers for cloning the full length or fragment of ABC1 nucleic acid, or for detecting the presence of ABC1 encoding nucleic acid. In a further aspect, the oligonucleotides of the present invention may form triple helices with ABC1 DNA molecules. In general, oligonucleotides are preferably prepared synthetically on nucleic acid synthesizers. Thus, oligonucleotides having non-naturally occurring phosphoester homologue bonds such as thioester bonds and the like can be prepared.

"상동성 재조합"은 염색체 내 벡터의 외래 DNA 서열을 말한다. 바람직하게는, 벡터는 상동 재조합을 위한 특정 염색체 부위를 표적화한다. 특이적 상동 재조합의 경우, 벡터는 염색체 중으로 벡터의 상보적인 결합 및 혼입을 허용하도록 염색체의 서열과 상동성인 충분히 긴 영역을 함유할 것이다. 좀더 긴 상동 영역, 및 좀더 큰 서열 유사도는 상동 재조합의 효능을 증가시킬 수 있다."Homologous recombination" refers to the foreign DNA sequence of a vector in a chromosome. Preferably, the vector targets a specific chromosomal site for homologous recombination. In the case of specific homologous recombination, the vector will contain a sufficiently long region homologous to the sequence of the chromosome to allow complementary binding and incorporation of the vector into the chromosome. Longer homologous regions, and greater sequence similarity can increase the efficacy of homologous recombination.

DNA "암호화 서열"은 적당한 조절 서열의 조절하에 놓일 때 시험관내 또는 생체내 세포에서 전사되어 폴리펩타이드로 해독되는 이본쇄 DNA 서열이다. 암호화 서열의 경계는 5′(아미노) 말단에서의 개시 코돈 및 3′(카복실) 말단에서의 해독 정지 코돈에 의해 결정된다. 암호화 서열은 원핵세포 서열, 진핵세포 mRNA로부터의 cDNA, 진핵세포(예를 들면, 포유동물) DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으며 이에 한정되지는 않는다. 암호화 서열이 진핵세포에서의 발현용일 경우, 폴리아데닐화 시그널 및 전사 종결 서열은 통상적으로 암호화 서열에 대해 3′에 위치될 것이다.A DNA “coding sequence” is a double-stranded DNA sequence that is transcribed into a polypeptide and transcribed in cells in vitro or in vivo when placed under the control of appropriate regulatory sequences. The boundaries of the coding sequence are determined by the start codon at the 5 '(amino) terminus and the translation stop codon at the 3' (carboxyl) terminus. Coding sequences may include, but are not limited to, prokaryotic sequences, cDNAs from eukaryotic mRNAs, genomic DNA sequences from eukaryotic (eg, mammalian) DNAs, and synthetic DNA sequences. If the coding sequence is for expression in eukaryotic cells, the polyadenylation signal and transcription termination sequence will typically be located 3 'to the coding sequence.

전사 및 해독 조절 서열은 숙주세포에서의 암호화 서열 발현을 제공하는, 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등과 같은 DNA 조절 서열이다. 진핵세포에서, 폴리아데닐화 시그널은 조절 서열이다.Transcriptional and translational regulatory sequences are DNA regulatory sequences, such as promoters, enhancers, terminators, and the like, that provide for encoding sequence expression in a host cell. In eukaryotic cells, the polyadenylation signal is a regulatory sequence.

"조절 영역"은 핵산의 발현을 조절하는 핵산 서열이다. 조절 영역은 본래 특정 핵산(상동 영역)의 발현을 담당하는 서열 또는 상이한 기원(상이한 단백질 또는 합성 단백질의 발현 담당)의 서열을 포함할 수 있다. 특히, 서열은 특이적 또는 비-특이적 방식으로 및 유도성 또는 비-유도성 방식으로 유전자의 전사를 자극하거나 억제하는 진핵세포 또는 바이러스 유전자의 서열 또는 유도 서열일 수 있다. 조절 영역은 복제 기원, RNA 스플라이스 부위, 인핸서, 전사 종결 서열, 폴리펩타이드를 표적 세포의 분비경로로 지시하는 시그널 서열, 및 프로모터를 포함한다.A "regulatory region" is a nucleic acid sequence that regulates the expression of a nucleic acid. The regulatory region may comprise a sequence originally responsible for the expression of a particular nucleic acid (homologous region) or a sequence of different origin (for expression of a different protein or synthetic protein). In particular, the sequence may be a sequence or derived sequence of a eukaryotic or viral gene that stimulates or inhibits transcription of the gene in a specific or non-specific manner and in an inducible or non-induced manner. Regulatory regions include the origin of replication, RNA splice sites, enhancers, transcription termination sequences, signal sequences that direct polypeptides to the secretory pathway of target cells, and promoters.

"이종 공급원"으로부터의 조절 서열은 발현된 핵산과 본래 연관되지 않은 조절 영역이다. 이종 조절 영역에는 상이한 종으로부터의 조절 영역, 상이한 유전자로부터의 조절 영역, 하이브리드 조절 서열, 및 자연상태에서는 발생하지 않지만 당업자에 의해 고안되는 조절 서열이 포함된다.Regulatory sequences from “heterologous sources” are regulatory regions that are not originally associated with expressed nucleic acids. Heterologous regulatory regions include regulatory regions from different species, regulatory regions from different genes, hybrid regulatory sequences, and regulatory sequences that do not occur in nature but are devised by those skilled in the art.

"카세트"란 특이적 제한부위로 삽입될 수 있는 DNA 단편을 말한다. DNA의 단편은 해당 폴리펩타이드를 암호화하고, 카세트와 제한부위는 전사 및 해독을 위한 적당한 판독 프레임에 카세트의 삽입을 보장하도록 디자인된다."Cassette" refers to a DNA fragment that can be inserted into specific restriction sites. Fragments of DNA encode the polypeptide of interest, and cassettes and restriction sites are designed to ensure insertion of the cassette into a suitable reading frame for transcription and translation.

"프로모터 서열"은 세포에서 RNA 폴리머라제를 결합시킬 수 있고다운스트림(3′방향) 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명의 정의상, 프로모터 서열은 전사 개시 부위까지 3′말단에서 결합되고 백그라운드 이상의 검출 가능한 수준에서의 전사를 개시하는 데 필요한 염기 또는 요소의 최소수를 포함하도록 업스트림으로(5′방향) 연장한다. 프로모터 서열 안에서는 전사 개시 부위(예를 들면, 뉴클레아제 S1으로 지도 작성함으로써 편리하게 규정됨), 및 RNA 폴리머라제 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인(컨센서스 서열)이 발견될 것이다.A "promoter sequence" is a DNA regulatory region capable of binding RNA polymerase in a cell and initiating transcription of downstream (3 'direction) coding sequences. By definition, the promoter sequence extends upstream (5 'direction) to include the minimum number of bases or elements necessary to bind at the 3' end to the transcription initiation site and initiate transcription at a detectable level above background. Within the promoter sequence will be found a transcription initiation site (eg, conveniently defined by mapping with nuclease S1), and a protein binding domain (consensus sequence) responsible for RNA polymerase binding.

RNA 폴리머라제가 암호화 서열을 mRNA로 전사하고, 이어서 이는 트랜스-RNA 스플라이싱되어 암호화 서열에 의해 암호화된 단백질로 해독될 때 암호화 서열은 세포에서 전사 및 해독 조절 서열의 "조절하에" 있다.When an RNA polymerase transcribes a coding sequence into mRNA, which is then trans-RNA spliced and translated into a protein encoded by the coding sequence, the coding sequence is "under control" of the transcriptional and translational regulatory sequences in the cell.

"시그널 서열"은 세포 표면상에 발현시킬 단백질의 암호화 서열의 개시부에 포함된다. 이러한 서열은 성숙 폴리펩타이드에 대한 시그널 펩타이드, N-말단을 암호화, 즉 숙주세포가 폴리펩타이드를 전좌시키게 지시한다. "전좌 시그널 서열"이란 용어는 시그널 서열의 이러한 종을 말한다. 전좌 시그널 서열은 진핵세포 및 원핵세포에 고유한 각종 단백질과 관련되어 있는 것으로 발견될 수 있으며, 종종 두 유기체 유형 모두에서 기능을 띤다.A "signal sequence" is included at the beginning of the coding sequence of a protein to be expressed on the cell surface. This sequence encodes the signal peptide, N-terminus, to the mature polypeptide, ie, directs the host cell to translocate the polypeptide. The term "translocation signal sequence" refers to this species of signal sequence. Translocation signal sequences can be found to be associated with a variety of proteins unique to eukaryotic and prokaryotic cells, often functioning in both organism types.

"폴리펩타이드"는 공유결합된 아미노산 잔기로 구성된 중합체 화합물이다.아미노산은 다음과 같은 일반 구조를 갖는다:A "polypeptide" is a polymeric compound consisting of covalently bonded amino acid residues. Amino acids have the following general structure:

아미노산은 측쇄 R을 기준으로 7개 그룹으로 분류된다: (1)지방족 측쇄, (2)하이드록실(OH) 그룹을 함유하는 측쇄, (3)황 원자를 함유하는 측쇄, (4)산성 또는 아미드 그룹을 함유하는 측쇄, (5)염기성 그룹을 함유하는 측쇄, (6)방향족 환을 함유하는 측쇄, 및 (7)측쇄가 아미노 그룹과 융합되는 이미노산인 프롤린.Amino acids are classified into seven groups based on side chain R: (1) aliphatic side chains, (2) side chains containing hydroxyl (OH) groups, (3) side chains containing sulfur atoms, (4) acidic or amides A proline which is a side chain containing a group, (5) a side chain containing a basic group, (6) a side chain containing an aromatic ring, and (7) the side chain is an imino acid fused with an amino group.

"단백질"은 생세포에서 구조적 또는 기능적 역할을 하는 폴리펩타이드이다.A "protein" is a polypeptide that plays a structural or functional role in living cells.

본 발명의 폴리펩타이드 및 단백질은 글리코실화 또는 비글리코실화될 수 있다.Polypeptides and proteins of the invention can be glycosylated or aglycosylated.

"상동성"이란 공통 진화 기원을 반영하는 서열의 유사성을 의미한다. 아미노산의 상당수가 (1)동일하거나, (2)화학적으로 유사한 R 측쇄를 갖는 경우 폴리펩타이드 또는 단백질은 상동성, 또는 유사성을 갖는다고 한다. 뉴클레오타이드의 상당수가 동일한 경우 핵산은 상동성을 갖는다고 말한다.By “homology” is meant the similarity of sequences that reflect a common evolutionary origin. Polypeptides or proteins are said to have homology or similarity when a significant number of amino acids are (1) identical or (2) chemically similar R side chains. If many of the nucleotides are identical, the nucleic acid is said to be homologous.

"분리된 폴리펩타이드" 또는 "분리된 단백질"은 자연 상태에서 정상적으로 함께 연관되어 있는 그러한 화합물(예를 들면, 타 단백질 또는 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질)이 실질적으로 없는 폴리펩타이드 또는 단백질이다. "분리된"이란 타 화합물과의 인공적인 또는 합성 혼합물, 또는 생물학적 활성을 방해하지 않고, 예를 들면 불완전한 정제, 안정제의 첨가, 또는 약학적으로 허용되는 제제에의 배합으로 인해 존재할 수 있는 불순물의 존재를 배제함을 의미하지는 않는다.An "isolated polypeptide" or "isolated protein" is a polypeptide or protein that is substantially free of such compounds (eg, other proteins or polypeptides, nucleic acids, carbohydrates, lipids) that are normally associated together in nature. "Isolated" means the presence of impurities that may be present in an artificial or synthetic mixture with another compound, or without interfering with biological activity, for example due to incomplete tablets, the addition of stabilizers, or a combination in a pharmaceutically acceptable formulation. It does not mean to exclude existence.

본 발명에 따른 폴리펩타이드의 "단편"은 아미노산 서열이 기준 폴리펩타이드의 것보다 짧고 이러한 기준 폴리펩타이드와 전 부분에 걸쳐서 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 단편은 경우에 따라 이들이 일부분인 더 큰 폴리펩타이드에 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 그러한 단편은 10, 15, 20, 30-40, 50, 100, 200 또는 300 아미노산의 길이를 가질 수 있다.By “fragment” of a polypeptide according to the invention is meant a polypeptide comprising an amino acid sequence whose amino acid sequence is shorter than that of the reference polypeptide and which is identical throughout this reference polypeptide. Such fragments may optionally be included in larger polypeptides to which they are part. Such fragments of polypeptides according to the invention may have a length of 10, 15, 20, 30-40, 50, 100, 200 or 300 amino acids.

본 발명에 따른 폴리펩타이드의 "변이체"는 기준 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 대해, 아미노산 서열이 적어도 하나의 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환, 첨가 또는 결실을 함유하는 폴리펩타이드를 주로 의미하는 것으로 이해될 것이며, 아미노산 치환은 보존적 또는 비보존적일 수 있음이 이해된다.A “variant” of a polypeptide according to the invention will be understood to mean a polypeptide which, relative to the amino acid sequence of the reference polypeptide, contains an amino acid sequence containing at least one substitution, addition or deletion of at least one amino acid residue, It is understood that amino acid substitutions may be conservative or non-conservative.

폴리펩타이드 또는 단백질의 "변이체"는 폴리펩타이드 또는 단백질로부터 유도되고 폴리펩타이드 또는 단백질의 적어도 하나의 생물학적 특성을 유지하는 동족체, 단편, 유도체, 또는 돌연변이체이다. 폴리펩타이드 또는 단백질의 상이한 변이체는 자연에서 존재할 수 있다. 이들 변이체는 단백질을 암호화하는 구조 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서의 차이를 특징으로 하는 대립유전자 변이일 수 있거나, 차별적인 스플라이싱 또는 후-해독 변형을 수반할 수 있다. 변이체는 또한, 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 가지만 상이한 종으로부터 수득된 관련 단백질을 포함한다.A “variant” of a polypeptide or protein is a homologue, fragment, derivative, or mutant derived from a polypeptide or protein and retaining at least one biological property of the polypeptide or protein. Different variants of the polypeptide or protein may exist in nature. These variants may be allelic variations characterized by differences in the nucleotide sequence of the structural gene encoding the protein, or may involve differential splicing or post-translational modifications. Variants also include related proteins having substantially the same biological activity but obtained from different species.

당업자는 단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실, 첨가, 또는 치환을 갖는 변이체를 생성할 수 있다. 이러한 변이체는 그 중에서도 특히: (a)하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비-보존적 아미노산으로 치환되는 변이체, (b)하나 이상의 아미노산이 폴리펩타이드 또는 단백질에 첨가되는 변이체, (c)아미노산의 하나 이상이 치환 그룹을 포함하는 변이체, 및 d)폴리펩타이드 또는 단백질이 혈청 알부민과 같은 또다른 폴리펩타이드와 융합되는 변이체를 포함할 수 있다. 유전자(억제, 결실, 돌연변이 등), 화학적, 및 효소학적 기술을 포함한 이들 변이체의 수득 기술은 당업자에 공지되어 있다.One skilled in the art can generate variants with single or multiple amino acid substitutions, deletions, additions, or substitutions. Such variants include, among others: (a) variants in which one or more amino acid residues are replaced with conservative or non-conservative amino acids, (b) variants in which one or more amino acids are added to a polypeptide or protein, (c) one of the amino acids Variants comprising substitution groups as described above, and d) variants in which the polypeptide or protein is fused with another polypeptide such as serum albumin. Techniques for obtaining these variants, including genes (inhibitions, deletions, mutations, etc.), chemical, and enzymatic techniques are known to those skilled in the art.

대안의 mRNA 스플라이싱 형태 및 대안의 후-해독 변형 형태를 포함한 그러한 대립유전자 변이, 동족체, 단편, 유도체, 돌연변이체, 및 변형이 폴리펩타이드의 생물학적 특성을 유지하는 폴리펩타이드의 유도체를 생성하면, 이들은 본 발명의 범위 안에 포함시키고자 한다.If such allelic variants, homologs, fragments, derivatives, mutants, and modifications, including alternative mRNA splicing forms and alternative post-translational modification forms, produce derivatives of the polypeptide that retain the biological properties of the polypeptide, These are intended to be included within the scope of this invention.

"벡터"는 부착된 단편의 복제를 일으키도록 또다른 DNA 단편이 부착될 수 있는, 플라스미드, 바이러스, 파지 또는 코스미드와 같은 레플리콘이다. "레플리콘"은 생체내에서 DNA 복제의 자치단위로서 기능하는, 즉 자신의 조절하에 복제할 수 있는 유전 요소(예를 들면, 플라스미드, 염색체, 바이러스)이다.A "vector" is a replicon, such as a plasmid, virus, phage or cosmid, to which another DNA fragment may be attached to cause replication of the attached fragment. A "replicon" is a genetic element (e.g., plasmid, chromosome, virus) that functions as an autonomous unit of DNA replication in vivo, i.e., can replicate under its control.

본 발명은 또한, ABC1 폴리펩타이드, 및 타 종으로부터의 이의 상동체와 동일하거나 상동한 기능 활성을 지닌, 본 발명의 ABC1 폴리펩타이드의 동족체 및 유도체를 암호화하는 유전자를 함유하는 클로닝 벡터에 관한 것이다. ABC1에 관련된 유도체 및 동족체의 생산과 용도는 본 발명의 범위 안에 있다. 특정 양태에서, 유도체 또는 동족체는 기능적으로 활성을 띠고, 즉 본 발명의 ABC1 폴리펩타이드의완전한 길이의 야생형과 연관된 하나 이상의 기능적 활성을 보일 수 있다.The present invention also relates to a cloning vector containing the ABC1 polypeptide and genes encoding homologs and derivatives of the ABC1 polypeptide of the invention, which have the same or homologous functional activity as homologs thereof from other species. The production and use of derivatives and homologues related to ABC1 are within the scope of the present invention. In certain embodiments, the derivative or homologue may be functionally active, ie, exhibit one or more functional activities associated with the full length wild type of the ABC1 polypeptide of the invention.

ABC1 유도체는 기능적으로 등가 분자를 제공하는 치환, 첨가 또는 결실에 의해 암호화 핵산 서열을 변경시켜 만들 수 있다. 바람직하게는, 네이티브 ABC1에 대해 증강되거나 증가된 기능적 활성을 지닌 유도체가 제조된다. 이와 달리, 이러한 유도체는 본 발명의 ABC1 폴리펩타이드의 천연 리간드에 대해 동일하거나 더 큰 활성을 지닌 ABC1 세포외 도메인의 가용성 단편을 암호화할 수 있다. 이러한 가용성 유도체는 ABC1에 결합하는 리간드의 강력한 억제제일 수 있다.ABC1 derivatives can be made by altering the coding nucleic acid sequence by substitutions, additions or deletions that provide functionally equivalent molecules. Preferably, derivatives are prepared with enhanced or increased functional activity for native ABC1. Alternatively, such derivatives may encode soluble fragments of the ABC1 extracellular domain that have the same or greater activity against the natural ligand of the ABC1 polypeptide of the invention. Such soluble derivatives may be potent inhibitors of ligands that bind ABC1.

뉴클레오타이드 암호화 서열의 축퇴성에 기인하여, ABC1 유전자와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 타 DNA 서열이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 이러한 것들에는 대립유전자, 타 종으로부터의 상동 유전자, 및 서열내 동일한 아미노산 잔기를 암호화하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경되어, 사일런트 변화를 일으키는 ABC1 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 뉴클레오타이드 서열이 포함되며 이에 한정되지 않는다. 이와 마찬가지로, 본 발명의 ABC1 유도체는 기능적 등가 아미노산 잔기로 서열내 잔기가 치환되어 보존적 아미노산 치환을 일으키는 변경된 서열을 포함한 ABC1 단백질의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 1차 아미노산 서열로서 함유하는 것들을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 서열내 하나 이상의 아미노산 잔기는 서열이 기능적 등가물로 작용하는 동일 극성의 다른 아미노산으로 치환될 수 있어 사일런트 변형을 일으킨다. 서열내 아미노산의 치환은 아미노산이 속하는 부류의 다른 멤버로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌,트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 방향족 환 구조를 함유하는 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판, 및 타이로신이다. 극성 중성 아미노산은 글라이신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파트산 및 글루탐산이 포함된다. 이러한 변경은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 등전점에 의해 측정되는 겉보기 분자량에 영향을 미칠 것으로 예상되지는 않을 것이다.Due to the degeneracy of the nucleotide coding sequence, other DNA sequences encoding amino acid sequences substantially identical to the ABC1 gene can be used in the practice of the present invention. These include and include nucleotide sequences that include all or part of the ABC1 gene, altered by alleles, homologous genes from other species, and substitution of different codons encoding the same amino acid residues in the sequence, resulting in a silent change. It is not limited. Similarly, ABC1 derivatives of the present invention include those containing all or a portion of the amino acid sequence of the ABC1 protein as a primary amino acid sequence, including a modified sequence in which residues in the sequence are replaced with functional equivalent amino acid residues resulting in conservative amino acid substitutions. It is not limited to this. For example, one or more amino acid residues in a sequence can be substituted with other amino acids of the same polarity, where the sequence acts as a functional equivalent, resulting in a silent modification. Substitution of amino acids in the sequence may be selected from other members of the class to which the amino acids belong. For example, nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine. Amino acids containing an aromatic ring structure are phenylalanine, tryptophan, and tyrosine. Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine. Positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine. Negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid. Such alterations would not be expected to affect the apparent molecular weight measured by polyacrylamide gel electrophoresis, or isoelectric point.

특히 바람직한 치환은:Particularly preferred substitutions are:

- 양전하가 유지될 수 있도록 Arg를 Lys으로 및 그 반대로;Arg to Lys and vice versa so that a positive charge can be maintained;

- 음전하가 유지될 수 있도록 Asp를 Glu로 및 그 반대로;Asp to Glu and vice versa so that negative charge can be maintained;

- 유리-OH가 유지될 수 있도록 Thr을 Ser로; 및Thr to Ser so that free-OH can be maintained; And

- 유리 CONH2가 유지될 수 있도록 Asn을 Gln으로.Asn to Gln so that the glass CONH 2 is maintained.

아미노산 치환은 또한 특히 바람직한 성질을 지닌 아미노산을 치환시키기 위해 도입될 수 있다. 예를 들면, Cys는 또다른 Cys와의 디설파이드 브리지를 위한 잠재적인 부위에 도입될 수 있다. His는 특히 "촉매적" 부위로서 도입될 수 있다(즉, His는 산 또는 염기로 작용할 수 있고 생화학적 촉매작용에서 가장 일반적인 아미노산이다). Pro는 단백질 구조에 b-회전을 유도하는 특별한 평면 구조 때문에 도입될 수 있다.Amino acid substitutions may also be introduced to substitute amino acids having particularly desirable properties. For example, Cys can be introduced at a potential site for disulfide bridges with another Cys. His can in particular be introduced as a "catalytic" site (ie His can act as an acid or base and is the most common amino acid in biochemical catalysis). Pro can be introduced because of the special planar structure that induces b-rotation in the protein structure.

본 발명의 ABC1 유도체 및 동족체를 암호화하는 유전자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 생성을 유도하는 조작은 유전자 또는 단백질수준에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 클로닝된 ABC1 유전자 서열은 당업계에 공지된 다수의 전략에 의해 변형될 수 있다(Sambrook et al., 1989, 상기문헌). 서열은 제한 엔도뉴클레아제로 적당한 부위에서 절단될 수 있고, 이어서 필요하다면 추가로 효소 변형시키며, 분리한 다음 시험관내에서 연결시킨다. ABC1의 유도체 또는 동족체를 암호화하는 유전자의 생산에 있어서, 목적하는 활성이 암호화되는 유전자 영역에서, 해독 정지 시그널에 의해 중단되지 않은, ABC1 유전자와 동일한 해독 판독 프레임에 변형된 유전자가 남게 보장하도록 유의하여야 한다.Genes encoding the ABC1 derivatives and homologues of the invention can be produced by a variety of methods known in the art. Manipulations that induce production can occur at the gene or protein level. For example, the cloned ABC1 gene sequence can be modified by a number of strategies known in the art (Sambrook et al., 1989, supra). The sequence can be cleaved at the appropriate site with restriction endonucleases, followed by further enzymatic modification if necessary, isolation and ligation in vitro. In the production of genes encoding derivatives or homologues of ABC1, care should be taken to ensure that in the gene region to which the desired activity is encoded, the modified gene remains in the same reading frame as the ABC1 gene, which is not interrupted by the translation stop signal. do.

추가로, ABC1-암호화 핵산을 시험관내 또는 생체내에서 돌연변이시켜, 해독, 개시, 및/또는 종결 서열을 생성 및/또는 파괴하거나, 암호화 영역에 변이를 생성 및/또는 새로운 제한 엔도뉴클레아제 부위를 형성하거나 기존의 것을 파괴하여, 시험관내 변형을 더욱 촉진시킬 수 있다. 바람직하게는, 이러한 돌연변이는 돌연변이된 ABC1 유전자 산물의 기능적 활성을 증진시킨다. TABR링커(Pharmacia)의 시험관내 부위-지향성 돌연변이유발(Hutchinson, C., et al., 1978; Zoller and Smith, 1984; Oliphant et al., 1986; Hutchinson et al., 1986; Huygen et al., 1996) 사용 등을 포함한 당업자에 공지된 돌연변이유발 기술이 사용될 수 있으며 이에 한정되지 않는다. PCR 기술은 부위 지향성 돌연변이유발에 바람직하다(참조: Higuch, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich. ed., Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70).In addition, the ABC1-encoding nucleic acid may be mutated in vitro or in vivo to generate and / or disrupt translation, initiation, and / or termination sequences, or to generate mutations in the coding region and / or to a new restriction endonuclease site. Formation or disruption of existing ones can further promote in vitro deformation. Preferably such mutations enhance the functional activity of the mutated ABC1 gene product. In vitro site-directed mutagenesis of the TAB R linker (Pharmacia) (Hutchinson, C., et al., 1978; Zoller and Smith, 1984; Oliphant et al., 1986; Hutchinson et al., 1986; Huygen et al. , 1996) mutagenesis techniques known to those skilled in the art, including, but not limited to, use. PCR techniques are preferred for site-directed mutagenesis (Higuch, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich.ed., Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70).

이어서, 동정되고 분리된 유전자를 적당한 클로닝 벡터 중으로 삽입시킬 수있다. 당업계에 공지된 다수의 벡터-숙주 시스템이 사용될 수 있다. 가능한 벡터는 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 포함하고 이에 한정되지 않지만, 벡터 시스템은 사용되는 숙주세포와 상용성이어야 한다. 벡터의 예는 이.콜라이, 박테리오파지, 예를 들면 람다 유도체, 또는 플라스미드, 예를 들면, pBR322 유도체 또는 pUC 플라스미드 유도체, 예를 들면, pGEX 벡터, pmal-c, pFLAG 등을 포함한다. 클로닝 벡터 중으로의 삽입은 예를 들면, 상보적인 점착 말단을 갖는 클로닝 벡터 중으로 DNA 단편을 연결시킴으로써 달성될 수 있다. 그러나, DNA 단편화에 사용된 상보적인 제한부위가 클로닝 벡터에 존재하지 않으면, DNA 분자의 말단은 효소로 변형시킬 수 있다. 이와 달리, 임의의 원하는 부위는 DNA 말단에 뉴클레오타이드 서열(링커)을 연결함으로써 생성시킬 수 있으며; 이들 연결된 링커는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 암호화하는 특이적인 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 재조합 분자는 형질전환, 형질감염, 감염, 전기투공 등을 통해 숙주세포 중으로 도입될 수 있어, 유전자 서열의 다수 카피가 생성된다. 바람직하게는, 필요하다면, 클로닝된 유전자는 클로닝 세포, 예를 들면, 이.콜라이에서의 팽창, 및 적당한 발현 세포주 중으로의 후속 삽입을 위한 용이한 정제를 제공하는 셔틀 벡터 플라스미드에 함유된다. 예를 들면, 1종 이상의 유기체에서 복제할 수 있는 벡터인 셔틀 벡터가, 이.콜라이 플라스미드로부터의 서열을 효모 2m 플라스미드로부터의 서열과 연결시킴으로써 이.콜라이 및 사카로마이세스 세레비지애 모두에서의 복제를 위해 제조될 수 있다.The identified and isolated genes can then be inserted into suitable cloning vectors. Many vector-host systems known in the art can be used. Possible vectors include, but are not limited to, plasmids or modified viruses, but the vector system must be compatible with the host cell used. Examples of vectors include E. coli, bacteriophages such as lambda derivatives, or plasmids such as pBR322 derivatives or pUC plasmid derivatives such as pGEX vectors, pmal-c, pFLAG and the like. Insertion into the cloning vector can be accomplished, for example, by linking the DNA fragment into a cloning vector with complementary cohesive ends. However, if the complementary restriction sites used for DNA fragmentation are not present in the cloning vector, the ends of the DNA molecules can be modified with enzymes. Alternatively, any desired site can be generated by linking a nucleotide sequence (linker) to the DNA terminus; These linked linkers may comprise specific chemically synthesized oligonucleotides encoding restriction endonuclease recognition sequences. Recombinant molecules can be introduced into host cells through transformation, transfection, infection, electroporation, and the like, resulting in multiple copies of the gene sequence. Preferably, if necessary, the cloned gene is contained in a shuttle vector plasmid that provides for easy purification for expansion in cloning cells, eg, E. coli, and subsequent insertion into a suitable expression cell line. For example, a shuttle vector, a vector capable of replicating in one or more organisms, can be used in both E. coli and Saccharomyces cerevisiae by linking sequences from the E. coli plasmid with sequences from the yeast 2m plasmid. It can be prepared for replication.

대안의 방법으로, 목적하는 유전자는 "샷 건(shot gun)"법으로 적당한 클로닝 벡터 중으로 삽입 후에 동정 및 분리될 수 있다. 예를 들면, 크기 분별에 의한 목적하는 유전자의 농축은 클로닝 벡터 중으로의 삽입 전에 수행될 수 있다.Alternatively, the gene of interest can be identified and separated after insertion into a suitable cloning vector by the "shot gun" method. For example, enrichment of the desired gene by size fractionation can be performed prior to insertion into the cloning vector.

키메릭 단백질을 포함하여 ABC1 폴리펩타이드 또는 항원 단편, 이의 유도체 또는 동족체, 또는 기능적 활성 유도체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 적당한 발현벡터, 즉, 삽입된 단백질-암호화 서열의 전사와 해독에 필요한 요소를 함유하는 벡터 중으로 삽입시킬 수 있다. 이러한 요소는 본원에서 "프로모터"로 불린다. 따라서, 본 발명의 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 본 발명의 발현벡터에서 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다. cDNA 및 게놈 서열 모두 클로닝시켜 그러한 조절 서열의 조절하에 발현시킬 수 있다. 발현벡터는 또한 바람직하게는 복제 기원을 포함한다.A nucleotide sequence encoding an ABC1 polypeptide or antigen fragment, derivative or homologue thereof, or functionally active derivative, including a chimeric protein, contains a suitable expression vector, i.e., elements necessary for the transcription and translation of the inserted protein-coding sequence. Can be inserted into a vector. Such elements are referred to herein as "promoters." Thus, the nucleic acid encoding the ABC1 polypeptide of the present invention is operably linked to a promoter in the expression vector of the present invention. Both cDNA and genomic sequences can be cloned and expressed under the control of such regulatory sequences. The expression vector also preferably comprises a replication origin.

필요한 전사 및 해독 시그널이 재조합 발현벡터상에 제공될 수 있거나, 이들은 ABC1 및/또는 이의 플랭킹 영역을 암호화하는 네이티브 유전자에 의해 공급될 수 있다.Necessary transcriptional and translational signals can be provided on recombinant expression vectors or they can be supplied by native genes encoding ABC1 and / or its flanking regions.

잠재적인 숙주-벡터 시스템은 바이러스(예를 들면, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 등)로 감염된 포유류 세포 시스템; 바이러스(예를 들면, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 효모 벡터를 함유하는 효소와 같은 미생물; 또는 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 벡터의 발현 요소는 이의 강도와 특이성에서 다양하다. 사용되는 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적당한 전사 및 해독 요소 중 임의 하나가 사용될 수 있다.Potential host-vector systems include mammalian cell systems infected with viruses (eg vaccinia virus, adenovirus, etc.); Insect cell systems infected with viruses (eg, baculovirus); Microorganisms such as enzymes containing yeast vectors; Or bacteria transformed with bacteriophage, DNA, plasmid DNA, or cosmid DNA. The expression elements of the vector vary in their strength and specificity. Depending on the host-vector system used, any one of a number of suitable transcription and translation elements can be used.

본 발명의 재조합 ABC1 단백질, 또는 이의 기능성 단편, 유도체, 키메릭 작제물, 또는 동족체는 재조합에 의한 암호화 서열의 통합 후에 염색체적으로 발현시킬 수 있다. 이와 관련하여, 다수의 증폭 시스템이 고수준의 안정한 유전자 발현 달성에 사용될 수 있다(참조: Sambrook et al., 1989, 상기문헌).The recombinant ABC1 protein of the invention, or functional fragments, derivatives, chimeric constructs, or homologs thereof, can be chromosomally expressed after integration of the coding sequence by recombination. In this regard, a number of amplification systems can be used to achieve high levels of stable gene expression (Sambrook et al., 1989, supra).

본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 세포를 세포에 의한 ABC1 폴리펩타이드의 발현을 제공하는 조건하에서 적당한 세포 배양 배지에서 배양한다.Cells containing a recombinant vector comprising a nucleic acid encoding an ABC1 polypeptide according to the present invention are cultured in a suitable cell culture medium under conditions providing expression of the ABC1 polypeptide by the cells.

클로닝 벡터 중으로 DNA 단편의 삽입에 대해 앞서 기술된 방법을 사용하여 적당한 전사/해독 조절 시그널 및 단백질 암호화 서열로 이루어진 유전자를 함유하는 발현벡터를 작제할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 DNA 및 합성 기술 및 생체내 재조합(유전자 재조합)을 포함할 수 있다.The methods described above for the insertion of DNA fragments into cloning vectors can be used to construct expression vectors containing genes consisting of appropriate transcriptional / translational regulatory signals and protein coding sequences. These methods may include in vitro DNA and synthetic techniques and in vivo recombination (genetic recombination).

ABC1 폴리펩타이드의 발현은 당업계에 공지된 프로모터/인핸서 요소에 의해 조절될 수 있지만, 이들 조절 요소는 발현을 위해 선택된 숙주에서 기능성이어야 한다. ABC1 유전자 발현의 조절에 사용될 수 있는 프로모터는 SV40 초기 프로모터 영역(Benoist and Chambon, 1981), 라우스 육종 바이러스의 3′장 말단 반복부에 함유된 프로모터(Yamamoto et al., 1980), 허피스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner et al., 1981), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(Brinster et al., 1982); b-락타마제 프로모터와 같은 진핵세포 발현벡터(Villa-Kamaroff et al., 1978), 또는 tac 프로모터(DeBoer et al., 1983); 또한 "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94 참조; Gal 4 프로모터, ADC(알콜 데하이드로키나제) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터와 같은 효모 또는 기타 진균으로부터의 프로모터 요소; 및 조직 특이성을 보이고 트랜스제닉 동물에 사용되어온 동물 전사 조절 영역: 췌장 소포 세포에서 활성을 띠는 엘라스타제 I 유전자 조절 영역(Swift et al., 1984; Ornitz et al., 1986; MacDonald, 1987); 췌장 베타 세포에서 활성을 띠는 인슐린 유전자 조절 영역(Hanahan, 1985), 림프 세포에서 활성을 띠는 면역글로불린 유전자 조절 영역(Grosschedl et al., 1984; Adames et al., 1985; Alexander et al., 1987), 정소, 유방, 림프 및 비만 세포에서 활성을 띠는 마우스 유방 종양 바이러스 조절 영역(Leder et al., 1986), 간에서 활성을 띠는 알부민 유전자 조절 영역(Pinkert et al., 1987), 간에서 활성을 띠는 알파-페토단백질 유전자 조절 영역(Krumlauf et al., 1985; Hammer et al., 1987), 간에서 활성을 띠는 알파 1-안티트립신 유전자 조절 영역(Kelsey et al., 1987), 골수성 세포에서 활성을 띠는 베타-글로빈 유전자 조절 영역(Mogram et al., 1985; Kollias et al., 1986), 뇌의 올리고덴드로부위 세포에서 활성을 띠는 마이엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역(Readhead et al., 1987), 골격근에서 활성을 띠는 마이오신 경쇄-2 유전자 조절 영역(Sani, 1985), 및 시상하부에서 활성을 띠는 고나도트로핀 방출 호르몬 유전자 조절 영역(Mason et al., 1986)이 포함되며 이에 한정되지 않는다.Expression of the ABC1 polypeptide can be regulated by promoter / enhancer elements known in the art, but these regulatory elements must be functional in the host selected for expression. Promoters that can be used for the regulation of ABC1 gene expression include the SV40 early promoter region (Benoist and Chambon, 1981), promoters contained in the 3 ′ long terminal repeat of Raus sarcoma virus (Yamamoto et al., 1980), herpes thymidine kinase Promoter (Wagner et al., 1981), regulatory sequences of metallothionein genes (Brinster et al., 1982); eukaryotic expression vectors such as the b-lactamase promoter (Villa-Kamaroff et al., 1978), or tac promoter (DeBoer et al., 1983); See also “Useful proteins from recombinant bacteria” in Scientific American, 1980, 242: 74-94; Promoter elements from yeast or other fungi such as Gal 4 promoter, ADC (alcohol dehydrokinase) promoter, PGK (phosphoglycerol kinase) promoter, alkaline phosphatase promoter; And animal transcriptional regulatory regions that have shown tissue specificity and have been used in transgenic animals: Elastase I gene regulatory regions that are active in pancreatic vesicle cells (Swift et al., 1984; Ornitz et al., 1986; MacDonald, 1987) ; Insulin gene regulatory region active in pancreatic beta cells (Hanahan, 1985), immunoglobulin gene regulatory region active in lymphoid cells (Grosschedl et al., 1984; Adames et al., 1985; Alexander et al., 1987), mouse breast tumor virus regulatory region active in testis, breast, lymph and mast cells (Leder et al., 1986), albumin gene regulatory region active in the liver (Pinkert et al., 1987), Alpha-fetoprotein gene regulatory region active in the liver (Krumlauf et al., 1985; Hammer et al., 1987), alpha 1-antitrypsin gene regulatory region active in the liver (Kelsey et al., 1987) ), Beta-globin gene regulatory region active in myeloid cells (Mogram et al., 1985; Kollias et al., 1986), myelin basic protein gene regulatory region active in oligodendrome region cells of the brain ( Readhead et al., 1987), myosin nerves active in skeletal muscle 2 gene regulatory region (Sani, 1985), and the band is active in the hypothalamus to release pin Tarragona dot hormone gene control region (Mason et al., 1986) and include, but not limited thereto.

본 발명의 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유하는 발현벡터는 4가지 일반 방법으로 동정될 수 있다: (a)목적하는 플라스미드 DNA 또는 특이적 mRNA의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭, (b)핵산 하이브리드화, (c)선별 마커 유전자기능의 존재 또는 부재, (d)적당한 제한 엔도뉴클레아제에 의한 분석, 및 (e)삽입된 서열의 발현. 첫번째 방법에서, 핵산은 증폭 산물의 검출을 제공하기 위해 PCR로 증폭시킬 수 있다. 두번째 방법에서, 발현벡터에 삽입된 외래 유전자의 존재는 삽입된 마커 유전자와 상동성인 서열을 포함하는 탐침을 사용하는 핵산 하이브리드화에 의해 검출될 수 있다. 세번째 방법에서, 재조합 벡터/숙주 시스템은 벡터내 외래 유전자의 삽입으로 초래된 특정의 "선별 마커" 유전자 기능(예를 들면, b-갈락토시다제 활성, 티미딘 키나제 활성, 항생제 내성, 형질전환 표현형, 배큘로바이러스에서의 교합체 형성 등)의 존재 또는 부재에 기초하여 동정 및 선별될 수 있다. 또다른 예에서, ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 벡터의 "선별 마커" 유전자 서열 안에 삽입되면, ABC1 유전자 기능의 부재에 의해 ABC1 핵산 삽입체를 함유하는 재조합체가 동정될 수 있다. 네번째 방법에서, 재조합 발현벡터는 적당한 제한 효소로 분해시켜 동정된다. 다섯번째 방법에서, 재조합 발현벡터는 재조합체에 의해 발현된 유전자 산물의 활성, 생화학적, 또는 면역학적 특징을 평가함으로써 동정될 수 있으며, 단 발현된 단백질은 기능적 활성 형태를 취한다.Expression vectors containing nucleic acids encoding the ABC1 polypeptides of the invention can be identified by four general methods: (a) polymerase chain reaction (PCR) amplification of the target plasmid DNA or specific mRNA, (b) Nucleic acid hybridization, (c) the presence or absence of selection marker gene function, (d) analysis by appropriate restriction endonucleases, and (e) expression of the inserted sequences. In the first method, nucleic acids can be amplified by PCR to provide detection of amplification products. In a second method, the presence of the foreign gene inserted into the expression vector can be detected by nucleic acid hybridization using a probe comprising a sequence homologous to the inserted marker gene. In a third method, the recombinant vector / host system is characterized by certain “selection marker” gene functions (eg, b-galactosidase activity, thymidine kinase activity, antibiotic resistance, transformation) resulting from the insertion of a foreign gene into the vector. Phenotype, occlusal formation in baculovirus, etc.) can be identified and selected. In another example, if a nucleic acid encoding an ABC1 polypeptide is inserted into the "selection marker" gene sequence of a vector, recombinants containing ABC1 nucleic acid inserts may be identified by the absence of ABC1 gene function. In a fourth method, recombinant expression vectors are identified by digestion with appropriate restriction enzymes. In a fifth method, recombinant expression vectors can be identified by assessing the activity, biochemical, or immunological characteristics of the gene product expressed by the recombinant, provided that the expressed protein takes a functionally active form.

광범위의 숙주/발현벡터 조합이 본 발명의 핵산 발현에 사용될 수 있다. 예를 들면, 유용한 발현벡터는 염색체, 비-염색체 및 합성 DNA 서열의 단편으로 구성될 수 있다. 적당한 벡터는 SV40 및 공지의 박테리아 플라스미드의 유도체, 예를 들면 이.콜라이 플라스미드 col E1, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX(Smith et al., 1988), pMB9 및 이들의 유도체, RP4와 같은 플라스미드; 파지 DNA, 예를 들면, 파지 1의 다수 유도체, 예를 들면 NM989, 및 다른 파지 DNA, 예를 들면 M13 및필라멘트성 일본쇄 파지 DNA; 효모 플라스미드, 예를 들면 2m 플라스미드 또는 이의 유도체; 진핵세포에서 유용한 벡터, 예를 들면 곤충 또는 포유동물 세포에서 유용한 벡터; 플라스미드와 파지 DNA의 조합으로부터 유래한 벡터, 예를 들면 파지 DNA 또는 타 발현 조절 서열을 사용하기 위해 변형시킨 플라스미드; 등을 포함한다.A wide range of host / expression vector combinations can be used for nucleic acid expression of the invention. For example, useful expression vectors can consist of fragments of chromosomes, non-chromosomes and synthetic DNA sequences. Suitable vectors are derivatives of SV40 and known bacterial plasmids, for example E. coli plasmid col E1, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX (Smith et al., 1988), pMB9 and derivatives thereof, RP4 and Same plasmid; Phage DNA, eg, multiple derivatives of phage 1, eg NM989, and other phage DNA such as M13 and filamentary single stranded phage DNA; Yeast plasmids such as 2m plasmids or derivatives thereof; Vectors useful in eukaryotic cells, such as vectors useful in insect or mammalian cells; Vectors derived from a combination of plasmid and phage DNA, such as plasmid modified to use phage DNA or other expression control sequences; And the like.

예를 들면, 배큘로바이러스 발현 시스템에서, pVL941(BamH1 클로닝 부위; Summers), pVL1393(BamH1, SmaI, XbaI, EcoR1, XmaIII, BglII, 및 PStI 클로닝 부위; Invitrogen), pVL1392(BglII, PstI, NotI, XmaIII, EcoRI, XbaI, SmaI, 및 BamH1 클로닝 부위; Summers and Invitrogen), 및 pBlueBacIII(BamH1, PstI, NcoI, 및 HindIII 클로닝 부위, 청/백 재조합체 스크리닝 가능; Invitrogen)와 같은 비-융합 전달 벡터(이에 한정되지 않음), 및 예를 들면, pAc700(BamH1 및 KpnI 클로닝 부위, 여기에서 BamH1 인식 부위는 개시 코돈으로 시작됨; Summers), pAc701 및 pAc702(pAc700과 동일, 상이한 판독 프레임 가짐), pAc360(폴리헤드린 개시 코돈의 다운스트림에 있는 BamH1 클로닝 부위 36 염기쌍; Invitrogen(195)), 및 pBlueBacHisA, B, C(3개의 상이한 판독 프레임, BamH1, BglII, PstI, NcoI, 및 HindIII 클로닝 부위, ProBond 정제를 위한 N-말단 펩타이드, 및 플라크의 청/백 재조합 스크리닝; Invitrogen(220)과 같은(이에 한정되지 않음) 융합 전달 벡터 모두 사용될 수 있다.For example, in the baculovirus expression system, pVL941 (BamH1 cloning site; Summers), pVL1393 (BamH1, SmaI, XbaI, EcoR1, XmaIII, BglII, and PStI cloning site; Invitrogen), pVL1392 (BglII, PstI, NotI, Non-fusion delivery vectors (XmaIII, EcoRI, XbaI, SmaI, and BamH1 cloning sites; Summers and Invitrogen), and pBlueBacIII (BamH1, PstI, NcoI, and HindIII cloning sites, blue / white recombinant screenable; Invitrogen) PAc700 (BamH1 and KpnI cloning sites, where the BamH1 recognition site begins with an initiation codon; Summers), pAc701 and pAc702 (same as pAc700, with different reading frames), pAc360 (poly) 36 base pairs of BamH1 cloning site downstream of the headlin initiation codon; Invitrogen (195), and pBlueBacHisA, B, C (3 different reading frames, BamH1, BglII, PstI, NcoI, and HindIII cloning site, for ProBond purification) Blue / white of N-terminal peptide, and plaque Screening combination; but not limited to, such as Invitrogen (220) can be used both fusion transfer vectors.

본 발명에 사용하는 데 고려되는 포유동물 발현벡터는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 프로모터와 같이 유도성 프로모터를 갖는 벡터, 예를 들면 DHFR 발현벡터를 갖는 발현벡터, 또는 pED(PstI, SalI, SbaI, SmaI, 및 EcoRI 클로닝 부위, 벡터는 클로닝된 유전자 및 DHFR 모두 발현; Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991)와 같은 DHFR/메토트렉세이트 공-발현벡터를 갖는 발현벡터를 포함한다. 이와 달리, pEE14(HindIII, XbaI, SmaI, SbaI, EcoRI, 및 BclI 클로닝 부위, 여기에서 벡터는 글루타민 신타제 및 클로닝된 유전자를 발현; Celltech)와 같은 글루타민 신세타제/메티오닌 설폭시민 공-증폭 벡터. 다른 양태에서, 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 조절하에 에피솜 발현을 지시하는 벡터, 예를 들면 pREP4(BamH1, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII, 및 KpnI 클로닝 부위, 구조적 RSV-LTR 프로모터, 하이그로마이신 선별 마커; Invitrogen), pCEP4(BamH1, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII, 및 KpnI 클로닝 부위, 구조적 hCMV 즉시 초기 유전자, 하이그로마이신 선별 마커; Invitrogen), pMEP4(Kpn1, PvuI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamH1 클로닝 부위, 유도성 메탈로티오네인 IIa 유전자 프로모터, 하이그로마이신 선별 마커: Invitrogen), pREP8(BamH1, XhoI, NotI, HindIII, NheI, 및 KpnI 클로닝 부위, RSV-LTR 프로모터, 히스티디놀 선별 마커; Invitrogen), pREP9(KpnI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, 및 BamHI 클로닝 부위, RSV-LTR 프로모터, G418 선별 마커; Invitrogen), 및 pEBVHis(RSV-LTR 프로모터, 하이그로마이신 선별 마커, ProBond를 통해 정제 가능하고 엔테로키나제에 의해 절단되는 N-말단 펩타이드)가 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 선별 가능한 포유동물 발현벡터는 pRc/CMV(HindIII, BstXI, NotI, SbaI, 및 ApaI 클로닝 부위, G418 선별; Invitrogen), pRc/RSV(HindIII,SpeI, BstXI, NotI 클로닝 부위, G418 선별; Invitrogen) 등을 포함한다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 백시니아 바이러스 포유동물 발현벡터(Kaufman, 1991, 상기 참조)는 pSC11(SmaI 클로닝 부위, TK- 및 b-gal 선별), pMJ601(SalI, SmaI, AflI, NarI, BspMII, BamHI, ApaI, NheI, SacII, KpnI, 및 HindIII 클로닝 부위; TK- 및 b-gal 선별), 및 pTKgptF1S(EcoRI, PstI, SalI, AccI, HindII, SbaI, BamHI, 및 Hpa 클로닝 부위, TK 또는 XPRT 선별)을 포함하며 이에 한정되지 않는다.Mammalian expression vectors contemplated for use in the present invention are vectors having an inducible promoter, such as a dihydrofolate reductase (DHFR) promoter, for example, an expression vector having a DHFR expression vector, or a pED (PstI, SalI, SbaI, SmaI, and EcoRI cloning sites, vectors include expression of both cloned genes and DHFR; expression vectors with DHFR / methotrexate co-expression vectors such as Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991). Glutamine synthetase / methionine sulfoximine co-amplification vectors, such as pEE14 (HindIII, XbaI, SmaI, SbaI, EcoRI, and BclI cloning sites, wherein the vector expresses glutamine synthase and cloned genes; Celltech). In a vector that directs episomal expression under the control of Epstein Barr virus (EBV), for example pREP4 (BamH1, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII, and KpnI cloning site, structural RSV- LTR promoter, hygromycin selection marker; Invitrogen), pCEP4 (BamH1, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII, and KpnI cloning sites, structural hCMV immediate early gene, hygromycin selection marker; Invitrogen), pMEP4 (Kpn1, PvuI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamH1 cloning site, inducible metallothionein IIa gene promoter, hygromycin selection marker: Invitrogen), pREP8 (BamH1, XhoI, NotI, HindIII, NheI And KpnI cloning site, RSV-LTR promoter, histidinol selection marker; Invitrogen), pREP9 (KpnI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, and BamHI cloning site, RSV-LTR promoter, G418 selection marker; Invitrogen), and pEBVHis (RSV-LTR promoter, hygromycin selection marker, N-terminal peptide which is purified through ProBond and cleaved by enterokinase) can be used. Selectable mammalian expression vectors for use in the present invention include pRc / CMV (HindIII, BstXI, NotI, SbaI, and ApaI cloning sites, G418 screening; Invitrogen), pRc / RSV (HindIII, SpeI, BstXI, NotI cloning sites, G418 selection; Invitrogen) and the like. Vaccinia virus mammalian expression vectors (Kaufman, 1991, supra) for use in accordance with the present invention include pSC11 (SmaI cloning site, TK- and b-gal selection), pMJ601 (SalI, SmaI, AflI, NarI, BspMII, BamHI, ApaI, NheI, SacII, KpnI, and HindIII cloning sites; TK- and b-gal selection), and pTKgptF1S (EcoRI, PstI, SalI, AccI, HindII, SbaI, BamHI, and Hpa cloning sites, TK or XPRT selection ), Including but not limited to.

효모 발현 시스템도 ABC1 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들면, 바로 두 개를 말하면 비-융합 pYES2 벡터(XbaI, SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI, BstXI, BamH1, SacI, Kpn1, 및 HindIII 클로닝 부위; Invitrogen) 또는 융합 pYESHisA, B, C(XbaI, SphI, ShoI, NotI, BstXI, EcoRI, BamH1, SacI, KpnI, 및 HindIII 클로닝 부위, ProBond 수지로 정제되고 엔테로키나제로 절단된 N-말단 펩타이드; Invitrogen)가 본 발명에 따라 사용될 수 있다.Yeast expression systems can also be used in accordance with the present invention to express ABC1 polypeptide. For example, just two words non-fused pYES2 vectors (XbaI, SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI, BstXI, BamH1, SacI, Kpn1, and HindIII cloning sites; Invitrogen) or fused pYESHisA, B, C ( XbaI, SphI, ShoI, NotI, BstXI, EcoRI, BamH1, SacI, KpnI, and HindIII cloning site, N-terminal peptide purified with ProBond resin and cleaved with enterokinase; Invitrogen) can be used according to the present invention.

일단 특정의 재조합 DNA 분자가 동정 및 확인되면, 당업계에 공지된 몇가지 방법을 사용하여 이를 증식시킬 수 있다. 일단 적당한 숙주 시스템과 성장 조건이 설정되면, 재조합 발현벡터를 증식시켜 다량으로 제조할 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 사용될 수 있는 발현벡터는 몇개를 예를 들면 하기의 벡터 또는 이의 유도체가 포함되며 이에 한정되지 않는다: 백시니아 바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 인간 또는 동물 바이러스; 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스; 효모 벡터; 박테리오파지(예를 들면, 람다), 및 플라스미드 및 코스미드 DNA 벡터.Once a particular recombinant DNA molecule has been identified and identified, it can be propagated using several methods known in the art. Once appropriate host systems and growth conditions are established, recombinant expression vectors can be propagated to produce large amounts. As described above, expression vectors that may be used include, but are not limited to, for example, the following vectors or derivatives thereof: human or animal viruses such as vaccinia virus or adenovirus; Insect viruses such as baculovirus; Yeast vectors; Bacteriophages (eg, lambda), and plasmid and cosmid DNA vectors.

또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 원하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형 및 가공하는 숙주세포 균주가 선택될 수 있다. 상이한 숙주세포는 단백질의 전사 및 후-해독 프로세싱 및 변형(예를 들면, 글리코실화, 절단[예를 들면, 시그널 서열의])에 대한 특징적이고 구체적인 메커니즘을 가진다. 적당한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현된 외래 단백질의 원하는 변형과 프로세싱을 보장하도록 선택될 수 있다. 예를 들면, 박테리아 시스템에서의 발현을 이용하여 비-글리코실화 코어 단백질 산물을 생산할 수 있다. 그러나, 박테리아에서 발현된 막횡단 ABC1 단백질이 적절히 폴딩되지 않을 수도 있다. 효모에서의 발현은 글리코실화 산물을 생성할 수 있다. 진핵세포에서의 발현은 이종 단백질의 "네이티브" 글리코실화 및 폴딩의 가능성을 증가시킬 수 있다. 더욱이, 포유동물에서의 발현은 ABC1 활성의 재구성, 또는 구성을 위한 도구를 제공할 수 있다. 아울러, 상이한 벡터/숙주 발현 시스템은 상이한 정도로, 단백질 분해 절단과 같은 프로세싱 반응에 영향을 미칠 수 있다.In addition, host cell strains may be selected that modulate the expression of the inserted sequences or modify and process the gene product in a specific manner as desired. Different host cells have characteristic and specific mechanisms for transcription and post-translational processing and modification of proteins (eg, glycosylation, cleavage [eg, of signal sequences]). Appropriate cell lines or host systems can be selected to ensure the desired modification and processing of the foreign protein expressed. For example, expression in bacterial systems can be used to produce non-glycosylated core protein products. However, the transmembrane ABC1 protein expressed in bacteria may not be properly folded. Expression in yeast can produce glycosylation products. Expression in eukaryotic cells can increase the likelihood of "native" glycosylation and folding of heterologous proteins. Moreover, expression in mammals may provide a tool for reconstitution, or construction of ABC1 activity. In addition, different vector / host expression systems can affect processing reactions, such as proteolytic cleavage, to different extents.

벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들면 형질감염, 전기투공, 미세주사, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전, 리포펙션(라이소좀 융합), 유전자 건의 사용, 또는 DNA 벡터 트랜스포터에 의해 목적하는 숙주세포 중으로 도입된다(예를 들면, Wu et al., 1992; Wu and Wu, 1988; Hartmut et al., 1990년 3월 15일자 출원된 캐나다 특허원 No. 2,012,311 참조).Vectors are known in the art, such as transfection, electroporation, microinjection, transduction, cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate precipitation, lipofection (lysosomal fusion), use of gene guns, or DNA vectors Introduced into a desired host cell by a transporter (see, eg, Wu et al., 1992; Wu and Wu, 1988; Hartmut et al., Filed March 15, 1990, Canadian Patent Application No. 2,012,311). .

그러한 DNA가 세포 내측으로 도입되었을 때 세포는 외생성 또는 이종 DNA로 "형질감염"된다. 형질감염된 DNA가 표현형 변화에 영향을 줄 때 세포는 외생성 또는 이종 DNA로 "형질전환"된다. 바람직하게는, 형질전환 DNA는 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA 중으로 통합(공유 결합)되어야 한다.When such DNA is introduced into a cell, the cell is "transfected" with exogenous or heterologous DNA. When transfected DNA affects phenotypic changes, cells are "transformed" into exogenous or heterologous DNA. Preferably, the transforming DNA should be integrated (covalently linked) into the chromosomal DNA making up the genome of the cell.

인테그럴 막 단백질로 발현된 재조합 마커 단백질은 표준 방법으로 분리 정제할 수 있다. 일반적으로, 인테그럴 막 단백질은 막을 세제, 예를 들면 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 트리톤 X-100 폴리옥시에틸렌 에스테르, Ipagel/nonidet P-40(NP-40)(옥틸페녹시)-폴리에톡시에탄올, 디곡신, 나트륨 데옥시콜레이트 등 및 이들의 혼합물로(이에 한정되지 않음) 용해시켜 수득할 수 있다. 가용화는 현탁액의 초음파처리에 의해 증진시킬 수 있다. 단백질의 가용성 형태는 배양액을 수집하거나, 예를 들면 세제 처리, 및 필요에 따라 초음파처리 또는 다른 기계적 과정 에 의해 봉입체를 가용화시킴으로써 수득될 수 있다. 가용화된 또는 가용성 단백질은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE), 등전 포커싱, 2차원 겔 전기영동, 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 친화성, 면역친화성, 및 사이징 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별 용해도, 면역침전과 같은 다양한 기술을 이용하여, 또는 단백질 정제를 위한 다른 표준 기술에 의해 분리할 수 있다.Recombinant marker proteins expressed as integral membrane proteins can be isolated and purified by standard methods. In general, integral membrane proteins are used in detergents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), triton X-100 polyoxyethylene esters, Ipagel / nonidet P-40 (NP-40) (octylphenoxy) -poly It can be obtained by dissolving (but not limited to) methoxyethanol, digoxin, sodium deoxycholate and the like and mixtures thereof. Solubilization can be enhanced by sonication of the suspension. Soluble forms of the protein can be obtained by collecting the culture or solubilizing the inclusion body by, for example, detergent treatment, and by sonication or other mechanical procedures as necessary. Solubilized or soluble proteins include polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), isoelectric focusing, two-dimensional gel electrophoresis, chromatography (eg, ion exchange, affinity, immunoaffinity, and sizing column chromatography), centrifugation. Separation, differential solubility, immunoprecipitation can be performed using various techniques, or by other standard techniques for protein purification.

이와 달리, 본 발명에 따른 핵산 또는 벡터는 리포펙션에 의해 생체내에서 도입시킬 수 있다. 지난 십년 간, 시험관내에서 핵산의 캡슐화 및 형질감염에 리포솜의 사용이 증가하여 왔다. 리포솜 매개 형질감염으로 직면하는 난관과 위험을 제한하기 위해 디자인된 합성 양이온 지질을 사용하여 마커 암호화 유전자의 생체내 형질감염을 위한 리포솜을 제조할 수 있다(Felgner et al., 1987; Mackey et al., 1988; Ulmer et al., 1993). 양이온 지질의 사용은 음으로 하전된 핵산의 캡슐화를 촉진하고, 또한 음으로 하전된 세포막과의 융합을 촉진한다(Felgner and Ringold,1989). 핵산의 전달에 특히 유용한 지질 화합물과 조성물이 국제특허 공개 WO95/18863 및 W96/17823에, 및 U.S. 특허 No. 5,459,127에 기술되어 있다. 생체내 특정 기관으로 외생성 유전자의 도입에 리포펙션의 사용은 특정의 실용적인 이점이 있다. 특정 세포에 대한 리포솜의 분자 표적화는 이점 중 한 영역을 나타낸다. 특정 세포 유형으로의 형질감염 지정이 췌장, 간, 신장, 및 뇌와 같은 세포 불균질성을 갖는 조직에서 특히 바람직함이 자명하다. 지질은 표적화 목적을 위해 타 분자에 화학적으로 커플링될 수 있다[Macket et al., 상기 참조]. 표적화된 펩타이드, 즉 호르몬 또는 신경전달물질, 및 항체와 같은 단백질 또는 비-펩타이드 분자를 리포솜에 화학적으로 커플링시킬 수 있다.Alternatively, nucleic acids or vectors according to the invention can be introduced in vivo by lipofection. Over the past decade, the use of liposomes for encapsulation and transfection of nucleic acids in vitro has been increasing. Synthetic cationic lipids designed to limit the challenges and risks encountered with liposome mediated transfection can be used to prepare liposomes for in vivo transfection of marker coding genes (Felgner et al., 1987; Mackey et al. , 1988; Ulmer et al., 1993). The use of cationic lipids promotes the encapsulation of negatively charged nucleic acids and also promotes fusion with negatively charged cell membranes (Felgner and Ringold, 1989). Lipid compounds and compositions particularly useful for the delivery of nucleic acids are described in WO 95/18863 and W96 / 17823, and in U.S. Patent No. 5,459,127. The use of lipofection in the introduction of exogenous genes into specific organs in vivo has certain practical advantages. Molecular targeting of liposomes to specific cells represents one area of advantage. It is apparent that the designation of transfection to specific cell types is particularly desirable in tissues with cell heterogeneity such as pancreas, liver, kidney, and brain. Lipids can be chemically coupled to other molecules for targeting purposes (Macket et al., Supra). Proteins or non-peptide molecules such as targeted peptides, ie hormones or neurotransmitters, and antibodies, can be chemically coupled to liposomes.

양이온성 올리고펩타이드(예를 들면, 국제특허 공개 WO95/21931), DNA 결합 단백질로부터 유래된 펩타이드(예를 들면, 국제특허 공개 WO96/25508), 또는 양이온 중합체(예를 들면, 국제특허 공개 WO95/21931)와 같은 다른 분자 또한 생체내에서 핵산의 형질감염을 촉진하는 데 유용할 수 있다.Cationic oligopeptides (eg WO 95/21931), peptides derived from DNA binding proteins (eg WO 96/25508), or cationic polymers (eg WO 95/21931). Other molecules, such as 21931), may also be useful for promoting transfection of nucleic acids in vivo.

네이키드 DNA 플라스미드로서 생체내로 벡터를 도입하는 것도 가능하다(U.S.특허 5,693,622, 5,589,466 및 5,580,859). 유전자 요법을 위한 네이키드 DNA 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들면, 형질감염, 전기투공, 미세주사, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전, 유전자 건의 이용, 또는 DNA 벡터 트랜스포터의 사용에 의해 목적하는 숙주세포 중으로 도입시킬 수 있다(참조: Wu et al., 1992, Wu and Wu, 1988; Hartmut et al., 1990년 3월 15일자 출원된 캐나다 특허원 No. 2,012,311; Williams et al., 1991). 수용체-매개 DNA 전달법도사용될 수 있다(Curiel et al., 1992; Wu and Wu, 1987).It is also possible to introduce vectors in vivo as naked DNA plasmids (U.S. Patents 5,693,622, 5,589,466 and 5,580,859). Naked DNA vectors for gene therapy include methods known in the art, such as transfection, electroporation, microinjection, transduction, cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate precipitation, use of gene guns, or DNA vectors It can be introduced into a host cell of interest by use of a transporter (Wu et al., 1992, Wu and Wu, 1988; Hartmut et al., Filed March 15, 1990, Canadian Patent Application No. 2,012,311). Williams et al., 1991). Receptor-mediated DNA delivery can also be used (Curiel et al., 1992; Wu and Wu, 1987).

"약학적으로 허용되는 비히클 또는 부형제"는 투여방법에 약학적으로 허용되고, 멸균성이며, 적당한 분산제 또는 습윤제와 현탁제를 사용하여 제형된 수성 또는 유성 현탁액일 수 있는 희석제 및 충진제를 포함한다. 특정의 약학적으로 허용되는 담체 및 활성 화합물:담체의 비는 조성물의 용해도와 화학적 성질, 특정의 투여방식, 및 표준 제약학적 실행에 의해 결정된다.“Pharmaceutically acceptable vehicle or excipient” includes diluents and fillers which are pharmaceutically acceptable for the method of administration, sterile and may be aqueous or oily suspensions formulated with suitable dispersing or wetting agents and suspending agents. The ratio of a particular pharmaceutically acceptable carrier and active compound: carrier is determined by the solubility and chemical nature of the composition, the particular mode of administration, and standard pharmaceutical practice.

본 발명의 핵산, 폴리펩타이드, 벡터, 또는 숙주세포는 바람직하게는 약학적으로 허용되는 비히클 또는 부형제로 생체내에 도입될 것이다. "약학적으로 허용되는"이란 구절은 생리학적으로 허용되고 인간에 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 다루기 힘든 반응을 일으키지 않는 분자 실재 및 조성물을 말한다. 바람직하게는, 본원에서 사용되듯이, "약학적으로 허용되는"이란 연방정부의 규제국에서 인가받았거나 동물, 특히 인간에서의 사용을 위한 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인식되어 있는 약전에 올라 있음을 의미한다. "부형제"란 용어는 화합물이 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 말한다. 이러한 약학적 담체는 낙화생유, 대두유, 광유, 호마유 등과 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들을 포함하여, 물 및 오일과 같은 멸균액일 수 있다. 물 또는 수용액 생리식염수액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 바람직하게는 부형제로서, 특히 주사액을 위해 사용된다. 적당한 약학적 부형제는 E.W. Martin의 "Remington′s Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다.Nucleic acids, polypeptides, vectors, or host cells of the invention will preferably be introduced in vivo into a pharmaceutically acceptable vehicle or excipient. The phrase “pharmaceutically acceptable” refers to molecular entities and compositions that are physiologically acceptable and that, when administered to a human, typically do not cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness, or the like. Preferably, as used herein, "pharmaceutically acceptable" means that it is licensed by a federal regulatory authority or is listed in a US pharmacopoeia or other generally recognized pharmacopeia for use in animals, especially humans. it means. The term "excipient" refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the compound is administered. Such pharmaceutical carriers may be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. Water or aqueous solution saline solution and aqueous dextrose and glycerol solutions are preferably used as excipients, in particular for injection solutions. Suitable pharmaceutical excipients are described in E.W. Martin's "Remington's Pharmaceutical Sciences".

당연히, 본 발명은 유전자 요법 적용을 위한 치료 유효량의 ABC1 폴리펩타이드를 발현하게 될 벡터의 전달을 고려한다. "치료 유효량"이란 구절은 숙주의 활성에 있어서의 임상적으로 중요한 결함, 기능 및 반응을 적어도 약 15%, 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%까지 감소시키고, 한층 더 바람직하게는 예방하기에 충분한 양을 의미한다. 또한, 치료 유효량은 숙주에서 임상적으로 유의한 증상의 개선을 초래하기에 충분하다.Naturally, the present invention contemplates delivery of a vector that will express a therapeutically effective amount of ABC1 polypeptide for gene therapy applications. The phrase “therapeutically effective amount” reduces clinically significant defects, functions, and responses in the activity of the host by at least about 15%, preferably at least 50%, more preferably at least 90%, even more preferably. Means an amount sufficient to prevent. In addition, a therapeutically effective amount is sufficient to result in improvement of clinically significant symptoms in the host.

"지질 프로필"은 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 지방단백질 콜레스테롤 및 인간 또는 다른 동물 체내의 다른 지질의 세트를 의미한다."Lipid profile" means a set of cholesterol, triglycerides, lipoprotein cholesterol and other lipids in the human or other animal body.

"바람직하지 않은 지질 프로필"은 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 또는 지방단백질 콜레스테롤의 농도가 연령- 및 성별-조정된 기준 범위를 벗어나는 상태이다. 일반적으로, 총 콜레스테롤 ＞200 mg/dl, 혈장 트리글리세라이드 ＞200 mg/dl, LDL 콜레스테롤 ＞130 mg/dl, HDL 콜레스테롤 ＜39 mg/dl의 농도, 또는 총 콜레스테롤:HDL 콜레스테롤의 비 ＞4.0이 바람직하지 않은 지질 프로필인 것으로 생각된다. 바람직하지 않은 지질 프로필은 고지질혈증, 당뇨병 고콜레스테롤혈증, 및 관상동맥 질환의 다른 형태를 포함하여 각종 병리 상태와 관련된다.An "undesired lipid profile" is a condition in which the concentration of cholesterol, triglycerides, or lipoprotein cholesterol is outside the age- and gender-adjusted baseline range. Generally, total cholesterol> 200 mg / dl, plasma triglycerides> 200 mg / dl, LDL cholesterol> 130 mg / dl, HDL cholesterol <39 mg / dl, or total cholesterol: HDL cholesterol ratio> 4.0 are preferred. It is thought to be a lipid profile. Undesired lipid profiles are associated with various pathological conditions, including hyperlipidemia, diabetic hypercholesterolemia, and other forms of coronary artery disease.

ABC1 유전자의 핵산Nucleic Acids of the ABC1 Gene

게놈 서열Genomic sequence

마우스의 정규위치(orthologous) ABC1 유전자의 구조를 특히 참고하면, 인간 ABC1 유전자는 48개의 엑손과 47개의 인트론을 포함하는 것으로 여겨진다. 최근에 와서, 부분 엑손 및 인트론 ABC1 게놈 DNA가 분리되고 동정되었다(Rust et al., 1999). 본 발명에 따라, 인간 ABC1 유전자가 49 엑손 및 48 인트론을 포함함이 비로서 밝혀졌다.With particular reference to the structure of the orthologous ABC1 gene in mice, the human ABC1 gene is believed to contain 48 exons and 47 introns. Recently, partial exons and intron ABC1 genomic DNA have been isolated and identified (Rust et al., 1999). According to the invention, it has been found that the human ABC1 gene comprises 49 exons and 48 introns.

ABC1 유전자의 여러 부분적 게놈 뉴클레오타이드 서열이 본 발명에 따라 분리되고 특징규명 되었는데, 이들 게놈 서열은 샘플내 ABC1 유전자 또는 이의 뉴클레오타이드 발현 산물의 다양한 검출 수단의 생산을 위해 특히 사용될 수 있는 신규한 엑손 서열과 인트론 서열 모두를 포함하고 있다. 이들 부분 게놈 서열은 하기 표 1에 나타나 있다.Several partial genomic nucleotide sequences of the ABC1 gene have been isolated and characterized in accordance with the present invention, which genome sequences are novel exon sequences and introns that can be used in particular for the production of various means of detection of the ABC1 gene or its nucleotide expression products in a sample. It contains both sequences. These partial genomic sequences are shown in Table 1 below.

인간 ABC1 유전자의 부분(p) 게놈 DNAPart (p) genomic DNA of the human ABC1 gene 서열번호SEQ ID NO: ABC1 게놈 DNAABC1 genomic DNA 1One 인트론 1(p), 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3, 인트론 3, 엑손 4, 인트론 4(p)Intron 1 (p), exon 2, intron 2, exon 3, intron 3, exon 4, intron 4 (p) 44 인트론 4(p), 엑손 5, 인트론 5(p)Intron 4 (p), Exon 5, Intron 5 (p) 55 인트론 5(p), 엑손 6, 인트론 6(p)Intron 5 (p), exon 6, intron 6 (p) 66 인트론 6(p), 엑손 7, 인트론 7(p)Intron 6 (p), Exon 7, Intron 7 (p) 77 인트론 7(p), 엑손 8, 인트론 8(p)Intron 7 (p), exon 8, intron 8 (p) 88 인트론 8(p), 엑손 9, 인트론 9, 엑손 10, 인트론 10(p)Intron 8 (p), exon 9, intron 9, exon 10, intron 10 (p) 99 인트론 10(p), 엑손 11, 인트론 11(p)Intron 10 (p), Exon 11, Intron 11 (p) 1010 인트론 11(p), 엑손 12, 인트론 12, 엑손 13, 인트론 13, 엑손 14, 인트론 14, 엑손 15, 인트론 15, 엑손 16, 인트론 16, 엑손 17, 인트론 17(p)Intron 11 (p), exon 12, intron 12, exon 13, intron 13, exon 14, intron 14, exon 15, intron 15, exon 16, intron 16, exon 17, intron 17 (p) 1111 인트론 17(p), 엑손 18, 인트론 18(p)Intron 17 (p), Exon 18, Intron 18 (p) 1212 인트론 38(p), 엑손 39, 인트론 39(p)Intron 38 (p), Exon 39, Intron 39 (p) 1313 인트론 42(p), 엑손 43, 인트론 43(p)Intron 42 (p), Exon 43, Intron 43 (p) 1414 인트론 43(p), 엑손 44, 인트론 44(p)Intron 43 (p), Exon 44, Intron 44 (p) 1515 인트론 44(p), 엑손 45, 인트론 45(p)Intron 44 (p), Exon 45, Intron 45 (p) 1616 인트론 45(p), 엑손 46, 인트론 46, 엑손 47, 인트론 47(p)Intron 45 (p), exon 46, intron 46, exon 47, intron 47 (p) 1717 인트론 48(p), 엑손 49, 3′말단 서열Intron 48 (p), exon 49, 3 ′ terminal sequence

따라서, 본 발명의 제 1 주제는 서열번호 1 및 4-17 중 임의 하나 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 있다.Accordingly, a first subject of the invention is a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 and 4-17 or of a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한, a)서열번호 1 및 4-8, 및 11-16 중 임의 하나 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to a) any one of SEQ ID NOs: 1 and 4-8, and 11-16 or to a complementary polynucleotide sequence, b) a nucleotide 3154-3200 of SEQ ID NO: 9, or a complementary polynucleotide sequence, c) SEQ ID NO: 10 Nucleotide 1-242, or a complementary polynucleotide sequence, or d) a nucleotide 1-1851 of SEQ ID NO: 17, or a nucleic acid comprising at least eight consecutive nucleotides of a polynucleotide sequence comprising a complementary polynucleotide sequence.

본 발명의 주제는 또한, a)서열번호 1 및 4-8, 및 11-16 중 임의 하나 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산이다.The subject matter of the present invention also relates to a) any one of SEQ ID NOs: 1 and 4-8, and 11-16 or to a complementary polynucleotide sequence, b) a nucleotide 3154-3200 of SEQ ID NO: 9, or a complementary polynucleotide sequence, c) sequence Nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 10, or a complementary polynucleotide sequence, or d) a nucleotide 1-1851 of SEQ ID NO: 17, or a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한, a)서열번호 1 및 4-8, 및 11-16 중 임의 하나 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 한층 더 바람직하게는 98% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to a) any one of SEQ ID NOs: 1 and 4-8, and 11-16 or to a complementary polynucleotide sequence, b) a nucleotide 3154-3200 of SEQ ID NO: 9, or a complementary polynucleotide sequence, c) SEQ ID NO: 10 At least 85%, preferably 90%, more preferably 95% of nucleic acids comprising nucleotides 1-242, or the complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or d) nucleotides 1-1851, or the complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 17; And more preferably relates to a nucleic acid having 98% nucleotide identity.

본 발명은 또한, a)서열번호 1 및 4-8, 및 11-16 중 임의 하나 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 고엄격 조건하에서 하이브리드화하는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to a) any one of SEQ ID NOs: 1 and 4-8, and 11-16 or to a complementary polynucleotide sequence, b) a nucleotide 3154-3200 of SEQ ID NO: 9, or a complementary polynucleotide sequence, c) SEQ ID NO: 10 Nucleotide 1-242, or a complementary polynucleotide sequence, or d) a nucleotide 1-1851 of SEQ ID NO: 17, or a nucleic acid that hybridizes under high stringency conditions with a complementary polynucleotide sequence.

ABC1 유전자의 수개의 엑손이 적어도 부분적으로 이의 뉴클레오타이드 서열에 의해 특징규명 되었으며, 하기 표 2에 나타나 있다.Several exons of the ABC1 gene have been characterized, at least in part, by their nucleotide sequences and are shown in Table 2 below.

인간 ABC1 엑손 DNAHuman ABC1 Exon DNA 엑손 번호Exon number 서열번호SEQ ID NO: 서열번호에서의 위치Position in SEQ ID NO: 5′뉴클레오타이드의 위치Location of 5'nucleotides 3′뉴클레오타이드의 위치Position of 3 ′ nucleotides 22 1818 1One 46474647 47404740 33 1919 1One 92749274 94159415 44 2020 1One 1068510685 1080310803 55 2121 44 254254 375375 66 2222 55 161161 337337 77 2323 66 107107 199199 88 2424 77 604604 844844 99 2525 88 615615 754754 1010 2626 88 10841084 12001200 1111 2727 99 30033003 32003200 1717 2828 1010 78887888 80018001 1818 2929 1111 388388 559559 3939 3030 1212 44 127127 4343 3131 1313 266266 372372 4444 3232 1414 1616 157157 4545 3333 1515 177177 311311 4646 3434 1616 377377 480480 4747 3535 1616 963963 10551055 4949 3636 1717 195195 30883088

따라서, 본 발명은 서열번호 18-36 중 임의 하나 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.Accordingly, the present invention relates to a nucleic acid comprising any one of SEQ ID NOs: 18-36 or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한 서열번호 18-36 중 임의 하나로 표시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 18-36, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한 a)서열번호 18-26 및 28-35 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산에 관한 것이다.The present invention also relates to a) any one of SEQ ID NOs: 18-26 and 28-35, or complementary polynucleotide sequence, b) nucleotide 152-198 of SEQ ID NO: 27, or complementary polynucleotide sequence, c) nucleotide 1 of SEQ ID NO: 36 -1657, or a nucleic acid comprising at least eight consecutive nucleotides of the complementary polynucleotide sequence.

본 발명의 주제는 또한, a)서열번호 18-26 및 28-35 중 임의 하나 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산이다.The subject matter of the present invention is also directed to a) any one of SEQ ID NOs: 18-26 and 28-35 or complementary polynucleotide sequence, b) nucleotide 152-198 of SEQ ID NO: 27, or complementary polynucleotide sequence, c) of SEQ ID NO: 36 Nucleotide 1-1657, or a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid comprising a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한, a)서열번호 18-26 및 28-35 중 임의 하나 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 한층 더 바람직하게는 98% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산에 관한 것이다.The invention also provides a) any one of SEQ ID NOs: 18-26 and 28-35 or a complementary polynucleotide sequence, b) a nucleotide 152-198 of SEQ ID NO: 27, or a complementary polynucleotide sequence, c) nucleotide 1 of SEQ ID NO: 36 -1657, or a nucleic acid having at least 85%, preferably 90%, more preferably 95%, and even more preferably 98% nucleotide identity with a nucleic acid comprising a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한, a)서열번호 18-26 및 28-35 중 임의 하나 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 고엄격 조건하에서 하이브리드화하는 핵산에관한 것이다.The invention also provides a) any one of SEQ ID NOs: 18-26 and 28-35 or a complementary polynucleotide sequence, b) a nucleotide 152-198 of SEQ ID NO: 27, or a complementary polynucleotide sequence, c) nucleotide 1 of SEQ ID NO: 36 -1657, or a nucleic acid hybridizing under high stringency conditions with a nucleic acid comprising a complementary polynucleotide sequence.

또한, ABC1 유전자의 몇몇 인트론이 적어도 부분적으로 분리되고 특징규명되었다. ABC1 유전자의 인트론 핵산, 및 이의 단편과 이들의 변이체도 샘플내 ABC1 유전자의 적어도 하나의 카피의 검출, 또는 ABC1 유전자내 주어진 표적 서열의 증폭을 위한 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머로 사용될 수 있다.In addition, several introns of the ABC1 gene have been at least partially isolated and characterized. Intron nucleic acids of the ABC1 gene, and fragments thereof and variants thereof, can also be used as nucleotide probes or primers for the detection of at least one copy of the ABC1 gene in a sample, or for the amplification of a given target sequence in the ABC1 gene.

ABC1 유전자의 인트론 핵산 서열을 표 3에 나타내었다.Intron nucleic acid sequences of the ABC1 gene are shown in Table 3.

인간 ABC1 인트론 DNAHuman ABC1 Intron DNA 인트론 번호Intron number 서열번호SEQ ID NO: 서열번호내 위치Position in sequence number 5′뉴클레오타이의 위치Position of 5 ′ nucleotides 3′뉴클레오타이드의 위치Position of 3 ′ nucleotides 1(3′말단)1 (3 'end) 3737 1One 1One 46464646 22 3838 1One 47414741 92739273 33 3939 1One 94169416 1068410684 4(5′말단)4 (5 'end) 4040 1One 1080410804 1175411754 4(3′말단)4 (3 'end) 4141 44 1One 253253 5(5′말단)5 (5 'end) 4242 44 376376 571571 5(3′말단)5 (3 'end) 4343 55 1One 160160 6(5′말단)6 (5 'end) 4444 55 338338 428428 6(3′말단)6 (3 'end) 4545 66 1One 106106 7(5′말단)7 (5 'end) 4646 66 200200 213213 7(3′말단)7 (3 'end) 4747 77 1One 603603 8(5′말단)8 (5 'end) 4848 77 845845 14021402 8(3′말단)8 (3 'end) 4949 88 1One 614614 99 5050 88 755755 10831083 10(5′말단)10 (5 'end) 5151 88 12011201 18081808 11(5′말단)11 (5 'end) 5252 99 32013201 32153215 11(3′말단)11 (3 'end) 5353 1010 1One 639639 17(3′말단)17 (3 'end) 5454 1111 1One 387387 18(5′말단)18 (5 'end) 5555 1111 560560 578578 38(3′말단)38 (3 'end) 5656 1212 1One 33 39(5′말단)39 (5 'end) 5757 1212 128128 384384 42(3′말단)42 (3 'end) 5858 1313 1One 265265 43(5′말단)43 (5 'end) 5959 1313 373373 386386 43(3′말단)43 (3 'end) 6060 1414 1One 1515 44(5′말단)44 (5 'end) 6161 1414 158158 345345 44(3′말단)44 (3 'end) 6262 1515 1One 176176 45(5′말단)45 (5 'end) 6363 1515 312312 618618 45(3′말단)45 (3 'end) 6464 1616 1One 376376 4646 6565 1616 481481 962962 47(5′말단)47 (5 'end) 137137 1616 10561056 13291329 48(3′말단)48 (3 'end) 6868 1717 1One 194194

따라서, 본 발명은 또한 서열번호 37-65, 68, 및 137 중 임의 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.Accordingly, the present invention also relates to a nucleic acid comprising the polynucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 37-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한 서열번호 37-65, 68, 및 137 중 임의 하나로 표시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 37-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한, a)서열번호 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 b)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산에 관한 것이다.The invention also provides a) at least one of SEQ ID NOs: 37-52, 54-65, 68, and 137, or complementary polynucleotide sequences, or b) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or complementary polynucleotide sequences. It relates to a nucleic acid comprising eight consecutive nucleotides.

본 발명의 주제는 또한, a)서열번호 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 b)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산에 관한 것이다.The subject matter of the present invention also relates to a) any one of SEQ ID NOs: 37-52, 54-65, 68, and 137, or complementary polynucleotide sequence, or b) nucleotides 1-242, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 53 A nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid comprising.

본 발명은 또한, a)서열번호 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 b)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 한층 더 바람직하게는 98% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산에 관한 것이다.The invention also includes a) any one of SEQ ID NOs: 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence, or b) the nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a complementary polynucleotide sequence To a nucleic acid having at least 85%, preferably 90%, more preferably 95%, and even more preferably 98% nucleotide identity with the nucleic acid.

본 발명은 또한, a)서열번호 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 b)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 고엄격 조건하에서 하이브리드화하는 핵산에 관한 것이다.The invention also includes a) any one of SEQ ID NOs: 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence, or b) the nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a complementary polynucleotide sequence The present invention relates to a nucleic acid that hybridizes under high stringency conditions.

완전 길이 ABC1 단백질을 암호화하는 cDNA 분자CDNA molecule encoding full length ABC1 protein

전술한 바와 같이, 인간 ABC1 유전자에 상응하는 부분 cDNA 서열이 Langman 등(1999)에 의해 동정되었다. ABC1의 이러한 부분 cDNA 서열은 6880개의 뉴클레오타이드로 구성되고, 콜레스테롤 역수송에 연관된 질환에 걸리지 않은 피검자에서 생산된 부분적인 2201 아미노산(aa) ABC1 폴리펩타이드에 상응하는 6603 뉴클레오타이드 개방 판독 프레임을 함유한다. 또한, Langmann 등(1999)에 의해 기술된 cDNA 서열은 5'-비해독 영역(UTR)(뉴클레오타이드 1부터 120)의 일부와 3'-UTR 영역(뉴클레오타이드 6727부터 6880)의 일부를 함유한다.As described above, partial cDNA sequences corresponding to the human ABC1 gene have been identified by Langman et al. (1999). This partial cDNA sequence of ABC1 consists of 6880 nucleotides and contains a 6603 nucleotide open reading frame corresponding to a partial 2201 amino acid (aa) ABC1 polypeptide produced in a subject not affected by cholesterol back transport. In addition, the cDNA sequence described by Langmann et al. (1999) contains a portion of the 5'-nontranslated region (UTR) (nucleotides 1 to 120) and a portion of the 3'-UTR region (nucleotides 6727 to 6880).

최근에 와서, 인간 ABC1 cDNA의 3′-UTR의 추가 부분이 분리되고 동정되었다(Rust et al., 1999).Recently, additional portions of the 3′-UTR of human ABC1 cDNA have been isolated and identified (Rust et al., 1999).

완전 길이 인간 ABC1 단백질을 암호화하는 cDNA가 비로서 본 발명에 따라 동정되었다(실시예 2 참조). 이러한 신규의 인간 ABC1 cDNA(서열번호 69)는 244개의 추가적인 5′뉴클레오타이드 및 진정한 개시 ATG 코돈을 포함하는 새로 동정된 5′-영역을 포함한다. 본 발명에 따라, 새로운 인간 ABC1 cDNA는 Langmann 등(199) 및 Rust 등(1999)에 의해 앞서 보고된 것보다 더 큰 개방 판독 프레임을 포함한다. 특히, 본 발명의 이러한 cDNA 핵산 분자는 완전 길이 인간 ABC1 단백질의 N-말단에서 60개의 추가 아미노산을 암호화한다. 추가로, 본 발명의 이러한 새로운 cDNA 분자는 새로 동정된 5′UTR을 포함한다.CDNA encoding the full length human ABC1 protein was identified according to the invention as a ratio (see Example 2). This new human ABC1 cDNA (SEQ ID NO: 69) comprises a newly identified 5′-region comprising 244 additional 5 ′ nucleotides and a true starting ATG codon. According to the present invention, the new human ABC1 cDNA comprises a larger open reading frame than previously reported by Langmann et al. (199) and Rust et al. (1999). In particular, such cDNA nucleic acid molecules of the invention encode 60 additional amino acids at the N-terminus of full length human ABC1 protein. In addition, these new cDNA molecules of the present invention comprise the newly identified 5'UTR.

완전 길이 ABC1 단백질의 특이 활성을 시험관내에서 시험하면, 완전 길이 ABC1 단백질이 세포 지질 유출을 촉진할 수 있음이 증명된다. 사실상, 실시예 16과도면 4 내지 7에 제시된 결과는 아포지방단백질이 완전 길이 ABC1 단백질로 형질감염되는 세포에서 콜레스테롤 및 인지질 유출을 현저히 증가시킴을 보여준다. 비교상, HDL 및 포스파티딜콜린은 완전 길이 ABC1 형질감염 세포에서의 콜레스테롤 유출을 매개하지 않거나 부분적으로만 매개한다.In vitro testing of the specific activity of full length ABC1 protein demonstrates that full length ABC1 protein can promote cellular lipid efflux. In fact, the results presented in Examples 16 and 4-7 show that apolipoproteins significantly increased cholesterol and phospholipid efflux in cells transfected with full length ABC1 protein. In comparison, HDL and phosphatidylcholine do not or only partially mediate cholesterol efflux in full length ABC1 transfected cells.

이러한 결과는 아포지방단백질이 ABC1 매개 콜레스테롤 및 인지질 유출을 위한 수용체임을 시사하는 듯하다. 또한, 도 7은 완전 길이 ABC1 형질감염 세포에의 apo A-I 및 A-II의 특이적 결합을 명백히 증명하며, 따라서 완전 길이 ABC1 단백질이 아포지방단백질과의 직접 상호작용을 통해 작용하고, 이러한 상호작용이 아포지방단백질과 완전 길이 ABC1 단백질에 의해 촉진된 지질 유출에 요구됨을 암시한다. 따라서, 간과 장으로부터의 생체내 아포지방단백질이 순환하고 말초 세포로부터 지질 유출을 보충하기 위해 세포 표면상에서 완전 길이 ABC1 단백질과 상호작용함을 생각할 수 있다.These results seem to suggest that apofatty protein is a receptor for ABC1-mediated cholesterol and phospholipid efflux. In addition, Figure 7 clearly demonstrates the specific binding of apo AI and A-II to full-length ABC1 transfected cells, such that the full-length ABC1 protein acts through direct interaction with apolipoproteins, and this interaction It is suggested that this is required for lipid efflux promoted by the apolipoprotein and full length ABC1 protein. Thus, it is conceivable that apolipoproteins in vivo from the liver and intestine interact with full-length ABC1 protein on the cell surface to circulate and replenish lipid efflux from peripheral cells.

구체적으로는, 서열번호 69의 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 인간 ABC1 유전자의 cDNA 분자는 위치 185의 뉴클레오타이드(해독 개시를 위한 ATG 코돈의 염기 A)에서 시작하여 위치 6967의 뉴클레오타이드에 이르는 개방 판독 프레임을 포함한다. (서열 ATTAAA를 갖는) 폴리아데닐화 시그널이 존재하며, 서열번호 69의 서열의 위치 9698의 뉴클레오타이드로부터 시작된다. 본 발명에 따라, 서열번호 69를 포함하는 ABC1 cDNA는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 2261 아미노산의 완전 길이 ABC1 폴리펩타이드를 암호화한다.Specifically, the cDNA molecule of the human ABC1 gene having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 69 includes an open reading frame starting at nucleotide at position 185 (base A of the ATG codon for initiation of readout) and reaching the nucleotide at position 6967 . There is a polyadenylation signal (with the sequence ATTAAA), starting from the nucleotide at position 9698 of the sequence of SEQ ID NO: 69. According to the present invention, ABC1 cDNA comprising SEQ ID NO: 69 encodes the full length ABC1 polypeptide of 2261 amino acids comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71.

결과적으로, 본 발명은 또한, 서열번호 69, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.As a result, the present invention also relates to a nucleic acid comprising SEQ ID NO: 69, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한 서열번호 69로 표시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 69, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한, 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.The invention also relates to nucleic acid molecules comprising the nucleotides 1-244, or the complementary polynucleotide sequences of SEQ ID NO: 69.

본 발명은 또한 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to a nucleic acid comprising at least eight consecutive nucleotides of nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69, or complementary polynucleotides.

본 발명의 주제는 또한, 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244를 포함하는 핵산, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산과 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산이다.Subject of the invention is also a nucleic acid comprising nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69, or a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid having a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244를 포함하는 핵산, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 한층 더 바람직하게는 98% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to nucleic acids comprising nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69, or to nucleic acids having complementary polynucleotide sequences, at least 85%, preferably 90%, more preferably 95%, even more preferably 98% It relates to a nucleic acid having nucleotide identity.

본 발명의 다른 주제는 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244를 포함하는 핵산, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산과 고엄격 조건하에서 하이브리드화하는 핵산이다.Another subject of the invention is a nucleic acid comprising nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69, or a nucleic acid which hybridizes under high stringency conditions with a nucleic acid having a complementary polynucleotide sequence.

GenBank Database(www.ncbi.nlm.nih.gov)의 검색은 EST의 뉴클레오타이드 114-292에서 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-179와 중첩된 표준화된 유아의 뇌로부터 발현된 서열 태그(EST), 기탁번호 Z44377를 밝혀내었다. 본 발명에 따른 cDNA분자가 동정될 때까지, 상기 EST와 ABC1간의 어떠한 연관도 알려지지 않았었다. 따라서, 이러한 EST는 인간 ABC1 cDNA의 부수적인 5′UTR 뉴클레오타이드를 나타낸다.A search of the GenBank Database (www.ncbi.nlm.nih.gov) found sequence tags (EST), accession numbers expressed from the brains of standardized infants that overlap with nucleotides 1-179 of SEQ ID NO: 69 in nucleotides 114-292 of EST. Z44377 was found. Until the cDNA molecule according to the present invention was identified, no association between the EST and ABC1 was known. Thus, these ESTs represent ancillary 5′UTR nucleotides of human ABC1 cDNA.

따라서, 본 발명은 또한 EST(GenBank 기탁번호 Z44377)의 뉴클레오타이드 1-113 및 ABC1 cDNA 분자의 뉴클레오타이드 1-9741(서열번호 69)를 포함하는 cDNA 분자에 관한 것이다. 이러한 두번째 cDNA 분자는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이러한 두번째 cDNA 분자의 ORF는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 298 내지 뉴클레오타이드 7080에 위치하며 (서열 ATTAAA를 갖는) 폴리아데닐화 시그널은 서열번호 70의 뉴클레오타이드 9811의 개시부에 위치한다. 서열번호 70을 포함하는 핵산은 또한, 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 완전 길이 인간 ABC1 단백질을 암호화한다.Accordingly, the present invention also relates to cDNA molecules comprising nucleotides 1-113 of EST (GenBank Accession No. Z44377) and nucleotides 1-9741 (SEQ ID NO: 69) of ABC1 cDNA molecules. This second cDNA molecule comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 70. The ORF of this second cDNA molecule is located at nucleotides 298 to nucleotide 7080 of SEQ ID NO: 70 and the polyadenylation signal (with sequence ATTAAA) is located at the beginning of nucleotide 9811 of SEQ ID NO: 70. The nucleic acid comprising SEQ ID NO: 70 also encodes a full length human ABC1 protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71.

결과적으로, 본 발명은 또한 서열번호 70, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.As a result, the invention also relates to nucleic acids comprising SEQ ID NO: 70, or the complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한 서열번호 70으로 표시된 폴리뉴클레오타이드, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.The present invention also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한, 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to a nucleic acid comprising the nucleotides 1-357, or complementary polynucleotide sequences of SEQ ID NO: 70.

본 발명은 또한, 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산에 관한 것이다.The present invention also relates to a nucleic acid comprising at least eight consecutive nucleotides of the nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or the complementary polynucleotide sequence.

본 발명의 주제는 또한, 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산에 관한 것이다.The subject matter also relates to a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid comprising nucleotides 1-357, or the complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 70.

본 발명은 또한, 서열번호 70의 뉴클레오타이드, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 한층 더 바람직하게는 98% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산에 관한 것이다.The invention also provides a nucleic acid having at least 85%, preferably 90%, more preferably 95%, and even more preferably 98% nucleotide identity with a nucleic acid comprising the nucleotide of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence. It is about.

본 발명의 다른 주제는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357을 포함하는 핵산, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산과 고엄격 조건하에서 하이브리드화하는 핵산에 관한 것이다.Another subject of the invention relates to a nucleic acid comprising nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a nucleic acid which hybridizes under high stringency conditions with a nucleic acid having a complementary polynucleotide sequence.

본 발명에 따라, 서열번호 69 또는 서열번호 70의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 2261 아미노산의 완전 길이 인간 ABC1 폴리펩타이드를 암호화한다.According to the present invention, a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 69 or SEQ ID NO: 70 encodes a full length human ABC1 polypeptide of 2261 amino acids comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71.

따라서, 본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.Accordingly, the invention also relates to nucleic acids encoding polypeptides comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71.

본 발명은 또한 서열번호 71로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 71.

특정 양태에서, 본 발명은 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.In certain embodiments, the invention relates to a nucleic acid encoding a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.The invention also relates to a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71.

본 발명은 또한 서열번호 71로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.The invention also relates to a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 71.

본 발명은 서열번호 71의 아미노산을 포함하는 포릴펩타이드에 관한 것이다.The present invention relates to a polypeptide comprising the amino acid of SEQ ID NO: 71.

본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 이의 펩타이드 단편과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드에 관한 것이다.The invention also relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, or a polypeptide having at least 80% amino acid identity with a peptide fragment thereof.

본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 한층 더 바람직하게는 98% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드에 관한 것이다.The invention also relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71 at least 85%, preferably 90%, more preferably 95%, even more preferably 98% amino acid identity. It relates to a polypeptide having.

바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 특히 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 15, 18 또는 20 내지 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100 또는 200개의 연속 아미노산 길이를 가질 것이다.Preferably, the polypeptide according to the invention comprises 15, 18 or 20 to 25, 35, 40, of a polypeptide according to the invention, in particular a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71; It will have 50, 70, 80, 100 or 200 consecutive amino acids in length.

이와 달리, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 특히 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100 또는 200개의 연속 아미노산 길이를 갖는 단편을 포함할 것이다.In contrast, a polypeptide according to the invention comprises a polypeptide according to the invention, in particular 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50 of a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71. , 100 or 200 consecutive amino acids in length.

ABC1 유전자내의 다형성Polymorphism in ABC1 Gene

돌연변이Mutation

ABC1 유전자내 돌연변이 분석은 가족 중 몇몇 구성원이 미성숙 관상동맥 이상이 있는 탠지어병 및/또는 FHD 질환을 앓고 있는 가족에 속하는 몇몇 개체로부터의 게놈 DNA에 대해 수행될 수 있다. 본 발명에 따라 여러 개의 돌연변이가 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 ABC1 유전자 서열 영역에서 동정되었다. 이들 돌연변이는 특히 중증 관상동맥 장애와 관련된, 탠지어병의 중증 형태를 앓고 있는 환자에서 발견된다. 17개의 돌연변이가 표 4에 기술되었다. 야생형(WT) 서열의 돌연변이는 각각의 돌연변이체 서열에 대해 표 4에 표시하였다.Analysis of mutations in the ABC1 gene can be performed on genomic DNA from several individuals in the family, with some members of the family suffering from Tangier's disease and / or FHD disease with immature coronary artery abnormalities. According to the present invention several mutations have been identified in the ABC1 gene sequence region encoding the ABC1 polypeptide. These mutations are found in patients suffering from the severe form of tangery disease, especially associated with severe coronary artery disorders. Seventeen mutations are described in Table 4. Mutations in wild-type (WT) sequences are shown in Table 4 for each mutant sequence.

ABC1 유전자에서 발견된 돌연변이Mutations found in ABC1 gene ABC1 유전자 돌연변이 위치ABC1 gene mutation position 돌연변이체 엑손의 뉴클레오타이드 서열번호Nucleotide sequence number of the mutant exon 돌연변이체 ABC1 폴리펩타이드 서열번호Mutant ABC1 Polypeptide SEQ ID NO: 돌연변이(WT→돌연변이체)Mutations (WT → mutants) ABC1 단백질에 미치는 돌연변이 효과Mutation Effect on ABC1 Protein 엑손 5, nt 53Exon 5, nt 53 7272 --- G→AG → A aa158에서 사일런트silent from aa158 엑손 6, nt 113Exon 6, nt 113 7373 8989 G→AG → A aa219에서 R→KR → K at aa219 엑손 6, nt 136Exon 6, nt 136 7474 9090 C→TC → T aa226에서 정지stop at aa226 엑손 8, nt 31Exon 8, nt 31 7575 9191 C→TC → T aa281에서 정지stop at aa281 엑손 8, nt 123Exon 8, nt 123 7676 --- C→TC → T aa312에서 사일런트silent from aa312 엑손 8, nt 135Exon 8, nt 135 7777 --- G→AG → A aa316에서 사일런트silent from aa316 엑손 13, nt 109Exon 13, nt 109 7878 9292 G→-G →- aa608에서 프레임쉬프트→aa 634에서 정지Frame shift at aa608 → stop at aa 634 엑손 15, nt 205Exon 15, nt 205 7979 9393 A→CA → C aa774에서 T→PT → P at aa774 엑손 17, nt 9Exon 17, nt 9 8080 9494 G→AG → A aa851에서 G→RG → R at aa851 엑손 17, nt 107Exon 17, nt 107 8181 9595 A→GA → G aa883에서 I→MI → M at aa883 엑손 22, nt 101-102Exon 22, nt 101-102 8282 9696 CT→-CT →- aa1114에서 프레임 쉬프트→aa1144에서 정지Frame shift from aa1114 → stop at aa1144 엑손 22, nt 102-103Exon 22, nt 102-103 8383 9797 TC→-TC →- aa1114에서 프레임 쉬프트→aa1144에서 정지Frame shift from aa1114 → stop at aa1144 엑손 27, nt 123Exon 27, nt 123 8484 9898 C→TC → T aa1342에서 R→WR → W at aa1342 엑손 32, nt 19Exon 32, nt 19 8585 9999 G→AG → A aa1525에서 W→정지W → stop at aa1525 엑손 34, nt 62Exon 34, nt 62 8686 100100 G→AG → A aa1587에서 R→KR → K at aa1587 엑손 47, nt 2Exon 47, nt 2 8787 101101 A→GA → G aa2104에서 M→VM → V at aa2104 엑손 47, nt 27Exon 47, nt 27 8888 102102 C→-C →- aa2112에서 프레임 쉬프트→aa2130에서 정지Frame shift at aa2112 → stop at aa2130

ABC1의 돌연변이된 서열(게놈 서열, 메신저 RNA, cDNA)로부터 정상 서열을 분화시킬 수 있게 하는 구조적 특징을 활용하여 샘플내 ABC1의 돌연변이된 서열의 검출 수단, ABC1의 돌연변이된 서열과 특이적으로 하이브리드화 할 수 있는 탐침 또는 특히 전술한 돌연변이를 운반하는 ABC1 유전자의 영역을 선택적으로 증폭시킬수 있게 하는 프라이머 쌍을 생성할 수 있으며, 특히 증폭된 핵산 단편 길이의 식별에 의해, 전술한 특이적 탐침의 보조로 증폭된 단편의 하이브리드화에 의해, 또는 이들 증폭된 단편의 직접 서열분석에 의해 이들 돌연변이의 존재 검출을 수행할 수 있다.Means of detection of mutated sequences of ABC1, specific hybridization with mutated sequences of ABC1, utilizing structural features that allow differentiation of normal sequences from mutated sequences of ABC1 (genomic sequence, messenger RNA, cDNA) Can generate a primer or a pair of primers that can selectively amplify regions of the ABC1 gene that carry the mutations described above, and in particular with the aid of the specific probes described above, by identifying the length of the amplified nucleic acid fragments. The presence of these mutations can be performed by hybridization of the amplified fragments or by direct sequencing of these amplified fragments.

따라서, 본 발명은 서열번호 72-88 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.Accordingly, the present invention relates to a nucleic acid comprising any one of SEQ ID NOs: 72-88, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한 서열번호 72-88 중 임의 하나로 표시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.The invention also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 72-88, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명의 추가 주제는 서열번호 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이다.A further subject of the invention is a nucleic acid encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 89-102.

본 발명은 서열번호 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.The present invention relates to a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 89-102.

기타 다형성Other polymorphism

기타 다형성, 특히 비암호화 영역(인트론)에 위치한 뉴클레오타이드 치환이 ABC1 유전자내에서 발견되었다. ABC1 유전자에서 동정된 8개의 다형성 각각을 표 5에 나타내었다. 표 5는 야생형(WT) 대립유전자와 돌연변이체 대립유전자를 표시하며, 다형성 자체는 각각의 대립유전자에 각각 상응하는 두 뉴클레오타이드 서열로 정의된다.Other polymorphisms, particularly nucleotide substitutions located in the non-coding region (intron), were found in the ABC1 gene. Each of the eight polymorphisms identified in the ABC1 gene is shown in Table 5. Table 5 shows the wild type (WT) alleles and mutant alleles, wherein the polymorphism itself is defined by two nucleotide sequences, each corresponding to each allele.

ABC1 유전자에서 발견된 다형성Polymorphism found in ABC1 gene ABC1 유전자 인트론 위치ABC1 gene intron location 야생형 대립유전자 서열번호Wild-type allele SEQ ID NO: 돌연변이체 대립유전자 서열번호Mutant allele SEQ ID NO: 다형성 염기 대립유전자1/대립유전자 2Polymorphic base allele 1 / allele 2 인트론 7, nt 590Intron 7, nt 590 103103 111111 A의 삽입Insertion of A 인트론 24, nt 23Intron 24, nt 23 104104 112112 G→AG → A 인트론 31, nt 30Intron 31, nt 30 105105 113113 G→TG → T 인트론 32, nt 982Intron 32, nt 982 106106 114114 G→AG → A 인트론 32, nt 1099Intron 32, nt 1099 107107 115115 G→CG → C 인트론 40, nt 146Intron 40, nt 146 108108 116116 C→TC → T 인트론 47, nt 13Intron 47, nt 13 109109 117117 A→GA → G 인트론 47, nt 88Intron 47, nt 88 110110 118118 A→CA → C

다른 양태에 따라, 본 발명은 또한 표 5에 기술된 적어도 하나의 복대립유전자 다형성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 ABC1 유전자의 핵산에 관한것이다.According to another aspect, the invention also relates to a nucleic acid of the ABC1 gene comprising a nucleotide sequence comprising at least one bi-allelic polymorphism described in Table 5.

따라서, 본 발명은 서열번호 103 및 109-118 중 적어도 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.Accordingly, the present invention relates to a nucleic acid comprising at least one of SEQ ID NOs: 103 and 109-118, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한 서열번호 103 및 109-118로 표시된 뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.The present invention also relates to nucleic acids comprising the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 103 and 109-118, or complementary polynucleotide sequences.

피검자로부터 수득한 DNA 샘플내 이들 ABC1 유전자 다형성의 검출은 예를 들면 다형성 염기를 함유하는 ABC1의 뉴클레오타이드 영역의 특이적 증폭, 이어서 증폭된 단편을 서열분석하여 대립유전자의 또는 피검자에 의해 운반된 대립유전자의 성질을 측정함으로써 수행된다.Detection of these ABC1 gene polymorphisms in DNA samples obtained from a subject may include, for example, specific amplification of the nucleotide region of ABC1 containing the polymorphic base, followed by sequencing of the amplified fragments of the allele or by the subject. By measuring the properties of

피검자로부터 수득한 DNA 샘플내 이러한 다형성의 검출은 또한 본 발명에 따른 ABC1 유전자의 다형성의 다형성 염기 중 하나를 함유하는 주어진 대립유전자와특이적으로 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 또는 프라이머의 도움하에 수행될 수 있다.Detection of such polymorphisms in DNA samples obtained from a subject can also be performed with the aid of nucleotides or primers that specifically hybridize to a given allele containing one of the polymorphic bases of the polymorphism of the ABC1 gene according to the present invention.

예로써, 적당한 뉴클레오타이드 프라이머는 예를 들면 다형성을 포함하는 단편의 다형성 염기의 5′사이드상에 바로 위치한 염기와 3′말단에서의 염기가 하이브리드화하는 프라이머이다. 특이적 프라이머의 하이브리드화 단계 후에, 예를 들면 형광으로 차등적으로 표지된 다형성의 다형성 염기와 상보적인 두 디데옥시뉴클레오타이드의 혼합물에 의한 연장 단계, 및 이어서 수득된 형광 시그널의 검출 단계는 두 개의 차등적으로 표지된 형광 디데옥시뉴클레오타이드 중 어느 것이 혼입되었는지를 측정하고 이러한 다형성 수준에서 존재하는 다형성 염기의 성질을 직접 추론할 수 있게 한다.By way of example, suitable nucleotide primers are primers which hybridize, for example, a base directly on the 5 'side of the polymorphic base of a fragment comprising polymorphism and a base at the 3' end. After the hybridization step of the specific primer, for example, an extension step by a mixture of two dideoxynucleotides complementary with a polymorphic base of fluorescence differentially labeled polymorphism, and then the detection of the obtained fluorescence signal are two differential It is possible to determine which of the labeled fluorescent dideoxynucleotides are incorporated and to directly deduce the nature of the polymorphic bases present at this polymorphic level.

다양한 접근법이 디데옥시뉴클레오타이드의 표지 및 검출을 위해 사용될 수 있다. FRET("형광 공명 에너지 전달")에 기초한 균질상에서의 방법은 Chen and Kwok(1997)에 의해 기술되었다. 이 방법에 따르면, 다형성을 함유하는 게놈 DNA의 증폭된 단편을 표지된 디데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 및 변형된 Taq 폴리머라제의 존재하에 5′말단에서 플루오레신으로 표지된 프라이머와 배양시킨다. 표지된 프라이머는 상보 게놈 DNA 서열상에 존재하는 대립유전자에 특이적인 표지된 디데옥시뉴클레오타이드의 혼입에 의해 1개의 염기가 연장된다. 이러한 유전자형 반응의 말미에, 표지된 디데옥시뉴클레오타이드를 위한 두 표지 화합물에 대한 형광 강도는 분리 또는 정제 없이 직접 분석된다. 이러한 모든 단계는 동일한 튜브에서 수행될 수 있으며 형광 시그널의 변형은 실시간으로 모니터된다. 또다른 양태에따라, 연장된 프라이머는 MALDI-TOF형 질량 분광법으로 분석될 수 있다. 다형 부위의 수준에서 위치된 염기는 마이크로서열분석 프라이머에 첨가된 매스를 측정함으로써 동정된다(Haff and Smimov, 1997).Various approaches can be used for the labeling and detection of dideoxynucleotides. A homogeneous method based on FRET (“fluorescence resonance energy transfer”) has been described by Chen and Kwok (1997). According to this method, an amplified fragment of genomic DNA containing polymorphism is incubated with a fluorescein-labeled primer at the 5 ′ end in the presence of labeled dideoxynucleotide triphosphate and modified Taq polymerase. Labeled primers extend one base by incorporation of labeled dideoxynucleotides specific for alleles present on the complementary genomic DNA sequence. At the end of this genotyping reaction, the fluorescence intensities for the two labeled compounds for labeled dideoxynucleotides are analyzed directly without separation or purification. All these steps can be performed in the same tube and the modification of the fluorescent signal is monitored in real time. According to another embodiment, the extended primer can be analyzed by MALDI-TOF type mass spectroscopy. Bases located at the level of the polymorphic site are identified by measuring the mass added to the microsequencing primers (Haff and Smimov, 1997).

이러한 뉴클레오타이드 프라이머는 예를 들면, 지지체상에 고정화시킬 수 있다. 또한, 지지체상에, 예를 들면, 순서대로, 전술한 다중 특이성 프라이머를 고정화시킬 수 있으며, 각각의 프라이머는 본 발명에 따른 ABC1 유전자의 다형성 중 하나의 검출에 적합하다.Such nucleotide primers can be immobilized, for example, on a support. It is also possible to immobilize the above-mentioned multispecific primers on the support, for example, in sequence, each primer being suitable for the detection of one of the polymorphisms of the ABC1 gene according to the invention.

본 발명에 따른 ABC1 유전자의 다형성은 피검자내 주어진 대립유전자의 존재와 주어진 병리, 특히 바람직하게는 콜레스테롤 역수송 기능장애와 연관된 병리를 갖는 염색체 영역 9q31과 이미 연관된 병리 중 하나에 대한 이러한 피검자의 성향간의 관련 연구에서 유전자 마커로서 특히 유용하다.The polymorphism of the ABC1 gene according to the invention relates to the relationship between the presence of a given allele in a subject and the propensity of such subject to one of the pathologies already associated with a given pathology, particularly those associated with chromosomal region 9q31, preferably with pathologies associated with cholesterol reverse transport dysfunction. It is particularly useful as a genetic marker in research.

복합 형질(표현형)의 유전자 분석을 위한 방법은 유형이 다양하다(Lander and Schork, 1994). 일반적으로, 본 발명에 따른 복대립유전자 다형성은 유전자형과 표현형간의 통계적으로 유의성이 있는 상관관계를 입증하기 위한 최신기술에 기술된 임의 방법에 유용하다. 복대립유전자 다형성은 연관 분석과 대립유전자 공유방법에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 복대립유전자 다형성은 형질에 의해 영향받은 계통의 사용을 요하지 않고, 복합적이고 특발성인 형질과 연관된 유전자의 동정을 허용하는 방법인, 연관 연구의 사용에서 검출 가능한 형질(표현형)과 연관된 유전자의 동정에 사용된다.There are many types of methods for genetic analysis of complex traits (phenotypes) (Lander and Schork, 1994). In general, allelic polymorphisms according to the invention are useful in any of the methods described in the state of the art for demonstrating statistically significant correlations between genotypes and phenotypes. Bi-allelic polymorphisms can be used for association analysis and allelic sharing methods. Preferably, the allelic polymorphism according to the present invention does not require the use of the lineage affected by the trait, but is a method that allows for the identification of genes associated with complex and idiopathic traits. Phenotype).

본 발명에 따른 복대립유전자 다형성을 이용하는 다른 통계학적 방법은 예를들면, Forsell 등(1997), Xiong 등(1999), Horvath 등(1998), Sham 등(1995) 또는 Nickerson 등(1992)에 의해 기술된 것들이다.Other statistical methods of using the allele polymorphism according to the present invention are described, for example, by Forsell et al. (1997), Xiong et al. (1999), Horvath et al. (1998), Sham et al. (1995) or Nickerson et al. (1992). Are described.

뉴클레오타이드 탐침 및 프라이머Nucleotide Probes and Primers

본 발명에 따른 핵산(게놈 DNA, 메신저 RNA, cDNA)과 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 탐침과 프라이머도 본 발명의 일부를 구성한다.Nucleotide probes and primers that hybridize with nucleic acids (genome DNA, messenger RNA, cDNA) according to the present invention also form part of the present invention.

본 발명에 따라, a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드; g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드; 또는 h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 유도된 핵산 단편은 샘플내 ABC1 유전자, 이의 단편 또는 변이체(돌연변이 또는 다형성을 함유하는)의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 하나의 카피의 존재 검출에 유용하다.According to the invention, a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotides; e) nucleotides 152-198, or complementary polynucleotides of SEQ ID NO: 27; f) nucleotide 1-1657 of SEQ ID NO: 36, or a complementary polynucleotide; g) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or complementary polynucleotides; Or h) a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a nucleic acid fragment derived from a complementary polynucleotide sequence, of the ABC1 gene, fragment or variant thereof (containing a mutation or polymorphism) in a sample. Useful for detecting the presence of at least one copy of a nucleotide sequence.

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드; g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드, 또는 h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.Nucleotide probes or primers according to the invention are a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or complementary poly Nucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotides; e) nucleotides 152-198, or complementary polynucleotides of SEQ ID NO: 27; f) nucleotide 1-1657 of SEQ ID NO: 36, or a complementary polynucleotide; g) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or complementary polynucleotides, or h) nucleotide sequences comprising nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or complementary polynucleotide sequences .

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드; g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드, 또는 h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.Nucleotide probes or primers according to the invention are a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or complementary poly Nucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotides; e) nucleotides 152-198, or complementary polynucleotides of SEQ ID NO: 27; f) nucleotide 1-1657 of SEQ ID NO: 36, or a complementary polynucleotide; g) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or complementary polynucleotides, or h) nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or at least eight nucleic acids comprising a complementary polynucleotide sequence Contiguous nucleotide sequences.

바람직하게는, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 본 발명에 따른 핵산, 특히 a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드; g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드, 또는 h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 10, 12, 15, 18 또는 20 내지 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500개의 연속 뉴클레오타이드 길이를 갖게 된다.Preferably, the nucleotide probes or primers according to the invention comprise nucleic acids according to the invention, in particular a) SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, Any one of 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotides; e) nucleotides 152-198, or complementary polynucleotides of SEQ ID NO: 27; f) nucleotide 1-1657 of SEQ ID NO: 36, or a complementary polynucleotide; g) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or complementary polynucleotides, or h) nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or 10, 12 of a nucleic acid comprising a complementary polynucleotide sequence , 15, 18 or 20 to 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500 consecutive nucleotides in length.

이와 달리, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 본 발명에 따른 핵산, 좀더 구체적으로 a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드; g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드, 또는 h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500개의 연속뉴클레오타이드 길이로 구성되게 된다.In contrast, a nucleotide probe or primer according to the present invention may be a nucleic acid according to the present invention, more specifically: a) SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65 Any one of, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotides; e) nucleotides 152-198, or complementary polynucleotides of SEQ ID NO: 27; f) nucleotide 1-1657 of SEQ ID NO: 36, or a complementary polynucleotide; g) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or complementary polynucleotides, or h) nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or 12, 15 of a nucleic acid comprising a complementary polynucleotide sequence , 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500 contiguous nucleotides in length.

따라서, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머의 정의는 전술한 고엄격 하이브리드화 조건하에서, a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.Thus, the definition of a nucleotide probe or primer according to the present invention is defined under the high stringency hybridization conditions described above: a) SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54- Any one of 65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; g) hybridization with a nucleic acid comprising a nucleotide 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a complementary polynucleotide sequence, or h) a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence To oligonucleotides.

바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 프라이머는 서열번호 119-136, 138, 및 141-152의 뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 핵산 서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.According to a preferred embodiment, the nucleotide primers according to the invention comprise the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 119-136, 138, and 141-152, or the nucleotide sequence of the complementary nucleic acid sequence.

ABC1 유전자의 다양한 영역을 증폭시킬 수 있게 하는 프라이머 및 프라이머 쌍의 예를 표 6에 제시하였다. 서열번호 1, 4-9, 11, 및 13-16내의 서열번호 119-136, 138, 및 141-152 및 이의 하이브리드화 영역내 각 프라이머의 위치를 표 6에 나타내었다. "Comp"란 약어는 상보 핵산 서열을 의미한다.Examples of primers and primer pairs that allow for amplification of various regions of the ABC1 gene are shown in Table 6. The positions of each primer in SEQ ID NOs: 119-136, 138, and 141-152 and their hybridization regions in SEQ ID NOs: 1, 4-9, 11, and 13-16 are shown in Table 6. The abbreviation “Comp” refers to the complementary nucleic acid sequence.

ABC1 유전자의 핵산 단편 증폭용 프라이머Primer for Amplifying Nucleic Acid Fragments of ABC1 Gene 프라이머 서열번호Primer sequence number 서열번호내 위치Position in sequence number 서열내 위치Position in sequence 하이브리드화 영역Hybridization Zone 119119 1One 4621-46424621-4642 인트론 1Intron 1 120120 1One Comp 4793-4814Comp 4793-4814 인트론 2Intron 2 121121 1One 9207-92269207-9226 인트론 2Intron 2 122122 1One Comp 9583-9603Comp 9583-9603 인트론 3Intron 3 123123 1One 10455-1047510455-10475 인트론 3Intron 3 124124 1One Comp 10880-10897Comp 10880-10897 인트론 4Intron 4 125125 44 101-121101-121 인트론 4Intron 4 126126 44 Comp 473-492Comp 473-492 인트론 5Intron 5 127127 55 83-10283-102 인트론 5Intron 5 128128 55 Comp 378-395Comp 378-395 인트론 6Intron 6 129129 66 4-254-25 인트론 6Intron 6 130130 66 Comp 193-212Comp 193-212 엑손 7/인트론 7Exxon 7 / Intron 7 131131 77 449-470449-470 인트론 7Intron 7 132132 77 Comp 881-899Comp 881-899 인트론 8Intron 8 133133 88 451-472451-472 인트론 8Intron 8 134134 88 Comp 916-934Comp 916-934 인트론 9Intron 9 135135 88 870-891870-891 인트론 9Intron 9 136136 88 Comp 1311-1330Comp 1311-1330 인트론 10Intron 10 138138 99 Comp 3191-3212Comp 3191-3212 엑손 11/인트론 11Exxon 11 / Intron 11 141141 1111 251-269251-269 인트론 17Intron 17 142142 1111 Comp 551-570Comp 551-570 엑손 18/인트론 18Exxon 18 / intron 18 143143 1313 189-209189-209 인트론 42Intron 42 144144 1313 Comp 364-385Comp 364-385 엑손 43/인트론 43Exxon 43 / intron 43 145145 1414 12-3212-32 인트론 43/엑손 44Intron 43 / exon 44 146146 1414 Comp 184-202Comp 184-202 인트론 44Intron 44 147147 1515 23-4023-40 인트론 44Intron 44 148148 1515 Comp 437-455Comp 437-455 인트론 45Intron 45 149149 1616 158-178158-178 인트론 45Intron 45 150150 1616 Comp 528-549Comp 528-549 인트론 46Intron 46 151151 1616 817-836817-836 인트론 46Intron 46 152152 1616 Comp 1174-1195Comp 1174-1195 인트론 47Intron 47

본 발명에 따른 바람직한 탐침과 프라이머의 특정 양태에 따라, 이들은 서열번호 119-136, 138, 및 141-152 중 임의 하나를 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상보 핵산 서열을 갖는 핵산의 전부 또는 일부를 포함한다.According to certain embodiments of the preferred probes and primers according to the invention, they comprise all or part of a polynucleotide comprising any one of SEQ ID NOs: 119-136, 138, and 141-152, or a nucleic acid having a complementary nucleic acid sequence. .

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 제한효소의 클로닝 및 작용에 의한 또는 Narang 등(1979) 또는 Brown 등(1979)에 의한 포스포디에스테르법, Beaucage 등(1980)에 의한 디에틸포스포라미다이트법 또는 EU 특허 No. EP 0,707,592에 기재된 고체 지지체상 기술과 같은 기술에 따른 직접 화학 합성에 의한 방법을 포함하여 당업자에 익히 공지된 적당한 방법으로 제조될 수 있다.Nucleotide probes or primers according to the present invention can be prepared by the cloning and action of restriction enzymes or by the phosphodiester method by Narang et al. (1979) or Brown et al. (1979), the diethylphosphoramidate method by Beaucage et al. (1980), or EU Patent No. It may be prepared by any suitable method well known to those skilled in the art, including by direct chemical synthesis according to techniques such as those on solid support described in EP 0,707,592.

전술한 올리고뉴클레오타이드 탐침 및 프라이머를 포함한 본 발명에 따른 핵산 각각은 필요하다면, 분광, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학 수단에 의해 검출될 수 있는 마커를 혼입함으로써 표지시킬 수 있다. 예를 들면, 이러한 마커는 방사선 동위원소(32P,33P,3H,35S), 형광 분자(5-브로모데옥시우리딘, 플루오레신, 아세틸아미노플루오렌, 디곡시게닌) 또는 바이오틴과 같은 리간드로 구성될 수 있다. 탐침의 표지는 바람직하게는, 프라이머 연장에 의해 폴리뉴클레오타이드 중으로 표지된 분자를 혼입하거나, 또는 5′또는 3′말단에의 첨가에 의해 수행된다. 핵산 단편의 비방사선 표지의 예는 특히 프랑스 특허 No. 78 109 75에 또는 Urdea 등(1988) 또는 Sanchez-pescador 등(1988)에 의한 논문에 기재되어 있다.Each of the nucleic acids according to the invention, including the aforementioned oligonucleotide probes and primers, can be labeled by incorporating markers that can be detected by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means, if necessary. For example, such markers may be radioisotopes ( 32 P, 33 P, 3 H, 35 S), fluorescent molecules (5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene, digoxigenin) or biotin It may be composed of a ligand such as. Labeling of the probe is preferably carried out by incorporating a molecule labeled into the polynucleotide by primer extension, or by addition at the 5 'or 3' end. Examples of non-radioactive labels of nucleic acid fragments are particularly described in French Patent No. 78 109 75 or in a paper by Urdea et al. (1988) or Sanchez-pescador et al. (1988).

바람직하게는, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 및 프라이머는 Urdea 등(1991)에 또는 유럽 특허 No. EP-0,225,807(CHIRON)에 기술된 탐침과 같은 시그널의 증폭을 허용하는 유형의 구조적 특징을 지닐 수 있다.Preferably, nucleotide probes and primers according to the invention are described in Urdea et al. (1991) or in European Patent No. It may have structural features of the type that allow for amplification of signals such as probes described in EP-0,225,807 (CHIRON).

본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 탐침은 특히 게놈 DNA와의 서던 타입 하이브리드화 또는 상응하는 전사체의 발현을 샘플에서 추구하는 경우에 상응하는 메신저 RNA와의 하이브리드화에 사용될 수 있다.Oligonucleotide probes according to the present invention can be used for hybridization with corresponding messenger RNA, particularly when Southern type hybridization with genomic DNA or expression of the corresponding transcript is sought in the sample.

본 발명에 따른 탐침과 프라이머는 PCR 증폭 산물의 검출 또는 미스매치의 검출에도 사용될 수 있다.Probes and primers according to the invention can also be used for detection of mismatches or PCR amplification products.

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머는 고체 지지체상에 고정화시킬 수 있다. 이러한 고체 지지체는 당업자에 익히 공지되어 있으며 마이크로타이터 플레이트, 폴리스티렌 비드, 마그네틱 비드, 니트로셀룰로스 밴드 또는 라텍스 입자와 같은 마이크로입자의 벽면을 포함한다.Nucleotide probes or primers according to the invention can be immobilized on a solid support. Such solid supports are well known to those skilled in the art and include the wall surfaces of microparticles such as microtiter plates, polystyrene beads, magnetic beads, nitrocellulose bands or latex particles.

결과적으로, 본 발명은 또한, 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 또는 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 핵산 단편 또는 변이체를 포함하는 핵산의 샘플내 존재를 검출하는 방법에 관한 것으로, 본 방법은As a result, the invention also provides a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence or a complementary polynucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or A method of detecting the presence in a sample of a nucleic acid comprising a nucleic acid fragment or variant of any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a complementary polynucleotide sequence In this regard, the method

1)본 발명에 따른 하나 이상의 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머를 시험될 샘플과 접촉시키고;1) contacting one or more nucleotide probes or primers according to the invention with a sample to be tested;

2)샘플에 존재하는 핵산과 탐침간에 형성될 수 있는 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.2) detecting a complex that may be formed between the nucleic acid present in the sample and the probe.

본 발명에 따른 검출방법의 특정 양태에 따라, 올리고뉴클레오타이드 탐침과 프라이머는 고체상에 고정화된다.According to a particular embodiment of the detection method according to the invention, the oligonucleotide probe and primer are immobilized on a solid phase.

또다른 양태에 따라, 올리고뉴클레오타이드 탐침과 프라이머는 검출 가능한 마커를 포함한다.According to another embodiment, the oligonucleotide probe and primer comprise a detectable marker.

본 발명은 또한, 샘플내 본 발명에 따른 핵산의 존재 검출용 박스 또는 키트에 관한 것으로, 박스 또는 키트는The present invention also relates to a box or kit for detecting the presence of a nucleic acid according to the present invention in a sample.

a)전술한 하나 이상의 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머;a) one or more nucleotide probes or primers described above;

b)경우에 따라, 하이브리드화 반응에 필요한 시약을 포함한다.b) optionally, reagents necessary for the hybridization reaction.

제 1 양태에 따라, 검출 박스 또는 키트는 탐침 또는 프라이머가 지지체상에 고정화됨을 특징으로 한다.According to a first aspect, the detection box or kit is characterized in that the probe or primer is immobilized on the support.

제 2 양태에 따라, 검출 박스 또는 키트는 올리고뉴클레오타이드 탐침이 검출 가능한 마커를 포함함을 특징으로 한다.According to a second aspect, the detection box or kit is characterized in that the oligonucleotide probe comprises a marker detectable.

전술한 검출 키트의 특정 양태에 따라, 이러한 키트는 해당 표적 핵산의 검출 또는 본 발명에 따른 핵산, 좀더 구체적으로는 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 암호화 영역 또는 비-암호화 영역내 돌연변이 검출에 사용될 수 있는 본 발명에 따른 복수의 올리고뉴클레오타이드 탐침 및/또는 프라이머를 포함할 것이다.According to certain embodiments of the above-described detection kits, such kits can be used for the detection of a corresponding target nucleic acid or nucleic acid according to the present invention, more specifically SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118 And any of 137, or a plurality of oligonucleotide probes and / or primers according to the invention that can be used for detection of mutations in the coding region or non-coding region of a nucleic acid comprising a complementary polynucleotide sequence.

따라서, 지지체상에 고정화된 본 발명에 따른 탐침은 "DNA 칩"과 같은 매트릭스 중으로 정렬될 수 있다. 이러한 정렬된 매트릭스는 특히 US 특허 No. 5,143,854에, 공개된 PCT 출원 WO 90/15070 및 WO 92/10092에 기술되어 있다.Thus, the probe according to the invention immobilized on a support can be aligned in a matrix such as a "DNA chip". Such aligned matrices are particularly described in US Pat. 5,143,854 is described in published PCT applications WO 90/15070 and WO 92/10092.

올리고뉴클레오타이드 탐침이 고밀도로 고정된 지지체 매트릭스는 예를 들면 US 특허 No. 5,412,087에 및 공개된 PCT 출원 95/11995에 기재되어 있다.Support matrices in which the oligonucleotide probes are fixed at high density are described, for example, in US Pat. 5,412,087 and in published PCT application 95/11995.

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 프라이머는 본 발명에 따른 핵산 중 임의 하나, 좀더 구체적으로는 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 증폭에 사용될 수 있다. 이와 달리, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드프라이머는 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 핵산 단편 또는 변이체를 포함하는 핵산의 증폭에 사용될 수 있다.The nucleotide primer according to the present invention may be any one of the nucleic acids according to the present invention, more specifically, the polynucleotide of any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137 Sequences, or complementary polynucleotide sequences, can be used for amplification of nucleic acids. In contrast, nucleotide primers according to the invention include any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or nucleic acid fragments or variants of complementary polynucleotide sequences Can be used for amplification of nucleic acids.

특정 양태에서, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 프라이머는 a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 i)서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열로 표시되는 핵산의 증폭에 사용될 수 있다.In certain embodiments, the nucleotide primers according to the invention comprise a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or Complementary polynucleotide sequences; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; g) a nucleotide 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a complementary polynucleotide sequence, h) a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence, or i) a sequence It can be used for amplification of nucleic acids represented by any one of the numbers 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137 or by complementary polynucleotide sequences.

본 발명의 또다른 주제는 본 발명에 따른 핵산, 좀더 구체적으로는 a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 i)서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열로 표시되는 핵산의 증폭방법에 관한 것으로, 상기 방법은Another subject of the invention is a nucleic acid according to the invention, more specifically: a) SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and Any one of 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; g) a nucleotide 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a complementary polynucleotide sequence, or h) a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence, or i) A method for amplifying a nucleic acid represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137 or as a complementary polynucleotide sequence, the method

a)표적 핵산의 존재가 추정되는 샘플을 증폭반응에 필요한 시약의 존재하에, 증폭시키고자 하는 표적 핵산 영역의 5′사이드 및 3′사이드에 각각 하이브리드화 위치가 위치하는 뉴클레오타이드 프라이머 쌍과 접촉시킨 다음;a) contacting the sample with presumed presence of the target nucleic acid with a pair of nucleotide primers each having a hybridization position at the 5 'side and the 3' side of the target nucleic acid region to be amplified, in the presence of the reagents required for the amplification reaction; ;

b)증폭된 핵산을 검출하는 단계를 포함한다.b) detecting the amplified nucleic acid.

전술한 증폭반응을 수행하기 위하여, 바람직하게는 전술한 뉴클레오타이드 프라이머가 사용될 것이다.In order to carry out the amplification reaction described above, the aforementioned nucleotide primers will preferably be used.

또한, 본 발명의 주제는 본 발명에 따른 핵산, 좀더 구체적으로는 a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68-70, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 i)서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열로 표시되는 핵산의 증폭 박스 또는 키트이며, 상기 박스 또는 키트는In addition, the subject of the present invention is a nucleic acid according to the present invention, more specifically, a) SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68-70 And any one of 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; g) a nucleotide 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a complementary polynucleotide sequence, h) a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence, or i) a sequence An amplification box or kit of nucleic acid represented by any one of Nos. 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137 or a complementary polynucleotide sequence, wherein the box or kit is

a)하이브리드화 위치가 증폭시키고자 하는 표적 핵산의 5′사이드 및 3′사이드 각각에 위치되는 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 프라이머 쌍; 및 임의로a) a nucleotide primer pair according to the invention wherein the hybridization site is located on each of the 5 'side and the 3' side of the target nucleic acid to be amplified; And optionally

b)증폭반응에 필요한 시약을 포함한다.b) Contains the reagents required for the amplification reaction.

이러한 증폭 박스 또는 키트는 바람직하게는 전술한 뉴클레오타이드 프라이머 적어도 한 쌍을 포함할 것이다.Such amplification boxes or kits will preferably comprise at least one pair of nucleotide primers described above.

또한, 본 발명의 주제는 a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 h)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 전부 또는 일부 증폭용 박스 또는 키트이며, 상기 박스 또는 키트는In addition, subject matter of the present invention includes a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence ; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; g) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or the complementary polynucleotide sequence, or h) all or a nucleic acid comprising the nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or the complementary polynucleotide sequence; Some amplification boxes or kits,

1)하이브리드화 위치가 증폭시키고자 하는 표적 핵산의 5′사이드 및 3′사이드 각각에 위치되는 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 프라이머 쌍; 및 임의로1) a nucleotide primer pair according to the present invention wherein the hybridization site is located on each of the 5 'side and the 3' side of the target nucleic acid to be amplified; And optionally

2)증폭반응에 필요한 시약을 포함한다.2) Contains reagents necessary for amplification reaction.

상기 증폭 박스 또는 키트는 바람직하게는 전술한 뉴클레오타이드 프라이머 적어도 한 쌍을 포함할 것이다.The amplification box or kit will preferably comprise at least one pair of nucleotide primers described above.

본 발명은 또한 샘플내 본 발명에 따른 핵산의 존재 검출을 위한 박스 또는 키트에 관한 것이며, 이러한 박스 또는 키트는 a)본 발명에 따른 하나 이상의 뉴클레오타이드 탐침; b)경우에 따라, 하이브리드화 반응에 필요한 시약을 포함한다.The invention also relates to a box or kit for detecting the presence of a nucleic acid according to the invention in a sample, said box or kit comprising: a) at least one nucleotide probe according to the invention; b) optionally, reagents necessary for the hybridization reaction.

제 1 양태에 따라, 검출 박스 또는 키트는 뉴클레오타이드 탐침과 프라이머가 지지체상에 고정화됨을 특징으로 한다.According to a first aspect, the detection box or kit is characterized in that the nucleotide probe and primer are immobilized on the support.

제 2 양태에 따라, 검출 박스 또는 키트는 뉴클레오타이드 탐침 및 프라이머가 검출 가능한 마커를 포함함을 특징으로 한다.According to a second aspect, the detection box or kit is characterized in that the nucleotide probe and the primer comprise a marker detectable.

전술한 검출 키트의 구체적 양태에 따라, 이러한 키트는 해당 표적 핵산의 검출 또는 본 발명에 따른 핵산의 암호화 영역 또는 비-암호화 영역내 돌연변이 검출에 사용될 수 있는 본 발명에 따른 복수의 올리고뉴클레오타이드 및/또는 프라이머를 포함할 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에 따라, 표적 핵산은 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 핵산 서열을 포함한다. 이와 달리, 표적 핵산은 서열번호 1, 4-65,68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 핵산 단편 또는 변이체이다.According to specific embodiments of the above-described detection kits, such kits can be used for the detection of the corresponding target nucleic acid or for the detection of mutations in the coding region or non-coding region of the nucleic acid according to the present invention, and / or the plurality of oligonucleotides according to the present invention. It will include a primer. According to a preferred embodiment of the invention, the target nucleic acid comprises a polynucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a complementary nucleic acid sequence. . In contrast, the target nucleic acid is a nucleic acid fragment or variant of a nucleic acid comprising any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65,68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a complementary polynucleotide sequence.

바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 두 프라이머는 전술한 서열번호 72에 표시된 돌연변이를 운반하는 ABC1 유전자의 엑손 5의 영역을 증폭시킬 수 있게 하는 서열번호 125 및 126의 전부 또는 일부, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함한다.According to a preferred embodiment, the two primers according to the invention are all or part of SEQ ID NOs: 125 and 126, or complementary polynucleotides, which allow to amplify the region of exon 5 of the ABC1 gene carrying the mutations set forth in SEQ ID NO: 72 above Nucleic acids having a sequence.

제 2 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 두 프라이머는 전술한 서열번호 73 또는 742에, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산에 표시된 돌연변이를 운반하는 ABC1 유전자의 엑손 6의 영역을 증폭시킬 수 있게 하는, 서열번호 127 및 128의 전부 또는 일부를 포함한다.According to a second preferred embodiment, the two primers according to the invention allow for amplification of the region of exon 6 of the ABC1 gene carrying a mutation indicated in SEQ ID NO: 73 or 742 above, or in a nucleic acid having a complementary polynucleotide sequence. , All or part of SEQ ID NOs: 127 and 128.

제 3 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 두 프라이머는 전술한 서열번호 75-77에, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산에 표시된 돌연변이를 운반하는 ABC1 유전자의 엑손 8의 영역을 증폭시킬 수 있게 하는, 서열번호 131 및 132의 전부 또는 일부를 포함한다.According to a third preferred embodiment, the two primers according to the invention enable amplification of regions of exon 8 of the ABC1 gene carrying the mutations indicated in SEQ ID NOs: 75-77, or in nucleic acids having complementary polynucleotide sequences. , All or part of SEQ ID NOs: 131 and 132.

제 4 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 두 프라이머는 전술한 서열번호 84에, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산에 표시된 돌연변이를 운반하는 ABC1 유전자의 엑손 27의 영역을 증폭시킬 수 있게 하는, 서열번호 155 및 156의 전부 또는 일부를 포함한다.According to a fourth preferred embodiment, the two primers according to the present invention are capable of amplifying a region of exon 27 of the ABC1 gene carrying a mutation indicated in SEQ ID NO: 84 above, or in a nucleic acid having a complementary polynucleotide sequence. All or part of numbers 155 and 156;

제 5 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 두 프라이머는 전술한 서열번호 85에, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산에 표시된 돌연변이를 운반하는 ABC1 유전자의 엑손 32의 영역을 증폭시킬 수 있게 하는, 서열번호 159 및 160의 전부 또는 일부를 포함한다.According to a fifth preferred embodiment, the two primers according to the invention are capable of amplifying a region of exon 32 of the ABC1 gene carrying a mutation indicated in SEQ ID NO: 85 above, or in a nucleic acid having a complementary polynucleotide sequence. It includes all or part of the numbers 159 and 160.

제 6 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 두 프라이머는 전술한 서열번호 87 또는 88에, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산에 표시된 돌연변이를 운반하는 ABC1 유전자의 엑손 47의 영역을 증폭시킬 수 있게 하는, 서열번호 175 및 176의 전부 또는 일부를 포함한다.According to a sixth preferred embodiment, the two primers according to the invention allow for amplification of the region of exon 47 of the ABC1 gene carrying the mutations indicated in SEQ ID NOs: 87 or 88, or in nucleic acids having complementary polynucleotide sequences , All or part of SEQ ID NOs: 175 and 176.

다른 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 프라이머는 일반적으로, 서열번호 119-136, 138, 및 141-152 중 임의 하나의 전부 또는 일부, 또는 상보 서열을 포함한다.According to another preferred embodiment, the primers according to the invention generally comprise all or part of any one of SEQ ID NOs: 119-136, 138, and 141-152, or complementary sequences.

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 프라이머는 피검자의 유전자형 결정 및/또는 집단의 유전자형 결정방법에, 특히 피검자내 특정 대립유전자형 또는 대립유전자 그룹의 특정형과 이들 피검자내 특정 표현형(형질)의 존재간의 연관 연구 맥락에서, 예를 들면 콜레스테롤 역수송 결핍과 연관된 질환에 대한 이들 피검자의 발병 성향, 또는 후보 염색체 영역이 9번 염색체상에, 좀더 정확하게는 9q 아암상에, 한층 더 정확하게는 9q31 좌에 위치되는 병리에 대한 이들 피검자의 발병 성향의 연구 맥락에서 특히 유용하다.Nucleotide primers according to the present invention are used in genotyping and / or population genotyping methods of subjects, in particular in the context of a linkage study between specific alleles or allele groups in a subject and the presence of specific phenotypes (traits) in these subjects. The incidence of these subjects, for example, for diseases associated with cholesterol reverse transport deficiency, or for pathologies where the candidate chromosomal region is located on chromosome 9, more precisely on the 9q arm, and more precisely on the 9q31 locus. It is particularly useful in the research context of the subject's propensity to develop.

재조합 벡터Recombinant vector

본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 목적상 "벡터"는 일본쇄 또는 이본쇄 형태인 환상 또는 선형 DNA 또는 RNA 분자를 의미하는 것으로 이해될 것이다.The present invention relates to a recombinant vector comprising a nucleic acid according to the present invention. For the purposes of the present invention "vector" will be understood to mean a cyclic or linear DNA or RNA molecule that is in single- or double-stranded form.

바람직하게는, 이러한 재조합 벡터는 하기 핵산에서 선택된 핵산을 포함할 것이다:Preferably such recombinant vector will comprise a nucleic acid selected from the following nucleic acids:

a)서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산,a) a nucleic acid comprising the polynucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a complementary polynucleotide sequence,

b)서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나로 표시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산,b) a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a complementary polynucleotide sequence,

c)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산,c) a nucleic acid comprising a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence,

d) 1)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 2)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 3)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 4)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 5)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 6)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 7)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 8)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 핵산;d) 1) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; 2) nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; 3) the nucleotide 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; 4) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; 5) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; 6) nucleotide 1-1657, or the complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; 7) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or the complementary polynucleotide sequence, or 8) nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or polynucleotide sequences of the complementary polynucleotide sequence Nucleic acids having at least 8 consecutive nucleotides of nucleic acid;

e) 1)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 2)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 3)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 4)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 5)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 6)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 7)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 8)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 핵산;e) 1) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; 2) nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; 3) the nucleotide 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; 4) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; 5) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; 6) nucleotide 1-1657, or the complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; 7) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or the complementary polynucleotide sequence, or 8) nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or polynucleotide sequences of the complementary polynucleotide sequence Nucleic acids having at least 8 consecutive nucleotides of nucleic acid;

f) 1)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 2)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 3)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 4)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 5)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 6)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 7)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 8)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 85%, 90%, 95%, 또는 95% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산;f) 1) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; 2) nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; 3) the nucleotide 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; 4) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; 5) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; 6) nucleotide 1-1657, or the complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; 7) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or complementary polynucleotide sequences, or 8) nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or polynucleotide sequences of complementary polynucleotide sequences Nucleic acids having 85%, 90%, 95%, or 95% nucleotide identity with the nucleic acid;

g) 1)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 2)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 3)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 4)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 5)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 6)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 7)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 8)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 고엄격 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화하는 핵산;g) 1) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; 2) nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; 3) the nucleotide 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; 4) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; 5) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; 6) nucleotide 1-1657, or the complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; 7) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or the complementary polynucleotide sequence, or 8) nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or polynucleotide sequences of the complementary polynucleotide sequence Nucleic acids that hybridize with nucleic acids under high stringency hybridization conditions;

h)서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; 및h) a nucleic acid encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71; And

i)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.i) a nucleic acid encoding a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

제 1 양태에 따라, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 목적하는 세포 숙주의 형질전환 또는 형질감염 뒤에, 삽입된 핵산의 증폭에 사용된다.According to a first aspect, the recombinant vector according to the invention is used for amplification of the inserted nucleic acid following transformation or transfection of the cell host of interest.

제 2 양태에 따라, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 본 발명에 따른 핵산 외에, 핵산과 이의 암호화된 mRNA의 전사 및/또는 해독을 지시하거나 조절하는 조절 시그널 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현벡터에 상응한다.According to a second aspect, the recombinant vector according to the present invention corresponds to an expression vector comprising, in addition to the nucleic acid according to the present invention, a regulatory signal or nucleotide sequence which directs or regulates the transcription and / or translation of the nucleic acid and its encoded mRNA. .

바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 특히 하기 성분을 포함할 것이다;According to a preferred embodiment, the recombinant vector according to the invention will in particular comprise the following components;

(1)프로모터 및/또는 인핸서 서열과 같이 삽입될 핵산의 발현을 조절하는 요소 또는 시그널;(1) an element or signal that regulates the expression of the nucleic acid to be inserted, such as a promoter and / or enhancer sequence;

(2)상기 벡터 중으로 삽입될 본 발명에 따른 핵산내에 포함된 뉴클레오타이드 암호화 영역(암호화 영역은 (1)에서 기술된 조절 요소 또는 시그널과 동 위상으로 배치됨); 및(2) a nucleotide coding region contained within the nucleic acid according to the present invention to be inserted into the vector, wherein the coding region is arranged in phase with the regulatory element or signal described in (1); And

(3)(2)에서 기술된 핵산의 뉴클레오타이드 암호화 영역의 전사 개시와 종결을 위한 적당한 핵산.(3) a suitable nucleic acid for initiation and termination of transcription of the nucleotide coding region of the nucleic acid described in (2).

또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 증폭 또는 발현시키고자 하는 세포 숙주에서의 발현을 위한 하나 이상의 기원, 마커 또는 선별 마커를 포함할 수 있다.In addition, the recombinant vector according to the present invention may comprise one or more origin, marker or selection markers for expression in the cell host to be amplified or expressed.

예를 들면, 박테리아 프로모터는 LacI 또는 LacZ 프로모터, T3 또는 T7 박테리오파지 RNA 폴리머라제 프로모터, 람다 파지 PR 또는 PL 프로모터일 수 있다.For example, the bacterial promoter can be a LacI or LacZ promoter, a T3 or T7 bacteriophage RNA polymerase promoter, a lambda phage PR or PL promoter.

진핵세포의 프로모터는 허피스 심플렉스 바이러스(HSV) 바이러스 티미딘 키나제 프로모터 또는 마우스 메탈로티오네인-L 프로모터를 포함할 것이다.Promoters of eukaryotic cells will include the Herpes Simplex Virus (HSV) virus thymidine kinase promoter or the mouse metallothionein-L promoter.

일반적으로, 적당한 프로모터의 선택을 위해, 당업자는 앞서 인용된 Sambrook 등(1989)의 서적 또는 Fuller 등(1996)에 의해 기술된 기술을 참조할 수 있다.In general, for the selection of suitable promoters, those skilled in the art can refer to the books described by Sambrook et al. (1989) or the techniques described by Fuller et al. (1996) cited above.

ABC1 유전자의 게놈 서열의 발현을 원하는 경우, 대형 삽입 서열을 함유할 수 있는 벡터가 바람직하게 사용될 것이다. 특정 양태에서, Sternberg(1992, 1994)에 의해 기술된 벡터 p158 또는 벡터 p158/neo8과 같은 P1 박테리오파지 벡터와 같은 박테리오파지 벡터가 바람직하게 사용된다.If expression of the genomic sequence of the ABC1 gene is desired, vectors which can contain large insertion sequences will preferably be used. In certain embodiments, bacteriophage vectors such as P1 bacteriophage vectors such as the vector p158 or the vector p158 / neo8 described by Sternberg (1992, 1994) are preferably used.

본 발명에 따른 바람직한 박테리아 벡터는 예를 들면, 벡터 pBR322(ATCC37017) 또는 pAA223-3(Pharmacia, 스웨덴 웁살라 소재), 및 pEEM1(Promega Biotech, 미국 위스콘신 매디슨 소재)와 같은 벡터이다.Preferred bacterial vectors according to the invention are, for example, vectors pBR322 (ATCC37017) or pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden), and pEEM1 (Promega Biotech, Madison, Wisconsin, USA).

또한 벡터 pQE70, pQE60(Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG(Stratagene)과 같은 기타 시판 벡터를 들 수 있다.Other commercial vectors such as vectors pQE70, pQE60 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene) are also mentioned.

이들은 또한 스포돕테라 프루지페르다로부터 유도된 Sf9 계통(ATCC No. CRL 1711)의 세포의 형질감염에 사용된 벡터 pVL1392/1393(Pharmingen)와 같은 배큘로바이러스 타입의 벡터일 수 있다.They may also be vectors of baculovirus type, such as the vector pVL1392 / 1393 (Pharmingen) used for transfection of cells of the Sf9 lineage (ATCC No. CRL 1711) derived from Spodogerra frujiferda.

이들은 또한 2형 또는 5형 인간 아데노바이러스와 같은 아데노바이러스 벡터일 수 있다.They may also be adenovirus vectors such as type 2 or type 5 human adenoviruses.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 또한 레트로바이러스 벡터 또는 아데노-수반 벡터(AAV)일 수 있다. 이러한 아데노-수반 벡터는 예를 들면, Flotte 등(1992), Samulski 등(1989), 또는 McLaughlin BA 등(1996)에 의해 기술되어 있다.Recombinant vectors according to the invention may also be retroviral vectors or adeno-associated vectors (AAV). Such adeno-associated vectors are described, for example, by Flotte et al. (1992), Samulski et al. (1989), or McLaughlin BA et al. (1996).

본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드의 발현을 허용하기 위해, 후자는 숙주세포 중으로 도입되어야 한다. 숙주세포 중으로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드의 도입은 프라이머 배양으로, 또는 세포주 형태로, 세포를 형질전환시키거나 형질감염시키기 위한 당업자에 익히 공지된 기술에 따라 시험관내에서 수행될 수 있다. 또한, 콜레스테롤의 역수송 결핍과 연관된 질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 생체내에서 또는 생체외에서 도입시킬 수 있다.In order to allow expression of the polynucleotides according to the invention, the latter must be introduced into the host cell. The introduction of polynucleotides according to the invention into host cells can be carried out in vitro according to techniques well known to those skilled in the art for transforming or transfecting cells, either in primer culture or in the form of cell lines. In addition, for the prevention or treatment of diseases associated with the back transport deficiency of cholesterol, the polynucleotides according to the invention can be introduced in vivo or ex vivo.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 숙주세포 중으로 도입하기 위해, 당업자는 바람직하게는 칼슘 포스페이트 침전술(Graham et al., 1973; Chen et al., 1987), DEAE 덱스트란(Gopal, 1985), 전기투공(Tur-Kaspa, 1896; Potter et al., 1984), 직접 마이크로주사(Harland et al., 1985), DNA로 충진된 리포솜(Nicolau et al., 1982, Fraley et al., 1979)와 같은 다양한 기술을 참조할 수 있다.In order to introduce the polynucleotides or vectors of the present invention into host cells, those skilled in the art are preferably calcium phosphate precipitation (Graham et al., 1973; Chen et al., 1987), DEAE dextran (Gopal, 1985), electric Such as perforations (Tur-Kaspa, 1896; Potter et al., 1984), direct microinjection (Harland et al., 1985), liposomes filled with DNA (Nicolau et al., 1982, Fraley et al., 1979). Reference may be made to various techniques.

일단 폴리뉴클레오타이드가 숙주세포 중으로 도입되면, 세포 게놈 중으로 안정하게 통합될 수 있다. 통합은 상동 재조합에 의해 게놈의 정확한 부위에서 달성될 수 있거나, 이는 무작위로 통합될 수 있다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 에피솜 단편 형태로 숙주세포에 안정하게 유지될 수 있으며, 에피솜은 후자의 보유와 복제를 세포 주기와 독립적으로, 또는 동조 방식으로 허용하는 서열을 포함한다.Once the polynucleotides are introduced into the host cell, they can be stably integrated into the cell genome. Integration can be achieved at the correct site of the genome by homologous recombination, or it can be integrated randomly. In some embodiments, the polynucleotides can remain stable in the host cell in the form of episomal fragments, wherein the episomes comprise sequences that permit the latter retention and replication independently of the cell cycle or in a cooperative manner.

구체적 양태에 따라, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포, 특히 포유동물로부터 수득한 숙주세포 중으로, 생체내에서 도입하는 방법은 약학적으로 허용되는 벡터 및 적당한 조절 서열의 조절하에 있는 본 발명에 따른 "네이키드" 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제제를 선택된 조직, 예를 들면 평활근 조직의 수준에서 국소 주사함으로써 도입되는 단계를 포함하며, "네이키드" 폴리뉴클레오타이드는 상기 조직의 세포에 의해 흡수된다.According to a specific embodiment, the method of introducing a polynucleotide according to the invention into a host cell, especially a host cell obtained from a mammal, in vivo is carried out according to the invention under the control of a pharmaceutically acceptable vector and a suitable regulatory sequence. Introducing a formulation comprising a "naked" polynucleotide by topical injection at the level of selected tissue, such as smooth muscle tissue, wherein the "naked" polynucleotide is taken up by the cells of the tissue.

"네이키드" 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 시험관내 및 생체내 사용을 위한 조성물은 예를 들면, PCT 출원 No. WO 95/11307(Institut Pasteur, Inserm, University of Ottawa)에 및 Tacson 등(1996) 및 Huygen 등(1996)에 기술되어 있다.Compositions for in vitro and in vivo use comprising “naked” polynucleotides are described, for example, in PCT Application No. WO 95/11307 (Institut Pasteur, Inserm, University of Ottawa) and in Tacson et al. (1996) and Huygen et al. (1996).

본 발명의 특정 양태에 따라, ABC1 단백질의 생체내 생산을 위한 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 생리학적으로 허용되는 벡터내의 용액으로, 적당한 조절 서열의 조절하에 놓인 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.According to certain embodiments of the present invention, a composition for in vivo production of ABC1 protein is provided. Such compositions include polynucleotides that encode ABC1 polypeptides, which are placed under the control of appropriate regulatory sequences, in solution in a physiologically acceptable vector.

선택된 숙주 유기체 중으로 주입되는 벡터의 양은 주사 부위에 따라 다양하다. 지침으로서, ABC1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 약 0.1 내지 약 100 ㎍을 동물의 체내로, 바람직하게는 콜레스테롤 역수송 결핍과 연관된 질환의 발병 가능성이 있거나 이러한 질환이 이미 발병한 환자, 특히 탠지어병에 대한 질병소질이 있는 환자 또는 이미 발병한 환자에 투여할 수 있다.The amount of vector injected into the selected host organism will vary depending on the site of injection. As a guide, about 0.1 to about 100 μg of a polynucleotide encoding the ABC1 protein may be injected into the body of an animal, preferably for patients who may or may have already developed a disease associated with cholesterol back transport deficiency. It can be administered to patients with predisposition or to patients who have already developed the disease.

결과적으로, 본 발명은 또한 하나 이상의 생리학적으로 적합한 부형제와 함께, ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 환자 또는 피검자의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.As a result, the present invention also relates to a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of a patient or a subject suffering from the reverse transport dysfunction of cholesterol comprising a nucleic acid encoding ABC1 protein, together with one or more physiologically suitable excipients.

바람직하게는, 이러한 조성물은 서열번호 69 또는 서열번호 70의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함할 것이며, 여기에서 핵산은 적당한 조절 요소 또는 시그널의 조절하에 있다.Preferably such a composition will comprise a nucleic acid comprising the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 69 or SEQ ID NO: 70, wherein the nucleic acid is under the control of an appropriate regulatory element or signal.

본 발명의 주제는 또한 하나 이상의 생리학적으로 적합한 부형제와 함께, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 환자 또는 피검자의 예방 또는 치료용 약학 조성물이다.Subject of the present invention is also a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of a patient or subject suffering from reverse transport dysfunction of cholesterol comprising a recombinant vector according to the invention, together with one or more physiologically suitable excipients.

본 발명은 또한 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증의 예방 또는 특히 콜레스테롤 역수송 기능장애에 걸린 피검자 치료용 약제의 제조를 위한, ABC1 단백질을 암호화하는 본 발명에 따른 핵산의 용도에 관한 것이다.The present invention also relates to the use of the nucleic acid according to the invention encoding the ABC1 protein for the prevention of various forms of atherosclerosis or for the preparation of a medicament for treating a subject with cholesterol reverse transport dysfunction.

본 발명은 또한 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증의 예방 또는 특히 콜레스테롤 역수송 기능장애에 걸린 피검자 치료용 약제의 제조를 위한, ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 본 발명에 따른 재조합 벡터의 용도에 관한 것이다.The present invention also relates to the use of the recombinant vector according to the present invention comprising a nucleic acid encoding ABC1 protein for the prevention of various forms of atherosclerosis or for the preparation of a medicament for treating a subject suffering from cholesterol reverse transport dysfunction.

따라서, 본 발명의 주제는 또한 콜레스테롤 대사에 관여된 ABC1 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터이다.Accordingly, the subject of the invention is also a recombinant vector comprising a nucleic acid according to the invention which encodes an ABC1 protein or polypeptide involved in cholesterol metabolism.

본 발명은 또한, 탠지어병 및/또는 FHD 질환과 관련된 HDL 결핍, HDL 결핍, LCAT 결핍, 말라리아, 및 당뇨병과 같은 HDL 결핍과 관련된 심혈관 질환 또는 증상의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 재조합 벡터의 용도에 관한 것이다.The invention also provides for the preparation of a pharmaceutical composition for the prophylaxis and / or treatment of cardiovascular diseases or symptoms associated with HDL deficiency such as HDL deficiency, HDL deficiency, LCAT deficiency, malaria, and diabetes associated with tangerine disease and / or FHD disease. The use of a recombinant vector for the present invention.

본 발명은 또한, 생물학적 활성 ABC1 폴리펩타이드의 생체내에서의 장기적이고 효과적인 발현을 허용하기 위한, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 생체외에서 유전자 변형시킨 세포, 또는 재조합 벡터 생성 세포의 용도에 관한 것으로, 여기에서 세포는 체내에 이식된다.The invention also relates to the use of cells genetically modified in vitro with a recombinant vector according to the invention, or recombinant vector producing cells, to allow long-term and effective expression of a biologically active ABC1 polypeptide in vivo. Cells are transplanted into the body.

체세포 유전자 치료법에 유용한 벡터 및 이러한 벡터를 함유하는 조성물Vectors useful for somatic gene therapy and compositions containing such vectors

본 발명은 또한 콜레스테롤의 수송과 연관된 병리의 치료를 위한 새로운 치료법에 관한 것이다. 본 발명은 콜레스테롤의 수송과 대사에 관여된 ABC1 단백질을 암호화하는 유전자의 생체내 전달과 발현에 의해, 유전자 요법에 의한 콜레스테롤 수송과 연관된 병리의 치료 가능성을 입증함으로써 종래기술의 단점에 대한 유리한 해결책을 제공한다. 따라서, 본 발명은 예를 들면, 아테롬성동맥경화증과 같은 관련 병리의 특이적이고 효과적인 치료를 허용하는 간단한 수단을 제공한다.The invention also relates to novel therapies for the treatment of pathologies associated with the transport of cholesterol. The present invention provides an advantageous solution to the drawbacks of the prior art by demonstrating the therapeutic potential of pathologies associated with cholesterol transport by gene therapy by in vivo delivery and expression of genes encoding ABC1 protein involved in the transport and metabolism of cholesterol. to provide. Thus, the present invention provides a simple means that allows for the specific and effective treatment of related pathologies such as, for example, atherosclerosis.

유전자 요법은 결핍 또는 이상(돌연변이, 비정상 발현 등)의 교정 및 유전 정보를 병에 걸린 세포나 기관에 도입시켜 해당 치료 단백질의 발현을 일으키는 데 있다. 이러한 유전 정보는 기관으로부터 추출된 세포 중으로 생체외에서 도입되거나(이어서 변형 세포는 체내로 재도입된다), 직접 생체내에서 적당한 조직 중으로 도입될 수 있다. 이러한 두번째 경우에, 다양한 기술이 존재하며, 이러한 것들로는 DNA와 DEAE-덱스트란의 복합체(Pagano et al., 1967), DNA와 핵 단백질의 복합체(Kaneda et al., 1989), DNA와 지질의 복합체(Felgner et al., 1987), 리포솜의 사용(Fraley et al., 1980) 등을 수반하는 다양한 형질감염 기술이 있다. 좀더 최근에 와서는, 유전자 전달을 위한 벡터로서 바이러스의 사용이 이러한 물리적 형질감염 기술에 대한 유망한 대안으로 출현하였다. 이와 관련하여, 다양한 바이러스가 특정 세포 집단 감염능에 대해 시험되었다. 특히, 레트로바이러스(RSV, HMS, MMS 등), HSV 바이러스, 아데노-수반 바이러스 및 아데노바이러스.Gene therapy involves the introduction of correction and genetic information for deficiencies or abnormalities (mutations, abnormal expressions, etc.) into diseased cells or organs, resulting in the expression of the therapeutic protein. This genetic information can be introduced ex vivo into cells extracted from the organ (the modified cells are then reintroduced into the body) or directly into the appropriate tissue in vivo. In this second case, various techniques exist, such as complexes of DNA and DEAE-dextran (Pagano et al., 1967), complexes of DNA and nuclear proteins (Kaneda et al., 1989), DNA and lipids There are a variety of transfection techniques involving complexes of (Felgner et al., 1987), the use of liposomes (Fraley et al., 1980), and the like. More recently, the use of viruses as vectors for gene transfer has emerged as a promising alternative to this physical transfection technique. In this regard, various viruses have been tested for specific cell population infectivity. Especially retroviruses (RSV, HMS, MMS, etc.), HSV viruses, adeno-associated viruses and adenoviruses.

따라서, 본 발명은 또한 ABC1을 암호화하는 유전자의 생체내 전달 및 발현에있는, 콜레스테롤의 수송과 연관된 병리의 치료를 위한 새로운 치료법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 탠지어병 및/또는 FHD병과 연관된 HDL 결핍, HDL 결핍, LCAT 결핍, 말라리아, 및 당뇨병과 같은 HDL 결핍의 치료 및/또는 예방을 위한 새로운 치료법을 제공한다. 특히 바람직한 방식에서, 출원인은 콜레스테롤의 대사에 관여된 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 작제하여, 이들 재조합 벡터를 생체내에서 투여할 수 있으며, 이러한 투여가 어떠한 세포병리학적 효과 없이도, 생물학적 활성 ABC1 단백질의 안정하고 효과적인 발현을 허용함을 발견하였다.Accordingly, the present invention also relates to novel therapies for the treatment of pathologies associated with the transport of cholesterol in the in vivo delivery and expression of genes encoding ABC1. In particular, the present invention provides new therapies for the treatment and / or prophylaxis of HDL deficiencies such as HDL deficiency, HDL deficiency, LCAT deficiency, malaria, and diabetes associated with Tangerine disease and / or FHD disease. In a particularly preferred manner, Applicants can construct recombinant vectors comprising nucleic acids encoding ABC1 protein involved in the metabolism of cholesterol, and administer these recombinant vectors in vivo, which administration can be carried out without any cytopathological effects, It has been found to allow stable and effective expression of biologically active ABC1 protein.

본 발명은 또한, 아데노바이러스가 ABC1 유전자의 전달과 발현을 위한 특히 효율적인 벡터를 구성한다는 증명에서 연유한다. 특히, 본 발명은 벡터로서 재조합 아데노바이러스의 사용이 목적하는 치료 효과를 생성하도록 상기 유전자의 충분히 높은 발현 수준을 달성할 수 있게 함을 보여준다. 유전자의 안정한 발현을 허용하는 레트로바이러스 또는 아데노-수반 바이러스(AAV)와 같은 다른 바이러스 벡터도 청구된다.The invention also stems from the demonstration that adenoviruses constitute a particularly efficient vector for the delivery and expression of the ABC1 gene. In particular, the present invention shows that the use of recombinant adenovirus as a vector makes it possible to achieve a sufficiently high expression level of the gene to produce the desired therapeutic effect. Other viral vectors are also claimed, such as retroviruses or adeno-associated viruses (AAV) that allow for stable expression of genes.

따라서, 본 발명은 콜레스테롤의 수송 이상과 연관된 심혈관 및 신경학적 병리의 치료와 예방을 위한 새로운 치료 및 예방 방법을 제공한다.Accordingly, the present invention provides novel therapeutic and prophylactic methods for the treatment and prevention of cardiovascular and neurological pathologies associated with transport abnormalities of cholesterol.

따라서, 본 발명의 주제는 콜레스테롤 대사에 관여된 ABC1 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 결손형 재조합 바이러스이다.Accordingly, the subject of the present invention is a defective recombinant virus comprising a nucleic acid according to the present invention encoding an ABC1 protein or polypeptide involved in cholesterol metabolism.

본 발명은 또한 탠지어병 및/또는 FHD병과 연관된 HDL 결핍, HDL 결핍, LCAT결핍, 말라리아, 및 당뇨병과 같은 HDL 결핍과 연관된 심혈관 질환 또는 증상의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한 결손형 재조합 바이러스의 용도에 관한 것이다.The invention also provides a deficiency for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of cardiovascular diseases or symptoms associated with HDL deficiency, such as HDL deficiency, HDL deficiency, LCAT deficiency, malaria, and diabetes associated with Tangerine disease and / or FHD disease. It relates to the use of the type recombinant virus.

본 발명은 또한, 생물학적 활성 ABC1 폴리펩타이드의 생체내에서의 장기적이고 효과적인 발현을 허용하기 위한, 본 발명에 따른 결손형 재조합 바이러스로 생체내에서 유전자 변형된 세포, 또는 결손형 재조합 바이러스의 생성 세포의 용도에 관한 것으로, 여기에서 세포는 체내에 이식된다.The invention also provides for the production of cells that have been genetically modified in vivo with a defective recombinant virus according to the invention, or cells which produce a defective recombinant virus, to allow long-term and effective expression of a biologically active ABC1 polypeptide in vivo. In regards to use, wherein the cells are transplanted into the body.

본 발명은 ABC1을 암호화하는 DNA 서열을 바이러스 벡터 중으로 혼입시킬 수 있고, 이들 벡터가 생물학적 활성의 성숙한 형태를 효과적으로 발현시킬 수 있게 함을 보여준다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 ABC1의 생체내 발현이 아데노바이러스의 직접 투여에 의해 또는 생성 세포 또는 아데노바이러스 또는 그러한 DNA를 혼입하는 레트로바이러스에 의한 유전자 변형된 세포의 이식에 의해 수득될 수 있음을 보여준다.The present invention demonstrates that DNA sequences encoding ABC1 can be incorporated into viral vectors, allowing these vectors to effectively express mature forms of biological activity. More specifically, the present invention shows that in vivo expression of ABC1 can be obtained by direct administration of adenoviruses or by transplantation of genetically modified cells by producing cells or adenoviruses or retroviruses incorporating such DNA. .

본 발명은 상기 단백질의 발현에 정상적으로 관여되지 않는 기관에서 유해 효과 없이 ABC1의 조절된 발현을 유도할 수 있게 하기 때문에 특히 유리하다. 특히, ABC1 단백질의 현저한 방출은 본 발명의 벡터를 생성하거나 본 발명의 벡터로 생체외 감염된 세포를 이식함으로써 수득된다.The present invention is particularly advantageous because it enables induction of regulated expression of ABC1 without deleterious effects in organs not normally involved in the expression of the protein. In particular, significant release of the ABC1 protein is obtained by producing a vector of the present invention or transplanting an ex vivo infected cell with the vector of the present invention.

본 발명의 맥락에서 생성된 콜레스테롤의 수송 활성은 인간 또는 동물 ABC1 유형일 수 있다. 본 발명의 맥락에서 사용된 핵산 서열은 cDNA, 게놈 DNA(gDNA), RNA(레트로바이러스의 경우에) 또는 예를 들면 하나 이상의 인트론(gDNA)이 삽입될cDNA로 이루어진 하이브리드 작제물일 수 있다. 이는 또한, 합성 또는 반합성 서열을 포함할 수 있다. 특히 유리한 방식에서, cDNA 또는 gDNA가 사용된다. 특히, gDNA의 사용은 인간 세포에서 더 양호한 발현을 허용한다. 본 발명에 따른 바이러스 벡터 중으로의 혼입을 허용하기 위해, 이들 서열은 바람직하게는, 예를 들면 특히 적당한 제한 부위의 삽입을 위해 부위-지향성 돌연변이에 의해 변형된다. 종래기술에 기재된 서열은 사실 본 발명에 따른 용도를 위해 작제된 것은 아니며, 실질적인 발현을 달성하기 위해서는 사전 변용이 필요한 것으로 나타났다. 본 발명의 맥락에서, 인간 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 사용이 바람직하다. 또한, 이들 ABC1 단백질의 유도체를 암호화하는 작제물을 사용할 수도 있다. 이들 ABC1 단백질의 유도체는 예를 들면, 네이티브 서열에 대해 돌연변이, 결실 및/또는 첨가에 의해 수득되고, 콜레스테롤 수송 활성을 보유하는 산물을 암호화하는 서열을 포함한다. 이러한 변형은 당업자에 공지된 기술로 수행될 수 있다(하기의 일반 분자생물학 기술 참조). 이어서, 이렇게 하여 수득된 유도체의 생물학적 활성은 세포로부터 콜레스테롤 유출의 특정 예에서 구체적으로 나타낸 바와 같이 용이하게 측정될 수 있다. 본 발명의 목적상 유도체는 또한 네이티브 서열 또는 이의 단편을 탐침으로서 사용하여 핵산 라이브러리로부터 하이브리드화에 의해 수득될 수 있다.The transport activity of cholesterol produced in the context of the present invention may be of the human or animal ABC1 type. The nucleic acid sequence used in the context of the present invention may be a hybrid construct consisting of cDNA, genomic DNA (gDNA), RNA (in the case of a retrovirus) or cDNA into which, for example, one or more introns (gDNA) will be inserted. It may also include synthetic or semisynthetic sequences. In a particularly advantageous manner, cDNA or gDNA is used. In particular, the use of gDNA allows for better expression in human cells. To allow for incorporation into the viral vector according to the invention, these sequences are preferably modified by site-directed mutations, for example for insertion of particularly suitable restriction sites. The sequences described in the prior art were in fact not designed for use according to the present invention and have been shown to require prior modification to achieve substantial expression. In the context of the present invention, the use of nucleic acid sequences encoding human ABC1 protein is preferred. It is also possible to use constructs encoding derivatives of these ABC1 proteins. Derivatives of these ABC1 proteins include, for example, sequences encoding products that are obtained by mutations, deletions and / or additions to native sequences and retain cholesterol transport activity. Such modifications can be carried out by techniques known to those skilled in the art (see General Molecular Biology Techniques below). The biological activity of the derivatives thus obtained can then be readily determined as indicated in particular examples of cholesterol outflow from cells. Derivatives for the purposes of the present invention can also be obtained by hybridization from nucleic acid libraries using native sequences or fragments thereof as probes.

이들 유도체는 특히, 결합부위에 더 높은 친화성을 갖는 분자, 프로테아제에 대한 더 큰 내성을 보이는 분자, 더 높은 치료 효능 또는 좀더 적은 부작용, 또는 임의로 새로운 생물학적 특성을 갖는 분자이다. 유도체는 또한 생체내에서의 향상된 발현을 허용하는 변형된 DNA 서열을 포함한다.These derivatives are, in particular, molecules with higher affinity to the binding site, molecules that show greater resistance to proteases, molecules with higher therapeutic efficacy or less side effects, or optionally new biological properties. Derivatives also include modified DNA sequences that allow for enhanced expression in vivo.

제 1 양태에서, 본 발명은 콜레스테롤의 수송과 대사에 관여된 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA를 포함하는 결손형 재조합 바이러스에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 바람직한 양태에서, 결손형 재조합 바이러스는 콜레스테롤의 수송과 대사에 관여된 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 DNA(gDNA)를 포함한다. 바람직하게는, ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함한다. 좀더 바람직하게는, ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다.In a first aspect, the invention relates to a defective recombinant virus comprising a cDNA encoding the ABC1 polypeptide involved in the transport and metabolism of cholesterol. In another preferred embodiment of the invention, the defective recombinant virus comprises genomic DNA (gDNA) encoding the ABC1 polypeptide involved in the transport and metabolism of cholesterol. Preferably, the ABC1 polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID 71. More preferably, the ABC1 polypeptide comprises amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

본 발명의 벡터는 바이러스의 다양한 유형으로부터 제조될 수 있다. 바람직하게는, 아데노바이러스, 아데노-수반 바이러스(AAV), 허피스바이러스(HSV) 또는 레트로바이러스로부터 유도된 벡터가 사용된다. 이식될 세포의 직접 투여 또는 생체외 변형을 위해서는 아데노바이러스, 또는 생성 세포의 이식을 위해서는 레트로바이러스를 사용하는 것이 바람직하다.Vectors of the invention can be prepared from various types of viruses. Preferably, vectors derived from adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV), herpesviruses (HSV) or retroviruses are used. Preference is given to using adenoviruses for direct administration or ex vivo modification of the cells to be transplanted, or retroviruses for the transplantation of production cells.

본 발명에 따른 바이러스는 결손형, 즉 이들은 표적 세포에서 자가 복제 불능이다. 일반적으로, 본 발명의 맥락에서 사용된 결손형 바이러스의 게놈은 따라서 감염 세포내 바이러스의 복제에 필요한 서열을 적어도 결여한다. 이들 영역은 제거될 수 있거나(완전히 또는 부분적으로), 비기능성으로 만들거나, 다른 서열로, 특히 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열로 치환시킬 수 있다. 바람직하게는, 결손형 바이러스는 그럼에도 불구하고 바이러스 입자의 캡시드화에 필요한 유전자의 서열을 보유한다.The viruses according to the invention are defective, ie they are incapable of autonomous replication in target cells. In general, the genome of the defective virus used in the context of the present invention thus lacks at least the sequence necessary for replication of the virus in the infected cell. These regions can be removed (completely or partially), rendered nonfunctional, or substituted with other sequences, particularly nucleic acid sequences encoding the ABC1 protein. Preferably, the defective virus nevertheless retains the sequence of genes required for the encapsidation of viral particles.

아데노바이러스에 관하여 좀더 구체적으로는, 구조와 특성이 다소 다양한 다양한 혈청형이 성상확인 되었다. 이들 혈청형에서, 2형 또는 5형의 인간 아데노바이러스(Ad 2 또는 Ad 5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스(WO 94/26914 참조)가 본 발명의 맥락에서 바람직하게 사용된다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스로는, 개, 소, 쥐(예를 들면, Mav1, Beard et al., Virology 75(1990) 81), 양, 돼지, 조류 또는 원숭이(예를 들면, SAV) 기원의 아데노바이러스를 들 수 있다. 바람직하게는, 동물 기원의 아데노바이러스는 개 아데노바이러스, 좀더 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스[예를 들면, 맨하탄 또는 A26/61 스트레인(ATCC VR-800)]이다. 바람직하게는, 인간 또는 개 또는 혼합 기원의 아데노바이러스가 본 발명의 맥락에서 사용된다. 바람직하게는, 본 발명의 결손형 아데노바이러스는 ITR, 캡시드화를 허용하는 서열 및 ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 아데노바이러스 게놈에서, E1 영역이 최소한 비기능성이 되게 만든다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 아데노바이러스의 게놈에서, E1 유전자 및 E2, E4 및 L1-L5 유전자 중 적어도 하나가 비기능성이다. 고려되는 바이러스 유전자는 당업자에 공지된 임의 기술, 특히 고려되는 유전자내 하나 이상의 염기의 완전 억제, 치환, 부분 결실 또는 첨가에 의해 비기능성으로 만들 수 있다. 이러한 변형은 예를 들면, 유전공학 기술에 의해, 또는 돌연변이유발제 처리에 의해, 시험관내에서(분리된 DNA상에서) 또는 그 부위에서 수득될 수 있다. 다른 영역도, 특히 E3(WO 95/02697), E2(WO 94/28938), E4(WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697) 및 L5(WO 95/02697) 영역도 변형시킬 수 있다. 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 아데노바이러스는 E1 및 E4 영역에서의 결실을 포함하고 ABC1을 암호화하는 서열이 불활성화된 E1 영역의 수준에서 삽입된다. 다른 바람직한 양태에따라, E4 영역과 ABC1을 암호화하는 서열(프랑스 특허 출원 FR94 13355)이 삽입되는 수준에서 E1 영역에 결실을 포함한다.More specifically, adenovirus has been characterized by a variety of serotypes with slightly different structures and characteristics. In these serotypes, type 2 or 5 human adenoviruses (Ad 2 or Ad 5) or adenoviruses of animal origin (see WO 94/26914) are preferably used in the context of the present invention. Adenoviruses of animal origin that may be used in the context of the present invention include dogs, cows, mice (eg Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), sheep, pigs, birds or monkeys (eg For example, adenovirus of SAV) origin can be mentioned. Preferably, the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably CAV2 adenovirus (eg, Manhattan or A26 / 61 strain (ATCC VR-800)). Preferably, adenoviruses of human or dog or mixed origin are used in the context of the present invention. Preferably, the defective adenovirus of the invention comprises an ITR, a sequence allowing encapsidation and a sequence encoding the ABC1 protein. Preferably, in the adenovirus genome of the present invention, the El region is at least nonfunctional. More preferably, in the genome of the adenovirus of the present invention, at least one of the E1 gene and the E2, E4 and L1-L5 genes is nonfunctional. Viral genes to be contemplated may be rendered nonfunctional by any technique known to those skilled in the art, in particular by complete inhibition, substitution, partial deletion or addition of one or more bases in the gene under consideration. Such modifications can be obtained in vitro (on isolated DNA) or at the site, for example by genetic engineering techniques, or by mutagenesis treatment. Other regions may also be modified, in particular the E3 (WO 95/02697), E2 (WO 94/28938), E4 (WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697) and L5 (WO 95/02697) regions. Can be. According to a preferred embodiment, the adenovirus according to the invention is inserted at the level of the El region in which the sequence encoding ABC1 comprises a deletion in the El and E4 regions. According to another preferred embodiment, the deletion is in the El region at the level at which the sequence encoding the E4 region and ABC1 (French patent application FR94 13355) is inserted.

본 발명에 따른 결손형 재조합 아데노바이러스는 당업자에 공지된 임의 기술에 의해 제조할 수 있다(Levreo et al., 1991, EP 185 573; 및 Graham, 1984). 특히, 이들은 특히 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 운반하는 플라스미드와 아데노바이러스간의 상동 재조합에 의해 제조될 수 있다. 상동 재조합은 아데노바이러스와 플라스미드를 적당한 세포주 중으로 동시형질감염시킨 후 일어난다. 사용되는 세포주는 (i)상기 요소에 의해 형질전환 가능해야 하고, (ii)바람직하게는 재조합 위험을 피하기 위해 통합된 형태로 결손형 아데노바이러스 게놈의 일부를 상보할 수 있는 서열을 함유하여야 한다. 세포주의 예로는, 특히 Ad5 아데노바이러스 게놈의 좌측 부분(12%)을 게놈에 통합된 채로 함유하는 인간 배아 신장 세포주 293(Graham et al., 1977) 또는 출원 No. WO 94/26914 및 WO 95/02697에 기술된 바와 같은 E1 및 E4 기능을 상보할 수 있는 세포주를 들 수 있다.Defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art (Levreo et al., 1991, EP 185 573; and Graham, 1984). In particular, they can be prepared by homologous recombination between adenoviruses and plasmids carrying nucleic acids encoding the ABC1 protein in particular. Homologous recombination occurs after cotransfection of adenoviruses and plasmids into appropriate cell lines. The cell line used should be (i) transformable by said element and (ii) preferably contain sequences capable of complementing a portion of the defective adenovirus genome in an integrated form to avoid recombination risk. Examples of cell lines include, in particular, human embryonic kidney cell line 293 (Graham et al., 1977) or application No. 1 containing the left portion (12%) of the Ad5 adenovirus genome integrated into the genome. Cell lines capable of complementing El and E4 functions as described in WO 94/26914 and WO 95/02697.

이어서, 증폭된 아데노바이러스를 실시예에서 설명하는 바와 같이 통상의 분자생물학 기술에 따라 회수하고 정제한다.The amplified adenovirus is then recovered and purified according to conventional molecular biology techniques as described in the Examples.

아데노-수반 바이러스(AAV)의 경우, 이들은 이들이 안정하고 부위-특이성 방식으로 감염시키는 세포의 게놈 중으로 통합되는 비교적 크기가 작은 DNA 바이러스이다. 이들은 세포 증식, 형태 또는 분화에 어떠한 효과도 유도하지 않으면서, 광범위 스펙트럼의 세포를 감염시킬 수 있다. 더욱이, 이들은 인간에서의 병리에 관련된 것으로 보이지는 않는다. AAV의 게놈을 클로닝하고 서열분석하여 특징규명한다. 이는 약 4700개의 염기를 포함하고, 각각의 말단에 바이러스의 복제기원으로 작용하는 약 145개 염기로 된 역반복 영역(ITR)을 함유한다. 게놈의 나머지는 캡시드화 기능을 운반하는 2개의 필수 영역으로 세분된다: 바이러스 복제와 바이러스 유전자의 발현에 개입된, rep 유전자를 함유하는 게놈의 좌측 부분; 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 함유하는 게놈의 우측 부분.In the case of adeno-associated viruses (AAV), they are relatively small DNA viruses that integrate into the genome of the cells they infect in a stable and site-specific manner. They can infect a broad spectrum of cells without inducing any effect on cell proliferation, morphology or differentiation. Moreover, they do not appear to be involved in pathology in humans. The genome of AAV is cloned and sequenced and characterized. It contains about 4700 bases and at each end contains a reverse repeat region (ITR) of about 145 bases that serves as a replication source for the virus. The remainder of the genome is subdivided into two essential regions that carry capsidation functions: the left part of the genome containing the rep gene, involved in viral replication and expression of viral genes; The right part of the genome containing the cap gene encoding the viral capsid protein.

시험관내 및 생체내 유전자의 전달을 위한 AAV로부터 유도된 벡터의 사용이 문헌에 기술되어 있다(특히, WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528 참조). 이들 출원은 rep 및/또는 cap 유전자가 결실되고 해당 유전자에 의해 대치되는, AAV로부터 유도된 다양한 작제물, 및 해당 유전자의 시험관내(배양균 중의 세포상에서) 또는 생체내에서(유기체 중으로 직접)의 형질감염을 위한 사용을 기술하고 있다. 그러나, 이들 문헌 중 어느 것도 ABC1 단백질의 시험관내 또는 생체외 전달 및 발현을 위한 재조합 AAV의 용도, 또는 이러한 전달의 이점을 기술하거나 암시하고 있지 않다. 본 발명에 따른 결손형 재조합 AAV는 두 AAV 역반복 영역(ITR)에 의해 경계를 이룬 ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 플라스미드, 및 AAV 캡시드화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 운반하는 플라스미드를, 인간 헬퍼 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스)로 감염된 세포주 중으로 동시형질감염시킴으로써 제조될 수 있다. 이어서, 생성된 재조합 AAV는 통상의 기술로 정제된다.The use of vectors derived from AAV for the delivery of genes in vitro and in vivo is described in the literature (see in particular WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). These applications include various constructs derived from AAV, in which the rep and / or cap genes are deleted and replaced by the gene, and in vitro (on cells in culture) or in vivo (directly into the organism) of the gene. The use for transfection is described. However, none of these documents describe or imply the use of recombinant AAV for in vitro or ex vivo delivery and expression of the ABC1 protein, or the benefits of such delivery. The defective recombinant AAV according to the present invention comprises a plasmid containing a sequence encoding the ABC1 protein bounded by two AAV reverse repeat regions (ITRs), and a plasmid carrying AAV capsiding genes (rep and cap genes), It can be prepared by cotransfection into cell lines infected with human helper virus (eg, adenovirus). The resulting recombinant AAV is then purified by conventional techniques.

허피스바이러스와 레트로바이러스의 경우, 재조합 벡터의 작제는 문헌에 광범위하게 기술되어 있다: Breakfield et al., (1991); EP 453242, EP 178220,Bernstein et al.(1985); McCormick(1985) 등 참조.For herpesviruses and retroviruses, the construction of recombinant vectors is extensively described in the literature: Breakfield et al., (1991); EP 453242, EP 178220, Bernstein et al. (1985); See McCormick (1985) et al.

특히, 레트로바이러스는 분열세포에 감염하는 통합 바이러스이다. 레트로바이러스의 게놈은 특히 두 개의 긴 말단 반복부(LTR), 캡시드화 서열 및 3개의 암호화 영역(gag, pol 및 env)을 필수적으로 포함한다. 레트로바이러스에서 유래된 재조합 벡터에서, gag, pol 및 env 유전자가 일반적으로 완전히 또는 부분적으로 결실되고, 해당 이종 핵산 서열로 대치된다. 이러한 벡터는 특히 MoMuLV("쥐 몰로니 백혈병 바이러스"; 또한 MoMLV로도 불림), MSV("쥐 몰로니 육종 바이러스"), HaSV("하비 육종 바이러스"); SNV("비장 괴사 바이러스"); RSV("라우스 육종 바이러스") 또는 프렌즈 바이러스와 같은 레트로바이러스의 다양한 종류로부터 생성될 수 있다.In particular, retroviruses are integrated viruses that infect dividing cells. The genome of the retroviruses in particular essentially comprises two long terminal repeats (LTRs), capsidizing sequences and three coding regions (gag, pol and env). In recombinant vectors derived from retroviruses, the gag, pol and env genes are generally completely or partially deleted and replaced with the corresponding heterologous nucleic acid sequence. Such vectors include, in particular, MoMuLV (“rat Molecular Leukemia Virus”; also called MoMLV), MSV (“Rat Molecular Sarcoma Virus”), HaSV (“Harva Sarcoma Virus”); SNV ("splenic necrosis virus"); It can be produced from various kinds of retroviruses, such as RSV ("Raux sarcoma virus") or Friend virus.

본 발명에 따른 ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위하여, 특히 LTR, 캡시드화 서열 및 상기 암호화 서열을 함유하는 플라스미드가 일반적으로 작제된 다음, 플라스미드에는 결핍된 레트로바이러스 기능을 트랜스로 제공할 수 있는 소위 말하는 캡시드화 세포주를 형질감염시킨다. 일반적으로, 캡시드화주는 따라서 gag, pol 및 env 유전자를 발현할 수 있다. 이러한 캡시드화주는 선행기술에, 및 특히 PA317 계통(US 4,861,719), PsiCRIP 계통(WO 90/02806) 및 GP+envAm-12 계통(WO 89/07150)에 기술되어 있다. 또한, 재조합 레트로바이러스는 전사 활성을 억제하고 gag 유전자 부분을 함유하는, 캡시드화 서열을 연장하기 위해 LTR의 수준에서 변형을 함유할 수 있다(Bender et al., 1987). 이어서, 생성된 재조합 레트로바이러스를 통상의 기술로 정제한다.In order to construct recombinant retroviruses containing sequences encoding the ABC1 protein according to the present invention, in particular LTRs, capsidized sequences and plasmids containing the coding sequences are generally constructed and then the plasmids lack the retroviral function. The so-called capsidated cell lines, which can serve as trans, are transfected. In general, the capsid may thus express the gag, pol and env genes. Such capsids are described in the prior art and in particular in the PA317 strain (US 4,861,719), the PsiCRIP strain (WO 90/02806) and the GP + envAm-12 strain (WO 89/07150). In addition, recombinant retroviruses may contain modifications at the level of LTR to inhibit transcriptional activity and extend the capsidation sequence, which contains the gag gene moiety (Bender et al., 1987). The resulting recombinant retroviruses are then purified by conventional techniques.

본 발명을 실행하기 위하여, 결손형 재조합 아데노바이러스를 사용하는 것이 바람직하다. 아데노바이러스의 특히 유리한 성질은 콜레스테롤 수송 활성을 지닌 단백질의 생체내 발현에 바람직하다. 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 이식이라는 관점에서 볼 때, 정제된 현탁액의 생체내 직접 투여, 또는 세포, 특히 자치적인 세포의 생체외 형질전환에 특히 바람직하다. 더욱이, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 또한, 소량의 바이러스 현탁액을 사용하여 감염을 수행할 수 있게 하는, 특히 매우 높은 감염 효율과 같은 상당한 이점을 보인다.In order to practice the invention, it is preferred to use a defective recombinant adenovirus. Particularly advantageous properties of adenoviruses are desirable for in vivo expression of proteins with cholesterol transport activity. The adenovirus vectors according to the present invention are particularly preferred for in vivo direct administration of purified suspensions or for ex vivo transformation of cells, especially autonomous cells, from the viewpoint of transplantation. Moreover, the adenovirus vectors according to the invention also show significant advantages, such as very high infection efficiencies, which make it possible to carry out infections using small amounts of virus suspensions.

본 발명의 또다른 특히 바람직한 양태에 따라, ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 레트로바이러스 벡터 생산주는 생체내 이식에 사용된다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 세포주는 특히 본 발명에 따른 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 레트로바이러스의 생성을 허용하도록 변형된 PA317(US 4,861,719), PsiCrip(WO 90/02806) 및 GP+envAm-12(US 5,278,056) 세포이다. 예를 들면, 혈액 세포주의 전구체인 분화 전능성 줄기 세포가 피검자로부터 수집되고 분리될 수 있다. 이들 세포는 배양될 때, 대식구에 특이적인 바이러스, 비바이러스 또는 비바이러스 프로모터의 조절하에 또는 자신의 프로모터의 조절하에 ABC1 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 레트로바이러스 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 이어서, 이들 세포는 피검자 안으로 재도입된다. 이들 세포의 분화는 ABC1 단백질을 발현하는 혈액 세포, 특히 대식구로 변형될 때 동맥벽으로부터 콜레스테롤의 제거에 참여하는 단핵구가 담당한다. ABC1 단백질을 발현하는 이러한 대식구는 과량의 콜레스테롤을 대사하는 증가된 능력을 가질 것이고 막 콜레스테롤의 1차 수용체에 의한 이의 제거가 세포 표면에 이용 가능하게 할 것이다.According to another particularly preferred aspect of the invention, retroviral vector producers containing sequences encoding the ABC1 protein are used for in vivo transplantation. Cell lines that can be used for this purpose in particular modified PA317 (US 4,861,719), PsiCrip (WO 90/02806) and GP + envAm- modified to allow the production of retroviruses containing nucleic acid sequences encoding the ABC1 protein according to the invention. 12 (US 5,278,056) cells. For example, differentiation-potent stem cells that are precursors of blood cell lines can be collected and isolated from the subject. When cultured, these cells can be transfected with retroviral vectors containing sequences encoding the ABC1 protein under the control of viral, nonviral or nonviral promoters specific to macrophages or under the control of their promoters. These cells are then reintroduced into the subject. Differentiation of these cells is responsible for monocytes that participate in the removal of cholesterol from the arterial wall when transformed into blood cells expressing ABC1 protein, especially macrophages. Such macrophages expressing ABC1 protein will have increased ability to metabolize excess cholesterol and its removal by the primary receptor of membrane cholesterol will be available to the cell surface.

바람직하게는, 본 발명의 벡터에서, ABC1 단백질을 암호화하는 서열은 감염세포에서의 발현을 허용하는 조절 시그널하에 있다. 이들은 상동 또는 이종인 발현 시그널, 즉 ABC1 단백질의 발현을 본래 담당하는 것들과는 상이한 시그널일 수 있다. 이들은 또한, 특히 다른 단백질의 발현을 담당하는 서열, 또는 합성 서열일 수 있다. 특히, 이들은 특이적 방식으로 또는 비특이적 방식으로 및 유도성 방식으로 또는 비유도성 방식으로 유전자의 전사를 자극하거나 억제하는 진핵세포 또는 바이러스 유전자 또는 유도된 서열의 서열일 수 있다. 예를 들면, 이들은 감염시키고자 하는 세포의 게놈으로부터, 또는 바이러스 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열, 특히 아데노바이러스의 E1A 또는 주요 후기 프로모터(MLP) 유전자, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, RSV-LTR 등일 수 있다. 진핵세포 프로모터로는, 편재성 프로모터(HPRT, 비멘틴, α-액틴, 튜불린 등), 중간 필라멘트의 프로모터(데스민, 뉴로필라멘트, 케라틴, GFAP 등), (MDR, CFTR 또는 인자 VIII 타입 등의) 치료 유전자의 프로모터, 조직-특이성 프로모터(피루베이트 키나제, 빌린, 지방산 결합 장 단백질의 프로모터, 평활근 세포 α-액틴의 프로모터, 간에 특이적인 프로모터; Apo Al, Apo All, 인간 알부민 등) 또는 자극에 대응하는 프로모터(스테로이드 호르몬 수용체, 레티노산 수용체 등)가 언급될 수 있다. 또한, 이러한 발현 서열은 인핸서 또는 조절 서열 등의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 또한, 삽입된 유전자가 발현 서열을 함유하지 않을 경우, 이는 이러한 서열의 하류에 놓인 결손형 바이러스의 게놈 안으로 삽입될 수 있다.Preferably, in the vector of the present invention, the sequence encoding the ABC1 protein is under regulatory signals to allow expression in infected cells. These may be expression signals that are homologous or heterologous, ie signals that are different from those originally responsible for expression of the ABC1 protein. They may also be, in particular, sequences responsible for the expression of other proteins, or synthetic sequences. In particular, they may be sequences of eukaryotic or viral genes or derived sequences that stimulate or inhibit transcription of the gene in a specific or nonspecific manner and in an inducible or non-inducible manner. For example, they may be promoter sequences derived from the genome of the cell to be infected or from the viral genome, in particular the E1A or major late promoter (MLP) gene, cytomegalovirus (CMV) promoter, RSV-LTR, etc. of the adenovirus. have. Examples of eukaryotic promoters include ubiquitous promoters (HPRT, bimentin, α-actin, tubulin, etc.), intermediate filament promoters (desmin, neurofilament, keratin, GFAP, etc.), (MDR, CFTR, or factor VIII types, etc.). ) Promoters of therapeutic genes, tissue-specific promoters (pyruvate kinases, borrowers, promoters of fatty acid binding enteric proteins, promoters of smooth muscle cell α-actin, promoters specific to the liver; Apo Al, Apo All, human albumin, etc.) or to stimulation Corresponding promoters (steroid hormone receptors, retinoic acid receptors, etc.) may be mentioned. In addition, such expression sequences can be modified by addition of enhancers or regulatory sequences and the like. In addition, if the inserted gene does not contain an expression sequence, it may be inserted into the genome of a defective virus lying downstream of this sequence.

특정 양태에서, 본 발명은 RSV-LTR 또는 CMV 초기 프로모터 중에서 선택된 프로모터의 조절하에 콜레스테롤의 대사에 관여하는 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 결손형 재조합 바이러스에 관한 것이다.In certain embodiments, the invention relates to a defective recombinant virus comprising a nucleic acid encoding an ABC1 protein involved in the metabolism of cholesterol under the control of a promoter selected from among RSV-LTR or CMV early promoters.

전술한 바와 같이, 본 발명은 또한 콜레스테롤의 수송과 연관된 병리의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한 전술한 바이러스의 용도에 관한 것이다.As noted above, the present invention also relates to the use of the aforementioned viruses for the manufacture of pharmaceutical compositions for the treatment and / or prevention of pathologies associated with the transport of cholesterol.

본 발명은 또한 전술한 하나 이상의 결손형 재조합 바이러스를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이러한 약학 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내 또는 경피 경로 등에 의한 투여용으로 제형될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 특히 환자의 문정맥 안으로의 경우처럼 정맥내 주사의 경우에 주사가능한 제형을 위해 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 생리적으로 적합한 부형제를 포함한다. 이는 특히 등장성 멸균액, 또는 건조, 특히 동결-건조된 조성물과 관계되며, 후자의 경우, 멸균수 또는 생리 식염수의 경우에 따른 첨가시 주사액을 제조할 수 있다. 환자의 문정맥으로 직접 주사가 바람직한데 그 이유는 간 수준에서 감염을 표적화하여 이러한 기관 수준에서 치료 효과를 집중시킬 수 있기 때문이다.The present invention also relates to pharmaceutical compositions comprising one or more of the defective recombinant viruses described above. Such pharmaceutical compositions may be formulated for administration by topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular or transdermal routes and the like. Preferably, the pharmaceutical composition of the present invention comprises a pharmaceutically acceptable vehicle or physiologically suitable excipient for injectable formulation, especially in the case of intravenous injection, such as in the vein of a patient. This relates in particular to isotonic sterile liquids, or to dried, in particular freeze-dried compositions, in the latter case of injection solutions upon addition according to the case of sterile water or physiological saline. Direct injection into the arterial vein of the patient is preferred because it can target infection at the liver level and focus therapeutic effects at this organ level.

주사용으로 사용된 결손형 재조합 바이러스의 투여량은 각종 파라미터, 특히 바이러스 벡터, 사용된 투여방식, 관련 병리 또는 원하는 치료 기간의 함수로서 조정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 104내지 1014pfu/ml, 바람직하게는 106내지 1010pfu/ml의 투여량으로 제형되어 투여된다. 용어 pfu("플라크 형성 단위")는 바이러스 용액의 감염도에 상응하고, 적절한 세포 배양균을 감염시킨 다음 일반적으로 48시간 후에 감염된 세포 용해로부터 생기는 플라크의 수를 측정하여 결정된다. 바이러스 용액의 pfu 역가를 측정하는 기술은 문헌에 자세히 수록되어 있다.The dosage of the defective recombinant virus used for injection can be adjusted as a function of various parameters, in particular the viral vector, the mode of administration used, the relevant pathology or the desired duration of treatment. In general, the recombinant adenovirus according to the invention is formulated and administered at a dosage of 10 4 to 10 14 pfu / ml, preferably 10 6 to 10 10 pfu / ml. The term pfu (“plaque forming unit”) corresponds to the degree of infection of the viral solution and is determined by measuring the number of plaques resulting from infected cell lysis, usually 48 hours after infection of the appropriate cell culture. Techniques for measuring pfu titers of viral solutions are described in detail in the literature.

레트로바이러스의 경우에, 본 발명에 따른 조성물은 이식의 측면에서 생산 세포를 직접 함유할 수도 있다.In the case of retroviruses, the compositions according to the invention may contain the producing cells directly in terms of transplantation.

이와 관련하여, 본 발명의 또다른 주제는 본 발명에 따른 하나 이상의 결손형 재조합 바이러스로 감염된 임의의 포유동물 세포에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 이러한 바이러스로 감염된 인간 세포 집단에 관한 것이다. 이들은 특히 혈액 기원의 세포(분화 전능성 줄기 세포 또는 전구체), 섬유아세포, 근원세포, 간세포, 케라틴생성세포, 평활근 및 내피 세포, 신경교 세포 등일 수 있다.In this regard, another subject of the invention relates to any mammalian cell infected with one or more defective recombinant viruses according to the invention. More specifically, the present invention relates to a population of human cells infected with such viruses. These may in particular be cells of blood origin (differentiated pluripotent stem cells or precursors), fibroblasts, myoblasts, hepatocytes, keratinocytes, smooth muscle and endothelial cells, glial cells and the like.

본 발명에 따른 세포는 1차 배양균에서 유도될 수 있다. 이들은 당업자에 공지된 기술에 의해 수집된 다음 증식 허용 조건하에 배양된다. 좀더 구체적으로 섬유아세포의 경우, 이들은 예를 들면 Ham(1980)에 의해 기재된 기술에 따라 생검으로부터 쉽게 수득할 수 있다. 이러한 세포는 바이러스를 사용한 감염에 직접 사용되거나, 추후 사용의 관점에서 자기유래 라이브러리의 설정을 위해 동결건조에 의해 보관될 수 있다. 본 발명에 따른 세포는 예를 들면, 미리설정된 라이브러리에서 수득된 2차 배양균일 수 있다(예를 들어 EP 228458, EP 289034, EP 400047, EP456640 참조).The cells according to the invention can be derived from primary cultures. These are collected by techniques known to those of skill in the art and then cultured under conditions that permit growth. More specifically for fibroblasts, they can be readily obtained from biopsies, for example according to the technique described by Ham (1980). Such cells may be used directly for infection with the virus or may be stored by lyophilization for the purpose of setting up a self-derived library in terms of future use. The cells according to the invention can be, for example, secondary cultures obtained from a predetermined library (see for example EP 228458, EP 289034, EP 400047, EP456640).

배양액내 세포는 본 발명에 따른 재조합 바이러스로 감염되어, 생물학적 활성 ABC1 단백질을 생산하는 능력을 부여한다. 감염은 당업자에 공지된 기술에 따라 시험관내에서 수행된다. 특히, 사용된 세포 종류와 세포당 원하는 바이러스 카피 수에 따라, 당업자는 감염 중복도와 임의로는 생산되는 감염 사이클의 횟수를 조정할 수 있다. 이러한 단계는 세포가 생체내 투여를 위한 경우에 적절한 멸균 조건하에 수행되어야 한다. 세포 감염에 사용된 재조합 바이러스의 투여량은 원하는 목적에 따라 당업자가 조정할 수 있다. 생체내 투여를 위한 전술한 조건은 시험관내 감염에도 적용될 수 있다. 레트로바이러스를 사용한 감염의 경우에, 본 발명에 따른 재조합 레트로바이러스를 생산하는 세포로 감염시킬 세포를 함께 배양할 수 있다. 이로 인해 레트로바이러스의 정제가 필요없을 수 있다.Cells in culture are infected with the recombinant virus according to the present invention, conferring the ability to produce biologically active ABC1 protein. Infection is performed in vitro according to techniques known to those skilled in the art. In particular, depending on the cell type used and the desired number of virus copies per cell, one skilled in the art can adjust infection redundancy and optionally the number of infection cycles produced. This step should be performed under appropriate sterile conditions if the cells are for in vivo administration. The dosage of recombinant virus used for cell infection can be adjusted by one skilled in the art according to the desired purpose. The conditions described above for in vivo administration can also be applied to in vitro infections. In the case of infection with retroviruses, the cells to be infected with the cells producing the recombinant retrovirus according to the invention can be cultured together. This may eliminate the need for retrovirus purification.

본 발명의 또다른 주제는 본 발명에 따른 하나 이상의 결손형 재조합 바이러스로 감염된 포유동물 세포 또는 재조합 바이러스를 생산하는 세포, 및 세포외 매트릭스를 포함하는 이식편에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이식편은 105내지 1010세포를 포함하고, 좀더 바람직하게는, 106내지 108세포를 포함한다.Another subject of the invention relates to a graft comprising a mammalian cell or a cell producing a recombinant virus infected with one or more defective recombinant viruses according to the invention, and an extracellular matrix. Preferably, the graft according to the invention comprises 10 5 to 10 10 cells, more preferably 10 6 to 10 8 cells.

좀더 구체적으로 말하면, 본 발명의 이식편에서, 세포외 매트릭스는 겔화 화합물과, 임의로, 세포 고정을 허용하는 지지체를 포함한다.More specifically, in the graft of the present invention, the extracellular matrix comprises a gelling compound and optionally a support that allows for cell fixation.

본 발명에 따른 이식편의 제조를 위해, 다양한 종류의 겔화제가 사용될 수 있다. 이러한 겔화제는 겔 구성을 지닌 매트릭스에 세포의 봉입, 및 경우에 따라, 지지체상에 세포의 고정을 촉진시키는 데 사용된다. 다양한 세포 부착제, 특히 콜라겐, 젤라틴, 글리코사미노글리칸, 피브로넥틴, 렉틴 등이 겔화제로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 콜라겐이 본 발명의 맥락에서 사용된다. 이는 인간, 소 또는 쥐 기원의 콜라겐일 수 있다. 좀더 바람직하게는, I형 콜라겐이 사용된다.For the preparation of the grafts according to the invention, various kinds of gelling agents can be used. Such gelling agents are used to promote the encapsulation of cells in a matrix having a gel composition, and, optionally, the fixation of cells on a support. Various cell adhesion agents, in particular collagen, gelatin, glycosaminoglycans, fibronectin, lectins and the like can be used as the gelling agent. Preferably, collagen is used in the context of the present invention. It may be collagen of human, bovine or rat origin. More preferably, type I collagen is used.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 유리하게는 세포 고정을 허용하는 지지체를 포함한다. 용어 고정은 지지체에 세포의 접착 및/또는 부착을 야기하는 생물학적 및/또는 화학적 및/또는 물리적 상호작용 형태를 말한다. 또한, 세포는 사용된 지지체를 덮거나, 이러한 지지체 내부를 통과하거나, 둘 모두의 경우일 수 있다. 본 발명의 문맥상 고체의 무독성 및/또는 생체적합성 지지체를 사용함이 바람직하다. 특히, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 섬유 또는 생물학적 기원의 지지체를 사용할 수 있다.As mentioned above, the composition according to the invention advantageously comprises a support which allows for cell fixation. The term fixation refers to biological and / or chemical and / or physical interaction forms that result in adhesion and / or attachment of cells to a support. The cells may also cover the support used, pass through such support, or both. It is preferred in the context of the present invention to use solid non-toxic and / or biocompatible supports. In particular, polytetrafluoroethylene (PTFE) fibers or supports of biological origin can be used.

본 발명은 콜레스테롤의 수송과 연관된 병리, 특히 비만, HDL 결핍, 고트리글리세라이드혈증, 아테롬성동맥경화증, 또는 심혈관 질환 영역에서, 심근 경색, 앙기나, 돌연사, 심장의 대상부전 및 뇌혈관 우발증후의 치료 또는 예방에 매우 효과적인 수단을 제공한다.The present invention provides for the treatment of myocardial infarction, angina, sudden death, cardiac insufficiency and cerebrovascular contingency in the pathologies associated with the transport of cholesterol, in particular obesity, HDL deficiency, hypertriglyceridemia, atherosclerosis, or cardiovascular disease areas Or it provides a very effective means of prevention.

부가적으로, 이러한 치료법은 인간과 동물, 예를 들면 양, 소, 가축(개, 고양이 등), 말, 어류 등 모두에 적용될 수 있다.In addition, these therapies can be applied to both humans and animals, such as sheep, cattle, livestock (dogs, cats, etc.), horses, fish, and the like.

재조합 숙주세포Recombinant host cell

본 발명은 또한 본 발명의 핵산, 좀더 구체적으로 말하면 서열번호 69 또는 서열번호 70의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also relates to a recombinant host cell comprising a nucleic acid of the invention, more specifically a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 69 or SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한 본 발명의 핵산, 좀더 구체적으로는 서열번호 69 또는 서열번호 70으로 표시된 뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also relates to a recombinant host cell comprising a nucleic acid of the invention, more specifically a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 69 or SEQ ID NO: 70, or a nucleic acid comprising a complementary polynucleotide sequence.

구체적으로 말해서, 본 발명은 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.Specifically, the present invention provides a recombinant host cell comprising a nucleic acid comprising any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a complementary polynucleotide sequence. It is about.

본 발명은 또한, 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나로 표시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also provides a recombinant comprising a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a complementary polynucleotide sequence. It relates to a host cell.

본 발명은 또한 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The present invention also relates to a recombinant host cell comprising a nucleic acid comprising a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also relates to a recombinant host cell comprising a nucleic acid encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71.

본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also relates to a recombinant host cell comprising a nucleic acid encoding a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

또다른 일면에 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 핵산, 좀더 구체적으로는 서열번호 69 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 서열, 또는 상보폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 중 임의의 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.According to another aspect, the invention also relates to a recombinant host cell comprising the recombinant vector according to the invention. Accordingly, the present invention also provides a recombinant host cell comprising a recombinant vector comprising a nucleic acid of the invention, more specifically a nucleic acid comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 69 or SEQ ID NO: 70, or a nucleic acid comprising a complementary polynucleotide sequence. It is about.

좀더 자세히 설명하면, 본 발명은 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.More specifically, the present invention provides a recombinant vector comprising a nucleic acid comprising any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a complementary polynucleotide sequence. It relates to a recombinant host cell comprising a.

본 발명은 또한 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열 중 임의 하나로 표시되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also provides a recombinant comprising a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or complementary polynucleotide sequences. It relates to a recombinant host cell comprising a vector.

본 발명은 또한 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also relates to a recombinant host cell comprising a recombinant vector comprising a nucleic acid comprising a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence.

본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also relates to a recombinant host cell comprising a recombinant vector comprising a nucleic acid encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71.

본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포에 관한 것이다.The invention also relates to a recombinant host cell comprising a recombinant vector comprising a nucleic acid encoding a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

본 발명에 따른 바람직한 숙주세포는 예를 들면, 하기와 같다:Preferred host cells according to the invention are, for example:

a) 원핵생물 숙주세포: 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli, 균주 DH5-α), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 피피뮤리움(Salmonella typhimurium) 균주, 또는 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 스타필로코커스(Staphylococus)와 같은 속의 균주계통;a) Prokaryotic host cells: Escherichia coli (Escherichia coli, strain DH5-α), Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Salmonella Phi mu Solarium (Salmonella typhimurium) strain, or Pseudomonas (Pseudomonas), Streptomyces ( Strain strains of the same genus, such as Streptomyces ) and Staphylococus ;

b) 진핵생물 숙주세포: HeLa 세포(ATCC No. CCL2), Cv 1 세포(ATCC No. CCL70), COS 세포(ATCC No. CRL 1650), sf-9 세포(ATCC No. CRL 1711), CHO 세포(ATCC No. CCL-61) 또는 3T3 세포(ATCC No. CRL-6361).b) Eukaryotic host cells: HeLa cells (ATCC No. CCL2), Cv 1 cells (ATCC No. CCL70), COS cells (ATCC No. CRL 1650), sf-9 cells (ATCC No. CRL 1711), CHO cells (ATCC No. CCL-61) or 3T3 cells (ATCC No. CRL-6361).

돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드Mutated ABC1 Polypeptide

또다른 일면에 따라서, 본 발명은 돌연변이된 ABC1 유전자, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 결핍을 겪고 있는 환자, 특히 탠지어병을 앓고 있는 환자의 돌연변이된 ABC1 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.According to another aspect, the present invention relates to a polypeptide encoded by a mutated ABC1 gene, more particularly by a mutated ABC1 gene of a patient suffering from a reverse transport deficiency of cholesterol, in particular a patient suffering from Tanger's disease.

상기에 지적하였듯이, 17 가지의 돌연변이가 본 발명에 따른 ABC1 유전자에서 동정되었다(참조: 표 IV).As noted above, 17 mutations have been identified in the ABC1 gene according to the present invention (Table IV).

서열번호 89-102로 표시된 폴리펩타이드는 비-사일런트 ABC1 유전자 돌연변이에 상응하고, 이들을 특이적으로 인식하는 항체의 제조를 위해 특히 유용하다. 이러한 항체는 시험되는 피검자, 바람직하게는 콜레스테롤의 역수송 결핍의 특징적인 증상을 가지는 환자, 더욱 바람직하게는 탠지어병 및/또는 FHD 질환의 특징적인 증상을 가지는 환자로부터 수득되는 샘플에서 돌연변이된 ABC1 폴리펩타이드의 생산을 검출하기 위한 수단을 구성한다.Polypeptides represented by SEQ ID NOs: 89-102 are particularly useful for the preparation of antibodies that correspond to non-silent ABC1 gene mutations and specifically recognize them. Such antibodies are mutated ABC1 poly in a sample obtained from a subject to be tested, preferably a patient having a characteristic symptom of a deficiency of reverse transport of cholesterol, more preferably a patient having a characteristic symptom of tangerine disease and / or FHD disease. It constitutes a means for detecting the production of peptides.

또다른 일면에 따라서, 본 발명은 또한 서열번호 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.According to another aspect, the invention also relates to a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 89-102.

또다른 일면에 따라서, 본 발명은 또한 서열번호 89-102 중 임의 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.According to another aspect, the invention also relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 89-102.

일반적으로, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 분리된 형태 또는 정제된 형태로 제공된다.In general, polypeptides according to the invention are provided in isolated or purified form.

ABC1 폴리펩타이드의 생산방법Production method of ABC1 polypeptide

본 발명은 또한 서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 생산방법에 관한 것이고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:The invention also relates to a method for producing a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 71 and 89-102, the method comprising the following steps:

a)상기의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 적절한 벡터에 삽입하고;a) inserting a nucleic acid encoding said polypeptide into an appropriate vector;

b)적절한 배양 배지에서, 이미 형질전환된 숙주세포를 배양하거나 숙주세포를 단계 a)의 재조합 벡터로 형질감염시키며;b) in a suitable culture medium, culturing the host cells already transformed or transfecting the host cells with the recombinant vector of step a);

c)조건화 배양 배지를 회수하거나 예를 들면, 초음파 처리 또는 삼투 쇼크로 숙주세포를 용해시키며;c) recovering the conditioned culture medium or lysing the host cells, for example by sonication or osmotic shock;

d)상기의 폴리펩타이드를 상기의 배양 배지 또는 이와 달리 단계 c)에서 수득되는 세포 용해물로부터 분리하고 정제한 다음;d) separating and purifying the polypeptide from the culture medium or alternatively the cell lysate obtained in step c);

e)경우에 따라, 생산된 재조합 폴리펩타이드를 특징규명한다.e) Optionally characterize the produced recombinant polypeptides.

본 발명의 특정 양태는 서열번호 71의 아미노산 1-60의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 생산방법에 관한 것이다.Certain embodiments of the invention relate to a method of producing a polypeptide comprising the amino acid sequence of amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는 이 폴리펩타이드 또는 이의 단편 혹은 변이체에 대한 항체가 이미 고정화된 면역친화성 크로마토그래피 칼럼에 결합시킴으로써 특징규명될 수 있다.Polypeptides according to the invention can be characterized by binding to an immunoaffinity chromatography column in which an antibody against this polypeptide or fragment or variant thereof is already immobilized.

또다른 일면에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 폴리펩타이드가 당업자에게 알려져 있고 예를 들면, F. Ausubel 등(1989)에 의해 설명된 방법에 따라, 적절한 일련의 크로마토그래피 칼럼 위로 이것을 통과시킴으로써 정제될 수 있다.According to another aspect, the recombinant polypeptides according to the invention are known to those skilled in the art and can be purified by passing them over a suitable series of chromatography columns, for example according to the methods described by F. Ausubel et al. (1989). have.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는 또한 균질액 또는 고체상으로 통상의 화학적 합성기술에 의해 제조될 수 있다. 예시의 방법으로, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 Houben Weyl(1974)에 의해 설명된 균질액 기술 또는 Merrifield(1965a; 1965b)에 의해 설명된 고체상 합성기술에 의해 제조될 수 있다.Polypeptides according to the invention can also be prepared by conventional chemical synthesis techniques in homogeneous or solid phase. By way of example, the polypeptides according to the invention can be prepared by the homogenate technique described by Houben Weyl (1974) or by the solid phase synthesis technique described by Merrifield (1965a; 1965b).

"상동성" 폴리펩타이드(서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드) 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이러한 상동성 폴리펩타이드로는 서열번호 71의 아미노산 1-60에 대한, 등가 아미노산에 의한 아미노산의 하나 이상의 치환이 일어난 아미노산 서열이 포함된다.“Homologous” polypeptides (polypeptides having amino acid sequences comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71) also form part of the invention. Such homologous polypeptides include amino acid sequences in which one or more substitutions of amino acids by equivalent amino acids, relative to amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, have occurred.

본 발명에 따른 "등가 아미노산"은 예를 들면, 당업자에게 잘 알려져 있는 기술에 따라 L형 잔기의 D형 잔기에 의한 치환 또는 글루탐산(E)의 피로-글루탐산에 의한 치환을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 예시의 방법으로, 적어도 하나의 D형 잔기를 함유하는 펩타이드의 합성이 Koch(1977)에 의해 설명되었다. 또다른 일면에 따라서, 동일한 부류에 속하는 두 개의 아미노산, 즉 두 개의 비하전 극성, 비극성, 염기성 또는 산성 아미노산 또한 등가 아미노산인 것으로 간주된다."Equivalent amino acid" according to the present invention will be understood to mean, for example, substitution of L-type residues with D-type residues or glutamic acid (E) with pyro-glutamic acid, according to techniques well known to those skilled in the art. . By way of example, the synthesis of peptides containing at least one D-type residue has been described by Koch (1977). According to another aspect, two amino acids belonging to the same class, ie two uncharged polar, nonpolar, basic or acidic amino acids, are also considered equivalent amino acids.

레트로-인버스 결합(NHCO), 카바 결합(CH2CH2) 또는 케토메틸렌 결합(CO-CH2)과 같은 적어도 하나의 비펩타이드 결합을 포함하는 폴리펩타이드 또한 본 발명의 일부를 형성한다.Polypeptides comprising at least one non-peptide bond, such as a retro-inverse bond (NHCO), carba bond (CH 2 CH 2 ), or ketomethylene bond (CO-CH 2 ), also form part of the invention.

바람직하게는, 적어도 하나의 아미노산의 하나 이상의 첨가, 결실, 치환을 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 비변형 폴리펩타이드에 대한 항체에 의해 인식되는 능력을 보유할 것이다.Preferably, a polypeptide according to the invention comprising one or more additions, deletions, substitutions of at least one amino acid will retain the ability to be recognized by the antibody against the unmodified polypeptide.

항체Antibodies

본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드, 특히 1) 서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 2) 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드, 3) 서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 단편 또는 폴리펩타이드의 변이체(여기에서, 폴리펩타이드 단편 또는 변이체는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다), 또는 4) 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드인 "상동성" 폴리펩타이드가 항체, 특히 환자에서 정상 형태 또는 변형된 형태의 ABC1 폴리펩타이드의 생산을 검출하기 위한 항체의 제조에 사용될 수 있다.ABC1 polypeptide according to the invention, in particular 1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 71 and 89-102, 2) a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, 3) SEQ ID NO: Polypeptide fragment or variant of the polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of 71 and 89-102, wherein the polypeptide fragment or variant comprises amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, or 4) SEQ ID NO: “Homologous” polypeptides, which are polypeptides comprising amino acids 1-60 of 71, can be used in the production of antibodies, particularly antibodies for detecting the production of normal or modified forms of the ABC1 polypeptide in patients.

서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드에 대한 항체 또한 본 발명의 일부를 형성한다.Antibodies to polypeptides comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71 also form part of the present invention.

서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드인 "상동성" 폴리펩타이드에 대한 항체 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이러한 항체는 서열번호 71의 아미노산 1-60에 대한, 등가 아미노산에 의한 아미노산의 하나 이상의 치환이 일어난 아미노산 서열을 포함하는 상동성 폴리펩타이드에 대한것이다.Antibodies to “homologous” polypeptides, which are polypeptides having an amino acid sequence comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, also form part of the present invention. Such an antibody is directed to a homologous polypeptide comprising an amino acid sequence in which at least one substitution of an amino acid by an equivalent amino acid has occurred to amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

본 발명의 목적상 "항체"는 특히, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 단편(예: F(ab)'2및 Fab 단편) 또는 본 발명에 따른 표적 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 단편을 인식하는 초기 항체의 도메인을 포함하는 임의 폴리펩타이드를 의미하는 것으로 이해될 것이다.For the purposes of the present invention an "antibody" is in particular the initial recognition of a polyclonal or monoclonal antibody or fragment (eg F (ab) ' 2 and Fab fragment) or a target polypeptide or polypeptide fragment according to the invention. It will be understood to mean any polypeptide comprising the domain of an antibody.

모노클로날 항체는 Kohler 및 Milstein(1975)에 의해 설명된 기술에 따라 하이브리도마로부터 제조될 수 있다.Monoclonal antibodies can be prepared from hybridomas according to the techniques described by Kohler and Milstein (1975).

본 발명에 따라서, 재조합으로 또는 화학적 합성으로 생산된 폴리펩타이드와, 융합 단백질을 포함하는 이의 단편 또는 기타 유도체 또는 동족체가 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 인식하는 항체를 생산하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 이러한 항체로는 폴리클로날, 모노클로날, 키메릭, 일본쇄, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리가 포함되고, 이로 한정되지는 않는다. 본 발명의 항-ABC1 항체는 교차반응성일 수 있는데, 예를 들면 이들은 상이한 종으로부터의 ABC1 폴리펩타이드를 인식할 수 있다. 폴리클로날 항체는 교차반응의 가능성이 더 크다. 이와 달리, 본 발명의 항체는 단일 형태의 ABC1에 대해 특이적일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 항체는 인간 ABC1에 대해 특이적이다.According to the invention, polypeptides produced recombinantly or chemically, and fragments or other derivatives or homologs thereof comprising the fusion protein, can be used as immunogens for producing antibodies which recognize the polypeptides according to the invention. Such antibodies include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, chimeric, single chain, Fab fragments and Fab expression libraries. Anti-ABC1 antibodies of the invention can be cross-reactive, for example they can recognize ABC1 polypeptides from different species. Polyclonal antibodies are more likely to cross react. In contrast, the antibodies of the present invention may be specific for a single form of ABC1. Preferably such antibodies are specific for human ABC1.

당분야에 알려져 있는 다양한 과정이 ABC1 폴리펩타이드 또는 이의 유도체 혹은 동족체에 대한 폴리클로날 항체의 생산에 사용될 수 있다. 항체의 생산을 위해, 토끼, 마우스, 래트, 양, 염소 등을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는 다양한 숙주 동물이 ABC1 폴리펩타이드, 또는 이의 유도체(예: 단편 또는 융합 단백질)를주사함으로써 면역화될 수 있다. 일 양태에서, ABC1 폴리펩타이드 또는 이의 단편은 면역원성 담체, 예를 들면 소 혈청 알부민(BSA) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 접합될 수 있다. 숙주 종에 따라서, 프로인트(완전 및 불완전), 알루미늄 하이드록사이드와 같은 미네랄 겔, 라이소레시틴과 같은 계면활성 물질, 플루론 폴리올, 폴리음이온, 펩타이드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀과, BCG(bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 인간 보조제를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는 각종 보조제가 면역반응을 증대시키기 위해 사용될 수 있다.Various procedures known in the art can be used for the production of polyclonal antibodies against ABC1 polypeptides or derivatives or homologues thereof. For the production of antibodies, various host animals, including but not limited to rabbits, mice, rats, sheep, goats, and the like, can be immunized by injecting ABC1 polypeptides, or derivatives thereof (eg, fragments or fusion proteins). have. In one aspect, the ABC1 polypeptide or fragment thereof can be conjugated to an immunogenic carrier such as bovine serum albumin (BSA) or keyhole limpet hemocyanin (KLH). Depending on the host species, Freund (complete and incomplete), mineral gels such as aluminum hydroxide, surfactants such as lysolecithin, pluron polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin, di Various adjuvants, including but not limited to nitrophenols and potentially useful human adjuvants such as bacille Calmette-Guerin (BCG) and Corynebacterium parvum , can be used to enhance the immune response. .

ABC1 폴리펩타이드, 또는 이의 단편, 동족체 혹은 유도체에 대한 모노클로날 항체의 제조를 위해, 배양균 중의 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생산을 제공하는 임의 기술이 사용될 수 있다. 원래 Kohler 및 Milstein(1975)에 의해 개발된 하이브리도마 기술과 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor 등, 1983a); Cote 등(1983), 및 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술(Cole 등, 1985)이 포함되지만, 이로 한정되지는 않는다. 본 발명의 추가 양태에서, 모노클로날 항체는 무균 동물에서 생산될 수 있다[1989년 12월 28일자로 공개된 국제 특허 공개 No. WO 89/12690]. 사실, 본 발명에 따라서, 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 ABC1 폴리펩타이드에 대해 특이적인 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 스플라이싱함에 의한 "키메릭 항체"의 생산을 위해 개발된 기술[Morrison 등, (1984); Neuberger 등, (1984); Takeda 등,(1985)]이 사용될 수 있는데; 이러한 항체도 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 인간 또는 인간화 키메릭 항체는 인간의 질환 또는 장해의 치료에 사용하기에 바람직한데(후술), 그 이유는 인간 또는 인간화된 항체는 이종 항체보다 면역반응, 특히 알러지 반응을 훨씬 덜 유도하기 때문이다.For the preparation of monoclonal antibodies against ABC1 polypeptides, or fragments, homologs or derivatives thereof, any technique can be used that provides for the production of antibody molecules by continuous cell lines in culture. Hybridoma technology and trioma technology, originally developed by Kohler and Milstein (1975), human B-cell hybridoma technology (Kozbor et al., 1983a); Cote et al. (1983), and EBV-Hybridoma technology (Cole et al., 1985) for producing human monoclonal antibodies. In a further aspect of the invention, monoclonal antibodies can be produced in sterile animals [International Publication No. No. published December 28, 1989]. WO 89/12690]. Indeed, according to the present invention, a technique developed for the production of "chimeric antibodies" by splicing genes from mouse antibody molecules specific for ABC1 polypeptide with genes from human antibody molecules of appropriate biological activity. Morrison et al., (1984); Neuberger et al., (1984); Takeda et al. (1985) can be used; Such antibodies are also within the scope of the present invention. Such human or humanized chimeric antibodies are preferred for use in the treatment of human diseases or disorders (described later), because human or humanized antibodies induce an immune response, especially an allergic reaction, much less than heterologous antibodies. .

본 발명에 따라서, 일본쇄 항체의 생산을 위해 설명된 기술[Huston의 미국 특허 No. 5,476,786 및 5,132,405; 미국 특허 4,946,778]이 ABC1 폴리펩타이드-특이적 일본쇄 항체를 생산하도록 변경될 수 있다. 본 발명의 추가 양태는 Fab 발현 라이브러리의 작제를 위해 설명된 기술(Huse 등, 1989)을 이용하여 ABC1 폴리펩타이드, 또는 이의 유도체 혹은 동족체에 대한 목적하는 특이성을 지니는 모노클로날 Fab 단편의 신속하고 용이한 동정을 허용한다.According to the present invention, the described techniques for the production of single-chain antibodies [Huston, U.S. Pat. 5,476,786 and 5,132,405; US Patent 4,946,778 may be modified to produce ABC1 polypeptide-specific single chain antibodies. A further aspect of the invention is the rapid and easy use of monoclonal Fab fragments having the desired specificity for ABC1 polypeptides, or derivatives or homologs thereof, using the techniques described for the construction of Fab expression libraries (Huse et al., 1989). Allow one sympathy.

항체 분자의 유전자형을 함유하는 항체 단편이 공지 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면, 이러한 단편으로는: 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생산될 수 있는 F(ab')2단편; F(ab')2단편의 디설파이드 브리지를 제거함으로써 생산될 수 있는 Fab' 단편; 및 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리함으로써 생산될 수 있는 Fab 단편이 포함되고, 이로 한정되지 않는다.Antibody fragments containing the genotype of an antibody molecule can be produced by known techniques. For example, such fragments include: F (ab ') 2 fragments that can be produced by pepsin digestion of antibody molecules; Fab 'fragments that can be produced by removing the disulfide bridges of F (ab') 2 fragments; And Fab fragments that can be produced by treating antibody molecules with papain and a reducing agent.

항체의 생산에서, 목적하는 항체의 스크리닝은 당분야에 알려져 있는 기술, 예를 들면 방사면역측정법, ELISA(효소면역측정법), "샌드위치" 면역측정법, 면역방사선 측정법, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 측정법, 원위치의 면역측정법(예를 들어, 콜로이드 금, 효소 또는 방사성 동위원소 표지 사용), 웨스턴 블롯, 침전 반응, 응집 분석법(예를 들어, 겔 응집 분석법, 적혈구 응집 분석법), 보체 결합 분석법, 면역형광 측정법, 단백질 A 측정법 및 면역전기영동법 등에 의해 달성될 수 있다. 일 양태에서, 항체 결합은 1차 항체 상의 표지를 검출함으로써 검출된다. 또다른 양태에서, 1차 항체는 2차 항체 또는 시약의 1차 항체와의 결합을 검출함으로써 검출된다. 추가의 양태에서는, 2차 항체가 표지된다. 면역분석에서 결합을 검출하기 위한 여러가지 수단이 당분야에 알려져 있고 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들면, ABC1 폴리펩타이드의 특정 에피토프를 인식하는 항체를 선택하기 위해, 이러한 에피토프를 함유하는 ABC1 폴리펩타이드 단편과 결합하는 산물에 대해 생산된 하이브리도마를 분석할 수 있다. 특정 종의 동물로부터의 ABC1 폴리펩타이드에 대해 특이적인 항체를 선택하기 위해, 그 종의 동물에 의해 발현되거나 그 종의 동물의 세포로부터 분리된 ABC1 폴리펩타이드와의 포지티브 결합을 기초로 하여 선택할 수 있다.In the production of antibodies, screening for the desired antibody can be performed using techniques known in the art, such as radioimmunoassay, ELISA (enzyme immunoassay), "sandwich" immunoassay, immunoradiometric assay, gel diffuse sedimentation reaction, immunodiffusion. Assays, in situ immunoassays (eg, using colloidal gold, enzyme or radioisotope labels), western blots, precipitation reactions, aggregation assays (eg, gel aggregation assays, hemagglutination assays), complement binding assays, immunity Fluorescence assay, protein A assay, immunoelectrophoresis and the like. In one aspect, antibody binding is detected by detecting a label on the primary antibody. In another embodiment, the primary antibody is detected by detecting binding of the secondary antibody or reagent with the primary antibody. In further embodiments, the secondary antibody is labeled. Various means for detecting binding in immunoassays are known in the art and are within the scope of the present invention. For example, to select antibodies that recognize specific epitopes of the ABC1 polypeptide, the hybridomas produced can be analyzed for products that bind ABC1 polypeptide fragments containing these epitopes. To select an antibody specific for an ABC1 polypeptide from an animal of a particular species, it can be selected based on positive binding with an ABC1 polypeptide expressed by or isolated from an animal of that species. .

선행 항체는 상기에서 언급되었거나 당분야에 알려져 있는 검출 기술 중 임의의 기술을 사용하는 ABC1 폴리펩타이드의 정위 및 활성과 관련하여 당분야에 알려져 있는 방법, 예를 들면 웨스턴 블롯팅(적당한 생리학적 샘플에서의 ABC1 폴리펩타이드 수준을 측정)에 사용될 수 있다.The preceding antibodies are known in the art in connection with the positioning and activity of ABC1 polypeptides using any of the detection techniques mentioned above or known in the art, such as Western blotting (in suitable physiological samples). Can be used to determine the level of ABC1 polypeptide.

특정 양태에서, ABC1 폴리펩타이드의 활성을 증대시키거나 상쇄시키는 항체가 생산될 수 있다. 이러한 항체는 리간드의 동정을 위해 후술된 분석법을 사용하여 시험할 수 있다.In certain embodiments, antibodies can be produced that enhance or counteract the activity of the ABC1 polypeptide. Such antibodies can be tested using the assays described below for the identification of ligands.

본 발명은 Kozbor 등(1983b)에 의해 설명된 트리오마 기술 또는 하이브리도마 기술로 생산되는, 1) 서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을포함하는 폴리펩타이드, 2) 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드, 3) 서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 단편 또는 폴리펩타이드의 변이체(여기에서, 폴리펩타이드 단편 또는 변이체는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다), 또는 4) 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드인 "상동성" 폴리펩타이드(이들 또한 본 발명의 일부를 형성한다)에 대한 항체에 관한 것이다.The present invention provides a polypeptide produced by the trioma technique or hybridoma technique described by Kozbor et al. (1983b), comprising: 1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 71 and 89-102, 2) SEQ ID NO: 71 A polypeptide comprising amino acids 1-60 of 3, 3) a polypeptide fragment or variant of polypeptide comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 71 and 89-102, wherein the polypeptide fragment or variant is SEQ ID 71 4) amino acids 1-60, or 4) an antibody against a "homologous" polypeptide, which is also a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, which also form part of the present invention. .

본 발명은 또한 미국 특허 No. 4,946,778에 기술되었거나 Martineau 등(1998)에 의해 설명된 일본쇄 Fv 항체 단편(ScFv)에 관한 것이다.The invention also discloses US patent no. A single-chain Fv antibody fragment (ScFv) described in 4,946,778 or described by Martineau et al. (1998).

본 발명에 따른 항체는 또한 Ridder 등(1995)에 의해 설명된 파지 라이브러리를 통해 수득된 항체 단편 또는 Reinmann 등(1997) 및 Leger 등(1997)에 의해 설명된 인간화 항체를 포함한다.Antibodies according to the present invention also include antibody fragments obtained through phage libraries described by Ridder et al. (1995) or humanized antibodies described by Reinmann et al. (1997) and Leger et al. (1997).

본 발명에 따른 항체 제조방법은 샘플에서의 항원의 존재 및/또는 존재하는 항원의 양을 동정하기 위한 면역 검출 시험에서 유용하다.The antibody preparation method according to the invention is useful in immunodetection tests to identify the presence of an antigen in a sample and / or the amount of antigen present.

본 발명에 따른 항체는 또한, 동위원소 또는 비동위원소, 예를 들면 형광성인 검출 가능한 마커를 포함할 수 있거나, 당업자에 잘 알려져 있는 기술에 따라 바이오틴과 같은 분자와 연결될 수 있다.Antibodies according to the invention may also comprise detectable markers that are isotopes or non-isotopes, for example fluorescent, or may be linked with molecules such as biotin according to techniques well known to those skilled in the art.

따라서, 본 발명의 주제는 또한, 샘플에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 방법이고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:Accordingly, the subject of the invention is also a method for detecting the presence of a polypeptide according to the invention in a sample, the method comprising the following steps:

a)시험할 샘플을 1)서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 2)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드,3)서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 단편 또는 폴리펩타이드의 변이체(여기에서, 폴리펩타이드 단편 또는 변이체는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다), 또는 4)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드인 "상동성" 폴리펩타이드에 대한 항체와 접촉시키고,a) a sample to be tested comprising 1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 71 and 89-102, 2) a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, 3) SEQ ID NOs: 71 and 89 Polypeptide fragment or variant of the polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of -102, wherein the polypeptide fragment or variant comprises amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, or 4) amino acid of SEQ ID NO: 71 Contacting with an antibody against a “homologous” polypeptide that is a polypeptide comprising 1-60,

b)형성된 항원/항체 복합체를 검출한다.b) detect the formed antigen / antibody complex.

본 발명은 또한 샘플에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 존재를 식별하거나 검출하기 위한 박스 또는 키트에 관한 것이고, 상기 박스는 하기를 포함한다:The invention also relates to a box or kit for identifying or detecting the presence of a polypeptide according to the invention in a sample, said box comprising:

a)1) 서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 2)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드, 3)서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 단편 또는 폴리펩타이드의 변이체(여기에서, 폴리펩타이드 단편 또는 변이체는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다), 또는 4)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드인 "상동성" 폴리펩타이드에 대한 항체, 및a) a polypeptide comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 71 and 89-102, 2) a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, 3) any of SEQ ID NOs: 71 and 89-102 A polypeptide fragment or variant of the polypeptide comprising one amino acid sequence, wherein the polypeptide fragment or variant comprises amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, or 4) amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71 An antibody against a “homologous” polypeptide that is a polypeptide, and

b)형성된 항원/항체 복합체의 검출을 가능하게 하는 시약.b) reagents that allow detection of the formed antigen / antibody complex.

약학 조성물 및 치유적 치료방법Pharmaceutical Compositions and Healing Methods

본 발명은 또한 아테롬성동맥경화증과 같은 콜레스테롤의 대사, 구체적으로는 콜레스테롤의 수송, 좀더 구체적으로 콜레스테롤의 역수송 결핍을 예방하거나 치료하기 위한 것이고, 정상 ABC1 폴리펩타이드, 특히 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 유효량을 생산할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 치료 유효량을 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서,ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다.The present invention is also intended to prevent or treat metabolism of cholesterol, such as atherosclerosis, specifically the transport of cholesterol, more specifically the deficiency of cholesterol transport, and comprising a normal ABC1 polypeptide, in particular the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71. A pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of polynucleotides capable of producing an effective amount of a polypeptide. In a preferred embodiment, the ABC1 polypeptide comprises amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

본 발명의 주제는 또한, 아테롬성동맥경화증과 같은 콜레스테롤의 대사, 구체적으로는 콜레스테롤의 수송, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 결핍을 예방하거나 치료하기 위한 것이고, 정상 ABC1 폴리펩타이드, 특히 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 치료 유효량을 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물이다. 바람직한 양태에서, ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다.The subject matter of the present invention is also to prevent or treat metabolism of cholesterol, such as atherosclerosis, specifically the transport of cholesterol, more specifically the lack of reverse transport of cholesterol, and to the normal ABC1 polypeptide, in particular the amino acid of SEQ ID 71 Pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a polypeptide comprising a sequence. In a preferred embodiment, the ABC1 polypeptide comprises amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

본 발명은 또한 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증의 예방, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 환자의 치료를 목적으로 하는 약제의 제조를 위한, 서열번호 71의 아미노산 서열 또는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 가지는 ABC1 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.The invention also relates to the preparation of a medicament for the purpose of the prevention of various forms of atherosclerosis, and more particularly for the treatment of patients with a reverse transport dysfunction of cholesterol, amino acid sequence of SEQ ID 71 or amino acid 1 of SEQ ID 71 The use of the ABC1 polypeptide having -60.

본 발명은 서열번호 71의 아미노산 서열 또는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 가지는 폴리펩타이드 치료 유효량을 포함하는, 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 환자의 예방용 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating a patient suffering from reverse transport dysfunction of cholesterol, comprising a therapeutically effective amount of a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 71 or amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

또다른 일면에 따라서, 본 발명의 주제는 또한 콜레스테롤의 대사, 구체적으로는 콜레스테롤의 수송, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 결핍에 의해 유발되는 질환의 예방적 또는 치유적 치료방법이고, 이러한 방법은 ABC1 폴리펩타이드 치료 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함하고, 상기의 폴리펩타이드는 경우에 따라, 하나 이상의 생리학적으로 적합한 비히클 및/또는 부형제와 배합된다.According to another aspect, the subject matter of the present invention is also a prophylactic or curative treatment of diseases caused by the metabolism of cholesterol, in particular the transport of cholesterol, more specifically the deficiency of cholesterol transport, which method is ABC1 Administering to the patient a therapeutically effective amount of the polypeptide, wherein the polypeptide is optionally combined with one or more physiologically compatible vehicles and / or excipients.

바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물이 환자에게 투여될 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 아테롬성동맥경화증과 같은 콜레스테롤의 대사, 구체적으로는 콜레스테롤의 수송, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 결핍의 예방 또는 치료를 위한 것이고, 정상 ABC1 폴리펩타이드, 특히 서열번호 71의 아미노산 서열 또는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 가지는 폴리펩타이드 유효량을 생산할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 치료 유효량을 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물에 관한 것이다.Preferably, the pharmaceutical composition comprising the polypeptide according to the invention will be administered to the patient. Accordingly, the present invention also relates to the prevention or treatment of cholesterol metabolism, such as atherosclerosis, in particular the transport of cholesterol, more specifically the lack of reverse transport of cholesterol, and the amino acid sequence of the normal ABC1 polypeptide, in particular SEQ ID NO: 71 Or to a therapeutically effective amount of polynucleotides capable of producing an effective amount of a polypeptide having amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

본 발명의 주제는, 또한 아테롬성동맥경화증과 같은 콜레스테롤의 대사, 구체적으로는 콜레스테롤의 수송, 좀더 구체적으로 콜레스테롤의 역수송 결핍의 예방 또는 치료를 위한 것이고, 정상 ABC1 폴리펩타이드, 특히 서열번호 71의 아미노산 서열 또는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 가지는 폴리펩타이드 치료 유효량을 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물이다.Subject of the invention is also for the prevention or treatment of cholesterol metabolism, such as atherosclerosis, in particular the transport of cholesterol, more specifically the deficiency of reverse transport of cholesterol, and the amino acid sequence of the normal ABC1 polypeptide, in particular SEQ ID NO: 71 Or a therapeutically effective amount of a polypeptide having amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

이러한 약학 조성물은 바람직하게는 1 ㎍/㎏/1일 내지 10 ㎎/㎏/1일, 바람직하게는 적어도 0.01 ㎎/㎏/1일, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 1 ㎎/㎏/1일 범위의 ABC1 폴리펩타이드 양을 예를 들면, 비경구 경로로 투여하기에 적당할 것이다.Such pharmaceutical compositions preferably range from 1 μg / kg / 1 day to 10 mg / kg / 1 day, preferably at least 0.01 mg / kg / 1 day, more preferably from 0.01 to 1 mg / kg / 1 day. The amount of ABC1 polypeptide will be suitable, for example, by parenteral routes.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 약학 조성물을 제공하고 본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물은 탠지어병 및/또는 FHD 질환과 같은 콜레스테롤의 역수송 결핍과 관련있는 질환의 치료를 위한 것이다.The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid encoding the ABC1 polypeptide according to the present invention and the pharmaceutical composition comprising the ABC1 polypeptide according to the present invention is deficient in reverse transport of cholesterol such as tangerine disease and / or FHD disease. It is for the treatment of diseases related to.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 생체내에서 전달하고 발현시키는 단계를 포함하는, 콜레스테롤의 수송과 관련있는 병리의치료를 위한 신규한 치료적 접근법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 탠지어병 및/또는 FHD 질환과 관련있는 HDL 결핍과 같은 HDL 결핍, HDL 결핍, LCAT 결핍, 말라리아 및 당뇨병의 치료 및/또는 예방을 위한 신규한 치료적 접근법을 제공한다.The invention also relates to a novel therapeutic approach for the treatment of pathologies associated with the transport of cholesterol, comprising the step of delivering and expressing in vivo the nucleic acid encoding the ABC1 protein according to the invention. In particular, the present invention provides novel therapeutic approaches for the treatment and / or prevention of HDL deficiency, HDL deficiency, LCAT deficiency, malaria and diabetes, such as HDL deficiency associated with tangerine disease and / or FHD disease.

따라서, 본 발명은 콜레스테롤의 수송 및 대사의 이상과 관련있는 심혈관 및 신경학적 병리의 치료 및 예방을 위한 신규한 접근법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 환자 또는 피검자에게서 콜레스테롤의 역수송을 복구하거나 회복을 촉진하기 위한 방법을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a novel approach for the treatment and prevention of cardiovascular and neurological pathologies associated with abnormalities in the transport and metabolism of cholesterol. Specifically, the present invention provides a method for restoring or facilitating recovery of cholesterol in a patient or subject.

그 결과, 본 발명은 또한 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 피검자의 예방 또는 치료를 목적으로 하고, 하나 이상의 생리학적으로 적합한 비히클 및/또는 부형제와 함께 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.As a result, the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid encoding ABC1 protein with one or more physiologically compatible vehicles and / or excipients for the purpose of preventing or treating a subject suffering from reverse transport dysfunction of cholesterol. will be.

본 발명의 특정 양태에 따라서, 조성물은 ABC1 단백질의 생체내 생산을 위해 제공된다. 본 조성물은 생리학적으로 허용가능한 비히클 및/또는 부형제 용액 중의 적절한 조절 서열의 조절하에 있는 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다.According to certain embodiments of the present invention, a composition is provided for in vivo production of ABC1 protein. The composition comprises nucleic acids encoding ABC1 polypeptides under the control of appropriate regulatory sequences in a physiologically acceptable vehicle and / or excipient solution.

따라서, 본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기에서 핵산은 적절한 조절 요소의 조절하에 있다.Accordingly, the present invention also relates to a composition comprising a nucleic acid encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71, wherein the nucleic acid is under the control of an appropriate regulatory element.

본 발명은 또한 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기에서 핵산은 적절한 조절 요소의 조절하에 있다.The present invention also relates to compositions comprising nucleic acids encoding polypeptides comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, wherein the nucleic acids are under the control of appropriate regulatory elements.

바람직하게는, 이러한 조성물은 적절한 조절 요소의 조절하에 있는, 서열번호 69 또는 70의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함할 것이다.Preferably such a composition will comprise a nucleic acid comprising a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 69 or 70 under the control of appropriate regulatory elements.

또다른 일면에 따라서, 본 발명의 주제는 또한 콜레스테롤의 대사, 구체적으로는 콜레스테롤의 수송, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 결핍에 의해 유발되는 질환의 예방적 또는 치유적 치료방법이고, 이러한 방법은 본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산은 경우에 따라, 하나 이상의 생리학적으로 적합한 비히클 및/또는 부형제와 배합된다.According to another aspect, the subject matter is also a prophylactic or curative treatment of a disease caused by the metabolism of cholesterol, in particular the transport of cholesterol, more specifically the deficiency of the transport of cholesterol. Administering to the patient a nucleic acid encoding the ABC1 polypeptide according to the invention, which nucleic acid is optionally combined with one or more physiologically suitable vehicles and / or excipients.

본 발명은 또한 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 피검자의 예방 또는 치료를 목적으로 하고, 생리학적으로 적합한 하나 이상의 부형제와 배합된, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the recombinant vector according to the invention, for the purpose of preventing or treating a subject suffering from reverse transport dysfunction of cholesterol and in combination with one or more physiologically suitable excipients.

특정 양태에 따라서, 본 발명에 따른 핵산의 숙주세포, 특히 포유류로부터 수득되는 숙주세포에의 생체내 도입방법은 약학적으로 적합한 벡터 및 본 발명에 따른 "네이키드" 핵산(적절한 조절 서열의 조절하)을 포함하는 제조물이 선택된 조직, 예를 들면, 평활근 조직의 수준으로 국소 주사에 의해 도입되는 단계를 포함하고, "네이키드" 핵산이 이 조직의 세포에 의해 흡수된다.According to certain embodiments, methods for in vivo introduction of nucleic acids according to the invention into host cells, in particular host cells obtained from mammals, comprise pharmaceutically suitable vectors and "naked" nucleic acids according to the invention (under the control of appropriate regulatory sequences). Preparation comprising the step of introducing by topical injection at the level of the selected tissue, eg, smooth muscle tissue, wherein the "naked" nucleic acid is taken up by the cells of this tissue.

본 발명은 또한 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증의 예방 또는 치료, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 피검자의 치료용 약제의 제조를 위한 ABC1 단백질을 암호화하는 본 발명에 따른 핵산의 용도에 관한 것이다.The present invention also relates to the use of a nucleic acid according to the invention encoding the ABC1 protein for the prevention or treatment of various forms of atherosclerosis, more specifically for the preparation of a medicament for the treatment of a subject with a reverse transport dysfunction of cholesterol. .

본 발명은 또한 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증의 예방, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 피검자의 치료용 약제의 제조를 위한, ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 본 발명에 따른 재조합 벡터의 사용에 관한 것이다.The present invention also relates to a recombinant vector according to the present invention comprising a nucleic acid encoding ABC1 protein for the prevention of various forms of atherosclerosis, more specifically for the preparation of a medicament for the treatment of a subject suffering from reverse transport of cholesterol. It is about use.

상기에 지적하였듯이, 본 발명은 또한 콜레스테롤의 수송과 관련있는 병리의 치료용 및/또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 결손형 재조합 바이러스의 사용에 관한 것이다.As noted above, the present invention also relates to the use of the defective recombinant virus according to the invention for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prophylaxis of pathologies associated with the transport of cholesterol.

본 발명은 콜레스테롤의 역수송 결핍과 관련있는 심혈관계 질환의 치료용 및/또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한 이러한 결손형 재조합 바이러스의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 하나 이상의 결손형 재조합 바이러스를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to the use of such defective recombinant viruses for the preparation of pharmaceutical compositions for the treatment and / or prophylaxis of cardiovascular diseases associated with reverse transport deficiency of cholesterol. Accordingly, the invention also relates to pharmaceutical compositions comprising one or more defective recombinant viruses according to the invention.

본 발명은 또한 생물학적으로 활성인 ABC1 단백질의 생체내에서의 장기적이고 효과적인 발현을 가능하게 하는, 본 발명에 따른 바이러스로 생체외에서 유전자 변형된 세포 또는 체내에 이식된 바이러스와 같은 생성 세포의 사용에 관한 것이다.The present invention also relates to the use of producing cells, such as cells which have been genetically modified in vitro with a virus according to the present invention or a virus transplanted into the body, which enables long-term and effective expression of biologically active ABC1 protein in vivo. will be.

본 발명은 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 바이러스 벡터에 도입하는 것이 가능하고, 이러한 벡터가 생물학적으로 활성이고 성숙한 형태를 효과적으로 발현할 수 있다는 것을 보여준다. 좀더 자세히 설명하면, 본 발명은 ABC1의 생체내 발현이 아데노바이러스의 직접 투여 또는 생성 세포 또는 아데노바이러스 또는 이러한 DNA를 도입하는 레트로바이러스에 의해 유전자 변형된 세포의 이식에 의해 달성될 수 있다는 것을 보여준다.The present invention shows that it is possible to introduce nucleic acids encoding ABC1 polypeptides into viral vectors, which vectors can effectively express biologically active and mature forms. More specifically, the present invention shows that in vivo expression of ABC1 can be achieved by direct administration or production of adenoviruses or transplantation of cells genetically modified by adenoviruses or retroviruses that introduce such DNA.

바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 주사 가능한 제형물, 특히 예를 들면, 환자의 문맥과 같이 정맥내 주사용으로 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 생리학적으로 적합한 부형제를 포함한다. 이들은 특히 등장성 멸균액 또는 멸균수 또는 생리 식염수의 경우에 따라 첨가시 주사액의 제조를 가능하게 하는 건조, 특히 동결건조된 조성물과 관련있을 수 있다. 환자의 문맥에의 직접 주사가 바람직한데 그 이유는 간의 수준에서 감염을 표적화하여 이 기관의 수준에서 치료 효능을 집중시키는 것이 가능하기 때문이다.Preferably, the pharmaceutical composition of the present invention comprises an injectable formulation, in particular a pharmaceutically acceptable vehicle or physiologically suitable excipient for intravenous injection, such as for example in the context of a patient. These may in particular be related to dry, in particular lyophilized compositions which allow the preparation of injectable solutions upon addition, in the case of isotonic sterile solutions or sterile water or physiological saline. Direct injection into the patient's context is preferred because it is possible to target infection at the level of the liver and focus treatment efficacy at the level of this organ.

"약학적으로 허용되는 비히클 또는 부형제"는 투여방법에 대해 약학적으로 허용되고, 멸균되었으며, 적당한 분산제 또는 습윤제와 현탁제를 사용하여 제형된 수성 또는 유성 현탁액일 수 있는 희석제 및 충진제를 포함한다. 약학적으로 허용되는 특정 담체 및 활성 화합물 대 담체의 비는 조성물의 용해도 및 화학적 성질, 특정 투여모드 및 표준 약학적 행위에 의해 결정된다.“Pharmaceutically acceptable vehicle or excipient” includes diluents and fillers which are pharmaceutically acceptable, sterile, and aqueous or oily suspensions formulated with suitable dispersing or wetting agents and suspending agents for the method of administration. The ratio of specific pharmaceutically acceptable carrier and active compound to carrier is determined by the solubility and chemical nature of the composition, the particular mode of administration and standard pharmaceutical behavior.

본 발명의 임의 핵산, 폴리펩타이드, 벡터 또는 숙주세포는 바람직하게는 약학적으로 허용되는 비히클 또는 부형제와 함께 생체내 도입될 것이다. 구 "약학적으로 허용되는"은 인간에게 투여되었을 때, 생리학적으로 허용되고 급성위연동이상항진, 현기증 등과 같은 알러지 또는 유사한 곤란한 반응을 통상 일으키지 않는 분자 잔기 및 조성물을 언급한다. 바람직하게는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용되는"은 동물, 좀더 구체적으로는 인간에게 사용하도록 연방 정부또는 주 정부의 관리국에 의해 인가되었거나 미국 약전 또는 일반적으로 공인된 기타 약전에 일람되어 있다는 것을 의미한다. 용어 "부형제"는 화합물이 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 언급한다. 이러한 약학적 담체는 물 및 낙화생유, 대두유, 광유, 호마유 등과 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일을 포함하는 오일과 같은 멸균액일 수 있다. 물 또는 수용액 생리식염수와 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 바람직하게는, 특히 주사액용 부형제로서 이용된다. 적당한 약학적 부형제는 E.W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다.Any nucleic acid, polypeptide, vector or host cell of the invention will preferably be introduced in vivo with a pharmaceutically acceptable vehicle or excipient. The phrase “pharmaceutically acceptable” refers to molecular moieties and compositions that, when administered to humans, do not normally cause physiologically acceptable and allergic or similar difficult reactions such as acute gastric dysfunction, dizziness, and the like. Preferably, as used herein, the term “pharmaceutically acceptable” refers to a US pharmacopoeia or other generally recognized pharmacopoeia or that has been authorized by the federal or state authorities for use in animals, more specifically humans. It means that it is listed in. The term "excipient" refers to a diluent, adjuvant, excipient or vehicle with which the compound is administered. Such pharmaceutical carriers may be sterile liquids such as water and oils including oils of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. Water or aqueous solution saline and aqueous dextrose and glycerol solutions are preferably used, in particular, as excipients for injection. Suitable pharmaceutical excipients are described in E.W. Martin's "Remington's Pharmaceutical Sciences".

본 발명에 따른 약학 조성물은 경구, 직장, 비경구, 정맥내, 피하 또는 경피 경로로 균일하게 잘 투여될 수 있다.The pharmaceutical compositions according to the invention can be well and uniformly administered by the oral, rectal, parenteral, intravenous, subcutaneous or transdermal route.

본 발명은 또한 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증의 예방, 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 환자 또는 피검자의 치료용 약제의 제조를 위한, 서열번호 71의 아미노산 서열 또는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 가지는 ABC1 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.The invention also provides for the prevention of various forms of atherosclerosis, specifically for the preparation of a medicament for the treatment of a patient or subject with a reverse transport dysfunction of cholesterol, amino acid sequence of SEQ ID NO: 71 or amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71 It relates to the use of the ABC1 polypeptide having a.

본 발명은 최종적으로 하나 이상의 생리학적으로 적합한 비히클 및/또는 부형제와 배합된, 서열번호 71의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드 또는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드 치료 유효량을 포함하는, 콜레스테롤의 역수송 기능장애에 걸린 환자 또는 피검자의 예방용 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention includes a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 71 or a polypeptide therapeutically effective amount comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, finally combined with one or more physiologically suitable vehicles and / or excipients, It relates to a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of a patient or subject suffering from reverse transport dysfunction of cholesterol.

또다른 일면에 따라서, 본 발명의 주제는 또한 콜레스테롤 대사, 구체적으로는 콜레스테롤의 수송, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 결핍에 의해 유발되는 질환의 예방적 또는 치유적 치료방법이고, 이러한 방법은 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 환자 또는 피검자에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 핵산은 경우에 따라, 하나 이상의 생리학적으로 적합한 비히클 및/또는 부형제와 배합된다.According to another aspect, the subject matter is also a prophylactic or curative treatment of diseases caused by cholesterol metabolism, specifically the transport of cholesterol, more specifically the deficiency of cholesterol transport, which method is ABC1 poly Administering to the patient or subject a nucleic acid encoding a peptide, wherein the nucleic acid is optionally combined with one or more physiologically suitable vehicles and / or excipients.

또다른 일면에 따라서, 본 발명의 주제는 또한 콜레스테롤의 대사, 구체적으로는 콜레스테롤의 수송, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 결핍에 의해 유발되는 질환의 예방적 또는 치유적 치료방법이고, 이러한 방법은 환자 또는 피검자에서의 본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드 치료 유효량을 환자 또는 피검자에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 폴리펩타이드는 경우에 따라, 하나 이상의 생리학적으로 적합한 비히클 및/또는 부형제와 배합된다.According to another aspect, the subject matter is also a prophylactic or curative treatment of a disease caused by cholesterol metabolism, in particular the transport of cholesterol, more specifically the deficiency of cholesterol transport, which method is a patient. Or administering to the patient or subject a therapeutically effective amount of an ABC1 polypeptide according to the invention in a subject, wherein the polypeptide is optionally combined with one or more physiologically compatible vehicles and / or excipients.

또다른 양태에서, 본 발명에 따른 핵산, 폴리펩타이드, 재조합 벡터 및 조성물은 소포, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다(참조: Langer, 1990; Treat 등, 1989; 및 Lopez-Berestein, 1989).In another embodiment, nucleic acids, polypeptides, recombinant vectors and compositions according to the invention can be delivered as vesicles, in particular liposomes (Langer, 1990; Treat et al., 1989; and Lopez-Berestein, 1989).

또다른 양태에서, 본 발명에 따른 핵산, 폴리펩타이드, 재조합 벡터, 재조합 세포 및 조성물은 조절성 분비 시스템으로 전달될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 정맥내 주입, 매몰식 삼투성 펌프, 경피성 패치, 리포솜 또는 기타 투여모드를 사용하여 투여될 수 있다. 일 양태에서, 펌프가 사용될 수 있다(참조: Langer, 1990; Sefton, 1987; Buchwald 등, 1980; Saudek 등, 1989). 또다른 양태에서는, 중합체 물질이 사용될 수 있다(Langer 및 Wise, 1974; Smolen 및 Ball, 1984;Ranger 및 Peppas, 1983; Levy 등, 1985; During 등, 1989; 및 Howard 등, 1989). 또다른 양태에서는, 조절성 분비 시스템이 표적 조직 또는 기관, 즉 심혈관계에 근접하여 있을 수 있어, 전신 투여의 일부만을 요한다(참조: Goodson, 1984). 기타 조절성 분비 시스템이 Langer(1990)의 논문에 기술되어 있다.In another embodiment, nucleic acids, polypeptides, recombinant vectors, recombinant cells and compositions according to the invention can be delivered to a regulatory secretion system. For example, the polypeptide can be administered using intravenous infusion, buried osmotic pumps, transdermal patches, liposomes or other modes of administration. In one aspect, a pump may be used (Langer, 1990; Sefton, 1987; Buchwald et al., 1980; Saudek et al., 1989). In another embodiment, polymeric materials can be used (Langer and Wise, 1974; Smolen and Ball, 1984; Langer and Peppas, 1983; Levy et al., 1985; During et al., 1989; and Howard et al., 1989). In another embodiment, a regulated secretion system may be in close proximity to the target tissue or organ, ie the cardiovascular system, requiring only a portion of systemic administration (Goodson, 1984). Other regulatory secretion systems are described in Langer (1990).

추가의 일면에서, 본 발명에 따른 핵산으로 형질감염되고 본 발명에 따른 ABC1 폴리펩타이드를 고 수준으로 발현하는 재조합 세포가 ABC1 폴리펩타이드를 요하는 피검자에게 이식될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 ABC1 암호화 핵산으로 형질감염된 자가조직의 세포가 거부반응을 회피하도록 이식되고; 이와 달리, 면역 인식 및 거부반응을 방지하는 중합체 매트릭스 내에서 가용성 인자를 생산하는 비-자가조직의 세포를 감추기 위한 기술이 이용 가능하다.In a further aspect, recombinant cells transfected with a nucleic acid according to the invention and expressing high levels of the ABC1 polypeptide according to the invention can be transplanted into a subject in need of the ABC1 polypeptide. Preferably, cells of autologous tissues transfected with ABC1 encoding nucleic acids according to the present invention are transplanted to avoid rejection; Alternatively, techniques are available for hiding cells of non-autologous tissues that produce soluble factors in a polymer matrix that prevents immune recognition and rejection.

따라서, ABC1 폴리펩타이드는 정맥내, 동맥내, 복막내, 근육내 또는 피하 투여 경로로 전달될 수 있다. 이와 달리, 적절하게 제형된 ABC1 폴리펩타이드는 비강 또는 경구 투여로 투여될 수 있다. ABC1의 일정한 공급이 필요한 간격으로, 예를 들면 매일, 12시간 등의 간격으로 치료 유효 투여량(즉, 피검자에서 대사 변화를 유도하는 유효 투여량)을 제공함으로써 보장될 수 있다. 이러한 파라미터는 치료할 질환 증상의 심각성, 시행되는 식이요법의 변화와 같은 기타 행위, 피검자의 체중, 연령 및 성별과, 기타 기준에 좌우될 것이고, 이는 당업자에 의한 양호한 표준 의료 행위에 따라 쉽게 결정될 수 있다.Thus, the ABC1 polypeptide can be delivered by intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular or subcutaneous route of administration. Alternatively, suitably formulated ABC1 polypeptides can be administered by nasal or oral administration. A constant supply of ABC1 can be ensured by providing a therapeutically effective dose (ie, an effective dose that induces metabolic changes in a subject) at intervals that require a regular interval, such as daily, 12 hours, and the like. These parameters will depend on the severity of the disease symptom to be treated, other behaviors such as changes in the diet being administered, the weight, age and gender of the subject, and other criteria, which can be readily determined by good standard medical practice by those skilled in the art. .

본 발명에 따른 핵산, 폴리펩타이드, 재조합 벡터, 재조합 숙주세포 및 조성물의 투여가 수행되는 피검자는 바람직하게는 인간이지만, 임의 동물일 수도 있다.따라서, 당업자에 의해 쉽게 감지될 수 있는 것처럼, 본 발명의 방법 및 약학 조성물은 임의 동물, 특히 포유류에 투여하기에 특히 적당하고, 임의 동물로는 고양이 또는 개와 같은 가축 실험 재료, 소, 말, 염소, 양 및 돼지와 같은 농장 동물 실험 재료(이로 한정되지 않음), 야생 동물(야생 또는 동물원), 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이 등과 같은 연구용 동물, 닭, 칠면조, 새 등과 같은 조류 종, 즉 수의학적 용도를 위한 동물이 포함되고, 이로 한정되지는 않는다.The subject to which administration of the nucleic acid, polypeptide, recombinant vector, recombinant host cell and composition according to the present invention is preferably performed is human, but may be any animal. Thus, as can be easily detected by those skilled in the art, the present invention The methods and pharmaceutical compositions of the present invention are particularly suitable for administration to any animal, especially a mammal, and any animal includes, but is not limited to, farm animal test materials such as cats or dogs, and farm animal test materials such as cattle, horses, goats, sheep and pigs. ), Wild animals (wild or zoo), research animals such as mice, rats, rabbits, goats, sheep, pigs, dogs, cats, etc., bird species such as chickens, turkeys, birds, etc., ie animals for veterinary use It is not limited to this.

바람직하게는, 전술한 바와 같은 핵산, 재조합 벡터, 폴리펩타이드 또는 재조합 숙주세포를 포함하는 약학 조성물이 환자 또는 피검자에게 투여될 것이다.Preferably, a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid, a recombinant vector, a polypeptide or a recombinant host cell as described above will be administered to a patient or subject.

ABC1 폴리펩타이드에 대한 효능제 또는 길항제 화합물의 스크리닝 방법Screening methods of agonist or antagonist compounds against ABC1 polypeptide

또다른 일면에 따라서, 본 발명은 또한 탠지어병, 좀더 일반적으로는 FHD형 증상과 같은 콜레스테롤의 대사, 구체적으로는 콜레스테롤의 수송, 좀더 구체적으로는 콜레스테롤의 역수송 결핍으로 인한 질환의 치료에 유용한 치료용 화합물 또는 소형 분자의 다양한 스크리닝 방법에 관한 것이다.According to another aspect, the present invention also provides treatments useful for the treatment of tangerine disease, more generally the metabolism of cholesterol, such as FHD type symptoms, specifically the transport of cholesterol, and more particularly the disease caused by deficiency of back transport of cholesterol. A method for screening various compounds or small molecules.

따라서 본 발명은 또한 콜레스테롤의 역수송 기능장애로부터 초래되는 질환의 예방용 또는 치료용 활성 성분을 스크리닝하기 위한, ABC1 폴리펩타이드의 용도 또는 ABC1 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 용도에 관한 것이다. ABC1 폴리펩타이드의 촉매 부위 및 올리고펩타이드 또는 면역원성 단편이 모든 기존 기술에 의한 산물 라이브러리의 스크리닝에 소용될 수 있다. 이러한 유형의 스크리닝에 사용되는 폴리펩타이드 단편은 세포 표면 또는 세포에서 용액으로 유리 상태일 수 있고, 고형 지지체에 결합된 상태일 수 있다. 이어서 ABC1 폴리펩타이드 단편과 시험 제제 간의 결합 복합체 형성이 평가될 수 있다.The present invention therefore also relates to the use of ABC1 polypeptides or the use of cells expressing ABC1 polypeptides for the screening of active ingredients for the prevention or treatment of diseases resulting from reverse transport dysfunction of cholesterol. Catalytic sites and oligopeptides or immunogenic fragments of the ABC1 polypeptide may be useful for screening product libraries by all existing techniques. Polypeptide fragments used for this type of screening may be free in solution at the cell surface or at the cell, and bound to a solid support. Binding complex formation between the ABC1 polypeptide fragment and the test agent can then be assessed.

해당 단백질에 대해 친화성을 가지는 산물에의 접근을 가능하게 하는 고-플럭스 스크리닝에 사용될 수 있는 또다른 산물 스크리닝 기술이 출원 WO84/03564에 기술되어 있다. ABC1 단백질에 적용되는 이 방법에서, 다양한 산물이 고체 표면 상에서 합성된다. 이러한 산물은 ABC1 단백질 또는 이의 단편과 반응하고 복합체가 세척된다. 이어서 ABC1 단백질과 결합한 산물이 당업자에게 알려져 있는 방법으로 검출된다. 비-중화 항체 또한 펩타이드를 포획하여 지지체에 고정시키는 데 사용될 수 있다.Another product screening technique that can be used for high-flux screening that allows access to products having affinity for the protein of interest is described in application WO84 / 03564. In this method applied to the ABC1 protein, various products are synthesized on a solid surface. This product reacts with ABC1 protein or fragments thereof and the complex is washed. The product bound to ABC1 protein is then detected by methods known to those skilled in the art. Non-neutralizing antibodies can also be used to capture and immobilize the peptides to the support.

또다른 가능성은 ABC1 중화 항체 경쟁, ABC1 단백질 및 ABC1 단백질과 잠재적으로 결합하는 산물을 사용하는 산물 스크리닝 방법을 수행하는 것이다. 이 방법에서, 항체는 ABC1 폴리펩타이드 또는 단백질과 공통의 항원성 단위를 가지는 펩타이드의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다.Another possibility is to carry out product screening methods using ABC1 neutralizing antibody competition, ABC1 protein and products that potentially bind ABC1 protein. In this method, the antibody can be used to detect the presence of a peptide having an antigenic unit in common with an ABC1 polypeptide or protein.

ABC1 활성의 증가능에 대해 평가될 산물 중에서, 특히 분자의 활성화에 관여하는 키나제-특이적 ATP 유사체 및 키나제로부터 초래되는 탈인산화를 회피할 수 있는 포스파타제가 언급될 수 있다. 특히 포스포디에스테라제(PDE) 테오필린 및 3-이소부틸-1-메틸잔틴형의 억제제 또는 아데닐사이클라제 포스콜린 활성제가 언급될 수 있다.Among the products to be evaluated for the increased ability of ABC1 activity, mention may be made of kinases-specific ATP analogs involved in the activation of molecules and phosphatase which can avoid dephosphorylation resulting from kinases. Particular mention may be made of inhibitors of the phosphodiesterase (PDE) theophylline and 3-isobutyl-1-methylxanthin type or adenylcyclase phospholine activators.

따라서, 본 발명은 막 또는 소포 간의 콜레스테롤의 전좌방법(참조: 실시예 13)을 기본으로 하는, 산물, 즉 화합물, 소형 분자 등의 스크리닝 방법의 용도에 관한 것인데, 이것은 모든 합성형 또는 세포형, 즉 인간 ABC1 암호화 핵산을 구성적으로 발현하거나 이것이 도입된 포유류, 곤충, 박테리아 또는 효모의 합성형 또는 세포형이다.Accordingly, the present invention relates to the use of screening methods of products, i.e. compounds, small molecules, etc., based on the method of translocation of cholesterol between membranes or vesicles (see Example 13), which relates to all synthetic or That is, synthetic or cell types of mammals, insects, bacteria or yeast constitutively expressing or introducing human ABC1 encoding nucleic acids.

마찬가지로, ABC1 단백질이 음이온 수송을 가능하게 하고(Becq 등, 1997 및 Yamon 등, 1997) 이 수송이 오카다산 및 오르토바나데이트와 같은 포스파타제 억제제 및 부분적으로는 포스콜린과 같은 제제에 의한 cAMP의 증가에 의해 활성화된다는 것이 설명되었다. 본 발명은 또한 ABC1 단백질의 활성을 조절하는 분자를 스크리닝하기 위한 이러한 시스템의 사용에 관한 것이다(참조: 실시예 14).Similarly, the ABC1 protein allows for anion transport (Becq et al., 1997 and Yamon et al., 1997) and this transport is associated with an increase in cAMP by agents such as phosphatase inhibitors such as okadaic acid and orthovanadate and, in part, forskolin. It has been described that it is activated by. The present invention also relates to the use of such a system for screening molecules that modulate the activity of ABC1 protein (see Example 14).

Yamon 등(1997)은 마우스 ABC1 단백질이 마우스 복막의 대식구에서 프로염증성 사이토킨 IL-1 베타의 분비에 관여한다는 것을 입증하였다. 따라서 두 단백질을 발현하는 임의 세포형으로부터의 IL-1 베타 방출을 측정함으로써 ABC1 단백질의 활성을 조절하는 산물의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다(참조: 실시예 15).Yamon et al. (1997) demonstrated that mouse ABC1 protein is involved in the secretion of pro-inflammatory cytokine IL-1 beta in macrophages of the mouse peritoneum. Thus, one can provide a method for screening products that modulate the activity of ABC1 protein by measuring IL-1 beta release from any cell type expressing both proteins (see Example 15).

추가로, 여러 트랜스포터의 파괴가 설명된 것을 알고서(van den Hazel 등, 1999), 특징적인 표현형을 가지는 세포 돌연변이체의 사용을 고려하고, ABC1으로 이의 기능을 보완하며, 스크리닝을 위해 전체를 사용할 수 있게 되었다.In addition, knowing that the destruction of several transporters has been described (van den Hazel et al., 1999), consider the use of cell mutants with characteristic phenotypes, complement their function with ABC1, and use the whole for screening. It became possible.

본 발명은 또한 콜레스테롤의 대사에서 활성 화합물 또는 소형 분자인, ABC1 폴리펩타이드의 효능제 또는 길항제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:The present invention also relates to a method for screening an agonist or antagonist of ABC1 polypeptide, which is an active compound or small molecule in the metabolism of cholesterol, the method comprising the following steps:

a)ABC1 폴리펩타이드를 포함하는 막 소포 및 검출 가능한 마커를 포함하는 지질 기질을 제조하고;a) preparing a lipid substrate comprising a membrane vesicle comprising an ABC1 polypeptide and a detectable marker;

b)단계 a)에서 수득된 소포를 효능제 또는 길항제 후보 화합물과 함께 배양하며;b) incubating the vesicle obtained in step a) with an agonist or antagonist candidate compound;

c)검출 가능한 마커를 포함하는 지질 기질의 방출량을 정성적 및/또는 정량적으로 측정한 다음;c) qualitatively and / or quantitatively determining the amount of release of a lipid substrate comprising a detectable marker;

d)단계 b)에서 수득된 방출량 측정 값을 효능제 또는 길항제 후보 화합물과 함께 미리 배양하지 않은 소포에 의한 표지된 지질 기질의 방출량 측정 값과 비교한다.d) The release measurement obtained in step b) is compared with the release measurement of the labeled lipid substrate by vesicles not preincubated with the agonist or antagonist candidate compound.

첫번째 특정 양태에서, ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함한다.In a first specific embodiment, the ABC1 polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71.

두번째 특정 양태에서, ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다.In a second specific embodiment, the ABC1 polypeptide comprises amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

상기 스크리닝 방법의 첫번째 일면에 따라서, 막 소포는 당업자에게 잘 알려져 있는 기술에 따라 제조될 수 있는, 합성 지질 소포이다. 이 특정 일면에 따라서, ABC1 단백질은 재조합 ABC1 단백질일 수 있다.According to the first aspect of the screening method, the membrane vesicles are synthetic lipid vesicles, which can be prepared according to techniques well known to those skilled in the art. According to this particular aspect, the ABC1 protein may be a recombinant ABC1 protein.

두번째 일면에 따라서, 막 소포는 ABC1 폴리펩타이드를 발현하는 세포로부터 유도된 원형질 막의 소포이다. 이들은 ABC1 폴리펩타이드를 자연 발현하는 세포 또는 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산으로 형질감염된 세포 또는 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터일 수 있다.According to a second aspect, the membrane vesicles are vesicles of plasma membrane derived from cells expressing ABC1 polypeptide. These may be cells that express naturally the ABC1 polypeptide or recombinant vectors comprising cells transfected with a nucleic acid encoding the ABC1 polypeptide or nucleic acids encoding the ABC1 polypeptide.

상기 스크리닝 방법의 세번째 일면에 따라서, 지질 기질은 콜레스테롤 또는 포스파티딜콜린 중에서 선택된다.According to a third aspect of the screening method, the lipid substrate is selected from cholesterol or phosphatidylcholine.

네번째 일면에 따라서, 지질 기질은 예를 들어,3H 또는125I 중에서 선택된동위원소로 방사성 표지된다.According to a fourth aspect, the lipid substrate is radiolabeled with an isotope selected from, for example, 3 H or 125 I.

다섯번째 일면에 따라서, 지질 기질은 NBD 또는 피렌과 같은 형광 화합물로 표지된다.According to a fifth aspect, the lipid substrate is labeled with a fluorescent compound such as NBD or pyrene.

여섯번째 일면에 따라서, 표지된 지질 기질 및 ABC1 폴리펩타이드를 포함하는 막 소포는 단계 b) 전에 고형 지지체의 표면에 고정화된다.According to a sixth aspect, membrane vesicles comprising the labeled lipid substrate and the ABC1 polypeptide are immobilized on the surface of the solid support before step b).

일곱번째 일면에 따라서, 소포에 의해 방출된 형광성 또는 방사능의 측정은 ABC1 폴리펩타이드에 의한 지질 기질 수송 활성의 직접적인 반영이다.According to a seventh aspect, the measurement of the fluorescence or radioactivity released by the vesicles is a direct reflection of the lipid substrate transport activity by the ABC1 polypeptide.

본 발명은 또한 콜레스테롤의 대사에서 활성 화합물 또는 소형 분자인, ABC1 폴리펩타이드의 효능제 또는 길항제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:The present invention also relates to a method for screening an agonist or antagonist of ABC1 polypeptide, which is an active compound or small molecule in the metabolism of cholesterol, the method comprising the following steps:

a)본래 또는 세포를 ABC1 암호화 핵산으로 형질감염시킨 후에, ABC1 폴리펩타이드를 발현하는 세포, 예를 들면 세포주를 수득하고;a) after transfection of the original or the cells with ABC1 encoding nucleic acid, obtaining a cell expressing the ABC1 polypeptide, eg, a cell line;

b)단계 a)의 세포를 검출 가능한 마커로 표지된 음이온의 존재하에 배양하며;b) culturing the cells of step a) in the presence of an anion labeled with a detectable marker;

c)이러한 세포에 침투하지 않은 과량의 표지된 음이온을 제거하기 위해 단계 b)의 세포를 세척하며;c) washing the cells of step b) to remove excess labeled anions that did not penetrate these cells;

d)단계 c)에서 수득된 세포를 ABC1 폴리펩타이드에 대한 효능제 또는 길항제 후보 화합물과 함께 배양하며;d) culturing the cells obtained in step c) with an agonist or antagonist candidate compound for ABC1 polypeptide;

e)표지된 음이온의 유출량을 측정한 다음;e) measuring the outflow of labeled anions;

f)단계 e)에서 측정된 표지된 음이온의 유출량 값을 ABC1 폴리펩타이드에 대한 효능제 또는 길항제 후보 화합물의 존재하에 미리 배양하지 않은 세포로 측정된 표지된 음이온의 유출량 값과 비교한다.f) The effluent value of the labeled anion measured in step e) is compared with the effluent value of the labeled anion measured with cells not previously cultured in the presence of an agonist or antagonist candidate compound for the ABC1 polypeptide.

첫번째 특정 양태에서, ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함한다.In a first specific embodiment, the ABC1 polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71.

두번째 특정 양태에서, ABC1 폴리펩타이드는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다.In a second specific embodiment, the ABC1 polypeptide comprises amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

상기 스크리닝 방법의 첫번째 일면에 따라서, 사용되는 세포는 ABC1 폴리펩타이드를 자연 발현하는 세포이다. 이들은 인간 혈액의 단핵구 집단으로부터 정제된 1차 배양균 중의 인간 단핵구일 수 있다. 이들은 또한 단핵구 백혈병 계통 THP1과 같은 인간 단핵구 세포주일 수 있다.According to the first aspect of the screening method, the cell used is a cell that naturally expresses the ABC1 polypeptide. These may be human monocytes in primary cultures purified from monocyte populations of human blood. They can also be human monocyte cell lines such as monocyte leukemia lineage THP1.

두번째 일면에 따라서, 전술한 스크리닝 방법에 사용된 세포는 ABC1 폴리펩타이드를 자연 발현하지 않거나, 이와 달리 저 수준으로 발현하는 세포일 수 있는데, 상기 세포는 ABC1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 발현할 수 있는 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질감염된다.According to a second aspect, the cells used in the screening methods described above may be cells that do not naturally express ABC1 polypeptide or otherwise express low levels, which cells may express nucleic acids encoding ABC1 polypeptide. Transfected with the recombinant vector according to the invention.

세번째 일면에 따라서, 세포는 음이온 수송이 자연 결여된 세포 또는 VerapamilTM또는 테트라에틸암모늄과 같은 하나 이상의 음이온 채널 억제제로 전처리된 세포일 수 있다.According to a third aspect, the cell may be a cell naturally lacking anion transport or a cell pretreated with one or more anion channel inhibitors such as Verapamil ™ or tetraethylammonium.

상기 스크리닝 방법의 네번째 일면에 따라서, 음이온은 염 K125I 또는 Na125I와 같은 아이오다이드로 방사성 표지된다.According to a fourth aspect of the screening method, the anion is radiolabeled with an iodide such as salt K 125 I or Na 125 I.

다섯번째 일면에 따라서, 표지된 음이온 유출량의 측정은 실험 도중에 수시간에 걸쳐서 주기적으로 시행되어, 또한 이 유출량의 역학적 측정을 가능하게 한다.According to a fifth aspect, the measurement of labeled anion outflow is performed periodically over several hours during the experiment, which also allows for the mechanical measurement of this outflow.

여섯번째 일면에 따라서, 표지된 음이온 유출량 값은 세포 배양균 상등액에 주어진 시간에 존재하는 표지된 음이온의 양을 측정함으로써 측정된다.According to a sixth aspect, the labeled anion outflow value is determined by measuring the amount of labeled anion present at a given time in the cell culture supernatant.

일곱번째 일면에 따라서, 표지된 음이온의 유출량 값은 세포 용해물에서 측정된 방사성과 세포 배양균 상등액에서 측정된 방사성의 총계에 상응하는 전체 방사성에 대한 세포 배양균 상등액에서 측정된 방사성의 비율로 결정된다.According to the seventh aspect, the effluent value of labeled anions is determined as the ratio of radioactivity measured in the cell culture supernatant to total radioactivity corresponding to the total radioactivity measured in the cell lysate and the radioactivity measured in the cell culture supernatant. do.

본 발명의 주제는 또한 콜레스테롤의 대사에서 활성 화합물 또는 소형 분자인, ABC1 폴리펩타이드의 효능제 또는 길항제를 스크리닝하는 방법이고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:Subject of the invention is also a method of screening for agonists or antagonists of ABC1 polypeptide, which are active compounds or small molecules in the metabolism of cholesterol, the method comprising the following steps:

a)인간 단핵구 계통의 세포를 적절한 배양 배지에서 정제된 인간 알부민의 존재하에 배양하고;a) cells of human monocyte lineage are cultured in the presence of purified human albumin in a suitable culture medium;

b)단계 a)의 세포를 동시에 IL-1 베타 및 효능제 또는 길항제 후보 화합물의 생산을 자극하는 화합물의 존재하에 배양하며;b) the cells of step a) are simultaneously cultured in the presence of a compound that stimulates the production of IL-1 beta and an agonist or antagonist candidate compound;

c)단계 b)에서 수득되는 세포를 ATP의 적절한 농축액 존재하에 배양하며;c) culturing the cells obtained in step b) in the presence of appropriate concentrate of ATP;

d)세포 배양균 상등액으로 방출된 IL-1 베타를 측정한 다음;d) measuring IL-1 beta released into the cell culture supernatant;

e)단계 d)에서 수득된 IL-1 베타의 방출량 값을 효능제 또는 길항제 후보 화합물의 존재하에 미리 배양하지 않은 세포의 배양 상등액으로 방출된 IL-1 베타의 값과 비교한다.e) The release value of IL-1 beta obtained in step d) is compared with the value of IL-1 beta released into the culture supernatant of cells not previously cultured in the presence of an agonist or antagonist candidate compound.

전술한 스크리닝 방법의 첫번째 일면에 따라서, 사용되는 세포는 인간 백혈병 단핵구 계통 THP1에 속한다.According to the first aspect of the screening method described above, the cells used belong to the human leukemia monocyte line THP1.

스크리닝 방법의 두번째 일면에 따라서, IL-1 베타의 생산을 자극하는 화합물은 리포폴리사카라이드이다.According to a second aspect of the screening method, the compound that stimulates production of IL-1 beta is lipopolysaccharide.

상기 방법의 세번째 일면에 따라서, IL-1 알파, IL-6 및 TNF 알파의 이러한 세포에 의한 생산 또한 정량적 및/또는 정성적으로 평가된다.According to a third aspect of the method, the production by these cells of IL-1 alpha, IL-6 and TNF alpha is also assessed quantitatively and / or qualitatively.

네번째 일면에 따라서, 메신저 RNA 암호화 IL-1 베타의 발현 수준 또한 측정된다.According to a fourth aspect, the expression level of messenger RNA encoding IL-1 beta is also measured.

하기 실시예는 본 발명을 더욱 자세히 설명하기 위한 것이고 본 발명을 제한하지는 않는다.The following examples are intended to illustrate the invention in more detail and do not limit the invention.

실시예 1: 본 발명의 따른 ABC1 유전자 전사체의 조직 분포Example 1 Tissue Distribution of the ABC1 Gene Transcript According to the Present Invention

본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드의 발현 프로필이 특히 Sambrook 등(1989)에 의해 설명된 PCR-커플링 역전사 및 노던 블롯 분석의 프로토콜에 따라 평가된다.The expression profile of the polynucleotides according to the invention is assessed according to the protocol of PCR-coupled reverse transcription and Northern blot analysis, in particular described by Sambrook et al. (1989).

예를 들면, 역전사에 의한 분석의 경우에, 전술한 바와 같은 한 쌍의 프라이머가 서열번호 69 및 70으로 표시되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인간 ABC1 유전자의 cDNA로부터 합성될 수 있다. 이 프라이머 쌍은 상응하는 ABC1 cDNA를 검출하는 데 사용될 수 있다. 좀더 자세히 설명하면, ABC1에 대해 특이적이고 1) 서열번호 69의 뉴클레오타이드 영역 1-184에 있는 서열 및 서열번호 69의 뉴클레오타이드 영역 6968-9741에 있는 상보 서열, 또는 2) 서열번호 70의 뉴클레오타이드 영역 1-297에 있는 서열 및 서열번호 70의 뉴클레오타이드 영역 7081-9854에 있는 상보 서열을 포함하는 두 개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 ABC1 cDNA를 분리하는 데 사용될 수 있다.For example, in the case of analysis by reverse transcription, a pair of primers as described above can be synthesized from the cDNA of the human ABC1 gene comprising the polynucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 69 and 70. This primer pair can be used to detect the corresponding ABC1 cDNA. More specifically, it is specific for ABC1 and may be 1) the sequence in nucleotide region 1-184 of SEQ ID NO: 69 and the complementary sequence in nucleotide region 6968-9741 of SEQ ID NO: 69, or 2) the nucleotide region 1- of SEQ ID NO: 70 Two oligonucleotide primers comprising the sequence at 297 and the complementary sequence at nucleotide region 7081-9854 of SEQ ID NO: 70 can be used to isolate ABC1 cDNA.

폴리머라제 연쇄반응(PCR)이 역전사된 폴리A+mRNA(Clontech)에 상응하는 cDNA 주형으로 수행된다. cDNA로의 역전사가 제조업자에 의해 설명된 조건에 따라 효소 SUPERSCRIPT II(GibcoBRL, Life Technologies)로 수행된다. 폴리머라제 연쇄반응은 표준 조건에 따라, cDNA 제조물 25 ng을 지니는 반응 혼합물 20 ㎕에서 수행된다. 반응 혼합물은 dNTP 각각 400 μM, Thermus aquaticus(Taq) DNA 폴리머라제(Ampli Taq Gold; Perkin Elmer) 2 단위, 각 프라이머 0.5 μM, MgCl22.5 mM 및 PCR 완충액으로 구성된다. 34 PCR 사이클[94℃에서 30초간 변성, 34 사이클 중에 다음과 같이 분리된 30초의 어닐링: 64℃(2 사이클), 61℃(2 사이클), 58℃(2 사이클) 및 55℃(28 사이클) 및 72℃에서 킬로베이스마다 1분의 신장]이 Perkin Elmer 9700 써모사이클러를 사용하는 10분간의 94℃에서의 제 1 변성 단계 후에 수행된다. PCR 반응은 전기영동에 의해 아가로스 겔 상에서 가시화된다. 수득되는 cDNA 단편이 노던 블롯 분석을 위한 탐침으로서 사용될 수 있고 또한 폴리뉴클레오타이드 서열의 정확한 결정을 위해 사용될 수도 있다.Polymerase chain reaction (PCR) is performed with cDNA templates corresponding to reverse transcribed polyA + mRNA (Clontech). Reverse transcription to cDNA is performed with enzyme SUPERSCRIPT II (GibcoBRL, Life Technologies) according to the conditions described by the manufacturer. The polymerase chain reaction is carried out in 20 μl of the reaction mixture with 25 ng of cDNA preparation, according to standard conditions. The reaction mixture consists of 400 μM dNTP each, 2 units of Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase (Ampli Taq Gold; Perkin Elmer), 0.5 μM each primer, 2.5 mM MgCl 2 and PCR buffer. 34 PCR cycles denatured at 94 ° C for 30 seconds, 30 seconds of annealing separated during 34 cycles as follows: 64 ° C (2 cycles), 61 ° C (2 cycles), 58 ° C (2 cycles) and 55 ° C (28 cycles) And 1 minute elongation per kilobase at 72 ° C. is performed after the first denaturation step at 94 ° C. for 10 minutes using a Perkin Elmer 9700 thermocycler. PCR reactions are visualized on agarose gels by electrophoresis. The resulting cDNA fragment can be used as a probe for northern blot analysis and can also be used for accurate determination of polynucleotide sequences.

노던 블롯 분석의 경우에, 전술한 바와 같이 생산된 cDNA 탐침은 제조업자의 지침에 따라 DNA 표지 시스템 High Prime(Boehringer) 방법에 의해32P로 표지된다.표지 후에, 탐침은 제조업자의 지침에 따라 Sephadex G50 마이크로칼럼(Pharmacia) 상에서 정제된다. 이어서 표지되고 정제된 탐침은 다양한 조직에서 mRNA의 발현을 검출하는 데 사용된다.In the case of Northern blot analysis, the cDNA probe produced as described above is labeled 32 P by the DNA labeling system High Prime (Boehringer) method according to the manufacturer's instructions. After labeling, the probe is Sephadex G50 according to the manufacturer's instructions Purified on microcolumn (Pharmacia). Labeled and purified probes are then used to detect expression of mRNA in various tissues.

상이한 인간 조직의 RNA 샘플을 함유하는 노던 블롯(Multiple Tissue Northern, MTN, Clontech, Blot 2, 참조번호 77759-1)이 표지된 탐침과 하이브리드화된다. 하이브리드화 및 세척을 위한 프로토콜은 제조업자에 의해 설명된 그대로일 수 있거나(Instruction manual PT1200-1) 당업자에게 알려져 있거나 예를 들면, F. Ausubel 등(1999)에 의해 설명된 방법을 사용하여 수정될 수 있다. 따라서 예를 들면, 포름아미드의 존재하에 예비하이브리드화 및 하이브리드화 온도를 변경할 수 있다.Northern blots containing RNA samples from different human tissues (Multiple Tissue Northern, MTN, Clontech, Blot 2, Ref. 77759-1) are hybridized with labeled probes. Protocols for hybridization and washing may be as described by the manufacturer (Instruction manual PT1200-1) or may be known to those skilled in the art or modified using methods described, for example, by F. Ausubel et al. (1999). Can be. Thus, for example, the prehybridization and hybridization temperatures can be altered in the presence of formamide.

예를 들면, 하기 프로토콜이 사용될 수 있다:For example, the following protocol can be used:

1-막 경쟁 및 예비하이브리드화: 1- Membrane Competition and Prehybridization:

- 혼합: 연어 정충 DNA 40 ㎕(10 mg/㎖)Mix: 40 μl salmon sperm DNA (10 mg / ml)

+ 인간의 태반 DNA 40 ㎕(10 mg/㎖)40 μl of human placental DNA (10 mg / ml)

- 5분간 96℃에서 변성, 이어서 혼합물을 얼음에 침지.Denaturing at 96 ° C. for 5 min, then immersing the mixture in ice.

- 2X SSC 제거하고 막을 함유하는 하이브리드화 튜브에 포름아미드 믹스 4 ㎖ 첨가.Remove 2X SSC and add 4 ml of formamide mix to the hybridization tube containing the membrane.

- 두 변성 DNA의 혼합물 첨가.Addition of a mixture of two denatured DNAs.

- 42℃에서 5 내지 6시간 동안 회전시키면서 배양.Incubate with rotation at 42 ° C. for 5-6 hours.

2-표지된 탐침 경쟁: 2- labeled probe competition:

- 반복 서열의 양에 따라, 표지되고 정제된 탐침 Cot I DNA 10 내지 50 ㎕ 첨가.Add 10-50 μl of labeled and purified probe Cot I DNA, depending on the amount of repeat sequence.

- 7 내지 10분간 95℃에서 변성.Denaturation at 95 ° C. for 7-10 minutes.

- 65℃에서 2 내지 5시간 동안 배양.Incubate at 65 ° C. for 2-5 hours.

3-하이브리드화: 3- Hybridization:

- 예비하이브리드화 혼합물 제거.Removal of the prehybridization mixture.

- 연어 정충 DNA 40 ㎕ + 인간의 태반 DNA 40 ㎕를 혼합; 5분간 96℃에서 변성, 이어서 얼음에 침지.-Mix 40 μl salmon sperm DNA + 40 μl human placental DNA; Denature at 96 ° C. for 5 min, then immersed in ice.

- 하이브리드화 튜브에 포름아미드 혼합물 4 ㎖, 두 DNA의 혼합물 및 변성되고 표지된 탐침/Cot I DNA 첨가.Add 4 ml of formamide mixture, a mixture of two DNAs and denatured and labeled probe / Cot I DNA to the hybridization tube.

- 15 내지 20시간 동안 42에서 회전시키면서 배양.Incubate with rotation at 42 for 15-20 hours.

4-세척: 4- washing:

- 실온에서 2X SSC로 1회 세척(세정).Wash once with 2X SSC at room temperature (wash).

- 5분간 실온에서 2X SSC로, 65℃에서 0.1% SDS로 2회.2x with 2X SSC at room temperature for 5 minutes and 0.1% SDS at 65 ° C.

- 15분간 65℃에서 1X SSC로, 65℃에서 0.1% SDS로 2회.2x with 1X SSC at 65 ° C. and 0.1% SDS at 65 ° C. for 15 minutes.

하이브리드화 및 세척 후에, 블롯이 스톰(미국 캘리포니아 서니베일 소재의 Molecular Dynamics)을 통해 나타나는 인 스크린과 밤새 접촉시킨 후에 분석된다.After hybridization and washing, blots were analyzed after overnight contact with the in-screen appearing via Storm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Calif.).

실시예 2: 인간 ABC1 cDNA의 5' 신장Example 2 5 ′ Elongation of Human ABC1 cDNA

본 실시예는 완전 길이 인간 ABC1 단백질을 암호화하는 cDNA 분자의 분리 및 동정을 설명하고 있다. 부분 ABC1 cDNA 서열의 5'신장(GenBank Accession#AJ012376, Langmann 등, 1999)이 변형된 5' RACE 접근법을 사용하여 수행된다.This example describes the isolation and identification of cDNA molecules encoding full length human ABC1 protein. The 5 'extension of the partial ABC1 cDNA sequence (GenBank Accession # AJ012376, Langmann et al., 1999) is performed using a modified 5' RACE approach.

실험 계획:Experiment plan:

포볼 에스테르로 분별된 다음 아세틸화 LDL로 로딩되어 포말세포 표현형으로 전환된 THP1 세포로부터 미리 제조된 인간 단핵구 THP1 cDNA 라이브러리(Lambda 파지 벡터 lZip-lox에서, Life TechR)가 본 실시예에서 사용된다. 콜레스테롤과 함께 로딩될 때 THP1 세포가 인간 ABC1 유전자의 발현을 상당히 상향-조절한다는 것이 알려져 있다(Langmann 등, 1999). 이 THP1 cDNA 라이브러리가 인간 ABC1 cDNA를 5' 신장시키는 데 사용되는데, 그 이유는 이것이 ABC1 cDNA가 풍부하기 때문이다.A human monocyte THP1 cDNA library (from the Lambda phage vector lZip-lox, Life Tech R ), previously prepared from THP1 cells fractionated with a pobol ester and then loaded with an acetylated LDL and converted to a foam cell phenotype, is used in this example. It is known that THP1 cells significantly up-regulate the expression of the human ABC1 gene when loaded with cholesterol (Langmann et al., 1999). This THP1 cDNA library is used to 5 'elongate the human ABC1 cDNA because it is rich in ABC1 cDNA.

인간 ABC1 cDNA의 5' 공지 서열 영역의 뉴클레오타이드와 하이브리드화된(Langmann 등, 1999) 네스팅 PCR 프라이머의 세트(서열번호 155 및 156)가 ABC1 cDNA를 5' 방향으로 신장시키는 데 사용된다(참조: 표 VII). 두 세트의 네스팅 벡터 아암 특이적 프라이머(서열번호 2, 140, 153 및 154)가 인간 ABC1 cDNA 특이적 프라이머에 대해 역방향으로 합성되도록 고안되었다(참조: 표 7 및 도 1). 표 7에서, 용어 "Comp"는 표시된 뉴클레오타이드 위치의 상보 뉴클레오타이드 서열을 언급한다. 이러한 방법으로, 벡터내의 배향에 상관없이 인간 ABC1 cDNA의 진정한 5' 말단에 상응하는 PCR 산물이 수득될 수 있다.A set of nesting PCR primers (SEQ ID NOs 155 and 156) hybridized with nucleotides of the 5 'known sequence region of human ABC1 cDNA (Langmann et al., 1999) is used to elongate ABC1 cDNA in the 5' direction (see: Table VII). Two sets of nesting vector arm specific primers (SEQ ID NOs: 2, 140, 153 and 154) were designed to be reversely synthesized for human ABC1 cDNA specific primers (Table 7 and FIG. 1). In Table 7, the term "Comp" refers to the complementary nucleotide sequence of the indicated nucleotide position. In this way, a PCR product corresponding to the true 5 'end of human ABC1 cDNA can be obtained regardless of the orientation in the vector.

5' ABC1 cDNA 신장 프라이머5 'ABC1 cDNA Elongation Primer PCR 프라이머PCR primers PCR 프라이머 서열번호PCR primer sequence number 1차, 2차 또는서열분석 반응 사용Use of primary, secondary, or sequencing reactions 서열번호 69에서의 위치Position in SEQ ID NO: 69 인간 ABC1 cDNA에 대한 배향Orientation Against Human ABC1 cDNA ABC1-3'ABC1-3 ' 155155 1차 PCRPrimary PCR Comp nt803-824Comp nt803-824 안티센스Antisense ABC1-9ABC1-9 156156 2차 PCR2nd PCR Comp nt703-727Comp nt703-727 안티센스Antisense ABC1-7ABC1-7 139139 서열분석Sequencing Comp nt448-468Comp nt448-468 안티센스Antisense λZip-순방향λZip-forward 140140 1차 PCRPrimary PCR ------ 센스sense λZip-역방향λZip-reverse 153153 1차 PCRPrimary PCR ------ 센스sense λZip-seq-1λZip-seq-1 154154 2차 PCR2nd PCR ------ 센스sense λZip-seq-2λZip-seq-2 22 2차 PCR2nd PCR ------ 센스sense

재료 및 방법:Material and method:

1차 PCR. THP1 cDNA 라이브러리(약 5 ×109pfu/㎖의 λ-Zip-lox-THP1-FC 라이브러리 파지, 2.5×106재조합체를 함유하며, 평균 삽입체 크기가 1.5 kb인 청징화된 박테리아 용해물)를 95℃에서 10분 동안 가열하여 파지를 용해시키고 DNA를 방출시킨다. 이어서, 4 ㎕의 용해된 파지를 20 mM Tris (pH 8.4), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 2.5 단위의 PlatinumRTaq 폴리머라제-HF(BRL), 0.2 uM의 각 프라이머[ABC1-3'(서열번호 155), λZip-순방향(서열번호 140) 또는 λZip-역방향(서열번호 153) 중 하나]를 함유한 50 ㎕ PCR 반응에 사용한다. 증폭은 94℃에서 10초 동안, 58℃에서 20초 동안, 및 72℃에서 2.5분 동안에 35회 수행된다. PCR 반응물 5 ul은 0.02 ug/ml의 에티디움 브로마이드를 함유한 0.8% 아가로스/TBE 겔 상에서 전기영동된다. 겔을 촬영하여 산물의 증거에 대해 검사한다. First PCR . THP1 cDNA library (clarified bacterial lysate containing approximately 5 × 10 9 pfu / ml λ-Zip-lox-THP1-FC library phage, 2.5 × 10 6 recombinant, with an average insert size of 1.5 kb) Heated at 95 ° C. for 10 minutes to dissolve phage and release DNA. 4 μl of the dissolved phage were then 20 mM Tris (pH 8.4), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTP, 2.5 units of Platinum R Taq Polymerase-HF (BRL), 0.2 uM of each primer [ ABC1-3 '(SEQ ID NO: 155), [lambda] Zip-forward (SEQ ID NO: 140) or [lambda] Zip-reverse (SEQ ID NO: 153)]. Amplification is performed 35 times for 10 seconds at 94 ° C., 20 seconds at 58 ° C., and 2.5 minutes at 72 ° C. 5 ul of PCR reaction is electrophoresed on a 0.8% agarose / TBE gel containing 0.02 ug / ml ethidium bromide. Gels are taken and examined for evidence of product.

2차 PCR.1차 PCR로부터 선택된 반응물 1 ul는 50 ul의 10 mM Tris pH 8.5로 제거되고 희석된다. 희석된 1차 PCR 반응물 1 ul는 네스팅 ABC1 프라이머(ABC1-9, 서열번호 156)와 적당한 네스팅 아암 프라이머 λZip-seq-1(서열번호 154) 또는 λZip-seq-2(서열번호 2)를 사용하는 2차 PCR에 사용될 수 있다. PCR 반응은 사이클링 파라미터만 다음과 같이 수정한 것을 제외하고는 상기에서와 같이 증폭된다 :94℃에서 20초 동안, 56℃에서 20초 동안, 72℃에서 1.5분 동안에 25 사이클. 2차 PCR 반응물 5ul은 전술한 아가로스 겔 위에서 분석된다. Secondary PCR. One ul of reaction selected from the primary PCR is removed and diluted with 50 ul of 10 mM Tris pH 8.5. One ul of diluted primary PCR reactant was prepared using nesting ABC1 primer (ABC1-9, SEQ ID NO: 156) and a suitable nesting arm primer, λZip-seq-1 (SEQ ID NO: 154) or λZip-seq-2 (SEQ ID NO: 2). Can be used for secondary PCR used. PCR reactions were amplified as above except that only the cycling parameters were modified as follows: 25 cycles at 94 ° C. for 20 seconds, 56 ° C. for 20 seconds, 72 ° C. for 1.5 minutes. 5ul of secondary PCR reaction is analyzed on the agarose gel described above.

PCR 산물의 정제.적당한 크기의 산물을 가진 것으로 보이는 2차 PCR 반응은 아가로스 겔 위에서 분석되고 ABC1 cDNA 5'증폭 산물에 상응하는 밴드는 Qiagen QiaquickTM겔 추출 정제 시스템을 사용하여, 절단하고 정제한다. 정제된 DNA 단편은 30 ul의 10 mM Tris pH 8.5에서 용출된다. 용출된 PCR 산물 5 ul은 대략의 수율을 결정하기 위하여 아가로스 겔상에서 분석된다. Purification of PCR Products. Secondary PCR reactions appearing to have appropriately sized products are analyzed on agarose gels and bands corresponding to ABC1 cDNA 5 ′ amplification products are cleaved and purified using the Qiagen Qiaquick ™ gel extraction purification system. Purified DNA fragments are eluted at 30 ul of 10 mM Tris pH 8.5. 5 ul of eluted PCR product is analyzed on agarose gel to determine approximate yield.

서열분석.각 정제된 PCR 산물 5 ul과 20 ng의 ABC1-7 서열분석 프라이머(서열번호 139)는 ABI 377 서열분석 장치에서 BigDyeTM터미네이터 사이클 서열분석기를 사용한다. 정제된 5' 증폭 인간 ABC1 cDNA PCR 산물의 서열 결과는 Lasergene DNA Star 소프트웨어 패키지와 NCBI 웹 부위(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 BLAST 프로그램을 사용하여 분석한다. Sequencing. 5 ul and 20 ng of the ABC1-7 sequencing primer (SEQ ID NO: 139) of each purified PCR product were run using a BigDye ™ terminator cycle sequencer on an ABI 377 sequencing device. Sequence results of the purified 5 'amplified human ABC1 cDNA PCR product were analyzed using the Lasergene DNA Star software package and the BLAST program at the NCBI web site (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

결과 및 고찰:Results and Discussion:

1차 PCR 반응은 프라이머가 염색된 것을 제외하고는 약한 밴드를 보일뿐이다(도 2a 참조). 그러므로, 2차 네스팅 PCR 반응이 수행된다. 2차 PCR 반응(도 2b)은, ABC1-9(서열번호 156)과 λZip-seq-2(서열번호 2)의 프라이머를 두반응 동안에(도 2b, 3과 6 레인 참조) 사용하여 약 800 bp의 강하게 염색된 단일밴드를 만드는 반면, ABC1-9(서열번호 156)과 λZip-seq-1(서열번호 154)의 프라이머를 사용했을 때는 7 레인에서 약 750 bp의 약한 밴드를 보인다.The first PCR reaction shows only weak bands except the primer is stained (see FIG. 2A). Therefore, a second nesting PCR reaction is performed. The secondary PCR reaction (FIG. 2B) was approximately 800 bp using primers ABC1-9 (SEQ ID NO: 156) and λZip-seq-2 (SEQ ID NO: 2) during the two reactions (see lanes 2B, 3 and 6). While strongly stained single bands were produced, primers of ABC1-9 (SEQ ID NO: 156) and λZip-seq-1 (SEQ ID NO: 154) showed weak bands of about 750 bp in lane 7.

위 PCR 산물이 인간 ABC1 cDNA에 있어 확실하고 특이적인지를 입증하기 위해, 각각 ABC1-7(서열번호 139)와 λZip-seq-2(서열번호 154) 또는 λZip-seq-1(서열번호 2) 프라이머를 사용한 2차 PCR 반응에서 수득되는 밴드(도 2b에서 레인 3,6,7)를 산출하는 희석된 1차 PCR 반응을 사용하여, 부가적인 네스팅 PCR 반응이 수행된다. 이 부가적인 네스팅 PCR 반응은 2차 PCR 반응에서 수득된 것 보다 작은 254 bp의 산물을 생산한다. 이것은 레인 3과 6에 상응하는 샘플에 대한 사례이다. 그러나 레인 7의 샘플은 그러한 산물을 생산하지 않고 그에 따라, ABC1 cDNA에 특이적이지 않은 것으로 보이고, 더이상 분석하지 않는다.To demonstrate that the above PCR products are specific and specific for human ABC1 cDNA, primers ABC1-7 (SEQ ID NO: 139) and λZip-seq-2 (SEQ ID NO: 154) or λZip-seq-1 (SEQ ID NO: 2), respectively Additional nesting PCR reactions are performed using a diluted primary PCR reaction that yields the band obtained in the secondary PCR reaction using lanes (lanes 3,6,7 in FIG. 2B). This additional nesting PCR reaction produces a product of 254 bp smaller than that obtained in the secondary PCR reaction. This is the case for the samples corresponding to lanes 3 and 6. However, the sample in lane 7 does not produce such a product and therefore appears not to be specific for ABC1 cDNA and is no longer analyzed.

부가적인 100 ul PCR 반응이 레인 3의 샘플에 상응하는 2차 PCR 반응에서 수득되는 산물을 더 많이 생성하기 위해 수행된다. 처음의 샘플 3, 100 ul 스케일-업의 샘플 3, 및 샘플 6으로 이루어진 2차 PCR 반응은 클로닝과 서열분석의 준비를 위해 겔 정제된다(도 3). 정제 후, 3개 겔 정제 샘플의 5 ul은 ABC1-7 올리고뉴클레오타이드(서열번호 139)를 프라이머로 사용하여 서열분석된다. 뿐만 아니라, 정제된 산물은 플라스미드 pcr2.1(Invitrogen)으로 각각 클로닝된다.An additional 100 ul PCR reaction is performed to produce more product obtained in the secondary PCR reaction corresponding to the sample in lane 3. Secondary PCR reactions consisting of the first sample 3, 100 ul scale-up sample 3, and sample 6 were gel purified for the preparation of cloning and sequencing (FIG. 3). After purification, 5 ul of three gel purification samples are sequenced using ABC1-7 oligonucleotide (SEQ ID NO: 139) as a primer. In addition, the purified product is cloned into plasmid pcr2.1 (Invitrogen), respectively.

서열분석 결과는, 발표된 부분적 인간 ABC1 cDNA 의 5'에 부가적인 244 뉴클레오타이드(서열번호 3)를 포함하는 핵산이 수득되는 것으로 드러났다. 이 핵산으로 개방 판독 프레임(ORF)의 조사를 수행하였으며, 이전에 발표된 ORF와 연속적인,새로운 ORF가 동정되었다. 이 ORF는 Langmann 등(1999)의 서열과 비교할 때 부가적인 60개 아미노산 잔기(아미노산 1-60, 서열번호 71)까지 인간 ABC1 단백질을 연장한다. 새로 동정된 개시 ATG 코돈(뉴클레오타이드 185-187, 서열번호 3)은 진핵생물의 해독개시를 위한 Kozak 컨센서스 서열에 따르며, 중요하게도 새로운 ATG 개시 코돈의 9 염기 상류에 프레임 내 TGA 종결코돈(뉴클레오타이드 176-178, 서열번호 3)이 있다. 그러므로 본 발명은 인간 ABC1 단백질(서열번호 71)의 완전길이를 암호화 하는 핵산을 제공한다. 특히 본 발명은 서열번호 71 의 아미노산 1-60으로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공한다.Sequencing results revealed that a nucleic acid comprising 244 nucleotides (SEQ ID NO: 3) additional to 5 'of the published partial human ABC1 cDNA was obtained. Investigation of the open reading frame (ORF) with this nucleic acid was performed, and a new ORF was identified that was continuous with the previously published ORF. This ORF extends the human ABC1 protein up to an additional 60 amino acid residues (amino acids 1-60, SEQ ID NO: 71) when compared to the sequences of Langmann et al. (1999). The newly identified initiating ATG codon (nucleotide 185-187, SEQ ID NO: 3) follows the Kozak consensus sequence for initiation of eukaryotic translation, and importantly the TGA termination codon (nucleotide 176-) in frame upstream of the 9 base of the new ATG initiation codon. 178, SEQ ID NO: 3). The present invention therefore provides a nucleic acid encoding the full length of human ABC1 protein (SEQ ID NO: 71). In particular, the present invention provides a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71.

또한, 발표된 서열과 비교해서 서열번호 3의 새로운 위치 260과 262에서[이것은 Langmann et al.(1999)의 16 및 18 위치에 상응] 2,3 위치의 염기가 다름도 또한 동정되었다. 이들 뉴클레오타이드의 차이는 보존적 변화:260:T→C 및 262:A→G이며; 다른 코돈의 변화를 유발하지는 않는다. 새로운 5' 연장 ABC1 cDNA 영역(서열번호 3)을 포함하는 서열번호 69와 70이 이 예에서 수득된다. 특별히, 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1-244는 서열번호 69의 1-244와 서열번호 70의 뉴클레오타이드 114-357과 각각 상응한다.In addition, different bases at positions 2 and 3 at the new positions 260 and 262 of SEQ ID NO: 3, which correspond to positions 16 and 18 of Langmann et al. (1999) compared to the published sequences, were also identified. The difference between these nucleotides is conservative changes: 260: T → C and 262: A → G; It does not cause other codon changes. SEQ ID NOs: 69 and 70 are obtained in this example comprising a new 5 ′ extension ABC1 cDNA region (SEQ ID NO: 3). In particular, nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 3 correspond to 1-244 of SEQ ID NO: 69 and nucleotides 114-357 of SEQ ID NO: 70, respectively.

ABC1의 완전한 cDNA와 상응하는 cDNA를 분리해내기 위한 다양한 다른 접근이 시도될 수 있다. 예를 들면, 완전한 클론은 해당 유전자의 서열에 특이적인 폴리뉴클레오타이드 탐침을 사용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝 함으로써 하이브리드화 하여 직접 분리해 낼 수 있다. 구체적으로, 30-40 뉴클레오타이드의 특이적 탐침은 선택된 서열에 따라 Applied Biosystem/Perkin Elmer trademark의 합성기를 사용하여 합성할 수 있다. 수득된 올리고뉴클레오타이드는 방사성 원소로 표지하고(예를 들면 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 [감마-32P]ATP로), 통상적인 방법에 따라 정제할 수 있다(예를 들면 Maniatis et al., 1982 또는 F. Ausubel et al.,1989).Various other approaches can be attempted to isolate the complete cDNA of ABC1 and the corresponding cDNA. For example, complete clones can be isolated directly by hybridization by screening cDNA libraries using polynucleotide probes specific for the sequence of the gene of interest. Specifically, specific probes of 30-40 nucleotides can be synthesized using a synthesizer of Applied Biosystem / Perkin Elmer trademark depending on the selected sequence. The obtained oligonucleotides can be labeled with radioactive elements (eg [gamma- 32 P] ATP using T4 polynucleotide kinase) and purified according to conventional methods (eg Maniatis et al., 1982). Or F. Ausubel et al., 1989).

스크리닝할 cDNA를 함유한 클론 라이브러리는 상기의 통상적인 방법(F.Ausubel 등)에 따른 적당한 항생물질을 함유한 페트리디쉬(1.5% 아가)의 배양배지에서 설정된다. 통상의 방법에 따라 배양 후에 생긴 콜로니는 니트로셀룰로스 필터로 옮겨지고 방사성 표지된 뉴클레오타이드 탐침을 사용하여 스크리닝되며, 탐침과 하이브리드화하는 콜로니는 분리되고 서브클로닝된다.Clonal libraries containing cDNAs to be screened are set up in Petri dishes (1.5% agar) containing appropriate antibiotics according to the conventional methods described above (F. Ausubel et al.). Colonies resulting after culture according to conventional methods are transferred to nitrocellulose filters and screened using radiolabeled nucleotide probes, and colonies that hybridize with the probes are isolated and subcloned.

그리하여 동정된 클론의 DNA는 서열분석에 의해 준비되고, 분석된다. 완전한 cDNA에 상응하는 단편을 포함한 클론은 정제되고, 또한 당업자에게 잘 알려진 프로토콜과 F.Ausubel 등(1989)에서의 예에 나타난 바와 같이 pcDNA3 벡터로 재클로닝된다.Thus, the DNA of the identified clones is prepared and analyzed by sequencing. Clones containing fragments corresponding to complete cDNA are purified and recloned into pcDNA3 vectors as shown in protocols well known to those skilled in the art and in examples in F. Ausubel et al. (1989).

본 출원에 기술된 유전자에 상응하는 cDNA의 5' 및 3' 말단을 동정하기 위한 다양한 방법이 잘 알려져 있다. 이들 방법은 하이브리드화 클로닝을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 당업자에게 잘 알려진 3' 또는 5' RACE-PCR(Rapid Amplification of cDNA End-PCR)과 비슷하거나 같은 프로토콜을 사용하는 클로닝도 포함한다.Various methods are well known for identifying the 5 'and 3' ends of the cDNA corresponding to the genes described in this application. These methods include, but are not limited to, hybridization cloning, including cloning using protocols similar or equivalent to 3 'or 5' Rapid Amplification of cDNA End-PCR (RACE-PCR), which are well known to those skilled in the art.

예를 들면, Clontech사의 판매 kit(Marathon ReadyTMcDNA kit, protocol identified by the reference PT1156-1)를 사용하거나 또는 대안적으로 5'RACE와유사한 방법이 5' 말단이 부재하는 cDNA의 특징분석에 유용하게 쓰일수 있다(Formont-Racine et al.,1993). 간단하게, 하나의 RNA 올리고뉴클레오타이드는 mRNA 집단의 5' 말단에 연결된다. cDNA로의 역전사 후, 해당 유전자의 5'에 연결된 어댑터와 3'에 위치한 서열에 특이적인 프라이머의 세트는 목적한 cDNA의 5' 부분을 증폭하기 위한 PCR에 사용한다. 증폭된 단편은 완전한 cDNA의 재구성에 사용된다.For example, Clontech's sales kit (Marathon Ready TM cDNA kit, protocol identified by the reference PT1156-1), or alternatively a method similar to 5'RACE, is useful for characterization of cDNAs that lack 5 'ends. (Formont-Racine et al., 1993). In brief, one RNA oligonucleotide is linked to the 5 'end of an mRNA population. After reverse transcription to cDNA, a set of adapters linked to the 5 'of the gene and primers specific for the sequence located at 3' are used for PCR to amplify the 5 'portion of the cDNA of interest. The amplified fragment is used for reconstitution of complete cDNA.

실시예 3: 탠지어병에 대한 유전자 발현 프로필의 분석Example 3: Analysis of Gene Expression Profiles for Tangier Disease

탠지어 세포 표현형을 유발하는 ABC1 유전자의 발현 수준의 손상의 증명은 아래 기술하는 방법에 따라, 병을 앓고 있거나 그렇지 않은 피검자의 섬유아세포에서 수득된 mRNA에 상응하는 탐침과 이들 서열을 하이브리드화함으로써 결정될 수 있다.Demonstration of impairment of the expression level of the ABC1 gene causing the Tangier cell phenotype can be determined by hybridizing these sequences with probes corresponding to mRNA obtained from fibroblasts of a diseased or otherwise subject, according to the method described below. Can be.

1.전체 RNA, 폴리(A) + mRNA 및 cDNA 탐침의 제조 1. Preparation of Total RNA, Poly (A) + mRNA and cDNA Probes

전체 RNA는 정상 피검자 또는 탠지어병을 앓고 있는 피검자의 섬유아세포의 배양세포로부터 구아니딘 이소티오시아네이트 방법(Chomczynski & Sacci, 1987)을 사용해서 수득할 수 있다. 폴리(A)+mRNA는 올리고(dT)-셀룰로스 칼럼에서 친화성 크로마토그래피를 사용하여 수득될 수 있으며(Sambrook et al.,1989), 탐침으로서 사용되는 cDNA는 형광산물(Amersham Pharmacia Biotech;CyDyeTM)로 표지를 한 올리고뉴클레오타이드로 RT-PCR함으로써 수득될 수 있다(DeRisi et al., 1997).Total RNA can be obtained using the guanidine isothiocyanate method (Chomczynski & Sacci, 1987) from cultured cells of fibroblasts of normal subjects or those with Tangier disease. Poly (A) + mRNA can be obtained using affinity chromatography on an oligo (dT) -cellulose column (Sambrook et al., 1989) and the cDNA used as a probe is a fluorescent product (Amersham Pharmacia Biotech; CyDye ™). ) Can be obtained by RT-PCR with oligonucleotides labeled (DeRisi et al., 1997).

2.하이브리드화 및 발현수준의 검출 2. Hybridization and Detection of Expression Levels

본원에 제시된 서열을 함유하고, 탠지어 유전자에 상응하는 서열을 함유한 유리막을 섬유아세포로부터 수득된 cDNA 탐침과 하이브리드화 한다(Iyer et al.,1999). Amersham/molecular Dynamics System(Avalanche MicroscannerTM)의 사용은 건강하거나 또는 병에 걸린 세포형에서, 서열의 산물 발현에 있어서의 정량분석을 가능하게 한다.Glass membranes containing the sequences set forth herein and containing sequences corresponding to Tangier genes are hybridized with cDNA probes obtained from fibroblasts (Iyer et al., 1999). The use of the Amersham / molecular Dynamics System (Avalanche Microscanner ™ ) allows for quantitative analysis of product expression of sequences in healthy or diseased cell types.

실시예 4: 포유동물 세포내 ABC1의 완전한 cDNA를 함유하는 발현벡터의 제조Example 4 Preparation of Expression Vectors Containing Complete cDNA of ABC1 in Mammalian Cells

ABC1 유전자는 포유류 세포내에서 발현될 것이다. 전형적인 진핵생물 발현벡터는 mRNA의 전사개시를 가능하게 하는 프로모터, 단백질을 암호화하는 서열, 및 전사의 종결과 전사체의 폴리아데닐화에 필요한 시그널을 함유하고 있다. 또한 인핸서, Kozak 서열, mRNA의 스플라이싱에 필요한 서열과 같은 부가적인 시그널 또한 함유한다. 효율적인 전사는 SV40 바이러스 프로모터의 초기 및 후기 요소, 레트로바이러스 LTR 또는 CMV 바이러스 초기 프로모터에 의해 이루어진다. 그러나 액틴 프로모터와 같은 세포 요소도 사용될 수 있다. 많은 발현벡터가 본 발명을 수행하기 위해 사용될 수 있으며, 그러한 벡터의 일례로 pcDNA3(Invitrogen)을 들 수 있다.The ABC1 gene will be expressed in mammalian cells. Typical eukaryotic expression vectors contain a promoter that enables the initiation of transcription of mRNA, a sequence encoding a protein, and a signal necessary for the termination of transcription and polyadenylation of the transcript. It also contains additional signals such as enhancers, Kozak sequences, and sequences required for splicing mRNA. Efficient transcription is achieved by the early and late elements of the SV40 virus promoter, the retroviral LTR or CMV virus early promoter. However, cellular elements such as actin promoters can also be used. Many expression vectors can be used to carry out the invention, and one example of such a vector is pcDNA3 (Invitrogen).

실시예 5: 정상 및 돌연변이 ABC1 폴리펩타이드의 제조Example 5: Preparation of Normal and Mutant ABC1 Polypeptides

실시예 2(완전한 cDNA의 클로닝)에서 분리과정이 기술된 ABC1의 완전한 cDNA에 의해 암호화된 정상 ABC1 폴리펩타이드, 또는 실시예 2에서 묘사된 기술에 따라수득될 수 있는 완전한 cDNA의 돌연변이 ABC1 폴리펩타이드는 배큘러 바이러스 벡터를 사용한 박테리아 또는 곤충 세포 발현 시스템 또는 백시니아 바이러스 벡터의 존재 또는 부재하에 포유류 세포에서 쉽게 제조할 수 있다. 모든 방법이 폭넓게 기술되었으며 당업자에게 익히 알려져있다. 그것의 상세한 설명은 F.Ausubel 등(1989)의 예에서 찾아볼 수 있다.In Example 2 (cloning of complete cDNA), the normal ABC1 polypeptide encoded by the complete cDNA of ABC1 described in the isolation process, or the mutant ABC1 polypeptide of the complete cDNA which can be obtained according to the techniques described in Example 2 Easily produced in mammalian cells in the presence or absence of bacterial or insect cell expression systems or vaccinia virus vectors using baculovirus vectors. All methods are widely described and are well known to those skilled in the art. Its detailed description can be found in the example of F. Ausubel et al. (1989).

실시예 6: 하나의 돌연변이 ABC1 폴리펩타이드에 대한 항체의 제조Example 6: Preparation of Antibody Against One Mutant ABC1 Polypeptide

본 발명내의 항체는 다양한 방법(Current protocols In Molecular Biology Volume 1 edited by Frederick M.Ausubel, Roger Brent, Robert E.Kingston, David D.Moore, J.G. Seidman, John A.Smith, Kevin Struhl-Massachusetts General Hospital Harvard Medical School, chapter 11,1989)에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면 본 발명의 폴리펩타이드를 발현시키는 세포는 항체를 포함하는 혈청의 제조를 유도하기 위해 동물내로 주사된다. 이 방법 중 하나가 기술되었는데, 단백질이 준비되고 오염되지 않도록 정제된다. 이러한 제조물은 높은 활성을 가지는 폴리클로날 항혈청을 제조할 목적을 가지고 동물내로 도입된다.Antibodies within the present invention are described in various ways (Current protocols In Molecular Biology Volume 1 edited by Frederick M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, JG Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl-Massachusetts General Hospital Harvard Medical School, chapter 11,1989). For example, cells expressing a polypeptide of the invention are injected into an animal to induce the preparation of a serum comprising an antibody. One of these methods has been described, in which the protein is prepared and purified to prevent contamination. Such preparations are introduced into animals for the purpose of producing high activity polyclonal antisera.

바람직한 방법에서, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체이다. 이러한 모노클로날 항체는 하이브리도마 기술(Kohler et al, 1975; Kohler et al, 1976; Kohler et al, 1976; Hammeling et al.,1981)을 사용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 그러한 방법은 폴리펩타이드로 또는 폴리펩타이드를 발현하는 세포로, 동물(바람직하게는 쥐)을 면역화 하는 것을 포함한다. 이들 세포는 적당한 조직 배양 배지에서 배양된다. 그러나, 10% 태 소 혈청(56℃에서 비활성)과 약 10g/ℓ의 필수 아미노산, 1000 u/㎖의 페니실린 및 약 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신이 공급된 이글 배지(변형된 Earle)에서 배양하는 것이 바람직하다.In a preferred method, the antibody of the invention is a monoclonal antibody. Such monoclonal antibodies can be prepared using hybridoma technology (Kohler et al, 1975; Kohler et al, 1976; Kohler et al, 1976; Hammeling et al., 1981). In general, such methods include immunizing an animal (preferably a rat) with a polypeptide or with a cell expressing the polypeptide. These cells are cultured in a suitable tissue culture medium. However, cultured in Eagle's medium (modified Earle) fed with 10% fetal calf serum (inactive at 56 ° C.) and about 10 g / l essential amino acids, 1000 u / ml penicillin and about 100 μg / ml streptomycin It is preferable.

이들 쥐의 비장세포가 추출되고 적당한 골수종 세포주와 융합시킨다. 그러나 ATCC로부터의 이용가능한 친주 골수종 세포주(SP20)를 사용하는 것이 바람직하다. 융합 후 생기는 하이브리도마 세포를 HAT 배지에서 선택적으로 유지시키고 그 후 Wands et al.(1981)이 기술한 바와 같이 제한 희석에 의해 클로닝된다. 그러한 선별 후의 하이브리도마 세포는 폴리펩타이드에 결합 가능한 항체 분비 클론을 동정하기 위하여 시험된다.The splenocytes of these mice are extracted and fused with the appropriate myeloma cell line. However, it is preferred to use available parental myeloma cell line (SP20) from ATCC. Hybridoma cells resulting after fusion are selectively retained in HAT medium and then cloned by limiting dilution as described by Wands et al. (1981). Hybridoma cells after such selection are tested to identify antibody secreting clones capable of binding to the polypeptide.

또한 폴리펩타이드에 결합가능한 다른 항체가 안티-이디오타입(anti-idiotype) 항체를 사용하는 2-단계 과정에 따라 제조될 수도 있는데, 그러한 방법은 항체가 그들의 항원이며 결론적으로 한 항체가 다른 항체를 인식하는 것이 가능하다는 사실에 근거를 두고 있다. 이 방법에 따르면, 단백질에 특이적인 항체는 동물, 바람직하게는 쥐에게 면역성을 부여하는 데 쓰인다. 이러한 동물의 비장세포는 그 후 하이브리도마 세포를 생산하는 데 쓰이고, 하이브리도마 세포는 폴리펩타이드에 의해 차단당할 수 있는 특정 항체-단백질 결합체에 결합할 능력이 있는 항체를 생산하는 클론을 동정하기 위해 스크리닝된다. 이들 항체는 단백질에 특이적인 항체의 생산을 다량으로 유도하기 위해 동물에게 면역성을 부여하는 데에 사용된다.Other antibodies capable of binding to the polypeptide may also be prepared according to a two-step process using an anti-idiotype antibody, in which such an antibody is their antigen and consequently one antibody is used to target another antibody. It is based on the fact that it is possible to recognize. According to this method, proteins specific antibodies are used to confer immunity to animals, preferably mice. The splenocytes of these animals are then used to produce hybridoma cells, which identify the clones that produce antibodies that are capable of binding to specific antibody-protein conjugates that can be blocked by the polypeptide. Is screened for. These antibodies are used to confer immunity to animals in order to induce large amounts of protein-specific antibody production.

여기서 기재된 방법에 따라 Fab과 F(ab')2 및 본 발명의 항체의 다른 단편을 사용하는 것이 바람직하다. 그러한 단편은 보통 파파인(Fab 단편을 만들기 위해)또는 펩신(F(ab')2를 만들기 위해)과 같은 효소의 도움으로 단백질분해성 절단에 의해 생성된다. 그렇지 않으면 단백질을 인식하는 미지의 단편은 재조합 DNA 또는 합성화학 기술을 이용하여 제조할 수도 있다.Preference is given to using Fab and F (ab ') 2 and other fragments of the antibodies of the invention according to the methods described herein. Such fragments are usually produced by proteolytic cleavage with the help of enzymes such as papain (to make Fab fragments) or pepsin (to make F (ab ') 2). Alternatively, unknown fragments that recognize the protein may be prepared using recombinant DNA or synthetic chemistry techniques.

인간내에서 항체의 생체내 사용을 위해서는 "인간화된(humanized)" 키메릭 모노클로날 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 항체는 상기 기술한 모노클로날 항체를 만드는 하이브리도마 세포로부터 유래한 유전자 조성물을 사용해 제조될 수 있다. 키메릭 항체를 만드는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.(검토를 위해 하기 참조: Morrison,(1985);Oi et al.,(1986); Cability et al., US 특허 No.4,816,567; Taniguchi et al.,EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al., WO 8601553; Robinson et sl., WO 8702671; Boulianne et al; (1984); and Neuberger et al.,(1985))For in vivo use of the antibody in humans, preference is given to using “humanized” chimeric monoclonal antibodies. Such antibodies can be prepared using gene compositions derived from hybridoma cells that produce the monoclonal antibodies described above. Methods of making chimeric antibodies are well known to those of skill in the art. (For review see Morrison, (1985); Oi et al., (1986); Cability et al., US Pat. No. 4,816,567; Taniguchi et al. , EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al., WO 8601553; Robinson et sl., WO 8702671; Boulianne et al; (1984); and Neuberger et al., (1985))

실시예 7: 탠지어병의 세포내 표현형의 교정Example 7: Correction of Intracellular Phenotype of Tangier Disease

탠지어병은 고-밀도 지방단백질(HDL) 입자의 가속되는 이화작용과 조직내에 콜레스테롤이 축적되는 것을 특징으로 한다. 특히, 탠지어병을 앓고 있는 피부의 섬유아세포는 아포단백질 A-I(apoA-I)과 HDL의 주 단백질에 의해 수행되는 콜레스테롤의 유입과정으로 인해 낮은 콜레스테롤 함량 제거능을 가진다(Francis et al.,1995). 기능 상실에 상응하는 이러한 특징은 가족성 HDL 결핍을 앓고 있는 환자의 섬유아세포에서도 발견된다(Marcil et al.,1999a).Tangier disease is characterized by accelerated catabolism of high-density lipoprotein (HDL) particles and the accumulation of cholesterol in tissues. In particular, fibroblasts of skin with Tangier's disease have a low cholesterol removal ability due to the influx of cholesterol carried out by the apoprotein AI (apoA-I) and the main protein of HDL (Francis et al., 1995). . This feature, corresponding to loss of function, is also found in fibroblasts of patients suffering from familial HDL deficiency (Marcil et al., 1999a).

탠지어 섬유아세포의 표현형의 교정은 본 발명에 따른 ABC1의 완전한 cDNA를 상기 세포내로 형질감염시켜 수행할 수 있다. cDNA는 앞으로 아래 기술한 방법에따라 형질감염될 발현벡터내로 삽입된다.Correction of the phenotype of Tangier fibroblasts can be performed by transfecting the complete cDNA of ABC1 according to the invention into said cells. cDNA is inserted into the expression vector to be transfected according to the method described below.

1.정상 피검자 및 탠지어병을 앓고 있는 피검자의 섬유아세포 제조 1. Preparation of Fibroblasts from Normal Subjects and Subjects with Tangier Disease

인간 피부의 1차 섬유아세포는 전완으로부터 수득된 피부 생검을 배양함으로써 수득된다. 이들 생검은 "동형접합체"의 임상적 및 생화학적 특징을 가진 탠지어병을 앓고 있는 환자에서 수행되는데, 오렌지 색깔의 편도선, apoA-I의 혈장 농축액, 및 5thpercentile이 아닌 콜레스테롤-HDL에 의해서 수행된다. American Type Culture Collection(미국 메릴랜드 록빌)로부터 정상 섬유아세포주를 입수할 수 있다. 섬유아세포는 10% 태 송아지 혈청, 2mM 글루타민, 100 IU/㎖의 페니실린, 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신이 공급된 EMMEM(Eagle-modified minimum essential medium; GIBCO) 배지(EMMEM 10으로 명명된 배지)에서 배양된다. 콜레스테롤 유출의 연구를 수행하기 위해 세포는 위에서 설명한 배지에 송아지 혈청을 제외하고 2 ㎎/㎖의 소 알부민(BSA, 분획 V)를 첨가한 배지에 50 ㎍/㎖의 콜레스테롤과 함께 24시간 동안 배양함으로써 콜레스테롤에 미리 로딩된다.Primary fibroblasts of human skin are obtained by culturing skin biopsies obtained from forearms. These biopsies are performed in patients with Tangier's disease with the clinical and biochemical characteristics of the "homozygote," which is characterized by orange tonsils, plasma concentrate of apoA-I, and cholesterol-HDL rather than 5 th percentile. Is performed. Normal fibroblast lines are available from the American Type Culture Collection (Rockville, MD). Fibroblasts were composed of 10% fetal calf serum, 2 mM glutamine, 100 IU / ml penicillin, and 100 μg / ml streptomycin, EMMEM (Eagle-modified minimum essential medium (GIBCO) medium (medium designated as EMMEM 10) Are incubated. To conduct a study of cholesterol efflux, cells were incubated for 24 hours with 50 μg / ml cholesterol in medium supplemented with 2 mg / ml bovine albumin (BSA, Fraction V) excluding calf serum in the medium described above. It is preloaded with cholesterol.

2.콜레스테롤 유출의 연구 2. Study of Cholesterol Spill

24-웰 플레이트상 유착에서 콜레스테롤로 미리로딩한 섬유아세포는 EMMEM10 배지와 1 μCi/㎖의 1,2-3H-콜레스테롤(50 Ci/mmol; Dupont; 미국 델라웨어 윌밍턴) 내에서 48시간 동안 배양한다. 1분당 약 100,000 카운트가 한 웰에서 수득되며 또는 분당, 및 세포내 단백질의 ㎍ 당 1000 카운트가 수득된다. 세포는 EMMEM/BSA 배지에서 세 번 세척되고, 해당 유전자의 형질감염과 EMMEM/BSA 배지내에서 apoA-I을함유하는 10 ㎍/㎖의 프로테오리포솜을 첨가함으로써 일어나는 유출이 시작되기 전에, 이 배지에서 24시간 동안 배양된다. 이들 프로테오리포솜은 포스파티딜콜린과 정제된 인간 apoA-I의 초음파처리에 의해 제조된다(Jonas, 1986). 세포 형질 감염은 칼슘 포스페이트 침전 기술에 의해 수행된다(Sambrook et al.,1989). 유출기 후에(보통은 20시간), 배지를 수집하여 원심분리 하고 (1000 g, 5분), 액체 섬광 계수기로 방사능을 측정한다. 세포내 잔류 방사능은 이소프로판올 내에서 지방의 추출 후에 밤새 측정된다. % 유출은 상등액에서 측정된 방사능을 상등액과 세포 추출액에서 측정된 방사능의 합으로 나누어 줌으로써 계산된다. 내부 표준은 마커 유전자를 형질감염하고, apoA-I을 함유하고 프로테오리포솜이 배제된 EMMEM/BSA 배지에서 24시간 배양함으로써 제조된다. 조절 유전자로 형질감염된 정상 섬유아세포의 세포내 콜레스테롤의 유출은 6±2%에 이르는 반면, 탠지어병을 앓고 있는 섬유아세포로부터 수득하고 또한 조절유전자로 형질감염한 것은 1% 미만이었다. 한편, 탠지어병을 앓고 있는 섬유아세포를 완전한 cDNA를 함유한 플라스미드로 또는 본 발명에 따른 ABC1에 대한 게놈 DNA로 형질감염하는 것은, 정상 섬유아세포에 상응하는 콜레스테롤 수준에서 과량의 콜레스테롤을 제거하는 이들 세포의 능력을 회복가능하게 만들 수 있다.24-well fibroblasts pre-loaded with cholesterol in the plate adhesion is 1,2- 3 H- cholesterol EMMEM10 medium with 1 μCi / ㎖ (50 Ci / mmol; Dupont; Wilmington, Delaware, USA) for 48 hours in the Incubate. About 100,000 counts per minute are obtained in one well or 1000 counts per minute and per μg of intracellular protein. Cells are washed three times in EMMEM / BSA medium and before the efflux caused by transfection of the gene and the addition of 10 μg / ml proteoliposome containing apoA-I in EMMEM / BSA medium begins. Incubate for 24 hours. These proteoliposomes are prepared by sonication of phosphatidylcholine and purified human apoA-I (Jonas, 1986). Cell transfection is performed by calcium phosphate precipitation technique (Sambrook et al., 1989). After the effluent (usually 20 hours), the medium is collected and centrifuged (1000 g, 5 minutes) and radioactivity is measured with a liquid scintillation counter. Intracellular residual radioactivity is measured overnight after extraction of fat in isopropanol. The% runoff is calculated by dividing the radioactivity measured in the supernatant by the sum of the radioactivity measured in the supernatant and the cell extract. Internal standards are prepared by transfecting marker genes and incubating for 24 hours in EMMEM / BSA medium containing apoA-I and excluding proteoliposomes. The intracellular cholesterol efflux of normal fibroblasts transfected with regulatory genes reached 6 ± 2%, whereas less than 1% were obtained from fibroblasts suffering from Tangier disease and also transfected with regulatory genes. On the other hand, transfecting fibroblasts suffering from Tangier disease with a plasmid containing complete cDNA or genomic DNA for ABC1 according to the present invention can be used to remove excess cholesterol at cholesterol levels corresponding to normal fibroblasts. Can make the cell's capacity recoverable.

실시예 8: 인간 ABC1 유전자의 게놈 단편의 분리와 특징분석Example 8: Isolation and Characterization of Genomic Fragments of Human ABC1 Gene

인간 ABC1 cDNA의 약 3 kb 단편이 최초의 ABC1의 ATP-결합 도메인을 포함한 "pf 10"으로 명명된 cDNA 클론으로부터 수득될 수 있는데, 이 cDNA 클론은 Luciani 등(1994)의 논문에 기술되어 있다.An about 3 kb fragment of human ABC1 cDNA can be obtained from a cDNA clone named “pf 10” containing the original ATP-binding domain of ABC1, which cDNA clone is described in Luciani et al. (1994).

제한 엔도뉴클레아제 EcoRI으로 pf10 클론을 분해하여 수득된 cDNA 단편은 전기영동 후 아가로스 겔상에서 분리되고, 그 후 제조업자의 지침(Boehringer Mannheim, reference 1 585 614에 의해 판매되는 키트)에 따라 디독시게닌으로 표지된다.The cDNA fragments obtained by digesting the pf10 clone with the restriction endonuclease EcoRI are isolated on agarose gels after electrophoresis and then dedoxygenated according to the manufacturer's instructions (Boehringer Mannheim, kit sold by reference 1 585 614). It is labeled with nin.

표지된 cDNA 단편은 NylonTM필터에 고정된 9번 염색체의 LLNL(Lawrence Livermore National Labs) 코스미드 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용된다.Labeled cDNA fragments are used to screen the Lawrence Livermore National Labs (LLNL) cosmid library of chromosome 9 immobilized on a Nylon ™ filter.

여섯 개의 양성 클론이 동정되었다. 이들 6개 코스미드를 위해 단일 콜로니와 탐침이 하이브리드화 된다.Six positive clones were identified. Single colonies and probes are hybridized for these six cosmids.

이들 각 콜로니로부터 대표적인 클론이 분리되었다.Representative clones were isolated from each of these colonies.

LLNLC 131J087 Q2(여기서 cos3a로 명명)와 LLNLc 131O1165 Q2(여기서 cos 6f로 명명)가 상세히 분석되었다.LLNLC 131J087 Q2 (named cos3a) and LLNLc 131O1165 Q2 (named cos 6f) were analyzed in detail.

cos3a 클론은 ECoRI 단편의 형태로 Gen3zf(-) 벡터에서 서브클로닝 되었고, ABI377 타입 서열분석기에서 Big Dye Terminator 기술을 사용하여 양 말단의 서열이 분석되었다(Applied Biosystem, Perkin Elmer).The cos3a clone was subcloned in a Gen3zf (-) vector in the form of an ECoRI fragment and sequenced at both ends using Big Dye Terminator technique in an ABI377 type sequencer (Applied Biosystem, Perkin Elmer).

벡터의 서열과 프라이머를 하이브리드화 함으로써 완전히 서열분석되기에는 너무 긴, 별개의 삽입체(다양한 삽입체의 마단을 서열분석한 후 결정되거나 또는 그들의 크기에 의해 결정되는)를 함유한 클론은 트랜스포손 삽입기술과 트랜스포손에 특이적인 프라이머에 의한 서열분석(New England Biolabs에서 판매되는"GPS" 시스템 )으로 미리 분석된다.Clones containing separate inserts (determined after sequencing the ends of various inserts or determined by their size) that are too long to be fully sequenced by hybridizing the sequences and primers of the vector are transposon insertions. It is pre-analyzed by sequencing with primers specific for technology and transposons ("GPS" system sold by New England Biolabs).

이러한 방법으로 인간 ABC1 유전자에 상응하는 유전자 서열이 분리되고, 특징분석되었다. 이들 서열은 인트론-엑손 연접부를 결정 가능케 하는 데이타베이스에서의 참조에 의해 동정된 인간 및 마우스의 서열과 비교된다.In this way the gene sequence corresponding to the human ABC1 gene was isolated and characterized. These sequences are compared to those of human and mouse identified by reference in a database that allows for determination of intron-exon junctions.

환자의 DNA를 증폭하기 위한 프라이머는 ABC1 유전자의 인트론 DNA의 비반복서열로부터 디자인되며, 이런 방법으로 인트론-엑손 연접부의 증폭 및 스플라이싱 단계에서 2차 구조를 형성하는 데 필수적인 염기가 증폭된 단편에 포함되게 된다.Primers for amplifying a patient's DNA are designed from non-repetitive sequences of the intron DNA of the ABC1 gene, and in this way the base-amplified fragments necessary to form secondary structures in the amplification and splicing steps of the intron-exon junctions. Will be included.

환자의 게놈 DNA는 위에 기술한 하이브리드화 조건과, 제조업자가 권장하는 증폭 사이클 조건을 이용하고 Qiagen's Star Taq 키트나 Supertaq 키트를 사용하는 프라이머의 도움으로 증폭될 수 있다.The patient's genomic DNA can be amplified using the hybridization conditions described above and the amplification cycle conditions recommended by the manufacturer and with the help of primers using Qiagen's Star Taq kit or Supertaq kit.

증폭된 PCR 산물은 이어서 Qiagen사에 의해 판매되는 키트를 사용하여 정제되고 ABI377 서열분석기에서 Big Dye Terminator 방법에 의해서 그 서열이 분석된다.The amplified PCR product is then purified using a kit sold by Qiagen, and sequenced by the Big Dye Terminator method in an ABI377 sequencer.

실시예 9: ABC1 유전자내 다형성/돌연변이의 측정Example 9: Measurement of Polymorphism / mutation in ABC1 Gene

ABC1 유전자의 유전자 서열안에서의 또는 전사체의 서열안에서의 다형성 또는 돌연변이의 검출은 다양한 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 바람직한 방법은 직접 서열분석이다.Detection of polymorphisms or mutations in the gene sequence of the ABC1 gene or in the sequence of transcripts can be performed according to various protocols. Preferred method is direct sequencing.

mRNA의 제조가 가능한 환자의 경우, 바람직한 방법은 cDNA를 제조하고 그것을 직접 서열분석하는 것이다. 오직 DNA만이 사용가능한 환자를 위해서, 및 유전자에 상응하는 구조가 알려져 있지 않거나 부분적으로 알려진 전사체의 경우, 그것의 인트론-엑손 구조 및 상응하는 유전자의 유전자 서열을 정확히 결정할 필요가 있다. 이것은 그러므로, 예를 들면, 실시예 8에서 기술된 방법에 따라 연구된 전사체에 상응하는 게놈 DNA BAC 또는 코스미드 클론(들)을 분리하고, 상응하는 클론(들)의 삽입체를 서열분석하는 것과, 수득된 게놈 DNA와 cDNA 서열의 비교를 통한 인트론-엑손 구조의 결정을 포함한다.For patients capable of producing mRNA, the preferred method is to prepare cDNA and sequence it directly. For patients where only DNA is available, and for transcripts whose structure corresponding to a gene is unknown or partially known, it is necessary to accurately determine its intron-exon structure and the gene sequence of the corresponding gene. This thus separates, for example, genomic DNA BAC or cosmid clone (s) corresponding to the transcript studied according to the method described in Example 8 and sequenced the insert of the corresponding clone (s). And determination of the intron-exon structure through comparison of the obtained genomic DNA and cDNA sequence.

직접 서열분석에 의해 돌연변이를 검출하는 기술은 질환의 동형접합체로부터 수득된 또는 적어도 8 개체(4 개체는 조사된 병리에 걸리고, 4 개체는 그렇지 않은)로부터 수득된 ABC1 유전자의 유전자 서열을 비교하는 것으로 이루어져 있다. 서열의 다양성은 다형성에 기여한다. 야생형 단백질의 변형된 아미노산 서열 모두는 상기 단백질의 기능에 영향을 줄 수 있는 돌연변이일 수 있다. 그것은 돌연변이의 동시분리 연구와 가계도 내에서의 질환 연구(유전자형-표현형 상관성) 또는 특발성 사례의 분석을 위한 사례/대조 관련 연구에 좀더 구체적으로 고려되어야 함이 바람직하다.Techniques for detecting mutations by direct sequencing include comparing the gene sequence of the ABC1 gene obtained from homozygotes of the disease or from at least 8 individuals (4 subjects to the investigated pathology, 4 subjects not). consist of. Sequence diversity contributes to polymorphism. All of the modified amino acid sequences of the wild type protein can be mutations that can affect the function of the protein. It should be considered more specifically in the co-separation studies of mutations and in disease studies (genotype-phenotype correlations) in genealogy or in case / control studies for the analysis of idiopathic cases.

실시예 10: 원인 돌연변이 또는 전사적 차이에 의한 콜레스테롤 역수송 결핍과 연관된 질환에서의 원인 유전자의 동정Example 10 Identification of Causal Genes in Diseases Associated with Cholesterol Reverse Transport Deficiency by Cause Mutations or Transcriptional Differences

실시예 9에서 기술된 방법에 따라 동정된 돌연변이 중에서, 질환의 표현형과 연관된 모든 것은 원인성일수 있다. 이들 결과의 타당성은 모든 병에 걸린 개체와 그들의 친척(이들의 DNA는 이용가능)에서의 유전자를 서열분석 함으로써 수득된다.Of the mutations identified according to the methods described in Example 9, everything associated with the phenotype of the disease may be causative. The validity of these results is obtained by sequencing the genes in all affected individuals and their relatives, whose DNA is available.

더욱히, 실시예 1에서 기술된 방법에 따라, 병에 걸린 또는 그러하지 않은 개체에 특이적인 RNA를 사용하는 노던 블로팅 또는 RT-PCR 분석은 유전자 발현 수준에서 괄목할 만한 변이를 검출할 수 있게 하며, 특히 유전자의 전사가 부재한 가운데에서는 더욱 그러하다.Furthermore, according to the method described in Example 1, Northern blotting or RT-PCR analysis using RNA specific to an individual with or without disease allows for detection of significant variations in gene expression levels. This is especially true in the absence of gene transcription.

실시예 11: ABC1 유전자내의 복대립유전자 다형성의 동정Example 11: Identification of allele polymorphism in ABC1 gene

환자의 DNA를 증폭하기 위한 프라이머는 ABC1 유전자의 인트론 DNA의 비반복서열로부터 디자인되며, 이러한 방법으로 인트론-엑손 연접부의 증폭 및 RNA 스플라이싱 동안에 2차 구조를 형성하는 데 필수적인 염기는 증폭된 단편내에 포함된다.Primers for amplifying a patient's DNA are designed from the non-repetitive sequence of the intron DNA of the ABC1 gene, and in this way the bases necessary to form secondary structures during amplification and RNA splicing of the intron-exon junctions are amplified fragments. It is included in.

다양한 프라이머 쌍이 표 4에서 보여지는 바와 같이 특이적으로 개발되었다. 탠지어병의 사례를 포함하는 7 가족으로부터 또는 FHD 병으로부터의 DNA 결과는 표5에서 찾아볼 수 있다.Various primer pairs were developed specifically as shown in Table 4. DNA results from the 7 families, including cases of Tangier disease, or from FHD disease can be found in Table 5.

환자의 게놈 DNA는 위에 기술한 Qiagen's Star Taq 키트나 Supertaq 키트를 사용하고 하이브리드화 조건과, 제조자가 추천하는 증폭 사이클 조건을 사용하는 프라이머의 도움으로 증폭될 수 있다.The patient's genomic DNA can be amplified using primers using the Qiagen's Star Taq kit or Supertaq kit described above and using hybridization conditions and amplification cycle conditions recommended by the manufacturer.

증폭된 PCR 산물은 그 후 Qiagen사에서 판매하는 키트를 사용하여 정제하고, ABI377 서열분석기에서 Big Dye Terminator 방법에 의해 그 서열이 결정된다(Applied Biosystems, Perkin Elmer).The amplified PCR product is then purified using a kit sold by Qiagen, and its sequence is determined by Big Dye Terminator method in an ABI377 sequencer (Applied Biosystems, Perkin Elmer).

실시예 12:ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터의 제조Example 12 Preparation of a Recombinant Vector Comprising Nucleic Acids Encoding ABC1 Protein

I. 인간 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산의 합성I. Synthesis of Nucleic Acids Encoding Human ABC1 Protein

인간세포(즉, 태반조직, Clontech, 미국 캘리포니아 팔로 알토 소재 또는 THP1 세포)로부터 분리된 전체 RNA(500 ng)는 인간 ABC1 유전자의 cDNA 합성에 있어서 공급원으로 사용될 수 있다. mRNA를 cDNA로 역전사하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, 그 중 하나로 "Superscript one step RT-PCR" 시스템(Life Technologies, 미국 메릴랜드 게이더스버그 소재)을 사용할 수 있다.Total RNA (500 ng) isolated from human cells (ie placental tissue, Clontech, Palo Alto, Calif., Or THP1 cells) can be used as a source for cDNA synthesis of the human ABC1 gene. Methods of reverse transcription of mRNA into cDNA are well known to those skilled in the art. For example, one can use the "Superscript one step RT-PCR" system (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

ABC1 cDNA에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 특히 1)과 2)중 하나를 포함하는 ABC1에 특이적인 두 개의 올리고뉴클레오타이드(0.25 μM)는 ABC1 단백질을 암호화하는 핵산을 분리해내는 데 사용될 수 있다 [1)서열번호 69의 1-184 뉴클레오타이드 영역이 포함된 서열 및 서열번호 69, 6968-9741 뉴클레오타이드 영역이 포함된 것의 상보 서열 2)서열번호 70의 1-297 뉴클레오타이드 영역이 포함된 서열 및 서열번호 70의 7081-9854 뉴클레오타이드 영역에 포함된 것의 상보 서열].Oligonucleotides specific for ABC1 cDNA can be used for this purpose. In particular, two oligonucleotides (0.25 μM) specific for ABC1, including one of 1) and 2), can be used to isolate nucleic acids encoding the ABC1 protein. [1] The 1-184 nucleotide region of SEQ ID NO: 69 This sequence and the complement of SEQ ID NO: 69, 6968-9741 nucleotide region included SEQ ID NO: 2) the sequence containing the 1-297 nucleotide region of SEQ ID NO: 70 and the complement contained in the 7081-9854 nucleotide region of SEQ ID NO: 70 order].

이들 뉴클레오타이드 프라이머는 ABI 394 타입의 DNA 합성기(Applied Biosystem, 미국 캘리포니아 포스터시티 소재)에서 포스포라미다이트 방법을 통해 합성될 수 있다.These nucleotide primers can be synthesized by phosphoramidite method in an ABI 394 type DNA synthesizer (Applied Biosystem, Foster City, Calif.).

50 ng의 인간 ABC1 cDNA를 주형으로 사용하고, 그것의 5'에 제한효소 Not1에 의해 인식되는 부위(5'-GCGGCCGC-3')를 포함하는 0.25 μM의 ABC1 특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하며, 각각 200 μM의 디데옥시뉴클레오타이드 dATP, dCTP, dTTP, dGTP 및 파이로코커스 퓨리어수스(Pyrococcus furiosus)DNA 합성효소의 존재하의 2차 증폭에 의해, 제한효소 NotI에 의해 인식되는 부위는 재조합 벡터내로 삽입하기 위한 ABC1 cDNA 영역을 공격하기 위해, 증폭된 ABC1 cDNA로 혼입될 수 있다(Stratagene,Inc. 미국 캘리포니아 라졸라 소재).50 ng of human ABC1 cDNA is used as a template and 0.25 μM of ABC1 specific oligonucleotide primers containing a site recognized by restriction enzyme Not1 (5'-GCGGCCGC-3 ') at its 5', By secondary amplification in the presence of 200 μM of dideoxynucleotides dATP, dCTP, dTTP, dGTP and Pyrococcus furiosus DNA synthase, respectively, sites recognized by restriction enzyme NotI were inserted into the recombinant vector. In order to attack the ABC1 cDNA region, it can be incorporated into amplified ABC1 cDNA (Stratagene, Inc. La Jolla, CA, USA).

PCR 반응은 30 사이클에 걸쳐 PCR을 위한 써모사이클러내에서 수행되는데 각 사이클은 95℃에서 1분 동안의 변성단계, 50℃에서 1분 동안의 재생단계, 72℃에서2분 동안의 증폭단계로 이루어져 있다(Cetus Perkin Elmer, 미국 커네티컷 노워크 소재).The PCR reaction is carried out in a thermocycler for PCR over 30 cycles, each cycle being denatured at 95 ° C. for 1 minute, regenerated at 50 ° C. for 1 minute and amplified at 72 ° C. for 2 minutes. (Cetus Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut, USA).

Ⅱ. 인간 ABC1 유전자의 cDNA를 발현벡터로 클로닝II. Cloning cDNA of the Human ABC1 Gene into an Expression Vector

인간 ABC1 cDNA 삽입체는 발현벡터의 NotI 제한부위로, 예를 들면 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터와 인핸서 서열 및 SV40 폴리아데닐화 시그널을 함유한 pCMV 벡터(Beg et al.,1990; Applebaum-Boden,1996)로, pABC1로 명명된 발현벡터를 생산하기 위해 클로닝될 수 있다.Human ABC1 cDNA inserts are NotI restriction sites of expression vectors, e.g. pCMV vectors containing cytomegalovirus (CMV) early promoter and enhancer sequences and SV40 polyadenylation signals (Beg et al., 1990; Applebaum-Boden). , 1996), can be cloned to produce an expression vector named pABC1.

복제된 cDNA의 서열은 ABI 310 타입의 모세관 서열 분석기(Applied Biosystems, 미국 캘리포니아 포스터 시티 소재)내에서 반응세트 "ABI Prism Big Dye Terminater Cycle Sequencing ready"(Applied Biosystems사에서 판매, 미국 캘리포니아 포스터 시티 소재)를 사용하는 두 본쇄상에서의 서열분석으로 결정할 수 있다.The sequence of the cloned cDNA was prepared in the reaction set "ABI Prism Big Dye Terminater Cycle Sequencing ready" (Applied Biosystems, Foster City, CA) in an ABI 310 type capillary sequence analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Can be determined by sequencing on two strands using.

Ⅲ. 인간 ABC1 유전자의 cDNA를 함유하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조III. Preparation of Recombinant Adenovirus Vectors Containing the cDNA of the Human ABC1 Gene

A-발현벡터 pCMV-β의 변형Modification of the A-expression vector pCMV-β

발현벡터 pCMV-β의 베타-갈락토시다제 cDNA(Clontech, 미국 캘리포니아 팔로 알토 소재, Gene Bank Accession No.UO2451)는 제한 엔도뉴클레아제 NotI으로 분해되고, 다중 클로닝 부위(5' 말단으로부터 3' 말단 방향으로 다음 부위를 가진다: NotI, AscI, RsrⅡ, AvrⅡ, SwaI, 및 NotI)에 의해 치환되며, NotI 제한부위의 영역에서 클로닝된다. 이 클로닝 부위의 서열은:Beta-galactosidase cDNA of the expression vector pCMV-β (Clontech, Gene Bank Accession No.UO2451, Palo Alto, CA, USA) was digested with restriction endonuclease NotI and multiple cloning sites (3 'from 5' end) In the terminal direction it has the following sites: NotI, AscI, RsrII, AvrII, SwaI, and NotI), and is cloned in the region of the NotI restriction site. The sequence of this cloning site is:

5'-CGGCCGCGGCGCGCCCGGACCGCCTAGGATTTAAATCGCGGCCCGCG-3'(서열번호 66)5'-CGGCCGCGGCGCGCCCGGACCGCCTAGGATTTAAATCGCGGCCCGCG-3 '(SEQ ID NO: 66)

변형된 발현벡터 pCMV의 EcoRI과 SanI 부위 사이의 DNA 단편은 분리되고, 셔틀벡터 pXCXII의 변형된 XbaI 부위로 클로닝될 수 있다(McKinnon et al.,1982; McGrory et al.,1988).DNA fragments between the EcoRI and SanI sites of the modified expression vector pCMV can be isolated and cloned into the modified XbaI sites of the shuttle vector pXCXII (McKinnon et al., 1982; McGrory et al., 1988).

B-셔틀벡터 pXCXII의 변형Variation of B-shuttle vector pXCXII

5' 말단에서 3' 말단 방향으로 다음 서열을 가지는 XbaI, EcoRI, SfiI, PmeI, NheI, SrfI, PacI, SalI, XbaI 제한부위를 포함하는 다중 클로닝 부위는:Multiple cloning sites comprising XbaI, EcoRI, SfiI, PmeI, NheI, SrfI, PacI, SalI, XbaI restriction sites in the 5 'to 3' end direction:

5'-GCTCTAGAATTCGGCCTCCGTGGCCGTTTAAACGCTAGCGCCCGGGCTTAATTAAGTCGACTCT5'-GCTCTAGAATTCGGCCTCCGTGGCCGTTTAAACGCTAGCGCCCGGGCTTAATTAAGTCGACTCT

AGAGC-3'(서열번호 67)AGAGC-3 '(SEQ ID NO: 67)

pXCXII 벡터의 XbaI 부위(3329 위치의 뉴클레오타이드)의 수준에서 삽입될 수 있다(McKinnon et al.,1982; McGrory et al.,1989).It can be inserted at the level of the XbaI site (nucleotide at position 3329) of the pXCXII vector (McKinnon et al., 1982; McGrory et al., 1989).

CMV 프로모터/인핸서를 포함하는 변형된 pCMV-β벡터로부터 분리된 EcoRI-SalI DNA단편, FV 40의 공여체(donor),수용체(acceptor) 스플라이싱 부위와 FV40의 폴리아데닐화 시그널은 그 후 pCMV-11로 명명된, 변형된 셔틀벡터 pXCX 의 EcoRI-SalI부위로 클로닝 될 수 있다.The EcoRI-SalI DNA fragment isolated from the modified pCMV-β vector containing the CMV promoter / enhancer, the donor, acceptor splicing site of FV 40 and the polyadenylation signal of FV40 were then followed by pCMV- It can be cloned into the EcoRI-Sal region of the modified shuttle vector pXCX, designated 11.

C.셔틀벡터 pAD12-ABC1의 제조C. Preparation of Shuttle Vector pAD12-ABC1

인간 ABC1 cDNA는 RT-PCR 반응에 의해 수득될 수 있고, 위에 기술한 바대로 pCMV-12벡터로 NotI 부위 수준에서 클로닝되며, 결국 pCMV-ABC1벡터의 획득을 초래한다.Human ABC1 cDNA can be obtained by RT-PCR reaction and cloned at the NotI site level with pCMV-12 vector as described above, resulting in the acquisition of pCMV-ABC1 vector.

D. ABC1 재조합 아데노바이러스의 제조D. Preparation of ABC1 Recombinant Adenovirus

인간 ABC1 cDNA를 포함한 ABC1-rldV 재조합 아데노바이러스는 McGrory 등(1988)이 설명한 기술에 따라 제조할 수 있다.ABC1-rldV recombinant adenovirus comprising human ABC1 cDNA can be prepared according to the techniques described by McGrory et al. (1988).

간단히, pAD12-ABC1 벡터는 Chen과 Okayama(1987)의 기술에 따라 tGM17 벡터와 공형질감염된다.Briefly, the pAD12-ABC1 vector is cotransfected with the tGM17 vector according to the technique of Chen and Okayama (1987).

이와 같이, pAD12-루시퍼라제 벡터는 pJM17 벡터와 함께 제조되고 공형질감염된다.As such, the pAD12-luciferase vector is prepared with the pJM17 vector and cotransfected.

재조합 아데노바이러스는 PCR 증폭에 의해 동정되고, 인간 배아 신장 세포주 HEK 293 안에서의 대규모 증폭 전에 두 정제 사이클을 거친다(American Type Culture Collection, 미국 메릴랜드 록빌 소재).Recombinant adenoviruses are identified by PCR amplification and undergo two purification cycles before large-scale amplification in human embryonic kidney cell line HEK 293 (American Type Culture Collection, Rockville, MD).

아데노바이러스 벡터로 감염한 후 48 내지 72시간 후 감염된 세포를 수집하고, 5 동결 해동 용해 사이클을 거친다.Infected cells are collected 48-72 hours after infection with adenovirus vectors and undergo 5 freeze thaw lysis cycles.

조 용해물은 Freon의 도움으로 추출되고(Halocarbone 113, Matheson product, 미국 뉴저지 스코커스 소재), 0.2% 쥐 알부민(Sigma Chemical Co., 미국 미주리 세인트 루이스 소재)이 공급된 세슘 클로라이드 안에서 두 번 침전되고, 150 nM NaCl, 10 mM Hepes(pH 7.4), 5 mM KCl,1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2로 이루어진 완충액에 대해 강하게 투석된다.The crude lysate was extracted with the help of Freon (Halocarbone 113, Matheson product, Scocus, NJ), and precipitated twice in cesium chloride supplied with 0.2% rat albumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Is strongly dialyzed against a buffer consisting of 150 nM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.4, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 1 mM CaCl 2 .

재조합 아데노바이러스는 -70℃에서 보관되고 동물에 적용되거나, 배양시 세포와 함께 배양되기 전에, 적정된다.Recombinant adenoviruses are stored at −70 ° C. and applied to animals or titrated before being incubated with the cells in culture.

야생형 오염 아데노바이러스의 부재는 소실된 영역의 구조적 부분에 위치한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 PCR 증폭의 도움으로 스크리닝 함으로써결정된다.Absence of wild-type contaminating adenovirus is determined by screening with the aid of PCR amplification using oligonucleotide primers located in the structural part of the missing region.

Ⅳ. 인간 ABC1 cDNA 발현의 증명Ⅳ. Demonstration of Human ABC1 cDNA Expression

인간 ABC1 폴리펩타이드에 특이적인 폴리클로날 항체는 위에 기술된 바대로 토끼나, 닭에 ABC1 단백질로부터 유래한 합성 폴리펩타이드 단편(위에 기술한 서열번호 71의 아미노산 서열의 전체 또는 부분)을 주사하여 제조할 수 있다. 이들 폴리클로날 항체는 세포와 동물 모델 내에서의 인간 ABC1 유전자의 발현을 면역블롯팅 및/또는 면역검출을 이용하여 검출 및/또는 정량분석하는 데 쓰인다.Polyclonal antibodies specific for human ABC1 polypeptides are prepared by injecting synthetic polypeptide fragments (all or part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71 described above) derived from ABC1 protein into rabbits or chickens as described above can do. These polyclonal antibodies are used to detect and / or quantify expression of human ABC1 genes in cell and animal models using immunoblotting and / or immunodetection.

ABC1의 생물학적 활성은 콜레스테롤로 로딩되어 있던 pCMV-ABCI 벡터로 형질감염된 세포를 사용하는 apoA-I에 의해 유도되는 콜레스테롤 플럭스를 정량분석함으로써 모니터될 수 있다(Remaley et al.,1997).The biological activity of ABC1 can be monitored by quantifying the cholesterol flux induced by apoA-I using cells transfected with pCMV-ABCI vectors loaded with cholesterol (Remaley et al., 1997).

Ⅴ.세포내 인간 ABC1 cDNA의 시험관내 발현In vitro expression of human ABC1 cDNA in cells

HEK 293 계통과 COS-7 계통의 세포(American Tissue Culture Collection, 미국 메릴랜드 베데스타 소재) 및 탠지어병으로부터 유래한 또는 저-알파지방단백질혈증을 앓고 있는 환자로부터 유래한 1차 배양균의 섬유아세포는 리포펙타민(Lipofectamine)(BRL, 미국 메릴랜드 게이더스버그 소재)을 사용하는 pCMV-ABC1 발현벡터(5-25 ㎍)로, 또는 칼슘 클로라이드의 도움으로 공침되는 것을 통해 형질감염된다(Chen et al.,1987).Fibroblasts from HEK 293 strains and COS-7 strains (American Tissue Culture Collection, Bethesta, Md.) And primary cultures from tangeria or from patients with low-alpha lipoproteinemia. Is transfected with pCMV-ABC1 expression vector (5-25 μg) using Lipofectamine (BRL, Gaithersburg, MD) or via coprecipitation with the help of calcium chloride (Chen et al. ., 1987).

이러한 세포들은 pABC-AdV 벡터로도 감염될 수 있다(감염지수, MOI=10).These cells can also be infected with the pABC-AdV vector (infection index, MOI = 10).

인간 ABC1의 발현은 면역블롯팅 및, 형질감염된 및/또는 감염된 세포를 사용하는 apoA-1에 의해 유도되는 콜레스테롤의 유출을 정량분석하는 것에 의해 모니터할 수 있다.Expression of human ABC1 can be monitored by immunoblotting and quantitating the outflow of cholesterol induced by apoA-1 using transfected and / or infected cells.

탠지어병 환자와 저-알파지방단백질혈증 환자가 앓고 있는 유전자 결함을 이들 환자의 섬유아세포를 사용하여 상보시키는 것은 정상 ABC1 유전자의 발현을 검출함으로써 확인될 수 있으며, 이는 이 수용체의 기능적 중요성을 수립 가능하게 만든다.Complementary use of fibroblasts of these patients with gene defects in patients with tangeria and low-alpha lipoproteinemia can be identified by detecting the expression of the normal ABC1 gene, which establishes the functional significance of this receptor. Make it possible

Ⅵ. 다양한 동물내에서의 ABC1 유전자의 생체내 발현Ⅵ. In vivo expression of the ABC1 gene in various animals

108-109용해 플라크-형성 단위(pfu)를 포함하는 정제된 재조합 아데노바이러스(pABC1-AdV 또는 pLucif-AdV)를 포함하는 적당한 부피(100-300 ㎕)의 배지를 마우스(C57BL/6, 대조 마우스와 트랜스제닉 또는 녹아웃 마우스 모델 모두)의 Saphenous 정맥내로 실험 0일에 주입한다.A suitable volume (100-300 μl) of medium containing purified recombinant adenovirus (pABC1-AdV or pLucif-AdV) containing 10 8-10 9 soluble plaque-forming units (pfu) was transferred to mice (C57BL / 6, Inject intravenous Saphenous intravenously (in both control mice and transgenic or knockout mouse models) on day 0 of the experiment.

지방단백질의 대사에서의 ABC1 단백질의 생체내 역할을 평가하는 것은 아데노바이러스의 적용 전(0일)과 후(2,4,7,10,14일)의 마우스의 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 인지질, 유리 콜레스테롤(Sigma and Wako Chemicals, 미국 버지니아 리치먼드 소재), 콜레스테롤-HDL(CIBA-Corning, 미국 오하이오 오벌린 소재), 및 아포지방단백질 A-I, A-Ⅱ, E, B(Foger et al.,1997)의 양을 측정함으로써 수행된다.Assessing the in vivo role of ABC1 protein in the metabolism of lipoproteins can be attributed to the total cholesterol, triglycerides, phospholipids, Free cholesterol (Sigma and Wako Chemicals, Richmond, Va.), Cholesterol-HDL (CIBA-Corning, Oberlin, Ohio), and apofatty proteins AI, A-II, E, B (Foger et al., 1997). This is done by measuring the amount.

HDL과 LDL의 대사 및 간으로의 콜레스테롤 방출에 대한 ABC1의 발현효과를 평가하기 위해 rLucif-AdV 및 rABC1-AdV 벡터의 투여 5일 후에 apoA-Ⅰ-HDL, CE-HDL 및 apoB-LDL, CE-LDL과 같은 방사성 표지된 산물로 역학 연구가 수행된다.To evaluate the effect of ABC1 on the metabolism of HDL and LDL and cholesterol release into the liver, apoA-I-HDL, CE-HDL and apoB-LDL, CE- after 5 days of rLucif-AdV and rABC1-AdV vectors Epidemiological studies are performed with radiolabeled products such as LDL.

아테롬성동맥경화증의 발병에 있어서 ABC1의 발현효과는 rABC1-AdV 벡터의적용 후에 마우스의 apoE내의 대동맥 병변의 평균 표면적을 정량함으로써 평가될 수 있다.The expression effect of ABC1 in the development of atherosclerosis can be assessed by quantifying the average surface area of aortic lesions in apoE of mice after application of the rABC1-AdV vector.

더욱이, Vaisman(1995)와 Hoeg(1996)의 교시에 따르면, ABC1, CMV 또는 apoE와 같은 내생적 프로모터의 조절하에 있는 인간 ABC1 cDNA를 포함하는 작제물을 사용하면 ABC1 유전자가 과발현된 트랜스제닉 마우스나 토끼가 만들어 질 수 있다.Furthermore, according to the teachings of Vaisman (1995) and Hoeg (1996), constructs containing human ABC1 cDNAs under the control of endogenous promoters such as ABC1, CMV or apoE can be used for transgenic mice overexpressing the ABC1 gene. Rabbits can be made.

원형질 지방, 지방단백질, 아포지방단백질의 동역학에서, 및 아테롬성동맥경화증에서의 ABC1의 발현의 장기 효과의 측정은 상기 서술한 바대로 수행될 수 있다.In the kinetics of plasma fat, lipoproteins, apolipoproteins, and determination of the long-term effects of the expression of ABC1 in atherosclerosis can be performed as described above.

실시예 13: ABC1 단백질의 효능제 및 길항제를 스크리닝 하기 위한 소포의 사용Example 13: Use of Vesicles for Screening agonists and Antagonists of ABC1 Protein

본 스크리닝 실험의 기본은 ABC1 단백질에 포함되어 있고, 콜레스테롤 또는 인지질과 같은 기질을 함유한 막의 재구성이다. ABC1 단백질은 당해 분자을 첨가함으로써 그 기능이 활성화되거나 억제될 수 있다. 이어서, ABC1 단백질에 의해 형성된 채널을 통한 기질의 유출을 검출한다.The basis of this screening experiment is the reconstitution of a membrane contained in ABC1 protein and containing a substrate such as cholesterol or phospholipids. ABC1 protein can be activated or inhibited by the addition of the molecule. The outflow of the substrate through the channel formed by the ABC1 protein is then detected.

a)ABC1 단백질과 표지된 지방 기질을 함유한 막의 재구성a) reconstitution of membrane containing ABC1 protein and labeled fat substrate

이들 막을 제조하기 위해 다양한 전략이 사용될 수 있다. 유기용매를 사용하는 방법, 초음파처리, 즉 "프렌치 프레스"와 같은 기계적 도구를 사용하는 방법, 또는 동결-해동 사이클 또는 계면활성제(cholate,chaps,chapso)를 사용하는 방법 등이 있다.(Rigaud et al.,1995)Various strategies can be used to make these membranes. Methods of using organic solvents, sonication, ie using mechanical tools such as "French presses", or using freeze-thaw cycles or surfactants (cholate, chaps, chapso). al., 1995)

좀더 구체적으로, 인지질, 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 에스테르와 같은 지질 기질,3H-콜레스테롤,125I-콜레스테롤 또는3H-포스파티딜콜린과 같은 방사성 기질, NBD와 함께 형광성 기질, 또는 피렌(Molecular Probe; http://www.probes .com), 및 난의 포스파티딜콜린(1 mM)과 같은 지질 기질은 유리 플라스크의 펠렛 위에서 건조된다. 나트륨 콜레이트와 ABC1 단백질은 이 플라스크에서 몰 대 몰 비율이 0.3이 되도록 섞는다. 그것을 5분 동안 와동-혼합하고 25℃에서 30분 동안 배양한 후 생리식염수 완충액에 대해 투석한다. 이 프로토콜에 의해 생성된 프로테오리포솜은 잘 제조되었는지를 확인하기 위해 탁도(turbidimetry)를 통해 모니터된다.More specifically, a substrate such as a lipid a phospholipid, cholesterol or a cholesterol ester, cholesterol, 3 H-, 125 I- cholesterol or three radioactive substrates, fluorescent substrates with NBD such as H- phosphatidylcholine, or pyrene (Molecular Probe; http: // www.probes.com), and lipid substrates such as egg phosphatidylcholine (1 mM) are dried over pellets in a glass flask. Sodium cholate and ABC1 protein are mixed in this flask to a molar to molar ratio of 0.3. It is vortex-mixed for 5 minutes and incubated at 25 ° C. for 30 minutes before dialysis against physiological saline buffer. Proteoliposomes produced by this protocol are monitored via turbidimetry to confirm that they are well prepared.

b)고체 표면상에 프로테오리포솜의 포획b) capture of proteoliposomes on solid surfaces

본 단계는 인티그린 타입의 결합단백질을 혼입함으로써 수행할 수 있다. 이 프로토콜에서, ABC1 단백질에 대한 것이고 96 또는 384-웰 플레이트상에 흡착되었던 항체에 의한 포획이 이용된다.This step can be carried out by incorporating integrin type binding proteins. In this protocol, capture by antibodies against ABC1 protein and which has been adsorbed on 96 or 384-well plates is used.

농도 100 ㎍/I의 이들 항체를 함유한 용액은 다중-웰 플레이트에서 밤새 4℃에서 배양함으로써 흡수된다. 세척 후 플레이트는 1 ㎎/㎖의 소 알부민으로 포화되고 37℃에서 2시간 동안 배양된다. 이어서 전 용액을 세척하고, ABC1을 함유한 프로테오리포솜과 2시간 동안 37℃에서 배양된다.Solutions containing these antibodies at a concentration of 100 μg / I are taken up by incubating at 4 ° C. overnight in multi-well plates. After washing the plates are saturated with 1 mg / ml bovine albumin and incubated at 37 ° C. for 2 hours. The whole solution is then washed and incubated at 37 ° C. for 2 hours with proteoliposomes containing ABC1.

c)당해 분자의 결합c) binding of the molecule

본 단계는 산물을 1시간 동안 37℃에서 배양함으로써 수행된다.This step is carried out by incubating the product at 37 ° C. for 1 hour.

d)ABC1 단백질의 활성 또는 억제의 결정d) determination of activity or inhibition of ABC1 protein

만약 기질이 형광성이라면, 상등액의 형광은 프로테오리포솜의 외부로 지방의 수송을 유도하는 산물의 활성을 나타내는 것이다. 대안적으로, Confocal 시스템의 사용은 프로테오리포솜 내부와 외부의 기질의 양의 정보를 준다. 만약, 기질이 방사성이라면, 섬광 액체 바닥을 가진 CytoStar-타입 플레이트를 사용하여 프로테오리포솜 내에 여전히 남아있는 기질을 알아볼 수 있게 해준다.If the substrate is fluorescent, the fluorescence of the supernatant is indicative of the activity of the product to induce the transport of fat out of the proteoliposomes. Alternatively, the use of the Confocal system gives information on the amount of substrate inside and outside the proteoliposome. If the substrate is radioactive, CytoStar-type plates with scintillation liquid bottoms can be used to identify the substrate still remaining in the proteoliposomes.

실시예 14: ABC1 단백질의 효능제 및 길항제 분자를 스크리닝 하기 위한 음이온 수송의 사용Example 14 Use of Anion Transport to Screen Agonist and Antagonist Molecules of ABC1 Protein

이 실험의 원리는 ABC1 단백질이 활성화 동안에 수송을 위한 음이온을 가진다는 특징에 기초한다.The principle of this experiment is based on the feature that the ABC1 protein has an anion for transport during activation.

a)THP-1 계통의 대식구, 인간세포의 단핵구는 분화된 대식구의 모델이다. 세포는 10% 태 송아지 혈청이 공급된 RPMI 1640 배지에서 웰당 2×105세포의 밀도를 가지는 48-다중 웰 플레이트에서 배양된다. 탠지어병을 앓고 있는 환자의 섬유아세포는 음성 대조군으로 사용될 수 있는데, 왜냐하면 그들의 ABC1 단백질이 제 기능을 하지 못하기 때문이다. 다른 음성대조군이 항-ABC1 항체를 첨가함으로써 수득될 수 있다.a) Macrophages of the THP-1 strain, monocytes of human cells are models of differentiated macrophages. Cells are cultured in 48-multi well plates with a density of 2 × 10 5 cells per well in RPMI 1640 medium fed with 10% fetal calf serum. Fibroblasts from patients with Tangier's disease can be used as a negative control because their ABC1 protein is not functioning. Other negative controls can be obtained by adding anti-ABC1 antibodies.

b)음이온 수송 결핍 세포의 사용이나 또는 음이온 채널 억제제(Verapamil 타입, P-당단백질 또는 테트라에틸암모늄의 억제제, 칼륨 채널 억제제)로 처리한 세포 또한 사용가능하다.b) Cells using anion transport deficient cells or treated with anion channel inhibitors (Verapamil type, inhibitors of P-glycoprotein or tetraethylammonium, potassium channel inhibitors) are also available.

c)실제적 실험을 위해 이어서 세포는 37℃에서 30분 동안 1 ㎖의 KI를1㎛ol/L(0.1 μCi/㎖의 NaI 125)의 ESS 배지에 미리로드한 Earles's modified salt solution(ESS) 배지에서 세척된다. 산물은 그후 세포외 배지에 첨가된다. 그후 세포는 ESS 배지로 세척된다.c) For practical experiments, cells were then placed in Earles's modified salt solution (ESS) medium, preloaded with 1 mL of KI in ESS medium at 1 μmol / L (0.1 μCi / mL NaI 125) for 30 minutes at 37 ° C. Washed. The product is then added to extracellular medium. The cells are then washed with ESS medium.

d)배지내 아이오다이드의 양은 11분 동안 매분 검출된다. 처음 두 포인트는 기본 유출과 상응한다. 배양의 막바지에서, 배지는 수거 되고, 세포내 잔존하는 요오드의 양은 이어지는 1 몰 NaOH에서의 세포의 용해로 측정된다.d) The amount of iodide in the medium is detected every minute for 11 minutes. The first two points correspond to the base runoff. At the end of the culture, the medium is harvested and the amount of iodine remaining in the cells is measured by subsequent lysis of cells in 1 mole NaOH.

e)시간 0에서의 방사능 전체량은 상등액에서 발견되는 방사능과 세포내 잔류 방사능의 합과 같다. 유출 곡선은 시간의 함수에 따라 배지로 방출되는 방사능의 %를 플롯하여 수득할 수 있다.e) The total amount of radioactivity at time zero is equal to the sum of the radioactivity found in the supernatant and the residual intracellular radioactivity. The runoff curve can be obtained by plotting the percentage of radioactivity released into the medium as a function of time.

실시예 15: ABC1 단백질의 효능제 및 길항제 분자를 스크리닝하기 위한 IL-1 베타를 발현하는 THP-1 대식구의 사용Example 15 Use of THP-1 Macrophages Expressing IL-1 Beta for Screening agonist and Antagonist Molecules of ABC1 Protein

이 실험의 원리는 ABC1 단백질의 활성을 조절하는 어떠한 기질도 IL-1 베타의 합성에 있어서 영향을 줄 것이라는 데 기초하고 있다.The principle of this experiment is based on that any substrate that modulates the activity of the ABC1 protein will affect the synthesis of IL-1 beta.

a)THP-1 계통의 대식구, 단핵성 백혈병 인간 세포는 분화된 대식구의 모델이다. 세포는 10% 태 송아지 혈청이 공급된 RPMI 1640 배지에서 웰당 2105 세포의 밀도를 가지는 다중 웰 플레이트에서 배양된다.a) Macrophage, mononuclear leukemia human cells of the THP-1 lineage are models of differentiated macrophages. Cells are cultured in multi-well plates with a density of 2105 cells per well in RPMI 1640 medium fed with 10% fetal calf serum.

b)실제 실험을 위해서, 이어서 세포는 세척되고 1 ㎍/㎖의 정제된 인간 알부민 분획 4를 함유한 RPMI 1640 배지에 위치한다.b) For the actual experiment, cells are then washed and placed in RPMI 1640 medium containing 1 μg / ml of purified human albumin fraction 4.

c)산물은 세포외 배지에 첨가된다. 동시에, 세포는 5 mmol/L의 ATP 존재하에서 30분 배양된 후 1 ㎍/㎖의 리포폴리사카라이드(LPS)를 3시간 이상 첨가함으로써활성화된다.c) The product is added to extracellular medium. At the same time, cells are incubated for 30 minutes in the presence of 5 mmol / L of ATP and then activated by adding 1 μg / ml of lipopolysaccharide (LPS) for at least 3 hours.

d)IL-1 베타, 조절 IL-1 알파, 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파), IL-6의 농도는 제조자의 지침에 따른 ELISA 키트에 의해 결정된다(R&D System; 인간 IL-1 베타 화학발광 ELISA reference QLB00). 병에 걸리지 않은 것으로 보이는 IL-1 베타의 mRNA의 변이는 상응하는 탐침을 사용하여 노던 블롯 기술에 의해 평가될 수 있다.d) The concentrations of IL-1 beta, regulatory IL-1 alpha, tumor necrosis factor alpha (TNF alpha), IL-6 are determined by ELISA kits according to the manufacturer's instructions (R & D System; human IL-1 beta chemiluminescence ELISA reference QLB00). Mutations in the mRNA of IL-1 beta that do not appear to be diseased can be assessed by Northern blot techniques using the corresponding probes.

실시예 16: ABC1 매개 인지질 및 콜레스테롤 유출Example 16: ABC1 Mediated Phospholipids and Cholesterol Outflow

I.-배양 세포I.-cultured cells

인간 Hela Tet-off 세포(Clontech, 미국 캘리포니아 팔로 알토 소재)는 10% 태 송아지 혈청, 2 mM 글루타민, 100 IU/㎖의 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(EMEM10), 250 ㎍/㎖의 G418이 공급된 둘베코 변형 최소 필 수 배지(DMEM)(GIBRO BRL, 미국 메릴랜드 록빌)에서 생장시킨다. 안정하게 인간 ABC1-GFP 융합 단백질을 발현하는 세포주가 융합단백질의 cDNA를 포함하고, 하이그로마이신 내성 마커를 암호화하는 pHygro를 포함하는 pTR2 플라스미드(Clontech, 미국 캘리포니아 팔로 알토 소재)로 공-형질감염하여 수득된다. 1 ㎍/㎖의 하이그로마이신으로 선별한 후 약 2주간, GFP에 양성인 형광현미경으로 평가한 세포는 클로닝되고 확장된다.Human Hela Tet-off cells (Clontech, Palo Alto, CA, USA) contained 10% fetal calf serum, 2 mM glutamine, 100 IU / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin (EMEM10), 250 μg / ml G418 This Dulbecco's Modified Minimum Essential Medium (DMEM) (GIBRO BRL, Rockville, MD) is grown. Cell lines stably expressing human ABC1-GFP fusion proteins were co-transfected with a pTR2 plasmid (Clontech, Palo Alto, Calif.) Containing a cDNA of the fusion protein and a pHygro encoding a hygromycin resistance marker. Obtained. About 2 weeks after selection with 1 μg / ml of hygromycin, cells evaluated by fluorescence microscopy positive for GFP are cloned and expanded.

Ⅱ. 콜레스테롤 유출 분석II. Cholesterol Spill Analysis

콜레스테롤 유출 분석은 Oram 등(1986)과 Rothblat 등(1986)이 기술한 바대로 필수적으로 수행되어야 한다.Cholesterol release analysis should be performed essentially as described by Oram et al. (1986) and Rothblat et al. (1986).

24-웰 플레이트에서 생장시킨 유착성 콜레스테롤-로딩 섬유아세포는 1 μCi/㎖의 1,2-3H-콜레스테롤(50 Ci/mmol)(Dupont, 미국 델라웨어 윌밍턴 소재)을 함유한 EMEM 10에서 48시간 동안 배양된다. 전형적으로 이 표지 프로토콜은 약 100,000 CPM/well 또는 1000C PM/㎍ 단백질을 생성한다. 세포는 EMEM/BSA에서 세번 세척되고, 콜레스테롤 수용체(즉, apoA-I, apoA-Ⅱ, apoA-Ⅳ, apoC-I, apoC-Ⅱ, apoC-Ⅲ, apoE3) 10 ㎍/㎖의 존재 또는 부재하의 EMEM/BSA 배지는 콜레스테롤의 유출에 앞서 24시간 동안, 37℃에서 첨가되고 배양된다. 유출기 후에(18시간), 배지를 수집하고 원심분리(10,000 ×g, 5분)하며, 배지의 분획은 액체섬광계수기로 방사능을 측정한다. 세포 분획의 잔류 방사능 카운트는 이소프로판올을 통한 추출 후에 밤 사이 결정된다. 유출 %는 유출 배지내 방사능 카운트를 배지와 세포내의 방사능 카운트의 합으로 나누어 줌으로써 결정된다. 지적하지 않는 한, EMEM/BSA 배지는 블랭크로 사용되고 블랭크로부터의 결과는 콜레스테롤 수용체의 존재하에서 수득된 방사능으로부터 빼준다.Adherent cholesterol-loaded fibroblasts grown in 24-well plates were 48 in EMEM 10 containing 1 μCi / mL of 1,2-3H-cholesterol (50 Ci / mmol) (Dupont, Wilmington, Delaware, USA). Incubate for hours. Typically this labeling protocol produces about 100,000 CPM / well or 1000C PM / μg protein. Cells are washed three times in EMEM / BSA and the presence or absence of 10 μg / ml of cholesterol receptors (ie apoA-I, apoA-II, apoA-IV, apoC-I, apoC-II, apoC-III, apoE 3 ) EMEM / BSA medium underneath is added and incubated at 37 ° C. for 24 hours prior to the outflow of cholesterol. After the effluent (18 hours), the medium is collected and centrifuged (10,000 x g, 5 minutes), and the fractions of the medium are measured for radioactivity with a liquid scintillation counter. Residual radioactivity counts of cell fractions are determined overnight after extraction through isopropanol. The percent effluent is determined by dividing the radioactivity counts in the effluent medium by the sum of the radioactivity counts in the medium and cells. Unless indicated, EMEM / BSA medium is used as a blank and the results from the blank are subtracted from the radioactivity obtained in the presence of cholesterol receptors.

도 4에서 보여지는 결과는, 다양한 아포지방단백질 A-I, A-Ⅱ, A-Ⅳ, C-I, C-Ⅱ, C-Ⅲ, E3의 첨가는 ABC1으로 형질감염된 세포에서의 콜레스테롤 유출을 현저히 증가시킴을 명확히 증명하며, 그러므로 본 발명에 따른 전 길이의 ABC1 단백질은 다양한 아포지방단백질 A-I, A-Ⅱ, A-Ⅳ, C-I, C-Ⅱ, C-Ⅲ, E3에 의해 매개되는 콜레스테롤 유출을 촉진시킬 수 있음을 보인다.The results shown in FIG. 4 show that the addition of various apolipoproteins AI, A-II, A-IV, CI, C-II, C-III, E 3 significantly increases cholesterol outflow in cells transfected with ABC1. The full-length ABC1 protein according to the present invention therefore promotes cholesterol outflow mediated by various apolipoproteins AI, A-II, A-IV, CI, C-II, C-III, E 3 It can be done.

Ⅲ. 인지질 유출분석III. Phospholipid Runoff Analysis

인지질 유출분석은 본질적으로 Mendez 등(1994)이 설명한 바대로 수행된다.Phospholipid runoff analysis is performed essentially as described by Mendez et al. (1994).

콜린-함유 인지질은 5 μCi/㎖의 메틸-3H 콜린 클로라이드(84 Ci/mmol(Amersham; 미국 일리노이 알링턴 하이츠 소재)를 함유한 EMEM 10 배지와 함께 24 웰 플레이트 위에서 생장시킨 유착성 콜레스테롤-로딩 섬유아세포를 24시간 동안 배양함으로써 표지된다. EMEM/BSA에서 1시간 전-배양 후, 인지질 수용체(즉, apoA-I, apoA-Ⅱ, apoA-Ⅳ, apoC-I, apoC-Ⅱ, apoC-Ⅲ, apoE3) 10 ㎍/㎖의 존재 또는 부재하에 EMEM/BSA 배지와의 배양에 앞서서, 세포는 EMEM/BSA로 세번 세척된다. 보통은, 이 표지 프로토콜은 약 500,000 CPM/well 또는 5000 CPM/㎍ 단백질을 생성한다. 유출기 후(18시간), 배지를 수집하고 원심분리한다(10,000 ×g, 5분). 상등액의 분액은 클로로포름:메탄올(2:1)로 추출하고, 유기상의 방사능을 섬광계수기로 측정한다. 세포내 분획에 남아있는 카운트는 1시간의 헥산: 이소프로판올(3:2)추출 후에 이소프로판올로 밤새 추출하여 측정한다.Choline-containing phospholipids were adherent cholesterol-loaded fibroblasts grown on 24-well plates with EMEM 10 medium containing 5 μCi / ml of methyl-3H choline chloride (84 Ci / mmol (Amersham, Arlington Heights, Ill.) Labeled by incubating for 24 hours After 1 hour pre-culture in EMEM / BSA, phospholipid receptors (ie apoA-I, apoA-II, apoA-IV, apoC-I, apoC-II, apoC-III, apoE) 3 ) Cells are washed three times with EMEM / BSA prior to incubation with EMEM / BSA medium in the presence or absence of 10 μg / ml Normally, this labeling protocol is about 500,000 CPM / well or 5000 CPM / μg protein. After the effluent (18 hours), the medium is collected and centrifuged (10,000 x g, 5 min), the aliquots of the supernatant are extracted with chloroform: methanol (2: 1) and the radioactivity of the organic phase is flashed with a scintillation counter. Remaining counts in intracellular fractions were extracted for 1 hour of hexane: isopropanol (3: 2). The extracts measured with isopropanol overnight.

% 유출은 유출 배지내의 방사능 카운트를 유출배지와 세포 분획의 방사능 카운트의 합으로 나누어 줌으로써 결정된다. 지적하지 않는 한, EMEM/BSA 배지는 블랭크로 사용되고 블랭크로부터의 결과는 인지질 수용체의 존재하에서 수득된 방사능으부터 빼 준다.The% efflux is determined by dividing the radioactivity count in the effluent medium by the sum of the radioactivity counts of the effluent medium and the cell fraction. Unless indicated, EMEM / BSA medium is used as a blank and the results from the blank are subtracted from the radioactivity obtained in the presence of phospholipid receptors.

도 5에서의 결과는 다양한 아포지방단백질 A-I, A-Ⅱ, A-Ⅳ, C-I, C-Ⅱ, C-Ⅲ, E3의 첨가는 ABC1 형질감염된 세포에서의 콜레스테롤 유출을 현저히 증가시킴을 명확히 증명하며, 그러므로 본 발명에 따른 완전 길이 ABC1 단백질은 다양한 아포지방단백질 A-I, A-Ⅱ, A-Ⅳ, C-I, C-Ⅱ, C-Ⅲ, E3에 의해 매개되는 인지질 유출에 관여되어 있음을 보인다.The results in FIG. 5 clearly demonstrate that addition of various apolipoproteins AI, A-II, A-IV, CI, C-II, C-III, E 3 significantly increases cholesterol outflow in ABC1 transfected cells. Therefore, the full-length ABC1 protein according to the present invention is shown to be involved in phospholipid efflux mediated by various apolipoproteins AI, A-II, A-IV, CI, C-II, C-III, E 3 .

Ⅳ. 지방단백질, 아포지방단백질 소포 제조Ⅳ. Lipoprotein, Apofatty Protein Vesicle Manufacture

HDL(d=1.063-1.021 g/㎖)는 Shumaker 등이 서술한 바와 같이 밀도 구배 초원심분리를 통해 인간 혈장으로부터 분리가능하다.HDL (d = 1.063-1.021 g / ml) is separable from human plasma via density gradient ultracentrifugation as described by Shumaker et al.

아포지방단백질은 Brewer 등(1986)이 기술한 바대로 칼럼 크로마토그래피를 통해 인간 혈장으로부터 정제가능하며 99% 순도를 결정하기 위해 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 아미노 말단 서열분석을 통해 측정할 수 있다. 비가 1;2.5(W:W)인 포스파티딜콜린 소포와 난황 포스파티딜콜린의 apo-I 재구성은 초음파처리에 의해 수행된다(이전에 Jonas et al.,(1986)이 기술).Apofatty proteins are purified from human plasma by column chromatography as described by Brewer et al. (1986) and can be measured via SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and amino terminal sequencing to determine 99% purity. have. Apo-I reconstitution of phosphatidylcholine vesicles and egg yolk phosphatidylcholine with a ratio of 1: 2.5 (W: W) is performed by sonication (previously described by Jonas et al. (1986)).

도 6에서의 결과는 apo-I과 HDL이 각각 전부 및 부분적으로 ABC1으로 형질감염된 세포내에서의 콜레스테롤 유출을 매개함을 보여준다. 또한, apoA-I는 ABC1 형질감염된 세포에서의 인지질의 유출도 매개함을 알 수 있다. 그러나 포스파티딜콜린(pc)은 ABC1 형질감염된 세포내에서의 콜레스테롤 유출을 매개하지 않는다.The results in FIG. 6 show that apo-I and HDL mediate cholesterol outflow in cells transfected with ABC1 in whole and in part, respectively. It can also be seen that apoA-I also mediates the outflow of phospholipids from ABC1 transfected cells. However, phosphatidylcholine (pc) does not mediate cholesterol outflow in ABC1 transfected cells.

V- ABC1과 ApoA-I 및 ApoA-II 결합Combined ApoA-I and ApoA-II with V-ABC1

ApoA-I을 아이오다이드 모노클로라이드법에 의해 동위원소125아이오다이드로 요오드 처리하여 2 X 106 cpm/㎍의 특이 활성이 되게 한다. 24-웰 플레이트에서 생장시킨 유착성 섬유아세포를 HDL로부터 분리한 50배 과량의 아포지방단백질 A-I 및 A-II 분획의 존재하에 및 부재하에 37℃에서 3시간 동안 요오드 처리된 apoA-I과 배양한다. 세포를 4℃에서 EMEM/BSA로 3회 신속히 세척한다. 0.1 M NaOH 및 0.1% SDS로 세포 분획을 용해시킨 후, 결합된 요오드 처리 리간드를 감마 카운팅으로 측정한다.ApoA-I was iodine treated with isotope 125 iodide by iodide monochloride to give specific activity of 2 × 10 6 cpm / μg. Adherent fibroblasts grown in 24-well plates are incubated with iodine treated apoA-I for 3 hours at 37 ° C. in the presence and absence of 50-fold excess of apolipoprotein AI and A-II fractions isolated from HDL. . The cells are washed three times rapidly with EMEM / BSA at 4 ° C. After lysis of the cell fractions with 0.1 M NaOH and 0.1% SDS, bound iodine treated ligands are determined by gamma counting.

참조문헌Reference

본 발명은 본원에 기재된 특정 양태에 의해 범위가 제한되지는 않는다. 사실, 본원에 기재된 것들 외에 본 발명의 다양한 변형이 전술한 명세서와 첨부 도면으로부터 당업자에 자명해질 것이다. 이러한 변형도 첨부 특허청구의 범위 안에 들어온다.The present invention is not to be limited in scope by the specific embodiments described herein. Indeed, various modifications of the invention in addition to those described herein will become apparent to those skilled in the art from the foregoing specification and the accompanying drawings. Such modifications also fall within the scope of the appended claims.

다양한 간행물이 본원에 인용되며, 이들의 게재내용은 전부 참조로 인용된다.Various publications are cited herein, the disclosures of which are incorporated by reference in their entirety.

Claims (111)

서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산.An isolated nucleic acid comprising any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a complementary polynucleotide sequence. a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산.a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; Or g) nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or at least 8 consecutive nucleotides of the polynucleotide sequence of the complementary polynucleotide sequence. a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 포함하는 분리된 핵산.a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; Or g) an isolated nucleic acid comprising at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid comprising nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a complementary polynucleotide sequence. 제 3 항에 있어서, 핵산이The method of claim 3 wherein the nucleic acid is a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 85%, 90%, 95%, 또는 98% 뉴클레오타이드 동일성을 포함하는 분리된 핵산.a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; Or g) an isolated nucleic acid comprising 85%, 90%, 95%, or 98% nucleotide identity with a nucleic acid comprising the nucleotides 1-242, or the complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 53. a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 고엄격 조건하에서 하이브리드화하는 분리된 핵산.a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; Or g) an isolated nucleic acid which hybridizes under high stringency conditions with a nucleic acid comprising nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a complementary polynucleotide sequence. 서열번호 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, 및 137 중 임의 하나로 표시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산.An isolated nucleic acid comprising a polynucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 4-65, 68-70, 72-88, 103, 109-118, and 137, or a complementary polynucleotide sequence. 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산.An isolated nucleic acid comprising the nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or the nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or the complementary polynucleotide sequence. 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산.An isolated nucleic acid comprising nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or at least eight consecutive nucleotides of the complementary polynucleotide sequence. 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 포함하는 분리된 핵산.An isolated nucleic acid comprising at least 80% nucleotide identity with nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or complementary polynucleotide sequences. 제 9 항에 있어서, 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열과 85%, 90%, 95%, 또는 98% 뉴클레오타이드 동일성을 포함하는 분리된 핵산.The isolated nucleic acid of claim 9, wherein the nucleic acid comprises 85%, 90%, 95%, or 98% nucleotide identity with the nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or the complementary polynucleotide sequence. . 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열과 고엄격 조건하에서 하이브리드화하는 분리된 핵산.An isolated nucleic acid that hybridizes under strict conditions with nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or complementary polynucleotide sequences. 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머가 a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, ABC1 유전자에 특이적인 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머.A nucleotide probe or primer may comprise a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; Or g) a nucleotide probe or primer specific for the ABC1 gene comprising nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or at least 15 consecutive nucleotides of the polynucleotide sequence of the complementary polynucleotide sequence. 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머가 서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, ABC1 유전자에 특이적인 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머.A nucleotide probe or primer specific for the ABC1 gene, wherein the nucleotide probe or primer comprises nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or at least 15 consecutive nucleotides of the complementary polynucleotide sequence. 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머가 서열번호 119-136, 138, 및 141-152 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, ABC1 유전자에 특이적인 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머.A nucleotide probe or primer specific for the ABC1 gene, wherein the nucleotide probe or primer comprises any one of SEQ ID NOs: 119-136, 138, and 141-152, or a complementary polynucleotide sequence. a)핵산을 증폭반응에 필요한 시약의 존재하에, 제 1 뉴클레오타이드 프라이머가 핵산 영역의 위치 5′에서 하이브리드화하고, 제 2 뉴클레오타이드 프라이머가 핵산 영역의 위치 3′에서 하이브리드화하는 두 뉴클레오타이드 프라이머와 접촉시킨 다음;a) in the presence of the reagents required for the amplification reaction, the first nucleotide primer hybridizes at position 5 'of the nucleic acid region and the second nucleotide primer is contacted with two nucleotide primers which hybridize at position 3' of the nucleic acid region. next; b)증폭된 핵산 영역을 검출하는 단계를 포함하는, 제 1 항에 따른 핵산 영역의 증폭방법.b) A method for amplifying a nucleic acid region according to claim 1, comprising detecting the amplified nucleic acid region. 제 15 항에 있어서, 두 뉴클레오타이드 프라이머가The method of claim 15, wherein the two nucleotide primers are A)a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 프라이머,A) a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; Or g) a nucleotide primer comprising at least 15 contiguous nucleotides of the nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or the polynucleotide sequence of the complementary polynucleotide sequence, B)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 프라이머, 또는 상보 서열을 갖는 핵산, 및B) a nucleotide primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of nucleotides 1-244 of SEQ ID NO: 69 or nucleotides 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a nucleic acid having a complementary sequence, and C)서열번호 119-136, 138, 및 141-152 중 임의 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 프라이머, 또는 상보 서열을 갖는 핵산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 영역의 증폭방법.C) A method for amplifying a nucleic acid region selected from the group consisting of nucleotide primers comprising a polynucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 119-136, 138, and 141-152, or a nucleic acid having a complementary sequence. a)하이브리드화 위치가 핵산 영역의 5′사이드와 3′사이드 각각에 위치되는 두 뉴클레오타이드 프라이머,a) two nucleotide primers whose hybridization sites are located on the 5 'and 3' sides of the nucleic acid region, respectively, b)증폭반응에 필요한 시약을 포함하는, 제 1 항에 따른 핵산의 증폭키트.b) An amplification kit of nucleic acid according to claim 1, which contains a reagent for amplification reaction. 제 17 항에 있어서, 두 뉴클레오타이드 프라이머가18. The method of claim 17, wherein the two nucleotide primers are A)a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 프라이머,A) a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; Or g) a nucleotide primer comprising at least 15 contiguous nucleotides of the nucleotides 1-242 of SEQ ID NO: 53, or the polynucleotide sequence of the complementary polynucleotide sequence, B)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 프라이머, 및B) a nucleotide primer comprising at least 15 contiguous nucleotides comprising a nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or a nucleotide 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence, and C)서열번호 119-136, 138, 및 141-152 중 임의 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 프라이머로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 키트.C) a kit selected from the group consisting of a polynucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 119-136, 138, and 141-152, or a nucleotide primer comprising a complementary polynucleotide sequence. 제 12 항에 있어서, 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머가 마커 화합물을 포함하는 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머.13. The nucleotide probe or primer of claim 12, wherein the nucleotide probe or primer comprises a marker compound. 제 13 항에 있어서, 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머가 마커 화합물을 포함하는 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머.The nucleotide probe or primer of claim 13, wherein the nucleotide probe or primer comprises a marker compound. 제 14 항에 있어서, 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머가 마커 화합물을 포함하는 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머.The nucleotide probe or primer of claim 14, wherein the nucleotide probe or primer comprises a marker compound. A) 1) a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 탐침,A) 1) a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; Or g) a nucleotide probe comprising at least 15 consecutive nucleotides of nucleotide 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a polynucleotide sequence of complementary polynucleotide sequence, 2)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 프라이머, 및2) a nucleotide primer comprising at least 15 nucleotides of nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence, and 3)서열번호 119-136, 138, 및 141-152 중 임의 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 탐침으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 뉴클레오타이드 탐침과 핵산을 접촉시킨 다음,3) contacting the nucleic acid with a nucleotide probe selected from the group consisting of a polynucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 119-136, 138, and 141-152, or a nucleotide probe comprising a complementary polynucleotide sequence, B)핵산과 탐침간에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 제 1 항에따른 핵산의 검출방법.B) A method for detecting a nucleic acid according to claim 1, comprising detecting the complex formed between the nucleic acid and the probe. 제 22 항에 있어서, 탐침이 지지체상에 고정화되는 검출방법.The method of claim 22, wherein the probe is immobilized on a support. A) 1) a)서열번호 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, 및 137 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; b)서열번호 9의 뉴클레오타이드 3154-3200 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; c)서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-242 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; d)서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-1851; 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; e)서열번호 27의 뉴클레오타이드 152-198, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; f)서열번호 36의 뉴클레오타이드 1-1657, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 g)서열번호 53의 뉴클레오타이드 1-242, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 탐침,A) 1) a) any one of SEQ ID NOs: 1, 4-8, 11-16, 18-26, 28-35, 37-52, 54-65, 68, and 137, or a complementary polynucleotide sequence; b) the nucleotide 3154-3200 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; c) nucleotides 1-242 or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; d) nucleotides 1-1851 of SEQ ID NO: 17; Or complementary polynucleotide sequences; e) nucleotide 152-198, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; f) the nucleotide 1-1657, or complementary polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36; Or g) a nucleotide probe comprising at least 15 consecutive nucleotides of nucleotide 1-242 of SEQ ID NO: 53, or a polynucleotide sequence of complementary polynucleotide sequence, 2)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-244 또는 서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-357, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 프라이머, 및2) a nucleotide primer comprising at least 15 nucleotides of nucleotide 1-244 of SEQ ID NO: 69 or 1-357 of SEQ ID NO: 70, or a complementary polynucleotide sequence, and 3)서열번호 119-136, 138, 및 141-152 중 임의 하나, 또는 상보 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 탐침으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 뉴클레오타이드 탐침, 및 임의로3) a nucleotide probe selected from the group consisting of any one of SEQ ID NOs: 119-136, 138, and 141-152, or a nucleotide probe comprising a complementary polynucleotide sequence, and optionally B)하이브리드화 반응에 필요한 시약을 포함하는, 제 1 항에 따른 핵산의 검출 키트.B) A kit for detecting a nucleic acid according to claim 1, which comprises a reagent necessary for a hybridization reaction. 제 24 항에 있어서, 탐침이 지지체상에 고정화되는 키트.The kit of claim 24, wherein the probe is immobilized on a support. 제 1 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터.A recombinant vector comprising the nucleic acid according to claim 1. 제 26 항에 있어서, 벡터가 아데노바이러스인 벡터.27. The vector of claim 26, wherein the vector is adenovirus. 제 6 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터.A recombinant vector comprising the nucleic acid according to claim 6. 제 28 항에 있어서, 벡터가 아데노바이러스인 벡터.29. The vector of claim 28, wherein the vector is adenovirus. 제 7 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터.Recombinant vector comprising a nucleic acid according to claim 7. 제 30 항에 있어서, 벡터가 아데노바이러스인 벡터.31. The vector of claim 30, wherein the vector is adenovirus. 제 1 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포.Recombinant host cell comprising the nucleic acid according to claim 1. 제 26 항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포.A recombinant host cell comprising the recombinant vector of claim 26. 제 6 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포.Recombinant host cell comprising the nucleic acid according to claim 6. 제 28 항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포.A recombinant host cell comprising the recombinant vector according to claim 28. 제 7 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포.Recombinant host cell comprising the nucleic acid according to claim 7. 제 30 항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포.A recombinant host cell comprising the recombinant vector according to claim 30. 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산.An isolated nucleic acid encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID 71. 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산.An isolated nucleic acid encoding a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71. 제 38 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터.A recombinant vector comprising the nucleic acid according to claim 38. 제 39 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터.A recombinant vector comprising the nucleic acid according to claim 39. 제 38 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포.A recombinant host cell comprising the nucleic acid according to claim 38. 제 39 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포.A recombinant host cell comprising the nucleic acid according to claim 39. 제 40 항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포.A recombinant host cell comprising the recombinant vector according to claim 40. 제 41 항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포.A recombinant host cell comprising the recombinant vector according to claim 41. a)서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,a) a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 71 and 89-102, b)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드,b) a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, c)서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 단편 또는 변이체(여기에서, 폴리펩타이드 단편 또는 변이체는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함한다), 및c) polypeptide fragments or variants of the polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 71 and 89-102, wherein the polypeptide fragments or variants comprise amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71, and d)서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드에 상동한 폴리펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 분리된 폴리펩타이드.d) an isolated polypeptide selected from the group consisting of polypeptides homologous to a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71. 제 46 항에 따른 분리된 폴리펩타이드에 대한 항체.An antibody against an isolated polypeptide according to claim 46. 제 47 항에 있어서, 항체가 검출 가능한 화합물을 포함하는 항체.48. The antibody of claim 47, wherein the antibody comprises a detectable compound. a)폴리펩타이드를 제 47 항에 따른 항체와 접촉시킨 다음;a) contacting the polypeptide with an antibody according to claim 47; b)폴리펩타이드와 항체간에 형성된 항원/항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드의 검출방법.b) detecting the antigen / antibody complex formed between the polypeptide and the antibody. a)제 47 항에 따른 항체; 및a) the antibody according to claim 47; And b)폴리펩타이드와 항체간에 형성된 항원/항체 복합체의 검출을 허용하는 시약을 포함하는, 폴리펩타이드 검출용 진단 키트.b) A diagnostic kit for detecting a polypeptide, comprising a reagent allowing detection of an antigen / antibody complex formed between the polypeptide and an antibody. 제 1 항에 따른 핵산 및 생리학적으로 적합한 부형제를 포함하는 약학 조성물.A pharmaceutical composition comprising the nucleic acid according to claim 1 and a physiologically suitable excipient. 제 6 항에 따른 핵산 및 생리학적으로 적합한 부형제를 포함하는 약학 조성물.A pharmaceutical composition comprising the nucleic acid according to claim 6 and a physiologically suitable excipient. 제 7 항에 따른 핵산 및 생리학적으로 적합한 부형제를 포함하는 약학 조성물.A pharmaceutical composition comprising the nucleic acid according to claim 7 and a physiologically suitable excipient. 제 38 항에 따른 핵산 및 생리학적으로 적합한 부형제를 포함하는 약학 조성물.A pharmaceutical composition comprising the nucleic acid according to claim 38 and a physiologically suitable excipient. 제 39 항에 따른 핵산 및 생리학적으로 적합한 부형제를 포함하는 약학 조성물.A pharmaceutical composition comprising the nucleic acid according to claim 39 and a physiologically suitable excipient. 제 26 항에 따른 재조합 벡터 및 생리학적으로 적합한 부형제를 포함하는 약학 조성물.A pharmaceutical composition comprising the recombinant vector according to claim 26 and a physiologically suitable excipient. 제 28 항에 따른 재조합 벡터 및 생리학적으로 적합한 부형제를 포함하는 약학 조성물.A pharmaceutical composition comprising the recombinant vector according to claim 28 and a physiologically suitable excipient. 제 30 항에 따른 재조합 벡터 및 생리학적으로 적합한 부형제를 포함하는 약학 조성물.A pharmaceutical composition comprising the recombinant vector according to claim 30 and a physiologically suitable excipient. 제 40 항에 따른 재조합 벡터 및 생리학적으로 적합한 부형제를 포함하는 약학 조성물.A pharmaceutical composition comprising the recombinant vector according to claim 40 and a physiologically suitable excipient. 제 41 항에 따른 재조합 벡터 및 생리학적으로 적합한 부형제를 포함하는 약학 조성물.A pharmaceutical composition comprising the recombinant vector according to claim 41 and a physiologically suitable excipient. 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증 예방 또는 좀더 구체적으로 콜레스테롤역수송 기능장애에 걸린 피검자 치료용 약제의 제조를 위한 제 1 항에 따른 핵산의 용도.Use of the nucleic acid according to claim 1 for the preparation of a medicament for the prevention of various forms of atherosclerosis or more specifically for treating a subject suffering from cholesterol reverse transport dysfunction. 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증 예방 또는 좀더 구체적으로 콜레스테롤 역수송 기능장애에 걸린 피검자 치료용 약제의 제조를 위한 제 6 항에 따른 핵산의 용도.Use of the nucleic acid according to claim 6 for the preparation of a medicament for the prevention of various forms of atherosclerosis or more specifically for treating a subject suffering from cholesterol reverse transport dysfunction. 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증 예방 또는 좀더 구체적으로 콜레스테롤 역수송 기능장애에 걸린 피검자 치료용 약제의 제조를 위한 제 7 항에 따른 핵산의 용도.Use of a nucleic acid according to claim 7 for the preparation of a medicament for the prevention of various forms of atherosclerosis or more specifically for treating a subject suffering from cholesterol reverse transport dysfunction. 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증 예방 또는 좀더 구체적으로 콜레스테롤 역수송 기능장애에 걸린 피검자 치료용 약제의 제조를 위한 제 38 항에 따른 핵산의 용도.Use of a nucleic acid according to claim 38 for the preparation of a medicament for the prevention of various forms of atherosclerosis or more specifically for treating a subject suffering from cholesterol reverse transport dysfunction. 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증 예방 또는 좀더 구체적으로 콜레스테롤 역수송 기능장애에 걸린 피검자 치료용 약제의 제조를 위한 제 39 항에 따른 핵산의 용도.Use of the nucleic acid according to claim 39 for the preparation of a medicament for the prevention of various forms of atherosclerosis or more specifically for treating a subject suffering from cholesterol reverse transport dysfunction. 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증 예방 또는 좀더 구체적으로 콜레스테롤역수송 기능장애에 걸린 피검자 치료용 약제의 제조를 위한 제 26 항에 따른 재조합 벡터의 용도.Use of the recombinant vector according to claim 26 for the preparation of a medicament for the prevention of various forms of atherosclerosis or more specifically for treating a subject suffering from cholesterol reverse transport dysfunction. 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증 예방 또는 좀더 구체적으로 콜레스테롤 역수송 기능장애에 걸린 피검자 치료용 약제의 제조를 위한 제 28 항에 따른 재조합 벡터의 용도.Use of the recombinant vector according to claim 28 for the preparation of a medicament for the prevention of various forms of atherosclerosis or more specifically for treating a subject suffering from cholesterol reverse transport dysfunction. 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증 예방 또는 좀더 구체적으로 콜레스테롤 역수송 기능장애에 걸린 피검자 치료용 약제의 제조를 위한 제 30 항에 따른 재조합 벡터의 용도.Use of the recombinant vector according to claim 30 for the preparation of a medicament for the prevention of various forms of atherosclerosis or more specifically for the treatment of a subject with cholesterol reverse transport dysfunction. 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증 예방 또는 좀더 구체적으로 콜레스테롤 역수송 기능장애에 걸린 피검자 치료용 약제의 제조를 위한 제 40 항에 따른 재조합 벡터의 용도.Use of the recombinant vector according to claim 40 for the preparation of a medicament for the prevention of various forms of atherosclerosis or more specifically for treating a subject suffering from cholesterol reverse transport dysfunction. 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증 예방 또는 좀더 구체적으로 콜레스테롤 역수송 기능장애에 걸린 피검자 치료용 약제의 제조를 위한 제 41 항에 따른 재조합 벡터의 용도.Use of the recombinant vector according to claim 41 for the preparation of a medicament for the prevention of various forms of atherosclerosis or more specifically for treating a subject suffering from cholesterol reverse transport dysfunction. 다양한 형태의 아테롬성동맥경화증 예방 또는 좀더 구체적으로 콜레스테롤역수송 기능장애에 걸린 피검자 치료용 약제의 제조를 위한 서열번호 71의 아미노산 서열 또는 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 분리된 ABC1 폴리펩타이드의 용도.Use of an isolated ABC1 polypeptide comprising amino acid sequence of SEQ ID NO: 71 or amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71 for the manufacture of a medicament for the prevention of various forms of atherosclerosis or more specifically for treating a subject suffering from cholesterol reverse transport dysfunction . 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 생리학적으로 적합한 부형제를 포함하는 약학 조성물.A pharmaceutical composition comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71 and a physiologically suitable excipient. 서열번호 71의 아미노산 1-60을 포함하는 폴리펩타이드 및 생리학적으로 적합한 부형제를 포함하는 약학 조성물.A pharmaceutical composition comprising a polypeptide comprising amino acids 1-60 of SEQ ID NO: 71 and a physiologically suitable excipient. 서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 생리학적으로 적합한 부형제를 포함하는 약학 조성물.A pharmaceutical composition comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 71 and 89-102, and a physiologically suitable excipient. 콜레스테롤 역수송 기능장애에 연유하는 질환의 예방 또는 치료용 활성성분 스크리닝을 위한 서열번호 71 및 89-102 중 임의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 ABC1 폴리펩타이드의 용도.Use of an isolated ABC1 polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 71 and 89-102 for the screening of the active ingredient for the prevention or treatment of diseases resulting from cholesterol reverse transport dysfunction. 콜레스테롤 역수송 기능장애에 연유하는 질환의 예방 또는 치료용 활성성분 스크리닝을 위한 서열번호 71 및 89-102의 아미노산 서열을 포함하는 ABC1 폴리펩타이드 발현 재조합 숙주세포의 용도.Use of an ABC1 polypeptide expressing recombinant host cell comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 71 and 89-102 for screening for active ingredients for the prevention or treatment of diseases resulting from cholesterol reverse transport dysfunction. a)ABC1 폴리펩타이드 및 검출 가능한 마커를 포함하는 지질 기질을 포함하는 막 소포를 제조하고;a) preparing a membrane vesicle comprising a lipid substrate comprising an ABC1 polypeptide and a detectable marker; b)단계 a)에서 수득한 소포를 효능제 또는 길항제 후보 화합물과 배양하며;b) incubating the vesicle obtained in step a) with an agonist or antagonist candidate compound; c)검출 가능한 마커를 포함하는 지질 기질의 방출을 정성적으로 및/또는 정량적으로 측정한 다음;c) qualitatively and / or quantitatively measuring release of a lipid substrate comprising a detectable marker; d)효능제 또는 길항제 후보 화합물과 사전에 배양하지 않은 막 소포에 의한 표지 지질 기질의 방출 측정과 단계 b)에서 측정한 지질 기질의 방출을 비교하는 단계를 포함하는, 콜레스테롤 대사에 활성을 띠는 화합물, ABC1 폴리펩타이드의 효능제, 또는 길항제의 스크리닝 방법.d) comparing the release of the labeled lipid substrate by the membrane vesicles not previously cultured with the agonist or antagonist candidate compound and the release of the lipid substrate as measured in step b). A method of screening for a compound, an agonist of ABC1 polypeptide, or an antagonist. a)ABC1 폴리펩타이드 발현 세포를 검출 가능한 마커로 표지된 음이온과 배양 하고;a) incubating ABC1 polypeptide expressing cells with an anion labeled with a detectable marker; b)단계 a)의 세포를 세척하여 세포 중으로 침투하지 않은 과량의 표지 음이온을 제거하며;b) washing the cells of step a) to remove excess labeled anions that did not penetrate into the cells; c)단계 b)에서 수득한 세포를 ABC1 폴리펩타이드에 대한 효능제 또는 길항제 후보 화합물과 배양하며;c) incubating the cells obtained in step b) with an agonist or antagonist candidate compound for ABC1 polypeptide; d)세포로부터 표지 음이온의 유출을 측정한 다음;d) measuring the outflow of the labeled anion from the cell; e)효능제 또는 길항제 후보 화합물과 사전에 배양하지 않은 세포로 측정한 표지 음이온의 유출과 단계 d)에서 측정된 표지 음이온의 유출을 비교하는 단계를포함하는, 콜레스테롤 대사에 활성을 띠는 화합물, ABC1 폴리펩타이드의 효능제 또는 길항제를 스크리닝하는 방법.e) a compound that is active in cholesterol metabolism, comprising comparing the outflow of the labeling anion as measured by cells that have not been previously cultured with the agonist or antagonist candidate compound and the outflow of the labeling anion as measured in step d), A method of screening agonists or antagonists of ABC1 polypeptide. a)인간 단핵구 세포 계통의 세포를 적당한 배양 배지에서 정제된 인간 알부민과 배양하고;a) culturing cells of human monocyte lineage with purified human albumin in a suitable culture medium; b)IL-1 베타의 생성을 자극하는 화합물 및 효능제 또는 길항제 후보 화합물과 동시에 단계 a)의 세포를 배양하며;b) culturing the cells of step a) simultaneously with a compound that stimulates production of IL-1 beta and an agonist or antagonist candidate compound; c)단계 b)에서 수득한 세포를 적정 농도의 ATP와 배양하며;c) incubating the cells obtained in step b) with an appropriate concentration of ATP; d)단계 c)에서 수득된 세포에 의해 세포 배양 상등액 중으로 방출된 IL-1 베타를 측정한 다음;d) measuring IL-1 beta released into the cell culture supernatant by the cells obtained in step c); e)효능제 또는 길항제 후보 화합물과 사전에 배양하지 않은 세포의 배양 상등액 중으로 방출된 IL-1 베타와 단계 d)에서 수득한 방출된 IL-1 베타를 비교하는 단계를 포함하는, 콜레스테롤 대사에 활성을 띠는 화합물, ABC1 폴리펩타이드의 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법.e) activating cholesterol metabolism comprising comparing the agonist or antagonist candidate compound with IL-1 beta released into the culture supernatant of cells not previously cultured with the released IL-1 beta obtained in step d). To screen a compound, agonist or antagonist of ABC1 polypeptide. 제 32 항에 따른 재조합 숙주세포를 포함하는 이식편.A graft comprising the recombinant host cell of claim 32. 제 34 항에 따른 재조합 숙주세포를 포함하는 이식편.Graft comprising a recombinant host cell according to claim 34. 제 36 항에 따른 재조합 숙주세포를 포함하는 이식편.A graft comprising the recombinant host cell of claim 36. a)서열번호 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, 및 70, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 1의 뉴클레오타이드 1-387, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 1의 뉴클레오타이드 11498-11754, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, d)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-110, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, e)서열번호 69의 뉴클레오타이드 7971-9741, f)서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-223, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, g)서열번호 70의 뉴클레오타이드 8084-9854, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, h)서열번호 40의 뉴클레오타이드 696-951, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, i)서열번호 36의 뉴클레오타이드 296-2894, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, 및 j)서열번호 17의 뉴클레오타이드 490-5352, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열 중 임의 하나를 포함하는 분리된 핵산.a) SEQ ID NOs: 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, and 70, or complementary nucleotide sequences thereof, b) nucleotides 1-387 of SEQ ID NO: 1, or their complementary nucleotide sequences, c) of SEQ ID NO: 1 Nucleotide 11498-11754, or its complementary nucleotide sequence, d) nucleotides 1-110 of SEQ ID NO: 69, or its complementary nucleotide sequence, e) nucleotides 7971-9741 of SEQ ID NO: 69, f) nucleotides 1-223, SEQ ID NO: 70, Or its complementary nucleotide sequence, g) the nucleotide 8084-9854 of SEQ ID NO: 70, or its complementary nucleotide sequence, h) the nucleotide 696-951 of SEQ ID NO: 40, or its complementary nucleotide sequence, i) the nucleotide 296-2894 of SEQ ID NO: 36 , Or its complementary nucleotide sequence, and j) the nucleotide 490-5352 of SEQ ID NO: 17, or any complementary nucleotide sequence thereof An isolated nucleic acid comprising. a)서열번호 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, 및 70 중 임의 하나, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 1의 뉴클레오타이드 1-387, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 1의 뉴클레오타이드 11498-11754, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, d)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-110, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, e)서열번호 69의 뉴클레오타이드 7971-9741, f)서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-223, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, g)서열번호 70의 뉴클레오타이드 8084-9854, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, h)서열번호 40의뉴클레오타이드 696-951, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, i)서열번호 36의 뉴클레오타이드 296-2894, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, 및 j)서열번호 17의 뉴클레오타이드 490-5352, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 8개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산.a) any one of SEQ ID NOs: 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, and 70, or a complementary nucleotide sequence thereof, b) nucleotides 1-387 of SEQ ID NO: 1, or a complementary nucleotide sequence thereof, c) sequence Nucleotide 11498-11754 of No. 1, or its complementary nucleotide sequence, d) nucleotide 1-110 of SEQ ID NO: 69, or its complementary nucleotide sequence, e) nucleotide 7971-9741 of SEQ ID NO: 69, f) nucleotide 1 of SEQ ID NO: 70 -223, or its complementary nucleotide sequence, g) the nucleotide 8084-9854 of SEQ ID NO: 70, or its complementary nucleotide sequence, h) the nucleotides 696-951 of SEQ ID NO: 40, or its complementary nucleotide sequence, i) the nucleotide of SEQ ID NO: 36 296-2894, or its complementary nucleotide sequence, and j) the nucleotide 490-5352 of SEQ ID NO: 17, or its complementary nucleotide sequence An isolated nucleic acid comprising at least 8 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence. a)서열번호 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, 및 70 중 임의 하나, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 1의 뉴클레오타이드 1-387, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 1의 뉴클레오타이드 11498-11754, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, d)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-110, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, e)서열번호 69의 뉴클레오타이드 7971-9741, f)서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-223, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, g)서열번호 70의 뉴클레오타이드 8084-9854, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, h)서열번호 40의 뉴클레오타이드 696-951, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, i)서열번호 36의 뉴클레오타이드 296-2894, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, 및 j)서열번호 17의 뉴클레오타이드 490-5352, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 포함하는 분리된 핵산.a) any one of SEQ ID NOs: 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, and 70, or a complementary nucleotide sequence thereof, b) nucleotides 1-387 of SEQ ID NO: 1, or a complementary nucleotide sequence thereof, c) sequence Nucleotide 11498-11754 of No. 1, or its complementary nucleotide sequence, d) nucleotide 1-110 of SEQ ID NO: 69, or its complementary nucleotide sequence, e) nucleotide 7971-9741 of SEQ ID NO: 69, f) nucleotide 1 of SEQ ID NO: 70 -223, or its complementary nucleotide sequence, g) the nucleotide 8084-9854 of SEQ ID NO: 70, or its complementary nucleotide sequence, h) the nucleotide 696-951 of SEQ ID NO: 40, or its complementary nucleotide sequence, i) the nucleotide of SEQ ID NO: 36 296-2894, or its complementary nucleotide sequence, and j) the nucleotide 490-5352 of SEQ ID NO: 17, or its complementary nucleotide sequence Nucleic acid comprising the isolated nucleic acid comprising at least 80% nucleotide identity. 제 85 항에 있어서, 핵산이 a)서열번호 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, 및 70 중 임의 하나, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 1의 뉴클레오타이드 1-387, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 1의 뉴클레오타이드11498-11754, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, d)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-110, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, e)서열번호 69의 뉴클레오타이드 7971-9741, f)서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-223, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, g)서열번호 70의 뉴클레오타이드 8084-9854, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, h)서열번호 40의 뉴클레오타이드 696-951, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, i)서열번호 36의 뉴클레오타이드 296-2894, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, 및 j)서열번호 17의 뉴클레오타이드 490-5352, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 85%, 90%, 95%, 또는 98% 뉴클레오타이드 동일성을 포함하는 분리된 핵산.The nucleic acid of claim 85, wherein the nucleic acid is a) any one of SEQ ID NOs: 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, and 70, or a complementary nucleotide sequence thereof, b) nucleotides 1-387 of SEQ ID NO: 1, or Its complementary nucleotide sequence, c) the nucleotide 11498-11754 of SEQ ID NO: 1, or its complementary nucleotide sequence, d) the nucleotide 1-110 of SEQ ID NO: 69, or its complementary nucleotide sequence, e) the nucleotide 7971-9741 of SEQ ID NO: 69, f) nucleotides 1-223 of SEQ ID NO: 70, or its complementary nucleotide sequence, g) nucleotide 8084-9854, or its complementary nucleotide sequence, of SEQ ID NO: 70, h) nucleotides 696-951 of SEQ ID NO: 40, or its complementary nucleotide sequence i) nucleotide 296-2894 of SEQ ID NO: 36, or its complementary nucleotide sequence, and j) nucleotide 490-5352 of SEQ ID NO: 17, or Nucleic acid material containing a nucleotide sequence beams and 85%, 90%, 95%, or an isolated nucleic acid containing a 98% nucleotide identity. a)서열번호 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, 및 70 중 임의 하나, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 1의 뉴클레오타이드 1-387, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 1의 뉴클레오타이드 11498-11754, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, d)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-110, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, e)서열번호 69의 뉴클레오타이드 7971-9741, f)서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-223, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, g)서열번호 70의 뉴클레오타이드 8084-9854, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, h)서열번호 40의 뉴클레오타이드 696-951, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, i)서열번호 36의 뉴클레오타이드 296-2894, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, 및 j)서열번호 17의 뉴클레오타이드 490-5352, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 고엄격 조건하에서 하이브리드화하는 분리된 핵산.a) any one of SEQ ID NOs: 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, and 70, or a complementary nucleotide sequence thereof, b) nucleotides 1-387 of SEQ ID NO: 1, or a complementary nucleotide sequence thereof, c) sequence Nucleotide 11498-11754 of No. 1, or its complementary nucleotide sequence, d) nucleotide 1-110 of SEQ ID NO: 69, or its complementary nucleotide sequence, e) nucleotide 7971-9741 of SEQ ID NO: 69, f) nucleotide 1 of SEQ ID NO: 70 -223, or its complementary nucleotide sequence, g) the nucleotide 8084-9854 of SEQ ID NO: 70, or its complementary nucleotide sequence, h) the nucleotide 696-951 of SEQ ID NO: 40, or its complementary nucleotide sequence, i) the nucleotide of SEQ ID NO: 36 296-2894, or its complementary nucleotide sequence, and j) the nucleotide 490-5352 of SEQ ID NO: 17, or its complementary nucleotide sequence An isolated nucleic acid which hybridizes under high stringency conditions with a nucleic acid comprising. a)서열번호 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, 및 70 중 임의 하나, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 1의 뉴클레오타이드 1-387, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 1의 뉴클레오타이드 11498-11754, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, d)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-110, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, e)서열번호 69의 뉴클레오타이드 7971-9741, f)서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-223, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, g)서열번호 70의 뉴클레오타이드 8084-9854, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, h)서열번호 40의 뉴클레오타이드 696-951, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, i)서열번호 36의 뉴클레오타이드 296-2894, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, 및 j)서열번호 17의 뉴클레오타이드 490-5352, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열로 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산.a) any one of SEQ ID NOs: 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, and 70, or a complementary nucleotide sequence thereof, b) nucleotides 1-387 of SEQ ID NO: 1, or a complementary nucleotide sequence thereof, c) sequence Nucleotide 11498-11754 of No. 1, or its complementary nucleotide sequence, d) nucleotide 1-110 of SEQ ID NO: 69, or its complementary nucleotide sequence, e) nucleotide 7971-9741 of SEQ ID NO: 69, f) nucleotide 1 of SEQ ID NO: 70 -223, or its complementary nucleotide sequence, g) the nucleotide 8084-9854 of SEQ ID NO: 70, or its complementary nucleotide sequence, h) the nucleotide 696-951 of SEQ ID NO: 40, or its complementary nucleotide sequence, i) the nucleotide of SEQ ID NO: 36 296-2894, or its complementary nucleotide sequence, and j) the nucleotide 490-5352 of SEQ ID NO: 17, or its complementary nucleotide sequence An isolated nucleic acid comprising a labeled nucleotide sequence. 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머가 a)서열번호 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, 및 70 중 임의 하나, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 1의 뉴클레오타이드 1-387, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 1의 뉴클레오타이드 11498-11754, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, d)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-110, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, e)서열번호 69의 뉴클레오타이드 7971-9741, f)서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-223, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, g)서열번호 70의 뉴클레오타이드 8084-9854, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, h)서열번호 40의 뉴클레오타이드 696-951, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, i)서열번호 36의 뉴클레오타이드 296-2894, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, 및 j)서열번호 17의 뉴클레오타이드 490-5352, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, ABC1 유전자에 특이적인 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머.The nucleotide probe or primer comprises a) any one of SEQ ID NOs: 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, and 70, or a complementary nucleotide sequence thereof, b) nucleotides 1-387 of SEQ ID NO: 1, or a complementary nucleotide thereof Sequence c) nucleotide 11498-11754 of SEQ ID NO: 1, or its complementary nucleotide sequence, d) nucleotide 1-110 of SEQ ID NO: 69, or its complementary nucleotide sequence, e) nucleotide 7971-9741 of SEQ ID NO: 69, f) Nucleotide 1-223 of No. 70, or its complementary nucleotide sequence, g) nucleotide 8084-9854 of SEQ ID NO: 70, or its complementary nucleotide sequence, h) nucleotide 696-951 of SEQ ID NO: 40, or its complementary nucleotide sequence, i) Nucleotides 296-2894 of SEQ ID NO: 36, or their complementary nucleotide sequences, and j) nucleotides 490-5352 of SEQ ID NO: 17 Or a nucleotide probe or primer specific for ABC1 gene, comprising at least 15 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence of its complementary nucleotide sequence. 제 89 항에 있어서, 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머가 마커 화합물을 포함하는 뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머.90. The nucleotide probe or primer of claim 89, wherein the nucleotide probe or primer comprises a marker compound. a)핵산을 증폭반응에 필요한 시약의 존재하에, 제 1 뉴클레오타이드 프라이머가 핵산 영역의 위치 5′에서 하이브리드화하고, 제 2 뉴클레오타이드 프라이머가 핵산 영역의 위치 3′에서 하이브리드화하는 두 뉴클레오타이드 프라이머와 접촉시킨 다음;a) in the presence of the reagents required for the amplification reaction, the first nucleotide primer hybridizes at position 5 'of the nucleic acid region and the second nucleotide primer is contacted with two nucleotide primers which hybridize at position 3' of the nucleic acid region. next; b)증폭된 핵산 영역을 검출하는 단계를 포함하는, 제 83 항에 따른 핵산 영역의 증폭방법.b) A method for amplifying a nucleic acid region according to claim 83, comprising detecting the amplified nucleic acid region. 제 91 항에 있어서, 두 뉴클레오타이드 프라이머가 a)서열번호 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, 및 70 중 임의 하나, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 1의 뉴클레오타이드 1-387, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 1의 뉴클레오타이드 11498-11754, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, d)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-110, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, e)서열번호 69의 뉴클레오타이드 7971-9741, f)서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-223, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, g)서열번호 70의 뉴클레오타이드 8084-9854, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, h)서열번호 40의 뉴클레오타이드 696-951, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, i)서열번호 36의 뉴클레오타이드 296-2894, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, 및 j)서열번호 17의 뉴클레오타이드 490-5352, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 프라이머로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 영역의 증폭방법.92. The method of claim 91, wherein the two nucleotide primers are a) any one of SEQ ID NOs: 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, and 70, or a complementary nucleotide sequence thereof, b) nucleotides 1-387 of SEQ ID NO: 1 , Or its complementary nucleotide sequence, c) the nucleotide 11498-11754 of SEQ ID NO: 1, or its complementary nucleotide sequence, d) the nucleotide 1-110 of SEQ ID NO: 69, or its complementary nucleotide sequence, e) the nucleotide 7971-SEQ ID NO: 69 9741, f) nucleotides 1-223 of SEQ ID NO: 70, or its complementary nucleotide sequence, g) nucleotide 8084-9854, or its complementary nucleotide sequence, of SEQ ID NO: 70, h) nucleotides 696-951 of SEQ ID NO: 40, or its complement Nucleotide sequence, i) nucleotides 296-2894 of SEQ ID NO: 36, or its complementary nucleotide sequence, and j) nucleotides of SEQ ID NO: 17 A method for amplifying a nucleic acid region selected from the group consisting of nucleotide primers comprising at least 15 contiguous nucleotides of the nucleotide sequence of id 490-5352, or a complementary nucleotide sequence thereof. 키트가Kit a)하이브리드화 위치가 핵산 영역의 5′및 3′에 각각 위치되는 두 뉴클레오타이드 프라이머, 및 임의로a) two nucleotide primers whose hybridization positions are located at 5 'and 3' of the nucleic acid region, respectively, and optionally b)증폭반응에 필요한 시약을 포함하는, 제 83 항에 따른 핵산의 증폭 키트.b) Amplification kit of nucleic acid according to claim 83, comprising a reagent for amplification reaction. 제 93 항에 있어서, 두 뉴클레오타이드 프라이머가 a)서열번호 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, 및 70 중 임의 하나, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 1의 뉴클레오타이드 1-387, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 1의 뉴클레오타이드 11498-11754, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, d)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-110, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, e)서열번호 69의 뉴클레오타이드 7971-9741, f)서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-223, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, g)서열번호 70의 뉴클레오타이드 8084-9854, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, h)서열번호 40의 뉴클레오타이드 696-951, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, i)서열번호 36의 뉴클레오타이드 296-2894, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, 및 j)서열번호 17의 뉴클레오타이드 490-5352, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 프라이머로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 키트.95. The nucleotide of claim 93 wherein the two nucleotide primers are a) any one of SEQ ID NOs: 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, and 70, or a complementary nucleotide sequence thereof, b) nucleotides 1-387 of SEQ ID NO: 1 , Or its complementary nucleotide sequence, c) the nucleotide 11498-11754 of SEQ ID NO: 1, or its complementary nucleotide sequence, d) the nucleotide 1-110 of SEQ ID NO: 69, or its complementary nucleotide sequence, e) the nucleotide 7971-SEQ ID NO: 69 9741, f) nucleotides 1-223 of SEQ ID NO: 70, or its complementary nucleotide sequence, g) nucleotide 8084-9854, or its complementary nucleotide sequence, of SEQ ID NO: 70, h) nucleotides 696-951 of SEQ ID NO: 40, or its complement Nucleotide sequence, i) nucleotides 296-2894 of SEQ ID NO: 36, or its complementary nucleotide sequence, and j) nucleotides of SEQ ID NO: 17 A kit selected from the group consisting of nucleotide primers comprising at least 15 contiguous nucleotides of the nucleotide sequence of id 490-5352, or a complementary nucleotide sequence thereof. A)핵산을 a)서열번호 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, 및 70 중 임의 하나, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 1의 뉴클레오타이드 1-387, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 1의 뉴클레오타이드 11498-11754, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, d)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-110, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, e)서열번호 69의 뉴클레오타이드 7971-9741, f)서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-223, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, g)서열번호 70의 뉴클레오타이드 8084-9854, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, h)서열번호 40의 뉴클레오타이드 696-951, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, i)서열번호 36의 뉴클레오타이드 296-2894, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, 및 j)서열번호 17의 뉴클레오타이드 490-5352, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 탐침으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 탐침과 접촉시킨 다음,A) a nucleic acid is selected from a) any one of SEQ ID NOs: 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, and 70, or its complementary nucleotide sequence, b) the nucleotides 1-387 of SEQ ID NO: 1, or its complementary nucleotide sequence c) nucleotide 11498-11754 of SEQ ID NO: 1, or its complementary nucleotide sequence, d) nucleotide 1-110 of SEQ ID NO: 69, or its complementary nucleotide sequence, e) nucleotide 7971-9741 of SEQ ID NO: 69, f) SEQ ID NO: Nucleotide 1-223 of 70, or its complementary nucleotide sequence, g) nucleotide 8084-9854 of SEQ ID NO: 70, or its complementary nucleotide sequence, h) nucleotide 696-951 of SEQ ID NO: 40, or its complementary nucleotide sequence, i) Nucleotide 296-2894 of SEQ ID NO: 36, or its complementary nucleotide sequence, and j) nucleotide 490-5352 of SEQ ID NO: 17, or its complementary nucleotide thereof Brought into contact with a nucleotide probe selected from the group at least consisting of a nucleotide probe comprising a nucleotide sequence of 15 consecutive nucleotides of the sequence following de, B)핵산과 탐침간에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 제 83 항에 따른 핵산의 검출방법.B) A method for detecting a nucleic acid according to claim 83, comprising detecting a complex formed between a nucleic acid and a probe. 제 95 항에 있어서, 탐침이 지지체상에 고정화되는 검출방법.96. The method of claim 95, wherein the probe is immobilized on a support. 키트가Kit A) a)서열번호 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, 및 70 중 임의 하나, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, b)서열번호 1의 뉴클레오타이드 1-387, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, c)서열번호 1의 뉴클레오타이드 11498-11754, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, d)서열번호 69의 뉴클레오타이드 1-110, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, e)서열번호 69의 뉴클레오타이드 7971-9741, f)서열번호 70의 뉴클레오타이드 1-223, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, g)서열번호 70의 뉴클레오타이드 8084-9854, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, h)서열번호 40의 뉴클레오타이드 696-951, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, i)서열번호 36의 뉴클레오타이드 296-2894, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열, 및 j)서열번호 17의 뉴클레오타이드 490-5352, 또는 이의 상보 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 탐침으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 뉴클레오타이드 탐침, 및 임의로A) a) any one of SEQ ID NOs: 1, 17, 36, 37, 38, 40, 69, and 70, or a complementary nucleotide sequence thereof, b) nucleotides 1-387 of SEQ ID NO: 1, or a complementary nucleotide sequence thereof, c ) Nucleotide 11498-11754 of SEQ ID NO: 1, or its complementary nucleotide sequence, d) nucleotide 1-110 of SEQ ID NO: 69, or its complementary nucleotide sequence, e) nucleotide 7971-9741 of SEQ ID NO: 69, f) of SEQ ID NO: 70 Nucleotides 1-223, or its complementary nucleotide sequence, g) the nucleotide 8084-9854 of SEQ ID NO: 70, or its complementary nucleotide sequence, h) the nucleotide 696-951 of SEQ ID NO: 40, or its complementary nucleotide sequence, i) SEQ ID NO: 36 Nucleotide 296-2894, or its complementary nucleotide sequence, and j) nucleotide 490-5352 of SEQ ID NO: 17, or its complementary nucleotide sequence Oligonucleotide probe is selected from the group of nucleotides, at least consisting of a nucleotide probe comprising 15 contiguous nucleotides of the sequence, and optionally B)하이브리드화 반응에 필요한 시약을 포함하는, 제 83 항에 따른 핵산 검출 키트.B) A nucleic acid detection kit according to claim 83 comprising a reagent required for a hybridization reaction. 제 97 항에 있어서, 탐침이 지지체상에 고정화되는 키트.98. The kit of claim 97, wherein the probe is immobilized on the support. 제 83 항 또는 제 88 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터.89. A recombinant vector comprising the nucleic acid according to claim 83 or 88. 제 99 항에 있어서, 벡터가 아데노바이러스인 벡터.107. The vector of claim 99, wherein the vector is adenovirus. 제 83 항 또는 제 88 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포.89. A recombinant host cell comprising the nucleic acid according to claim 83 or 88. 제 99 항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포.A recombinant host cell comprising the recombinant vector of claim 99. 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열번호 69 또는 70에서 선택된 서열의 분리된 핵산.An isolated nucleic acid of a sequence selected from SEQ ID NO: 69 or 70 encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71. 제 103 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터.A recombinant vector comprising a nucleic acid according to claim 103. 제 103 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포.A recombinant host cell comprising the nucleic acid according to claim 103. 제 104 항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포.A recombinant host cell comprising the recombinant vector of claim 104. 제 83 항, 제 88 항, 및 제 103 항 중 어느 한 항에 따른 핵산과 생리학적으로 적합한 부형제를 포함하는 약학 조성물.98. A pharmaceutical composition comprising the nucleic acid according to any one of claims 83, 88 and 103 and a physiologically suitable excipient. 제 104 항에 따른 재조합 벡터와 생리학적으로 적합한 부형제를 포함하는 약학 조성물.105. A pharmaceutical composition comprising a recombinant vector according to claim 104 and a physiologically suitable excipient. 다양한 형태의 동맥경화증의 예방 또는 좀더 구체적으로는 콜레스테롤 역수송 기능장애에 걸린 피검자의 치료용 약제의 제조를 위한 제 83 항, 제 88 항, 및 제 103 항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 용도.Use of the nucleic acid according to any one of claims 83, 88 and 103 for the preparation of various forms of atherosclerosis or more specifically for the treatment of a subject suffering from cholesterol reverse transport dysfunction. 다양한 형태의 동맥경화증의 예방 또는 좀더 구체적으로는 콜레스테롤 역수송 기능장애에 걸린 피검자의 치료용 약제의 제조를 위한 제 104 항에 따른 재조합 벡터의 용도.Use of a recombinant vector according to claim 104 for the prevention of various types of atherosclerosis or more specifically for the preparation of a medicament for the treatment of a subject suffering from cholesterol reverse transport dysfunction. 제 106 항에 따른 재조합 숙주세포를 포함하는 이식편.106. A graft comprising the recombinant host cell of claim 106.
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