KR20020049031A - Techniques and compositions for treating cardiovascular disease by in vivo gene delivery - Google Patents

Abstract

심장 질환 및 말초 혈관 질환을 포함하는 심혈관질환을 가진 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 본원발명의 바람직한 방법은 심장 또는 말초 허혈조직을 공급하는 혈관에 유전자를 함유하는 벡터를 도입함으로써 심근 또는 말초 허혈조직에 의 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 유전자의 생체내 송달을 포함한다.A method of treating a patient with cardiovascular disease, including heart disease and peripheral vascular disease, is provided. A preferred method of the present invention involves in vivo delivery of a gene encoding an angiogenic protein or peptide to myocardial or peripheral ischemic tissue by introducing a vector containing the gene into a blood vessel supplying the heart or peripheral ischemic tissue.

Description

생체내 유전자 송달에 의하여 심혈관 질환을 치료하기 위한 기술 및 조성물{TECHNIQUES AND COMPOSITIONS FOR TREATING CARDIOVASCULAR DISEASE BY IN VIVO GENE DELIVERY}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a technique and a composition for treating cardiovascular diseases by in vivo gene delivery. ≪ Desc / Clms Page number 1 >

미국심장협회 (1995년 통계 부록)에 따르면 미국내에 약 6천만 성인이 심혈관 질환을 앓는 것으로 보고되어 왔다. 심혈관 질환은 한해에 약 100만 건의 사망원인이 되며 이는 모든 사망의 약 40 %를 넘는다. 매년, 미국에서, 간혈적 심근허혈에 따르는 흉통을 특징으로 하는 관상동맥의 일반 상태인 협심증의 새로운 사례가 약 350,000 건 발생한다. 유사하게, 매년 약 400,000명의 환자가 미국에서 가장 빈번한 입원 비-선택 원인이 되는 심장질환의 또 다른 징후인 울혈성 심부전, 즉 "CHF"로 진단된다. 1996년에 725,000명으로 추산되는 인구가 말초혈질환을 앓았으며 그 중 100,000명이 넘는 수가 사지절단이 필요하였다.About 60 million adults in the United States have been reported to have cardiovascular disease according to the American Heart Association (1995 Statistical Annex). Cardiovascular disease accounts for about one million deaths per year, which is about 40% of all deaths. Every year in the United States, about 350,000 new cases of angina, a common condition of the coronary artery characterized by chest pain due to hepatic myocardial ischemia, occur. Similarly, approximately 400,000 patients each year are diagnosed with congestive heart failure, or "CHF," another sign of heart disease, the most frequent inpatient non-selectable cause in the United States. In 1996, an estimated population of 725,000 people suffered from peripheral blood disease, of which more than 100,000 were in need of amputation.

심근허혈은 심근(myocardium)이 적절한 혈공급을 받지 못하여 필수적 수준의 산소와 영양이 결핍되었을 때 발생하는 심기능장애의 한 양태이다. 심근허혈은 다양한 심장질환, 예를 들어 협심증, 심장발작 및/또는 울혈성 심부전의 원인이 될 수 있다. 심근허혈의 가장 일반적 원인은, 심근으로 혈류를 공급하는 혈관인 관상동맥내에 폐색를 일으키는 (관상동맥질환 또는 'CAD'라고도 일컫는) 아테로마성 동맥경화증이다. 심근허혈에 대한 현재의 치료법은 약물치료, 관상동맥 우회로 조성술, 및 풍선 혈관성형술 같은 기술을 사용하는 경피적 재혈관화를 포함한다. 표준적 약물치료는 심근에 혈공급을 증가시키거나 심근의 산소와 영양분 요구량을 감소시키는 것이 관련되는 전략에 기초를 둔다. 예를 들어, 심근에 대한 증가된 혈공급은 칼슘 채널 봉쇄 작용제나 니트로글리세린에 의하여 성취될 수 있다. 이 같은 작용제는 동맥벽 내 민무늬근의 이완을 일으켜 질환의 동맥의 지름을 증가시킨다. 심근의 산소와 영양 요구량 감소는 동맥혈관 확장제 같은 심장의 혈역학적 부하를 감소시키는 작용제나 β-아드레날린성 수용체 아고니스트 같은 주어진 혈역학적 부하에 대한 심장의 수축반응을 감소시키는 작용제에 의하여 성취될 수 있다. 허혈성 심장질환의 수술치료는 일반적으로 전략적으로 위치되는 우회로 이식편 (통상 두렁정맥 또는 내유동맥 이식편)을 가지는 질환의 동맥 단편의 우회로에 기초한다. 경피적 재혈관화는 질환의 관상동맥 내 협착을 감소시키기 위한 카테테르의 사용에 일반적으로 기초한다. 모든 이들 전략은 허혈성 삽화를 감소시키거나 또는 근절하기 위하여 사용되지만 모두 다양한 한계를 지니며, 그 중 몇몇이 하기에서 논의된다.Myocardial ischemia is an aspect of the cardiac dysfunction that occurs when myocardium fails to receive adequate blood supply and is deficient in essential oxygen and nutrients. Myocardial ischemia can cause a variety of cardiac diseases, such as angina, heart attacks and / or congestive heart failure. The most common cause of myocardial ischemia is atherosclerotic atherosclerosis (sometimes referred to as coronary artery disease or 'CAD') that causes occlusion within the coronary artery, a blood vessel that supplies blood flow to the myocardium. Current treatments for myocardial ischemia include percutaneous revascularization using techniques such as drug therapy, coronary artery bypass grafting, and balloon angioplasty. Standard drug therapy is based on strategies involving increasing blood supply to the myocardium or reducing myocardial oxygen and nutrient requirements. For example, increased blood supply to the myocardium can be achieved by calcium channel blockers or nitroglycerin. These agents increase the diameter of the arteries of the disease by causing relaxation of the intramural wall of the intramural wall. Reduced oxygen and nutrient requirements of the myocardium can be achieved by agents that reduce cardiac hemodynamic load, such as arterial vasodilators, or agents that reduce the cardiac contractile response to a given hemodynamic load, such as a-adrenergic receptor agonist . Surgical treatment of ischemic heart disease is based on a bypass of an arterial segment of a disease that generally has a bypass graft located strategically (usually a buccal vein or an iliac artery graft). Percutaneous re-vascularization is generally based on the use of catheters to reduce coronary stenosis of the disease. All these strategies are used to reduce or eliminate ischemic episodes, but all have various limitations, some of which are discussed below.

중증 심근허혈이 심장 발작을 일으키는 많은 환자를 포함하여, 심장 질환을 가진 많은 환자는 울혈성 심부전을 가진 것으로 진단된다. 울혈성 심부전은 대사요구를 만족시키기 부적당한 심박출량을 유발하는 비정상적 심장기능으로 정의된다 (Braunwald, E. (ed), In: Heart Disease, W.B. Saunders, Philadelphia, 제 426 면, 1988). 5 만명으로 추산되는 미국내 인구가 울혈성 심부전을 앓는다. CHF의 증상이 일단 중간정도로 중증이면, 그 같은 환자의 절반만이 2 년 이상 생존할 것으로 예상된다는 점에서 대부분의 암보다도 예후가 나쁘다 (Braunwald, E. (ed), In: Heart Disease, W.B. Saunders, Philadelphia, 제 426 면, 1988). 의학적 치료법이 CHF의 증상 (예를 들어 부종, 운동 불내성 및 호흡곤란)을 초기에 완화시킬 수 있고, 몇몇 경우에서는 생명을 연장시킨다. 그러나, 이 질병에 대한 예후는, 의학적 치료가 있더라도, 여전히 암울한 상태이며, CHF의 발생은 증가하고 있다 (Baughman, K.,Cardiology Clinics13: 27-34, 1995). CHF의 증상은 호흡곤란, 피로, 쇠약, 다리부종 및 운동 불내성을 포함한다. 신체 실험에서, 심부전 환자는 심박수 및 맥박수의 증가, 수포음(허파 내 장액의 지표), 부종, 목정맥확장 및 일반적으로 심장의 확대의 경향이 있다. 가장 일반적인 CHF 원인은, 상기 논의된 바와 같이, 심근으로 혈류를 공급하는 혈관인 관상동맥 내에 폐색를 일으키는 아테로마성 동맥경화증이다. 그러므로, 울혈성 심부전은, 범위나 돌연성 면에서 중증이어서 만성 또는 급성 심부전의 발전을 일으키는 관상동맥질환과 가장 일반적으로 연관된다. 그 같은 환자에서, 하나 이상의 심장동맥의 확장성 및/또는 돌연성 발병은 심근으로의 적당한 혈류를 저지하여 중증 허혈을, 몇몇 경우에는 심근경색이나 심근 괴사를 유발한다. 심근 괴사의 결과는 -그 양자 모두 높은 사망률과 연관되는- 진행성 만성 심부전 또는 급성 저박출상태로 이어지는 경향을 보인다.Many patients with heart disease are diagnosed with congestive heart failure, including those with severe myocardial ischemia leading to heart attacks. Congestive heart failure is defined as abnormal cardiac function that causes inadequate cardiac output to meet metabolic demands (Braunwald, E. (ed), In: Heart Disease, WB Saunders, Philadelphia, p. The estimated 50,000 people in the United States suffer from congestive heart failure. Once the symptoms of CHF are moderately severe, only half of those patients are expected to survive for more than 2 years (Braunwald, E., ed., Heart Disease, WB Saunders , Philadelphia, 426, 1988). Medical treatments can initially relieve the symptoms of CHF (for example, edema, motor immobility and dyspnea), and in some cases prolong life. However, the prognosis for this disease is still depressing, even with medical treatment, and the incidence of CHF is increasing (Baughman, K., Cardiology Clinics 13: 27-34, 1995). Symptoms of CHF include dyspnea, fatigue, weakness, leg swelling, and motor immobility. In physical examinations, patients with heart failure have a tendency to increase heart rate and pulse rate, to swell (index of intrathecal fluid), edema, neck vein dilatation, and usually heart enlargement. The most common cause of CHF is atherosclerosis arteriosclerosis, which, as discussed above, causes occlusion in the coronary arteries, which are blood vessels supplying blood flow to the myocardium. Therefore, congestive heart failure is most commonly associated with coronary artery disease, which is severe in range or suddenness and leads to the development of chronic or acute heart failure. In such patients, the dilatation and / or the onset of at least one of the coronary arteries may result in severe ischemia by inhibiting proper blood flow to the myocardium, and in some cases, myocardial infarction or myocardial necrosis. The results of myocardial necrosis tend to lead to progressive chronic heart failure or acute hypotonic state, both of which are associated with high mortality.

대부분의 울혈성 심부전 환자는, "확장성 심근증" (또는 여기에 사용될 때 DCM)으로 지칭되는 상태인, 확장된 빈수축의 심장을 진행시키는 경향이 있다. DCM은 확장되고 빈수축인 좌 및/또는 우심실의 발견에 의하여 전형적으로 진단되는 심장의 증상이다. 반복하면, 대부분의 경우에서, 확장된 심장과 연관된 울혈성 심부전은 관상동맥 질환의 결과이며, 종종 하나 이상의 심근 경색을 야기하도록 중증이다. 그러나, 상당수의 소수 사례에서 DCM은 관상동맥질환 (예를 들어 아테로마성 동맥경화증)의 특징 없이도 발생할 수 있다. 확장성 심근증이 CAD과 연관되지 않은 많은 사례에서, DCM의 원인이 알려지거나 의심된다. 그 예는 (진행성 근이영양증, 그긴장성 근이영양증, 프리이드라이히 운동실조증 및 유전성 확장성심근증과 연관된 것과 같은) 가족성 심근증, (다양한 바이러스, 박테리아 및 다른 기생균에 의한 감염 같은) 심근염증을 유발하는 감염, (자가면역 질환, 말초 심근증, 과민반응 또는 이식거부반응에 의한 것 같은) 비감염성 염증, (영양학적, 내분비학적 및 전해질 이상을 포함하는) 심근염을 유발하는 대사장애 및 (알콜 뿐 아니라 일정 화학요법제 및 카테콜아민을 포함하는) 심근염을 유발하는 독성 작용제에의 노출을 포함한다. 그러나, 대부분의 비-CAD DCM 사례에서, 질병의 원인은 알려지지 않은 상태이며 그런 증상은 따라서 "특발성 확장성 심근증" (또는 "IDCM")이라 지칭한다. 내재적 원인의 잠재적 차이에도 불구하고, 대부분의 중증 CHF 환자는 확장된, 박벽의 심장 (즉, DCM)을 가지며 대부분의 그런 환자는 (비록 그들의 몇몇은 명백한 아테로마성 동맥경화증을 가지지 않을 수도 있으나) 심근허혈을 나타낸다. 더욱이, DCM 환자는 비록 중증 관상동맥 질환이 없더라도 협심증을 경험할 수 있다.Most congestive heart failure patients tend to drive the heart of an expanded vasoconstriction, a condition referred to as " dilated cardiomyopathy " (or DCM when used herein). DCM is a symptom of the heart that is typically diagnosed by the discovery of left and / or right ventricles that are dilated and voided. Again, in most cases, congestive heart failure associated with an extended heart is a consequence of coronary artery disease and is often severe enough to cause one or more myocardial infarction. However, in a small number of cases, DCM can occur without the characteristics of coronary artery disease (eg, atherosclerosis). In many cases where dilated cardiomyopathy is not associated with CAD, the cause of DCM is known or suspected. Examples include familial cardiomyopathy (such as those associated with progressive muscular dystrophy, its tender muscular dystrophy, Preid Rhee Ataxia and hereditary dilated cardiomyopathy), infections that cause myocardial inflammation (such as infection by various viruses, bacteria and other parasites) Non-infectious inflammation (such as by autoimmune disease, peripheral cardiomyopathy, hypersensitivity or transplant rejection), metabolic disorders causing myocarditis (including nutritional, endocrinological and electrolyte abnormalities) Lt; RTI ID = 0.0 > and / or < / RTI > catecholamines). However, in most non-CAD DCM cases, the cause of the disease is unknown and such symptoms are therefore referred to as "idiopathic dilated cardiomyopathy" (or "IDCM"). Despite the potential differences in intrinsic causes, most severe CHF patients have an extended, thin wall of heart (ie, DCM) and most such patients (although some of them may not have obvious atherosclerosis) Myocardial ischemia. Furthermore, DCM patients may experience angina even if they do not have severe coronary artery disease.

CHF의 발병은, 진행성 심근 손상, 확장된 심장과 연관된 혈역학적 비효율, 전신성 색전의 위험, 및 심실성 부정맥의 위험을 포함하는 몇몇의 치료학적 문제를 제기한다. 폐색성 관상동맥질환은 주요 문제가 아니므로, 전통적인 재혈관화는 비-CAD DCM의 치료를 위한 선택사항이 아니다. DCM의 원인이 알려지거나 의심되는 환자에게 조차도 손상은 전형적으로 비가역적이다. 예를 들어, 아드리아마이신-유도 심독성의 사례에서, 심근증은 일반적으로 비가역적이며 사망에 이르는 확률이 발병 환자의 60 %를 넘는다. 몇몇 DCM 환자에 대하여는 그 원인 자체가 알려지지 않는다. 결과적으로, DCM에 대하여 적용하는 일반적인 치료법이 없다. 의사들은 전통적으로 (예를 들어, 이뇨제를 사용하여 장액 축적을 완화시키고/또는 앤지오텐신 전환 효소 저해제를 사용하여 산소와 영양분에 대한 심장의 요구량을 감소시킴으로서) DCM을 나타내는 환자에 존재하는 증상을 완화하는데 초점을 맞춘다. 결과적으로, DCM을 나타내는 환자의 약 50 %가, 종종 심실성 부정맥과 연관된 돌연 심장마비로, 진단 2 년 이내에 사망한다. "심실재형성"은 심근경색 후 종종 발생하며 종종 심실 기능의 더 나아간 감소를 유발하는 심장 질환의 한 양태이다. 많은 경우에 있어서, 심근경색 치유 후, 치유된 경색과 정상 조직과의 경계 영역에서의 연속적 허혈과 다른 요인들이 잔여 심장 조직의 확장증 및/또는 재형성을 유발한다. 이 확장증이나 재형성은, 초기에는 순응성이나, 종종 더 나아간 심실 기능 손상으로 이어진다. 심장 전체의 확장증은 이 같은 경색을 가지는 환자의 약 50 %에서 발생하며, 재형성은 비록 경색 1 내지 2 주 후 정도로 조기에 일어날 수도 있으나, 통상 심근경색 이삼개월 후에 발달한다. 좌심실의 기능 불량은 심근경색에 따르는 악영향의 가장 좋은 단일 전조이다. 따라서, 심근경색 후 심실 재형성 방지는 유익하다. 심실재형성을 방지하려는 노력의 한 접근방법은 심근경색을 앓는 환자를 앤지오텐신 전환 효소 ("ACE") 저해제로 치료하는 것이다 (예를 들어, McDonald, K.M.,Trans, Assoc. Am. Physicians103: 229-235, 1990; Cohn, J. Clin. Cardiol. 18 (Suppl. IV) IV-4-IV-12, 1995 참조). 그러나, 이들 작용제는 오직 악성 심실재형성을 방지하는데에만 어느 정도 효과적일 뿐 새로운 치료법이 필요하다.The onset of CHF raises several therapeutic problems including progressive myocardial injury, hemodynamic inefficiency associated with extended heart, risk of systemic embolism, and risk of ventricular arrhythmias. Conventional revascularisation is not an option for the treatment of non-CAAD DCM, since occlusive coronary artery disease is not a major problem. Damage is typically irreversible, even for patients with known or suspected DCM causes. For example, in the case of adriamycin-induced cardiotoxicity, cardiomyopathy is generally irreversible and the probability of death is greater than 60% of the onset patients. For some DCM patients, the cause is unknown. As a result, there is no general treatment for DCM. Doctors have traditionally used a combination of symptoms (for example, diuretics to relieve intestinal accumulation and / or use an angiotensin converting enzyme inhibitor to reduce the heart's demand for oxygen and nutrients) Focus on mitigation. As a result, approximately 50% of patients presenting with DCM die from sudden cardiac arrest, often associated with ventricular arrhythmias, within two years of diagnosis. &Quot; Vascular occlusion " is an aspect of heart disease that often occurs after myocardial infarction and often leads to a further reduction of ventricular function. In many cases, after healing of myocardial infarction, successive ischemia and other factors in the border area between the healed infarct and normal tissue lead to enlargement and / or remodeling of residual cardiac tissue. This enlargement or remodeling leads to conformity in the early days, but often further impaired ventricular function. Cardiac enlargement occurs in about 50% of patients with such an infarct, and remodeling may develop early after the infarction of myocardial infarction, although it may occur as early as 1 to 2 weeks after infarction. Left ventricular dysfunction is the best single predictor of adverse effects from myocardial infarction. Therefore, prevention of ventricular remodeling after myocardial infarction is beneficial. One approach to preventing deep-seated formation is to treat patients with myocardial infarction with angiotensin converting enzyme ("ACE") inhibitors (eg, McDonald, KM, Trans, Assoc. : 229-235, 1990; Cohn, J. Clin. Cardiol. 18 (Suppl. IV) IV-4-IV-12, 1995). However, these agents are only somewhat effective at preventing the formation of malignant deep seated bodies and require new therapies.

현재 CHF에 대한 치료는 약학적 치료, 관상동맥 재혈관화 및 심장이식이다. CHF에 대한 약학적 치료는 (디지탈리스와 β-아드레날린성 수용체 길항제 같은 심근수축제를 사용에 의하여) 심장의 수축력을 증가시키고, (이뇨제를 사용하여) 허파와 다른 곳의 장액축적을 감소시키고, (앤지오텐신 전환 효소 저해제 같은 전신성 혈관 저항을 감소시키는 작용제를 사용하여) 심장의 작동을 감소시키는데 방향이 맞추어져 왔다. β-아드레날린성 수용체 길항제가 또한 시험되어 왔다. 이 같은 약학적 작용제는 증상을 호전시킬 수 있고 잠재적으로 생명을 연장시킬 수 있으나, 대부분의 예후는 비참한 상태다.Currently, treatment for CHF is pharmacological treatment, coronary artery revascularization and heart transplantation. Pharmacological treatment of CHF increases the contractility of the heart (by using a cardiomyocyte fibril, such as a digitalis and a-adrenergic receptor antagonist), reduces the accumulation of serous fluid in the lungs and other areas (using diuretics) (Using agents that reduce systemic vascular resistance, such as angiotensin converting enzyme inhibitors) have been directed to reduce heart function. [beta] -adrenergic receptor antagonists have also been tested. These pharmacological agents can improve symptoms and potentially prolong life, but most of the prognosis is disastrous.

관상동맥 질환과 연관된 원인의 심부전 환자 몇몇은 관상동맥 우회로 조성술 및 혈관성형술 같은 재혈관화 과정에 의하여 적어도 일시적으로 이익을 볼 수 있다. 이 같은 과정은 부적합한 혈류때문에 심근이 괴사하지 않았지만 기능장애인 경우에 잠재적으로 유익하다. 만약 정상적인 관상혈류가 회복되면, 이전에 기능장애가 있던 심근은 더 정상적으로 수축할 수 있고 심장기능은 개선될 수 있다. 그러나, 환자가 (예를 들어, 더 중증의 CHF 환자에서 발견될 수 있는) 부적당한 미세혈관상(床)을 가지는 경우, 재혈관화는 비록 온화한 개선이 가끔 나타나지만, 심기능을 정상 또는 근정상 수준으로 거의 회복시키지는 못할 것이다. 또한, 실패한 우회로 이식편의 발생과 혈관성형술 후 재협착은 이 같은 방법으로 치료된 환자에게 더 나아간 위험이 된다. 심장이식은 다른 교차질환이 없고 상대적으로 젊은 CHF 환자에게 적합한 선택이지만, 이는 이런 환자의 단지 소수를 위한 선택일 뿐이고 비용이 비싼 경우뿐이다. 요약하면, CHF는 매우 불량한 예후를 가지며 현행 치료법에 매우 불량하게 반응한다는 것을 알 수 있다.Some patients with coronary heart disease associated with coronary artery disease may benefit at least temporarily through reanastomosis, such as coronary artery bypass grafting and angioplasty. This process is potentially beneficial when the myocardium is not necrotic due to inadequate blood flow, but is impaired. If normal coronary blood flow is restored, previously functioning myocardium may contract more normally and cardiac function may be improved. However, when a patient has an improper microvascular bed (for example, which can be found in a more severe CHF patient), re-vascularization can be achieved by modifying the cardiac function to a normal or near normal level It will almost never recover. In addition, the occurrence of failed bypass grafts and restenosis after angioplasty are a greater risk for patients treated in this manner. Cardiac transplantation is a good choice for younger CHF patients with no other crossover disease, but only for a small fraction of these patients, and only if it is costly. In summary, it can be seen that CHF has a very poor prognosis and responds poorly to current treatments.

CHF와 연관된 생리적 증상을 더욱 복잡하게 하는 것은 기능장애의 심장 환자에게서 발생하는 경향이 있는 다양한 자연적 적응이다. 비록 이런 자연적 반응은 초기에 심기능을 개선시킬 수 있으나, 그것은 종종 질환을 악화시키고, 치료를 혼란시키고, 생존에의 악영향을 일으킬 수 있는 다른 문제를 낳는다. 이 같은 적응의 세가지: (i) 장액 부피를 확장시키고 초기에 심박출을 개선시키는, 나트륨 재흡수의 변화에 의하여 유도되는 부피축적; (ii) 상대적으로 정상적인 내벽 장력을 유지하면서 박출량을 증가시킬 수 있는 (확장과 비대에 따르는) 심장 확장 ; 및 (iii) 심장 β-아드레날린성 수용체와 상호작용함으로써 심박동수와 수축력을 증가시키고 그에 의하여 심박출량을 증가시키는, 심장에 닿는 아드레날린성 신경 말단으로부터의 노르에피네프린 분비의 증가가 CHF 환자에서 일반적으로 관찰된다. 그러나, 이들 세가지 자연적 적응의 각각은 궁극적으로 다양한 이유 때문에 실패하는 경향이 있다. 특히, 장액 분비 정지는 부종을 유발하고 호흡을 곤란하게 하는 허파내 장액을 축적시키는 경향이 있다. 심장 확장은 악성 좌심실 재형성을 유도하고 중증의확장과 내벽 장력의 증가를 가져와 CHF를 악화시킨다. 마지막으로, 심장의 노르에피네프린에의 장기간 노출은 심장을 아드레날린성 자극에 무반응하게 하고 불량한 예후와 연관되는 경향이 있다.Further complicating the physiological symptoms associated with CHF are the various natural adaptations that tend to occur in heart patients with dysfunction. Although these natural responses may initially improve cardiac performance, it often results in other problems that can aggravate disease, disrupt treatment, and cause adverse effects on survival. There are three such adaptations: (i) volume accumulation induced by changes in sodium reabsorption, which dilates the serous volume and improves early cardiac output; (ii) cardiac enlargement (due to enlargement and enlargement) that can increase output while maintaining a relatively normal inner wall tension; And (iii) increased secretion of norepinephrine from cardiac adrenergic nerve terminals, which increases cardiac output and cardiac output thereby increasing heart rate and contractility by interacting with cardiac? -Adrenergic receptors. do. However, each of these three natural adaptations ultimately tends to fail for a variety of reasons. In particular, the secretion of a gland fluid tends to accumulate intestinal fluids that cause edema and make breathing difficult. Heart enlargement induces malignant left ventricular remodeling and leads to severe dilation and increased inner wall tension, which exacerbates CHF. Finally, prolonged exposure of the heart to norepinephrine tends to cause the heart to be unresponsive to adrenergic stimulation and to be associated with a poor prognosis.

심장질환 같은 말초혈관의 질환은 종종, 특히 (운동과 같이) 대사요구가 증가될 때, (심장 질환 같이) 허혈이 될 수 있는 조직 (예를 들어 골격 근육)으로의 제한된 혈류의 결과이다. 그러므로, 말초혈관에 존재하는 아테로마성 동맥경화증은 영향 받은 혈관에 의하여 공급되는 조직 내에 허혈을 유발할 수 있다. 말초 동맥 패색 질환 (PAOD)으로 알려진 이런 문제점은 환자의 하지에서 가장 빈번하게 영향을 준다. 심혈관 질환의 다른 형태에서와 같이, 이 상태 또는 적어도 그 증상의 몇몇은 아스피린이나 혈점성을 감소시키는 다른 작용제 같은 약물을 사용하거나 동맥이식, 지질태 침착물의 외과적 제거 같은 외과적 개입, 또는 혈관성형술 같은 내혈관 치료에 의하여 치료될 수 있다. 증상은 개선될 수 있으나 이 같은 치료의 효과는, 상기 기재된 것과 유사한 이유에서, 전형적으로 부당하다.Peripheral vascular diseases such as heart disease are often the result of limited blood flow to tissues that may become ischemic (such as skeletal muscle) (such as heart disease), especially when metabolic demand is increased (such as exercise). Therefore, atherosclerotic arteriosclerosis present in the peripheral blood vessels can induce ischemia in tissues supplied by the affected blood vessels. This problem, known as Peripheral Arterial Disease (PAOD), most commonly affects the patient's legs. As with other forms of cardiovascular disease, this condition, or at least some of its symptoms, may be caused by the use of drugs such as aspirin or other agents that reduce blood viscosity, or by surgical intervention such as arterial grafting, surgical removal of lipodermal deposits, Can be treated by the same endovascular treatment. The symptoms may be improved, but the effectiveness of such treatment is typically unreasonable for reasons similar to those described above.

최근, 심혈관 질환에 대한 치료에 대한 투자가 혈관형성에 관련된 치료법 추세로 되어 왔다. 혈관형성은 일반적으로 혈관의 발생 및 분화를 지칭한다. 전형적으로 "혈관형성 단백질"로 지칭되는 많은 단백질이 혈관형성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 이 같은 혈관형성 단백질은 섬유모세포 성장인자 (FGF) 부류, 혈관 내피 성장인자 (VEGF) 부류, 혈소판-유래 성장인자 (PDGF) 부류, 인슐린-유사 성장인자 (IGF) 부류, 및 (하기 상술된 바 및 당업계에서와 같은) 다른 것들의 구성원들을 포함한다. 예를 들어, FGF 부류와 VEGF 부류 구성원은 성장과 발생 동안 혈관형성의 조절자로 알려져 있다. 성체 동물에서의 혈관형성 촉진에서의 그들의 역할이 최근 (하기한 바대로) 시험되어 왔다. FGF 부류와 VEGF 부류의 혈관형성 활성이 시험되어 왔다. 예를 들어, 산성 FGF ("aFGF") 단백질은 성체 래트의 복강 내에 위치할 때, 콜라겐-코팅 기질 내에서 양호하게 혈관형성되고 정상적으로 관류된 구조를 결과함이 보여졌다 (Thompson et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 7928-7932, 1989). 보고된 바에 의하면 관상동맥 폐색 동안 염기성 FGF ("bFGF") 단백질의 성체 개의 관상동맥 내로의 주사는 심근 기능장애의 감소, 더 작아진 심근 경색, 및 위험이 있는 상에서의 증가된 혈관계를 유발한다 (Yanagisawa-Miwa et al.,Science, 257: 1401-1403.1992). bFGF 단백질을 사용한 심근허혈의 동물 모델에서 유사한 결과가 보고되어 왔다 (Harada et al.,J. Clin. Invest., 94: 623-630, 1994; Unger et al.,Am. J. Physiol., 266: H1588-H1595, 1994). 부행 혈류의 증가가 VEGF 단백질로 처리된 개에서 보여졌다 (Banai et al.Circulation89: 2183-2189, 1994).Recently, investment in treatment for cardiovascular disease has become a trend of treatment related to angiogenesis. Angiogenesis generally refers to the development and differentiation of blood vessels. Many proteins, typically referred to as " angiogenic proteins ", are known to promote angiogenesis. Such angiogenic proteins include but are not limited to fibroblast growth factor (FGF) class, vascular endothelial growth factor (VEGF) class, platelet-derived growth factor (PDGF) class, insulin-like growth factor (IGF) class, And others in the art). For example, members of the FGF class and the VEGF class are known as modulators of angiogenesis during growth and development. Their role in promoting angiogenesis in adult animals has been tested recently (as described below). The angiogenic activity of the FGF class and the VEGF class have been tested. For example, it has been shown that acidic FGF (" aFGF ") proteins, when located in the abdominal cavity of adult rats, result in favorably vascularized and normally perfused structures in the collagen-coated matrix (Thompson et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA , 86: 7928-7932, 1989). It has been reported that injection of adult FGF ("bFGF") protein into the coronary arteries during coronary occlusion leads to decreased myocardial dysfunction, smaller myocardial infarction, and increased vasculature at risk Yanagisawa-Miwa et al., Science , 257: 1401-1403, 1992). Similar results have been reported in animal models of myocardial ischemia using bFGF proteins (Harada et al., J. Clin. Invest. , 94: 623-630, 1994; Unger et al., Am. J. Physiol. , 266 : H1588-H1595, 1994). Increased ascending blood flow was seen in dogs treated with VEGF protein (Banai et al. Circulation 89: 2183-2189, 1994).

그러나, 심장혈관형성을 촉진하기 위한 이 같은 단백질 주입의 잠재적 사용과 연관된 난점은: 충분한 기간동안 적당한 편재를 성취하는 것, 및 섭취 및 심근 세포 내에서 혈관형성 효과의 촉진에 필요한 적당한 형태와 정도로 그 단백질이 존재하고 남아 있는 것을 보장하는 것을 포함한다. (예를 들어, 일시 주입에 따르는) 초기에는 높으나 그 다음 (신체에 의한 제거작용으로) 빠르게 떨어지는 단백질 농도는 유독하고 비효율적일 수 있다. 다른 난점은 단백질의 반복적인 주입이나 주사에 대한 요구이다.However, the difficulties associated with the potential use of such protein infusions to promote cardiovascular formation are: achievement of adequate ubiquity for a sufficient period of time, and the ability to achieve the desired form and extent of ingestion and promotion of angiogenic effects within the myocardial cells. And ensuring that the protein is present and remains. A protein concentration that is high initially (following a temporary infusion, for example) and then quickly (due to the body's elimination) may be toxic and ineffective. Another difficulty is the need for repetitive infusion or injection of proteins.

몇몇 간행물은 특정 심장 질환을 포함하는 질환의 치료 또는 예방을 위한 유전자 전달의 사용을 전제하였다. 예를 들어, French, "Gene Transfer and Cardiovascular Disorders,"Herz18 : 222-229, 1993 ; Williams, "Prospects for Gene Therapy of Ischemic Heart Disease,"American Journal of Medical Sciences306 : 129-136, 1993 ; Schneider 및 French,"The Advent of Adenovirus : Gene Therapy for Cardiovascular Disease,"Circulation88 : 1937-1942, 1993 ; and Mazur et al., "Coronary Restenosis and Gene Therapy,"Molecular and Cellular Pharmacology, 21 : 104-111, 1994를 참조. 또한, 몇몇 그룹은 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 다른 벡터를 사용한 심근 내로의 생체내 유전자 전달을 시사하여 왔다 (예를 들어, Barr et al., Supplement II,Circulation, 84 (4) : Abstract 1673, 1991 ; Barr et al.,Gene Ther., 1 : 51-58, 1994 ; French et al.,Circulation, 90 (5) : 2402-2413, 1994 ; French et al.,Circulation, 90 (5) : 2414-2424, 1994 ; French et al.,Circulation, 90 : 1517 Abstract No. 2785, 1994 ; Leiden, et al., W094/11506 (1994년 5월 26일) ; Guzman et al.,Circ. Res., 73 (6) : 1202-1207, 1993 ; Kass Eisler et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 11498-11502, 1993 ; Muhlhauser et al.,Hum. Gene Ther., 6 : 1457-1465, 1995 ; Muhlhauser et al.Circ. Res., 77 (6) : 1077-1086, 1995 ; and Rowland et al.,Am. Thorac. Surg., 60 (3) : 721-728, 1995를 참조.Several publications have suggested the use of gene delivery for the treatment or prevention of diseases involving certain heart diseases. For example, French, " Gene Transfer and Cardiovascular Disorders, " Herz 18: 222-229, 1993; Williams, " Prospects for Gene Therapy of Ischemic Heart Disease, " American Journal of Medical Sciences 306: 129-136, 1993; Schneider and French, " The Advent of Adenovirus: Gene Therapy for Cardiovascular Disease, " Circulation 88: 1937-1942, 1993; and Mazur et al., " Coronary Restenosis and Gene Therapy, " Molecular and Cellular Pharmacology , 21: 104-111, In addition, several groups have suggested in vivo gene transfer into the myocardium using plasmids, retroviruses, adenoviruses and other vectors (e. G., Barr et al., Supplement II, Circulation , 84 , 1991; Barr et al, Gene Ther, 1: 51-58, 1994; French et al, Circulation, 90 (5):.... 2402-2413, 1994; French et al, Circulation, 90 (5): 2414-2424, 1994; French et al, Circulation, 90:.... 1517 Abstract No. 2785, 1994; Leiden, et al, W094 / 11506 ( May 26, 1994); Guzman et al, Circ Res. , 73 (6): 1202-1207, 1993; Kass Eisler et al., Proc Natl Acad Sci USA 90: 11498-11502, 1993; Muhlhauser et al., Hum. Gene Ther. , 6: 1457 See, for example, Muhlhauser et al., Circ.res . , 77 (6): 1077-1086, 1995, and Rowland et al., Am. Thorac. Surg. , 60 (3): 721-728, 1995 .

그러나, 일반적으로 이들 보고는 잠재적 치료법에 대한 시사나 희망 이상의 것을 거의 제공하지 않는다. 동물 데이터를 제공하는 이들 중 대부분은 실제 생체내 조건에 적합하게 관련된 질병 모델을 채용하고 있지 않았다. 게다가, 시도된 생체내 방법은 일반적으로 하나 이상의 다음 결점: 부적당한 형질도입 효율 및 트랜스젠 발현; 염증과 조직괴사를 포함하는, 사용된 벡터에 대한 두드러진 면역반응; 및 중요하게는, 관심의 기관에 형질도입 및 트랜스젠 발현을 표적화하는 것이 상대적으로 불가능함 (예를 들어, 트랜스젠의 결과인 심장을 목표로 한 유전자 전달이, 시험 동물의 간, 신장, 허파, 뇌 및 고환 같은 비-심장 위치에도 송달됨)을 경험하였다. 예로써, 고속 분열 세포군 내로의 트랜스젠 삽입이 실질적으로 트랜스젠 발현의 지속기간을 감소시킬 것이다. 이 같은 세포의 예는, 모든 혈관의 내층을 형성하는 상피세포 및, 심장 전반을 통하여 산재하는 섬유모세포를 포함한다. 오직 원하는 세포만 트랜스젠을 수용하고 발현할 것이고 그 트랜스젠이 전신적으로 방해되지 않도록 트랜스젠을 표적화하는 것 또한 결정적으로 중요한 고려사항이다. 이것이 성취되지 않는다면, 트랜스젠의 전신적 발현과 그에 부수하는 문제가 결과될 것이다. 예를 들어 간에서 아데노바이러스-매개 유전자 전달 후의 염증 침윤이 기록되어 왔다 (Yang et al.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 91 : 4407, 1994). 또한, 심장에서 심근 벽내로 삽입된 바늘을 통한 직접 심근 내 주사 후의 염증 침윤이 기록되어 왔다 (French et al.,Circulation, 90 (5) : 2414-2424, 1994).However, in general these reports provide little more than suggestions or hopes for potential treatment. Most of those providing animal data have not employed disease models that are relevant to the actual in vivo conditions. Moreover, attempted in vivo methods generally have one or more of the following drawbacks: inadequate transduction efficiency and transgene expression; A prominent immune response to the vector used, including inflammation and tissue necrosis; And importantly, it is relatively impossible to target transduction and transgene expression to the organ of interest (e. G., Gene delivery targeted to the heart as a result of the transgene is mediated by the liver, , Delivered to non-cardiac locations such as the brain and testes). By way of example, transgene insertion into fast dividing cell populations will substantially reduce the duration of transgene expression. Examples of such cells include epithelial cells that form an inner layer of all blood vessels and fibroblasts scattered throughout the heart. It is also a crucial consideration to target transgenes so that only the desired cells will receive and express the transgene and that the transgene is not systemically disturbed. If this is not accomplished, systemic expression of transgenes and associated problems will result. For example, inflammatory infiltration after adenovirus-mediated gene transfer in the liver has been documented (Yang et al., Proc. Natl Acad Sci USA , 91: 4407, 1994). In addition, inflammatory infiltration after direct intramyocardial injection through the needle inserted into the wall of the myocardium has been documented (French et al., Circulation , 90 (5): 2414-2424, 1994).

β-아드레날린성 울혈성 심부전의 특정 형태를 치료하기 위한 방법이 최근 Hammond et al.에 의하여 1998년 3 월 12일 공개된 PCT WO 98/10085에 기재되었다. 그 방법은, β-아드레날린성 신호의 감소와 연관된 심장 질환 환자의 심장으로의 β-아드레날린성 신호 경로의 구성요소를 코딩하는 유전자의 송달과 관련된다.Methods for treating certain forms of β-adrenergic congestive heart failure have been described in PCT WO 98/10085 published March 12, 1998 by Hammond et al. The method involves the delivery of a gene encoding a component of the? -Adrenergic signal pathway to the heart of a patient with heart disease associated with a decrease in? -Adrenergic signaling.

발명의 개요Summary of the Invention

본 발명은, 발현되어 질병 증상이 완화되는 트랜스젠을 포함하는 벡터를 조직으로 도입함으로써 손상받은 조직에 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트랜스젠을 송달하는 것을 포함하는, 심혈관 질환을 치료하기 위한 기술 및 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 심장 내 수축 기능 및/또는 혈류는, 심근으로 송달되어 거기에서 발현되는 트랜스젠-함유 벡터를 환자의 적어도 하나의 관상동맥으로 도입하여 증가될 수 있다. 말초동맥 폐쇄질환 (PAOD) 같은 말초혈관 질환에 사용되기 위하여 방법이 또한 제공된다. 여기에 기재되고 서술된 바와 같이, 이들 방법은 따라서 심장 질환, 말초혈관 질환 및 유사 이상을 치료하는데 유용하다.The present invention relates to a technique for treating cardiovascular diseases, which comprises delivering a transgene encoding an angiogenic protein or peptide to a damaged tissue by introducing into a tissue a vector comprising a transgene that is expressed and the disease symptoms are alleviated, And compositions. For example, intracardiac contractile function and / or blood flow may be increased by introducing a transgen-containing vector delivered to the myocardium and expressed therein into at least one coronary artery of the patient. Methods are also provided for use in peripheral vascular disease such as peripheral arterial occlusive disease (PAOD). As described and described herein, these methods are therefore useful for the treatment of heart disease, peripheral vascular disease and similar disorders.

본 발명은, 조직에서 발현되어 그 조직내 혈류를 증가시키는 트랜스젠을 포함하는 벡터를 조직으로 도입함으로써 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 상기 조직의 허혈성 부위로 송달하는 것을 포함하는, 환자의 허혈성 조직내 혈류를 증가시키는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 조직에서 발현되어 혈류를 증가시키고 허혈을 감소시키는 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트랜스젠을 포함하는 벡터는 허혈성 골격근 내로 도입된다. 대안의 구체예에서, 벡터는 허혈성 조직에 혈을 공급하는 혈관으로 (예를 들어, 골격근을 공급하는 대퇴동맥 같이 심근을 공급하는 관상동맥 내로 또는 말초 동맥 내로 도입에 의하여) 도입된다. 본 발명에서 채용되는 벡터는 플라스미드 또는 바람직하게는 바이러스 벡터, 예를 들어 복제능-결여 아데노바이러스일 수 있다. 본 발명의 다양한 측면과 치료학적 응용이 하기에 기재 및 서술되어 있다.The present invention relates to a method for the treatment of ischemic tissue blood flow in a patient, comprising introducing into the tissue a vector comprising a transgene expressed in the tissue and increasing blood flow in the tissue to deliver the angiogenic protein or peptide to the ischemic site of the tissue / RTI > In one embodiment, a vector comprising an angiogenic protein or a transgene encoding a peptide that is expressed in the tissue to increase blood flow and reduce ischemia is introduced into the ischemic skeletal muscle. In an alternative embodiment, the vector is introduced into a blood vessel supplying blood to the ischemic tissue (e.g., into the coronary artery supplying the myocardium, such as the femoral artery supplying the skeletal muscle, or by introduction into the peripheral artery). The vector employed in the present invention may be a plasmid or preferably a viral vector, for example a replication competent-deficient adenovirus. Various aspects and therapeutic applications of the present invention are described and described below.

한 양태에서, 본 발명은, 심근에 송달되어 발현되고 심장내 수축 기능이 증가되는 트랜스젠을 포함하는 벡터를 심근에 도입함으로써 (바람직하게는 하나 이상의 관상동맥으로 송달함으로써) 환자의 심근으로 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트랜스젠을 송달하는 것을 포함하는, 환자의 심장 내 수축 기능을 증가시키는 방법을 제공한다. 트랜스젠은, 예를 들어, 심근으로 혈을 공급하는 하나 이상의 관상동맥 또는 두렁정맥 이식편 또는 내유동맥 이식편으로 관상동맥 내 주사하는 것에 의하여 도입된다. 트랜스젠은 바람직하게는 적어도 하나의 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩한다. 본 발명에서 채용된 벡터는 플라스미드 또는 바람직하게는, 복제능-결핍 아데노바이러스를 설시 방법으로서 포함하는 바이러스 벡터일 수 있다. (바람직하게는 야생형 바이러스가 거의 없거나 전혀 없는) 바이러스 벡터 스톡을 하나 이상의 관상동맥 또는 이식편 내강 깊숙이 (적어도 약 1 cm), 바람직하게는 광학밀도계로 측정하여 10⁷내지 10¹³바이러스 입자 분량으로 (더욱 바람직하게는 10⁹내지 10¹¹바이러스 입자 분량으로) 주사함으로써, 원하는 수의 세포, 특히 심근세포를 혈관형성 단백질 -또는 펩티드- 을 코딩하는 유전자로 영향받은 심근 내로 국부적으로 트랜스펙션시켜 유전자 전달의 치료 효율을 최대화하고 심장외 부위에서의 바람직하지 않은 혈관형성과 바이러스 단백질에 대한 염증반응의 가능성을 최소화하는 것이 가능하다. 심근세포-특이적 프로모터가 사용되면 발현은 심근세포에 더 한정되어 망막 같은 비-심장 조직 내 혈관형성의 잠재적 해로운 영향이 더욱 감소될 수 있다.In one embodiment, the present invention provides a method of treating a subject suffering from angiogenesis by introducing into the myocardium (preferably by delivering to one or more coronary arteries) a vector comprising a transgene that is transmitted to the myocardium and that is increased in intracardiac contractile function, Lt; RTI ID = 0.0 > transient < / RTI > encoding a protein or peptide. The transgene is introduced by, for example, coronary artery injection into one or more coronary or pulmonary vein grafts or myasthenia gravis that supply blood to the myocardium. The transgen preferably encodes at least one angiogenic protein or peptide. The vector employed in the present invention may be a plasmid or, preferably, a viral vector containing the replication competent-deficient adenovirus. A viral vector stock (preferably with little or no wild-type virus) is measured at one or more deep coronary arteries or gut lumens (at least about 1 cm), preferably in an optical density meter, at a volume of 10 ⁷ to 10 ¹³ viral particles Preferably 10 ⁹ to 10 ¹¹ viral particles) to locally transfect a desired number of cells, particularly myocardial cells, into the myocardium affected by the gene encoding the angiogenic protein- or peptide- It is possible to maximize therapeutic efficiency and to minimize the possibility of undesirable angiogenesis at the extra-cardiac sites and inflammatory response to viral proteins. When a myocyte cell-specific promoter is used, expression is more restricted to myocardial cells, potentially further reducing the detrimental effects of angiogenesis in non-cardiac tissue such as the retina.

치료 기술에 따라 사용될 수 있는 키트와 조성물 또한 제공된다.Kits and compositions that can be used according to therapeutic techniques are also provided.

정부-후원 연구에 관한 설명Explanation of government-sponsored research

여기에 기재된 연구성과의 일정부분은 국립위생연구소에 의하여 수여되는 보조금 Nos. VA-HL0281201, HL1768218 및 IP50HL53773.01에 의거하여 미연방 정부로부터의 보조금에 의하여 부분적으로 후원되었다. 미연방 정부는 이 발명에 대하여 일정부분 권리를 가질 수 있다.Part of the research outcome described here is the subsidy awarded by the National Institutes of Health. Partially supported by subsidies from the US Government under VA-HL0281201, HL1768218 and IP50HL53773.01. The US Government may have certain rights in this invention.

관련건에 대한 교차 참고Cross reference to related case

이 출원은, 1995년 2월 28일 출원된 US 출원번호 08/396,207의 부분계속출원인 1995년 6월 7일 출원된 (현재 U.S. 특허 No. 5,792,453으로 특허된) US 출원번호 08/485,472의 부분계속출원인 1996년 2월 27일 출원된 (현재 특허부여 진행중인) US 출원번호 08/722,271의 부분계속출원인 1999년 11월 5일 출원된 US 출원번호 09/435,156의 부분계속출원인 2000년 6월 30일 출원된 US 출원번호 09/609,080의 부분계속출원이고; 이 출원은, 1995년 6월 7일 출원된 (현재 U.S. 특허 No. 5,792,453으로 특허된) US 출원번호 08/485,472의 부분계속출원인 1998년 2월 11일 출원된 US 출원번호 09/021,773의 부분계속출원인 1999년 2월 9일 출원된 국제출원번호 PCT/US99/02702의 부분계속출원이며; 이 출원은, 1997년 5월 6일 출원된 US 출원번호 08/852,779의 계속출원이고 1998년 8월 10일 출원된 US 출원번호 09/132,167의 부분계속출원인 1998년 4월 30일 출원된 US 출원번호 09/068,102의 부분계속출원이다. 상기 특허출원 모두는 여기에 참고문헌으로서 포함된다.This application is a continuation-in-part of U.S. Serial No. 08 / 396,207 filed on February 28, 1995, U.S. Serial No. 08 / 485,472, filed June 7, 1995 (now U.S. Patent No. 5,792,453) Filed on June 30, 2000, which is a continuation-in-part of U.S. Serial No. 08 / 722,271, filed February 27, 1996, now U.S. Serial No. 08 / 722,271, filed on November 5, 1999, Lt; RTI ID = 0.0 > 09 / 609,080, < / RTI > This application is a continuation-in-part of U.S. Serial No. 09 / 021,773, filed on February 11, 1998, which is a continuation-in-part of U.S. Serial No. 08 / 485,472 filed June 7, 1995 (now U.S. Patent No. 5,792,453) A continuation-in-part application of International Application No. PCT / US99 / 02702 filed February 9, 1999; This application is a continuation-in-part of U.S. Serial No. 08 / 852,779 filed on May 6, 1997 and U.S. Serial No. 09 / 132,167, filed on August 10, 1998, No. 09 / 068,102. All of these patent applications are incorporated herein by reference.

발명의 분야Field of invention

본 발명은 생체내 유전자 요법에 의하여 심혈관 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관련된다. 더 자세하게는, 본 발명은 혈관형성 트랜스젠의 생체내 송달에 의하여 심장질환을 치료하기 위한/또는 말초혈질환을 치료하기 위한 기술 및 폴리뉴클레오티드 구성체에 관련된다.The present invention relates to methods and compositions for treating cardiovascular diseases by in vivo gene therapy. More particularly, the present invention relates to techniques and polynucleotide constructs for treating heart diseases by in vivo delivery of angiogenic transgenes and / or for treating peripheral blood diseases.

도 1은 울혈성 심부전의 돼지 모델에서 조율 동안의 벽 비후화 백분율을 그래프로 나타낸다. 벽 비후화 백분율은 심실간 격막과 측벽 내에서 조율 전 (제 0 일)과 매 7일 마다 심부전이 진행됨에 따라 (실시예 1에 기재된 바대로) 순차적으로 평가되었다. 기호는 평균값을 나타내고; 오차 막대는 1 표준 편차 (1 SD)를 나타낸다. 이중-방법 ANOVA (반복측정)은 벽 비후화 백분율이 대조표준간에 의하여 (P < 0. 001) 및 영역에 의하여 (P=0. 001) 영향을 받음을 나타낸다. 더 나아가, 벽 비후화의 변화 양상은 두 영약 사이에서 상이하다 (P < 0. 0001). 각 시점에서의 벽 비후화 백분율에 대한 평균값이 그 다음 Tukey 방법에 의하여 두 영역 간의 차이에 대하여 시험되었다; 이 분석에 대한 P 값은 오차 막대의 아래에 나타낸다.FIG. 1 graphically illustrates the percentage of wall hypertrophy during tuning in a pig model of congestive heart failure. The percentage of wall hypertrophy was evaluated sequentially (as described in Example 1) as the heart failure progressed prior to tuning (day 0) and every 7 days within the ventricular septum and sidewall. Symbol represents an average value; The error bars represent one standard deviation (1 SD). The double-method ANOVA (repeated measures) indicates that the percentage of wall hypertrophy is affected by the control standard (P <0.0001) and the area (P = 0.001). Furthermore, the pattern of changes in wall hypertrophy is different between the two species (P <0.0001). The mean values for wall thickening percentages at each time point were then tested for differences between the two areas by the Tukey method; The P value for this analysis is shown below the error bars.

도 2A 및 2B는 실시예 1에 기재한 대로 울혈성 심부전의 돼지 모델에서 조율 동안의 심장내막하 혈류를 그래프로 나타낸다.Figures 2A and 2B are graphs of subchocardial blood flow during tune in a pig model of congestive heart failure as described in Example 1.

도 2A에 대하여, 심장내막하 (내부) 혈류가 x축을 따라 열거된 조건 하에서 심실간 격막과 측벽 내에서 순차적으로 평가되었다. 날은 측정값이 얻어진 조율 지속일을 가리킨다 (0, 조율의 시작; 14, 제 14 일; 21 - 28, 제 21 일 내지 제 28 일). PACE는 혈류 측정이 활성화된 (+) 심박조율기로 얻어졌는지 불활성화된 (0) 심박조율기로 얻어졌는지를 가리킨다. 심박조율기 속도는 225 bpm였다 (여기에 숫자 값으로 나타낸 표 3 을 참조.). 기호는 평균값을 나타내고; 오차 막대는 1 표준 편차 (1 SD)를 나타낸다. 이중-방법 ANOVA (반복측정)은 심장내막하 혈류가 대조표준간에 의하여 (P = 0.0001) 및 영역에 의하여 (P=0.017) 영향을 받음을 나타낸다. 더 나아가, 심장내막하 혈류의 변화 양상은 두 영역 사이에서 상이하다 (P < 0.006). 각 시점에서의 심장내막하 혈류에 대한 평균값이 그 다음에 Tukey 방법에 의하여 두 영역 간의 차이에 대하여 시험되었다; 이 분석에 대한 P 값은 오차 막대의 아래에 나타낸다.For FIG. 2A, intracardiac (internal) blood flow was sequentially evaluated in the ventricular septum and sidewall under the conditions listed along the x-axis. The day indicates the coarse continuation date for which the measured value is obtained (0, start of tuning; 14, 14, 21-28, 21-28). PACE indicates whether blood flow measurements were obtained with (+) paced or paced (0) pacemakers. The pacemaker speed was 225 bpm (see Table 3, here as a numerical value). Symbol represents an average value; The error bars represent one standard deviation (1 SD). The double-method ANOVA (repeated measures) indicates that subchocardial blood flow is affected by control norms (P = 0.0001) and by area (P = 0.017). Furthermore, changes in subchondral blood flow are different between the two regions (P <0.006). The mean value for endocardial perfusion at each time point was then tested for differences between the two regions by the Tukey method; The P value for this analysis is shown below the error bars.

도 2B에 대하여는, 심박동 당 심장내막하 (내부) 혈류가 x축을 따라 열거된 조건 하에서 심실간 격막과 측벽 내에서 순차적으로 평가되었다. 기호와 조건은 도 2A에서와 같다. (숫자값에 대하여는 여기의 표 4 참조.) 이중-방법 ANOVA (반복측정)은 심박동 당 심장내막하 혈류가 조율기간에 의하여 (P = 0.0001) 및 영역에 의하여 (P=0.0198) 영향을 받음을 나타낸다.For FIG. 2B, endocardial (internal) blood flow per heart rate was sequentially evaluated in the ventricular septum and sidewall under the conditions listed along the x-axis. The symbols and conditions are the same as in Fig. 2A. The double-method ANOVA (repeated measures) shows that endocardial perfusion per heart rate is affected by the tuning duration (P = 0.0001) and by the domain (P = 0.0198) .

도 3A는 심실간 격막과 측벽 내에서 조율 전 (제 0 일)과 매 7일 마다 심부전이 진행됨에 따라 (실시예 1에 기재된 바대로) 순차적으로 평가될 때의 세로 수축말기 측벽 응력을 그래프로 나타낸다. 이중-방법 ANOVA (반복측정)은 수축 측벽 응력이 조율기간에 의하여 (P < 0.0001) 영향을 받음을 나타낸다.FIG. 3A graphically depicts the end-systolic sidewall stresses as assessed sequentially (as described in Example 1) as the heart failure progresses before and after cohort (day 0) in the interventricular septum and sidewall . The double-method ANOVA (repeated measurement) indicates that the contraction sidewall stress is affected by the tuning period (P <0.0001).

도 3B는 실시예 1에 기재한 대로 울혈성 심부전의 돼지 모델에서 조율 동안의 관상혈관저항을 그래프로 나타낸다. 관상혈관저항의 표준이 x축을 따라 열거된 조건 하에서 심실간 격막과 측벽 내에서 순차적으로 평가되었다. 기호와 조건은 도 2A에서와 같다. 이중-방법 ANOVA (반복측정)은 관상혈관저항이 조율기간에 의하여 (P = 0.0001) 및 영역에 의하여 (P=0.013) 영향을 받음을 나타낸다. 더 나아가, 관상혈관저항의 변화 양상은 두 영역 사이에서 상이하다 (P < 0.006). 각 시점에서의심장내막하 혈류에 대한 평균값이 그 다음에 Tukey 방법에 의하여 두 영역 간의 차이에 대하여 시험되었다; 이 분석은 조율이 시작된 직후 관상혈관저항이 격막 내에서보다 측벽 내에서 더 높음을 나타내었다 (P 값은 오차 막대의 아래에 있음).Figure 3B graphically illustrates coronary vascular resistance during cochlea in a pig model of congestive heart failure as described in Example 1. The standard of coronary vascular resistance was evaluated sequentially in the ventricular septum and sidewall under the conditions listed along the x-axis. The symbols and conditions are the same as in Fig. 2A. The double-method ANOVA (repeated measures) indicates that coronary vascular resistance is affected by the tuning period (P = 0.0001) and by region (P = 0.013). Furthermore, changes in coronary vascular resistance differ between the two regions (P <0.006). The mean values for subchondral blood flow at each time point were then tested for differences between the two regions by the Tukey method; This analysis showed that coronary vascular resistance was higher in the sidewall than in the septum immediately after tuning began (P value is below the error bars).

도 4는 하기 실시예에 개재된 바와 같이 유전자 전달에 유용한 전형적인 복제능-결여 재조합 아데노바이러스 벡터 구성체의 구성도를 나타낸다.Figure 4 shows a schematic representation of a typical replication competent-defective recombinant adenovirus vector construct useful for gene delivery as interfered with in the Examples below.

도 5는 트랜스젠-코딩 아데노바이러스의 레스큐 재조합 구성체를 나타내는 개요도이다.Figure 5 is a schematic representation of a rescue recombinant construct of transgenic-coding adenovirus.

도 6A와 6B는, 실시예 5에서 기재된 바와 같이, 처리된 동물의 국부적 수축 기능을 그래프로 나타낸다. 도 6A는 유전자 전달 후 2 주 지난 시험 동물의 결과를 나타내고, 도 6B는 유전자 전달 후 12 주의 결과를 나타낸다.Figures 6A and 6B graphically depict the local contraction function of the treated animal, as described in Example 5. FIG. 6A shows the results of the test animals two weeks after gene transfer, and FIG. 6B shows the results of 12 weeks after gene transfer.

도 7A, 7B 및 7C는 심근 방사조영 심초음파검사에 대응하는 도식이다. 백색 영역은 방사조영 증강(더 많은 혈류)을 표시하고 암영역은 혈류의 감소를 표시한다. 7A는 정상 돼지에서 급성 LCx 폐색을 도식화한다. 7B는 lacZ로 유전자 전달된 후 14일에서의 IVS와 LCx상 간의 방사조영 증강을 도식화하는데, 이는 심방 조율 기간 동안에 두 영역에서의 상이한 혈류를 나타낸다(200 bpm). 도 7C에서는, FGF-5로 유전자 전달된 후 제 14일에서의 IVS와 LCx상 간의 방사조영 증강이 평형을 이루는 것으로 나타나는데, 이는 심방 조율 기간 동안에 두 영역에서의 혈류가 유사함을 나타낸다. 이들 결과는 실시예 5에 기재된다.Figures 7A, 7B and 7C are schematic diagrams corresponding to myocardial radiographic echocardiography. The white area indicates radiographic enhancement (more blood flow) and the dark area indicates a decrease in blood flow. 7A schematizes acute LCx occlusion in normal pigs. 7B depicts radiographic enhancement between the IVS and LCx phases at 14 days after gene transfer to lacZ, which exhibits different blood flow (200 bpm) in both regions during the atrial tune period. In FIG. 7C, radiographic enhancement between the IVS and LCx phases at day 14 after gene delivery to FGF-5 appears to be in equilibrium, indicating that blood flow in both regions is similar during the atrial tuning period. These results are described in Example 5.

도 8은, lacZ (대조표준 유전자) 및 FGF-5로 유전자 전달되기 전 또는 후 14 ±1 일에서의, 및 5 마리 동물에서의 FGF-5 유전자 전달 후 12 주에서의 심방조율기간동안 (200bpm)의, 컴퓨터-기초 비디오 분석 프로그램을 사용하여 비디오 영상으로부터 측정된, 심실간 격막 (IVS)내 최대 영상강도로 나눈 허혈부위 (LCx 상)내 최대 영상강도의 비로 표현되는 (혈류의 상관값인) 최대 방사조영비를 나타낸다 (실시예 5에 기재됨). 허혈상으로의 혈류는, 대조표준 유전자로 유전자 전달 후는 정상의 50 %였으나 FGF-5로 유전자 전달 후는 적어도 12 주 지속되는 효과로서 정상의 2 배 이상으로 증가하였다.Figure 8 shows that during the atrial tuning period (200 bpm) at 14 +/- 1 days before or after gene transfer to lacZ (control standard gene) and FGF-5, and at 12 weeks after FGF-5 gene transfer in 5 animals ), Expressed as the ratio of the maximum image intensity in the ischemic area (LCx phase) divided by the maximum image intensity in the interventricular septum (IVS) measured from the video image using a computer-based video analysis program ) Maximum emission contrast ratio (described in Example 5). The blood flow to the ischemic phase was 50% of normal after gene transfer as a control standard gene, but increased to more than twice that of normal as the effect lasted at least 12 weeks after FGF-5 gene transfer.

도 9는 lacZ 및 FGF-5로 유전자 전달 후 허혈 및 비허혈 부위에서의 현미경 분석에 의하여 정량될 때의 혈관 수를 나타낸다(실시예 5에 기재됨). lacZ 유전자를 수용한 동물과 비교하여 FGF-5 유전자 전달을 수용한 동물의 허혈 및 비허혈 부위에서의 각 섬유를 둘러싼 모세혈관의 증가가 있었다 (P<0.038).Figure 9 shows the number of blood vessels as quantified by microscopic analysis at ischemic and non-ischemic sites after gene transfer to lacZ and FGF-5 (described in Example 5). There was an increase in capillary blood flow around each fiber in the ischemic and non-ischemic areas of animals receiving FGF-5 gene transfer compared to animals receiving the lacZ gene (P <0.038).

도 10A, 10B 및 10C는 본 발명에 따른 심근으로의 혈관형성 트랜스젠의 유전자 전달 후 DNA, mRNA 및 단백질 발현을 기록하는 겔에서 유래한 것이다 (실시예 5에 기재된 바와 같음). 도 10D는 처리된 동물의 망막, 간 또는 골격근으로의 어떤 검출 가능한 유전자 전달도 없음을 나타내는 PCR 증폭후 겔에서 유래한 것이다 (실시예 5에 기재된 바와 같음).Figures 10A, 10B and 10C are from gels (as described in Example 5) that record DNA, mRNA and protein expression following gene transfer of an angiogenic transgene into the myocardium according to the present invention. Figure 10D is from a gel after PCR amplification (as described in Example 5) indicating no detectable gene transfer to the retina, liver or skeletal muscle of the treated animal.

도 11은, 실시예 6 및 7에서 기술된 바와 같이, 상이한 혈관형성 유전자 구성체 FGF-4, FGF-5 및 FGF-2LI +/-sp (즉, 분비 신호 펩티드 존재 또는 부존재 FGF-2LI)를 사용한 생체내 유전자 전달로 성취된 벽 비후화의 비교를 나타낸다.Figure 11 shows the use of different angiogenic genomes FGF-4, FGF-5 and FGF-2 LI +/- sp (i.e., the presence or absence of secretory signal peptide FGF-2LI), as described in Examples 6 and 7 This shows a comparison of wall hyperplasia achieved by in vivo gene transfer.

도 12는 (벽 비후화에 의하여 나타난 바와 같이) FGF-4 유전자 전달 후 허혈 부위 내 개선된 기능은 개선된 국부적 관류와 연관됨을 나타낸다.Figure 12 shows that improved function in the ischemic area after FGF-4 gene transfer (as indicated by wall thickening) is associated with improved local perfusion.

도 13은, 실시예 6 및 7에 기재된 바대로, FGF-4, FGF-5 및 FGF-2LI +/-sp (즉, 분비 신호 펩티드 존재 또는 부존재 FGF-2LI)의 주사로 결과된 관류 (혈류)의 비교를 나타낸다.Figure 13 shows the perfusion resulting from the injection of FGF-4, FGF-5 and FGF-2 LI +/- sp (i.e., the presence or absence of secretory signal peptide or absence FGF-2LI), as described in Examples 6 and 7 ). &Lt; / RTI &gt;

도 14는 실시예 7에 기재된 바대로, FGF-2 플러스 (FGF-2LI+sp) 또는 FGF-2 마이너스(FGF-2LI-sp)분비 신호 펩티드로의 유전자 전달의 결과인 관류 (혈류)의 비교를 나타낸다.Figure 14 shows the comparison of perfusion (blood flow) resulting from gene transfer to FGF-2 plus (FGF-2LI + sp) or FGF-2 minus (FGF-2LI-sp) secretory signal peptide, .

"심장질환"은 급성 및/또는 만성 심장 기능장애를 지칭한다. 심장질환은 종종 심장 수축 기능의 감소 질환과 연관되고, (예를 들어, 관상동맥 질환의 결과로서) 심근으로의 혈류의 식별가능한 감소와 연관될 수 있다. 심장질환의 징후는, 협심증, 심장 발작 및/또는 울혈성 심부전을 야기할 수 있는 심근 허혈을 포함한다.&Quot; Heart disease " refers to acute and / or chronic cardiac dysfunction. Heart disease is often associated with reduced disease of cardiac contractile function and may be associated with an identifiable decrease in blood flow to the myocardium (e.g., as a result of coronary artery disease). Signs of heart disease include myocardial ischemia, which can lead to angina, heart attacks and / or congestive heart failure.

"심근허혈"은, 전형적으로 심근으로의 부적당한 혈 공급에 의하여 (예를 들어, 관상동맥 질환의 결과로), 심근이 적당한 수준의 산소와 영양분을 받지 못하는 상태이다.&Quot; Myocardial ischemia " is a condition in which the myocardium does not receive adequate levels of oxygen and nutrients, typically due to inadequate blood supply to the myocardium (e. G., As a result of coronary artery disease).

"심부전"은 심장이 대사 요구에 맞게 적당한 혈류를 신체에 제공하지 못하는 상태로 임상적으로 정의된다. 증상은 호흡곤란, 피로, 쇠약, 다리부종, 및 운동 불내성을 포함한다. 신체 실험에서, 심부전 환자는 심박수 및 맥박수의 증가, 수포음(허파내 장액의 지표), 부종, 목정맥확장 및, 많은 경우에 있어, 심장 확장의 경향이 있다. 중증 심부전 환자는 매우 높은 사망률을 보이며; 전형적으로 증상의 발생 2년 이내에 환자의 50 %가 사망한다. 몇몇 경우에서, 여기와 당업계에서기술된 바와 같이, 심부전은 중증 관상동맥 질환 ("CAD")과 연관되고, 전형적으로 심근경색 및 진행성 만성 심부전 또는 급성 저박출량을 유발한다. 다른 경우에는, 심부전은 중증 관상동맥 질환과 무관한 확장된 심근증과 연관된다."Heart failure" is defined clinically as a condition in which the heart is unable to provide the body with the proper blood flow to meet metabolic demands. Symptoms include dyspnea, fatigue, weakness, leg swelling, and motor immobility. In physical studies, patients with heart failure have a tendency to increase heart rate and pulse rate, to the shade (index of intrathecal fluid), edema, neck vein dilatation, and, in many cases, heart enlargement. Patients with severe heart failure have a very high mortality rate; Typically, 50% of patients die within 2 years of symptom onset. In some cases, heart failure is associated with severe coronary artery disease (" CAD "), as described herein and in the art, and typically results in myocardial infarction and progressive chronic heart failure or acute low ejection. In other cases, heart failure is associated with extended cardiomyopathy independent of severe coronary artery disease.

"말초혈관 질환"은 말초 (즉, 비-심장) 혈관계 및/또는 그것에 의하여 공급되는 조직의 급성 또는 만성 기능장애를 지칭한다. 심장 질환과 마찬가지로, 전형적으로 말초혈관 질환은 혈관계에 의하여 공급되는 조직으로의 부적당한 혈류의 결과인데, 그 혈의 결핍은, 예를 들어 허혈 또는 중증의 경우에는 세포괴사를 야기한다. 말초혈관 질환의 양태들은 말초혈관 패쇄 질환 (PAOD)과 말초근육 허혈을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 빈번하게는, 말초혈관 질환의 증상은 환자의 사지, 특히 다리에서 징후가 나타난다.&Quot; Peripheral vascular disease " refers to an acute or chronic dysfunction of the peripheral (i.e., non-cardiac) vascular system and / or tissue supplied thereby. As with heart disease, peripheral vascular disease is typically the result of inadequate blood flow to tissues supplied by the vasculature, which deficiency leads to cell necrosis, for example in the case of ischemia or severe. Embodiments of peripheral vascular disease include, but are not limited to, peripheral vascular occlusive disease (PAOD) and peripheral muscle ischemia. Frequently, the symptoms of peripheral vascular disease manifest itself in the limbs of the patient, especially in the legs.

여기에서 사용될 때, "치료적 효과를 가지는" 및 "성공적 치료"는 본질적으로 동일한 의미를 가진다. 특히, 심장 질환을 앓는 환자는 그 환자가 본 발명의 방법에 따라 혈관형성 인자 트랜스젠을 수용한 후 심장 질환 증상이 식별 가능한/또는 측정 가능한 감소 또는 제거를 나타낸다면 그 상태에 대하여 성공적으로 "치료"된다. 이들 신호 또는 증상의 감소는 또한 환자에 의하여 감지될 수 있다. 따라서, 심장 질환 상태의 성공적 치료의 지표는, 협심증의 증상인 피로, 쇠약, 호흡곤란, 다리부종, 수포음, 심박수 및 맥박수의 증가, 부종, 목정맥확장 중 어느 하나에 있어서의 감소를 나타내거나 감지하는 환자를 포함한다. 환자는 또한 더 심한 운동 불내성을 감지하고, 개선된 심실 및 심 기능의 더 작은 심장을 가지며 일반적으로 심장 상태와 관련하여 더 드문 통원이 요구될 수도 있다. 심혈관 기능의 개선은 환자의 대사요구를 만족시킬정도로 적당할 수 있고 환자는 온화한 운동이나 휴식 시 증상을 나타내지 않을 수도 있다. 이들 신호와 증상 중 다수가 육안으로 식별가능하고/또는 의사에게 익숙한 통상적 과정에 의하여 측정 가능하다. 개선된 심혈관 기능의 지표는 처리된 조직에서의 증가된 혈류 및/또는 수축기능을 포함한다. 하기된 바와 같이, 환자의 혈류는 (Heart Disease, 4th ed., pp. 276-311 (Saunders, Philadelphia, 1992)에서 Braunwald이 기재한 바와 같이) 탈륨 영상화 또는 (Sahn, DJ., et al., Circulation. 58 : 1072-1083, 1978과 실시예 1과 5에서 기재된) 심초음파검사에 의하여 측정될 수 있다. 혈관형성 유전자 전달 전후의 혈류는 이 방법을 사용하여 비교될 수 있다. 상기한 바와 같이, 개선된 심기능은 감소된 신호 및 증상과 연관된다. 심초음파검사에 추가하여, 당업계에 알려진 것과 같은 (비-침습적) 핵 기술에 의하여 박출계수 (LV)를 측정할 수 있다. 혈류와 수축기능은 본 발명에 따라 치료된 말초 조직 내에서 마찬가지로 측정될 수 있다.As used herein, " having a therapeutic effect " and " successful treatment " have essentially the same meaning. In particular, a patient suffering from a heart condition will be able to successfully " treat " the condition if the patient exhibits an identifiable / measurable reduction or elimination of the cardiac disease symptoms after receiving the angiogenic factor transgene according to the method of the present invention "do. The reduction in these signals or symptoms can also be detected by the patient. Thus, an indicator of successful treatment of a cardiac condition is a decrease or manifestation of any of the symptoms of angina pectoris, fatigue, weakness, dyspnea, leg swelling, elevated heart rate, heart rate and pulse rate, edema, . The patient may also be required to detect a greater degree of motion intolerance, have a smaller heart with improved ventricular and cardiac function, and generally have less frequent visits in connection with cardiac conditions. Improvement of cardiovascular function may be adequate to meet the patient's metabolic needs, and the patient may not exhibit mild exercise or resting symptoms. Many of these signals and symptoms can be measured visually and / or by routine procedures familiar to the physician. Indicators of improved cardiovascular function include increased blood flow and / or contractile function in the treated tissue. As described below, the patient &apos; s blood flow is monitored by thallium imaging (Sahn, DJ., Et al., &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; Circulation. 58: 1072-1083, 1978 and Examples 1 and 5). Blood flow before and after angiogenic gene transfer can be compared using this method. As noted above, improved cardiac performance is associated with reduced signals and symptoms. In addition to echocardiography, the ejection fraction (LV) can be measured by a (non-invasive) nuclear technique as known in the art. Blood flow and contraction functions can be similarly measured in peripheral tissues treated according to the present invention.

"혈관형성 단백질 또는 펩티드"는 혈관형성 또는 혈관형성 활성, 즉 혈관 발생을 촉진시킬 수 있는 임의의 단백질 또는 펩티드를 지칭한다.An " angiogenic protein or peptide " refers to any protein or peptide capable of promoting angiogenesis or angiogenic activity, i. E. Angiogenesis.

"폴리뉴클레오티드"는 임의의 길이의 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체인 뉴클레오티드의 중합 형태를 지칭한다. 이 용어는 분자의 1차구조를 지칭하고 따라서 이중- 및 단일-사슬 DNA 뿐 아니라 이중- 및 단일-사슬 RNA 를 포함한다. 그것은 또한 메틸화 및/또는 캡핑된 것과 같은 변형된 폴리뉴클레오티드도 포함한다.&Quot; Polynucleotide " refers to a polymeric form of a nucleotide of any length, ribonucleotide or deoxyribonucleotide or an analogue thereof. The term refers to the primary structure of the molecule and thus includes double- and single-chain DNA as well as double- and single-chain RNA. It also includes modified polynucleotides such as methylated and / or capped.

"재조합체"는 폴리뉴클레오티드에 적용될 때 폴리뉴클레오티드가 천연에서발견되는 폴리뉴클레오티드와 구별되는 구조를 유발하는, 클로닝, 제한효소처리 및/또는 라이게이션 단계 및 다른 과정의 다양한 조합의 산물임을 의미한다.&Quot; Recombinant " means that the polynucleotide when applied to a polynucleotide is the product of various combinations of cloning, restriction enzyme treatment and / or ligation steps and other procedures which cause a structure distinct from polynucleotides found in nature.

"유전자" 또는 "트랜스젠"은 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부를 지칭한다. 대부분의 경우에 있어서, 유전자는 효과적으로 전사를 촉진시키기 위하여 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터도 또한 포함하는 것이 바람직하다. 당업계에 주지된 바와 같이, 인핸서, 저해제 및 다른 조절 서열 또한 유전자의 활성을 변형시키기 위하여 포함될 수 있다 (하기 인용된 참고문헌 참조).&Quot; Genes " or " transgenes " refer to a portion of a polynucleotide or polynucleotide comprising a sequence encoding a protein. In most cases, it is preferred that the gene also includes a promoter operably linked to the coding sequence to effectively promote transcription. As is well known in the art, enhancers, inhibitors and other regulatory sequences may also be included to modify the activity of a gene (see references cited below).

용어, "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하는데 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 또한 글리코실화, 아세틸화 및 인산화를 포함하는 반응을 통하여 번역후 변형된 단백질을 포함한다.The terms "polypeptide", "peptide", and "protein" are used interchangeably to refer to polymers of amino acids of any length. These terms also include post-translationally modified proteins through reactions involving glycosylation, acetylation and phosphorylation.

"이형" 구성요소는, 도입되거나 그것이 천연적으로 위치하는 것과는 상이한 존재물 내에서 생산된 구성요소를 지칭한다. 예를 들어, 한 생체로부터 유래하여 상이한 생체로 유전자 조작기술에 의하여 도입된 폴리뉴클레오티드는, 만약 발현된다면 이형 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 이형 폴리뉴클레오티드이다. 유사하게, 천연적 코딩 서열로부터 분리되어 상이한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터나 인핸서는 이형 프로모터나 인핸서가 된다.A " heterogeneous " component refers to a component that is introduced or is produced in an entity that differs from that which is naturally located. For example, a polynucleotide derived from a living organism and introduced into a different organism by genetic engineering is a heterologous polynucleotide capable of encoding a heterologous polypeptide, if expressed. Similarly, a promoter or enhancer that is operably linked to a different coding sequence, separated from the native coding sequence, is a heterologous promoter or enhancer.

"프로모터"는 여기에서 사용될 때, 그것이 작동가능하게 연결된 유전자나 코딩 서열의 전사를 조절하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 다양한 상이한 기원으로부터의 구성적, 유도적 및 억제적 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터가당업계 주지이고 (GenBank 같은 데이터베이스에 동정되어 있고), 클론된 폴리뉴클레오티드 서열로서 또는 그 안에서 (예를 들어 ATCC 기탁자뿐 아니라 다른 상업적 또는 개인적 기원으로부터) 이용가능하다.&Quot; Promoter " when used herein refers to a polynucleotide sequence that regulates the transcription of the operably linked gene or coding sequence. A number of promoters are known in the art, including constitutive, inducible and repressive promoters from a variety of different origins (identified in databases such as GenBank), as cloned polynucleotide sequences or within it (for example, ATCC Depository As well as from other commercial or personal origins.

"인핸서"는 여기에서 사용될 때, 그것이 작동가능하게 연결된 유전자나 코딩 서열의 전사를 증강시키는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 다양한 기원으로부터의 다수의 인핸서가 당업계에서 주지이고 (GenBank 같은 데이터베이스에 동정되어 있고) 클론된 폴리뉴클레오티드 서열로서 또는 그 안에서 (예를 들어 ATCC 기탁자뿐 아니라 다른 상업적 또는 개인적 기원으로부터) 이용가능하다. (일반적으로 사용되는 CMV 프로모터 같은) 프로모터 서열을 포함하는 다수의 폴리펩티드가 인핸서 서열 또한 포함한다.&Quot; Enhancer " when used herein refers to a polynucleotide sequence that augments transcription of the operably linked gene or coding sequence. A number of enhancers from a variety of sources are available in the art (as identified in databases such as GenBank) and as cloned polynucleotide sequences (e.g., from other commercial or personal origins as well as ATCC depositors). A number of polypeptides, including promoter sequences (such as the commonly used CMV promoter), also include enhancer sequences.

"작동가능하게 연결된"은 구성요소들이 의도된 방식으로 기능하는 것이 허용되는 관계에 있도록 된 둘 이상의 구성요소의 배열을 지칭한다. 프로모터가 유전자나 코딩 서열의 전사를 조절하면, 프로모터는 유전자나 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 비록 작동가능하게 연결된 프로모터는 일반적으로 코딩 서열의 상류에 위치하지만, 반드시 그것에 인접할 필요는 없다. 만일 인핸서가 코딩서열의 전사를 증가시키면 인핸서는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 코딩서열의 상류, 그 이내 또는 하류에 위치할 수 있다. 만일 코딩 서열 하류 말단에 위치하여 전사가 코딩 서열을 관통하여 폴리아데닐화 서열 내로 진행하면 폴리아데닐화 서열은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.&Quot; Operably connected " refers to an arrangement of two or more components such that the components are in a relationship that is allowed to function in an intended manner. When the promoter regulates transcription of the gene or coding sequence, the promoter is operably linked to the gene or coding sequence. Although operably linked promoters are generally upstream of the coding sequence, they need not be contiguous. If the enhancer increases the transcription of the coding sequence, the enhancer is operably linked to the coding sequence. The operably linked enhancer may be located upstream, within or downstream of the coding sequence. If the coding sequence is located at the downstream end and the transcription proceeds through the coding sequence into the polyadenylation sequence, the polyadenylation sequence is operably linked to the coding sequence.

"레플리콘"은 적당한 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드의 복제를 허용하는 복제시점을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 실시예는 (복제하는 플라스미드와 에피솜 같은) 염색체외 레플리콘 뿐 아니라 이형 핵산이 삽입될 수 있는 표적 세포의 염색체 (예를 들어 핵 및 미토콘드리아 염색체)를 포함한다.&Quot; Replicon " refers to polynucleotides that contain a cloning site that allows replication of the polynucleotide in a suitable host cell. Examples include chromosomes (e. G., Nuclear and mitochondrial chromosomes) of target cells into which heterologous nucleic acids can be inserted, as well as chromosomal replicons (such as replicating plasmids and episomes).

"유전자 송달", "유전자 전달" 등은 여기에서 사용될 때, 그 도입에 사용된 방법을 불문하고 (때로 "트랜스젠"이라 지칭되는) 외인성 폴리뉴클레오티드의 숙주 세포 내로의 도입을 지칭하는 용어이다. 이 같은 방법은 벡터-매개 유전자 전달 (예를 들어 바이러스 감염/트랜스펙션, 또는 다양한 다른 단백질-기초 또는 지질-기초 유전자 송달 복합체)뿐 아니라 (일렉트로포레이션, "유전자 권총" 송달 및 폴리펩티드의 도입을 위하여 사용되는 다양한 다른 기술 같은) "나(裸)"폴리펩티드의 송달을 용이하게하는 기술 같은 다양한 주지 기술을 포함한다. 도입된 폴리펩티드는 숙주 세포 내에서 안정하거나 일시적으로 유지된다. 안정한 유지는 삽입된 폴리펩티드가 숙주 세포와 비견할만 한 복제시점을 함유하거나, 염색체외 레플리콘 (예를들어 플라스미드)이나 핵 또는 미토콘드리아 염색체 같은 숙주세포의 레플리콘에 삽입될 것을 전형적으로 요구한다. 당업계 및 여기에 기재된 바와 같이, 다수의 벡터가 포유 세포로의 유전자의 전달을 매개할 수 있는 것으로 알려져 있다.&Quot; gene delivery ", " gene delivery " and the like, as used herein, are terms referring to the introduction of exogenous polynucleotides (sometimes referred to as "transgenes") into host cells, regardless of the method used for their introduction. Such methods include vector-mediated gene delivery (e. G., Viral infection / transfection, or various other protein-based or lipid-based gene delivery complexes) as well as electroporation, Quot; naked " polypeptides, such as various other techniques used for the &lt; / RTI &gt; The introduced polypeptide is stable or transiently maintained in the host cell. Stable maintenance typically requires that the inserted polypeptide contain a cloning time comparable to that of the host cell, or that it is inserted into a replicon of a host cell, such as a chromosomal replicon (e.g., a plasmid) or a nuclear or mitochondrial chromosome do. As is known in the art and described herein, a number of vectors are known to be capable of mediating the delivery of genes into mammalian cells.

"생체내" 유전자 송달, 유전자 전달, 유전자 요법 등은 여기에서 사용될 때, 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 인간 또는 비-인간 포유동물 생체 내로 직접 도입함에 의하여 외인성 폴리펩티드가 그 같은 생체의 세포 내로 생체내 도입되는 것을 지칭하는 용어이다.By " in vivo " gene delivery, gene delivery, gene therapy and the like, as used herein, the exogenous polypeptide is introduced into the cells of such a living organism by direct introduction of a vector comprising the exogenous polynucleotide into a human or non-human mammalian organism Quot; is introduced.

(종종 유전자 송달 또는 유전자 전달 "매개체"로 지칭되는) "벡터"는 시험관내 또는 생체내 숙주 세포로 송달될 폴리펩티드를 포함하는 고분자 또는 분자의 복합체를 지칭한다. 송달될 폴리펩티드는 유전자 요법에서의 관심의 코딩 서열을 포함할 수 있다.A " vector " (sometimes referred to as a gene delivery or gene delivery " mediator ") refers to a complex of a polymer or molecule comprising a polypeptide to be delivered in vitro or in vivo in a host cell. The polypeptide to be delivered may comprise the coding sequence of interest in gene therapy.

"혈관계" 또는 "혈관"은 포유 동물 신체를 통하여 혈 (뿐 아니라 림프액)을 운반하는 맥관 시스템을 지칭하는 용어이다.&Quot; Vascular system " or " vessel " is a term that refers to a vascular system that carries blood (as well as lymphatic fluid) through the mammalian body.

"혈관"은 동맥, 세동맥, 모세혈관, 시맥, 정맥, 수동(隨洞),및 맥관벽 혈관을 포함하는 포유동물 혈관 시스템의 임의의 맥관을 지칭한다. 심장 질환을 치료하는 본 발명의 바람직한 양태에서, 혈관형성 트랜스젠을 포함하는 벡터는 심근으로 혈을 공급하는 혈관 도관 내로 직접 도입된다. 이 같은 혈관 도관은 관상동맥 뿐 아니라 두렁정맥 또는 내유동맥 이식편 같은 맥관을 포함한다."Vascular" refers to any vascular system of the mammalian vascular system including arteries, arterioles, capillaries, veins, veins, vasculature, and vascular wall vessels. In a preferred embodiment of the present invention for treating heart disease, a vector comprising an angiogenic transgene is introduced directly into a blood vessel that supplies blood to the myocardium. Such vessels include not only coronary arteries but also veins such as bilge veins or intrahepatic vein grafts.

"동맥"은 심장으로부터 혈이 관통하여 나가는 혈관을 지칭한다. 관상동맥은 심장 자체에 조직을 공급하며, 다른 동맥은 신체의 나머지 기관에 공급한다. 관상동맥의 일반적인 구조는 다중층 동맥벽에 의하여 둘러싸인 내강으로 구성된다.&Quot; Artery " refers to blood vessels that pass through the blood from the heart. The coronary arteries supply tissue to the heart itself, while the other arteries feed the rest of the body. The general structure of coronary arteries consists of lumens surrounded by multilamellar walls.

"개체" 또는 "환자"는 포유 동물, 바람직하게는 큰 포유 동물, 가장 바람직하게는 인간이다.Is a mammal, preferably a large mammal, most preferably a human.

"치료" 또는 "치료법"은 여기에서 사용될 때 개체 상에서 예방, 치료 또는 다른 유익한 효과를 도출할 수 있는 작용제를 개별 환자에게 투여하는 것을 지칭한다.&Quot; Treatment " or " treatment ", as used herein, refers to administration of an agent to an individual patient that is capable of eliciting preventive, therapeutic or other beneficial effects on the individual.

"유전자 요법"은 여기에서 사용될 때 치료적 유전자를 포함하는 벡터를 개별 환자에게 투여하는 것을 지칭한다.&Quot; Gene therapy ", as used herein, refers to administering a vector comprising a therapeutic gene to an individual patient.

"치료적 폴리펩티드" 또는 "치료적 유전자"는 개체에 전달되었을 때 그 개체에서 예방, 치료 또는 다른 유익한 효과를 도출할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.&Quot; Therapeutic polypeptide " or " therapeutic gene " refers to a nucleotide sequence that, when delivered to a subject, can result in prevention, treatment, or other beneficial effect in the subject.

참고문헌references

본 발명의 실시는 다르게 지시되어 있지 않으면, 당업계의 기술에 속하는 분자생물학 등의 전통적 기술을 채용한다. 이 같은 기술은 논문에 설명되어 있다. 예를 들어, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) ; Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al. eds., 1987 and updated) ; Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press 1991) ; Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991) ; Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell et al. eds., Bartlett Publ. 1990) ; Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990) ; Recombinant DNA Methodology (R. Wu et al. eds., Academic Press 1989) ; PCR : A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991) ; Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990) ; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos eds., 1987) ; Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler ed., 1991) ; Animal Cell Culture (J. Pollard et al. eds., Humana Press 1990) ; Culture of Animal Cells, 2nd Ed. (R. Freshney et al. eds., Alan R. Liss 1987) ; Flow Cytometry and Sorting(M. Melamed et al. eds., Wiley-Liss 1990) ; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) ; Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock & P. Petrusz eds., Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989) ; Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir & C. Blackwell, eds.) ; Cellular and Molecular Immunology (A. Abbas et al., W. B. Saunders Co. 1991, 1994) ; Current Protocols in Immunology (J. Coligan et al. eds. 1991) ; the series Annual Review of Immunology ; the series Advances in Immunology ; Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984) ; Animal Cell Culture (R. Freshney ed., IRL Press 1987) ; the series Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology (Lippincott, Williams & Wilkins publishers for the American Heart Association) ; the series Circulation (Lippincott, Williams & Wilkins publishers for the American Heart Association) ; 및 the series Circulation Research (Lippincott, Williams & Wilkins publishers for the American Heart Association)를 참조.The practice of the present invention employs conventional techniques, such as molecular biology, within the skill of the art, unless otherwise indicated. These techniques are described in the paper. For example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al. Eds., 1987 and updated); Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell et al., Eds., Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology (R. Wu et al., Eds., Academic Press 1989); PCR: A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991); Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos eds., 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler ed., 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard et al., Eds., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2nd Ed. (R. Freshney et al., Eds., Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed et al., Eds., Wiley-Liss 1990); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock & P. Petrusz eds., Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir & C. Blackwell, eds.); Cellular and Molecular Immunology (A. Abbas et al., W. B. Saunders Co. 1991, 1994); Current Protocols in Immunology (J. Coligan et al. the series Annual Review of Immunology; the series Advances in Immunology; Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney ed., IRL Press 1987); the series Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology (Lippincott, Williams & Wilkins publishers for the American Heart Association); the series Circulation (Lippincott, Williams & Wilkins publishers for the American Heart Association); And the series Circulation Research (Lippincott, Williams & Wilkins publishers for the American Heart Association).

본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 송달 및 수술의 세부기술을 기재한 추가적 참고문헌은 다음: Topol, EJ (ed.), The Textbook of Interventional Cardiology, 2nd Ed. (W. B. Saunders Co. 1994) ; Rutherford, RB, Vascular Surgery, 3rd Ed. (W. B. Saunders Co. 1989) ; The Cecil Textbook of Medicine, 19th Ed. (W. B. 1992) ; 및 Sabiston, D, The Textbook of Surgery, 14th Ed. (W. B. 1991)을 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 혈관에서 발견되는 세포형 및 혈관계의 세포형을 기재하는 추가적 참고문헌은 다음: W. Bloom & D. Fawcett, A Textbook of Histology (V. B. Saunders Co. 1975)을 포함한다..Additional references describing the detailed description of delivery and surgery that can be used in the methods of the present invention are provided in: Topol, EJ (ed.), The Textbook of Interventional Cardiology, 2nd Ed. (W. B. Saunders Co. 1994); Rutherford, RB, Vascular Surgery, 3rd Ed. (W. B. Saunders Co. 1989); The Cecil Textbook of Medicine, 19th Ed. (W. B. 1992); And Sabiston, D, The Textbook of Surgery, 14th Ed. (W. B. 1991). Additional references describing cell types and vascular system cell types found in blood vessels useful in the methods of the present invention include the following: W. Bloom & D. Fawcett, A Textbook of Histology (V. B. Saunders Co. 1975).

많은 간행물이 심장 질환을 포함하는 질환의 방지를 위하여 유전자 전달의 사용을 전제하고 있다. 예를 들어, Methods in Virology, Vol. 7 : Gene Transfer and Expression Protocols, Murray, E. (ed.), Weiss, Clifton, N. J., 1991 ; Mazur et al., Molecular and Cellular Biology, 21 : 104-111, 1994 ; French, Herz 18 : 222-229, 1993 ; Williams, Journal of Medical Sciences 306 : 129-136, 1993 ; 및 Schneider, Circulation 88 : 1937-1942, 1993를 참조.Many publications are predicated on the use of gene delivery to prevent diseases involving heart disease. See, for example, Methods in Virology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray, E. (ed.), Weiss, Clifton, N. J., 1991; Mazur et al., Molecular and Cellular Biology, 21: 104-111, 1994; French, Herz 18: 222-229, 1993; Williams, Journal of Medical Sciences 306: 129-136, 1993; And Schneider, Circulation 88: 1937-1942, 1993.

상기 인용된 참고문헌은, 이들 참고문헌이 본 발명의 실시에서 채용하는 기술을 교시한다는 정도로 여기에 참고문헌으로서 이것에 의하여 수록된다.The cited references are hereby incorporated by reference herein to the extent that these references teach the techniques employed in the practice of the invention.

참고문헌에 의한 수록Included by references

특허, 특허출원, 및 다른 간행물을 포함하는, 이 출원 내에서 인용된 참고문헌 모두는 참고로서 여기에 수록된다.All references cited within this application, including patents, patent applications, and other publications, are incorporated herein by reference.

다양한 바람직한 구체예의 상세한 설명Detailed Description of Various Preferred Embodiments

본 명의 다양한 바람직한 양태가 하기에 요약되고 이어지는 상세한 설명과 도면에서 더 기재하고 설시한다.Various preferred embodiments of the present invention will be described and illustrated in the following detailed description and the accompanying drawings.

본 발명은 심근 허혈, 심부전 및 말초혈관 질환을 포함하는 심혈관 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관련된다.The present invention relates to methods and compositions for treating cardiovascular diseases, including myocardial ischemia, heart failure and peripheral vascular disease.

본 발명에서, 심장질환을 치료하기 위하여, 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터 구성체가 환자의 심장에 표적화되어, 외인성 혈관형성 단백질이 심근에서 발현되고 따라서 혈류를 개선시키고/또는 심장 수축기능을 개선시켜 심기능 장애를 완화시킨다. 개선된 심장 기능은 궁극적으로 하나 이상의 심장 질환 또는 심부전의 증상의 감소로 나아가고 예상 생존율 이상으로 생명을 연장시킨다.In the present invention, in order to treat a heart disease, a vector construct containing a gene encoding an angiogenic protein or peptide is targeted to the heart of a patient so that the exogenous angiogenic protein is expressed in the myocardium and thus improves blood flow and / It improves the contractile function and alleviates the cardiac dysfunction. Improved cardiac function ultimately leads to a reduction of symptoms of one or more heart disease or heart failure and prolongs life beyond the expected survival rate.

유사하게, 본 발명의 방법에 따르는 말초혈관질환의 치료에서, 적어도 하나의 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트랜스젠을 함유하는 벡터 구성체가 영향받은 조직으로 예를 들어 허혈성 골격근으로 표적화되어, 외인성 혈관형성 단백질의 합성이, 예를 들어 조직의 영향받은(예를 들어 허혈의) 부위에 혈류를 증가시키고/또는 영향받은 근육의 수축기능을 개선시킴으로써 말초혈관 질환의 증상을 완화시키고/또는 치유한다.Similarly, in the treatment of peripheral vascular disease according to the method of the present invention, a vector construct containing a transgene encoding at least one angiogenic protein or peptide is targeted to the affected tissue, for example to an ischemic skeletal muscle, The synthesis of forming proteins alleviates and / or cures the symptoms of peripheral vascular disease, for example, by increasing blood flow to the affected (e.g., ischemic) site of the tissue and / or by improving the contractile function of the affected muscle.

따라서, 바람직한 양태에서 본 발명은, 바람직하게는 한쪽 또는 양쪽의 관상동맥 (또는 이식편) 내로 직접 벡터를 주사함에 의하여, 트랜스젠-삽입 벡터를, 트랜스젠이 발현되어 혈류 및/또는 수축 기능이 개선되는 환자의 심근에 송달하는 단계를 포함하는, 심근허혈 환자의 심장질환을 치료하는 방법을 제공한다. 서술의 수단으로서, 치료학적으로 의미있는 정도로 심근 내에서 지속 기간동안 연속적으로 단백질 또는 펩티드가 발현되는 심장내로 송달되는, 예를 들어 FGF-5, FGF-4, aFGF, bFGF 및/또는 VEGF 같은 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트랜스젠을 포함하는 벡터를 사용하여, 심근의 영향받은 부위에서 혈관형성이 촉진될 수 있다. β-아드레날린성 신호 단백질 또는 다른 심- 또는 근육-증강 단백질을 코딩하는 것과 같은 다른 트랜스젠 또한, 하기한 바와 같이 혈관형성 트랜스젠의 사용과결합하여 사용될 수 있다. 본 발명에서 채용된 벡터는 플라스미드나 바람직하게는 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스나 아데노바이러스-연관 바이러스 (AAV)일 수 있다. 야생형 바이러스가 거의 없거나 전혀 없는 것 같은 바이러스 벡터 스톡을 하나 이상의 관상동맥 (또는 이식편), 바람직하게는 양쪽 좌 및 우관상동맥 (또는 이식편) 내강 깊숙이, 바람직하게는 광학밀도계로 측정하여 10⁷내지 10¹³바이러스 입자 분량으로 (더욱 바람직하게는 10⁹내지 10¹¹바이러스 입자 분량으로)주사함으로써, 원하는 수의 세포를 혈관형성 단백질 -또는 펩티드- 를 코딩하는 유전자로 영향 받은 심근 내로 국부적으로 트랜스펙션시켜 유전자 전달의 치료 효율을 최대화하고 심장외 부위에서의 바람직하지 않은 혈관형성과 바이러스 단백질에 대한 염증반응의 가능성을 최소화하는 것이 가능하다.Thus, in a preferred embodiment, the present invention relates to a method of transgene-inserting a transgene-inserted vector, preferably by direct injection of a vector into one or both coronary arteries (or grafts), whereby the transgene is expressed to improve blood flow and / To a myocardium of a subject suffering from myocardial ischemia. As a means of describing, blood vessels such as FGF-5, FGF-4, aFGF, bFGF and / or VEGF, which are delivered into the heart in which the protein or peptide is continuously expressed for a sustained period in the myocardium in a therapeutically significant degree Using a vector comprising a transgene encoding a forming protein or peptide, angiogenesis may be promoted in the affected area of the myocardium. Other transgenes such as those encoding beta-adrenergic signal proteins or other cardiac-or muscle-enhancing proteins can also be used in conjunction with the use of angiogenic transgenes, as described below. The vector employed in the present invention may be a plasmid or preferably a viral vector, for example an adenovirus or an adenovirus-associated virus (AAV). Wild-type virus has little or one or more of the coronary arteries of a viral vector stock, such that no (or grafts), preferably deep into both the left and right coronary arteries (or graft) lumen, preferably an optical density to step measures 10 ⁷ to 10 ^13, by scanning with a virus particle volume (more preferably 10 ⁹ to 10 ¹¹ virus particles, portions), the desired number of cells, angiogenic protein - to design the local transfected into the myocardium affected by a gene encoding a-or peptide It is possible to maximize the therapeutic efficiency of gene transfer and to minimize the possibility of undesirable angiogenesis at the extra-cardiac region and inflammatory response to viral proteins.

다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 또한 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하고 심장에서 발현되어 증가된 혈류 및 기능을 야기하는 트랜스젠을 포함하는 트랜스젠-삽입 벡터를 환자의 심장에 송달함으로써 울혈성 심부전 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 이 같은 울혈성 심부전을 앓는 환자 중에는 확장된 심근증을 나타내는 환자 및 중증 심근경색, 전형적으로 중증 또는 패색성 관상동맥 질환을 나타내는 환자가 있다. 백터는, 벡터를 심근으로 송달하도록 심장의 심근으로 혈을 공급하는 혈관 내로 바람직하게 도입된다. 바람직하게는 벡터는 관상동맥, 두렁정맥 이식편, 또는 내유동맥 이식편의 내강 내로 도입된다; 가장 바람직하게는, 벡터는 좌 및 우관상동맥 양쪽의 내강 내로 도입된다. 관상맥내 주사가 단일주사로 각선택의 동맥 내로 상대적으로 깊숙이 (예를 들어, 맥관의 내강 적어도 약 1cm 내로) 행하여진다.In another preferred embodiment, the invention also provides a method of treating a patient suffering from a congestive heart failure patient, comprising administering to the patient's heart a transgenic-insertion vector that encodes an angiogenic protein or peptide and that is expressed in the heart to produce increased blood flow and function, &Lt; / RTI &gt; Among patients with such congestive heart failure, there are patients presenting with enlarged cardiomyopathy and patients presenting with severe myocardial infarction, typically with severe or complicated coronary artery disease. The vector is preferably introduced into a blood vessel that supplies blood to the cardiac muscle of the heart to deliver the vector to the myocardium. Preferably the vector is introduced into the lumen of a coronary artery, a bovine venous graft, or an internal mammary artery graft; Most preferably, the vector is introduced into the lumen of both the left and right coronary arteries. Coronary intramuscular injection is performed relatively deeply into each selected artery (e.g., within at least about 1 cm of the lumen of the vasculature) with a single injection.

본 발명의 기술은 또한 심근경색을 앓(거나 앓을 수 있)는 환자에서 악성 심실 재형성을 방지하거나 완화시키는데 유용하다. 반복하면, 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는, 바람직하게는 그 유전자를 발현시키기 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된, 트랜스젠을 포함하는 벡터가 환자의 심장으로 송달되어, 그곳에서 트랜스젠이 발현되고 악성 심실 재형성은 완화된다.The techniques of the present invention are also useful for preventing or alleviating malignant ventricular remodeling in patients with (or may be suffering from) myocardial infarction. Once again, a vector comprising a transgene encoding an angiogenic protein or peptide, preferably operably linked to a promoter for expressing the gene, is delivered to the patient's heart, where the transgene is expressed, Ventricular remodeling is relieved.

혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트랜스젠Transgenes encoding angiogenic proteins or peptides

본 발명에서는, 혈류 및/또는 수축기능을 증강시킬 수 있는 혈관 형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 하나 이상의 트랜스젠이 사용될 수 있다. 여기와 당업계에서 기재된 방법에 의하여 측정될 수 있는, 혈관형성 활성을 나타내는 어떤 단백질 또는 펩티드도 본 발명과 관련되어 잠재적으로 채용될 수 있다. 다수의 이 같은 혈관형성 단백질이 당업계에 알려져있고 새로운 형태가 일상적으로 동정된다. 적당한 혈관형성 단백질 또는 펩티드가 섬유모세포 성장인자(FGF), 혈관내피세포 성장인자 (VEGF), 혈소판-유래 성장인자 (PDGF), 인슐린-유사 성장인자 (IGF), 및 다른 것들의 부류의 구성원에 의하여 예시된다. FGF 부류는 aFGF (FGF-1), bFGF (FGF-2), ("hst/KS3"로도 알려진) FGF-4, FGF-5, FGF-6를 포함하나 이에 한정되지 않는다. VEGF는 허혈에 반응하여 생체내 및 시험관내에서 심근세포에 의하여 발현된다 (Banai et al. Circulation 89 : 2183-2189, 1994). VEGF 부류는 VEGF-A 아부류 (예를 들어, VEGF-121, VEGF-145, VEGF-165, VEGF-189 및 VEGF-206)의 구성원뿐 아니라, VEGF-B 아부류 (예를 들어 VEGF-167와 VEGF-186)및 VEGF-C 아부류의 구성원을 포함한다. PDGF는 예를 들어 PDGF A와 PDGF B를 포함하고, IGF는 예를 들어, IGF-1을 포함한다. 다른 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 당업계에 알려져 있고 새로운 것들은 정규적으로 동정된다. 이들 및 다른 단백질을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열과 대응하는 아미노산 서열은 마찬가지로 당업계에서 알려져 있다 (예를 들어 GENBANK 서열 데이터베이스 참조).In the present invention, one or more transgenes encoding an angiogenic protein or peptide capable of enhancing blood flow and / or contractile function may be used. Certain proteins or peptides exhibiting angiogenic activity, which can be measured by the methods described herein and in the art, can potentially be employed in connection with the present invention. Many such angiogenic proteins are known in the art and new forms are routinely identified. Appropriate angiogenic proteins or peptides are found in members of the family of fibroblast growth factor (FGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), platelet-derived growth factor (PDGF), insulin-like growth factor (IGF) . FGF classes include, but are not limited to, aFGF (FGF-1), bFGF (FGF-2), FGF-4 (also known as "hst / KS3"), FGF-5 and FGF-6. VEGF is expressed by cardiomyocytes in vivo and in vitro in response to ischemia (Banai et al. Circulation 89: 2183-2189, 1994). The VEGF family includes members of the VEGF-A subgroup (e.g., VEGF-121, VEGF-145, VEGF-165, VEGF-189 and VEGF- And VEGF-186) and members of the VEGF-C subclass. PDGF includes, for example, PDGF A and PDGF B, and IGF includes, for example, IGF-1. Other angiogenic proteins or peptides are known in the art and new ones are routinely identified. Amino acid sequences corresponding to the nucleotide sequences of genes encoding these and other proteins are likewise known in the art (see, for example, the GENBANK sequence database).

혈관형성 단백질 및 펩티드는 활성 펩티드 및 혈관형성 단백질 또는 펩티드의 "유도체" 및 "기능적 균등물"로 번역후 프로세싱되는 펩티드 전구체를 포함한다. 혈관형성 단백질 또는 펩티드의 유도체는 유사한 아미노산 서열을 가지고 관련 혈관형성 단백질 또는 펩티드의 하나 이상의 활성을 어느정도 가지는 펩티드이다. 당업자에게 주지인 바와 같이, 유용한 유도체는 일반적으로 혈관형성 활성과 연관된 단백질의 영역 또는 도메인에 있어 (아미노산 수준에서) 실질적인 서열 유사성을 가진다. 유사하게, 당업계 숙련자는 "기능적 균등물"이 특정 혈관형성 단백질 또는 펩티드의 하나 이상의 활성과 치환될 수 있는 활성을 가지는 단백질 또는 펩티드를 의미한다는 것을 잘 인식하고 있다. 바람직한 기능적 균등물은 특정 혈관형성 단백질 또는 펩티드의 모든 활성들을 보유한다; 하지만, 기능적 균등물은 그 활성을 정량적으로 측정하는 경우에 야생형 펩티드나 단백질보다 더 강하거나 약한 활성을 가질 수 있다.Angiogenic proteins and peptides include active peptides and peptide precursors that are post-translationally processed into " derivatives " and " functional equivalents " of angiogenic proteins or peptides. An angiogenic protein or derivative of a peptide is a peptide having a similar amino acid sequence and having at least some of the activity of the relevant angiogenic protein or peptide. As is well known to those skilled in the art, useful derivatives generally have substantial sequence similarity (at the amino acid level) in the region or domain of the protein associated with angiogenic activity. Similarly, those skilled in the art are well aware that the term " functional equivalent " refers to a protein or peptide that has activity that can be displaced by one or more activities of a particular angiogenic protein or peptide. Preferred functional equivalents retain all activities of a particular angiogenic protein or peptide; However, functional equivalents may have stronger or weaker activity than wild-type peptides or proteins when quantitatively measuring their activity.

FGF 부류에 대한 더 상세한 것은, 예를 들어, Burgess, Ann. N. Y. Acad. Sci. 638 : 89-97, 1991 ; Burgess et al.Annu. Rev. Biochem.58 : 575-606,1989 ; Muhlhauser et al.,Hum. Gene Ther.6 : 1457-1465, 1995 ; Zhan et al.,Mol. Cell. Biol., 8 : 3487, 1988 ; Seddon et al., Ann.. N. Y. Acad. Sci. 638 : 98-108, 1991을 참조. 인간 hst/KS3 (즉 FGF-4)에 대하여는, Taira et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 : 2980-2984, 1987을 참조. 인간 VEGF-A 단백질에 대하여는, 예를 들어, Tischer et al.J. Biol. Chem.206 : 11947-11954, 1991, 및 그 안에 있는 참고문헌 ; Muhlhauser et al.,Circ. Res.77 : 1077-1086, 1995 ; 및 Neufeld et al., WO 98/10071 (1998년 3월 12일)을 참조. 알려진 혈관형성 단백질의 다른 변이체도 마찬가지로 기재된다; 예를 들어 VEGF 단백질과 VEGF 관련 단백질의 변이체는 예를 들어, Baird et al., WO 99/40197, (1999년 8월 12일) ; 및 Bohlen et al., WO 98/49300, (1998년 11월 5일)을 참조. 혈관형성 단백질의 조합과 그런 조합을 코딩하는 벡터를 송달하는 유전자는, 766, 2000년 6월 30일 출원하고, "Dual Recombinant Gene Therapy Compositions and Methods of Use"가 발명의 제목이며, 그 전체로 여기에 참고문헌으로써 수록된 Gao et al. USSN 09/607에 기재된다. 당업계 숙련자가 또한 잘 이해하고 있는 바와 같이, 혈관형성 단백질은 다른 혈관형성 단백질의 발현, 안정성 또는 기능성을 증강시킴으로써 혈관형성을 촉진시킬 수 있다. 이 같은 혈관형성 단백질 또는 펩티드의 예는, 예를 들어, 저산소증에 반응하여 유도되는 조절인자 (예를 들어 Hif-1, Hif-2 등과 같은 저산소증-유도인자를 포함한다; 예를 들어, Wang et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 (9) : 4304-8, 1993 ; Forsythe et al.,Mol. Cell. Biol.16 (9) : 4604-13, 1996 ; Semenza et al., Kidney Int., 51 (2) : 553-5, 1997 ; 및 O'Rourke et al.,Oncol. Res., 9 (6-7) : 327-32, 1997을 참조) ; 뿐 아니라 예를 들어 염증같은 심혈관 질환과 연관된 생리학적 상태에 의하여 유도되는 것같은 다른 조절인자를 포함한다 (예를 들어, 유도성 산화질소 신세아제 (iNOS), 뿐 아니라 그것의 구성적 상대인, cNOS ; 예를 들어, Yoshizumi et al.,Circ. Res., 73 (1) : 205-9, 1993 ; Chartrain et al.,J. Biol. Chem., 269 (9) : 6765-72, 1994 ; Papapetropoulos et al.,Am. J. Pathol., 150 (5) : 1835-44, 1997 ; and Palmer, et al.,Am. J. Physiol., 274 (2 Pt 1) : L212-9, 1998를 참조). 이 같은 혈과형성 단백질의 추가적 예는 특정 인슐린-유사 성장인자(예를 들어, IGF-1), 및 VEGF 같은 다른 혈관형성 단백질의 발현 및/또는 활성을 촉진 및/또는 자극하는 것으로 보고된 앤지오포이에틴 (Angs)을 포함한다 (예를 들어, Goad, et al,Endocrinology, 137 (6) : 2262-68 (1996) ; Warren, et al.,J. Bio. Chem., 271 (46) : 29483-88 (1996) ; Punglia, et al,Diabetes, 46 (10) : 1619-26 (1997) ; 및 Asahara, et al.,Circ. Res., 83 (3) : 233-40 (1998) 및 Bermont et al.Int. J. Cancer85 : 117-123, 2000을 참조). 유사하게, 생체내에서 혈관형성을 유도하는 것으로 보고되어 온 (Scatter 인자라고도 지칭되는) 간세포 성장인자 (예를 들어, Grant et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 : 1937-1941, 1993참조) 또한 VEGF의 발현을 증가시키는 것으로 보고되어 왔다 (예를 들어, Wojta et al., Lab Invest. 79 : 427-438, 1999 참조). 혈관형성 폴리펩티드의 추가적 예는 내인성 혈관형성 유전자의 프로모터 역할을 하는 천연적 및 합성 조절 펩티드 (혈관형성조절자)를 포함한다. 천연적 혈관형성 폴리펩티드 조절자는 내인성 혈관형성 유전자의 유도체로부터 유래될 수 있다. 상기한 바와 같이, Hif는 다른 혈관형성 유전자의 발현을 유도함으로써 혈관형성을 촉진시키는 것으로 보고된 혈관형성 유전자의 설명적 실례이다. 합성 혈관형성 폴리펩티드 조절자는, 예를 들어, 내인성 혈관형성 유전자의 코딩영역의 서열 상류에 특이적으로 결합하고 이 같은 내인성 유전자의 발현을 유도할 수 있는 다중-핑거 아연-결합 단백질을 제조함으로써 고안될 수 있다. 다수의 유전자의 연구는 이 같은 아연-핑거 DNA 결합 단백질의 고안을 위한 "법칙"의 발전을 야기하였다 (예를 들어, Rhodes and Klug,Scientific American, 1993년 2월, pp 56-65 ; Choo and Klug,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (23) : 11163-7, 1994 ; Rebar 및 Pabo,Science, 263 (5147) : 671-3, 1994 ; Choo et al.,J. Mol. Biol., 273 (3) : 525-32, 1997 ; Pomerantz et al.,Science267 : 93-96, 1995 ; 및 Liu et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 : 5525-5530, 1997를 참조). 당업계 숙련자에게 잘 이해될 바와 같이, 혈관형성을 직간접적으로 촉진시키는 능력을 가지는 다수의 추가적 유전자가 정규적으로 동정되고, 새로운 유전자는 유전자의 알려진 혈관형성 단백질 또는 펩티드에 대한 또는 이 같은 유전자의 혈관형성을 촉진하는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 능력에 대한 유사성에 기초하여 동정될 것이다. 이 같은 유전자 및 코딩된 폴리펩티드에 대한 서열 정보는 GenBank나 EMBL 같은 서열 데이터베이스로부터 쉽게 얻을 수 있다. 이들 단백질을 코딩하는 폴리펩티드는 또한 예를 들어 당업계에 일상적인 PCR이나 혼성화 기술을 사용하여 유전자 라이브러리로부터 얻을 수 있다.More details on the FGF class can be found, for example, in Burgess, Ann. NY Acad. Sci. 638: 89-97, 1991; Burgess et al. Annu. Rev. Biochem. 58: 575-606, 1989; Muhlhauser et al., Hum. Gene Ther. 6: 1457-1465,1995; Zhan et al., Mol. Cell. Biol. , 8: 3487, 1988; Seddon et al., Ann .. NY Acad. Sci. 638: 98-108, 1991. For human hst / KS3 (i.e., FGF-4), Taira et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2980-2984, 1987. For human VEGF-A protein, see, for example, Tischer et al. J. Biol. Chem. 206: 11947-11954, 1991, and references therein; Muhlhauser et al., Circ. Res. 77: 1077-1086,1995; And Neufeld et al., WO 98/10071 (12 March 1998). Other variants of known angiogenic proteins are likewise described; For example, variants of VEGF proteins and VEGF related proteins are described, for example, in Baird et al., WO 99/40197, (Aug. 12, 1999); And Bohlen et al., WO 98/49300, (5 November 1998). Genes that deliver vectors that combine angiogenic proteins and vectors that code such combinations are filed on June 30, 2000, and entitled " Dual Recombinant Gene Therapy Compositions and Methods of Use " Gao et &lt; RTI ID = 0.0 &gt; al., &Lt; / RTI &gt; USSN 09/607. As one of ordinary skill in the art also appreciates, angiogenic proteins can promote angiogenesis by enhancing the expression, stability, or functionality of other angiogenic proteins. Examples of such angiogenic proteins or peptides include, for example, regulatory elements that are induced in response to hypoxia (e.g., hypoxia-inducible factors such as Hif-1, Hif-2, etc; see, for example, Wang et USA, 90 (9): 4304-8, 1993; Forsythe et al., Mol. Cell Biol. 16 (9): 4604-13, 1996; Semenza et al., Kidney Int., 51 (2): 553-5, 1997; and O'Rourke et al., Oncol. Res. , 9 (6-7): 327-32, 1997); As well as other regulatory factors such as those induced by physiological conditions associated with cardiovascular disease, such as inflammation (for example, inducible nitric oxide synthase (iNOS), as well as its constitutive counterparts, cNOS; for example, Yoshizumi et al., Circ. Res. , 73 (1): 205-9, 1993; Chartrain et al., J. Biol. Chem. , 269 (9): 6765-72, 1994; ... Papapetropoulos et al, Am J. Pathol, 150 (5): 1835-44, 1997; and Palmer, et al, Am J. Physiol, 274 (2 Pt 1):... L212-9, 1998 Reference). Additional examples of such haemopoietic proteins include, but are not limited to, certain angiogenic growth factors (e.g., IGF-1), angiomas reported to promote and / or stimulate the expression and / or activity of other angiogenic proteins such as VEGF includes Va'a-o the tin (Angs) (e.g., Goad, et al, Endocrinology, 137 (6):... 2262-68 (1996); Warren, et al, J. Bio Chem, 271 (46) Et al., Circ. Res. , 83 (3): 233-40 (1998), pp . 29483-88 (1996); Punglia et al., Diabetes , 46 (10): 1619-26 And Bermont et al. Int. J. Cancer 85: 117-123, 2000). Similarly, hepatocyte growth factor (also referred to as the Scatter factor), which has been reported to induce angiogenesis in vivo (see, for example, Grant et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1937-1941, 1993 ) Have also been reported to increase the expression of VEGF (see, for example, Wojta et al., Lab Invest. 79: 427-438, 1999). Additional examples of angiogenic polypeptides include natural and synthetic modulatory peptides (angiogenesis regulators) that act as promoters of endogenous angiogenic genes. Natural angiogenic polypeptide modulators can be derived from derivatives of endogenous angiogenic genes. As described above, Hif is an illustrative example of angiogenic genes reported to promote angiogenesis by inducing expression of other angiogenic genes. A synthetic angiogenic polypeptide modulator is designed, for example, by producing a multi-finger zinc-binding protein capable of specifically binding upstream of the coding region of the endogenous angiogenic gene and inducing expression of such endogenous gene . Studies of multiple genes have led to the development of "laws" for the design of such zinc-finger DNA binding proteins (see, for example, Rhodes and Klug, Scientific American , February 1993, pp 56-65; Choo and Klug, Proc Natl Acad Sci USA, 91 (23): 11163-7, 1994; Rebar and Pabo, Science, 263 (5147) :...... 671-3, 1994; Choo et al, J. Mol Biol ., 273 (3): 525-32 , 1997; Pomerantz et al, Science 267:. 93-96, 1995; and Liu et al, Proc Natl Acad Sci USA, 94:..... 5525-5530, 1997 ). As will be appreciated by those skilled in the art, a number of additional genes having the ability to directly or indirectly promote angiogenesis are routinely identified, and the new genes are identified for known angiogenic proteins or peptides of the gene, Will be identified based on similarity to the ability to encode a protein or peptide that promotes the formation. Sequence information for such genes and coded polypeptides can be readily obtained from sequence databases such as GenBank or EMBL. Polypeptides encoding these proteins can also be obtained, for example, from gene libraries using routine PCR or hybridization techniques in the art.

바람직하게는, 혈관형성 단백질-코딩 트랜스젠은 심장 또는 골격근의 세포같은 포유 동물 세포내 유전자의 전사 및 발현을 유발하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 현재 바람직한 한 프로코터는 CMV 프로모터이다. 다른 바람직한 구체예에서, 하기 더 논의되는 바와 같이, 프로모터는 심장-특이적 프로모터 (예를 들어 심근-특이적 프로모터)같은 조직-특이적 프로모터이다. 바람직하게는, 혈관형성 인자를 코딩하는 유전자는 또한 폴리아데닐화 신호에 작동가능하게 연결된다.Preferably, the angiogenic protein-coding transgenes are operably linked to a promoter that induces transcription and expression of genes in mammalian cells such as cells of the heart or skeletal muscle. One presently preferred promoter is the CMV promoter. In another preferred embodiment, as further discussed below, the promoter is a tissue-specific promoter such as a cardiac-specific promoter (e. G., A myocardial-specific promoter). Preferably, the gene encoding the angiogenic factor is also operably linked to a polyadenylation signal.

유전자 전달 접근법의 성공은 유전자 산물의 합성과 트랜스펙션된 세포로부터의 분비 양자를 필요로 한다. 따라서, 바람직한 혈관형성 단백질 또는 펩티드는, 신호 펩티드에 작동가능하게 연결된 것과 같이, 천연적으로 분비하거나 분비를 허용하도록 변형된 것을 포함한다. 이 같은 관점으로부터, FGF-4, FGF-5, 또는 FGF-6같은 분비되는 혈관형성 단백질을 코딩하는 유전자는, 이들 단백질이 기능하는 분비신호 서열을 함유하고 세포로부터 쉽게 분비되므로 바람직하다. 대부분은 아니라도 많은 수의 인간 (VEGF-121 및 VEGF-165를 포함하나 이에 한정되지 않는) VEGF-165 단백질 또한 쉽게 분비되고 분비 후 확산된다. 따라서, 발현되었을 때, 이들 혈관형성 단백질은 쉽게 심간질에 접근할 수 있고 혈관형성을 유도할 수 있다. 혈관형성에서 발생되는 혈관은 약 8 미크론의 지름을 가지는 가장 작은 구경의 모세혈관 및 적어도 약 10 미크론의 지름을 가지는 더 큰 구경 혈관을 포함한다. 혈관형성 활성은, 당업계에 알려지거나 여기에 기재된 방법을 사용하여 혈류, 처리된 조직의 기능 증가 또는 혈관의 존재여부를 측정하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 모세혈관 수나 밀도는 동물에서 조직 부위의 가시적 또는 현미경적 분석에 의하여 정량될 수 있다 (실시예 5 참조).The success of the gene transfer approach requires both synthesis of the gene product and secretion from the transfected cells. Thus, preferred angiogenic proteins or peptides include those that are naturally secreted or modified to permit secretion, such as operably linked to a signal peptide. From this viewpoint, genes encoding secreted angiogenic proteins such as FGF-4, FGF-5, or FGF-6 are preferable because they contain secretory signal sequences functioning from these proteins and are easily secreted from the cells. Most, if not most, human VEGF-165 proteins, including but not limited to VEGF-121 and VEGF-165, are also readily secreted and diffuse after secretion. Thus, when expressed, these angiogenic proteins are easily accessible to the epilepsy and can induce angiogenesis. The blood vessels arising from angiogenesis include capillaries of the smallest diameter having a diameter of about 8 microns and larger capillaries having a diameter of at least about 10 microns. Angiogenic activity can be measured by measuring blood flow, increased function of the treated tissue, or the presence of blood vessels using methods known in the art or described herein. For example, capillary blood vessel density or density can be quantified by visual or microscopic analysis of tissue sites in an animal (see Example 5).

천연적 분비 신호 서열을 결여한 aFGF (FGF-1) 및 bFGF (FGF-2) 같은 다른 혈관형성 단백질과 결합하여, 분비신호 서열을 가지는 융합 단백질이, 당업계 숙련자에게 익숙한 재조합 DNA 방법학을 사용하여, 재조합적으로 제조될 수 있다. aFGF와 bFGF 양자는 어느 정도 천연적으로 분비되는 것으로 믿어진다; 그러나 추가적 분비 신호 서열의 포함이 단백질의 분비를 증강시키기 위하여 사용될 수 있다. 분비 신호 서열은 전형적으로 원하는 단백질의 N-말단에 위치하지만 혈관형성 인자의 분비를 허용하기 적당한 어느 위치에도 위치할 수 있다. 예를 들어, 적당한 신호 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드는 선택의 혈관형성 단백질 유전자의 첫 코돈의 5'에 융합될 수 있다. 적당한 분비 신호 서열은 FGF-4, FGF-5, FGF-6 유전자의 신호서열 또는 IL-1-β같은 상이한 분비 단백질의 신호서열을 포함한다. 하기 실시예 7은 상이한 단백질로부터의 신호서열을 함유하기 위한 혈관형성 단백질의 변형의 한가지 유형을 예로 나타내는데 그 변형은 혈관형성 단백질의 잔기를, 분비되는 제 2의 단백질의 분비를 유발하도록 하는 잔기와 치환함으로써 성취된다. 심근세포로부터 정상적으로 분비되는 단백질에서 유래하는 신호 서열이 사용될 수 있다. 혈관형성 단백질은 또한 예를 들어 심장세포 기능을 개선할 수 있는 추가적 기능을 제공할 수 있다. 예를 들어, FGF는 혈관형성을 촉진시킬 능력과 독립된 것일 수 있는 심장 증강 및/또는 "허혈 보호 효과"를 제공할 수 있다. 따라서, 혈관형성 유전자는, 혈관형성 그 자체의 촉진에 추가하거나 대체하는 기작에 의하여 심장 기능을 증강시키는데 사용될 수 있다. 추가적 예로써, 혈관형성을 촉진시키는 IGF는 또한 근육 세포 기능을 증강시킬 수 있을 뿐만 아니라 (예를 들어, Musaro et al.Nature400 : 581-585, 1999 참조) ; 항-애폽토시스성 효과를 나타낼 수 있다 (예를 들어 Lee et al.Endocrinology140 : 4831-4840, 1999 참조). 근육세포 기능을 증강시키는 다른 단백질 또한 본 발명의 방법에 따라 채용될 수 있다.Fusion proteins with secretory signal sequences that bind to other angiogenic proteins such as aFGF (FGF-1) and bFGF (FGF-2) lacking the naturally occurring secretory signal sequence use recombinant DNA methods familiar to those skilled in the art , And can be produced recombinantly. Both aFGF and bFGF are believed to be secreted to some extent by nature; However, the inclusion of additional secretory signal sequences can be used to enhance secretion of the protein. The secretory signal sequence is typically located at the N-terminus of the desired protein, but may be located at any suitable position to allow secretion of the angiogenic factor. For example, a polynucleotide containing the appropriate signal sequence may be fused to the 5 'of the first codon of the angiogenic protein gene of choice. Suitable secretory signal sequences include signal sequences of FGF-4, FGF-5, FGF-6 genes or signal sequences of different secretory proteins such as IL-1-beta. Example 7 below illustrates one type of modification of an angiogenic protein to contain a signal sequence from a different protein, the variant of which includes residues that cause the secretion of an angiogenic protein to be secreted by the secreted second protein . A signal sequence derived from a protein normally secreted from myocardial cells can be used. Angiogenic proteins may also provide additional functions that can improve, for example, cardiac cell function. For example, FGF may provide a cardiac augmentation and / or " ischemic protective effect " which may be independent of its ability to promote angiogenesis. Thus, angiogenic genes can be used to enhance cardiac function by mechanisms that add or replace the promotion of angiogenesis itself. As a further example, IGF promoting angiogenesis is not only capable of enhancing muscle cell function (see, for example, Musaro et al., Nature 400: 581-585, 1999); Can exhibit an anti-apoptotic effect (see, for example, Lee et al. Endocrinology 140: 4831-4840, 1999). Other proteins that enhance muscle cell function may also be employed in accordance with the methods of the present invention.

상기한 바와 같이, 하나 이상의 혈관형성 단백질이나 펩티드를 코딩하는 유전자는 본 발명과 결합하여 사용될 수 있다. 따라서, 혈관형성 단백질 또는 펩티드의 조합을 코딩하는 유전자는 여기에 기재된 방법에 따른 하나 이상의 벡터를 사용하여 송달될 수 있다. 여기에 기재된 및 당업계의 혈관형성 유전자 부류는 이 같은 유전자의 다수의 예를 포함한다. 바람직하게는, 이 같은 조합이 채용될 때, 유전자는 (FGFs, VEGFs, PDGFs 및 IGFs로 구성되는 군의 둘 이상의 상이한 구성원으로부터 선택되는 조합과 같은) 상이한 부류의 혈관형성 인자로부터 유래한다. 이 같은 조합의 단일 설시를 취하기 위하여는, FGF 유전자와 VEGF 유전자를 포함하는 벡터가 사용될 수 있다. 설시하는 예로서, 우리는 FGF 유전자 (FGF-4 단편 140) (예를 들어, FGF-4 유전자 및 그것의 변이체 1995년 10월 17일 특허된 Basilico et al., in U. S. Patent No. 5, 459, 250 및 관련건 참조)와 VEGF 유전자 변이체 (VEGF-145 뮤테인 2) (예를 들어, 1998년 3월 12일 공개된 Neufeld et al., WO 98/10071에 기재된 EGF-145 유전자와 그것의 변이체 및 관련건 참조) 의 조합을 사용하였다. 이 같은 조합은 부가적 및/또는 상승작용의 효과를 나타낼 수 있다. 다수의 다른 조합이 이 기술에 기초하여 당업계 숙련자에게 명백할 것이다. 본 발명에 따르는 혈관형성 유전자 또는 혈관형성 유전자의 조합을 포함하는 벡터는 또한 조직 혈류 및/또는 수축 기능을 더 증강시키는데 사용될 수 있는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, (Hammond et al.가 공동출원하고 1998년 3월 12일 공개된 WO 98/10085에서 기재한 바와 같이) 심장에서 β-ASP를 코딩하는 유전자는 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 유전자와 조합하여 채용될 수 있다. 다른 심장 또는 근육 세포 증강 단백질이 유사하게 본 발명의 조성물 및 방법에 결합될 수 있다.As described above, one or more genes encoding angiogenic proteins or peptides can be used in combination with the present invention. Thus, a gene encoding an angiogenic protein or a combination of peptides may be delivered using one or more vectors according to the methods described herein. The angiogenic gene classes described herein and in the art include many examples of such genes. Preferably, when such a combination is employed, the gene is derived from a different class of angiogenic factors (such as a combination selected from two or more different members of the group consisting of FGFs, VEGFs, PDGFs and IGFs). In order to take this single combination, vectors containing the FGF gene and the VEGF gene may be used. As an illustrative example, we have shown that the FGF gene (FGF-4 fragment 140) (e.g., the FGF-4 gene and its variants Basilico et al., In U.S. Patent No. 5,459 145 and the VEGF gene mutant (VEGF-145 mutein 2) (see, e. G., The EGF-145 gene described in Neufeld et al., WO 98/10071, published March 12, 1998, Variants and related issues) were used. Such combinations may exhibit additional and / or synergistic effects. Many other combinations will be apparent to those skilled in the art based on this technique. A vector comprising a combination of angiogenic genes or angiogenic genes according to the present invention may also comprise one or more genes that can be used to further enhance tissue blood flow and / or contractile function. For example, a gene encoding β-ASP in the heart (as described in WO 98/10085, co-filed by Hammond et al., Published March 12, 1998) is a gene encoding an angiogenic protein or peptide And the like. Other cardiac or muscle cell enhancing proteins may similarly be incorporated into the compositions and methods of the present invention.

본 발명에 따라 채용될 수 있는 유전자의 조합은 (예를 들어, 각각이 프로모터의 조절 하에 있는 분리된 유전자로서 또는 단일 전사 또는 번역 융합 유전자로서) 단일 벡터 내에 제공될 수 있다. 유전자의 조합은 또한 (아데노바이러스 벡터의 조합 또는 아데노바이러스 벡터와 AAV 벡터의 조합처럼 동일하거나 상이한 벡터로부터 유래한) 벡터의 조합으로서 제공될 수 있고; 환자에게 동시 또는 순서대로 도입될 수 있다. 아데노바이러스 (Ad) 및 아데노-연관 바이러스 (AAV)의 경우, 정상적으로는 AAV에 대한 헬퍼 바이러스인 Ad의 존재는 AAV의 유전자 전달을 매개하는 능력을 증강시킬 수 있다. Ad 벡터는 따라서 본발명에 따라 AAV 벡터의 도입과 동시 또는 이전에 도입될 수 있다. 트랜스펙션 효율에 추가하여, 벡터의 선택은 또한 트랜스젠 발현의 요구되는 지속기간에 의하여 영향을 받는다. 설시 방법으로서, 많은 혈관형성 유전자가 (예를 들어 조직 재혈관화의 증가를 유발하는 혈관형성의 과정을 개시 또는 용이하게 함으로써) 장기간 발현을 요하지 않고 장기간 효과를 일으키므로, 혈관형성 유전자는, 장기간 발현이 요구되는 트랜스젠을 운반하는 AAV벡터 (예를 들면 β-ASP)의 도입 이전 또는 도입과 조합하여 사용될 수 있는 아데노바이러스 (또는 숙주 DNA에 정상적으로는 삽입되지 않는 다른 벡터)를 사용하여도입된다. 트랜스젠 및/또는 벡터의 다른 조합은 본발명의 교시와 설시에 기초하여 당업계 숙련자에게 명백할 것이다.Combinations of genes that may be employed in accordance with the present invention may be provided in a single vector (e. G., As separate genes, each under the control of a promoter, or as a single transcription or translation fusion gene). The combination of genes may also be provided as a combination of vectors (derived from the same or different vectors, such as a combination of adenoviral vectors or a combination of adenoviral and AAV vectors); Can be introduced to the patient simultaneously or sequentially. In the case of adenovirus (Ad) and adeno-associated virus (AAV), the presence of Ad, a helper virus normally associated with AAV, can enhance the ability to mediate gene transfer of AAV. The Ad vector can therefore be introduced either prior to or simultaneously with the introduction of the AAV vector according to the present invention. In addition to the transfection efficiency, the choice of vector is also influenced by the required duration of transgene expression. As an illustrative method, since many angiogenic genes cause long-term effects without requiring long-term expression (for example, by initiating or facilitating the process of angiogenesis causing an increase in tissue remodeling) Is introduced using an adenovirus (or other vector that is not normally inserted into the host DNA) that can be used prior to or with the introduction of an AAV vector (e. G., Beta-ASP) that carries the transgene for which expression is desired . Other combinations of transgenes and / or vectors will be apparent to those skilled in the art based on the teachings and teachings of the present invention.

인간을 치료하기 위하여는, 비록 종교차 활성을 나타내는, 즉 인간에서 혈관형성 활성을 가지는 다른 포유동물 기원의 혈관형성 단백질 또한 사용될 수 있으나, 인간 기원의 혈관형성 단백질을 코딩하는 유전자가 바람직하다.To treat humans, angiogenic proteins of other mammalian origin, which exhibit religious activity, that is, having angiogenic activity in humans, may also be used, but genes encoding angiogenic proteins of human origin are preferred.

생체내 유전자 송달을 위한 벡터Vector for in vivo gene delivery

일반적으로, 관심의 유전자는 심장 또는 말초 혈관계로 생체내 전달되고, 코딩하는 단백질의 생산을 유발한다. 바람직하게는 이 같은 생산은 (비록 유도적 발현 시스템 또한 사용될 수 있으나) 구성적이다.Generally, the gene of interest is delivered in vivo to the heart or peripheral vasculature and leads to the production of a coding protein. Preferably, such production is constitutive (although an inducible expression system may also be used).

본 발명에서 유용한 벡터는 비-분열 세포로 DNA를 생체내 송달하는 능력이 있는 바이러스 벡터, 지질-기초 벡터 (예를 들면 리포솜) 및 다른 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터, 특히 예를 들어 복제능-결여 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함하는 복제능-결여 바이러스 벡터가 현재 바람직하다. 본 발명에서의 생산과 사용의 용이를 위하여는, 복제능-결여 아데노바이러스 벡터가 현재 가장 바람직하다. 아데노바이러스는 비-분열 세포를 효율적으로 감염시키고 따라서 심근세포의 비복제적 특성 때문에 재조합 유전자를 심근에서 발현시키는데 유용하다.Vectors useful in the present invention include viral vectors capable of delivering DNA in vivo to non-dividing cells, lipid-based vectors (e. G., Liposomes) and other vectors. Viral vectors, particularly replication-deficient adenoviral vectors, for example, and replication-deficient viral vectors comprising adeno-associated viral vectors, are presently preferred. For ease of production and use in the present invention, replication competence-deficient adenovirus vectors are presently most preferred. Adenoviruses are useful for efficiently infecting non-dividing cells and thus expressing the recombinant gene in the myocardium due to the non-specific properties of the myocardial cells.

생체내 유전자 요법에 적당한 다른 다수의 벡터가 본 발명에서 사용되기 위한 혈관 형성 단백질 트랜스젠을 운반하기 위하여 채용될 수 있다. 이 같은 다른 벡터는 (AAV 같은) 다른 바이러스 벡터, 비-바이러스 단백질-기초 송달 플랫폼 뿐아니라 (리포솜, 마이셀, 지질-함유 에멀젼 및 당업계에서 기재되어 온 다른 것 같은) 지질-기초 벡터를 포함한다. AAV 벡터에 관하여는, 당업계에 알려진 바와 같이, 그것은 예를 들어 (전형적으로 충전 세포주에서 AAV 벡터를 복제 및 충전하기 위하여 외부적으로 공급되어야 하는 서열인) rep 및 cap 유전자가 제거되어 있어 인간에서 바람직하게 복제능-결여이고, 삽입된 (예를 들어 그것에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한) 트랜스젠은 AAV 역말단 반복단 (ITR)에 의하여 양쪽으로 접하여 있다.A number of other vectors suitable for in vivo gene therapy may be employed to deliver angiogenic protein transgenes for use in the present invention. Such other vectors include lipid-based vectors (such as liposomes, micelles, lipid-containing emulsions and others described in the art) as well as other viral vectors (such as AAV), non-viral protein- . With respect to AAV vectors, as is known in the art, it is preferred that the rep and cap genes, which are sequences that typically have to be externally supplied to replicate and charge the AAV vector in a packed cell line, Preferably, the transgenes that are inserted (e. G., Including operably linked promoters therein) are flanked by the AAV inverted terminal repeat (ITR).

재조합 바이러스 벡터는 하나 이상의 이형 유전자 또는 서열을 포함한다. 반은 바이러스 벡터가 충전과 연관된 크기-구속을 나타내므로, 그리고 생체내 운반에 복제능-결여 바이러스 벡터가 일반적으로 바람직하므로, 이형 유전자 또는 서열은 전형적으로 바이러스 게놈의 하나 이상의 부분을 복제함에 의하여 도입된다. 이 같은 바이러스는 결실의 결과로 복제증-결여될 수 있고 그것에 의하여 바이러스 복제 및 캡핑 동안 (예를 들어 복제 및/또는 캡핑에 필수적인 유전자를 운반하는 헬퍼 바이러스 또는 충전 세포주를 사용하여) 결손된 기능이 외부에서 제공되는 것을 요구할 수 있다 (예를 들어 참고문헌과 하기 설시 참조). 상기된 바와 같이, rep 및 또는 cap 유전자 대신 트랜스젠이 삽입된 변형된 AAV 벡터는 마찬가지로 당업계 주지이다. 유사하게, 송달될 폴리펩티드가 바이러스 입자 외부에서 운반되는 변형된 바이러스 벡터 또한 기재되었다 (예를 들어, Curiel, DT, et al. PNAS 88 : 8850-8854, 1991 참조). 이들 및 다른 유전자 송달 벡터를 기재하는 참고문헌이 당업계에 알려져 있고 다수가 여기에 인용된다.The recombinant viral vector comprises one or more heterologous genes or sequences. Because the viral vector represents the size-constraint associated with the charge, and since replication-deficient viral vectors are generally preferred in vivo delivery, the variant gene or sequence is typically introduced by replication of one or more parts of the viral genome do. Such viruses can be replication-deficient as a result of deletion, thereby eliminating defective functions during virus replication and capping (e.g., using helper viruses or embryonic cell lines that carry genes essential for replication and / or capping) May be required to be provided externally (see, for example, references and references below). As noted above, modified AAV vectors with transgenes inserted instead of the rep and / or cap genes are likewise well known in the art. Similarly, modified viral vectors in which the polypeptide to be delivered is carried outside the viral particle have also been described (see for example Curiel, DT, et al., PNAS 88: 8850-8854, 1991). References describing these and other gene delivery vectors are known in the art and many are incorporated herein by reference.

상기 및 인용된 참고문헌에 기재된 바와 같이, 벡터는 또한 유전자 송달 및/또는 유전자 발현, 또는 표적화된 세포에 유익한 성질을 다르게 제공하는 다른 구성요소 및 기능을 포함한다. 이 같은 다른 구성요소는 예를 들어 (세포형 또는 조직 특이적 결합을 매개하는 구성요소를 포함하는) 세포에의 결합 또는 표적화에 영향을 주는 구성요소; 세포에 의한 벡터의 섭취에 영향을 주는 구성요소; (세포내 프로세싱 및/또는 핵 편재를 매개하는 작용제) 섭취 후 세포 내에서 벡터와 그 핵산의 프로세싱 및/또는 편재에 영향을 주는 구성요소; 및 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 주는 구성요소를 포함한다. 이 같은 구성요소는 또한 벡터에 의하여 송달된 핵산을 섭취하고 발현하는 세포를 검출하고 선택하는데 사용될 수 있는 검출가능/또는 선택 마커 같은 마커를 포함한다. 이 같은 구성요소는 벡터의 천연적 성질로서 제공될 수 있거나 또는 벡터가 이 같은 기능을 제공하도록 변형될 수 있다. 검출가능 마커 유전자는 (예를 들어 마커 유전자를 운반하지 않는 세포로부터 구별되는) 세포가 특이적으로 검출할 유전자를 운반하도록 허용한다. 이 같은 검출가능 마커 유전자의 한 예는, 하기 기재한 바와 같이 LacZ 유전자를 운반하는 벡터로 형질도입된 세포를 염색에 의하여 검출하도록 허용하는, β-갈락토시다제를 코딩하는 lacZ 유전자이다. 검출가능 마커는 포지티브, 네거티브 또는 이중기능일 수 있다. 포지티브 선택 마커는 마커를 운반하는 세포의 선택을 허용하는 반면, 네거티브 선택 마커는 마커를 운반하는 세포를 선택적으로 제거하는 것을 허용한다. 이중 기능 마커 (즉, 포지티브/네거티브)를 포함하는 다양한 이 같은 마커가 기재되어 왔다 .(예를 들어, Lupton, S., WO 92/08796, 1992년 5월 29일 공개됨 ; 및 Lupton, S.,WO 94/28143, 1994년 12월 8일에 공개됨). 이 같은 마커 유전자는 유전자 요법 문맥에서 유익할 수 있는 대조의 추가된 표준을 제공할 수 있다. 다양한 이 같은 벡터가 당업계에 알려져 있고 일반적으로 이용가능하다 (상기한 다양한 참고문헌 참조).As described in the above and cited references, the vectors also include gene delivery and / or gene expression, or other components and functions that otherwise provide beneficial properties to the targeted cells. Such other components include, for example, components that affect binding or targeting to cells (including components that mediate cell-type or tissue-specific binding); A component that affects the uptake of the vector by the cell; (Agents that mediate intracellular processing and / or nuclear localization) Components that influence the processing and / or the ubiquity of vectors and their nucleic acids in cells after ingestion; And components that affect the expression of the polynucleotide. Such components also include markers such as detectable / or selectable markers that can be used to detect and select cells that ingest and express the nucleic acid delivered by the vector. Such an element may be provided as a natural property of the vector, or the vector may be modified to provide such functionality. A detectable marker gene allows the cell to carry a gene that is specifically detectable (e.g., distinguished from cells that do not carry the marker gene). One example of such a detectable marker gene is the lacZ gene encoding beta -galactosidase, which allows the cells transduced with the vector carrying the LacZ gene to be detected by staining, as described below. The detectable marker may be positive, negative or dual function. The positive selection marker allows selection of cells carrying the marker, while the negative selection marker allows selective removal of cells carrying the marker. A variety of such markers have been described, including dual function markers (i.e., positive / negative) (see, for example, Lupton, S., WO 92/08796, published May 29, 1992; , WO 94/28143, published Dec. 8, 1994). Such marker genes can provide an added standard of control, which may be beneficial in the context of gene therapy. A variety of such vectors are known in the art and are generally available (see various references cited above).

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 아데노바이러스 벡터 및 다른 바이러스 벡터를 기재하는 참고문헌은 다음: Horwitz, M. S., Adenoviridae and Their Replication, in Fields, B., et al.. (eds.) Virology, Vol. 2, Raven Press New York, pp. 1679-1721, 1990) ; Graham, F., et al., pp. 109128 in Methods in Molecular Biology, Vol. 7 : Gene Transfer and Expression Protocols, Murray, E. (ed.), Humana Press, Clifton, N. J. (1991) ; Miller, N., et al., FASEB Journal 9 : 190-199, 1995 ; Schreier, H, Pharmaceutica Acta Helvetiae 68 : 145-159, 1994 ; Schneider and French, Circulation 88 : 1937-1942, 1993 ; Curiel D. T., et al., Human Gene Therapy 3 : 147-154, 1992 ; Graham, F. L., et al., WO 95/00655 (5 January 1995) ; Falck-Pedersen, E. S., WO 95/16772 (22 June 1995) ; Denefle, P. et al., WO 95/23867 (8 September 1995) ; Haddada, H. et al., WO 94/26914 (24 November 1994) ; Perricaudet, M. et al., WO 95/02697 (26 January 1995) ; Zhang, W., et al., WO 95/25071 (12 October 1995)을 포함한다. 다양한 아데노바이러스 플라스미드 또한 예를 들어 Microbix Biosystems of Toronto, Ontario를 포함하는 기원으로부터 시중구입 가능하다 (예를 들어, Microbix Product Information Sheet : Plasmids for Adenovirus VectorConstruction, 1996 참조). 다양한 추가적 아데노바이러스 벡터와 그 생산과 정제를 위한 방법이 정규적으로 동정된다.References describing adenoviral vectors and other viral vectors that may be used in the methods of the present invention are described in the following: Horwitz, M. S., Adenoviridae and Their Replications in Fields, B., et al. (Eds.) Virology, Vol. 2, Raven Press New York, pp. 1679-1721, 1990); Graham, F., et al., Pp. 109128 in Methods in Molecular Biology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray, E. (ed.), Humana Press, Clifton, N. J. (1991); Miller, N., et al., FASEB Journal 9: 190-199, 1995; Schreier, H., Pharmaceutica Acta Helvetiae 68: 145-159, 1994; Schneider and French, Circulation 88: 1937-1942, 1993; Curiel D. T., et al., Human Gene Therapy 3: 147-154, 1992; Graham, F. L., et al., WO 95/00655 (5 January 1995); Falck-Pedersen, E. S., WO 95/16772 (22 June 1995); Denefle, P. et al., WO 95/23867 (8 September 1995); Haddada, H. et al., WO 94/26914 (24 November 1994); Perricaudet, M. et al., WO 95/02697 (26 January 1995); Zhang, W., et al., WO 95/25071 (12 October 1995). A variety of adenovirus plasmids are also commercially available from, for example, Microbix Biosystems of Toronto, Ontario (see, for example, Microbix Product Information Sheet: Plasmids for Adenovirus Vector Construction, 1996). A variety of additional adenoviral vectors and methods for their production and purification are routinely identified.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 AAV 벡터를 기재하는 추가적 참고문헌은 다음: Carter, B., Handbook of Parvoviruses, vol. 1, pp. 169-228, 1990 ; Berns, Virology, pp. 1743-1764 (Raven Press 1990) ; Carter, B., Curr. Opin. Biotechnol., 3 : 533-539, 1992 ; Muzyczka, N., Current Topics in Microbiology and Immunology, 158 : 92-129, 1992 ; Flotte, T. R., et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7 : 349-356, 1992 ; Chatterjee et al., Ann. NY Acad. Sci., 770 : 79-90, 1995 ; Flotte, T. R., et al., WO 95/13365 (1995년 5월 18일) ; Trempe, J. P., et al., WO 95/13392 (1995년 5월 18일) ; Kotin, R., Human Gene Therapy, 5 : 793-801, 1994 ; Kotin et al., WO 98/11244 (1998년 3월 19일) ; Kotin et al., WO 99/61601 (1999년 12 월 2일) ; Flotte, T. R., et al., Gene Therapy 2 : 357-362, 1995 ; Allen, J. M., WO 96/17947 (1996년 6월 13일) ; 및 Du et al., Gene Therapy 3 : 254261, 1996을 포함한다.Additional references describing AAV vectors that may be used in the methods of the present invention are described in Carter, B., Handbook of Parvoviruses, vol. 1, pp. 169-228, 1990; Berns, Virology, pp. 1743-1764 (Raven Press 1990); Carter, B., Curr. Opin. Biotechnol., 3: 533-539, 1992; Muzyczka, N., Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 92-129, 1992; Flotte, T. R., et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7: 349-356, 1992; Chatterjee et al., Ann. NY Acad. Sci., 770: 79-90, 1995; Flotte, T. R., et al., WO 95/13365 (May 18, 1995); Trempe, J. P., et al., WO 95/13392 (May 18, 1995); Kotin, R., Human Gene Therapy, 5: 793-801, 1994; Kotin et al., WO 98/11244 (19 March 1998); Kotin et al., WO 99/61601 (Dec. 2, 1999); Flotte, T. R., et al., Gene Therapy 2: 357-362, 1995; Allen, J. M., WO 96/17947 (June 13, 1996); And Du et al., Gene Therapy 3: 254261, 1996.

상기와 과학 문헌에 개시된 대로, 많은 레트로바이러스-유래 시스템이 개발되어 생체내 유전자 송달에 사용되어왔다. 설시의 방법으로, 레트로바이러스 속의 렌티바이러스(예를 들면, 사람 면역결핍 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스 등)가 변형되어서 전형적인 비분열 세포를 형질전환시킬 수 있다(예를 들면, Poeschla et al.,PNSA96:11395-11399, 1996; Naldini et al.,PNAS96:11382-11388,1996; Naldini et al.,Science272:263-267,1996; Srinivasakumar et al.,J.Viorl.71:5841-5848, 1997; Zufferey et al.,Nat. Biotechnol. 15:871-875, 1997; Kim et al.,J.Viorl. 72:811-816, 1998; Miyoshi et al., J.Virol.72:8150-8157,1998; 또한, Buchschacher et al.,Blood15:2499-2504, 2000참조; 또한 Sali Institute, WO97/12622(1997년 4월 10일)참조). 이러한 관점에서 HIV-기초 렌티바이러스 벡터 시스템이 어느 정도 주목을 받으면서, HIV-기초 시스템에 대한 잠재적인 잇점을 제공하는 고양이 면역결핍 바이러스-기초 렌티바이러스 벡터 시스템과 같은 다른 렌티바이러스 벡터 시스템이 개발되었다(예를 들어, Poeschla et al.,Nat.Med.4:354-357,1998; Johnston et al., J.Virol. 73:2491-2498, 1999; 및 Johnston et al., J.Virol. 73:4991-5000, 1999 참조; Romano et al.,Stem Cell18:19-39, 2000 및 그 안에 개관된 참조문헌 참조).As disclosed in the above and in the scientific literature, many retrovirus-derived systems have been developed and used for in vivo gene delivery. In the present method, lentiviruses in retroviruses (for example, human immunodeficiency virus, cat immune deficiency virus, etc.) can be transformed to transform typical non-dividing cells (see, for example, Poeschla et al., PNSA 96: 11395-11399, 1996; Naldini et al, PNAS 96: 11382-11388,1996; Naldini et al, Science 272:.... 263-267,1996; Srinivasakumar et al, J.Viorl 71: 5841-5848 , 1997; Zufferey et al, Nat Biotechnol 15:... 871-875, 1997; Kim et al, J.Viorl 72:... 811-816, 1998; Miyoshi et al, J.Virol.72: 8150- See also Buchschacher et al., Blood 15: 2499-2504, 2000, and Sali Institute, WO97 / 12622 (April 10, 1997)). In this regard, other lentiviral vector systems have been developed, such as the feline immunodeficiency virus-based lentiviral vector system, which provide some of the potential benefits for HIV-based systems, while the HIV-based lentiviral vector system has received some attention For example, Poeschla et al., Nat. Med. 4: 354-357, 1998, Johnston et al., J. Virol. 73: 2491-2498, 1999 and Johnston et al., J. Virol. 4991-5000, 1999; Romano et al., Stem Cell 18: 19-39, 2000 and references cited therein).

바이러스 벡터뿐만 아니라, 유전자 송달 수단으로 사용될 수 있는 비바이러스 벡터가 마찬가지로 공지되고, 현재까지 개발중이다. 예를 들어, DNA 결합 단백질 및 유전자 송달을 매개할 수 있는 담체 또는 부분을 포함하는 거대분자 복합체와 같은 비바이러스 단백질 송달 플랫폼뿐만 아니라, 지질-기초 벡터(리포좀, 교질입자, 지질-함유 현탁액 등)가 당업계에 개시되었다. 본원 발명의 방법에 사용될 수 있는 비바이러스 벡터를 개시하는 문헌은 다음의 것을 포함한다: Ledley, FD, Human Gene Therapy 6:11 29-1144,1995; Miller, N., et al., FASEB Journal 9:190-199, 1995; Chonn, A., et al., Curr. Opin. in Biotech. 6:698-708,1995;Schofield, JP, et al., British Med. Bull. 51:56-71, 1995; Brigham, K.L., et al., J.Liposome Res. 3:31 49, 1993; Brigham, K.L., WO91/06309(1991년5월 16일); Felgner, P.L., et al., WO91/17424(1991년 11월 14일); Solodin et al., Biochemistry 34:13537-13544, 1995; WO93/19768(1993년 10월 14일); Debs et al., WO93/125673; Felgner, P.L., et al., U.S. 특허 5,283,185(1994년 2월 1일); Gao et al., WO 96/22765(1996년 8월 1일); Gebeyehu et al., U. S. 특허 5,334,761 (1994년 8월 2일); Feigne, P. L., et al., U. S. 특허 5,459,127(1995년 10월 17일); Overell, R. W., et al., WO 95/28494 (1995년 10월 26일);Jessee, WO 95/02698 (1995년 2월 26일); Haces and Ciccarone, WO 95/17373(1995년 6월 29일);Lin et al., WO 96/01840(1996년 2월 25일). 많은 추가적인 생체내 지질-매개 유전자 송달 벡터 및 벡터 송달 공동인자가 동정되었다(예를 들어, Kollen et al., Hum. Gene Ther. 10 : 615-22, 1999 ; Roy et al., Nat. Med. 5 : 387-391 ; Fajac et al., Hum. Gene Ther. 10 : 395-406, 1999 ; Ochiya et al., Nat. Med. 5 : 707-710, 1999참조). 추가적으로, 바이러스 및 비바이러스 매개 유전자 송달 시스템의 성분을 조합하는 시스템의 개발이 개시되었고 본원발명에 사용될 수 있다(예를 들어, Philip et al., Mol. Cell Biol., 14 : 2411-2418, 1994 ; 또한 Di Nicola et al., Hum. Gene Ther. 10 : 1875-1884, 1999참조). 다양한 추가적인 비바이러스 유전자 송달 벡터 및 그것의 제조 및 정제를 위한 방법이 정규적으로 동정되었다.As well as viral vectors, nonviral vectors that can be used as gene delivery means are likewise known and are being developed to date. For example, lipid-based vectors (liposomes, colloidal particles, lipid-containing suspensions, etc.) as well as non-viral protein delivery platforms, such as DNA binding proteins and macromolecular complexes comprising a carrier or moiety capable of mediating gene delivery, Have been disclosed in the art. Literature disclosing non-viral vectors that can be used in the methods of the present invention include: Ledley, FD, Human Gene Therapy 6: 11 29-1144, 1995; Miller, N., et al., FASEB Journal 9: 190-199, 1995; Chonn, A., et al., Curr. Opin. in Biotech. 6: 698-708, 1995; Schofield, JP, et al., British Med. Bull. 51: 56-71, 1995; Brigham, K. L., et al., J. Liposome Res. 3:31 49, 1993; Brigham, K. L., WO 91/06309 (May 16, 1991); Felgner, P. L., et al., WO 91/17424 (Nov. 14, 1991); Solodin et al., Biochemistry 34: 13537-13544, 1995; WO93 / 19768 (Oct. 14, 1993); Debs et al., WO93 / 125673; Felgner, P. L., et al., U.S. Pat. Patent 5,283,185 (Feb. 1, 1994); Gao et al., WO 96/22765 (Aug. 1, 1996); Gebeyehu et al., U. S. Patent 5,334,761 (August 2, 1994); Feigne, P. L., et al., U. S. Patent 5,459,127 (Oct. 17, 1995); Overell, R. W., et al., WO 95/28494 (October 26, 1995); Jessee, WO 95/02698 (February 26, 1995); Haces and Ciccarone, WO 95/17373 (June 29, 1995); Lin et al., WO 96/01840 (February 25, 1996). Many additional in vivo lipid-mediated gene delivery vectors and vector delivery cofactors have been identified (see, for example, Kollen et al., Hum. Gene Ther. 10: 615-22, 1999; Roy et al., Nat. Med. 5: 387-391; Fajac et al., Hum Gene Ther. 10: 395-406, 1999; Ochiya et al., Nat. Med. 5: 707-710, 1999). In addition, the development of a system for combining components of viral and nonviral mediated gene delivery systems has been disclosed and can be used in the present invention (see, for example, Philip et al., Mol. Cell Biol., 14: 2411-2418, 1994 ; See also Di Nicola et al., Hum. Gene Ther. 10: 1875-1884, 1999). A variety of additional non-viral gene delivery vectors and methods for their preparation and purification have been routinely identified.

상기에 개시된 대로, 바이러스 벡터와 같은 벡터를 사용한 유전자 송달의 효율성은 본원 및 1999년 8월 19일 공개된 공유 PCT 출원중인 WO 99/40945에 더 예시된바와 같이 예를 들어, 히스타민 또는 히스타민 아고니스트, 또는 혈관 내피세포성장 인자(VEGF)단백질과 같은 혈관활성제보다 미리 주입되고/또는 공-주입된 동맥 또는 조직과 같은 혈관에 벡터를 송달함으로써 향상될 수 있다. 유전자 송달의 효율성을 향상시키기 위해 사용될 수 있는 혈관활성제의 또다른 예는 소듐 니트로프루시드와 같은 산화질소이다. 대부분의 바람직한 혈관활성제는 혈관 또는 조직에 벡터의 도입과 동시에 및/또는 벡터의 도입전 몇분내에 주입된다. 본원에 사용된 혈관활성제는 증가된 혈관 침투성을 유발하고/또는 예를 들어, 모세혈관 내피를 통해 혈관으로부터 유전자 송달 벡터와 같은 거대분자의 전달을 향상시키는 천연적 또는 합성 물질을 말한다. 거대분자 혈관 침투성을 증가시키거나 다르게는 거대분자를 동맥에 의해 관류된 모세혈관상에의 전달을 촉진시킴으로써 혈관활성제가 이러한 벡터를 치료 부위에 송달하는 것을 향상시킬 수 있고, 따라서 표적 조직에서 트랜스젠의 전체적인 발현을 효과적으로 향상시킬 수 있다. 우리는 혈관활성제로서 히스타민을 사용하였고, 이것은 심근과 같은 주입 부위에 벡터의 송달을 실질적으로 향상시킨다는 것을 발견하였다. 사용가능한 히스타민 H 수용체와 상호작용하는 것과 같은 히스타민 유도체 및 아고니스트는 예를 들어, 2메틸히스타민, 2-피리딜에틸아민, 베타히스타민, 및 2-티아졸일에틸아민을 포함한다. 이러한 추가적인 히스타민 아고니스트는 예를 들어, Garrison JC., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (8th Ed : Gilman AG, Rall TW, Nies AS, Taylor P, eds) Pergamon Press, 1990, pp 575-582 및 다른 약학 논문에 개시된다.혈관활성제로 사용될 수 있는 히스타민과 히스타민 아고니스트뿐만 아니라, 혈관 내피세포 성장인자(VEGF) 및 VEGF 아고니스트(본원 및 참고문헌에 개시)는 증가된혈관 침투성을 유도하여 본원에 사용된 조성물 및 방법으로 유전자 송달을 향상시키기 위한 혈관활성제로 사용될 수 있다. 히스타민과 함께 사용될 때, VEGF 는 바람직하게는 벡터의 주입 전 수분동안 표적 부위를 공급하는 혈관에 주입된다. 소듐 니트로프루시드(SNP)와 같은 산화질소 공여체가 또한 혈관 활성제로 사용될 수 있다. 바람직하게는 산화 질소 공여체(예를 들어, SNP)가 벡터 조성물의 주입 수분전에 시작하여 주입동안까지 표적 조직에(표적 조직을 공급하는 혈관) 먼저 주입된다. 투여 역시 벡터 조성물의 주입동안 계속될 수 있다.As described above, the efficiency of gene delivery using vectors such as viral vectors can be determined, for example, as described in WO 99/40945, , Or by delivering the vector to a blood vessel, such as an artery or tissue previously injected and / or co-injected with a vasoactive agent such as a vascular endothelial growth factor (VEGF) protein. Another example of a vasoactive agent that can be used to improve the efficiency of gene delivery is nitric oxide, such as sodium nitroprusside. Most preferred vasoactive agents are injected within a few minutes prior to introduction of the vector and / or introduction of the vector into the vessel or tissue. The vasoactive agents as used herein refer to natural or synthetic materials that cause increased vascular permeability and / or enhance delivery of macromolecules such as, for example, gene delivery vectors from blood vessels via capillary endothelium. By increasing macromolecular permeability or otherwise promoting the transfer of macromolecules to capillary vessels perfused by arteries, it is possible for the vasoactive agent to enhance delivery of such vectors to the therapeutic site, The overall expression can be effectively improved. We have used histamine as a vasoactive agent, and have found that this substantially improves the delivery of the vector to the site of injection, such as the myocardium. Histamine derivatives and agonists such as interacting with available histamine H receptors include, for example, 2-methylhistamine, 2-pyridylethylamine, betahistamine, and 2-thiazolylethylamine. Such additional histamine agonists are described in, for example, Garrison JC., Goodman and Gilman ' s Pharmacological Basis of Therapeutics (8th Ed: Gilman AG, Rall TW, Nies AS, Taylor P, eds) Pergamon Press, 1990, pp 575-582 Vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGF agonists (as disclosed herein and in the references), as well as histamine and histamine agonists that can be used as vasoactive agents, Can be used as a vasoactive agent to improve gene delivery by the compositions and methods used in the &lt; RTI ID = 0.0 &gt; When used in conjunction with histamine, VEGF is preferably injected into the blood vessel that supplies the target site for a few minutes before injection of the vector. Nitric oxide donors such as sodium nitroprusside (SNP) may also be used as vasoactive agents. Preferably, a nitric oxide donor (e. G., A SNP) is injected first into the target tissue (the vessel supplying the target tissue) beginning before the infusion of the vector composition and during the infusion. Administration may also be continued during the infusion of the vector composition.

사람에서 헬퍼-독립 및 복제능 결여인 아데노바이러스 벡터의 예Examples of adenoviral vectors that lack helper-independence and replication in humans

일반적으로, 관심의 유전자는 생체내 심장 또는 말초 혈관에 전달되고, 코딩 단백질의 생산을 지시한다. 몇개의 상이한 유전자 전달 기법이 이용가능하다. 현재 바람직한 것은 사람의 아데노바이러스 5(Ad5)에 기초한 헬퍼-독립 복제능 결여 시스템이다. 이러한 재조합 Ad5-기초 시스템과 같은 단일 관상내 주사를 사용하여, 생체내 심근 세포의 의미있는 트랜스펙션을 증명했다(Giordano and Hammond, Clin. Res., 42 : 123A, 1994). 비복제 재조합 아데노바이러스 벡터가 관상내 주사후에 매우 효과적인 트랜스펙션을 초래하는, 관상 내피세포 및 심근세포를 트랜스펙션시키는데 특히 유용하다. 아데노바이러스 벡터 역시 예를 들어, 동맥내 또는 직접 주사에 의해서 말초 혈관에 의해 공급된 조직을 트랜스펙션시키는데 유용할 수 있다.Generally, the gene of interest is delivered to the heart or peripheral blood vessels in vivo and directs the production of the coding protein. Several different gene delivery techniques are available. Currently preferred is helper-independent replication-deficient system based on human adenovirus 5 (Ad5). Using single intra-coronary injections such as these recombinant Ad5-based systems, we have demonstrated a meaningful transfection of in vivo myocardial cells (Giordano and Hammond, Clin. Res., 42: 123A, 1994). Particularly useful for transfection of coronary endothelial cells and myocardial cells where non-replicative recombinant adenoviral vectors result in highly efficient transfection after intra-coronary injection. Adenoviral vectors may also be useful for transfecting tissues supplied by peripheral vessels, for example, by intramuscular or direct injection.

본원에서 증명된대로, 헬퍼-독립 복제능-결여 사람의 아데노바이러스 5 시스템은 1회의 관상내 주사에 의해서 생체내에서 대부분의 심근 세포를 효과적으로 트랜스펙션시키는데 사용될 수 있다. 이러한 송달 기술이 대부분의 포유동물 심장의심근에 벡터를 효과적으로 표적화시키는데 사용될 수 있다. 특정 세포 또는 조직 형태에 벡터를 표적화시키는 추가적인 수단은 하기와 당업계에 개시된다.As demonstrated herein, helper-independent replication-deficient human adenoviral 5 systems can be used to effectively transfect most cardiomyocytes in vivo by one intra-coronary injection. This delivery technique can be used to effectively target the vector to the myocardium of most mammalian hearts. Additional means of targeting a vector to a particular cell or tissue form are disclosed in the following and in the art.

다양한 예가 하기에 개시되고, 사용된 재조합 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈에서 필수적인 초기 유전자(일반적으로 E1A/E1B)가 결여된 사람의 아데노바이러스 5(McGrory WJ et al., Virology 163 : 614-617, 1988에 개시)이므로, 트랜스로 결여된 유전자 생성물을 제공하는 수용성 세포 라인에서 배양되지 않는다면 복제할 수 없다. 결여된 아데노바이러스 게놈 서열대신에, 관심의 트랜스젠이 복제능-결여 아데노바이러스로 감염된 조직/세포에서 클로닝되고 발현된다. 일반적으로 아데노바이러스 기초 유전자는 표적 세포 게놈에 안정하게 통합되지 않는다. 그러나, 아데노바이러스 벡터는 고 역가로 증식되고, 비복제 세포를 트랜스펙션시킬 수 있고; 트랜스젠이 딸세포로 전달되지는 않지만, 이것은 활발하게 분열하지 않는 성체 심근세포에 유전자를 전달하기에 적합하다. 레트로바이러스 벡터는 안정한 유전자 전달을 제공하고, 현재 레트로바이러스 슈도타이핑에 의해서 고역가를 얻을 수 있지만(Burns, et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 8033-8037, 1993), 일반적으로 통상의 레트로바이러스 벡터는 비복제 세포(예를 들어, 심근세포)를 효과적으로 형질전환시킬 수 없다. 게다가, 숙주 DNA 에 트랜스젠 통합의 잠재적인 위험은 단기간 유전자 전달로 충분한지를 보장하지 못한다.A variety of examples are described below, and the recombinant adenovirus vectors used are human adenoviruses 5 (McGrory WJ et al., Virology 163: 614-617, which lacks the essential genes essential for the adenoviral genome (generally E1A / E1B) 1988), it can not be cloned unless it is cultured in a water-soluble cell line that provides the gene product lacking the trans. Instead of the missing adenoviral genomic sequence, the transgene of interest is cloned and expressed in tissues / cells infected with replication competent-deficient adenovirus. In general, adenovirus-based genes are not stably integrated into the target cell genome. However, the adenoviral vector can be propagated in high order and transfected with non-replicating cells; Although transgenes are not transmitted to daughter cells, they are suitable for delivering genes to adult cardiomyocytes that are not actively dividing. Retroviral vectors provide stable gene transfer and are currently available in high yields by retroviral pseudotyping (Burns, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 90: 8033-8037, 1993) Conventional retroviral vectors can not efficiently transform non-replicating cells (e. G., Myocardial cells). In addition, the potential risk of transgen integration in host DNA does not guarantee that short-term gene transfer is sufficient.

게다가, 제한된 기간동안의 혈관형성 단백질의 발현은 허혈 조직에서 혈류 및 기능을 실질적으로 개선시키기에 충분하다는 것을 증명했다(실시예 5). 그러므로, 일시적인 유전자 전달은 이러한 심혈관 상태를 치료하는데 치료적으로 적절하다. FGF-5를 심근으로 유전자 전달한 후 14일내에, 허혈상으로의 혈류가 2배 증가했고, 효과는 적어도 12주 지속되었다(실시예 5 및 도8). 증가된 혈류는 심장 모세혈관수의 증가와 관련된다(실시예 5). 벽 비후화 역시 유전자 전달 후 2 주내에 증가되었고, 적어도 12주 동안 지속되었다. 그러므로 혈관형성 인자 유전자가 치료적 효과를 나타내기 위해서 몇 주 이상동안 감염 세포에 존재해야만 하는 것은 아니다. 일단 혈관이 발생되면, 새로운 혈관 구조 및 증가된 혈류를 유지하기 위해서 외인성 혈관형성 단백질의 계속된 발현이 요구되는 것은 아니다.In addition, it has been demonstrated that the expression of angiogenic proteins for a limited period of time is sufficient to substantially improve blood flow and function in ischemic tissue (Example 5). Therefore, transient gene delivery is therapeutically appropriate to treat these cardiovascular conditions. Within 14 days after gene delivery of FGF-5 to myocardium, blood flow to the ischemic phase was doubled and the effect lasted at least 12 weeks (Example 5 and Figure 8). Increased blood flow is associated with an increase in cardiac capillary blood flow (Example 5). Wall thickening also increased within 2 weeks after gene transfer and persisted for at least 12 weeks. Therefore, the angiogenic factor gene does not have to be present in infected cells for more than a few weeks to show a therapeutic effect. Once blood vessels are generated, continued expression of exogenous angiogenic proteins is not required to maintain the new vasculature and increased blood flow.

심근세포와 같은 비분열 세포와 연관된 잇점은 바이러스 벡터는 숙주 세포 분열로 쉽게 희석화되지 않는다는 것이다. 그러나, 심장에서 트랜스젠 발현의 기간을 더 증가시키는 것이 필요하거나 요구된다면, E1 및 E4 결실을 가지는 다양한 제2세대 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것이 가능하고, 이것은 시클로포스파미드 투여와 결부되어 사용될 수 있다(예를 들어, Dai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 : 1401-1405, 1995참조).An advantage associated with non-mitotic cells such as myocardial cells is that viral vectors are not easily diluted by host cell division. However, if it is necessary or required to further increase the duration of transgene expression in the heart, it is possible to use a variety of second generation adenoviral vectors with E1 and E4 deletions, which can be used in conjunction with cyclophosphamide administration (See, for example, Dai et al., Proc. Natl. Acad Sci USA, 92: 1401-1405, 1995).

아데노바이러스 E1A/E1B 유전자로 형질전환된 사람의 배아 신장 세포인 사람의 293 세포(접수 번호 ATCC CRL1573; Rockville, MD)는 이러한 복제능-결여 벡터의 생산을 위한 유용한 전형적 허용성 세포 라인이다. 그러나, 복제능-결여 아데노바이러스 벡터가 그 안에서 증식하는 것을 허용하는 다른 세포 라인, HeLa 세포가 사용될 수 있다.293 cells of human embryonic kidney cells transfected with the adenovirus E1A / E1B gene (accession number ATCC CRL 1573; Rockville, Md.) Are a typical line of tolerable cell line for the production of this replication competency-deficient vector. However, other cell lines, HeLa cells, may be used that allow replication-deficient adenoviral vectors to proliferate therein.

재조합 아데노바이러스 벡터 제조Preparation of Recombinant Adenovirus Vector

본원발명에 사용된 아데노바이러스 벡터는 Graham, Virology 163:614-617,1988 에 개시된 레스큐 재조합 기법으로 제조될 수 있다. 요약하면, 관심의 트랜스젠이 프로모터, 폴리링커 및 일부분이 양쪽에 접한 결실된 E1A/E1B 유전자의 아데노바이러스 서열을 함유하는 셔틀 벡터로 클로닝된다. 셔틀 벡터로서, 바이러스 복제에 필수적인 E1A 및 E1B서열을 코딩하는 초기 단백질이 제거된 사람의 아데노바이러스 5 게놈의 왼쪽 말단 부분(Virology 163:614-617, 1988)을 코딩하는 플라스미드 pAC1(Virology 163: 614-617, 1988)(유사체), 및 폴리링커, E1A/E1B유전자로부터 부분적인 아데노바이러스 서열이 양쪽에 놓인 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 함유하는 플라스미드 ACCMVPLPA(Gomez-Foix et al., J. Biol. Chem. 267 : 25129-25134, 1992)가 예증될 수 있다. 플라스미드 pAC1 또는 ACCMVPLA 의 사용은 클로닝 과정을 촉진시킨다. 그 다음 셔틀 벡터는 너무 길어서 캡슐화될 수 없는 사람의 전체 아데노바이러스 5 게놈을 함유하는 플라스미드로 293 세포에 코트랜스펙션(cotransfection)된다. 코트랜스펙션은 칼슘 포스페이트 침전 또는 리포펙션으로 수행될 수 있다(Zhang et al., Biotechniques 15 : 868-872, 1993). 플라스미드 JM17 은 사람의 아데노바이러스 5 게놈과 암피실린 내성에 대한 유전자(4.3kb)를 함유하는 벡터 pBR322의 부분을 코딩한다. JM17 은 성숙한 바이러스 입자를 만들기에 필요한 모든 아데노바이러스 단백질을 코딩하지만, 이것은 캡슐화되기에 너무 크다(40 kb 대 야생형 36 kb). 코트랜스펙션된 세포의 작은 서브셋에서, 플라스미드 pAC1 과 같은 셔틀 벡터를 함유하는 트랜스젠과 플라스미드 pJM17과 같은 전체 아데노바이러스 5 게놈을 가지는 플라스미드간의 레스큐 재조합은 E1A/E1B 서열이 결여된 재조합 게놈을 제공하고, 관심의 트랜스젠을 함유하지만재조합동안 pBR322 서열과 같은 추가적인 서열이 2차적으로 결여되어서, 캡슐화될 수 있을만큼 작다(도1 참조). 상기 방법에 관하여, 우리는 성공적인 결과를 보고했다(Giordano, et al. Circulation 88 : 1-139, 1993, and Giordano and Hammond, Clin. Res. 42 : 123A, 1994). CMV 유래 β-갈락토시다제 코딩 아데노바이러스 HCMVSP1lacZ(Clin Res 42 : 123A, 1994)가 X-gal 치료를 사용하는 유전자 전달의 효험을 평가하기위해 사용될 수 있다.Adenovirus vectors used in the present invention can be prepared by the rescue recombination technique disclosed in Graham, Virology 163: 614-617, Briefly, transgenes of interest are cloned into a shuttle vector containing the promoter, polylinker, and adenovirus sequences of deleted E1A / E1B genes in which a portion is flanked by both. As a shuttle vector, a plasmid pAC1 (Virology 163: 614) encoding the left end portion of the human adenovirus 5 genome (Virology 163: 614-617, 1988) from which the initial protein coding for E1A and E1B sequences essential for viral replication was removed And plasmid ACCMVPLPA (Gomez-Foix et al., J. Biol. Chem., 6, 177, 1988) (analog) and polylinker, a CMV promoter with partial adenoviral sequences on both sides of the E1A / E1B gene and the SV40 polyadenylation signal. Biol. Chem. 267: 25129-25134, 1992) can be exemplified. Use of the plasmid pAC1 or ACCMVPLA promotes the cloning process. The shuttle vector is then cotransfected into 293 cells with a plasmid containing the entire genome of the adenovirus 5 that is too long to be encapsulated. Co-transfection may be performed with calcium phosphate precipitation or lipofection (Zhang et al., Biotechniques 15: 868-872, 1993). Plasmid JM17 encodes a portion of the vector pBR322, which contains the genome of human adenovirus 5 and the gene for ampicillin resistance (4.3 kb). JM17 encodes all the adenovirus proteins necessary to make mature viral particles, but it is too large to be encapsulated (40 kb versus 36 kb wild type). In a small subset of co-transfected cells, rescue recombination between a transgene containing a shuttle vector such as plasmid pACl and a plasmid carrying the entire genome of adenovirus 5, such as plasmid pJM17, provides a recombinant genome lacking the E1A / E1B sequence And is small enough to encapsulate, containing a transgene of interest but lacking secondary sequences such as the pBR322 sequence during recombination (see Figure 1). Regarding this method, we have reported successful results (Giordano, et al. Circulation 88: 1-139, 1993, and Giordano and Hammond, Clin. Res. 42: 123A, 1994). CMV-derived β-galactosidase coding adenovirus HCMVSP1lacZ (Clin Res 42: 123A, 1994) can be used to assess the efficacy of gene transfer using X-gal therapy.

표적화 벡터 구성체Targeting vector construct

심장, 또는 심장내의 특정 세포 형태(예를 들어, 심근세포) 또는 말초 맥관형성 조직과 같은 다른 표적 조직에로의 혈관형성 트랜스젠의 제한된 발현은 하기에 논의된 것과 같은 어떤 잇점을 제공할 수 있다.Limited expression of angiogenic transgenes into the heart, or other target tissues, such as certain cell types in the heart (e. G., Myocardial cells) or peripheral vasculature, can provide some benefits such as those discussed below .

본원발명은 관상동맥 또는 조직-특이적 도관 내로 트랜스젠의 송달에 의한 것 뿐만 아니라, 예를 들어, 특정 숙주 세포 또는 숙주 세포 형태(예를 들어, 심장 또는 다른 심근세포)로의 유전자 송달 및/또는 유전자 발현을 표적화하는 특징을 가지는 표적화된 벡터 구성체의 사용에 의한 표적화의 용도를 기대할 수 있다. 그러므로, 이러한 표적화 벡터 구성체는 하기와 공개 문헌에 더욱 상세하게 개시된 바와 같이, 표적화된 송달 벡터 및/또는 표적화된 벡터를 포함할 것이다. 제한된 송달 및/또는 발현은 유전자 요법의 잠재적인 효과를 더욱 강화시키는 수단으로 유리할 수 있다. 더욱 제한된 송달/발현의 잠재적인 유용성은 대부분 사용된 벡터의 형태 및 이러한 벡터의 도입의 방법 및 위치에 의존한다. 본원에 개시된 바와 같이, 심근에의 관상내의 주사에 의한 바이러스 벡터의 송달은 그 자체로 매우 표적화된 유전자 송달을 제공하는 것이 관찰되었다(하기의 실시예 참조). 게다가, 숙주 세포(아데노바이러스 및 많은 다른 벡터)의 레플리콘으로 트랜스젠을 일반적으로 통합시키지 않는 벡터를 사용하는 것은 세포가 일반적으로 복제하지 않기 때문에 상대적으로 장기간의 트랜스젠 발현을 나타내지 않을 것으로 예상된다. 대조적으로, 내피세포와 같은 빠르게 분열하는 세포에서의 발현은 세포 분열 및 턴오버에 의해서 감소되는 경향이 있다. 그러나, 본원에 개시된 바와 같은 예시된 송달 방법에 추가하여, 또는 그 대신에 송달 및/또는 발현을 제한시키는 다른 수단이 또한 사용될 수 있다.The present invention is not limited to delivery of a transgene into a coronary artery or tissue-specific duct, but may also include delivery of a gene to, for example, a particular host cell or host cell form (e.g., heart or other cardiomyocytes) and / The use of targeting by the use of targeted vector constructs having the characteristics of targeting gene expression can be expected. Therefore, such a targeting vector construct will include a targeted delivery vector and / or a targeted vector, as described in more detail in the following and the disclosure documents. Limited delivery and / or expression may be advantageous as a means of further enhancing the potential effects of gene therapy. The potential utility of more limited delivery / expression is largely dependent on the type of vector used and the method and location of the introduction of such a vector. As disclosed herein, delivery of viral vectors by intra-coronary injection into the myocardium itself has been observed to provide highly targeted gene delivery (see Examples below). In addition, the use of vectors that do not generally incorporate transgenes into the replicons of host cells (adenovirus and many other vectors) is expected to exhibit relatively long-term transgene expression, since cells generally do not replicate do. In contrast, expression in rapidly dividing cells such as endothelial cells tends to be reduced by cell division and turnover. However, other means of restricting delivery and / or expression in addition to, or instead of, the exemplified delivery methods as disclosed herein may also be used.

표적화된 송달 벡터는 예를 들어, 표면 구성요소(많은 리간드-수용체쌍, 표적화될 숙주 세포에서 발견된 다른 구성원) 또는 특정 숙주 세포 또는 숙주 세포 형태에 우선적인 결합 및/또는 유전자 송달을 조절하는 다른 특징을 가지는 벡터(바이러스, 비바이러스 단백질-기초 벡터 및 지질-기초 벡터)를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 바이러스 및 비바이러스 기원의 많은 벡터는 이러한 우선적인 결합을 촉진하는 내재적인 성질을 가지고/또는 우선적인 표적화에 영향을 미치도록 변형되었다(예를 들어, Douglas et al., Nat. Biotech. 14 : 1574-1578, 1996 ; Kasahara, N. et al. Science 266 : 1373-1376, 1994 ; Miller,N., et al., FASEB Journal 9 : 190-199, 1995 ; Chonn, A., et al., Curr. Opin. in Biotech. 6 : 698-708, 1995 ; Schofield, JP, et al., British Med. Bull. 51 : 56-71, 1995 ; Schreier, H, Pharmaceutica Acta Helvetiae 68 : 145-159, 1994 ; Ledley, F. D., Hum. Gene Ther. 6 : 11291144, 1995 ; Conary, J. T., et al., WO 95/34647 (1995년 11월 21일) ; Overell, R. W., et al., WO 95/28494 (1995년 10월 26일) ; 및 Truong, V. L. et al., WO 96/00295 (1996년 1월 4일)참조).A targeted delivery vector can be, for example, a surface element (many ligand-receptor pairs, other members found in the host cell to be targeted) or other host that controls preferential binding and / or gene delivery to a particular host cell or host cell form (Virus, non-viral protein-based vector and lipid-based vector). As is known in the art, many vectors of viral and non-viral origin have been modified to have an intrinsic property that promotes this preferential binding and / or to influence preferential targeting (see, for example, Douglas et al. , Miller, N., et al., FASEB Journal 9: 190-199, 1995, Chonn, N. et al., Nat. Biotech 14: 1574-1578, 1996; Kasahara, N. et al. Science 266: 1373-1376, 51, 56-71, 1995; Schreier, H, Pharmaceutica Acta Helveticiae, J. Biol., 6: 698-708, 1995; Schofield, JP, et al., British Med. Conell, JT, et al., WO 95/34647 (Nov. 21, 1995); Overell, RW, et al., &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; , WO 95/28494 (Oct. 26, 1995) and Truong, VL et al., WO 96/00295 (Jan. 4, 1996)).

표적화된 벡터는 송달이 상대적으로 특정 숙주 세포 또는 숙주 세포 형태에 제한된 트랜스젠의 발현을 초래하도록 하는 벡터(바이러스, 비바이러스 단백질-기초 벡터 및 지질-기초 벡터)를 포함한다. 예로서, 본원발명에 따라 송달된 혈관형성 트랜스젠은 이형 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결되어서 특정 조직에서 세포에의 발현을 제한할 수 있다.Targeted vectors include vectors (viruses, non-viral protein-based vectors and lipid-based vectors) that allow delivery to result in the expression of transgenes that are relatively restricted to a particular host cell or host cell type. By way of example, angiogenic transgenes delivered in accordance with the present invention may be operably linked to heterologous tissue-specific promoters to limit expression to cells in certain tissues.

예를 들어, 심근세포-특이적 미오신 경쇄(MLC) 또는 미오신 중쇄(MHC)프로모터를 코딩하는 유전자에서 유래된 조직-특이적 전사 조절 서열은 상기에 개시된 아데노바이러스 구성체와 같은 벡터내의 FGF 유전자와 같은 트랜스젠에 융합될 수 있다. 그러므로, 트랜스젠의 발현은 상대적으로 심근세포에 제한될 수 있다. lacZ 와 함께 심근세포-특이적 MLC 및 MHC 프로모터에 의해 제공된 유전자 발현의 효율성 및 특이성의 정도가 (본원에 예시된 것과 같은 재조합 아데노바이러스 시스템을 사용하는 것) 결정되었고; 심장-특이적 발현이 보고되었다(예를 들어, Lee et al., J. Biol Chem 267 : 15875-15885, 1992참조).For example, a tissue-specific transcriptional control sequence derived from a gene encoding a myocardial cell-specific myosin light chain (MLC) or myosin heavy chain (MHC) promoter may be used as the FGF gene in a vector such as the adenoviral construct described above Can be fused to transgenes. Therefore, the expression of transgenes can be relatively restricted to myocardial cells. the degree of efficiency and specificity of gene expression provided by myocardial cell-specific MLC and MHC promoters with lacZ was determined (using a recombinant adenoviral system as exemplified herein); Cardiac-specific expression has been reported (see, for example, Lee et al., J. Biol Chem 267: 15875-15885, 1992).

MLC 프로모터는 250bp 만큼 적은 bp 로 포함될 수 있어서, 본원에 예시된 아데노바이러스-5-패키징 시스템과 같은 크기-제한 송달 벡터내에조차 용이하게 적합하다. 강력한 전사 프로모터로 공지된 미오신 중쇄 프로모터는 약 300 bp 미만으로 이루어지는 다른 택일적인 심장-특이적 프로모터를 제공한다. 트로포닌-C 프로모터와 같은 다른 프로모터가 조직 특이성을 제공하지 않는 반면에, 이들은 작고 매우효과적이다.The MLC promoter can be included with as little as 250 bp of bp and is therefore readily suited even within size-restricted delivery vectors such as the adenovirus-5-packaging system exemplified herein. The myosin heavy chain promoter known as a strong transcriptional promoter provides another alternative cardiac-specific promoter consisting of less than about 300 bp. While other promoters such as the troponin-C promoter do not provide tissue specificity, they are small and highly effective.

표적화 유전자 발현Targeting gene expression

본원발명의 기대되지 않은 발견은 재조합 아데노바이러스는 직면한 제1의 혈관상에 매우 효과적으로 섭취된다는 것이다. 게다가, 실시예 4의 동물모델에서, 관상내 주사후의 심장에의 바이러스 섭취의 효율은 98%, 즉, 바이러스의 98%가 심근 혈관상을 통한 바이러스의 제1의 통과에서 제거되었다. 더욱이, 주사동안에 동물에서 혈청의 제거는 200배 희석될때까지 바이러스 플라크를 배양할 수 없도록 하고(Graham, Virology, 163 : 614617, 1988)이것은, 혈청 인자(또는 결합 단백질) 의 존재가 바이러스의 증식을 억제한다는 것을 제시한다. 이러한 2인자(바이러스의 효율적인 제1의 통과 부착 및 혈청 결합 단백질의 가능성)는 바이러스에 접한 제1의 혈관상에 유전자 발현을 제한하도록 함께 작용할 수 있다.The unexpected discovery of the present invention is that the recombinant adenovirus is ingested very effectively in the first blood vessel phase encountered. In addition, in the animal model of Example 4, the efficiency of viral ingestion to the heart after intravitreal injection was 98%, i.e., 98% of the virus was removed in the first pass of the virus through the myocardial vascular bed. Moreover, the removal of serum from the animal during the injection does not allow for viral plaque cultivation until 200-fold dilution (Graham, Virology, 163: 614617, 1988). This indicates that the presence of serum factor (or binding protein) . These two factors (the efficient first pass attachment of the virus and the possibility of serum binding proteins) can work together to limit gene expression to the first blood vessel in contact with the virus.

유전자 전달이 관상내 유전자 전달 후에 심장에 제한된 정도를 더욱 평가하기 위해서, 중합효소 연쇄반응(PCR)이 2개의 처리된 동물(하기의 실시예 4)에 유전자 전달 2 주후에 바이러스 DNA 가 심장외 존재하는 지를 확인하기 위해서 사용되었다. 동물은 그들의 망막, 골격근, 또는 간이 아닌 심장에서 바이러스 DNA 의 존재를 나타냈다. PCR 의 감도는 5,000,000 세포당 단일 DNA 서열이 검출될 수 있는 정도이다. 그러므로, 이러한 데이타는 유전자 송달 2 주후에 심장외 조직에서 어떠한 바이러스 DNA 도 존재하지 않는다는 것을 나타내었다. 이러한 결과는 하기에 논의된 다른 혈관형성 단백질 및 유도체를 사용하여 더욱 확실히 되었다. 이러한 발견은 그것이 심장 트랜스젠 표적화의 개념을 확증하기 때문에 매우 중요하다(즉,다른 곳이 아닌 심장에서 트랜스젠의 발현을 제공). 국부화된 트랜스젠 송달 및 발현은 환자의 치료시 본원방법의 사용을 더욱 향상시키면서 안정성의 잇점을 제공한다.In order to further assess the extent of gene transfer to the heart after coronary gene transfer, polymerase chain reaction (PCR) was performed in two treated animals (Example 4 below) Was used to confirm that Animals showed the presence of viral DNA in their retina, skeletal muscle, or non-liver heart. The sensitivity of the PCR is such that a single DNA sequence per 5,000,000 cells can be detected. Therefore, this data indicated that no viral DNA was present in extracardiac tissue after 2 weeks of gene delivery. These results were further confirmed using other angiogenic proteins and derivatives discussed below. This finding is very important because it confirms the concept of cardiac transgene targeting (ie, providing transgene expression in the heart, not elsewhere). Localized transgenic delivery and expression provide the benefit of stability while further improving the use of the subject methods in the treatment of patients.

아데노바이러스 벡터의 증식 및 정제Proliferation and purification of adenoviral vectors

아데노바이러스 벡터와 같은 재조합 바이러스 벡터는 표준 방법에 따라서 정제된 플라크일 수 있다. 예로서, 결과적인 재조합 아데노바이러스 벡터는 사람의 293 세포(트랜스로 E1A 및 E1B 기능을 제공)에서 증식되어 약 10¹⁰-10¹²바이러스 입자/ml의 바람직한 범위로 적정될 수 있다. 증식 및 정제 기술이 본원발명과 함께 결합되어 사용될 수 있는 다양한 바이러스에 대해 개시되었다. AAV 와 같은 다른 바이러스 벡터가 아닌 본원의 아데노바이러스 벡터가 역시 사용될 수 있다. 아데노바이러스의 경우에, 세포는 80% 합류점으로 감염될 수 있고, 48 시간 후에 검출될 수 있다. 감염 세포의 3 회 동결-해동 순환 후에, 세포 파편은 원심분리로 펠렛되고 바이러스는 CaCI 구배 초원심분리에 의해서 정제된다. (이중 CsCI 구배 초원심분리가 바람직하다). 생체내 주입전에, 바이러스 스톡은 담수화될 수 있다(예를 들어, Sephadex G25 와 같은 Sepharose 를 통한 겔 여과에 의함). 담수화된 바이러스 스톡은 또한 원한다면 0.3 마이크론 필터를 통하여 여과될 수 있다. 전형적으로 이중 CsCI 초원심분리에 의해서 바이러스를 농축하고 정제한 다음, 인산 완충 식염수(PBS)로 평형화된 Sephadex G25 상에서 크로마토그래피 한다. 결과적인 바이러스 스톡은 전형적으로 적어도 약 10¹⁰-10¹²바이러스 입자/ml로 최종 바이러스 역가를 가진다.Recombinant viral vectors, such as adenovirus vectors, can be purified plaques according to standard methods. By way of example, the resulting recombinant adenovirus vector may be propagated in human 293 cells (providing E1A and E1B function by trans) and titrated to a preferred range of about 10 ¹⁰ -10 ¹² viral particles / ml. Proliferation and purification techniques have been disclosed for a variety of viruses that can be used in conjunction with the present invention. Adenoviral vectors of the present invention that are not other viral vectors such as AAV may also be used. In the case of adenovirus, the cells can be infected with 80% confluence and can be detected 48 hours later. After 3 freeze-thaw cycles of infected cells, the cell debris is pelleted by centrifugation and the virus is purified by CaCI gradient ultracentrifugation. (Double CsCI gradient ultracentrifugation is preferred). Prior to in vivo infusion, the virus stock can be desalted (e.g., by gel filtration through Sepharose, such as Sephadex G25). The desalted virus stock can also be filtered through a 0.3 micron filter if desired. The virus is typically concentrated and purified by double CsCI ultracentrifugation and then chromatographed on Sephadex G25 equilibrated with phosphate buffered saline (PBS). The resulting virus stock typically has a final viral titer of at least about 10 ¹⁰ -10 ¹² viral particles / ml.

바람직하게는, 재조합 아데노바이러스는 매우 정제되고, 실질적으로 야생형(잠재적으로 복제성) 바이러스가 결여된다. 이유는, 증식 및 정제가 예를 들어, 적당한 프라이머를 사용하여 PCR 로 성공적인 재조합 바이러스를 동정하고, 플라크 정제의 2순환, 및 이중 CsCI 구배 초원심분리를 수행하는 것에 의해서 오염균 및 야생형 바이러스를 배제하는데 사용될 수 있다.Preferably, the recombinant adenovirus is highly purified and substantially free of wild-type (potentially replicative) virus. The reason is that the propagation and purification are carried out by, for example, PCR using a suitable primer to identify a successful recombinant virus, two rounds of plaque purification, and double CsCI gradient ultracentrifugation to exclude contaminants and wild type virus .

혈관형성 트랜스젠을 운반하는 벡터의 송달Delivery of a vector carrying an angiogenic transgene

혈관형성 단백질 트랜스젠을 운반하는 벡터 송달에 사용된 수단 및 조성물은 당업계에 잘 알려진 바와 같이 사용된 특정 벡터에 의존한다. 그러나, 전형적으로, 벡터는 예를 들어, 인산 완충 식염수와 같은 약학적으로 허용가능한 담체/희석제를 함유하는 주사가능한 제제의 형태일 수 있다. 다른 약학적 담체, 조성물 및 투여량이 하기에 개시된다.Means and compositions used to deliver vectors that carry angiogenic protein transgenes depend on the particular vector used as is well known in the art. Typically, however, the vector may be in the form of an injectable formulation containing a pharmaceutically acceptable carrier / diluent, such as, for example, phosphate buffered saline. Other pharmaceutical carriers, compositions and dosages are disclosed below.

현재 심장 질환에의 생체내 송달에 바람직한 수단(특히, 심근 또는 다른 표적 조직에 제한된 송달 및/또는 발현에 표적화된 벡터 구성체용)은 심근 또는 조직을 직접 공급하는 혈관 또는 다른 도관에 벡터를 주사하는 것, 바람직하게는 한쪽 또는 양쪽 관상동맥 또는 다른 조직-특이적 동물에의 주사이다.(또는 말초조직에 일시 주사). 예로서, 심근에의 송달의 경우에, 이러한 주사는 바람직하게는 하나 또는 양쪽 관상동맥 또는 하나 이상의 두렁정맥 또는 내유동물 이식편 또는 심근에 혈을 송달하는 다른 도관의 내강내에 도입된 카테테르에 의해서 실질적으로 이루어진다(전형적으로 적어도 약 1cm). 바람직하게는 좌 및 우 관상동맥에 주사되어 심장의 모든 영역에의 일반적인 분배를 제공한다(예를 들어, LAD, LCx 및 Right). 선택적으로 본원에 개시된 유전자 송달을 향상시키기 위한 혈관활성제와 조합하여 이것과 함께 아데노바이러스 벡터 제조를 주사함으로써, 어떤 부작용없이 예를 들어, 임상 심근 허혈, 또는 말초혈관질환과 같은 심혈관 질환의 치료를 위해서 효과적인 아데노바이러스-매개 혈관형성 유전자 전달을 수행하는 것이 가능하다.The presently preferred means for in vivo delivery to heart disease, particularly for vector constructs targeted for limited delivery and / or expression to myocardial or other target tissues, is to inject a vector into a vessel or other conduit that directly feeds myocardial or tissue , Preferably one or both coronary arteries or other tissue-specific animals (or a temporary injection into the peripheral tissues). By way of example, in the case of delivery to the myocardium, such injection is preferably performed substantially by catheters introduced into the lumen of one or both coronary arteries or one or more other duodenal veins or other ducts delivering blood to the endodermic animal graft or myocardium (Typically at least about 1 cm). Is preferably injected into the left and right coronary arteries to provide a general dispense to all areas of the heart (e.g., LAD, LCx, and Right). Optionally for the treatment of cardiovascular diseases such as clinical myocardial ischemia, or peripheral vascular disease, without any side effects, by injecting adenoviral vector preparation therewith in combination with a vasoactive agent for enhancing gene delivery as disclosed herein It is possible to carry out effective adenovirus-mediated angiogenic gene delivery.

벡터는 트랜스젠이 발현되고, 치료적 잇점을 제공하기에 충분한 양으로 송달된다. 바이러스 벡터(아데노바이러스)의 경우에, 주사가능하게 제조된 바이러스의 최종 역가는 효과적인 유전자 전달을 허용하는 바람직하게는 약 10⁷-10¹³바이러스 입자이다. 바람직하게는 야생형 바이러스가 결여된 아데노바이러스 벡터 스톡은 관상동맥(또는 이식편)의 한쪽 또는 양쪽의 내강내에, 바람직하게는 좌 및 우관상동맥 이식편의 내강내에, 광학 밀도계로 측정될 때 바람직하게는 약 10⁹-10¹¹바이러스 입자의 양으로 깊숙히 주사될 수 있다. 바람직하게는 벡터는 각 도관에(예를 들어, 각 관상동맥) 1회 주사로 송달된다.The vector expresses the transgene and is delivered in an amount sufficient to provide a therapeutic benefit. In the case of viral vectors (adenoviruses), the final potency of the injectably prepared viruses is preferably about 10 &lt; ⁷ &gt; -10 &lt; ¹³ &gt; Preferably, the adenoviral vector stock lacking the wild-type virus is administered in an amount sufficient to inhibit the growth of the coronary artery (or graft), preferably in the lumen of one or both coronary arteries (or grafts), preferably in the lumen of the left and right coronary artery graft, 10 ⁹ -10 ¹¹ can be injected deep into the amount of viral particles. Preferably, the vector is delivered in a single shot to each conduit (e.g., each coronary artery).

본원발명에 따른 유전자 요법 벡터의 국부화된 송달을 더욱 증가시키기 위해서, 그리고 유전자 송달의 효율성을 향상시키기 위해서, 혈관 활성제, 바람직하게는 히스타민 또는 히스타민 아고니스트 또는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 단백질 또는 산화질소 공여체(예를 들면, 소듐 니트로프루시드)를 혈관형성 유전자 요법 벡터와 함께 또는 바람직하게는 벡터의 도입전 수분내에 치료될 조직에 주입할 수 있다.In order to further increase the localized delivery of the gene therapy vectors according to the invention and to improve the efficiency of gene delivery, a vasoactive agent, preferably a histamine or histamine agonist or vascular endothelial growth factor (VEGF) A nitrogen donor (e. G., Sodium nitroprusside) may be injected into the tissue to be treated with an angiogenic gene therapy vector, or preferably within a few minutes prior to the introduction of the vector.

관상 카테테르에 의해서 관상동맥의 내강에 직접 벡터 조성물을 주사하여, 유전자를 더욱 효과적으로 표적화하고, 주사동안 근대동맥에 재조합 벡터의 손실을 최소화하는 것이 가능하다. 이러한 주사의 형태는 혈관형성 단백질 또는 펩티드-코딩 유전자와 함께 원하는 수의 세포, 특히 심근세포의 국부적 트랜스펙션을 가능케하여 유전자 전달의 치료적 효험을 극대화하고, 심장외 부위에서 바람직하지 않은 혈관형성을 최소화한다. 말단 혈관형성에 의해서 공급된 병든 조직에의 송달의 경우에, 이러한 조직을 공급하는 하나 이상의 동맥에 조직에 일시주사로 벡터가 도입될 수 있다.It is possible to inject the vector composition directly into the lumen of the coronary artery by a coronary catheter to more efficiently target the gene and to minimize the loss of the recombinant vector in the modern artery during injection. These forms of injection enable the local transfection of a desired number of cells, particularly myocardial cells, in conjunction with angiogenic proteins or peptide-coding genes to maximize the therapeutic efficacy of gene delivery and to inhibit undesired angiogenesis . In the case of delivery to diseased tissue supplied by endovascularization, the vector may be introduced into the tissue by a transfusion into one or more arteries supplying such tissue.

심근-특이적 결합 또는 섭취 구성요소를 통합하는 벡터 및/또는 심근-특이적 전사 조절 서열의 조절하에 있는(예를 들어, 심근세포-특이적 프로모터) 혈관형성 단백질 트랜스젠을 통합하는 벡터와 같은 심근에 특이적으로 표적된 벡터 구성체는 심근(심근세포)에의 발현을 더욱 제한하는 수단으로 이러한 특이적인 주사 기법과 결합되어 적소에서 사용될 수 있다. 면역반응을 유발할 수 있는 벡터의 경우에, 심장외 송달 또는 다르게는 면역반응에 대한 잠재성을 감소시키는 추가적인 기술이 사용될 수 있지만, 벡터를 상기에 개시된 바와 같이 심근을 공급하는 혈관에 직접 주사하는 것이 바람직하다. 골격근 또는 골격근에서 특이적으로 발현된 프로모터에 표적화된 벡터와 같은 말초 혈관형성에 의해 공급된 조직에 표적화된 벡터가 마찬가지로 사용가능하다.Such as a vector that integrates a myocardial-specific binding or ingestion component and / or a vector that integrates an angiogenic protein transgene (e.g., a myocardial cell-specific promoter) under the control of a myocardial-specific transcriptional regulatory sequence Vector constructs specifically targeted to the myocardium may be used in place in combination with this specific injection technique as a means of further restricting expression in myocardial cells (myocardial cells). In the case of a vector capable of causing an immune response, additional techniques which reduce the potential for extracardiac delivery or otherwise an immune response may be used, but direct injection of the vector into the blood vessel supplying the myocardium as described above desirable. Vectors targeted to tissue supplied by peripheral angiogenesis, such as those targeted to a promoter specifically expressed in skeletal muscle or skeletal muscle, are equally usable.

하기에 상세히 개시된 바와 같이, 혈관형성 트랜스젠을 함유하는 바이러스 벡터의 생체내 송달을 위한 본원발명의 기법을 사용하는 것은 트랜스젠이 간세포에서 발현되지 않았고, 바이러스 RNA가 관상내의 주사후에 어느때이든지 뇨에서 발견되지 않았다는 것을 증명한다. 게다가, 눈, 간, 또는 골격근에서 심장외 유전자 발견의 어떤 증거도 이러한 방법에서 트랜스젠의 관상내 송달 2 주후에 PCR 로 발견되지 않았다.Using the technique of the present invention for in vivo delivery of viral vectors containing angiogenic transgenes, as detailed below, demonstrates that transgenes are not expressed in hepatocytes and that viral RNA is present in urine any time after intra- Proves that it was not found. In addition, no evidence of extracardiac gene discovery in the eye, liver, or skeletal muscle was found by PCR after two weeks of intravenous delivery of transgen in this method.

당업계에 알려진 다양한 카테테르 및 송달 루트가 관상내 송달을 달성하기 위해서 사용될 수 있다(예를 들어:Topol, EJ (ed.), The Textbook of Interventional Cardiology, 2nd Ed. (W. B. Saunders Co. 1994) ; Rutherford, RB, Vascular Surgery, 3rd Ed. (W. B. Saunders Co. 1989) ; Wyngaarden JB et al. (eds.), The Cecil Textbook of Medicine, 19th Ed.(W. B. Saunders, 1992) ; and Sabiston,D, The Textbook of Surgery, 14th Ed.(W. B. Saunders Co. 1991)를 포함하는 상기에 언급된 참조문헌). 직접적인 관상내(또는 이식편 혈관) 주사는 형광 가이드하의 방법에 기초한 표준 경피 카테테르를 포함한다. 다양한 관상 카테테르, 또는 예를 들어, 스택 관류 카테테르가 본원발명에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원발명에의 사용에 적합한 다양한 일반적인 목적의 카테테르뿐만 아니라 변형된 카테테르가 Advanced Cardiovascular Systems (ACS), Target Therapeutics, Boston Scientific and Cordis 와 같은 상업적인 공급원으로부터 이용가능하다. 또한, 심근에의 송달이 (현재 가장 바람직한)관상동맥으로 직접 주사에 의해서 이루어지는 경우에, 당업계에 공지된 많은 접근법이 카테테르를 관상동맥에 도입하기 위해서 사용될 수 있다. 예컨대, 카테테르는 대퇴동맥에 용이하게 도입될 수 있고, 장골동맥 및 복부대동맥을 통해 역행성 관류된다. 택일적으로, 카테테르는 우선 위팔동맥 또는 경동맥에 도입될 수 있고, 관상동맥에 역행성 관류된다. 심근의 모세혈관상은 또한 예를 들어, 관상정동맥에 위치한 카테로로부터의 역행성 관류에 의해 이룰 수 있다. 이러한 카테테르는 또한 근위의 풍선을 사용하여 역행성 관류를 촉진시키는 수단으로 선행성 혈류를 예방 또는 감소시킬 수 있다. 말초 혈관에 의해 공급된 조직에의 송달을 위해서, 카테테르는 이러한 조직을 공급하는 동맥에 도입될 수 있거나(예를 들어, 다리의 경우에 넙다리동맥) 감염 조직에 일시 주사 또는 주입으로 도입될 수 있다.Various catheters and delivery routes known in the art can be used to achieve intra-coronary delivery (e.g., Topol, EJ (ed.), The Textbook of Interventional Cardiology, 2nd Ed. (WB Saunders Co. 1994) (WB Saunders, 1989); and Sabiston, D, et al. (Eds.), The Cecil Textbook of Medicine, 19th Ed. (WB Saunders, 1992); Rutherford, RB, Vascular Surgery, The Textbook of Surgery, 14th Ed. (WB Saunders Co. 1991). Direct intra-coronary (or graft) injection includes standard percutaneous catheters based on the method under fluorescent guidance. Various coronary catheters, or, for example, stack perfusion catheters may be used in the present invention. For example, modified catheters as well as various general purpose catheters suitable for use with the present invention are available from commercial sources such as Advanced Cardiovascular Systems (ACS), Target Therapeutics, Boston Scientific and Cordis. Also, where delivery to the myocardium is by direct injection into the (currently most preferred) coronary artery, many approaches known in the art can be used to introduce the catheter into the coronary artery. For example, the catheter can be easily introduced into the femoral artery and retrograde through the iliac and abdominal aorta. Alternatively, the catheter may first be introduced into the brachial artery or carotid artery and retrograde perfusion into the coronary artery. The capillary blood vessel image of the myocardium may also be achieved, for example, by retrograde perfusion from the catheter located in the coronary artery. These catheters can also prevent or reduce antegrade blood flow as a means of promoting retrograde perfusion using a proximal balloon. For delivery to tissue supplied by peripheral blood vessels, the catheter may be introduced into the artery supplying such tissue (e.g., in the case of a leg, the femoral artery) .

혈관형성 유전자 및 카테테르 또는 다른 생체내 송달 장치(예를 들어, 일반적으로 완충 용액으로 혈관 또는 근육에 약학적 조성물을 도입할 수 있는 다른 장치)를 포함하는 벡터의 다양한 조합은 본원발명에 따른 사용을 위해 키트내로 통합될 수 있다. 이러한 키트는 또한 유전자 송달을 향상시키기 위해서 하나 이상의 혈관활성제를 통합할 수 있고, 본원에 개시된 어떤 방법에 따른 키트의 사용을 개시하는 지시를 더 포함할 수 있다.Various combinations of vectors including angiogenic genes and catheters or other in vivo delivery devices (e.g., other devices capable of introducing pharmaceutical compositions into blood vessels or muscles, generally as a buffer solution) RTI ID = 0.0 &gt; kit. &Lt; / RTI &gt; Such kits may also incorporate one or more vasoactive agents to enhance gene delivery and may further include instructions to initiate use of the kit according to any of the methods described herein.

동물 모델Animal model

심혈관 유전자 요법의 성공적인 연구를 위한 필요조건은 (1)증가된 혈류 및/또는 수축기능에 대한 메카니즘을 고려한 유용한 데이타를 제공할 수 있는 임상 심혈관질환에 이용가능한 동물 모델의 구성, 및 (2) 유전자 전달 효과의 정확한 평가이다. 그러므로, 이러한 필요조건을 충족하는 돼지 모델을 사용하였다. 돼지는 그것의 사람 생리와의 관련성때문에 사람의 심장 질환의 연구에 특히 적합한 모델이다. 돼지 심장은 다음의 면에서 사람 심장과 극히 유사하다. 돼지는 천연 관상 부행혈관의 상대적인 부족을 포함하여 사람의 그것과 매우 유사한 천연 관순환을 가진다. 다음으로, 총 체중%에 대한 돼지 심장의 크기는 사람 심장의 체중%와 유사하다. 게다가, 돼지는 거대한 동물 모델이므로 유효 벡터 투여량, 독성등과 같은 다양한 지표에 관한 더욱 정확한 추정을 허용한다. 대조적으로 개 및 뮤린목 구성원의 심장은 의미있는 내인성 부행 혈관을 가진다. 추가적으로, 총체중에 비하여, 개 심장의 크기는 사람 심장 크기의 2 배이다.The requirements for a successful study of cardiovascular gene therapy include: (1) the composition of animal models available for clinical cardiovascular disease that can provide useful data, taking into account mechanisms for increased blood flow and / or contractile function; and (2) It is an accurate assessment of the delivery effect. Therefore, a pig model meeting these requirements was used. Pigs are a particularly suitable model for studying human heart disease because of its relevance to human physiology. The pig heart is very similar to the human heart in the following aspects. The pig has a natural tubal circulation that is very similar to that of humans, including the relative lack of natural coronary arteries. Next, the size of the pig heart relative to the total% body weight is similar to the percent body weight of the human heart. In addition, since pigs are large animal models, they allow more accurate estimates of various indicators such as effective vector doses, toxicity, and the like. In contrast, the heart of dog and myurin members has significant endogenous adrenal vessels. In addition, the size of the dog's heart is twice the size of the human heart compared to the total body weight.

본원의 실시예 5에 개시된 동물 모델은 심근허혈의 대표적인 예이다(예냐하면, 심근허혈은 또한 울혈성 심부전을 초래하고/또는 그와 함께 연관되어 발생할 수 있다. 특정 모델은 이 상황에 더 관련된다). 이 모델을 사용하여, 혈관형성 단백질을 코딩하는 유전자의 벡터-매개 송달이 심근허혈을 경감시켰고, 허혈 영역에서 혈류를 향상시켰다는 것을 증명했다. 부행 혈관 발생이 마찬가지로 증가되었다. 예로서, 천연형태 및 뮤테인 모두를 포함하는 몇개의 상이한 혈관형성 단백질을 가진 유전자 전달 기법을 증명했다(하기 실시예에 상세히 개시).The animal model disclosed in Example 5 herein is a representative example of myocardial ischemia (i.e., myocardial ischemia may also result in and / or be associated with congestive heart failure. Certain models are more relevant to this situation ). Using this model, it was demonstrated that vector-mediated delivery of genes encoding angiogenic proteins relieved myocardial ischemia and improved blood flow in the ischemic area. The occurrence of collateral vessels was similarly increased. As an example, a gene transfer technique with several different angiogenic proteins including both native forms and muteins has been demonstrated (detailed in the Examples below).

임상 관상동맥 질환을 모방하는 이 모델에서, 좌측 휘돌이(LCx) 관상동맥 주위의 아메로이드(ameroid) 수축근 부위가 최소의 경색(좌심실의 1%, LCx 상의 41%)으로 점진적으로 완전한 폐색(배치후 7일내)을 초래한다(Roth, et al., Circulation. 82 : 1778, 1990 ; Roth, et al.,Am. J. Physiol., 235 : 1-11279, 1987 ; White, et al., Circ. Res., 71 : 1490, 1992 ; Hammond, et al., Cardiol., 23 : 475, 1994 ; and Hammond, et al., J. Clin. Invest., 92 : 2644, 1993). 심근 기능 및 혈류는 휴식기에 폐색 동맥에 의한 이미 관류된 영역(허혈영역이라 함)에서는 정상적이지만, 제한된 내인성 부행혈관 발생때문에 심근의 산소 요구가 증가되는 경우에는 허혈을 방지하기에 불충분하다. 그러므로, LCx상은 임상 협심증에 유사한 발작성 허혈에 놓인다. 부행 혈관 발생 및 혈류기능 관계는 아메로이드 배치의 21일내에 안정하고, 4개월동안 안정이 지속된다(Roth, et al., Circulation,82:1778, 1990; Roth, et al., Am.J.Physiol., 235:H1279, 1987;White, et al., Circ.Res., 71:1490, 1992). 동물이 일상을 통하여 사료먹기, 사람에 의한 방해등의 동안에 심장박동수에서 갑작스러운 증가와 관련된 위험시에 주기적인 허혈 기능장애를 가진다는 것을 원격조정으로 관찰했다. 그러므로, 모델은 안정하지만 부적절한 부행혈관을 가진 상을 가지고, 주기적인 허혈에 놓인다. 본 모델의 다른 분명한 잇점은 이상 관류 및 기능장애 영역(LCx 상)에 인접한 일반적인 관류 및 기능 영역(LAD 상)이 존재함으로써, 각 동물내에 대조상을 제공하는 것이다.In this model mimicking clinical coronary artery disease, the left anterior descending coronary artery (LCx) amyoid shrinking muscle area around the coronary artery gradually progresses to complete occlusion with minimal infarction (1% of left ventricle and 41% of LCx) (Roth, et al., Circulation 82: 1778, 1990; Roth, et al., Am. J. Physiol., 235: 1-11279, 1987; White, et al. Circ. Res., 71: 1490, 1992; Hammond, et al., Cardiol., 23: 475, 1994; and Hammond, et al., J. Clin. Invest., 92: 2644, 1993). Myocardial function and blood flow are normal in the already perfused area (called the ischemic area) by the occlusion artery at rest, but are insufficient to prevent ischemia when the oxygen demand of the myocardium is increased due to limited endogenous collateral circulation. Therefore, the LCx phase is placed on paroxysmal ischemia, similar to clinical angina. The vascular development and blood flow function relationships are stable within 21 days of the amyloid placement and remain stable for 4 months (Roth, et al., Circulation, 82: 1778, 1990; Roth, et al., Am. Physiol., 235: H1279, 1987; White, et al., Circ. Res., 71: 1490, 1992). We observed by telemetry that animals have periodic ischemic dysfunction during daily life through food intake, human disturbance, and at risk associated with a sudden increase in heart rate. Therefore, the model is stable, but has an image with improper adnexal blood vessels and is placed on periodic ischemia. Another obvious advantage of this model is that there is a general perfusion and functional area (LAD phase) adjacent to the abnormal perfusion and dysfunction area (on the LCx), thereby providing a reference image within each animal.

심근 방사조영 심초음파검사는 국부성 심근 관류를 측정하는데 사용되었다. 대조물질은 갈락토스의 미세응집괴로 구성되고, 영상의 에코발생(백색)을 증가시킨다. 미세응집괴는 혈류에 비례하는 방식으로 관상동맥 및 심근벽에 분배된다(Skyba, et al., Criculation, 90;1513-1521, 1994). 최대 방사조영 강도는 중심체에 의해 측정될 때 심근 혈류와 밀접하게 연관된다(Skyba, et al., Circulation, 90:1513-1521, 1994). 본원발명에 사용된 심초음파검사 영상이 정확하게 LCx 상을 확인하고 있다는 것과 심근 방사조영 심초음파검사는 심근 혈류를 평가하는데 사용될 수 있다는 것을 기록하기 위해서, 수력 커프 가리개를 아메로이드에 인접한 근위 LCx 주위에 놓는다.Myocardial radiographic echocardiography was used to measure local myocardial perfusion. The control material is composed of galactose microaggregates and increases echogenicity (white) of the image. The microaggregates are distributed to the coronary artery and myocardial wall in a manner proportional to the blood flow (Skyba, et al., Criculation, 90; 1513-1521, 1994). Maximum radiographic intensity is closely related to myocardial blood flow when measured by centrosomes (Skyba, et al., Circulation, 90: 1513-1521, 1994). To note that the echocardiography image used in the present invention accurately identifies the LCx phase and that myocardial radiographic echocardiography can be used to assess myocardial blood flow, a hydraulic cuff shield is placed around the proximal LCx adjacent to the amyloid Leave.

본원 연구의 어떤 측면에서, 동물을 희생시킨 경우에, 심장을 관류 고정(글루타르알데히드, 생리압, 제자리)을 하여 현미경으로 모세혈관 성장을 정량화한다. PCR 을 사용하여 혈관형성 DNA 와 유전자 전달을 수용한 동물의 심근 mRNA 를 검출한다. 하기에 개시된 바와 같이, 유전자 전달 2 주후에, lacZ-형질전환된 동물의 심근 샘플은 조직 관찰에서 실질적인 베타-갈락토시다제 활성을 보였다. 최종적으로, 혈관형성 단백질에 대한 다클론 항체를 사용함으로써, 유전자 전달을 수용한 세포 및 동물의 심근에서 혈관형성 단백질 발현을 증명했다.In some aspects of the present study, when the animal is sacrificed, the heart is perfused (glutaraldehyde, physiological pressure, in place) to quantitate capillary growth with a microscope. PCR is used to detect myocardial mRNA in animals that have received angiogenic DNA and gene transfer. As described below, after 2 weeks of gene transfer, myocardial samples of lacZ-transformed animals showed substantial beta-galactosidase activity in tissue observation. Finally, by using polyclonal antibodies to angiogenic proteins, we have demonstrated angiogenic protein expression in the myocardium of cells and animals that have received gene delivery.

개선된 혈류를 증명하는 것과 관련하여, 다양한 기법이 당업자에게 공지된다. 예를 들어, 심근 혈류가 Roth, DM, et al., Am.J.Physiol. 253:H1279-H1288, 1987 또는 Roth, DM, et al., Circulation 82:1778-1779, 1990 에 개시된 방사선 중심체 기법으로 결정될 수 있다. 심근 혈류를 예를 들어, Braunwald in Heart Disease, 4^thed., pp.276-311(Saunders, Philadelphia, 1992)에 개시된 방사선핵종 탈륨으로 심장을 관류시키는 것을 포함하는 탈륨 영상화로 정량화할 수 있다. 심장세포는 탈륨에 대한 친화성을 가진다. 탈륨의 흡수는 혈류와 양성적 연관관계가 있다. 그러므로, 감소된 흡수는 관류 부족이 존재하는 허혈 상태에서 발생하는 경우에 감소된 혈류를 나타낸다. 의식이 있는 환자에서, 혈관형성 활성은 실시예 1 및 5 및 Sahn, DJ, et al., Circulation. 58:1072-1083, 1978. 에 개시된 바와 같은 방사조영 심초음파검사로 용이하게 평가될 수 있다. 개선된 심근 기능은 경흉부 심초음파검사와 같은 벽 비후화를 측정함으로써 결정될 수 있다.With regard to proving improved blood flow, various techniques are known to those skilled in the art. For example, myocardial blood flow is determined by Roth, DM, et al., Am. J. Physiol. 253: H1279-H1288, 1987 or Roth, DM, et al., Circulation 82: 1778-1779, 1990. Myocardial blood flow, for ^{example, Braunwald in Heart Disease, 4 th} ed., Can be quantified by thallium imaging which comprises flowing through the heart with thallium radionuclides disclosed pp.276-311 (Saunders, Philadelphia, 1992) . Cardiac cells have affinity for thallium. Absorption of thallium is positively correlated with blood flow. Therefore, reduced absorption indicates decreased blood flow when it occurs in an ischemic condition in which there is a lack of perfusion. In conscious patients, angiogenic activity was assessed in Examples 1 and 5 and Sahn, DJ, et al., Circulation. 58: 1072-1083, 1978, which is incorporated herein by reference. Improved myocardial function can be determined by measuring wall thickening, such as transthoracic echocardiography.

치료 연구의 전략은 트랜스젠 송달의 시간, 트랜스젠의 투여 수단 및 경로, 및 혈관형성 유전자의 선택을 포함했다. 심근 허혈의 아메로이드 모델에서, 유전자 전달을 안정하지만 불충분한 부행 혈관이 발생된 후에 실행했다. 아메로이드 모델을 사용한 사전 연구는 허혈 및 부행 혈관의 발생 전, 아메로이드 폐쇄동안 혈관형성 펩티드의 송달을 포함했다. 그러나, 이 접근법은 몇 가지 이유에서 사용되지 않았다. 첫째로, 이러한 연구는 진행중인 심근 허혈의 고정시에 유전자 전달을 수용한 임상 심근 허혈의 치료에 존재하는 상태를 밀접하게 복제하는데 적합하고; 사전 연구는 허혈이 기대되는 펩티드 제공에 유사하여 덜 관련된다. 둘째로, 혈관형성 펩티드와 관련된 허혈 자극이 혈관형성의 자극에 최적 환경일 것이라는 것이 세포 배양에서의 사전 연구에 기초하여 추정된다. 이것은 심장 질환이 이미 존재하는 경우에 트랜스젠의 송달에 의해 최적으로 얻어진다. 이러한 결정에 연관된 것은 트랜스젠 송달을 얻기위한 방법의 선택이었다. 기법이 관상 질환을 가진 환자의 일련의 치료에 적합해야만하는 제약이 몇몇의 접근법을 불용하게 만들었다(관상동맥에 펩티드의 계속적인 주사, 심장에 직접적인 플라스미드 주사, 장기간 느린 방출을 제공하는 펩티드를 함유하는 수지로 심장 코팅). 마지막으로, 돼지 모델은 유전자 송달의 전 및 후에 국부성 혈류 및 기능을 추적할 수 있는 우수한 수단을 제공한다. 같은 벡터(재조합 아데노바이러스)를 수용하지만, 리포터 유전자를 가지는 대조표준 동물의 사용은 이러한 연구에 대한 대조표준을 제공한다. 돼지는 천연 관상 부행 혈관의 상대적인 부족을 포함하는 사람의 그것과 유사한 천연 관순환을 가진다.돼지 모델은 또한 유전자 송달전 및 후에 국부성 혈류 및 기능을 추척할 수 있는 훌륭한 수단을 제공했다. 같은 재조합 아데노바이러스 구성체를 수용하지만 리포터 유전자를 가지는 대조표준 동물이 본 연구에 대한 대조표준으로 제공된다. 전술한 바, 및 이미 공개된 연구에 기초하여, 당업자는 돼지에서 하기에 개시된 결과로 사람에서의 예상된 결과를 예측한다.Strategies of treatment studies included the time of transgene delivery, the means and route of administration of transgen, and the selection of angiogenic genes. In the amyloid model of myocardial ischemia, gene transfer was performed after stable but insufficient adventitia occurred. Preliminary studies using the amyloid model involved delivery of angiogenic peptides during amyloid closure, prior to ischemic and adventitial vascular occlusion. However, this approach has not been used for several reasons. First, these studies are well suited for replicating closely the conditions present in the treatment of clinical myocardial ischemia that have received gene delivery during ongoing myocardial ischemic fixation; Preliminary studies are less related to providing peptides for which ischemia is expected. Second, it is estimated based on a preliminary study in cell culture that ischemic stimulation associated with angiogenic peptides will be the optimal environment for stimulation of angiogenesis. This is best achieved by the delivery of the transgene when a heart disease already exists. Associated with this decision was the choice of method to obtain transgenic service. The constraint that the technique must be suited to a series of treatments of patients with coronary disease has made some approaches impractical (including continuous injections of peptides into the coronary arteries, direct plasmid injections into the heart, and peptides that provide long-term slow release Heart coated with resin). Finally, pig models provide an excellent means of tracking localized blood flow and function before and after gene delivery. The use of control animals with the same vector (recombinant adenovirus), but with a reporter gene, provides a reference for this study. The pigs have a natural tubal circulation similar to that of humans, including those with a relative deficiency of natural coronary arteries. The pig model also provided an excellent means of tracking local blood flow and function before and after gene delivery. Control standard animals bearing the same recombinant adenoviral construct but carrying a reporter gene are provided as a control standard for this study. Based on the foregoing, and on the basis of studies already published, those skilled in the art predict the expected outcome in humans as a result of the following outcome in pigs.

말초혈관 질환과 관련하여, 본원발명의 유전자 요법 벡터를 사용하여 혈관형성 유전자의 말초 혈관에의 송달은 예를 들어, 말초허혈의 후사지 연결 모델을 사용하여 검사될 수 있다. 예를 들어, R. L. Terjung and colleagues 에 개시된 넙다리동맥 연결모델 참조. (예를 들어, Yang, et al., Circ. Res., 79 (1) : 62-9, 1996참조). 허혈심근에의 혈관형성 유전자의 송달과 관련하여, 본원발명에 따른 혈관형성 유전자의 말초 혈관 및/또는 연관 근육에의 송달은 말초 혈관 질환의 결과를 극복하기 위해서 사용될 수 있다.With respect to peripheral vascular disease, delivery of angiogenic genes to peripheral blood vessels using the gene therapy vectors of the present invention can be tested using, for example, a posterior limb connection model of peripheral ischemia. See, for example, the femoral artery connection model disclosed in R. L. Terjung and colleagues. (See, for example, Yang, et al., Circ. Res., 79 (1): 62-9, 1996). With respect to delivery of angiogenic genes to the ischemic myocardium, delivery of angiogenic genes according to the present invention to peripheral blood vessels and / or associated muscles can be used to overcome the consequences of peripheral vascular disease.

실시예 1 에 개시된 또다른 동물 모델은 임상 울혈 심부전에서 관찰된 바와 같은 확장 심근증을 유발한다. 이 모델에서, 3 내지 4 주의 기간동안 연속적인 빠른 심실 조율은 심부전에서 관찰된 국부성 기능 이상(심각한 관상 동맥 질환 및 IDCM 과 같은 비-CAD DCM과 연관된 이상을 포함)에 유사한 손상된 수축 기능을 가진 좌 심실 확장을 포함하는 임상 심부전의 많은 특징과 유사성을 보이는 심부전을 유발한다. 울혈성 심부전의 다른 동물 모델은 중심체의 관상내 송달에 의해 만성 심실 기능장애의 유발을 포함한다(예를 들어, Lavine et al., J Am Coll. Cardiol. 18 : 1794-1803 (1991) ; Blaustein et al., Am. J. Cardio. Path. 5 : 32-48(1994) ; Sabbah et al. Am. J. Physiol. 260 : H1379-H1384 (1991)참조). 심실 기능장애의 추가적인 예로서, 래트 모델에서 좌관상동맥의 폐색은 경색을 유발하고, 그 다음 동물을 연구대상으로 하여 연속적인 날 또는 주동안 치료한다(예를 들어, Pfeffer et al., Circ. Res. 44 : 503-512, 1979 ; Pfeffer et al., Am. J. Physiol. 260 : H1406-1414, 1991참조).Another animal model disclosed in Example 1 induces enlarged cardiomyopathy as observed in clinical congestive heart failure. In this model, continuous rapid ventricular tune for a period of 3 to 4 weeks has similar impaired contraction function to localized dysfunction observed in heart failure (including severe coronary artery disease and abnormalities associated with non-CAD DCM such as IDCM) Causing heart failure with similarity to many features of clinical heart failure, including left ventricular enlargement. Other animal models of congestive heart failure include the induction of chronic ventricular dysfunction by intra-coronary delivery of centrosomes (see, for example, Lavine et al., J Am Coll Cardiol. 18: 1794-1803 (1991); Blaustein J. Am. J. Physiol. 260: H1379-H1384 (1991)). As a further example of ventricular dysfunction, occlusion of the left coronary artery in a rat model causes an infarct, and then the animal is studied for consecutive days or weeks (see, e.g., Pfeffer et al., Circ. Res 44: 503-512, 1979; Pfeffer et al., Am. J. Physiol. 260: H1406-1414, 1991).

그러므로, 이러한 모델은 혈관형성 펩티드 또는 단백질이 이러한 상태와 연관된 심기능장애를 경감시키는데 효과적인지를 결정하는데 사용될 수 있다. 이러한 모델은 울혈성 심부전 및 심실 재형성의 치료용 생체내 유전자 요법의 효험을 평가함으로써 어떤 지표를 제공하는데 유용하다.Therefore, this model can be used to determine whether angiogenic peptides or proteins are effective in alleviating the cardiac dysfunction associated with this condition. This model is useful for providing some indication by evaluating the efficacy of in vivo gene therapy for the treatment of congestive heart failure and ventricular remodeling.

치료적 이용Therapeutic use

본원발명의 벡터(복제능 결여 아데노바이러스)는 현저한 괴사 또는 염증없이 생체내에서 매우 효과적인 유전자 전달을 허용한다. 이러한 결과에 기초하여, 하기의 실시예에 상세하게 개시된 것과 같이, 생체내 기능적 변화에 영향을 주는 의미있는 정도의 생체내 유전자 전달이 이루어졌다. 단독으로 또는 단백질 또는 펩티드를 향상시키는 다른 골격과 함께 조합하여 혈관형성 단백질의 유전자 전달은 혈류를 증가시키고, 치료될 근육의 근기능을 향상시킬 것이다. 더욱이, 원한다면, 혈관활성제(히스타민, 히스타민 아고니스트, 산화질소 공여체, 또는 VEGF 단백질)는 유전자 벡터 투여량에서 유전자 전달의 효율성을 향상시키는 데 사용될 수 있고, 이러한 약제의 통합은 허용된 치료 효과를 얻기 위해서 투여에 필요한 벡터의 양을 제한하는데 사용될 수 있다.The vector of the present invention (replication-deficient adenovirus) allows highly efficient gene delivery in vivo without significant necrosis or inflammation. On the basis of these results, a significant degree of in vivo gene transfer has been achieved which affects in vivo functional changes, as detailed in the Examples below. Gene delivery of angiogenic proteins, alone or in combination with other skeletons that enhance the protein or peptide, will increase blood flow and improve muscle function of the muscle to be treated. Moreover, if desired, vasoactive agents (histamine, histamine agonists, nitric oxide donors, or VEGF proteins) can be used to enhance the efficiency of gene delivery at a gene vector dose, and the integration of such agents Can be used to limit the amount of vector required for administration.

한 양태에서, 본원발명의 벡터 및 방법은 확장된 심근증(DCM), 전형적으로 저수축 좌 및/또는 우심실의 발견으로 진단된 심장병의 형태를 치료하는데 사용될 수 있다. 상기에 언급된 대로, DCM 은 관상 폐색 또는 심근경색의 가계와 같은 다른 특징적인 형태의 심장질환의 부재에서도 발생될 수 있다. DCM 은 좋지 않은 혈관 기능 및 심장병의 징후와 결합된다. 이러한 환자에서, 심실 확장 및 심벽 박화는 일반적으로 높은 좌심실벽 긴장을 초래한다. 많은 환자들은 약간의 운동 또는 휴식시에조차 징후를 나타내므로, 심각한, 즉 각각 "형태-E" 또는 "형태-IV", 심장병을 나타내는 것을 특징으로 한다. (예를 들어, NYHA 심장병 분류 참조) 상기에 언급된 대로, 관상동맥 질환을 가지는 많은 환자는 종종 한 번이상의 심발작(심근경색)의 결과로서 확장된 심근증을 나타내도록 진전될 수 있다.In one embodiment, the vectors and methods of the present invention can be used to treat forms of heart disease diagnosed with the discovery of extended cardiomyopathy (DCM), typically low-contraction left and / or right ventricle. As mentioned above, DCM can also occur in the absence of other distinctive forms of cardiac disease, such as tubular obstruction or myocardial infarction. DCM is associated with poor vascular function and signs of heart disease. In these patients, ventricular dilatation and wall thickening generally result in high left ventricular wall tension. Many patients are characterized as exhibiting severe, i.e., " Form-E " or " Form-IV, " respectively, heart disease as they exhibit signs even at slight exercise or rest. As noted above, many patients with coronary artery disease can often progress to exhibit expanded cardiomyopathy as a result of one or more seizures (myocardial infarction).

본원발명의 더이상의 이용은 심각한 심장병으로 진전될 수 있는 심근경색 후의 심실 확장으로 언급되는 해로운 좌심실 재형성을 예방하거나 적어도 감소시키는 것이다. (a. k. a., 해로운 재형성) 심실 재형성이 이미 개시된 경우조차도, 심실 기능장애를 오프셋하기에 효과적이기때문에 혈류 증가를 촉진하는 것이 여전히 바람직하다. 유사하게, 미세혈관상의 발생이 심실 기능장애를 오프셋하기에 효과적일 수 있기 때문에 혈관형성의 촉진이 유용할 수 있다. 더욱이, 이러한 혈관형성 단백질 또는 펩티드가 또한 다른 향상 효과를 가질 수 있다. 심근경색을 겪는 환자의 경우에, 환자가 심방 확장이 결핍되고, 심부전의 징후가 발생되지 않는다면 유해한 심실 재형성이 예방된다. 유해한 심실 재형성은 현존하는 심부전이 어떤 관찰가능하거나 측정가능하게 감소한다면 경감된다. 예를 들어, 환자는 호흡곤란을 덜 나타내고 개선된 운동 허용능을 나타낼 수 있다. 심기능의 개선 및 징후의 감소를 측정하는 방법은 DCM 에 대하여 상기에 개시된 것과 본질적으로 유사하다. 개선된 부행 혈류 및 심실 기능및/또는 다른 메카니즘의 결과로서 유해한 심실 재형성의 예방 또는 경감이 본원에 개시된 방법을 사용하여 환자에게 생체내 혈관형성 유전자 전달을 한 후 수주 내에 획득될 것으로 기대된다.The further use of the present invention is to prevent or at least reduce harmful left ventricular remodeling, referred to as ventricular dilatation after myocardial infarction, which can evolve into severe cardiac disease. It is still desirable to promote blood flow increase because it is effective in offsetting ventricular dysfunction, even if ventricular remodeling has already been initiated. Similarly, the promotion of angiogenesis may be useful because the occurrence of microvascular events may be effective in offsetting ventricular dysfunction. Moreover, such angiogenic proteins or peptides may also have other enhancing effects. In patients suffering from myocardial infarction, if the patient lacks atrial dilation and signs of heart failure do not occur, harmful ventricular remodeling is prevented. Harmful ventricular remodeling is relieved if there is any observable or measurable decrease in existing heart failure. For example, the patient may exhibit less respiratory distress and improved exercise tolerance. The method of measuring improvement in cardiac function and reduction of symptoms is essentially similar to that described above for DCM. It is expected that the prevention or alleviation of detrimental ventricular remodeling as a result of improved subpopulation and ventricular function and / or other mechanisms will be obtained within a few weeks after in vivo angiogenic gene delivery to the patient using the methods disclosed herein.

한 예에서, 본원발명의 혈관형성 단백질을 코딩하는 트랜스젠의 생체내 전달방법은 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 발현하는 재조합 아데노바이러스의 유전자 전달이 심근허혈을 감소시키기에 효과적이라는 것을 증명하는데 사용된다. 다른 예에서, 본원발명의 혈관형성 단백질을 코딩하는 트랜스젠의 생체내 전달은 울혈성 심부전과 결합된 상태를 치료하는데 사용된다.In one example, an in vivo delivery method of a transgene encoding an angiogenic protein of the present invention is used to demonstrate that gene delivery of recombinant adenovirus expressing angiogenic proteins or peptides is effective in reducing myocardial ischemia. In another example, the in vivo delivery of a transgene encoding an angiogenic protein of the invention is used to treat conditions associated with congestive heart failure.

하기에 나타난 바와 같이, 외인성-공급 혈관형성 트랜스젠의 발현은 증가된 혈류 및/또는 심장에서의 기능(또는 다른 표적 조직)을 초래한다. 증가된 혈류 및/또는 기능은 표적 조직에 영향을 주는 하나 이상의 심혈관 질환을 경감시킬 것이다.As shown below, the expression of the exogenous-feeding angiogenic transgenes results in increased blood flow and / or function in the heart (or other target tissue). Increased blood flow and / or function will alleviate one or more cardiovascular diseases affecting the target tissue.

본원에 개시된대로, 많은 상이한 벡터가 본원발명의 방법에 따라 생체내에 혈관형성 단백질 트랜스젠을 송달하기위해 사용될 수 있다. 한 예로서, 본원에 예증된 복제능 결여 재조합 아데노바이러스 벡터는 유전자 발현 영역에서 세포병변 효과 또는 염증없이 생체내에 매우 효과적인 유전자 전달을 이루었다.As disclosed herein, many different vectors may be used to deliver angiogenic protein transgenes in vivo according to the methods of the present invention. As an example, the replication competent recombinant adenovirus vector exemplified herein has achieved very effective gene transfer in vivo without cytopathic effect or inflammation in the gene expression region.

CAD 와 연관될 수 있는 협심증의 치료에서, 트랜스젠을 코딩하는 혈관형성 단백질의 유전자 전달은 어느때이든 수행될 수 있지만, 바람직하게는 심각한 협심증의 발병 후에 비교적 곧 수행된다. 대부분의 울혈성 심부전의 치료에서, 트랜스젠을 코딩하는 혈관형성 단백질의 유전자 전달은 예를 들어, 심부전의 발생이 있음직하거나, 심부전이 진단된 경우에 수행될 수 있다. 심실 재형성을 치료하기 위해서, 유전자 전달은 환자가 경색을 겪은 후 어느때이든지 수행될 수 있고, 바람직하게는 30일 내이고, 더욱 바람직하게는 경색 후 7-20일내이다.In the treatment of angina, which may be associated with CAD, gene transfer of angiogenic proteins encoding transgenes can be performed at any time, but is preferably performed relatively soon after the onset of severe angina. In the treatment of most congestive heart failure, gene delivery of angiogenic proteins encoding transgenes can be performed, for example, if heart failure is likely or heart failure is diagnosed. To treat ventricular remodeling, gene delivery can be performed any time after the patient has suffered an infarction, preferably within 30 days, more preferably within 7-20 days after infarction.

상기에 언급된 대로, 베타-아드레날린성 신호전달 단백질(베타-ASP)(베타아드레날린성 수용체(베타-AR), G-단백질 수용체 키나제 억제제(GRK 억제제) 및 아데닐사이클레이즈(AC)를 포함) 역시 본원에 참고문헌으로 수록된 U. S. 특허출원 일련번호 08/924,757, 1997.9.5 출원(1997.6.16 출원된 U. S. 60/048,933 및 1996.9.5 출원된 U. S. 08/708,661)뿐만 아니라, 1997.9.5. 출원된 PCT/US97/15610 및, 1998.1.16.출원된 U. S.가출원 일련번호 09/008,097, 및 1999.12.27. 출원된 U. S. 가출원 일련번호 09/472,667 에 개시되고 예시된 대로 심장 기능을 향상시키기 위해서 사용된다.As mentioned above, beta-adrenergic signal transduction protein (beta-ASP) (including beta adrenergic receptor beta-AR, G-protein receptor kinase inhibitor GRK inhibitor and adenyl cyclase AC) U.S. Patent Application Serial No. 08 / 924,757, filed September 9, 1997 (US 60 / 048,933 filed June 16, 1997 and US 08 / 708,661 filed September 5, 1996), both of which are incorporated herein by reference. PCT / US97 / 15610 and U.S. Provisional Application Serial Nos. 09 / 008,097, filed October 16, 1998, U.S. Provisional Application Serial No. 09 / 472,667, incorporated herein by reference in its entirety.

본원발명의 조성물 및 생산물은 환자에의 투여에 적합한 조성물의 형태로 혈류에 용이하게 제공될 수 있다(예를 들어, 동맥내 주사 또는 골격근과 같은 조직에의 일시주사) 적당한 투여 포맷은 의사에 의해 가장 잘 결정될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 적당한 담체 및 그들의 조성물은 예를 들어, Remington's Pharmaceuticals Sciences by E. W. Martin. See also Wang, Y. J. and Hanson, M. A.,"Parental Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers", Journals of Parental Sciences and Technology, Technical ReportNo. 10, Supp. 42 : 2S (1988)와 같은 표준 조성물 치료에서 개시된다. 본원발명의 벡터는 메타크레졸 0.1% 내지 0.75%, 더욱 바람직하게는 0.15% 내지 0.4% 메타크레졸과 같은 허용된 보존제와 함께 일반적으로 안전하게 여겨지는 인산 나트륨과 같은 당업계에 공지된 완충 용액으로 완충된 pH인 중성 pH, 예를 들어, pH 6.5 내지 약 pH 8.5, 더욱 바람직하게는 약 pH 7 내지 8의 용액으로 용액을 예를 들어, 4.5% 만니톨 또는 0/9% 염화나트륨의 등삼투압으로 하는 부형제와 함께 조제되어야만한다. 바람직한 등삼투압은 염화나트륨 또는 덱스트로스, 붕산, 소듐 타르타레이트, 프로필렌 글리콜, 폴리올(만니톨 및 솔비톨), 또는 다른 무기 또는 유기 용매와 같은 다른 약학적으로 허용가능한 약제를 사용하여 이루어질 수 있다. 염화나트륨은 나트륨 이온을 함유하는 완충액의 경우에 특이 바람직하다. 원한다면, 상기 조성물의 용액 역시 저장기간 및 안정성을 향상시키도록 제조될 수 있다. 본원발명의 치료적으로 유용한 조성물이 일반적으로 허용된 과정에 따라 성분을 혼합하여 제조된다. 예를 들어, 선택된 성분은 혼합되어서 농축 혼합물을 생산하고, 그 다음 pH를 조절하기 위해서 물 및/또는 완충액의 첨가 또는 삼투압을 조절하기 위해서 용매의 첨가로 최종 농도 및 점도에 적합하게 될 수 있다.The compositions and products of the present invention can be readily provided to the blood stream in the form of a composition suitable for administration to a patient (for example, intramuscular injection or temporary injection into a tissue such as skeletal muscle). It can be best determined. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and their compositions are described, for example, in Remington ' s Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin. See also Wang, Y. J. and Hanson, M. A., "Parental Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers", Journals of Parental Sciences and Technology, 10, Supp. 42: 2S (1988). The vector of the present invention is buffered with a buffer solution known in the art, such as sodium phosphate, which is generally considered safe with an acceptable preservative such as metacresol 0.1% to 0.75%, more preferably 0.15% to 0.4% for example, an isotonic osmotic pressure solution of 4.5% mannitol or 0/9% sodium chloride in a solution at a neutral pH, for example pH 6.5 to about pH 8.5, more preferably about pH 7 to 8, It should be prepared together. Preferred iso-osmotic pressure can be achieved using sodium chloride or other pharmaceutically acceptable agents such as dextrose, boric acid, sodium tartrate, propylene glycol, polyols (mannitol and sorbitol), or other inorganic or organic solvents. Sodium chloride is particularly preferred in the case of a buffer containing sodium ions. If desired, solutions of the above compositions may also be prepared to improve shelf life and stability. The therapeutically useful compositions of the present invention are prepared by admixing the ingredients according to generally accepted procedures. For example, the selected ingredients may be mixed to produce a thickened mixture, followed by the addition of water and / or buffer to adjust the pH or to the final concentration and viscosity by the addition of a solvent to control the osmotic pressure.

의사의 사용을 위해서, 조성물은 일회 또는 다회 투여에 효과적인 본발명의 벡터의 양을 함유하는 투여 형태로 제공되어 치료적 효과를 나타낼 것이다. 당업계에서 인지된 대로, 치료제의 유효량은 환자의 나이 및 체중, 환자의 신체 조건, 및 혈관형성의 수준 및/또는 다른 부수적인 효과, 및 다른 요소를 포함하는 많은 요소로 다양하게 될 것이다.For use by a physician, the composition will be provided in a dosage form containing an amount of a vector of the present invention effective for single or multiple doses to exhibit therapeutic effects. As is recognized in the art, the effective amount of the therapeutic agent will vary in many factors, including the age and weight of the patient, the physical condition of the patient, and the level of angiogenesis and / or other ancillary effects, and other factors.

본원발명의 바이러스 벡터의 효과적인 투여는 전형적으로 약 10⁷-10¹³바이러스 입자, 바람직하게는 약 10⁹-10¹¹바이러스 입자의 범위내일 것이다. 언급된 대로, 투여될 정확한 투여량은 담당의사에 의해서 결정되지만, 바람직하게는 5 ml 미만의 생리적 완충 용액(인산 완충 식염수), 더욱 바람직하게는 1-3ml이다.Effective administration of the viral vector of the present invention will be typically from about 10 ⁷ -10 ¹³ viral particles, preferably, within the range of about 10 ⁹ -10 ¹¹ virus particles. As noted, the exact dosage to be administered is determined by the attending physician, but is preferably less than 5 ml of physiological buffer solution (phosphate buffered saline), more preferably 1-3 ml.

바람직한 투여 방식은 적당한 카테테르 또는 다른 생체내 송달 장치를 사용한 하나 이상의 국부화 부위(예를 들어, 심질환의 경우에 한쪽 또는 양쪽 관상 동맥)에의 주사이다.A preferred mode of administration is injection into one or more localization sites (e. G., One or both coronary arteries in the case of heart disease) using suitable catheters or other in vivo delivery devices.

하기의 예는 당업자를 더욱 보조하기 위해서 제공된다. 그러므로 이러한 예는 예시를 위한 것이지 본원 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 않된다. 많은 실험적 변형이 본출원에 개시되고, 다른 것들이 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 변형은 본원에 개시되고 청구된 본원발명의 범위내에 여겨진다.The following examples are provided to further aid those skilled in the art. Therefore, these examples are for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the invention. Many experimental variations are set forth in the present application, and others will be apparent to those skilled in the art. Such variations are within the scope of the present invention as disclosed and claimed herein.

실시예 1 : 울혈성 심부전 및 관련 심근허혈의 돼지 모델Example 1: Pig model of congestive heart failure and related myocardial ischemia

1-A. 동물 및 수술과정1-A. Animal and Surgery courses

40±6kg 무게의 9 마리의 요크셔(Yorkshire) 돼지(Sus scrofa)를 케타민(50 mg/kg IM) 및 아트로핀 술페이트(0.1 mg/kgIM)에 이어서 소듐 아미탈(100 mg/kg IV)로 마취시켰다. 기관내 삽관후에, 할로탄(0.5% 내지 1.5%)을 과정동안 압력주기 호흡기로 송달했다. 좌개흉술시에, 카테테르를 대동맥, 폐심방, 및 좌심방에 놓였다. Konigsberg 마이크로마노미터를 좌심실 축에 놓았고, 외심 단극성 납을 좌심실의 측벽에서 방실 그루브 1.0cm 아래에 놓았다. 강력한 생성기(Spectrax 5985 ; Medtronic, Inc.)를 부종의 피하 포켓에 삽입시켰다. 4 마리의 동물에 주요 폐동맥 주위에 혈류 프로브를 장착했다(Transonic, Inc.). 심낭을 대략 측정했고, 흉부를 폐쇄했다.Nine Yorkshire pigs (Sus scrofa) weighing 40 ± 6 kg were anesthetized with ketamine (50 mg / kg IM) and atropine sulfate (0.1 mg / kg IM) followed by sodium amide (100 mg / kg IV) . After tracheal intubation, halothane (0.5% to 1.5%) was delivered to the pressure cycling respirator during the course. During left thoracotomy, the catheter was placed in the aorta, lung atrium, and left atrium. The Konigsberg micromanometer was placed on the left ventricle axis, and the ectodermal lead was placed 1.0 cm below the atrioventricular groove in the left ventricular sidewall. A powerful generator (Spectrax 5985; Medtronic, Inc.) was inserted into the subcutaneous pocket of the edema. Four animals were fitted with a blood flow probe around the main pulmonary artery (Transonic, Inc.). We measured the pericardium approximately and closed the chest.

개흉술 후 7 내지 10일에, 혈역학, 좌심실 기능, 및 심근 혈류의 베이스라인 측정을 했다. 그 다음 심실 조율을 개시했다(26±4일동안 220±9bpm(분당 심박동)). 자극 진폭은 2.5V, 펄스 기간은 0.5ms 였다. 9마리의 추가적인 돼지(407kg)를 대조표준으로 사용했다; 5 마리를 조율없이 개흉했고, 초기 개흉술후에 30±7일에서 죽였다. 좌 및 우심실 질량에 관한 데이타는 그들이 개흉술을 겪는지 아닌지에 관계없이 대조표준에 유사하여, 그들의 데이타를 단일 대조표준으로 모았다.Baseline measurements of hemodynamics, left ventricular function, and myocardial blood flow were performed 7-10 days after thoracotomy. Then initiated ventricular tune (220 ± 9 bpm (heart rate per minute) for 26 ± 4 days). The excitation amplitude was 2.5 V and the pulse duration was 0.5 ms. Nine additional pigs (407 kg) were used as control standards; 5 dogs were untuned and died at 30 ± 7 days after the initial thoracotomy. Data on left and right ventricular masses were similar to control standards, whether they were undergoing thoracotomy or not, and collected their data into a single control standard.

1-B. 혈역학 연구1-B. Hemodynamics Research

혈역학 데이타를 심박조율기가 적어도 1 시간동안 꺼진후 의식있는 깨어있는 동물로부터 얻었고, 동물은 기초 상태에 있었다. 7일 간격으로 각 동물에서 모든 데이타를 얻었다. 좌심방, 폐동맥, 및 대동맥으로부터 혈압을 쟀다. 좌심실 dP/dt 를 고충실성 좌심실 혈압으로부터 얻었다. 폐동맥류를 기록했다. 대동맥 및 폐혈 샘플을 동정맥 산소 함량 차이의 계산으로 얻었다.Hemodynamic data were obtained from conscious awake animals after the pacemaker was turned off for at least one hour, and the animals were in a basal state. All data were obtained from each animal at 7-day intervals. The left atrium, the pulmonary artery, and the aorta. The left ventricular dP / dt was obtained from the hypertonic LV blood pressure. The pulmonary artery was recorded. Aortic and pulmonary blood samples were obtained by calculating the difference in arterial oxygen content.

1-C. 심초음파검사 연구1-C. Echocardiography study

심초음파검사는 환자 또는 동물에 대조 물질의 주사를 포함하는 국소성 심근 혈류를 측정하는 방법이다. 대조물질(갈락토스의 미세응집괴)은 좌심방 주사후에영상의 에코음영(미백)을 증가시킨다. 미세응집괴는 혈류에 비례하는 방식으로 관상동맥 및 심근벽에 분포한다((Skyba, et al., Circulation, 90 : 1513-1521, 1994). 중심체로 측정될 때, 최대 방사조영 강도의 강화는 심근 혈류와 관련된다.(Skyba, et al., Circulation, 90 : 15131521, 1994).Echocardiography is a method of measuring focal myocardial blood flow involving the injection of contrast material into a patient or animal. The control material (microagglutination of galactose) increases the echo shade (whitening) of the image after left atrium injection. The microagglomerates are distributed in the coronary artery and myocardial wall in a manner proportional to the blood flow (Skyba, et al., Circulation, 90: 1513-1521, 1994) Associated with blood flow (Skyba, et al., Circulation, 90: 15131521, 1994).

2-차원 및 M-모드 영상을 Hewlett Packard Sonos 1500 영상 시스템으로 얻었다. 영상을 유두중앙 근육 수준에서 우흉골연 접근법으로 얻었고, VHS 테잎상에 기록했다. 심초음파검사의 아메리카 협회의 기준에 따라서 측정했다. (Sahn, DJ, et al., Circulation. 58 : 1072-1083, 1978). 돼지 심실간 격막(IVS)의 중앙 배향 및 우흉골 관점의 사용때문에, IVS 및 해부 측벽을 통해서 단축 M-모드 측정을 했다. 확장-말기 치수(EDD), 수축-말기 치수(ESD), 및 벽 비후화를 포함하는 모든 변수를 적어도 5 개의 무작위 호기성-말기 심박수에서 측정했고, 평균화했다. 확장-말기 치수를 ORS 복합체의 시작에서 얻었다.Two-dimensional and M-mode images were obtained with a Hewlett Packard Sonos 1500 imaging system. Imaging was obtained with a right sternal approach at the papillary central muscle level and recorded on VHS tape. Were measured according to American Association of Echocardiography criteria. (Sahn, DJ, et al., Circulation 58: 1072-1083, 1978). Due to the central orientation of the pig ventricular septum (IVS) and the use of the right sternal viewpoint, a short axis M-mode measurement was made through the IVS and anatomic side walls. Expansion - All variables including EDD, shrinkage, and wall thickening were measured and averaged in at least five random aerobic - end - of - heart rates. Expansion - The terminal dimensions were obtained at the start of the ORS complex.

수축-말기 치수를 IVS 의 최대 측벽 위치 또는 T 웨이브의 말기에서 취했다. 최심실 수축 기능을 분획 단축 FS= [(EDD-ESD)/EDD] x100을 사용하여 평가했다. % 벽 비후화(% WTh)를 % WTh= [(ESWTh-EDWTh)/EDWTh]x100일때 계산했다. 심초음파 측정의 재생을 증명하기 위해서, 조율 프로토콜을 개시하기 전 연속적인 2일에서 동물을 영상화했다. 별개 결정인자의 데이타는 매우 재생가능했다(계수 단축, R²=. 94, P=.006; 측벽 비후화, R²=.90, P=.005). 모든 측정을 심박조율기를 끄고 했다.The contraction-terminal dimension was taken at the maximum sidewall position of the IVS or at the end of the T wave. The ventricular contraction function was evaluated using fractional shortening FS = [(EDD-ESD) / EDD] x100. % Wall thickening (% WTh) was calculated at% WTh = [(ESWTh-EDWTh) / EDWTh] x100. To demonstrate regeneration of echocardiographic measurements, the animals were imaged in two consecutive days prior to initiation of the tune protocol. The data of the different determinants were highly reproducible (coefficient shortening, R ² = .94, P = .006; sidewall hypertrophy, R ² = .90, P = .005). All measurements were made with the pacemaker turned off.

1-D. 심근 혈류1-D. Myocardial blood flow

심근 혈류를 이미 상세하게 개시된 대로 방사선 중심체 기법에 의해 결정되었다(Roth, DM, et al., Am. J. Physiol. 253 : H1279-H1288, 1987 ; Roth, DM, et al., Circulation 82 : 1778-1789, 1990). 좌심실 측벽 및 IVS 로부터 전층 샘플을 내심, 중벽, 및 내심 3 부분으로 나누었고, 혈을 각 3 부분으로 나누었고, 전층 혈류를 측정했다. 전층 절개물을 심초음파검사 측정을 한 영역으로부터 취해서, 혈류 및 각 상내에 해당된 기능적 측정을 했다. 심실 조율의 개시시에(225bpm), 중심체를 대조표준 상태에 주사했고(비조율), 그 다음 225 bmp 에서 심실 조율동안 7일 간격으로; 중심체를 또한 14일(n=4) 및 21일 내지 28일(n=3)에서 심박조율기를 끄고 주사했다. 심박수당 심근 혈류를 분열하는 심근의 혈류를 심박수로 나누어서 계산했다(중심체 주입동안 기록)(Indolfi, C., et al., Circulation 80:933-993, 1989). 평균 좌심방 및 평균 동맥혈압을 중심체 주사동안 기록하여, 관상 혈관 저항의 측정을 계산했다; 관상혈관 저항 지표는 평균 동맥 혈압-좌심방 혈압을 전층 관상 혈류로 나눈 것과 같다.Myocardial blood flow has been determined by the radiocentral technique as previously described in detail (Roth, DM, et al., Am. J. Physiol. 253: H1279-H1288, 1987; Roth, DM, et al., Circulation 82: 1778 -1789, 1990). Whole-layer samples from the left ventricular sidewall and IVS were divided into three parts: the inner, middle, and inner parts. Blood was divided into three parts, and whole blood flow was measured. Whole-thickness incisions were taken from the echocardiographic area and functional measurements were made in the bloodstream and each phase. At the onset of ventricular tune (225 bpm), centrioles were injected (non-tuned) into the control standard state, then at 7 days intervals during ventricular tune at 225 bmp; The pancreas was also injected with the pacemaker turned off at 14 days (n = 4) and 21 to 28 days (n = 3). (Indolfi, C., et al., Circulation 80: 933-993, 1989) by dividing the myocardial blood flow dividing myocardial blood flow per heart rate by the heart rate. Mean left atrial and mean arterial blood pressures were recorded during centrosurgery to calculate the measurement of coronary vascular resistance; Coronary vascular resistance index is equal to mean arterial blood pressure - left atrial pressure divided by total coronary blood flow.

1-E. 수축 벽 응력1-E. Contraction wall stress

좌심실의 긴 축을 측정하기 위한 적당한 관점을 얻을 수 없기때문에 주위수축벽응력을 결정할 수 없었다. 그러므로, 우리는 평균 세로 수축-말기 벽응력을 사용하여 수축-말기 벽 응력을 계산했다(Riechek, N., et al., Circulation 65 : 99-108, 1982). (다인)=(0.334xPxD)÷[h(I-h/D)]; 여기에서, P는 다인으로 좌심실 수축-말기 벽 압력이고, D는 cm 로 좌심실 수축-말기 직경이고, h는 수축-말기 벽 비후화이다. 세로 수축-말기 벽응력을 조율의 개시전과 매주 간격으로 계속적으로 측벽과 IVS 에 대하여 계산했다(심박조율기 끔).The peripheral contraction wall stress could not be determined because an appropriate viewpoint for measuring the long axis of the left ventricle could not be obtained. Therefore, we calculated the contraction-end wall stress using mean longitudinal contraction-end wall stress (Riechek, N., et al., Circulation 65: 99-108, 1982). (Dyne) = (0.334xPxD) / h (I-h / D)]; Where P is the left ventricular contraction - end wall pressure, D is the left ventricular contraction - terminal diameter, and h is the contraction - terminal wall hypertrophy. The longitudinal contraction-end wall stresses were continuously calculated for the sidewall and IVS at the beginning of the tuning and every week intervals (pacemaker off).

1-F. 최종 수술1-F. Final surgery

계속된 조율 26±2일 후에, 동물을 마취시켰고 인큐베이션했고, 정중흉골 절개술을 했다. 정지된 심박 심장을 식염수(4℃)에 액침했고, 관상동맥을 심염수로 빠르게 관류시켰고(4℃), 우심실 및 좌심실(IVS포함)을 무게를 쟀고, 각 영역으로부터의 전층 샘플을 액체 질소에서 빠르게 동결시켜서, -70℃에서 저장했다.After 26 ± 2 days of continuous tuning, the animals were anesthetized, incubated and subjected to a median sternotomy. The resting cardiac heart was immersed in saline (4 ° C), the coronary arteries were rapidly perfused with deep saline (4 ° C), the right ventricle and left ventricle (including IVS) were weighed, Quickly frozen and stored at -70 &lt; 0 &gt; C.

1-G. 아데닌 뉴클레오티드1-G. Adenine nucleotide

ATP 와 ADP 를 심부전을 가진 4 마리의 동물 및 (조율후 28일) 및 4 마리의 대조표준 동물에서 IVS 의 전층경색 샘플 및 측벽에서 측정했다. 심부전을 가진 동물의 샘플을 동물이 희생된 날에 심박조율기를 끄고(60분) 얻었다. 샘플을 모든 동물에서 동시에 취했다. ATP 및 ADP 를 이미 개시된 바와 같이 Waters 고성능 액체 크로마토그래프에서 측정했다(Pilz, R. B., et al., J. Biol. Chem. 259 : 2927-2935, 1984).ATP and ADP were measured in full-thickness infarct samples and sidewalls of IVS in 4 animals with heart failure (28 days post-tuning) and 4 control reference animals. Samples of animals with heart failure were taken off the pacemaker (60 min) on the day the animal was sacrificed. Samples were taken simultaneously in all animals. ATP and ADP were measured on a Waters high performance liquid chromatograph as previously described (Pilz, R. B., et al., J. Biol. Chem. 259: 2927-2935, 1984).

1-H. 통계적 분석1-H. Statistical analysis

데이타를 평균±표준 편차(SD)로 나타냈다. 대조표준(선조율) 상태 및 조율동안 1-주 간격에서 얻은 특정 측정을 반복 측정 ANOVA와 비교했다(Crunch4, Crunch Software Corp.). 어떤 비교에서(예를 들어, 측벽 대 IVS), 이중-방식 ANOVA 를 사용했다. 후 Hoc 에 당업계에 개시된 "Tukey 방법"으로 수행했다. 9마리의 동물이 조율 후 21일에서 생존했고; 이 중 6 마리가 조율 후 28 일에서 생존했다. 28 일에서 생존한 동물의 데이타는 단지 21일에서 생존한 동물의 데이타와 통계적으로 구별되지 않는다. 그러므로, ANOVA를 4 시간 포인트에서 9 마리 동물에 대하여 수행했다: 대조표준(선조율), 7일, 14일, 및 21 내지 28일. 무효가설은 P <.05(이중-미(尾))일때 반려했다.Data were expressed as mean ± standard deviation (SD). The specific measurement obtained at the 1-week interval during the control standard (conditioning rate) condition and during tuning was compared to the repeated measurement ANOVA (Crunch4, Crunch Software Corp.). In some comparisons (eg sidewall vs. IVS), we used a dual-way ANOVA. &Quot; Tukey method " disclosed in the art. Nine animals survived on day 21 after adjustment; Six of them survived on the 28th day after the tuning. The data of the surviving animal on day 28 are not statistically distinguishable from the data on surviving animal on day 21 only. Therefore, ANOVA was performed on 9 animals at 4 hour points: control standards (fasting rate), 7 days, 14 days, and 21 to 28 days. The null hypothesis was rejected when P <.05 (double-tailed).

결과 1-I.Results 1-I.

혈역학 연구Hemodynamics Research

빠른 심실 조율은 조율 7 내지 14 일후에 의미있는 혈역학에서의 변화를 초래했다. 7일에서, 동물은 평균 좌심방 및 동맥압을 증가시켰다. 이러한 혈압은 더이상의 주에서 조율하는 동안 증기일로로 비정상이 되었다(표 1). 순환 울혈의 지표(빈호흡, 복수, 및 빈맥)가 14 내지 21 일에서 분명했다. 폐동맥류(심박출)는 조율 21에서 감소되었다(대조표준, 3.3±0.1 L/분; 21일, 1.9±0.4 L/분 ;P<.05).Early ventricular tune resulted in significant hemodynamic changes after 7 to 14 days of tuning. At day 7, the animals increased the mean left atrium and arterial pressure. These blood pressures became abnormally steamy during coordination in no more weeks (Table 1). Indicators of circulating congestion (rash, ascites, and tachycardia) were evident at 14 to 21 days. Pulmonary artery flow (heart rate excretion) was reduced at the tuning 21 (control standard, 3.3 ± 0.1 L / min; 21 days, 1.9 ± 0.4 L / min; P <.05).

분산의 분석(반복된 측정)을 사용하여 조율의 기간이 특정 분산에 영향을 미쳤는지를 결정하는데 사용했고; ANOVA 의 p-값은 오른쪽 열에 목록화했다. 후 hoc시험을 Tukey 방법으로 실행했다:^ap<0.05;^bp<0.01;^cp<0.001(같은 변수에 대한 대조표준 값);^dp<0.05;^ep< 0.01;^fp,0.00 (대. 이전주);^gp <0.05;^hp<0.01 ;ⁱp<0.001 (대. 7d 값); Tukey 방법에 의한 후 hoc 시험. 심박조율기가 불활성화되었을 때 측정을 했고, 평균±SD를 나타낸다. 7d: 7일의 조율; 14d: 14일의 조율; 21-28d:21-28일의 조율.An analysis of the variance (repeated measures) was used to determine if the duration of the tune affected the specific variance; The p-value of ANOVA is listed in the right column. The post hoc test was performed by the Tukey method: ^a p &lt;0.05; ^b p &lt;0.01; ^c p <0.001 (control standard value for the same variable); ^d p &lt;0.05; ^e p &lt;0.01; ^f p, 0.00 (vs. previous week); ^g p &lt;0.05; ^h p &lt;0.01; ⁱ p < 0.001 (vs. 7d value); Post hoc test by Tukey method. Measurements were made when the pacemaker was deactivated and represent the mean ± SD. 7d: Tuning of 7 days; 14d: Tuning of 14 days; 21-28d: Tuning of 21-28 days.

1-J. 전좌심실 기능1-J. Anterior left ventricular function

좌심실 기능을 심박조율기를 끈 후에 심초음파검사 및 혈역학 변수에 의해서 측정했다. 경색 단축이 조율동안(P=.0001;표1) 점진적으로 감소되어, 21 내지 28일에 가장 낮은 값에 이르렀다(대조표준, 39±3% ; 21 내지 28일 13+4% ; P<. 0002). 좌심실 확장-말기 치수가 조율동안 점진적으로 증가되어(P<.0001; 표1), 21 내지 28일에 최대값에 이르렀다(대조표준, 3.9±0.4cm; 21 내지 28 일, 5.8±0.6 cm;P=.0002). 좌심실 최대 양성 dp/dt 역시 연구동안 감소되었다 (P=.0001; 표1). 증가된 예비부하는 일반적으로 좌심실 최대 dP/dt 를 증가시키기 때문에, 최대 dP/dt 내의 점진적인 감소가 좌심실 확장-말기압을 향상시킴으로써 이루어졌고, 감소된 좌심실 수축성을 기록했다(Mahler, F., et al., Am. J. Cardiol.35 : 626-634, 1975).Left ventricular function was measured by echocardiography and hemodynamic variables after the pacemaker was turned off. The infarcted shortening was progressively reduced during co-ordination (P = .0001; Table 1), reaching the lowest value at 21-28 days (control standard, 39 +/- 3%; 21-28 days 13 + 4%; 0002). The left ventricular dilatation-end stage was gradually increased during the adjustment (P <.0001; Table 1), reaching a maximum at 21-28 days (control standard, 3.9 ± 0.4 cm; 21 to 28 days, 5.8 ± 0.6 cm; P = .0002). Maximum left ventricular dp / dt was also decreased during the study (P = .0001; Table 1). Since the increased preload generally increases the left ventricular max dP / dt, a gradual decrease in maximum dP / dt was achieved by improving left ventricular dilatation-end pressure and recorded reduced left ventricular contractility (Mahler, F., et al., J. J. Cardiol. 35: 626-634, 1975).

1-k. 좌심실 국소적 기능1-k. Left ventricular local function

심방조율기가 비활성화됨에 따라서, 국소성 좌심실 기능을 좌심실측벽 및 IVS 의 벽 비후화 백분율의 측정에 의해서 평가했다. 측벽 기능의 의미있는 손실을 야기한 측벽의 심실 조율을 IVS 와 비교했다(P=.001; 도1 및 표2). 이러한 차이는 7일에서 의미있고, 측벽 기능이 손상됨에 따라서 21 내지 28일에 더 증가했다. IVS 는 연구동안 벽 비후화에서 덜의미있는 감소를 보였다. 확장-말기 벽 비후화는 연구동안 점진적인 박화를 보였고, 이것은 측벽에서 더욱 중증이었다(표 2).As the atrial tune was deactivated, focal left ventricular function was assessed by measuring the percentage of wall hypertrophy of the left ventricular sidewall and IVS. The ventricular tachycardia of the sidewall causing significant loss of sidewall function was compared with IVS (P = .001; Fig. 1 and Table 2). This difference was significant at 7 days and increased further at 21 to 28 days as sidewall function was impaired. IVS showed a less significant decrease in wall thickening during the study. Expansion-terminal wall thickening showed gradual thinning during the study, which was more severe in the sidewall (Table 2).

이중-방식 분산 분석(반복된 측정)은 확장-말기 벽 비후화(EDTh) 또는 % 벽 비후화(WTh)가 조율(시간), 또는 영역(측벽,LAT;또는 심실중격, IVS)에 의해서 영향을 받는지, 또는 EDTh 또는 WTh% 가 양 영역(간;inter)간에 상이한지를 결정하는데 사용했다. 각 시간 포인트에서의 EDTh 및 WTh%의 평균값을 Tukey 분석에 의한 후 hoc 양 영역간의 차이에 대해서 시험했다. 값은 평균±SD. 7d : 7일 조율; 14d : 14 일 조율; 21-28d : 21-28 일 조율. n=9 을 나타냈다.Double-way ANOVA (repeated measures) can be used to assess the effect of extended-terminal wall hypertrophy (EDTh) or% wall hypertrophy (WTh) on coordination (time) or on the area (sidewall, LAT; or ventricular septum, IVS) , Or whether EDTh or WTh% is different between the two regions (inter; inter). The mean value of EDTh and WTh% at each time point was tested for differences between the hoc and the posterior regions by Tukey's analysis. Values are mean ± SD. 7d: 7 days coordination; 14d: Tuning for 14 days; 21-28d: Tuning 21-28 days. n = 9.

1-L. 좌심실 국부성 혈류1-L. Left ventricular localization blood flow

조율이 개시된 경우에 분당 심내막하 혈류는 측벽에서보다 IVS 에서 더욱 증가되었다(도2 및 표3). 조율동안 국부성 혈류의 차이는 연구 기간동안 지속되었고, 혈류 변화의 양상은 양 영역에서 상이했다(P=.006). 조율동안 양 영역간의 분당 혈류에서의 변화 패턴은 내심(P=.006), 중벽(P=.002), 외심(P=.016), 또는 전층(P=. 003) 절개(표3)에서 측정되었는지에 따라 일정하다. 대조적으로, 심박조율기를 끈경우에, 심내막하 혈류는 대조표준 상태, 14일, 또는 21 내지 28 일(도 2 및 표3)에 측정되었는지에 따라 어떠한 국부적 차이를 보이지 않았다.When the tuning was initiated, the pericardial flow per minute was further increased in the IVS than in the sidewall (FIG. 2 and Table 3). The difference in localized blood flow during coordination lasted for the duration of the study, and the pattern of blood flow change was different in both regions (P = .006). The patterns of changes in blood flow per minute between the two regions during the tuning were found to be significantly different from those in the middle (P = .006), middle (P = .002), outer (P = .016) It is constant depending on whether it is measured. In contrast, when the pacemaker was turned off, the subcapsular blood flow did not show any local difference depending on whether it was measured in the control standard state, 14 days, or 21-28 days (Figure 2 and Table 3).

분산의 이중-방식 분석(반복된 측정)을 사용하여 아내심(END0)또는 전층(TRANS)혈류가 조율기간(시간), 또는 영역(측벽, LAT;또는 심실간 격막, IVS)에 의해서 영향을 받는지, 또는 혈류 변화의 패턴이 양 영역(간)에 상이한지를 결정하는데 사용했다. 각 시간 포인트에서 혈류에 대한 평균값을 Tukey 분석에 의해서 후 hoc 양 영역간의 차이에 대해 시험했다. 값은 5 동물에서 평균 SD 를 나타낸다. ON: 심실 조율동안 주사된 중심체(225 bpm). OFF: 심박조율기를 끔. 0일= 대조표준; 14일: 14일 조율; 21-28일:21-28일 조율.(END0) or whole layer (TRANS) blood flow is affected by the tuning period (time), or by the area (sidewall, LAT; or IVS) using dual-way analysis of variance , Or whether the pattern of blood flow change was different in both regions (liver). The mean value of blood flow at each time point was tested for differences between post hoc regions by Tukey analysis. Values represent mean SD in 5 animals. ON: Centrifugal injected during ventricular tachycardia (225 bpm). OFF: Turn the pacemaker off. 0 day = control standard; 14 days: 14 days coordination; 21-28 days: 21-28 days coordination.

심내막에서 심외막으로의 혈류 비율은 심부전이 진행할때 의미있게 변하지 않았다(P=.058). 그러나, 조율의 개시와 함께, 내심 대 외심의 비율은 IVS에서 보다 측벽에서 실질적으로 낮았다(IVS, 1.32±0.23; 측벽, 0.77±0.10; P=.0002; 표3). 양 영역에서의 비율은 나머지 연구동안 >1.0 이었다.The rate of flow from the endocardium to the epicardium did not change significantly when heart failure progressed (P = .058). However, with the onset of tuning, the ratio of the inner to the outer core was substantially lower at the sidewall than at the IVS (IVS, 1.32 ± 0.23; sidewall, 0.77 ± 0.10; P = .0002; The ratio in both regions was> 1.0 for the remainder of the study.

심박동당 내심 혈류(도2 및 표4)는 조율의 개시 전 양 영역에서 유사했다(IVS, 0.013±0.003 mL·min^-1·g^-1·심박동^-1; 측벽, 0.012±0.004mL·min^-1·g^-1·심박동^-1; P=NS). 심실 조율의 개시에서(225bpm), IVS 에서는 아니지만 측벽에서 심박동당 내피 혈류에서 국부성 결손이 있었다(IVS,0.009±0.002 mL. min^-1· g^-1·심박동^-1; 측벽, 0.005±0.001 mL·min^-1· g^-1·심박동^-1; P=.001). 14일 및 21일 내지 28 일에, 심박동당 내심 혈류는 조율동안 IVS 에서 보다 측벽에서 더 약했다(도2 및 표4). 이러한 데이타는 측벽에서 심근 저관류가 조율의 개시에서 시작했고, 상대적인 허혈이 지속되었다는 것을 나타낸다. 그러나, 심박동당 내심 혈류는 심박조율기를 끈 양 영역에서 정상이었다(도2 및 표4).The inward heart flow per heart beat (Figure 2 and Table 4) was similar in both regions before initiation of coordination (IVS, 0.013 ± 0.003 mL · min^-One· G^-One· Heart beat^-One; Side wall, 0.012 ± 0.004 mL · min^-One· G^-One· Heart beat^-One; P = NS). At the onset of ventricular tune (225 bpm), there was a localized defect in the endothelium flow in the sidewall, not in the IVS (IVS, 0.009 ± 0.002 mL. Min^-One· g^-One· Heart beat^-One; Side wall, 0.005 ± 0.001 mL · min^-One· g^-One· Heart beat^-One; P = .001). On days 14 and 21-28, endocardial flow per heart beat was weaker at the sidewall than at IVS during tune (FIG. 2 and Table 4). These data indicate that myocardial hypoperfusion at the sidewall began at the onset of tuning and continued relative ischemia. However, the flow of the inner heart per heart was normal in both regions where the pacemaker was turned on (FIG. 2 and Table 4).

양 영역에서 혈류는 조율의 마지막 주 동안 증가하는 경향이 있었다(도 2 및 표3). 이 패턴은 관상 혈관 저항 지표와 관련되었고(도3), 관상 혈관 구조 및 기능에서의 변형은 심부전이 진행됨에따라 좌심실 재형성을 수반할 수 있다는 것을 제안한다. 조율의 개시시에 관상혈관 저항 지표는 IVS 에서 보다 측벽에서 더욱 의미있었고, 관상 혈관 저항에서 변화의 패턴은 양 영역에서 상이했다(P=.0012)(도3). 이러한 발견은 심근 관류에 대한 변형된 전기 활성의 효과를 나타낼 수 있다.In both regions, blood flow tended to increase during the last week of tuning (Figure 2 and Table 3). This pattern is associated with coronary vascular resistance index (Fig. 3), suggesting that deformation in coronary vasculature and function may involve left ventricular remodeling as heart failure progresses. The coronary vascular resistance index at the onset of tuning was more significant in the sidewall than in IVS, and the pattern of change in coronary vascular resistance was different in both regions (P = .0012) (Fig. 3). This finding may indicate the effect of modified electroactivity on myocardial perfusion.

1-M. 좌심실 수축말기 벽 응력1-M. Left ventricular contraction End wall stress

조율(P<0.0001) 기간에 관하여 추정 세로 수축말기 벽 응력에 유의한 증가가 있었지만, 벽 응력의 변화 패턴은 측벽 및 IVS(P=33)과 유사했고, 후 hoc 시험은 어떤 특정한 시간 포인트에서 수축기 벽 응력에 어떤 부위적 차이도 나타내지 않았다(도 3). 수축말기 벽 응력의 증가는 측벽(대조표준, 168±40×10³다인; 28일, 412±143×10³다인; P=0.0001) 및 IVS(대조표준, 159±35×10³다인; 28일, 480±225×10³다인; P=0.0001)에서 대략 3배였다.The pattern of change in wall stress was similar to that of the sidewall and IVS (P = 33), although there was a significant increase in the estimated longitudinal contraction end wall stress for the tuning period (P <0.0001) But did not show any regional differences in wall stress (FIG. 3). The increase in wall stress at the end of contraction was measured by the side wall (control standard, 168 ± 40 × 10 ³ dyne; 28 days, 412 ± 143 × 10 ³ dyne; P = 0.0001) and IVS (control standard, 159 ± 35 × 10 ³ dyne; Day, 480 ± 225 × 10 ³ dynes; P = 0.0001).

1-N. 부검1-N. Autopsy

부검에서, 심부전을 갖는 동물은 복수가 있었으며, 심장은 팽창되어 벽이 얇아져 있었고, 4개 심방실이 모두 전체적으로 커진 것으로 나타났다. 심실 중량 대 체중의 비는 우심실만의 비대를 암시하며, 이 모델을 사용한 선행 연구로부터 데이타를 확인했다(Roth, D. A., 등, J. Clin, Invest. 91:939-949, 1993). 중량이 일치하는 대조표준 동물과 비교한 경우, 심부전에 관련하여 좌심실 질량에는 변화가 없었고(대조표준, 112±10g; 심부전, 114±17g), 좌심실 중량 대 체중의 비 또한 양쪽 군에서 유사했다(대조표준, 2.8±0.3g/kg; 심부전, 2.9±0.3g/kg). 반면, 심부전은 우심실 중량 증가(대조표준, 38±3g; 심부전, 52±11g; P=0.003) 및 우심실 중량 대 체중 비(대조표준, 0.09±0.1g/kg; 심부전, 1.3±0.3g/kg; P<0.003)과 관련이 있었다. 조율된 동물은 연구가 진행되는 동안 4kg이 늘었고, 이것은 복수 축적에 의해 일부 설명된다. 초기 체중을 좌심실 중량 대 체중의 비를 계산하는데 사용한다면, 이 비율은 여전히 중량이 일치하는 대조표준 동물보다 그다지 더 높지않다. 이들 데이타로 연구가 진행되는 동안 좌심실 질량에 실재적 증가가 없었음을 확인했다.On autopsy, the animals with heart failure had ascites, the heart was swollen, the wall thinned, and all four ventricles were enlarged. The ratio of ventricular weight to weight implies hypertrophy of the right ventricle only and confirms data from previous studies using this model (Roth, D. A., et al., J. Clin. Invest. 91: 939-949, 1993). There was no change in the left ventricular mass associated with heart failure (control standard, 112 ± 10 g; heart failure, 114 ± 17 g), and the ratio of left ventricular weight to body weight was similar in both groups Control standard, 2.8 ± 0.3 g / kg; heart failure, 2.9 ± 0.3 g / kg). In contrast, heart failure was associated with an increase in the right ventricular weight gain (control standard, 38 ± 3 g; heart failure, 52 ± 11 g; P = 0.003) and right ventricular weight to weight ratio (control standard, 0.09 ± 0.1 g / kg; heart failure, 1.3 ± 0.3 g / kg ; P <0.003). The coordinated animal increased by 4 kg during the course of the study, which is partly explained by multiple accumulation. If the initial body weight is used to calculate the ratio of left ventricular weight to body weight, this ratio is still not much higher than the weighted control reference animal. These data confirm that there was no real increase in left ventricular mass during the study.

1-O. 아데닌 뉴클레오티드1-O. Adenine nucleotide

대조표준 동물은 천공 생검한 후 바로 액체 질소에 침지시켜서 수집한 돼지 심장에서 보고된 것들과 유사한 정상 ATP/ADP 비율을 나타냈으며(White, F. C. 및 Boss, G., J. Cardiovasc. Pathol. 3:225-236, 1990), 이것은 사용된 샘플링 기술이 적합했음을 나타낸다. 심부전을 가지는 동물은 IVS(대조표준, 14.8±1.1; 심부전, 2.4±0.3; 양쪽 그룹 모두 P<0.0001, n=4) 및 측벽(대조표준, 14.3±4.0; 심부전, 2.4±0.9; 양쪽 그룹 모두 P=0.0012, n=4)으로부터 취해진 샘플에서 ATP/ADP 비율의 현저한 감소를 나타냈다. 이것으로 심근 산소 공급 및 수요간 불균형을 확인한다.Control standard animals showed normal ATP / ADP ratios similar to those reported in pig hearts collected by immersion in liquid nitrogen immediately following perforation biopsy (White, FC and Boss, G., J. Cardiovasc. Pathol. 3: 225-236, 1990), indicating that the sampling technique used is appropriate. Animals with heart failure were treated with IVS (control standard, 14.8 ± 1.1; heart failure, 2.4 ± 0.3; P <0.0001, n = 4 in both groups) and sidewall (control standard, 14.3 ± 4.0; heart failure, 2.4 ± 0.9; P = 0.0012, n = 4). &Lt; / RTI &gt; This confirms the imbalance between myocardial oxygen supply and demand.

1-P. 심근 혈류1-P. Myocardial blood flow

빠른 심실 조율의 즉각적 결과로서 심근 혈류의 부위적 편차는 조율-유도 심부전에서 국소적 및 전체적 기능장애의 병인에 어떤 역할을 할 수 있다. 조율 동안 좌심실 측벽(자극 부위에 인접)과 IVS 사이에서 분당 심근 혈류의 차이를 발견했다. 감소된 혈류는 조율이 개시되자마자 측벽에서 나타났고, 21일 내지 28일간 지속되었다. 조율 동안 IVS보다 적은 혈류를 수용한 좌심실 측벽은 조율한 21일 내지 28일 동안 벽 비후화의 점진적인 감소(조율기 끔)를 나타냈다. 반면, 조율 동안 더 많은 혈류를 받은 IVS는 조율한 21일 내지 28일 내내 비교적 정상인 벽 비후화를 유지했다.As immediate consequence of rapid ventricular tune, regional deviations of myocardial blood flow can play a role in the pathogenesis of local and global dysfunction in coordinated-induced heart failure. During the tune, we found differences in myocardial blood flow per minute between the left ventricular sidewall (adjacent to the stimulation site) and the IVS. Reduced blood flow appeared at the sidewalls as soon as the tuning was initiated and lasted from 21 to 28 days. The left ventricular sidewall, which received less blood flow during IVT than during the tuning, exhibited a gradual decrease in wall thickening (tuning off) for 21 to 28 days of tuning. On the other hand, IVS, which received more blood flow during tuning, maintained a relatively normal wall thickening over the 21 to 28 days of tuning.

분당 심근 혈류가 상대적 심근 허혈의 평가를 쉽게 허가하지 않았으므로, 우리는 또한 박동당 심내막 혈류로서 관상 혈류를 표시했다. 그러한 분석에 대한 생리학적 근거는 분당 국소적 심내막하 혈류가 진행성 관상동맥 협착증 상태하의 국소적 심근 수축의 제1결정인자라는 것(Gallagher, K. P. 등, Am. J. Physiol. 16:H727-H738, 1984) 및 심박수의 증가가 이 흐름-기능 관계를 하향이동시켜 어떤 수준의 심내막 혈류에서 더 약한 국소적 기능을 가진다는 것을 보여준 선행 실험에 있다(Delbaas, T. 등, J. Physiol. 477:481-496, 1990). 그러나, 흐름-기능 관계를 국소적 기능 대 박동당 심내막 혈류로서 작성해 심박수 효과를 보정한다면, 상이한 심박수에서 단일 관계가 있게 되는데, 이것은 관상 혈류가 감소된 때, 박동당 심내막 혈류가 벽기능의 수준을 일차적으로 결정한다는 것을 나타낸다(Indolfi, C. 등, Circulation 80:933-993, 1989; Ross, J., Circulation 83:1076-1083, 1991). 조율을 개시하자 IVS(P<0.001; 표 4)와 비교하여 측벽에서 박동당 심내막 혈류가 50% 감소했다.Because the per - minute myocardial blood flow was not readily permissible to assess relative myocardial ischemia, we also displayed coronary blood flow as pericardial echocardiogram. The physiological basis for such analysis is that localized subperiosteal blood flow per minute is the first determinant of local myocardial contraction under the condition of advanced coronary artery stenosis (Gallagher, KP et al., Am. J. Physiol. 16: H727-H738, 1984) and a previous experiment in which an increase in heart rate indicates that this flow-function relationship is down-shifted to have weaker local function at some level of endocardial blood flow (Delbaas, T. et al., J. Physiol. 477: 481-496, 1990). However, if the flow-function relationship is created as an endocardial perfusion per local function versus beating heart rate to compensate for the heart rate effect, there is a single relationship at different heart rates, which may be due to a decrease in coronary blood flow, (Indolfi, C. et al., Circulation 80: 933-993, 1989; Ross, J., Circulation 83: 1076-1083,1991). Upon initiation of tuning, there was a 50% decrease in intimal endothelial blood flow per beat compared to IVS (P <0.001; Table 4).

의식이 있는 돼지의 선행 연구에서, 우리는 심내막 혈류의 50% 감소가 국소적 기능의 50% 감소를 야기했고, 본 연구에서 측벽에서 관찰된 것과 유사한 박동당 심내막하 흐름과 관련있었다는 것을 입증했다(표 4). 조율 동안 측벽에서 혈류의 감소는 연구의 처음부터 끝까지 지속되었다. 이들 데이타는 심실 조율의 개시시 측벽에서의 심근 허혈에 대한 증거를 제공한다. 반면, IVS 기능 및 박동당 심내막 흐름은 비교적 정상을 유지했다. 심박조율기를 끄자 박동당 심내막하 혈류는 연구의 처음부터 끝까지 양쪽 영역에서 정상을 유지한 반면, 측벽에서는 이 영역에서의심근 기절의 발생과 일관된 국소적 기능장애가 지속되었다. 따라서, 우리는 측벽의 지속적 허혈이 조율 동안 및 조율 후 전체적 기능에 유의한 효과를 가진다는 것을 가정한다.In a previous study of conscious pigs, we demonstrated that a 50% reduction in intimal endocardial blood flow resulted in a 50% reduction in local function and was associated with a per-epicardial flow similar to that observed in the sidewall in this study (Table 4). The reduction of blood flow in the sidewall during tuning continued throughout the study. These data provide evidence for myocardial ischemia at the sidewall at the onset of ventricular tune. On the other hand, IVS function and endocardial flow per pulse were relatively normal. With pacemaker turned off, the pericardial perfusion flow remained normal in both areas from the beginning to the end of the study, while the sidewall continued to have localized functional impairment consistent with the occurrence of myocardial stunning in this area. Thus, we assume that persistent ischemia of the sidewall has a significant effect on overall function during and after tune.

실시예 2Example 2

예시적 유전자 송달 구성체의 제조Preparation of exemplary gene delivery constructs

2-A. 예시적 아데노바이러스 구성체의 제조2-A. Preparation of exemplary adenoviral constructs

초기 유전자 송달 벡터로서, 헬퍼 독립적 복제 결함 사람 아데노바이러스-5시스템을 사용했다. 벡터 구성체의 초기 실례로서, β-갈락토시다제 및 FGF-5를 코딩하는 유전자를 사용했다. β-갈락토시다제 또는 FGF-5를 코딩하는 재조합 아데노바이러스를 전길이 cDNA를 사용하여 구성했다. 이 시스템을 사용하여 트랜스젠 삽입체에 대해 약 5kb의 충전 한계가 부여된 재조합 아데노바이러스를 생성했다. 각각 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결되고 SV40 폴리아데닐화 서열을 가지는 β-gal 및 FGF-5는 4kb보다 작았으며, 패키징 콘스트레인츠내에 알맞았다.As the initial gene delivery vector, a helper-independent replication deficient human adenovirus-5 system was used. As an initial example of the vector construct, genes encoding β-galactosidase and FGF-5 were used. Recombinant adenovirus encoding beta -galactosidase or FGF-5 was constructed using full-length cDNA. This system was used to generate recombinant adenovirus with a charge limit of approximately 5 kb for the transgenic insert. [Beta] -gal and FGF-5, each operably linked to the CMV promoter and having the SV40 polyadenylation sequence, were smaller than 4 kb and fit within the packaging constraint.

사람 FGF-5에 대한 전길이 cDNA를 유전자의 981bp 오픈 리딩 프레임을 포함하는 1.1kb ECOR1 단편으로서 플라스미드 pLTR122E(Zhan 등, Mol. Cell. Biol., 8:3487, 1988)로부터 유리시켜, 셔틀 벡터 플라스미드 ACCMVpLpA의 폴리링커로 클론했다. FGF-5의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 Zhan 등, Mol. Cell. Biol., 8: 3487, 1988의 도 1에 개시된다. pACCMVpLpA는 Gomez-Foix 등, J. Biol. Chem. 267 :25129-25134, 1992에 설명된다. pACCMVpLpA는 E1 영역이 사람 사이토메갈로바이러스 인핸서-프로모터(CMV 프로모터), 이어서 pUC19(본 분야에 잘 알려진 플라스미드)로부터의 다중 클로닝 부위, 이어서 SV40 폴리아데닐화 신호로 치환된 아데노바이러스 혈청형 5 게놈(지도 단위 0에서 17)의 5' 단부를 함유한다. lacZ-코딩 대조표준 아데노바이러스는 지도 단위 1에서 9.8로부터 E1A/E1B 결실에 기초를 둔다. FGF-5-코딩 아데노바이러스(Ad.FGF-5)는 지도 단위 1.3에서 9.3으로부터 E1A/E1B 결실에 기초를 둔다. 이들 벡터 모두 전체 E1A 코딩 서열 및 대부분의 E1B 코딩 서열을 제거한다. 벡터들 모두 아데노바이러스 서열에 관하여 역방향으로 클론된 트랜스젠 삽입체를 가진다. 따라서, 만일 리드-스루드 전사일 경우, 아데노바이러스 전사체는 안티센스이고, 바이러스 단백질을 발현하지 않는다.Full length cDNA for human FGF-5 was obtained from the plasmid pLTR122E (Zhan et al., Mol. Cell. Biol., 8: 3487, 1988) as a 1.1 kb ECOR1 fragment containing the 981 bp open reading frame of the gene, And cloned by polylinker of ACCMVpLpA. The nucleotide and amino acid sequences of FGF-5 are described by Zhan et al., Mol. Cell. Biol., 8: 3487, 1988. pACCMVpLpA was prepared as described in Gomez-Foix et al., J. Biol. Chem. 267: 25129-25134, 1992. pACCMVpLpA is a plasmid in which the E1 region is a human cytomegalovirus enhancer-promoter (CMV promoter) followed by a multiple cloning site from pUC19 (a plasmid well known in the art) followed by an adenovirus serotype 5 genome substituted with the SV40 polyadenylation signal Units 0 to 17). The lacZ-coding control standard adenovirus is based on E1A / E1B deletion from map units 1 to 9.8. FGF-5-coding adenovirus (Ad.FGF-5) is based on E1A / E1B deletion from map units 1.3 to 9.3. Both of these vectors eliminate the entire E1A coding sequence and most of the E1B coding sequence. Both vectors have transgenic inserts cloned in the reverse direction with respect to the adenovirus sequence. Thus, if it is a lead-thrude transcription, the adenovirus transcript is antisense and does not express the viral protein.

FGF-5 유전자-함유 플라스미드를, 전체 사람 아데노바이러스 5 게놈을 함유하며 4.3kb 삽입체를 추가하여 pJM17을 성숙한 아데노바이러스 비리온으로 엔켑시스되지 못할 만큼 크게 만든 플라스미드 JM17(pJM17)와 함께 293 세포로 코트랜스펙션했다. 다음에, 이 세포를 영양 아가로스로 덮었다. 혈관형성유전자를 함유하는 감염성 바이러스 입자를 293 세포에서 상동성 구제 재조합에 의해 생성했고, 10 내지 12일 후 단일 플라크으로서 분리했다(또한, Zhang 등, Biotechniques 15(5):868-872, 1993에 설명된 바와 같이, 성공적 재조합 바이러스를 리포펙션에 의해 코트랜스펙션하고, 현미경으로 세포변성 효과를 직접 찾음으로써 확인할 수 있다). 결과의 아데노바이러스 벡터는 E1A/E1B 서열이 없는 트랜스젠을 함유하며, 따라서 복제-결함이다. 또한, FGF-5 유전자를 지니는 아데노바이러스 벡터는 Ad.FGF-5로서 본원에서 언급된다.The FGF-5 gene-containing plasmid was transformed into 293 cells with the plasmid JM17 (pJM17) containing the entire human adenovirus 5 genome and adding a 4.3 kb insert to make pJM17 large enough to be unable to encapsulate into mature adenoviral virions Courtland was the span. Next, the cells were covered with nutrient agarose. Infectious viral particles containing angiogenic genes were generated by homologous recombination in 293 cells and were isolated as a single plaque after 10-12 days (see also Zhang et al., Biotechniques 15 (5): 868-872, 1993 As described, can be confirmed by co-transfecting the successful recombinant virus by lipofection and directly examining the cytopathic effect with a microscope). The resulting adenoviral vector contains transgenes without the E1A / E1B sequence and is therefore replication-defective. In addition, the adenoviral vector carrying the FGF-5 gene is referred to herein as Ad.FGF-5.

이들 재조합 아데노바이러스는 포유류 세포에서 비복제성이었지만, E1A/E1B를 사용하여 형질전환되어 트랜스에 이들 본질적 유전자 생성물이 제공된 293 세포에서는 증식할 수 있었다. 개별 플라크로부터의 재조합 바이러스를 293 세포에서 증식시켰고, 바이러스 DNA를 제한 분석에 의해 특성화했다.These recombinant adenoviruses were non-replicable in mammalian cells but could be propagated in 293 cells transfected with E1A / E1B and provided with these intrinsic gene products in the trans. Recombinant virus from individual plaques was propagated in 293 cells and viral DNA was characterized by restriction analysis.

다음에, 성공적 재조합 바이러스를 표준 과정을 사용하여 2번 플라그 정제했다. 바이러스 스톡을 광학 밀도계에 의해 측정된 바 ml 당 10¹⁰내지 10¹²의 범위내에서 역가까지 293 세포에서 증식시켰다. 사람 293 세포를 80% 합류점에서 감염시키고, 배양 상청액을 36 내지 48 시간째에 수집했다. 바이러스-함유 상청액에 냉동-해동 사이클을 행한 후, 세포 파편을 표준 원심분리에 의해 펠렛으로 만들고, 바이러스를 2 염화세슘(CsCl) 구배 초원심분리(불연속 1.33/1.45 CsCl 구배; 5mM 트리스, 1mM EDTA(pH 7.8) 중에 제조된 CsCl; 90,000xg(2 시간), 105,000xg(18 시간))에 의해 더 정제했다. 생체내 주사 전에 바이러스 스톡을 세파로스 칼럼(예를 들어, PBS로 평형화된 G25 Sephadex)을 통한 겔 여과에 의해 탈염했다. 최종 바이러스 농도는 광학 밀도계에 의해 측정된 바 ml 당 약 10¹¹바이러스 입자였다. 바이러스 스톡은 -70℃의 배지에서 세포중에 편리하게 저장할 수 있다. 주사를 위해 정제된 바이러스를 식염수에 재현탁하는 것이 바람직하다. 아데노바이러스 벡터 제제는 고도로 정제되었고, 실질적으로 야생형(잠재적으로 복제성) 바이러스를 함유하지 않았다(즉, 바람직하게 백만 당 약 1 복제 수용성 아데노바이러스(RCA) 입자 이하, 더 바람직하게 10⁹당 1 이하, 가장 바람직하게 10¹²당 1 이하를 함유). 따라서, 심장에서 아데노바이러스 감염 및 염증성 침투가 최소화되었다.Next, the successful recombinant virus was plagiographed twice using standard procedures. The virus stock in a range of 10 ¹⁰ to 10 per ml a measured bar by means of an optical densitometer ¹² to titers were grown in 293 cells. Human 293 cells were infected at an 80% confluence and the culture supernatants were collected at 36-48 hours. The cell debris was pelleted by standard centrifugation and the virus was washed twice with cesium dichloride (CsCl) gradient ultracentrifugation (discontinuous 1.33 / 1.45 CsCl gradient; 5 mM Tris, 1 mM EDTA (2 hours), 105,000 x g (18 hours)) of CsCl prepared in a buffer solution (pH 7.8). Prior to in vivo injection, the virus stock was desalted by gel filtration through a Sepharose column (e. G., G25 Sephadex equilibrated with PBS). The final viral concentration was about 10 &lt; ¹¹ &gt; viral particles per ml as measured by an optical density meter. Virus stock can conveniently be stored in cells at -70 ° C in medium. It is preferred that the purified virus is resuspended in saline for injection. Adenovirus vector preparation was highly purified, substantially wild-type (potentially replication properties) did not contain a virus (i.e., preferably about 1 clone per million water-soluble adenovirus (RCA) particles or less, more preferably 10 ⁹ per 1 below , Most preferably not more than 1 per 10 ¹² ). Thus, adenoviral infection and inflammatory infiltration in the heart were minimized.

아데노바이러스 벡터 구성체의 추가적 예가 아래에 제공되며, 본원에 제공되는 다른 교시와 조합하여, 변형된 아데노바이러스 벡터를 기초로 한 구성체를 포함하는 본 발명에 사용하기 적합한 다른 아데노바이러스 벡터 구성체가 사용될 수 있다.Additional examples of adenoviral vector constructs are provided below, and in combination with other teachings provided herein, other adenoviral vector constructs suitable for use in the invention, including constructs based on modified adenoviral vectors, can be used .

2-B. 추가의 예시적 벡터 및 트랜스젠 구성체2-B. Additional illustrative vectors and transgenic constructs

상술된 바와 같이, 다양한 바이러스 및 비-바이러스 벡터를 사용하여 본 발명에 따르는 유전자를 송달할 수 있다. 다른 벡터의 예로서, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 상술된 본 발명의 방법에 따르는 생체내 송달을 위해 생성했다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 다른 혈관형성유전자의 예로서, 우리는 아데노바이러스(Ad) 및 AAV 벡터 구성체 모두에, 상술된 IGF 유전자를 포함하는 구성체을 제조했다.As described above, various viruses and non-viral vectors can be used to deliver genes according to the present invention. As an example of another vector, an adeno-associated virus (AAV) vector was generated for in vivo delivery in accordance with the method of the present invention described above. As an example of other angiogenic genes that can be used in connection with the present invention, we have constructed constructs containing the above-described IGF genes in both adenovirus (Ad) and AAV vector constructs.

모범적인 구성체는 이형 프로모터(예로서 CMV 프로모터를 사용했다)의 제어하에 IGF-1 유전자를 함유하며 rAd/IGF 또는 rAAV/IGF로 표시된다. 이것들에 더하여, 마커 유전자, 예를 들어 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)를 포함하는 구성체를 구성했다. 또한, rAd/IGF 또는 rAAV/IGF 구성체를 마커 유전자(EGFP와 같은)를 포함하도록 구성할 수 있다. EGFP를 포함하는 구성체는 상업적으로 입수할 수 있다(예를 들어, Clontech, 캘리포니아 팔로 알토).Exemplary constructs contain the IGF-1 gene under the control of a heterologous promoter (using the CMV promoter, for example) and are designated rAd / IGF or rAAV / IGF. In addition to these, a construct comprising a marker gene, for example an enhanced green fluorescent protein (EGFP), was constructed. In addition, rAd / IGF or rAAV / IGF constructs can be constructed to include marker genes (such as EGFP). Constructs comprising EGFP are commercially available (e. G., Clontech, Palo Alto, Calif.).

rAd/IGF를 생성하기 위해서, IGF-1 유전자(ATCC로부터 입수가능)를 아데노바이러스 셔틀 벡터, 예컨대 pAdshuttle-CMV, pAd5CI, 및/또는 pAdtrack-CMV로 서브클론한다. 결과의 IGF-1 셔틀 플라스미드는 사용된 셔틀 벡터에 따라서 박테리아또는 293 세포에서 헬퍼 플라스미드인 pJM17을 사용하여 재조합 과정을 행한다. 결과의 rAd/IGF 바이러스를 RT-PCR 및/또는 웨스턴 블롯팅에 의해 IGF-1 단백질의 발현에 대해 입증한다.To generate rAd / IGF, the IGF-1 gene (available from ATCC) is subcloned into adenovirus shuttle vectors such as pAdshuttle-CMV, pAd5CI, and / or pAdtrack-CMV. The resulting IGF-1 shuttle plasmid undergoes a recombination process using pJM17, a helper plasmid in bacteria or 293 cells, according to the shuttle vector used. The resulting rAd / IGF virus is verified for expression of IGF-1 protein by RT-PCR and / or Western blotting.

예시를 위해서, 우리는 본래 FGF-5 혈관형성유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 생성에 대해 상기 설명 및 예시된 바와 같이, 293 세포에서 셔틀 벡터 및 pJM17 헬퍼 플라스미드를 사용하여 모범적인 rAd/IGF 구성체를 제조했다. EGFP를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 유사한 기술을 사용하여 대조표준으로서 제조했다.For illustrative purposes, we used an exemplary rAd / IGF construct using a shuttle vector and pJM17 helper plasmid in 293 cells as described and exemplified above for the generation of an adenoviral vector containing the native FGF-5 angiogenic gene . Adenovirus vectors containing EGFP were prepared as control standards using similar techniques.

우리는 본래 본 분야에 설명된 재조합 AAV 벡터의 제조에 대한 기술을 사용하여 모범적인 rAAV/IGF 구성체를 제조했다. 예를 들어, 상기 인용된 AAV 제조에 관한 참고문헌 참조. 본 분야에 설명된 여러 가지 상이한 기술을 사용하여 AAV 벡터를 생성할 수 있지만, 우리는 본래 Samulski 등, J. Virol. 63:3822-3828, 1989에 설명된 기초적 이중 트랜스펙션 과정을 사용했다. 간단히 말해서, rAAV/IGF를 생성하기 위해, IGF-1 유전자를 rAAV 플라스미드 DNA로 서브클론하고(이로써, IGF 유전자가 AAV 역말단 반복단 또는 ITR에 의해 주변화된다), 다음에 이 rAAV 플라스미드를 AAV 헬퍼 플라스미드(트랜스에 AAV rep 및 모자 유전자를 제공하기 위해)와 함께 293 세포에 코트랜스펙션했다. 이어서, AAV 제조를 헬퍼 아데노바이러스로 감염시킴으로써 개시했다(우리는 dl312로 알려진 E1-결실된 아데노바이러스를 사용했다). 바이러스 여액을 일반적으로 열처리하여 아데노바이러스를 불활성화시키고, 표준 기술에 따라 DNase 및 Pronase로 처리했다(예를 들어, Samulski 등, 상동참조).We have produced exemplary rAAV / IGF constructs using techniques for the production of recombinant AAV vectors originally described in the art. See, for example, the references cited above for the manufacture of AAV. Although a variety of different techniques described in the art can be used to generate AAV vectors, we have originally described the method of Samulski et al., J. Virol. 63: 3822-3828, 1989. &lt; / RTI &gt; Briefly, in order to generate rAAV / IGF, the IGF-1 gene was subcloned into rAAV plasmid DNA (whereby the IGF gene was inverted by the AAV inverted repeat or ITR), then this rAAV plasmid was amplified by AAV Helper plasmid (to provide AAV rep and hAT genes in trans) and cotransfected in 293 cells. The AAV production was then initiated by infecting with helper adenovirus (we used E1-deleted adenovirus known as dl312). Viral filtrates were generally heat-treated to inactivate adenoviruses and treated with DNase and Pronase according to standard techniques (see, for example, Samulski et al., Supra).

여러 가지 기술을 rAAV 벡터의 정제를 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 우리는 본래 본 분야에 설명된 바와 같이, 오염물로부터 rAAV 입자를 초기에 분리하기 위해서 표준 염화세슘(CsCl) 초원심분리 과정(2 CsCl 정제를 사용)을 사용했다. 투석 후 HPLC에 의해 물질을 더 정제했다. 이 예에서, 우리는 헤파린 (POROSHE, PE Biosystems로부터 입수가능, 캘리포니아 포스터 시티)으로 코팅되고, 염(1 내지 2M NaCl)로 용출되는 친화성 크로마토그래피 칼럼을 사용했다. 이 예에서, 대부분의 AAV는 대략 0.7M NaCl에서 용출했다. PBS(pH 7.4)에 대한 투석 후, 벡터를 60분간 56℃에서 열처리하여 잔류 아데노바이러스를 파괴했다. 아데노바이러스에 관해서, 결과의 벡터 스톡을 일반적으로 DNase 내성 입자(DRP)에 대해 적정하고, 세포변성 효과의 부재에 대해 시험한다.Several techniques can be used for the purification of rAAV vectors. For example, we used a standard cesium chloride (CsCl) ultracentrifugation process (using 2 CsCl tablets) to initially separate rAAV particles from contaminants, as described in the art. The material was further purified by HPLC after dialysis. In this example, we used an affinity chromatography column coated with heparin (POROSHE, available from PE Biosystems, Foster City, CA) and eluted with a salt (1-2 M NaCl). In this example, most AAVs eluted at approximately 0.7 M NaCl. After dialysis against PBS (pH 7.4), the vector was heat treated at 56 &lt; 0 &gt; C for 60 minutes to destroy the residual adenovirus. For adenovirus, the resulting vector stock is titrated against DNase resistant particles (DRP) in general and tested for the absence of cytopathic effect.

rAd/IGF 및 rAAV/IGF에서 IGF-1의 발현을 웨스턴 블롯 분석에 의해 입증했다. 그것들을 배양된 MCF-7 세포에 대한 증식 분석을 사용하여 기능적 IGF-1 단백질 제조에 대해 더 시험했다. 간단히 말해서, HEK(사람 배 신장 암종) 293 세포를 1일에서 rAd/IGF 또는 rAAV/IGF로 형질도입하고, 무혈청 배지에서 배양했다. 48 시간 인큐베이션한 후, 무혈청 배지를 수집하고, 무혈청 배지에서 배양된 MCF-7 세포위에 놓았다. MCF-7 세포의 증식을 본래 Mosmann에 의해 설명된(예를 들어, Mos mann, J. Immunol. Meth. 16:55-63, 1983 참조) 표준 증식 분석법(예를 들어, MTT 분석)으로 다음 72 시간 동안 모니터링한다. 강화된 녹색 형광 단백질 유전자를 지니는 아데노바이러스 또는 AAV 벡터인 rAd/EGFP 또는 rAAV/EGFP를 음성 대조표준으로 사용했고, 재조합 사람 IGF-1 단백질을 양성 대조표준으로 사용했다. 이 MTT 분석의 결과는 rAd/IGF 및 rAAV/IGF 벡터 구성체가 모두 IGF-1 트랜스젠을 사람 표적 세포(HEK 293)으로 송달할 수 있고, 다음에 그러한 표적화된 세포의 배지가 정제된 IGF-1 단백질과 유사한 방식으로 MCF-7 세포의 증식을 유도할 수 있다는 것을 나타냈다. 음성 대조표준(즉, rAd/EGFP 또는 rAAV/EGFP)으로 트랜스펙션된 세포로부터의 배지를 사용한 경우에는 유의한 증식을 관찰하지 못했다. 또한, 우리는 MCF-7 세포를 직접 트랜스펙션함으로써 벡터 구성체를 시험했고, IGF 구성체(AAV 및 아데노바이러스 모두)를 사용하여, 세포에 IGF-1 단백질을 투여(약 3㎍/ml의 농도로)하는 것에 필적하는 방식으로 트랜스펙션된 세포에서 증식을 직접 유도할 수 있다는 것을 증명했다.Expression of IGF-1 in rAd / IGF and rAAV / IGF was demonstrated by western blot analysis. They were further tested for functional IGF-1 protein production using proliferation assays on cultured MCF-7 cells. Briefly, HEK 293 cells were transfected with rAd / IGF or rAAV / IGF on day 1 and cultured in serum-free medium. After 48 hours of incubation, serum-free medium was collected and placed on MCF-7 cells cultured in serum-free medium. The proliferation of MCF-7 cells is followed by a standard proliferation assay (e.g., MTT assay) 72 (see, for example, Mosmann, J. Immunol. Meth. 16: 55-63, 1983) Monitor for hours. The adenovirus or AAV vector carrying the enhanced green fluorescent protein gene rAd / EGFP or rAAV / EGFP was used as the negative control standard and the recombinant human IGF-1 protein was used as the positive control standard. The results of this MTT assay indicate that both rAd / IGF and rAAV / IGF vector constructs are capable of delivering IGF-1 transgenes to human target cells (HEK 293), and then the medium of such targeted cells is treated with purified IGF-1 Lt; RTI ID = 0.0 &gt; MCF-7 &lt; / RTI &gt; cells in a manner similar to the protein. No significant proliferation was observed when media from cells transfected with negative control standards (i.e., rAd / EGFP or rAAV / EGFP) were used. We also tested vector constructs by directly transfecting MCF-7 cells and used IGF constructs (both AAV and adenovirus) to administer IGF-1 protein to cells (at a concentration of about 3 μg / ml Lt; RTI ID = 0.0 &gt; transfected &lt; / RTI &gt;

IGF 벡터 구성체의 기능성을 확인하기 위한 추가의 시험을 근세포를 사용하여 수행할 수 있으며, 근육 세포 크기 및/또는 기능에 대한 IGF의 효과를 관찰할 수 있다. 예로서, 일차 신생아 심근세포(NCM) 또는 성인 심근세포에 대한 IGF의 효과를 다양한 분석법으로 시험할 수 있다. 예를 들어, IGF-1은 아데노바이러스 또는 AAV 벡터에 의해 송달되어, NCM에서 과비대 및 세포 DNA 합성을 유도할 수 있다. 적합한 감염 다중도(MOI)로 NCM의 형질도입 후, 전형적으로 약 100 내지 1000의 범위내에서 심근세포를 크리스탈 바이올렛 또는 뉴트럴 레드로 염색한다. 이 세포를 현미경 아래에 형상화하여, 면적, 길이, 및 폭을 포함하여 개별 세포의 크기를 자동적으로 측정할 수 있다(예를 들어, 영상 플러스 소프트웨어를 사용). 세포 DNA 합성에 대한 IGF-1의 효과를³H-티미딘의 세포 결합에 의해 정량할 수 있으며, 이로써 세포 DNA 합성이 세포 DNA의 TCA 침전 후³H 수에 의해 모니터된다.Additional tests to confirm the functionality of IGF vector constructs can be performed using muscle cells and the effects of IGF on muscle cell size and / or function can be observed. As an example, the effects of IGF on primary neonatal myocardial cells (NCM) or adult myocardial cells can be tested by various assays. For example, IGF-1 may be delivered by an adenovirus or AAV vector to induce hypervariable and cellular DNA synthesis in NCM. After transduction of NCM with a suitable multiplicity of infection (MOI), myocardial cells are stained with crystal violet or neutral red, typically within the range of about 100 to 1000. The cells can be shaped under a microscope to automatically measure the size of individual cells, including area, length, and width (using, for example, image plus software). The effect of IGF-1 on cellular DNA synthesis can be quantified by cell binding of ³ H-thymidine, whereby cellular DNA synthesis is monitored by ³ H counts after TCA precipitation of cellular DNA.

실시예 3Example 3

레트 심근세포에서 유전자 전달Gene transfer in rat myocardial cells

3-A. Ad.β-gal 유전자 전달 및 발현3-A. Ad.beta.-gal gene transfer and expression

성인 레트 심근세포를 표준 방법에 따라서 관류액을 함유하는 콜라게나제를 사용하는 란젠도르프 관류에 의해 제조했다. 막대 모양 세포를 라미닌 코팅된 플레이트에서 배양했고, 24 시간째에 1:1의 감염 다중도로 상기 실시예 2에서 얻어진 β-갈락토시다제-코딩 아데노바이러스로 감염시켰다. 36 시간 후, 이 세포를 글루타르알데히드로 고정하고, X-gal과 함께 인큐베이션했다. 일관적으로 성인 근세포 중 70 내지 90%가 재조합 아데노바이러스로 감염된 후 β-갈락토시다제 트랜스젠을 발현했다. 1 내지 2:1의 감염 다중도에서는 세포독성이 관찰되지 않았다.Adult rat myocardial cells were prepared by Lancendorf perfusion using collagenase containing a perfusion solution according to standard methods. The rod-shaped cells were cultured in laminin-coated plates and infected with the β-galactosidase-coding adenovirus obtained in Example 2 above at a multiplicity of infection of 1: 1 at 24 hours. After 36 hours, the cells were fixed with glutaraldehyde and incubated with X-gal. Consistently, 70-90% of adult myocytes expressed beta -galactosidase transgenes after infection with recombinant adenovirus. Cytotoxicity was not observed in the multiplicity of infection of 1 to 2: 1.

3-B. rAAV/IGF-1 유전자 전달 및 발현3-B. rAAV / IGF-1 gene transfer and expression

레트 신생아 심근세포에서 IGF-1 발현의 효과를 평가하기 위해, 2x10⁶세포를 10cm 세포 배양 접시에 평판하여, rAAV/IGF-1 또는 rAAV/EGFP의 1x10¹⁰DNase 내성 입자로 감염시켰다. 세포를 37℃에서 최소 배지 및 정상 산소 수준에서 혈청 없이 배양했다. 재조합 IGF-1 단백질(50ng/ml) 또는 페닐에프린(50uM)을 가하여 양성 대조표준으로서 배양했다. 세포를 처리 후 48 시간째에 시각적으로 평가했다. rAAV-IGF-1으로 처리된 세포는 미처리 세포와 비교하여, 형태적 외양에 기준하여 유의한 과비대(페닐에프린을 사용하여 얻어진 것에 필적함)를 나타냈다. 외인성으로 첨가된 IGF-1 단백질은 rAAV/IGF-1과 비교하여 단지 약간의 과비대를 유도하는 것 같다. 과비대의 수준을 정량하기 위해, 입체 해석학적 프로그램인 영상 프로 플러스 5(Media Cybernetics, 캘리포니아 칼스버그)를 이용했다. 간단히 말해서, 영상 프로 플러스 5 프로그램은 개별 세포를 추적하여 측정값을 얻는다. 프로그램 범위내에서 세포의 윤곽을 그리고, 세포 당 면적 수를 계산했다. 대략 50 내지 100 세포를 조건 당 계수했고, 통계 프로그램인 프리즘으로 그래프화했다. 페닐에프린-처리된 세포 및 rAAV/IGF-1-감염된 세포가 미처리된 세포와 비교하여 유의한 과비대를 보인다는 것을 발견했다.To evaluate the effect of IGF-1 expression in rat neonatal myocardial cells, 2x10 ⁶ cells were plated in 10 cm cell culture dishes and infected with 1x10 ¹⁰ DNase resistant particles of rAAV / IGF-1 or rAAV / EGFP. Cells were cultured at 37 &lt; 0 &gt; C in minimal medium and normal oxygen levels without serum. Recombinant IGF-1 protein (50 ng / ml) or phenylephrine (50 uM) was added and incubated as a positive control standard. Cells were visually assessed at 48 hours after treatment. Cells treated with rAAV-IGF-1 showed a significant over-range (comparable to that obtained using phenylephrine) relative to untreated cells, based on morphological appearance. The exogenously added IGF-1 protein appears to induce only a slight overproduction compared to rAAV / IGF-1. In order to quantify the level of oversampling, a stereoscopic program, Media Cybernetics, Carlsbad, Calif., Was used. Simply put, the Video Pro Plus 5 program tracks individual cells and obtains measurements. Outline the cells within the program range and calculate the number of areas per cell. Approximately 50 to 100 cells were counted per condition and graphed with prism, a statistical program. Phenyl-prine-treated cells and rAAV / IGF-1-infected cells exhibit significant hypervariability compared to untreated cells.

과비대를 시험하는 것에 더하여, rAAV/IGF-1 발현 후 배지로의 IGF-1 분비 수준을 IGF-1 단백질에 대한 ELISA 분석을 사용하여 측정했다. 간단히 말해서, 단백질 발현을 48 시간째에 수집된 rAAV/IGF-1-감염된 배양물의 배지에서 발견했으며, 그 수준은 대략 0.1 내지 1.0ng/ml이었고, 이것은 대조표준 집단(미처리 또는 rAAV/EGFP로 감염)의 IGF-1 수준에 비하여 유의한 증가를 표시한다.In addition to testing for excess, the level of IGF-1 secretion in the medium after rAAV / IGF-1 expression was measured using an ELISA assay for the IGF-1 protein. Briefly, protein expression was found in the medium of rAAV / IGF-1-infected cultures collected at 48 hours and the level was approximately 0.1 to 1.0 ng / ml, which was compared with the control standard population (untreated or infected with rAAV / EGFP ) Compared to the IGF-1 level of the control group.

실시예 4Example 4

시험관내에서 돼지 심근층으로의 유전자 전달Gene transfer to pig heart myocardium in vitro

4-A. Ad.β-gal 유전자 전달 및 발현4-A. Ad.beta.-gal gene transfer and expression

실시예 2에서 얻어진 β-갈락토시다제-코딩 아데노바이러스 벡터를 허용 293세포에서 증식시키고, 실시예 2의 과정을 기초로 최종 바이러스 역가가 1.5x10¹⁰바이러스 입자가 되도록 CsCl 구배 초원심분리에 의해 적정했다. 마취, 환기된 40kg 돼지를 개흉했다. 26 게이지 나비 바늘을 중앙 좌전하행(LAD) 관상동맥에 삽입하고, 벡터(1.5x10¹⁰바이러스 입자)를 인산 완충 식염수로 2ml 부피로 만들어 주사했다. 흉부를 닫고 동물을 회복시켰다. 주사 후 4일째에 동물을 죽였다. 심장을 글루타르알데히드로 고정하고, 얇은 조각으로 만들어 16.5 시간 동안 X-gal과 함께 인큐베이션했다. 함몰시켜 얇은 조각으로 만든 후, 조직을 에오신으로 대조염색했다.The? -Galactosidase-coding adenovirus vector obtained in Example 2 was allowed to proliferate in permissive 293 cells and was subjected to CsCl gradient ultracentrifugation based on the procedure of Example 2 to give a final viral titer of 1.5 x ^{10 10} viral particles It was appropriate. Anesthesia, and ventilated 40kg pigs. A 26-gauge butterfly needle was inserted into the LAD coronary artery and the vector (1.5x10 ¹⁰ viral particles) was injected into a 2 ml volume with phosphate-buffered saline. The thorax was closed and the animal restored. Animals were killed on the fourth day after injection. The heart was fixed with glutaraldehyde, made into thin pieces and incubated with X-gal for 16.5 hours. After being made into thin pieces, the tissue was stained by contrast with eosin.

조직 박편(lacZ을 함유하는 아데노바이러스의 관상내 주사 후 96 시간의 LAD 층의 전층 박편)의 현미경 분석은, β-갈락토시다제에 대해 양성으로 염색한 실질적인 세포 비율을 보이는 많은 조직 박편을 갖는 LAD 관상층에서 관찰된, 유의한 크기의 유전자 전달을 밝혔다. LAD 순환층에서 멀리 떨어진 심근층의 영역은 X-gal 염색을 보이지 않아서 음성 대조표준으로 사용했으며, 확산 동안 유전자의 발현이 근세포 및 내피세포에서 관찰되었다. 실질적인 비율의 근세포가 β-갈락토시다제 활성(청색 염색)을 나타냈고, 닫힌 흉부 관상내 주사를 사용한 이어진 연구에서 유사한 활성이 유전자 전달(n=8) 후 14일에 나타났다. 유전자 발현 영역에서 염증 또는 괴사의 증거는 없었다.Microscopic analysis of the tissue flakes (whole-layer flakes of the LAD layer at 96 hours after the intra-coronary injection of adenovirus containing lacZ) revealed that many tissue flakes exhibiting a substantial percentage of cells stained positive for? -Galactosidase Revealed a significant size of gene transfer observed in the LAD tubular layer. The region of the myocardial layer away from the LAD circulation layer was used as a negative control standard because of the lack of X-gal staining, and gene expression was observed in the myocardial and endothelial cells during diffusion. Substantial proportions of myocytes exhibited β-galactosidase activity (blue staining) and similar activity in a subsequent study using closed thoracic endocardial injection at 14 days after gene transfer (n = 8). There was no evidence of inflammation or necrosis in the gene expression region.

4-B. rAAV/EGFP 유전자 전달 및 발현4-B. rAAV / EGFP gene transfer and expression

EGFP-코딩 아데노-관련 바이러스 벡터를 실시예 2에 상술된 바와 같이 제조,증식 및 정제했다. 4 마리의 사육 돼지(각각 ~30kg)를 마취, 환기하여 목 중심선을 정맥절개했다. 경동맥을 분리하고, 5번 프렌치 유도자 초를 삽입했다. 5번 프렌치 다목적 혈관 카테테르를 카테테르의 팁이 관상동맥 내강내 약 1cm에 위치하도록 좌회선동맥(LCX)에 배치했다. 유전자 주사에 사용되는 주사기를 먼저 PBS로 씻어 내린 후, 유전자 용액을 주사기에 흡입해 넣었다. 바이러스 투여 전에 관상내의 히스타민을 25㎍/분으로 3분간 LCX에 주입하고, 이어서 2.36x10¹³바이러스 입자의 rAAV/EGFP(n=3) 또는 4.72x10¹³바이러스 입자의 rAAV/EGFP(n=1)을 투여했다. 총부피 1.5ml의 유전자 용액을 1ml/30초의 주입 속도로 각 돼지에 주사했다. 다음에, 혈관 카테테르 및 유도자 초를 제거하고 목 절개부를 닫았다. 동물을 마취에서 회복시키고, 연구가 완료될 때까지 우리에 두었다.EGFP-coding adeno-associated viral vectors were prepared, propagated and purified as described in Example 2. [ Four breeding pigs (~ 30kg each) were anesthetized and ventilated, and the neckline of the neck was incised. The carotid artery was isolated, and a fifth French inductor chest was inserted. Five French multivessel vascular catheters were placed in the left anterior artery (LCX) so that the tip of the catheter was positioned approximately 1 cm in the coronary lumen. The syringe used for the gene injection was washed first with PBS, and the gene solution was sucked into the syringe. Injection of histamine in the tubular prior to virus administration for 3 minutes with LCX 25㎍ / min and then to ¹³ 2.36x10 rAAV / EGFP (n = 3) or ^{4.72x10 13 rAAV / EGFP (n =} 1) of the virus particles of the virus particle . A total volume of 1.5 ml of the gene solution was injected into each pig at an infusion rate of 1 ml / 30 seconds. Next, the vascular catheter and inductor candle were removed and the neck incision was closed. The animals were recovered from the anesthesia and placed in the study until the study was completed.

유전자 주사 후 6 내지 8주째에, 돼지를 죽여 조직을 수집했다. 심장을 절제하여 얼음을 채운 식염수에 두었다. 관상동맥을 냉각 관류하고, 조직을 수집하여 액체 질소에서 순간냉동했다. 다른 조직을 역시 가능한 빨리 수집하고 액체 질소에서 순간냉동했다. 닫힌 흉부 돼지에서 이런 직접적 관상내 주사 송달법을 사용한 경우, 조직 박편에 대한 형광 현미경 및 RT-PCR은 모두 rAAV 벡터에 의한 EGFP 유전자의 성공적인 송달 및 발현을 보였다. 특히, 아래 나타낸 RT-PCR의 결과로 좌전하행 관상동맥(LAD) 층과 비교하여 주사된 동맥에 의해 공급된 층으로 유전자가 성공적으로 송달되었고, 이 층에서 발현되었음을 확인했다.Six to eight weeks after gene injection, pigs were killed and tissues were collected. The heart was resected and placed in saline filled with ice. Coronary arteries were perfused for cooling, tissues were collected and instant frozen in liquid nitrogen. Other tissues were also collected as soon as possible and instant frozen in liquid nitrogen. When using this direct coronary interventional delivery method in closed thoracic pigs, fluorescence microscopy and RT-PCR on tissue flaps showed successful delivery and expression of EGFP gene by rAAV vector. In particular, it was confirmed that the gene was successfully delivered and expressed in this layer as a result of the RT-PCR shown below, as compared to the left anterior descending coronary artery (LAD) layer, the layer supplied by the injected artery.

돼지 #1Pig # 1 돼지 #2Pig # 2 돼지 #3Pig # 3 돼지 #4Pig # 4 LCX 박편 1LCX Flakes 1 ++ ++ ++ ++ LCX 박편 2LCX flakes 2 ++ -- ++ ++ LADLAD -- -- -- --

실시예 5Example 5

혈관형성-매개 유전자 치료법의 돼지 모델(FGF-5 트랜스젠 사용)Pig model of angiogenesis-mediated gene therapy (using FGF-5 transgenes)

심근 허혈 및 심부전에 대한 이 돼지 모델에서, 동물은 심방 전기 자극(조율)에 의해 응력을 받았다. 응력-유도 심근 기능장애의 정도 및 불충분한 국소적 혈류를 정량한 후, 유전자 전달을 FGF-5를 발현하는 예시한 재조합 아데노바이러스의 관상내 주사에 의해 수행했다. 유전자 전달을 안정하지만 제한된 외인성 혈관형성이 발생한 후에 수행했고, 환자에서 협심증과 유사한 유도성 허열이 나타났다. 동물은 휴식 동안은 허혈이 없었지만, 활동 또는 심방 조율 동안은 허혈이 발생했다. 대조표준 동물은 FGF-5에 독립적으로 아데노바이러스 자체가 새로운 혈관 형성을 자극할 가능성을 배제하기 위해 lacZ(β-gal)를 발현하는 재조합 아데노바이러스를 받았다. 또한, 유전자 전달과 관계 없이 가능한 계속되는 측부 혈관 발생을 제어했다. 유전자 전달 후 2주째에 응력-유도 심기능장애 및 국소적 혈류를 다시 측정했다.In this pig model for myocardial ischemia and heart failure, the animals were stressed by atrial electrical stimulation (tuning). After quantification of the degree of stress-induced myocardial dysfunction and insufficient localized blood flow, gene transfer was performed by intra-coronary injection of the exemplified recombinant adenovirus expressing FGF-5. Gene transfer was performed after a stable, but limited, exogenous angiogenesis occurred, and inducible hypothyroidism similar to angina occurred in the patient. Animals did not have ischemia during rest, but during ischemia during activity or atrial tune. Control standard animals received recombinant adenovirus expressing lacZ ([beta] -gal) independent of FGF-5 to exclude the possibility that the adenovirus itself would stimulate new angiogenesis. It also controlled the ongoing side vascular development as possible regardless of gene transfer. Stress-induced cardiac dysfunction and local blood flow were measured again at 2 weeks after gene transfer.

lacZ를 받은 돼지는 유전자 전달 전과 유전자 전달 후 2주째에 허혈 영역에서 유사한 정도의 조율-유도 기능장애를 나타냈다. 반면, FGF-5 유전자를 받은 후 2주째에 동물은 벽 비후화가 증가했고, 조율 동안 허혈 영역에서 혈류가 개선되었다. 결과는 혈관형성트랜스젠(FGF-5)의 유전자 전달이 새로 형성된 혈관을 통해 국소적 혈류를 개선시킴으로써 국소적 심근 수축성 기능장애를 개선하는데 효과적이었음을 증명했다.The pigs receiving lacZ showed a similar degree of coordination-induced dysfunction in the ischemic area before and 2 weeks after gene transfer. On the other hand, at 2 weeks after receiving the FGF-5 gene, the animals exhibited increased wall thickening and improved blood flow in the ischemic area during tuning. The results demonstrated that gene delivery of angiogenic transgenes (FGF-5) was effective in improving local myocardial contractility dysfunction by improving local blood flow through newly formed blood vessels.

방법Way

동물 및 모델Animal and model

요크셔 집돼지(sus scrofa, n=27) 중량 47±9kg을 사용했다. 2 마리의 동물에 lacZ를 발현하는 재조합 아데노바이러스를 관상내 주사(2.0ml 식염수중에 10¹¹바이러스 입자)하고 주사 후 3일 또는 5일째에 죽였다. 남아 있는 25 마리의 동물에는 국소적 혈류를 측정하고 압력을 모니터하기 위한 수단으로 심방, 폐동맥 및 대동맥에 카테테르를 배치했다. 와이어를 좌심실에 봉합하여 ECG 기록 및 심방 조율을 허가했다. 아메로이드 수축근을 근위 좌회선 관상동맥 주변에 배치했다. 아메로이드 물질은 흡수성으로 서서히 팽윤하여 배치 후 10일까지 동맥의 폐쇄를 점차 완료하지만, 측부 혈관의 발생으로 인해 경색은 최소화되었다(좌심실 <1%). 심근 기능 및 혈류는 폐색된 동맥에 의해 이미 관류된 영역(허혈 영역)에서는 휴식 동안 정상이지만, 혈류는 심근 산소 수요가 증가할 때 허혈을 방지하기에는 불충분하다. 측부 혈관 발생은 아메로이드 배치 후 21일내에 완료되고, 적어도 4개월 동안 변하지 않고 그대로 있다(Roth 등, Am. J. Physiol. 253:H1279-H1288, 1987). 또한, 수압 커프를 아메로이드에 인접하지만 말단인 동맥 주변에 배치했다. 이들 과정은 다른 곳에 상세히 설명되어 있다(Hammond 등, J. Am. Coll. Cardiol. 23:475-482, 1994 및 Hammond 등, J. Clin. Invest. 92:2644-2652, 1993). 2 마리의 동물을 아메로이드 배치 후 5일 및 7일째에 죽였다. 제한된 측부 순환이 발생하여 안정화된 때인 아메로이드 배치 후 38(±2)일째에 동물을 조사하여 조율-유도 국소적 기능 및 혈류를 규정한 후, 동물에게 관상내 주사에 의해 송달되는 lacZ(n=7, 대조표준 동물) 또는 FGF-5(n=16, 처리군)를 발현하는 재조합 아데노바이러스를 주었다. 다음에, 14±1일 후 조율-유도 국소적 기능 및 혈류를 규정하기 위한 조사를 반복했다. 다음 날 AdlacZ(n=7 ) 및 AdFGF-5(n=11) 동물을 죽이고 조직을 수집했다. 5 마리의 AdFGF-5 동물은 유전자 전달 후 12주에 조사한 후 죽였다.Yorkshire scoop ( sus scrofa, n = 27 ) Weighed 47 ± 9 kg. Recombinant adenovirus expressing lacZ was injected intravenously (10 < ¹¹ &gt; viral particles in 2.0 ml saline) in two animals and killed at day 3 or day 5 after injection. The remaining 25 animals placed catheters in the atria, pulmonary artery, and aorta as a means of measuring local blood flow and monitoring pressure. The wires were sealed in the left ventricle to permit ECG recording and atrial tune. Amyloid contractile muscle was placed around the proximal left coronary artery. The amyloid material slowly swells to absorb and gradually complete the occlusion of the artery by 10 days post deployment, but infarction is minimized by the development of collateral vessels (LV <1%). Myocardial function and blood flow are normal during rest in areas that have already been perfused by occluded arteries (ischemic areas), but blood flow is insufficient to prevent ischemia when myocardial oxygen demand increases. The collateral vessels are completed within 21 days after placement of amyloid and remain unchanged for at least 4 months (Roth et al., Am. J. Physiol. 253: H1279-H1288, 1987). In addition, a hydraulic cuff was placed adjacent to the amyloid but near the distal artery. These procedures are elaborated elsewhere (Hammond et al., J. Am. Coll. Cardiol. 23: 475-482, 1994 and Hammond et al., J. Clin. Invest. 92: 2644-2652, 1993). Two animals were killed on days 5 and 7 after placement of amyloid. Animals were irradiated at 38 (+/- 2) days after AME placement when limited side circulation had stabilized and staged, and the lacZ (n = 7, control standard animal) or FGF-5 (n = 16, treated group). Then, after 14 +/- 1 days, the investigation was repeated to determine the co-ordination-induced local function and blood flow. The following day, AdlacZ (n = 7) and AdFGF-5 (n = 11) animals were killed and tissues collected. Five AdFGF-5 animals were killed after 12 weeks of gene transfer.

재조합 아데노바이러스 및 트랜스젠 송달Recombinant adenovirus and transgenic delivery

헬퍼-독립적 복제-결함 사람 아데노바이러스-5 시스템을 상기 실시예 2에 설명된 바와 같이 제조했다.Helper-independent replication-defective human adenovirus-5 system was prepared as described in Example 2 above.

트랜스젠의 관상내 송달을 위해서, 동물을 마취하고 5F 동맥 초를 경동맥에 배치했다. 5F 다목적(A2) 관상 카테테르를 이 초를 통해 관상동맥에 삽입했다. 좌측 주관상동맥에 대조 주사하여 아메로이드의 폐쇄를 모든 동물에서 확인했다. 다음에, 카테테르 팁을 동맥 내강내에 깊게 배치하여, 주사 동안 근위 대동맥에서 최소한의 물질이 손실되도록 했다. 재조합 아데노바이러스를 2x10¹¹바이러스 입자 함유하는 4ml를 좌측 및 우측 관상동맥에 2.0ml씩 서서히 주사하여 송달했다.For the coronary delivery of the transgene, the animals were anesthetized and 5F artery chops were placed in the carotid artery. 5F multifunctional (A2) coronary catheter was inserted into the coronary artery through this second. Closure of amyloid was confirmed in all animals by contrast injection into the left main coronary artery. The catheter tip was then placed deep within the arterial lumen so that minimal material was lost in the proximal aorta during injection. 4 ml of recombinant adenovirus containing 2x10 ¹¹ viral particles was delivered by slow injection into the left and right coronary arteries in 2.0 ml increments.

분석:analysis:

(i) 국소적 수축 기능 및 관류(i) local contraction function and perfusion

2-차원 및 M-모드 영상을 휴렛 팩커드 초음파 영상 시스템(Hewlett-PackardSonos 1000)을 사용하여 유두근 수준에서 우측 흉골연의 접근법으로 얻었다. 의식이 있는 동물을 몸체의 이동을 최소화하기 위해 편안한 슬링에 매단채로 조사했다. 기초 상태에 있는 동물에 대해, 그리고 좌심방 조율(심박수 = 분당 200 박동) 동안 다시 한 번 영상을 VHS 테이프상에 기록했다. 이들 조사를 유전자 전달 1일 전에 수행하고, 그 후 14±1일에 반복했다. 5 마리의 동물을 FGF-5를 사용한 유전자 전달 후 12주째에 다시 시험하여, 기능 개선에 대한 효과가 지속되었는지의 여부를 측정했다. 속도-압력 결과 및 좌심방 압력은 유전자 전달 전후에 양쪽 그룹에서 유사했으며, 이것은 유사한 심근 산소 요구 및 부하 상태를 나타낸다. 심초음파 검사 측정을 표준화된 기준(Sahn 등, Circulation 58:1072-1083, 1978)을 사용하여 행했다. 심초음파검사 측정의 재현성을 증명하기 위해, 동물(n=5)을 2일간 연속해서 영상화했다. 개별 측정으로부터의 데이타는 재현성이 높았다(측벽 비후화: r²=0.90; P=0.005). 이 모델에서 흉막을 통한 심초음파검사 및 소노마이크로메트리에 의해 측정된 기능의 감소률은 유사하며(Hammond 등, J. Am. Coll. Car diol. 23:475-482, 1994 및 Hammond 등, J. Clin. Invest. 92:2644-2652, 1993), 이것은 허혈 기능장애의 평가에 대한 심초음파검사의 정확성을 나타낸다. 처리군에 대한 지식 없이 분석을 수행했다.Two-dimensional and M-mode images were obtained with a right sternal approach at the papillary muscle level using a Hewlett-Packard Sonos 1000 system. Conscious animals were kept in a comfortable sling to minimize movement of the body. Images were again recorded on the VHS tape for the animals in the basal state and again for the left atrium (heart rate = 200 beats per minute). These investigations were performed 1 day before gene transfer and then 14 +/- 1 days. Five animals were tested again at 12 weeks after gene transfer using FGF-5 to determine whether the effect on functional improvement persisted. Velocity-pressure results and left atrial pressures were similar in both groups before and after gene transfer, indicating similar myocardial oxygen demand and load status. Echocardiographic measurements were performed using standardized criteria (Sahn et al., Circulation 58: 1072-1083, 1978). To demonstrate the reproducibility of echocardiographic measurements, animals (n = 5) were imaged for two consecutive days. Data from individual measurements were highly reproducible (sidewall thickening: r ² = 0.90; P = 0.005). In this model, the rate of decline in function measured by pleural echocardiography and Sono micro-metry is similar (Hammond et al., J. Am. Coll. Car diol. 23: 475-482, 1994 and Hammond et al. Clin. Invest. 92: 2644-2652, 1993), indicating the accuracy of echocardiography for the assessment of ischemic dysfunction. The analysis was performed without knowledge of the treatment groups.

대조 물질(Levovist; 갈락토스의 미세응집괴)은 좌심방 주사 후 영상의 반향도(흰색부분)가 증가한다. 미세응집괴는 혈류에 비례하는 방식으로 관상동맥 및 심근벽에 분포한다. 최대 방사조영 강도의 강화는 중심체에 의해 측정된 심근 혈류와 상호 관련된다(Skyba 등, Circulation 58:1072-1083, 1978). 아메로이드 폐쇄 훨씬 후이지만 유전자를 전달하기 전인 아메로이드 배치 후 38(±2)일에, 방사조영 심초음파검사를 심방 조율(200bpm) 동안 수행했다. 유전자 전달 후 14±1일에 조사를 반복하고, 5 마리 동물에서는 FGF-5를 사용한 유전자 전달 후 12주째에 반복했다. 최대 방사조영 강도를 컴퓨터-기반 비디오 분석 프로그램(Color Vue II, Nova Microson ics, 인디애나 인디애나폴리스)을 사용하여 비디오 영상으로부터 측정했는데, 이것은 비디오 강도의 객관적인 측정을 제공했다. 데이타를 허혈 영역(LCx 층)의 최대 비디오 강도를 심실 중격(IVS, 폐색되지 않은 좌전하행 관상동맥을 통해 정상 혈류를 받은 영역)의 최대 비디오 강도로 나눈 비로써 표현했다. 방사조영 심초음파검사에 의해 측정된 심방 조율 동안의 국소적 혈류의 차이는 우리 연구실에서 이 동일한 모델에서 중심체에 의해 측정된 차이와 유사했으며, 이것은 국소적 심근 혈류의 평가에 대한 심초음파검사의 정확성을 나타낸다. 대조 연구를 동물이 어떤 유전자를 받았는지 모르는채 분석했다.Levovist (fine agglutination of galactose) increases the degree of echo (white part) of the image after the left atrium injection. The microaggregates are distributed in the coronary artery and myocardial wall in a manner proportional to the blood flow. The enhancement of maximal radiographic intensity is correlated with myocardial blood flow measured by centrosomes (Skyba et al., Circulation 58: 1072-1083, 1978). Radiographic echocardiography was performed during atrial tune (200 bpm) at 38 (± 2) days after the amyloid placement, much later than the ampuloid closure but prior to gene transfer. Irradiation was repeated 14 ± 1 days after gene transfer and 5 weeks after FGF-5 gene transfer. Maximum radial intensity was measured from the video image using a computer-based video analysis program (Color Vue II, Nova Microsonics, Indianapolis, IN), which provided an objective measure of video intensity. Data were expressed as the ratio of the maximum video intensity of the ischemic area (LCx layer) divided by the maximum video intensity of the ventricular septum (IVS, the area under normal blood flow through the unstated left anterior descending coronary artery). The difference in local blood flow during atrial tune measured by radiographic echocardiography was similar to the difference measured by the centrosome in this same model in our laboratory, which showed that the accuracy of echocardiography for the assessment of local myocardial blood flow . Control studies were run without knowing which genes the animals received.

(ii) 혈관형성평가(ii) Evaluation of angiogenesis

완두 동맥에 캐뉼러를 꽂고 다른 큰 혈관들을 연결했다. 헤파린(10,000IU), 파파베린(60mg), 그리고 다음에 염화칼륨(확장기 심정지를 유도하기 위해)을 정맥내 주사한 후, 대동맥을 교차하여 클램프로 조이고 관상 맥관구조를 관류시켰다. 글루타르알데히드 용액(6.25%, 0.1M 카코딜레이트 완충액)을 120mmHg 압력으로 관류시키고; 심장을 꺼내고; 색-표지 염료를 좌전하행, 좌회선 및 우관상동맥을 통해 선행성 주사하여 층들을 확인하고; 아메로이드를 시험하여 폐쇄를 확인했다. 정상적으로 관류된 허혈 영역(심내막 및 심외막 1/3)으로부터 취해진 샘플을 플라스틱에 함몰시켜 모세관수의 현미경 분석용으로 만들었다. 두께가 1㎛인 횡단 박편 4개를 이전에 설명된 바와 같이(Mathieu-Costello, Microvasc. Res. 33:98-117, 1987 및 Poole & Mathieu-Costello, Am. J. Physiol. 259:H204-H210, 1990) 각 부표본(각 영역의 심내막 및 심외막)으로부터 취했다. 각 부표본(전신적 샘플링에 의해 무작위적으로 선택)의 8개 필드 각각에서 각 섬유 주변의 모세관수 및 섬유 단면적을 X1400의 영상 분석기(Videometric 150, American Innovision)를 사용하여 측정했다. 총 325±18 섬유 주변의 모세관수를 측정했다. 모세관 밀도(섬유 단면적 당 수)를 부표본 당 15±1 필드를 점계수하여 추정했다. 섬유 주변의 모세관수, 섬유 단면적 및 모세관 밀도의 상대표준오차는 각각 1.4, 4.1 및 4.2%였다. 모세관 대 섬유 비율을 모세관 밀도와 섬유 단면적의 결과로써 계산했다. 양쪽 그룹으로부터의 심근 샘플에서 섬유 단면적에 유의한 차이는 없었다. 브로모디옥시우리딘(50mg /kg)을 5 마리 동물의 복막 공간에 주사했다: 대조표준 동물(아메로이드 없음); 2주 전에 lacZ 유전자 전달을 받았던 아메로이드 폐색제를 가진 동물 2 마리; 2주 전에 FGF-5 유전자 전달을 받았던 아메로이드 폐색제를 가진 동물 2마리. BRDU 주사 후 36 시간째에 동물을 죽이고, 이전에 설명된 방법(Kajstura 등, Circ. Res. 74:383-400, 1994)를 사용하여 분석용으로 조직을 만들었다.I inserted a cannula into the pea artery and connected the other large blood vessels. After intravenous infusion of heparin (10,000 IU), papaverine (60 mg), and then potassium chloride (to induce diastolic cardiac arrest), the clamps were crossed and the coronary vasculature was perfused through the aorta. Glutaraldehyde solution (6.25%, 0.1 M chocodilate buffer) was perfused at a pressure of 120 mmHg; Take out the heart; Color-marking dyes are prospectively injected through the left anterior descending, left lobe, and right coronary arteries to identify layers; Ameloid was tested to confirm closure. Samples taken from normally perfused ischemic areas (1/3 of the endocardium and the epicardium) were plunged into plastic for microscopic analysis of capillary counts. Four cross-section pieces with a thickness of 1 [mu] m were prepared as described previously (Mathieu-Costello, Microvasc. Res. 33: 98-117, 1987 and Poole & Mathieu-Costello, Am. J. Physiol. 259: H204- , 1990) were taken from each sub-specimen (endocardium and epicardium of each region). The number of capillaries and fiber cross-sectional area around each fiber in each of the eight fields of each subsample (randomly selected by systemic sampling) were measured using an X1400 image analyzer (Videometric 150, American Innovision). The total number of capillaries around the 325 ± 18 fibers was measured. The capillary density (number per fiber cross-sectional area) was estimated by point-counting 15 ± 1 fields per negative specimen. The relative standard errors of capillary number, fiber cross section and capillary density around the fiber were 1.4, 4.1 and 4.2%, respectively. The capillary to fiber ratio was calculated as a result of capillary density and fiber cross-sectional area. There was no significant difference in fiber cross-sectional area in myocardial samples from both groups. Bromodioxyuridine (50 mg / kg) was injected into the peritoneal space of 5 animals: control standard animals (no amyloid); Two animals with amyloid obturator that had received lacZ gene delivery two weeks prior; Two animals with amyloid obturator who received FGF-5 gene delivery two weeks ago. Animals were killed at 36 hours post-BRDU injection and tissues were prepared for analysis using the previously described method (Kajstura et al., Circ. Res. 74: 383-400, 1994).

(iii) DNA, mRNA 및 단백질 발현(iii) DNA, mRNA and protein expression

유전자 전달 후, 좌심실 균등질을 조사하여 트랜스젠의 존재 및 발현을 나타냈다. CMV 프로모터(GCAGAGCTCGTTTAGTGAAC; SEQ ID NO.1)에 대한 센스 프라이머및 내부 FGF-5 서열(GAAAATGGGTAGAGATATGCT; SEQ ID NO.2)에 대한 안티센스를 사용하는 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 예상된 500bp 단편을 증폭했다. FGF-5 서열(ATG AGCTGTCCTTCCTCCTC; SEQ ID NO.3)의 시작부분에 대한 센스 프라이머 및 내부 FGF-5 서열(즉, SEQ ID NO.2)에 대한 안티센스 프라이머를 사용하여, RT-PCR로 예상된 400bp 단편을 증폭했다. 아데노바이러스 DNA E2 영역에 대해 지정된 프라이머를 사용하여 조직에서 야생형 또는 재조합 바이러스 DNA(TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG; SEQ ID NO.4) 및 (CATCTGAACTCAAAGCGTGG; SEQ ID NO.5)를 검출했다. 예상된 900bp 단편을 재조합 바이러스로부터 증폭했다. 이들 연구를 심근층 및 다른 조직으로부터의 200mg 조직 샘플에 대해 수행했다. PCR 검출 감도는 5백만 세포 당 1 바이러스 서열이었다. FGF-5에 대해 지정된 다중클론 항체(Kitaoka 등 Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35:3189-3198, 1994)를 FGF-5 또는 lacZ의 유전자 전달 후 48 시간째에 배양된 레트 심장 섬유모세포의 배지로부터의 단백질의 면역블롯에 사용했다. FGF-5 단백질은 FGF-5의 유전자 전달 후 콘디셔닝 배지에서 발견되었지만, lacZ의 유전자 전달 후에는 그렇지 않았다. PCR 및 웨스턴 블롯 방법은 다른 곳에 상세히 설명되어 있다(Hammond 등, J. Clin. Invest. 92:2644-2652, 1993, Roth 등, J. Clin. Invest. 91:939-949, 1993, 및 Tsai 등, Am. J. Physiol. 267:H2079-H2085, 1994). 트랜스젠을 시험관내에서 미토겐 활성에 대해 시험하기 위해서, 성인 레트 심장 섬유모세포를 아데노바이러스-코딩 FGF-5 또는 아데노바이러스-코딩 lacZ로 감염시키거나, 또는 감염시키지 않았다. 이들 세포 배양물로부터의 배지를 NIH3T3 마우스 섬유모세포와 함께 인큐베이션하고, 삼중수소 티미딘 결합을 측정했다(Tsai등, Endocrinology 136:3831-3838, 1995).After gene transfer, left ventricular homogeneity was examined to show the presence and expression of transgenes. Amplified 500 bp fragment predicted by polymerase chain reaction (PCR) using a sense primer for the CMV promoter (GCAGAGCTCGTTTAGTGAAC; SEQ ID NO. 1) and an antisense for the internal FGF-5 sequence (GAAAATGGGTAGAGATATGCT; SEQ ID NO. did. PCR using the antisense primers for the sense primer at the beginning of the FGF-5 sequence (ATG AGCTGTCCTTCCTCCTC; SEQ ID NO. 3) and the internal FGF-5 sequence (ie, SEQ ID NO. 2) The 400bp fragment was amplified. Wild type or recombinant viral DNA (TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG; SEQ ID NO. 4) and (CATCTGAACTCAAAGCGTGG; SEQ ID NO. 5) were detected in tissues using primers designated for the adenoviral DNA E2 region. The expected 900 bp fragment was amplified from the recombinant virus. These studies were performed on 200 mg tissue samples from the myocardial layer and other tissues. PCR detection sensitivity was 1 viral sequence per 5 million cells. (Kitaoka et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35: 3189-3198, 1994) designated for FGF-5 was cultured in a medium of retort cardiomyocyte cultured 48 hours after the gene transfer of FGF-5 or lacZ &Lt; / RTI &gt; was used for immunoblotting of proteins from E. coli. FGF-5 protein was found in the conditioning medium after gene transfer of FGF-5, but not after lacZ gene transfer. PCR and Western blot methods are elaborated elsewhere (Hammond et al., J. Clin. Invest. 92: 2644-2652, 1993, Roth et al., J. Clin. Invest. 91: 939-949, , Am. J. Physiol. 267: H2079-H2085, 1994). To test for transgene in vitro for mitogen activity, adult reticulate cardiomyocytes were infected with adenovirus-encoding FGF-5 or adenovirus-encoding lacZ, or not infected. The medium from these cell cultures was incubated with NIH3T3 mouse fibroblasts and tritium thymidine binding was measured (Tsai et al., Endocrinology 136: 3831-3838, 1995).

(iv) 관상내 송달 동안 아데노바이러스 방출(iv) release of adenovirus during intravenous delivery

3 마리의 동물에게 재조합 아데노바이러스를 관상내 주사하는 동안 계속해서 폐동맥혈을 뽑아냈다. 각 샘플로부터의 혈청을 표준 플라크 분석에 사용했다. 희석되지 않은 혈청(0.5ml)을 아합류 H293 세포에 첨가했는데, 10일 후 플라크는 형성되지 않았다. 그러나, 0.5ml 혈청을 DMEM(2% FBS)로 200 내지 8000배 희석했을 때는 바이러스 플라크가 9일까지는 형성되었다. 단일 혈관층(심근)이 관상동맥과 폐동맥을 분리한다. 만일 바이러스가 관상동맥에 주사 후 이 층에 부착하지 않는다면, 바이러스의 폐동맥 농도는 주사 시간 동안의 전신적 정맥혈에 의한 관상정맥동혈의 희석을 반영할 것이다. 우리 연구실의 측정은 관상 흐름이 폐동맥 흐름 중 5%에 상당한다는 것을 나타낸다. 이 희석 인자(20배), 관상 주사 기간, 및 주사된 아데노바이러스의 양을 사용하여, 아데노바이러스의 탈출 또는 부착이 없다는 가정하에 폐동맥으로 송달된 아데노바이러스의 양을 계산했다. 이 추정치를 측정된 양과 비교했고, 이 차이를 심근 혈관층에 의해 제거된 바이러스양의 추정치로써 사용했다.Three animals continued to extract pulmonary arterial blood during the intravenous injection of recombinant adenovirus. Serum from each sample was used for standard plaque analysis. Diluted serum (0.5 ml) was added to the subunit H293 cells, but no plaque was formed after 10 days. However, when 0.5 ml serum was diluted 200 to 8000 times with DMEM (2% FBS), virus plaques were formed until day 9. A single vessel layer (myocardium) separates the coronary arteries from the pulmonary artery. If the virus does not adhere to this layer after injection into the coronary arteries, the pulmonary arterial concentration of the virus will reflect dilution of coronary venous blood due to systemic venous blood during the injection time. Our lab measurements indicate that coronary flow is equivalent to 5% of pulmonary arterial flow. The amount of adenovirus delivered to the pulmonary artery was calculated using this dilution factor (20-fold), the tubular injection period, and the amount of injected adenovirus, assuming no adenovirus escape or adherence. This estimate was compared to the measured amount and this difference was used as an estimate of the amount of virus removed by the myocardial vascular layer.

(v) 염증 평가(v) Evaluation of inflammation

헤마톡실린/에오신 및 Masson의 삼색 염색을 사용하여 염증성 세포 침윤물, 세포 괴사 및 섬유증을 검출했다. 마우스 복수, 돼지 항-CD4 및 항-CD8 단일클론 항체(1.0mg/ml; VMRD, Inc., 워싱톤 풀만)을 사용하여 비장(양성 대조표준) 및 심장의 냉동 박편(6㎛)에서 T 림프구에 대한 CD4 및 CD8 마커를 검출했다. 이들 연구를 죽기 50일 전에 아메로이드 폐색제를 받은 6 마리 동물의 심장 전층 샘플에 대해 수행했다: 유전자 전달을 받지 않은 동물 2 마리. 2주 전에 FGF-5 유전자 전달을 받은 2 마리, 2주 전에 lacZ 유전자 전달을 받은 2 마리. 처리군에 대한 지식 없이 분석을 수행했다.Hematoxylin / eosin and Masson's tricolor staining were used to detect inflammatory cell infiltrates, cellular necrosis and fibrosis. (Positive control standard) and frozen flasks (6 쨉 m) of the heart using T-lymphocytes, mouse anti-CD4 and anti-CD8 monoclonal antibodies (1.0 mg / ml; VMRD, Inc., And CD4 and CD8 markers were detected. These studies were performed on whole heart samples of six animals receiving amyloid obturator 50 days before death: 2 animals without gene transfer. Two mice received FGF-5 gene transfer two weeks ago, and two mice received lacZ gene transfer two weeks ago. The analysis was performed without knowledge of the treatment groups.

(vi) 통계적 분석(vi) Statistical analysis

데이타는 평균 ±1 s.e.m.으로 표현한다. FGF-5 및 lacZ를 사용한 유전자 전달 전후에 행한 측정을 변화에 대한 2-방식 분석(Crunch4, Crunch Software Corp oration, 캘리포니아 오클랜드)을 사용하여 비교했다. 또한, 혈관형성연구로부터의 데이타를 변화에 대해 2-방식 분석했다. 무효 가설은 P<0.05일때 반려했다.Data are expressed as mean ± 1 s.e.m. Measurements performed before and after gene transfer using FGF-5 and lacZ were compared using a two-way analysis of variance (Crunch4, Crunch Software Corp., Auckland, CA). In addition, data from angiogenesis studies were analyzed in a two-way fashion for changes. The null hypothesis was rejected when P <0.05.

FGF-5 트랜스젠을 사용한 결과Results using FGF-5 transgenes

3가지 측정을 사용하여 FGF-5의 유전자 전달이 심근 허혈을 치료하는데 효과적인지의 여부를 평가했다: 국소적 수축 기능 및 관류(유전자 전달 전후에 평가) 및 모세관수. 모든 측정을 동물이 어떤 유전자(FGF-5 대 lacZ)를 받았는지 모르는채 수행했다.Three measurements were used to assess whether gene delivery of FGF-5 was effective in treating myocardial ischemia: local contraction function and perfusion (evaluated before and after gene transfer) and capillary number. All measurements were performed without knowing which animal received the gene (FGF-5 vs. lacZ).

국소적 수축 기능 및 혈류Local contraction and blood flow

아메로이드 배치 후 38일에 동물은 동맥 전기 자극 동안 손상된 벽 비후화를 나타냈다. lacZ를 받은 돼지는 유전자 전달 전과 유전자 전달 후 2주째에 허혈 영역에서 유사한 정도의 조율-유도 기능장애를 나타냈다. 반면, FGF-5 유전자 전달 후 2주째에는 조율 동안 허혈 영역에서 벽 비후화가 2.7배 증가했다(P<0.0001; 동 6). 정상적으로 관류된 영역(심실 중격)의 벽 비후화는 조율 동안 정상이었으며,유전자 전달에 의해 영향을 받지 않았다(% 벽 비후화: lacZ: 유전자 전달 전 53±8%, 유전자 전달 후 51±6%; FGF-5: 유전자 전달 전 59±4%, 유전자 전달 후 59±6%).At day 38 after amered placement, the animals exhibited impaired wall hypertrophy during electrical stimulation. The pigs receiving lacZ showed a similar degree of coordination-induced dysfunction in the ischemic area before and 2 weeks after gene transfer. On the other hand, at 2 weeks after FGF-5 gene transfer, wall thickening increased 2.7-fold in the ischemic area during the tuning (P <0.0001; Wall hypertrophy of the normally perfused area (ventricular septum) was normal during tuning and was not affected by gene transfer (% wall hyperplasia: lacZ: 53 ± 8% before gene transfer, 51 ± 6% after gene transfer; FGF-5: 59 ± 4% before gene transfer and 59 ± 6% after gene transfer).

허혈 영역에서의 개선된 기능과 관련된 개선된 국소적 혈류가 있었다. lacZ 유전자 전달 후 2주째에는 조율 동안 허혈 영역에 지속적 흐름 부족이 있었다(도 8). 그러나, FGF-5 유전자 전달을 받은 동물은 2주후에 두 영역에서 동형의 조영 강화를 나타냈으며, 이것은 허혈 영역에서 혈류가 개선되었음을 나타낸다(P=0.0001 ). 허혈층에서 개선된 기능 및 관류가 오래 지속되는지의 여부를 측정하기 위해, 5 마리의 동물을 FGF-5 유전자 전달 후 12주에 다시 한 번 시험했다. 각 동물은 기능(P=0.005; 도 6) 및 관류(P=0.001; 도 8)에서 지속적인 개선을 나타냈다.There was an improved localized blood flow associated with improved function in the ischemic area. At 2 weeks after lacZ gene transfer there was a persistent lack of flow during ischemia (Figure 8). However, animals receiving FGF-5 gene delivery exhibited homotypic enhancement in both areas after two weeks, indicating improved blood flow in the ischemic area (P = 0.0001). To determine whether improved function and perfusion in the ischemic layer lasted for longer, 5 animals were tested again at 12 weeks after FGF-5 gene transfer. Each animal exhibited continuous improvement in function (P = 0.005; Figure 6) and perfusion (P = 0.001; Figure 8).

혈관형성Angiogenesis

감염되지 않은 아메로이드-수축된 동물(유전자 전달 수행하지 않음)은 lacZ-코딩 아데노바이러스를 받은 동물과 동일한 생리학적 반응을 가졌으며, 이것은 lacZ 벡터가 자생적 혈관형성에 부정적인 영향을 미치지 않았다는 것을 나타낸다. 혈관형성을 평가하기 위해서, 심근 모세관수를 관류-고정 심장에 대한 현미경 분석을 사용하여 정량했다(도 9). 각 심근섬유 주변의 모세관수는 lacZ를 사용한 유전자 전달을 받은 동물 심장의 동일한 영역과 비교했을 때, FGF-5를 사용한 유전자 전달을 받은 동물의 허혈 및 비허혈 영역의 심내막에서 더 컸다(P=0.038). 따라서, 개선된 국소적 기능 및 관류는 FGF-5 유전자 전달 후 2주째의 모세관 혈관형성과 관련있었다. 각 섬유 주변의 증가된 모세관수는 FGF-5 유전자 전달 후 벽의 심외막 부분을 증가시키려는 경향이 있었다(P=0.13). 섬유 단면적 당 모세관수 및 섬유수 당 모세관수와 같은 모세관 현상의 다른 측정은 심내막층 또는 심외막층에서 변화하지 않았다.Uninfected amyloid-shrunken animals (not carrying gene transfer) had the same physiological response as animals receiving lacZ-coding adenoviruses, indicating that the lacZ vector had no adverse effect on native angiogenesis. To assess angiogenesis, myocardial capillary counts were quantified using microscopic analysis of perfusion-fixed hearts (Figure 9). The number of capillaries around each myocardial fiber was greater in the endocardium of the ischemic and non-ischemic areas of animals receiving FGF-5 gene transfer compared to the same area of animal hearts receiving gene transfer using lacZ (P = 0.038). Thus, improved local function and perfusion were associated with capillary angiogenesis at 2 weeks after FGF-5 gene transfer. Increased capillary number around each fiber tended to increase the epicardial portion of the wall after FGF-5 gene transfer (P = 0.13). Other measurements of capillary phenomena such as the number of capillaries per fiber cross-section and the number of capillaries per fiber did not change in the endocardial or epicardial layers.

DNA. mRNA 및 단백질 발현DNA. mRNA and protein expression

기능, 관류 및 각 섬유 주변의 모세관수에 대한 FGF-5 유전자 전달의 호의적인 효과를 성립하는 것은, 심장에서 트랜스젠의 존재 및 발현을 증명하기 위해 꼭 필요했다. 중합효소 연쇄반응(PCR) 및 PCR과 짝을 이룬 역전사효소(RT-PCR)을 사용하여 FGF-5 유전자 전달을 받은 동물로부터 심근층에서 트랜스제닉 FGF-5 DNA 및 mRNA를 검출했다.Establishing a favorable effect of FGF-5 gene delivery on function, perfusion and capillary count around each fiber was essential to demonstrate the presence and expression of transgenes in the heart. Transgenic FGF-5 DNA and mRNA were detected in the myocardial layer from animals receiving FGF-5 gene transfer using polymerase chain reaction (PCR) and reverse transcriptase (RT-PCR)

유전자 전달 후, 좌심실 샘플을 시험하여 트랜스젠 결합 및 발현을 나타냈다. 간단히 말해서, lacZ의 관상내 유전자 전달 후 3일째에 X-gal로 처리하고, 다음에 에오신 X120으로 대조염색했다. 표준 조직학 기술을 사용한 시험은 대다수의 심근세포가 β-갈락토시다제 활성(청색 염색)을 나타냈음을 밝혔다. 또한, 활성은 lacZ 유전자 전달을 받은 모든 동물에서 유전자 전달 후 14±1일째에 보였다. 더 큰 확대는 β-갈락토시다제 활성을 함유하는 세포에서 가로무늬를 나타냈으며, 이로써 근세포에서 유전자 발현을 확인한다. CMV 프로모터에 대해 지정된 센스 프라이머 및 내부 FGF-5 서열에 대해 지정된 안티센스 프라이머를 사용한 PCR 분석을 수행하여 FGF-5 유전자 전달을 받은 3 마리 동물의 허혈(LCx) 및 비허혈(LAD) 영역에서 FGF-5를 코딩하는 재조합 아데노바이러스 DNA의 존재를 확인했다. 도 10A에 나타낸 결과로 예상된 500pb 단편의 존재를 확인했다. 다음에, FGF-5 mRNA 발현을유전자 전달 후14일째에 시험했다. 도 10B에 나타낸 바와 같이, RT-PCR 증폭된 400bp 단편은 2 마리 동물로부터의 양쪽 영역에 모두 존재했으며, 대조표준 동물은 신호를 나타내지 않았다. FGF-5에 대해 지정된 다중클론 항체를 FGF-5 또는 lacZ의 유전자 전달 후 48 시간째에 배양된 레트 심장 섬유모세포의 배지로부터의 단백질의 면역블롯에 사용했다. 도 10C에 나타낸 바와 같이, FGF-5 단백질은 FGF-5(F)의 유전자 전달 후 발견되었지만, lacZ(β)의 유전자 전달 후에는 발견되지 않았으며, 이것은 FGF-5 유전자 전달 후의 단백질 발현 및 세포외 분비를 증명한다. 마지막으로, 아데노바이러스 DNA(E2 영역)에 대해 지정된 프라이머 세트를 사용한 PC R을 수행하여 아데노바이러스 DNA가 14일전에 아데노바이러스의 관상내 주사를 받은 2 마리 동물의 망막, 간 또는 골격근에 존재하는지의 여부를 측정했다. 도 10D에 나타낸 바와 같이, 예상된 900bp 증폭된 단편은 재조합 아데노바이러스(양성 대조표준으로서)를 함유하는 대조표준 레인(+)에서만 발견되었고, 처리된 동물의 망막(r) , 간(l), 또는 골격근(m)으로부터 유도된 레인에서는 발견되지 않았다.After gene transfer, left ventricle samples were tested to show transgenic binding and expression. Briefly, on day 3 post-tubal gene transfer of lacZ, treatment with X-gal and subsequent staining with Eosin X120 was performed. Tests using standard histological techniques revealed that the majority of myocardial cells exhibited? -Galactosidase activity (blue staining). In addition, the activity was seen 14 ± 1 days after gene transfer in all animals receiving lacZ gene transfer. Larger enlargements showed transverse patterns in cells containing beta -galactosidase activity, thereby confirming gene expression in myocytes. PCR assays were performed using the sense primer designated for the CMV promoter and the designated antisense primer for the internal FGF-5 sequence to generate FGF-5 in the ischemic (LCx) and non-ischemic (LAD) RTI ID = 0.0 &gt; adenoviral &lt; / RTI &gt; The presence of the expected 500pb fragment was confirmed as a result shown in Figure 10A. Next, FGF-5 mRNA expression was tested on day 14 after gene transfer. As shown in Fig. 10B, the RT-PCR amplified 400 bp fragment was present in both regions from two animals, and control standard animals did not display a signal. The polyclonal antibodies directed against FGF-5 were used for immunoblotting of proteins from the culture medium of reticulate cardiomyocytes cultured 48 hours after gene transfer of FGF-5 or lacZ. As shown in Fig. 10C, FGF-5 protein was found after gene transfer of FGF-5 (F), but not after lacZ (β) gene transfer, Proving the external secretion. Finally, PCR using the designated primer set for the adenovirus DNA (E2 region) was performed to determine whether the adenoviral DNA was present in the retina, liver or skeletal muscle of 2 animals receiving the intravenous injection of adenovirus 14 days ago Whether it was measured. As shown in Figure 10D, the predicted 900 bp amplified fragment was found only in the control standard lane (+) containing recombinant adenovirus (as a positive control standard), and the retina (r), liver Or in lanes derived from the skeletal muscle (m).

성공적인 유전자 전달이 허혈 및 비허혈 영역 모두에서 나타났다. 면역블롯팅은 FGF-5 유전자 전달을 받은 동물로부터의 심근층에서 FGF-5 단백질을 나타냈다. 배양된 섬유모세포를 사용한 실험에 더하여, 우리는 FGF-5의 유전자 전달이 이들 세포에게 세포외적으로 FGF-5를 합성 및 분비하는 능력을 수여했다고 나타냈다. FGF-5를 발현하는 재조합 아데노바이러스로 감염된 배양 세포로부터의 배지는 미토겐 반응을 나타냈다(대조표준에 대해 14배 증가; P=0.005). 마지막으로, 유전자 전달 후 2주째에, lacZ-감염된 동물로부터의 심근 샘플(간 샘플은 아님)은 조직학적 검사에서 β-갈락토시다제 활성을 나타냈다. 이들 연구로 성공적인 생체내 유전자 전달 및 발현을 확인하고, 트랜스젠 생성물의 생물학적 활성을 증명한다.Successful gene transfer was found in both ischemic and non-ischemic areas. Immunoblotting revealed FGF-5 protein in the myocardial layer from animals receiving FGF-5 gene delivery. In addition to experiments using cultured fibroblasts, we showed that gene transfer of FGF-5 conferred the ability to synthesize and secrete FGF-5 extracellularly in these cells. Medium from cultured cells infected with recombinant adenovirus expressing FGF-5 showed a mitogenic response (14-fold increase compared to control standard; P = 0.005). Finally, at 2 weeks after gene transfer, myocardial samples (not liver samples) from lacZ-infected animals showed beta -galactosidase activity in histological examination. These studies confirm successful in vivo gene transfer and expression and demonstrate the biological activity of transgenic products.

재조합 아데노바이러스의 관상내 주사 후 2주째에, 우리는 심근층에 바이러스 DNA가 존재함에도 불구하고 PCR을 사용하여 간, 망막 또는 골격근에서 바이러스 DNA를 검출할 수 없었다. 더욱이, 바이러스 DNA는 관상내 주사 후 2 내지 24 시간째에 소변에서도 검출되지 않았다. 이들 실험은 아데노바이러스 벡터의 관상내 송달이 PCR 방법의 검출한계 이하 수준으로 바이러스의 전신적 동맥 분포를 최소화했다는 것을 나타냈다. 이 기술은 토끼와 같은 더 작은 관상동맥 크기를 가지는 동물에서는 달성되기 어려울 수 있다.At 2 weeks after intravenous injection of recombinant adenovirus, we were unable to detect viral DNA in the liver, retina or skeletal muscle using PCR, despite the presence of viral DNA in the myocardial layer. Furthermore, viral DNA was not detected in urine 2 to 24 hours after intravenous injection. These experiments indicated that the intraduodenal delivery of the adenoviral vector minimized the systemic arterial distribution of the virus to below the detection limit of the PCR method. This technique may be difficult to achieve in animals with smaller coronary artery size, such as rabbits.

아데노바이러스의 심근 업테이크의 효율을 평가하기 위해서, 우리는 관상내 주사 동안 폐동맥혈을 샘플링함으로써 심장으로부터 방출된 아데노바이러스의 양을 측정했다. 놀랍게도 바이러스의 98.7%가 최초 통과시 심장에 의해 제거되었다. 바이러스의 관상내 송달 동안 폐동맥으로부터 얻어진 희석되지 않은 혈청은 적합한 조건하에서 바이러스 플라크를 형성할 수 없었다. 따라서, 본 발명은 심장-특이적 유전자 송달 시스템을 효과적으로 제공한다.To assess the efficiency of adenovirus myocardial uptake, we measured the amount of adenovirus released from the heart by sampling pulmonary arterial blood during intravenous injection. Surprisingly, 98.7% of the virus was removed by the heart at first passage. Undiluted serum from the pulmonary artery during the coronary delivery of the virus was unable to form viral plaque under appropriate conditions. Thus, the present invention effectively provides a cardiac-specific gene delivery system.

염증 평가Inflammation evaluation

재조합 아데노바이러스를 받는 동물 심장의 횡단 박편에 대한 현미경 검사는 염증성 세포 침윤물, 세포 괴사 또는 증가된 섬유증을 나타내지 않았다. 아데노바이러스-유도 세포변성 효과에 대한 추가의 평가로서, 우리는 세포독성 T 세포의 존재를 나타내는 CD4 및 CD8 항원을 검출하기 위해 면역-조직학적 연구를 수행했다.이들 연구는 감염되지 않은 동물(n=2) 또는 재조합 아데노바이러스를 받은 동물(n= 4)로부터의 심장의 횡단 박편에 양성 세포가 거의 없다는 것을 나타냈다. 간도 또한 염증이 없었다.Microscopic examination of the transverse flap of animal hearts receiving recombinant adenovirus did not reveal inflammatory cell infiltrates, cytotoxicity or increased fibrosis. As an additional assessment of the adenovirus-induced cytopathic effect, we performed immunohistochemical studies to detect CD4 and CD8 antigens, indicating the presence of cytotoxic T cells. = 2) or from animals receiving recombinant adenovirus (n = 4). The liver also had no inflammation.

실시예 6Example 6

FGF-4 트랜스젠을 사용한 유전자-매개 혈관형성Gene-mediated angiogenesis using FGF-4 transgenes

이 실험예는 상이한 혈관형성단백질-코딩 유전자인 FGF-4를 사용한 성공적인 유전자 치료법을 나타냈다. FGF-4 유전자 치료법의 프로토콜은 본래 FGF-5에 대해 상기 실시예 5에 설명된 바와 같다.This experimental example showed successful gene therapy using a different angiogenic protein-coding gene, FGF-4. The protocol of FGF-4 gene therapy is essentially as described in Example 5 above for FGF-5.

사람 FGF-4 유전자를 Kaposi's Sarcoma DNA 형질전화된-NIH3T3 세포의 mRNA로부터 구성된 cDNA 라이브러리로부터 분리했다. FGF-4 cDNA는 약 1.2kb 길이이고, N-말단의 30 아미노산 신호 펩티드를 포함하는 206 아미노산의 폴리펩티드를 코딩한다(Dell Bovi 등, Cell 50:729-737, 1987; Bellosta 등, J. Cell. Biol. 121 :705-713, 1993). 우리는 아데노바이러스 벡터 pACCMVpLpASR(간단히 pACSR)의 Eco R1 부위에 본래 전길이 1.2kb EcoR1 단편인 FGF-4 cDNA를 서브클론했다. 5' 시작 부위는 243 염기쌍이었고, 3' 말단은 863 염기쌍이었다. FGF-4를 코딩하는 재조합 아데노바이러스(또한 본원에서 Ad.FGF-4로 언급됨)를 FGF-5 아데노바이러스 제조에 대해 실시예 2에 설명된 바와 같이 제조했다.Human FGF-4 gene was isolated from a cDNA library constructed from mRNA of Kaposi's Sarcoma DNA transfected-NIH3T3 cells. FGF-4 cDNA is approximately 1.2 kb in length and encodes a polypeptide of 206 amino acids comprising the N-terminal 30 amino acid signal peptide (Dell Bovi et al., Cell 50: 729-737, 1987; Bellosta et al., J. Cell. Biol., 121: 705-713, 1993). We subcloned the original full-length 1.2 kb EcoR1 fragment, FGF-4 cDNA, into the Eco R1 region of the adenoviral vector pACCMVpLpASR (simply pACSR). The 5 'start site was 243 base pairs and the 3' end was 863 base pairs. Recombinant adenovirus (also referred to herein as Ad.FGF-4) encoding FGF-4 was prepared as described in Example 2 for FGF-5 adenovirus production.

심장 조직에서 FGF-4의 발현(그리고, 간, 골격근 및 눈을 포함하는 다른 조직에서 발현의 결여)을 검출용 항-FGF-4 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인했다. 또한, 시험관내에서 내피 세포의 증식에 대한 FGF-4의 미토겐 효과를시험했다.Expression of FGF-4 in heart tissue (and lack of expression in liver, skeletal muscle and other tissues including the eye) was confirmed by Western blot analysis using anti-FGF-4 antibody for detection. In addition, the mitogen effect of FGF-4 on the proliferation of endothelial cells in vitro was examined.

아메로이드 배치 후 45일째에, 동물을 조사하여 응력-유도 국소적 기능 및 혈류를 규정하고, 다음에 FGF-4(n=6 동물)을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 관상내 주사하여 동물에 송달했다. 13일 후, 응력-유도 국소적 기능 및 혈류를 규정하기 위한 조사를 반복했다. 다음 날, 동물을 죽이고 조직을 수집했다.On day 45 after amphetamine placement, animals were challenged to define stress-induced local function and blood flow, and then fed recombinant adenovirus expressing FGF-4 (n = 6 animals) . After 13 days, investigations were repeated to define the stress-induced local function and blood flow. The next day, animals were killed and tissues collected.

트랜스젠 송달Transgene Serving

FGF-5에 관해서, 내인성 혈관형성이 정지되고 환자에서angina pectoris와 유사한 유도성 심근 허혈이 나타난 후에 유전자 전달을 수행했다. 트랜스젠의 관상내 송달을 위해서, 동물을 마취시키고 5F 동맥 초를 경동맥에 배치했다. 아메로이드의 폐쇄를 좌측 주관상동맥으로의 대조 주사에 의해 모든 동물에서 확인했다. 다음에, 카테테르 팁을 동맥 내강내 1cm에 배치하여, 최소한의 물질이 주사 동안 근위 대동맥에서 손실되도록 했다. FGF-4를 발현하는 재조합 아데노바이러스를 1.5x 10¹²바이러스 입자 함유하는 5ml를 좌관상동맥에 3.0ml, 그리고 우관상동맥에 2.0 ml 서서히 주사하여 송달했다.With respect to FGF-5, endogenous angiogenesis was stopped and gene transfer was performed after inducible myocardial ischemia similar to angina pectoris in the patient. For the coronary delivery of the transgenes, the animals were anesthetized and 5F artery chops were placed in the carotid artery. Closure of amyloid was confirmed in all animals by contrast injection into the left main coronary artery. The catheter tip was then placed 1 cm in the lumen of the artery so that minimal material was lost in the proximal aorta during injection. Recombinant adenovirus expressing FGF-4 was delivered by slow infusion of 3.0 ml into the left coronary artery and 2.0 ml into the right coronary artery in 5 ml containing 1.5 x 10 ¹² viral particles.

FGF-4 트랜스젠을 사용한 결과Results using FGF-4 transgenes

국소적 기능 및 관류Local function and perfusion

아메로이드 배치 후 45일째에, 동물은 심방 조율 동안 손상된 벽 비후화를 나타냈다. 반면, FGF-4 유전자 전달 후 2주째에 조율 동안 허혈 영역에서 벽 비후화가 2.7배 증가했다(p<0.0001; 도 11 및 12). 정상적으로 관류된 영역(심실 중격)에서 벽 비후화는 조율 동안 정상이었고, 유전자 전달에 의해 영향을 받지 않았다. FGF-4 유전자 전달 후 기능의 개선은 FGF-5 또는 FGF-2LI +신호 펩티드("sp")를 사용한 유전자 전달 후 얻어진 개선과 통계적으로 구별할 수 없었다(도 11). 허혈 영역에서 개선된 기능은 개선된 국소적 관류와 관련 있었다(도 12). 도 12에 나타낸 바와 같이, FGF-4 유전자 전달 전에는 조율 동안 허혈 영역에 흐름 부족이 있었다. FGF-4를 사용한 유전자 전달 후 2주째에, 동질의 조영 강화가 두 영역에서 보였으며, 이것은 허혈 영역에서 개선된 흐름을 나타낸다(p=0.0001). FGF-4를 사용한 결과는 FGF-5 및 FGF-2LI +sp를 사용하여 얻어진 결과와 통계적으로 구별할 수 없었다(도 13). FGF-2LI +sp를 실시예 7에 설명하고, 신호 서열을 함유하는 FGF-2를 언급한다.On day 45 after amered placement, the animals exhibited impaired wall thickening during atrial tune. On the other hand, wall thickening increased 2.7-fold in the ischemic area during tuning at 2 weeks after FGF-4 gene transfer (p <0.0001; FIGS. 11 and 12). In the normally perfused area (ventricular septum), wall hypertrophy was normal during tuning and was not affected by gene transfer. Improvement of function after FGF-4 gene transfer was not statistically distinguishable from improvement obtained after gene transfer using FGF-5 or FGF-2LI + signal peptide ("sp") (FIG. 11). Improved function in the ischemic area was associated with improved local perfusion (Figure 12). As shown in Fig. 12, there was a flow shortage in the ischemic area during the tuning before the FGF-4 gene transfer. At 2 weeks after gene transfer using FGF-4, homogenous enhancement was seen in both areas, indicating improved flow in the ischemic area (p = 0.0001). Results using FGF-4 were not statistically distinguishable from results obtained using FGF-5 and FGF-2LI + sp (FIG. 13). FGF-2LI + sp is described in Example 7 and refers to FGF-2 containing the signal sequence.

트랜스젠 발현Transgenic expression

심장에서 FGF-4의 배타적인 발현을 트랜스젠을 코딩하는 서열에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 및 RT-PCR를 수행하여 확인했다. FGF-4 DNA 및 mRNA는 심장에서 발견되었지만, 눈, 간, 및 골격근에서는 존재하지 않았다. 이들 데이타로 Ad.FGF-5(n=2) 및 Ad.FGF-2LI +sp(n=1)을 사용하여 유도된 데이타를 확인한다. 따라서, 심장에서 트랜스젠의 배타적인 발현을 상이한 혈관형성단백질-코딩 유전자를 함유하는 아데노바이러스 벡터를 받은 4 마리 동물 모두에서 확인했다.Exclusive expression of FGF-4 in the heart was confirmed by PCR and RT-PCR using a sequence specific primer encoding transgenes. FGF-4 DNA and mRNA were found in the heart but not in the eyes, liver, and skeletal muscle. These data confirm the data derived using Ad.FGF-5 (n = 2) and Ad.FGF-2LI + sp (n = 1). Thus, the exclusive expression of transgenes in the heart was confirmed in all four animals receiving adenoviral vectors containing different angiogenic protein-coding genes.

심근 염증의 부재Absence of myocardial inflammation

Ad.FGF-4를 받은 3 마리의 동물로부터의 횡단 심근 생검을 시험했다. 동물을 유전자 전달 후 2주째에 죽였다. 아데노바이러스를 받지 않은 대조표준 아메로이드 동물과 비교하여 이들 박편에서 염증성 세포 침윤물, 괴사, 또는 증가된 섬유증의 증거는 없었다. 이것은 LAD 및 LCx 층에서도 사실이었다. 이들 연구를 병리학자들이 블라인드-샘플 평가에 의해 검토했으며, 어떤 박편에도 심근염의 증거가 없다고 논평했다.We examined transverse myocardial biopsies from three animals receiving Ad.FGF-4. Animals were killed at 2 weeks after gene transfer. There was no evidence of inflammatory cell infiltrates, necrosis, or increased fibrosis in these flaps compared to control standard amered animals without adenovirus. This was also true for the LAD and LCx layers. These studies were reviewed by pathologists by blind-sample evaluation, and there is no evidence of myocarditis in any flakes.

실시예 7Example 7

FGF-2 뮤테인을 사용한 유전자-매개 혈관형성Gene-mediated angiogenesis using FGF-2 muteins

이 실험 실시예는 제 3의 혈관형성단백질-코딩 유전자인 FGF-2를 사용하여 성공적인 유전자 치료법을 나타냈다. 또한, 이 실험은 혈관형성단백질이 분비를 증가시키고, 심장내의 강화된 혈류 및 심기능에 있어 혈관형성유전자 치료법의 효율을 잠재적으로 개선시키기 위해 어떻게 변형될 수 있는지를 증명한다. 사람 FGF -2 유전자 치료법에 사용되는 프로토콜은 상기 FGF-5 및 FGF-4에 사용된 것과 실질적으로 동일했다.This experimental example showed successful gene therapy using a third angiogenic protein-coding gene, FGF-2. This experiment also demonstrates how angiogenic proteins can be modified to increase secretion and potentially improve the efficiency of angiogenic gene therapy in the enhanced blood flow and cardiac function in the heart. The protocol used for human FGF-2 gene therapy was substantially the same as that used for FGF-5 and FGF-4.

산성 FGF(aFGF, FGF-1) 및 염기성 FGF(FGF-2)는 자생적 분비 신호 서열이 결여되어 있지만, 어떤 단백질 분비는 일어날 수 있다. Golgi 장치를 포함하지 않는 다른 분비 경로가 산성 FGF에 대해 설명되었다. 고전적 단백질 분비 경로에 대한 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 가지는 것(FGF-2LI +sp)과, 신호 펩티드 코딩 서열을 가지지 않는 것(FGF-2LI -sp)의, 2개의 FGF-2 구성체(FGF-2LI +sp 및 FGF-2LI -sp)를 만들어서, 신호 펩티드가 추가되지 않은 동일한 단백질에 비해서 신호 펩티드 서열이 추가된 FGF-2의 효능이 개선되는 것에 대해 시험했다.Acidic FGF (aFGF, FGF-1) and basic FGF (FGF-2) lack spontaneous secretory signal sequences, but some protein secretion can occur. Other secretory pathways not involving the Golgi apparatus have been described for acidic FGF. Two FGF-2 constructs (FGF-2 LI -sp), one having a sequence encoding a signal peptide for the classical protein secretion pathway (FGF-2LI + sp) and one having no signal peptide coding sequence (FGF- 2LI + sp and FGF-2LI-sp) were tested to see that the effect of FGF-2 with added signal peptide sequence was improved compared to the same protein without added signal peptide.

아래에 나타낸 바와 같이, FGF-2는 아미노산 잔기 118에서 잔기 122까지 확장된 5-잔기 루프 구조를 가진다. 이 루프 구조는 돌연변이를 지정하는 카세트를 대체하며, 이것은 FGF-2LI 루프 교체 돌연변이를 생성하기 위한 인터류킨-1β로부터의 5-잔기 루프에 상응한다. 간단히 말해서, 사람 Glu^3,5FGF-2를 코딩하는 유전자 (Seddon 등, Ann. N. Y. Acad. Sci. 638:98-108, 1991)를Ndel및BamH1사이에서 T7 발현 벡터 pET-3a(M13), pET-3a의 유도체(Rosenberg 등, Gene 56:125-135, 1987 )로 클론했다. 유일한 제한 엔도뉴클레아제 부위인BstB1및Spl1을 FGF-2의 세그먼트 Ser117-Trp123을 코딩하는 코돈이 측면에 배치된 위치에 있는 코딩된 아미노산(즉, 사일런트 돌연변이)에는 변화를 만들지 않는 방식으로 유전자로 도입했다.As shown below, FGF-2 has a 5-residue loop structure extending from amino acid residue 118 to residue 122. This loop structure replaces the cassette designating the mutation, which corresponds to a 5-residue loop from interleukin-1 [beta] to generate the FGF-2LI loop replacement mutation. In short, one gene coding for Glu ^3,5 FGF-2 (Seddon, etc., Ann NY Acad Sci 638:. .. 98-108, 1991) the T7 expression between the Ndel and BamH1 vector pET-3a (M13), was cloned into a derivative of pET-3a (Rosenberg et al., Gene 56: 125-135, 1987). The only restricted endo-nuclease sites, BstB1 and Spl1 , are encoded by the gene in a manner that does not make a change in the coded amino acid (i. E., Silent mutation) located at the flank position of the codon encoding Ser117-Trp123 of the FGF- .

FGF-1, FGF-2, 및 IL-1β내의 β9-β10 루프의 구조 배열¹.Structural arrangement of FGF-1, FGF-2, and β9-β10 loops in IL-1β ¹ .

110 115 120 125 130110 115 120 125 130

FGF-1 ENHYNTYISKKHAEKHWFVGLKKNG (SEO ID NO. 6)FGF-1 ENHYNTYIS KKHAEKH WFVGLKKNG ( SEO ID NO. 6 )

110 115 120 125 130110 115 120 125 130

FGF-2 SNNYNTYRSRKY..TSWYVALKRTG (SEQ ID NO. 7)FGF-2 SNNYNTYRS RKY..TS WYVALKRTG ( SEQ ID NO. 7 )

110 115 120 125110 115 120 125

IL-lβNNKLEFESAOF..PNWYISTSQAE (SEO ID NO.8)IL-lβNNKLEFES AOF..PN WYISTSQAE ( SEO ID NO.8 )

¹FGF-1 및 FGF-2 의 넘버링은 155-잔기 형태를 코딩하는 cDNA 에서 연역된 아미노산 잔기 1로부터이고(Seddon et al. Ann.N. Y. Acad. Sci. 638 : 98-108, 1991에 개시), IL-1β의 넘버링은 성숙한 153-잔기 폴리펩티드(id)의 잔기 1로부터이다. ¹ FGF-1 and FGF-2 are from the deduced amino acid residue 1 in the cDNA encoding the 155-residue form (Seddon et al. Ann. NY Acad. Sci. 638: 98-108, 1991) The numbering of IL-l [beta] is from residue 1 of the mature 153-residue polypeptide (id).

FGF-2 의 잔기 Argl18-Lysll9-Tyrl20-Thrl21-Serl22 를 구조 유사체 IL-1β(115-119)의 상응하는 루프로부터의 사람의 서열 Ala-Gln-Phe-Pro-Asn으로 교체하는 것은 본질적으로 하기와 같이 수행되었다:Replacing residues Argl18-Lysll9-Tyrl20-Thrl21-Serl22 of FGF-2 with the human sequence Ala-Gln-Phe-Pro-Asn from the corresponding loops of the structural analog IL-1? (115-119) Was performed as follows:

플라스미드 DNA, pET-3a(M13)을BstB1 및Spl1 분해를 하고, 결과적으로 더 큰 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리했다. DNA 단편을 T₄DNA 리가제를 사용하여 연결하여 2 개의 합성 올리고뉴클레오티드를 어닐링함으로써 이중-가닥 DNA 를 얻었다:BstBl 및Spll 분해로 발생한 것과 양립가능한 말단을 함유하는 5"-CGAACGATTG GAATCTAATA ACTACAATAC GTACCGGTCT GCGCAGTTTC CTAACTGGTA TGTGGCACTTAAGC-3'(SEO ID NO.9) 및 5'GTACGCTTAA GTGCCACATA CCAGTTAGGA AACTGCGCAG ACCGGTACGT ATTGTAGTTA TTAGATTCCA ATCGTT-3' (SEO ID NO. 10). 연결 생성물을 Escherichia coli(균주 DH5α)세포로 전달하는데 사용했다. 바람직한 돌연변이체 플라스미드(FGF-2LI)를 새로이 도입된 Afl2 제한 부위에서(상기에 밑줄) 절단에 대한 감도의 기초로 선택했다.Plasmid DNA, pET-3a (M13) was digested with Bst B1 and Spl1 , and as a result larger DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis. Double-stranded DNA was obtained by annealing two synthetic oligonucleotides by ligating the DNA fragments using T ₄ DNA ligase: 5 " -CGAACGATTG GAATCTAATA ACTACAATAC GTACCGGTCT containing the ends compatible with those resulting from Bst Bl and Spl l digestion GCGCAGTTTC CTAACTGGTA TGTGGCA CTTAAG C-3 '( SEO ID NO.9 ) and 5'GTACG CTTAA G TGCCACATA CCAGTTAGGA AACTGCGCAG ACCGGTACGT ATTGTAGTTA TTAGATTCCA ATCGTT-3' ( SEO ID NO. The preferred mutant plasmid (FGF-2LI) was selected as the basis for sensitivity to cleavage at the newly introduced Afl2 restriction site (underlined above).

신호 펩티드가 존재하는 FGF-2LI 및 부재하는 FGF-2LI를 중합효소 연쇄반응(PCR)-기초 방법을 사용하여 제조했다. FGF-2LI 의 5'에 FGF-4 신호 펩티드를 첨가하고, 신호 펩티드가 FGF-2LI 단백질로부터 절단될 것이라는 것을 보장하기 위해서, 분비 FGF-1 을 얻기 위해서 Forough R.et al 에 의해 사용된 유전자 카세트를 사용했다. FGF-4 신호 펩티드의 5'부분에 일치하는 프라이머(pFlB: 5'-CGGGATCCGC CCATGGCGGG GCCCGGGACG GC-3'(SEQ ID NO.11) 및 FGF-1 의 5'부분에 일치하는 2번째 프라이머(pF2R : 5'-CGGAATTCTG TGAAGGTGGT GATTTCCC3')(SEQ ID NO. 12)를 사용하여, PCR 로 FGF-4 신호 펩티드 서열의 5'말단에서 Bam HI 부위에 이어서 FGF-1 의 첫번째 10개의 아미노산 및 3'말단에서 EcoRI 를 함유하는 DNA 단편을 합성했다. 각각 FGF-2LI 의 5'- 및 3'- 의 서열에 일치하는 다른 한쌍의 프라이머(pF3R : 5'-CGGAATTCAT GGCTGAAGGG GAAATCACC-3' (SEQ ID NO. 13) 및 pF4HA : 5'-GCTCTAGATT AGGCGTAGTC TGGGACGTCG TATGGGTAGC TCTTAGCAGA CATTGGAAGA AAAAG-3'(SEQ ID NO. 14)를 사용하여 5'말단에 EcoR1 및 FGF-2LI 의 3'말단에 인플루엔자 헤모아글루티닌(HA) 태그 및 XbalI 부위를 가지는 2번째 DNA 단편을 얻었다. 이러한 2 개의 단편을 분자 연결에 의해서 BamHI 및 Xbai 부위에서 pcDNA3 벡터로 아클론했다. 신호 서열이 없다는 것을 제외하고는 pSPFGF-2LI/cDNA3 에 유사한 플라스미드 pGFG-2LI/cDNA3 를 유사한 방식으로 아클론했다. 그 다음, 양 플라스미드를 올바르게 삽입되었는지를 확인하기 위해서 시퀀싱했다. 그다음, FGF-2LI 단편을 BamHI 및 Xbai 로 분해하여 pcDNA3 로부터 해리했고, 재조합 바이러스를 제조하기 위해서 셔틀 벡터인 pACCMVpLpASR(+)(약어로 pACSR)에 아클론했다. 재조합 바이러스 및 주사가능한 벡터를 본질적으로 실시예 2에 개시된 대로 제조했다. 실시예 5에 개시된 대로 유전자 전달을 수행했다(대조표준으로 기능하는 lacZ 벡터, 10¹¹내지 10¹²바이러스 입자와 함께 FGF-2LI sp+ 에 대한 8 마리 동물 및 FGF-2LI sp- 에 대한 6 마리 동물을 사용)FGF-2LI in the presence of the signal peptide and absent FGF-2LI were prepared using the polymerase chain reaction (PCR) -based method. To add FGF-4 signal peptide to 5 'of FGF-2LI and to ensure that the signal peptide will be cleaved from FGF-2LI protein, the gene cassette used by Forough R. et al to obtain secretory FGF- . (PFlB: 5'-CGGGATCCGC CCATGGCGGG GCCCGGGACG GC-3 '( SEQ ID NO.11 ) corresponding to the 5' portion of the FGF-4 signal peptide and a second primer (pF2R: The first 10 amino acids of FGF-1 and the 3 ' end of FGF-1 followed by the BamHI site at the 5 ' end of the FGF-4 signal peptide sequence were amplified by PCR using the 5'-CGGAATTCTG TGAAGGTGGT GATTTCCC3 '( SEQ ID NO. (PF3R: 5'-CGGAATTCAT GGCTGAAGGG GAAATCACC-3 '( SEQ ID NO. 13 ) corresponding to the 5'- and 3'- sequences of FGF-2LI, respectively, (HA) tag at the 3 'end of EcoR1 and FGF-2LI at the 5' end using pF4HA: 5'-GCTCTAGATT AGGCGTAGTC TGGGACGTCG TATGGGTAGC TCTTAGCAGA CATTGGAAGA AAAAG-3 ' (SEQ ID NO. And XbaI sites were obtained. These two fragments were ligated to the pcDNA3 vector at the BamHI and Xbai sites by molecular linkage The plasmid pGFG-2LI / cDNA3, similar to pSPFGF-2LI / cDNA3, was cloned in a similar manner except that the signal sequence was absent. The two plasmids were then sequenced to verify correct insertion of both plasmids. The FGF-2LI fragment was digested with BamHI and Xbai and dissociated from pcDNA3 and was cloned into the shuttle vector pACCMVpLpASR (+) (abbreviated as pACSR) in order to prepare the recombinant virus. 2. Gene transfer was performed as described in Example 5 (lacZ vector functioning as a control standard, 8 animals for FGF-2LI sp + with 10 ¹¹ to 10 ¹² viral particles, and FGF-2 LI sp - using 6 animals for the animals)

FGF-2 뮤테인을 사용한 결과Results using FGF-2 mutein

FGF-2LI +sp 와 함께 유전자 전달을 한 2 주 후에, 200 bpm 에서 응력을 조율하는 동안 최대 조영율(LCx/LV)은 예비 유전자 전달과 비교하여 의미있는 개선을 보였다. 도13은 비교를 위하여 lacZ, FGF-5, FGF-2LI+sp, FGF-2LI-sp, 및 FGF-4 를 발현하는 재조합 아데노바이러스의 관상내 유전자 전달을 사용한 결과를 도시한다. 도 13 우측의 검정 막대는 본 발명의 방법을 사용한 정상 혈류를 나타낸다. FGF-2LI +sp 는 본 동물에서 최대 조영율 비를 일반화했다.After two weeks of gene transfer with FGF-2LI + sp, the maximal contrast ratio (LCx / LV) during the adjustment of stress at 200 bpm showed a significant improvement compared to the pre-gene delivery. FIG. 13 shows the results using the intra-coronary gene transfer of recombinant adenovirus expressing lacZ, FGF-5, FGF-2LI + sp, FGF-2LI-sp, and FGF-4 for comparison. The black bars on the right side of FIG. 13 represent normal blood flow using the method of the present invention. FGF-2LI + sp normalized the maximal contrast ratio in this animal.

벽 비후화 백분율 역시 FGF-2LI+sp를 발현하는 재조합 아데노바이러스의 관상내 수송후 2 주동안 개선되었다. 도11은 비교를 위해 lacZ, FGF-5, FGF-2LI+sp, FGF-2LI-sp, 및 FGF-4 를 발현하는 재조합 아데노바이러스의 관상내 유전자 전달을 사용한 결과를 도시한다. 도 11 우측의 검정 막대는 조율-유도 응력전의 정상적인 벽 비후화 백분율을 도시한다. FGF-2LI-sp과 함께 유전자 전달을 한 후에 나타난 어떤 향상이 있었지만, 트랜스젠을 함유하는 신호 펩티드로의 향상이 더욱 우세하다(도 13).The percentage of wall hyperplasia was also improved for 2 weeks after intraductal transfer of recombinant adenovirus expressing FGF-2LI + sp. FIG. 11 shows the results using the in vivo gene transfer of recombinant adenovirus expressing lacZ, FGF-5, FGF-2LI + sp, FGF-2LI-sp, and FGF-4 for comparison. The black bars on the right hand side of FIG. 11 show the normal wall thickening percentage before tuning-induced stress. Although there was some improvement after gene transfer with FGF-2 LI-sp, the enhancement to signal peptide containing transgenes was even more prevalent (Figure 13).

Claims (156)

적어도 하나의 관상동맥 내로 트렌스젠을 포함하는 벡터를 도입하여 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트랜스젠을 환자의 심근에 송달하여 트랜스젠이 심근에 송달되고 발현되어 심장 내 수축 기능이 증가되는 것을 포함하는 환자의 심장내 수축 기능을 증가시키는 방법.The transgene that transgene encodes an angiogenic protein or peptide is introduced into a patient's myocardium by introducing a vector comprising transgen into the at least one coronary artery, whereby the transgene is delivered to the myocardium and expressed to increase the intracardiac contraction function Wherein the intracardiac contraction function of the patient is increased. 제 1 항에 있어서, 벡터는 하나 이상의 관상동맥의 내강 내로 삽입된 카테테르로부터 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the vector is introduced from a catheter inserted into the lumen of one or more coronary arteries. 제 2 항에 있어서, 벡터는 상기 카테테르의 선단으로부터 주사되는 것을 특징으로 하는 방법.3. The method of claim 2, wherein the vector is injected from the tip of the catheter. 제 1 항에 있어서, 벡터의 도입은 혈을 심근으로 공급하는 적어도 두 개의 관상동맥의 내강 내로 벡터를 주사하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the introduction of the vector comprises injecting the vector into the lumen of at least two coronary arteries supplying blood to the myocardium. 제 4 항에 있어서, 벡터는 적어도 하나의 우관상동맥과 적어도 하나의 좌관상동맥 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.5. The method of claim 4, wherein the vector is introduced into at least one right coronary artery and at least one left coronary artery. 제 3 항에 있어서, 벡터는 상기 동맥의 내강 내로 적어도 약 1 cm 삽입된 카테테르로부터의 주사에 의하여 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.4. The method of claim 3, wherein the vector is introduced by injection from a catheter inserted at least about 1 cm into the lumen of the artery. 제 6 항에 있어서, 벡터는 적어도 하나의 우관상동맥과 적어도 하나의 좌관상동맥 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.7. The method of claim 6, wherein the vector is introduced into at least one right coronary artery and at least one left coronary artery. 제 1 항에 있어서, 벡터는 심근에 혈을 공급하는 두렁정맥이식편 및/또는 내유동맥이식편 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the vector is introduced into a bovine vein graft and / or an internal carotid artery graft that supplies blood to the myocardium. 제 1 항에 있어서, 벡터는 심근으로부터 혈을 수용하는 도관 내로 위치된 카테테르로부터 역행성관류에 의하여 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the vector is introduced by retrograde perfusion from a catheter located within the conduit that receives blood from the myocardium. 제 1 항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the vector is a viral vector. 제 10 항에 있어서, 상기 벡터는 복제능결여 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.11. The method of claim 10, wherein the vector is a replication deficient virus. 제 10 항에 있어서, 상기 벡터는 아데노 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.11. The method of claim 10, wherein the vector is an adenovirus vector. 제 12 항에 있어서, 상기 벡터는 복제능결여 아데노 바이러스 벡터인 것을특징으로 하는 방법.13. The method of claim 12, wherein the vector is a replicative lacking adenovirus vector. 제 12 항에 있어서, 약 10⁷내지 10¹³아데노 바이러스 입자가 생체내 송달되는 것을 특징으로 하는 방법.13. The method of claim 12 wherein about 10 &lt; ⁷ &gt; to 10 &lt; ¹³ &gt; adenoviral particles are delivered in vivo. 제 12 항에 있어서, 약 10⁹내지 10¹²아데노 바이러스 입자가 생체내 송달되는 것을 특징으로 하는 방법.13. The method of claim 12 wherein about 10 &lt; ⁹ &gt; to 10 &lt; ¹² &gt; adenoviral particles are delivered in vivo. 제 1 항에 있어서, 상기 트랜스젠의 발현은 벡터에 함유된 CMV 프로모터에 의하여 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the expression of the transgenes is induced by a CMV promoter contained in the vector. 제 1 항에 있어서, 상기 트랜스젠의 발현은 벡터에 함유된 조직-특이적 프로모터에 의하여 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the expression of the transgene is induced by a tissue-specific promoter contained in the vector. 제 17 항에 있어서, 상기 트랜스젠의 발현은 벡터에 함유된 심근세포-특이적 프로모터에 의하여 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.18. The method of claim 17, wherein the expression of the transgene is induced by a cardiomyocyte-specific promoter contained in the vector. 제 18 항에 있어서, 상기 심근세포-특이적 프로모터는 심근세포-특이적 미오신 경쇄 프로모터와 심근세포-특이적 미오신 중쇄로 구성된 군으로부터 선택되는것을 특징으로 하는 방법.19. The method of claim 18, wherein the myocardial cell-specific promoter is selected from the group consisting of myocardial cell-specific myosin light chain promoter and myocardial cell-specific myosin heavy chain. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장인자, 혈관 내피세포 성장인자, 혈소판-유래 성장인자 및 인슐린-유사 성장인자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the angiogenic protein or peptide is selected from the group consisting of fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor, platelet-derived growth factor, and insulin-like growth factor. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장인자인 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the angiogenic protein or peptide is a fibroblast growth factor. 제 21 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 aFGF, bFGF, FGF-4, FGF-5 및 FGF-6로 구성된 군으로부터 선택되는 섬유모세포 성장인자인 것을 특징으로 하는 방법.22. The method of claim 21, wherein the angiogenic protein or peptide is a fibroblast growth factor selected from the group consisting of aFGF, bFGF, FGF-4, FGF-5, and FGF-6. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 혈관 내피세포 성장인자인 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the angiogenic protein or peptide is a vascular endothelial cell growth factor. 제 23 항에 있어서, 상기 혈관 내피세포 성장인자는 VEGF-A, VEGF-B 및 VEGF-C로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.24. The method of claim 23, wherein the vascular endothelial growth factor is selected from the group consisting of VEGF-A, VEGF-B, and VEGF-C. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 인슐린-유사 성장인자인 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the angiogenic protein or peptide is an insulin-like growth factor. 제 25 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 인슐린-유사 성장인자-1인 것을 특징으로 하는 방법.26. The method of claim 25, wherein said angiogenic protein or peptide is insulin-like growth factor-1. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 신호 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the angiogenic protein or peptide comprises a signal peptide. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 혈관형성 폴리펩티드 조절인자인 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the angiogenic protein or peptide is an angiogenic polypeptide modulator. 제 1 항에 있어서, 상기 벡터는 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 제 2의 트랜스젠을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein said vector further comprises a second transgenic protein encoding an angiogenic protein or peptide. 제 1 항에 있어서, 상기 벡터는 적어도 두개의 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트렌스젠(들)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the vector comprises a transgene (s) encoding at least two angiogenic proteins or peptides. 제 30 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장인자, 혈관 내피세포 성장인자, 혈소판-유래 성장인자 및 인슐린-유사 성장인자로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.31. The method of claim 30, wherein the angiogenic protein or peptide is independently selected from the group consisting of fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor, platelet-derived growth factor, and insulin-like growth factor. 제 30 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장인자, 혈관 내피세포 성장인자, 혈소판-유래 성장인자, 인슐린-유사 성장인자, 저산소증-유도인자 및 혈관형성 폴리펩티드 조절인자로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.32. The method of claim 30, wherein the angiogenic protein or peptide is selected from the group consisting of fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor, platelet-derived growth factor, insulin-like growth factor, hypoxia-inducing factor and angiogenic polypeptide modulator Each independently selected. 제 30 항에 있어서, 제 1의 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장인자, 혈관 내피세포 성장인자, 혈소판-유래 성장인자, 저산소증-유도인자, 인슐린-유사 성장인자 및 혈관형성 폴리펩티드 조절인자로 구성된 군으로부터 선택되고 제 2 의 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 상기 군의 다른 구성원으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.31. The method of claim 30, wherein the first angiogenic protein or peptide is selected from the group consisting of a fibroblast growth factor, a vascular endothelial growth factor, a platelet-derived growth factor, a hypoxia-inducing factor, an insulin-like growth factor and an angiogenic polypeptide modulator And wherein said second angiogenic protein or peptide is selected from the other members of said family. 제 30 항에 있어서, 제1의 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장인자이고 제2의 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 혈관 내피세포 성장인자인 것을 특징으로 하는 방법.31. The method of claim 30, wherein the first angiogenic protein or peptide is a fibroblast growth factor and the second angiogenic protein or peptide is a vascular endothelial growth factor. 제 30 항에 있어서, 제1의 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장인자나 혈관 내피세포 성장인자이고 제2의 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 인슐린-유사 성장인자인 것을 특징으로 하는 방법.31. The method of claim 30, wherein the first angiogenic protein or peptide is a fibroblast growth factor or vascular endothelial growth factor and the second angiogenic protein or peptide is an insulin-like growth factor. 제 30 항에 있어서, 상기 벡터는 섬유모세포 성장인자, 혈관 내피세포 성장인자 및 인슐린-유사 성장인자를 코딩하는 트렌스젠(들)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.31. The method of claim 30, wherein said vector comprises a fibroblast growth factor, a vascular endothelial growth factor, and a transgene (s) encoding an insulin-like growth factor. 제 1 항에 있어서, 상기 벡터는 심증강 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트렌스젠을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the vector further comprises a transgene encoding a deep seated protein or peptide. 제 37 항에 있어서, 상기 심증강 단백질 또는 펩티드는 β-아드레날린성 신호 단백질 또는 펩티드 (β-ASP)인 것을 특징으로 하는 방법.37. The method of claim 37, wherein the septal enhancement protein or peptide is a? -Adrenergic signal protein or peptide (?-ASP). 제 37 항에 있어서, 상기 심증강 단백질 또는 펩티드는 근세포의 성장이나 기능을 유도하여 심장 내 수축 기능을 증강시키는 것을 특징으로 하는 방법.38. The method of claim 37, wherein the deep seated protein or peptide induces growth or function of muscle cells to enhance intracardiac contraction. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 심장 내 부행 혈관 발생을 촉진시켜 심장 내 혈류를 증강시키는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the angiogenic protein or peptide enhances intracardiac collateral blood flow to enhance intracardiac blood flow. 제 1 항에 있어서, 상기 벡터를 사용한 트랜스젠의 송달은 심장에 지배적으로 편재되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the delivery of the transgen using the vector is predominantly localized to the heart. 제 1 항에 있어서, 상기 벡터는 지배적으로 심장세포를 트랜스펙션시키는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein said vector predominantly transfects cardiac cells. 제 1 항에 있어서, 상기 트랜스젠의 발현은 심근 내에서 지배적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the expression of the transgene is predominantly in the myocardium. 제 43 항에 있어서, 상기 트랜스젠의 발현은 심근세포 내에서 지배적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.44. The method of claim 43, wherein expression of said transgene is predominantly in cardiac myocytes. 제 1 항에 있어서, 심장에서 벽 비후화 백분율이 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the percentage of wall hyperplasia in the heart is increased. 제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 관상동맥으로 벡터를 도입하는 단계가 혈관활성제를 동맥에 주입하는 것과 동시에 또는 주입한 후에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.45. The method according to any one of claims 1 to 45, wherein the step of introducing the vector into at least one coronary artery is performed after or simultaneously with the infusion of the angiostatic agent into the artery. 제 46 항에 있어서, 상기 혈관활성제가 상기 벡터를 주사하기 적어도 약 2분전에 동맥에 주입되는 것을 특징으로 하는 방법.47. The method of claim 46, wherein the vasoactive agent is injected into the artery at least about two minutes before the vector is injected. 제 46 항에 있어서, 혈관활성제가 히스타민 또는 히스타민 아고니스트 또는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.47. The method of claim 46, wherein the vasoactive agent is histamine or histamine agonist or vascular endothelial growth factor (VEGF) protein. 제 48 항에 있어서, 혈관활성제가 히스타민 또는 히스타민 아고니스트인 것을 특징으로 하는 방법.49. The method of claim 48, wherein the vasoactive agent is histamine or a histamine agonist. 제 49 항에 있어서, 혈관활성제가 약 1 내지 75㎍/ml 농도의 히스타민인 것을 특징으로 하는 방법.50. The method of claim 49, wherein the vasoactive agent is histamine at a concentration of about 1 to 75 mu g / ml. 제 50 항에 있어서, 혈관활성제가 상기 벡터를 주사하기 전 약 3분간 대략 1ml/분의 속도로 동맥에 주입된 약 25㎍/ml 농도의 히스타민인 것을 특징으로 하는 방법.51. The method of claim 50, wherein the vasoactive agent is histamine at a concentration of about 25 占 퐂 / ml injected into the artery at a rate of about 1 ml / min for about 3 minutes prior to injecting the vector. 제 1 항에 있어서, 상기 환자가 심혈관 질환을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the patient has cardiovascular disease. 제 52 항에 있어서, 상기 환자가 아테로마성 동맥경화증을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.53. The method of claim 52, wherein said patient has atherosclerosis. 제 52 항에 있어서, 상기 환자가 심근 허혈을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.53. The method of claim 52, wherein said patient has myocardial ischemia. 제 1 항 내지 제 45 항 또는 제 52 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 사람인 것을 특징으로 하는 방법.54. The method according to any one of claims 1 to 45 or 52 to 54, wherein the patient is a human. 제 55 항에 있어서, 심장내에서 혈류가 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.57. The method of claim 55, wherein blood flow is increased in the heart. 환자의 허혈조직에서 혈류를 증가시키는 방법으로서, 상기 조직에 트랜스젠을 포함하는 벡터를 도입하여 혈관형성단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트랜스젠을 상기 조직의 허혈 영역에 송달하여 이로써 트랜스젠이 조직에서 발현되고 조직에서 혈류가 증가되는 것을 포함하는 환자의 허혈 조직에서 혈류를 증가시키는 방법.A method of increasing blood flow in a patient's ischemic tissue, the method comprising: introducing a vector comprising transgen into the tissue to deliver a transgene encoding an angiogenic protein or peptide to the ischemic area of the tissue, whereby the transgene is expressed in the tissue And increasing blood flow in the tissue. 제 57 항에 있어서, 벡터는 조직으로 혈을 송달하는 도관 내에 위치한 카테테르로부터 선행성 관류에 의하여 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.57. The method of claim 57, wherein the vector is introduced by a peritoneal perfusion from a catheter located within the conduit delivering blood to the tissue. 제 57 항에 있어서, 벡터는 조직으로부터 혈을 수용하는 도관 내로 위치된 카테테르로부터 역행성관류에 의하여 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein the vector is introduced by retrograde perfusion from a catheter positioned within the conduit that receives blood from the tissue. 제 57 항에 있어서, 허혈 조직이 근육 세포를 포함하고, 허혈 조직내에서 증가한 혈류가 증가된 수축 기능을 가져오는 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein the ischemic tissue comprises muscle cells and the increased blood flow within the ischemic tissue results in increased contractile function. 제 60 항에 있어서, 근육 세포가 심근세포인 것을 특징으로 하는 방법.61. The method of claim 60, wherein the muscle cells are cardiac muscle cells. 제 62 항에 있어서, 혈관이 관상동맥 및 대퇴동맥으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.63. The method of claim 62, wherein the blood vessel is selected from the group consisting of a coronary artery and a femoral artery. 제 57 항에 있어서, 벡터가 골격근에 벡터를 포함하는 용액을 주사함에 의해 도입되고, 혈관형성 단백질 또는 펩티드가 이 조직에서 혈류 증가 및 허혈 감소를 야기하는 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein the vector is introduced by injecting a solution comprising a vector into the skeletal muscle, wherein the angiogenic protein or peptide causes increased blood flow and ischemia in the tissue. 제 63 항에 있어서, 상기 용액이 적어도 약 1ml를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.64. The method of claim 63, wherein the solution comprises at least about 1 ml. 제 57 항에 있어서, 환자가 심혈관 질환을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein the patient has cardiovascular disease. 제 65 항에 있어서, 환자가 말초혈관 질환을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.66. The method of claim 65, wherein the patient has peripheral vascular disease. 제 57 항에 있어서, 벡터는 하나 이상의 관상동맥의 내강내로 삽입된 카테테르로부터 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.57. The method of claim 57, wherein the vector is introduced from a catheter inserted into the lumen of one or more coronary arteries. 제 57 항에 있어서, 벡터의 도입이 심근에 혈을 공급하는 적어도 2개 관상동맥의 내강에 벡터를 주사하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein the introduction of the vector comprises injecting a vector into the lumen of at least two coronary arteries supplying blood to the myocardium. 제 68 항에 있어서, 벡터는 적어도 하나의 우관상동맥 및 적어도 하나의 좌관상동맥내로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.69. The method of claim 68, wherein the vector is introduced into at least one right coronary artery and at least one left coronary artery. 제 68 항에 있어서, 벡터는 상기 동맥 내강 내로 적어도 약 1cm 삽입된 카테테르로부터의 주사에 의해 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.69. The method of claim 68, wherein the vector is introduced by injection from a catheter inserted at least about 1 cm into the lumen of the artery. 제 70 항에 있어서, 벡터는 적어도 하나의 우관상동맥 및 적어도 하나의 좌관상동맥 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.71. The method of claim 70, wherein the vector is introduced into at least one right coronary artery and at least one left coronary artery. 제 66 항에 있어서, 벡터는 또한 심근에 혈을 공급하는 두렁정맥 이식편 및/또는 내유동맥이식편 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.67. The method of claim 66, wherein the vector is also introduced into a bovine vein graft and / or an internal mammary artery graft that also supplies blood to the myocardium. 제 57 항에 있어서, 벡터는 심근으로부터 혈을 수용하는 도관 내로 위치된 카테테르로부터 역행성 관류에 의해 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.57. The method of claim 57, wherein the vector is introduced by retrograde perfusion from a catheter located within the conduit that receives blood from the myocardium. 제 57 항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein the vector is a viral vector. 제 74 항에 있어서, 상기 벡터는 복제능-결여 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.75. The method of claim 74, wherein said vector is a replication competent-deficient viral vector. 제 74 항에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.75. The method of claim 74, wherein said vector is an adenovirus vector. 제 76 항에 있어서, 상기 벡터는 복제능-결여 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.78. The method of claim 76, wherein the vector is a replication competent-deficient adenovirus vector. 제 76 항에 있어서, 약 10⁷내지 약 10¹³아데노바이러스 벡터 입자가 생체내 송달되는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 76 wherein from about 10 ⁷ to 10 ¹³ adenovirus vector particles, characterized in that the in vivo delivery. 제 78 항에 있어서, 약 10⁹내지 약 10¹²아데노바이러스 벡터 입자가 생체내 송달되는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 78, wherein about 10 ⁹ to about 10 ¹² adenovirus vector particles, the method characterized in that the in vivo delivery. 제 57 항에 있어서, 상기 트랜스젠의 발현이 벡터에 함유된 CMV 프로모터에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein the expression of said transgen is induced by a CMV promoter contained in a vector. 제 57 항에 있어서, 상기 트랜스젠의 발현이 벡터에 함유된 조직-특이적 프로모터에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein expression of said transgen is induced by a tissue-specific promoter contained in the vector. 제 81 항에 있어서, 상기 트랜스젠의 발현이 벡터에 함유된 심근세포-특이적 프로모터에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.83. The method of claim 81, wherein the expression of the transgene is induced by a cardiomyocyte-specific promoter contained in the vector. 제 82 항에 있어서, 상기 심근세포-특이적 프로모터는 심근세포-특이적 미오신 경쇄 프로모터 및 심근세포-특이적 미오신 중쇄 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.83. The method of claim 82, wherein the myocardial cell-specific promoter is selected from the group consisting of myocardial cell-specific myosin light chain promoter and myocardial cell-specific myosin heavy chain promoter. 제 57 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자 및 인슐린-유사 성장 인자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein the angiogenic protein or peptide is selected from the group consisting of a fibroblast growth factor, a vascular endothelial growth factor, a platelet-derived growth factor, and an insulin-like growth factor. 제 57 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장 인자인 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein the angiogenic protein or peptide is a fibroblast growth factor. 제 85 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 aFGF, bFGF, FGF-4, FGF-5 및 FGF-6으로 구성된 군으로부터 선택된 섬유모세포 성장 인자인 것을 특징으로 하는 방법.83. The method of claim 85, wherein the angiogenic protein or peptide is a fibroblast growth factor selected from the group consisting of aFGF, bFGF, FGF-4, FGF-5, and FGF-6. 제 57 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질은 혈관 내피 성장 인자인 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein the angiogenic protein is a vascular endothelial growth factor. 제 87 항에 있어서, 상기 혈관 내피 성장 인자는 VEGF-A, VEGF-B 및 VEGF-C로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.89. The method of claim 87, wherein the vascular endothelial growth factor is selected from the group consisting of VEGF-A, VEGF-B, and VEGF-C. 제 57 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 인슐린-유사 성장 인자인 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein the angiogenic protein or peptide is an insulin-like growth factor. 제 89 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 인슐린-유사 성장 인자 1인 것을 특징으로 하는 방법.90. The method of claim 89, wherein the angiogenic protein or peptide is insulin-like growth factor 1. &lt; RTI ID = 0.0 &gt; 제 57 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 신호 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein the angiogenic protein or peptide comprises a signal peptide. 제 57 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 혈관형성 폴리펩티드 조절인자인 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein the angiogenic protein or peptide is an angiogenic polypeptide modulator. 제 57 항에 있어서, 상기 벡터는 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 제2의 트랜스젠을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein said vector further comprises a second transgenic protein encoding an angiogenic protein or peptide. 제 57 항에 있어서, 상기 벡터는 적어도 두개의 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트랜스젠(들)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein said vector comprises transgen (s) encoding at least two angiogenic proteins or peptides. 제 94 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자 및 인슐린-유사 성장 인자로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.95. The method of claim 94, wherein the angiogenic protein or peptide is independently selected from the group consisting of a fibroblast growth factor, a vascular endothelial growth factor, a platelet-derived growth factor, and an insulin-like growth factor. 제 94 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 저산소증-유도인자 및 혈관형성 폴리펩티드 조절인자로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.87. The method of claim 94, wherein the angiogenic protein or peptide is selected from the group consisting of a fibroblast growth factor, a vascular endothelial growth factor, a platelet-derived growth factor, an insulin-like growth factor, a hypoxia-inducing factor and an angiogenic polypeptide modulator Lt; / RTI &gt; is independently selected. 제 94 항에 있어서, 제1의 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 저산소증-유도인자, 인슐린-유사 성장 인자 및 혈관형성 폴리펩티드 조절인자로 구성된 군으로부터 선택되고, 제2의 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드는 상기 군의 다른 구성원으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.95. The method of claim 94, wherein said first angiogenic protein or peptide is selected from the group consisting of fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor, platelet-derived growth factor, hypoxia-inducing factor, insulin-like growth factor and angiogenic polypeptide modulator And wherein said second angiogenic protein or peptide is selected from other members of said group. 제 94 항에 있어서, 제1의 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장 인자이고, 제2의 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 혈관 내피 성장 인자인것을 특징으로 하는 방법.95. The method of claim 94, wherein the first angiogenic protein or peptide is a fibroblast growth factor and the second angiogenic protein or peptide is a vascular endothelial growth factor. 제 94 항에 있어서, 제1의 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드가 섬유모세포 성장 인자 또는 혈관 내피세포 성장 인자이고, 제2의 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 인슐린-유사 성장 인자인 것을 특징으로 하는 방법.95. The method of claim 94, wherein the first angiogenic protein or peptide is a fibroblast growth factor or vascular endothelial cell growth factor and the second angiogenic protein or peptide is an insulin-like growth factor. 제 94 항에 있어서, 상기 벡터가 섬유모세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자 및 인슐린-유사 성장 인자를 코딩하는 트랜스젠(들)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.96. The method of claim 94, wherein said vector comprises a transgen (s) encoding a fibroblast growth factor, a vascular endothelial growth factor and an insulin-like growth factor. 제 57 항에 있어서, 상기 벡터는 심증강 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트랜스젠을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.57. The method of claim 57, wherein said vector further comprises a transgene encoding a deep seated protein or peptide. 제 101 항에 있어서, 상기 심증강 단백질 또는 펩티드는 β-아드레날린성 신호 단백질 또는 펩티드(베타-ASP)인 것을 특징으로 하는 방법.101. The method of claim 101, wherein the septal enhancement protein or peptide is a? -Adrenergic signal protein or peptide (beta-ASP). 제 101 항에 있어서, 상기 심장 강화 단백질 또는 펩티드는 근세포의 성장 이나 기능을 유도하여 심장 내 수축 기능을 증강시키는 것을 특징으로 하는 방법.101. The method of claim 101, wherein the cardiac-reinforcing protein or peptide induces growth or function of muscle cells to enhance intracardiac contraction. 제 57 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 심장에서 부행 혈관 발생을 촉진시켜 심장 내 혈류를 증강시키는 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein said angiogenic protein or peptide enhances the blood flow in the heart by promoting the development of the adrenal angiogram in the heart. 제 57 항에 있어서, 상기 벡터를 사용한 트랜스젠의 송달은 심장에 지배적으로 편재되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein the delivery of the transgen using the vector is predominantly localized to the heart. 제 57 항에 있어서, 상기 벡터는 심장세포를 우세하게 트랜스펙션시키는 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein said vector predominantly transfects a cardiac cell. 제 57 항에 있어서, 상기 트랜스젠의 발현이 심근 내에서 지배적으로 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.57. The method of claim 57, wherein the expression of the transgene is predominantly in the myocardium. 제 107 항에 있어서, 상기 트랜스젠의 발현은 심근세포내에서 지배적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.108. The method of claim 107, wherein expression of said transgene is predominantly in cardiac myocytes. 제 57 항에 있어서, 심장에서 벽 비후화 백분율이 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein the percentage of wall hyperplasia in the heart is increased. 제 52 항 내지 제 54 항 또는 제 57 항 내지 제 109 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 관상동맥으로 백터를 도입하는 단계가 혈관활성제를 동맥에 주입하는 것과 동시에 또는 주입한 후에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.109. The method according to any one of claims 52 to 54 or 57 to 109, wherein the step of introducing the vector into at least one coronary artery is performed simultaneously with or after the infusion of the angiostatic agent into the artery Lt; / RTI &gt; 제 110 항에 있어서, 상기 혈관활성제가 상기 벡터를 주사하기 적어도 약 2분전에 동맥에 주입되는 것을 특징으로 하는 방법.112. The method of claim 110, wherein the vasoactive agent is injected into the artery at least about two minutes before the vector is injected. 제 110 항에 있어서, 혈관활성제가 히스타민 또는 히스타민 아고니스트 또는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.112. The method of claim 110, wherein the vasoactive agent is a histamine or histamine agonist or a vascular endothelial growth factor (VEGF) protein. 제 112 항에 있어서, 혈관활성제가 히스타민 또는 히스타민 아고니스트인 것을 특징으로 하는 방법.115. The method of claim 112, wherein the vasoactive agent is histamine or a histamine agonist. 제 113 항에 있어서, 혈관활성제가 약 1 내지 75㎍/ml 농도의 히스타민인 것을 특징으로 하는 방법.114. The method of claim 113, wherein the vasoactive agent is histamine at a concentration of about 1 to 75 mu g / ml. 제 114 항에 있어서, 혈관활성제가 상기 벡터를 주사하기 전 약 3분간 대략 1ml/분의 속도로 동맥에 주입된 약 25㎍/ml 농도의 히스타민인 것을 특징으로 하는 방법.114. The method of claim 114, wherein the vasoactive agent is histamine at a concentration of about 25 占 퐂 / ml injected into the artery at a rate of about 1 ml / min for about 3 minutes prior to injecting the vector. 제 57 항에 있어서, 상기 환자가 심혈관 질환을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.58. The method of claim 57, wherein said patient has cardiovascular disease. 제 116 항에 있어서, 상기 환자가 아테로마성 동맥경화증을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.116. The method of claim 116, wherein the patient has atherosclerosis. 제 116 항에 있어서, 상기 환자가 심근 허혈을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.116. The method of claim 116, wherein the patient has myocardial ischemia. 제 57 항 내지 제 109 항 또는 제 116 항 내지 제 118 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 사람인 것을 특징으로 하는 방법.118. The method according to any one of claims 57 to 109 or 116 to 118, wherein said patient is a human. 제 119 항에 있어서, 조직내의 수축 기능이 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.120. The method of claim 119, wherein the contraction function in the tissue is increased. 혈관형성단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트랜스젠을 함유하는 벡터를 포함하는 유전자 요법 조성물.A gene therapy composition comprising a vector containing an angiogenic protein or a transgene encoding a peptide. 제 121 항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.126. The composition of claim 121, wherein said vector is a viral vector. 제 122 항에 있어서, 상기 벡터는 복제능-결여 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.123. The composition of claim 122, wherein said vector is a replication competent-defective viral vector. 제 122 항에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.123. The composition of claim 122, wherein the vector is an adenoviral vector. 제 124 항에 있어서, 상기 벡터는 복제능-결여 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.124. The composition of claim 124, wherein the vector is a replication competent-deficient adenovirus vector. 제 124 항에 있어서, 약 10⁷내지 약 10¹³아데노바이러스 벡터 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.123. The composition of claim 124, comprising about 10 ⁷ to about 10 ¹³ adenoviral vector particles. 제 126 항에 있어서, 약 10⁹내지 약 10¹²아데노바이러스 벡터 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.126. The composition of claim 126 comprising about 10 &lt; ⁹ &gt; to about 10 &lt; ¹² &gt; adenoviral vector particles. 제 121 항에 있어서, 상기 트랜스젠의 발현은 벡터에 함유된 CMV 프로모터에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 조성물.121. The composition of claim 121, wherein expression of said transgen is induced by a CMV promoter contained in a vector. 제 121 항에 있어서, 상기 트랜스젠의 발현은 벡터에 함유된 조직-특이적 프로모터에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 조성물.123. The composition of claim 121, wherein the expression of the transgen is induced by a tissue-specific promoter contained in the vector. 제 129 항에 있어서, 상기 트랜스젠의 발현은 벡터에 함유된 심근세포-특이적 프로모터에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 조성물.129. The composition of claim 129, wherein expression of said transgene is induced by a cardiomyocyte-specific promoter contained in a vector. 제 130 항에 있어서, 상기 심근세포-특이적 프로모터는 심근세포-특이적 미오신 경쇄 프로모터 및 미오신 중쇄 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.132. The composition of claim 130, wherein the myocardial cell-specific promoter is selected from the group consisting of myocardial cell-specific myosin light chain promoter and myosin heavy chain promoter. 제 121 항에 있어서, 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자 및 인슐린-유사 성장 인자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.121. The composition of claim 121, wherein said angiogenic protein or peptide is selected from the group consisting of fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor, platelet-derived growth factor, and insulin-like growth factor. 제 121 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장 인자인 것을 특징으로 하는 조성물.121. The composition of claim 121, wherein the angiogenic protein or peptide is a fibroblast growth factor. 제 133 항에 있어서, 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드는 aFGF, bFGF, FGF-4, FGF-5 및 FGF-6으로 구성된 군으로부터 선택된 섬유모세포 성자 인자인 것을 특징으로 하는 조성물.133. The composition of claim 133, wherein the angiogenic protein or peptide is a fibroblast progenitor selected from the group consisting of aFGF, bFGF, FGF-4, FGF-5 and FGF-6. 제 121 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질이 혈관 내피 성장 인자인 것을 특징으로 하는 조성물.121. The composition of claim 121, wherein the angiogenic protein is a vascular endothelial growth factor. 제 135 항에 있어서, 상기 혈관 내피 성장 인자가 VEGF-A, VEGF-B 및 VEGF-C로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.136. The composition of claim 135, wherein the vascular endothelial growth factor is selected from the group consisting of VEGF-A, VEGF-B, and VEGF-C. 제 121 항에 있어서, 상기 혈관형성 단백질 또는 펩티드는 인슐린-유사 성장 인자인 것을 특징으로 하는 조성물.121. The composition of claim 121, wherein the angiogenic protein or peptide is an insulin-like growth factor. 제 137 항에 있어서, 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드는 인슐린-유사 성장 인자 1인 것을 특징으로 하는 조성물.137. The composition of claim 137, wherein said angiogenic protein or peptide is insulin-like growth factor 1. &lt; Desc / 제 121 항에 있어서, 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드는 신호 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.121. The composition of claim 121, wherein the angiogenic protein or peptide comprises a signal peptide. 제 121 항에 있어서, 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드는 혈관형성 폴리펩티드 조절인자인 것을 특징으로 하는 조성물.126. The composition of claim 121, wherein the angiogenic protein or peptide is an angiogenic polypeptide modulator. 제 121 항에 있어서, 상기 벡터는 혈관형성단백질 또는 펩티드를 코딩하는 제2의 트랜스젠을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.121. The composition of claim 121, wherein the vector further comprises a second transgeneprinting angiogenic protein or peptide. 제 121 항에 있어서, 상기 벡터는 적어도 두개의 혈관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트랜스젠(들)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.124. The composition of claim 121, wherein said vector comprises transgen (s) encoding at least two angiogenic proteins or peptides. 제 142 항에 있어서, 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자 및 인슐린-유사 성장 인자로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.143. The composition of claim 142, wherein said angiogenic protein or peptide is independently selected from the group consisting of fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor, platelet-derived growth factor, and insulin-like growth factor. 제 142 항에 있어서, 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 저산소증-유도인자 및 혈관형성 폴리펩티드 조절인자로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.142. The method of claim 142, wherein said angiogenic protein or peptide is selected from the group consisting of fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor, platelet-derived growth factor, insulin-like growth factor, hypoxia-inducing factor and angiogenic polypeptide modulator Lt; / RTI &gt; is independently selected. 제 142 항에 있어서, 제1의 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 저산소증-유도성 인자, 인슐린-유사 성장 인자 및 혈관형성 폴리펩티드 조절인자로 구성된 군으로부터 선택되고, 제2의 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드는 상기 군의 다른 구성원으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.142. The method of claim 142, wherein the first angiogenic protein or peptide is selected from the group consisting of a fibroblast growth factor, a vascular endothelial growth factor, a platelet-derived growth factor, a hypoxia-inducible factor, an insulin-like growth factor and an angiogenic polypeptide modulator And wherein said second angiogenic protein or peptide is selected from other members of said group. 제 142 항에 있어서, 제1의 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드가 섬유모세포 성장 인자이고, 제2의 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드는 혈관 내피 성장 인자인 것을 특징으로 하는 조성물.143. The composition of claim 142, wherein said first angiogenic protein or peptide is a fibroblast growth factor and said second angiogenic protein or peptide is a vascular endothelial growth factor. 제 142 항에 있어서, 제1의 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드는 섬유모세포 성장 인자 또는 혈관 내피 성장 인자이고, 제2의 상기 혈관형성단백질 또는 펩티드는 인슐린-유사 성장 인자인 것을 특징으로 하는 조성물.142. The composition of claim 142, wherein the first angiogenic protein or peptide is a fibroblast growth factor or vascular endothelial growth factor and the second angiogenic protein or peptide is an insulin-like growth factor. 제 142 항에 있어서, 상기 벡터는 섬유모세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자 및 인슐린-유사 성장 인자를 코딩하는 트랜스젠(들)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.143. The composition of claim 142, wherein the vector comprises a transgene (s) encoding a fibroblast growth factor, a vascular endothelial growth factor and an insulin-like growth factor. 제 121 항에 있어서, 상기 벡터가 심증강 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트랜스젠을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.121. The composition of claim 121, wherein said vector further comprises a transgene encoding a deep seated protein or peptide. 제 149 항에 있어서, 상기 심증강 단백질 또는 펩티드는 β-아드레날린성 신호 단백질 또는 펩티드(β-ASP)인 것을 특징으로 하는 조성물.149. The composition of claim 149, wherein the septal enhancement protein or peptide is a? -Adrenergic signal protein or peptide (?-ASP). 제 121 항에 있어서, 약학적 부형제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.118. The composition of claim 121, further comprising a pharmaceutical excipient. 제 121 항 내지 제 151 항 중 어느 한 항에 따르는 유전자 요법 조성물을 포함하는 키트.151. A kit comprising a gene therapy composition according to any one of claims &lt; RTI ID = 0.0 &gt; 121 &lt; / RTI &gt; 제 152 항에 있어서, 생체내 혈관 또는 조직 내로 조성물을 도입하기 위한 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.153. The kit of claim 152, further comprising an apparatus for introducing the composition into a blood vessel or tissue in vivo. 제 153 항에 있어서, 장치가 카테테르인 것을 특징으로 하는 키트.153. The kit of claim 153, wherein the device is a catheter. 제 152 항에 있어서, 혈관활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.153. The kit of claim 152, further comprising a vasoactive agent. 제 155 항에 있어서, 혈관활성제는 히스타민인 것을 특징으로 하는 키트.155. The kit of claim 155, wherein the vasoactive agent is histamine.