KR20020042333A - 프로테아제 억제 활성을 갖는 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다음 일반구조식 (I)을 갖는 화합물의 프로테아제 억제자로서의 용도 및 이를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

프로테아제 억제 활성을 갖는 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition having inhibition activity of proteases}

본 발명은 다음 일반구조식 (I)의 화합물의 프로테아제 억제제로서의 용도 및 이를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

(I)

스트렙토마이세스 니그레센스(Streptomyces nigrescens) WT-27의 배양여과물로부터 섭틸리신(subtilisin)에 대하여 유효한 억제작용을 가지는 펩티드성 프로테아제 억제자가 최초로 분리되었다(Murao, S. and T. Watanabe. 1977. Novel microbial alkaline protease inhibitor, MAPI, produced byStreptomycessp. No. WT-27.Agric. Biol. Chem. 41:1313-1314; Murao, S. and T. Watanabe. 1978. Isolation and identification of microorganism, producing microbial alkaline proteinase inhibitor (MAPI).Agric. Biol. Chem. 42:2209-2215.). 마피(MAPI)는 세 화합물의 혼합물(각각 α-, β- 및 γ-MAPI로 명명됨.)로서 확인되었으며, 이 들 세 화합물은 동일한 억제 스펙트럼을 보이지만 서로 다른 억제능을 나타낸다(Watanabe, T. and S. Murao. 1979. Purification and characterization of crystalline microbial alkaline proteinase inhibitors (MAPI), produced byStreptomyces nigrescensWT-27.Agric. Biol. Chem. 43:243-250.). α-와 β-마피는 C-말단 페닐알라닌 영역에서 구성이 다른 광학 이성체로서 밝혀졌다(Shin-Watanabe, T., K. Fukuhara, and S. Murao. 1982. The structure of β-MAPI, a novel proteinase inhibitor.Tetrahedron 38:1775-1780; Watanabe, T., K. Fukuhara, and S.Murao. 1979. Structural elucidation of alpha-MAPI, a novel microbial alkaline proteinase inhibitor produced byStreptomyces nigrescensWT-27.Tetrahedron Lett.625-628.)

최근, 스트렙토마이세스 균주 GE16457로부터 분리된 α-마피가 HIV-1 아스파틱 프로테아제를 억제한다는 보고가 있었다(Stella, S., G. Saddler, E. Sarubbi, L. Colombo, S. Stefanelli, M. Denaro, and E. Selva. 1991. Isolation of α-MAPI from fermentation broths during a screening program for HIV-1 protease inhibitors.J. Antibiot. 44:1019-1022.).

α-마피는 쥐의 태아(embryo)의 성장에서(Ichikawa, S., T. Shibata, Y. Takehara, H. Tamada, K. Oda, and S. Murao. 1985. Effects of proteinase inhibitors on preimplantation embryos in the rat.J. Reprod. Fertil.73:385-390.) 그리고 햄스터 난소의 배란에서(Ichikawa, S., H. Morioka, M. Ohta, K. Oda, and S. Murao. 1983. Effect of various proteinase inhibitors on ovulation of explanted hamster ovaries.J. Reprod. Fertil. 68:407-412.) 세포내 키모트립신-유사 프로테아제 및 시스테인 프로테아제의 역할을 연구하는 데 사용되어왔다. α-마피는 선택적으로 착체(complex) 형성을 통하여 멤브레인 결합 세린 프로테아제의 단백질 분해 활성을 억제함으로써 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)의 포자형성을 억제하는 것으로 알려진다(Shimizu, Y., T. Nishino, and S. Murao. 1984. Inhibition of sporulation ofBacillus subtilisby MAPI, a serineprotease inhibitor, and interaction of MAPI with membrane bound protease.Agric. Biol. Chem. 48:365-372.).

세린과 시스테인에 대한 특이적 억제자로서, 마피의 억제 활성은 동력학적(kinetic) 분석이 이루어지지 않았기에 본 발명은 최초로 대표적인 세린과 시스테인 프로테아제로서 키모트립신, 프로티나제 K, 카텝신 B, 및 파파인에 대한 마피의 억제활성의 동력학적 측정결과를 보고하는 것이다. 더욱이, 본 발명은 억제메카니즘에 대한 1차적인 연구로서 마피와 프로테아제의 상호작용을 기술한다.

생성 균주들에서 마피의 세부적인 기능에 관하여는 거의 알려져 있지 않지만 마피를 불활성화하는 인자가 또한 본 발명에 의해 제시되며 마피의 기능을 해명하는 데 유용할 것으로 기대된다.

따라서 본 발명의 목적은 상기 일반구조식 (I)을 갖는 마피의 프로테아제 억제자로서의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 일반구조식 (I)을 갖는 화합물, 마피를 유효성분으로 함유하는 프로테아제 억제활성을 갖는 신규 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 스트렙토마이세스 크로모푸스쿠스(Streptomyces chromofuscus) SMF28를 배양시 생물량(biomass), 글루코스와 암모니움 이온의 농도, 그리고 억제활성의 변화를 나타낸다.

도 2는 본 발명의 프로테아제 억제자(MAPI)의 질량스펙트럼 분절 패턴과 트립신에 의한 절단 위치(화살표)를 보여준다.

도 3a는 카텝신 B에 대한 마피의 억제활성을 나타내는 그라프이다.

도 3b는 키모트립신에 대한 마피의 억제활성을 나타내는 그라프이다.

도 3c는 프로티나제 K에 대한 마피의 억제활성을 나타내는 그라프이다.

도 4는 키모트립신, 엘라스타제 및 트립신과 배양시 마피의 잔류 억제 활성을 나타내는 그라프이다.

본 발명자들은, 스트렙토마이세스 크로모푸스쿠스(Streptomyces chromofuscus)SMF28의 배양 브로쓰(broth)로부터 미생물성 알칼리성 프로테아제 억제자인, MAPI를 분리하였다. 키모트립신과 프로테아제 K와 같은 대표적인 세린 프로테아제에 대한 MAPI의 Ki값은 각각 0.28과 0.63μM이었으며, 카텝신(cathepsin) B 및 파파인과 같은 시스테인 프로테아제에 대하여서는 MAPI의 Ki값은 각각 0.66과 0.28μM이었다. MAPI에 의한 세가지 프로테아제의 억제효과에 대한 진행곡선(progress curve)은 다음과 같은 특징적인 패턴을 보여주었다: MAPI는 카텝신 B와 느린-결합(slow-binding) 억제를 보였으며, MAPI는 기질의 첨가전에는 키모트립신과 빠르게 결합(association)하는 반면, 기질 존재하 MAPI-억제된 효소의 재활성화가 관찰되었고, 한편 MAPI-프로티나제 K 상호작용은 전통적인 억제자들의 행태와 같이 전형적이었다. 트립신과 함께 MAPI를 배양하였을 때, 66.5%의 마피 불활성화에 상응하는 마피의 억제 활성의 상당한 감소를 보였는데 이는 트립신-유사 프로테아제가 배양중에 억제활성의 감소에 있어서 중요한 역할을 할 것이라는 것을 나타낸다.

이하 실시예 및 실험예를 참조하여 본 발명의 상세히 설명한다.

재료 및 방법

미생물

이 연구에서는 토양으로부터 분리한 스트렙토마이세스 크로모푸스쿠스 (Streptomyces chromofuscus) SMF28을 사용하여 마피를 생산하였다(Lee, H. S., I.S. Kim, H. T. Kim, S. J. Yoon, and K. J. Lee. 1995. Isolation and identification ofStreptomyces chromofuscusproducing cathepsin B inhibitor.Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 23:565-572.). 이 균주는 매달 사면배양 보존배양배지에서 계대하였으며, 4℃에서 보존하였다.

배지 및 배양 조건

보존배양 배지는 1% 글루코스, 2% 용성 전분, 0.5% 효모추출물, 0.5% NZ-아민 A형(YTT), 0.1% CaCO₃, 그리고 1.8% 아가로 구성된다. 종균배양 배지는 3% 글루코스, 2% 효모추출물, 그리고 0.1% CaCO₃로 구성되었다. 주 배양배지는 3% 글루코스, 2% 카시톤, 0.01% KH₂PO₄, 0.034% K₂HPO₄, 0.03% NaCl, 0.03% MgSO₄-7H₂O, 0.001% ZnCl₂, 0.003% MnCl₂-4H₂O, 0.001% CaCl₂-2H₂O, 0.001% FeSO₄-7H₂O 그리고 0.001% CuSO₄-7H₂O로 구성되었다. 배양사면(slope)으로부터 포자 한 루프를 500ml 배플(baffled) 플라스크에 담긴 종균배양 배지 100ml에 접종하고, 회전진탕배양기에서 150rpm의 속도로 30℃에서 48시간 배양하였다. 5%(v/v) 농도의 종균배양물을 5리터 jar 발효기(Korea Fermentor Co., Korea)에 담긴 주 배지 3리터에 접종하였다. 온도를 30℃로 유지하고 1N HCl 또는 1N NaOH를 자동으로 첨가하여 배양 pH를 7.0으로 유지하였다. 교반(agitation)과 폭기(aeration)는 각각 300rpm과 0.5vvm으로 고정하였다.

장치분석

억제 동력학은 UV-160(Shimadzu, Japan) UV/VIS 스펙트로포토메터를 이용하여 수행하였다. 질량 스펙트럼은 JMS AX505WA (Jeol, Japan) 스펙트로메터(Inter-University Center for Natural Science Research Facilities, Seoul, Korea)를 이용하여 얻었다.¹H-NMR 스펙트럼은 AMX500(Bruker, Cermany) FT NMR 스펙트로스코프(Inter-University Center for Natural Science Research Facilities, Seoul, Korea)를 이용하여 환경기온에서 용매로서 CD₃OD를 이용하여 측정하였다.

성장 분석과 글루코스 및 암모니움 이온 농도의 결정

침지 배양물의 마이셀리아를 진공여과(GF/C filter paper, Whatman International Ltd., U.K.)하여 수집하고 80℃에서 24시간 건조한 다음 건조중량을 측정하였다. 글루코스의 농도는 디니트로살리실산 방법으로 측정하였다(Miller, G. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.Anal. Chem. 31:426-428.). 암모니움 이온의 농도는 특정 이온 분석기(Model EA940, Orion Research, U.S.A.)로 결정하였다.

효소 검정(Enzyme Assays)

배양과 억제자 정제중에, 억제자의 양은 카텝신 B에 대한 억제활성으로부터 평가하였다. 카텝신 B 활성은 바렛(Barret) 방법으로 기질로서 N-α-벤조일-_DL-아르기닌-2-나프틸아마이드를 이용하여 검정하였다(Barrett, A. J. 1972. A new assay for cathepsin B1 and other thiol proteinases.Anal. Biochem. 47:280-293; Barrett, A. J. 1976. An improved color reagent for use in Barrett's assay of cathepsin B.Anal. Biochem. 76:374-376.). 카텝신 0.5단위량을 다음 반응 혼합물에 사용하였다.(카텝신 활성의 1단위량은 37℃에서 1분당 기질로부터 1nmole의 2-나프틸아민을 방출하는 것으로 정의한다.). 억제자 10μl를, 1.33 mM EDTA / 2 mM 시스테인을 함유하는 0.1 M 소디움 포스페이트 완충액(pH 6.0)에서 10분간 전배양한 다음, 3.64mM 기질을 40 μl를 가하여 반응을 시작하였다. 20분간 더 배양한 후, 생성된 2-나프틸아민을 mercurial and detergent Tween 20 존재하 10 mM Fast Garnet GBC 디아조니움염 100 μl와 결합반응을 하도록 하고, 그 결과로 생긴 아조 염료의 흡수도(absorbance)를 540nm에서 측정하였다. 카텝신 B 억제자의 활성을 다음 관계식으로 평가하였다 :

% inhibition = 100(A-B)/A

A는 억제자 없이 효소활성을 나타내며, B는 억제자가 있을 때 효소활성을 나타낸다. 억제자 1단위는 카텝신 B 1 단위를 50% 억제하는 데 요구되는 억제자의 량으로 정의하였다.

프로테아제에 의한 억제자의 불활성화에 대한 실험에서, 완충액중에서 트립신(26.7 μM) 또는 엘라스타제(121.8 μM)를 30℃에서 23시간동안 최종 부피300μl로 하여 배양하였다. 키모트립신(4μl)을 억제자와 함께 18시간 배양하였다. 각 프로테아제를 100℃에서 5분간 가열하여 불활성화시켜서 대조군으로 사용하였다. 반응을 100℃에서 5분간 열을 가하여 중지시킨 후 잔류 억제활성을 카텝신 B에 대하여 검정하였다. 카텝신 B 활성은 동력학 분석에서 사용한 방법과 같은 방법을 사용하여 측정하였다. 기질의 최종농도는 0.5 mM이었다.

동력학 분석

억제자 동력학 연구를 위하여, 카텝신 B(소의 비장(bovine spleen)), 파파인(파파야 라텍스), 트립신(소의 췌장), 엘라스타제(돼지 췌장), 키모트립신(소의 췌장) 및 프로티나제 K(Promega, Co., U.S.A)를 포함하는 다양한 프로테아제의 아미다제 활성의 초기(initial) 속도를 다양한 아미노아실p-니트로아닐리드 기질을 사용하는 연속 스펙트로포토메트리 검정법에 의해 결정하였다. 기질로부터 방출되는p-니트로아닐린을 기록계가 장치된 스펙트로포토메터에서 30℃ 400nm에서 감시하였다. 이 기질에 대한 흡수계수는 10500 M^-1cm^-1로 나타났다. 각 프로테아제를 다음 완충액에 용해시켜 약 0.01-0.3 μM의 농도로 가하였다. :

트립신, 엘라스타제, 프로티나제 K 및 키모트립신(0.05 M CaCl₂포함)은 0.1M Tris-HCl 완충액(pH 7.5);

카텝신 B(2mM 시스테인 포함) 및 파파인(5mM 시스테인 포함)은 1.33mM EDTA를 포함하는 0.1 M 소디움 포스페이트 완충액(pH 6.0).

억제자들은 10분간 효소와 함께 전배양한 후 최종농도 0.1-0.5 mM이 되도록 기질을 가하여 반응을 시작하게 하였다. Lineweaver-Burk plots로부터 Ki 값을 결정하였다(Lineweaver, H. and D. Burk. 1934. The determination of enzyme dissociation constants.J. Am. Chem. Soc. 56:658-666.).

억제자의 일과성(전-안정) 상태의 동력학을 위하여 완충액에서 10분간 전-활성화시킨 효소에 억제자와 기질을 가하여 반응을 개시시켰다. 400 nm에서p-니트로아닐린의 방출을 감시하여 스펙트로포토메트리방식으로 반응의 진행을 감시하였다. 500에서 800 (흡수도, 시간)값으로 반응곡선을 구성하였다. 흡수도 강도로부터 반응중 효소활성의 변화를 계산하였다.

결과 및 고찰

마피의 생성

스트렙토마이세스 크로모푸스쿠스(Streptomyces chromofuscus) SMF28를 30℃에서 5리터 jar 발효기 내의 4리터 배치에서 성장시켰다. 생물량(biomass), 글루코스와 암모니움 이온의 농도, 그리고 억제활성의 변화를 도 1에 나타낸다(이때, 배양은 30℃에서 300 rpm으로 교반하며, pH를 7.0으로 유지하며 3.0리터 용량으로 수행하였다. 폭기(aeration)는 0.5vvm의 비율로 유지하였다. 도면의 그라프에서 ●는 생물량, ○는 마피, △는 암모니움 이온, 그리고 ▲는 글루코스의 변화량값을 나타낸다.). 억제활성은 대수증식기중 빠른 속도로 증가하여 배양시간 43시간에 최대값을 나타낸 다음, 그후 급격히 감소하였다. 마피 생성은 균사(mycelium) 성장과 밀접하게 관련이 있는 것으로 보인다. 글루코스의 농도는 대수증식기 동안에 급격히 감소하였고 암모니움 이온의 농도는 정지기중에 급격히 증가하였다.

마피의 정제

배양 브로쓰(broth: 12리터)를 GF/C 여과지(Whatman International Ltd., U.K.)로 여과하여 균사를 제거하였다. 그렇게 얻은 여액을 NMWL 3000(Millipore Co., U.S.A.) 한외여과막을 이용하여 여과하였다. 여액을 Amberlite XAD-7 수지에 흡수시켰다. 칼럼을 증류수로 세척하고 활성물질을 80% 메탄올로 용출시켰다. 활성분획을 농축하여 Amberlite IRC-50(H⁺형) 칼럼에 적용하였다. 활성분획을 0.04 N HCl을 함유하는 80% 메탄올로 용출시키고 농축건조하여 노란 시럽을 얻었다. 조제(Preparative) HPLC를 이용하여 추가의 정제를 수행하였다. JAIGEL-GS310 칼럼(20x500mm; JAI Co., Ltd., Japan)에서 5ml/분의 유속으로 이동상으로서 40% 메탄올을 사용하여 42-56분동안 다른 피이크로부터 활성 피이크 물질을 분리하였다. 활성분획을 역상 Hypersil H5MOS 칼럼(10x250mm, Hichrom Co., U.K.)에서 2.5ml/분의 유속으로 소디움 포스페이트 완충액(0.02M, pH 6.0)중에서 아세토니트린(24에서 30%) 선형 농도구배에 의해 더 정제하였다. 정제된 억제자를 동결건조하여 프로테아제와의 상호작용에 대한 다음 연구에 사용하였다.

마피의 동정

정제된 억제자는 저-해상도 FAB-MS 분석의 결과 마피 군의 하나로 밝혀졌다(도 2). 분절 양상은 HIV-1 프로테아제 억제자에 대한 스크리닝 프로그람시의 스트렙토마이세스의 발효 브로쓰로부터 분리한 마피의 것과 유사하였다(Stella, S., G. Saddler, E. Sarubbi, L. Colombo, S. Stefanelli, M. Denaro, and E. Selva. 1991. Isolation of α-MAPI from fermentation broths during a screening program for HIV-1 protease inhibitors.J. Antibiot. 44:1019-1022.). CD₃OD에서의¹H NMR 스펙트럼은 마피로 가정된 구조에 대한 모든 프로톤 시그날을 분해해냈다. 그 구조는 다음 일반구조식 (I)로 나타내진다.

(I)

프로테아제에 대한 억제 활성의 동력학적 측정

표 1에, 여러 유형의 프로테아제에 대한 정제된 마피의 억제활성을 비교하였다.

표 1.Inhibition of various proteases by MAPI.

Protease	Substrate	Ki(μM)
Chymotrypsin	Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA	0.28
Proteinase K	Suc-Ala-Ala-Ala-pNA	0.63
Cathepsin B	Z-Arg-Arg-pNA	0.66
Papain	Z-Phe-Arg-pNA	0.28
Trypsin	Z-Phe-Arg-pNA	NI
Elastase	Suc-Ala-Ala-Ala-pNA	NI

Suc; succinyl, pNA;p-nitroanilide, Z; benzyloxycarbonyl.

NI: no inhibition.

키모트립신과 프로티나제 K에 대한 초기 Ki 값은 각각, 0.28과 0.63μM이고, 카텝신 B와 파파인에 대한 초기 Ki값은 0.66과 0.28μM으로서 우수한 억제활성을 보였다. 이 실험에서, 마피는 전에 연구한 바와 마찬가지로 트립신과 엘라스타제에 대하여 억제활성을 갖지 않았다(Watanabe, T. and S. Murao. 1979. Purification and characterization of crystalline microbial alkaline proteinase inhibitors (MAPI), produced byStreptomyces nigrescensWT-27.Agric. Biol. Chem. 43:243-250.).

마피에 의한 프로테아제 억제에 대한 시간에 따른 추이

마피에 의한 프로테아제 억제 활성에 대한 결과를 도 3a 내지 3c에 나타냈다. 도면중, 반응은 마피가 있는 경우(■), 없는 경우(○)에 대하여 매 30초마다 측정하였다. 마피가 있는 경우(---) 또는 마피가 없는 경우(-)에 대한 프로테아제 활성의 비율로써 상대적 억제활성(…)을 계산하였다. 마피는 각각 386nM(A), 96.5nM(B) 및 193nM(C)의 양으로 첨가하였다.

마피는 카텝신 B와 마피를 함유하는 혼합물에 기질을 가하고 측정한 진행곡선에서 카텝신 B 활성의 느린-결합 억제를 보였다(도 3a). 기질 가수분해율은 초기비율로부터 훨씬 느린 정지기 비율로 감소하였으며, 그러므로 억제활성은 일정한 값이 될 때까지 증가하였다. 느린-결합 억제자들은 다양한 효소들에 대하여 확인되는 바, 예를 들면, 키모트립신과 카텝신 G의 키모스타틴 억제(Stein, R. L. and A. M. Strimpler. 1987. Slow-binding inhibition of chymotrypsin and cathepsin G by the peptide aldehyde chymostatin.Biochemistry 26:2611-2615.), 카텝신 B의 류펩틴 억제(Baici, A. and M. Gyger-Marazzi. 1982. The slow, tight-binding inhibition of cathepsin B by leupeptin. A hysteretic effect.Eur. J. Biochem. 129:33-41.), 프로필 카르복시펩티다제의 Z-프롤리닐프롤리날 억제(Bakker, A. V., S. Jung, R. W. Spencer, F. J. Vinick, and W. S. Faraci. 1990. Slow tight-binding inhibition of prolyl endopeptidase by benzyloxycarbonyl-prolyl- prolinal.Biochem. J. 271:559-562.), 그리고 소 수정체(bovine lens) 류신 아미노펩티다제의 베스타틴 억제(Taylor, A., C. Z. Peltier, F. J. Torre, and N. Hakamian. 1993. Inhibition of bovine lens leucine aminopeptidase by bestatin: number of binding sites and slow binding of this inhibitor.Biochemistry 32:784-790.)가 있다.

마피는 기질의 첨가 전에 키모트립신과 신속히 결합한다. 기질 존해하에서는, 이 효소-마피 복합체는 부분적으로 해리되고 점진적인 효소 활성의 증가를 보인다.(도 3b) 억제활성은 초기값 79.3%로부터 최종값 45.5%로 감소하였다. 기질에 의한마피-억제 효소의 재활성화는 또한 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)에서 멤브레인 결합 프로테아제와 마피에 대한 상호결합 실험으로 조사하였다(Shimizu, Y., T. Nishino, and S. Murao. 1984. Inhibition of sporulation ofBacillus subtilisby MAPI, a serine protease inhibitor, and interaction of MAPI with membrane bound protease.Agric. Biol. Chem. 48:365-372.). 억제자-효소 복합체의 재활성화의 정도는 기질마다 다른 것으로 여겨진다고 보고되어 있다.

프로티나제 K의 경우, 기질 가수분해의 비율 변화는 더 1차함수적이고(linear) 억제자가 있거나 없거나 유사하였다.(도 3c) Lineweaver-Burk plot 는 가수분해의 역방향 비율(reciprocal rate)의 축선상에 교차점(intersection)이며, 이것은 경쟁적 억제의 특징이다.

프로테아제에 의한 마피의 불활성화

도 1에 나타낸 바와 같이, 억제 활성은 최대값 이후 점차 감소한다. 두 류신의 카르복실기 부분에서 분절함으로써 류펩틴의 불활성화에 관련되는 류펩틴-불활성화 효소와 같이 마피의 불활성화에 프로테아제가 관계되어 있는 것으로 생각되었다(Kim, I. S. and K. J. Lee. 1995. Regulation of production of leupeptin, leupeptin-inactivating enzyme, and trypsin-like protease inStreptomyces exfoliatusSMF13.J. Ferment. Bioeng. 80:434-439; Kim, I. S., Y. B. Kim, and K. J. Lee. 1998. Characterization of the leupeptin-inactivating enzyme fromStreptomyces exfoliatusSMF13 which producesleupeptin.Biochem. J. 331:539-545.). 마피는 프로테아제에 의해 분절되는 아르기닌과 발린을 갖고 있기 때문에, 각각 염기성 아미노산과 비-전하, 비-방향족 아미노산에 대한 특이성에 기인하는 마피에 대한 가수분해 활성을 시험하기 위하여 트립신과 엘라스타제를 선택하였다(Bieth, J. G. 1978. Elastases: structure, function and pathological role.InR. P. Mecham (eds.),Frontiers of Matrix, vol. 1: Regulation of Matrix Accumulation.Academic press, New York, pp. 217-320; Walsh, K. A. 1970. Trypsinogens and trypsins of various species. In G. E. Perlmann and L. Lorand (eds.),Methods in Enzymology, vol. XIX: Proteolytic Enzymes.Academic Press, New York and London, pp. 41-63.). 키모트립신은 비교용으로 시험하였다. 엘라스타제 또는 키모트립신과 배양되는 마피의 잔류 억제 활성은 대조군에 비하여 변화가 없었으며, 이는 마피가 손상받지 않은 채로 남아있다는 것을 가리킨다(도 4). 마피가 트립신과 배양될 때, 66.5% 불활성화에 해당하는 마피 억제 활성의 심각한 감소가 있었다. 이 결과는 트립신-유사 프로테아제가 배양중에 억제활성의 감소에 역할을 하며, 마피가 시험관내 또는 생체내 실험에서 프로테아제 억제자로서 사용될 때 트립신-유사 프로테아제에 의한 마피의 불활성화가 고려되어야 한다는 것을 가리킨다.

트립신에 의한 마피의 불활성화 메카니즘을 해명하기 위한 연구가 현재 진행중이다. 마피가 아르기닌의 카르복실기 부분에서 분절된다는 가설은 마피의 불활성화-산물의 분석의 방법으로 최초로 규명될 것이다.(도 2)

급성독성 실험

ICR계 마우스(25±5)와 스프라그 돌리계(Sprague Dawley) 마우스 각각 8마리씩 에 마피를 각각 500, 725, 1000 및 5000mg/kg의 용량으로 경구투여한 후 2주간 독성여부를 관찰한 결과 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 정상군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

이상의 실험결과로부터 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일반구조식 (I)의 MAPI는 프로테아제 억제제로서 의학적으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 환자의 성별, 나이, 질병의 정도 등에 의하여 그 사용량이 달라질 수 있으나, 일일 0.1mg 내지 500mg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.

본 발명의 화합물은 약제학적으로 통상으로 사용되는 부형제, 보조제, 무통화제, 등장화제, 보존제, 및 기타 약제학적으로 통상으로 허용되는 보조제와 혼합하고 약제학적으로 통상으로 허용되는 제제형태로 제제화하여 약학적 제제를 제조할 수 있다. 이러한 약제학적 제제형태로는 주사제, 액제, 정제, 캡슐제, 산제, 시럽제 등으로 제제화 할 수 있다.

다음에 제제 실시예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

제제실시예 1

MAPI 5mg

주사용 멸균증류수 적량

pH조절제 적량

MAPI를 주사용 증류수에 용해하고 pH 조절제로 pH약 7.6로 조절한 다음 전체를 2ml로 한 후 2ml용량의 앰플에 충진하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제실시예 2

MAPI 20mg

유당 100mg

전분 100mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제실시예 3

MAPI 15mg

유당 50mg

전분 50mg

탈크 2mg

스테아린산마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.

제제실시예 4

MAPI 500mg

설탕 20g

이성화당 20g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 100ml

상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 100ml 의 갈색병에 충진하고 멸균시켜서 액제를 제조한다.

본 발명에 따른 상기 일반구조식 (I)을 갖는 프로테아제 억제 활성을 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 프로테아제 관련 질환과 증상의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (2)

1. 다음 일반구조식 (I)을 갖는 화합물의 프로테아제 억제자로서의 용도.

   (I)
2. 다음 일반구조식 (I)을 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 프로테아제 억제활성을 갖는 약학적 조성물.

   (I)