KR20020013506A - 종양 괴사 인자 수용체 6α 및 6β - Google Patents

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유구오-리앙
루벤스티븐엠
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벤슨 로버트 에이치.
휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 신규한 종양 괴사 인자 수용체 단백질에 관한 것이다. 특히, 사람 TNFR-6α 및 TNFR-6β 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 제공된다. TNFR-6α 및 TNFR-6β 폴리펩타이드, 벡터, 숙주 세포 및 이를 제조하기 위한 재조합 방법이 또한 제공된다. 추가로, 본 발명은 TNFR-6α 및 TNFR-6β 활성에 대한 효능제 및 길항제를 동정하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한, 면역계-관련 질환을 검출하기 위한 진단 방법 및 면역계-관련 질환을 치료하기 위한 치료 방법이 제공된다.

Description

종양 괴사 인자 수용체 6α 및 6β{Tumor necrosis factor receptors 6α and 6β}
수많은 생물학적 작용, 예를 들어 특정 자극에 대한 반응 및 천연 생물학적 과정은 사이토킨 같은 인자들에 의해 조절된다. 수많은 사이토킨들이 수용체에 결합하여 세포내 반응을 생성시킴으로써, 수용체를 통해 작용한다.
예를 들어, 종양 괴사 인자(TNF) 알파 및 베타는, TNF 수용체를 통해 감염 예방 및, 쇼크 및 염증 질환의 유도를 포함하는 수많은 생물학적 과정을 조절하는 사이토킨이다. TNF 분자는 "TNF-리간드 슈퍼패밀리"에 속하며, 이의 수용체 또는대-리간드, 즉 "TNF-수용체" 슈퍼패밀리와 함께 작용한다. 지금까지, TNF 리간드 슈퍼패밀리의 9개 구성원이 분리되었으며 TNF-수용체 슈퍼패밀리의 10개 구성원이 특성화되었다.
리간드 중에는, TNF-α, 림포톡신-α(LT-α, 또는 TNF-β로 공지됨), LT-β(이형삼중체 LT-α2-β 복합체에서 발견됨), FasL, CD40L, CD27L, CD30L, 4-1BBL, OX40L 및 신경 성장 인자(NGF)가 포함된다. TNF 수용체의 슈퍼패밀리는 p55TNF 수용체, p75TNF 수용체, TNF 수용체-관련 단백질, FAS 항원 또는 APO-1, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, OX40, 저 친화도 p75 및 NGF-수용체[Meager, A., Biologicals, 22:291-295 (1994)]를 포함한다.
TNF-리간드 슈퍼패밀리의 수 많은 구성원들은 활성화 T-세포에 의해 발현되며, 이는 이들이 T-세포와 세포 원종양성 및 세포 기능에 기초가 되는 기타 세포 유형과의 상호작용에 필요함을 의미한다.[상기 Meager, A.].
TNF 수용체 패밀리 중 수 개의 구성원의 필수적인 기능에 대한 상당한 통찰력은 이러한 단백질의 발현을 억제시킨 돌연변이체의 분리 및 작제로부터 수득되었다. 예를 들어, FAS 항원 및 이의 리간드에서의 천연 돌연변이는 임파구 증식성 질환을 야기하며[Watanabe-Fukunaga, R., et al., Nature 356:314 (1992)], 이는 아마도 프로그램된 세포 사멸의 실패를 반영하는 것으로 보인다. CD40 리간드의 돌연변이는 혈장 중 높은 수치의 면역글로불린 M 및 낮은 수치의 면역글로불린 G로 특성화되는 X-관련된 면역결핍 상태를 야기하며, 이는 비정상적인 T-세포-의존성 B-세포 활성화를 의미한다[Allen, R.C. et al., Science 259: 990 (1993)]. 낮은친화도의 신경 성장 인자 수용체의 의도된 돌연변이는 비정상적인 말초 구조의 감각 혁신에 의해 특성화되는 질환을 야기한다[Lee, K.F. et al., Cell 69: 737 (1992)].
TNF 및 LT-α는 두 개의 TNF 수용체(55- 및 75-kd TNF 수용체)에 결합할 수 있다. 수용체를 통해 작용하는 TNF 및 LT-α에 의해 유도되는 수많은 생물학적 효과들은 이식된 종양의 출혈성 괴사, 세포독성, 내독성 쇼크, 염증, 면역조절, 증식 및 항-바이러스성 반응에서의 역할 뿐만 아니라 이온화 방사능의 유해 효과로부터의 보호를 포함한다. TNF 및 LT-α는 내독성 쇼크, 뇌성 말라리아, 종양, 자가면역 질환, AIDS 및 이식물-숙주 거부 반응을 포함하는, 광범위한 질환의 발병에 관여한다[Beutler, B. and Von Huffel, C., Science 264: 667-668 (1994)]. p55 수용체에서의 돌연변이는 미생물 감염에 대한 감수성 증가를 초래한다.
추가로, TNFR1(p55) 및 Fas의 C-말단 인접한 약 80개 아미노산 도메인은 "사멸 도메인(death domain)"으로 공지되어 있으며, 이는 프로그램된 세포 사멸을 위한 신호 전달에 관여한다[Tartaglia et al., Cell 74: 845 (1993)]. 어팝토시스(apoptosis), 즉 프로그램된 세포 사멸은 다세포 유기체의 정상적인 발달 및 항상성에 필수적인 생리적 과정이다[H. Steller, Science 267, 1445-1449 (1995)]. 어팝토시스의 교란은 암, 신경퇴행성 질환, 및 후천성 면역결핍증을 포함하는 수 개의 사람 질환의 발병에 관여한다[C.B. Thompson, Science 267, 1456-1462 (1995)]. 최근에, 많은 관심들이 두 개의 세포 표면 사멸 수용체, Fas/APO-1 및 TNFR-1의 신호 전달 및 생물학적 기능에 집중되고 있다[J.L. Cleveland, J.N.Ihle, Cell 81, 479-482 (1995); A. Fraser, G. Evan, Cell 85, 781-784 (1996); S. Nagata, P. Golstein, Science 267, 1449-56 (1995)]. 둘 모두는 TNF 수용체 패밀리의 구성원이며, 상기 패밀리는 또한 그외에, TNFR-2, 낮은 친화도 NGFR, CD40 및 CD30을 포함한다[C.A. Smith, et al., Science 248, 1019-23 (1990); M. Tewari, V.M. Dixit, in Modular Texts in Molecular and Cell Biology M. Purton, Heldin, Carl, Ed.(Chapman and Hall, London, 1995)]. 상기 패밀리 구성원들은 이들의 세포외 도메인에서 시스테인-풍부 반복체의 존재로서 정의되는 반면, Fas/APO-1 및 TNFR-1은 또한 "사멸 도메인"으로 적합하게 명명된, 세포내 상동성 영역을 공유하며, 이는 독특하게 초파리(Drosophila) 자살 유전자인, reaper와 관련이 있다[P. Golstein, D. Marguet, V. Depraetere, Cell 81, 185-6 (1995); K. White et al., Science 264, 677-83 (1994)]. 이러한 공유된 사멸 도메인은 두 수용체 모두가 최근까지 미확인된 채로 남아 있는, 관련된 신호 전달 분자 세트와 상호작용함을 제시한다. Fas/APO-1의 활성화는 사멸 도메인-함유 어댑터 분자 FADD/MORT1을 보강하고[A.M. Chinnaiyan, K. O'Rourke, M. Tewari, V.M. Dixit, Cell 81, 505-12 (1995); M.P. Boldin, et al., J. Biol Chem 270, 7795-8 (1995); F.C. Kischkel, et al., EMBO 14, 5579-5588 (1995)], 상기 분자는 차례로 프로-어팝토시스성 프로테아제의 ICE/CED-3 패밀리 중 한 구성원인, FLICE/MACH1에 결합하여 이를 활성화시키는 것으로 보인다[M. Muzio et al., Cell 85, 817-827 (1996); M.P. Boldin, T.M. Goncharov, Y.V. Goltsev, D. Wallach, Cell 85, 803-815 (1996)]. Fas/APO-1의 중심 역할이 세포 사멸을 촉진하는 것인데 반해, TNFR-1은NF-kB를 활성화시키는 이의 능력으로부터 주로 기인하는, 다양한 생물학적 활성을 전달할 수 있다[L.A. Tartaglia, D.V. Goeddel, Immunol Today 13, 151-3 (1992)]. 따라서, TNFR-1은 다가 어댑터 분자 TRADD를 보강하며, 이는 FADD와 마찬가지로, 또한 사멸 도메인을 함유한다[H. Hsu, J. Xiong, D.V. Goeddel, Cell 81, 495-504 (1995); H. Hsu, H.-B. Shu, M.-P. Pan, D.V. Goeddel, Cell 84, 299-308 (1996)]. FADD, TRAF2 및 RIP를 포함하는 수 많은 신호전달 분자와의 결합을 통하여, TRADD는 어팝토시스와 NF-kB 활성화 신호를 모두 전달할 수 있다[H. Hsu, H-B. Shu, M.-P. Pan, D.V. Goeddel, Cell 84, 299-308 (1996); H. Hsu, J. Huang, H.-B. Shu, V. Baichwal, D.V. Goeddel, Immunity 4, 387-396(1996)].
TNF 패밀리 리간드 및 TNF 패밀리 수용체의 효과들은 포유동물 시스템의 생물학적 과정에서 다양하며, 정상적인 및 비정상적인 수 많은 기능들에 영향을 미친다. 따라서, 정상적으로 및 질병 상태 모두에서 생물학적 활성에 영향을 미치는 이러한 수용체 및 리간드를 분리하고 특성화하는 것이 매우 필요하다. 특히, TNF 수용체 패밀리의 신규한 구성원들을 분리하고 특성화하는 것이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 각각, 서열 2 및 4로 나타낸 완전한 아미노산 서열, 또는 각각, ATCC 기탁번호 제97810호 및 제97809호로서 플라스미드 DNA로 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 TNFR(TNFR-6α 또는 -6β 폴리펩타이드)의 일부 내지 전부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 분리된 핵산 분자를 제공한다. 기탁된 TNFR-6α 및 -6β 클론을 서열 분석함으로써 결정된 상기 뉴클레오타이드 서열은 도 1 및 2에서 나타내며(각각, 서열 1 및 3), 이는 각각, 서열 1 및 3에서 뉴클레오타이드 25 내지 27 위치 및 73 내지 75 위치에서 N-말단 메티오닌을 암호화하는 개시 코돈을 포함하는, 각각 300개 및 170개의 아미노산 잔기의 완전한 폴리펩타이드를 암호화하는 개방형 판독 프레임을 함유한다.
본 발명의 TNFR 단백질은 기타 TNF 수용체들과 서열 상동성을 갖는다. 스플라이스 변이체(splice variant) TNFR-6α 및 -6β는 또한 다중 보존된 시스테인-풍부 도메인을 포함하는 TNFR-I 및 -II(도 3)(각각, 서열 5 및 6)에 대한 사람 mRNA의 해독 생성물과 높은 수준의 서열 상동성을 나타낸다.
TNFR-6α 및 -6β 폴리펩타이드는 각각 30개의 아미노산의 예견된 리더 서열을 가지며; 예견된 성숙한 TNFR-6α 및 -6β 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 각각, 아미노산 잔기 31 내지 300 위치(서열 2) 및 31 내지 170 위치(서열 4)로서 도 1 및 도 2에서 또한 나타낸다.
따라서, 본 발명의 한가지 양태는 (a) 서열 2 또는 4의 완전한 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열 2의 31 내지 300 위치에서 또는 서열 4의 31 내지 170 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드를암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열 2의 31 내지 283 위치 또는 서열 4의 31 내지 166 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 가용성 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (d) 서열 2의 31 내지 283 위치 또는 서열 4의 31 내지 166 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 가지며, TNFR 6α 및/또는 TNFR 6β 기능 활성을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (e) 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)의 뉴클레오타이드 중 어느 하나에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는 상기 (a), (b), (c), (d) 또는 (e)의 뉴클레오타이드 중 어느 하나에 대해 90% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 92%, 또는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 또는 엄격한(stringent) 하이브리드화 조건하에서 상기 (a), (b), (c), (d) 또는 (e)의 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 분리된 핵산 분자를 포함한다. 하이브리드를 형성하는 이러한 폴리뉴클레오타이드는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 단지 A 잔기 또는 T 잔기로만 이루어진 뉴클레오타이드 서열을갖는 폴리뉴클레오타이드와는 하이브리드를 형성하지 않는다. 본 발명의 부가적인 핵산 양태는 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)의 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 에피토프-보유 부분의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는, 재조합 벡터, 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포뿐만 아니라 이러한 벡터 및 숙주 세포를 작제하는 방법 및 재조합 기술들로 TNFR 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 제조하는데 이들을 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, (a) 서열 2 또는 4에서 나타낸 완전한 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 완전한 길이의 TNFR 폴리펩타이드의 아미노산 서열; (b) 서열 2의 31 내지 300 위치 또는 서열 4의 31 내지 170 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드의 아미노산 서열; (c) 서열 2의 31 내지 283 위치 또는 서열 4의 31 내지 166 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 가용성 세포외 도메인의 아미노산 서열; 또는 (d) 서열 2의 31 내지 283 위치 또는 서열 4의 31 내지 166 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 가지며, TNFR 6α 및/또는 TNFR 6β 기능 활성을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 단편의 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 TNFR 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 또한 상기 (a), (b),(c) 또는 (d)에 기술된 것들과 80% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 85% 이상 동일한, 보다 더 바람직하게는 90%, 92%, 95%, 96% , 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 뿐만 아니라 상기한 것들에 대해 90% 이상 유사한, 보다 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 92% 또는 95% 이상 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 상기 양태의 부가적인 양태는 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)에서 기술된 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 에피토프-보유 부분의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 상기된 본 발명의 폴리펩타이드의 전체 아미노산 서열 및 이의 임의의 길이의 서열을 포함하는 에피토프-보유 폴리펩타이드가 본 발명에 또한 포함되기는 하지만, 본 발명의 TNFR 폴리펩타이드의 에피토프-보유 부분의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 6 내지 7개 이상, 바람직하게는 9개 이상, 및 보다 바람직하게는 약 30개 이상 내지 약 50개의 아미노산을 갖는 그러한 폴리펩타이드의 부분을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기한 (a), (b),(c) 또는 (d)에서 기술된 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체를 제공한다. 본 발명은 추가로 본원에서 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 TNFR폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 분리하는 방법을 제공한다. 이러한 항체들은 이하에서 기술하는 바와 같이 진단 또는 치료학적으로 유용하다.
종양 괴사 인자(TNF) 패밀리 리간드는 세포독성, 항-바이러스 활성, 면역조절 활성 및 수 개의 유전자에 대한 전사 조절을 포함하는, 수많은 세포성 반응을 유도하는, 가장 다발성인 사이토킨에 속하는 것으로 공지되어 있다. 본 발명은 또한 TNFR 폴리펩타이드, 특히 사람 TNFR 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 이는 예를 들어, HIV 감염, 내독성 쇼크, 암, 자가면역 질환, 이식편-대-숙주 질환, 급성 이식 거부, 만성 이식 거부, 신경퇴행성 질환, 척수이형성 증후군, 허혈성 손상(예: 허혈성 심장 손상), 독소-유도된 간 질환, 패혈성 쇼크, 악액질 및 식욕 불량을 포함하는 감염성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. TNFR 폴리펩타이드를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명은 추가로 시험관내에서, 생체외에서 및 생체내에서 세포에, 또는 다세포 유기체에 투여하기 위한 TNFR 뉴클레오타이드 또는 TNFR 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 양태의 보다 특히 바람직한 양태에서, 조성물은 질환을 치료하기 위해서 숙주 유기체내에서 TNFR 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 TNFR 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이와 관련하여 TNFR 폴리펩타이드의 비정상적인 내인성 활성과 관련된 기능 이상을 치료하기 위한 사람 환자에서의 발현이 특히 바람직하다.
또 다른 양태에서, TNFR-패밀리 리간드에 결합하는 TNFR 폴리펩타이드 상에서 후보 화합물이 갖는 효능을 결정하는 것과 관련이 있는, 효능제 및 길항제에 대한 스크리닝 분석법이 제공된다. 특히, 상기 방법은 TNFR-패밀리 리간드와 TNFR 폴리펩타이드 및 후보 화합물을 접촉시키고 후보 화합물의 존재로 인해 TNFR 폴리펩타이드의 TNFR 패밀리 리간드에 대한 결합이 증가하는지 또는 감소하는지를 결정하는 것과 관련된다. 이러한 분석법에서, 표준 결합에 비해 TNFR 폴리펩타이드의 결합 증가는 후보 화합물이 TNFR 폴리펩타이드 결합 활성에 대한 효능제임을 나타내며 표준에 비해 TNFR 폴리펩타이드 결합의 감소는 상기 화합물이 TNFR 폴리펩타이드 결합 활성의 길항제임을 나타낸다.
TNFR-6α 및 -6β는 내피 세포, 케라틴 생성 세포, 정상적인 전립선 및 전립선 종양 조직에서 발현된다. 상기 조직 또는 세포의 수 많은 질환, 특히 면역계 질환에 있어서, "표준" TNFR 유전자 발현 수준, 즉, 면역계 질환이 없는 개체로부터의 건강한 조직에서 TNFR 발현 수준에 비교해서, TNFR 유전자 발현의 현저하게 높거나 낮은 수준이 상기 질환에 걸린 개체로부터 취해진 특정 조직(예를 들어, 암 조직) 또는 체액(예를 들어, 혈청, 혈장, 뇨, 활액 또는 척수액)에서 검출될 수 있다. 따라서, 본 발명은 (a) 개체의 세포 또는 체액에서 TNFR 유전자 발현 수준을 분석하고; (b) 표준 TNFR 유전자 발현 수준과 상기 TNFR 유전자 발현 수준을 비교하는 것(이때, 표준 발현 수준과 비교해서 분석된 TNFR 유전자 발현 수준에서의 증가 또는 감소는 면역계 질환에 대한 지표이다)과 관련되는, 상기 질환의 진단에서 유용한 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 부가적인 양태는 치료학적 유효량의 본 발명의 분리된 TNFR 폴리펩타이드 또는 이의 효능제를 포함하는 조성물을 체내에서 TNFR 폴리펩타이드 활성의 증가된 수준이 필요한 개체에게 투여함을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또한 추가의 양태는 치료학적 유효량의 TNFR 길항제를 포함하는 조성물을 TNFR 폴리펩타이드 활성의 감소된 수준이 필요한 개체에게 투여함을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 사용하는데 바람직한 길항제는 TNFR-특이적인 항체이다.
본 발명은 TNF 수용체 패밀리의 구성원인 폴리펩타이드를 암호화하는 신규한 사람 유전자들에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 하기에서 종종 "TNFR-6α, 및 -6β" 또는 일반적으로 "TNFR 폴리펩타이드"로 인용되는 종양 괴사 인자 수용체-6α 및 -6β로 불리는 사람 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 분자들이 제공된다. TNFR 폴리펩타이드는 또한 벡터, 숙주 세포 및 이를 제조하는 재조합 방법으로서 제공된다. 본 발명은 추가로 TNFR 폴리펩타이드 활성에 대한 효능제 및 길항제를 분리하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한 이러한 조성물을 사용하는 진단 방법 및 치료 방법이 제공된다.
도 1은 TNFR-6α의 뉴클레오타이드 서열(서열 1) 및 유추된 아미노산 서열(서열 2)을 나타낸다. 처음의 30개의 아미노산 서열(밑줄친 것)은 추정상의 리더 서열이다.
도 2는 TNFR-6β의 뉴클레오타이드 서열(서열 3) 및 유추된 아미노산 서열(서열 4)을 나타낸다. 처음의 30개의 아미노산 서열(밑줄친 것)은 추정상의 리더 서열이다.
도 3은 TNFR-6α("TNFR-6알파"(서열 2)) 및 TNFR-6β("TNFR-6베타"(서열 4))의 아미노산 서열을 하기와 같은 기타 TNF 수용체와 비교하여, DNA스타 수트(DNAstar suite)에서 메가라인 프로그램(Megaline program)을 사용하는 클러스탈 방법(Clustal method)에 의해 작제된 배열도이다: TNFR1(서열 5); TNFR2(서열 6); NGFR(서열 7); LTbR(서열 8); FAS(서열 9); CD27(서열 10); CD30(서열 11); CD40(서열 12); 4-1BB(서열 13); OX40(서열 14); VC22(서열 15); 및 CRMB(서열16).
도 4 및 5는 각각, TNFR-6α 및 -6β 아미노산 서열에 대한 개별적인 분석을 나타낸다. 알파, 베타, 턴(turn) 및 코일 영역; 친수성성; 양극성 영역; 유연성 영역; 항원 지수 및 표면 확률이 표시되어 있으며, 이는 상기 컴퓨터 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용하여 서열 2 및 4 각각의 아미노산 서열에 대해 예상된 바와 같다. "제임슨-울프 항원 지수(Antigenic Index-Jameson-Wolf)" 그래프에서, TNFR-6α 및 TNFR-6β의 높은 항원성 영역, 즉 본 발명의 에피토프-보유 펩타이드가 수득될 수 있는 영역의 위치를 나타낸다. TNFR-6α의 항원성 영역은 약 Ala-31 내지 about Thr-46, 약 Phe-57 내지 약 Thr-117, 약 15 Cys-132 내지 약 Thr-175, 약 Gly-185 내지 약 Thr-194, 약 Val-205 내지 약 Asp-217, 약 Pro-239 내지 약 Leu-264, 및 약 Ala-283 내지 약 Pro-298 (서열 2)를 포함한다. TNFR-6β의 항원성 영역은 약 Ala-31 내지 약 Thr-46, 약 Phe-57 내지 약 Gln-80, 약 Glu-86 내지 약 His-106, 약 Thr-108 내지 약 20 Phe-119, 약 His- 129 내지 약 Val-138, 및 약 Gly-142 내지 약 Pro-166 (서열 4)를 포함한다. 이들 폴리펩타이드 단편은 제임슨-울프 항원 지수의 분석에 의하면 TNFR-6 알파 및 TNFR-6 베타의 항원성 에피토프를 보유하는 것으로 판정된다.
또한, 도 4 및 5에 제시된 데이터는 표 I 및 II에서 각각 표형태로 제시된다. 표의 행은 "잔기", "위치", 및 로마 숫자 I 내지 XIV의 표제로 표시된다. 당해 행들의 표제는 도 4(표 I) 및 표 5(표 II)에 제시된 아미노산 서열의 하기 특징을 언급한다: "잔기": 서열 2(도 1) 또는 서열 4(도 2)의 아미노산 잔기; "위치":서열 2(도 1) 또는 서열 4(도 2)내에 상응하는 위치; I: 알파, 영역 - Garnier-Robson; II: 알파, 영역 - Chou-Fasman; III: 베타, 영역 - Garnier-Robson; IV: Beta, 영역 - Chou-Fasman; V: 턴, 영역 - Garnier-Robson; VI: 턴, 영역 - Chou-Fasman; VII 코일, 영역 - Garnier-Robson; VIII: 친수성 플롯 - Kyte-Doolittle; IX: 소수성 플롯 - Hopp-Woods; X: 알파, 양극성 영역 - Eisenberg; XI: 베타, 양극성 영역 - Eisenberg; XII 유연성 영역 - Karplus-Schulz; XIII: 항원성 지수 - 제임스-울프; 및 XIV: 표면 확률 플롯 - Emini.
도 6은 서열 1 및 3과 관련있는 HELDI06R(서열 17) 및 HCEOW38R(서열 18)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 7A 내지 B는 Fas 리간드-매개된 세포 사멸을 차단하는 TNFR6 알파를 도시한다. 주르케트(Jurkat) T-세포를 Fas 리간드와 TNFR6 알파 Fc 수용체의 배합물로 16시간 동안 처리한다. 처리 후, 생존 세포의 수준을 측정하기 위하여, 세포를 5시간 동안 10% ALOMAR 블루로 항온처리하고, OD 570mm 내지 630mm에서 분광기로 조사한다. 모든 샘플을 3중 반복으로 시험한다. TNFR6 알파-Fc 수용체는, Fas 리간드와 같이 효과적으로 투여량 의존 방식으로 주르케트 세포의 Fas-매개된 어팝토시스를 차단하는 것으로 여겨진다.
본 발명은 클로닝된 cDNA를 서열 분석함으로써 결정된, 각각 서열 2 및 4로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 TNFR-6α 또는 -6β 폴리펩타이드, 일반적으로 "TNFR폴리펩타이드(들)"을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 도 1 및 도 2에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열(서열 1 및 3)은 HPHAE52 및 HTPCH84 클론을 서열 분석하여 수득되며, 이는 미국 버지니아주 20110-2209, 마나사스, 유니버시티 불러바드 10801에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 1996년 11월 22일에 기탁되어, 각각 수탁 번호 ATCC 제97810호 및 제97809호를 받았다. 상기 기탁된 클론들은 플라스미드 pBluescript SK(-)(제조원: 스트라타진(Stratagene)사, 캘리포니아주 라 졸라)내에 함유되어 있다.
본 발명의 TNFR-6α 및 TNFR-6β 단백질은 각각의 단백질의 N-말단 142개 잔기에 대해 동일한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 공유하는 스플라이스 변이체이다. 이러한 단백질들의 아미노산 서열은 사람 TNFR-2 mRNA(도 3)(서열 6)의 해독 생성물과 약 23% 유사성을 가지며 다수의 보존된 시스테인 풍부 도메인을 공유한다. 중요하게도, 이들 단백질은 유의한 서브유니트 내부의 상동성을 갖는 4개의 반복되는 시스테인 풍부 모티프를 포함하는 이들의 세포외 도메인에 대해서 실질적인 서열 유사성을 공유한다. TNFR-2는 TNF에 의한 사람 T-세포 증식을 배타적으로 중개하는 것으로 여겨진다[PCT 제WO/94/09137호].
핵산 분자
특별한 언급이 없는 한, 본원에서 DNA 분자의 서열 분석에 의해 결정된 모든 뉴클레오타이드 서열은 자동화 DNA 서열 분석기(예를 들어, 모델 373, 제조원: Applied Biosystems, Inc., 캘리포니아주 포스터시)를 사용하여 결정된 것이며, 본원에서 결정된 DNA 분자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 모든 아미노산 서열은 상기 결정된 DNA 서열의 해독에 의해 예상되는 것이다. 따라서, 이러한 자동화된 방법에 의해 결정된 모든 DNA 서열에 있어서 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 본원에서 결정된 모든 뉴클레오타이드 서열은 일부 오류를 포함할 수 있다. 자동화에 의해 결정된 뉴클레오타이드 서열은 서열 분석된 DNA 분자의 정확한 뉴클레오타이드 서열에 대해 전형적으로 약 90% 이상, 보다 전형적으로 약 95% 이상 내지 약 99.9% 이상 동일하다. 실제 서열은 당해 분야에 널리 공지된 수동 DNA 서열 분석법을 포함하는 기타 방법으로 보다 정확하게 결정할 수 있다. 당해 분야에서 또한 공지된 바와 같이, 실제 서열에 필적하는 결정된 뉴클레오타이드 서열에서 단 하나의 삽입이나 결실도 뉴클레오타이드 서열의 해독에서 프레임 이동(frame shift)를 야기하여 결과적으로 결정된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 예견된 아미노산 서열은 그러한 삽입 또는 결실이 일어난 시점부터, 서열 분석된 DNA 분자에 의해 실질적으로 암호화되는 아미노산 서열과는 완전히 상이하게 될 것이다.
핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드의 "뉴클레오타이드 서열"이란 DNA 분자 또는 폴리뉴클레오타이드, 즉 데옥시리보뉴클레오타이드 서열, 및 RNA 분자 또는 폴리뉴클레오타이드, 즉 리보뉴클레오타이드(A, G, C 및 U)(이때, 구체화된 데옥시리보뉴클레오타이드 서열에서, 각각의 티미딘 데옥시리보뉴클레오타이드(T)는 리보뉴클레오타이드 우리딘(U)에 의해 교체된다)의 상응하는 서열을 의미한다.
도 1 및 도 2(서열 1 및 3)에서 뉴클레오타이드 서열과 같이, 본원에서 제공되는 정보를 사용하여, TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자는 출발 물질로서 mRNA를 사용하여 cDNA를 클로닝하기 위한 방법 같은, 표준 클로닝 및 스크리닝 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 본 발명을 예증하는, TNFR-6α 및 -6β 클론(각각, 도 1 및 도 2)은 다음 조직들로부터의 cDNA 라이브러리에서 분리된다: 내피 세포, 케라틴 생성 세포, 정상적인 전립선 조직 및 전립선 암 조직.
도 1 및 도 2의 TNFR cDNA의 결정된 뉴클레오타이드 서열(서열 1 및 3)은 각각, 도 1 및 도 2의 뉴클레오타이드 서열(서열 1 및 3)의 25 내지 27위치 및 73 내지 75 위치에서 개시 코돈을 갖는, 300 및 170개 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하는 개방형 판독 프레임을 함유한다.
TNFR-6α 및 -6β 유전자의 개방형 판독 프레임은 각각, 서열 2의 31 내지 283 잔기 및 서열 4의 31 내지 166 잔기의 가용성 세포외 도메인을 포함하는, 사람 TNFR-2의 mRNA의 해독 생성물과 서열 상동성을 공유한다.
통상의 숙련자가 인식하는 바와 같이, 상기 언급된 서열 분석의 오류의 가능성으로 인해, 약 300 및 170개 아미노산을 포함하는, 기탁된 cDNA에 의해 암호화되는 실질적으로 완전한 TNFR 폴리펩타이드는 다소 더 길거나 더 짧을 수 있다. 보다 일반적으로, 실질적인 개방형 판독 프레임은 도 1 및 도 2(서열 1 및 3)에서 나타낸 N-말단으로부터 첫 번째 메티오닌 코돈으로부터 예견되는 ±20개 아미노산의 범위내에, 보다 유망하게는 ±10개 아미노산의 범위내에 있을 수 있으며, 이는 각각의 도면에서 나타내는 해독된 서열과 함께 프레임내에 존재한다. 추가로, 다양한 기능성 도메인을 분리하게 위해 사용되는 분석학적 기준에 따라서, TNFR 폴리펩타이드의 세포외 및 트랜스막 도메인의 정확한 "주소"가 상기 예견된 위치로부터다소간의 차이가 있을 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 서열 2에서 세포외 도메인의 정확한 위치는 도메인을 정의하기 위해 사용된 기준에 따라 다소간 다양할 수 있다(예를 들어, 상기 주소는 약 1 내지 약 20개 잔기, 보다 유망하게는 약 1 내지 약 5개 잔기 정도 "이동"할 수 있다). 하여튼, 하기에 추가로 언급되는 바와 같이, 본 발명은 추가로 TNFR-6α 및 -6β 단백질의 세포외 도메인의 가용성 형태를 구성하는, 본원에 기술된 세포외 도메인의 N-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산이 결핍되는 폴리펩타이드를 포함하여, 완전한 폴리펩타이드의 N-말단으로부터 다양한 잔기들이 결실된 폴리펩타이드를 제공한다.
완전한 TNFR 단백질의 아미노산 서열은 서열 2 및 4에서 나타낸 바와 같이, 리더 서열 및 성숙한 단백질을 포함한다. 보다 특히, 본 발명은 TNFR 단백질의 성숙한 형태를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 따라서, 신호 가설에 따라서, 일단 조면 소포체를 가로질러 성장하는 단백질 쇄의 방출이 개시되면, 포유동물 세포에 의해 분비되는 단백질은 신호 또는 분비성 리더 서열을 가지며, 이는 완전한 폴리펩타이드로부터 절단되어 상기 단백질의 분비된 "성숙한" 형태를 생성한다. 대부분의 포유동물 세포 및 곤충 세포도 동일한 특이성을 갖는 분비성 단백질을 절단한다. 그러나, 특정의 경우에, 분비성 단백질의 절단은 완전히 동일한 형태는 아니며, 상기 단백질의 두 개 이상의 성숙한 종류를 초래한다. 추가로, 분비성 단백질의 절단 특이성은 궁극적으로 완전한 단백질의 1차 구조에 의해 결정되며, 즉 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 내재하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 본 발명은 ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호로서 동정되는 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. "ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호로서 동정되는 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드"란 기탁된 벡터내에 함유된 상기 클론의 사람 DNA 서열에 의해 암호화되는 완전한 개방형 판독 프레임의 포유동물 세포내(예를 들어, 하기되는 바와 같은 COS 세포)에서의 발현에 의해 생성되는 상기 단백질의 성숙한 형태(들)을 의미한다.
추가로, 단백질이 분비성 리더 서열뿐만 아니라 리더 서열에 대한 절단 부위를 갖는지를 예견하기 위한 방법이 제공된다. 예를 들어, 문헌[McGeoch, Virus Res. 3: 271-286 (1985)]의 방법은 완전한(비절단된) 단백질의 짧은 N-말단 하전된 영역 및 후속적인 비하전된 영역으로부터의 정보를 활용한다. 문헌[von Heinje, Nucleic Acids Res. 14:4683-4690 (1986)]의 방법은 절단 부위 주변의 잔기들, 전형적으로 -13 내지 +2 잔기들(이때, +1은 성숙한 단백질의 아미노 말단을 나타낸다)로부터의 정보를 활용한다. 이러한 방법들의 각각에 있어서 공지된 포유동물 분비성 단백질의 절단 부위를 예견하는 정확도는 75 내지 80%의 범위이다[상기, von Heinje]. 그러나, 상기 두 개의 방법이 항상 주어진 단백질의 동일한 예견된 절단 부위를 생성하는 것은 아니다.
본원의 경우, 완전한 TNFR 폴리펩타이드의 유추된 아미노산 서열을 쿄토대학교 화학연구소(Institute for Chemical Research, Kyoto University)의 나카이 겐타(Kenta Nakai) 박사로부터 제공받은, 컴퓨터 프로그램 "PSORT"를 사용하여 분석하며[참조: K. Nakai and M. Kanehisa, Genomics 14:897-911 (1992)], 상기 프로그램은 아미노산 서열에 기초하여 단백질의 세포내 위치를 예견하는 전문 시스템이다. 위치화의 이러한 계산에 의한 예견의 일부로서, McGeoch와 von Heinje의 방법을 혼용한다. 상기 프로그램에 의한 TNFR 아미노산 서열의 분석은 하기 결과를 제공한다: TNFR-6α 및 -6β는 각각, 서열 2 및 4의 잔기 31 내지 300 위치 및 31 내지 170 위치의 아미노산 서열을 갖는 성숙한 폴리펩타이드를 암호화한다.
특정 바람직한 양태에서, TNFR-6α 및 -6β는 각각 서열 2 및 4의 잔기 31 내지 299 및 31 내지 169를 갖는 성숙한 폴리펩타이드를 암호화한다.
지적한 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자는 mRNA 같은 RNA의 형태, 또는 예를 들어, 클로닝 또는 합성적으로 작제된 cDNA 및 게놈성 DNA를 포함하는 DNA의 형태로 존재할 수 있다. DNA는 이중-쇄 또는 단일-쇄일 수 있다. 단일-쇄 DNA 또는 RNA는 암호화 쇄(또는, 센스 쇄로 공지됨)이거나, 비-암호화 쇄(또한, 안티-센스 쇄로 인용됨)일 수 있다.
"분리된" 핵산 분자(들)이란 이의 천연 환경으로부터 분리된, 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들어, 벡터내에 함유되는 재조합 DNA 분자는 본 발명의 목적상 분리된 것으로 간주된다. 분리된 DNA 분자의 또 다른 예는 이종 숙주 세포내에서 유지되는 재조합 DNA 분자 또는 용액 중 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) DNA 분자를 포함한다. 분리된 RNA는 본 발명의 DNA 분자의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 그러나, 핵산은 혼합 클론 라이브러리(예: 게놈 또는 cDNA 라이브러리)의 구성원인 클론 및 당해 라이브러리의 다른 클론으로 부터 분리되진 않은 클론(예: 라이브러리의 다른 구성원이 부존재하는 클론을 함유하는균질한 용액의 형태)중에 함유된 핵산, 또는 세포 또는 세포 용해물로 부터 분리되거나 제거된 염색체(예: 핵형에서와 같은, 염색체 분산체)는 본 발명의 목적을 위하여 분리된 것이 아니다. 본원에서 추가로 논의되는 바와 같이. 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자는 천연적, 재조합적, 또는 합성적으로 제조될 수 있다.
본 발명의 분리된 핵산 분자는 각각, 서열 1 및 3에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 25 내지 27 위치 및 73 내지 75 위치에서 개시 코돈을 갖는 개방형 판독 프레임(ORF)을 포함하는 DNA 분자를 포함한다.
또한, 각각 서열 2 및 4의 31 내지 300 위치 및 31 내지 170 위치에서 나타낸 예견된 성숙한 TNFR 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함한다.
또한, 각각 서열 2 및 4의 31 내지 299 위치 및 31 내지 169 위치에서 나타낸 예견된 성숙한 TNFR 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함한다.
추가로, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 상기한 것과는 실질적으로 상이한 서열을 포함하지만, 유전 암호의 축퇴성으로 인해, 또한 TNFR 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 포함한다. 물론, 유전 암호 및 종-특이적인 코돈 선호도는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 당해 분야의 숙련자가 예를 들어, 특정 숙주에서 코돈 발현을 최적화하기 위해서(예를 들어, 사람 mRNA의 코돈을 이. 콜라이 같은 세균 숙주에 의해 선호되는 것으로 변화시키는 것), 상기 기술한 축퇴성 변이체를 생성시키는 것은 일상적인 일이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호 같은 기탁된 플라스미드내에 포함되는 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 바람직하게는, 이러한 핵산 분자는 상기-기술된 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하게 된다.
본 발명은 추가로 도 1 또는 도 2(서열 1 또는 3)에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열 또는 상기-기술된 기탁된 클론에 함유된 TNFR cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 분리된 핵산 분자, 또는 상기 서열 중 하나에 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 분리된 분자, 특히 DNA 분자는 염색체를 사용한 원위치 하이브리드화(in situ hybridization)에 의한 유전자 맵핑 및 예를 들어, 노던 블롯 분석에 의한 사람 조직에서 TNFR 유전자의 발현 검출을 위한 프로브로서 유용하다.
본 발명은 추가로 본원에 기술된 뉴클레오타이드 서열의 부분들을 암호화하는 핵산 분자뿐만 아니라 본원에 기술된 분리된 핵산 분자의 단편에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 각각, 서열 1 및 3의 25 내지 924 위치 및 73 내지 582 위치로 이루어지는 서열 1 또는 3의 일부분을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또한, 각각, 28 내지 924 위치 및 76 내지 582 위치로 이루어지는 서열 1 및 3의 일부분을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 갖는, 아미노 말단 메티오닌이 결핍된 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드도 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 또한 제공되며, 이러한 폴리펩타이드는 각각, 서열 2 및 4의 2 내지 300 위치 및 2 내지 170 위치의 아미노산 서열을 포함한다.
부가적으로, 본 발명은 다음과 같이 서열 1 및 3의 광범위한 부분과 관련된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자를 제공한다: HELDI06R(서열 17) 및 HCEOW38R(서열 18)은 서열 1 및 3 모두에 관련된다. 서열 17 또는 18, 또는 서열 17 또는 18의 아단편이 아닌 서열 1 및 3의 폴리펩타이드 단편이 바람직하다. HELDI06R 및 HCEOW38R의 서열은 도 6에 나타낸다.
보다 일반적으로, 기탁된 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 도 1 또는 도 2(서열 1 또는 3)에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 갖는 분리된 핵산 분자의 단편이란 본원에서 언급된 바와 같이 진단용 프로브 및 프라이머로서 유용한 약 15nt 이상, 보다 바람직하게는 약 20nt 이상, 보다 더 바람직하게는 약 30nt 이상, 및 더욱 더 바람직하게는 약 40nt 이상의 길이의 단편을 나타낸다. 이들 단편은, 본원에 기술된 바와 같은 진단용 프로브 및 프라이머 등을 포함하는 수 많은 용도를 갖는다. 물론, 기탁된 cDNA, 또는 도 1 및 도 2(서열 1 및 3)에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 대부분에, (전부는 아니더라도), 상응하는 단편들인 경우, 본 발명에 따르는 50 내지 300nt 이상 길이의 보다 큰 단편도 또한 유용하다. 서열 1에 나타낸 500개의 연속한 뉴클레오타이드에 80%, 85%, 90%, 92%, 또는 95% 이상 동일한 500개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 단편이 특히 바람직하다. 예를 들어, 20nt 이상의 단편이란 기탁된 cDNA의 뉴클레오타이드 서열, 또는 도 1 및 도 2(서열 1 및 3)에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 20개 이상 연속한 염기를 포함하는 단편을 나타낸다. 이와 관련하여, "약"은 특히 언급된 크기, 및 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에서 수개(5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 뉴클레오타이드 만큼 크거나 작은 크기를 포함한다. 본 발명의 바람직한 핵산 단편은, 도 4 및 5에서 인식되고 보다 상세히 후술된 바와 같이 TNFR 폴리펩타이드의 에피토프-보유 부분을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 TNFR-6α핵산 단편의 대표적인 예는, 예를 들어, 서열 1의 뉴클레오타이드 약 1번 내지 뉴클레오타이드 약 25번, 뉴클레오타이드 약 26번 내지 뉴클레오타이드 약 75번, 뉴클레오타이드 약 76 내지 뉴클레오타이드 약 114번, 뉴클레오타이드 약 115번 내지 뉴클레오타이드 약 162번, 뉴클레오타이드 약 163번 내지 뉴클레오타이드 약 216번, 뉴클레오타이드 약 217번 내지 뉴클레오타이드 약 267번, 뉴클레오타이드 약 268번 내지 뉴클레오타이드 약 318번, 뉴클레오타이드 약 319번 내지 뉴클레오타이드 약 369번, 뉴클레오타이드 약 370번 내지 뉴클레오타이드 약 420번, 약 뉴크레오티드 421번 내지 뉴클레오타이드 약 471번, 뉴클레오타이드 약 472번 내지 뉴클레오타이드 약 522번, 뉴클레오타이드 약 523번 내지 뉴클레오타이드 약 573번, 뉴클레오타이드 약 574번 내지 뉴크레오티드 약 625번, 뉴클레오타이드 약 626번 내지 뉴클레오타이드 약 675번, 뉴클레오타이드 약 676번 내지 뉴클레오타이드 약 714번, 뉴클레오타이드 약 715번 내지 뉴클레오타이드 약 765번, 뉴클레오타이드 약 766번 내지 뉴클레오타이드 약 816번, 뉴클레오타이드 약 817번 내지 뉴클레오타이드 약 867번, 뉴클레오타이드 약 868번 내지 뉴클레오타이드 약 924번, 뉴클레오타이드 약 925번 내지 뉴클레오타이드 약 975번으로부터의서열 또는 이에 상보적인 쇄, 또는 ATCC 기탁번호 제97810호로 기탁된 플라스미드에 함유된 cDNA을 포함하거나, 또는 이러한 cDNA로 이루어진 단편을 포함한다. 상기와 관련하여, "약"은 특히 언급된 범위를 포함하며, 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에서 수개(5, 4, 3, 2 또는 1개)의 뉴클레오타이드 만큼 크거나 작은 범위를 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명의 핵산 단편은, 예를 들어 서열 2의 아미노산 잔기 100번 내지 150번, 150번 내지 200번, 200번 내지 300번, 220번 내지 300번, 240번 내지 300번, 250번 내지 300번, 260번 내지 300번 및/또는 280번 내지 300번을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이에 상보적인 쇄를 포함하거나, 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드로 이루어진다. 상기 폴리뉴클레오타이드 단편과 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 TNFR-6β핵산 단편의 대표적인 예는, 예를 들어 서열 3의 뉴클레오타이드 약 1번 내지 뉴클레오타이드 약 36번, 뉴클레오타이드 약 37 내지 뉴클레오타이드 72번, 뉴클레오타이드 약 73번 내지 뉴클레오타이드 약 123번, 뉴클레오타이드 약 124번 내지 뉴클레오타이드 약 175번, 뉴클레오타이드 약 176번 내지 뉴클레오타이드 약 216번, 뉴클레오타이드 약 217번 내지 뉴클레오타이드 약 267번, 뉴클레오타이드 약 268번 내지 뉴클레오타이드 약 318번, 뉴클레오타이드 약 319번 내지 뉴클레오타이드 약 369번, 뉴클레오타이드 약 370번 내지 뉴클레오타이드 약 420번, 뉴클레오타이드 약 421번 내지 뉴클레오타이드 약 471번, 뉴클레오타이드 약 472번 내지 뉴클레오타이드 약 522번, 뉴클레오타이드 약 523번 내지 뉴클레오타이드 약 582번, 뉴클레오타이드 약 583번 내지 뉴클레오타이드 약 622번, 뉴클레오타이드 약 623번 내지 뉴클레오타이드 약 682번, 뉴클레오타이드 약 683번 내지 뉴클레오타이드 약 750번, 뉴클레오타이드 약 751번 내지 뉴클레오타이드 약 800번, 뉴클레오타이드 약 801번 내지 뉴클레오타이드 약 850번, 뉴클레오타이드 약 851번 내지 뉴클레오타이드 약 900번, 뉴클레오타이드 약 901번 내지 뉴클레오타이드 약 950번, 뉴클레오타이드 약 951번 내지 뉴클레오타이드 약 1000번, 뉴클레오타이드 약 1001번 내지 뉴클레오타이드 약 1050번, 뉴클레오타이드 약 1051번 내지 뉴클레오타이드 약 1100번, 뉴클레티드 약 1101번 내지 뉴클레오타이드 약 1150번, 뉴클레오타이드 약 1151번 내지 뉴클레오타이드 약 1200번, 뉴클레오타이드 약 1201번 내지 뉴클레오타이드 약 1250번, 뉴클레오타이드 약 1251번 내지 뉴클레오타이드 약 1300번, 뉴클레오타이드 약 1301번 내지 뉴클레오타이드 약 1350번, 뉴클레오타이드 약 1351번 내지 뉴클레오타이드 약 1400번, 뉴클레오타이드 약 1401번 내지 뉴클레오타이드 약 1450번, 뉴클레오타이드 약 1451번 내지 뉴클레오타이드 약 1500번, 뉴클레오타이드 약 1501번 내지 뉴클레오타이드 약 1550번, 뉴클레오타이드 약 1551번 내지 뉴클레오타이드 약 1600번, 뉴클레오타이드 약 1601번 내지 뉴클레오타이드 약 1650번, 뉴클레오타이드 약 1651번 내지 뉴클레오타이드 약 1667번, 또는 이들에 상보적인 쇄 또는 ATCC 기탁번호 제97809호로 기탁된 플라스미드내에 함유된 cDNA를 포함하거나, 또는 이러한 cDNA로 이루어진 단편을 포함한다. 이와 관련하여, "약"은 특히 언급된 범위, 및 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에서 수개(5, 4, 3, 2 또는 1개) 만큼 크거나 작은 범위를 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명의 핵산 단편은 서열 4의 아미노산 잔기 50번 내지 100번, 100번 내지 170번, 110번 내지 170번, 130번 내지 170번, 140번 내지 170번, 150번 내지 170번 및/또는 160번 내지 170번을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이에 상보적인 쇄를 포함하거나, 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 단편과 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 단편은 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β의 기능 활성을 입증하는 폴리펩타이드를 암호화한다. "기능 활성"을 나타내는 폴리펩타이드란, 완전한(전체 길이) 또는 성숙한 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드와 관련된 하나 이상의 공지된 기능 활성을 나타낼 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 기능 활성은 생물학적 활성(예: FasL 매개 어팝토시스의 억제 또는 감소), 항원성[항-TNFR-6α항체 및/또는 TNFR-6β항체에 결합하거나 (이에 결합하기 위해 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β와 경쟁하는) 능력], 면역원성(TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 생성하는 능력), 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드와 함께 다량체를 형성하는 능력, 및 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β에 대한 수용체 또는 리간드(예: Fas 리간드 및/또는 AIM-Ⅱ)에 결합하는 능력을 포함한다[참조 문헌: 1997년 9월 25일자로 공개된 국제출원 공개공보 WO97/34911].
TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드 및 이의 단편, 변이체, 유도체 및 동족체의 기능 활성은 다양한 방법을 사용하여 검정할 수 있다.
예를 들어, 항-TNFR-6α 및/또는 항-TNFR-6β 항체에 결합하거나 결합하기 위해 완전한(전체 길이) 또는 성숙한 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드와 경쟁하는 능력에 대하여 검정하는 하나의 양태에서, 당해 분야에 공지된 다양한 면역 분석법을 사용할 수 있으며, 이러한 것으로는 방사성면역검정법, ELISA(효소-연계된 면역흡착법; enzyme linked immunosorbent assay), "샌드위치" 면역검정법, 면역방사능계측 검정법, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 검정법, 원위치(in situ) 면역검정법(예를 들어, 콜로이드성 금, 효소 또는 방사선동위원소 표지를 이용), 웨스턴 블롯, 침전 반응, 응집 검정법(예: 겔 응집 검정법, 혈구응집 검정법), 보체 고정 검정법, 면역형광 검정법, 단백질 A 검정법, 및 면역전기영동 검정법 등과 같은 기술을 사용하는 경쟁 및 비경쟁 분석 시스템이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 하나의 양태에서, 항체 결합은 1차 항체상의 표지를 검출함으로써 검출된다. 또 다른 양태에서, 1차 항체는 1차 항체에 대한 2차 항체 또는 시약의 결합을 검출함으로써 검출된다. 또 다른 양태에서, 2차 항체는 표지화된다. 면역검정법에서 결합을 검출하기 위한 많은 방법이 당해 분야에 공지되어 있으며, 이는 본 발명의 범주내에 포함된다.
또 다른 양태에서, TNF-리간드(예: Fas 리간드 및 AIM-Ⅱ)가 동정되거나(참조 문헌: 1997년 9월 25일자로 공개된 국제출원 공보 WO97/34911), 본 발명의 폴리펩타이드 단편, 변이형 또는 유도체의 다량체화 능력을 평가하는 경우 , 결합은 예를 들면, 당해 분야에 익히 공지된 방법, 예컨대, 환원 및 비환원 겔 크로마토그래피, 단백질 친화성 크로마토그래피, 및 친화성 블로팅을 사용하여 분석할 수 있다[참조 문헌: Phizicky, E., et al., Microbiol. Rev. 59:94-123 (1995)]. 또 다른 양태에서, 기질에 결합하는 TNFR-6α및/또는 TNFR-6β의 생리학적 상관 관계를 분석할 수 있다.
또한, 본원에 기술된 검정법(예를 들어, 실시예 7 내지 9 참조) 및 당해 분야에 공지된 또 다른 검정법을 통상적으로 적용하거나 변형하여, TNFR-6α및/또는 TNFR-6β 관련 생물학적 활성을 유도(예를 들어, 생체내 또는 시험관내에서 FasL 매개된 어팝토시스를 억제 또는 감소하거나, 생체내 또는 시험관내에서 AIM-Ⅱ 매개된 어팝토시스를 억제 또는 감소)하는 TNFR-6α및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드 및 이의 단편, 변이체, 유도체 및 동족체의 능력을 측정한다.
예를 들어, FasL 매개된 어팝토시스를 감소 또는 차단하는 본 발명의 TNFR 폴리펩타이드의 능력은 Fas 발현 T-세포주, 예를 들어, Jurkat를 사용하여 분석할 수 있다. 상기 검정법에서, 가용성 FasL로 처리한 Jurkat 세포는 어팝토시스를 겪는다. FasL 첨가에 선행하여, 세포를 TNFR 및/또는 TNFR 효능제로 예비처리하는 것은, 세포가 어팝토시스로 부터 보호되며, 동일한 농도의 가용성 FasL을 TNFR 폴리펩타이드 또는 TNFR 효능제의 부재하에 동일한 농도의 Fas 발현 세포와 접촉시키는 경우를 관찰한 결과와 비교시, 감소된 수준의 어팝토시스를 야기한다. 또는, FasL 단백질과 TNFR 및/또는 TNFR을 혼합하는 것도 또한 FasL가 Jurkat 세포에 결합하며 어팝토시스를 매개할 수 있는 능력을 차단한다(실시예 9 참조).
이와 달리, 본 발명의 TNFR 길항제는 FasL 매개된 어팝토시스의 TNFR 매개된 억제를 차단한다. 따라서, 본 발명의 TNFR 길항제는, 예를 들어, (FasL에 결합하는 것으로 공지된) 성숙한 TNFR, 시험하고자 하는 TNFR 길항제 및 가용성 FasL을 배합하고, 당해 배합물을 Fas 발현 세포주와 접촉시킴으로써 분석될 수 있다. TNFR 길항제는 FasL 매개된 어팝토시스의 TNFR 매개된 억제를 감소 또는 차단한다. 따라서, 성숙한 TNFR, TNFR 길항제 및 가용성 Fas와 접촉된 Fas 발현 T 세포는, TNFR 길항제의 부재하에 동일한 농도의 성숙한 TNFR 및 FasL과 접촉시킨 동일한 농도의 Fas 발현 세포와 비교시, 상승된 어팝토시스 수준을 나타낸다.
어팝토시스는 예를 들어, 어팝토시스성 세포에 선택적으로 결합하는 아넥신(Annexin) 염색을 증가시킴으로써 측정한다. 또 다른 예에서, 어팝토시스에 의한 세포 수의 감소는 생존 세포를 검출하는 ALOMAR 블루 염색의 감소에 의해 검출될 수 있다.
또 다른 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되며 본 발명의 범주에 포함된다.
추가의 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β의 기능 특성을 암호화한다. 이러한 점에서 바람직한 본 발명의 양태는 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드의 알파-나선 및 알파-나선 형성 영역("알파-영역"), 베타-시트 및 베타-시트 형성 영역("베타-영역"), 턴(turn) 및 턴-형성 영역("턴-영역"), 코일 및 코일-형성 영역("코일-영역"), 친수성 영역, 소수성 영역, 알파 양극성 영역, 베타 양극성 영역, 유연성 영역, 표면-형성 영역, 및 고 항원 지수 영역을 포함하는 단편을 포함한다.
이러한 점에서 바람직한 특정 영역은 도 4(표 Ⅰ) 및 도 5(표 Ⅱ)에 제시되어 있다. 도 4 및 도 5에 나타낸 데이터 및 표 Ⅰ 및 표 Ⅱ에 나타낸 데이터는 각각 서열 2의 아미노산 서열 및 서열 4의 아미노산 서열을 DNA*STAR 컴퓨터 알고리즘의 데폴트 파라미터(default parameter)를 사용하여 분석하는 경우에 수득되는 동일한 결과의 상이한 포맷만을 제시한다.
상기 기술한 도 4(표 Ⅰ) 및 도 5(표 Ⅱ)에 제시된 바람직한 영역은 도 1 및 도 2에 제시된 아미노산 서열의 분석에 의해 동정된 전술한 유형의 영역을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다. 도 4 및 도 5에서 제시된 바와 같이, 이러한 바람직한 영역은 Garnier-Robson 알파-영역, 베타-영역, 턴-영역 및 코일 영역, Chou Fasman 알파-영역 및 코일 영역, Kyte-Doolittle 친수성 영역, Eisenbeg 알파- 및 베타-양극성 영역, Karplus-Schulz 유연성 영역, Emini 표면-형성 영역, 및 고 항원 지수의 제임슨-울프(Jamson-Wolf) 영역을 포함한다. 이 점에 있어서, 매우 바람직한 폴리뉴클레오타이드는 몇가지 구조적 특징, 예를 들어, 상기한 수개(예: 1 내지 4개)를 조합한 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β의 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이다.
또한, 표 Ⅰ 및 표 Ⅱ의 컬럼 Ⅷ, Ⅸ, ⅩⅢ 및 ⅩⅣ에 나타낸 데이터는 항원성에 대한 높은 잠재성을 나타내는 TNFR-6 영역을 측정하는데 통상적으로 사용될 수 있다. 높은 항원성 영역은, 항원 인식이 면역 반응의 개시 과정에서 이루어질 수 있는 환경에서 폴리펩타이드의 표면에 노출되기 쉬운 폴리펩타이드 영역을 나타내는 값을 선택함으로써 컬럼 Ⅷ, Ⅸ, ⅩⅢ 및/또는 ⅩⅣ에 제시되어 있는 데이터로부터 측정된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 핵산 단편은 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β의 하나 이상의 에피토프-보유 부분을 암호화하는 핵산 분자를 포함하거나, 또는 이러한 핵산분자로 이루어진다. 특히, 본 발명의 이러한 핵산 단편은, 서열 2중의 Phe-57 내지 약 Thr-117, 약 Cys-132 내지 Thr-175, 약 Gly-185 내지 약 Thr-194, 약 Val-205 내지 약 Asp-217, 약 Pro-239 내지 약 Leu-264, 및/또는 약 Ala-283 내지 약 Pro-298의 아미노산 잔기를 포함하거나, 또는 이러한 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 핵산 단편은 서열 4중의 약 Ala-31 내지 약 Thr-46, 약 Phe-57 내지 약 Gln-80, 약 Glu-86 내지 약 His-106, 약 Thr-108 내지 약 Phe- 119, 약 His-129 내지 약 Val- 138, 및/또는 약 Gly-142 내지 약 Pro-166의 TNFR-6β의 하나 이상의 에피토프를 암호화하는 핵산 분자를 포함하거나, 또는 이러한 핵산 분자로 이루어진다. 이와 관련하여, "약"은 특히 언급된 범위 및 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에서 수개의 아미노산(5, 4, 3, 2 또는 1개) 만큼 크거나 작은 범위를 포함한다. 이들 폴리펩타이드 단편은, 도 4 및 5에 도시된 바와 같이 제임슨-울프 항원 지수의 분석에 의하면, 각각 TNFR-6α 및 TNFR-6β 폴리펩타이드의 항원성 에피토프를 보유하는 것으로 판정된다. 또한, TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β의 항원성 에피토프를 보유하는 폴리펩타이드 단편은, 도 4 및 5에 도시된 바와 같이 상기한 제임스 울프 항원 지수의 분석을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 판정된다. TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β의 다른 에피토프-보유 부분을 판정하는 방법은 후술된다.
구체적 양태에서, 본 발명의 핵산은 길이가 100000 kb, 50000 kb, 10000 kb,1000 kb, 500 kb, 400 kb, 350 kb, 300 kb, 250 kb, 200 kb, 175 kb, 150 kb, 125 kb, 100 kb, 75 kb, 50 kb, 40 kb, 30 kb, 25 kb, 20 kb, 15 kb, 10 kb, 7.5 kb, 또는 5 kb 미만이다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 핵산은 TNFR 암호 서열중 15개 이상, 30개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 250개 이상, 500개 이상, 또는 1000개 이상의 연속적 뉴클레오타이드를 포함하나, 도 1(서열 1) 또는 도 2(서열 3)에 제시된 5' 또는 3' 암호 서열을 플랭킹하는 게놈 DNA의 1000kb, 500kb, 250kb, 150kb, 100kb, 75kbm 50kb, 30kb, 25kb, 20kb, 15kb, 10kb 또는 5kb 이하로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 핵산은 TNFR 암호 서열중 15개 이상, 30개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 250개 이상, 500개 이상, 또는 1000개 이상의 연속적 뉴클레오타이드를 포함하나, TNFR 인트론의 전부 또는 일부를 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, TNFR 암호 서열을 포함하는 핵산은 개놈 플랭킹 유전자(즉, 게놈중의 TNFR 유전자에 대한 5' 또는 3')의 암호 서열을 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 핵산은 게놈 플랭킹 유전자(들)의 1000, 500, 250, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1 이상의 암호 서열을 포함하지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 엄격한 하이브리드화 조건하에서 상기된 본 발명의 핵산 분자중의 폴리뉴클레오타이드 부분, 예를 들어, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호로서 기탁된 플라스미드중에 함유된 cDNA, 또는 도 1 및/또는 도 2에 제시된 폴리뉴클레오타이드의 단편과 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 분리된 핵산 분자를 제공한다. "엄격한 하이브리드화 조건"이란 50% 포름아미드, 5x SSC(750mM NaCl, 15mM 시트르산 삼나트륨), 50mM 인산 나트륨(pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 20㎍/㎖ 변성, 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액중에서 밤새 42℃에서 항온처리한 후, 약 65℃에서 0.1x SSC에서 필터를 세척하는 것을 의미한다.
폴리뉴클레오타이드의 "부분"과 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드란 기준 뉴클레오타이드의 약 15 뉴클레오타이드(nt) 이상, 보다 바람직하게는 약 20nt 이상, 보다 더 바람직하게는 약 30nt 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 30 내지 70(예를 들어, 50)nt와 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA 중 하나)를 나타낸다. 이들은 위에서 기술되었고 하기에서 보다 상세히 기술되는 진단용 프로브 및 프라이머 등으로서 유용하다.
"약 20nt 이상 길이"의 폴리뉴클레오타이드의 부분이란, 예를 들어, 기준 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 기탁된 cDNA 또는, 도 1 또는 도 2(서열 1 또는 3)에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열)의 뉴클레오타이드 서열로부터의 20개 이상의 연속한 뉴클레오타이드를 나타낸다. 이와 관련하여, "약"은 특히 언급된 크기, 및 한 쪽 말단 또는 양쪽 말단에서 수개(5, 4, 3, 2 또는 1개)의 뉴클레오타이드 만큼 크거나 작은 크기를 포함한다. 물론, 폴리 A 서열(TNFR cDNA의 3' 말단 폴리(A) 영역) 또는 상보적인 T(또는 U) 잔기들의 서열과만 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 핵산의 부분과 하이브리드를 형성하는데 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 중에 포함되지 않는데, 이는 폴리뉴클레오타이드는 폴리(A)서열 또는 이의 상보적인 서열(예: 프라이머로서 올리고 dT를 사용함으로써 생성되는 실제적으로 모든 이중쇄 cDNA 클론)을 포함하는 모든 핵산 분자와 하이브리드를 형성하기 때문이다.
지적한 바와 같이, TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자는 그 자체로, 성숙한 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자; 성숙한 폴리펩타이드, 및 프리-, 프로- 또는 프리프로-단백질 서열과 같은 약 26 내지 35개 아미노산의 리더 또는 분비성 서열을 암호화하는 것과 같은 부가적인 서열들을 암호화하는 서열; 전술한 부가적인 암호화 서열을 포함하거나 포함하지 않는, 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 전사, 및 스플라이싱(splicing) 및 폴리아데닐화 신호부가를 포함하는 mRNA 프로세싱, 예를 들어, mRNA의 리보솜 결합 및 안정화에서 역할을 수행하는, 전사되지만 해독되지 않는 서열들과 같은, 예를 들어, 인트론 및 비암호화 5' 및 3' 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 부가적인 비-암호화 서열; 및 부가적인 기능을 부여하는 부가적인 아미노산을 암호화하는 부가적인 암호화 서열을 함께 갖는 상기 단백질 서열은 본 발명의 핵산에 의해 암호화된다.
따라서, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 융합된 폴리펩타이드의 정제를 용이하게하는 펩타이드를 암호화하는 서열 같은, 마커 서열(marker sequence)에 융합시킬 수 있다. 본 발명의 이러한 양태의 특정한 바람직한 양태에서, 표지 아미노산 서열은 pQE 벡터(제조원: 퀴아젠, 인코포레이티드사(QIAGEN, Inc.), 캘리포니아주 91311, 차트스워드, 이톤 애비뉴 9259)에서 제공되는 태그(tag) 같은 헥사-히스티딘 펩타이드이며, 다른 것들 중 다수가 시판중이다. 문헌[Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)]에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 위해 제공된다. "HA" 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응하는 또 다른 펩타이드로서 정제에 유용하며, 문헌[Wilson et al., Cell 37: 767 (1984)]에 기술되어 있다. 하기에서 언급되는 바와 같이, 기타 이러한 융합 단백질은 N- 또는 C-말단에서 Fc에 융합된 TNFR-6α 또는 -6β를 포함한다.
본 발명은 추가로 TNFR 폴리펩타이드의 부분들, 동족체 또는 유도체를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자의 변이체에 관한 것이다. 변이체들은 천연 대립유전자 변이체(allelic variant)와 같이 천연적으로 발생할 수 있다. "대립유전자 변이체"란 유기체의 염색체 상의 주어진 좌위를 차지하는 한 유전자의 몇몇 또 다른형태 중 하나를 의미한다[Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)]. 비-천연적으로 발생하는 변이체는 당해 분야에 공지된 돌연변이 유발 기술로 작제할 수 있으며, 이에는 올리고뉴클레오타이드-매개된 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, PCR 돌연변이유발[참조 문헌: Carter et al., Nucl. Acids Res 13:4331 (1986); and Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10:6487 (1982)], 카세트 돌연변이유발[참조 문헌: Wells et al., Gene 34: 315 (1985)], 제한 선별 돌연변이유발[참조 문헌: Well et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317: 415 (1986)]이 포함되나, 이로서 제한되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명은 또한 선택된 숙주에서의 발현, 축적, 등에 보다 적합한TNFR 폴리펩타이드가 형성될 수 있도록 하나 이상의 결실, 부가 또는 치환된 아미노산 잔기를 갖는 TNFR 변이체(예: 유도체 및 동족체)를 포함한다. 예를 들면, 시스테인 잔기는 결실되거나 또 다른 시스테인 아미노산 잔기로 치환되어, 디설피드 브릿지를 제거할 수 있으며; N-연결된 글리코실화 부위는 변형되거나 제거됨으로써, 예를 들면 과글리코실화 N-연결된 부위로 공지된 효모 숙주로 부터 보다 용이하게 회수되어 정제된 균일한 생성물이 발현될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 본 발명의 TNFR 폴리펩타이드중의 임의의 하나 이상의 글리코실화 인식 부위 서열상의 제1 및 제3 아미노산 서열 모두 또는 둘중 하나에서의 다양한 아미노산 치환, 및/또는 임의의 하나 이상의 상기 인식 서열의 제2 위치에서의 아미노산 결실이 변형된 트리펩타이드 서열에서의 TNFR의 글리코실화를 방지할 것이다[참조 문헌: Miyajimo et al., EMBO J 5(6): 1193-97]. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기(예: 아르기닌 및 리신 잔기)가 결실되거나 또 다른 잔기로 치환됨으로써, 예를 들면 퓨린(furin) 또는 켁신(kexin)과 같은 프로테아제에 의한 원치 않은 프로세싱이 제거될 수 있다. 예를 들면, TNFR 폴리펩타이드 서열의 카복시 말단을 함유하는 본 발명의 폴리펩타이드는, 결실되거나 다른 잔기로 치환된 서열 2의 290 및/또는 295 위치의 아르기닌 잔기에 상응하는 아미노산 잔기를 가질 것이다.
이러한 변이체는 뉴클레오타이드 치환, 결실 및 부가에 의해 생성된 것을 포함한다. 치환, 결실 또는 부가는 하나 이상의 뉴클레오타이드와 연관될 수 있다. 변이체들은 암호화 영역, 비-암호화 영역 또는 둘 모두에서 변형될 수 있다. 암호화 영역에서의 변형은 보존적인 또는 비-보존적인 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 초래할 수 있다. 이들 중 특히 바람직한 것은 침묵(silent) 치환, 부가 및 결실이며, 이는 TNFR 폴리펩타이드 또는 이의 부분들의 특성 및 활성을 변형시키지 않는다. 또한 이와 관련하여, 특히 바람직한 것은 보존적 치환이다.
서열 2 및 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 성숙한 단백질, 또는 ATCC 기탁번호 제97810호 또는 ATCC 기탁번호 제97809호로서 기탁된 플라스미드중에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산 분자가 매우 바람직하다.
추가의 양태는, (a) 서열 2 또는 4의 완전한 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호로서 기탁된 플라스미드중에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 각각, 서열 2 또는 4의 31 내지 300 위치 또는 31 내지 170 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호로서 기탁된 플라스미드중에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (c) 각각, 서열 2 및 4의 31 내지 283 위치 및 31 내지 166 위치의 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 가용성 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (d) 서열 2 및 4의 완전한 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호로서 기탁된 플라스미드중에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는, TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β의 기능 활성을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 단편을을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (e) 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)에서의 뉴클레오타이드 서열중 하나에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드와 90% 이상, 보다 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 분리된 핵산 분자를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드도 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 추가의 양태는, 상기 (a), (b), (c), (d) 또는 (e)의 뉴클레오타이드 서열중 하나와 90% 이상, 및 보다 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 또는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 (a), (b), (c), (d) 또는 (e)의 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 하이브리드를 형성하는 이러한 폴리뉴클레오타이드는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 단지 A 잔기 또는 단지 T 잔기로만 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드와는 하이브리드를 형성하지 않는다. 본 발명의 또 다른 핵산 양태는 상기 (a), (b), (c), (d) 또는 (e)에서 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 에피토프-보유 부분의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 기준 뉴클레오타이드 서열과 예를 들어,95% 이상 "동일한" 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드란, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이, TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 기준 뉴클레오타이드 서열의 각 100개 뉴클레오타이드 당 5개 미만의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는, 기준 서열과 동일함을 나타낸다. 다시 말해서, 기준 뉴클레오타이드 서열과 80%, 85%, 90%, 92% 또는 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 수득하기 위해서는, 기준 서열 중 뉴클레오타이드의 5% 이하가 결실되거나 다른 뉴클레오타이드로 치환될 수 있거나, 기준 서열 중 전체 뉴클레오타이드의 5% 이하의 수 많은 뉴클레오타이드가 기준 서열내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이러한 돌연변이들은 기준 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서, 또는 기준 서열내 뉴클레오타이드 중에 상기 양 말단 사이의 임의의 위치에 개별적으로 산재하거나 기준 서열내에 하나 이상의 연속적인 그룹으로 존재할 수 있다. 기준 서열은 도 1(서열 1 및 2) 및 도 2(서열 3 및 4)에 제시된 전체 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 암호화 서열, 또는 본원에 기술된 바와 같은 이의 단편, 변이체, 유도체 또는 동족체일 수 있다.
실제적인 문제로서, 임의의 특정한 핵산 분자가 예를 들어, 도 1 또는 도 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열, 또는 기탁된 cDNA 클론의 하나 또는 둘다에 함유된 뉴클레오타이드 서열과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한가 하는 것은 베스트피트 프로그램(Bestfit program)(위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스 버젼 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정할수 있다. 베스트피트 프로그램은 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489 (1981)]의 국부적인 상동성 알고리즘을 사용하여 두 개의 서열 사이의 상동성이 가장 높은 단편을 찾아낸다. 베스트피트 또는 기타 서열 배열 프로그램을 사용하여, 특정 서열이 예를 들어, 본 발명에 따르는 참고 서열에 95%의 동일성이 있는지를 결정하는 경우, 물론 변수들이 설정되며, 결과적으로 동일성의 퍼센트는 기준 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 대해 계산되며 기준 서열 중 전체 뉴클레오타이드 수의 5% 이하의 상동성 차이는 허락된다. 기준 (조회)서열은 도 1(서열 1), 도 2(서열 3)에 제시된 전체 TNFR 암호화 서열, 또는 본원에 기술된 바와 같은, 임의의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리뉴클레오타이드 단편(예: 본원에 기술된 N 또는 C 말단 결실체중 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), 변이체, 유도체 또는 동족체일 수 있다.
구체적 양태에서, 기준(조회) 서열(본 발명의 서열)과 해당 서열간의 동일성(또한, 전체 서열 정렬로서 언급됨)은 문헌[Brutlag et al., Comp. App. Biosci, 6:237-245 (1990)]의 알로리즘을 기초로 하여 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정한다. 동일성%를 계산하기 위하여 DNA 서열의 FASTDB 정렬에 사용되는 바람직한 파라미터로는 매트릭스 = 단일(Unitary), k-벌(tuple) = 4, 부정합 페널티=1, 연결 패널티=30, 램던 그룹 길이=0, 컷오프 스코어=1, 갭 페널티=5, 갭 사이즈 패널티=0.05, 윈도우 사이즈=500, 또는 보다 짧은 해당 뉴클레오타이드 서열의 길이가 있다. 이러한 양태에 따르면, 해당 서열이 내부 결실이 아닌 5' 또는 3' 결실로 인해 조회 서열 보다 짧다면, 동일성%를 계산할 때, FASTDB 프로그램이해당 서열의 5' 및 3' 절두(truncation)를 고려하지 않는다는 사실을 참작하여, 당해 결과를 수작업으로 교정한다. 조회 서열에 비해, 5' 또는 3' 말단에서 절두된 해당 서열의 경우에, 동일성%는, 정합/정렬되지 않은 해당 서열의 5' 및 3'인 조회 서열의 염기수를, 조회 서열의 전체 염기%로서 계산하여 교정한다. 뉴클레오타이드가 정합/정렬되었는지에 대한 결정은 FASTDB 서열의 정렬의 결과로 판정한다. 이후, 이러한 %를 구체화된 파라미터를 사용한 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성%로 부터 공제하여, 최종 동일성% 스코어를 수득한다. 이와같이 교정된 스코어가 상기 태양의 목적을 위해 사용되는 것이다. FASTDB 정렬에 의해 나타나는 바와 같이, 조회 서열과 정합/정렬되지 않는 해당 서열의 5' 및 3' 염기외의 염기만이 동일성%를 수작업으로 조정하기 위한 목적으로 계산된다. 예를 들면, 90개의 해당 염기 서열을 100개의 조회 서열에 정렬시켜 동일성%를 결정한다. 해당 서열의 5' 말단에서 결실이 일어나기 때문에, FASTDB 정렬은 5' 말단에서 앞부분 10개의 염기의 정합/정렬을 보여주지 않는다. 쌍을 이루지 못한 10개의 염기는 서열의 10%(조회 서열중 염기의 총수당 정합되지 않은 5' 및 3' 말단에서의 염기의 수)를 나타내므로, 10%는 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성% 스코어로 부터 공제된다. 나머지 90개 염기는 완벽하게 정합되는 경우, 최종 동일성%는 90%일 것이다. 또 다른 예에서, 90개의 해당 서열은 100개의 조회 서열과 비교된다. 이 때의 결실은 내부 결실이므로, 조회 서열과 정합/정렬되지 않는, 해당 서열의 5' 또는 3'상의 염기가 존재하지 않는다. 이러한 경우에, FASTDB에 의해 계산된 동일성%는 수작업으로 교정하지 않는다. 일단 다시, 조회 서열과 정합/정렬되지 않는 해당서열의 5' 및 3' 염기만을 수작업으로 교정한다. 이러한 양태의 목적을 위하여, 다른 수작업 교정은 행하지 않는다.
본 출원은, 도 1 또는 도 2(서열 1 또는 3)에서 나타낸 핵산 서열, 기탁된 cDNA의 핵산 서열 및/또는 그밖에 본원에 기술된 핵산 서열(예: 본원에 기술된 N 및/또는 C 말단 결실의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화함)과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 핵산 분자에 관한 것으로서, 이들이 TNFR 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 것과는 무관하다. 이는, 특정한 핵산 분자가 TNFR 기능 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하지 않는 경우라도, 당해 분야의 숙련자는 예를 들어, 하이브리드화 프로브 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 프라이머로서 상기 핵산 분자를 사용하는 방법을 알고 있기 때문이다. TNFR 기능 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하지 않는 본 발명의 핵산 분자의 용도로는, 무엇보다도, 문헌[Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); and Northern Blot analysis for detecting TNFR mRNA expression in specific tissues]에 기술된 바와 같이, (1) cDNA 라이브러리에서 TNFR 유전자 또는 이의 대립유전자 변이체의 분리; (2) TNFR 유전자의 정확한 염색체상 위치를 제공하기 위한 유사분열 중기 염색체 분산체에 대한 원위치 하이브리드화 (예를 들어, "FISH")가 포함된다.
그러나, 도 1 또는 2(서열 1 또는 3)에 제시된 핵산과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 갖는 핵산 서열, 또는 ATCC 기탁번호 제97810호 또는 ATCC 기탁번호 제97809호로서 기탁된 플라스미드중에 함유된 cDNA 클론의 핵산 서열, 및/또는 본원에 기술된, 실제로 TNFR(즉, TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β) 단백질 기능 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 다른 핵산 서열(예: 본원에 기술된 N 및/또는 C 말단 결실체의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화함)이 바람직하다. "TNFR 기능 활성을 갖는 폴리펩타이드"란 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 단백질(예: 예컨대, 특히 면역분석 또는 생물학적 분석에 측정된 바와 같은 완전하고(전체 길이), 성숙한, 세포외 도메인)의 활성과 유사하지만, 반드시 동일하지는 않은 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들면, TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드가 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 활성은 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 리간드(예: Fas 리간드 및/또는 AIM(참조: 1997년 9월 25일 공개된 국제출원 공개번호 WO97/34911호)에 결합할 수 있는 능력을 측정함으로써 측정될 수 있다. 또 다른 예로서, TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 기능 활성은 유리되거나 세포 표면상에서 발현되는 동족의 리간드와 같은 폴리펩타이드가 어팝토시스를 유도할 수 있는 능력을 판정함으로써 측정된다.
TNF 패밀리 리간드는 본 발명의 TNFR-6α 및 TNFR-6β를 포함하는, TNF-패밀리 수용체에 결합함으로써 다양한 세포성 반응을 유도한다. B 임파구(CD19+), CD4 및 CD8+ T 임파구, 단핵구 및 내피 세포를 포함하는, TNFR 단백질을 발현하는 세포들은 TNFR-I 수용체 리간드에 대해 유력한 세포성 반응을 하는 것으로 인식되고 있다. "TNF-패밀리 리간드에 대한 세포성 반응"이란 TNF-패밀리 리간드에 의해 유도되는 세포, 세포주, 조직, 조직 배양물 또는 환자에 대한 유전형적, 표현형적 및/또는 형태학적 변화를 나타낸다. 지적한 바와 같이, 이러한 세포성 반응은 TNF-패밀리 리간드에 대한 정상적인 생리학적 반응 뿐만 아니라 증가된 세포 증식 또는 어팝토시스의 억제에 의한 것과 같은 증가된 세포 증식의 억제와 연관된 질병을 포함한다.
전술한 것에 대한 스크리닝 분석법은 당해 분야에 공지되어 있다. 한 가지 그러한 스크리닝 분석법은 예를 들어, 문헌[Science 246:181-196 (October 1989)]에서 기술된 바와 같이, 수용체 활성화에 의해 야기된 세포외 pH 변화를 측정하는 시스템에서 수용체를 발현하는 세포(예를 들어, 형질감염된 CHO 세포)의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, TNF-패밀리 리간드는 본 발명의 수용체 폴리펩타이드의 성숙한 형태를 발현시키는 세포와 접촉할 수 있고, 2차 메신저 반응, 예를 들어, 신호 전달 또는 pH 변화를 측정하여 TNFR 폴리펩타이드가 활성인지를 결정할 수 있다.
물론, 유전 암호의 축퇴성으로 인해, 당해 분야의 통상의 숙련자는, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호로서 기탁된 cDNA 클론의 핵산 서열, 도 1 또는 도 2(서열 1 및 3)에서 나타낸 핵산 서열, 또는 이의 단편과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 갖는 수많은 핵산 분자가 "TNFR 단백질 기능 활성을 갖는" 폴리펩타이드를 암호화할 것이라는 것을 즉시 인식할 것이다. 사실, 이러한 뉴클레오타이드 서열의 축퇴성 변이체 모두가 동일한 폴리펩타이드를 암호화하기 때문에, 이는 당해 분야의 숙련자에게 상기 기술된 비교 분석법을 수행해보지 않고도 명백할 것이다. 추가로, 축퇴성 변이체가 아닌 그러한 핵산 분자에 있어서, 합리적인 수가 TNFR 단백질 활성을 갖는 폴리펩타이드를 또한 암호화할 것이라는 것은 당해 분야에서 인식될 것이다. 이는, 하기에서 추가로 기술되는 바와 같이, 당해 분야의 숙련자는 단백질 기능에 상당한 영향을 거의 또는 전혀 미치지 않는 아미노산 치환(예를 들어, 지방족 아미노산의 제2 지방족 아미노산으로의 대체)에 대해 완전히 숙지하고 있기 때문이다.
벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 DNA 분자를 포함하는 벡터, 재조합 벡터를 사용하여 유전자 조작하거나, 또는 달리 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하도록 유전자 조작한 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 TNFR 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 제조에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 벡터(예: 클로닝 또는 발현 벡터)에 연결된다. 상기 벡터는 예를 들어, 파아지, 플라스미드, 바이러스성 또는 레트로바이러스성 벡터일 수 있다. 레트로바이러스성 벡터는 복제 수용능(competent) 또는 복제 결함성일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 증식은 일반적으로 보충성 숙주 세포에서만 일어난다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 침전물, 예를 들면 인산칼슘 침전물로서, 또는 하전된 지질과의 복합체로서 도입된다. 만일 벡터가 바이러스인 경우, 이는 적당한 패키징 세포주를 사용하여 시험관내에서 패키징한 후, 숙주 세포내로 형질도입시킬 수 있다.
일반적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포의 형질전환을 가능하게 하는 복제원 및 선별 마커(예: 이.콜라이의 앰피실린 내성 유전자 및 에스.세레비지애(S.cerevisiae) TRP1 유전자), 및 하류 구조 서열의 전사를 지시하는, 고 발현 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 그외, 이러한 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), a-인자, 산 포스포타제 또는 열 쇼크 단백질과 같은 오페론 암호화 해당 효소로부터 유래될 수 있다. 발현 작제물은 전사 개시 부위, 종결 부위, 전사 영역, 해독을 위한 리보조옴 결합 부위를 추가로 함유할 수 있다. 당해 작제물에 의해 발현된 전사체의 암호화 부분은 바람직하게는 해독될 폴리펩타이드의 전단에는 개시 코돈을, 그리고, 이의 말단에는 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)를 포함할 것이다. 이종 구조 서열은 적절한 단계에서 해독 개시 및 종결 서열, 및 바람직하게는 주변세포질 공간 또는 세포외 매질로 해독된 단백질의 분비를 지시할 수 있는 리더 서열과 함께 조립된다. 임의로, 이종 서열은 원하는 특징(예, 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순화된 정제)을 부여하는 N-말단 동정 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 DNA는 적당한 이종성 조절 요소(예: 프로모터 또는 인핸서), 예를 들어 몇개를 제시하면, 파아지 람다 PL 프로모터, 이.콜라이 lac, trp, phoA, 및 tac 프로모터, SV 40 초기(early) 및 후기(late) 프로모터, 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터와 작동적으로 결합된다. 다른 적합한 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다.
지적한 바와 같이, 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선별 마커를 포함할 것이다. 이러한 선별 마커에는 디하이드로폴레이트 리덕타제, 진핵세포 배양물에 대한 G418 또는 네오마이신 내성 유전자, 및 이.콜라이 및 다른 세균에 대한 테트라사이클린, 카나마이신 또는 앰피실린 내성 유전자가 포함된다. 적당한 숙주의 대표적인 예로는, 이.콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 살모넬라 티피뮤륨(salmonella typimurium) 세포와 같은 세균 세포; 효모 세포와 같은 진균 세포; 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 세포와 같은 곤충 세포; CHO, COS, 293 및 바우즈(Bowes) 흑색종 세포와 같은 동물 세포; 및 식물 세포가 포함되지만, 이로서 제한되는 것은 아니다. 상기한 숙주 세포를 위한 적당한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다.
상기 숙주 세포는 포유동물 세포(예: 사람-유래된 세포)와 같은 고등 진핵 세포, 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포일 수 있거나, 숙주 세포는 세균 세포와 같은 원핵세포일 수 있다. 삽입된 유전자 서열의 발현을 조절하거나 개질시키고 유전자 생성물을 원하는 특정 방식으로 프로세싱하는 숙주 종이 선택될 수 있다. 특정 프로모터로 부터의 발현이 특정 유도인자의 존재하에 증가될 수 있으며; 따라서, 유전자 조작된 폴리펩타이드의 발현이 조절될 수 있다. 또한, 상이한 숙주 세포가 단백질의 해독, 및 해독후 프로세싱 및 변형(예: 인산화, 절단)을 위한 특징적이고 특이적인 기전을 가지고 있다. 적당한 세포주는, 발현된 외래 단백질의 목적하는 변형 및 프로세싱을 보장하도록 선택된다. 숙주 세포에서 발현시키기 위한 적합한 벡터 및 프로모터의 선택은 익히 공지된 절차이고, 발현 벡터 작제, 숙주 세포로의 벡터의 도입, 및 숙주내에서의 발현에 필요한 기술은 당업계에서는 통상적인 기술이다.
세균에 유용한 발현 벡터는 목적하는 단백질을 암호화하는 DNA 구조 서열을,기능성 프로모터와 작동가능한 판독 단계에서 적합한 해독 개시 및 종결 신호와 함께 삽입하여 작제한다. 벡터는 벡터의 유지를 보장하고, 필요한 경우, 숙주내에서의 증폭을 제공하는 복제원 및 하나 이상의 표현형 선별 마커를 포함한다. 형질전환에 적합한 원핵세포 숙주로는, 비록 다른 것이 선택되어 사용될 수 있으나, 이.콜라이, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피뮤륨(Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 스타필로코커스(Staphylococcus) 속내의 여러 종이 포함된다. 세균에 유용한 발현 벡터는, 이들로 한정되는 것은 아니지만 대표적인 예로서, 익히 공지된 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 유전 요소를 포함하는 시판중에 있는 플라스미드로부터 유래된 선별 마커 및 세균 복제원을 포함할 수 있다. 이러한 상업적인 벡터로는 예를 들면 pKK223-3(스웨덴 웁살라 소재 파머시아 파인 케미칼즈) 및 GEM1(미국 위스콘신 매디슨 소재 프로메가 바이오텍)이 포함된다. 이들 pBR322 "중심" 부분은 적절한 프로모터 및 발현될 구조 서열과 결합된다. 벡터중에서, 세균에서 사용하기에 바람직한 것으로는, pHE4-5 (ATCC 기탁번호 제209311호; 및 이의 변형체), pQE70, pQE60 및 pQE-9(상기한 QlAGEN, Inc.에서 시판); pBS 벡터, Phagescript 벡터, Bluescript 벡터, pNHSA, pNHI6a, pNHI8A, pNH46A(Stratagene에서 시판); 및 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(Pharmacia에서 시판)이 있다. 이들 중에서 바람직한 진핵세포 벡터에는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT I 및 pSG(Stratagene에서 시판); 및 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(Pharmacia에서 시판)이 있다. 다른 적합한 벡터도 당업자에게는 쉽게 인지될 것이다.
적절한 숙주 균주의 형질전환 및 적절한 세포 밀도로의 숙주 균주의 성장 후, 선택된 프로모터는 적절한 수단(예, 온도 변화 또는 화학적 유도)에 의해 유도되고 세포는 추가의 기간 동안 배양된다. 세포는 전형적으로 원심분리에 의해 수거되고, 물리화학적 수단에 의해 파쇄되며, 생성된 조 추출물은 추가의 정제를 위해 보존된다.
단백질의 발현에 사용된 미생물 세포는 동결-해동 반복, 초음파처리, 기계적 파쇄 또는 세포 용해제의 사용을 포함하는 임의의 편리한 방법에 의해서도 파쇄될 수 있으며, 이러한 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다.
본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA의 고등 진핵세포에 의한 전사는 인핸서 서열을 벡터내로 삽입시킴으로써 증가될 수 있다. 인핸서는, 프로모터에 작용하여 DNA의 전사를 증가시키는 통상적으로 약 10 내지 300bp의 시스-작용성 요소이다. 예로는 복제원 bp 100 내지 270의 후기 부위상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제원의 후기 부위상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다.
또한, 다양한 포유동물 세포 배양 시스템이 재조합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예로는 문헌[Gluzman, Cell 23:175 (1981)]에 기술된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 계열, 및 적합한 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주(예: C127, 3T3, CHO, 헬라 및 BHK 세포주)가 포함된다. 포유동물 발현 벡터는 복제원, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 모든 필요한 리보조움 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여 및 수용 부위, 전사 종결 서열,및 5' 플랭킹 비전사 서열을 포함한다. SV40 스플라이스로부터 유래된 DNA 서열 및 폴리아데닐화 부위를 사용하여 필요한 비전사 유전요소를 제공할 수 있다.
숙주 세포로의 벡터 작제물의 도입은 당업계에 공지된 기술에 의해 수행될 수 있으며, 이러한 기술에는 인산칼슘 형질전환, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 양이온성 지질-매개된 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염, 또는 다른 방법이 포함되나, 이로써 제한되는 것은 아니다. 이러한 방법은 수 많은 표준 실험실 매뉴얼(예: Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986))에 기술되어 있다.
본원에 논의된 벡터 작제물을 함유한 숙주 세포이외에, 본 발명은 또한 내인성 유전물질(예, TNF-감마 암호화 서열)이 결실되거나 치환되도록 조작되고/되거나, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 연결되고 내인성 TNFF 폴리뉴클레오타이드를 활성화하고, 변경시키며/시키거나 증폭시키는 유전물질(예, 이종 폴리뉴클레오타이드 서열)이 포함되도록 조작된, 척추동물, 특히 포유동물 기원의 일차, 이차 및 불멸화된 숙주 세포를 포함한다. 예를 들면, 본 분야에 알려진 기술을 사용하여 이종 조절 영역(예, 프로모터 및/또는 인핸서) 및 내인성 TNFR 폴리뉴클레오타이드 서열을 상동 재조합을 통해 작동적으로 결합시킬 수 있다[참조: 1997년 6월 24일에 허여된 미국특허 제5,641,670호; 1996년 9월 26일에 공개된 국제특허공보 WO96/29411; 1994년 8월 4일에 공개된 국제특허공보 WO94/12650; Koller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935(1989); 및 Zijlstra et al., Nature 342:435-438(1989); 각 문헌의 전문은 본원에 참고로 원용된다].
하기에서 기술하는 숙주 세포를 통상의 방법으로 사용하여 재조합 서열에 의해 암호화되는 유전자 생성물을 제조할 수 있다. 또한, 무세포 해독 시스템을 사용함으로써, 본 발명의 DNA 작제물로부터 유래된 RNA를 사용하여 본 발명의 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 변형된 형태, 예를 들면 펩타이드 결합을 통하여 (상이한 단백질의) 이종성 단백질 서열[예: CK-베타8의 신호 펩타이드(95년 6월 23일자로 출원되어 공개된 PCT 출원 제PCT/US95/09058호에 기재되어 있는 CK-_8 서열의 아미노산 -21 내지 -1), 또는 스태니오칼신(stanniocalcin)의 신호 펩타이드(참조: 1994년 1월 25일자로 기탁된 ATCC 기탁번호 제75652호)]에 연결되어 있는 당해 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질로서 발현 또는 합성될 수 있으며, 또한 분비 산호뿐 아니라, 추가의 이종성 기능 영역을 포함할 수 있다. 이러한 융합 단백질은, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 목적하는 아미노산 서열을 암호화하는 목적하는 핵산 서열을 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 적절한 판독 프레임으로 서로 연결시키고, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 융합 단백질 생성물을 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 또한, 이러한 융합 단백질은 단백질 합성 기술, 예를 들어, 펩타이드 합성기를 사용함으로써 제조될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 추가 아미노산 영역, 특히 하전된 아미노산을 폴리펩타이드의 N-말단에 첨가하여 정제 또는 후속적인 취급 및 저장 동안 숙주 세포내에서의 안정성 및 지속성을 개선할 수 있다. 또한, 펩타이드 잔기를 폴리펩타이드에 첨가하여 정제를 용이하게 할 수 있다. 이러한 영역은 최종적인 폴리펩타이드 제조에 선행하여 제거할 수 있다. 펩타이드 잔기를 폴리펩타이드에 첨가하여 분비 또는 배설을 야기하며 안정성을 개선하고 정제를 촉진시키는 것은 당해 분야에서 일반적이며 통상적인 기술이다.
바람직한 융합 단백질은 단백질을 안정화시키고 정제하는데 유용한 면역글로불린으로부터의 이종성 영역을 포함한다. 예를 들어, EP-A-O 464 533(캐나다 상응 출원 제2045869호)에는 면역글로불린 분자의 불변 영역의 다양한 부분과 함께 또 다른 사람 단백질 또는 이의 일부을 포함하는 융합 단백질이 기재되어 있다. 다수의 경우에, 융합 단백질의 Fc 부분은 치료 및 진단에서 사용하기에 매우 유리하기 때문에 예를 들어, 약력학적 특성을 야기한다[참조: EP-A 0232 262]. 이와 달리, 일부 용도에 있어서는, 융합 단백질이 상기에서 기술한 유리한 방식으로 발현되고 검출되며 정제된 후에, Fc 부분을 제거할 수 있는 것이 바람직하다. 이는 Fc 부분이 치료 및 진단에서 사용하기에 장애가 되는 것으로 입증된 경우, 예를 들어, 융합 단백질이 면역에 대한 항원으로서 사용되는 경우이다. 약물 발견에 있어서, 예를 들어, 사람 단백질, 예를 들어, hIL-5가 hIL-5의 길항제를 동정하는 고처리량 스크리닝 분석법의 목적을 위해 Fc 부분과 융합된 바 있다[참조: D. Bennett et al., J. Molecular Recoghition 8:52-58 (1995) 및 K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995)]. 또 다른 예에서, 본 발명의 바람직한 융합 단백질은 면역글로불린 경쇄 부분(예: 카파 또는 람다 경쇄 부분)를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 카파 또는 람다 경쇄의 불변 영역 부분을 포함한다.
본 발명의 단백질은, 직접 분리 또는 배양된, 체액, 조직 및 세포를 포함하는 천연 공급원으로부터 정제된 생성물; 화학 합성법에 의한 생성물; 및 재조합 기술에 의해 원핵 또는 진핵 숙주(예: 세균, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포)로부터 제조된 생성물을 포함한다. 재조합 제조 방법에서 사용되는 숙주에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드를 글리코실화 또는 비-글리코실화 할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 숙주-매개된 방법의 결과로서, 일부 경우에 변형된 개시 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 단백질은 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다[참조: Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y. 및 Hunkapiller, M., et al., Nature 310:105-111 (1984)]. 예를 들어, 완전한 TNFR(예: TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β)의 단편에 상응하는 펩타이드는 펩타이드 합성기를 사용함으로써 합성할 수 있다. 게다가, 경우에 따라서, 비전형적 아미노산 또는 화학적 아미노산 동족체는 TNFR 폴리펩타이드 서열로 치환 또는 삽입함으로써 도입될 수 있다. 일반적으로, 비전형적인 아미노산은 통상의 아미노산의 D-이성체들, 2,4-디아미노부티르산, a-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, 아미노부티르산, 2-아미노 부티르산, g-아미노 부티르산, e-아미노 헥사논산, 6-아미노 헥사노산, 아미노 이소부티르산, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르루신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시트테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, b-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산,예를 들어, b-메틸 아미노산, Ca-메틸 아미노산, Na-메틸 아미노산, 및 일반적인 아미노산 유도체를 포함한다. 또한, 아미노산은 D(우선성) 또는 L(좌선성)일 수 있다.
당해 TNFR-6 알파 및/또는 TNFR-6 베타 단백질은 해독후 프로세싱과 자연적 방법, 또는 당해 분야에 익히 공지된 화학적 변형 기술을 사용함으로써 변형시킬 수 있다. 동일한 유형의 변형은 당해 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 단백질의 몇몇 자리에서 동일하거나 다양한 수준으로 존재할 수 있는 것이 바람직하다. 또한, TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 단백질은 수많은 유형의 변형을 포함할 수 있다. TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 단백질은, 예를 들어 유비퀴틴화의 결과로서 측쇄화될 수 있으며, 측쇄화되거나 측쇄화되지 않고 환상일 수 있다. 환상, 측쇄, 및 측쇄화된 환상 TNFR-6 알파 및/또는 TNFR-6 베타 단백질은 해독후 자연적 프로세싱에 의해 야기되거나, 합성법에 의해 제조될 수 있다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, 헴 잔기의 공유 결합, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유결합, 포스포티딜이노시톨의 공유 결합, 가교, 환형화, 디설파이드 결합 형성, 디메틸화, 공유 가교의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페질화(pegylation), 단백질용해 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 전달 RNA 매개된 아미노산의 단백질에의 첨가(예: 아르기닐화) 및 유비퀴논화를 포함한다[참조 문헌: PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES, 2nd EAD., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New york (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)].
본 발명은 해독 동안 또는 해독후에 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 그룹 보호/차단에 의한 유도체화, 단백용해성 절단, 항체 분자 또는 기타 세포 리간드로의 연결 등에 의해 상이하게 변형되는 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 단백질을 포함한다. 수많은 화학적 변형은 브롬화 시아노겐, 트립신, 키모트립신, 파파인, V8 프로테아제, 또는 NaBH4에 의한 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 산화, 환원, 및 투니카마이신 존재하의 대사적 합성 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 공지된 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명에 포함되는 추가의 해독후 변형은, 예를 들어 N-연결 또는 O-연결된 탄화수소 쇄, N-말단 또는 C-말단의 프로세싱, 아미노산 주쇄에 화학적 잔기의 부착, N-연결 또는 O-연결된 탄화수소 쇄의 화학적 변형, 및 원핵 숙주 세포 발현에 의한 N-말단 메티오닌 잔기의 첨가 또는 결실을 포함한다. 또한, 당해 폴리펩타이드는 검출 가능한 표지, 예를 들어, 효소 표지, 형광성 표지, 동위원소 표지 또는 친화성 표지를 사용하여 변형하여 단백질의 검출 및 분리가 가능하다.
본 발명에 의해 추가의 잇점, 예를 들어, 폴리펩타이드의 용해도, 안정성 및 순환 시간의 증가 또는 면역성의 감소를 제공하는 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β의 화학적 변형된 유도체가 또한 제공된다[참조 문헌: 미국 특허 제4,179,337호]. 유도체화를 위한 화학적 잔기는 수용성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카복시메틸셀룰로즈, 덱스트란, 폴리비닐 알콜 등으로부터 선택될 수 있다. 폴리펩타이드는 분자내의 무작위적 위치 또는 분자내의 예정된 위치에서 변형될 수 있으며 1 내지 3개 이상의 부착된 화학적 잔기를 포함할 수 있다.
중합체는 임의 분자량일 수 있으며 측쇄 또는 비측쇄일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 경우에, 바람직한 분자량은 취급 및 제조에 있어 용이한 약 1KDa 내지 약 100KDa(용어 "약"은 폴리에틸렌 글리콜 제조에서 일부 분자의 분자량이 언급된 분자량 이상이거나 이하일 수 있음을 나타낸다)이다. 목적하는 치료적 측면(예: 목적하는 서방출, 효과, 생물학적 활성에 있어서는 취급의 용이, 항원성의 정도 또는 결여, 및 치료적 단백질 또는 동족체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 또 다른 공지된 효과)에 따라서 또 다른 크기가 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 약 200, 500, 1000, 1500, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000,12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000 또는 100,000kDa이다.
상기된 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 측쇄 구조를 가질 수 있다. 측쇄폴리에틸렌 글리콜은 예를 들어, 문헌[참조 문헌: 미국 특허 제5,643, 575호; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); 및 Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999)]에 기술되어 있으며, 이들 각각의 기술은 본원에 참고로 인용된다.
폴리에틸렌글리콜 분자 (또는 기타 화학적 잔기)는 단백질의 작용성 또는 항원성 도메인에 있어서의 효과를 고려한다면 단백질에 부착되어 있어야 한다. 당해 분야의 숙련가에게 유용한 수 많은 부착 방법이 있다[참조: 본원에 참고로 인용된 EP 0 401 384(G-CSF에 대한 PEG의 커플링) 및 Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992)(염화트레실을 사용하는 GM-CSF의 페질화를 보고함)]. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 반응성 그룹(예: 유리 아미노 또는 카복실 그룹)에 의해 아미노산 잔기를 통하여 공유 결합될 수 있다. 반응성 그룹은 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자가 결합될수 있는 그룹이다. 유리 아미노 그룹을 갖는 아미노산 잔기는 리신 잔기 및 N-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며 유리 카복시 그룹을 갖는 아미노산 잔기는 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기 및 C-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 설피드릴 그룹이 또한 폴리에틸렌 글리콜분자 부착에 대한 반응성 그룹으로서 사용될 수 있다. 치료 목적을 위해서는 아미노 그룹, 예를 들어, N-말단 또는 리신 그룹에 부착하는 것이 바람직하다.
위에서 제시된 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 연결을 통하여 수많은 아미노산 잔기중의 어떠한 아미노산 잔기에도 부착될 수 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜은 공유 결합을 통하여 리신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산 또는 시스테인 잔기에 연결될 수 있다. 하나 이상의 반응 화학을 사용하여 폴리에틸렌 글리콜을 단백질의 특정 아미노산 잔기(예: 리신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산 또는 시스테인) 또는 단백질의 한가지 유형 이상의 아미노산 잔기(예: 리신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인 및 이의 혼합물)에 부착시킬 수 있다.
구체적으로는, N-말단에서 화학적으로 변형된 단백질이 요구될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜을 본 조성물의 예증으로서 사용하여, (분자량, 측쇄도 등이) 다양한 폴리에틸렌 글리콜 분자, 반응 혼합에 있어 단백질(또는 펩타이드)에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 비율, 수행할 페질화 반응의 유형 및 선택된 N-말단이 페질화된 단백질을 수득하는 방법으로부터 선택될 수 있다. N-말단 페질화된 제조물을 수득하는 방법(즉, 필요에 따라 또 다른 모노페질화된 잔기로부터 당해 잔기를 분리시킴)은 N-말단이 페질화된 물질을 페질화된 단백질 분자 집단으로부터 정제함으로써 가능하다. N-말단 변형에서 화학적으로 변형된 선택적 단백질은, 특정 단백질에서 유도체화에 이용 가능한 상이한 유형의 1급 아미노 그룹의 차별적인 반응성(N-말단에 대한 리신)을 이용하는 환원적 알킬화에 의해 달성될 수 있다. 적당한 반응 조건하에, 카보닐 그룹 함유 중합체와의 N-말단에서 실질적으로 단백질의 선택적인 유도체화가 성취된다.
위에서 지적한 바와 같이, 본 발명의 단백질의 페질화는 매우 많은 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 직접 또는 개재 링커(intervening linker)를 사용하여 단백질에 부착시킬 수 있다. 단백질에 폴리에틸렌 글리콜을 부착시키기 위한 링커-부재 시스템이 문헌[Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992); Francis et al., Intern. J. of Hematol. 68:1-18 (1998); U.S. Patent No.4,002,53 1; U.S. Patent No. 5,349,052; WO 95/06058 및 WO 98/324]에 기술되어 있으며, 이들 각각의 기술은 본원에 참고로 인용된다.
폴리에틸렌 글리콜을 개재 링커를 사용하지 않고 단백질의 아미노산 잔기에 직접 부착시키기 위한 시스템은, 염화트레실(ClSO2CH2CF3)을 사용하는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(MPEG)의 변형에 의해 제조되는 트레실화된 MPEG를 사용한다. 단백질과 트레실화 MPEG와의 반응시, 폴리에틸렌 글리콜은 단백질의 아민 그룹에 직접 부착된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 단백질과 2,2,2-트리플루오로에탄설포닐 그룹을 갖는 폴리에틸렌 글리콜의 반응에 의해 제조되는 단백질-폴리에틸렌 글리콜 접합체를 포함한다.
또한, 폴리에틸렌 글리콜은 다수의 상이한 개재 링커를 사용하여 단백질에 부착될 수 있다. 예를 들어, 본원에 전문이 참고로 인용되어 있는 미국 특허 제5,612,460호에는 폴리에틸렌 글리콜을 단백질에 연결시키기 위한 우레탄 링커가 기재되어 있다. 폴리에틸렌 글리콜이 링커에 의해 단백질에 부착되어 있는 단백질-폴리에틸렌 글리콜 접합체도 또한 단백질과 화합물, 예를 들어, MPEG-석시디미닐석시네이트, 1,1'-카보닐디이미다졸로 활성화된 MPEG, MPEG-2,4,5-트리크로로페닐카보네이트, MPEG-p-니트로페놀카보네이트 및 다양한 MPEG-석시네이트 유도체와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 다수의 추가 폴리에틸렌 글리콜 유도체 및 폴리에틸렌 글리콜을 단백질에 부착시키기 위한 반응 화학은 WO 98/32466에 기재되어 있으며, 이의 전문은 본원에 참고로 인용된다. 본원에서 기술되는 반응 화학을 사용하여 제조되는 페질화된 단백질 생성물은 본 발명의 범주내에 포함된다.
또한, 본 발명의 각각의 단백질에 부착되는 폴리에틸렌 글리콜 잔기의 수(즉, 치환도)는 다양하다. 예를 들어, 본 발명의 페질화된 단백질은 평균적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된다. 유사하게는, 평균 치환 정도는 단백질 분자당 예를 들어, 1 내지 3개, 2 내지 4개, 3 내지 5개, 4 내지 6개, 5 내지 7개, 6 내지 8개, 7 내지 9개, 8 내지 10개, 9 내지 11개, 10 내지 12개, 11 내지 13개, 12 내지 14개, 13 내지 15개, 14 내지 16개, 15 내지 17개, 16 내지 18개, 17 내지 19개 또는 18 내지 20개의 폴리에틸렌 글리콜 잔기의 범위내이다. 평균 치환 정도를 측정하는 방법은, 예를 들어, 문헌[참조 문헌: Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992)]에 논의되어 있다.
TNFR 단백질은, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피, 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하나 이에 국한되지 않는 공지된 방법으로 회수 및 정제될 수 있다. 가장 바람직하게는, 정제를 위해 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")를 사용한다.
TNFR 단백질
본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 서열을 함유하는 단백질을 추가로 제공한다.
본 발명의 TNFR 단백질은 단량체 또는 다량체(즉, 이량체, 삼량체, 사량체 및 보다 큰 다량체)로 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 TNFR 단백질의 단량체 및 다량체, 이들의 제조법 및 이를 포함하는 조성물(바람직하게는, 약제학적 조성물)에 관한 것이다. 구체적인 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 단량체, 이량체, 삼량체 또는 사량체이다. 추가의 양태에서, 본 발명의 다량체는 이량체, 삼량체 또는 사량체 이상이다.
본 발명에 의해 포함되는 다량체는 동종 다량체 또는 이종 다량체일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 동종다량체는 본 발명의 TNFR 단백질(본원에서 기술되는 바와 같은 TNFR 단편, 변이체 및 융합 단백질 포함) 만을 함유하는 다량체를 의미한다. 이들 동종다량체는 동일하거나 상이한 폴리펩타이드 서열을 갖는 TNFR 단백질을 포함할 수 있다. 구체적인 양태에서, 본 발명의 동종 다량체는 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는 TNFR 단백질만을 갖는 다량체이다. 또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 동종다량체는 상이한 폴리펩타이드 서열을 갖는 TNFR 단백질을 함유하는 다량체이다. 구체적인 양태에서, 본 발명의 다량체는 동종 이량체(예: 동일하거나 상이한 폴리펩타이드 서열을 갖는 TNFR 단백질을 함유하는 동종 이량체) 또는 동종 삼량체(예: 동일하거나 상이한 폴리펩타이드 서열을 갖는 TNFR 단백질을 함유하는 동종 삼량체)이다. 추가의 양태에서, 본 발명의 동종다량체성 다량체는 동종이량체, 동종삼량체 또는 동종사량체 이상이다.
본원에서 사용된, 이종다량체란 용어는, 본 발명의 TNFR 단백질에 부가하여 이종성 단백질(예: TNFR 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열에 상응하지 않는 폴리펩타이드만을 함유하는 단백질)을 함유하는 다량체를 의미한다. 특정 양테에서, 본 발명의 다량체는 이종이량체, 이종삼량체, 또는 이종사량체이다. 추가적 양태에서, 본 발명의 이종다량체는 이종이량체, 이종삼량체 또는 이종사량체 이상이다.
본 발명의 다량체는 소수성, 친수성, 이온성 및/또는 공유 결합에 의해 야기될 수 있으며/있거나 예를 들어, 리포좀 형성에 의해 간접적으로 연결될 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명의 다량체, 예를 들어, 동종이량체 또는 동종삼량체는 본 발명의 단백질이 용액중에서 서로 접촉되는 경우에 형성된다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 이종다량체, 예를 들어, 이종삼량체 또는 이종사량체는 본 발명의 단백질이 용액중에서 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 항체(본 발명의 융합 단백질중의 이종성 폴리펩타이드 서열에 대한 항체를 포함)에 접촉되는 경우에 형성된다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 다량체는 본 발명의 TNFR 단백질과의 및/또는 단백질간의 공유 결합에 의해 형성된다. 이러한 공유 결합은 당해 단백질의 폴리펩타이드 서열(예: 서열 2 또는 서열 4에 제시된 폴리펩타이드 서열, ATCC 기탁번호 제97810호에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 및 ATCC 기탁번호 제97809호에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩타이드)에 함유된 하나 이상의아미노산 잔기와 관련된다. 하나의 예에서, 공유 결합은 천연(즉 천연적으로 발생하는) 폴리펩타이드에서 상호작용하는 단백질의 폴리펩타이드내에 위치하는 시스테인 잔기간의 가교이다. 또 다른 예에서, 공유 결합은 화학적 또는 재조합 조작의 결과이다. 또는, 이러한 공유 결합은 TNFR 융합 단백질의 이종성 폴리펩타이드 서열에 함유된 하나 이상의 아미노산과 관련이 있다. 하나의 예에서, 공유 결합은 본 발명의 융합 단백질에 함유된 이종성 서열간에 존재한다[참조 문헌: 미국 특허 제5,478,925호]. 구체적 예에서, 공유 결합은 (본원에서 기술되는 바와 같이) 본 발명의 TNFR-Fc 융합 단백질에 함유된 이종성 서열간에 존재한다. 또 다른 구체적 예에서, 본 발명의 융합 단백질의 공유 결합은 공유 결합된 다량체, 예를 들어, 오스테오프로티거린(oesteoprotegerin)을 형성할 수 있는 또 다른 TNF 패밀리(family) 리간드/수용체 구성원으로부터의 이종성 폴리펩타이드 서열간에 존재한다[참조예: 국제 출원 공개공보 제WO 98/49305호, 이의 전문은 본원에 참고로 인용된다]. 또 다른 양태에서, 2개 이상의 본 발명의 TR6-알파 및/또는 TR6-베타 폴리펩타이드는 펩타이드 링커를 통하여 결합된다. 링커의 예는 문헌[참조 문헌: 미국 특허 제5,073,627호, 이는 본원에 참고로 인용된다]에 기술되어 있는 당해 펩타이드 링커를 포함한다. 펩타이드 링커에 의해 분리된 다량체 TR6-알파 및/또는 TR6-베타 폴리펩타이드를 포함하는 단백질은 통상의 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 다량체 TR6-알파 및/또는 TR6-베타 폴리펩타이드를 제조하는 또 다른 방법은 루신 지퍼(leucine zipper) 또는 이소루신 지퍼(isoleucine zipper)폴리펩타이드 서열에 결합된 TR6-알파 및/또는 TR6-베타 폴리펩타이드의 사용과 관련된다. 루신 지퍼 및 이소루신 지퍼 도메인은 이들 도메인이 발견되는 단백질의 다량체화를 촉진하는 폴리펩타이드이다. 루신 지퍼는 수개의 DNA-결합 단백질에서 최초로 동정되었으며[참조 문헌: Landschylz et al., Science 240: 1759, (1998)] 다양한 종류의 상이한 단백질에서 발견된 바 있다. 공지된 루신 지퍼는 천연 발생 펩타이드 및 이량체화 또는 삼량체화된 이의 유도체이다. 가용성 다량체 TR6-알파 및/또는 TR6-베타 단백질을 제조하는데 적합한 루신 지퍼 도메인의 예에는 문헌[참조 문헌: PCT 출원 WO 94/10308, 이는 본원에 참고로 인용된다]에 기재되어 있는 루신 지퍼 도메인이 있다. 용액중에서 이량체화 또는 삼량체화 펩타이드에 융합된 가용성 TR6-알파 및/또는 TR6-베타 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 융합 단백질은 적합한 숙주 세포내에서 발현되고 수득되는 가용성 다량체 TR6-알파 및/또는 TR6-베타는 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 배양물 상청액으로부터 회수한다.
TNF 패밀리의 특정 구성원은 삼량체 형태로 존재하는 것으로 여겨진다[참조 문헌: Beutler and Huffel, Science 264:667, 1994: Banner et al., Cell 73:431, 1993)]. 따라서, 삼량체 TR6-알파 및/또는 TR6-베타는 생물학적 활성을 증가시키는이라는 잇점을 제공한다. 바람직한 루신 지퍼 잔기는 우선적으로 삼량체를 형성하는 잔기이다. 한가지 예는 문헌[참조 문헌: Hoppe et al., FEBS Letters 344:199, (1994) 및 미국 특허원 제08/446,922호, 이는 본원에 참고로 인용된다]에 기술되어 있는 바와 같은 폐 계면활성 단백질 D(SPD)로부터 유래된 루신 지퍼이다. 천연 발생 삼량체 단백질로부터 유래된 또 다른 펩타이드를 삼량체 TR6-알파 및/또는 TR6-베타를 제조하는데 사용할 수 있다.
추가의 바람직한 양태에서, 본 발명의 TR-6알파 및/또는 TR-6베타 폴리펩타이드는 "FLAG" 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리펩타이드에 융합된다. 따라서, TR6-알파-FLAG 또는 TR6-베타-FLAG 융합 단백질이 본 발명에 포함된다. FLAG 항원성 폴리펩타이드는 아미노 또는 카복시 말단의 어느 한쪽 또는 둘다에서 본 발명의 TR6-알파 또는 TR6-베타 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. 바람직한 양태에서, TR6-알파-FLAG 또는 TR6-베타-FLAG 융합 단백질은 pFLAG-CMV-5a 또는 pFLAG-CMV-1 발현 벡터[판매원: Sigma, St. Louis, MO, USA]로부터 발현된다[참조 문헌: Andersson, S., et al., J. Biol. Chem. 264:8222-29 (1989); Thomsen, D. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:659-63 (1984) 및 Kozak, M., Nature 308:241 (1984), 이는 본원에 참고로 인용된다]. 추가의 바람직한 양태에서, TR6-알파-FLAG 또는 TR6-베타-FLAG 융합 단백질은 항-FLAG 모노클로날 항체[판매원: Sigma, St. Louis, MO, USA]에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 다량체는 당해 분야에 공지된 화학 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 바람직하게는 본 발명의 다량체에 함유되는 단백질은 링커 분자 및 당해 분야에 공지된 링커 분자 길이 최상화 기술을 사용하여 화학적으로 가교될 수 있다[참조 문헌: 미국 특허 제5,478,925호, 이의 전문은 본원의 참조로 인용된다]. 또한, 본 발명의 다량체는, 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 바람직하게는 다량체에 함유되는 단백질의 폴리펩타이드 서열내에 위치하는 시스테인 잔기간에 하나 이상의 분자간 가교를 형성할 수 있도록 생성된다[참조 문헌: 미국 특허제5,478,925호, 이의 전문은 본원에 참고로 인용된다]. 추가로, 본 발명의 단백질은 단백질의 폴리펩타이드 서열의 C 말단 또는 N-말단에 시스테인 또는 비오틴을 첨가함으로써 통상적으로 변형될 수 있으며 당해 분야에 공지된 기술을 하나 이상의 이들 변형된 단백질을 함유하는 다량체를 생성하는데 적용할 수 있다[참조 문헌: 미국 특허 제5,478,925호,이의 전문은 본원에 참고로 인용된다]. 또한, 당해 분야에 공지된 기술을 바람직하게는 본 발명의 다량체에 함유되는 단백질 성분을 함유하는 리포좀을 생성시키는데 적용할 수 있다[참조 문헌: 미국 특허 제5,478,925호, 이의 전문은 본원에 참고로 인용된다].
또는, 본 발명의 다량체는 당해 분야에 공지된 유전 공학기술을 사용하여 제조할 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 다량체에 함유된 단백질은 본원에 기술되어 있거나 당해 분야에 공지된 융합 단백질 기술을 사용하여 재조합적으로 제조한다[참조 문헌: 미국 특허 제5,478,925, 이의 전문은 본원에 참고로 인용된다]. 구체적 양태에서, 본 발명의 동종이량체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 링커 폴리펩타이드를 암호화하는 서열에 연결시키고 이어서 본래의 C 말단 내지 N 말단의 역 배향으로 해독된 폴리펩타이드 생성물(리더 서열이 결여됨)을 암호화하는 합성 폴리뉴클레오타이드에 추가로 연결시킴으로써 생성된다[참조 문헌: 미국 특허 제5,478,925호, 이의 전문은 본원에 참고로 인용된다]. 또 다른 양태에서, 본원에 기술되어 있거나 당해 분야에 공지된 재조합 기술은 막관통(transmembrane) 도메인을 함유하며 막 재구성 기술에 의해 리포좀으로 혼입될 수 있는 재조합 폴리펩타이드를 생성시키는데적용된다[참조 문헌: 미국 특허 제5,478,925호, 이의 전문은 본원에 참고로 인용된다].
하나의 양태에서, 본 발명은, ATCC 기탁번호 제97810호에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 완전한(전체 길이) TNFR 폴리펩타이드의 아미노산 서열, ATCC 기탁번호 제97809호에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 완전한(전체 길이) TNFR 폴리펩타이드의 아미노산 서열, 도 1에 기재된 완전한 TNFR-6α 폴리펩타이드의 아미노산 서열(서열 2), 도 2에 기재된 완전한 TNFR-6β 폴리펩타이드의 아미노산 서열(서열 4), 또는 상기 폴리펩타이드의 일부를 포함하거나, 또는 이러한 아미노산 서열로 이루어진 분리된 TNFR 단백질을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, ATCC 기탁번호 제97810호에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 성숙 TNFR 폴리펩타이드의 아미노산 서열, ATCC 기탁번호 제97809호에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 성숙 TNFR 폴리펩타이드의 아미노산 서열, 도 1에 기재된 TNFR-6α 서열의 아미노산 잔기 31번 내지 300번 , 도 2에 기재된 TNFR-6β 서열(서열 4)의 아미노산 잔기 31번 내지 170번, 또는 상기 폴리펩타이드의 일부(즉, 단편)를 포함하거나, 또는 이러한 아미노산 서열로 이루어진 분리된 TNFR 단백질을 제공한다.
본 발명의 폴리펩타이드 단편은 서열 2에 함유된 아미노산 서열, 서열 4에 함유된 아미노산 서열, ATCC 기탁번호 제97810호로서 기탁된 cDNA 플라스미드에 의해 암호화되는 아미노산 서열, 또는 ATCC 기탁번호 제97810호 및/또는 제97809호에 함유된 cDNA의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 엄격한 하이브리드화 조건하에서)과 하이브리드를 형성하는 핵산에 의해 암호화되는 아미노산 서열 또는 도 1 및/또는 2에 나타낸 아미노산 서열(각각 서열 1 및 서열 3) 또는 이에 상보적인 쇄를 포함하거나, 또는 이러한 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 단편과 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포함된다. 단백질 단편은 "유리 상태(free-standing)" 또는 상기 단편이 보다 큰 폴리펩타이드내에 포함되어 이의 일부 또는 영역을 형성하며, 가장 바람직하게는 단일 연속 영역으로서 존재할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 단편의 대표적인 예에는, 예를 들어 서열 2의 아미노산 잔기 1번 내지 31번, 32번 내지 50번, 51번 내지 100번, 101번 내지 150번, 151번 내지 200번, 201번 내지 250번 및/또는 251번 내지 300번를 포함하거나, 또는 이러한 아미노산 잔기로 이루어진 단편이 포함된다. 본 발명의 폴리펩타이드 단편의 추가의 대표적인 예에는, 서열 4의 아미노산 1번 내지 31번, 32번 내지 70번, 70번 내지 100번, 100번 내지 125번, 126번 내지 150번 및/또는 151번 내지 170번을 포함하거나, 또는 이러한 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 단편이 포함된다. 게다가, 폴리펩타이드 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175 또는 200개 이상의 아미노산의 길이일 수 있다. 이들 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
구체적 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 단편은 도 1(서열 2)에 나타낸 바와 같은 아미노산 잔기 100번 내지 150번, 150번 내지 200번, 200번 내지 300번, 210번 내지 300번, 220 내지 300번, 230번 내지 300번, 240번 내지 300번, 250번내지 300번, 260번 내지 300번, 270번 내지 300번 및/또는 290번 내지 300번을 포함하거나, 또는 이러한 아미노산 잔기로 이루어진다. 이들 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드도 본원중에 포함된다.
TNFR은 상이한 구조적 및 작용성을 갖는 2개의 도메인을 포함한다. 서열 2의 아미노 말단 도메인 스패닝 잔기 30번 내지 196번은 TNFR 패밀리중에서 4개의 시스테인이 풍부한 도메인 특성이 보존됨으로써 TNF 패밀의 다른 구성원과 상동성을 나타낸다. 각각의 4개의 도메인에 함유된 아미노산 서열은 개별적으로 서열2의 아미노산 잔기 34번 내지 70번, 73번 내지 113번, 115번 내지 150번 및 153번 내지 193번을 포함한다. 서열 2의 카복시 말단 도메인, 스패닝 아미노산 잔기 197번 내지 300번은 공지된 어떠한 서열과도 현저한 상동성을 나타내지 않는다. 다수의 다른 TNFR 수용체 패밀리 구성원과는 달리, TNFR은 오직 분비 단백질로만 존재하는 것으로 보이며 막 결합 형태로서 합성되지 않는 것으로 보인다. TNFR의 아미노 말단 도메인 TNFR의 생물학적 활성을 위해 요구되며, 카복시 말단 도메인은 TNFR의 다량체화에 중요한 것으로 간주된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 2의 아미노산 잔기 34번 내지 70번, 73번 내지 113번, 115번 내지 150번 및 153번 내지 193번 및/또는 30번 내지 196번을 포함하거나, 또는 이러한 아미노산 잔기로 이루어진다. 이들 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 포함된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 2의 아미노산 잔기 197번 내지 240번, 241번 내지 270번, 271번 내지 300번 및/또는 197번 내지 300번을 포함하거나, 또는 이러한 아미노산 잔기로 이루어진다. 이들 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포함된다. 이들 폴리펩타이드 서열은 TNFR의 다량체화와 연관이 있다고 여겨지기 때문에, 하나 이상의 이들 폴리펩타이드 서열을 갖는 단백질은 이량체, 삼량체 및 보다 큰 다량체를 형성하는 것으로 예상되며, 이는 유리한 특성, 예를 들어, 단량체성 형태와 비교하여 증가된 결합 친화성, 보다 큰 안정성 및 보다 긴 순환 반감기를 갖을 수 있다. 구체적 양태에서, 하나 이상의 상기 폴리펩타이드가 세포 신호전달 분자, 예를 들어, 수용체, 이의 세포외 도메인 및 수용체의 활성 단편, 유도체 또는 동족체 또는 세포외 도메인의 이종성 서열에 융합되는 것을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 바람직한 양태에서, 이종성 서열은 TNR-유사 수용체의 패밀리로부터 선택된다. 이러한 서열은 바람직하게는 기능성 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하며 기능성 막관통 도메인 및/또는 세포질 도메인은 결여되어 있다. 이러한 융합 단백질은 융합된 이종성 서열과 상호작용하는 분자를 검출함으로써 잠재적인 새로운 수용체 및 리간드를 동정하는데 유용하다. 융합 단백질은 또한 다양한 질환, 예를 들어, 수용체 결합 관련 질환의 치료에 유용하다. 하나의 양태에서, TNF/TNFR 및 TNF 수용체/TNFR 서열을 포함하는 본 발명의 융합 단백질은 TNF 및 TNF 수용체 매개 질환, 예를 들어, 염증, 자가면역 질병, 암 및 과도하거나 감소된 어팝토시스와 관련된 질환을 치료하는데 사용된다.
추가의 양태로, 본 발명의 폴리펩타이드의 기능성 영역, 예를 들어, Garnier-Robson 알파-영역, 베타-영역, 턴-영역 및 코일 영역, Chou-Fasman 알파-영역, 베타-영역 및 코일 영역, Kyte-Doolittle 친수성 영역, Eisenberg 알파- 및 베타-양쪽성 영역, Karplus-Schulz 유연성 영역, Emini 표면-형성 영역 및 고 항원 지수의 제임슨-울프 영역을 포함하거나, 이러한 영역으로 이루어진 TNFR 폴리펩타이드 단편이 본원에서 기술된 바와 같이 도 4(표 1) 및 도 5(표 2)에 제시된다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 단편은 항원성이다. 표 Ⅰ 및 Ⅱ의 컬럼 Ⅷ, Ⅸ, ⅩⅢ 및 ⅩⅣ에 제시된 데이터는 통상적으로 항원성에 있어 높은 정도의 잠재성을 나타내는 TNFR의 영역을 측정하는데 사용될 수 있다. 고 항원성 영역은 항원 인식이 면역 반응의 개시 과정에서 일어날 수 있는 환경에서 폴리펩타이드의 표면에 노출되기 쉬운 폴리펩타이드의 영역을 나타내는 값을 선택함으로써 컬럼 Ⅷ, Ⅸ, ⅩⅢ 및 ⅩⅣ에 제시된 데이터로부터 측정된다. 본 발명의 매우 바람직한 단편은 수가지의 구조적 특징, 예를 들어, 상기에서 기술한 수가지(예: 1, 2, 3 또는 4가지)의 특징을 갖는 TNFR의 영역을 포함하는 단편이다. 이들 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명은, 각각의 서열 2 및 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 에피토프, 또는 각각의 기탁된 클론 ATCC 기탁번호 제97810호 및 제97809호에 함유된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 서열의 에피토프, 또는 상기에서 정의된 바와 같은 엄격한 하이브리드화 조건 또는 낮은 엄격성의 하이브리드화 조건하에서 각각의 서열 1 및 3의 서열의 상보체, 또는 각각의 기탁된 클론 ATCC 기탁번호 제97810호 및 제97809호에 함유된 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 에피토프를 포함하거나, 또는 이러한 에피토프로 이루어진 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 폴리펩타이드 서열의 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 서열 1 및/또는 3에 기재된 서열), 본 발명의 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 상보적인 쇄의 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 상기에서 정의된바와 같은 엄격한 하이브리드화 조건 또는 낮은 엄격성 하이브리드화 조건하에서 상보적인 쇄와 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 사람에서 항원성 또는 면역원성 활성을 갖는 폴리펩타이드의 부분을 지칭한다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드뿐만 아니라 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에서 사용되는 "면역원성 에피토프"는 당해 분야에 공지된 임의 방법, 예를 들어, 하기에서 기술하는 항체 생성 방법을 사용하여 측정한 바와 같이 동물에서 항체 반응을 유도하는 단백질 부분으로서 정의된다[참조 문헌: Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983)]. 본원에서 사용되는 용어 "항원성 에피토프"는 당해 분야에 익히 공지된 임의 방법, 예를 들어, 본원에 기술된 면역분석법에 의해 측정된 바와 같이, 항체가 면역특이적으로 이의 항원에 결합하는 단백질 부분으로서 정의된다. 면역특이적 결합은 비특이적 결합을 제외하나 다른 항원과의 교차-반응성을 반드시 배제하는 것은 아니다. 항원성 에피토프가 반드시 면역원성일 필요는 없다.
TNFR-특이적 항체를 생성시키는데 사용될 수 있는 항원성 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 비제한적 예에는 서열 2의 약 Ala-31 내지 Thr-46, 약 Phe-57 내지 약 Thr-117, 약 Cys-132 내지 약 Thr-175, 약 Gly-185 내지 약 Thr-194, 약 Val-205 내지 약 Asp-217, 약 Pro-239 내지 약 Leu-264 및 약 Ala-283 내지 약 Pro-298, 및 서열 4의 약 Ala-31 내지 약 Thr-46, 약 Phe-57 내지 약 Gln-80, 약 Glu-86 내지 약 His-106, 약 Thr-108 내지 약 Phe-119, 약 His-129 내지 약 Val-138 및 약 Gly-142 내지 약 Pro-166가 포함된다. 이러한 폴리펩타이드 단편은 상기 도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, 제임슨-울프 항원 지수의 분석에 의해 각각의 TNFR-6 알파 및 TNFR-6 베타의 항원성 에피토프를 함유하는 것으로 측정되었다.
에피토프로서 작용하는 단편은 어떠한 통상의 방법에 의해서도 제조될 수 있다[참조 문헌: Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985), 미국 특허 제4,631,211호에 추가로 기술되어 있음].
본 발명에서, 항원성 에피토프는 바람직하게는 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 8개 이상. 9개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상의 아미노산 및 가장 바람직하게, 약 15개 내지 약 30개의 아미노산을 포함한다. 면역원 또는 항원성 에피토프를 포함하는 바람직한 폴리펩타이드는 길이가 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상, 45개 이상, 50개 이상, 55개 이상, 60개 이상, 65개 이상, 70개 이상, 75개 이상, 80개 이상, 85개 이상, 90개 이상, 95개 이상 또는 100개 이상인 아미노산 잔기이다. 항원성 에피토프는 예를 들어, 에피토프에 특이적으로결합하는 모노클로날 항체를 포함하는 항체를 제조하는데 유용하다. 항원성 에피토프는 면역분석에서 표적 분자로서 사용될 수 있다[참조 문헌: Wilson et al., Cell 37:767-778(1984); Sutcliffe et al., Science 219:660-666(1983)].
유사하게, 면역원성 에피토프가 예를 들어, 당해 분야에 공지된 방법[참조 문헌: Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra; Chow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914; and Bittle et al., J. Gen. Virol. 66:2347-2354(1985)]에 따라 항체를 유도하는데 사용될 수 있다. 하나 이상의 면역원성 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드가 동물 시스템(예를 들어, 래빗 또는 마우스)에 제공되어 알부민과 같은 담체 단백질과 함께 항체 반응을 유도할 수 있거나 폴리펩타이드가 충분히 긴 경우(약 25개 이상의 아미노산), 폴리펩타이드는 담체 없이 제공될 수 있다. 그러나, 8 내지 10개 정도의 소수의 아미노산을 포함하는 면역원성 에피토프는 변성된 폴리펩타이드에서 매우 적은 비율로 선형 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 발생시키는데 충분한 것으로 보여진다(예: 웨스턴 블롯팅의 경우).
본 발명의 에피토프-보유 폴리펩타이드를 사용하여, 생체내 면역화, 시험관내 면역화 및 파아지 디스플레이 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는, 당해 분야에 익히 공지된 방법에 따라 항체를 유도할 수 있다[참조예: Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra 및 Bittle, F. J. et al., J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985)]. 생체내 면역화를 사용하는 경우, 동물을 유리 펩타이드로 면역화시킬 수 있으나, 항-펩타이드 항체 역가는 펩타이드를 거대분자 담체, 예를 들어, 키홀 림펫 헤마시아닌(KLH) 또는 파상풍 톡소이드에 결합시켜 부스팅시킬 수 있다.예를 들어, 말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르(MBS)와 같은 링커를 사용하여 시스테인 잔기를 함유하는 펩타이드를 담체에 결합시킬 수 있는 한편, 글루타르알데히드와 같은 보다 일반적인 연결제를 사용하여 다른 펩타이드를 담체에 결합시킬 수 있다. 래빗, 랫트 및 마우스와 같은 동물을, 예를 들어, 약 100㎍ 펩타이드 또는 담체 단백질 및 프로인트 애주번트 또는 면역반응 자극용으로 공지된 임의의 기타 애주번트를 함유하는 유제의 복강내 및/또는 피내 주사에 의해 유리 또는 담체-결합된 펩타이드로 면역화시킨다. 수회의 부스터 주사는, 예를 들어, 고체 표면에 흡착된 유리 펩타이드를 사용하는 ELISA 검정법에 의해 검출할 수 있는 항-펩타이드 항체의 유용한 역가를 제공하기 위해, 예를 들어, 약 2주 간격으로 필요로 할 수 있다. 면역화된 동물로부터의 혈청 내에서의 항-펩타이드 항체의 역가는, 예를 들어, 고체 지지체 상에의 펩타이드의 흡착에 의한 항-펩타이드 항체의 선택 및 당해 분야에 익히 공지된 방법에 따라 선택된 항체의 용리에 의해 증가될 수 있다.
당해 분야의 숙련가가 인지할 수 있으며, 위에서 논의한 바와 같이, 면역원성 또는 항원성 에피토프를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드를 다른 폴리펩타이드 서열에 융합시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드는 면역글로불린(IgA, IgE, IgG, IgM)의 불변 도메인 또는 이의 부분(CH1, CH2, CH3 또는 임의의 이의 조합물 및 이의 부분)과 융합시켜, 키메라 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있다. 이러한 융합 단백질은 정제를 용이하게 할 수 있고, 생체내 반감기를 증가시킬 수 잇다. 이는 사람 CD4-폴리펩타이드의 첫 번째 2개 도메인과 포유동물 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 각종 도메인으로 이루어진 키메라 단백질에 대해 밝혀졌다[참조: EP A 394,827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)]. IgG 부분 디설파이드 결합으로 인해 디설파이드-결합된 이량체 구조를 갖는 IgG 융합 단백질은 단량체성 폴리펩타이드 또는 이의 단편 단독보다 다른 분자를 결합시키고 중화시키는데 보다 효과적인 것으로 밝혀져 있다[참조예: Fountoulakis et al., J. Biochem., 270:3958-3964 (1995)]. 상기 에피토프를 암호화하는 핵산을 또한 에피토프 태그(예: 헤마글루티닌("HA") 태그 또는 플래그 태그)로서의 목적 유전자와 재조합시켜, 발현된 폴리펩타이드의 검출 및 정제에 도움을 줄 수 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897]에 기술된 시스템은 사람 세포주에서 발현된 비변성된 융합 단백질의 즉석 정제를 가능하게 한다. 이러한 시스템에서는, 목적 유전자를 백시니아 재조합 플라스미드내로 서브클로닝시켜, 당해 유전자의 개방형 판독 프레임을 6개의 히스티딘 잔기로 이루어진 아미노-말단 태그에 해독적으로 융합시킨다. 당해 태그는 융합 단백질에 대한 매트릭스 결합 도메인으로서 작용한다. 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 세포로부터의 추출물을 Ni2+니트릴로아세트산-아가로스 컬럼에 로딩시키고, 히스티딘-태그된 단백질을 이미다졸-함유 완충액으로 선택적으로 용출시킬 수 있다.
유전자-셔플링(shuffling), 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링("DNA 셔플링"으로 총칭함)의 기법을 이용하여, TR6-알파 및/또는 TR6-베타의활성을 조절함으로써, TR6-알파 및/또는 TR6-베타의 효능제 및 길항제를 효과적으로 생성시킬 수 있다[통상적 참조 문헌: 미국 특허 제5,605,793호, 제5,811,238호, 제5,830,721호, 제5,834,252호 및 제5,837,458호, 및 Patten et al., Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33(1997); Harayama, S. Trends Biotechnol. 16(2):76-82(1998); Hansson, L. 0., et al., J. Mol. Biol. 287:265-76(1999); and Lorenzo, M. M. and Blasco, R. Biotechniques 24(2):308-13(1998), 이들 특허 및 문헌은 본원에 참고로 인용되어 있다)]. 특정 양태에서, TR6-알파 및/또는 TR6-베타 폴리뉴클레오타이드 및 상응하는 폴리펩타이드의 변형은 DNA 셔플링에 의해 달성할 수 있다. DNA 셔플링은, 동종성 또는 부위-특이적 재조합에 의해 2종 이상의 DNA 절편을 목적하는 TR6-알파 및/또는 TR6-베타 분자로 조립함을 포함한다. 또 다른 양태에서, TR6-알파 및/또는 TR6-베타 폴리뉴클레오타이드 및 상응하는 폴리펩타이드는, 재조합 이전에 에러-프론(error-prone) PCR, 랜덤 뉴클레오타이드 삽입 또는 기타 방법에 의해 랜덤 돌연변이유발시킴으로써 변형될 수 있다. 또 다른 양태에서, TR6-알파 및/또는 TR6-베타의 하나 이상의 성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편 등을 하나 이상의 이종성 분자의 하나 이상의 성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합할 수 있다. 바람직한 양태에서, 이종성 분자는 TNF-알파, 림포독소-알파, 림포독소-베타, FAS 리간드, APRIL이다. 추가의 바람직한 양태에서, 이종성 분자는 TNF 패밀리 중의 한 구성원이다.
또한, 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링("DNA 셔플링"으로 총칭함)의 기법을 이용하여, TNFR의 활성을 조절함으로써 TNRF의 효능제 및 길항제를 효과적으로 생성시킬 수 있다[일반적 참조 문헌: 미국 특허 제5,605,793호, 제5,811,238호, 제5,830,721호, 제5,834,252호 및 제5,837,458호, 및 Patten et al., Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33(1997); Harayama, S. Trends Biotechnol. 16(2):76-82(1998); Hansson, L. 0., et al., J. Mol. Biol. 287:265-76(1999); and Lorenzo, M. M. and Blasco, R. Biotechniques 24(2):308-13(1998), 이들 특허 및 문헌은 본원에 참고로 인용되어 있다)]. 특정 양태에서, TNFR 폴리뉴클레오타이드 및 상응하는 폴리펩타이드의 변형은 DNA 셔플링에 의해 달성할 수 있다. DNA 셔플링은 동종성 또는 부위-특이적 재조합에 의해 2종 이상의 DNA 절편의 목적하는 TNFR 분자로 조립함을 포함한다. 또 다른 양태에서, TNFR 폴리뉴클레오타이드 및 상응하는 폴리펩타이드는 재조합 이전에 에러-프론 PCR, 랜덤 뉴클레오타이드 삽입 또는 기타 방법에 의해 랜덤 돌연변이유발시킴으로써 변형될 수 있다. 또 다른 양태에서, TNFR의 하나 이상의 성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편 등을 하나 이상의 이종 분자의 하나 이상의 성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합할 수 있다. 바람직한 양태에서, 이종성 분자는 TNF-알파, 림포독소-알파(LT-알파, TNF-베타로서도 공지됨), LT-베타 (복합체 이종삼량체 LT-알파2-베타에서 발견됨), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-IBBL, DcR3, OX40L, TNF-감마(국제 공보 제WO 96/14328), TRAIL, AIM-II(국제 공보 제WO 97/34911), APRIL(J. Exp. Med. 188(6):1185-1190), 엔도킨-알파(국제 공보 제WO 98/07880), 뉴트로킨 알파(국제 공보 제W0 98/18921호), TR6(국제 공보 제WO 98/30694호), OPG, OX40, 및 신경 성장 인자(NGF), 및 Fas, CD30, CD27, CD40 및4-IBB의 가용성 형태, TR2(국제 공보 제WO 96/34095호), DR3(국제 공보 제WO 97/33904호), DR4(국제 공보 제WO 98/32856호), TR5(국제 공보 제WO 98/30693호), TR7(국제 공보 제WO 98/41629호), TRANK, TR9(국제 공보 제WO 98/56892호), TR1O(국제 공보 제WO 98/54202호), 312C2(국제 공보 제WO 98/06842호), 및 TR12, 및 CD154, CD70, 및 CD153의 가용성 형태를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 추가의 바람직한 양태에서, 이종성 분자는 TNF 계열 중의 한 구성원이다.
TNFR 폴리펩타이드의 특성을 개선시키거나 변형시키기 위해, 단백질 조작법을 이용할 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여, 단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실, 첨가 또는 융답 단백질을 포함하는 신규한 돌연변이체 단백질 또는 "뮤테인"을 생성시킬 수 있다. 이러한 변형된 폴리펩타이드는, 예를 들어, 증강된 활성 또는 증가된 안정성을 나타낼 수 있다. 또한, 이들은 최소한 특정 정제 및 저장 조건하에 보다 높은 수율로 정제되어, 상응하는 천연 폴리펩타이드보다 우수한 가용성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 막 관련된 단백질의 세포외 영역 또는 분비된 단백질의 성숙한 형태(들)를 포함하는 다수의 단백질의 경우에, 하나 이상의 아미노산이 생물학적 기능의 실질적 손실없이 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실되어 있음이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Ron et al., J. Biol. Chem., 268:2984-2988 (1993)]에는 3,8 또는 27개 아미노-말단 아미노산 잔기가 결여된 경우에도 헤파린 결합 활성을 갖는 변형된 KGF 단백질이 보고되어 있다.
당해 경우에, 본 발명의 단백질이 TNFR 폴리펩타이드 패밀리의 구성원이므로, 서열 2 및 4(TNFR-6 알파 및 TNFR-6 베타)의 위치 49의 시스테인까지의 N-말단 아미노산의 결실체는, 예를 들어, 세포 증식 및 어팝토시스의 조절(예: 림프양 세포의 경우) , Fas 리간드((FasL)를 결합시키는 능력 및 AIM-II를 결합시키는 능력과 같은 특정의 생물학적 활성을 보유할 것이다. 서열 2 및 4에서 Cys-49 잔기를 포함한 추가의 N-말단 결실을 갖는 폴리펩타이드는 상기 생물학적 활성을 보유할 것으로 예상되지 않는데, 이는 TNFR-관련 폴리펩타이드에서 이들 잔기가 수용체/리간드 결합 및 신호전달에 필요한 구조 안정성을 제공하는 디설파이드 브릿지를 형성하는데 필요하기 때문이다. 그러나, 단백질의 N-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산의 결실이 단백질의 1종 이상의 생물학적 기능의 손실의 변형을 초래하더라도, 다른 기능적 활성은 여전히 유지될 것이다. 이와 같이, 완전하거나 성숙한 TNFR 또는 TNFR 단백질의 세포외 영역을 인식하는 항체를 유도하고/하거나 이에 결합하는 단축된 단백질의 능력은 일반적으로 완전한 TNFR, 성숙한 TNFR 또는 TNFR의 세포외 영역의 잔기의 과반수 미만을 N-말단으로부터 제거할 경우에 보유될 것이다. 완전한 단백질의 N-말단 잔기가 결여된 특유의 폴리펩타이드가 이러한 면역학적 활성을 보유하는지의 여부는 본원에 기술되고 달리 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 49번 위치에서 시스테인 잔기까지의 서열 2 및 4에 제시된 TNFR의 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터 결실된 하나 이상의 잔기를 포함하거나, 또는 이러한 잔기로 이루어진 폴리펩타이드 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 도 1(서열 2)의 잔기 m-300 또는 도 2(서열 4)의 잔기 n-170의 아미노산 서열[여기서, m 및 n은 1 내지 49의 정수이고, 49는 TNFR-6α 및 TNFR-6β 단백질의 활성에 필요한 것으로 간주되는 완전한 TNFR-6α 및 TNFR-6β 폴리펩타이드(각각 서열 2 및 4에 제시됨)의 N-말단으로부터의 제1 시스테인 잔기의 위치이다]을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 TNFR 폴리펩타이드를 제공한다.
보다 특히, 본 발명은 서열 2의 잔기: 1-300, 2-300, 3-300, 4-300, 5-300, 6-300, 7-300, 8-300, 9-300, 10-300, 11-300, 12-300, 13-300, 14-300, 15-300, 16-300, 17-300, 18-300, 19-300, 20-300, 21-300, 22-300, 23-300, 24-300, 25-300, 26-300, 27-300, 28-300, 29-300, 30-300, 31-300, 32-300, 33-300, 34-300, 35-300, 36-300, 37-300, 38-300, 39-300, 40-300, 41-300, 42-300, 43-300, 44-300, 45-300, 46-300, 47-300, 48-300 및 49-300; 및 서열 4의 잔기: 1-170, 2-170, 3-170, 4-170, 5-170, 6-170, 7-170, 8-170, 9-170, 10-170, 11-170, 12-170, 13-170, 14-170, 15-170, 16-170, 17-170, 18-170, 19-170, 20-170, 21-170, 22-170, 23-170, 24-170, 25-170, 26-170, 27-170, 28-170, 29-170, 30-170, 31-170, 32-170, 33-170, 34-170, 35-170, 36-170, 37-170, 38-170, 39-170, 40-170, 41-170, 42-170, 43-170, 44-170, 45-170, 46-170, 47-170, 48-170 및 49-170으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구성원의 아미노산 서열을 가지거나(즉, 포함하거나), 또는 이러한 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이들 폴리뉴클레오타이드 단편에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
특정 양태에서, 본 발명은 서열 2의 잔기: Val-30 내지 His-300으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구성원의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이들 폴리뉴클레오타이드 단편에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
다른 특정 양태에서, 본 발명은 서열 2의 잔기: P-23 내지 H-300, 및/또는 P-34 내지 H-300으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구성원의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이들 폴리뉴클레오타이드 단편에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
위에서 언급한 바와 같이, 단백질의 N-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산의 결실이 단백질의 1종 이상의 생물학적 기능의 손실의 변경을 유발시키더라도, 다른 기능적 활성(예: 생물학적 활성)은 여전히 유지될 수 있다. 이와 같이, 폴리펩타이드의 완전하거나 성숙한 형태를 인식하는 항체를 유도하고/하거나 이에 결합하는 단축된 TNFR 뮤테인의 능력은 일반적으로 완전하거나 성숙한 폴리펩타이드의 잔기의 과반수 미만을 N-말단으로부터 제거할 경우에 보유될 것이다. 완전한 폴리펩타이드의 N-말단 잔기가 결여된 특유의 폴리펩타이드가 이러한 면역학적 활성을 보유하는지의 여부는 본원에 기술되고 달리 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 아마 다수의 결실된 N-말단 아미노산 잔기를 갖는 TNFR 뮤테인은 특정의 생물학적 또는 면역원성 활성을 보유할 것이다. 실제로, 6개 정도의 소수의 TNFR 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드는 면역 반응을 종종 유발시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은, 295번 위치에 존재하는 아르기닌 잔기까지, 도 1(즉, 서열 2)에 제시된 TNFR-6α 아미노산의 아미노 말단으로부터 결실된 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩타이드 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 도 1(서열 2)의 잔기 n1-300(여기서, n1은 도 1(서열 2)에서 아미노산 잔기의 위치에 해당하는 49 내지 295의 정수이다)의 아미노산을 포함하거나, 또는 이러한 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드를 제공한다.
보다 특히, 본 발명은 도 1(서열 2)에 제시된 TFNR-6α 서열 중의 다음의 잔기: C-49 내지 H-300; A-50 내지 H-300; Q-51 내지 H-300; C-52 내지 H-300; P-53 내지 H-300; P-54 내지 H-300; G-55 내지 H-300; T-56 내지 H-300; F-57 내지 H-300; V-58 내지 H-300; Q-59 내지 H-300; R-60 내지 H-300; P-61 내지 H-300; C-62 내지 H-300; R-63 내지 H-300; R-64 내지 H-300; D-65 내지 H-300; S-66 내지 H-300; P-67 내지 H-300; T-68 내지 H-300; T-69 내지 H-300; C-70 내지 H-300; G-71 내지 H-300; P-72 내지 H-300; C-73 내지 H-300; P-74 내지 H-300; P-75 내지 H-300; R-76 내지 H-300; H-77 내지 H-300; Y-78 내지 H-300; T-79 내지 H-300; Q-80 내지 H-300; F-81 내지 H-300; W-82 내지 H-300; N-83 내지 H-300; Y-84 내지 H-300; L-85 내지 H-300; E-86 내지 H-300; R-87 내지 H-300; C-88 내지 H-300; R-89내지 H-300; Y-90 내지 H-300; C-91 내지 H-300; N-92 내지 H-300; V-93 내지 H-300; L-94 내지 H-300; C-95 내지 H-300; G-96 내지 H-300; E-97 내지 H-300; R-98 내지 H-300; E-99 내지 H-300; E-100 내지 H-300; E-101 내지 H-300; A-102 내지 H-300; R-103 내지 H-300; A-104 내지 H-300; C-105 내지 H-300; H-106 내지 H-300; A-107 내지 H-300; T-108 내지 H-300; H-109 내지 H-300; N-110 내지 H-300; R-111 내지 H-300; A-112 내지 H-300; C-113 내지 H-300; R-114 내지 H-300; C-115 내지 H-300; R-116 내지 H-300; T-117 내지 H-300; G-118 내지 H-300; F-119 내지 H-300; F-120 내지 H-300; A-121 내지 H-300; H-122 내지 H-300; A-123 내지 H-300; G-124 내지 H-300; F-125 내지 H-300; C-126 내지 H-300; L-127 내지 H-300; E-128 내지 H-300; H-129 내지 H-300; A-130 내지 H-300; S-131 내지 H-300; C-132 내지 H-300; P-133 내지 H-300; P-134 내지 H-300; G-135 내지 H-300; A-136 내지 H-300; G-137 내지 H-300; V-138 내지 H-300; I-139 내지 H-300; A-140 내지 H-300; P-141 내지 H-300; G-142 내지 H-300; T-143 내지 H-300; P-144 내지 H-300; S-145 내지 H-300; Q-146 내지 H-300; N-147 내지 H-300; T-148 내지 H-3ft- Q-149 내지 H-300; C-150 내지 H-300; Q-151 내지 H-300; P-152 내지 H-300; C-153 내지 H-300; P-154 내지 H-300; P-155 내지 H-300; G-156 내지 H-300; T-157 내지 H-300; F-158 내지 H-300; S-159 내지 H-300; A-160 내지 H-300; S-161 내지 H-300; S-162 내지 H-300; S-163 내지 H-300; S-164 내지 H-300; S-165 내지 H-300; E-166 내지 H-300; Q-167 내지 H-300; C-168 내지 H-300; Q-169 내지 H-300; P-170 내지 H-300; H-171 내지 H-300; R-172 내지 H-300; N-173 내지 H-300; C-174 내지 H-300; T-175 내지 H-300; A-176 내지 H-300; L-177 내지 H-300; G-178 내지 H-300; L-179 내지 H-300; A-180 내지 H-300; L-181 내지 H-300; N-182 내지 H-300; V-183 내지 H-300; P-184 내지 H-300; G-185 내지 H-300; S-186 내지 H-300; S-187 내지 H-300; S-188 내지 H-300; H-189 내지 H-300; D-190 내지 H-300; T-191 내지 H-300; L-192 내지 H-300; C-193 내지 H-300; T-194 내지 H-300; S-195 내지 H-300; C-196 내지 H-300; T-197 내지 H-300; G-198 내지 H-300; F-199 내지 H-300; P-200 내지 H-300; L-201 내지 H-300; S-202 내지 H-300; T-203 내지 H-300; R-204 내지 H-300; V-205 내지 H-300; P-206 내지 H-300; G-207 내지 H-300; A-208 내지 H-300; E-209 내지 H-300; E-210 내지 H-300; C-211 내지 H-300; E-212 내지 H-300; R-213 내지 H-300; A-214 내지 H-300; V-215 내지 H-300; I-216 내지 H-300; D-217 내지 H-300; F-218 내지 H-300; V-219 내지 H-300; A-220 내지 H-300; F-221 내지 H-300; Q-222 내지 H-300; D-223 내지 H-300; I-224 내지 H-300; S-225 내지 H-300; I-226 내지 H-300; K-227 내지 H-300; R-228 내지 H-300; L-229 내지 H-300; Q-230 내지 H-300; R-231 내지 H-300; L-232 내지 H-300; L-233 내지 H-300; Q-234 내지 H-300; A-235 내지 H-300; L-236 내지 H-300; E-237 내지 H-300; A-238 내지 H-300; P-239 내지 H-300; E-240 내지 H-300; G-241 내지 H-300; W-242 내지 H-300; G-243 내지 H-300; P-244 내지 H-300; T-245 내지 H-300; P-246 내지 H-300; R-247 내지 H-300; A-248 내지 H-300; G-249 내지 H-300; R-250 내지 H-300; A-251 내지 H-300; A-252 내지 H-300; L-253 내지 H-300; Q-254 내지 H-300; L-255 내지 H-300; K-256 내지 H-300; L-257 내지 H-300; R-258 내지 H-300; R-259 내지 H-300; R-260 내지 H-300; L-261 내지 H-300; T-262 내지 H-300; E-263 내지 H-300; L-264 내지 H-300; L-265 내지 H-300; G-266 내지 H-300; A-267 내지 H-300; Q-268 내지 H-300; D-269 내지 H-300; G-270 내지 H-300; A-271 내지 H-300; L-272 내지 H-300; L-273 내지 H-300; V-274 내지 H-300; R-275 내지 H-300; L-276 내지 H-300; L-277 내지 H-300; Q-278 내지 H-300; A-279 내지 H-300; L-280 내지 H-300; R-281 내지 H-300; V-282 내지 H-300; A-283 내지 H-300; R-284 내지 H-300; M-285 내지 H-300; P-286 내지 H-300; G-287 내지 H-300; L-288 내지 H-300; E-289 내지 H-300; R-290 내지 H-300; S-291 내지 H-300; V-292 내지 H-300; R-293 내지 H-300; E-294 내지 H-300; 및 R-295 내지 H-300으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구성원의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이들 뉴클레오타이드 단편에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
유사하게는, 생물학적으로 기능성인 C-말단 결실 뮤테인의 다수의 예가 공지되어 있다. 예를 들어, 인터페론 감마는 단백질의 카복실 말단으로부터의 8 내지 10개 아미노산의 결실에 의해 10배 정도의 보다 높은 활성을 나타낸다[참조: Dobell et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)]. 당해 경우에, 본 발명의 단백질이 TNFR 단백질의 패밀리의 구성원이기 때문에, 서열 2 및 4 각각의 위치 193 및 132의 시스테인까지의 C-말단 아미노산의 결실은, 예를 들어, 생물학적 활성[예를 들어, 세포 증식 및 어팝토시스의 조절 (예를 들어, 림프양 세포의 경우, Fas 리간드를 결합시키는 능력 및 AIM-II를 결합시키는 능력)]과 같은 특정의 기능성활성을 유지할 것이다. 서열 2 및 4의 위치 193 및 132에 시스테인을 포함한 추가의 C-말단 결실을 추가로 갖는 폴리펩타이드는 상기 생물학적 활성을 보유할 것으로 예상되지 않는데, 이는 TNF 수용체-관련된 폴리펩타이드에서 이들 잔기가 수용체 결합에 필요한 구조 안정성을 제공하는 디설파이드 브릿지를 형성하는데 필요하기 때문이다.
그러나, 단백질의 C-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산의 결실이 단백질의 1종 이상의 생물학적 기능의 손실 또는 변경을 유발시키더라도, 다른 기능적 활성(예: 생물학적 활성, 다량체화 능력, 리간드(예: Fas 리간드 및 AIM-II)와의 결합능)은 여전히 유지될 수 있다. 이와 같이, 단백질의 완전하거나 성숙한 형태를 인식하는 항체를 유도하고/하거나 이에 결합하는 단축된 단백질의 능력은 일반적으로 완전하거나 성숙한 형태 단백질의 잔기의 과반수 미만을 C-말단으로부터 제거할 경우에 보유될 것이다. 완전한 단백질의 C-말단 잔기가 결여된 특유의 폴리펩타이드가 이러한 면역학적 활성을 보유하는지의 여부는 본원에 기술되고 달리 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 서열 2 및 서열 4에 각각 제시된 TNFR-6 알파 및 TNFR-6 베타의 아미노산 서열의 카복시 말단으로부터의 서열 2 및 4의 위치 193 및 132의 시스테인까지의 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩타이드 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 서열 2 및 4 각각에서 아미노산 서열의 잔기 1-y 및 1-z(여기서, y는 193 내지 300의 범위내의 임의의 정수이고, z는 132 내지 170의 범위내의 임의의 정수이다)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구성원의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 제공한다. 이들 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 또한 제공한다.
특정의 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 2 및 4 각각에서 아미노산 서열의 잔기 1-y' 및 1-z'(여기서, y'는 193 내지 299의 범위내의 임의의 정수이고, z'는 132 내지 169의 범위내의 임의의 정수이다)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구성원의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 제공한다. 이들 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 또한 제공한다.
추가의 바람직한 구체적 양태에서, 본 발명은 서열 2의 잔기 Pro-23 내지 His-300, Val-30 내지 His-300 및 Pro-34 내지 His-300으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구성원의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 폴리펩타이드, 서열 4의 잔기 Pro-23 내지 Pro-170, Val-30 내지 Pro-170 및 Pro-34 내지 His-170으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구성원의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다. 본원에 기술된 바와 같이, 이들 폴리펩타이드는 이종성 폴리펩타이드 서열에 융합될 수 있다. 상기 폴리펩타이드 및 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 제공된다.
본 발명은 또한 일반적으로 서열 2의 잔기 m-y 및 서열 4의 잔기 n-z(여기서, m, n, y 및 z는 상기한 바와 같은 정수이다)를 갖는 것으로 기술될 수 있는, 아미노 말단 및 카복실 말단 둘 다로부터 결실된 하나 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.
위에서 언급한 바와 같이, 단백질의 C-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산의 결실이 단백질의 1종 이상의 생물학적 기능의 손실의 변경을 유발시키더라도, 다른 기능적 활성(예: 생물학적 활성, 동종다량체 형성 능력, 리간드(예: Fas 리간드 및/또는 AIM-II)와의 결합능)은 여전히 유지될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 완전하거나 성숙한 형태를 인식하는 항체를 유도하고/하거나 이에 결합하는 단축된 TNFR 뮤테인의 능력은 일반적으로 완전하거나 성숙한 폴리펩타이드의 잔기의 과반수 미만을 C-말단으로부터 제거할 경우에 보유될 것이다. 완전한 폴리펩타이드의 C-말단 잔기가 결여된 특유의 폴리펩타이드가 이러한 면역학적 활성을 보유하는지의 여부는 본원에 기술되고 달리 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 아마 다수의 결실된 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 TNFR 뮤테인은 특정의 생물학적 또는 면역원성 활성을 보유할 것이다. 실제로, 6개 정도의 소수의 TNFR 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드는 면역 반응을 종종 유발시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은, 6번 위치에 존재하는 글리신 잔기까지의 도 1(서열 2)에 제시된 TNFR-6β 아미노산의 아미노 말단으로부터 결실된 하나 이상의 잔기를 포함하거나, 또는 이러한 잔기로 이루어진 폴리펩타이드 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 도 1(즉, 서열 2)의 잔기 1-m1(여기서, m1은 도 1(서열 2)에서 아미노산 잔기의 위치에 해당하는 6 내지 299의 정수이다)의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 제공한다.
보다 특히, 본 발명은 도 1(서열 2)에 제시된 TFNR 서열 중의 다음의 잔기: M-1 내지 V-299; M-1 내지 P-298; M-1 내지 L-297; M-1 내지 F-296; M-1 내지 R-295; M-1 내지 E-294; M-1 내지 R-293; M-1 내지 V-292; M-1 내지 S-291; M-1 내지 R-290; M-1 내지 E-289; M-1 내지 L-288; M-1 내지 G-287; M-1 내지 P-286; M-1 내지 M-285; M-1 내지 R-284; M-1 내지 A-283; M-1 내지 V-282; M-1 내지 R-281; M-1 내지 L-280; M-1 내지 A-279; M-1 내지 Q-278; M-1 내지 L-277; M-1 내지 L-276; M-1 내지 R-275; M-1 내지 V-274; M-1 내지 L-273; M-1 내지 L-272; M-1 내지 A-271; M-1 내지 G-270; M-1 내지 D-269; M-1 내지 Q-268; M-1 내지 A-267; M-1 내지 G-266; M-1 내지 L-265; M-1 내지 L-264; M-1 내지 E-263; M-1 내지 T-262; M-1 내지 L-261; M-1 내지 R-260; M-1 내지 R-259; M-1 내지 R-258; M-1 내지 L-257; M-1 내지 K-256; M-1 내지 L-255; M-1 내지 Q-254; M-1 내지 L-253; M-1 내지 A-252; M-1 내지 A-251; M-1 내지 R-250; M-1 내지 G-249; M-1 내지 A-248; M-1 내지 R-247; M-1 내지 P-246; M-1 내지 T-245; M-1 내지 P-244; M-1 내지 G-243; M-1 내지 W-242; M-1 내지 G-241; M-1 내지 E-240; M-1 내지 P-239; M-1 내지 A-238; M-1 내지 E-237; M-1 내지 L-236; M-1 내지 A-235; M-1 내지 Q-234; M-1 내지 L-233; M-1 내지 L-232; M-1 내지 R-231; M-1 내지 Q-230; M-1 내지 L-229; M-1 내지 R-228; M-1 내지 K-227; M-1 내지 I-226; M-1 내지 S-225; M-1 내지 I-224; M-1 내지 D-223; M-1 내지 Q-222; M-1 내지 F-221; M-1 내지 A-220; M-1 내지 V-219; M-1 내지 F-218; M-1 내지 D-217; M-1 내지 I-216; M-1 내지 V-215; M-1 내지 A-214; M-1 내지 R-213; M-1 내지 E-212; M-1 내지 C-211; M-1 내지 E-210; M-1 내지 E-209; M-1 내지 A-208; M-1 내지 G-207; M-1 내지 P-206; M-1 내지 V-205; M-1 내지 R-204; M-1 내지 T-203; M-1 내지 S-202; M-1 내지 L-201; M-1 내지 P-200; M-1 내지 F-199; M-1 내지 G-198; M-1 내지 T-197; M-1 내지 C-196; M-1 내지 S-195; M-1 내지 T-194; M-1 내지 C-193; M-1 내지 L-192; M-1 내지 T-191; M-1 내지 D-190; M-1 내지 H-189; M-1 내지 S-188; M-1 내지 S-187; M-1 내지 S-186; M-1 내지 G-185; M-1 내지 P-184; M-1 내지 V-183; M-1 내지 N-182; M-1 내지 L-181; M-1 내지 A-180; M-1 내지 L-179; M-1 내지 G-178; M-1 내지 L-177; M-1 내지 A-176; M-1 내지 T-175; M-1 내지 C-174; M-1 내지 N-173; M-1 내지 R-172; M-1 내지 H-171; M-1 내지 P-170; M-1 내지 Q-169; M-1 내지 C-168; M-1 내지 Q-167; M-1 내지 E-166; M-1 내지 S-165; M-1 내지 S-164; M-1 내지 S-163; M-1 내지 S-162; M-1 내지 S-161; M-1 내지 A-160; M-1 내지 S-159; M-1 내지 F-158; M-1 내지 T-157; M-1 내지 G-156; M-1 내지 P-155; M-1 내지 P-154; M-1 내지 C-153; M-1 내지 P-152; M-1 내지 Q-151; M-1 내지 C-150; M-1 내지 Q-149; M-1 내지 T-148; M-1 내지 N-147; M-1 내지 Q-146; M-1 내지 S-145; M-1 내지 P-144; M-1 내지 T-143; M-1 내지 G-142; M-1 내지 P-141; M-1 내지 A-140; M-1 내지 I-139; M-1 내지 V-138; M-1 내지 G-137; M-1 내지 A-136; M-1 내지 G-135; M-1 내지 P-134; M-1 내지 P-133; M-1 내지 C-132; M-1 내지 S-131; M-1 내지 A-130; M-1 내지 H-129; M-1 내지 E-128; M-1 내지 L-127; M-1 내지 C-126; M-1 내지 F-125; M-1 내지 G-124; M-1 내지 A-123; M-1 내지 H-122; M-1 내지 A-121; M-1 내지 F-120; M-1 내지 F-119; M-1 내지 G-118; M-1 내지 T-117; M-1 내지 R-116; M-1 내지 C-115; M-1 내지 R-114; M-1 내지 C-113; M-1 내지 A-112; M-1 내지 R-111; M-1 내지 N-110; M-1 내지 H-109; M-1 내지 T-108; M-1 내지 A-107; M-1 내지 H-106; M-1 내지 C-105; M-1 내지 A-104; M-1 내지 R-103; M-1 내지 A-102; M-1 내지 E-101; M-1 내지 E-100; M-1 내지 E-99; M-1 내지 R-98; M-1 내지 E-97; M-1 내지 G-96; M-1 내지 C-95; M-1 내지 L-94; M-1 내지 V-93; M-1 내지 N-92; M-1 내지 C-91; M-1 내지 Y-90; M-1 내지 R-89; M-1 내지 C-88; M-1 내지 R-87; M-1 내지 E-86; M-1 내지 L-85; M-1 내지 Y-84; M-1 내지 N-83; M-1 내지 W-82; M-1 내지 F-81; M-1 내지 Q-80; M-1 내지 T-79; M-1 내지 Y-78; M-1 내지 H-77; M-1 내지 R-76; M-1 내지 P-75; M-1 내지 P-74; M-1 내지 C-73; M-1 내지 P-72; M-1 내지 G-71; M-1 내지 C-70; M-1 내지 T-69; M-1 내지 T-68; M-1 내지 P-67; M-1 내지 S-66; M-1 내지 D-65; M-1 내지 R-64; M-1 내지 R-63; M-1 내지 C-62; M-1 내지 P-61; M-1 내지 R-60; M-1 내지 Q-59; M-1 내지 V-58; M-1 내지 F-57; M-1 내지 T-56; M-1 내지 G-55; M-1 내지 P-54; M-1 내지 P-53; M-1 내지 C-52; M-1 내지 Q-51; M-1 내지 A-50; M-1 내지 C-49; M-1 내지 V-48; M-1 내지 L-47; M-1 내지 R-46; M-1 내지 E-45; M-1 내지 G-44; M-1 내지 T-43; M-1 내지 E-42; M-1 내지 A-41; M-1 내지 D-40; M-1 내지 R-39; M-1 내지 W-38; M-1 내지 P-37; M-1 내지 Y-36; M-1 내지 T-35; M-1 내지 P-34; M-1 내지 T-33; M-1 내지 E-32; M-1 내지 A-31; M-1 내지 V-30; M-1 내지 G-29; M-1 내지 R-28; M-1 내지 V-27; M-1 내지 A-26; M-1 내지 P-25; M-1 내지 V-24; M-1 내지 P-23; M-1 내지 L-22; M-1 내지 L-21; M-1 내지 A-20; M-1 내지 P-19; M-1 내지 L-18; M-1 내지 A-17; M-1 내지 L-16; M-1 내지 V-15; M-1 내지 L-14; M-1 내지 C-13; M-1 내지 L-12; M-1 내지 L-11; M-1 내지 S-10; M-1 내지 L-9; M-1 내지 G-8; M-1 내지 P-7; 및 M-1 내지 G-6으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구성원의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이들 뉴클레오타이드 단편에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
특정 양태에 있어서, 본 발명은 서열 2의 잔기: M-1 내지 A-271, M-1 내지 Q-254 및/또는 M-1 내지 F-221로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구성원의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 도 1(서열 2)의 잔기 n1-m1(여기서, n1및 M1은 상기한 바와 같은 정수이다)을 갖는 것으로 일반적으로 기술할 수 있는 TNFR 폴리펩타이드의 아미노 말단 및 카복실 말단 둘 다로부터 결실된 하나 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 도 1(서열 2)의 잔기 30-m3(여기서, m3은 도 1(서열 2)에서 아미노산 잔기의 위치에 해당하는 36 내지 299의 정수이다)의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 도 1(서열 2)에 제시된 TFNR 서열 중의 다음의 잔기: V-30 내지 V-299; V-30 내지 P-298; V-30 내지 L-297; V-30 내지 F-296; V-30 내지R-295; V-30 내지 E-294; V-30 내지 R-293; V-30 내지 V-292; V-30 내지 S-291; V-30 내지 R-290; V-30 내지 E-289; V-30 내지 L-288; V-30 내지 G-287; V-30 내지 P-286; V-30 내지 M-285; V-30 내지 R-284; V-30 내지 A-283; V-30 내지 V-282; V-30 내지 R-281; V-30 내지 L-280; V-30 내지 A-279; V-30 내지 Q-278; V-30 내지 L-277; V-30 내지 L-276; V-30 내지 R-275; V-30 내지 V-274; V-30 내지 L-273; V-30 내지 L-272; V-30 내지 A-271; V-30 내지 G-270; V-30 내지 D-269; V-30 내지 Q-268; V-30 내지 A-267; V-30 내지 G-266; V-30 내지 L-265; V-30 내지 L-264; V-30 내지 E-263; V-30 내지 T-262; V-30 내지 L-261; V-30 내지 R-260; V-30 내지 R-259; V-30 내지 R-258; V-30 내지 L-257; V-30 내지 K-256; V-30 내지 L-255; V-30 내지 Q-254; V-30 내지 L-253; V-30 내지 A-252; V-30 내지 A-251; V-30 내지 R-250; V-30 내지 G-249; V-30 내지 A-248; V-30 내지 R-247; V-30 내지 P-246; V-30 내지 T-245; V-30 내지 P-244; V-30 내지 G-243; V-30 내지 W-242; V-30 내지 G-241; V-30 내지 E-240; V-30 내지 P-239; V-30 내지 A-238; V-30 내지 E-237; V-30 내지 L-236; V-30 내지 A-235; V-30 내지 Q-234; V-30 내지 L-233; V-30 내지 L-232; V-30 내지 R-231; V-30 내지 Q-230; V-30 내지 L-229; V-30 내지 R-228; V-30 내지 K-227; V-30 내지 I-226; V-30 내지 S-225; V-30 내지 I-224; V-30 내지 D-223; V-30 내지 Q-222; V-30 내지 F-221; V-30 내지 A-220; V-30 내지 V-219; V-30 내지 F-218; V-30 내지 D-217; V-30 내지 I-216; V-30 내지 V-215; V-30 내지 A-214; V-30 내지 R-213; V-30 내지 E-212; V-30 내지 C-211; V-30 내지 E-210; V-30 내지 E-209; V-30 내지 A-208; V-30 내지 G-207; V-30 내지 P-206; V-30 내지V-205; V-30 내지 R-204; V-30 내지 T-203; V-30 내지 S-202; V-30 내지 L-201; V-30 내지 P-200; V-30 내지 F-199; V-30 내지 G-198; V-30 내지 T-197; V-30 내지 C-196; V-30 내지 S-195; V-30 내지 T-194; V-30 내지 C-193; V-30 내지 L-192; V-30 내지 T-191; V-30 내지 D-190; V-30 내지 H-189; V-30 내지 S-188; V-30 내지 S-187; V-30 내지 S-186; V-30 내지 G-185; V-30 내지 P-184; V-30 내지 V-183; V-30 내지 N-182; V-30 내지 L-181; V-30 내지 A-180; V-30 내지 L-179; V-30 내지 G-178; V-30 내지 L-177; V-30 내지 A-176; V-30 내지 T-175; V-30 내지 C-174; V-30 내지 N-173; V-30 내지 R-172; V-30 내지 H-171; V-30 내지 P-170; V-30 내지 Q-169; V-30 내지 C-168; V-30 내지 Q-167; V-30 내지 E-166; V-30 내지 S-165; V-30 내지 S-164; V-30 내지 S-163; V-30 내지 S-162; V-30 내지 S-161; V-30 내지 A-160; V-30 내지 S-159; V-30 내지 F-158; V-30 내지 T-157; V-30 내지 G-156; V-30 내지 P-155; V-30 내지 P-154; V-30 내지 C-153; V-30 내지 P-152; V-30 내지 Q-151; V-30 내지 C-150; V-30 내지 Q-149; V-30 내지 T-148; V-30 내지 N-147; V-30 내지 Q-146; V-30 내지 S-145; V-30 내지 P-144; V-30 내지 T-143; V-30 내지 G-142; V-30 내지 P-141; V-30 내지 A-140; V-30 내지 I-139; V-30 내지 V-138; V-30 내지 G-137; V-30 내지 A-136; V-30 내지 G-135; V-30 내지 P-134; V-30 내지 P-133; V-30 내지 C-132; V-30 내지 S-131; V-30 내지 A-130; V-30 내지 H-129; V-30 내지 E-128; V-30 내지 L-127; V-30 내지 C-126; V-30 내지 F-125; V-30 내지 G-124; V-30 내지 A-123; V-30 내지 H-122; V-30 내지 A-121; V-30 내지 F-120; V-30 내지 F-119; V-30 내지 G-118; V-30 내지 T-117; V-30 내지 R-116; V-30 내지C-115; V-30 내지 R-114; V-30 내지 C-113; V-30 내지 A-112; V-30 내지 R-111; V-30 내지 N-110; V-30 내지 H-109; V-30 내지 T-108; V-30 내지 A-107; V-30 내지 H-106; V-30 내지 C-105; V-30 내지 A-104; V-30 내지 R-103; V-30 내지 A-102; V-30 내지 E-101; V-30 내지 E-100; V-30 내지 E-99; V-30 내지 R-98; V-30 내지 E-97; V-30 내지 G-96; V-30 내지 C-95; V-30 내지 L-94; V-30 내지 V-93; V-30 내지 N-92; V-30 내지 C-91; V-30 내지 Y-90; V-30 내지 R-89; V-30 내지 C-88; V-30 내지 R-87; V-30 내지 E-86; V-30 내지 L-85; V-30 내지 Y-84; V-30 내지 N-83; V-30 내지 W-82; V-30 내지 F-81; V-30 내지 Q-80; V-30 내지 T-79; V-30 내지 Y-78; V-30 내지 H-77; V-30 내지 R-76; V-30 내지 P-75; V-30 내지 P-74; V-30 내지 C-73; V-30 내지 P-72; V-30 내지 G-71; V-30 내지 C-70; V-30 내지 T-69; V-30 내지 T-68; V-30 내지 P-67; V-30 내지 S-66; V-30 내지 D-65; V-30 내지 R-64; V-30 내지 R-63; V-30 내지 C-62; V-30 내지 P-61; V-30 내지 R-60; V-30 내지 Q-59; V-30 내지 V-58; V-30 내지 F-57; V-30 내지 T-56; V-30 내지 G-55; V-30 내지 P-54; V-30 내지 P-53; V-30 내지 C-52; V-30 내지 Q-51; V-30 내지 A-50; V-30 내지 C-49; V-30 내지 V-48; V-30 내지 L-47; V-30 내지 R-46; V-30 내지 E-45; V-30 내지 G-44; V-30 내지 T-43; V-30 내지 E-42; V-30 내지 A-41; V-30 내지 D-40; V-30 내지 R-39; V-30 내지 W-38; V-30 내지 P-37; 및 V-30 내지 Y-36으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구성원의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이들 뉴클레오타이드 단편에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 또한 본 발명에 포함된다. 특정 양태에있어서, 본 발명은 서열 2의 잔기: V-30 내지 A-271, V-30 내지 Q-254 및/또는 V-30 내지 F-221로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구성원의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 또한 본 발명에 포함된다. 본원은 또한 상기한 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 포함하거나, 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이종성 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열과 각각 융합된 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 포함한다.
위에서 언급한 TNFR-6β의 단편과 관련하여, 단백질의 N-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산의 결실이 단백질의 1종 이상의 생물학적 기능의 손실의 변경을 유발시키더라도, 다른 기능적 활성(예: 생물학적 활성, 다량체화 능력, 리간드(예: Fas 리간드 및/또는 AIM-II)와의 결합능)은 여전히 유지될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 완전하거나 성숙한 형태를 인식하는 항체를 유도하고/하거나 이에 결합하는 단축된 TNFR 뮤테인의 능력은 일반적으로 완전하거나 성숙한 폴리펩타이드의 잔기의 과반수 미만을 N-말단으로부터 제거할 경우에 보유될 것이다. 완전한 폴리펩타이드의 N-말단 잔기가 결여된 특유의 폴리펩타이드가 이러한 면역학적 활성을 보유하는지의 여부는 본원에 기술되고 달리 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 아마 다수의 결실된 N-말단 아미노산 잔기를 갖는 TNFR 뮤테인은 특정의 생물학적 또는 면역원성 활성을 보유할 것이다. 실제로, 6개 정도의 소수의 TNFR 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드는 면역 반응을 종종 유발시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은, 165번 위치에 존재하는 글리신 잔기까지, 도 2(즉, 서열 4)에 제시된 TNFR-6β 아미노산의 아미노 말단으로부터 결실된 하나 이상의 잔기를 포함하거나, 또는 이러한 잔기로 이루어진 폴리펩타이드, 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 도 2(서열 4)의 잔기 n2-170(여기서, n2는 도 2(서열 4)에서 아미노산 잔기의 위치에 해당하는 2 내지 165의 정수이다)의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 제공한다.
보다 특히, 본 발명은 도 2(서열 4)에 제시된 TNFR-6β 서열중의 다음의 잔기: R-2 내지 P-170; A-3 내지 P-170; L-4 내지 P-170; E-5 내지 P-170; G-6 내지 P-170; P-7 내지 P-170; G-8 내지 P-170; L-9 내지 P-170; S-10 내지 P-170; L-11 내지 P-170; L-12 내지 P-170; C-13 내지 P-170; L-14 내지 P-170; V-15 내지 P-170; L-16 내지 P-170; A-17 내지 P-170; L-18 내지 P-170; P-19 내지 P-170; A-20 내지 P-170; L-21 내지 P-170; L-22 내지 P-170; P-23 내지 P-170; V-24 내지 P-170; P-25 내지 P-170; A-26 내지 P-170; V-27 내지 P-170; R-28 내지 P-170; G-29 내지 P-170; V-30 내지 P-170; A-31 내지 P-170; E-32 내지 P-170; T-33 내지 P-170; P-34 내지 P-170; T-35 내지 P-170; Y-36 내지 P-170; P-37 내지 P-170; W-38 내지 P-170; R-39 내지 P-170; D-40 내지 P-170; A-41 내지 P-170; E-42 내지 P-170; T-43 내지 P-170; G-44 내지 P-170; E-45 내지 P-170; R-46 내지 P-170; L-47 내지 P-170; V-48 내지 P-170; C-49 내지 P-170; A-50 내지 P-170; Q-51 내지 P-170; C-52 내지 P-170; P-53 내지 P-170; P-54 내지 P-170; G-55 내지 P-170; T-56 내지 P-170; F-57 내지 P-170; V-58 내지 P-170; Q-59 내지 P-170; R-60 내지 P-170; P-61 내지 P-170; C-62 내지 P-170; R-63 내지 P-170; R-64 내지 P-170; D-65 내지 P-170; S-66 내지 P-170; P-67 내지 P-170; T-68 내지 P-170; T-69 내지 P-170; C-70 내지 P-170; G-71 내지 P-170; P-72 내지 P-170; C-73 내지 P-170; P-74 내지 P-170; P-75 내지 P-170; R-76 내지 P-170; H-77 내지 P-170; Y-78 내지 P-170; T-79 내지 P-170; Q-80 내지 P-170; F-81 내지 P-170; W-82 내지 P-170; N-83 내지 P-170; Y-84 내지 P-170; L-85 내지 P-170; E-86 내지 P-170; R-87 내지 P-170; C-88 내지 P-170; R-89 내지 P-170; Y-90 내지 P-170; C-91 내지 P-170; N-92 내지 P-170; V-93 내지 P-170; L-94 내지 P-170; C-95 내지 P-170; G-96 내지 P-170; E-97 내지 P-170; R-98 내지 P-170; E-99 내지 P-170; E-100 내지 P-170; E-101 내지 P-170; A-102 내지 P-170; R-103 내지 P-170; A-104 내지 P-170; C-105 내지 P-170; H-106 내지 P-170; A-107 내지 P-170; T-108 내지 P-170; H-109 내지 P-170; N-110 내지 P-170; R-111 내지 P-170; A-112 내지 P-170; C-113 내지 P-170; R-114 내지 P-170; C-115 내지 P-170; R-116 내지 P-170; T-117 내지 P-170; G-118 내지 P-170; F-119 내지 P-170; F-120 내지 P-170; A-121 내지 P-170; H-122내지 P-170; A-123 내지 P-170; G-124 내지 P-170; F-125 내지 P-170; C-126 내지 P-170; L-127 내지 P-170; E-128 내지 P-170; H-129 내지 P-170; A-130 내지 P-170; S-131 내지 P-170; C-132 내지 P-170; P-133 내지 P-170; P-134 내지 P-170; G-135 내지 P-170; A-136 내지 P-170; G-137 내지 P-170; V-138 내지 P-170; I-139 내지 P-170; A-140 내지 P-170; P-141 내지 P-170; G-142 내지 P-170; E-143 내지 P-170; S-144 내지 P-170; W-145 내지 P-170; A-146 내지 P-170; R-147 내지 P-170; G-148 내지 P-170; G-149 내지 P-170; A-150 내지 P-170; P-151 내지 P-170; R-152 내지 P-170; S-153 내지 P-170; G-154 내지 P-170; G-155 내지 P-170; R-156 내지 P-170; R-157 내지 P-170; C-158 내지 P-170; G-159 내지 P-170; R-160 내지 P-170; G-161 내지 P-170; Q-162 내지 P-170; V-163 내지 P-170; A-164 내지 P-170; 및 G-165 내지 P-170으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구성원의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이들 뉴클레오타이드 단편에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
위에서 언급한 TNFR-6β의 단편과 관련하여, 단백질의 C-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산의 결실이 단백질의 1종 이상의 생물학적 기능의 손실의 변경을 유발시키더라도, 다른 기능적 활성(예: 생물학적 활성, 댜량체화 능력, 리간드(예: Fas 리간드 및/또는 AIM-II)와의 결합능)은 여전히 유지될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 완전하거나 성숙한 형태를 인식하는 항체를 유도하고/하거나 이에 결합하는 단축된 TNFR-6β 뮤테인의 능력은 일반적으로 완전하거나 성숙한 폴리펩타이드의 잔기의 과반수 미만을 C-말단으로부터 제거할 경우에 보유될 것이다. 완전한 폴리펩타이드의 C-말단 잔기가 결여된 특유의 폴리펩타이드가 이러한 면역학적 활성을 보유하는지의 여부는 본원에 기술되고 달리 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 아마 다수의 결실된 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 TNFR-6β 뮤테인은 특정의 생물학적 또는 면역원성 활성을 보유할 것이다. 실제로, 6개 정도의 소수의 TNFR-6β 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드는 면역 반응을 종종 유발시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은, 6번 위치에 존재하는 글리신 잔기까지의 도 2(서열 4)에 제시된 TNFR-6β 아미노산의 아미노 말단으로부터 결실된 하나 이상의 잔기를 포함하거나, 또는 이러한 잔기로 이루어진 폴리펩타이드, 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 도 1(즉, 서열 2)의 잔기 1-m2(여기서, m2는 도 2(서열 4)에서 아미노산 잔기의 위치에 해당하는 6 내지 169의 정수이다)의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 제공한다.
보다 특히, 본 발명은 도 2(서열 4)에 제시된 TNFR-6β 서열중의 다음의 잔기: M-1 내지 A-169; M-1 내지 L-168; M-1 내지 S-167; M-1 내지 P-166; M-1 내지 G-165; M-1 내지 A-164; M-1 내지 V-163; M-1 내지 Q-162; M-1 내지 G-161; M-1 내지 R-160; M-1 내지 G-159; M-1 내지 C-158; M-1 내지 R-157; M-1 내지 R-156; M-1 내지 G-155; M-1 내지 G-154; M-1 내지 S-153; M-1 내지 R-152; M-1 내지 P-151;M-1 내지 A-150; M-1 내지 G-149; M-1 내지 G-148; M-1 내지 R-147; M-1 내지 A-146; M-1 내지 W-145; M-1 내지 S-144; M-1 내지 E-143; M-1 내지 G-142; M-1 내지 P-141; M-1 내지 A-140; M-1 내지 I-139; M-1 내지 V-138; M-1 내지 G-137; M-1 내지 A-136; M-1 내지 G-135; M-1 내지 P-134; M-1 내지 P-133; M-1 내지 C-132; M-1 내지 S-131; M-1 내지 A-130; M-1 내지 H-129; M-1 내지 E-128; M-1 내지 L-127; M-1 내지 C-126; M-1 내지 F-125; M-1 내지 G-124; M-1 내지 A-123; M-1 내지 H-122; M-1 내지 A-121; M-1 내지 F-120; M-1 내지 F-119; M-1 내지 G-118; M-1 내지 T-117; M-1 내지 R-116; M-1 내지 C-115; M-1 내지 R-114; M-1 내지 C-113; M-1 내지 A-112; M-1 내지 R-111; M-1 내지 N-110; M-1 내지 H-109; M-1 내지 T-108; M-1 내지 A-107; M-1 내지 H-106; M-1 내지 C-105; M-1 내지 A-104; M-1 내지 R-103; M-1 내지 A-102; M-1 내지 E-101; M-1 내지 E-100; M-1 내지 E-99; M-1 내지 R-98; M-1 내지 E-97; M-1 내지 G-96; M-1 내지 C-95; M-1 내지 L-94; M-1 내지 V-93; M-1 내지 N-92; M-1 내지 C-9 1; M-1 내지 Y-90; M-1 내지 R-89; M-1 내지 C-88; M-1 내지 R-87; M-1 내지 E-86; M-1 내지 L-85; M-1 내지 Y-84; M-1 내지 N-83; M-1 내지 W-82; M-1 내지 F-81; M-1 내지 Q-80; M-1 내지 T-79; M-1 내지 Y-78; M-1 내지 H-77; M-1 내지 R-76; M-1 내지 P-75; M-1 내지 P-74; M-1 내지 C-73; M-1 내지 P-72; M-1 내지 G-71; M-1 내지 C-70; M-1 내지 T-69; M-1 내지 T-68; M-1 내지 P-67; M-1 내지 S-66; M-1 내지 D-65; M-1 내지 R-64; M-1 내지 R-63; M-1 내지 C-62; M-1 내지 P-61; M-1 내지 R-60; M-1 내지 Q-59; M-1 내지 V-58; M-1 내지 F-57; M-1 내지 T-56; M-1 내지 G-55; M-1 내지 P-54; M-1 내지 P-53; M-1 내지 C-52; M-1 내지 Q-51; M-1 내지 A-50; M-1 내지 C-49; M-1 내지 V-48; M-1 내지 L-47; M-1 내지 R-46; M-1 내지 E-45; M-1 내지 G-44; M-1 내지 T-43; M-1 내지 E-42; M-1 내지 A-41; M-1 내지 D-40; M-1 내지 R-39; M-1 내지 W-38; M-1 내지 P-37; M-1 내지 Y-36; M-1 내지 T-35; M-1 내지 P-34; M-1 내지 T-33; M-1 내지 E-32; M-1 내지 A-31; M-1 내지 V-30; M-1 내지 G-29; M-1 내지 R-28; M-1 내지 V-27; M-1 내지 A-26; M-1 내지 P-25; M-1 내지 V-24; M-1 내지 P-23; M-1 내지 L-22; M-1 내지 L-21; M-1 내지 A-20; M-1 내지 P-19; M-1 내지 L-18; M-1 내지 A-17; M-1 내지 L-16; M-1 내지 V-15; M-1 내지 L-14; M-1 내지 C-13; M-1 내지 L-12; M-1 내지 L-11; M-1 내지 S-10; M-1 내지 L-9; M-1 내지 G-8; M-1 내지 P-7; 및 M-1 내지 G-6으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구성원의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이들 뉴클레오타이드 단편에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명은 도 2(서열 4)의 잔기 n2-m2(여기서, n2및 m2는 상기한 바와 같은 정수이다)을 갖는 것으로 일반적으로 기술할 수 있는 TNFR-6β 폴리펩타이드의 아미노 말단 및 카복실 말단 둘 다로부터 결실된 하나 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.
본원은 또한 m-y, n-z, n1-m1, 30-m3및/또는 n2-m2로서 본원에 제시된 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 90% 이상, 92% 이상, 95%이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직한 양태에 있어서, 본원은 본원에 언급된 특이적 N- 및 C-말단의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 이루어진 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열과 각각 융합된 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이들 핵산 및/또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
또한, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 TNFR 아미노산 서열의 부분으로 이루어지는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 포함되며, 이때 이러한 부분은 각각, ATCC 기탁번호 제97810호 및 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터의 1 내지 약 49개 아미노산; 또는 각각, ATCC 기탁번호 제97810호 및 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열의 카복시 말단으로부터의 1 내지 약 107개 또는 58개 아미노산; 또는 ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열의 상기 아미노 말단 및 카복시 말단 결실체의 조합체를 제외한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드의 전부를 암호화하는 폴리펩타이드도 본 발명에 포함된다.
상기 언급된 단백질의 말단 결실 형태에 부가하여, TNFR 폴리펩타이드의 일부 아미노산 서열이 단백질의 구조 또는 기능에 현저한 영향을 주지 않고 달라질 수 있다는 것은 당해 분야의 통상적인 숙련자에게 또한 인식될 것이다. 서열에서의 이러한 차이점이 의도된 경우, 활성을 결정하는 단백질 상의 중요한 영역이 있을 것이라는 점을 상기해야만 한다.
따라서, 본 발명은 추가로 실질적인 TNFR 폴리펩타이드 기능 활성(예: 면역원성 활성, 생물학적 활성)을 나타내거나 하기 언급되는 바와 같은 단백질 부분들과 같은 TNFR 단백질의 영역들을 포함하는 TNFR 폴리펩타이드의 변형체들을 포함한다. 이러한 돌연변이체들은, 활성에 거의 영향을 미치지 않는 한, 당해 분야에 공지된 일반 법칙에 따라 선택된 결실, 삽입, 역위, 반복 및 유형 치환을 포함한다. 예를 들어, 표현형적으로 침묵 아미노산 치환체를 제조하는 방법에 관한 지침은 문헌[Bowie, J.U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Sustitutions", Science 247:1306-1310 (1990)]에 제공되며, 상기 문헌의 저자들은 변화에 대한 아미노산 서열의 내성을 연구하는 두 가지 주요한 방법이 있음을 지적한다. 제1 방법은 진화 과정에 따른 것으로, 돌연변이는 자연 선택에 의해 수용되거나 거부된다는 것이다. 제2 방법은 유전공학을 이용하여 클로닝된 유전자의 특정 위치에 아미노산 변화를 도입하고, 기능성을 유지하는 서열을 분리하기 위해서 선택 및 스크리닝을 사용하는 것이다. 또한, 저자들의 주장과 같이, 이러한 연구들은 단백질이 아미노산 치환에 대해 놀라울 정도의 내성이 있음을 밝혀냈다. 저자들은 추가로 아미노산 변화가 단백질의 특정 위치에서는허용될 수도 있다는 것을 지적한다. 예를 들어, 대부분의 매몰된 아미노산 잔기들은 비극성 측쇄를 요구하는 반면, 표면 측쇄의 특성은 일반적으로 거의 보존되지 않는다. 기타 이러한 표현형적 침묵 치환체는 문헌[상기, Bowie, J.U. et al]에 기술되어 있으며, 본원에 참조로 인용된다. 전형적으로 나타나는 보존성 치환으로는, 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile 사이의 서로간의 교체; 하이드록실 잔기인 Ser 및 Thr의 상호교환; 산성 잔기인 Asp 및 Glu의 교환; 아미드 잔기인 Asn 및 Gln 사이의 치환; 염기성 잔기인 Lys 및 Arg의 교환; 및 방향성 잔기인 Phe 및 Tyr 사이의 교체이다. 따라서, 서열 2, 4 또는 6의 폴리펩타이드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 단편, 유도체 또는 동족체는, (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존된 또는 비-보존된 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고, 상기 치환된 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 암호화되거나 되지 않는 것일 수 있는 것, (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환체 그룹을 포함하는 것, (iii) 성숙한 또는 가용성 세포외 폴리펩타이드가 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 기타 화합물과 융합된 것, 또는 (iv) 예를 들면, IgG Fc 펩타이드 융합체, 리더 서열, 분비 서열, 또는 TNFR 폴리펩타이드의 정제를 위해 사용되는 서열 같은, 부가적인 아미노산이 본원에 기술된 TNFR 폴리펩타이드에 융합된 것일 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 이러한 단편, 유도체 및 동족체가 본원의 교시의 범위내에 있는 것으로 생각할 것이다.
따라서, 본 발명의 TNFR는 천연 돌연변이 또는 사람의 조작에 의한, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 지적한 바와 같이, 변화는 단백질의 폴딩(folding) 또는 활성에 현저한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환 같이, 부수적 특성이 바람직하다(표 III 참조).
보존성 아미노산 치환
방향성 페닐알라닌, 트립토판, 티로신
소수성 루이신, 이소루이신, 발린
극성 글루타민, 아스파라긴
염기성 아르기닌, 리신, 히스티딘
산성 아스파르트산, 글루탐산
소형 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 글리신
본 발명의 TNFR 단백질에서 기능에 필수적인 아미노산은 부위-지시된 돌연변이 유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발 같은 당해 분야에서 공지된 방법으로 g확인할 수 있다[Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]. 후자의 방법은 분자내 잔기 마다 단독 알라닌 돌연변이를 도입한다. 이후, 수득되는 돌연변이체 분자를, 예를 들면 리간드/수용체(예: Fas 리간드 및/또는 AIM-II) 수용체 결합 또는 생체내 또는 시험관내 증식 활성과 같은 기능 활성에 대해 시험한다.
특히 흥미로운 것 중에는 하전된 아미노산을, 보다 낮은 응집 같은 매우 바람직한 개선된 특성을 갖는 단백질을 생성할 수 있는 다른 하전된 또는 중성 아미노산으로 치환하는 것이다. 응집체는 면역원성일 수 있기 때문에, 응집은 활성을 감소시킬 뿐만 아니라 약제학적 제형물을 제조하는 경우 문제가 유발될 수 있다[Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al.,Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Theapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993)].
또한, 아미노산 교체는 리간드의 세포 표면 수용체에 대한 결합의 선택도를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ostade et al., Nature 361:266-268 (1993)]은 두 개의 공지된 유형의 TNFR 수용체 중 하나에만 TNF-α의 선택적인 결합을 초래하는 특정 돌연변이를 기술하고 있다. 리간드-수용체 결합에 중요한 부위는 또한 결정화, 핵 자기 공명 또는 광친화도 표지화 같은 구조 분석으로 결정할 수 있다[Smith et al.,J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) and de Vos et al., Science 255:306-312 (1992)].
TNFR-6α 및 -6β는 TNF 수용체-관련 단백질 패밀리의 구성원이기 때문에, TNFR의 생물학적 활성을 완전히 제거하기 보다는 개질시키기 위해서는, 바람직하게는 돌연변이는 TNFR 보존된 세포외 도메인, 보다 바람직하게는 TNFR 수용체 패밀리의 구성원 사이에서 보존되지 않는 이러한 영역내의 잔기에서 아미노산을 암호화하는 서열 중에서 수행된다. 또한, 본 발명의 일부를 형성하는 것은 상기 TNFR 돌연변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 분리된 형태로 제공되며, 바람직하게는 실질적으로 정제된다. 재조합적으로 생성된 TNFR 폴리펩타이드는 문헌[Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988)]에 기술된 1-단계 방법에 의해 실질적으로 정제될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 당해 분야에서 단백질 정제에 대해 널리 공지된 방법들로 항-TNFR-6α 및 -6β 항체를 사용하여 천연 또는 재조합 공급원으로부터 정제할 수 있다.
본 발명은 추가로, (a) 서열 2 또는 4에 나타낸 완전한 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호로서 기탁된 플라스미드중에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 완전한 길이의 TNFR 폴리펩타이드의 아미노산 서열; (b) 서열 2의 31 내지 300 위치 또는 서열 4의 31 내지 170 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호로서 기탁된 플라스미드중에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드의 아미노산 서열; 또는 (c) 서열 2의 31 내지 283 위치 또는 서열 4의 31 내지 166 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호로서 기탁된 플라스미드중에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 가용성 세포외 도메인의 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 TNFR 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 본 발명의 폴리펩타이드는 상기 기술된 것에 대해 90% 이상, 보다 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 92%, 또는 95% 이상, 및 보다 더 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 유사성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 기탁된 cDNA(ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호)에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 또는 서열 2 또는 4의 폴리펩타이드에 대해 80% 이상, 보다 바람직하게는 85%, 90%, 92% 또는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 것을 포함하며, 또한 30개 이상 아미노산, 보다 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 갖는 상기 폴리펩타이드의 부분을 포함한다.
두 개의 폴리펩타이드에 있어서 "% 유사성"이란 베스트피트 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스 버젼 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) 및 유사성을 결정하기 위한 디폴트 셋팅(default setting)을 사용하여 두 개의 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 비교함으로써 수득되는 유사성 스코어를 나타낸다. 베스트피트는 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489, 1981]의 국부적인 상동성 알고리즘을 사용하여 두 개의 서열 사이의 상동성이 가장 높은 단편을 찾아낸다.
TNFR 폴리펩타이드의 기준 아미노산 서열과, 예를 들어, 95% 이상 "동일한" 아미노산을 갖는 폴리펩타이드란, TNFR 폴리펩타이드의 기준 아미노산의 100개 아미노산 당 5개 이하의 아미노산 변형이 포함될 수 있다는 것을 제외하고는, 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 기준 서열과 동일함을 나타낸다. 다시 말해서, 기준 아미노산 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 수득하기 위해서는, 기준 서열 중 5% 이하의 아미노산 서열 잔기가 결실되거나 다른 아미노산으로 치환될 수 있거나, 기준 서열 중 전체 아미노산 잔기의 5% 이하의 다수의 아미노산이 기준 서열에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이러한 변형은 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카복시 말단에서, 또는 기준 서열 중 잔기들 사이에서 개별적으로 산재하거나 기준 서열 중 하나 이상의 연속적인 그룹으로서 두 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있다.
실제적인 문제로서, 임의의 특정 폴리펩타이드가 서열 2 또는 4에 나타낸 아미노산 서열, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호의 기탁물중에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열, 또는 이의 단편(예: 본원에 기술된 바와 같은, N 또는 C 말단 결실체에 상응하는 임의의 폴리펩타이드 서열(예: 서열 2의 30 내지 300개의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)과 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한가 하는 것은 베스트피트 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스 버젼 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다. 베스트피트 또는 임의의 기타 서열 정렬 프로그램을, 특정 서열이 예를 들어, 본 발명에 따른 기준 서열과 95% 동일한가를 결정하는데 사용하는 경우, 물론, 파라미터들이 설정되며, 결과적으로 동일성 %가 완전한 길이의 기준 아미노산 서열에 대해 계산되며, 기준 서열 중 전체 아미노산 수의 5% 이하의 상동성에서의 차이는 허용된다.
구체적 양태에서, 기준(조회) 서열(본 발명의 서열)과 해당 서열간의 동일성(또한, 전체 서열 정렬로서 언급되기도함)은 문헌[Brutlag et al., Comp. App. Biosci, 6:237-245 (1990)]의 알고리즘을 기초로 하여 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정한다. FASTDB 아미노산 정렬에 사용되는 바람직한 파라미터로는 매트릭스=PAM 0, k-벌(tuple)=2, 부정합 페널티=1, 연결 패널티=30, 램던 그룹 길이=0, 컷오프 스코어=1, 윈도우 사이즈=500, 갭 페널티=5, 갭 사이즈 패널티=0.05, 또는 보다 짧은 해당 뉴클레오타이드 서열의 길이가 있다. 이러한양태에 따르면, 해당 서열이 내부 결실이 아닌 N- 또는 C-말단 결실로 인해 조회 서열 보다 짧다면, 동일성%를 계산할 때, FASTDB 프로그램이 해당 서열의 N- 및 C-말단 절두를 고려하지 않는다는 사실을 참작하여, 당해 결과를 수작업으로 교정한다. 조회 서열에 비해, N- 및 C-말단에서 절두된 해당 서열의 경우에, 동일성%는, 해당 잔기와 정합/정렬되지 않은 해당 서열의 N- 및 C-말단인 조회 서열의 염기수를, 조회 서열의 전체 염기%로서 계산하여 교정한다. 잔기가 정합/정렬되었는지에 대한 결정은 FASTDB 서열의 정렬의 결과로 판정한다. 이후, 이러한 %를 구체화된 파라미터를 사용한 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성%로 부터 공제하여, 최종 동일성% 스코어를 수득한다. 이러한 최종 동일성% 스코어가 상기 태양의 목적을 위해 사용되는 것이다. 조회 서열과 정합/정렬되지 않는 해당 서열의 N- 및 C-말단에 대한 잔기만이 동일성% 스코어를 수작업으로 조정하기 위한 목적으로 고려된다. 즉, 조회 잔기만이 해당 서열의 N- 및 C- 최말단의 외부에 위치한다. 예를 들면, 90개의 해당 아미노산 잔기 서열을 100개 잔기의 조회 서열에 정렬시켜 동일성%를 결정한다. 해당 서열의 N-말단에서 결실이 일어나기 때문에, FASTDB 정렬은 N-말단에서 앞부분 10개의 잔기의 정합/정렬을 보여주지 않는다. 쌍을 이루지 못한 10개의 잔기는 서열의 10%(조회 서열중 잔기의 총수당 정합되지 않은 N- 및 C-말단에서의 잔기의 수)를 나타내므로, 10%는 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성% 스코어로 부터 공제된다. 나머지 90개 잔기는 완벽하게 정합되는 경우, 최종 동일성%는 90%일 것이다. 또 다른 예에서, 90개의 해당 잔기는 100개 잔기의 조회 서열과 비교된다. 이 때의 결실은 내부 결실이므로, 조회 서열과 정합/정렬되지 않는, 해당 서열의 N- 및 C-말단상의 잔기가 존재하지 않는다. 이러한 경우에, FASTDB에 의해 계산된 동일성%는 수작업으로 교정하지 않는다. 일단 다시, 조회 서열과 정합/정렬되지 않는, FASTDB 정렬중에 나타난 바와 같은 해당 서열의 N- 및 C-말단의 외부에 위치하는 잔기만을 수작업으로 교정한다. 이러한 양태의 목적을 위하여, 다른 수작업 교정은 행하지 않는다.
본 발명의 폴리펩타이드는, 당업자에게 익히 공지된 방법을 사용하는 SDS-PAGE 겔 또는 분자체 겔 여과 칼럼 상의 분자량 마커로서의 용도를 가지나, 이로서 제한되는 것은 아니다. 아래에 상세히 기술되는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 생성시키는데 사용될 수 있으며, 이들 항체는 하기되는 바와 같은 TNFR 단백질 발현을 검출하는 분석법에서 유용하거나, TNFR 단백질 기능을 강화시키거나 억제하는 효능제 및 길항제로서 유용하다. 추가로, 이러한 폴리펩타이드는 효모의 2-하이브리드 시스템에서, 본 발명에 따른 후보 효능제 및 길항제일 수 있는 TNFR 단백질에 결합하는 단백질을 "포획하는데" 사용될 수 있다. 효모 2-하이브리드 시스템은 문헌[Fields and Song, Mature 340:245-246 (1989)]에 기술되어 있다.
유전자전이체(transgenics)
본 발명의 폴리펩타이드는 또한 유전자전이된 동물에서 발현될 수 있다. 이들로 한정되는 것은 아니지만 마우스, 랫트, 토끼, 햄스터, 기니아 피그, 돼지, 초소형(mini) 돼지, 염소, 양, 소, 및 사람을 제외한 영장류(예, 개코원숭이, 원숭이및 침팬지)를 포함하는 어떠한 종의 동물도 유전자전이된 동물을 생성하는데 사용될 수 있다. 구체적 양태로서, 본원에 기술된 기술 또는 본 분야에 공지된 기술을 사용하여 유전자 요법 프로토콜의 일부로서 사람의 체내에서 본 발명의 폴리펩타이드를 발현시킨다.
본 분야에 공지된 임의의 기술을 동물내로 전이유전자(transgene)(즉, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드)를 도입하는데 사용하여, 유전자전이된 동물의 시조 계열을 수득할 수 있다. 이러한 기술에는, 이들로 한정되는 것은 아니지만 전핵(pronuclear) 미세주사[Paterson et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:691-698 (1994); Carver et al., Biotechnology(NY) 11:1263-1270 (1993); Wright et al., Biotechnology (NY) 9:830-834 (1991); 및 Hoppe et al., USP 4,873,191 (1989)]; 배선(germ line)(Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152 (1985)), 포배 또는 배아로의 레트로바이러스 매개된 유전자 전달; 배 간(embryonic stem) 세포에서의 유전자 표적화(Thompson et al., Cell 56:313-321 (1989)); 세포 또는 배아의 전기천공(Lo, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814 (1983)); 유전자 총을 사용한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드로의 도입(Ulmer et al., Science 259:1745 (1993)); 배 흉막기능(embryonic pleuripotent) 간 세포내로의 핵산 작제물의 도입 및 포배내로의 간 세포의 재전달; 및 정자-매개된 유전자 전달(Lavitrano et al., Cell 57:717-723 (1989)) 등이 포함된다. 이러한 기술을 검토하려면, 전문이 본원에 인용된 문헌[Gordon, "Transgenic Animals," Intl. Rev. Cytol. 115:171-229 (1989)]을 참조한다. 또한, 각각 본원에 전문이 인용된다음 문헌을 참조한다: 미국 특허 제5,464,764호 (Capecchi, et al., Positive-Negative Selection Methods and Vectors); 미국 특허 제5,631,153호 (Capecchi, et al., Cells and Non-Human Organisms Containing Predetermined Genomic Modifications and Positive-Negative Selection Methods and Vectors for Making Same), 미국 특허 제4,736,866호 (Leder, et al., Transgenic Non-Human Animals); 및 미국 특허 제4,873,191호 (Wagner, et al., Genetic Transformation of Zygotes).
당업계에 공지된 모든 기술은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 함유한 유전자전이된 클론을 생성하는데, 예를 들면, 휴지기로 유도된 배양된 배세포, 태세포 또는 성숙세포로부터 핵이 제거된 난모세포로 핵을 전달하는데 사용될 수 있다[Campell et al., Nature 380:64-66 (1996); Wilmut et al., Nature 385:810-813 (1997); 상기 문헌들은 각각 전문이 본원에 참조로 인용된다].
본 발명은 모든 세포내에 전이유전자를 함유한 유전자전이된 동물 뿐만 아니라 모든 세포에서가 아니라 일부의 세포에서 전이유전자를 함유한 동물(즉, 모자이크 동물 또는 키메라 동물)을 제공한다. 전이유전자는 단일 전이유전자로서 또는 콘카테머(concatamer)(예: 헤드 대 헤드의 종렬체 또는 헤드 대 테일의 종렬체)에서와 같은 다수 복제물로서 통합될 수 있다. 전이유전자는 예를 들면 문헌[Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236 (1992)]에 기술된 교시에 따라 특정 유형의 세포내로 선택적으로 도입되고 활성화될 수 있다. 이러한 세포-유형 특이적 활성화에 필요한 조절 서열은 당해 특정 세포 유형에 따라 달라지며, 이는당업자에게는 자명한 것이다. 폴리뉴클레오타이드 전이유전자가 내인성 유전자의 염색체 부위내로 통합되는 것이 필요한 경우, 유전자 표적화가 바람직하다. 간단히 설명하여, 이러한 기술이 사용될 경우, 내인성 유전자와 상동성인 일부 뉴클레오타이드 서열을 함유한 벡터가, 염색체 서열과의 상동 재조합을 통해 통합되어 내인성 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 기능을 붕괴시킬 목적으로, 설계된다. 또한, 문헌[Gu et al., Science 265:103-106 (1994))에 기술된 교시에 따라 전이유전자를 특정 유형의 세포내로 선택적으로 도입하여 그 유형의 세포에서만 내인성 유전자를 불활성화시킬 수 있다. 이러한 세포-유형 특이적 불활성화에 필요한 조절 서열은 당해 특정 세포 유형에 따라 달라지며 이는 당업자에게는 자명한 것이다. 상기 문단에서 인용된 문헌의 각 내용은 본원에 전문이 인용된다.
일단, 유전자전이된 동물이 생산되었으면, 표준 기술을 사용하여 재조합 유전자의 발현을 검정할 수 있다. 초기 스크리닝은 써던 블롯팅 분석 또는 PCR 기술에 의해 전이유전자의 통합이 이루어졌음을 입증하는 분석을 동물 조직에 대해 실시함으로써 달성될 수 있다. 또한, 이들로 한정되는 것은 아니지만 동물로부터 채취된 조직 샘플의 노던 블롯팅 분석, 원위치(in situ) 하이브리드화 분석, 및 역전사효소-PCR(rt-PCR)을 포함하는 기술을 사용하여 유전자전이된 동물의 조직에서 전이유전자의 mRNA 발현 수준을 평가할 수 있다. 유전자전이된 유전자-발현 조직의 샘플은 또한 전이유전자 생성물에 대해 특이적인 항체를 사용하여 면역세포화학적으로 또는 면역조직화학적으로 평가할 수 있다.
일단, 시조 동물이 생산되었으면, 이들을 교배, 근교배(inbreed),이계교배(outbreed) 또는 잡종교배(crossbreed)시켜 특정 동물의 콜로니를 생성할 수 있다. 이러한 교배 방법의 예로는, 이들로 한정되는 것은 아니지만 별도의 계통을 확립하기 위한 하나 이상의 통합 부위를 갖는 시조 동물의 이계교배; 각 전이유전자의 추가 발현의 영향 때문에 전이유전자를 보다 높은 수준으로 발현하는 유전자전이된 화합물을 생성하기 위한 별개 계통의 근교배; 발현을 증가시키고 DNA 분석에 의해 동물을 스크리닝할 필요성을 제거하기 위해 소정 통합 부위에 있어서 동형접합성인 동물을 생산하기 위한 이형접합성 유전자전이된 동물의 잡종교배; 이종접합 또는 동종접합 계통의 화합물을 생성하기 위한 별개의 동종접합 계통의 잡종교배; 및 당해 실험 모델에 적합한 뚜렷한 백그라운드상에 전이유전자를 배치하기 위한 교배가 포함된다.
본 발명의 유전자전이된 동물 및 "녹아웃(knock-out)" 동물은, 이들로 한정되는 것은 아니지만 TNF-폴리펩타이드의 생물학적 기능을 연구하고, 비정상적인 TNF-발현과 연관된 병리상태 및/또는 장애를 연구하며, 이러한 병리상태 및/또는 장애를 경감시키는데 효과적인 화합물을 스크리닝하는데 유용한 동물 모델 시스템으로서 사용된다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하도록 유전공학적으로 조작된 세포, 또는 본 발명의 단백질을 발현하지 않도록 유전공학적으로 조작된 세포(녹아웃)가 환자에게 생체내 투여된다. 이러한 세포는 환자(즉, 사람을 포함하는 동물) 또는 MHC 적합 공여자로부터 수득할 수 있으며, 이러한 것들로는 섬유아세포, 골수세포, 혈액세포(즉, 임파구), 지방세포, 근세포, 내피세포 등이 포함될 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 플라스미드, 코스미드, YAC, 나상(naked) DNA, 전기천공, 리포좀 등의 사용을 포함하는 예를 들면, 형질도입(바이러스 벡터, 바람직하게는 전이유전자를 세포 게놈내로 통합시키는 벡터를 사용함) 또는 형질감염 방법에 의해, 이들 세포를 시험관내에서 재조합 DNA 기술에 따라 유전공학적으로 조작하여 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 암호화 서열을 세포내로 도입하거나, 또는 달리 본 발명의 폴리펩타이드와 연관된 암호화 서열 및/또는 내인성 조절 서열을 붕괴시킨다. 본 발명의 폴리펩타이드의 암호 서열은, 본 발명의 폴리펩타이드의 발현, 및 바람직하게는 분비가 이루어지도록 강력한 구성적(constitutive) 또는 유도성 프로모터 또는 프로모터/인핸서의 조절하에 놓일 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하고, 바람직하게는 분비하는 조작된 세포는 환자내로 전신적으로, 예를 들면 순환계로 또는 복강내로 투입될 수 있다. 다른 방도로서, 세포를 매트릭스내로 삽입하거나 체내로 이식할 수 있다. 예를 들면, 유전공학적으로 조작된 섬유아세포를 피부 이식편의 일부로서 이식할 수 있으며; 유전공학적으로 조작된 내피 세포를 임파 이식편 또는 혈관 이식편의 일부로서 이식할 수 있다[참조: Anderson 등의 미국 특허제5,399,349호 및 Mulligan & Wilson의 미국 특허 제5,460,959호; 이들 문헌의 전문은 본원에 참조로 인용된다].
투여될 세포가 비-자가 또는 비-MHC 적합 세포인 경우, 이들 세포는 도입된 세포에 대한 숙주 면역 반응의 전개를 억제시키는 익히 공지된 기술을 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 세포를 캡슐 형태로 도입할 수 있는데, 이러한 캡슐 형태는 성분이 인접한 세포외 환경과의 교환을 가능케하는 한편, 도입된 세포가 숙주면역계에 의해 인식되지 않도록 한다.
항체
본 발명은 또한 (특이적 항체-항원 결합을 검정하는 당해 분야에 익히 공지된 면역검정에 의해 결정된 바와 같은) 본 발명의 폴리펩타이드, 바람직하게는 에피토프를 면역특이적으로 결합시키는 항체 및 T-세포 항원 수용체(TCR)에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 다중특이적, 사람, 사람화 또는 키메라 항체, 일본쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 제조된 단편, 항-개별특이형 (항-Id) 항체(예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체를 포함), 및 상기한 것들 중의 하나의 에피토프-결합 단편을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉, 항원을 면역특이적으로 결합시키는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 의미한다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 면역글로불린 분자의 하위분류일 수 있다.
가장 바람직하게는, 당해 항체는 본 발명의 사람 항원-결합 항체 단편이고, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 일본쇄 Fvs(scFv), 일본쇄 항체, 디설파이드-결합된 fvs(sdFv), 및 VL 또는 VH 영역을 포함하는 단편을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 일본쇄 항체를 포함하는 항원-결합 항체 단편은 가변 영역을 단독으로 또는 힌지 부위, CH1, CH2 및 CH3 영역의 전체 또는 일부와 함께 포함할 수 있다. 또한, 가변 영역과 힌지 부위, CH1, CH2 및 CH3 영역과의 임의의 조합을 추가로 포함하는 항원-결합 단편이 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체는 조류 및 포유동물을 포함하는 임의의 동물 기원일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 사람, 마우스, 당나귀, 양, 래빗, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말 또는 닭이다. 본원에 사용된 바와 같은, "사람" 항체는 사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 사람 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 이하 문헌, 및 예를 들어, 미국 특허 제5,939,598호(Kucherlapati et al.)에 기술된 바와 같이 하나 이상의 사람 면역글로불린에 대해 형질전환되고 내인성 면역글로불린을 발현시키지 않는 동물로부터 분리된 항체를 포함한다.
본 발명의 항체는 단일특이성, 이중특이성, 삼중특이성 또는 보다 큰 다중특이성일 수 있다. 다중특이적 항체는 본 발명의 폴리펩타이드의 상이한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나 본 발명의 폴리펩타이드와 이종 에피토프, 예를 들어, 이종 폴리펩타이드 또는 고체 지지재 양쪽에 대해 특이적일 수 있다[참조예: PCT 공보 제WO 93/17715호, 제WO 92/08802호, 제WO 91/00360호, 제WO 92/05793호, Tutt, et al., J. Immunol. 147:60-69(1991); 미국 특허 제4,474,893호, 제4,714,681호, 제4,925,648호, 제5,573,920호, 제5,601,819호, Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)].
본 발명의 항체는, 이들이 인식하거나 특이적으로 결합하는 본 발명의 에피토프(들) 또는 폴리펩타이드의 부분(들)에 관하여 기술되거나 구체화될 수 있다. 에피토프(들) 또는 폴리펩타이드 부분(들)은, 예를 들어, N-말단 및 C-말단 위치에으해, 인접하는 아미노산 잔기내의 크기에 의해 본원에 기술된 바와 같이 구체화되거나, 표와 도면에 기재될 수 있다. 본 발명의 임의의 에피토프 또는 폴리펩타이드를 특이적으로 결합시키는 항체는 또한 배제될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 특이적으로 결합시키는 항체를 포함하고, 이들의 배제를 가능하게 한다.
본 발명의 항체는 또한 이들의 교차-반응성에 관하여 기술되거나 구체화될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 임의의 다른 동족체, 오르토로그 또는 동족체를 결합시키지 않는 항체가 포함된다. 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상, 55% 이상 및 50% 이상의 상동성(당해 분야에 공지되고 본원에 기술된 방법을 사용하여 계산됨)을 갖는 폴리펩타이드를 본 발명의 폴리펩타이드에 결합시키는 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만 및 50% 미만의 상동성(당해 분야에 공지되고 본원에 기술된 방법을 사용하여 계산됨)을 갖는 폴리펩타이드를 본 발명의 폴리펩타이드에 결합시키는 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 엄격한 하이브리드화 조건(본원에기술된 바와 같음)하에 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 결합시키는 항체가 본 발명에 추가로 포함된다. 본 발명의 항체는 또한 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 친화도의 관점에서 기술되거나 구체화될 수 있다. 바람직한 결합 친화도에는 5X10-2M, 10-2M, 5X10-3M, 10-3M, 5X10-4M, 10-4M, 5X10-5M, 10-5M, 5X10-6M, 10-6M, 5X10-7M, 10-7M, 5X10-8M, 10-8M, 5X10-9M, 10-9M, 5X10-10M, 10-10M, 5X10-11M, 10-11M, 5X10-12M, 10-12M, 5X10-13M, 10-13M, 5X10-14M, 10-14M, 5X10-15M 및 10-15M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 갖는 것이 포함된다.
본 발명은 또한 경쟁적 결합을 측정하기 위해 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 본원에 기술된 면역검정에 의해 측정된 바와 같이, 항체가 본 발명의 에피토프에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체를 제공한다. 바람직한 양태에서, 당해 항체는 에피토프에의 결합을 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상 또는 50% 이상으로 경쟁적으로 억제한다.
본 발명의 항체는 본 발명의 폴리펩타이드의 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드와의 수용체/리간드 상호작용을 부분적으로 또는 완전히 붕괴시키는 항체를 포함한다. 본 발명은 수용체-특이적 항체 및 리간드-특이적 항체 둘다를 특성화한다. 또한, 본 발명은, 리간드 결합을 저해하지 않으나 수용체 활성화를 저해하는 수용체-특이적 항체를 특성화한다. 수용체 활성화(즉, 신호전달)는 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 기법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 수용체 활성화는 면역침전에 이어 웨스턴 블롯 분석(예를 들어, 상기 문헌에 기술된 바와 같음)에 의해 수용체 또는 이의 기질의 포스포릴화(예를 들어, 티로신 또는 세린/트레오닌)를 검출함으로써 측정할 수 있다. 구체적 양태에서, 리간드 또는 수용체 활성을 항체의 부재하에 활성의 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 또는 50% 이상으로 억제하는 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은, 리간드 결합 및 수용체 활성화 둘 다를 저해하는 수용체-특이적 항체뿐만 아니라, 수용체-리간드 착체를 인식하고, 바람직하게는 미결합 수용체 또는 미결합 리간드를 특이적으로 인식하지 않는 항체를 특성화한다. 게다가, 리간드를 결합시켜 리간드의 수용체에의 결합을 저해하는 항체뿐만 아니라, 리간드를 결합시킴으로써 수용체 활성화는 저해하나, 리간드가 수용체를 결합시키는 것은 저해하지 않는 항체를 중화시키는 것이 본 발명에 포함된다. 이들 항체는 수용체 효능제로서 작용, 즉, 리간드-매개된 수용체 활성화의 생물학적 활성의 전체 또는 부분을 강화시키거나 활성화시킬 수 있다. 항체는 본원에 기재된 발명의 펩타이드의 특이적 생물학적 활성을 포함하는 생물학적 활성에 대한 효능제, 길항제 또는 역 효능제로서 특정화할 수 있다. 상기 항체 효능제는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다[참조예: PCT 공보 제WO 96/40281호, 미국 특허 제5,811,097호, Deng et al., Blood 92(6):1981-1988(1998); Chen, et al., Cancer Res. 58(16):3668-3678(1998); Harrop et al., J. Immunol. 161(4):1786-1794(1998); Zhu et al., Cancer Res. 58(15):3209-3214(1998); Yoon, et al., J. Immunol. 160(7):3170-3179(1998); Prat et al., J. Cell. Sci. 111(Pt2):237-247(1998); Pitard et al., J. Immunol. Methods 205(2):177-190(1997); Liautard et al., Cytokine 9(4):233-241(1997); Carlson et al., J. Biol. Chem. 272(17):11295-11301(1997); Taryman et al., Neuron 14(4):755-762(1995); Muller et al., Structure 6(9):1153-1167(1998); Bartunek et al., Cytokine 8(1):14-20(1996)(이들 문헌은 전문이 참고로 본원에 인용되어 있음)].
본 발명의 항체는, 예를 들어, 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 방법을 포함하여, 본 발명의 폴리펩타이드를 정제하고, 검출하고 표적화하는데 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 당해 항체는 생물학적 샘플에서 본 발명의 폴리펩타이드의 수준을 정성 및 정량적으로 측정하기 위한 면역검정법에서 사용한다[참조예: Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)(본원에 내용이 참고로 인용되어 있음)].
아래에 보다 상세히 논의하는 바와 같이, 본 발명의 항체는 단독으로 또는 다른 조성물과 배합하여 사용할 수 있다. 당해 항체는 또한 N- 또는 C-말단에서 이종 폴리펩타이드에 재조합적으로 융합되거나 폴리펩타이드 또는 다른 조성물에 화학적으로 접합(공유결합적 및 비-공유결합적 접합 포함)될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 검출 검정에서 표지로서 유용한 분자 및 이펙터 분자, 예를 들어, 이종 폴리펩타이드, 약물 또는 독소에 재조합적으로 융합되거나 접합될 수 있다[참조예: PCT 공보 제WO 92/08495호; 제WO 91/14438호; 미국 특허 제5,314,995호; 및 EP 제396,387호].
본 발명의 항체는, 공유 부착이 항체의 항체-개별특이형 반응 발생을 저해하지 못하도록, 예를 들어, 임의의 유형의 분자의 항체에의 공유 부착에 의해 개질된 유도체를 포함한다. 예를 들어, 항체 유도체는, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 페질화, 포스필화, 아미드화, 공지된 보호/차단 그룹, 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 결합에 의한 유도체화 등에 의해 개질된 항체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 임의의 다수의 화학적 개질은, 특이적 화학적 분해, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사 합성 등에 의해 수행할 수 있다. 또한, 당해 유도체는 하나 이상의 비-전형적 아미노산을 함유할 수 있다.
본 발명의 항체는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 대상 항원에 대한 폴리클로날 항체는 당해 분야에 익히 공지된 다양한 과정에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드를, 래빗, 마우스, 래트 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 숙주 동물에게 투여하여, 항원에 특이적인 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청의 생산을 유도할 수 있다. 다양한 면역보강제를 사용하여, 숙주 종에 따라 달라지는 면역학적 반응을 증가시킬 수 있으며, 프로인트(완전 및 불완전) 면역보강제, 미네랄 겔, 예를 들어, 수산화알루미늄, 계면활성 물질, 예를 들어, 라이소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가음이온, 펩타이드, 오일 유액, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 및 잠재적으로 유용한 사람 면역보강제, 예를 들어, BCG(bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테륨 파르품(Corynebacterium parvum)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 면역보강제는 또한 당해 분야에 익히 공지되어 있다.
모노클로날 항체는, 하이브리도마, 재조합체 및 파아지 디스플레이 기술, 또는 이의 조합의 사용을 포함한 당해 분야에 공지된 다양한 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 당해 분야에 익히 공지되고 교시된 것을 포함한 하이브리도마 기법을 이용하여 제조할 수 있다[참조예: Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nded. 1988); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)(이들 참고문헌의 내용은 참고로 인용되어 있음)]. 본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 제조된 항체에 한정되는 것은 아니다. 용어 "모노클로날 항체"는, 임의의 진핵, 원핵 또는 파아지 클론을 포함한 단일 클론으로부터 유래하고, 단일 클론을 제조한 방법으로부터 유래하지 않는 항체를 의미한다.
하이브리도마 기술을 이용한 특이적 항체를 제조하고 선별하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 실시예 11에 상세히 논의되어 있다. 요약하면, 마우스를 본 발명의 폴리펩타이드 또는 당해 펩타이드를 발현시키는 세포로 면역화시킬 수 있다. 일단 면역 반응이 검출되면, 예를 들어, 항원에 특이적인 항체를 마우스 혈청에서 검출하고, 마우스 비장을 회수하여, 비장 세포를 분리한다. 이어서, 비장 세포르 익히 공지된 기법에 의해 적합한 골수종 세포, 예를 들어, ATCC로부터 구입가능한 세포주 SP20으로부터의 세포에 융합시킨다. 하이브리도마를 유한 희석에 의해 선택하고 클로닝시킨다. 이어서, 하이브리도마 클론을 본 발명의 폴리펩타이드를 결합시킬 수 있는 항체를 분비하는 세포에 대해 당해 분야에 공지된 방법에 의해 검정한다. 일반적으로 높은 수준의 항체를 함유하는 복수는, 마우스를 양성 하이브리도마 클론으로 면역화시켜 생성시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 모노크로날 항체를 제조하는 방법뿐만 아니라, 바람직하게는, 본 발명의 항원으로 면역화시킨 마우스로부터 분리된 비장 세포를 골수종 세포와 융합시키고, 이어서 융합물로부터 생성된 하이브리도마를 본 발명의 폴리펩타이를 결합시킬 수 있는 항체를 분비하는 하이브리도마 클론에 대해 선별함으로써 하이브리도마를 생성시키는, 본 발명의 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 배양함을 포함하는 방법에 의해 제조된 항체를 제공한다.
특이적 에피토프를 인식하는 항체 단편을 공지된 기법에 의해 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Fab 및 F(ab')2 단편을 파파인(Fab 단편을 제조하기 위해) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 제조하기 위해)과 같은 효소를 사용하여 면역글로불린 분자의 단백질분해 절단에 의해 제조할 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 영역을 함유한다.
예를 들어, 본 발명의 항체는 또한 당해 분야에 공지된 다양한 파아지 디스플레이 방법을 이용하여 생성시킬 수도 있다. 파아지 디스플레이 방법에 있어서, 기능성 항체 영역을 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 보유하는 파아지 입자의 표면 상에서 디스플레이한다. 특히, 이러한 파아지는 저장소 또는 연합 항체 라이브러리(예: 사람 또는 마우스)로부터 발현된 항원-결합 영역을 디스플레이하는데 활용할 수 있다. 대상 항원을 결합시키는 항원 결합 영역을 발현시키는 파아지를, 예를 들어, 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 이용하여 항원으로 선택하거나 동정할 수 있다. 당해 방법에 사용된 파아지는 전형적으로는 파아지로부터 발현된 fd 및 M13 결합 영역을 파아지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 디설파이드 안정화 Fv 항체 영역을 포함하는 사상 파이지이다. 본 발명의 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 파아지 디스플레이 방법의 예는 내용이 참고로 본원에 인용되어 있는문헌[참조: Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50(1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186(1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958(1994); Persic et al., Gene 187 9-18(1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280(1994); PCT 공보 제PCT/GB91/01134호; PCT 공보 제WO 90/02809호; 제WO 91/10737호; 제WO 92/01047호; 제WO 92/18619; 제WO 93/11236호; 제WO 95/15982호; 제WO 95/20401호; 및 미국 특허 제5,698,426호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,750,753호, 제5,821,047호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5,516,637호, 제5,780,225호, 제5,658,727호, 제5,733,743호 및 제5,969,108호]에 기재된 것을 포함한다.
상기 참고문헌에 기술된 바와 같이, 파아지 선택 후에, 파아지로부터의 영역을 암호화하는 항체를 분리하여 사람 항체를 포함하는 전체 항원, 또는 임의의 다른 목적하는 항원 결합 단편을 생성시킬 수 있고, 예를 들어, 아래에 상세하게 기술한 바와 같은 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 세균을 포함한 임의의 바람직한 숙주내에서 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[참조: PCT 공보 제WO 92/22324호; Millinax et al., BioTecniques 12(6):864-869(1992); Sawai et al., AJRI 34:26-34(1995); 및 Better et al., Science 240:1041-1043(1988)(이들 참고문헌의 내용은 참고로 인용되어 있음)]에 기재된 것과 같은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하는 Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 제조하는 기법을 또한 이용할 수 있다.
일본쇄 Fvs 및 항체를 제조하는데 사용할 수 있는 기법의 예는 문헌[참조:미국 특허 제4,946,778호 및 제5,258,498호; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-99(1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999(1993); 및 Skerra et al., Science 240:1038-1040(1998)]에 기재된 것을 포함한다. 사람에서의 항체의 생체내 용도 및 시험관내 검출 검정에서의 용도를 포함한 특정 용도를 위해, 키메라, 사람화 또는 사람 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자, 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체로부터 유래된 가변 영역 및 사람 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체이다. 키메라 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조예: Morrison, Science 229:1202(1985); Oi et al., BioTechniques 4:214(1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호 및 제4,816,397호(이들 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용되어 있음)]. 사람화 항체는 비-사람 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 부위(CDR) 및 사람 면역글로불리 분자로부터의 골격 부위를 갖는 바람직한 항원을 결합시키는 비-사람 종 항체로부터의 항체 분자이다. 종종, 사람 골격 부위내의 골격 잔기는 CDR 공여체 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환시켜, 항원 결합을 개질, 바람직하게는 개선시킬 수 있다. 이러한 골격 치환은 당해 분야에 익히 공지된 방법에 의해, 예를 들어, CDR 및 골격 잔기의 상호작용의 모델링하여, 비통상정인 골격 잔기를 특유의 위치에서 동정하기 위한 항원 결합 및 서열 비교에 중요한 골격 잔기를 동정함으로써 동정할 수 있다[참조예: Queen et al., 미국 특허 제5,585,089호; Riechmann et al., Nature 332:323(1988)(이들 문헌의 내용은 본원에 인용되어 있음)]. 당해 항체를, 예를 들어, CDR-그래프팅(EP 제239,400호; PCT 공보 제WO 91/09967호; 미국 특허 제5,225,539호, 제5,530,101호 및 제5,585,089호], 표면피복 또는 재표면화[참조: EP 제592,106호; EP 제519,596호; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814(1994); Roguska et al., PNAS 91:969-973(1994)] 및 쇄 셔플링[참조: 미국 특허 제5,565,332호]을 포함한 당해 분야에 공지된 다양한 기법을 이용하여 사람화시킬 수 있다.
완전한 사람 항체가 사람 환자의 치료학적 치료에 대해 특히 바람직하다. 사람 항체는 사람 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 상기한 파아지 디스플레이 방법을 포함한 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조할 수 있다[참조: 미국 특허 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 PCT 공보 제WO 98/46645호, 제WO 98/50433호, 제WO 98/24893호, 제WO 98/16654호, 제WO 96/34096호, 제WO 96/33735호 및 제WO 91/10741호(이들 문헌의 각각의 내용은 참고로 본원에 인용되어 있음)].
사람 항체는 또한 기능성 내인성 면역글로불린을 발현시킬 수는 없으나, 사람 면역글로불린 유전자를 발현시킬 수 있는 형질전환 마우스를 이용하여 제조할 수도 있다. 예를 들어, 사람 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 착제를 마우스 배아 간상 세포내로 무작위로 또는 동종 재조합에 의해 도입할 수 있다. 또는, 사람 가변 영역, 불변 영역 및 전환성 영역을 사람 중쇄 및 경쇄 유전자 이외에 마우스 배아 간상 세포내에 도입할 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자를동종 재조합에 의해 사람 면역글로불린 좌위의 도입과 개별적으로 또는 동시에 비-작용성으로 만들 수 있다. 특히, JH 영역의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생산을 저해한다. 개질된 배아 간상 세포를 팽창시켜 포배로 미세주사시켜 키메라 마우스를 생산시킨다. 이어서, 키메라 마우스를 번식시켜 사람 항체를 발현시키는 동형접합성 자손을 생산시킨다. 형질전환 마우스를 선택된 항원, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드의 전체 또는 일부로 통상의 방식으로 면역화시킨다. 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체를 면역화된 형질전환 마우스로부터 통상적인 하이브리도마 기법을 이용하여 수득할 수 있다. 형질전환 마우스로부터 회수된 사람 면역글로불린 형질전환 유전자를 B 세포 분화 동안 재배열하고, 이어서 클래스 스위칭 및 체세포 변이에 적용시킨다. 이와 같이, 이러한 기법을 이용하여, 치료학적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 제조할 수 있다. 사람 항체를 제조하는 이러한 기술의 개관을 위해, 문헌[Lonberg and Huszar(1995, Int. Rev. Immunolo. 13:65-93)]을 참조한다. 사람 항체 및 사람 모노클로날 항체를 제조하는 상기 기술의 상세한 논의 및 이러한 항체를 제조하는 프로토콜에 대해서는, 문헌[예: PCT 공보 제WO 98/24893호, 제WO 96/34096호, 제WO 96/33735호, 미국 특허 제5,413,923호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,5,69,825호, 제5,661,016호, 제5,545,806호, 제5,814,318호 및 제5,939.598호(이들 문헌의 내용은 참고로 본원에 인용되어 있음)]을 참조한다. 또한, 아브제닉스, 인코포레이티드(Abgenix, Inc.; Freemont, CA) 및 젠팜(Genpharm; San Jose, CA)와 같은 회사가 관여하여 상기한 것과 유사한 기술을 이용하여 선택된 항원에 대해 지시된 사람 항체를 제공할 수 있다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전 사람 항체를 "유도된 선택"으로 불리는 기법을 이용하여 생성시킬 수 있다. 이러한 접근법에 있어서, 선택된 비-사람 모노크로날 항체, 예를 들어, 마우스 항체를 사용하여, 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 사람 항체의 선택을 유도한다[참조: Jespers et al., Bio/technology 12:899-903(1988)].
또한, 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 항체를 교대로 활용하고, 당해 분아의 숙련가에게 익히 공지된 기법을 이용하여 본 발명의 폴리펩타이드와 "유사한" 항-개별특이형 항체를 생성시킬 수 있다[참조예: Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5)"437-444(1989) 및 Nissinoff, J. Immunol. 147(8):2429-2438(1991)]. 예를 들어, 폴리펩타이드 다중 중합체화 및/또는 본 발명의 폴리펩타이드의 리간드에의 결합을 완전히 억제하고 이에 결합하는 항체를 사용하여, 폴리펩타이드 다중 중합체화 및/또는 결합 영역과 "유사한" 항-개별특이형을 생성시키고, 그 결과 폴리펩타이드를 및/또는 이의 리간드에 결합하고 이를 중화시킬 수 있다. 이러한 중화 항-개별특이형 또는 이러한 항-개별특이형의 Fab 단편을 치료학적 섭생에서 사용하여, 폴리펩타이드 리간드를 중화시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 항-개별특이형 항체를 사용하여, 본 발명의 폴리펩타이드를 결합시키고/하거나 이의 리간드/수용체를 결합시켜, 어팝토시스의 TNFR 매개된 억제를 차단할 수 있다.
항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편을 제공한다. 또한, 본 발명은, 예를 들어, 위에서 정의한 바와 같은 엄격하거나 보다 낮은 엄격도 하이브리드화 조건하에, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게는 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
당해 폴리뉴클레오타이드 및 결정된 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수득할 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오타이드 서열이 공지되어 있을 경우, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드[예를 들어, 문헌(참조: Kutmeier et al., Bio Techniques 17:242(1994))에 기술된 바와 같음]로부터 어셈블링할 수 있으며, 화학적 합성법은, 요약해서, 항체를 암호화하는 서열의 부분을 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 중첩시키고, 상기 올리고뉴클레오타이드를 어닐링 및 결합시킨 다음, 결합된 올리고뉴클레오타이드를 PCR에 의해 증폭시키는 합성법을 포함한다.
또는, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 적합한 공급원으로부터의 핵산으로부터 생성시킬 수 있다. 특유의 항체를 암호화하는 핵산을 함유하는 클론을 구입할 수 없으나, 항체 분자의 서열이 공지되어 있을 경우에, 면역글로불린을 암호화하는 핵산을 적합한 공급원(예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 항체를 할현시키는 임의의 조직 또는 세포, 예를 들어, 본 발명의 항체를 발현시키기 위해선택된 하이브리도마 세포로부터 생성된 cDNA 라이브러리 또는 이로부터 분리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A+RNA)으로부터 서열의 3' 및 5' 말단에 하이브리드 가능한 합성 프라이머를 사용하는 PCT 증폭 또는 예를 들어, 항체를 암호화하는 cDNA로부터의 cDNA 클론을 동정하기 위해 특유의 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하는 클로닝에 의해 수득할 수 있다. 이어서, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산을 당해 분야에 익히 공지된 임의의 방법을 이용하여 복제가능한 클로닝 벡터내로 클로닝시킬 수 있다.
항체의 뉴클레오타이드 서열 및 상응하는 아미노산 서열이 일단 결정되면, 항체의 뉴클레오타이드 서열을 뉴클레오타이드 서열의 조작에 대해 당해 분야에 익히 공지된 방법[참조예: 내용이 참고로 본원에 인용되어 있는 문헌(Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 및 Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY)에 기술되어 있는 기법)을 이용하여 조작함으로써, 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 발생시킬 수 있다.
구체적 양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 당해 분야에 익히 공지된 방법, 예를 들어, 다른 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 공지된 아미노산 서열과의 비교에 의해 조사함으로써 상보성 결정 영역(CDR)을 동정하여, 서열 과변이성 영역을 결정할 수 있다. 통상적 재조합 DNA 기법을 이용하여, 하나 이상의 CDR을 골격 영역, 예를 들어, 사람 골격 영역내에 삽입하여, 위에서 정의한 바와 같은 비-사람 항체를 사람화시킬 수 있다. 골격 영역은 천연 또는 콘센서스 골격 영역, 바람직하게는 사람 골격 영영일 수 있다[사람 골격 영역의 목록에 대한 참조예: Chothia et al., J. Mol. Biol. 278:457-479(1998)]. 바람직하게는, 골격 영역 및 CDR의 조합에 의해 생성된 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 특이적으로 결합시키는 항체를 암호화한다. 바람직하게는, 위에서 논의한 바와 같이, 하나 이상의 아미노산 치환을 골격 구조내에서 발생시킬 수 있고, 바람직하게는 아미노산 치환은 항체의 이의 항원에의 결합을 향상시킨다. 또한, 이러한 방법을 사용하여, 쇄내 디설파이드 결합에 관여하는 아미노산 치환 또는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 결실을 발생시켜, 하나 이상의 쇄내 디설파이드 결합이 결핍된 항체 분자를 생성시킬 수 있다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 다른 변형은 본 발명에 의해 및 당해 분야의 기술내에 포함된다.
또한, 적합한 생물학적 활성의 사람 항체 분자로부터의 유전자아 함께 적합한 항원 특이성의 마유스 항체 분자로부터의 스플라이싱 유전자에 의해 "키메라 항체"의 제조를 위해 개발된 기법[참조: Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454]을 사용할 수 있다. 위에서 기술한 바와 같이, 키메라 항체는, 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자, 예를 들어, 마우스 mAb 및 사람 면역글로불린 불변 영역, 예를 들어, 사람화 항체로부터 유래된 가변 영역을 갖는 것이다.
또는, 일본쇄 항체의 제조에 대해 기술된 기법[참조: 미국 특허 제4,694,778호; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-59883; 및 Ward et al., 1989, Nature 334:544-54]을 일본쇄 항체를 제조하는데 적용시킬 수 있다. 일본쇄 항체를 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄를 아미노산 가교를 통해 결합시킴으로써 형성시켜, 일본쇄 폴리펩타이드를 발생시킨다. 기능성 Fv 단편의 이. 콜라이내에서의 어셈블리에 대한 기법을 또한 사용할 수 있다[참조: Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041].
항체 제조 방법
본 발명의 항체를 항체 합성에 대해 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 특히 화학적 합성 또는 바람직하게는 재조합 발현 기법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이의 단편, 유도체 또는 동족체, 예를 들어, 본 발명의 중쇄 또는 경쇄의 재조합 발현은 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터의 작제를 필요로 한다. 일단 본 발명의 항체 분자 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 부분(바람직하게는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 함유)이 수득되면, 항체 분자의 제조를 위한 벡터를 당해 분야에 익히 공지된 기법을 이용하는 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다. 이와 같이, 뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 항체를 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하는 방법은 본원에 기술되어 있다. 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지된 방법을 사용하여, 항체 암호화 서열 및 전사 및 해독 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어,시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 이와 같이, 본 발명은, 본 발명의 항체 분자, 또는 프로모터에 작동적으로 결합되는, 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 항체 분자의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고[참조예: PCT 공보 제WO 86/05807호; PCT 공보 제WO 89/01036호; 및 미국 특허 제5,122,464호], 항체의 가변 영역을 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위해 상기 벡터내로 클로닝시킬 수 있다.
발현 벡터를 통상적인 기법에 의해 숙주 세포에 전달하고, 이어서 감염된 세포를 통상적인 기법에 의해 배양시켜, 본 발명의 항체를 제조한다. 이와 같이, 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 이종 프로모터에 작동적으로 결합되는 이의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 이중 쇄 항체의 발현에 대해 바람직한 양태에서, 중쇄 및 경쇄 둘 다를 암호화하는 벡터를 아래에 상세히 기술하는 바와 같이 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포내에서 공발현시킬 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 활용하여, 본 발명의 항체분자를 발현시킬 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 해당 암호화 서열을 제조하고 후속적으로 제조할 수 있는 비히클을 나타내나, 적합한 뉴클로레오타이드 암호화 서열로 형질전환되거나 형질감염된 경우에 동일 반응계내에서 본 발명의 항체 분자를 발현시킬 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질감연된 세균(예:이. 콜라이, 비. 서브틸리스(B. subtilis)와 같은 미생물; 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예: 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Phichia)); 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예: Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 레이트 프로모터 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 작제물을 제공하는 포유동물 세포계(예: COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 대해 바람직한 세균 세포, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 및 보다 바람직한 진핵 세포를 재조합 항체 분자의 발현에 사용한다. 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 중국산 햄스터 난소 세포(CHO)는 사람 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간체 초기 유전자 프로모터 성분과 같은 벡터와 함께 항체에 대해 유효한 발현 시스템이다[참조: Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2].
세균계에 있어서, 다수의 발현 벡터를 발현시킬 항체 분자에 대해 목적하는 용도에 따라 유리하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 다량의 단백질을 제조할 경우에, 항체 분자의 약제학적 조성물의 생산에 대해, 용이하게 정제되는 고수준의 융합 단백질 산물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는, 항체 암호화 서열을 lac Z 암호화 영역을 갖는 구조물인 벡터내로 개별적으로 결합시켜 융합 단백질을 제조할 수 있는 이. 콜라이 발현 벡터 pUR278[참조: Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791]; pIN 벡터[참조: Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509] 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, pGEX 벡터를 사용하여, 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 이종 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질을 가용성이며, 매트릭스 글루타치온-아가로스 비즈에의 흡착 및 결합에 의해, 후속적으로 유리 글루타치온의 존재하의 용출에 의해 용해된 세포ㄹ부터 용이하게 정제할 수 있다. pGEX 벡터를, 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하여, 클로닝된 표적 유전자 산물을 GST 성분으로부터 유리시킬 수 있도록 고안되어 있다.
곤충계에 있어서, 오토그래파 캘리포니카 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV: Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)를 벡터로서 사용하여, 외래 유전자를 발현시킨다. 당해 바이러스를 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포내에서 성장시킨다. 항체 암호화 서열을 바이러스의 비필수 영역(예를 들어, 폴리페드린 유전자)내로 개별적으로 클로닝시키고, AcNPV 프로모터(예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 제어하에 위치시킬 수 있다.
포유동물 숙주 세포에 있어서, 다수의 바이러스계 발현 시스템을 활용할 수있다. 아데노바이러스를 발현 벡터로서 사용하는 경우에 있어서, 대상 항체 암호화 서열을 아데노바이러스 전사/해독 제어 복합체, 예를 들어, 레이트(late) 프로모터 및 삼부체(triparite)로 이루어진 리더 서열에 결합시킬 수 있다. 이어서, 이들 키메라 유전자를 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈내에 삽입시킬 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역(예를 들어, 영역 E1 또는 E3)을 삽입하여 감염된 숙주내에서 생존가능하고 항체 분자를 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스를 생성시킬 수 있다(참조예: Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359]. 특이적인 개시 신호는 삽입된 항체 암호화 서열의 효율적인 해독을 필요로 할 수도 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접하는 서열을 포함한다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입물의 해독을 확실하게 하는 목적하는 암호화 서열의 리딩 프레임을 갖는 상내에 존재할 수 있다. 이러한 외인성 해독 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 다양한 기원일 수 있다. 발현의 효율은 적합한 전사 인핸서 인자, 전사 터미네이터 등의 봉입에 의해 증강시킬 수 있다[참조: Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544].
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 바람직한 특정 방식으로 유전자 산물을 변형시키고 처리하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 처리(예를 들어, 절단)는 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 해독후 처리 및 변형에 대해 특징적이고 특수한 메카니즘을 가진다. 적합한 세포주 또는 숙주계를 선택하여, 발현된 외래 단백질의 올바른 변형 및 처리를 확실하게 할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 유전자 산물의 일차 전사, 글리코실화 및 포스포릴화의 적합한 처리를 위해 세포 조직을 처리하는 진핵 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, 및 특히 유방암 세포주, 예를 들어, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, 및 정상 포유동물 선 세포주, 예를 들어, CRL 7030 및 Hs578Bst를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정하게 발현시키는 세포주를 조작할 수 있다. 복제의 바이러스성 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것 보다는, 숙주 세포를 적합한 발현 제어 인자(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 터미네이터, 폴리아데닐화 부위 등), 및 선택가능한 마커에 의해 제어된 DNA로 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포를 강화 배지내에서 1 내지 2일 동안 성장시킬 수 있고, 이어서 선택 배지로 대체한다. 재조합 플라스미드내의 선택가능한 마커는 선택에 대한 내성을 제공하고, 플라스미드를 세포의 염색체내에 안정하게 통합시키고, 성장시켜 교대로 세포주에 클로닝시키고 확대시킬 수 있는 포커스를 형성시킨다. 이러한 방법은 항체 분자를 발현시키는 세포주를 조작하는데 유리하게 사용할 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 선별 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 각각 사용할 수 있는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제[참조: Wigler et al., 1977, Cell 11:223], 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제[참조: Szyvalska & Szybalski, 192, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202], 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제[참조: Lowy et al., 1980, Cell 22:817] 유전자를 포함하는 다수의 선택 시스템을 사용할 수 있다. 또한, 항대사물질 내성을 다음 유전자에 대한 선택의 기준으로서 사용할 수 있다: 메토트렉세이트에 내성을 제공하는 dhfr[참조: Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527]; 마이코페놀산에 대한 내성을 제공하는 gpt[참조: Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072]; 아미노글리코사이드 G-418에 내성을 제공하는 neo[참조: Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; 및 Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215]; 및 하이그로마이신에 내성을 제공하는 hygro[참조: Santerre et al., 1984, Gene 30:147]. 사용할 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에 통상적으로 공지된 방법이 문헌[참조: Ausuvel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecylar Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; 및 in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1, 이들 문헌의 내용이 참고로 본원에 인용되어 있음]에 기술되어 있다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가시킬 수 있다[개관용 참조:Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplication for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3.(Academic Press, New York, 1987)]. 항체를 발현시키는 벡터 시스템내에서 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양물내에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 복제수를 증가시킬 수 있다. 증폭된 영역이 항체 유전자와 연합되기 때문에, 항체의 생산은 또한 증가할 것이다[참조: Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257].
숙주 세포를 본 발명의 2종의 발현 벡터, 즉 중쇄 유래된 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 벡터 및 경쇄 유래된 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 벡터로 공형질전환시킬 수 있다. 2종의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 또는, 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다를 암호화하는 단일 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 상황에서, 과잉의 독성 유리 중쇄를 회피하기 위해는 중쇄 앞에 경쇄를 위치시켜야만 한다[참조: Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 77:197]. 중쇄 및 경쇄의 암호화 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
일단 본 발명의 항체 분자가 재조합적으로 발현되면, 이를 면역글로불린 분자의 정제에 대해 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피(예: 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A에 대한 특이적 항원에 관한 친화도에 의해, 및 사이징 컬럼 크로마토프래피), 원심분리, 또는 분별 용해성에 의해, 또는 단백질 정제에 대한 임의의 다른 표준 기법에 의해 정제할 수 있다.
항체 접합체
본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드(또는 이의 부분, 바람직하게는 폴리펩타이드의 10개, 20개 또는 50개 이상 아미노산)에 재조합적으로 융합되거나 화학적으로 접합(공유 및 비공유 접합 둘 다를 포함)되어 융합 단백질을 생성시키는 항체를 포함한다. 이러한 융합은 반드시 지시되어야만 하는 것은 아니나, 링커 서열을 통해 발생할 수 있다. 당해 항체는 본 발명의 폴리펩타이드(또는 이의 부분, 바람직하게는 폴리펩타이드의 10개, 20개 또는 50개 이상 아미노산) 이외의 항원에 대해 특이적일 수 있다. 예를 들어, 당해 항체를 사용하여, 본 발명의 폴리펩타이드를 시험관내 또는 생체내에서 특유의 세포 표면 수용체에 대해 특이적인 항체에 융합시키거나 접합시킴으로써 본 발명의 폴리펩타이드를 특유의 세포 유형에 대해 표적화시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드에 융합되거나 접합된 항체를 또한 당해 분야에 공지된 방법을 이용하는 시험관내 면역검정 및 정제법에서 사용할 수도 있다[참조예: Harbor et al., supra; 및 PCT 공보 제WO 93/21232호; EP 제439,095호, Naramura et al., Immunol. Lett. 39:91-99(1994); 미국 특허 제5,474,981호; Gillies et al,. PNAS 89:1428-1432(1992); Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452(1991); 이들 문헌의 내용은 참고로 인용되어 있음].
본 발명은 가변 영역 이외의 항체 영역에 융합되거나 접합되어 있는 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드는 항체 Fc 영역 또는 이의 부분에 융합되거나 접합될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드에 융합된 항체 부분은 불변 영역, 힌지 영역, CH1 영역, CH2 영역 및 CH3 영역, 또는 전체 영역 또는 이의 부분의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 당해 폴리펩타이드는 상기 항체 부분에 융합되거나 접합되어 중합체를 형성시킬 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드에 융합된 Fc 부분은 Fc 부분 사이의 디설파이드 결합을 통해 이량체를 형성할 수도 있다. 보다 큰 중합체성 형태를, 폴리펩타이드를 IgA 및 IgM의 부분에 융합시킴으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 항체 부분에 융합시키거나 접합시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조예: 미국 특허 제5,336,603호, 제5,622,929호, 제5,359,046호, 제5,349.053호, 제5,447, 851호, 제5,112,946호, EP 제307,434호, EP 제367,166호, PCT 공보 제WO 96/04388호, 제WO 91/06570호; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539(1991); Zheng et al., J. Immunol. 154:5590-5600(1995); 및 Vil et al., Proc. Narl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341(1992)(이들 문헌의 내용은 참고로 인용되어 있음)].
위에서 논의한 바와 같이, 폴리펩타이드의 생체내 반감기를 증가시키기 위해 또는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하는 면역검정법에서 사용하기 위해, 본 발명의 폴리펩타이드를 상기 항체 부분에 융합시키거나 접합시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드를 상기 항체 부분에 융합시키거나 접합시켜, 정제를 용이하게 할 수 잇다. 한 보고된 예는 사람 CD4-폴리펩타이드의 첫번째 2개 영역 및 포유동물 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역 중 다양한 영역으로 이루어진 키메라 단백질을 기술하고 있다[참조: EP 제394,827호; Traunecker et al., Nature331:84-86(1988)]. (IgG로 인해) 디설파이드-결합된 이량체 구조를 갖는 항체에 융합되거나 접합된 본 발명의 폴리펩타이드가 또한 단량체성 분비된 단백질 또는 단백질 단편 단독 이외의 다른 분자를 결합시키고 중화시키는데 보다 효율적일 수도 있다[참조: Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964(1995)]. 다수의 경우에, 융합 단백질내의 Fc 부분은 치료법 및 진단법에서 유효하므로, 예를 들어, 개선된 약력학적 특성을 발생시킬 수 있다[참조: EP A 제232,262호]. 또는, 융합 단백질을 발현시키고, 검출하고, 정제한 후에 Fc 부분을 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질이 면역화에 대한 항원으로 사용되는 경우에, Fc 부분은 치료법 및 진단법을 방해할 수 있다. 약물 발견에 있어서, 예를 들어, 고처리량 선별 검정의 목적을 위해 hIL-5와 같은 사람 단백질을 Fc 부분과 융합시켜, hIL-5의 길항제를 동정한다[참조: D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58(1995); K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459-9471(1995)].
또한, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 펩타이드와 같은 마커 서열에 융합시켜, 이의 정제를 용이하게 할 수 있다. 바람직한 양태에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩타이드, 예를 들어, pQE 벡터내에 제공된 태그[참조: QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311]이고, 이들 가운데, 다수가 상업적으로 구입가능하다. 문헌[참조: Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824(1989)]에 기술되어 있는 바와 같이, 예를 들어, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 위해 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩타이드 태그는 인플루엔자 혈구응집 단백질로부터 유래하는 에피토프에 상응하는 "HA" 태그[참조:Wilson et al., Cell 37:767(1984)] 및 "플래그(flag)" 태그를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 진단제 또는 치료제에 접합된 항체 또는 단편을 추가로 포함한다. 당해 항체를 진단학적으로 사용하여, 예를 들어, 임상 시험 과정의 일부로서 종양의 성장 또는 퇴행을 모니터링하여, 제공된 치료 섭생의 효능을 측정할 수 있다. 항체를 검출가능한 물질에 커플링시켜 검출을 용이하게 할 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 효소, 인공삽입물 그룹, 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 다양한 양자 방출 단층촬영술을 이용하는 양자 방출 금속 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다. 본 발명에 따라 진단제로서 사용하기 위해 항체에 접합시킬 수 있는 금속 이온에 대해서는 미국 특허 제4,741,900호를 참조할 수 있다. 적합한 효소의 예는 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린스테라제를 포함하고, 적합한 인공삽입물 그룹 복합체의 예는 스트렙트아비딘/비오틴, 및 아비딘/비오틴을 포함하고, 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 , 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 파이코에리트린을 포함하고, 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고, 생체발광 물질의 예는 루시페라제, 루시페린 및 아에쿠오린을 포함하고, 적합한 방사성 물질의 예는125I,131I,111In 또는99Tc를 포함한다.
또한, 항체 또는 이의 단편을 치료학적 성분, 예를 들어, 세포독소, 예를 들어, 정균제 또는 살균제, 치료제 또는 방사성 금속 이온에 접합시킬 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 제제를 포함한다. 이들 예에는 파클리탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올 및 푸로마이신, 및 이들의 유사체 또는 동족체가 포함된다. 치료제는 항대사물질, 티오에파 클로르암부실, 멜파란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP)(시스플라틴), 안트라사이클린(예: 다우노루비신(이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예: 닥티노마이신(이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)), 및 항유사분열제(예: 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함한다.
본 발명의 접합체는 제공된 생물학적 반응을 조절하는데 사용할 수 있으며, 치료제 또는 약물 성분은 통상의 화학적 치료제에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 약물 성분은 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소와 같은 독소; 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 혈전제 또는 항-혈관형성제, 예를 들어, 안지오스타틴 또는 엔도스타틴과 같은 단백질; 또는, 예를 들어, 림포카인, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-6("IL-6"), 과립구 마크로파아지 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF") 또는 다른 성장 인자와 같은 생물학적 반응 조절인자일 수 있다.
또한, 항체를, 면역검정 또는 표적 항원의 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착시킬 수 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 치료학적 성분을 항체에 접합시키는 기술은 익히 공지되어 있다[참조예: Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56(Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstroma et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)].
또는, 내용이 참고로 본원에 인용되어 있는 문헌[참조: 미국 특허 제4,476,980호(Segal)]에 기술된 바와 같이, 당해 항체를 제2 항체에 접합시켜, 항체 이종접합체를 형성시킬 수 있다.
항체에 접합되어 있는 치료학적 성분의 존재 또는 부재하에 단독으로 또는 세포독성 인자(들) 및/또는 사이토킨(들)과 배합하여 당해 항체를 치료제로서 사용할 수 있다.
항체 결합에 대한 검정법
본 발명의 항체를 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 면역특이적 결합에 대해 검정할 수 있다. 사용할 수 있는 면역검정법은 웨스턴 블롯, 방사성 면역검정, ELISA(효소 결합 면역흡착 검정법), "샌드위치" 면역검정법, 면역침강 검정법, 침강 반응, 겔 확산 침강 반응, 면역확산 검정법, 응집 검정법, 보체-결합 검정법, 면역방사측정 검정법, 형광 면역검정법, 단백질 A 면역검정법과 같은 기법을 이용하는 경쟁적 및 비경쟁적 검정 시스템을 포함하나, 이에 한정되지는 않으며, 단지 소수만을 예로 든 것이다. 이러한 검정법은 일상적이며 당해 분야에 익히 공지되어 있다[참조예: Ausubel et al, eds, 1994, Curre추 Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, 당해 문헌의 내용은 참고로 본원에 인용되어 있음]. 전형적인 면역검정법은 아래에 간략하게 기술되어 있다(그러나, 이에 의해 한정하고자 하는 것은 아니다).
면역침강 프로토콜은 일반적으로 세포의 개체군을 용해 완충액, 예를 들어, 단백질 포스파타제 및/또는 프로테아제 억제제(예: EDTA, PMSF, 아프로티닌, 나트륨 바나데이트)를 보충시킨 RIPA 완충액(1% NP-40 또는 Triton X-100, 1% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 0.15M NaCl, 0.01M 나트륨 포스페이트, pH 7.2, 1% 트라실올)내에서 용해시키고, 대상 항체를 세포 용해물에 가하고, 4℃에서 일정 시간(예: 1 내지 4시간) 동안 배양하고, 단백질 A 및/또는 단백질 G 세파로즈 비드를 세포 용해물에 가하고, 4℃에서 약 1시간 이상 동안 가하고, 상기 비드를 용해 완충액으로 세척하고, 비드를 SDS/샘플 완충액에 재현탁시킴을 포함한다. 대상 항체가 특유의 항원을 면역침강시키는 능력을, 예를 들어, 웨스턴 블롯 분석법에 의해 검정할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 항체의 항원에의 결합을 증가시키고 배경을 감소시키도록(예를 들어, 세포 용해물을 세파로즈 비드로 예비 정화시킴) 개질시킬 수 있는 파라미터에 대해 정통할 것이다. 면역침강 프로토콜에 대한 추가의 논의는 문헌[Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10. 16. 1.]을 참조한다.
웨스턴 블롯 분석법은 단백질 샘플을 제조하고, 당해 단백질 샘플을 폴리아크릴아미드 겔(예: 항원의 분자량에 따라 8% 내지 20% SDS-PAGE)내에서 전기영동시키고, 폴리아크릴아미드로부터의 단백질 샘플을 니트로셀룰로즈, PVDF 또는 나일론과 같은 막에 이전시키고, 막을 차단 용액(예: 3% BSA 또는 탈지유를 함유하는 PBS)내에서 차단시키고, 막을 세척 완충액(예: PBS-Tween 20)으로 세척하고, 막을 차단 완충액으로 희석시킨 1차 항체(대상 항체)로 차단시키고, 막을 세척 완충액으로 세척하고, 막을 차단 완충액으로 희석시킨 효소성 기질(예: 서양 고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제) 또는 방사성 분자(예: 32P 또는 125I)에 접합된 2차 항체(1차 항체를 인식함, 예: 항-사람 항체)로 차단시키고, 막을 세척 완충액으로 세척하고, 항원의 존재를 검출함을 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 검출되는 신호를 증가시키고 배경 소음을 감소시키도록 개질시킬 수 있는 파라미터에 대해 정통할 것이다. 웨스턴 블롯 프로토콜에 대한 추가의 논의는 문헌[Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10. 8. 1.]을 참조한다.
ELISA는 항원을 제조하고, 96웰 미세역가 플레이트의 웰을 항원으로 피복시키고, 효소성 기질(예를 들어, 서양 고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제)과 같은 검출가능한 화합물에 접합된 대상 항체를 웰에 가하고, 일정 시간 동안 배양하고, 항원의 존재를 검출함을 포함한다. ELISA에 있어서, 대상 항체를 검출가능한 화합물에 접합시켜서는 안되며, 대신에 검출가능한 화합물에 접합된 제2 항체(대상 항체를 인식함)를 웰에 가할 수 있다. 또한, 웰을 항원으로 피복시키는 대신에, 항체를 웰에 피복시킬 수 있다. 이러한 경우에, 검출가능한 화합물에 접합된 제2 항체를 가한 다음, 대상 항원을 피복된 웰에 가할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 검출된 신호를 증가시키도록 개질시킬 수 있는 파라미터뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 ELISA의 변형에 대해 정통할 것이다. ELISA에 대한 추가의 논의는 문헌[Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1.]을 참조한다.
항체의 항원에 대한 결합 친화도 및 항체-항원 상호작용의 해제 속도를 경쟁적 결합 검정법에 의해 측정할 수 있다. 경쟁적 결합 검정법의 일례는 표지된 항원(예: 3H 또는 125I)을 미표지된 항원의 증가량의 존재하에 대상 항체와 함께 배양하고, 표지된 항원에 결합된 항체를 검출함을 포함하는 방사성 면역검정법이다. 대상 항체의 특유의 항원에 대한 친화도 및 결합 해제 속도를 스케챠드 플롯 분석법에 의한 데이터로부터 측정할 수 있다. 제2 항체와의 경쟁을 또한 방사성 면역검정법에 의해 측정할 수 있다. 이러한 경우에, 항원을 미표지된 제2 항체의 증가량의 존재하에 표지된 화합물(예: 3H 또는 125I)에 접합된 대상 항체와 함께 배양한다.
치료학적 용도
또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 하나 이상의 기술한 장애를 치료하기 위해 환자인 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 사람에게 투여함을 포함하는 항체-기본 요법에 관한 것이다. 본 발명의 치료학적 화합물은 본 발명의 항체(본원에 기술된 바와 같은 이의 단편, 유사체 및 동족체를 포함) 및 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산(본원에 기술된 바와 같은 이의 단편, 유사체 및 동족체를 포함)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 항체를 사용하여, 자가면역 질환 및/또는 결핍증과 같은 질환 및/또는 장애를 포함하나, 이에 한정되지는 않는, 본 발명의 폴리펩타이드의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 및 장애를 치료하거나 예방할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 이상 발현 및/또는 활성과관련된 질환 및 장애의 치료 및/또는 장애는 이들 질환 및 장애와 관련된 증상을 완화시킴을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 항체는 당해 분야에 공지되거나 본원에 기술된 바와 같은 약제학적으로 허용되는 조성물로 제공할 수 있다.
본 발명의 항체를 치료학적으로 사용할 수 있는 방식의 개요는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 생체내에서 국부적으로 또는 전신적으로, 또는 예를 들어, 보체에 의해 매개된 바와 같은 항체의 직접 세포독성(CDC)에 의해 또는 이펙터 세포에 의해(ADCC) 결합시킴을 포함한다. 이들 접근법 중 몇몇은 아래에 보다 상세하게 기술되어 있다. 본원에 제공된 교시로 보강할 경우, 당해 분야의 숙련가는 과도한 실험작업없이 진단, 모니터링 또는 치료학적 목적을 위해 본 발명의 항체를 사용하는 방법을 이해할 것이다.
본 발명의 항체는 다른 모노클로날 또는 키메라 항체와 배합하거나, 예를 들어, 항체와 작용하는 이펙터 세포의 수 또는 활성을 증가시키는 작용을 하는 림포킨 또는 조혈 성장 인자(예를 들어, IL-2, IL-3 및 IL-7)와 함께 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명의 항체는 단독으로 또는 다른 유형의 치료법(예를 들어, 방사선 치료, 화학요법, 호르몬 요법, 면역요법 및 항종양제)과 함께 투여할 수 있다. 일반적으로, 환자의 종과 동일한 종인 종 기원 또는 종 반응성(항체의 경우)의 산물의 투여가 바람직하다. 이와 같이, 바람직한 양태에서는, 사람 항체, 단편, 유도체, 유사체 또는 핵산을 치료 또는 예방을 위해 사람 환자에게 투여한다.
생체내 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드(이의 단편 포함)에 대해 지시된 면역검정 및 이와 관련된 장애의 치료법을 위해 본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 대한 항체(이의 단편 또는 부분 포함)의 고 친화성 및/또는 강력한 억제 및/또는 중화를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 항체, 단편 또는 부분은 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드(이의 단편 포함)에 대한 친화성을 가질 것이다. 바람직한 결합 친화도에는 5X10-6M, 10-6M, 5X10-7M, 10-7M, 5X10-8M, 10-8M, 5X10-9M, 10-9M, 5X10-10M, 10-10M, 5X10-11M, 10-11M, 5X10-12M, 10-12M, 5X10-13M, 10-13M, 5X10-14M, 10-14M, 5X10-15M 및 10-15M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 갖는 것이 포함된다.
유전자 요법
구체적 양태에 있어서, 항체 또는 이의 기능성 유도체를 암호화하는 핵산을 투여하여, 유전자 요법에 의해 본 발명의 폴리펩타이드의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 치료하거나, 억제하거나 예방한다. 유전자 요법은 발현되거나 발현가능한 핵산을 환자에게 투여함으로써 수행되는 요법을 의미한다. 본 발명의 양태에 있어서, 핵산은 치료학적 효과를 매개하는 이들의 암호화된 단백질을 생산한다.
당해 분야에서 이용가능한 유전자 요법에 대한 임의의 방법을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 전형적인 방법을 아래에 기술한다.
유전자 요법의 개관을 위해서, 문헌[Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; and Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215)]을 참조한다. 사용할 수 있는 재조합 DNA 기술의 당해 분야에 통상적으로 공지된 방법은 문헌[참조: Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; and Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY]에 기술되어 있다.
바람직한 국면에서, 당해 화합물은, 항체 또는 이의 단편 또는 키메라 단백질 또는 중쇄 또는 경쇄를 적합한 숙주내에서 발현시키는 발현 벡터의 일부인, 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 특히, 이러한 핵산 서열은 유도가능하거나 구조성이고, 임의로 조직-특이적인, 항체 암호화 부위에 작동적으로 결합된 프로모터를 보유한다. 다른 구체적 양태에 있어서, 항체 암호화 서열 및 임의의 다른 바람직한 서열이 게놈내의 바람직한 부위에서 동종성 재조합을 촉진시키는 부위에 의해 플랭킹되어, 항체 핵산의 염색체내 발현을 제공하는 핵산 분자를 사용한다[참조: Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438]. 구체적 양태에 있어서, 발현된 항체 분자는 일본쇄 항체이고, 또는, 핵산 서열은 항체의 중쇄 및 경쇄 또는 이들의 단편을 둘 다 암호화하는 서열을 포함한다.
핵산의 환자에게의 전달은 직접적 또는 간접적일 수 있으며, 직접적인 경우에, 환자는 핵산 또는 핵산-전달 벡터에 직접적으로 노출되며, 간접적인 경우에는, 세포를 먼저 시험관내에서 핵산으로 형질전환시킨 다음, 환자에게 이식한다. 이들 2가지 접근법은 생체내 또는 생체외 유전자 요법으로서 각각 공지되어 있다.
구체적 양태에 있어서, 핵산 서열은 직접적으로 생체내 투여하며, 이는 발현되어 암호화된 산물을 생산한다. 이는 당해 분야에 공지된 임의의 다수의 방법에 의해, 예를 들어, 핵산 서열을 적합한 핵산 발현 벡터의 일부로서 작제하여, 이들이 세포내에 존재하도록 투여함으로써, 예를 들어, 결손 또는 약독화 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 사용한 감염[참조: 미국 특허 제4,980,286호]에 의해 또는 노출된 DNA의 직접 주사에 의해, 또는 미세입자 충격(예: 유전자 건; Biolistic, Dupont), 또는 액체 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제로의 피복, 리포좀, 미세입자 또는 미세캡슐내로의 캡슐화, 또는 공지된 펩타이드에 결합시킨 핵산 서열을 투여하여, 핵을 유입시키고, 수용체-매개된 세포내 이입에 적용된 리간드에 결합시킨 핵산 서열을 투여[참조예: Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432](이러한 방법을 사용하여 수용체를 특이적으로 발현시키는 세포 유형을 표적화할 수 있다)하거나, 기타 방법에 의해 달성할 수 있다. 또 다른 양태에 있어서, 리간드가 엔도좀을 파괴시켜, 핵산을 리소좀 분해로부터 피할 수 있도록 하는 용해성 바이러스 펩타이드를 포함하는 핵산-리간드 착체를 형성할 수 있다. 또 다른 양태에 있어서, 핵산을 특이적 수용체의 표적화에 의해 세포 특이적 흡수 및 발현에 대해 생체내에서 표적화할 수 있다[참조예: PCT 공보 제WO92/06180호, 1992년 4월 16일(Wu et al.); 제WO 92/22635호, 1992년 12월 23일(Wilson et al.); 제WO 92/20316호, 1992년 11월 26일(Findeis et al.); 제WO 93/14188호, 1993년 7월 22일(Clarke et al.); 제WO 93/20221호, 1993년 10월 14일(Young)]. 또는, 핵산을 발현을 위해 동종성 재조합에 의해 세포내로 유입하거나 숙주 세포 DNA내에 통합시킬 수 있다[참조: Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; ZijIstra et al., 1989, Nature 342:435-438].
구체적 양태에 있어서, 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 벡터를 사용한다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있다[참조: Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599]. 이들 레트로바이러스 벡터는, 바이러스 게놈의 팩킹 및 숙주 세포 DNA내로의 통합에 필요로 하지 않는 레트로바이러스 서열을 결실시켜야만 하였다. 유전자 요법에서 사용되는 항체를 암호화하는 핵산 서열을 하나 이상의 벡터에 클로닝시켜, 유전자의 환자에게로의 전달을 용이하게 한다. 레트로바이러스 벡터에 관한 보다 상세한 사항은, mdrl 유전자를 조혈 간세포로 전달하여, 간세포를 화학요법에 대해 보다 더 내성이도록 만들기 위해 레트로바이러스 벡터를 사용함을 기술하고 있는 문헌[참조: Boesen et al., 1994, Biotherapy 6:291-302]에서 찾아볼 수 있다. 유전자 요법에서의 레트로바이러스 벡터의 사용을 예시하고 있는 다른 참고문헌은 다음 문헌[참조: Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-65 1; Klein et al., 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-14 1; 및 Grossmanand Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114]이다.
아데노바이러스가 유전자 요법에서 사용할 수 있는 다른 바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 유전자를 호흡 상피에 전달하기 위한 특히 관심있는 비히클이다. 아데노바이러스는 경질환을 유발하는 호흡 상피를 자연적으로 감염시킨다. 아데노바이러스계 전달 시스템에 대한 다른 표적은 간, 중추신경계, 내피 세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 비-분할 세포를 감염시킬 수 있는 이점을 갖는다. 문헌[참조: Kozarsky and Wilson, 15 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503]에는 아데노바이러스계 유전자 요법의 개관을 기술한다. 문헌[참조: Bout et al., 1994, Human Gene Therapy 5:3-10]은 유전자를 리저스 원숭이의 호흡 상피에 전달하기 위한 아데노바이러스 벡터의 사용을 명시하고 있다. 유전자 요법에서의 아데노바이러스의 사용의 다른 예는 문헌[참조: Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143- 155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234; PCT 공보 제W0 94/12649호; 및 Wang, et al., 1995, Gene Therapy 2:775-783]에서 찾아볼 수 있다. 바람직한 양태에 있어서, 아데노바이러스 벡터를 사용한다.
아데노-관련된 바이러스(AAV)가 또한 유전자 요법에서의 사용에 대해 제안되어 있다[참조: Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300; 미국 특허 제5,436,146호].
유전자 요법에 대한 또 다른 접근법은, 전기천공, 리포펙션, 인산칼슘 매개된 형질감염 또는 바이러스 감염과 같은 방법에 의해 유전자를 조직 배양물내의 세포에 전달함을 포함한다. 통상적으로, 전달 방법은 선택가능한 마커의 세포에의 전달을 포함한다. 다음, 세포를 선택하에 위치시켜, 채택된 세포를 분리하고, 전달된 유전자를 발현시킨다. 이들 세포를 환자에게 전달시킨다.
이들 양태에서, 핵산을 생성된 재조합 세포의 생성된 세포를 생체내 투여 전에 세포에 도입한다. 이러한 도입은, 형질감염, 전기천공, 미세주사, 핵산 서열을 함유하는 바이러스 또는 박테리오파아지 벡터로의 감염, 세포 융합, 염색체-매개된 유전자 전달, 미세세포-매개된 유전자 전달, 스페로플라스트 융합 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행할 수 있다. 외래 유전자의 세포내로의 도입에 대해 다수의 기법이 당해 분야에 공지되어 있으며[참조예: Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618; Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol.217:618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29:69-92], 수용체 세포의 필수적인 발생 및 생리학적 기능을 붕괴시키지 않는 조건으로 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 이러한 기법은 핵산의 세포에의 안정한 전달을 제공하여, 핵산이 세포에 의해 발현가능하고, 바람직하게는 이의 세포 자손에 의해 유전가능하고 발현가능하여야 한다.
생성된 재조합 세포를 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 환자에게 전달할 수 있다. 재조합 혈구(예: 조혈 간세포 또는 전구 세포)를 바람직하게는 정맥내로 투여한다. 용도에 따라 고려되는 세포의 양은 목적하는 효과, 환자 상태 등에 따라 달라지고, 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다.
핵산을 유전자 요법의 목적을 위해 도입할 수 있는 세포는 임의의 바람직한,이용가능한 세포 유형을 포함하고, 상피 세포, 내피 세포, 각질 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; 혈구, 예를 들어, T림프구, B림프구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거핵세포, 과립구; 다양한 간세포 또는 전구 세포, 특히 예를 들어, 골수, 제대혈, 말초혈, 태아 간 등으로부터 수득된 바와 같은 조혈 간세포 또는 전구 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 양태에 있어서, 유전자 요법에 사용되는 세포는 환자에 대해 자가유래이다.
재조합 세포를 유전자 요법에서 사용하는 양태에 있어서, 항체를 암호화하는 핵산 서열을 세포에 도입하여, 세포 또는 이의 자손에 의해 발현가능하도록 하고, 이어서 재조합 세포를 치료학적 효과를 위해 생체내에 투여한다. 구체적 양태에 있어서, 간세포 또는 전구 세포를 사용한다. 시험관내에서 분리하여 유지시킬 수 있는 임의의 간세포 및/또는 전구 세포를 잠재적으로 본 발명의 양태에 따라 사용할 수 있다[참조예: PCT 공보 제WO 94/08598호, 1994년 4월 28일; Stemple and Anderson, 1992, Cell 71:973-985; Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229; 및 Pitterlkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771].
구체적 양태에 있어서, 유전자 요법의 목적을 위해 도입할 핵산은, 핵산의 발현을 적합한 전사 유도인자의 존재 또는 부재하에 제어함으로써 제어가능하게 하는 암호화 영역에 작동적으로 결합된 유도가능한 프로모터를 포함한다.
치료학적 또는 예방학적 활성의 입증
본 발명의 화합물 또는 약제학적 조성물을 바람직하게는 사람에서 사용하기 전에 목적하는 치료학적 또는 예방학적 활성에 대해 시험관내, 및 이어서 생체내에서 시험한다. 예를 들어, 당해 화합물 또는 약제학적 조성물의 치료학적 또는 예방학적 유용성을 입증하는 시험관내 검정은 당해 화합물의 세포주 또는 환자 조직 샘플에 대한 효과를 포함한다. 당해 화합물 또는 조성물의 세포주 및/또는 조직 샘플에 대한 효과는, 로제트 형성 검정법 및 세포 용해 검정법을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기법을 이용하여 측정할 수 있다. 본 발명에 따라서, 특정 화합물의 투여가 필요한지의 여부를 결정하는데 사용할 수 있는 시험관내 검정법은, 환자 조직 샘플을 배양물내에서 성장시켜, 상기 화합물 또는 다른 투여된 화합물에 노출시키고, 상기 화합물의 조직 샘플에 대한 효과를 관찰하는 시험관내 세포 배양물 검정법을 포함한다.
치료학적/예방학적 투여 및 조성물
본 발명은 유효량의 본 발명의 화합물 또는 조성물, 바람직하게는 본 발명의 항체를 환자에게 투여하는, 치료, 억제 및 예방 방법을 제공한다. 바람직한 국면에 있어서, 당해 화합물은 실질적으로 정제되어 있다(예를 들어, 이의 효과를 한정하거나 바람직하지 않은 부작용을 발생시키는 물질을 실질적으로 함유하지 않는다). 환자는 바람직하게는, 소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 동물이고, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 사람이다.
화합물이 핵산 또는 면역글로불린을 포함하는 경우에 사용할 수 있는 제형 및 투여 방법은 상기한 바와 같고, 추가의 적합한 제형 및 투여 경로를 아래에 기술한 것들 중에서 선택할 수 있다.
다양한 전달 시스템, 예를 들어, 리포좀내로의 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 화합물을 발현시킬 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개된 세포내 이입[참조예: Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432], 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서의 핵산의 작제는 공지되어 있고, 본 발명의 화합물을 투여하는데 사용할 수 있다. 도입 방법은, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외 및 경구 경로를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 당해 화합물 또는 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들어, 주입 또는 거환 주사, 상피 또는 점막피부 내층(예: 경구 점막, 직장 및 장관 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여할 수 있고, 다른 생물학적 활성 제제와 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신 또는 국부적일 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 화합물 또는 조성물을 심실내 및 경막내 주사를 포함한 임의의 적합한 경로에 의해 중추 신경계내에 도입하는 것이 바람직할 수 있으며, 심실내 주사는, 예를 들어, 옴마야(Ommaya) 저장소와 같은 저장소에 부착되어 있는 심실내 카테터에 의해 수월하게 할 수 있다. 또한, 예를 들어, 흡입기 또는 분무기의 사용에 의해, 및 에어로졸화 제제와의 제형화에 의해 폐 투여할 수도 있다.
구체적 양태에 있어서, 본 발명의 약제학적 화합물 또는 조성물을 치료를 요하는 부위에 국부적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있으며, 이는, 예를 들어, 비한정적으로 수술 동안의 국부 주입, 예를 들어, 수술 후 창상 처리와 함께 국소 도포에 의해, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해 또는 시아라스트 막과 같은 막 또는 섬유를 포함한 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 재료인 이식물에 의해 달성할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체를 포함한 단백질을 투여할 경우, 단백질이 흡수되지 않는 물질을 사용하도록 주의하여야만 한다.
또 다른 양태에 있어서, 당해 화합물 또는 조성물을 소포, 특히 리포좀내에 전달할 수 있다[참조: Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-20 Berestein, pp. 상기 문헌, 317-327; 일반적으로 상기 문헌 참조].
또 다른 양태에 있어서, 당해 화합물 또는 조성물을 조절된 방출 시스템으로 전달할 수 있다. 한 양태에 있어서, 펌프를 사용할 수 있다[참조: Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574]. 또 다른 양태에 있어서, 중합체성 물질을 사용할 수 있다[참조: Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; 및 Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105]. 또 다른 양태에 있어서, 조절된 방출 시스템을 치료학적 표적, 즉, 뇌에 근접하여 위치시켜, 소량의 전신 복용량의 필요로 한다[참조예: Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)].
다른 조절된 방출 시스템은 문헌[참조: Langer, 1990, Science 249:1527-1533]의 개관에서 논의되어 있다.
본 발명의 화합물이 단백질을 암호화하는 핵산인 구체적 양태에 있어서, 핵산을 생체내 투여하여, 이를 적합한 핵산 발현 벡터의 일부로서 작제하고, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터(미국 특허 제4,980,286호 참조)의 사용에 의해, 직접 주사에 의해 또는 미세입자 충격(예: 유전자 건; Biolistic, Dupont)의 사용에 의해 핵산이 세포내에 존재하도록 투여하거나, 액체 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제로의 피복하거나, 리포좀, 미세입자 또는 미세캡슐내로의 캡슐화, 또는 공지된 호메오박스형 펩타이드에 결합시킨 핵산을 투여하여, 핵을 유입시켜, 이의 암호화된 단백질의 발현을 촉진시킨다[참조예: Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868]. 또는, 핵산을 동종성 재조합에 의해 세포내로 도입하여 발현용 숙주 세포 DNA내에 통합시킬 수 있다.
본 발명은 또한 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 약제학적 유효량의 화합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 구체적 양태에 있어서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물, 및 특히 사람에서 사용하기 위해 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기구에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인지된 약전에 기재됨을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여하는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약제학적 담체는 물과 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예를 들어, 낙화생유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함하는 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 약제학적 조성물을 정맥내로 투여할 경우에, 물이 바람직한 담체이다. 멸균 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액을 특히 주사가능한 용제용 액체 담체로서 사용할 수도 잇다. 적합한 약젝학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤, 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 필요한 경우에, 당해 조성물은 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수도 있다. 이들 조성물을 용제, 현탁제, 유제, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 서방성 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 당해 조성물은 통상적인 결합제 및 담체, 예를 들어, 트리글리세라이드와 함께 좌제로서 제형화될 수 있다. 경구 제형은 표준 담체, 예를 들어, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로즈, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 문헌[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin]에 기술되어 있다. 당해 조성물은 바람직하게는 정제된 형태로 적합한 양의 담체와 함께 치료학적 유효량의 화합물을 함유하여, 환자에게 적합하게 투여하기 위한 형태를 제공할 것이다. 제형은 투여 양식에 적합하여야 한다.
바람직한 양태에 있어서, 조성물은 사람에게 정맥내 투여하기에 적합한 약제학적 조성물로서 일상적 과정에 따라 제형화한다. 전형적으로는, 정맥내 투여용조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 당해 조성물은 가용화제 및 국부적 마취제, 예를 들어, 리그노카인을 포함하여, 주사 부위의 통증을 경감시킬 수 있다. 일반적으로는, 상기 성분을 개별적으로 공급하거나 활성제의 양을 지시하는 앰풀 또는 샤세이와 같은 기밀 밀봉된 용기내에서 단일 투여 형태, 예를 들어, 무수 동결건조 분말 또는 비함수 농축물로서 혼합할 수 있다. 조성물을 주입에 의해 투여하여야 하는 경우에, 이를 멸균 약제학적 등급 물 또는 염수를 함유하는 주입 병에 분배할 수 있다. 조성물을 주사에 의해 투여하는 경우에, 성분들을 투여 전에 혼합할 수 있는 주사용 멸균수 또는 염수의 앰풀을 제공할 수 있다.
본 발명의 화합물은 중성 또는 염 형태로서 제형화시킬 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 음이온, 예를 들어, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것과 함께 형성된 것, 및 양이온, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것과 함께 형성된 것을 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 또는 장애의 치료, 억제 및 예방에 유효한 본 발명의 화합물의 양은 표준 임상 기법에 의해 측정할 수 있다. 또한, 시험관내 검정법을 임의로 사용하여, 최적 투여량 범위를 확인하는데 도움을 줄 수 있다. 제형에 사용할 정확한 투여량은 또한 투여 경로 및 질환 또는 장애의 중증도에 따라 달라질 것이고, 주치의의 판정 또는 개개의 환자의 상황에 따라 결정하여야만 한다. 유요한 투여량은 시험관내 또는 동물 모델시험 시스템으로부터 유도된 투여량-반응 곡선으로부터 외삽할 수 있다.
항체의 경우, 환자에게 투여되는 복용량은 전형적으로는 환차의 체중 kg당 0.1 내지 100mg/kg이다. 바람직하게는, 환자에게 투여되는 투여량은 환자의 체중 kg당 0.1 내지 20mg/kg, 보다 바람직하게는 환자의 체중 kg당 1 내지 10mg/kg이다. 일반적으로는, 사람 항체는 외래 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 인해 사람 신체내에서 다른 종으로부터의 항체보다 긴 반감기를 갖는다. 이와 같이, 사람 항체의 보다 적은 투여량 및 보다 덜 빈번한 투여 회수가 종종 가능하다. 또한, 본 발명의 항체의 투여량 및 투여 회수는 변형, 예를 들어, 지질화에 의해 항체의 흡수량 및 조직 관통율(예를 들어, 뇌내로)을 증강시킴으로써 저하시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물 중의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 사람 투여에 대한 제조, 사용 또는 판매의 기구에 의한 승인을 반영하는, 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기구에 의해 규정된 형태의 통지서가 임의로 이러한 용기에 동봉될 수 있다.
진단 및 영상화
대상 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는, 표지된 항체, 이의 유도체 및 우사체를 본 발명의 폴리펩타이드의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 및/또는 장애를 검출하거나, 진단하거나 모니터링하는데 사용할 수 있다. 본 발명은 (a) 대상 폴리펩타이드에 특이적인 하나 이상의 항체를 사용하여 개체의 세포 또는 체액내에서의 대상 폴리펩타이드의 발현을 검정하는 단계 및 (b) 유전자 발현 수준을 표준 유전자 발현 수준과 비교하는 단계(이에 의해, 표준 발현 수준과 비교하여 검정된 폴리펩타이드 유전자 발현 수준에서의 증가 또는 감소는 이상 발현의 표시이다)를 포함하는, 대상 폴리펩타이드의 이상 발현의 검출법을 제공한다.
본 발명은 (a) 대상 폴리펩타이드에 특이적인 하나 이상의 항체를 사용하여 개체의 세포 또는 체액내에서의 대상 폴리펩타이드의 발현을 검정하는 단계 및 (b) 유전자 발현 수준을 표준 유전자 발현 수준과 비교하는 단계(이에 의해, 표준 발현 수준과 비교하여 검정된 폴리펩타이드 유전자 발현 수준에서의 증가 또는 감소는 특유의 장애의 표시이다)를 포함하는, 장애의 진단을 위한 진단 검정법을 제공한다. 암과 관련하여, 개체로부터 생검된 비교적 많은 양의 전사체가 존재하는 것은 질환의 발현에 대한 소인을 지시하거나, 실제 임상 증상의 출현 전에 질환을 검출하는 수단을 제공할 수 있다. 이러한 유형의 보다 명확한 진단법은, 건강 전문가가 초기에 예방적인 조치 또는 공격적인 치료법을 사용하여, 암의 발현 또는 추후 진행을 방지할 수 있도록 한다.
생물학적 샘플내의 TR6-알파 및/또는 TR6-베타 폴리펩타이드 수준은 항체계 기법을 이용하여 검정할 수 있다. 본 발명의 항체를 사용하고, 당해 분야에 공지된 전형적인 면역조직학적 방법을 이용하여 생물학적 샘플내의 단백질 수준을 검정할 수 있다[참조예: Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)]. 단백질 유전자 발현을 검출하는데 유용한 다른 항체계 방법은 면역검정법, 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA) 및 방사성면역검정법(RIA)를 포함한다. 적합한 항체 검정 표지는 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 효소 표지, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 및 방사성 동위원소, 예를 들어, 요오드(131I,125I,123I,121I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중 수소(3H), 인듐(115mIn,113mIn,112In,111In), 테크네튬(99Tc,99mTc), 탄탈(201Ti), 갈륨(68Ga,67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 크세논(133Xe), 불소(18F),153Sm,177Lu,159Gd,149Pm,140La,175Yb,166Ho,90Y,47Sc,186Re,188Re,142Pr,105Rh,97Ru, 발광 표지, 예를 들어, 루미놀, 및 형광 표지, 예를 들어, 플루오레세인 및 로다민, 및 비오틴을 포함한다.
당해 분야에 공지된 기법을 적용시켜, 본 발명의 항체를 표지화시킬 수 있다. 이러한 기법은 이작용성 접합제의 사용을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다[참조예: 미국 특허 제5,756,065호; 제5,714,631호; 제5,696,239호; 제5,652,361호; 제5,505,931호; 제5,489,425호; 제5,435,990호; 제5,428,139호; 제5,342,604호; 제5,274,119호; 제4,994,560호 및 제5,808,003호, 이들 문헌의 각각의 내용은 참고로 본원에 인용되어 있음].
본 발명의 한 국면은 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 사람에서의 대상 폴리펩타이드의 이상 발현과 관련된 질환 또는 장애의 검출법 및 진단법이다. 한 양태에 있어서, 진단법은 a) 대상 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 표지된 분자의 유효량을 환자에게 투여(예를 들어, 비경구, 피하 또는 복강내)하는 단계; b) 폴리펩타이드가 발현되는 환자의 부위에서 표지된 분자가 우선적으로 농축되도록(및 미결합된 표지된 분자가 배경 수준으로 정화되도록) 투여 후 시간 간격 동안 대기하는 단계; c) 배경 수준을 측정하는 단계 및 d) 표지된 분자를 환자에서 검출하는 단계(배경 수준을 초과하는 표지된 분자의 검출은, 환자가 대상 폴리펩타이드의 이상 발현관 관련된 특유의 질환 또는 장애를 갖고 있다는 것을 지시한다)를 포함한다. 배경 수준은, 검출된 표지된 분자의 양을 특유의 시스템에 대해 이전에 측정한 표준값과 비교함을 포함하는 다양한 방법에 의해 측정할 수 있다.
사용된 환자의 사이즈 및 영상화 시스템이 진단학적 영상을 생성시키는데 필요한 영상화 성분의 양을 결정할 것이라는 사실은 당해 분야에 인식되어 있을 것이다. 방사성 동위원소 성분의 경우에, 사람 환자에 대해, 주사한 방사성의 양은 통상적으로 99mTc 약 5 내지 20밀리큐리의 범위일 것이다. 이어서, 표지된 항체 또는 항체 단편은 특이적 단백질을 함유하는 세포의 위치에서 우선적으로 축적될 것이다. 생체내 종양 영상화는 문헌[참조: S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." (Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochernical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)]에 기술되어 있다.
사용된 표지의 유형 및 투여 방식을 포함한 몇몇 변수에 따라, 표지된 분자가 환자의 부위에서 우선적으로 농축되고 미결합된 표지된 분자가 배경 수준으로정화되도록 하는 투여 후의 시간 간격은 6 내지 48시간 또는 6 내지 24시간 또는 6 내지 12시간이다. 또 다른 양태에 있어서, 투여 후의 시간 간격은 5 내지 20일 또는 5 내지 10일이다.
한 양태에 있어서, 예를 들어, 개시 진단 후 1개월, 개시 진단 후 6개월, 개시 진단 후 1년 및 기타 기간 동안 질환 또는 장애를 진단하는 방법을 반복하여 모니터링한다.
표지된 분자의 존재는 생체내 스캐닝에 대해 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 환자에서 검출할 수 있다. 이들 방법은 사용된 표지의 유형에 따라 달라진다. 숙련가는 특유의 표지를 검출하는데 적합한 방법을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 진단 방법에서 사용할 수 있는 방법 및 장치는, 컴퓨터 단층촬영(CT), 전신 스캔, 예를 들어, 위치 방사 단층촬영(PET), 자기 공명 영상화(MRI) 및 초음파검사를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
특정 양태에서, 당해 분자는 방사서동위원소로 표지화되고, 방사선 반응성 외과 장비를 사용하여 환자에서 검출된다[참조 문헌: 미국 특허 제5,441,050호(Thurston et al.). 또 다른 양태에서, 당해 분자는 형광성 화합물로 표지화되고, 형광 반응성 스캐닝 장비를 사용하여 환자에서 검출된다. 또 다른 양태에서, 당해 분자는 양전자 방출 금속으로 표지화되고, 양전자 방출-단층 X선 사진법을 사용하여 환자에서 검출된다. 또 다른 양태에서, 당해 분자는 상자성체 표지로 표지화되고, 자기 공명성 영상화(MRI)를 사용하여 환자에서 검출된다.
키트
본 발명은 상기한 방법에서 사용할 수 있는 키트를 제공한다. 한 양태에 있어서, 키트는 본 발명의 항체, 바람직하게는 정제된 항체를 하나 이상의 용기내에 포함한다. 구체적 양태에 있어서, 본 발명의 키트는 키트내에 포함된 항체와 특이적으로 면역반응성인 에피토프를 포함하는 실질적으로 분리된 폴리펩타이드를 함유한다. 바람직하게는, 본 발명의 키트는 대상 폴리펩타이드와 반응하지 않는 대조 항체를 추가로 포함한다. 또 다른 구체적 양태에 있어서, 본 발명의 키트는 항체의 대상 폴리펩타이드에의 결합을 검출하는 수단(예를 들어, 항체를 형광 화합물, 효소 기질, 방사성 화합물 또는 발광 화합물과 같은 검출가능한 기질에 접합시킬 수 있거나, 제1 항체를 인식하는 제2 항체를 검출가능한 기질에 접합시킬 수 있다)을 함유한다.
본 발명의 또 다른 구체적 양태에 있어서, 키트는 증식성 및/또는 암성 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드에 대해 특이적인 항체를 함유하는 혈청을 선별하는데 사용하는 진단 키트이다. 이러한 키트는 대상 폴리펩타이드와 반응하지 않는 대조 항체를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 하나 이상의 항-폴리펩타이드 항원 항체와 특이적으로 면역반응성인 에피토프를 포함하는 실질적으로 분리된 폴리펩타이드 항원을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트는 상기 항체의 항원에의 결합을 검출하는 수단(예를 들어, 항체를 유량 세포계측법에 의해 검출할 수 있는 플루오레세인 또는 로다민과 같은 형광 화합물에 접합시킬 수 있다)을 포함한다. 구체적 양태에 있어서, 키트는 재조합적으로 제조되거나 화학적으로 합성된 폴리펩타이드항원을 포함할 수 있다. 당해 키트의 폴리펩타이드 항원을 또한 고체 지지체에 부착시킬 수 있다.
보다 더 구체적 양태에 있어서, 상기한 키트의 검출 수단은 상기 폴리펩타이드 항원을 부착시키는 고체 지지체를 포함한다. 이러한 키트는 또한 비-부착된 리포터-표지된 항-사람 항체를 포함할 수도 있다. 이러한 양태에 있어서, 항체의 폴리펩타이드 항원에의 결합은 상기 리포터-표지된 항체의 결합에 의해 검출할 수 있다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드의 항원을 함유하는 혈청을 선별하는데 사용하는 진단 키트를 포함한다. 당해 진단 키트는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 항원과 특이적으로 면역반응성인 실질적으로 분리된 항체, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 항원의 항체에의 결합을 검출하기 위한 수단을 포함한다. 한 실시양태에 있어서, 항체를 고체 지지체에 부착시킨다. 구체적 양태에 있어서, 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 키트의 검출 수단은 제2의 표지된 모노클로날 항체를 포함할 수 있다. 달리, 또는 또한, 검출 수단은 표지된 경쟁 항원을 포함할 수 있다.
한 진단학적 배치에 있어서, 시험 혈청을 본 발명의 방법에 의해 수득된 표면-결합된 항원을 보유하는 고체 상 시약과 반응시킨다. 특이적 항원 항체를 시약에 결합시키고 미결합된 혈청 성분을 세척하여 제거한 후에, 시약을 고체 지지체 상에 결합된 항-항원 항체의 양에 비례하여 리포터를 시약에 결합시키는 리포터-표지된 항-사람 항체와 반응시킨다. 시약을 다시 세척하여, 미결합 표지된 항체를제거하고, 시약과 결합된 리포터의 양을 측정한다. 전형적으로는, 리포터는 적합한 형광측정, 형광 또는 비색계 기질의 존자하에 고체 상을 배양하여 검출되는 효소(Sigma, St. Louis, MO)이다.
상기 검정법에서 고체 표면 시약은 단백질 재료를 고체 지지체 재료, 예를 들어, 중합체성 비드, 딥 스틱, 96웰 플레이트 또는 필터 재료에 부착시키는데 대한 공지된 기법에 의해 제조한다. 이들 부착 방법은 일반적으로 단백질의 지지체에의 비-특이적 흡착 또는 전형적으로 유리 아민 그룹을 통한 단백질의 고체 지지체 상에서의 화학적 반응성 그룹, 예를 들어, 활성화 카복실, 하이드록실 또는 알데히드 그룹에의 공유 부착을 포함한다. 또는, 스트렙타비딘 피복된 플레이트를 비오티닐화 항원(들)과 함께 사용할 수 있다.
이와 같이, 본 발명은 상기 진단 방법을 수행하기 위한 검정 시스템 또는 기트를 제공한다. 당해 키트는 일반적으로 표면-결합된 재조합 항원을 보유한 지지체, 및 표면-결합된 항-항원 항체를 검출하기 위한 리포터-표지된 항-사람 항체를 포함한다.
면역계-관련 질환
진단
본 발명자들은 TNFR-6α 및 TNFR-6β가 조혈 조직 및 형질전환된 조직에서 발현된다는 것을 발견하였다. 수많은 면역계-관련 질환에 있어서, TNFR 유전자 발현의 실질적으로 변화된(증가된 또는 감소된) 수준은, "표준" TNFR 유전자 발현 수준, 즉, 면역계 질환에 걸리지 않은 개체로부터의 면역계 조직 또는 체액에서의 TNFR 발현 수준에 비해, 상기 질환에 걸린 개체로부터 취한 면역계 조직, 기타 세포 또는 체액(예를 들어, 혈청 및 혈장)에서 검출될 수 있다. 따라서, 본 발명은 면역계 질환의 진단 동안 유용한 진단 방법을 제공하며, 이러한 방법은 개체로부터의 면역계 조직, 기타 세포 및 체액에서 TNFR 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하고, 상기 측정된 유전자 발현 수준을 표준 TNFR 유전자 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 이때, 표준과 비교하여 유전자 발현 수준의 증가 또는 감소는 면역계 질환의 지표가 된다.
특히, 암(예: 결장암, 유방암, 폐암)에 걸린 포유동물에서 특정 조직들은 상응하는 "표준" 수준과 비교해 볼 때, TNFR 유전자의 복사체 수가 증가하고/하거나, TNFR 단백질 및 TNFR 단백질을 암호화하는 mRNA를 현저하게 증가된 수준으로 발현하는 것으로 여겨진다. 추가로, TNFR 단백질의 증가된 수준은, 상기와 같은 암에 걸리지 않은 동일 종의 포유동물로부터의 혈청과 비교하여, 암에 걸린 포유동물로부터의 특정 세포 또는 체액(예: 혈청 및 혈장)에서 검출될 수 있다.
따라서, 본 발명은 암을 포함하는 면역계 질환의 진단 동안의 진단 방법을 제공하며, 이러한 방법은 개체로부터의 면역계 조직, 기타 세포 또는 체액에서 TNFR 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하고, 상기 측정된 유전자 발현 수준을 표준 TNFR 유전자 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 이때, 표준과 비교해서 상기 유전자 발현 수준의 증가 또는 감소는 면역계 질환의 지표가 된다.
종양 진단을 포함하는 면역계 질환의 진단이 통상적인 방법들에 따라서 수행되는 경우, 본 발명은 예후 지표(prognostic indicator)로서 유용하며, 이에 따라 감소된 유전자 발현을 나타내는 환자는 표준 수준에 보다 근접한 수준으로 상기 유전자를 발현하는 환자에 비해 보다 나쁜 임상적 결과를 경험하게 될 것이다.
"TNFR 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 분석하는 것"이란 직접적으로(예를 들어, 절대 단백질 수준 또는 mRNA 수준을 측정하고 평가함으로써) 또는 간접적으로 (예를 들어, 제2 생물학적 샘플에서의 TNFR 단백질 수준 또는 mRNA 수준과 비교함으로써), 제1 생물학적 샘플에서 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 단백질 수준 또는 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 단백질을 암호화하는 mRNA 수준을 정성적으로 또는 정량적으로 측정하거나 평가하는 것을 나타낸다. 바람직하게는, 제1 생물학적 샘플에서 TNFR 단백질 수준 또는 mRNA 수준을 측정하거나 평가하고, 표준 TNFR 단백질 수준 또는 mRNA 수준과 비교하며, 이때, 표준은 면역계 질환에 걸리지 않은 개체로부터 수득된 제2 생물학적 샘플로부터 수득되거나, 면역계 질환에 걸리지 않은 개체 집단으로부터의 평균 수준을 측정한 것이다. 당해 분야에서 인식될 수 있는 바와 같이, 일단 표준 TNFR 단백질 수준 또는 mRNA 수준이 공지되면, 이들을 비교를 위한 표준으로서 반복적으로 사용할 수 있다.
"생물학적 샘플"이란 개체, 체액, 세포주, 조직 배양물, 또는 TNFR 단백질 또는 mRNA를 함유하는 기타 공급원으로부터 수득되는 임의의 생물학적 샘플을 나타낸다. 지적한 바와 같이, 생물학적 샘플은 TNFR 단백질의 유리된 세포외 도메인(들)(또는 가용성 형태(들))을 함유하는 체액(혈청, 혈장, 뇨, 활액 및 척수액), 면역계 조직, 및 완전한 TNFR, 성숙한 TNFR, 또는 TNFR의 세포외 도메인을 발현하는것으로 밝혀진 기타 조직 공급원을 포함한다. 포유동물로부터 조직 절편 및 체액을 수득하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 생물학적 샘플이 mRNA을 포함하는 경우, 조직 절편이 바람직한 공급원이다.
본 발명은 또한 TNFR 유전자 돌연변이를 진단하기 위한 본 발명의 유전자의 용도를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이가 본 발명의 유전자 중 하나에 존재하는 경우, 병리상태는 본 발명의 수용체 폴리펩타이드의 생성의 결핍으로부터 기인하게 된다. 추가로, 수용체 폴리펩타이드 활성을 강화시키는 돌연변이는 수용체 폴리펩타이드의 과발현과 관련된 질환(예: 암)을 초래한다. 상기 유전자중에서의 돌연변이는 정상 유전자 서열과 결함 유전자 서열을 비교함으로써 검출될 수 있다. 후속적으로, 돌연변이 유전자가 질환 상태 또는 질환 상태에 대한 감염용이성과 관련이 있다는 것을 입증할 수 있다. 즉, 본 발명의 수용체 폴리펩타이드의 과발현을 초래하는 돌연변이 유전자는, TNFR가 Fas 리간드 및/또는 AIM-II 매개된 어팝토시스를 억제하지 못하여, 결국 불규칙한 세포 증식(예: 종양 성장)을 초래하는 것과 관련이 있을 수 있다.
전술한 분석법에 의해 진단될 수 있는 기타 면역계 질환에는 과감작화, 알레르기, 감염성 질환, 이식편-대-숙주 질환, 면역결핍, 자가면역 질환 등이 포함되나, 이로서 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 유전자중에 돌연변이를 가진 개체는 다양한 기술에 의해 DNA 수준에서 검출될 수 있다. 진단에 사용되는 핵산은 혈액, 뇨, 타액 및 기타 조직중의 조직 절편과 같은 환자의 세포로부터 수득될 수 있다. 게놈성 DNA는 검출에 직접적으로 사용되거나 분석에 앞서 PCR[Saiki et al., Nature, 324:163-166 (1986)]을 사용하여 효소적으로 증폭시킬 수 있다. RNA 또는 cDNA도 또한 동일한 목적에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 본 발명의 사람 유전자 중 돌연변이를 분리하고 분석할 수 있다. 예를 들어, 결실물 및 삽입물은 정상적인 유전자형과 비교하여 증폭된 생성물의 크기 변화에 의해 검출될 수 있다. 점 돌연변이는 증폭된 DNA를 본 발명의 방사능 표지된 RNA, 또는 달리, 방사능표지된 안티센스 DNA 서열에 하이브리드화시킴으로써 확인될 수 있다. 완전히 정합된 서열은 RNase A 절단 또는 융점 온도 차이에 의해 부정합된 이본쇄로부터 구별될 수 있다. 이러한 진단은 출생전 또는 신생아 시험에 특히 유용하다.
기준 유전자 및 "돌연변이체" 사이의 서열 차이는 직접적인 DNA 서열 분석법으로 밝혀질 수 있다. 또한, 클로닝된 DNA 단편을 프로브로 사용하여 특정한 DNA 단편을 검출할 수 있다. 이러한 방법의 민감성은 PCR과 병용하는 경우 크게 향상된다. 예를 들면, 이본쇄 PCR 생성물 또는 개질된 PCR 생성물에 의해 생성된 일본쇄 주형 분자와 함께 프라이머를 사용하여, 서열을 분석한다. 서열 결정은 방사능 표지된 뉴클레오타이드를 사용한 통상적인 방법 또는 형광성 태그를 사용하는 자동화 서열 분석법으로 수행한다.
특정 위치에서의 서열 변화는 RNase 및 S1 보호 같은 뉴클레아제 보호 분석법, 또는 화학적 절단법[예를 들어, Cotton et al., PNAS, 85:4397-4401 (1985)] 에 의해 밝혀질 수 있다.
생물학적 샘플중 TNFR 단백질 수준의 분석은 항체 이용 기술들을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 조직에서의 TNFR 단백질 발현은 전통적인 면역조직학 방법으로 연구할 수 있다[Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)]. TNFR 유전자 발현을 검출하기 위한 기타 항체 이용 방법들로는 효소-결합된 면역흡착 분석법(ELISA) 및 방사성면역분석법(RIA) 같은 면역분석법이 포함된다. 적합한 항체 분석 표지로는 당해 분야에 공지되어 있으며 글루코스 옥시다제와 같은 효소 표지, 및 요오드(125I,121I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중수소(3H), 인듐(112In), 및 테크네튬(99mTc)과 같은 방사성 동위원소, 및 플루오레세인 및 로다민 같은 형광성 표지, 및 바이오틴이 포함된다.
개체로부터 수득한 생물학적 샘플에서 TNFR 단백질 수준을 분석하는 것에 부가적으로, TNFR 단백질은 또한 영상화에 의해 생체내에서 검출될 수 있다. TNFR 단백질의 생체내 영상화를 위한 항체 표지 또는 마커로는 X-방사선 사진술, NMR 또는 ESR에 의해 검출할 수 있는 것들이 포함된다. 예를 들어, X-방사선 사진술에 있어서, 적합한 표지로는 바륨 또는 세슘 같은 방사선 동위원소 등이 있으며, 이들은 검출가능한 방사선을 방출하지만, 피험체에 명백히 유해하지는 않다. NMR 및 ESR을 위한 적합한 마커로는 중수소와 같은 검출가능한 특징적인 각운동량(spin)을 갖는 것 등이 있으며, 이는 관련 하이브리도마를 위한 영양소를 표지화함으로써 항체내에 도입될 수 있다.
방사선 동위원소[예를 들어,131I,112In,99mTc,(131I,125I,123I,121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중수소 (3H), 인듐 (115mIn,113mIn,112In,111In), 및 테크네튬 (99Tc,99mTc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga ,67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브덴 (99Mo), 크세논 (133Xe), 플르오르 (18F),153Sm,177Lu,159Gd,149pM,140La,175Yb,166Ho,90Y,47se,186Re,188Re,142Pr,105Rh,97Ru], 방사성-불투명 물질, 또는 핵 자기 공명으로 검출할 수 있는 물질 같은 적합한 검출가능한 영상화 잔기로 표지화된 TNFR-특이적인 항체 또는 항체 단편을 면역계 질환에 대해 시험하고자 하는 포유동물에 도입(예: 비경구, 피하내, 또는 복강내)한다. 피험체의 크기 및 사용되는 영상화 시스템이 진단성 영상을 형성하는데 필요한 영상화 잔기의 양을 결정할 것이라는 것은 당해 분야에서 이해될 것이다. 방사성 동위원소 잔기의 경우, 사람 피험체의 경우에, 주입되는 방사능의 양은 일반적으로99mTc 약 5 내지 20 밀리퀴리(mCμ)의 범위이다. 이후, 표지된 항체 또는 항체 단편은 뉴트로카인-알파 단백질을 함유하는 세포의 위치에서 우선적으로 축적될 것이다. 생체내 종양 영상화는 문헌[S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments"(Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)]에 기술되어 있다.
처리
종양 괴사 인자(TNF) 패밀리 리간드는 세포독성, 항-바이러스 활성, 면역조절 활성, 및 수 개의 유전자의 전사 조절을 포함하는, 다수의 세포 반응을 유도하는 가장 다면발현성인 사이토킨중에 속하는 것으로 공지되어 있다[Goeddel, D.V. et al., "Tumor Necrosis Factors: Gene Structure and Biological Activities," Symp. Quant. Biol. 51:597-609 (1986), Cold Spring Harbor; Beutler, B., and Cerami, A., Annu. Rev. Biochem. 57:505-518(1988); Old, L.J., Sci. Am. 258:59-75 (1988); Fiers, W., FEBS Lett. 285:199-224 (1991)]. TNF-패밀리 리간드는 TNFR-패밀리 수용체에 결합함으로써 상기와 같은 다양한 세포성 반응을 유도한다.
본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β의 결함 또는 불충한 양으로 인해 매개되는(적접적으로 또는 간접적으로) 임의의 질환의 치료법을 개발하는데 사용될 수 있다. TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드는 상기 질환을 앓고 있는 환자(예를 들어, 포유동물, 바람직하게는 사람)에 투여될 수 있다. 또한, 유전자 치료법이 상기 질환을 치료하는데 적용될 수 있다. 본원에 기술된 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 유전자의 결함을 검출하고 이를 정상적인 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 암호화 유전자로 대체할 수 있다. 유전자 결함은 시험관내 진단 분석에서, 본원에 기술된 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 뉴클레오타이드 서열을 당해 유전자중 결함을 갖는 것으로 의심되는 환자로부터 유래된 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 유전자의 서열과 비교하여 검출될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 상이한 세포 유형에서 Fas 리간드/TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 및/또는 AIM-II 상호작용을 억제함으로써 비롯되는 생리학적 효과를 연구하기 위한 연구 도구로서 사용된다. 또한 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β폴리펩타이드는 Fas 리간드, AIM-II 또는 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 또는 이의 상호작용을 검출하기 위한 시험관내 분석에 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 정제된 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β폴리펩타이드는 내인성 세포 표면 Fas 리간드 및/또는 AIM-II 수용체로의 Fas 리간드 및/또는 AIM-II의 결합을 억제하는데 사용된다. TNF 패밀리(Fas 리간드 및 AIM-II가 구성원이다)의 특정 리간드가 하나 이상의 명백한 세포 표면 수용체 단백질에 결합하는 것으로 보고되었다. 마찬가지로 AIM-II가 다중 세포 표면 단백질에 결합하는 것으로 여겨진다. Fas 리간드 및/또는 AIM-II를 결합시킴으로써 본 발명의 가용성 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드가 내인성 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 뿐만 아니라 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β와는 명백하게 구분되는 Fas 리간드 및 AIM-II 수용체 단백질로의 Fas 리간드 및/또는 AIM-II의 결합을 억제시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 양태에서, TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β는 시험관내 또는 생체내 과정에서 Fas 리간드 및/또는 AIM-II의 생물학적 활성을 억제시키는데 사용된다. 세포 표면 수용체로의 Fas 리간드 및/또는 AIM-II의 결합을 억제함으로써 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드는 내인성 수용체로 Fas 리간드 및/또는 AIM-II가 결합함에 의해 비롯되는 생물학적 효과를 억제한다. 예를 들어,상기 기술된 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 단편, 유도체, 및 Fas 리간드 및/또는 AIM-II와 결합할 수 있는 변형체를 포함하는 다양한 형태의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β가 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 가용성 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β폴리펩타이드를 투여하여 Fas 리간드 및/또는 AIM-II의 생물학적 활성, 예를 들어, 어팝토시스에 민감한 세포의 Fas 리간드-매개된 및/또는 AIM-II 매개된 어팝토시스를 억제한다.
추가의 양태에서, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β폴리펩타이드를 포유동물에 투여하여 Fas 리간드 매개된 및/또는 AIM-II 매개된 질환을 치료한다. 이러한 Fas 리간드 매개된 및/또는 AIM-II 매개된(예를 들어, 사람) 질환은 Fas 리간드 및/또는 AIM-II에 의해 유발되거나(직접 또는 간접적으로) 악화되는 증상을 포함한다.
TNFR 폴리펩타이드를 발현하고 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β리간드에 강한 세포성 반응을 갖는 세포는 임파구, 내피세포, 각질세포, 및 전립선 조직을 포함한다. "TNF-패밀리 리간드에 대한 세포성 반응"이란 TNF-패밀리 리간드에 의해 유도되는 세포, 세포주, 조직, 조직 배양 또는 환자에 유전형, 표현형 및/또는 형태학적 변화를 의미한다. 지적된 바와 같이, 상기 세포성 반응은 TNF-패밀리 리간드에 대해 정상적인 생리학적 반응 뿐만 아니라 어팝토시스가 증가되거나 어팝토시스가 억제된 것과 연관된 질환을 포함한다. 추가로, 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 TNFR 폴리펩타이드는 Fas 리간드 및 AIM-II와 결합하고 결과적으로 Fas 리간드 및 AIM-II 매개된 어팝토시스를 차단한다. 어팝토시스-프로그램된 세포 사멸은 면역 시스템중에 B 및/또는 T 임파구를 소실시키는데 관여하는 생리학적 기작이고 이의 탈조절은 많은 상이한 병리학적 과정을 유발할 수 있다[참조 문헌: J.C. Ameisen AIDS 8:1197-1213(1994); P.H. Krammer et al., Curr. Opin. Immunol. 6:279-289(1994)].
세포 생존력이 증가되거나 어팝토시스의 억제와 관련된 질환은 암(예를 들어, 결장암, 심장 종양, 췌장암, 흑색종, 망막아종, 교아종, 폐암, 대장암, 고환 암, 위암, 신경아세포종, 점액종, 근종, 임파종, 내피종, 골아세포종, 파골세포종, 골육종, 연골육종, 선종, 유방암, 전립선암, 카포시의 육종 및 난소암을 포함하지만 이에 제한되지 않는 호르몬-의존성 종양, 소포의 임파종, 및 p53 돌연변이를 갖는 육종); 자가면역 질환{예를 들어, 다발성 경화증, 소조렌의 증후군, 그레이브 질환, 하시모토의 갑상선염, 자가면역 당뇨병, 담즙 경변증, 베체의 질환, 크론 질환, 다발성 근염, 전신성 홍반성 루프스 및 면역 관련 사구체신염(예: 증식성 사구체신염), 자가면역 위염, 자가면역 혈소판감소성 자반증 및 류마티스 관절염}, 및 바이러스 감염(예를 들어, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스 및 아데노바이러스), 및 염증, 이식편-대-숙주 질환(급성 및/또는 만성), 급성 이식편 거부 및 만성 이식편 거부를 포함한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 및/또는 길항제는 암의 증식, 진행 및/또는 전이, 특히 상기 열거된 질환들을 억제하는데 사용된다.
세포 생존력이 증가된 것과 연관된 추가의 질환 또는 증상은 악성 종양의 진행 및/또는 전이, 및 관련 질환, 예를 들면 백혈병[급성 백혈병{예를 들어, 급성임파구 백혈병, 급성 골수구성 백혈병(골수모세포성 백혈병, 전골수세포성 백혈병, 골수단구성 백혈병, 단구성 백혈병 및 적백혈병을 포함)} 및 만성 백혈병{예, 만성 골수(과립구성) 백혈병 및 만성 임파구 백혈병}], 진성 적혈구 증가, 임파종(예: 흡킨스 질환 및 비흡킨스 질환) , 다발성 골수종, 발덴스트롬의 거대글로불린혈증, 중쇄 질환, 및 충실성 종양(육종 및 암종, 예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지질육종, 연골육종, 골육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 임파척삭종, 임파척삭내피육종, 활막종, 중피종, 어윈 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 상피세포암, 기저 세포암, 선암종, 땀샘암, 기름샘 암, 유두암, 유두선암, 낭선암종, 연수암, 기관지암, 망막 세포암, 간암, 담관암, 융모막암종, 정상피종, 태생암, 빌름 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐암종, 소 세포 폐암, 방광암, 상피암, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 메난지오마, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종을 포함하지만 이에 제한되지 않음)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
어팝토시스가 증가된 것과 연관된 질환은 AIDS; 신경퇴행성 질환(예를 들어, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 근위축성 외측 경화증, 망막색소변성, 소뇌변성 및 뇌종양 또는 이전 연관된 질환); 자가면역 질환(예를 들어, 다발성 경화증, 소조그렌 증후군, 그레이브 질환, 하시모토 갑상선염, 자가면역 당뇨병, 담즙 경변증, 베체 질환, 크론질환, 다발성근염, 전신성 홍반성 루프스, 면역-관련 사구체신염(예를 들어, 증식성 사구체신염), 자가면역 위염, 혈소판감소성 자반증 및 류마티스관절염), 골수이형성 증후군(예: 무형성 빈혈), 이식편-대-숙주 질환(급성 및/또는 만성), 허혈 손상(예를 들어, 허혈성 심장 손상 및 심근경색, 발작 및 재관류 손상에 의해 유발되는 것), 간 손상 또는 질환(예를 들어, 간염 관련 간 손상, 경변증, 허혈/재관류 손상, 콜레스테롤혈증(담즙관 손상) 및 간암); 독소 유발된 간 질환(예를 들어, 알콜에 의해 유발되는 것), 패혈성 쇼크, 궤양성 대장염, 악액질 및 식욕불량을 포함한다. 바람직한 양태에서, TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 효능제는 상기 열거된 질환 및 장애를 치료하거나 예방하기 위해 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 사구체신염을 치료하고/하거나 예방하는데 사용된다. 추가의 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 만성 사구체신염 및/또는 세포/조직 상해(예: 사구체 세포 사멸) 및/또는 이러한 질환과 연관된 의학 증상을 치료하고/하거나 예방하는데 사용된다. 추가의 포괄 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 증식성 사구체신염 및/또는 세포/조직 상해(예: 사구체 세포 사멸) 및/또는 이러한 질환과 연관된 의학 증상을 치료하고/하거나 예방하는데 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 담즙 경변증 및/또는 이러한 질환과 연관된 의학 증상을 치료하거나 예방하는데 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 예를 들어, 알콜성 간 질환 및/또는 이러한 질환과 연관된 의학 증상(예를 들어, 경변증)과 같은 질환을 치료하거나 예방하는데 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 이식편-대-숙주 질환을 치료하고/하거나 예방하는데 사용된다. 특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 조직 또는 세포 상해 또는 파괴(예를 들어, 이식편-대-숙주 질환과 연관된 펌프 세포 고갈) 및/또는 또 다른 이러한 질환과 연관된 의학 증상을 치료하거나(예를 들어 경감시킴) 예방하는데 사용된다. 또 다른 포괄 특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 이식편-대-숙주 질환중의 설사를 치료(예를 들어, 경감)하고/하거나 예방하는데 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 효능제 또는 길항제는 쇼그렌의 질환을 치료하고/하거나 예방하는데 사용되고/되거나 조직/세포 상해 또는 파괴(예를 들어, 침샘 조직 및/또는 누골 조직의 상해 또는 파괴) 및/또는 이러한 질환과 연관된 또 다른 의학 증상을 경감시키는데 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 다발성 경화증을 치료하고/하거나 예방하고/하거나 조직 상해 또는 파괴(예를 들어, 신경 조직(예를 들어, CNS 조직) 상해 또는 파괴) 및/또는 이러한 질환과 연관된 병변 또는 또 다른 의학 증상을 경감시키는데 사용된다.
특정 양태에서, 항체 및 항체 단편을 포함하는 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 알츠하이머 질환을 치료하고/하거나 예방하고/하거나 조직 상해 또는 파괴(신경 조직 또는 세포의 상해 또는 파괴) 및/또는 이러한 질환과 연관된 의학 증상을 경감시키는데 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 파킨슨 질환을 치료하고 예방하고/하거나 조직 상해 또는 파괴(예를 들어, 신경 조직 또는 세포, 예를 들어 신경 세포의 상해 또는 파괴) 및/또는 이러한 질환과 연관된 의학 증상을 경감시키는데 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 발작전, 발작중, 발작직후 및/또는 발작후에 세포 또는 조직(예를 들어, 신경 조직)의 상해 및/또는 이러한 발작과 연관된 의학 증상을 치료하고 예방하거나 경감시키는데 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 허혈 손상(예를 들어, 허혈 심장 손상) 및/또는 허혈 손상과 연관된 의학 증상을 치료하거나 예방하거나 경감시키는데 사용된다. 특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 심장 발작전, 심장 발작중, 심장 발작 직후 및/또는 심장 발작후에 허혈성 심장 손상을 치료하거나 예방하거나 경감시키는데 사용된다.
또 다른 특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 효능제는 골수이형성 증후군(MDS) 및/또는 MDS와 연관된 의학 증상을 치료하거나 예방하는데 사용된다.
또 다른 특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 또는 길항제는 혈소판감소증, 임파구감소증 및/또는 빈혈을 앓는 환자내에서 순환 혈액 세포수를 증가시키는데 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 하시모토의 갑상선염증을 치료하고/하거나 예방하고/하거나 조직 또는 세포(예를 들어, 갑상선)의 파괴 또는 상해를 경감시키고/시키거나 이러한 질환과 연관된 의학 증상을 치료하거나 예방하는데 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 자가면역 위염 및/또는 이러한 질환과 연관된 의학 증상을 치료(예를 들어, 경감)하고/하거나 예방하는데 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 궤양성 대장염 및/또는 세포/조직 상해(예를 들어, 결장내 궤양) 및/또는 이러한 질환과 연관된 의학 증상을 치료하고/하거나 예방하는데 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 효능제 또는 길항제는 류마티스 관절염 및/또는 이러한 질환과 연관된 의학 증상을 치료하고/하거나 예방하는데 사용된다.
추가로, 다수의 암은 Fas 양성 T 세포에 결합하여 이들을 사멸시키는 FasL을 분비한다. FasL을 발현하는 임의의 암은 본 발명의 TNFR 또는 TNFR 효능제로 치료하기 위한 표적이 될 수 있다. 이러한 암은 악성 골수종, 백혈병 및 임파종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
HIV-유도된 신병증 및 HIV 뇌염을 포함하는 HIV와 연관된 많은 병리학은 어팝토시스에 의해 매개된다. 따라서 추가의 바람직한 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 TNFR 효능제는 AIDS 및 AIDS와 연관된 병리학을 치료하거나 예방하는데 사용된다. 본 발명의 또 다른 양태는 HIV-감염 환자에서 Fas 리간드 및/또는 AIM-II 매개된 T 세포의 사멸을 경감시키기 위한 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β의 용도에 관한 것이다.
AIDS를 정의하는 면역결핍의 상태는 CD4+T-임파구의 수 및 기능이 감소하는 속발성이다. 최근 보고서는 CD4+T 세포의 하루 손실이 3.5 X 107내지 2 X 109세포일 것으로 추정하고 있다[참조 문헌: Wei X., et al., Nature 373:117-122(1995)]. HIV 감염 상태에서 CD4+T 세포가 고갈되는 한 가지 이유는 HIV-유도된 어팝토시스인 것으로 여겨진다[참조 문헌: Meyaard et al., Science 257:217-219,(1992); Groux et al., J Exp. Med., 175:331, (1992); and Oyaizu et al., in Cell Activation and Apoptosis in HIV infection, Andrieu and Lu, Eds., Plenum Press, New York, 1995, pp. 101-114]. 실질적으로, HIV-유도된 어팝토시스 세포 사멸은 시험관내에서 뿐만 아니라 보다 중요하게 감염된 환자에게서 입증되었다[참조 문헌: Ameisen, J.C., AIDS 8: 1197-1213(1994); Finkel, T.H., and Banda, N.K., Curr. Opin. Immunol. 6:605-615(1995); Muro-Cacho, C.A. et al., J. Immunol. 154:5555-5566(1995)]. 추가로, 어팝토시스 및 CD4+T-임파구 고갈은 상이한 동물 모델의 AIDS에서도 친밀하게 관련되어 있고[참조 문헌: Brunner, T., et al., Nature 373:441-444(1995); Gougeon, M.L., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:553-563(1993)] 어팝토시스는 바이러스 복제가 AIDS를 발병시키지 않는 동물 모델에서는 관찰되지 않는다[참조 문헌: M.L. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:553-563(1993)]. 추가의 데이터는 감염되지 않았지만 HIV-감염된 환자로부터의 항원자극되거나 활성화된 T 임파구는 Fas 리간드를 접하게 된후 어팝토시스를 일으킨다는 것을 지적한다. HIV 감염에 따라 사멸하게 되는 단핵구 세포주를 사용하여, U937 세포를 HIV로 감염시키면 Fas 리간드가 새롭게 발현하게 되고 Fas 리간드가 HIV-유도된 어팝토시스를 일으키는 것으로 입증되었다[참조 문헌: Badley, A.D. et al., J. Virol. 70:199-206(1996)]. 추가로, TNF-패밀리 리간드는 감염되지 않은 대식세포에서 검출될 수 있고 이의 발현은 HIV 감염 후 상향조절되어 비감염된 CD4 T-임파구를 선택적으로 사멸시킨다[참조 문헌: Badley, A.D et al., J. Virol. 70:199-206(1999)]. 추가로, 추가의 연구는 Fas-매개된 어팝토시스를 HIV 환자의 T 세포 손실과 연루시켰다[참조 문헌: Katsikis et al., J. Exp. Med. 181:2029-2036, 1995].
따라서, 본 발명은 본 발명의 TNFR 및/또는 TNFR 효능제를 투여하여 CD4 T-임파구의 선택적인 사멸을 경감시킴을 포함하는 HIV+환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 투여 방법 및 투여량은 하기에서 상세하게 논의된다.
또한 T 세포 어팝토시스는 다중 기작을 통해 일어날 수 있다. 추가로, HIV환자에게서 나타나는 T 세포 사멸의 일부 내지 전부는 AIM-II에 의해 매개될 수 있다. 이론에 얽매이지 않으면서, 이러한 Fas 리간드 및/또는 AIM-II-매개된 T 세포 사멸은 활성화 유도된 세포 사멸(AICD)로서 공지된 기작을 통해 일어나는 것으로 여겨진다.
활성화된 사람 T 세포는 CD3/T 세포 수용체 복합체를 통한 자극시의 프로그램화된 세포 사멸(어팝토시스), 즉 활성화된 유도 세포 사멸(AICD)이라고 명명된 과정을 겪도록 유도된다. HIV 감염된 무증상 환자로부터 분리된 CD4 T 세포의 AICD가 보고되었다[참조 문헌: Groux et al., supra). 따라서, AICD는 HIV 감염 환자에서 CD4+T 세포를 고갈시키고 AIDS로 진행하는데 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드를 환자에 투여함을 포함하는 HIV 환자에서 Fas 리간드-매개된 및/또는 AIM-II-매개된 T 어팝토시스를 억제하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 환자는 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 치료를 개시하는 경우 증상이 없다. 경우에 따라, 치료하기 전에, 말초 혈액 T 세포는 HIV 환자로부터 추출될 수 있고 통상적인 방법에 의해 Fas 리간드-매개된 및/또는 AIM-II 매개된 세포 사멸에 대한 민감성에 대해 시험한다. 한 양태에서, 환자의 혈액 또는 혈장을 생체외에서 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β와 접촉시킨다. TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β는 통상적인 방법에 의해 당해 기술분야에 공지된 적합한 크로마토그래피에 결합될 수 있다. 환자의 혈액 또는 혈장을, 환자에게 재투입하기 전에 매트릭스에 결합된 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드를 함유하는 크로마토그래피 칼럼을 통해 유동시킨다. 고정화된 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β는 Fas 리간드 및/또는 AIM-II와 결합하여 환자의 혈액으로부터 Fas 리간드 및/또는 AIM-II 단백질을 제거한다.
추가의 양태에서, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드는 T-세포 어팝토시스의 또 다른 억제제와 배합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, HIV 환자에게서 나타나는 T 세포 사멸의 일부 내지 전부는 TRAIL[참조 문헌: 본원에 참조 문헌으로서 인용된 국제출원공개번호 제WO 97/01633호]에 의해 매개되는 것으로 여겨진다. 따라서, 예를 들어, Fas 리간드 매개되고 TRAIL 매개된 T 세포 사멸 모두에 민감한 환자는 TRAIL/TRAIL-수용체 상호작용을 차단하는 제제와 Fas-리간드/Fas 상호작용을 차단하는 제제로 치료될 수 있다. TRAIL과 TRAIL 수용체의 결합을 차단하기 위해 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드와 투여될 수 있는 적합한 제제는 가용성 TRAIL 수용체 폴리펩타이드[예를 들어, OPG의 가용성 형태, DR4(국제출원공개번호 제WO 98/32586호); TR5(국제출원공개번호 제WO 98/30693호); DR5(국제출원공개번호 제WO 98/41629호); TR10(국제출원공개번호 제WO 98/54202호)]; 다량체 형태의 가용성 TRAIL 수용체 폴리펩타이드; 및 어팝토시스를 일으키는 생물학적 신호를 전달하지 않고 TRAIL 수용체와 결합하는 TRAIL 수용체, TRAIL이 하나 이상의 TRAIL 수용체와 결합하는 것을 차단하는 항-TRAIL 항체, 및 TRAIL 수용체와 결합하지만 어팝토시스를 일으키는 생물학적 신호를 전달하지 않는 TRAIL의 뮤테인을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 항체는 모노클로날 항체이다.
또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드와 함께 투여될 수 있는 Fas 리간드의 Fas로의 결합을 차단하는 적합한 제제는 가용성 Fas 폴리펩타이드; 다양체 형태의 가용성 Fas 폴리펩타이드(예를 들어, sFas/Fc의 이량체); 어팝토시스를 일으키는 생물학적 신호를 전달하지 않으면서 Fas와 결합하는 항-Fas 항체; Fas-리간드의 Fas로의 결합을 차단하는 항-Fas-리간드 항체; 및 Fas와 결합하지만 어팝토시스를 일으키는 생물학적 신호를 전달하지 않는 Fas-리간드의 뮤테인을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 차단하는 항-Fas 모노클로날 항체를 포함하는 Fas-L/Fas 상호작용을 차단하기 위한 적합한 제제의 예는 본원에 참조 문헌으로서 인용된 국제출원 공개번호 제WO 95/10540호에 기술되어 있다.
AIM-II의 AIM-II 수용체로의 결합을 차단하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드와 함께 투여될 수 있는 적합한 제제는 가용성 AIM-II 수용체 폴리펩타이드[예를 들어, 가용성 형태의 TR2(국제출원공개번호 제WO 96/34095호); LT 베타 수용체; 및 TR8(국제출원공개번호 제WO 96/34095호)]; 다량체 형태의 가용성 AIM-II 수용체 폴리펩타이드 및 어팝토시스를 일으키는 생물학적 신호의 전달없이 AIM-II 수용체와 결합하는 AIM-II 수용체 항체, AIM-II의 하나 이상의 AIM-II 수용체로의 결합을 차단하는 항-AIM-II 항체, 및 AIM-II 수용체와 결합하지만 어팝토시스를 일으키는 생물학적 신호를 전달하지 않는 AIM-II의 뮤테인을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 항체는 모노클로날 항체이다.
동족이식 거부반응에서, 대부분의 면역 시스템이 주변 항원에 의해서만 자극되어있기 때문에 수혜 동물의 면역 시스템은 이전에 반응하도록 항원 자극되지 않는다. 동일 종의 또 다른 구성원으로부터의 조직은 예를 들어, 바이러스와 세균이 제공되는 것과 동일한 방식으로 제공되지 않는다. 동종이식 거부반응의 경우에 면역 억제 방법은 면역 시스템이 작동 단계에 이르지 못하도록 계획된다. 그러나 이종이식 거부반응의 면역 프로필은 동종이식 거부반응 보다 더 질환을 재발할 수 있다. 질환 재발의 경우에, 면역 시스템은 고유 섬 세포의 파괴에 의해 입증되는 바와 같이 이미 활성화되어 있다. 따라서, 질환 재발의 경우에 면역 시스템은 이미 작동 단계에 있다. 본 발명의 길항제는, 작동 세포(effector cell)로 활성화되고 분화된 임파구는 TNFR 폴리펩타이드를 발현하고 이에 의해 TNFR 활성을 증진시키는 화합물에 민감하기 때문에, 동종이식 및 이종이식 모두에 대한 면역반응을 억제할 수 있다. 따라서, 추가로 본 발명은 면역 획득 조직을 생성시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 길항제는 추가로 염증성 보웰-질환의 치료에 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 및 효능제는 면역 반응을 억제하는데 사용될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 효능제는 이식과 연관된 불리한 효과를 최소화시키는데 사용된다. 특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 효능제는 Fas 매개된 면역 반응을 억제하는데 사용된다(예를 들어, 라파마이신 또는 사이클로스포린과 같은 면역억제제와 유사한 방식으로). 또 다른 특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 효능제는 AIM-II 매개된 면역 반응을 억제하는데 사용된다.
추가로, 이식 거부 및 이식편-대-숙주 질환 모두는 어팝토시스에 의해 부분적으로 자극된다. 따라서, 추가의 바람직한 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 TNFR 효능제는 이식 거부반응을 치료하고 예방하고/하거나 경감시키는데 사용된다. 추가의 바람직한 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 TNFR 효능제는 이식편-대-숙주 질환을 치료하고 예방하고/하거나 경감시키는데 사용된다.
추가로, TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 효능제는 이식 거부 반응[예를 들어, 이종이식 및 동종이식 거부 반응(예: 급성 동종이식 거부반응)] 및/또는 이러한 이식 거부반응과 연관된 의학 증상을 치료하거나 예방하는데 사용된다. 특정 양태에서, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 효능제는 급성 동종이식 거부반응 및 급성 동종이식 거부반응과 연관된 의학적 증상을 치료하거나 예방하는데 사용된다. 추가의 특정 양태에서, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 효능제는 신장의 동종이식 거부반응 및/또는 신장의 급성 동종이식 거부반응과 연관된 의학적 증상을 치료하거나 예방하는데 사용된다.
Fas 리간드는 Fas에 결합함에 의해 어팝토시스를 유도하는 II형 막 단백질이다. Fas 리간드는 활성화된 T 세포에서 발현되고 세포독성 임파구의 작동체로서 작용한다. Fas 및 Fas 리간드의 분자 분석 및 유전자 분석은 마우스 임파구 증식 돌연변이(lpr) 및 전신성 임파구 증식 질환(gld)이 각각 Fas 및 Fas 리간드의 돌연변이임을 지적한다. gld 마우스의 lpr은 림프선종을 발병시키고 자가면역 질환을앓게된다. 이들 표현형 및 또 다른 연구를 바탕으로, Fas 시스템이 T-세포 분화동안에 어팝토시스 과정, 특히 말초 클론의 결실 또는 성숙한 T 세포의 활성화 유도된 자살에 관여하는 것으로 여겨진다. 활성화된 임파구 뿐만 아니라 Fas는 간, 심장 및 폐에서 발현된다. 효능제성 항-Fas 항체를 마우스에 투여함으로써 간에서 어팝토시스를 유도하여 신속하게 마우스를 죽이고 간 상해를 일으킨다는 것을 보여준다. 이들 발견은 Fas 시스템이 임파구 분화의 생리학적 과정 뿐만 아니라 급격하게 진행되는 간염 및/또는 바이러스 감염 또는 독성제로부터 비롯된 감염과 같은 세포독성 T-임파구- 매개된 질환에 중요한 역할을 한다는 것을 지적한다. 본원에서 논의되는 바와 같이, TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β는 Fas 리간드에 결합함에 따라서 Fas-리간드 매개된 활성의 길항제로서 작용한다. 따라서, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이의 효능제가 임파구 증식성 질환(예를 들어, 림프선종 및 본원에 기술된 기타), 자가면역 질환(예를 들어, 자가면역 당뇨병, 전신성 홍반성 루프스, 그레이브 질환, 하시모토의 갑상선염, 면역 관련 사구체신염, 자가면역 위염, 자가면역 혈소판 감소성 자반증, 다발성 경화증, 류마티스 관절염 및 본원에 기술된 기타 질환) 및/또는 간 질환(예를 들어, 급성 간염 및 만성 간염 및 경변증)을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 효능제 또는 길항제는 간염 및/또는 조직/세포 상해 또는 파괴 및/또는 간염과 연관된 의학 증상을 치료하거나 예방하는데 사용된다. 특정 양태에서, 본 발명의TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 효능제 또는 길항제는 급격히 진행되는 간염 및/또는 급격히 진행되는 간염과 연관된 의학 증상을 치료하거나 예방하는데 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 효능제 또는 길항제는 전신성 홍반성 루프스(SLE) 및/또는 조직/세포 상해 또는 파괴 및/또는 SLE와 연관된 의학 증상을 치료하거나 예방하는데 사용된다. 추가의 특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 효능제 또는 길항제는 SLE 환자에서 피부 병변을 치료하거나 예방하는데 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 및/또는 길항제는 인슐린 의존성 당뇨병 및/또는 조직/세포 상해 또는 파괴 및/또는 인슐린 의존성 당뇨병과 연관된 의학 증상을 치료하거나 예방하는데 사용된다. 추가의 특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 효능제 또는 길항제는 당뇨병이 발병전, 발병중, 발병 직후에 섬 세포에 대한 상해를 경감시키거나 예방하고/하거나 외인성 인슐린 요구량을 경감시키는데 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 효능제 또는 길항제는 독성 표피 괴사(TEN) 및/또는 조직/세포 손상 또는 파괴, 및/또는 TEN과 연관된 의학 증상을 치료하거나 예방하는데 사용된다. 추가의 특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 효능제 또는 길항제는 리엘(Lyell) 증후군을 치료하거나 예방하는데 사용된다.
간염 바이러스(예를 들어, B형 간염 바이러스 및 C형 간염 바이러스)는 만성간 질환의 주요 원인 요소이다. 간염 감염에서, 간세포에서 Fas 발현이 간 염증의 중증에 따라 상향조절된다. 간염 바이러스 특이적 T 세포가 간세포로 이동하여 T 세포 수용체를 통해 바이러스 항원을 인식하는 경우 이들은 활성화되어 Fas 리간드를 발현하고 이것은 어팝토시스 신호를 Fas-함유 간세포에 전달할 수 있다. 따라서, Fas 시스템은 바이러스 간염에 의한 간 세포 손상에 중요한 역할을 한다. 따라서, 특정 양태에서, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 효능제 또는 길항제는 바이러스 감염(예를 들어, B형 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 의한 감염)으로부터 비롯된 간염을 치료하거나 예방하는데 사용된다. 하나의 양태에서, 환자의 혈액 또는 혈장을, 생체외에서 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드와 접촉시킨다. TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β는 통상적인 방법에 의해 적합한 크로마토그래피 매트릭스로 결합될 수 있다. 상기 양태에 따라, 환자의 혈액 또는 혈장을, 환자에게 재투입되기 전에 매트릭스에 결합된 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β를 함유하는 크로마토그래피 칼럼을 통해 유동시킨다. 고정화된 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β는 Fas 리간드와 결합함에 따라, Fas-리간드 단백질을 환자의 혈액으로부터 제거한다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 및/또는 효능제 또는 길항제는 신부전(예를 들어, 만성 신부전) 및/또는 조직/세포 상해 또는 파괴(예를 들어, 관상 상피 세포 결실) 및/또는 신부전과 연관된 의학 증상을 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 효능제 또는 길항제는 골 성장을 조절(자극하거나 억제함)하는데 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 및/또는 효능제 또는 길항제는 골 성장을 자극하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물을 사용하여 치료되거나 예방될 수 있는 특정 질환 또는 증상은 골절 및 결손, 및 골다공증, 골연화 및 노화에 따른 골 질량의 손실과 같은 골을 약화시키는 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드 또는 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 효능제 또는 길항제는 말초 동맥 질환(예: 사지 허혈)을 포함하는 심혈관 질환을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다.
심혈관 질환은 심혈관 이상증, 예를 들어, 동맥-동맥 피스툴라, 동정맥 피스툴라, 뇌 동정맥 기형, 선천성 심장 결함, 폐 폐쇄증 및 시미타르 증후군을 포함한다. 선천성 심장 결함은 대동맥 교착, 삼방심, 관상 혈관 이상증, 교차 심장, 우심증, 개방된 관 동맥관, 에브시타인 기형, 에이센멘거 후유증, 재생불량성 좌심장 증후군, 좌심증, 필로증후군, 대혈관전위증, 양대혈관 우심실기시증, 삼천관폐쇄증, 동맥간존속증, 및 심중격 결손증, 예를 들어, 대동맥 폐동맥 중격 결손증, 심내막 융기 결손증, 루템바허 증후군, 필로삼징, 심실성 심장 중격 결손증을 포함한다.
심혈관 질환은 또한 심장 질환, 예를 들어, 죽상경화증, 부정맥, 카르시노이드 심장 질환, 높은 심박출량, 낮은 심박출량, 심장압전, 심내막염(세균성 포함),심장 동맥류, 심박정지, 울혈성 심부전증(예를 들어, 만성 울혈성 심부전증), 울혈성 심근병증, 발작성 호흡곤란, 심인성 부종, 심장 비대증, 울혈성 심근병증, 좌심실 비대증, 우심실 비대증, 경색후 심장 파열, 심실 중격 파열, 심판막 질환, 심근 질환, 심근 허혈, 심낭 삼출액, 심막염(교착성 및 결핵성 포함), 심막기종, 심낭막절개술후 증후군, 폐 섬유증, 폐 심장질환, 류마티스 심장 질환, 심실 기능장애, 충혈, 심혈관 임신 합병증, 시미타르 증후군, 심혈관 매독 및 심혈관 결핵을 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 또는 효능제는 만성 울혈성 심부전증 및/또는 만성 울혈성 심부전증과 연관된 의학 증상을 치료하고/하거나 예방하는데 사용될 수 있다.
또 다른 특정 양태에서, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 폐 손상 또는 질환(예를 들어, 폐 섬유증 및 만성 폐쇄성 폐 질환, 예를 들어, 기종 및 만성 기관지염) 및/또는 조직/세포 상해 또는 파괴(예를 들어, 폐포 벽 및/또는 세기관지 벽 파괴) 및/또는 폐 손상 또는 질환과 연관된 의학 증상을 치료하고/하거나 예방하는데 사용될 수 있다.
부정맥은 동부정맥, 심방세동, 심방조동, 서맥, 기외수축, 아담스-발작 증후군, 측각차단, 동방 차단, 긴 QT 증후군, 수축동시성, 로운-가농-레빈 증후군, 마하임 유형 조기 흥분 증후군, 볼프-파킨슨-화이트 증후군, 동기능부전증증후군, 빈박 및 심실 세동을 포함한다. 빈박은 발작성 빈맥, 상실성 빈맥, 가속심실고유율동, 방실결절 재진입 빈맥, 전위성 심박 빈맥, 전위성 연결 빈맥, 동방 결절 재진입 빈맥, 동빈맥, 토르사데스 드 포인테스 및 심실성 빈맥을 포함한다.
심판막 질환은 대동맥 판막 부전증, 대동맥 판막 협착증, 이상음, 대동맥 판막 탈출증, 승모판탈출증, 삼첨판 탈출증, 승모판부전증, 승모판협착증, 폐동맥판폐쇄증, 폐판막 부전증, 폐판막 협착증, 삼첨판 폐쇄증, 삼첨판 판막 부전증 및 삼첨판 판막 협착증을 포함한다.
심근질환은 알콜성 심근병증, 울혈성 심근병증, 비대성 심근병증, 대동맥 판하부 협착증, 폐 판하부 협착증, 제한성 심근병증, 샤가스 심근병증, 심내막섬유탄성증, 심내막심근 섬유증, 케언스 증후군, 심근 재관류 손상 및 심근염증을 포함한다.
심근 허혈은 관상 질환, 예를 들어, 협심증, 관상 동맥류, 관상 동맥경화증, 관장 혈전증, 관상 혈관경련, 심근 경색 및 심근 기절을 포함한다.
심혈관 질환은 또한 혈관 질환, 예를 들어, 동맥류, 혈관이형성증, 혈관종증, 세균성 혈관종증, 하이펠-린다우 질환, 클리펠-트레나우나이-베버 증후군, 스투르게-베버 중후군, 혈관신경성 수종, 대동맥 질환, 다카야쓰의 동맥염증, 대동맥염증, 레리헤 증후군, 동맥 폐쇄 질환, 동맥염증, 구관절염, 결절성 다발성 동맥염, 뇌혈관성 질환, 당뇨 혈관병증, 당뇨 망막병증, 색전증, 혈전증, 홍통증, 치핵, 간 정맥 폐쇄 질환, 고혈압, 저혈압, 허혈, 말초 혈관 질환, 정맥염, 폐 정맥-폐쇄 질환, 레이노드 질환, CREST 증후군, 망막 정맥 폐쇄증, 스시미타르 증후군, 상대정맥 증후군, 모세혈관 확장증, 혈관확장성 운동실조증, 유전성 출혈 운동실조증, 정맥류, 정맥류성정맥, 정맥류성 궤양, 혈관염 및 정맥 부전증을 포함한다.
동맥류는 박리성 동맥류, 가동맥류, 감염된 동맥류, 파열된 동맥류, 대동맥 동맥류, 뇌 동맥류, 관상 동맥류, 심장 동맥류 및 장골 동맥류를 포함한다.
동맥 폐쇄 질환은 동맥경화증, 간헐성 파행, 경동맥 협착증, 근섬유 이형성증, 장간막 혈관 폐쇄증, 모야모야 질환, 신장 동맥 폐쇄증, 망막 동맥 폐쇄증 및 폐쇄성 혈전혈관염을 포함한다.
뇌혈관 질환은 경동맥 질환, 뇌 유전분 혈관병증, 뇌 동맥류, 뇌 무산소증, 뇌 동맥경화증, 뇌 동정맥 기형, 뇌 동맥 질환, 뇌 색전증 및 혈전증, 경동맥 혈전증, 동혈전증, 발렌버그 증후군, 뇌 출혈, 경막외 혈종, 격막하 혈종, 서브아락스노이드 출혈, 뇌 경색, 뇌 허혈(일과성 허혈을 포함), 쇄골하동맥 도류 증후군, 뇌실 백색연화증, 혈관 두통, 군집 두통, 편두통 및 척추고 뇌저동맥(기능)부전증을 포함한다.
색전증은 공기 색전증, 양수 색전증, 콜레스테롤 색전증, 청족지 증후군, 지방 색전증, 폐 색전증 및 혈전색전증을 포함한다. 혈전증은 관상 혈전증, 간 정맥 혈전증, 망막 정맥 폐쇄증, 경동맥 혈전증, 정맥동 혈전증, 발렌버그 증후군 및 혈전정맥염을 포함한다.
허혈은 뇌 경색, 허혈성 결장염, 구획 증후군, 전방 구획 증후군, 심근 허혈, 재관류 손상 및 말초 수족 허혈을 포함한다. 혈관염은 대동맥염, 동맥염, 베체트 증후군, 추르그-스트라우스 증후군, 점막피부 임파선 증후군, 폐쇄성 혈전혈관염, 과민성 혈관염, 쇼엔레인-헤노흐 자반증, 알레르기성 피부 혈관염 및 베게너 육아종을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 효능제 또는 길항제는 혈전정 미세혈관병증을 치료하거나 예방하는데 사용된다. 이러한 하나의 질환은 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP)을 치료하거나 예방하는데 사용된다[참조 문헌: Kwaan, H.C., Semin. Hematol. 24:71(1987); Thompson et al., Blood 80:1890(1992)]. TTP-관련 치사율이 증가한다는 것이 보고되었다[U.S. centers for Disease Control(Torok et al., Am. J. Hematol. 50:84(1995)]. TTP를 앓는 환자(HIV + 및 HIV - 환자 포함) 기원의 혈장은 피부 미세혈관 기원의 사람 내피 세포의 어팝토시스를 유도하지만 대형 혈관 기원의 사람 내피 세포의 어팝토시스를 유도하지 않는다[참조 문헌: Laurence et al., Blood 87:3245(1996)]. 따라서 TTP 환자의 혈장은 직접 또는 간접적으로 어팝토시스를 유도하는 하나 이상의 인자를 포함하는 것으로 여겨진다. 항-Fas 차단 항체는 미세혈관 내피 세포의 TTP 혈장 매개된 어팝토시스를 감소시킴을 보여준다[참조 문헌: Lawrence et al., Blood 87:3245(1996); 본원에 참조 문헌으로서 인용됨]. 따라서, TTP 환자의 혈청내에 존재하는 Fas 리간드는 미세혈관 내피 세포의 어팝토시스를 유도하는데 중요한 역할을 할 가능성이 있다. 또 다른 혈전성 미세혈관병증은 용혈성 요독 증후군(HUS)이다[참조 문헌: Moake, J.L., Lancet, 343:393,(1994); Melnyk et al., (Arch. Intern. Med., 155:2077, (1995); Thompson et al., supra]. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 흔히 성인 HUS(심지어 어린아이에게 발병할 수 있지만)라고 언급되는 증상을 치료하거나 예방하기 위한 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β의 용도에 관한 것이다. 유년기/설사-연관된 HUS로서공지된 질환은 성인 HUS와는 병인학에서 상이하다. 또 다른 양태에서, 소혈관의 응고로 특징되는 증상은 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β를 사용하여 치료될 수 있다. 이러한 증상은 본 원에 기술된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 소아 AIDS 환자의 약 5 내지 10%에서 나타나는 심장질환의 문제는 소혈관의 응고가 관여하는 것으로 여겨진다. 심장내 미세혈관이 다발성 경화증에서 파괴되는 것으로 보고되었다. 추가의 예로서, 전신성 홍반성 루프스의 치료가 고려된다. 한 양태에서, 환자의 혈액 또는 혈장은 생체외에서 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드와 접촉시킨다. TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β는 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 적합한 크로마토그래피 매트릭스에 결합될 수 있다. 이러한 양태에 따라, 환자의 혈액 또는 혈장을, 환자에게 재투입하기 전에 매트릭스에 결합된 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β를 함유하는 크로마토그래피 칼럼을 통해 유동시킨다. 고정화된 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β는 Fas 리간드 및/또는 AIM-II와 결합함에 따라서 환자의 혈액으로부터 Fas 리간드가 제거된다. 또한, TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β는 생체내에서 혈전성 미세혈관병증을 앓는 환자에게 투여될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 환자에게 투여된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β폴리펩타이드 유효량을 사용함을 포함하는 혈전성 미세혈관병증을 치료하는 방법을 제공한다. TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드는 생체내 또는 생체외에서 사용되어 미세혈관 내피 세포에 대한 Fas 리간드 매개되고/되거나 AIM-II 매개된 상해(예를 들어, 어팝토시스)를 억제할 수 있다.
본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 특정 질환을 치료하는데 유용한 또 다른 제제와 연계하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Laurence et al.(Blood 87:3245,1996)]에 보고된 시험관내 연구에서, 항-Fas 차단 항체, 아우린트리카복실산 또는 동결 침전물이 없는 정상 플라스마를 사용하여 미세혈관 내피 세포의 TTP-매개된 어팝토시스를 약간 감소시킬 수 있다. 따라서, 환자는 내피 세포의 Fas-리간드 매개된 어팝토시스를 억제하는 추가의 제제, 예를 들어, 상기된 제제와 배합하여 치료할 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드 및 항-FAS 차단 항체는 TTP 또는 HUS와 같은 혈전성 미세혈관병증에 의해 특징되는 질환을 앓는 환자에게 투여된다. Fas 항원(CD95)에 대해 지시된 차단 모노클로날 항체의 예는 본원에 참조 문헌으로서 인용된 국제출원번호 제WO95/10540호에 기술되어 있다.
혈관형성의 내인성 자극인자 및 억제인자간의 천연적으로 존재하는 균형은 대부분 억제되는 영향하에 있다[참조 문헌: Rastinejad et al., Cell 56:345-355(1989)]. 정상적인 생리학적 조건하에서 혈관신생이 일어나는 드문 경우, 예를 들어, 상처 치유, 기관 재생, 배 발육 및 암컷 번식 과정의 경우에 혈관형성이 엄격하게 조절되고 공간적으로 및 시간적으로 한정된다. 충실성 종양 성장을 특징으로하는 것과 같은 병리학적 혈관형성의 조건하에서 이들 조절 억제는 실패한다. 조절되지 않은 혈관형성은 병리학적 증세를 나타내게 되고, 많은 신생물성 및 비신생물성 질환으로 계속 진행하게 된다. 다수의 심각한 질환은 충실성 종양 성장 및 전이, 관절염, 몇몇 유형의 안질환, 및 건선을 포함하는 비정상적인 혈관신생이 대부분 차지하게 된다[참조 문헌: Moses et al., Biotech. 9:630-634(1991);Folkman et al., N. Engl. J. Med., 333:1757-1763(1995); Auerbach et al., J. Microbasc. Res. 29:401-411(1985); Folkman, Advances in Cancer Research, eds. Klein and Weinhouse, Academic Press, New York, pp. 175-203(1985); Patz, Am. J. Ophalmol. 94:715-743(1982); and Folkman et al., Science 221:719(1983)]. 다수의 병리학적 증상에서, 혈관형성의 과정은 질환상태에 기여한다. 예를 들어, 충실성 종양의 성장이 혈관형성에 의존한다는 것을 제안하는 중요한 데이터가 축적되었다[참조 문헌: Folkman and Klagsbrun, Science 235:442-447(1987)].
본 발명은 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드를 투여하여 혈관신생과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드로 치료될 수 있는 악성 증상 및 전이 증상은 악성 종양, 충실성 종양 및 본원에 기술되고 또한 당업계에 공지된 암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다[참조: Fishman et al., Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia(1985)].
본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드(TNFR 효능제 및/또는 길항제 포함)로 치료될 수 있는 혈관신생과 연관된 안질환은 혈관신생 녹내장, 당뇨 망막병증, 망막모세포종, 수정체후부섬유증식증, 포도막염, 미성숙 황반 변성의 망막병증, 각막 이식 신생혈관뿐 아니라, 및 또 다른 안 염증 질환, 안 종양, 및 맥락막혈관신생 또는 홍채 혈관신생과 연관된 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다[참조 문헌: Waltman et al., Am. J.Ophthal. 85:704-710(1978 and Gartner et al., Surv. Ophthal. 22:291-312(1978)].
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 효능제 또는 길항제는 광수용체 세포의 분화 및/또는 생존을 자극하고/하거나 광수용체 세포의 수 감소, 분화 및/또는 생존과 연관된 질환, 장애 또는 증상을 치료하거나 예방하는데 사용된다.
추가로, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드(TNFR 효능제 및/또는 길항제 포함)로 치료될 수 있는 추가의 질환은 혈관종, 관절염, 건선, 혈관섬유종, 죽상경화 플라크, 상처 치유 지연, 육아, 혈우병 관절, 상처 비대, 유착 불능 골절, 오슬러-베버 증후군, 화농성 녹내장, 경피증, 트라코마 및 혈관 유착을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
추가의 양태에서, 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 또 다른 조성물(항-TNFR-6α 및/또는 항-TNFR-6β 항체를 포함)은 알레르기 및/또는 염증과 연관된 질환 또는 증상을 치료하거나 예방하는데 사용된다.
특정 양태에서, TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 효능제 또는 길항제는 갑상선 연관된 안병증 및/또는 조직/세포 상해 또는 파괴 및/또는 갑상선 연관된 안병증과 관련된 의학 증상을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNFR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 효능제는 유전자 치료후 전이유전자 발현 세포의 제거를 억제하거나 감소시킴에 의해단백질 발현을 지연시키는데 사용된다.
추가의 양태에서, TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 효능제 또는 길항제는 상처 치유를 촉진시키는데 사용된다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 및/또는 효능제 및/또는 길항제는 광범위한 범위의 질환 및/또는 증상을 진단하고 치료하거나 예방하는데 유용하다. 이러한 질환 및 증상은 암(예를 들어, 면역 세포 관련 암, 유방암, 전립선암, 난소암, 난포 임파종, p53의 돌연변이 또는 변환과 연관된 암, 뇌 종양, 방광암, 자궁암, 결장암, 직장결장암, 폐의 비-소형 세포 암종, 폐의 소형세포 암종, 위암등), 임파구증식 질환(예를 들어, 임파구병증), 미생물(예를 들어, 바이러스, 세균등) 감염(예를 들어, HIV-1 감염, HIV-2 감염, 헤르페스바이러스 감염(HSV-1, HSV-2, CMV, VZV, HHV-6, HHV-7, EBV를 포함하지만 이에 제한되지 않음), 아데노바이러스 감염, 폭스바이러스 감염, 사람 파필로마 바이러스 감염, 간염 바이러스(예를 들어, HAV, HBV, HCV등), 헬리코박터 파일로리 감염, 침입성 스타필로코시아등), 기생충 감염, 신장염, 골질환(예를 들어, 골다공증), 죽상경화, 통증, 심혈관 질환(예를 들어, 혈관신생, 저혈관형성, 혈액순환 감소(예를 들어, 허혈성 질환(예를 들어, 심근 경색, 발작등)), AIDS, 알레르기, 염증, 신경퇴행성 질환(예를 들어, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 근위축성 측상 경화증, 색소성 망막염, 소뇌 퇴행), 이식 거부(급성 및 만성), 이식편-대-숙주 질환, 골수이형성증으로 인한 질환(예를 들어, 재생불량성 빈혈증등), 류마티스 관절염에서의 관절 조직 파괴, 간 질환(예를 들어, 급성 및 만성 간염, 간 손상 및 경변증), 자가면역 질환(예를 들어, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루프스, 면역 복합 사구체신염, 자가면역 당뇨병, 자가면역 혈소판감소성 자반증, 그레이브 질환, 하시모토 갑상선염등), 심근병증(확장형 심근병증), 당뇨병, 당뇨병 합병증(예를 들어, 당뇨병 신병증, 당뇨병 신경병증, 당뇨병 망막병증), 인플루엔자, 천식, 건선, 사구체신염, 패혈성 쇼크 및 궤양성 결장염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 및/또는 효능제 및/또는 길항제는 혈관형성을 촉진시키고 조혈 및 상처 치유(예를 들어, 상처, 화상 및 골절)을 조절하는데 유용하다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 및/또는 효능제 및/또는 길항제는 또한 특정 항원, 항-바이러스 면역 반응에 대한 면역학적 반응을 증진시키기 위한 보조제로서 유용하다.
보다 일반적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 및/또는 효능제 및/또는 길항제는 면역반응을 조절(즉, 상승 또는 감소)하는데 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드는 수술, 외상, 방사선 치료, 화학적 치료 및 이식으로부터 회복시키거나 이를 준비하는데 유용할 수 있거나, 노령이고 면역약화된 환자의 면역반응 및/또는 회복을 촉진시키기위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 및/또는 효능제 및/또는 길항제는 면역억제제로서, 예를 들어, 자가면역 질환의치료 또는 예방에 유용하다. 특정 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드는 본원에 기술된 바와 같은 질환 또는 당해 분야에 공지된 질환과 같은 만성 염증, 알레르기성 또는 자가면역 증상을 치료하거나 예방하는데 사용된다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 TNF-패밀리 리간드에 의해 유도되는 어팝토시스를 강화시키는 방법에 관한 것이며, 이는 TNFR 길항제(예: 항-TNFR 항체 또는 TNFR 폴리펩타이드 단편)을 환자(바람직하게는, 사람)에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, TNFR 길항제를 투여하여, 증가된 세포 생존을 보이는 질환 또는 상태를 치료한다. 본 발명의 길항제로는 TNFR의 가용성 형태, 및 TNFR 폴리펩타이드에 대해 유도되는 모노클로날 항체가 포함될 수 있다.
"길항제"란 어팝토시스를 증진시키거나 강화시킬 수 있는 천연 및 합성 화합물을 나타낸다. "효능제"란 어팝토시스를 억제시킬 수 있는 천연 및 합성 화합물을 나타낸다. 임의의 본 발명의 "효능제" 또는 "길항제"가 어팝토시스를 강화시키거나 억제할 수 있는가 하는 것은 하기에 보다 상세히 기술되는 것을 포함하여, 당해 기술 분야의 공지된 TNFR-패밀리 리간드/수용체 세포성 반응 분석법을 사용하여 결정할 수 있다.
상기한 스크리닝 방법중의 하나는 본 발명의 수용체를 발현시키기 위해서 형질감염시킨 멜라닌보유 세포을 사용하는 단계를 포함한다. 이러한 스크리닝 기술은 문헌[1992년 2월 6일에 공개된 PCT WO 92/01810에 기술되어 있다. 상기 분석법은 예를 들어, 수용체를 암호화하는 멜라닌보유 세포를 TNF-패밀리 리간드 및 후보길항제(또는 효능제) 둘 모두와 함께 접촉시킴으로써 본 발명의 수용체 폴리펩타이드의 활성화를 억제(또는 강화)하는 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 리간드에 의해 발생되는 신호의 억제 또는 강화는 상기 화합물이 리간드/수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 효능제임을 나타낸다.
기타 스크리닝 기술은, 예를 들면 문헌[Science 246:181-296, October 1989]에 기술된 바와 같이, 수용체 활성화에 의해 야기되는 세포외 pH 변화를 측정하는 시스템 내에서 수용체를 발현하는 세포(예를 들어, 형질감염된 CHO 세포)를 사용한다. 예를 들면, 화합물을 본 발명의 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 세포와 접촉시키고, 제2 메신저 반응, 예를 들어, 신호 전달 또는 pH 변화를 측정하여, 잠재적 화합물이 수용체를 활성화시키거나 억제하는지를 결정할 수 있다.
또 다른 스크리닝 기술은 수용체를 암호화하는 RNA를 제노푸스(Xenopus) 난모 세포에 도입하여 일시적으로 수용체를 발현시키는 단계를 포함한다. 이후, 수용체 난모 세포를 수용체 리간드 및 스크리닝하고자 하는 화합물과 접촉시킨 후, 수용체 활성을 억제하리라 생각되는 화합물을 스크리닝하는 경우, 칼슘 신호의 억제 또는 활성화를 검출할 수 있다.
또 다른 스크리닝 기술은 수용체를 포스포리파제 C 또는 D에 결합시킨 작제물을 세포에서 발현시키는 단계를 포함한다. 이러한 세포로는 내피 세포, 평활근 세포, 신장 배 세포 등이 포함된다. 스크리닝은 포스포리파제 신호로부터 수용체의 활성화, 또는 수용체의 활성화 억제를 검출함으로써 상기 기술된 바와 같이 달성될 수 있다.
또 다른 방법은, 표면에 수용체를 갖는 세포에 표지된 리간드가 결합하는 것을 억제하는지를 측정함으로써 본 발명의 수용체 폴리펩타이드의 활성화를 억제하는 화합물을 스크리닝하는 단계를 포함한다. 상기 방법은, 세포가 이의 표면에 수용체를 발현하도록, 수용체를 암호화하는 DNA로 진핵 세포를 형질감염시키고, 당해 세포를 공지된 리간드의 표지된 형태의 존재하에 화합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 리간드를 예를 들어, 방사능으로 표지할 수 있다. 수용체에 결합된 표지된 리간드의 양을, 예를 들면 수용체의 방사능을 측정하여 결정한다. 수용체에 결합하는 표지된 리간드의 감소에 의해 측정되는 바와 같이, 화합물이 수용체에 결합하는 경우, 수용체에 대한 표지된 리간드의 결합은 억제된다.
본 발명의 효능제 및 길항제에 대한 추가의 스크리닝 분석법은 문헌[Tartaglia, L.A., and Goeddel, D.V., J. Biol. Chem. 267(7):4304-4307 (1992)]에 기술되어 있다.
따라서, 추가의 양태에서, 스크리닝 방법은 후보 효능제 또는 길항제가 TNF-패밀리 리간드에 대한 세포성 반응을 강화시키거나 억제시킬 수 있는지를 결정하기 위해서 제공된다. 상기 방법은 TNFR 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 후보 화합물 및 TNF-패밀리 리간드와 접촉시키고, 세포성 반응을 분석한 후, 세포성 반응을 표준 세포성 반응과 비교하는 단계를 포함하고, 이 때의 표준 세포성 반응은 후보 화합물의 부재하에 리간드와 접촉시켜 분석되며, 이러한 방법에서, 표준에 비해 세포성 반응이 증가하는 것은 후보 화합물이 리간드/수용체 신호전달 경로의 효능제임을 나타내며, 표준에 비해 세포성 반응이 감소되는 것은 후보 화합물이 리간드/수용체 신호전달 경로의 길항제임을 나타낸다. "세포성 반응을 분석하는 것"이란 후보 화합물 및/또는 TNF-패밀리 리간드에 대한 세포성 반응을 정성적으로 또는 정량적으로 측정하는 것(예를 들어, T 세포 증식 또는 삼중수소화된 티미딘 표지화에서 증가 또는 감소를 측정하거나 평가하는 것)을 의미한다. 본 발명에 의해, TNFR 폴리펩타이드를 발현하는 세포는 내인성 또는 외인성으로 투여되는 TNF-패밀리 리간드와 접촉될 수 있다.
본 발명에 따른 효능제는 예를 들어, TNF-패밀리 리간드 펩타이드 단편, 형질전환성 성장 인자, 신경전달물질(글루타메이트, 도파민, N-메틸-D-아스파르테이 트), 종양 억제인자(p53), 세포용해성 T 세포 및 항-대사산물과 같은 천연 및 합성 화합물을 포함한다. 바람직한 효능제로는, 예를 들면 시스플라틴, 독소루비신, 블레오마이신, 시토신 아라비노사이드, 질소 머스타드, 메톡트렉세이트 및 빈크리스틴과 같은 화학요법 약제가 포함된다. 기타의 것으로는 에탄올 및 -아밀로이드 펩타이드가 포함된다[Science 267:1457-1458 (1995)]. 추가로 바람직한 효능제로는 TNFR 폴리펩타이드에 대해 유도된 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 또는 이의 단편이 포함된다. TNF-패밀리 수용체에 대해 유도된 이러한 효능제 항체는 문헌[Tartaglia, L.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9292-9296 (1991); and Tartaglia, L.A., and Goeddel, D.V., J. Biol. Chem. 267(7):4304-4307 (1992)]]에 기술되어 있다. 또한, 문헌[PCT 출원공보 WO 제94/09137호]을 참조한다.
본 발명에 따른 길항제로는, 예를 들면 CD40 리간드, 중성 아미노산, 아연,에스트로겐, 안드로겐, 바이러스성 유전자(아데노바이러스 ElB, 배쿨로바이러스 p35 및 IAP, 우두 바이러스 crmA, 엡스타인-바르 바이러스 BHRF1, LMP-1, 아프리카 돼지 열병 바이러스 LMW5-HL, 및 포진 바이러스 yl 34.5), 칼페인 억제제, 시스테인 프로테아제 억제제, 및 종양 프로모터(예: PMA, 페노바비탈, 및 -헥사클로로사이클로헥산)과 같은 천연 및 합성 화합물이 포함된다. 기타 길항제로는 TNFR 폴리펩타이드 및 이의 단편에 대해 유도된 폴리클로날 및 모노클로날 항체 및 이의 단편이 포함된다. TNF-패밀리 수용체에 대해 유도된 상기와 같은 길항제 항체는 문헌[Tartaglia, L.A., and Goeddel, D.V., J. Biol. Chem. 267(7):4304-4307 (1992) and Tartaglia, L.A. et al., Cell 73:213-216 (1993)]에 기술되어 있다. 또한, 문헌[PCT 출원공보 WO 제94/09137호]을 참조한다.
특정 태양에서, 본 발명에 따른 길항제는 TNFR중에 함유된 서열에 상응하는 핵산, 또는 이의 상보적인 쇄, 및/또는 기탁된 클론(ATCC 기탁번호 제97810호 및 제97809호)중에 함유된 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 핵산이다. 한가지 양태에서, 안티센스 서열은 유기체에 의해 내부적으로 생성되며, 또 다른 양태에서 안티센스 서열은 별도로 투여된다[참조 문헌: O'Connor, J., Neurochem. 56:560 (1991) and Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitor of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1998)]. 안티센스 기술은 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해, 또는 삼중-나선 형성을 통해 유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 안티센스 기술은, 예를 들면 문헌[Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press,Boca Raton, FL (1988)]에 기술되어 있다. 삼중-나선 형성은, 예를 들면 문헌[Lee et al., Nucleic Acids Research 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); and Dervan et al., Science 251:1360 (1991)]에 기술되어 있다. 상기 방법들은 상보성 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오타이드의 결합을 기본적으로 이용하고 있다.
예를 들면, 본 발명의 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 5' 암호화 부분을 사용하여 길이가 약 10 내지 40 염기쌍인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드를 설계할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오타이드를 전사와 관련된 유전자의 영역에 상보적이도록 설계하여, 수용체의 전사 및 생성을 방지한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드는 생체내에서 mRNA와 하이브리드를 형성하여, mRNA 분자가 수용체 폴리펩타이드로 해독되는 것을 차단한다.
한 양태에서, 본 발명의 TNFR 안티센스 핵산은 외인성 서열로부터 전사에 의해 세포내에서 생산된다. 예를 들어, 벡터 또는 이의 일부가 전사되어 본 발명의 안티센스 핵산(RNA)가 생산된다. 이러한 벡터는 TNFR 안티센스 핵산을 암호화하는 서열을 포함한다. 이러한 벡터는 전사되어 목적하는 안티센스 RNA가 생산되는 한 에피좀 형태로 유지되거나 염색체에 통합될 수 있다. 이러한 벡터는 선행 기술 분야의 재조합 DNA 기술 표준 방법에 의해 작제될 수 있다. 벡터는 당해 분야에 공지된 척추 동물 세포에서 복제하고 발현하는데 사용되는 플라스미드, 바이러스 등 일 수 있다. TNFR 또는 이의 단편을 암호화하는 서열의 발현은 척추 세포, 바람직하게는 사람 세포에 작용하는 것으로 당해 분야에 공지된 프로모터에 의해 수행될수 있다. 이러한 프로모터는 유도성이거나 구성적일 수 있다. 이러한 프로모터는 SV40 어얼리(early) 프로모터 영역(참조 문헌: Bernoist and Chambon, Nature 29:304-310(1981), 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복체에 함유된 프로모터[참조 문헌: Yamamoto et al., Cell 22:787-797(1980)], 헤르페스 티미딘 프로모터[참조 문헌: Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445 (1981)], 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열[참조 문헌: Brinster, et al., Nature 296:39-42(1982)]등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 안티센스 핵산은 TNFR 유전자의 RNA 전사체의 일부 내지 전부와 상보적인 서열을 포함한다. 그러나, 바람직하다 하더라도 절대적인 상보성은 요구하지는 않는다. 본원에 언급된 "RNA의 일부 내지 전부와 상보적인" 서열은 RNA와 하이브리드를 형성하여 안정한 이중나선 DNA를 형성할 수 있을 정도의 충분한 상보성을 갖는 서열을 의미하고, 이본쇄 TNFR 안티센스 핵산의 경우에, 이중나선 DNA의 일본쇄가 시험될 수 있거나 삼중나선 형성이 분석될 수 있다. 하이브리드 형성 능력은 상보성 정도 및 안티센스 핵산의 길이 모두에 의존한다. 일반적으로, 하이브리드화 핵산이 클 수록 보다 많은 염기가 TNFR RNA와 부정합되고, 여전히 안정한 이중나선(삼중나선도 마찬가지임)을 형성한다. 당해 분야의 기술자는 표준 방법을 사용하여 하이브리드화된 복합체의 융점을 결정하여 허용되는 부정합 정도를 확인할 수 있다.
전령 RNA의 5' 말단, 예를 들어, 5'비해독된 서열과 상보적이고 AUG 개시 코돈을 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 해독을 억제하는데 가장 효과적으로 작용한다. 그러나, mRNA의 3'비해독되도록된 서열과 상보적인 서열은 또한 mRNA의 해독을 억제하는데 효과적인 것으로 나타났다[참조 문헌: Wagner, P., Nature 372:333-335(1994)]. 따라서, 도 1 및 도 2에 나타낸 TNFR의 5' 또는 3' 비 해독된, 비 암호화된 영역중 하나와 상보적인 올리고뉴클레오타이드는 내인성 TNFR mRNA의 해독을 억제하기 위한 안티센스 방법에 사용될 수 있다. mRNA의 5' 비해독된 영역과 상보적인 올리고뉴클레오타이드는 AUG 개시 코돈의 상보적인 코돈을 포함한다. mRNA 암호화 영역과 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 해독에 대해 덜 효과적인 억제제이지만 본 발명에 따라 사용될 수 있다. TNFR mRNA의 5'-, 3'- 또는 암호화 영역과 하이브리드를 형성하도록 고안되었든지 간에 안티센스 핵산은 길이가 6개 이상인 뉴클레오타이드이어야만 하고 바람직하게 올리고뉴클레오타이드 길이는 6 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 범위에 있다. 특정 측면에서, 올리고뉴클레오타이드는 10개 이상의 뉴클레오타이드, 17개 이상의 뉴클레오타이드, 25개 이상의 뉴클레오타이드 또는 50개 이상의 뉴클레오타이드이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 또는 키메릭 혼합물 또는 유도체 또는 변형된 이의 형태, 일본쇄 또는 이본쇄 일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어, 분자의 안정성, 하이브리드화 등을 개선시키기 위해 염기 잔기, 당 잔기, 인산 골격에서 변형될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 펩타이드(예를 들어, 생체내 숙주 세포 수용체를 표적하기 위한 것) 또는 세포 막을 통과하는 수송을 용이하게 하는 제제[참조 문헌: Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556(1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652(1987)]; 1988년 12월 15일에 공개된 PCT 공보 WO88/09810] 또는 혈액-뇌 차단제[참조 문헌: 1988년 4월 25일 공개된 PCT 공보 WO89/10134], 하이브리드화 유도 절단제[참조 문헌: Krol et al., BioTechniques 6:958-976(1988)] 또는 재재제[참조 문헌: Zon, Pharm. Res. 5:539-549(1988)]와 같은 기타 부속 그룹을 포함할 수 있다. 이를 위해, 올리고뉴클레오타이드는 또 다른 분자, 예를 들어, 펩타이드, 하이브리드화 유도 가교제, 수송제, 하이브리드화 유도 절단제에 결합될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오드우라실, 5-하이포산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카복시하이드록실메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 위부톡소신, 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실, (acp3)w 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하지만 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 변형된 염기 잔기를 포함할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 또한 아라비노스, 2-플루오로아라비노스,크실룰로스 및 헥소스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 변형된 당 잔기를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 안티센스 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미도티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포르디아미데이트, 메틸포스포네이트, 알킬 포스포트리에스테르 및 포르마세탈 또는 이의 동족체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 변형된 인산 골격을 포함한다.
또 다른 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 α-아노머성 올리고뉴클레오타이드이다. α-아노머성 올리뉴클레오타이드는 통상적인 β-유니트와 상반되게 본쇄가 서로 병행하는 상보적인 RNA와 특이적인 이본쇄 하이브리드를 형성한다[참조 문헌: Gauitier et al., Nucl. Acids Res. 15:6625-6641(1987)]. 올리고뉴클레오타이드는 2ψ-0-메틸리보뉴클레오타이드[참조 문헌: Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15:6131-6148(1987)] 또는 키메릭 RNA-DNA 동족체[참조 문헌: Inoue et al., FEBS Lett. 215:327-330(1987)]이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 당해 공지된 표준 방법, 예를 들어, 자동화 DNA 합성기[제조원(Biosearch, Applied Biosystems, etc등)으로 부터 시판됨]를 사용하여 합성될 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드는 문헌[참조: Nucl. Acids Res. 16:3209(1988)]의 방법에 의해 합성될 수 있고 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드는 제어된 공극 유리 중합체 지지체를 사용하여 제조될 수 있다[참조 문헌: Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85:7448-7451(1988)]. TNFR 암호 영역 서열에 상보적인 안티센스 뉴클레오타이드가 사용될 수 있지만 전사된 비해독 영역에 상보적인 서열이 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 강력한 길항제는 또한 촉매 RNA 또는 리보자임[참조 문헌: 1990년 10월 4일 공개된 국제출원 공보 WO 90/1364; Sarver et al, Science 247:1222-1225(1990)]을 포함한다. 부위 특이적 인지 서열에서 mRNA를 절단하는 리보자임이 TNFR mRNA를 파괴하는데 사용될 수 있지만 해머헤드 리보자임을 사용하는 것이 바람직하다. 해머헤드 리보자임은 표적 mRNA와 상보적인 염기쌍을 형성하는 플랭킹 영역에 의해 지시된 위치에서 mRNA를 절단한다. 유일하게 요구되는 것은 표적 mRNA가 2개의 염기 서열(5'-UG-3')을 갖는다는 것이다. 해머헤드 리보자임의 작제 및 생산은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 문헌[참조: Haseloff and Gerlach, Nature 334-585-591(1988)]에 보다 완전하게 기술되어 있다. TNFR-6α(도 1, 서열 1) 및 TNFR-6β(도 2, 서열 3)의 뉴클레오타이드 서열내에 수많은 강력한 해머헤드 리보자임 절단 부위가 있다. 바람직하게, 리보자임은 절단 인식 부위가 TNFR mRNA의 5' 말단 근처에 위치하도록 즉, 비-기능적 mRNA 전사체의 효율을 증가시키고 이의 세포내 축적이 감소되도록 가공된다.
안티센스 연구방법에서와 같이, 본 발명의 리보자임은 변형된 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 개선된 안정성, 표적화 등)로 구성될 수 있고 생체내에서 TNFR을 발현하는 세포로 전달되어야만 한다. 리보자임을 암호화하는 DNA 작제물은 안티센스 암호화 DNA를 도입하기 위한 상기 기술된 바와 같은 동일한 방법으로 세포에 도입될 수 있다. 바람직한 전달 방법은 강한 구성적 프로모터, 예를 들어,pol III 또는 pol II 프로모터의 통제하에 리보자임을 암호화하는 DNA 작제물을 사용하여 형질감염된 세포가 충분한 양의 리보자임을 생산하여 내인성 TNFR 전령 RNA를 파괴하여 해독을 억제시킴을 포함한다. 안티센스 분자와는 달리 리보자임은 촉매이기 때문에 효율성을 위해 세포내 농도가 보다 저하되어야만 한다.
내인성 유전자 발현은 또한 표적화된 상동성 재조합을 사용하여 TNFR 유전자 및/또는 프로모터를 불활성화시키거나 녹아웃(knock-out)시킴으로써 감소될 수 있다[참조 문헌: Smithies et al., Nature 317:230-234(1985); Thomas & Capecchi, Cell 51:503-512(1987); Thompson et al., Cell 5:313-321(1989); 이러한 문헌은 본원에 전문이 참조로서 인용된다]. 예를 들어, 내인성 폴리뉴클레오타이드 서열(유전자의 암호 영역 또는 조절 영역중 하나)과 상동성인 DNA에 의해 플랭킹된 본 발명의 돌연변이체, 비-기능성 폴리뉴클레오타이드(완전히 관련이 없는 DNA 서열)가 선별 마커의 존재 또는 부재 및/또는 네가티브 선별 마커의 존재 또는 부재하에 생체내에서 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 당해 분야에 공지된 기술은 해당 유전자를 함유하지만 이를 발현하지는 않는 녹아웃을 생성시키는데 사용된다. 표적화된 상동성 재조합을 통한 DNA 작제물의 삽입은 표적화된 유전자를 불활성화시킨다. 이러한 방법은 특히, 배아 간 세포에 대한 변형이 불활성 표적화된 유전자를 갖는 동물 후손을 생성하는데 사용될 수 있는 연구 분야 및 농업 분야에서 적합하다[참조 문헌: Thomas & Capecchi 1987 and Thomson 1989, supra]. 그러나 이러한 방법은 통상적으로 재조합 DNA 작제물이 당해 분야의 기술자에게 명백한 적당한 바이러스 벡터를사용하여 생체내 요구 부위로 직접 투여되거나 삽입되는 경우 사람에게 사용되기에 적합할 수 있다. 본 문단에 인용된 문헌 각각의 내용은 이의 전문이 본원에 참조 문헌으로서 인용된다.
본 발명에 따른 항체는 본 발명의 TNFR 면역원을 사용하여 다양한 표준 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 TNFR 면역원은 도 1 및 도 2(각각 서열 2 및 서열 4)(이것은 리더 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다)에 나타낸 TNFR 단백질 및 TNFR의 리간드 결합 및/또는 세포외 도메인을 포함하는 TNFR의 폴리펩타이드 단편을 포함한다.
본 발명에 따른 폴리클로날 및 모노클로날 항체 효능제 또는 길항제는 본원에 기술되고/되거나 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 문헌[참조: Tartaglia and Goeddel, J. Biol. Chem. 267(7):4304-4307(1992); Tartaglia et al., Cell 73:213-216(1993), and International application publication number WO 94/09137(이들 3개의 출원 내용은 전반적으로 본원에 참조 문헌으로서 인용된다)]에 기술된 방법에 따라 제조될 수 있고 바람직하게 서열 2 및/또는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩타이드에 특이적이다. 본 발명에 따른 항체는 본원에 기술되고 당해 분야에 공지된 다양한 방법중 하나에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 다른 추가의 길항제는 TNFR의 가용성 형태, 예를 들어, 완전한 길이의 수용체의 세포외 영역으로부터 리간드 결합 도메인을 포함하는 TNFR 단편을 포함한다. 천연적으로 존재하거나 합성될 수 있는 수용체의 가용성 형태는 TNF-패밀리 리간드에 결합하는 것에 대해 세포 표면의 TNFR과 경쟁하여 TNFR 매개된 신호에 길항작용하고/하거나, 예를 들어, TNFR이 다량체화되고/되거나 Fas 리간드 및 AIM-II와 같은 리간드를 포함하는 리간드에 결합함으로써 어팝토시스를 중화시키는 능력을 붕괴시킴에 의해 TNFR 매개된 어팝토시스의 억제에 대해 길항작용한다. 따라서, 리간드 결합 도메인을 포함하는 수용체의 가용성 형태는 TNF-패밀리 리간드에 의해 유도된 종양 괴사의 TNF-매개된 억제를 감소시킬 수 있는 신규 사이토킨이다. 또 다른 이러한 사이토킨은 당해 분야에 공지되어 있고 Fas 리간드에 의해 유도된 어팝토시스를 생리학적으로 억제시키는 작용을 하는 FasB(마우스 Fas 수용체의 가용성 형태)를 포함한다[참조 문헌: Hughes, D.P. and Crispe., J. Exp. Med. 182:1395-1401(1995)].
세포외 도메인과 결합하는 단백질 및 다른 화합물은 또한 본 발명에 따른 효능제 및 길항제로서 유망하다. 이러한 결합 화합물은 효모 2-하이브리드 시스템을 사용하여 "포획"될 수 있다[참조 문헌: Fields and Song, Nature 340:245-246(1989)]. 효모 2-하이브리드 시스템의 변형된 형은 문헌[참조: Roger Brent and his colleagues(Gyuris, J. et al., Cell 75:791-803(1993); Zervos, A.S. et al., Cell 72:223-232(1993)]에 기술되어 있다.
"TNF-패밀리 리간드"는 다수의 TNF 수용체 패밀리의 구성원과 결합할 수 있고 리간드/수용체 신호전달 경로를 유도할 수 있는 천연적으로 존재하는 재조합 및 합성 리간드이다. TNF 리간드 패밀리의 구성원은 TNFR-6α & -6β 리간드, TNF-α, 임파독소-α(LT-α, 또한 TNF-β로서 공지됨), LT-β, FasL, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, OX40, TRAIL, AIM-II 및 신경 성장 인자(NGF)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
제형 및 투여
TNFR 폴리펩타이드 조성물은 개개 환자의 임상적 증상(특히, 단독의 TNFR-6α 또는 -6β 폴리펩타이드를 사용한 처리의 부작용), TNFR 폴리펩타이드 조성물의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄 및 개업 의사에게 공지된 또 다른 요소를 고려하는 우수한 의학 관행과 부합되는 양상으로 제형화되고 투여된다. 본 원에서 목적하는 TNFR 폴리펩타이드의 "유효량"은 상기와 같은 고려 사항에 의해 결정된다.
일반적인 경향으로서, 투여당 비경구적으로 투여되는 총 TNFR 폴리펩타이드의 약제학적 유효량은 상기 주지된 바와 같이 치료 지침에 좌우되는 것이지만 환자 체중을 기준으로 약 1㎍/kg/일 내지 10mg/kg/일의 범위에 있다. 보다 바람직하게, 이러한 투여량은 0.01mg/kg/일 이상이고, 사람을 위해 가장 바람직한 것은 호르몬에 대해 약 0.01 내지 1mg/kg/일이다. 연속적으로 투여되는 경우, TNFR 폴리펩타이드는 전형적으로 하루 1 내지 4회, 또는 예를 들어 소형 펌프를 사용한 피하내 연속 주입중 하나에 의해 약 1㎍/kg/시간 내지 약 50㎍/kg/시간의 투여 속도로 투여된다. 정맥내 백(bag) 용액이 또한 사용될 수 있다. 변화를 관찰하는데 요구되는 처리 소요 시간 및 반응이 치료 후 반응이 나타날 시간 간격은 목적하는 효과에 매우 의존적인 것으로 나타났다.
투여될 본 발명의 조성물의 유효량은 생물학적 반감기, 생체이용율 및 독성과 같은 계수를 고려하는 당해 분야의 기술자에게 널리 공지된 과정을 통해 결정될수 있다. 당해 분야의 기술자의 능력 범위내, 특히 본원에 제공된 상세한 기술을 통해 우수하게 결정된다.
또한, 치료 동안에 유기체를 TNFR-6α 또는 -6β 폴리펩타이드에 생체내노출시키는 것은 치료학적 및/또는 약제학적으로 효과적인 투여 방법을 결정하는데 중요한 역할을 한다. 비교적 장기간 동안 TNFR-6α 또는 -6β 폴리펩타이드의 비교적 낮은 투여량을 반복적으로 투여하는 것과 같은 다양한 투여가 비교적 단시간 동안 TNFR-6α 또는 -6β 폴리펩타이드의 반복 투여로 성취된 것과 치료학적 및/또는 약제학적으로 구별될 수 있는 효과를 가질 수 있다.
문헌[참조: Freireich, E, J., et al(Cancer Chemotherapy Reports 50(4):219-44(1966)]에 의해 제공된 동등한 표면적 투여량 환산 인자를 사용하여 당해 분야의 기술자는 주어진 실험 시스템에서의 TNFR-6α 또는 -6β 폴리펩타이드의 사용으로부터 수득된 데이터를 또 다른 실험 시스템에서 투여당 투여될 TNFR-6α 또는 -6β 폴리펩타이드의 약제학적 유효량에 대한 정확한 추정치로 간편하게 환산할 수 있다. 마우스에서 TNFR6-Fc의 투여를 통해 수득된 실험 데이터(예를 들어 실시예 21 참조)는 프레이레이흐 등에 의해 제공되는 환산 인자를 통해 랫트, 멍키, 개 및 사람에게 있어서의 TNFR-6의 약제학적 유효량의 정확한 추정치로 환산될 수 있다. 하기의 환산 표(표 IV)는 프레이레이흐 등에 의해 제공된 데이터를 요약한 것이다. 표 IV는 한 종으로부터 mg/kg으로 표현된 투여량을 표로 나타낸 또 다른 종에서 mg/kg으로서 표현되는 동등한 표면적 투여량으로 환산하기 위한 근사치 인자를 제공한다.
동등한 표면적 투여량 환산 인자
기원 마우스(20g) 랫트(150g) 멍키(3.5kg) 개(8kg) 사람(60kg)
마우스 1 1/2 1/4 1/6 1/12
랫트 2 1 1/2 1/4 1/7
멍키 4 2 1 3/5 1/3
개 6 4 5/3 1 1/2
사람 12 7 3 2 1
따라서, 예를 들어, 표 IV에 제공된 환산 인자를 사용하여 마우스에서의 50mg/kg의 투여량은 (50mg/kg) x (1/4)가 12.45mg/kg이기 때문에, 멍키에서 12.5mg/kg의 적당 투여량으로 환산된다. 추가의 예로서, 마우스에서의 0.02, 0.08, 0.8, 2 및 8mg/kg의 투여량은 사람에 있어서 각각 1.667㎍/kg, 6.67㎍/kg, 66.7㎍/kg, 166.7㎍/kg 및 0.667㎍/kg의 유효 투여량과 동일하다.
본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드는, 투여 부위에의 직접적 바늘 주사, 정맥내 주사, 국소 투여, 카테터 주입, 바이올리스틱 주입기, 입자 가속기, 겔폼 스폰지 데포우, 또 다른 시판되는 데포우 재료, 삼투압 펌프, 경구성 또는 좌제성 약제학적 고형 제제, 수술중의 디캔팅 또는 국소 적용, 에어로졸 분무를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 이러한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리펩타이드는 하기에 보다 상세하게 기술되는 약제학적 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 본 발명의 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 보다 상세하게 본원에 기술된다.
본 발명의 TNFR를 함유하는 약제학적 조성물은 경구, 직장, 비경구, 시스텀내(intracistemally), 질내, 복막내, 국소(산제, 연고제, 점적제 또는 경피 패치), 구강, 또는 경구 또는 경비 분무로 투여될 수 있다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 비-독성 고체, 반고체 또는 액체 충진제, 희석제, 캅셀화 물질 또는 임의의 유형의 제형 보조제를 의미한다. 경우에 따라 조성물은 또한 소량의 습윤제, 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용제, 현탁제, 유제, 정제, 환제, 캅셀제, 산제, 서방성 제제등의 형태를 취할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 형태를 언급한다.
TNFR 폴리펩타이드는 또한 적합하게 서방성 시스템에 의해 투여된다. 서방성 조성물의 적합한 예는 적합한 중합체 물질(예를 들어, 성형된 제품 형태로 반-투과성 중합체 매트릭스, 예를 들어 필름 또는 미세캅셀), 적합한 소수성 물질(예를 들어, 허용될 수 있는 오일중의 유제) 또는 이온 교환 수지, 및 난용성 유도체(예를 들어, 난용성 염)를 포함한다.
서방성 매트릭스는 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호, EP 58,481), L-글루타민산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체[참조 문헌: Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556(1983)], 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)[참조 문헌: R. Langer et al., J. Biomed. Moter. Res. 15:167-277(1981) and R. Langer, Chem. Tech. 12:98-105(1982)], 에틸렌 비닐 아세테이트(참조 문헌: R. Langer etal., Id) 또는 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산(EP 133,988)를 포함한다.
또한 서방성 조성물은 리포좀으로 포획된 본 발명의 조성물[참조 문헌: Langer, Science 249:1527-1533(1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infecious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler(eds.), Liss, New York, pp. 317-327 and 353-365(1989)]을 포함한다. TNFR 폴리펩타이드를 포함하는 리포좀은 공지된 방법 그 자체로 제조될 수 있다[참조 문헌: DE 3, 218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034(1980);EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호 및 제5,544,544호 및 EP 102,324]. 통상적으로 리포좀은 소형(약 200 내지 800 Å) 단일 층판의 형태이고, 리포좀내의 지질 함량은 약 30몰% 초과의 콜레스테롤로서, 선택된 비율은 TNFR 폴리펩타이드의 최적의 치료를 위해 조정된다.
또 다른 추가의 양태에서, 본 발명의 조성물은 펌프에 의해 전달된다[참조 문헌: Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201(1987); Buchwald et al., Surgery 88:507(1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574(1989)].
또 다른 조절 방출 시스템은 문헌[Langer, Science 249:1527-1533(1990)]에서 논의된다.
비경구 투여를 위한 한 양태에서, TNFR 폴리펩타이드는 일반적으로 목적하는 정도의 순도에서 단일 투여 주사용 형태(용제, 현탁제 또는 유제)로 이를 약제학적으로 허용되는 담체, 즉, 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고 제제의 또 다른 성분과 양립할 수 있는 담체와 혼합함으로써 제형화된다. 예를 들어, 제제는 바람직하게 산화제 및 폴리펩타이드에 해로운 것으로 공지된 기타 화합물을 포함하지 않는다.
일반적으로, 제제는 TNFR 폴리펩타이드를 균일하고 세밀하게 액체 담체 또는 세분된 고형 담체 또는 이 모두와 접촉시킴으로써 제조된다. 이어서, 경우에 따라, 생성물은 목적하는 제형으로 성형된다. 바람직하게, 담체는 비경구 담체이고 보다 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장성인 용액이다. 이러한 담체 비히클의 예로는 물, 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액이 포함된다. 비휘발성 오일 및 에틸 아세테이트와 같은 비-수성 비히클 뿐만 아니라 리포좀도 또한 본원에서 유용하다.
담체는 적합하게 소량의 첨가제, 예를 들어, 등장성 및 화학적 안정성을 증진시키는 물질을 함유한다. 이러한 물질은 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 포스페이트, 시트레이트, 숙시네에트, 아세트산 및 또 다른 유기산 또는 이의 염과 같은 완충제; 아스코르브산과 같은 산화 방지제; 저분자량(약 10개 잔기 미만)의 폴리펩타이드, 예를 들어, 폴리아르기닌 또는 트리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글라이신, 글루타민산, 아스파르트산, 또는 아르기닌과 같은 아미노산; 셀룰로스 또는 이의 유도체, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은당 알콜; 나트륨과 같은 대이온; 및/또는 폴리소르베이트, 폴록사머 또는 PEG와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
TNFR 폴리펩타이드는 전형적으로 약 0.1mg/ml 내지 100mg/ml, 바람직하게는 1 내지 10mg/ml의 농도로 약 pH 3 내지 8에서 상기 비히클중에 제형화된다. 이전의 특정 부형제, 담체 또는 안정화제를 사용함으로써 TNFR 폴리펩타이드 염이 형성되는 것으로 이해될 것이다.
치료학적 투여를 위해 사용될 TNFR 폴리펩타이드는 멸균되어야만 한다. 멸균은 멸균 여과 막(예를 들어, 0.2 마이크론 막)을 통해 여과함으로써 용이하게 달성된다. 치료학적 TNFR 폴리펩타이드 조성물은 일반적으로 멸균 가능한 포트(port), 예를 들어, 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알을 갖는 용기에 넣는다.
통상적으로 TNFR 폴리펩타이드는 단일 또는 다중 투여 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰풀 또는 바이알에 수용액 또는 재구성을 위한 동결건조된 제제로서 저장된다. 동결건조된 제제의 예로서, 10ml 바이알에 멸균 여과된 TNFR 폴리펩타이드 수용액 1%(w/v) 5ml을 채우고, 수득한 혼합물을 동결건조시킨다. 정균된 주입용수를 사용하여 동결건조된 TNFR 폴리펩타이드를 재구성하여 주입 용액을 제조한다.
본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 상기 용기와 연관되어 약제학적 제품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형태의 통지서가 있을 수 있고 이러한 통지서는 사람 투여용으로의 제조, 사용 또는 판매를 기관이 승인하였다는 것을 반영한다. 추가로, 본 발명의 폴리펩타이드는 또 다른 치료학적 화합물과 연계하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로 투여되어나, 화학치료제, 기회 감염 억제제, 항바이러스제, 항생제, 스테로이드성 및 비스테로이드성 소염제, 면역억제제, 통상적인 면역학적 치료제 및 사이토킨을 포함하지만 이에 제한되지 않는 또 다른 치료제와 배합하여 투여될 수 있다. 배합물은 동시에, 예를 들어 혼합물로서, 별도이지만 동시에 또는 공동으로 투여될 수 있거나 연속적으로 투여될 수 있다. 이것은 배합제를 치료학적 혼합물로서 함께 투여한다는 제안과 또한 배합제가 별도이지만 동시에, 예를 들어, 별도의 정맥내 선을 통해 동일한 개체에게 투여되는 방법을 포함한다. "배합된" 투여는 추가로 첫번째 주어진 화합물 또는 제제에 이어서 2번째 주어진 것을 별도로 투여함을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 조성물은 TNF 패밀리의 또 다른 구성원과 배합하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 투여될 수 있는 TNF, TNF-관련 또는 TNF 형 분자는 TNF-알파, 임파독소-알파(LT-알파, 또한 TNF-베타로서 공지됨), LT-베타(복합 이종삼량체 LT-알파 2-베타에서 발견됨), OPGL, CD27L, CD30L, CD40L, 41BBL, DcR3, OX40L, TNF-감마(국제출원 공개공보 WO 97/33899), AIM-II(국제출원 공개공보 WO 97/34911), APRIL(참조 문헌: J. Exp. Med. 188(6):1185-1190)), 엔도킨-알파(국제출원 공개공보 WO 98/07880), OPG 및 뉴트로킨-알파(국제출원 공개공보 WO 98/18921), TWEAK, OX40, 및 신경 성장 인자(NGF), Fas의 가용성 형태, CD30, CD27, CD40 및 4-IBB, TR2(국제출원 공개공보 WO 96/34095), DR3(국제출원 공개공보 WO 97/33904), DR4(국제출원 공개공보 WO 98/32856), TR5(국제출원 공개공보 WO 98/30693), TR7(국제출원 공개공보 WO 98/41629), TRANK, TR9(국제출원 공개공보 WO 98/56892), TR10(국제출원 공개공보 WO 98/54202), 312C2(국제출원 공개공보 WO 98/06842) 및 TR12를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물과 배합하여 투여될 수 있는 통상적인 비특이적 면역억제제로는 스테로이드, 사이클로스포린, 사이클로스포린 동족체, 사이클로포스프아미드 메틸프레드니손, 프레드니손, 아자티오프린, FK-506, 15-데옥시스퍼구알린 및 반응성 T 세포의 기능을 억제하는 작용을 하는 다른 면역 억제제가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
특정 양태에서, 본 발명의 조성물은 면역 억제제와 배합하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 면역 억제제로는 ORTHOCLONETM(OKT3), SANDIMMUNETM/NEORALTM/SANGDYATM(사이클로스포린), PROGRAFTM(타크롤리무스), CELLCEPTTM(마이코페놀레이트), 아자티오프린, 글루코르티코스테로이드 및 RAPAMUNETM(시롤리무스)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 면역 억제제는 기관 또는 골수 이식 거부를 예방하는데 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 조성물은 레트로바이러스 억제제, 뉴클레오사이드 역전사 효소 억제제, 비-뉴클레오사이드 역전사 효소 억제제 및/또는 프로테아제 억제제와 배합하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 배합되어 투여될 수 있는 뉴클레오사이드 역전사 효소 억제제로는 RETROVIRTM(지도부딘/AZT), VIDEXTM(디다노신/ddI), HIVIDTM(잘시타빈/ddC), ZERITTM(스타부딘/d4T), EPIVIRTM(라미부딘/3TC) 및 COMBIVIRTM(지도부틴/라미부딘)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물과 배합하여 투여될 수 있는 비-뉴클레오사이드 역전사 효소 억제제로는 VIRAMUNETM(네비라핀), RESCRIPTORTM(델라비르딘) 및 SUSTIVATM(에파비렌즈)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 레트로바이러스 억제제, 뉴클레오사이드 역전사 효소 억제제, 비-뉴클레오사이드 역전사 효소 억제제 및/또는 프로테아제 억제제를 본 발명의 조성물과 배합하여 AIDS를 치료하고/하거나 HIV 감염을 예방하거나 치료하는데 사용할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 기회 감염 억제제와 배합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물과 배합하여 투여될 수 있는 기회 감염 억제제로는 TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM, DAPSONETM, PENTAMIDINETM, ATOVAQUONETM, ISONIAZIDTM, RIFAMPINTM, PYRAZINAMIDETM, ETHAMBUTOLTM, RIFABUTINTM, CLARITHROMYCINTM, AZITHROMYCINTM, GANCICLOVIRTM, FOSCARNETTM, CIDOFOVIRTM, FLUCONAZOLETM, ITRACONAZOLETM, KETOCONAZOLETM, ACYCLOVIRTM, FAMCICOLVIRTM, PYRIMETHAMINETM, LEUCOVORINTM, NEUPOGENTM(필그라스팀/G-CSF) 및 LEUKINETM(사르그라모스팀/GM-CSF)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 본 발명의 조성물은 임의로, TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM, DAPSONETM, PENTAMIDINETM및/또는 ATOVAQUONETM과 배합하여 프네우모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii) 폐렴 기회 감염을 예방학적으로 치료하거나 예방하는데 사용된다. 또 다른 특정 양태에서, 본 발명의 조성물은 임의로 ISONIAZIDTM, RIFAMPINTM, PYRAZINAMIDETM, 및/또는 ETHAMBUTOLTM과 배합하여 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium) 복합 기회 감염을 예방학적으로 치료하거나 예방하는데 사용된다. 또 다른 특정 양태에서, 본 발명의 조성물은 임의로 RIFABUTINTM, CLARITHROMYCINTM및/또는 AZITHROMYCINTM과 배합하여 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 기회 감염을 예방학적으로 치료하거나 예방하는데 사용된다. 또 다른 특정 양태에서, 본 발명의 조성물은 임의로 GANCICLOVIRTM, FOSCARNETTM및/또는 CIDOFOVIRTM과 배합하여 사이토메갈바이러스 기회 감염을 예방학적으로 치료하거나 예방하는데 사용된다. 또 다른 특정 양태에서, 본 발명의 조성물은 FLUCONAZOLETM, ITRACONAZOLETM및/또는 KETOCONAZOLETM과 배합하여 진균 기회 감염을 예방학적으로 치료하거나 예방하는데 사용된다. 또 다른 특정 양태에서, 본 발명의 조성물은 임의로 ACYCLOVIRTM및/또는 FAMCICOLVIRTM와 배합하여 단순 포진 바이러스 I형 및/또는 II형 기회 감염을 예방학적으로 치료하거나 예방하는데 사용된다. 또 다른 특정 양태에서, 본 발명의 조성물은 임의로 PYRIMETHAMINETM및/또는 LEUCOVORINTM과 배합하여 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii) 기회 감염을 예방학적으로 치료하거나 예방하는데 사용된다. 또 다른 특정 양태에서, 본 발명의 조성물은 임의로 LEUCOVORINTM및/또는 NEUPOGENTM과 배합하여 세균 기회 감염을 예방학적으로 치료하거나 예방하는데 사용된다.
추가의 양태에서, 본 발명의 조성물은 바이러스 억제제와 배합하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 배합하여 투여될 수 있는 바이러스 억제제로는 어사이클로비르, 리바비린, 아만타딘 및 레만티딘이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
추가의 양태에서, 본 발명의 조성물은 항생제와 배합하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 항생제로는 아목실린, 아미노글리코사이드, 베타-락탐(글리코펩타이드), 베타-락타마제, 클린다마이신, 클로람페니콜, 세팔로스포린, 시프로플록사신, 시프로플록사신, 에리트로마이신, 플루오로퀴놀론, 마크롤리드, 메트로니다졸, 페니실린, 퀴놀론, 리팜핀, 스트렙토마이신, 설폰아미드, 테트라사이클린, 트리메토프림, 트리메토프림-설파메톡사졸 및 반코마이신이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
추가의 양태에서, 본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 소염제와 배합하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 소염제로는 글루코코르티코이드 및 비스테로이드성 소염제, 아미노아릴카복실산 유도체, 아릴아세트산 유도체, 아릴부티르산 유도체, 아릴카복실산, 아릴프로피온산 유도체, 피라졸, 피라졸론, 살리사이클산 유도체, 티아진카복스아미드, e-아세트아미도카프론산, S-아데노실메티오닌, 3-아미노-4-하이드록시부티르산, 아믹세트린, 벤다자크, 벤지다민, 부콜롬, 디펜피라미드, 디타졸, 에모르파존, 구아이아줄렌, 나부메톤, 니메설리드, 오르고테인, 옥사세프롤, 파라닐린, 페리속살, 피폭심, 프로쿠아존, 프록사졸 및 테니답이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 화학치료제와 배합하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 화학치료제로는 항생제 유도체(예를 들어, 독소루비신, 블레오마이신, 다우노루비신 및 다크티노마이신); 항에스트로겐(예를 들어, 타목시펜); 항대사물질(예를 들어, 플루오로우라실, 5-FU, 메토트렉세이트, 플록스우리딘, 인터페론 알파-2b, 글루탐산, 플리카마이신, 머캅토퓨린 및 6-티오구아닌); 세포독성 제제(예를 들어, 카르무스틴, BCNU, 로무스틴, CCNU, 사이토신 아라비노사이드, 사이클로포스프아미드, 에스트라무스틴, 하이드록시우레아, 프로카르바진, 마이토마이신, 부설판, 시스-플라틴 및 빈크리스틴 설페이트); 호르몬(예를 들어, 메드록시프로게스테론, 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨, 에티닐 에스트라디올, 에스트라디올, 메게스테롤 아세테이트, 메틸테스토스테론, 디에틸스틸베스트롤 디포스페이트, 클로로트리아니센 및 테스토락톤); 질소 머스타드 유도체(예를 들어, 메팔렌, 클로람부실, 메클로레타민(질소 머스타드) 및 티오테파); 스테로이드 및 배합물(예를 들어, 베타메타손 나트륨 포스페이트); 및 기타(예를 들어, 디카르바진, 아스파라기나제, 미토테인, 빈크리스틴 설페이트, 빈블라스틴 설페이트 및 에토폭사이드)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
특정 양태에서, 본 발명의 조성물은 CHOP(사이클로포스프아미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손)과 배합하거나 임의로 CHOP의 성분과 배합하여 투여된다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 리투시마브와 배합하여 투여된다. 추가의 양태에서, 본 발명의 조성물은 리툭스마브와 CHOP, 또는 리툭스마브와 CHOP 성분의 임의의 배합물과 함께 투여된다.
추가의 양태에서, 본 발명의 조성물은 사이토킨과 배합하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 사이토킨으로는 GM-CSF, G-CSF, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13, IL15, 항-CD40, CD40L, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, TNF-알파 및 TNF-베타가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 IL-알파, IL-베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20 및 IL-21을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 인터루킨과 함께 투여될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물은 TNF-알파와 배합하여 투여된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물은 IFN-알파와 배합하여 투여된다.
추가의 양태에서, 본 발명의 조성물은 맥관형성 단백질과 배합하여 투여된다. 본 발명의 화합물과 함께 투여될 수 있는 맥관형성 단백질로는 유럽 특허 제399816호에 기술된 바와 같은 신경교종 유래된 성장 인자(GDGF); 유럽 특허 제682110호에 기술된 바와 같은 혈소판 유래된 성장 인자-A(PDGF-A); 유럽 특허제282317호에 기술된 바와 같은 혈소판 유래 성장 인자-B(PDGF-B); 국제출원 공개공보 WO 92/06194에 기술된 바와 같은 태반 성장 인자(PIGF); 문헌[참조: Hauser et al., Gorwth Factors, 4:259-268(1993)]에 기술된 바와 같은 태반 성장 인자-2(PIGF-2); 국제출원 공개번호 WO 90/13649에 기술된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자(VEGF); 유럽 특허 제506477호에 기술된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자-A(VEGF-A); 국제출원 공개공보 WO 96/39515에 기술된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자-2(VEGF-2); 국제출원 공개공보 WO 96/26736에 기술된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자 B-186(VEGF-B186); 국제출원 공개공보 WO 98/02543에 기술된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자-D(VEGF-D); 국제출원 공개공보 WO 98/07832에 기술된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자-D(VEGF-D) 및 독일 특허 제19639601호에 기술된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자-E(VEGF-E)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 상기 언급된 문헌은 본원에 참조 문헌으로서 인용된다.
추가의 양태에서, 본 발명의 조성물은 섬유아세포 성장 인자와 배합하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 섬유아세포 성장 인자로는 FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14 및 FGF-15이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
추가의 양태에서, 본 발명의 조성물은 예를 들어, 방사선 치료와 같은 또 다른 치료학적 또는 예방학적 방법과 병행하여 투여된다.
염색체 분석법
본 발명의 핵산 분자는 또한 염색체 동정에 유용하다. 서열은 개개의 사람 염색체 상의 특정 위치에 특이적으로 표적화되거나 하이브리드화될 수 있다. 게다가, 최근에, 염색체 상의 특정 부위를 동정하고자 하는 필요성이 제기되고 있다. 현재 염색체 위치를 표시하기 위한 실질적인 서열 데이터(반복 다형성)를 기초로 한 염색체 표시 시약은 거의 이용될 수 없다. 본 발명에 따른 염색체에 대한 DNA 맵핑은 질환과 관련된 유전자와 이들 서열을 상호연계시키데 있어서 첫 번째 중요한 단계이다.
이와 관련하여 바람직한 특정 양태에서, 본원에 기술된 cDNA는 TNFR 단백질 유전자의 게놈성 DNA를 클로닝하는데 사용된다. 이는 통상적으로 시판되고 있는 널리 공지된 다양한 기술 및 라이브러리를 사용하여 달성할 수 있다. 이후, 게놈성 DNA는, 상기 목적을 위해 널리 공지된 기술을 사용하여, 원 위치(in situ) 염색체 맵핑하는데 사용된다.
또한, 일부 경우, 서열을 cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게는, 15 내지 25bp)를 작제하여, 염색체에 맵핑할 수 있다. 상기 유전자의 3' 비해독 영역의 컴퓨터 분석을 사용하여, 게놈성 DNA에서 엑손 하나 보다 더 길지 않은 프라이머들을 신속히 선택하며, 따라서 증폭 방법이 복잡해진다. 이후, 이들 프라이머들을 개개의 사람 염색체를 포함하는 체세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 사용한다. 유사분열 중기의 염색체 분산체에 대한 cDNA 클론의 형광 원 위치 하이브리드화("FISH")를 사용하여 한번의 단계로 정확한 염색체 위치를 제공할 수 있다. 이러한 기술은 50 내지 60bp 정도의 짧은 cDNA로부터의 프로브와 함께 사용될 수 있다. 이러한 기술을 검토하기 위해, 문헌[Verma et al., Human Chromosomes: A manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)]을 참조한다.
일단 서열이 정확한 염색체 위치에 맵핑되면, 염색체 상의 서열의 물리적 위치는 유전자 맵핑 데이터와 상호 관련이 있을 수 있다. 이러한 데이터는, 예를 들면 존스 홉킨스 대학교, 웰치 메디칼 라이브러리를 통해 온-라인으로 구할수 있는 문헌[V. McKusick, Mendelian Inheritance In Man]에서 발견된다. 이 후에, 동일한 염색체 영역에 맵핑되어진 유전자와 질환 사이의 관계는 연관 분석(물리적으로 인접한 유전자들의 공유전성)을 통해 확인된다.
다음, 병에 걸린 개체 및 병에 걸리지 않은 개체 사이의 cDNA 또는 게놈성 서열에서 차이점을 결정할 필요가 있다. 돌연변이가 병에 걸린 개체의 일부 또는 전부로부터 관찰되지만 정상적인 개체에서는 관찰되지 않는 경우, 당해 돌연변이가 상기 질환의 원인일 수 있다.
본 발명을 전반적으로 기술하면서, 상기 내용은 다음의 실시예들을 참고로 보다 용이하게 이해될 것이며, 실시예는 예증을 위한 수단으로 제공되며 이에 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
이. 콜라이에서 TNFR-6α 및 TNFR-6β의 발현 및 정제
세균 발현 벡터 pQE60을 본 실시예에서 세균 발현을 위해 사용한다(제조원: 퀴아젠, 인코포레이티드사, 캘리포니아주 91311, 차트스워드, 이톤 애비뉴 9259). pQE60은 암피실린 항생제 내성("Ampr")을 암호화하며 세균성 복제 오리진("ori"), IPTG 유도성 프로모터, 리보솜 결합 부위("RBS"), 상기 퀴아젠, 인코포레이티드사가 판매하는 니켈-니트릴로-트리-아세트산("Ni-NTA") 친화도 수지를 사용하는 친화도 정제를 가능하게 하는 히스티딘 잔기를 암호화하는 6개 코돈, 및 적합한 단일 제한 효소 절단 부위들을 포함한다. 이러한 요소들은 배열되어 결과적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 단편이, 상기 폴리펩타이드의 카복실 말단에 공유결합적으로 연결된 6개 His 잔기(즉, "6X His 태그")를 갖는 폴리펩타이드를 생성하는 방식으로 삽입될 수 있다. 그러나, 본 실시예에서, 폴리펩타이드 암호화 서열이 삽입되어 결과적으로 6개의 His 코돈의 해독이 방해되며, 따라서, 6X His 태그가 없는 폴리펩타이드가 제조된다.
TNFR-6α 및 TNFR-6β 아미노산 서열의 성숙한 형태를 포함하는 TNFR-6α 및 TNFR-6β 단백질의 바람직한 부분들을 암호화하는 DNA 서열을, TNFR-6α 및 TNFR-6β 단백질의 바람직한 부분의 아미노 말단 서열 및 cDNA 암호화 서열에 대해 기탁된 3' 작제물 중 서열에 어닐링하는 PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 기탁된 cDNA 클론으로부터 증폭시킨다. pQE60 벡터 중에 클로닝을 촉진하는 제한 부위를 함유하는 부가적인 뉴클레오타이드를 각각, 5' 및 3' 서열에 부가한다.
TNFR-6α 단백질의 성숙한 형태를 클로닝하기 위해서, 5' 프라이머는 밑줄친 NcoI 제한 부위를 함유하는 서열 5' CGCCCATGGCAGAAACACCCACCTAC 3'(서열 19)를 갖는다. 물론, 당해 분야의 통상의 숙련자는, 5' 프라이머가 시작하는 단백질 암호화 서열의 위치는 성숙한 형태보다 더 짧거나 보다 더 긴 완전한 단백질의 바람직한 부분을 증폭하기 위해서 다양할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 3' 프라이머는 밑줄친 HindIII 제한 부위를 함유하는 서열 5'CGCAAGCTTCTCTTTCAGTGCAAGTG 3'(서열 20)을 갖는다. TNFR-6β 단백질의 성숙한 형태를 클로닝하기 위해서, 5' 프라이머는 상기 서열 19의 서열을 갖고, 3' 프라이머는 밑줄친 HindIII 제한 부위를 함유하는 서열 5' CGCAAGCTTCTCCTCAGCTCCTGCAGTG 3'(서열 21)을 갖는다.
증폭된 TNFR-6α 및 TNFR-6β DNA 단편 및 벡터 pQE60은 NcoI 및 HindIII로 절단한 후, 함께 연결시킨다. TNFR-6α 및 TNFR-6β DNA의 제한 절단된 pQE60벡터내로의 삽입은 이와 관련된 종결 코돈을 포함하는 TNFR-6α 및 TNFR-6β 단백질 암호화 영역을 IPTG-유도성 프로모터 및 개시하는 AUG를 갖는 틀로부터 하류에 위치시킨다. 관련된 종결 코돈은 삽입 지점의 하류의 6개 히스티딘 코돈의 해독을 방해한다.
상기 연결 혼합물을 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)]에 기술된 바와 같은 표준 기술을 사용하여 수용능(competent) 이. 콜라이를 형질전환시킨다. lac 리프레서를 발현하고 카나마이신 내성("Kanr")을 주는 플라스미드 pREP4의 다수 복사체를 함유하는, 이. 콜라이 균주 M15/rep4는 본원에 기술된 예증적인 실시예를 수행하는데 사용된다. 상기 균주는 TNFR-6α 및 TNFR-6β 단백질을 발현하는데 적합한 수 많은 균주 중 하나이며, 상기 퀴아젠, 인코포레이티드사에서 시판되고 있다. 형질전환체는 암피실린 및 카나마이신의 존재하에 LB 플레이트에서 성장하는 이의 능력에 의해 동정된다. 플라스미드 DNA는 내성 클론으로부터 분리되며 클로닝된 DNA의 동정은 제한 분석, PCR 및 DNA 서열 분석에 의해 확인된다.
목적하는 작제물을 함유하는 클론은 앰피실린(100㎍/㎖) 및 카나마이신(25㎍/㎖) 모두로 보충된 LB 배지에서 액체 배양으로 밤새("O/N") 성장시킨다. O/N 배양물을 사용하여 약 1:25 내지 1:250의 희석으로, 대형 배양물에 접종한다. 세포는 600㎚에서 흡광도("OD600")에서 0.4 내지 0.6의 광학 밀도까지 성장시킨다. 이후, 이소프로필-b-D-티오갈락토피라노사이드("IPTG")를 최종 농도 1mM로 부가하여, lacI 리프레서를 불활성화시킴으로써, lac 리프레서 민감성 프로모터로부터의 전사를 유도한다. 세포를 후속적으로 추가로 3 내지 4시간 동안 배양한다. 이후, 세포를 원심분리시켜 수득한다.
TNFR-6α 및 TNFR-6β 폴리펩타이드를 정제하기 위해서, 이후, 세포를 4℃에서 pH 8의 6M 구아니딘-HCl 중에서 교반시킨다. 세포 부산물을 원심분리시켜 제거하고, TNFR-6α 및 TNFR-6β를 함유하는 상청액을 200mM NaCl를 보충시킨, pH 6의 50mM Na-아세테이트 완충액으로 투석한다. 달리, 상기 단백질을 연속적으로, 프로테아제 억제제를 함유하는 500mM NaCl, 20% 글리세롤, 25mM Tris/HCl(pH 7.4)로 투석시켜 다시 폴딩(folding)시킬 수 있다. 탈변성(renaturation) 후, 단백질을 이온 교환, 소수성 상호작용 및 크기 배제 크로마토그래피로 정제할 수 있다. 달리, 항체 컬럼 같은 친화도 크로마토그래피 단계를 사용하여 정제된 TNFR-6α 및 TNFR-6β 단백질을 수득할 수 있다. 정제된 단백질을 4℃에 보관하거나 -80℃에서 냉동시킨다.
하기 대안적인 방법을 사용하여, TNFR-6α 및 TNFR-6β가 봉입체 형태로 존재하는 경우, 이. 콜라이에서 발현된 상기 단백질을 정제할 수 있다. 특별히 구체화하지 않는 한, 모든 하기 단계들은 4 내지 10℃에서 수행된다.
이. 콜라이 발효의 생산 단계를 완료한 후, 세포 배양물을 4 내지 10℃로 냉각시키고, 세포를 15,000rpm에서 연속적 원심분리로 수득한다(Heraeus Sepatech). 세포 페이스트 단위 중량 당 예견되는 단백질 수율 및 요구되는 정제된 단백질의 양에 기초하여, 중량 당 적합한 세포 페이스트의 양을 100mM Tris, 50mM EDTA(pH 7.4)를 함유하는 완충액 용액 중에 현탁시킨다. 세포를 고전단 혼합기를 사용하여 균질한 현탁액으로 분산시킨다.
이후, 4000 내지 6000psi에서 미세유동화기(제조원: Microfuidics, Corp. 또는 APV Gaulin, Inc.)를 통해 2회 용액을 통과시킴으로써 세포를 용출시킨다. 균질화물을 최종 농도 0.5M NaCl로 NaCl 용액과 혼합한 후, 15분 동안, 7000 xg로 원심분리한다. 생성되는 펠렛을 0.5M NaCl, 100mM Tris 및 50mM EDTA(pH 7.4)를 사용하여 다시 세척한다.
생성된 세척한 봉입체를 2 내지 4시간 동안 1.5M 구아니딘 하이드로클로라이드(GnHCl)로 용해시킨다. 15분 동안 7000 xg로 원심분리한 후, 펠렛을 제거하고, TNFR-6α 또는 TNFR-6β 폴리펩타이드-함유 상청액을 4℃에서 밤새 항온처리하여 추가의 GnHCl 추출이 가능하도록 한다.
고속 원심분리(30,000 xg)로 불용성 입자를 제거한 후, GnHCl 용해된 단백질은, GnHCl 추출물을 50mM 나트륨,450mM NaCl, 2mM EDTA(pH 4.5)를 함유하는 완충액 20용적과 함께 격렬히 교반하여 신속하게 혼합함으로써 재 폴딩된다. 재 폴딩된 희석된 단백질 용액을 추가의 정제 단계에 앞서 12시간 동안 혼합없이 4℃에서 유지시킨다.
재 폴딩된 TNF 수용체 폴리펩타이드 용액을 정화시키기 위해서, 40mM 나트륨 아세테이트(pH 6.0)를 평형시킨, 적합한 표면 영역을 가진 0.16㎛ 막 필터(예: 필트론(Filtron))가 장착된 미리 제조된 접선 여과 단위를 사용할 수 있다. 여과된 샘플을 양이온 교환 수지(예를 들어, Poros HS-50, 제조원: Perseptive Biosystems)상에 로딩(loading)한다. 상기 컬럼을 40mM 나트륨 아세테이트(pH 6.0)로 세척하고, 단계적인 방식으로 동일한 완충액 중에서 250mM, 500mM, 1000mM, 및 1500mM NaCl로 용출시킨다. 유출액의 280nm에서의 흡광도를 계속적으로 모니터링한다. 분획물을 수거하고 추가로 SDS-PAGE로 분석한다.
이후, TNF 수용체 폴리펩타이드를 함유하는 분획물을 모으고 물 4용적과 혼합한다. 이후, 희석된 샘플을 이전에 제조된 강한 음이온(Poros HQ-50, 제조원: Perseptive Biosystems) 및 약한 음이온(Poros CM-20, 제조원: Perseptive Biosystems)의 직렬 컬럼 셋트상에 로딩한다. 컬럼들을 40mM 나트륨 아세테이트(pH 6.0)로 평형시킨다. 이후, CM-20 컬럼을 0.2M NaCl, 50mM 나트륨 아세테이트(pH 6,0) 내지 1.0M NaCl, 50mM 나트륨 아세테이트(pH 6.5)의 범위의 10개 컬럼 용적의 선형 구배를 사용하여 용출시킨다. 유출액의 지속적인 A280모니터링하에, 분획물을 수거한다. 이후, TNFR-6α 또는 -6β 폴리펩타이드를 함유하는 분획물(예를 들어, 16% SDS-PAGE로 결정함)을 모은다.
생성되는 TNF 수용체 폴리펩타이드는 상기 재 폴딩 및 정제 단계 후, 95% 이상의 순도를 나타낸다. 정제된 단백질 5㎍을 로딩하는 경우, 쿠마시에 블루 염색한 16% SDS-PAGE로부터 어떠한 주요 오염물 밴드도 관찰되지 않는다. 정제된 단백질은 또한 내독소/LPS 오염에 대해서도 시험하며, 전형적으로 LPS 함량은 LAL 분석법에 따라 0.1ng/㎖ 미만이다.
실시예 2
배쿨로바이러스 발현 시스템에서 TNFR-6α 및 TNFR-6β 단백질의 클로닝 및 발현
본 예증적인 실시예에서, 플라스미드 셔틀 벡터 pA2는, 문헌[Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987)]에 기술된 바와 같은 표준 방법을 사용하여, 이의 천연적으로 관련된 분비 신호(리더) 서열을 포함하는 완전한 단백질을 암호화하는 클로닝된 DNA를 배쿨로바이러스에 삽입하여 성숙한 TNFR-6α 또는 -6β 단백질을 발현하는데 사용된다. 상기 발현 벡터는 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스(polyhedrosis) 바이러스(AcMNPV)의 강력한 폴리헤드린 프로모터와뒤 이은 BamHI, XbaI 및 Asp718 같은 편리한 제한 부위를 포함한다. 원숭이 바이러스 40("SV40")의 폴리아데닐화 부위는 효과적인 폴리아데닐화를 위해 사용한다. 재조합 바이러스의 용이한 선택을 위해서, 플라스미드는 동일한 방향으로 약한 드로소필라 프로모터의 조절하에 이. 콜라이로부터의 베타-갈락토시다제 유전자 및 뒤 이은 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 삽입된 유전자는 야생형 바이러스 DNA와 세포-매개된 상동 재조합을 위한 바이러스 서열에 의해 양 쪽에서 플랭킹되어 클로닝된 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 생존할 수 있는 바이러스를 생성한다.
당해 분야의 숙련자가 용이하게 인식할 수 있는 바와 같이, 작제물이 신호 펩타이드 및 경우에 따라 AUG 프레임-유지를 포함하는, 전사, 해독, 분비 등을 위한 적합하게 위치된 신호를 제공하는 한, pAc373, pVL941 및 pAcIM1과 같은, 수많은 기타 배쿨로바이러스 벡터를 상기 벡터 대신에 사용할 수 있다. 이러한 벡터들은, 예를 들면 문헌[Luckow et al., Virology 170:31-39 (1989)]에 기술되어 있다.
서열 2 또는 4에서 나타낸 AUG 개시 코돈 및 천연 관련 리더 서열을 포함하는, 기탁된 클론 중 완전한 길이의 TNFR-6α 또는 -6β 단백질을 암호화하는 cDNA 서열을 상기 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. TNFR-6α 및 TNFR-6β를 위한 5' 프라이머는 밑줄친 BamHI 제한 효소 부위를 포함하는 서열 5' CGCGGATCCGCCATCATGAGGGCGTGGAGGGGCCAG 3'(서열 22)를 갖는다. 상기한 모든 프라이머들은 문헌[Kozak, M., J. Mol. Biol. 196:947-950 (1987)]에 기술된 바와 같이, 진핵 세포에서 해독을 개시하는 유효한신호를 암호화한다. TNFR-6α을 위한 3' 프라이머는 밑줄친 Asp718 제한 부위를 포함하는 서열 5'CGCGGTACCCTCTTTCAGTGCAAGTG 3'(서열 23)을 갖는다. TNFR-6β를 위한 3' 프라이머는 밑줄친 Asp718 제한 부위를 포함하는 서열 5'CGCGGTACCCTCCTCAGCTCCGCAGTG 3'(서열 24)을 갖는다.
증폭된 단편을 시판중인 키트("진클린(Geneclean)", 제조원: BIO 101 Inc., 캘리포니아주 라 졸라)를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리한다. 이후, 단편을, 구체적으로 상기한 바와 같이, 사용된 프라이머 각각에 대해 적합한 제한 효소를 사용하여 절단하고, 다시 1% 아가로스 겔 상에서 정제한다.
상기 플라스미드를 동일한 제한 효소로 절단하고 임의로, 당해 분야에 공지된 일상적인 기술을 사용하여, 송아지 장 포스파타제를 사용하여 탈인산화시킬 수 있다. 이후, DNA를 시판중인 키트("진클린", 제조원: BIO 101 Inc., 캘리포니아주 라 졸라)를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리한다.
단편 및 탈인산화된 플라스미드를 T4 DNA 리가제를 사용하여 함께 연결시킨다. 이. 콜라이 HB101 또는 XL-1 블루(제조원: 스트라타진 클로닝 시스템사, 캘리포니아주 라 졸라)같은 기타 적합한 이. 콜라이 숙주를 상기 연결 혼합물로 형질전환시키고 배양 플레이트 상에 도말한다. 상기에서 사용된 효소를 사용하여 각각의 클론들로부터 DNA를 절단한 후 겔 전기영동으로 절단 생성물을 분석함으로써 사람 TNF 수용체 유전자를 갖는 플라스미드를 함유하는 세균을 동정한다. 클로닝된 단편의 서열은 DNA 서열 분석법으로 확인한다. 이러한 플라스미드를 본원에서는 pA2-TNFR-6α 또는 pA2TNFR-6β(통틀어, pA2-TNFR)라고 명명한다.
플라스미드 pA2-TNFR 5㎍을 문헌[Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 (1987)]에 기술된 리포펙션 방법(lipofection method)을 사용하여, 상업적으로 시판중인 선형화된 배쿨로바이러스 DNA("BaculoGoldTM배쿨로바이러스 DNA", 제조원: Pharmingen, 캘리포니아주 샌 디에고) 1.0㎍과 공-형질감염시킨다. BaculoGoldTM바이러스 DNA 1㎍ 및 플라스미드 pA2-TNFR 5㎍을 혈청-비함유 그레이스 배지(Grace's medium)(제조원: Life Technologies Inc., 매릴랜드주 가이테스버그) 50㎕를 함유하는 미세적정 플레이트의 멸균된 웰에서 혼합한다. 이후, 리포펙틴 10㎕를 그레이스 배지 90㎕와 함께 부가하고, 혼합한 후 실온에서 15분 동안 항온 처리한다. 이후, 형질감염 혼합물을 혈청 비함유 그레이스 배지 1㎖로 35mm 조직 배양 플레이트에 시딩된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가한다. 이후, 상기 플레이트를 27℃에서 5 시간 동안 배양한다. 이후, 형질감염 용액을 플레이트로부터 제거하고 10% 송아지 태아 혈청으로 보충된 그레이스 곤충 배지 1㎖를 가한다. 배양을 4일 동안 27℃에서 계속한다.
4일 후, 문헌[상기, Summers and Smith]에 기술된 바와 같이, 상청액을 수거하고 플라크 분석을 수행한다. "블루 갈(Blue Gal)"(제조원: Life Technologies Inc., 가이테스버그)을 사용한 아가로스 겔을 사용하여 gal-발현 클론을 동정하고 분리하며, 상기 클론은 푸른색-염색된 플라크를 생성한다. (이러한 유형의 "플라크 분석법"에 대한 상세한 기술은 제조원(Life Technologies Inc., 가이테스버그)에 의해 배포된 곤충 세포 배양 및 배쿨로바이러스학을 위한 사용자 안내서, 제9면및 제10면에서 발견할 수 있다). 적당히 배양한 후, 푸른색 염색된 플라크를 마이크로피펫터(예를 들어, 에펜도르프사 제품)의 팁(tip)으로 찍어 올린다. 이후, 재조합 바이러스가 함유된 상기 아가를 그레이스 배지 200㎕를 함유하는 미세원심분리 튜브에 재현탁시키고, 재조합 배쿨로바이러스를 함유하는 현탁액을 사용하여 35mm 플레이트에 시딩된 Sf9 세포를 감염시킨다. 4일 후, 이러한 배양 플레이트의 상청액을 수거한 후 이들을 4℃에 저장한다.
TNF 수용체 유전자의 발현을 입증하기 위해서, Sf9 세포를 10% 가열-불활성화시킨 FBS로 보충시킨 그레이스 배지에서 성장시킨다. 상기 세포를 감염 다중도("MOI") 약 2에서 재조합 배쿨로바이러스로 감염시킨다. 방사능 표지된 단백질이 바람직한 경우, 6시간 후, 배지를 제거하고 SF900II 배지(메티오닌 및 시스테인 비함유)(제조원: Life Technologies Inc., 매릴랜드 록크빌)로 교체한다. 42시간 후,35S-메티오닌 5μCi 및35S-시스테인 5μCi(제조원: Amersham)를 부가한다. 추가로 세포를 16시간 동안 배양한 후 원심분리시켜 수거한다. 세포내 단백질 뿐만 아니라 상청액 중 단백질을 SDS-PAGE를 수행한 후 방사능 사진술(방사능 표지된 경우)로 분석한다.
정제된 단백질의 아미노 말단의 아미노산 서열에 대한 미세 서열 분석을 사용하여 TNF 수용체 단백질의 성숙 형태의 아미노 말단 서열을 결정할 수 있다.
실시예 3
포유 동물 세포에서 TNFR-6α 및 TNFR-6β의 클로닝 및 발현
전형적인 포유동물 발현 벡터는 mRNA의 전사를 매개하는 프로모터 인자, 단백질 암호화 서열, 및 전사 종결 및 전사체의 폴리아데닐화를 위해 필요한 신호를 포함한다. 부가적인 요소들은 인핸서, Kozak 서열 및 RNA 스플라이싱을 위한 공여체 및 수용체 부위에 의해 플랭킹되는 간섭 서열을 포함한다. 고효율 전사는 SV40의 early 및 late 프로모터, 레트로바이러스, 예를 들어, RSV, HTLVI, HIVI로부터의 장 말단 반복 서열(LTRs), 및 사이토메갈로바이러스(CMV)의 early 프로모터를 사용하여 달성할 수 있다. 그러나, 세포성 요소들(예를 들어, 사람 액틴 프로모터)이 또한 사용될 수 있다. 본 발명을 실시하는데 사용하기 위한 적합한 발현 벡터는 예를 들어, pSVL 및 pMSG(제조원: Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat(ATCC 제37152호), pSV2dhfr(ATCC 제37146호) 및 pBC12MI(ATCC 제67109호) 같은 벡터들을 포함한다. 사용될 수 있는 포유동물 숙주 세포는 사람 Hela, 293, H9 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, COS 1, COS 7 및 CV1, 모츠래기 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다.
대안적으로, 상기 유전자는 염색체에 통합된 상기 유전자를 함유하는 안정한 세포주에서 발현될 수 있다. dhfr, gpt, 네오마이신, 하이그로마이신 같은 선택성 표지와 함께 공-형질감염시켜 형질감염된 세포를 동정 및 분리할 수 있다.
형질감염된 유전자는 또한 대량의 암호화된 단백질을 발현하도록 증폭될 수 있다. DHFR(디하이드로폴레이트 리덕타제) 표지는 흥미있는 유전자의 수백 내지 수천개의 복사체를 갖는 세포주를 제조하는데 유용하다. 또 다른 유용한 선택 표지는 효소 글루타민 신타제(GS)이다[Murphy et al., Biochem J. 227:277-279 (1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)]. 상기 표지들을 사용하여, 포유동물 세포들을 선택성 배지에서 성장시키고 최고의 내성을 갖는 세포를 선택한다. 이들 세포주는 염색체내로 통합된 증폭된 유전자(들)을 함유한다. 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포 및 NSO 세포는 종종 단백질 생산용으로 사용된다.
발현 벡터 pC1 및 pC4는 라우스 육종 바이러스의 강력한 프로모터(LTR)[Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (March, 1985)] 및 CMV-인핸서의 단편[Boshart et al., Cell 41:521-530(1985)]을 포함한다. 예를 들어, 제한 효소 절단 부위 BamHI, XbaI 및 Asp718을 갖는 다중 클로닝 부위는 관심있는 유전자의 클로닝을 촉진시킨다. 벡터는 부가적으로 랫트의 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론, 폴리아데닐화 및 종결 신호를 함유한다.
실시예 3(a)
COS 세포에서 클로닝 및 발현
발현 플라스미드, pTNFR-α-HA 및 -6β-HA는 TNF 수용체 단백질의 성숙한 형태를 암호화하는 cDNA의 일부를 발현 벡터 pcDNAI/Amp 또는 pcDNAIII(이는 제조원: Invitrogen, Inc.로부터 수득할 수 있다)내로 클로닝함으로써 작제된다.
발현 벡터 pcDNAI/amp는 (1) 이. 콜라이 및 기타 원핵 세포에서의 증식에 유효한 이. 콜라이 복제 오리진; (2) 플라스미드-함유 원핵 세포의 선택을 위한 암피실린 내성 유전자; (3) 진핵 세포에서의 증식용 SV40의 복제 오리진; (4) CMV 프로모터, 폴리링커, SV40 인트론; (5) 배열된 종결 코돈 및 폴리아데닐화 신호가 뒤를 따르는 헤마글루티닌 단편(즉, 정제를 촉진하는 "HA" 태그)을 암호화하는 수 개의 코돈을 포함하며, 결과적으로 cDNA는 폴리링커 중 제한 부위들을 수단으로 CMV 프로모터의 발현 조절하에 위치되며 작동적으로 SV40 인트론 및 폴리아데닐화 신호에 연결될 수 있다. HA 태그는 문헌[Wilson et al., Cell 37:767 (1984)]에 기술된 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응한다. HA 태그의 표적 단백질에 대한 융합은 HA 에피토프를 인식하는 항체를 사용하여 재조합 단백질의 용이한 검출 및 회수를 가능하게 한다. 부가적으로, pcDNAIII은 선택성 네오마이신 마커를 포함한다.
완전한 TNF 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 단편을 벡터의 폴리링커 영역에 클로닝함으로써 재조합 단백질 발현은 CMV 프로모터에 의해 지시된다. 플라스미드 작제 전략은 하기와 같다. 이. 콜라이에서 TNF 수용체의 발현을 위한 벡터의 작제를 위해서 상기 기술한 바와 같이, 기탁된 클론의 TNF 수용체 cDNA를 편리한 제한 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 적합한 프라이머는 당해 분야의 통상의 숙련자에 의해 용이하게 디자인될 수 있다.
PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터, pcDNAI/Amp를 XbaI 및 EcoRI으로 절단한 후 연결시킨다. 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 SURE(스트라타진 클로닝 시스템스 시판중, 캘리포니아주 92037 라 졸라, 노쓰 토레이 파인스 로오드 11099)내로 형질전환시키고, 형질전환된 배양물을 암피실린 배지 플레이트에 플레이팅한 후 암피실린 내성 콜로니가 성장하도록 배양한다. 플라스미드 DNA를 내성 콜로니로부터 분리하고, TNFR-6α 및 TNFR-6β 폴리펩타이드를 암호화하는 단편의 존재에 대해 내성 분석 및 기타 수단으로 실험한다.
재조합 TNFR-6α 및 TNFR-6β의 발현을 위해서, COS 세포를 상기한 바와 같이, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]에 기술된 바와 같이, DEAE-덱스트란을 사용하여, 발현 벡터로 형질감염시킨다. 벡터에 의한 TNFR의 발현을 위한 조건하에서 세포를 배양한다.
TNFR-6α-HA 및 -6β-HA 융합 단백질의 발현은 예를 들어, 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboraory Manual, 2nd Ed; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988)]에 기술된 방법들을 사용하여, 방사능 표지화 및 면역침전시킴으로써 검출된다. 이러한 목적을 위해서, 형질감염 2일 후,35S-시스테인 함유 배지에서 8시간 동안 배양시킴으로써 세포들을 표지화시킨다. 세포 및 배지를 수거하고, 세포를 세척하고, 문헌[상기 인용된 Wilson et al.]에 의해 기술된 바와 같이, 세제-함유 RIPA 완충액(150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50mM TRIS, pH 7.5)으로 용해시킨다. HA-특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 단백질을 세포 용출물 및 배양 배지로부터 침전시킨다. 침전된 단백질을 SDS-PAGE 및 방사선 사진술로 분석한다. 예견된 크기의 발현 생성물이 세포 용출물에서 나타나며, 이는 네가티브 대조군에서는 나타나지 않는다.
실시예 3(b)
CHO 세포에서의 클로닝 및 발현
벡터 pC4는 TNFR-6α 및 TNFR-6β 폴리펩타이드의 발현을 위해서 사용한다. 플라스미드 pC4는 플라스미드 pSV2-dhfr(ATCC 기탁번호 제37146호)의 유도체이다. 상기 플라스미드는 SV40 early 프로모터의 조절하에 마우스 DHFR 유전자를 포함한다. 상기 플라스미드로 형질감염된, 디하이드로폴레이트 활성이 결핍된 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 기타 세포들은 화학요법제 메토트렉세이트로 보충된 선택성 배지(알파 마이너스 MEM, 제조원: Life Technologies)에서 세포를 성장시킴으로써 선택될 수 있다. 메토트렉세이트(MTX) 내성인 세포에서 DHFR 유전자의 증폭은 널리 공지되어 있다[문헌 참조: Alt, F.W., Kellems, R.M., Bertino, J.R., and Schimke, R.T., 1978, J. Biol. Chem. 253:1357-1370, Hamlin, J.L. and Ma, C. 1990, Biochem. et BioPhys. Acta, 1097:107-143, Page, M.J. and Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology 9:64-68]. 증가된 농도의 MTX에서 성장시킨 세포는, DHFR 유전자의 증폭의 결과로서, 표적 효소인 DHFR을 과생성시킴으로써 상기 약제에 대한 내성이 증진된다. 제2 유전자가 DHFR 유전자에 연결되는 경우, 이는 일반적으로 공-증폭되어 과-발현된다. 이러한 방법은 증폭된 유전자(들) 1000개 이상의 복사체를 갖는 세포주를 제조하는데 사용될 수 있다는 것이 당해 분야에 공지되어 있다. 후속적으로, 메토트렉세이트를 제거하는 경우, 숙주 세포의 하나 이상의 염색체내로 통합된 증폭된 유전자를 함유하는 세포주가 수득된다.
목적하는 유전자의 발현을 위해서 플라스미드 pC4는 라우스 육종 바이러스의 장 말단 반복 서열(LTR)의 프로모터[Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, March 1985: 438-447] 및 사람 사이토메갈로바이러스(CMV)의 immediate early 유전자의 인핸서로부터 분리된 단편[Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)]을 포함한다. 프로모터의 하류에는 유전자의 통합을 가능케 하는 다음의 단독 제한 효소 절단 부위가 따른다: BamHI, XbaI, 및 Asp718. 상기 클로닝 부위에 뒤 이어, 상기 플라스미드는 랫트의 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 기타 고효율 프로모터로는 또한 발현을 위해서, 예를 들어, 사람 β-액틴 프로모터, SV40의 early 또는 late 프로모터 또는 기타 레트로바이러스 예를 들어, HIV 및 HTLVI로부터의 장 말단 반복 서열이 사용될 수 있다. 클론텍(Clontech)사의 Tet-Off 및 Tet-On 유전자 발현 시스템 및 유사 시스템을 사용하여 포유동물에서 조절된 방식으로 TNF 수용체 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다[Gossen, M., & Bujard, H. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551]. mRNA의 폴리아데닐화를 위해서, 기타 신호, 예를 들어 사람 성장 호르몬 또는 글로빈 유전자로부터의 신호를 또한 사용할 수 있다. 염색체내에 통합된 관심있는 유전자를 갖는 안정한 세포주는 gpt, G418 또는 하이그로마이신 같은 선택성 표지를 사용하여 공-형질감염시켜 또한 선택할 수 있다. 시작부터, 예를 들어, G418 + 메토트렉세이트 같이 하나 이상의 선택성 표지를 사용하는 것이 유리하다.
플라스미드 pC4를 하기 개략한 바와 같이 선택된 TNF 수용체를 증폭하기 위해서 사용된 특정한 프라이머에 적합한 제한 효소로 절단한 후, 당해 분야에 공지된 방법으로 소 장 포스파타제를 사용하여 탈인산화시킨다. 이후, 벡터를 1% 아가로스 겔로부터 분리한다.
TNF 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 상기 유전자의 바람직한 부분의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. TNFR-6α 및 TNFR-6β를 위한 밑줄친 BamHI 부위를 포함하는 5' 프라이머는 하기 서열 5' CGCGGATCCGCCATCATGAGGGCGTGGAGGGGCCAG 3'(서열 22)을 갖는다. TNFR-6α를 위한 3' 프라이머는 밑줄친 Asp718 제한 부위를 포함하는 서열 5' CGCGGTACCCTCTTTCAGTGCAAGTG 3'(서열 23)을 갖는다. TNFR-6β를 위한 3' 프라이머는 밑줄친 Asp718 제한 부위를 포함하는 서열 5' CGCGGTACCCTCCTCAGCTCCTGCAGTG 3'(서열 24)을 갖는다.
증폭된 단편을 작제된 제한 부위를 절단하는 엔도뉴클레아제로 절단한 후 1% 아가로스 겔상에서 다시 정제한다. 이후 분리된 단편 및 탈인산화된 벡터를 T4 DNA 리가제로 연결시킨다. 이후, 이. 콜라이 HB101 또는 XL-1 블루 세포들을 형질전환시키고 예를 들어, 제한 효소 분석을 사용하여 플라스미드 pC4내로 삽입된 단편을 포함하는 세균을 분리한다.
활성 DHFR 유전자가 결핍된 중국산 햄스터 난소 세포를 형질감염에 사용한다. 발현 플라스미드 pC4 5㎍을 리포펙신[상기, Felgner et al.]을 사용하여 플라스미드 pSVneo 0.5㎍과 함께 공-형질감염시킨다. 플라스미드 pSV2-neo는 우세한 선택성 표지, 즉 G418을 포함하는 항생제 그룹에 내성을 주는 효소를 암호화하는 Tn5로부터의 neo 유전자를 포함한다. 세포를 G418 1㎎/㎖로 보충된 알파 마이너스MEM 배지에 시딩한다. 2일 후, 세포를 트립신으로 처리하고 메토트렉세이트 10, 25, 또는 50ng + G418 1㎎/㎖로 보충된 알파 마이너스 MEM 배지 중 하이브리도마 클로닝 플레이트(제조원: Greiner, 독일)에 시딩한다. 약 10 내지 14일 후, 단독 클론을 트립신 처리한 후 상이한 농도(50nM, 100nM, 200nM, 400nM, 800nM)의 메토트렉세이트를 사용하여 6-웰 페트리 디쉬 또는 10㎖ 플레이트에 시딩한다. 메토트렉세이트의 최고 농도에서 성장하는 클론을 보다 더 높은 농도(1μM, 2μM, 5μM, 10mM, 20mM)의 메토트렉세이트를 함유하는 새로운 6-웰 플레이트로 옮긴다. 동일 방법을 100 내지 200μM의 농도에서 성장하는 클론이 수득될 때까지 반복한다. 바람직한 유전자 생성물의 발현을, 예를 들어, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해서 또는 역상 HPLC 분석에 의해 분석한다.
실시예 4
TNF 수용체 mRNA 발현의 조직 분포
노던 블롯 분석을, 기타 방법 중 문헌[상기 인용된 Sambrook et al.]에 기술된 방법을 사용하여 수행하여 사람 조직에서 TNFR-6α 및 TNFR-6β 유전자 발현을 조사한다. TNF 수용체 단백질의 완전한 뉴클레오타이드 서열(서열 1 또는 3)을 포함하는 cDNA 프로브를 rediprimeTMDNA 표지화 시스템(제조원: Amersham Life Science)을 사용하여 제조원의 지침에 따라32P로 표지한다. 표지 후, 프로브를 CHROMA SPIN-100TM컬럼(제조원: Clontech Laboratories, Inc.)을 사용하여 제조원의 프로토콜 번호 PT1200-1에 따라서 정제한다. 이후, 정제한 표지된 프로브를 TNF 수용체 mRNA에 대해 다양한 사람 조직을 조사한다.
다양한 사람 조직(H) 또는 사람 면역계 조직(IM)을 포함하는 다중 조직 노던(MTN) 블롯은 제조원(Clontech)으로부터 수득하며 ExpressHybTM하이브리드화 용액(제조원: Clontech)을 사용하여 제조업자의 프로토콜 번호 PT1190-1에 따라 표지된 프로브로 조사한다. 하이브리드화 및 세척 후, 상기 블롯을 -70℃에서 필름에 올려 밤새 노출시키고, 표준 방법에 따라 필름을 현상한다.
본 발명은 상기 기술 및 실시예에서 특별히 기술한 것과 다르게 실시될 수 있다는 것은 명백할 것이다. 본 발명에 대한 수 많은 변형과 변화가 상기 교시하에 가능하며, 따라서, 첨부된 청구의 범위내에 포함된다.
실시예 5
내인성 TNFR-6 유전자를 이용하는 유전자 치료
본 발명에 따른 또 다른 유전자 치료 방법은 상동 재조합을 통해 프로모터와 내인성 TNFR(즉, TNFR-6) 서열을 작동적으로 결합시키는 단계를 포함한다[참조 문헌: 1997년 6월 24일에 등록된 미국 특허 제5,641,670호; 1996년 9월 26일 공개된 국제출원 WO94/12650; 1994년 8월 4일 공개된 국제출원 WO96/29411; Koller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); 및 Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)]. 이러한 방법은, 표적 세포에는 존재하나, 당해 세포에서 발현되지 않거나, 목적하는 수준 보다 낮은 수준으로 발현되는 유전자의 활성화 단계를 포함한다. 프로모터, 및 내인성 TNFR-6의 5'-비-암호화 서열과 상동성이고 프로모터와 플랭킹되어 있는 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 작제물을 제조한다. 표적 서열은 TNFR-6의 5' 말단과 충분히 근접되므로, 상동 재조합시 프로모터는 내인성 서열에 작동적으로 연결될 것이다. 프로모터 및 표적 서열은 PCR을 이용하여 증폭시킬 수 있다. 바람직하게는, 증폭된 프로모터는 5' 및 3' 말단에 특유한 제한 효소 부위를 포함한다. 바람직하게는, 제1 표적 서열의 3'말단은 증폭된 프로모터의 5'말단과 동일한 제한 효소 부위를 포함하며, 제2 표적 서열의 5'말단은 증폭된 프로모터의 3'말단과 동일한 제한 부위를 포함한다.
증폭된 프로모터 및 증폭된 표적 서열을 적당한 제한 효소로 분해하고, 이어서 송아지 장내 포스파타제로 처리한다. 분해된 프로모터 및 분해된 표적 서열을 T4 DNA의 존재하에 함께 가한다. 생성된 혼합물을 두 개의 단편을 연결시키기에 적합한 조건하에서 유지한다. 당해 작제물을 아가로즈 겔상에서 크기-분별한 후, 페놀 추출법 및 에탄올 침전법으로 정제한다.
본 실시예에서, 폴리뉴클레오타이드 작제물을 전기천공을 통해 나상 폴리뉴클레오타이드 상태로 투여한다. 그러나, 또한 당해 폴리뉴클레오타이드 작제물을 형질감염-촉진제, 예를 들면 리포좀, 바이러스 서열, 바이러스 입자, 침전제, 등과 함께 투여할 수 있다. 이러한 투여 방법은 당업계에 공지되어 있다.
일단 세포를 형질감염시키면, 상동 재조합이 일어나서, 프로모터가 내인성 TNFR-6 서열에 작동적으로 연결될 것이다. 이러한 결과에 의해, 세포내에서 TNFR-6이 발현된다. 발현은 면역학적 염색, 또는 당업계에 공지된 기타 방법에 의해 검출될 수 있다.
섬유아세포는 피부 생검에 의해 피험자로 부터 수득한다. 수득된 조직을 DMEM + 10% 태아 송아지 혈청중에 넣는다. 지수 성장기 또는 초기 정지기의 섬유아세포를 트립신으로 처리하고, 영양 배지로 플라스틱 표면으로 부터 씻어낸다. 세포 현탁액의 분액을 제거하여 계수하고, 잔류 세포를 원심분리시킨다. 상청액을 흡기시키고, 펠릿을 5ml의 전기천공 완충액[20mM HEPES pH 7.3, 137mM NaCl, 5mM KCl, 0.7mM Na2HPO4, 6mM 덱스트로즈]중에 재현탁시킨다. 당해 세포를 재원심분리시키고, 상청액을 흡기시킨 후, 아세틸화 소 혈청 알부민 1mg/ml을 함유하는 전기천공 완충액중에 재현탁시킨다. 최종 세포 현탁액은 약 3X106세포/ml을 함유한다. 전기천공은 재현탁 직후 수행하여야 한다.
플라스미드 DNA를 표준 기술에 따라 제조한다. 예를 들면, TNFR-6 좌위에 표적화하기 위한 플라스미드를 작제하기 위해, 플라스미드 pUC18(MBI Fermentas, Amherst, NY)를 HindIII로 분해한다. CMV 프로모터를, 5'말단상의 XbaI 부위 및 3'말단상의 BamHI를 이용하여 PCR로 증폭시킨다. 두 개의 TNFR-6-비암호화 서열을 PCR을 통해 증폭시킨다: 하나의 TNFR-6-비암호화 서열(TNFR-6 단편 1)을 5'말단상의 HindIII 및 3'말단상의 Xba 부위를 이용하여 증폭시키고: 다른 TNFR-6-비암호화 서열(TNFR-6 단편 2)을 3'말단상의 BamHI 및 3'말단상의 HindIII 부위를 이용하여 증폭시킨다. CMV 프로모터 및 TNFR-6 단편을 적당한 효소(CMV 프로모터: XbaI 및BamHI; TNFR-6 단편 1: XbaI; TNFR-6 단편 2: BamHI)로 분해하고, 서로 연결시킨다. 수득된 연결 생성물을 HindIII로 분해하고, HindIII-분해된 pUC18 플라스미드로 연결시킨다.
플라스미드 DNA를 전극 간극이 0.4cm인 멸균 큐벳(Bio-Rad)에 가한다. 최종 DNA농도는 일반적으로 120㎍/ml 이상이다. 이어서, 세포 현탁액 0.5ml(약 1.5 X 106개의 세포를 포함)을 상기 큐벳에 가하고, 당해 세포 현탁액 및 DNA 용액을 부드럽게 혼합한다. 전기천공을 Gene-Pulser 장치(BioRad)를 사용하여 수행한다. 정전용량 및 전압은 각각 960μF 및 250 내지 300V이다. 전압이 증가하면, 세포 생존이 감소하지만, 도입된 DNA가 세포의 게놈내로 안정하게 삽입된 생존 세포%는 급격하게 증가한다. 이러한 파라미터가 주어지는 경우, 약 14 내지 20mSec의 펄스 시간 동안 관찰하여야 한다.
전기천공된 세포를 실온에서 약 5분간 유지하고, 이어서 큐벳의 내용물을 멸균 전달 피펫으로 서서히 제거한다. 당해 세포를 10cm 디쉬에서 미리 가온시킨 영양 배지(15% 송아지 혈청을 포함하는 DMEM) 10ml에 직접 가하고, 37℃에서 항온처리한다. 다음날, 당해 배지를 흡기시키고, 10ml의 신선한 배지로 교체한 후, 16 내지 24시간 동안 추가로 항온처리한다.
이어서, 유전자조작된 섬유아세포를 단독으로 숙주 속으로 주사하거나, 사이토덱스(cytodex) 3 미세담체 비이드상에서 컨플루언스(confluence) 상태로 성장시킨 후 숙주 속에 주사한다. 이로써, 당해 섬유아세포는 단백질 생성물을 생산한다. 이 후, 당해 섬유아세포는 상기한 바와 같이 환자에게 도입될 수 있다.
실시예 6
마우스에서 이식편-대-숙주 질환 치료에 있어서 TNFR의 효과
본 발명은 본 발명의 TNFR 폴리펩타이드 또는 TNFR 효능제를 환자(바람직하게는, 사람)에 투여함을 포함하여, 환자에서 난치성/중증 급성 GVHD를 치료하는 방법을 포함한다.
이식편-대-숙주 질환(GVHD) 치료를 위한 본 발명의 가용성 TNFR 폴리펩타이드(예를 들면, TNFR-6)의 용도 분석은 C57BL/6 부모에서 (BALB/c X C57BL/6) F1 마우스 모델을 사용하여 수행한다. 상기 부모에서 F1 마우스 모델(parent to F1 mouse model)은 잘-특성화되어져 있으며 골수 이식 환자에서 GVHD의 재현가능한 동물 모델로서, 이는 당해 분야의 통상적인 숙련자에게 숙지되어져 있다[참조: 예를 들면, Gleichemann et al., Immunol Today 5:324, 1984, 이는 본원에 전체적으로 참조 문헌으로 도입된다]. 가용성 TNFR은 FasL에 결합하여 FasL-매개된 어팝토시스를 억제하는 것으로 예견되며, 이때, 어팝토시스는 상기 GVHD 동물 모델에서 관찰되는 간, 피부 및 림프계 기관 손상에서 결정적인 병인성 역할을 수행한다[Baker et al., J. Exp. Med. 183: 2645, (1996); Charles et al., J. Immunol. 157:5387, (1996); and Hattori et al. Blood 91:4051, (1998), 각각은 본원에 전체적으로 참조 문헌으로 도입된다].
GVHD 병증의 개시는 C57BL/6 마우스로부터의 약 1 내지 3 x 108비장 세포를 (BALB/c X C57BL/6) F1 마우스(이 둘 모두는 제조원: Jackson Lab, Bar Harbor, Maine으로부터 유용하다)내로 정맥내 주사함으로써 유도한다. 6 내지 8마리 마우스 그룹에 비장 세포 주사 후 2일 마다 복막내 또는 내피내로 TNFR 또는 사람 IgG 동종형 대조군 0.1 내지 5.0㎎/㎏을 공급한다. 간 손상의 지표인 혈청 중 간 효소 방출에서 TNFR의 효과는 3주 이상 동안 주 당 2회씩 분석한다. 사람 IgG-처리된 마우스에서 유의한 양의 간 효소가 검출되는 경우, 상기 동물들을 희생시켜 간, 비장, 피부 및 소장에서 조직 손상에 대한 상대적인 정도를 조직학적으로 평가하고, 치료학적 효과에 대해서는 상기 기관들에서 확인한다.
난치성/중증 급성 GVHD와 관련된 증상을 개선시키는 TNFR의 능력은 대조군과 비교하여, 혈청에서의 간 효소 방출, 조직 손상의 감소 및/또는 감소된 악액질, 체중 손실 및/또는 치사도의 감소로 나타난다.
최종적으로, TNFR- 및 사람 IgG-처리된 동물은 악액질, 체중 및 치사도를 평가하기 위해서 2일 마다 임상적 평가를 실시한다.
TNF-α 억제제와 혼용 치료에서 TNFR은 또한 상기 GVHD 쥐 모델에서 평가한다.
실시예 7
TNFR-6α(DcR3)는 AIM-II-매개된 어팝토시스를 억제한다
배경 기술
종양 괴사 인자(TNF) 패밀리의 구성원들은 세포 증식의 조절, 분화, 세포 생존, 세포 사멸, 사이토킨 생성, 임파구 공-자극, 면역글로불린 분비 및 동종형 스위칭(isotype switching) 같은 다양한 생물학적 활성을 조절하는데 관여한다 [Armitage, R., Curr. Opin. Immunol. 6, 407-413 (1994); Tewari, M. et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 6, 39-44 (1996)]. 상기 패밀리에서 수용체들은 약 30 내지 40개 아미노산의 다수의 시스테인-풍부 반복체로 이루어진 외부 도메인에서 공통적인 구조적 모티프를 공유한다[Gruss, H.-H., et al., Blood 85, 3378-3404 (1995)]. TNFR1, CD95/Fas/APO-1, DR3/TRAMP/APO-3, DR4/TRAIL-R1/APO-2, DR5/TRAIL-R2 및 DR6 수용체는 어팝토시스성 신호 전달 경로의 활성화와 관련된, 사멸 도메인으로 불리는 30 내지 40개 아미노산의 보존된 세포내 모티프를 함유하는 반면, 세포내 도메인에서 보다 낮은 서열 동일성을 함유하는 다른 구성원들은 전사 인자 NF-κB 및 AP-1을 촉진시킨다[Armitage, R., Curr. Opin. Immunol. 6, 407-413 (1994); Tewari, M. et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 6, 39-44 (1996); Gruss, H.-J. et al., Blood 85, 3378-3404 (1995)].
대부분의 TNF 수용체는 기능적인 세포질성 도메인을 함유하며 이들은 TNFR1[Loetscher, H. et al., Cell 61, 351-356 (1990); Schall, T.J., et al., Cell 61, 361-370 (1990)], TNFR2[Smith, C.A., et al., Science 248, 1019-1023 (1990)], 림프구독소 β수용체(LTβR)[Baens, M., et al., Genomics 16, 214-218 (1993)], 4-1BB[Kwon, B.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1963-1967(1989)], HVEM/TR2/ATAR[Kwon, B.S., et al., J. Biol. Chem. 272, 14272-14276 (1997); Montgomery, R.I., et al., Cell 87, 427-436 (1996); Hsu, H., et al., J. Biol. Chem. 272, 13471-13474 (1997)], NGFR[Johnson, D., et al., Cell 47, 545-554 (1986)], CD27[Van Lier, R.A., et al., J. Immunol. 139, 1589-1596 (1987)], CD30[Durkorp, H., et al., Cell 68, 421-427 (1992)], CD40[Banchereau, J., et al., Cell 68, 421-427 (1994)], OX40[Mallett, S., et al., EMBO J. 9, 1063-1068 (1990)], Fas[Itoh, N., et al., Cell 66, 233-243 (1991)], DR3/TRAMP[Chinnaiyan, A.M., et al., Science 274, 990-992 (1996)], DR4/TRAIL-R1[Pan, G., et al., Science 276, 111-113 (1996)], DR5/TRAIL-R2[Pan, D., et al., Science 277, 815-818 (1997)], 및 RANK[Anderson, D., et al., Nature 390, 175-179 (1997)]를 포함한다. TNFR 슈퍼패밀리의 일부 구성원들은 세포질성 도메인을 갖지 않으며, 오스테오프로테게린(osteoprotegerin, OPG)[Simmonet, et al., Cell 89, 309-319 (1997)] 같이 분비되거나, TRID/DcR1/TRAIL-R3[Degli-Esposti, M.A., et al., J. Exp. Med. 186, 1165-1170 (1997); Sheridan, J.P., et al., Science 277, 818-821 (1997)] 같이 당인지질 꼬리를 통해서 막에 결합된다. SFV-T2[Smith, C.A., et al., Science 248, 1019-1023 (1990)], Va53[Howard, S.T., et al., Virology 180, 633-647 (1991)], G4RG[Hu, F.Q., et al., Virology 204, 343-356 (1994)], 및 crmB[Gruss, H.-J., et al., Blood 85, 3378-3404 (1995)] 같은 가용성 TNFR을 암호화하는 바이러스성 개방 판독 프레임이 또한 확인되었다.
발현된 서열 태그(EST) 데이터베이스를 검색함으로써, TNFR 슈퍼패밀리의 신규한 구성원을 확인하였으며, TNFR-6α로 명명하고, AIM-II 및 FasL/CD95L에 대한 가용성 동계 리간드로서 특성화하였다. AIM-II 및 FasL은 어팝토시스를 매개하며, 이때, 어팝토시스는 세포 사멸의 가장 일반적인 생리학적 형태이며 배 발생, 조직 재형성, 면역 조절 및 종양 퇴화 동안 일어난다.
AIM-II는 활성화된 T 임파구 및 대식세포에서 주로 유도된다. AIM-II는 HVEM/TR2 및 LTβR에 대한 세포성 리간드로서 특성화되었다[Mauri, D.N., et al., Immunity 8, 21-30 (1998)]. HVEM/TR2는 사람 T 림프아세포내로의 I형 단순포진 바이러스(HSV-I) 도입을 위한 수용체이다. HVEM/TR2-Fc의 가용성 형태 및 HVEM/TR2에 대한 항체는 혼합된 임파구 반응을 억제하는 것으로 나타나며, 이는 T 임파수 증식에서 상기 수용체 또는 이의 리간드의 역할을 제시한다[Kwon, B., et al., J. Biol. Chem. 272, 14272-14276 (1997); Mauri, D.N., et al., Immunity, 21-30 (1998); Harrop, J.A., et al., J. Immunol. 161, 1786-1794 (1998)]. LTβR 발현 수준은 상피 세포에서 현저하며, T 및 B 임파구에서는 발현되지 않는다. LTβR을 통한 신호 전달은 일부 선암종에서 세포 사멸을 촉진시킨다[Browning, J.L., et al., J. Exp. Med. 183, 867-878 (1996)]. 활성화된 임파구에 의해 생산된 AIM-II는 단지 HVEM/TR2 만을 발현하는 조혈 세포로부터 면역 조절을 불러일으키고, 종양 세포의 어팝토시스를 유도할 수 있으며, 이때 종양 세포는 LTβR 및 HVEM/TR2 수용체 모두를 발현한다[Zhai, Y., et al., J. Clin. Invest. 102, 1142-1151 (1998); Harrop, J. A., et al., J. Biol. Chem. 273, 27548-27556 (1998)].
FasL은 세포독성 T 임파구 및 천연 킬러 세포의 주요 이펙터(effector) 중 하나이다. 이는 또한 말초 관용의 확립, 임파구의 활성화-유도된 세포 사멸에 관여한다. 또한, 비임파구성 및 종양 세포에서의 FasL 발현은 Fas-감수성 임파구의 침투를 예방함으로써 조직의 면역 특권의 유지에 기여한다[Nagata, S., Cell 88, 355-365 (1997)]. FasL은 또한 가공되어 사람 세포의 표면으로부터 분비된다[Schneider, P., et al., J. Exp. Med. 187, 1205-1213 (1998)].
이제, 본 발명자들은 TNFR 슈퍼패밀리의 신규한 구성원인 TNFR-6α가 AIM-II 및 FasL에 결합한다는 것을 입증하고자 한다. 따라서, TNFR-6α는 AIM-II와 이의 수용체의 상호작용을 차단시킴으로써 AIM-II 유도된 종양 세포 사멸에서 억제제로서 작용할 수 있다.
재료 및 방법
TNFR 슈퍼패밀리의 신규 구성원의 동정 및 클로닝
600개 이상의 상이한 cDNA 라이브러리로부터 수득된 EST cDNA 데이터베이스를 blastn 및 tblastn 알고리즘을 사용하여, TNFR 슈퍼패밀리의 시스테인-풍부 모티프와의 서열 상동성에 때해서 스크리닝한다. 이의 아미노산 서열이 TNFR-II와 유의한 상동성을 나타내는 동일한 개방 판독 프레임을 함유하는 3개의 EST 클론을 사람 정상 전립선 및 췌장암의 cDNA 라이브러리로부터 확인하였다. 온전한 N-말단 신호 펩타이드를 암호화하는 전장 TNFR-6αcDNA 클론을 사람 정상 전립선 라이브러리로부터 수득하였다.
RT-PCR 분석
RT-PCR 분석을 위해서, 전체 RNA를 PMA/이오노마이신 또는 LPS로 자극하기 전 또는 후에 다양한 사람 세포주로부터 Trizol(제조원: GIBCO)을 사용하여 분리한다. RNA를 역전사시켜 cDNA로 전환시키고 PCR에 의해 35회 증폭시킨다. TNFR-6α 단편의 증폭에 사용된 프라이머는 TNFR-6α의 서열에 따른다. β-액틴을 RNA 완전성을 위한 내부 대조군으로서 사용한다. PCR 생성물은 2% 아가로오스 겔 상에서 이동시키고, 에티디움 브로마이드로 염색하여 UV 조명으로 가시화시킨다.
재조합 단백질 생성 및 정제
재조합 TNFR-6α 단백질을 C-말단에서 헥사-히스티딘을 사용하여 생성시킨다. 전체 TNFR-6α 단백질을 암호화하는 TNFR-6α-(His)를 PCR로 증폭시킨다. 정확하게 배향된 클로닝을 위해서, 정방향 프라이머(5'-AGACCCAAGCTTCCTGCTCCA GCAAGGACCATG-3': 서열 25)의 5' 말단상에 HindIII 부위 및 역방향 프라이머(5'-GAGCGGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTCACAGGGAGGAAGCGCTC-3': 서열 26)의 5' 말단상에 BamHI 부위를 생성시킨다. 증폭시킨 단편을 HindIII/BamHI으로 절단하고 포유동물 발현 벡터 pCEP4(제조원: Invitrogen)내로 클로닝시킨다. TNFR-6α-(His)/pCEP4 플라스미드를 HEK 293 EBNA 세포내로 안정하게 형질감염시켜 재조합 TNFR-6α-(His)를 생성시킨다. TNFR-6α-(His)/pCEP4 형질감염된 세포로부터의 혈청 비함유 배양 배지를 Ni-컬럼(제조원: Novagen)을 통해 통과시킨다. 컬럼 용출액을 SDS-PAGE로 분획화시키고 TNFR-6α-(His)를 항-폴리(His)6항체(제조원: Sigma)를 사용하여 웨스턴 블롯 분석으로 검출한다.
HVEM/TR2-Fc, LTβR-Fc 및 Flag-태그된 가용성 AIM-II(가용성(AIM-II) 융합 단백질의 생성은 이전에 기술된 바 있다[Zhai, Y., et al., J. Clin. Invest. 102, 1142-1151 (1998)]. Fc 융합 단백질-함유 상청액을 여과시키고 단백질-G Sepharose 비드 상에 포착시킨다. Flag-태그된 가용성 AIM-II 단백질을 항-Flag mAb 친화도 컬럼을 사용하여 정제한다.
면역침강
TNFR-6α-(His)를 4℃에서 결합 완충액(150mM NaCl, 0.1% NP-40, 0.25% 젤라틴, 50mM HEPES, pH 7.4) 중 TNF 슈퍼패밀리의 다양한 Flag-태그된 리간드 및 항-Flag 아가로오스와 함께 밤새 항온처리한 후, 침전시킨다. 결합된 단백질은 12.5% SDS-PAGE로 분리시키고, HRP-접합된 항-폴리(His)6또는 항-사람 IgG1 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 검출한다.
세포결합분석
세포-결합 검정을 위해서, HEK 293 EBNA 세포를 인산칼슘 방법을 사용하여 pCEP4/전장 AIM-II cDNA 또는 pCEP4 벡터 단독으로 안정하게 형질감염시킨다. 하이그로마이신 B로 선택한 후, 세포를 PBS 중 1mM EDTA로 수거하고 빙상에서 20분동안 TNFR-6α-(His), HVEM/TR2-Fc, 또는 LTβR-Fc로 항온처리한다. Fc-융합 단백질을 검출하기 위해서, 세포를 FITC-접합된 염소 항-사람 IgG로 염색한다. TNFR-6α결합을 검출하기 위해서, 세포를 항-폴리(His)6및 연속적으로 FITC 접합된 염소 항-마우스 IgG로 염색한다. 세포를 FACScan(제조원: Becton Dickinson)으로 분석한다.
세포독성분석
HT29 세포를 사용한 세포독성분석은 문헌[Browning, J.L., et al., J. Exp. Med. 183, 867-878 (1996)]에 기술된 바와 같이 수행한다. 간략하면, 5000개의 HT29 세포를 1% FBS, DMEM을 채운 96-웰 플레이트에 씨딩하고 가용성 AIM-II(10ng/㎖) 및 사람 재조합 인터페론-γ(IFN-γ) 10단위/㎖로 처리한다. TNFR-6α-(His)의 일련의 희석물을 미세역가 웰에 4배수로 부가한다. IFN-γ및 가용성 AIM-II로 처리된 세포를 4일 동안 다양한 양의 TNFR-6α-(His)와 함께 항온처리한 후 배양 마지막 6시간 동안 [3H]티미딘을 부가한다. 세포를 수거하고, 티미딘 도입을 액체 섬광계수기를 사용하여 결정한다.
결과 및 토의
TNFR-6α는 TNFR 슈퍼패밀리의 신규한 구성원이다
TNFR-6α는 EST 데이터베이스를 검색하여 확인하였다. 동일한 개방 판독 프레임을 갖는 3개의 클론을 사람 정상 전립선 및 췌장암의 cDNA 라이브러리로부터 확인하였다. 온전한 N-말단 신호 펩타이드를 암호화하는 전장 TNFR-6αcDNA를 사람 정상 전립선 라이브러리로부터 수득하였다. TNFR-6α의 개방 판독 프레임은 300개 아미노산을 암호화한다. 성숙 TNFR-6α의 N-말단 아미노산 서열을 결정하기 위해서, 헥사-히스티딘 태그된 TNFR-6α를 포유동물 세포 발현 시스템에서 발현시키고 펩타이드 서열분석을 통해 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다. 가공된 성숙한 TNFR-6α-(His)의 N-말단 서열은 30번째 아미노산에서부터 시작되며, 이는 처음 29개 아미노산이 신호 서열을 구성한다는 것을 나타낸다. 따라서, TNFR-6α의 성숙 단백질은 어떠한 트랜스막 영역도 갖지 않는 271개 아미노산으로 구성된다. TNFR-6α에는 하나의 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위(Asn173)가 존재한다. OPG[Simmonet, W. et al., Cell 89, 309-319 (1997)]와 마찬가지로, 예견된 단백질은 가용성 분비 단백질이며 포유동물 세포에서 발현된 재조합 TNFR-6α는 폴리아크릴아미드 겔에서 추정된 바와 같이 약 40kD이다. TNFR-I, TNFR-II, 4-1BB, TR2/HVEM, LTβR, TR1/OPG 및 TNFR-6α의 아미노산 서열의 배열은 잠재적인 시스테인-풍부 모티프의 존재를 예시한다. TNFR-6α는 두 개의 완전하고 두 개의 불완전한 시스테인-풍부 모티프를 함유하며, 이의 아미노산 서열은 TR1/OPG 아미노산 서열과 현저하게 유사하다. TNFR-6α는 OPG 및 TNFR-II와 약 30% 서열 상동성을 공유한다.
mRNA 발현
본 발명자들은 노던 블롯 하이브리드화 기법으로 사람의 다수 조직에서 TNFR-6αmRNA의 발현을 분석하였다. 노던 블롯 분석은 TNFR-6αmRNA가 약 1.3kb의 길이이며 폐 조직 및 선암종 세포주 SW480에서 주로 발현된다는 것을 나타낸다. RT-PCR 분석을 수행하여 다양한 세포주에서 TNFR-6α의 발현 패턴을 결정하였다. TNFR-6α전사체가 조혈 세포주에서 약하게 검출된다. TNFR-6α의 발현은 Jurkat T 백혈병 세포에서 활성화시 유도된다. 흥미롭게도, TNFR-6αmRNA는 내피 세포주 HUVEC에서 높은 수준으로 구성적으로 발현된다.
TNFR-6α에 대한 리간드의 동정
TNFR-6α에 대한 리간드를 동정하기 위해서, 수 개의 TNF 리간드 패밀리 구성원의 Flag-태그된 가용성 단백질을 면역침강법으로 재조합 TNFR-6α-(His) 단백질에 결합하는지를 스크리닝하였다. TNFR-6α-(His)는 시험된 Flag-태그된 가용성 TNF 리간드 구성원의 AIM-II-Flag 및 FasL-Flag에 선택적으로 결합하였다. 이러한 결과는 TNFR-6α가 적어도 두 개의 리간드, AIM-II 및 FasL에 결합한다는 것을 나타낸다. AIM-II는 FasL의 C-말단 수용체-결합 도메인과 유의한 서열 상동성(31%)을 나타내지만, 가용성 AIM-II는 Fas에 결합할 수 없다[Mauri, D.N., et al., Immunity 8, 21-30 (1998); Zhai, Y., et al., J. Clin. Invest. 102, 1142-1151 (1998)]. 이들은 TNFR-6α결합을 위한 유사한 결합 에피토프를 가질 수 있다.
이전에, 문헌[Zhai, Y., et al., J. Clin. Invest. 102, 1142-1151 (1998); Harrop, J.A., et al., J. Biol. Chem. 273, 27548-27556 (1998)]에서는 AIM-II의생물학적 기능 및 HVEM/TR2 및/또는 LTβR에 대한 리간드로서의 이의 가능한 메카니즘을 보고한 바 있다. AIM-II는 활성화된 T 세포에서 발현된다. 혈청 기아 또는 IFN-γ의 부가와 혼용하여, AIM-II는 종양 세포 MDA-MB-231 및 HT29에서 세포 증식을 억제시킨다.
TNFR-6α가 AIM-II의 HVEM/TR2 또는 LTβR과의 상호작용에 대한 억제제로서 작용할 수 있는지를 결정하기 위해서, TNFR-6α-(His)를 AIM-II-HVEM/TR2 상호작용에서 경쟁 억제제로서 사용하였다. AIM-II가 TNFR-6α-(His)의 존재하에서 HVEM/TR2-Fc와 면역침강하는 경우, AIM-II에 대한 HVEM/TR2 결합은 TNFR-6α-(His)에 의해 경쟁적으로 감소되었으나, AIM-II에 대한 TNFR-6α-(His) 결합은 HVEM/TR2-Fc에 의해서 변화하지 않았다. 추가로, 면역침강 분석에서 HVEM/TR2 (6nM) 또는 LTβR(6nM)의 결합은 TNFR-6α-(His) 20nM에 의해서 완전히 억제되었다. 이러한 결과는 TNFR-6α가 HVEM/TR2 및 LTβR을 통한 AIM-II 기능의 강력한 억제제로서 작용할 수 있다는 관찰을 지지한다.
TNFR-6α-(His)의 AIM-II-형질감염된 세포로의 결합
TNFR-6α가 세포 표면에서 발현된 AIM-II에 결합하는지를 결정하기 위해서, 본 발명자들은 AIM-II-형질감염된 HEK 293 EBNA 세포를 사용하여 유동세포계수법으로 결합분석을 수행하였다. AIM-II-형질감염된 HEK 293 EBNA 세포를 HVEM/TR2-Fc 및 LTβR-Fc 뿐만 아니라 TNFR-6α-(His)로 현저하게 염색된다. pCEP4 벡터-형질감염된 HEK 293 세포 상에서 HVEM/TR2 또는 LTβR에 의한 어떠한 결합도 검출되지않았다. 추가로, 대조군 동종형은 AIM-II-형질감염된 HEK 293 EBNA 세포에 결합하지 않으며, 상기 융합 단백질 중 어떠한 것도 벡터-형질감염된 세포에 결합하지 않았으며, 이는 상기 결합의 특이성을 확인시켜 주는 것이다. 이러한 결합은 TNFR-6α가 AIM-II의 가용성 및 막-결합형 모두에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
TNFR-6α는 HT29 세포에서 AIM-II-유도된 세포독성을 억제시킨다
문헌[Browning et al., J. Exp. Med. 183, 867-878 (1996)]은 Fas 활성화는 직장결장 선암종 세포주 HT29에 대해서 신속한 세포 사멸(12 내지 24시간)을 야기하는 반면, LTβR은 어팝토시스를 유도하는데 2 내지 3일이 소요된다는 것을 나타낸다. 문헌[Zhai et al., J. Clin. Invest. 102, 1142-1151 (1998)]은 또한 AIM-II가 LTβR 및 HVEM/TR2 모두를 발현하는 세포의 사멸을 야기하는 반면, LTβR 또는 HVEM/TR2 수용체 중 단지 하나만을 발현하는 세포의 사멸은 야기하지 못한다는 것을 보고한 바 있다. HVEM/TR2 및 LTβR 모두는 HT29 세포의 AIM-II-매개된 사멸에 협동적으로 관여한다[Zhai, Y., et al., J. Clin. Invest. 102, 1142-1151 (1998)].
TNFR-6α의 결합이 AIM-II-매개된 세포독성을 억제하는지를 결정하기 위해서, HT29 세포를 LTβR-Fc 또는 TNFR-6α-(His) 200ng/㎖의 존재하에서 가용성 AIM-II 및 IFN-γ(10U/㎖)와 함께 항온처리하였다. TNFR-6α-(His)는 AIM-II-매개된 세포 사멸을 현저하게 차단하였다. 세포는 또한 다양한 농도의 TNFR-6α-(His)의 존재하에서 가용성 AIM-II 및/또는 IFN-γ와 함께 항온처리하였다. TNFR-6α-(His)는 용량 의존적인 방식으로 가용성 AIM-II-유도된 세포 사멸을 차단하였다. 함께 존재하는 경우, TNFR-6α는 AIM-II-유도된 종양 세포 사멸의 천연 억제제로서 작용하는 것으로 보인다. 상기 데이터는 또한 TNFR-6α가 종양의 면역 회피(immune evasion)에 기여한다는 것을 제시한다.
AIM-II의 HVEM/TR2 및/또는 LTβR과의 상호작용이 T 세포 증식, HVEM-의존적인 HSV1 감염 및 항-종양 활성 같은 독특한 생물학적 사건을 촉진시킬 수 있다[Mauri, D.N., et al., Immunity 8, 21-30 (1998); Zhai, Y., et al,. J. Clin. Invest. 102, 1142-1151 (1998); Harrop, J.A., et al., J. Biol. Chem. 273, 27548-27556 (1998)]. TNFR-6α는 AIM-II 상호작용의 억제제로서 작용할 수 있으며 다양한 세포 유형에서 다양한 역할을 수행할 수 있다. TNFR-6α는 교란 수용체(decoy receptor)로 작용할 수 있으며 느린 및 신속한 종양 세포 사멸 모두에서 면역 회피에 기여할 수 있으며, 이는 AIM-II 및/또는 FasL 매개된 어팝토시스 경로에 의해 매개된다.
또 다른 가능성은 TNFR-6α가 사이토킨으로 작용하여 막-결합된 FasL 또는 AIM-II를 촉진시키고 직접적으로 FasL 또는 AIM-II를 통해서 신호를 변환시킬 수 있다는 것이다. 최근에, 문헌[Desbarats, J., et al., Nature medicine , 1377-1382 (1998); Suzuki, I., et al., J. Exp. Med. 187, 123-128 (1998)]은 FasL이 그 자체로서 신호를 변환시켜 CD4+T 세포에서 세포-주기 억제 및 사포 사멸과 CD8+T 세포에서 세포 증식을 야기할 수 있다는 것을 보고한 바 있다. 따라서, TNFR-6α는 FasL 및 AIM-II를 통한 신호전달에 관여할 수 있다.
HUVEC 세포는 RT-PCR 분석에서 TNFR-6α를 구성적으로 발현한다. AIM-II 및 FasL은 활성화된 T 세포에서 발현되는 것으로 공지되어져 있다. 따라서, TNFR-6α 및 이의 리간드는 활성화된 T 임파구 및 내피세포 사이에서의 상호작용에 중요한 것으로 추측된다. TNFR-6α는 내피세포 생존 뿐만 아니라 활성화된 T 세포 트래픽킹에 관여할 수 있다.
실시예 8
활성화-유도된 어팝토시스 분석
활성화-유도된 어팝토시스는 SupT-13 T 백혈병 세포를 사용하여 분석하고 세포주기 분석에 의해 측정한다. 상기 분석은 하기와 같이 수행한다. SupT-13 세포를 10% FCS를 함유하는 RPMI중에서 로그 성장(약 1 x 106)으로 유지시킨다. Sup-T13 세포를 0.5 x 106/㎖, 1㎖/웰로 24웰 플레이트에 씨딩한다. AIM II 단백질 또는 Fas 리간드 단백질(0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000ng/㎖) 또는 완충액 대조군을 웰에 부가하고 세포를 37℃에서 24시간 동안 본 발명의 TNFR 폴리펩타이드의 존재 또는 부재하에서 배양한다. 또 다른 24웰 플레이트의 웰을 항-CD3 항체의 존재 또는 부재하에서 멸균-여과시킨 0.05M 중탄산 완충액 중 농도 10㎍/㎖로 정제된 BC3 mAb를 항온처리하거나, 또는 0.5㎖/웰로 웰에 완충액 단독을 항온처리하여 준비한다. 상기 플레이트를 4℃에서 밤새 항온처리한다. 항체 피복된 플레이트의 웰을4℃에서 멸균 PBS로 3회 세척한다. 처리된 Sup-T13 세포를 항체 피복된 웰로 옮기고 37℃에서 18시간 동안 항온처리한다. 어팝토시스는 요오드화 프로피듐을 사용하는 세포주기 분석 및 세포 계수법으로 측정한다. 처리된 세포의 증식은 각각 처리 웰 전체 300㎕를 취하여 96웰 플레이트의 3배수의 웰(100㎕/웰)로 전달한다. 각각의 웰에3H-티미딘(0.5μCi/20㎕, 2Ci/mM) 20㎕/웰을 부가하고 37℃에서 18시간 동안 항온처리한다. 수거하여 세포에 의한3H-티미딘 흡수를 계수한다. 이러한 측정법을 사용하여 다른 방법으로 관찰되는 경우 어팝토시스에 대한 효과를 입증할 수 있다. 상기 분석법에 대한 포지티브 대조군은 항-CD3 교차결합 단독, Fas 리간드 단독, 및/또는 AIM-II 단독이 있다. 또한, 상기 세포주에서 항-Fas 모노클로날 항체(가용 형태-IgM mAb 500ng/㎖)를 사용하여 난해하고 재생가능한 어팝토시스를 입증하였다. 상기 분석법에 대한 네가티브 대조군은 배지 또는 완충액 단독이 있다. 또한, 또 다른 항-CD3 mAb(OKT3)와의 교차결합은 효과가 전혀 없는 것으로 나타난다. 본 발명에 따른 TNFR 효능제는 TNFR 효능제의 부재하에서 Sup-T13 세포를 AIM-II 또는 Fas 리간드와 처리하는 것과 비교하여, 감소된 어팝토시스를 나타낼 것이다. 본 발명의 TNFR 길항제는 Fas 리간드 또는 AIM-II 결합 친화도를 갖는 TNFR 폴리펩타이드(예를 들면, 성숙 TNFR)를 시험하고자 하는 TNFR 폴리펩타이드와 혼합하고 이러한 혼합물을 AIM-II 또는 Fas 리간드 및 Sup-T13 세포의 용액중에서 접촉시킴으로써 확인할 수 있다. 상기 분석법에 대한 네가티브 대조군은 성숙 TNFR, Sup-T13 세포, 및 AIM-II 또는 Fas 리간드(FasL) 단독을 함유하는 혼합물이다. 본 발명의 TNFR 길항제를 함유하는 샘플은 네가티브 대조군과 비교하여 증가된 어팝토시스를 나타낼 것이다.
세포주기 분석에 의해 효과가 관찰되는 경우, 세포를 당해 분야의 숙련자게에 숙지된 기술을 사용하여, 유동 세포계수법을 위하여 TUNEL 분석용으로 염색하거나 아넥신 V로 추가로 염색할 수 있다.
실시예 9
TNFR6α-Fc에 의한 Jurkat T 세포의 Fas 리간드 매개된 어팝토시스의 차단
방법
Fas 수용체를 발현하는 Jurkat T-세포를 sFas 리간드 단독 또는 Fas-Fc와 병용하여 sFas 리간드, 또는 TNFR6α-Fc[본원에 기술된 바와 같이, Fc 도메인에 융합된 전장 TNFR6α 단백질(서열 2의 아미노산 1 내지 300개)에 상응함]로 처리한다. 사용되는 sFas 리간드 단백질은 제조원(Alexis Corporation)으로부터 수득하며 이의 N-말단에 FLAG 에피토프 태그를 함유한다. 모노클로날 Flag 에피토프를 사용한 Fas 리간드의 교차결합이 Fas 리간드가 어팝토시스를 매개하는 능력을 현저하게 증강시킨다는 것이 이전에 입증되었기 때문에, Flag 항체는 본 연구에 포함된다. 구체적으로, 106개 Jurkat 세포(RPMI + 5% 혈청)를 Fas 리간드(제조원: Alexix) (20ng/㎖) 및 항-Flag Mab(200ng/㎖)로 처리한 후 37℃에서 16시간 동안 항온처리한다. TFR6α-Fc를 분석에 포함시키는 경우, Fas 리간드 및 항-Flag Mab로 15분 동안 예비항온처리한다.
결과
항온처리 후, 세포를 수거하고, PBS에서 재현탁시키고 유동 세포계수 분석(표 V)한다. Fas 리간드(FasL) 부재시, 약 1%의 세포가 고 아넥신 염색 및 약한 요오드화 프로피듐 염색(표 IV)에 의해 측정한 바와 같이, 어팝토시스되는 것으로 보인다. 가용성 Fas 리간드 단독을 사용한 처리는 Fas-Fc 존재시 차단될 수 있는 것으로 예견되는 바와 같이, 어팝토시스성 세포의 수를 약 7배 증가시킨다. Fas-Fc와 유사하게, TNFR6α-Fc는 또한 로그 3승의 규모 이상의 투여량 의존적인 방식으로 관찰된 TNFR6α-Fc에 의한 차단으로, Fas 매개된 어팝토시스를 차단시킬 수 있다(표 V). TNFR6α-Fc의 Fas 매개된 Jurkat 세포의 사멸을 차단시키는 능력은 세포 사멸 분석으로 또한 결정한다(도 7A 및 7B). 상기 분석에서, 세포를 다시 16시간 동안 Fas 리간드 및 TNFR6α-Fc의 혼합물로 처리한다. 처리 후 생존 세포의 수준을 결정하기 위해서, 세포를 10% ALOMAR 블루와 함께 항온처리하고 OD 570㎚ 내지 630㎚에서 분광측광적으로 시험한다. Fas 리간드 처리는 세포 생존을 50% 감소시킨다(도 7A 및 7B). 세포 생존의 감소는 Fas-Fc 또는 TNFR6α-Fc 중 하나로 극복할 수 있지만, TR5-Fc에 의해서는 극복할 수 없으며(도 7A 및 7B), 이는 TNFR6α의 Fas 리간드 매개된 활성을 방해하는 능력을 확인시켜 주는 것이다. 본 분석에서 Fas 리간드 매개된 활성을 차단하는 100ng/㎖ 및 10ng/㎖에서의 TNFR6α-Fc의 능력은 어떠한 TNFR6α-Fc도 부가되지 않은 경우 보다 통계학적으로 상이하다(p < 0.05)(도 7A 및 7B). 추가로, Fas 리간드 매개된 세포 사멸 및 어팝토시스를 차단하는 TNFR6α-Fc의 능력은 Fas-Fc만으로 효과적인 것으로 보인다(표 V 및 도 7A 및 7B).
Fas 리간드 매개된 어팝토시스의 차단을 나타내는 FACS 분석
106Jurkat 세포(RPMI + 5% 혈청)를 Fas 리간드(제조원: Alexis; 20ng/㎖) 및 항-FLAG(200ng/㎖)로 처리한 후 16시간 동안 37℃에서 항온처리한다. Fc 수용체를 본 분석에서 사용하는 경우, 수용체는 15분 동안 Fas 리간드 및 항-FLAG Mab로 예비항온처리한다. 항온처리 후, 세포를 수거하고, PBS에 재현탁시키고 유동 세포계수분석한다.
처리 어팝토시스되는 세포(%)
대조군(완충액)FasL(20ng)FasL(20ng)+Fas-Fc(100ng)FasL(20ng)+TNFR6α-Fc(100ng)FasL(20ng)+TNFR6α-Fc(10ng)FasL(20ng)+TNFR6α-Fc(1ng)FasL(20ng)+TNFR6α-Fc(0.1ng) 1.248.871.781.242.797.958.58
결론
TNFR6α-Fc는 Fas 리간드 만큼 효과적으로 투여량 의존적인 방식으로 Jurkat 세포의 Fas 리간드 매개된 어팝토시스를 차단하는 것으로 보인다.
실시예 10
TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 단백질 융합
본 발명의 TNFR6α 및/또는 TNFR6β폴리펩타이드는 임의로 다른 단백질에 융합된다. 이러한 융합 단백질은 다양한 적용에 사용할 수 있다. 예를 들면, TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리펩타이드의 His-태그, HA-태그, 단백질 A, IgG 도메인, 및말토오스 결합 단백질에 대한 융합은 정제를 촉진시킨다[참조: EP A 제394,827호; Traunecker, et al., Nature 331:84-86 (1998)]. 유사하게 IgG-1, IgG-3, 및 알부민에 대한 융합은 생체내에서 반감기를 증가시킨다. TNFR6α 및/또는 TNFR6β폴리펩타이드에 융합된 핵 국부화 신호는 상기 단백질을 특정 세포내 위치로 표적화시킬 수 있는 반면, 공유결합성 이종이량체 또는 동종이량체는 융합 단백질의 활성을 증가시키거나 감소시킨다. 융합 단백질은 또한 하나 이상의 기능을 갖는 키메라 분자를 생성시킬 수 있다. 최종적으로, 융합 단백질은 비-융합된 단백질과 비교하여 융합 단백질의 용해도 및/또는 안정성을 증가시킬 수 있다. 상기된 모든 유형의 융합 단백질은 폴리펩타이드를 IgG 분자에 융합시키는 것을 약술하는, 하기 프로토콜을 사용하거나 이를 변형시킴으로써 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
간략하면, IgG 분자의 사람 Fc 부분은 하기되는 서열의 5' 및 3' 말단을 포함하는 프라이머를 사용하여, PCR 증폭시킬 수 있다. 이러한 프라이머는 또한 발현 벡터, 바람직하게는 포유동물 발현 벡터내로의 클로닝을 촉진시킬 수 있는 편리한 제한효소 부위를 함유한다.
예를 들면, pC4(승인 번호 209646) 발현 벡터를 사용하는 경우, 사람 Fc 부분을 BamHI 클로닝 부위에 결합시킬 수 있다. 3' BamHI 부위는 파괴되어야 한다는 것을 주의해야 한다. 다음으로, 사람 Fc 부분을 함유하는 상기 벡터를 BamHI으로 다시 절단하여 벡터를 선형화시키고, 실시예 1에서 기술된 PCR 프로토콜에 의해 분리시킨 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리뉴클레오타이드를 상기 BamHI 부위에 결합시킨다. 폴리뉴클레오타이드를 종결 코돈 없이 클로닝시킨다는 것을 주의해야 하며, 그렇지 않을 경우 융합 단백질은 생성되지 않을 것이다.
천연 신호 서열을 사용하여 분비 단백질을 생성시키는 경우, pC4는 제2 신호 펩타이드를 필요로 하지 않는다. 대안으로, 천연 신호 서열을 사용하지 않는 경우, 벡터는 이종성 신호 서열을 포함하도록 변형시킬 수 있다[참조: 예를 들면, 국제 출원 제WO 96/34891호].
사람 IgG Fc 영역:
GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAACACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT(서열 27).
실시예 11
항체 생산
a) 하이브리도마 기술
본 발명의 항체는 다양한 방법으로 제조할 수 있다[참조: Current Protocols, 2장]. 상기 방법의 한 가지 예로서, TR6α 및/또는 TR6β를 발현하는 세포를 동물에 투여하여 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청 생산을 유도한다. 바람직한 방법에서, TR6α 및/또는 TR6β 단백질의 제조가 바람직하며 실질적으로 천연 오염물을 비함유하도록 정제한다. 이후, 상기 제조물을 동물에 도입하여 보다 특이적인 활성의 폴리클로날 항혈청을 생산하게 한다.
단백질 TR6α 및/또는 TR6β에 특이적인 모노클로날 항체는 하이브리도마 기술을 사용하여 제조한다[Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immnol. 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981)]. 일반적으로, 동물(바람직하게는, 마우스)을 TR6α 및/또는 TR6β 폴리펩타이드, 또는 보다 바람직하게는, 분비된 TR6α 및/또는 TR6β 발현 세포로 면역화시킨다. 상기 폴리펩타이드-발현 세포를 임의의 적합한 조직 배양 배지, 바람직하게는 10% 태 소 혈청(약 56℃에서 불활성화시킴), 비필수 아미노산 약 10g/ℓ, 및 스트렙토마이신 약 100㎍/㎖로 보충된 얼스 변형된 이글스 배지(Earle's modified Eagle's medium)중에 배양한다.
상기 마우스의 비장 세포를 추출하고 적합한 골수종 세포주로 융합시킨다. 임의의 적합한 골수종 세포주를 본 발명에 따라서 사용할 수 있다. 그러나, ATCC로부터 유용한, 모 골수종 세포주(SP20)을 사용하는 것이 바람직하다. 융합 후,생성되는 하이브리도마 세포를 HAT 배지에서 선택적으로 유지시킨 후, 문헌[Wands et al., Gastroenterology 80: 225-232 (1981)]에 기술된 바와 같이 제한 희석시켜 클로닝한다. 상기 선택을 통해서 수득된 하이브리도마 세포를 분석하여 TR6α 및/또는 TR6β 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 항체를 분비하는 클론을 동정한다.
대안으로, TR6α 및/또는 TR6β 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 부가적인 항체를 항-이디오타입 항체를 사용하여 2-단계 공정으로 생산할 수 있다. 상기 방법은 항체 그 자체가 항원이 될 수 있고 따라서, 제2 항체에 결합하는 항체를 수득할 수 있다는 사실을 이용한다. 본 방법에 따라서, 단백질 특이적 항체를 사용하여 동물, 바람직하게는 마우스를 면역화시킨다. 이후, 상기 동물의 비장 세포를 하이브리도마 세포를 생산하는데 사용하고, 상기 하이브리도마 세포를 스크리닝하여, TR6α 및/또는 TR6β 단백질-특이적인 항체에 결합하는 이의 능력이 TR6α 및/또는 TR6β에 의해 차단될 수 있는 항체를 생산하는 클론을 동정한다. 상기 항체는 TR6α 및/또는 TR6β 단백질-특이적인 항체에 대한 항-이디오타입 항체를 포함하며 이를 사용하여 동물을 면역화시켜 추가적인 TR6α 및/또는 TR6β 단백질-특이적인 항체를 형성하도록 유도한다.
사람에서 항체의 생체내 사용에 있어서, 항체는 "사람화"된다. 상기 항체는 상기된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 유래된 유전자 작제물을 사용하여 생성시킬 수 있다. 키메라 및 사람화된 항체를 생산하는 방법은 당해 분야에 공지되어져 있으며 이하에서 논의된다[개괄을 위해서는 참조: Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly etal., 미국 특허 제4,816,567호; Tanuguchi et al., 유럽 특허 제171496호; Morrison et al., 유럽 특허 제173494호; Neuberger et al., WO 제8601533호; Robinson et al., WO 제8702671호; Boulianne et al., Nature 312;643 (1984); Neuberger et al., Nature 314:268 (1985)].
b) scFv의 라이브러리로부터 TR6α 및/또는 TR6β에 대해서 지시된 항체 단편의 분리
사람 PBL로부터 분리된 천연 V-유전자를, 공여자가 노출되거나 노출되지 않을 수 있는 TR6α 및/또는 TR6β에 대해서 반응성을 함유하는 항체 단편의 라이브러리내로 작제한다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,885,793호, 이는 전체적으로 본원에 참조 문헌으로 도입된다].
라이브러리 수득. scFv의 라이브러리를 문헌[PCT 공보 제WO 92/01047호]에 기술된 바와 같이 사람 PBL의 RNA로부터 작제한다. 항체 단편을 나타내는 파아지를 수득하기 위해서, 파아지미드를 갖는 약 109개의 이. 콜라이를 1% 글루코오스 및 암피실린 100㎍/㎖를 함유하는 2xTY(2xTY-AMP-GLU) 50㎖에 접종하고 진탕과 함께 O.D. 0.8까지 성장시킨다. 상기 배양물 5㎖를 (2xTY-AMP-GLU) 50㎖를 접종하는데 사용하고, 델타 유전자 3 헬퍼[M13 델타 유전자 III, 참조 PCT 공보 WO 제92/01047호] 2x 108 TU를 부가하고 37℃에서 45분 동안 배양하고 진탕과 함께 37℃에서 45분 동안 배양한다. 상기 배양물을 10분 동안 4000rpm에서 원심분리시키고, 펠렛을 암피실린 100㎍/㎖ 및 카나마이신 50㎍/㎖를 함유하는 2xTY 2ℓ에 재현탁시키고 밤새 성장시킨다. 파아지를 문헌[PCT 공보 WO 제92/01047호]에 기술된 바와 같이 제조한다.
M13 델타 유전자 III은 하기와 같이 제조한다: M13 델타 유전자 III 헬퍼 파아지는 유전자 III 단백질을 암호화하지 않으며, 따라서 항체 단편을 나타내는 파아지(미드)는 항원에 결합하는 보다 큰 친화도를 갖는다. 감염성 M13 델타 유전자 III 입자는 파아지 형태형성 동안 야생형 유전자 III 단백질을 제공하는 pUC19 유도체를 갖는 세포에서 헬퍼 파아지를 성장시킴으로써 제조한다. 상기 배양물을 37℃에서 진탕없이 1시간 동안 배양한 후 추가로 진탕과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 세포를 원심분리로 침전시키고(IEC-Centra 8, 400rpm, 10분), 암피실린 100㎍/㎖ 및 카나마이신 25㎍/㎖를 함유하는 2xTY 육즙(2xTY-AMP-KAN) 300㎖에 재현탁시키고, 37℃에서 진탕과 함께 밤새 성장시킨다. 파아지 입자를 배양 배지로부터 정제하고 2회의 PEG 침전[Sambrook et al., 1990]시켜, PBS 2㎖에 재현탁시키고, 0.45㎛ 필터(제조원: Minisart NML; Sartorius)를 통해 통과시켜 최종 농도 약 1013 형질전환 단위/㎖(암피실린-내성 클론)를 수득한다.
라이브러리 검색. 면역튜브(제조원: Nunc)를 본 발명에 따른 폴리펩타이드 100㎍/㎖ 또는 10㎍/㎖의 4㎖로 PBS 중에서 밤새 피복시킨다. 상기 튜브를 37℃에서 2시간 동안 2% Marvel-PBS로 차단한 후 PBS로 3회 세척한다. 약 1013 TU의 파아지를 상기 튜브에 적용시키고 30분 동안 실온에서 회전대 아래 위로 뒤집으면서 항온처리하고 다시 1.5시간 동안 정치시킨다. 튜브를 PBS + 0.1% 트윈-20으로 10회 및 PBS로 10회 세척한다. 파아지를 100mM 트리에틸아민 1㎖를 부가하여 용출시키고 회전대 위 아래로 15분 동안 회전시킨 후, 상기 용액을 즉시 1.0M 트리스-HCl, pH 7.4로 중화시킨다. 이후, 파아지를 사용하여 37℃에서 30분 동안 용출된 파아지와 세균을 함께 배양함으로써 중간-로그 단계의 이. 콜라이 10㎖를 감염시킨다. 상기 이. 콜라이를 1% 글루코오스 및 암피실린 100㎍/㎖를 함유하는 TYE 플레이트 상에 플레이팅한다. 이후, 생성되는 세균 라이브러리를 상기된 바와 같은 델타 유전자 3 헬퍼 파아지로 수득하여 2차 선택을 위한 파아지를 제조한다. 상기 공정은 튜브-세척과 함께 전체 4회의 친화도 정제를 20회, 즉 PBS + 0.1% 트윈-20으로 20회 및 3회 및 4회에 있어서, PBS로 20회까지 증가시켜 반복한다.
결합제의 특성화. 선택의 3회 및 4회로부터 용출된 파아지를 사용하여 이. 콜라이 HB2151을 감염시키고 가용성 scFv를 분석을 위해서 단일 클론으로부터 생성시킨다[Marks, et al., 1991]. ELISA는 50mM 중탄산염, pH 9.6 중 본 발명의 폴리펩타이드 10pg/㎖으로 피복시킨 미세역가 플레이트를 사용하여 수행한다. ELISA에서 포지티브한 클론을 추가로 PCR 핑거프린팅[참조: 예를 들면, PCT 공보 WO 제92/01047호] 및 이후 서열분석으로 특성화한다.
실시예 12
TNFR6α 및/또는 TNFR6β 유전자에서 변형을 결정하는 방법
RNA를 관심의 대상(예를 들면, 질환)인 표현형을 나타내는 패밀리 전체 또는 개별적인 환자로부터 분리한다. cDNA를 상기 RNA로부터 당해 분야에 공지된 프로토콜[참조: Sambrook]을 사용하여 생성시킨다. 이후, cDNA를 PCR을 위한 주형으로사용하며, 서열 1의 관심 영역 주변의 프라이머를 사용한다. 제시된 PCR 조건은 문헌[Sidransky, D., et al., Science 252:706 (1991)]에 기술된 완충액을 사용하여, 95℃에서 30초; 52 내지 58℃에서 60 내지 120초; 및 70℃에서 60 내지 120초의 35회 주기로 이루어진다.
이후, PCR 생성물을, SequiTherm 폴리머라제[제조원: Epicuentre Technologies]를 사용하여, T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 5' 말단을 표지한 프라이머를 사용하여 서열 분석한다. TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 분비된 엑손의 인트론-엑손 경계 영역을 또한 결정하고 게놈성 PCR 생성물을 분석하여 상기 결과를 확인한다. 이후, TNFR6α 및/또는 TNFR6β에서 추측되는 돌연변이를 갖는 PCR 생성물을 클로닝하고 직접적인 서열 분석의 결과를 입증한다.
TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 PCR 생성물을 문헌[Holton, T.A. and Graham, M.W., Nucleic Acids Research, 19:1156 (1991)]에 기술된 바와 같이 T-꼬리 벡터내로 클로닝하고 T7 폴리머라제(제조원: United States Biochemica)를 사용하여 서열 분석한다. 질병에 걸린 개체를 질병에 걸리지 않은 개체에서 존재하지 않는 TNFR6α 및/또는 TNFR6β내의 돌연변이로 동정한다.
게놈성 재배열이 또한 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 유전자에서의 변형을 결정하는 방법으로써 관찰된다. 당해 분야의 공지된 기술을 사용하여 분리된 게놈성 클론을 디곡시게닌데옥시-유리딘 5'-트리포스페이트(제조원: Boehringer Manheim)를 사용하여 닉-해독시키고, 문헌[Johnson, et al., Methods Cell Biol. 35:73-99 (1991)]에 기술된 바와 같이 FISH를 수행한다. 표지된 프로브를 사용한 하이브리드화는 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 게놈성 좌위와 특이적으로 하이브리드를 형성하는 매우 과량의 사람 cot-1 DNA를 사용하여 수행한다.
염색체를 4,6-디아미노-2-페닐리돌 및 요오드화 프로피움으로 카운터 염색하여 C- 및 R-밴드를 혼합 생성시킨다. 정확한 맵핑을 위해 정렬된 이미지를 트리플-밴드 필터 세트(triple-band filter set, 제조원: Chroma Technology, Brattleboro, VT)를 냉각시킨 전하-커플링된 장치 카메라(제조원: Photometrics, Tucson, AZ) 및 다양한 여기 파장 필터와 병용하여 수득한다[Johnson, et al., Genet. Anal. Tech. Appl., 8:75 (1991)]. 영상 수집, 분석 및 염색체 단편 길이 측정을 ISee 그래피칼 프로그램 시스템(ISee Graphical Program System, 제조원: Inovision Corporation, Durham, NC.)을 사용하여 수행한다. TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 게놈성 영역의 염색체 변형(프로브로 하이브리드화됨)은 삽입, 결실, 및 전위로서 확인된다. 이러한 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 변형은 관련 질환의 진단 마커로서 사용한다.
실시예 13
생물학적 샘플에서의 TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 비정상적인 수준을 검출하는 방법
TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리펩타이드는 생물학적 샘플에서 검출할 수 있으며, TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 증가된 또는 감소된 수준이 검출되는 경우, 이러한 폴리펩타이드는 특정 표현형의 마커이다. 검출 방법은 매우 다양하며, 따라서, 당해 분야의 숙련자는 특정 필요에 부합하도록 하기 분석법을 변형시킬 수 있을 것으로 이해된다.
예를 들면, 항체-샌드위치 ELISA를 사용하여 샘플, 바람직하게는 생물학적 샘플 중 TNFR6α 및/또는 TNFR6β를 검출한다. 미세역가 플레이트의 웰을 최종 농도 0.2 내지 10㎍/㎖로 TNFR6α 및/또는 TNFR6β에 특이적인 항체로 피복한다. 항체는 모노클로날이거나 폴리클로날이고 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 생성시킨다. 상기 웰을 차단하여 웰에 TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 비-특이적인 결합을 감소시킨다.
이후, 피복된 웰을 2시간 이상 동안 RT에서 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 함유 샘플과 항온처리한다. 바람직하게는, 상기 샘플의 일련의 희석물을 사용하여 결과를 입증해야만 한다. 이후, 상기 플레이트를 탈염수 또는 증류수로 3회 세척하여 비결합된 TNFR6α 및/또는 TNFR6β를 제거한다.
다음으로, 25 내지 400ng의 농도로 특이적인 항체-알칼리 포스파타제 접합체 50㎕를 부가하고 실온에서 2시간 동안 항온처리한다. 상기 플레이트를 다시 탈염수 또는 증류수로 3회 세척하여 비결합된 접합체를 제거한다.
3-메틸움벨리페릴 포스페이트(MUP) 또는 p-니트로페닐 포스페이트(NPP) 기질 용액 75㎕를 각각의 웰에 부가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하여 기질이 절단되어 형광을 발하게 한다. 상기 형광을 미세역가 플레이트 판독기로 측정한다. 표준 커브를 대조군 샘플의 일련의 희석물로부터의 실험적인 결과를 사용하여 준비하고, 샘플 농도를 X-축(로그 규모) 및 Y-축상에 형광 또는 흡광도(선형 규모)를 플롯팅한다. 이후, 샘플 중 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리펩타이드 농도를 상기샘플의 측정된 형광에 기초한 표준 커브를 사용하여 내삽한다.
실시예 14
TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 감소된 수준을 치료하는 방법
본 발명은 환자에게 치료학적 유효량의 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 길항제를 포함하는 조성물을 투여함을 포함하여, 체내에서 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 생물학적 활성 수준의 감소를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 길항제는 TNFR6α 및/또는 TNFR6β-특이적인 항체이다.
또한, 환자에서 TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 표준 또는 정상 발현 수준의 감소로 인해 야기되는 질환은 TNFR6α 및/또는 TNFR6β를, 바람직하게는 가용성 및/또는 분비성 형태로 투여함으로써 치료할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 환자에서 TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 생물학적 활성 수준을 증가시키기 위한 TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 양을 포함하는 약제학적 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여, TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리펩타이드의 수준을 증가시킬 필요가 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
예를 들면, TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리펩타이드의 수준이 감소된 환자에게 연속적으로 6일 동안 폴리펩타이드 1일 투여량 0.1 내지 100㎍/㎏을 제공한다. 바람직하게는, 상기 폴리펩타이드는 가용성 및/또는 분비 형태이다.
실시예 15
TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 증가된 수준을 치료하는 방법
본 발명은 또한 치료학적 유효량의 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 또는 이의 효능제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여, 체내에서 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 생물학적 활성 수준의 증가를 필요로하는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
안티센스 기술을 사용하여 TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 생산을 억제시킨다. 상기 기술은 암 같은 다양한 병인으로 인해, 바람직하게는 가용성 및/또는 분비된 형태의 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리펩타이드의 수준을 감소시키는 방법의 한 가지 예이다.
예를 들면, TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 수준이 비정상적으로 증가된 것으로 진단된 환자에게 21일 동안 1일에 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 및 3.0㎎/㎏으로 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 정맥내 투여한다. 이러한 치료법은 내성이 우수한 것으로 결정되는 경우, 7일의 휴식기 이후에 반복한다.
실시예 16
유전자 치료를 사용한 치료 방법-생체 외
유전자 치료의 한 가지 방법은 가용성 및/또는 성숙 TNFR6α 및/또는 TNFR6β를 발현할 수 있는 섬유아세포를 환자에게 이식하는 것이다. 일반적으로, 섬유아세포는 피부 생검에 의해 환자로부터 수득한다. 수득한 조직을 조직-배양-배지에 위치시키고 작은 조각으로 분리시킨다. 작은 덩어리의 조직을 조직 배양 플라스크의 습윤한 표면에 위치시키고, 약 10개의 조각을 각각의 위치에 위치시킨다. 상기 플라스크를 아래 위로 뒤집고, 단단히 밀봉시키고, 실온에서 밤새 정치시킨다. 실온에서 24시간 후, 플라스크를 뒤집으면, 조직 덩어리는 플라스크의 바닥에 고정되어 유지되며 신선한 배지(예를 들면, 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신 으로 보충된 Ham's F12 배지)를 부가한다. 이후, 플라스크를 약 1주일 동안 37℃에서 항온처리한다.
이때, 신선한 배지를 부가하고, 후속적으로 수일 마다 교체한다. 부가적으로 2주 동안 배양한 후에, 섬유아세포의 단층이 나타난다. 상기 단층을 트립신처리하고 보다 큰 플라스크로 옮긴다.
몰로니 쥐 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 플랭킹하는 pMV7[Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7:219-25 (1988)]을 EcoRI 및 HindIII로 절단하고 후속적으로 소 내장 포스파타제로 처리한다. 선형 벡터를 아가로오스 겔 상에서 분획화시키고 글래스 비드를 사용하여 정제한다.
TNFR6α 및/또는 TNFR6β를 암호화하는 cDNA를 각각 5' 및 3' 말단 암호화 서열과 상응하는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 바람직하게는, 5' 프라이머는 EcoRI 부위를 함유하며, 3' 프라이머는 HindIII 부위를 함유한다. T4 DNA 리가제의 존재하에, 등량의 몰로니 쥐 육종 바이러스 선형 골격 및 증폭된 EcoRI 및 HindIII 단편을 함께 부가한다. 생성되는 혼합물을 두 개의 단편의 결합에 적합한 조건하에서 유지시킨다. 이후, 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜라이HB101을 형질전환시키며, 이후, 이를 적합하게 삽입된 TNFR6α 및/또는 TNFR6β를 함유하는 벡터를 확인하기 위한 목적으로 카나마이신을 함유하는 아가상에 플레이팅한다.
양쪽성 pA317 또는 GP+am 12 패키징 세포를 10% 송아지 혈청(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된 둘비코스 변형된 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagles Medium, DMEM)중에서 조직 배양에서 컨플루언스 밀도까지 성장시킨다. 이후, TNFR6α 및/또는 TNFR6β 유전자를 함유하는 MSV 벡터를 배지에 부가하고, 패키징 세포를 벡터로 형질도입시킨다. 이제, 패키징 세포는 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 유전자를 함유하는 감염성 바이러스성 입자를 생산한다(패키징 세포는 이제 생산자 세포로 인용된다).
신선한 배지를 형질도입된 생산자 세포에 부가하고, 후속적으로 배지를 컨플루언스 생산자 세포의 10㎝ 플레이트로부터 수거한다. 감염성 바이러스 입자를 함유하는 소모된 배지를 밀리포어 필터를 통해서 여과시켜 떨어진 생산자 세포를 제거하고 상기 배지를 섬유아세포를 감염시키는데 사용한다. 배지를 섬유아세포의 서브-컨플루언스 플레이트로부터 제거하고 신속하게 생산자 세포로부터 상기 배지를 교체한다. 상기 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체한다. 바이러스 역가가 높은 경우, 실질적으로 모든 섬유아세포가 감염될 것이고 어떠한 선택도 필요하지 않다. 역가가 매우 낮은 경우, 네오(neo) 또는 히스(his) 같은 선택성 마커를 갖는 레트로바이러스 벡터를 사용할 필요가 있다. 일단 섬유아세포가 효과적으로 감염되면, 섬유아세포를 분석하여 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 단백질이 생산되는지를결정한다.
이후, 조작된 섬유아세포를 단독으로 또는 사이토덱스 3(cytodex 3) 미세운반체 비드 상에서 컨플루언스까지 성장시킨후, 숙주내로 이식시킨다.
실시예 17
유전자 치료를 사용하는 치료 방법- 생체내
본 발명의 또 다른 양태는 장애, 질환 및 질병상태를 치료하기 위한 생체내 유전자 치료 방법을 사용하는 것이다. 유전자 치료 방법은 나상 핵산(DNA, RNA, 및 안티센스 DNA 또는 RNA) TNFR6α 및/또는 TNFR6β 서열을 동물에 도입하여 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리펩타이드의 발현을 증가 또는 감소시키는 것에 관한 것이다. TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리뉴클레오타이드는 표적 조직에 의한 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리펩타이드의 발현에 필요한 프로모터 또는 임의의 다른 유전자 요소에 작동적으로 결합될 수 있다. 상기 유전자 치료 및 전달 기술 및 방법은 당해 분야에 공지되어져 있다[참조: 예를 들면, 국제 출원 공보 제WO90/11092호; 미국 특허 제5693622호, 제5705151호, 제5580859호; Tabata H. et al., Cardiovasc. Res. 35: 470-479 (1997); Chao J. et al., Pharmacol. Res. 35: 517-522 (1997); Wolff J.A. Neuromuscul. Disord. 7:314-318 (1997); Schwartz B. et al., Gene Ther. 3:405-411 (1996); Tsurumi Y. et al., Circulation 94:3281-3290 (1996)(본원에 참조 문헌으로 도입됨)].
TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리뉴클레오타이드 작제물은 조직(심장, 근육, 피부, 폐, 간, 장 등)의 간질 공간내로의 주입 같은 동물 세포에 주사할 수 있는 물질을 전달하는 모든 방법으로 전달할 수 있다. TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리뉴클레오타이드 작제물은 약제학적으로 허용되는 액체 또는 수성 담체중에서 전달할 수 있다.
용어 "나상" 폴리뉴클레오타이드, DNA 또는 RNA는 바이러스성 서열, 바이러스 입자, 리포좀 제형, 리포펙틴 또는 침전제 등을 포함하여, 세포내로의 도입을 보조하거나, 촉진시키거나 증진시키는 작용을 하는 모든 전달 비히클로부터 유리된 서열을 의미한다. 그러나, TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리뉴클레오타이드는 또한 당해 분야의 숙련자에게 숙지된 방법에 의해 제조될 수 있는 리포좀 제형[하기 문헌에 교시된 것들: Felgner P.L. et al. (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772:126-139 and Abdallah B. et al. (1995) Biol. Cell 85(1):1-7]중에서 전달할 수 있다.
유전자 치료 방법에서 사용되는 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리뉴클레오타이드 벡터 작제물은 숙주 게놈에 통합되거나 복제를 가능하게 하는 서열을 함유하지 않는 작제물이 바람직하다. 당해 분야의 숙련자에게 공지된 모든 강력한 프로모터를 DNA의 발현을 구동하는데 사용할 수 있다. 다른 유전자 치료 기술과는 다르게, 나상 핵산 서열을 표적 세포내로 도입하는 한 가지 주요 잇점은 세포내에서 상기 폴리뉴클레오타이드 합성의 일시성이다. 연구들은 비-복제성 DNA 서열이 세포내로 도입되어 6개월 미만의 기간 동안 목적하는 폴리펩타이드의 생산을 제공할 수 있다는 것을 나타낸다.
TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리뉴클레오타이드 작제물은 근육, 피부, 뇌, 폐,간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 골, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 눈, 선(gland), 및 결합 조직을 포함하여, 동물의 간질 공간내로 전달할 수 있다. 조직의 간질 공간은 조직액, 기관 조직의 세망 섬유 사이의 뮤코폴리사카라이드 기질, 혈관 또는 (안구)방의 벽내의 탄성 섬유, 섬유 조직의 콜라겐 섬유, 또는 결합 조직 초성 근육 세포내 또는 골소강내 동일한 기질을 포함한다. 이는 유사하게 순환계의 혈장 및 임파 통로의 림프액에 의해 점유되는 공간이다. 근육 조직의 간질 공간으로의 전달이 하기 논의된 이유로 인해 바람직하다. 이들은 상기 세포를 포함하는 조직내로 주사에 의해 용이하게 전달시킬 수 있다. 이들은, 비록 전달 및 발현이 예를 들면, 혈액 또는 피부 섬유아세포의 간(stem) 세포 같은 비-분화된 또는 보다 덜 완전하게 분화된 세포에서 달성될 수 있다고해도, 분화된 영속적이며 비분열성 세포에 전달하여 발현시키는 것이 바람직하다. 생체내 근육 세포는 폴리뉴클레오타이드를 흡수하고 발현하는 이의 능력에서 특히 적격이다.
나상 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리뉴클레오타이드 주사에 있어서, DNA 또는 RNA의 유효 투여량은 약 0.05g/㎏ 체중 내지 약 50㎎/㎏ 체중의 범위이다. 바람직하게는, 투여량은 약 0.005㎎/㎏ 체중 내지 약 20㎎/㎏ 체중 및 보다 바람직하게는 약 0.05㎎/㎏ 내지 약 5㎎/㎏이다. 물론, 당해 분야의 숙련자가 이해할 수 있는 바와 같이, 상기 투여량은 주사하는 조직 부위에 따라 다양할 것이다. 적합하고 효과적인 투여량의 핵산 서열은 당해 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며 치료하고자 하는 상태 및 투여 경로에 따를 수 있다. 바람직한 투여 경로는조직 간질 공간으로의 주사하는 비경구적 경로에 의한 것이다. 그러나, 특히 폐 또는 기관지 조직, 인후 또는 코의 점막으로의 전달을 위한 에어로졸 제형의 흡입 같은 다른 비경구적 경로가 또한 사용될 수 있다. 또한, 나상 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β 폴리뉴클레오타이드 작제물은 혈관성형물 중에 사용되는 카테터에 의해 동맥내로 전달될 수 있다.
생체내 근육에서 주입된 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리뉴클레오타이드의 용량 반응 효과는 하기와 같이 결정된다. TNFR6α 및/또는 TNFR6β 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA의 생산을 위해 적합한 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 주형 DNA는 표준 재조합 DNA 방법에 따라서 제조한다. 환형 또는 선형일 수 있는 주형 DNA는 나상 DNA 또는 리포좀과의 복합체로서 사용된다. 이후, 마우스의 사두근 근육에 다양한 양의 주형 DNA를 주입한다.
생후 5 내지 6주된 암컷 및 수컷 Balb/C 마우스를 2.5% 아베르틴 0.3㎖로 복막내 주사하여 마취시킨다. 앞 넓적다리에서 1.5㎝의 절개 부를 만들면, 사두근 근육이 직접적으로 나타난다. TNFR6α 및/또는 TNFR6β 주형 DNA를 근육의 말초 삽입 부위로부터 무릎방향으로 약 0.5㎝ 및 약 0.2㎝ 깊이로, 1분 동안 27규격 바늘을 통해 1cc 주사기에서 담체 0.1㎖중에서 주입한다. 봉합사를 봉합 부위로 주입 부위 상부에 위치시키고, 피부를 스테인레스 스틸 클립으로 폐쇄시킨다.
적합한 배양 시간(예를 들면, 7일) 후, 근육 추출물을 전체 사두근을 절개함으로써 제조한다. 각각의 사두근 근육의 다섯번째 15um 절단물을 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 단백질 발현을 위해서 조직학적으로 염색한다. 시간 경과에 따른 TNFR6α및/또는 TNFR6β 단백질 발현을, 상이한 마우스로부터의 사두근을 상이한 시간대에 수거한다는 것을 제외하고는, 유사한 방식으로 수행할 수 있다. 주사 후 근육에서 TNFR6α 및/또는 TNFR6β DNA의 지속성은 주사된 마우스와 대조군 마우스로부터 전체 세포성 DNA 및 HIRT 상청액을 제조한 후 서던 블롯 분석으로 결정할 수 있다. 마우스에서의 상기 실험 결과는 TNFR6α 및/또는 TNFR6β 나상 DNA를 사용하여 사람 및 다른 동물에서의 적합한 투여량 및 다른 치료 변수들을 추측할 수 있다.
실시예 18
래빗 하지 모델에서 허혈의 치료
허혈에 대한 TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 생체내 효과를 연구하기 위해서, 래빗 후지 허혈 모델을 이전 문헌[Takeshita, S. et al., Am. J. Pathol 147:1649-1660 (1995)]에 기술된 바와 같이 하나의 대퇴 동맥을 외과적으로 제거함으로써 제조한다. 대퇴 동맥의 절개는 외장골 동맥의 혈전 및 폐색의 진행을 퇴화시킨다. 결과적으로, 허혈 사지에 대한 혈액 흐름은 내장골 동맥으로부터 기원하는 부행 혈관에 의존하게 된다[Takeshita, et al., Am J. Pathol 147:1649-1660 (1995)]. 래빗의 수술후 회복 및 내인성 부행 혈관의 발생을 위해서 10일의 간격을 허용한다. 수술 10일 후(0일), 기저 혈관조영상을 수행한 후, 허혈성 사지의 내장골 동맥에 문헌[Riessen, R. et al., Hum Gene Ther. 4: 749-758 (1993); Leclerc, G. et al., J. Clin. Invest. 90: 936-944 (1992)]에 기술된 바와 같이 하이드로겔-피복된 풍선 카테터를 사용하는 동맥 유전자 전달 기술에 의해 나상 TNFR6α 및/또는TNFR6β 발현 플라스미드 500㎎을 형질감염시킨다. 치료에 사용하는 경우, 단백질 또는 대조군 500㎎의 단독 볼러스를 주입 카테터를 통해서 1분 동안 허혈 사지의 내장골 동맥내로 전달한다. 30일 후, 상기 래빗으로부터 다양한 변수들을 측정한다: (a) BP 비율 - 허헐 사지와 정상 사지의 수축압의 혈액 비율; (b) 혈류(BL) 및 혈액 예비량 - 휴지기 FL: 비확장시 상태 동안 혈류 및 최대 FL: 완전히 확장된 상태(또한 혈액양의 간접적인 측정) 동안 혈류, 및 혈액 예비량은 최대 FL:휴지기 FL의 비율로서 반영된다; (c) 혈관조영술 득점 - 이는 부행 혈관의 혈관조영술에 의해 측정된다. 득점은 위에 놓인 격자판내에서 가로지르는 불투명한 동맥을 갖는 영역을 래빗 넓적다리의 전체 수 m로 나눈 백분율(%)로서 결정된다; (d) 모세혈관 밀도 - 후지로부터 수득한 광학 현미경 절편에서 결정된 부행 모세혈관의 수.
상기 연구들은 본 실시예에서 TNFR6 단백질에서의 시험 활성을 기술한다. 그러나, 당해 분야의 숙련자는 실시된 연구들을 용이하게 변형하여 TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 유전자 치료), 효능제 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 19
당뇨 마우스 및 글루코코르티코이드-손상된 상처 치유 모델
A. 당뇨성 db+/db+ 마우스 모델
TNFR6가 치유 과정을 가속화시키는지를 결정하기 위해서, 유전적으로 당뇨성 마우스 모델의 상처 치유를 이용한다. db+/db+ 마우스에서의 전층 상처 치유 모델은 손상된 상처 치유의 잘 특성화되고, 임상적으로 관련되며 재생가능한 모델이다. 당뇨성 상처의 치유는 육아 조직의 형성 및 수축보다는 상피화에 따른다[Gartner, M.H. et al., J. Surg. Res. 52:389 (1992); Greenhalgh, D.G. et al., Am. J. Pathol. 136: 1235 (1990)].
당뇨성 동물은 II형 진성 당뇨병에서 관찰되는 많은 특징을 갖는다. 상동접합성(db+/db+) 마우스는 정상적인 이종접합성(db+/+m) 한배의 개체와 비교하여 비만이다. 돌연변이 당뇨성(db+/db+) 마우스는 염색체 4(db+)에서 1개의 상염색체 열성 돌연변이를 갖는다[Coleman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:283-293 (1982)]. 동물은 대식증, 다음증 및 다뇨증을 나타낸다. 돌연변이체 당뇨 마우스(db+/db+)는 혈당 증가, 증가된 또는 정상적인 인슐린 수치, 및 세포-매개 면역 억제를 나타낸다[Mandel et al., J. Immunol. 120: 1375 (1978); Debray-Sachs, M. et al., Clin. Exp. Immunol. 51(1):1-7 (1983); Leiter et al., Am. J. of Pathol. 114:46-55 (1985)]. 말초 신경병증, 심근 합병증, 및 미세혈관 병변, 기저막 비후 및 사구체 여과 이상이 상기 동물에서 기술된 바 있다[Norido, F. et al., Exp. Neurol. 83(2):221-232 (1984); Robertson et al., Diabetes 29(1):60-67 (1980); Giacomelli et al., Lab Invest. 40(4):460-473 (1979); Coleman, D.L., Diabetes 31 (Suppl):1-6 (1982)]. 이러한 상동접합성 당뇨 마우스는 사람 II형 당뇨병과 유사한 인슐린 내성을 나타내는 고혈당증을 나타낸다[Mandel et al., J. Immunol. 120:1375-1377 (1978)].
상기 동물들에서 관찰된 특성들은 상기 모델에서의 치유는 사람 당뇨병에서관찰되는 치유와 유사할 수 있다는 것을 제시한다[Greenhalgh, et al., Am. J. pf Pathol. 136:1235-1246 (1990)].
유전적으로 당뇨성인 암컷 C57BL/KsJ(db+/db+) 마우스 및 이의 비당뇨성 (db+/+m) 이종이합성 한배의 개체(제조원: Jackson Laboratories)를 본 연구에서 사용한다. 상기 동물을 본 연구의 시작 시점에서 생후 6주 및 8주된 것을 구입한다. 동물을 각각 수용하고 원하는대로 음식과 물을 공급한다. 모든 조작은 무균 기술을 사용하여 수행한다. 실험들은 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드. 인스티튜셔날 에니멀 케어 앤드 유즈 커미티(Human Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care and Use Committee)의 규정 및 지침, 및 가이드라인 포 더 케어 앤드 유즈 오브 라보라토리 에니멀(Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라서 수행한다.
상처 프로토콜은 이전에 보고된 방법[Tsuboi, R. and Rifkin, D.B., J. Exp. Med. 172:245-251 (1990)]에 따라서 수행한다. 간략하면, 상처화 당일에, 동물을 탈염수에 용해시킨 아베르틴(0.01㎎/㎖), 2,2,2-트리브로모에탄올 및 2-메틸-2-부탄올을 복막내 주사하여 마취시킨다. 동물의 등 부분의 털을 깎고 피부를 70% 에탄올 용액 및 요오드로 세척한다. 수술 부분을 상처를 내기 전에 멸균 가제로 건조시킨다. 이후, 키예스(Keyes) 조직 펀치를 사용하여 8㎜의 전층 상처를 생성시킨다. 상처를 생성시킨 후 즉시, 주변 피부를 조심스럽게 펴서 상처 확대를 배제시킨다. 상기 처리를 실험 지속 시간 동안 개방시켜 방치한다. 치료 적용은 상처화 당일에 개시하여 연속적인 5일 동안 국부적으로 제공한다. 치료 전에, 상처를조심스럽게 멸균 염수 및 가제 스폰지로 세정한다.
상처를 육안으로 검사하고 수술 당일 및 이후 2일 간격으로 지정된 거리에서 사진을 촬영한다. 상처 폐쇄는 1 내지 5일째 및 8일째 매일의 측정에 의해 결정한다. 상처는 교정된 제임슨 캘리퍼스를 사용하여 수평 및 수직으로 측정한다. 육아 조직이 더 이상 보이지 않고 상처가 지속적인 상피에 의해 피복되는 경우, 상처가 치유된 것으로 간주한다.
TNFR6α 및 TNFR6β를 비히클 중 8일 동안 1일 상처 부위 당 4㎎ 내지 500㎎의 상이한 용량으로 TNFR6 단백질을 사용하여 투여한다. 비히클 대조군 그룹은 비히클 용액 50㎖를 공급한다.
8일째, 동물에 나트륨 펜토바르비탈(300㎎/㎏)을 복막내 주사하여 안락사시킨다. 이후, 상처 및 주변 피부를 조직학 및 면역조직학적 연구를 위해서 수거한다. 조직 표본을 추가의 공정을 위해서 생검 스폰지 사이에 있는 조직 카셋트내 10% 중성 완충된 포르말린내에 위치시킨다.
각각 10마리의 3개 그룹(5마리는 당뇨성이고 5마리는 비당뇨성 대조군)을 평가한다: 1) 비히클 위약 대조군, 2) TNFR6α 및/또는 TNFR6β.
상처 폐쇄는 수직 및 수평 축에서 영역을 측정하고 상처의 전체 평방 영역을 수득함으로써 분석한다. 이후, 수축은 최초 상처 영역(0일) 및 치료 후(8일)의 영역 사이의 차이점을 확립함으로써 평가한다. 1일째 상처 영역은 64㎟이며, 피부 펀치에 상응하는 크기이다. 계산은 하기 공식을 사용하여 수행한다:
[8일째 개방 영역]-[1일째 개방 영역]/[1일째 개방 영역]
표본을 10% 완충된 포르말린으로 고정시키고, 파라핀으로 채운 덩어리를 상처 부위에 수직으로 구획(5㎜)하고 라이쉐르트-정 마이크로톰을 사용하여 절단한다. 통상적인 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색을 이분된 상처의 절단면에서 수행한다. 상처의 조직학적 시험을 사용하여 치유 과정 및 재생된 피부의 형태학적 외관이 TNFR6를 사용한 치료로 변화되었는지를 평가한다. 이러한 평가는 세포 축적, 염증성 세포, 모세혈관, 섬유아세포, 재-상피화 및 상피 성숙의 존재를 입증함을 포함한다[Greenhalgh, D.G. et al., Am. J. Pathol. 136: 1235 (1990)]. 맹검 관찰자가 교정된 렌즈 마이크로미터를 사용한다.
조직 절편들을 또한 ABC Elite 검출 시스템을 사용하여 폴리클로날 래빗 항-사람 케라틴 항체로 면역조직화학적으로 염색시킨다. 사람 피부를 포지티브 조직 대조군으로 사용하는 반면, 비-면역 IgG를 네가티브 대조군으로서 사용한다. 각질 세포 성장은 교정된 렌즈 마이크로미터를 사용하여 상처의 재상피화 정도를 평가하여 결정한다.
피부 표본에서 증식성 세포 핵 항원/사이클린(PCNA)는 ABC Elite 검출 시스템과 함께 항-PCNA 항체(1:50)를 사용하여 입증한다. 사람 결장암을 포지티브 조직 대조군으로서 사용하고 사람 뇌조직을 네가티브 조직 대조군으로서 사용한다. 각각의 표본은 제1 항체를 제외하고 비-면역 마우스 IgG로 치환시킨 절편을 포함한다. 이러한 절편들의 등급은 0 내지 8의 등급으로 증식 정도에 기초하며, 가장 낮은 등급은 미약한 증식을 반영하고 가장 높은 등급은 강력한 증식을 반영한다.
실험 결과는 언페어드 t 테스트(unpaired t test)를 사용하여 분석한다. p 값(< 0.05)은 유의한 것으로 간주한다.
B. 스테로이드 손상된 랫트 모델
스테로이드가 상처 치유를 억제한다는 것은 다양한 시험관내 및 생체내 시스템에서 입증되어져 왔다[Wahl, S.M. Glucocorticoids and Wound healing. In: Anti-Inflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects. 280-302 (1989); Wahl, S.M. et al., J. Immunol. 115:476-481 (1975); Werb, Z. et al., J. Exp. Med. 147:1684-1694 (1978)]. 글루코코르티코이드는 혈관형성을 억제하고 혈관 투과성[Ebert, R.H., et al., An. Intern. Med. 37:701-705 (1952)], 섬유아세포 증식, 및 콜라겐 합성을 감소시키며[Beck, L.S., et al., Growth Factors. 5: 295-304 (1991); Haynes, B.F., et al., J. Clin. Invest. 61: 703-7997 (1978)], 순환성 단핵구의 일시적인 감소를 야기하여[Haynes, B.F., et al., J. Clin. Invest. 61:703-797 (1978); Wahl, S.M., "Glucocorticoids and wound healing", In: Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, New York, pp. 280-302 (1989)], 상처 치유를 지연시킨다. 손상된 상처 치유에 대한 스테로이드의 전신계 투여는 랫트에서 잘 확립된 현상이다[Beck, L.S., et al., Growth Factors. 5: 295-304 (1991); Haynes, B.F., et al., J. Clin. Invest. 61: 703-797 (1978); Wahl, S.M., "Glucocorticoids and wound healing", In: Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press,New York, pp. 280-302 (1989); Pierce, G.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2229-2233 (1989)].
TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β가 치유 과정을 가속시킬 수 있다는 것을 입증하기 위해서, 메틸프레드니솔론의 전신계 투여에 의해 치유가 손상된 랫트에서 전층 제거 피부 상처에서 TNFR-6의 다중 국부 적용의 효과를 평가한다.
체중 250 내지 300g의 젊은 스프라그 돌리 랫트(제조원: Charles River Laboratories)를 본 실시예에서 사용한다. 상기 동물을 연구 개시 시점에서 생후 8주 및 9주된 것을 구입한다. 랫트의 치유 반응은 상처를 주는 시점에서 메틸프레드니솔론(17㎎/㎏/랫트, 근육내)의 전신계 투여로 손상시킨다. 동물을 각각 수용하고 원하는대로 음식과 물을 공급한다. 모든 조작은 무균 기술을 사용하여 수행한다. 본 연구는 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드. 인스티튜셔날 에니멀 케어 앤드 유즈 커미티(Human Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care and Use Committee)의 규정 및 지침, 및 가이드라인 포 더 케어 앤드 유즈 오브 라보라토리 에니멀(Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라서 수행한다.
상처화 프로토콜은 상기 A항에 따라 수행한다. 상처화 당일에, 동물을 케타민(50㎎/㎏) 및 자일라진(5㎎/㎏)의 근육내 주사로 마취시킨다. 동물의 배 부분의 털을 깎고 피부를 70% 에탄올 및 요오드 용액으로 세척한다. 수술 영역은 상처화 전에 멸균 가제로 건조시킨다. 8㎜의 전층 상처를 키예스 조직 펀치를 사용하여 생성시킨다. 상처를 실험 지속 동안 개방하여 방치한다. 시험 물질의 적용은 상처화 당일부터 시작하여 연속적인 7일 동안 및 메틸프레드니솔론 투여 후 1일 1회 국부적으로 제공한다. 치료 전에, 상처를 멸균 염수 및 가제 스폰지로 조심스럽게 세정한다.
상처는 육안으로 검사하고 상처화 당일 및 처리 말기에 고정된 거리에서 사진 촬영을 한다. 상처 폐쇄는 1 내지 5일 및 8일째 매일 측정하여 결정한다. 상처는 교정된 제임슨 캘리퍼스를 사용하여 수평 및 수직으로 측정한다. 육아 조직이 더 이상 보이지 않고 상처가 지속적인 상피에 의해 피복되는 경우, 상처가 치유된 것으로 간주한다.
TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β는 비히클 중 8일 동안 매일 상처 부위 당 4㎎ 내지 500㎎의 상이한 용량의 TNFR-6 단백질을 사용하여 투여한다. 비히클 대조군 그룹에는 비히클 용액 50㎖를 공급한다.
동물을 8일째 나트륨 펜토바르비탈(300㎎/㎏)의 복막내 주사로 안락사시킨다. 이후, 상처 및 주변 피부를 조직학적 시험을 위해서 수거한다. 조직 표본을 추가의 공정을 위해서 생검 스폰지 사이의 조직 카셋트내 10% 중성 완충된 포르말린에 위치시킨다.
각각 10마리의 4 그룹(5마리는 메틸프레드니솔론을 처리하고 5마리는 글루코코르티코이드 없이 처리한다)을 평가한다: 1) 비처리 그룹, 2) 비히클 위약 대조군, 및 3) TNFR-6 처리 그룹.
상처 폐쇄는 수직 및 수평 축으로 영역을 측정하고 상처의 전체 영역을 수득함으로써 분석한다. 이후, 폐쇄는 최초 상처 영역(0일) 및 치료 후의 영역(8일)사이의 차이점을 확립함으로써 평가한다. 1일째 상처 영역은 64㎟이며, 이는 피부 펀치의 상응하는 크기이다. 계산은 하기 공식을 사용하여 수행한다:
[8일째 개방 영역]-[1일째 개방 영역]/[1일째 개방 영역]
표본을 10% 완충된 포르말린으로 고정하고 파라핀으로 채운 덩어리를 상처 표면에 수직으로 구획화(5㎜)하고 올림푸스 마이크로톰을 사용하여 절단한다. 통상적인 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색을 이분된 상처의 절편 상에서 수행한다. 상처의 조직학적 시험은 치유 과정 및 재생된 피부의 형태학적 외관이 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β를 사용한 치료에 의해 개선되는지에 대한 평가를 가능하게 한다. 맹검 관찰자가 교정된 렌즈 마이크로미터를 사용하여 상처 갭의 거리를 결정한다.
실험 데이터를 언페어드 t 테스트로 분석한다. p 값(< 0.05)은 유의한 것으로 간주한다.
본 실시예에서 기술된 연구들은 TNFR-6 단백질의 활성을 시험한다. 그러나, 당해 분야의 숙련자들은 실시된 연구를 용이하게 변형하여 TNFR-6α 및/또는 TNFR-6β의 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 유전자 치료), 효능제, 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 20
림프부종 동물 모델
상기 실험 방법의 목적은 랫트 후지에서 림프관형성 및 림프 순환계의 재확립에 대한 치료 효과를 시험하기 위한 적합하고 일관된 림프부종 모델을 제조하는 것이다. 효과는 질병에 걸린 사지의 팽윤 체적, 림프혈관의 양의 정량화, 전체 혈장 단백질, 및 조직병리학에 의해 측정한다. 급성 림프부종은 7 내지 10일 동안 관찰된다. 보다 더 중요한 것은, 부종의 만성 진행이 이후 3 내지 4주 동안 계속된다는 것이다.
수술을 시작하기에 앞서, 혈액 샘플을 단백질 농도 분석을 위해서 채취한다. 체중 약 350g의 수컷 랫트에 펜토바르비탈을 투여한다. 후속적으로, 우측 다리에서 무릎에서부터 엉덩이의 털을 깎는다. 면도된 영역을 70% EtOH를 적신 가제로 훔친다. 혈액을 혈청 전체 단백질 시험을 위해서 채취한다. 환상면 및 체적 측정을 수행한 후 2개의 측정 수준(뒤꿈치 위 0.5㎝, 배쪽 뒤꿈치의 중간 부분)을 표시한 후 발내로 염료를 주입한다. 우측 및 좌측 뒤꿈치 모두의 진피 등에 1% 에반스 블루 0.05㎖를 주사한다. 이후, 뒤꿈치에 염료를 주사한 후 환상면 및 체적 측정을 수행한다.
무릎 관절을 지표로 사용하여, 중간-다리 서혜선 절개를 환상으로 수행하여 대퇴 혈관의 위치를 결정한다. 핀셋 및 지혈 겸자를 사용하여 피부판을 절개하여 분리한다. 대퇴 혈관의 위치를 결정한 후, 혈관을 따라 및 혈관 아래의 림프관의 위치를 결정한다. 이후, 이러한 영역에서 주요 림프 혈관을 전기적으로 응고시키거나 봉합사로 결찰시킨다.
현미경을 사용하여, 다리 뒤쪽[세미텐디노시스(semitendinosis) 및 내전(adductor) 근처]에서 근육을 평탄하게 이분한다. 이후, 슬와림프절의 위치를결정한다.
이후, 2개의 인접한 림프관 및 2개의 먼 림프관 및 슬와림프절의 말초 혈액 공급은 봉합에 의해 결찰시킨다. 이후, 슬와림프절, 및 모든 동반하는 지방 조직을 결합 조직을 절단시켜 제거한다.
상기 과정으로부터 야기되는 모든 가벼운 출혈도 억제시키도록 주의해야 한다. 림프관을 폐색시킨 후, 피부판을 액체 피부(Vetbond)(AJ Buck)를 사용하여 밀봉한다. 다리 주위로 약 0.5㎝의 갭을 둔 채로, 분리된 피부 가장자리를 아래 근육 조직에 밀착시킨다. 피부는 또한 경우에 따라서 아래의 근육에 봉합시켜 부착시킬 수 있다.
감염을 피하기 위해서, 동물을 각각 그물로 된 우리(짚은 없음)에 수용한다. 회복하는 동물은 5 내지 7일 마다 전형적으로 발생하는, 최적 부종 피크를 통해서 매일 체크한다. 이후, 편평기 부종 피크가 관찰된다. 림프부종의 정도를 평가하기 위해서, 각각의 발에서 지정된 2개의 위치에서 환상면 및 체적을 수술 후 및 7일 동안 매일 측정한다. 림프부종에 대한 혈장 단백질의 효과를 결정하고 단백질 분석이 유용한 시험 변수인지를 또한 조사한다. 대조군 및 부종 사지의 중량을 2개 위치에서 평가한다. 분석은 맹검 방식으로 수행한다.
환상면 측정: 사지 움직임을 예방하기 위한 간단한 가스 마취 하에서, 천 테이프를 사용하여 사지 환상면을 측정한다. 측정은 발목골 및 발의 등쪽에서 다른 2명에 의해 수행되며, 판독치를 평균한다. 판독은 대조군 및 부종 사지 모두로부터 수행된다.
체적 측정: 수술 당일, 동물을 펜토바르비톨로 마취시키고 수술전에 시험한다. 매일의 체적측정을 위해서, 동물을 간단한 할로탄 마취(신속한 고정 및 신속한 회복)하에서, 다리 모두의 털을 깎고 다리에 방수 마커를 사용하여 동일하게 표지한다. 다리를 우선 물에 담그고, 각각 표지된 수준까지 장치내로 집어넣어 Buxco 부종 소프트웨어(제조자: Chen/Victor)로 측정한다. 데이터를 한 사람이 기록하고, 다른 사람은 사지를 표지된 영역까지 담근다.
혈장 단백질 측정: 혈액을 채취하고, 원심분리시키고, 수술 및 전체 단백질 및 Ca2+을 비교하기 위한 측정을 위한 시험에 대한 결정 전에 혈청을 분리한다.
사지 중량 비교: 혈액을 채취한 후, 동물을 조직 수거를 위해 준비한다. 사지를 퀼리틴(quillitine)을 사용하여 절단하고, 실험용 및 대조군 다리 모두를 결찰 부위에서 절단하여 중량을 측정한다. 제2 중량측정은 경골종결 관절을 탈구시키고 발의 중량을 측정하여 수행한다.
조직학적 준비: 무릎(슬와)영역 뒤에 위치한 횡근을 이등분하여 프리즈겔(freezeGel)로 채워진 금속 주형내에 배열하고 차가운 메틸부탄내로 침지시키고, 절단 동안 -80℃에서 표지된 샘플 백내로 위치시킨다. 절단 동안, 근육을 림프관에 대해서 형광 현미경하에서 관찰한다. 다른 면역/조직학적 방법이 일반적으로 평가된다.
본 실시예에서 기술된 연구는 TNFR6 단백질에서의 활성을 시험한다. 그러나, 당해 분야의 숙련자는 실시된 연구를 용이하게 변형시켜 TNFR6α 및/또는 TNFR6β의 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 유전자 치료), 효능제, 및/또는 길항제의 활성을 시험할 수 있다.
본 발명은 상기 기술 및 실시예에서 특히 기술된 이상으로 다른 방법으로 실시될 수 있다는 것은 명백할 것이다. 본 발명의 수 많은 변형 및 변화가 상기 교시에 따라 가능할 것이며, 따라서, 첨부된 특허청구범위의 범위내에 속한다.
실시예 21
TNFR6-Fc는 ConA 마우스 간 상처 모델에서 FasL 매개된 독성을 억제한다
마우스에 대한 콘카나발린 A(Concanavalin A)의 정맥 투여는 T 임파구를 활성화시키고 간세포의 어팝토시스성 및 괴사성 세포 사멸 모두를 유도하며, 만성 활성 간염의 생리학적 특성을 모방한다[Tiegs et al., J. Clin. Invest. 90: 196 (1992)]. Fas 리간드 활성을 억제하는 것으로 예측되는 Fas의 이량체 형태인 Fas-Fc 단백질은 Fas 리간드의 억제를 통해서 상기 모델에서 간 상처를 감소시키는 것으로 보고되어져 있으며, 이는 병변에서 Fas 경로의 관련을 입증하는 것이다[Ksontini et al., J. Immunol.; 60(8): 4082-4089 (1998)].
모델의 유효성:
ConA 마우스 모델의 유효성을 입증하기 위해서, ConA를 마우스 당 위약 또는 Fas-Fc 97.5마이크로그램과 함께 ConA 10, 15 및 20㎎/㎏의 투여량으로 ConA를 Balb/c 마우스에 정맥내 투여한다. 치료 그룹 당 10마리의 Balb/c 마우스를 사용한다. 상기 마우스를 치료 22시간 후에 희생시키고, 혈청을 수거하고분석기(Clinical Chemistry Analyzer ILAB900, 제조원: Instrumentation Laboratory)를 사용하여 생화학적 분석을 수행하여 간 특이적 트랜스아미나제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)의 수준을 측정하며, 이들 효소는 간 손상시 혈청으로 방출되는 것이다[Tiegs et al., J. Clin. Invest. 90: 196 (1992)]. 마우스 당 97.5㎍(약 5㎎/㎏)의 투여량으로 FasFc의 투여는 10 및 15㎎/㎏의 투여량의 ConA에서 상승된 간 효소를 현저하게 억제시키지만, 20㎎/㎏에서는 억제하지 못하며(데이터 없음), 따라서 상기 모델의 유효성을 입증한다.
Bal/C 마우스에 3개의 로그 투여량의 TNFR6-Fc(0.6, 6, 60㎍/마우스)와 존재 또는 부재와 함께 ConA(15㎎/㎏)를 정맥내 주사한다. 본 실시예에서 사용되는 TNFR6-Fc 융합 단백질은 Fc 도메인에 융합된 전장 TNFR6α 폴리펩타이드 서열(서열 2의 1 내지 300번째 아미노산)에 상응한다. 치료 그룹 당 10마리의 Balb/c 마우스를 사용한다. 상기 마우스를 치료 22시간 후 희생시키고, ALT 및 AST의 혈청 수준을 분석기(Clinical Chemistry Analyzer ILAB900, 제조원: Instrumentation Laboratory)를 사용하여 측정한다. TNFR6-Fc의 투여는 시험된 최고 투여량(60㎍/마우스, 3㎎/㎏)에서 ALT 및 AST 수준을 50% 정도 억제시킨다(데이터 없음). 따라서, TNFR6-Fc는 투여량 의존적인 방식으로 ConA 유도된 혈청 ALT 및 AST를 현저하게 감소시킨다.
간에서 ConA 유도된 어팝토시스 사건에서의 TNFR6-Fc의 효과
혈청에서의 간 효소 수준의 상승은 간세포 파괴의 어팝토시성 및 비-어팝토시스성 경로 모두를 반영하기 때문에, 간 손상 정도에 대한 보다 결정적인 측정 방법이 어팝토시스성 사건의 직접적인 측정을 통해서 유도될 수 있다. 따라서, TNFR6-Fc 및 ConA로 처리한 마우스로부터 분리된 전체 간세포 현탁액을 사용하여 어팝토시스를 분석한다. 3개의 독립적인 어팝토시스 마커를 동일한 샘플에서 평가한다. 이들은 포스파티틸세린의 표면 발현에서의 변화, DNA 손상의 측정, 및 카스파제 활성화를 포함한다.
Balb/C 마우스에 3 로그 투여량의 TNFR6-Fc(0.6, 6, 60㎍/마우스)의 존재 또는 부재하에서 ConA(15㎎/㎏)를 정맥내 주사한다. 세포 현탁액을 그룹 당 3마리의 마우스의 간으로부터 분리하고 간세포를 온전한 간조직을 70㎛ 세포 여과기상에 위치시키고 RPMI 1640/10% FBS를 사용하여 5cc 주사기의 마개를 사용하여 가늘게 찢어 분리시킨다. 적혈구 및 큰 조각의 조직 파쇄물을 제거하기 위해서, 여과된 세포 현탁액을 임파구 분리 배지(밀도 1.0770g/㎖) 상에 층화시킨다. 경계면 층을 수거하고, 세척하고 세포를 계수한다. FACS 분석 전에, 세포 현탁액을 40㎛ 필터상에서 재여과시킨다.
아넥신 V 결합(어팝토시스의 지표)을 측정하기 위해서, 세포를 우선 형광크롬-접합된 모노클로날 항체 CD45 CyChrome 및 B220, 또는 항-TCRβPE(제조원: Pharmingen, San Diego, CA)로 항온처리한다. 세포를 결합 완충액(제조원: Pharmingen)으로 세척한 후 아넥신 V FITC(제조원: Pharmingen)로 항온처리한다. 염색시킨 세포를 수득하고 벡톤 딕킨슨 FACScan(Becton Dickinson FACScan, 제조원: Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 분석한다. 단지 CD45 포지티브 사건만을 수집한다. B220 및 아넥신 V에 대해서 밝게 염색되는 세포는 어팝토시스성 B 세포로 생각되며, 항-TCRβ 및 아넥신 V에 대해서 밝게 염색되는 세포는 어팝토시스성 T 세포로 생각된다.
DNA 분해(어팝토시스의 또 다른 특징) 수준을 말단 UTP 닉-말단 표지(TUNEL)로 결정하며, 이는 제조원의 지침에 따라서 Apo-DIRECT 키트(제조원: Pharmingen)를 사용하여 닉(nick)된 DNA의 3' 말단에 FITC-표지된 dUTP를 부가하는 TdT 효소를 사용하여 상기 분해를 측정한다. 간략하면, 세포를 1% 파라포름알데하이로 고정시키고, PBS로 세척하고 빙냉시킨 70% 에탄올로 고정한다. 세포를 세척 완충액으로 2회 세척한 후, 1시간 동안 37℃에서 TdT 효소 및 dUTP-FITC를 함유하는 염색 용액으로 항온처리한다. 세포를 세정 완충액으로 2회 세척하고, 요오드화 프로피듐에 재현탁시키고 FACScan상에서 수득한다. 분석에 있어서, 전자 게이트를 단일선 사건상에 설정하고, dUTP-FITC에 대해서 밝게 염색되는 세포를 어팝토시스성 세포로 생각한다.
카스파제-3의 활성형(어팝토시스의 초기 지표)의 존재를 결정하기 위해서, 세포를 IC FIX(제조원: BioSource International, Camarillo, CA)에서 항온처리하고, PBS에서 2회 세척한 후, IC PERM(제조원: BioSource)으로 투과시킨다. 세포를 IC PERM에서 래빗 항-카스파제-3-PE(제조원: Pharmingen) 5㎍으로 항온처리하고, IC PERM에서 세척하고, PBS에서 2회 세척한다. 세포를 FACScan상에서 수득하고 PE 평균 형광을 분석한다.
세가지 어팝토시스 지표 모두에 있어서, TNFR6-Fc는 ConA 단독으로 처리한 마우스에 비해서 마우스 간에서 어팝토시스를 억제한다(표 VI). 마커로서 DNA 손상 및 TUNEL 분석을 사용하여, TR6-Fc를 사용한 용량-의존성 억제 경향을 관찰한다. 이러한 데이터는 ConA-유도된 간염에서 어팝토시스의 억제에서 TNFR6-Fc의 역할을 지지한다.
TNFR6-Fc 처리된 마우스로부터 분리시킨 간세포의 어팝토시스1(어팝토시스 세포/측정)
처리 TUNEL 카스파제-3 아넥신 V/TcRβ 아넥신 V/B220
비처리 대조군 - 18.7 2.0 6.0
ConA(15㎎/㎏) 대조군 24.4 35.2 7.0 12.2
TNFR6-Fc(0.6㎍/마우스) 15.6 22.7 3.5 6.3
TNFR6-Fc(6.0㎍/마우스) 13.6 22.5 2.3 2.9
TNFR6-Fc(60㎍/마우스) 9.5 20.3 3.0 4.2
1간세포 현탁액은 세가지 독립적인 측정중 하나를 사용하여 어팝토시스에 대해서 분석한다. DNA 분해는 TUNEL 염색; 카스파제-3의 활성형에 대한 분석으로 카스파제 활성화 및 표면 막 변화의 아넥신 V 염색을 사용하여 측정한다. 세포 현탁액을 그룹 당 3마리의 마우스의 간으로부터 분리하고 모은다. 아넥신 V 염색을 위해서, 간 CD45+ 세포만을 수득하고 아넥신 V 염색은 B220 또는 TcRβ에 대해서 공염색된 세포를 평가한다.
결론
TNFR6-Fc가 ConA 유도된 혈청 AST 및 ALT 수준 및 ConA 유도된 간세포 어팝토시스 모두를 감소시킨다는 발견은 본 발명의 TNFR6α및 TNFR6β 폴리펩타이드의 간염 및 기타 간 상처 형태의 치료에 대한 치료학적 적용을 지지한다.
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출원인은 본 문서로서 본원이 덴마크 특허청에 의해 공개되거나 공개되지 않고 최종 결정될 때까지 시료의 분양은 단지 당해 분야의 전문가에게만 이루어질 것을 신청한다. 이 신청서는 출원이 덴마크 특허 조항의 섹션 22 및 33(3)에 의거 제3자에 의해 입수가능한 시점이전에 노르웨이 특허청에 제출되어야 한다. 만일 이러한 신청서가 출원인에 의해 제출된 경우, 이는 제3자가 시료의 분양을 신청했을 때 그 전문가가 사용할 수 있음을 부여하는 것이다. 그 전문가는 덴마크 특허청에서 인정하고 작성한 전문가 목록에 들어 있는 자 또는 개별적인 경우로 출원인에 의해 인정된 자일 수 있다.
스웨덴
출원인은 본 문서로서 본원이 스웨덴 특허청에 의해 공개되거나 공개되지 않고 최종 결정될 때까지 시료의 분양은 단지 당해 분야의 전문가에게만 이루어질 것을 신청한다. 이 신청서는 우선일로부터 16개월이 만료되기 이전에 국제사무국에 출원인에 의해(바람직하게는 PCT 출원인 가이드 제1권 부록 Z에 복사된 서식 PCT/RO/134를 이용) 제출되어야 한다. 만일 이러한 신청서가 출원인에 의해 제출된 경우, 이는 제3자가 시료의 분양을 신청했을 때 그 전문가가 사용할 수 있음을 부여하는 것이다. 그 전문가는 스웨덴 특허청에서 인정하고 작성한 전문가 목록에 들어 있는 자 또는 개별적인 경우로 출원인에 의해 인정된 자일 수 있다.
네덜란드
출원인은 본 문서로서 네덜란드 특허의 승인일 또는 출원이 거절, 취하 또는 소멸된 날까지 미생물은 특허 규칙 31F(1)에 규정된 바에 따라 단지 전문가에게 그 시료를 분양할 것을 신청한다. 이 신청서는 출원이 네덜란드 특허 조항의 섹션 22C 또는 섹션 25에 의거 제3자에 의해 입수 가능한 양 시점 중 빠른 날 이전에 출원인에 의해 네덜란드 공업소유청에 제출되어야 한다.
기탁된 미생물에 관한 정보
(PCT 규칙 13bis)
A. 하기에 기재된 정보는 명세서의 제5면 제7행에서 언급된 미생물에 관한 것이다.
B. 기탁 확인 추가의 기탁은 다음장에 표시된다 □
기탁 기관의 명칭아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션
기탁 기관의 주소 (우편 번호 및 국가를 포함)미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801
기탁일:1996년 11월 22일 수탁 번호:97810
C. 추가 정보 (미적용시 공백으로 함) 상기 정보는 다음장에 포함된다 □
D. 기재된 정보가 적용되는 지정국 (정보가 모든 지정된 국가에 해당되지 않는 경우)
유럽유럽 특허가 추구하고자 하는 상기 지정국과 관련하여, 상기 기탁된 미생물 샘플은 유럽 특허의특허사정에 대한 진술이 공표되거나 상기 출원이 거절 또는 취하되는 날 또는 취하될 것으로생각되는 날까지 상기 샘플을 요구하는 사람에 의해 추천된 전문가에게 상기 샘플을 배포함에의해서만 이용할 수 있을 것이다(규칙 28(4) EPC)
E. 정보의 별도 구비 (미적용시 공백으로 함)
하기에 열거된 정보는 이후에 국제사무국에 제출될 것이다 ( 정보의 일반적인 특성, 예를 들어, "기탁물의 기탁번호"를 명시한다)
수리관청용 국제사무국용
□ 본 서류를 국제 출원 명세서와 함께수령하였다. □ 본 서류를 국제사무국에서 일자로 수령하였다.
공인관 공인관
양식 PCT/RO/134(1992년 7월)
캐나다
출원인은 캐나다 특허가 출원을 기초로 허여되거나, 출원이 거절 또는 포기되어 더 이상 회복될 수 없거나 취하될 때까지 특허청장은 단지 본원에 언급된 생물학적 기탁물의 시료를 특허청장이 지명한 독립적인 전문가에게만 분양할 것을 신청하며, 이에 따라 출원인은 국제특허원의 공표를 위한 기술적 준비가 완료되기 이전에 국제사무국에 서면으로 알려야한다.
노르웨이
출원인은 본 문서로서 본원이 노르웨이 특허청에 의해 공개되거나 공개되지 않고 최종 결정될 때까지 시료의 분양은 단지 당해 분야의 전문가에게만 이루어질 것을 신청한다. 이 신청서는 출원이 노르웨이 특허 조항의 섹션 22 및 33(3)에 의거 일반대중에 의해 입수가능한 시점 이전에 노르웨이 특허청에 제출되어야 한다. 만일 이러한 신청서가 출원인에 의해 제출된 경우, 이는 제3자가 시료의 분양을 신청했을 때 그 전문가가 사용할 수 있음을 부여하는 것이다. 그 전문가는 노르웨이 특허청에서 인정하고 작성한 전문가 목록에 들어 있는 자 또는 개별적인 경우로 출원인에 의해 인정된 자일 수 있다.
호주
출원인은 본 문서로서 미생물 시료의 분양은 단지 특허 승인 이전 또는 출원의 소멸, 거절 또는 취하 전에 본 발명에 이해 없이 전문수신인에게 이루어질 수있음을 고시한다(호주 특허 규정의 규칙 3.25(3)).
핀란드
출원인은 본 문서로서 출원이 관계기관(National Board of Patents and Regulations)에 의해 공개되거나 공개되지 않고 최종 결정될 때까지 시료의 분양은 단지 당해 분야의 전문가에게 이루어질 것을 신청한다.
영국
출원인은 본 문서로서 미생물의 시료 분양은 단지 전문가에 이루어질 것을 신청한다. 이 신청서는 출원의 국제 공개에 대한 기술적 준비가 완료되기 전에 국제사무국에 출원인에 의해 제출되어야 한다.
덴마크
출원인은 본 문서로서 본원이 덴마크 특허청에 의해 공개되거나 공개되지 않고 최종 결정될 때까지 시료의 분양은 단지 당해 분야의 전문가에게만 이루어질 것을 신청한다. 이 신청서는 출원이 덴마크 특허 조항의 섹션 22 및 33(3)에 의거 제3자에 의해 입수가능한 시점이전에 노르웨이 특허청에 제출되어야 한다. 만일 이러한 신청서가 출원인에 의해 제출된 경우, 이는 제3자가 시료의 분양을 신청했을 때 그 전문가가 사용할 수 있음을 부여하는 것이다. 그 전문가는 덴마크 특허청에서 인정하고 작성한 전문가 목록에 들어 있는 자 또는 개별적인 경우로 출원인에 의해 인정된 자일 수 있다.
스웨덴
출원인은 본 문서로서 본원이 스웨덴 특허청에 의해 공개되거나 공개되지 않고 최종 결정될 때까지 시료의 분양은 단지 당해 분야의 전문가에게만 이루어질 것을 신청한다. 이 신청서는 우선일로부터 16개월이 만료되기 이전에 국제사무국에 출원인에 의해(바람직하게는 PCT 출원인 가이드 제1권 부록 Z에 복사된 서식 PCT/RO/134를 이용) 제출되어야 한다. 만일 이러한 신청서가 출원인에 의해 제출된 경우, 이는 제3자가 시료의 분양을 신청했을 때 그 전문가가 사용할 수 있음을 부여하는 것이다. 그 전문가는 스웨덴 특허청에서 인정하고 작성한 전문가 목록에 들어 있는 자 또는 개별적인 경우로 출원인에 의해 인정된 자일 수 있다.
네덜란드
출원인은 본 문서로서 네덜란드 특허의 승인일 또는 출원이 거절, 취하 또는 소멸된 날까지 미생물은 특허 규칙 31F(1)에 규정된 바에 따라 단지 전문가에게 그 시료를 분양할 것을 신청한다. 이 신청서는 출원이 네덜란드 특허 조항의 섹션 22C 또는 섹션 25에 의거 제3자에 의해 입수 가능한 양 시점 중 빠른 날 이전에 출원인에 의해 네덜란드 공업소유청에 제출되어야 한다.

Claims (23)

  1. (a) 서열 2 또는 서열 4의 완전한 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
    (b) 각각, 서열 2 또는 서열 4의 31 내지 300 위치 또는 31 내지 170 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
    (c) 각각, 서열 2 및 서열 4의 31 내지 283 위치 또는 31 내지 166 위치의 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 가용성 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및
    (d) 상기 (a), (b), 또는 (c)에서의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 서열 1 및 서열 3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 완전한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 서열 2 및 서열 4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 완전한 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 서열 2의 약 31 내지 약 300 위치 또는 서열 4의 약 31 내지 약 170 위치의 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 성숙한 형태를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 서열 2의 약 31 내지 약 283 위치 또는 서열 4의 약 31 내지 약 166 위치의 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 가용성 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자.
  6. (a) 서열 2의 잔기 m 내지 300의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(여기서, m은 1 내지 49 범위의 정수이다);
    (b) 서열 4의 잔기 n 내지 170의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(여기서, n은 1 내지 49 범위의 정수이다);
    (c) 서열 2의 잔기 1 내지 y의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(여기서, y는 193 내지 300 범위의 정수이다);
    (d) 서열 4의 잔기 1 내지 z의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(여기서, z는 132 내지 170 범위의 정수이다); 및
    (e) 서열 2의 잔기 m 내지 y 또는 서열 4의 잔기 n 내지 z로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(여기서, m, n, y 및 z는 (a), (b), (c) 및 (d)에서 정의한 바와 같다)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  7. (a) ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 TNFR 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터 1 내지 약 48개의 아미노산을 제외한, 당해 완전한 아미노산 서열의 부분으로 이루어지는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
    (b) 각각, ATCC 기탁번호 제97810호 및 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 TNFR 아미노산 서열의 카복시 말단으로부터 1 내지 약 107개 및 1 내지 약 38개의 아미노산을 제외한, 당해 완전한 아미노산 서열의 부분으로 이루어지는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및
    (c) 상기 (a) 및 (b)에서의 각각의 클론에 있어서 아미노 말단 및 카복시 말단 결실체의 임의의 조합을 포함하는, ATCC 기탁번호 제97810호 및 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 TNFR 아미노산 서열의 부분으로 이루어지는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  8. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자.
  9. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자.
  10. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자.
  11. 엄격한 하이브리드화 조건하에서 단지 A 잔기 또는 단지 T 잔기로 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드를 형성하지 않고, 엄격한 하이브리드화 조건하에서 제1항의 (a), (b), (c) 또는 (d)의 뉴클레오타이드 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열과 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  12. 제1항의 (a), (b), (c) 또는 (d)의 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 에피토프-보유 부분의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  13. 제12항에 있어서, 서열 2의 약 Ala-31 내지 약 Thr-46, 서열 2의 약 Phe-57 내지 약 Thr-117, 서열 2의 약 Cys-132 내지 약 Thr-175, 서열 2의 약 Gly-185 내지 약 Thr-194, 서열 2의 약 Val-205 내지 약 Asp-217, 서열 2의 약 Pro-239 내지 약 Leu-264, 서열 2의 약 Ala-283 내지 약 Pro-298; 서열 4의 약 Ala-31 내지 약 Thr-46, 서열 4의 약 Phe-57 내지 약 Gln-80, 서열 4의 약 Glu-86 내지 약 His-106, 서열 4의 약 Thr-108 내지 약 Phe-119, 서열 4의 약 His-129 내지 약 Val-138, 및 서열 4의 약 Gly-142 내지 약 Pro-166으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기를 포함하는 TNFR 폴리펩타이드의 에피토프-보유 부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  14. 제1항의 분리된 핵산 분자를 벡터내로 삽입함을 특징으로 하는 재조합 벡터의 제조 방법.
  15. 제14항의 방법에 의해 제조된 재조합 벡터.
  16. 제15항의 재조합 벡터를 숙주 세포내로 도입함을 특징으로 하는 재조합 숙주 세포의 제조 방법.
  17. 제16항의 방법에 의해 제조된 재조합 숙주 세포.
  18. TNFR 폴리펩타이드가 발현되는 조건하에서 제17항의 재조합 숙주 세포를 배양하고 당해 폴리펩타이드를 회수함을 특징으로 하는, TNFR 폴리펩타이드의 재조합 제조 방법.
  19. (a) 서열 2 또는 서열 4에서 제시된 완전한 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 전체 길이의 TNFR 폴리펩타이드의 아미노산 서열;
    (b) 서열 2의 31 내지 300 위치 또는 서열 4의 31 내지 170 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드의 아미노산 서열; 또는
    (c) 서열 2의 31 내지 283 위치 또는 서열 4의 31 내지 166 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 기탁번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 가용성 세포외 도메인의 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 TNFR 폴리펩타이드.
  20. 서열 2의 약 Ala-31 내지 약 Thr-46, 서열 2의 약 Phe-57 내지 약 Thr-117,서열 2의 약 Cys-132 내지 약 Thr-175, 서열 2의 약 Gly-185 내지 약 Thr-194, 서열 2의 약 Val-205 내지 약 Asp-217, 서열 2의 약 Pro-239 내지 약 Leu-264, 서열 2의 약 Ala-283 내지 약 Pro-298; 서열 4의 약 Ala-31 내지 약 Thr-46, 서열 4의 약 Phe-57 내지 약 Gln-80, 서열 4의 약 Glu-86 내지 약 His-106, 서열 4의 약 Thr-108 내지 약 Phe-119, 서열 4의 약 His-129 내지 약 Val-138, 및 서열 4의 약 Gly-142 내지 약 Pro-166의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩타이드로 이루어지는 그룹으로부터 선택된, TNFR 단백질의 에피토프-보유 부분을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  21. 제19항의 TNFR 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
  22. TNFR 폴리펩타이드 활성이 필요한 환자에게 제19항의 TNFR 폴리펩타이드를 투여함을 특징으로 하여, 상기 환자를 치료하는 방법.
  23. TNFR 폴리펩타이드 활성이 필요한 환자에게 제1항의 핵산을 투여함을 특징으로 하여, 상기 환자를 치료하는 방법.
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