KR20020013468A - Condensed plasmid-liposome complex for transfection - Google Patents
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Abstract
세포의 트랜스펙션용 플라스미드-리포좀 조성물이 기재되어 있다. 이 조성물에는 다가양이온 응축제로 응축된 플라스미드 분자 및 양이온성 리포좀을 포함한다. 또한 플라스미드-리포좀 복합체의 제조방법이 기술되어 있다.A plasmid-liposomal composition for transfection of cells is described. The composition includes plasmid molecules and cationic liposomes condensed with polycationic condensing agents. Also described are methods of making plasmid-liposomal complexes.
Description
특정세포로의 유전물질의 전달을 개선시키기 위하여 다양한 방법(예컨대 유전자 치료)이 개발되고 있다. 이러한 방법은 생체내 또는 생체외(ex vivo) 유전자 전달에 유용하다. 전자에서, 유전자는 피험자에게 직접적으로 도입된다(정맥내, 복강내, 에어로졸). 생체외(또는 실험관)유전자 전달에서는, 유전자는 피험자의 특정조직으로부터 세포를 분리한후 세포에 도입시키고, 이어서 트랜스펙션된 세포를 다시 피험자에게 도입시킨다.Various methods (eg gene therapy) have been developed to improve the delivery of genetic material to specific cells. Such methods are useful for in vivo or ex vivo gene delivery. In the former, the gene is introduced directly into the subject (intravenous, intraperitoneal, aerosol). In ex vivo (or in vitro) gene delivery, the gene isolates the cells from the subject's specific tissues and then introduces them into the cells, followed by introducing the transfected cells back into the subject.
생체내 및 생체외 유전자 치료를 위한 전달 시스템에는 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터, 마이크로주사, 전기천공, 원형질체 융합, 칼슘 포스페이트 및 리포좀이 포함된다 (Felgner, et al., 1987;Mulligan, 1993; Morishita et al., 1993),Delivery systems for in vivo and ex vivo gene therapy include viral vectors such as retroviral vectors or adenovirus vectors, microinjection, electroporation, protoplast fusion, calcium phosphate and liposomes (Felgner, et al., 1987; Mulligan, 1993; Morishita et al., 1993),
예컨대, 리포좀 매개 유전자 치료에는 양이온성 지질 및 중성 지질로 구성된 시약인 LIPOFECTIN 으로 형성된 양이온성 리포좀의 사용이 수반된다 (Felgner, et al., 1989, 1993). 양이온성 리포좀 및 DNA 의 정전기적 복합체를 형성시키는, 유전자 치료의 다른 리포좀 매개 방법이 기술되어 있다(Trubetskoy, et al., 1992; Morishita et al., 1993; Rose, 1994). 리포좀기재 트랜스펙션 조성물에 대한 좀더 최근의 접근법에는, DNA 를 지질입자에 결합시키거나 (Wagner, et al., 1991) 또는 DNA 를 응축시키는 (Gao and Hung, 1996; Li and Hung, 1996)다가 양이온, 예컨대, 프로타민 또는 폴리리신이 포함된다.For example, liposome mediated gene therapy involves the use of cationic liposomes formed with LIPOFECTIN, a reagent consisting of cationic lipids and neutral lipids (Felgner, et al., 1989, 1993). Other liposome mediated methods of gene therapy have been described that form electrostatic complexes of cationic liposomes and DNA (Trubetskoy, et al., 1992; Morishita et al., 1993; Rose, 1994). More recent approaches to liposome-based transfection compositions include binding DNA to lipid particles (Wagner, et al., 1991) or condensing DNA (Gao and Hung, 1996; Li and Hung, 1996). Cations such as protamine or polylysine.
그러나, 현재까지 기술된 리포좀 매개 유전자 치료법 및 조성물에는 예컨대 LIPOFECTIN의 독성, DNA-리포좀 복합체의 대용량 및 다소 불량한 생체내 트랜스펙션 효율을 포함한 한계가 있다.However, liposome mediated gene therapies and compositions described to date have limitations, including, for example, the toxicity of LIPOFECTIN, the large capacity of the DNA-liposomal complex, and rather poor in vivo transfection efficiency.
따라서, 비교적 비독성이고, 정맥투여 크기이며, 높은 트랜스펙션 효율을 갖는 DNA 플라스미드-리포좀 복합체를 제조하는 것이 바람직할 것이다.Therefore, it would be desirable to prepare DNA plasmid-liposomal complexes that are relatively nontoxic, intravenously sized, and have high transfection efficiency.
하나의 양태로서, 본 발명에는 플라스미드내 포함된 유전자로 숙주 세포를 트랜스펙션시킬때 사용하는 플라스미드-리포좀 복합체의 조성물이 포함된다. 이 조성물에는 다가양이온성 응축제로 응축 및 저이온 강도의 수성 매질에 현탁된 플라스미드 분자 및 양이온성 소포형성 지질로 형성된 양이온성 리포좀을 포함한다. 이 복합체는 5nmole 리포좀 지질/㎍ 플라스미드 초과 및 25nmole 리포좀 지질/㎍ 플라스미드 미만의 리포좀 지질 대 플라스미드의 비 및 약 200nm 미만의 실질적으로 균질한 크기를 갖는다.In one embodiment, the present invention includes a composition of a plasmid-liposomal complex used when transfecting a host cell with a gene contained in a plasmid. The composition includes cationic liposomes formed from plasmid molecules and cationic vesicle lipids suspended in an aqueous medium of low ionic strength condensed with a polycationic condensing agent. This complex has a ratio of liposome lipid to plasmid greater than 5 nmole liposome lipid / μg plasmid and less than 25 nmole liposome lipid / μg plasmid and a substantially homogeneous size of less than about 200 nm.
하나의 구현예로서, 응축된 플라스미드 분자는 담낭 섬유증 트랜스멤브레인 전도성 조절자, VIII 인자, 인터루킨-2 또는 p53 를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 유전자를 함유하는 DNA 플라스미드 분자이다.In one embodiment, the condensed plasmid molecule is a DNA plasmid molecule containing a gene selected from the group consisting of gallbladder fibrosis transmembrane conductivity regulators, genes encoding factor VIII, interleukin-2 or p53.
하나의 구현예로서, 응축제는 히스톤, 폴리-1-글루타민, 프로타민, 멜리틴 및 폴리마이신 B 로부터 선택된 다가양이온이다. 바람직한 구현예로서, 응축제는 전 히스톤, 히스톤 1 및 히스톤 4 에서 선택한 히스톤이다.In one embodiment, the condensing agent is a polycation selected from histone, poly-1-glutamine, protamine, melittin and polymycin B. In a preferred embodiment, the condensing agent is a histone selected from all histones, histone 1 and histone 4.
다른 구현예로서, 리포좀 지질 대 플라스미드의 비율은 8-18 nmole 리포좀 지질/㎍ 플라스미드이다.In another embodiment, the ratio of liposome lipid to plasmid is 8-18 nmole liposome lipid / μg plasmid.
저이온강도 수성 매질은 비이온성 삼투 용질, 예컨대 글루코오스, 수크로오스 또는 덱스트란으로 제조한다.Low ionic strength aqueous media are prepared with nonionic osmotic solutes such as glucose, sucrose or dextran.
양이온성 리포좀은 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB), 1,2-디올레일록시-3-(트리메틸아미노)프로판 (DOTAP), N-[1-(2,3-디테트라데실옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸암모늄 브로마이드 (DMRIE), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시 에틸암모늄 브로마이드 (DORIE), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA) 및 3β[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤 (DC-Chol)에서 선택된 양이온성 소포 형성 지질로 구성된다.Cationic liposomes include dimethyldioctadecylammonium (DDAB), 1,2-dioleyloxy-3- (trimethylamino) propane (DOTAP), N- [1- (2,3-ditetedecyloxy) propyl] -N, N-dimethyl-N-hydroxyethylammonium bromide (DMRIE), N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N-dimethyl-N-hydroxy ethylammonium bromide (DORIE ), N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) and 3β [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) carbamoyl ] Consists of cationic vesicle forming lipids selected from cholesterol (DC-Chol).
또 하나의 구현예로서, 양이온성 리포좀은 추가로 중성 소포 형성 지질을 포함한다. 또 하나의 구현예로서, 양이온성 리포좀은 추가로 콜레스테롤을 포함한다.In another embodiment, the cationic liposomes further comprise neutral vesicle forming lipids. In another embodiment, the cationic liposomes further comprise cholesterol.
또 하나의 구현예로서, 양이온성 리포좀은 친수성 중합체와 같은 중합체로 유도된 소포 형성 지질을 포함시켜 친수성 중합체 사슬의 표면 피복층을 갖는다. 하나의 구현예로서, 적어도 친수성 중합체 사슬의 일부는 방출성 결합, 예컨대 존재하는 또는 유도된 생리학적 조건에 응하여 친수성 중합체 사슬을 방출하는데 효과적인 결합에 의해 소포 형성 지질에 결합된다. 추가로 플라스미드-리포좀 복합체는 표적 세포 표면상의 수용체 분자에 리간드 특이적 결합하기 위해 친수성 중합체 사슬의 말단에 부착된 리간드를 포함할 수 있다. 예컨대, 바람직한 구현예로서, 친수성 중합체는 폴리에틸렌글리콜이다.In another embodiment, the cationic liposomes comprise a vesicle forming lipid derived from a polymer, such as a hydrophilic polymer, to have a surface coating layer of hydrophilic polymer chains. In one embodiment, at least a portion of the hydrophilic polymer chain is bound to the vesicle forming lipid by an effective binding to release the hydrophilic polymer chain in response to releasing bonds, such as physiological conditions present or induced. Additionally, the plasmid-liposomal complex may comprise a ligand attached to the end of the hydrophilic polymer chain for ligand specific binding to receptor molecules on the target cell surface. For example, in a preferred embodiment, the hydrophilic polymer is polyethylene glycol.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 플라스미드 분자를 응축시킨후, 응축된 플라스미드와 양이온성 리포좀의 현탁액과 혼합하여 숙주 세포 트랜스펙션용 플라스미드-지질 복합체를 형성시키는 플라스미드-리포좀 복합체의 제조 방법에서의 개선이 포함된다. 이 개선점에는 (i) 플라스미드 분자의 응축용 응축제로서 히스톤, 폴리-1-글루타민, 프로타민, 멜리틴 및 폴리마이신 B로부터 선택된 다가양이온의 선택, (ii) 응축된 플라스미드 분자의 현탁용 매질로서, 저이온강도의 수성 매질의 선택 및 (iii) 5nmole 리포좀 지질/㎍ 플라스미드의 초과 및 25nmole 리포좀 지질/㎍ 플라스미드의 미만의 리포좀 지질 대 플라스미드의 비의 선택이 포함된다. 이러한 개선에 의해 제조된 플라스미드-리포좀 복합체는 실질적으로 200nm 미만의 균질한 크기를 갖는다.In another aspect, the present invention provides an improvement in a method for preparing a plasmid-liposomal complex in which a plasmid molecule is condensed and then mixed with a suspension of the condensed plasmid and a cationic liposome to form a plasmid-lipid complex for host cell transfection. This includes. This improvement includes (i) selection of a polycation selected from histones, poly-1-glutamine, protamine, melittin and polymycin B as condensing agents for condensation of plasmid molecules, (ii) as a suspending medium for condensed plasmid molecules, Selection of an aqueous medium of low ionic strength and (iii) selection of the ratio of liposome lipid to plasmid above 5 nmole liposome lipid / μg plasmid and below 25 nmole liposome lipid / μg plasmid. The plasmid-liposomal complexes produced by this improvement have a homogeneous size of substantially less than 200 nm.
본 발명의 방법에 따라 제조된 플라스미드-리포좀 복합체는, 한 구현예로서, DNA 플라스미드에 함유된 유전자로 숙주세포를 트랜스펙션시키기는데 사용하며, 상기 DNA 플라스미드는 VIII 인자, 인터루킨-2 또는 p53 을 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택한 유전자를 포함한다.Plasmid-liposomal complexes prepared according to the method of the present invention, in one embodiment, are used to transfect host cells with the genes contained in the DNA plasmid, wherein the DNA plasmid comprises a factor VIII, interleukin-2 or p53. It includes genes selected from the group consisting of genes encoding.
바람직한 구현예로서, 플라스미드-리포좀 복합체는 담낭 섬유증 트랜스멤브레인 전도능 조절자, 또는, 폐암에 대해서는, 사이토킨, 예컨대, 인터루킨-2, 또는 종양 억제 유전자, 예컨대 p53 을 포함하는 DNA 플라스미드로 피험자의 폐내 숙주세포를 트랜스펙션시키는데 사용한다.In a preferred embodiment, the plasmid-liposomal complex is a gallbladder host of the subject with a DNA plasmid comprising a gallbladder fibrosis transmembrane conductivity regulator, or, for lung cancer, a cytoplasm such as interleukin-2, or a tumor suppressor gene such as p53. Used to transfect cells.
본 발명의 상기 및 기타 목적 및 특징은 본 발명의 하기 상술된 기술내용을 첨부된 도면과 함께 읽게 되면 좀더 명백해질 것이다.These and other objects and features of the present invention will become more apparent upon reading the following detailed description of the invention in conjunction with the accompanying drawings.
본 발명은 유전자의 생체내(in vivo)트랜스펙션용 플라스미드-리포좀 복합체의 제조방법의 개선 및 이 방법으로 제조된 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an improved method for preparing a plasmid-liposomal complex for in vivo transfection of a gene and to a composition prepared by the method.
참고문헌references
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도 1 은 다가양이온성 중합체 전 히스톤으로 응축된 플라스미드의 전자현미경사진의 컴퓨터 영상이다.1 is a computer image of electron micrographs of plasmids condensed into histones prior to polycationic polymers.
도 2 는 본 발명에 따른 양이온성 리포좀과 복합된 다가양이온성 응축 플라스미드의 전자현미경사진의 컴퓨터 영상이다.2 is a computer image of electron micrographs of a polycationic condensation plasmid complexed with a cationic liposome according to the present invention.
도 3A-3B 는 본 발명에 따른 양이온성 리포좀과 복합된 다가양이온-응축 플라스미드의 극저온 (도 3A) 및 냉동 단구(fracture) (도 3B) 투과형 전자현미경사진의 컴퓨터 영상이다.3A-3B are computer images of cryogenic (FIG. 3A) and cryofracture (FIG. 3B) transmission electron micrographs of polycationic-condensed plasmids complexed with cationic liposomes according to the present invention.
도 4 는 본 발명에 따라 제조된 플라스미드-리포좀 복합체의 동적광산란법ynamic light scattering)으로 측정시의 크기(nm)를 보여주는 도면이다.4 is a view showing the size (nm) when measured by dynamic light scattering method of the plasmid-liposomal complex prepared according to the present invention.
도 5 는 본 발명의 플라스미드-리포좀 복합체에 대한, 4℃ 에서 저장시간의 함수로서, 동적광산란법으로 측정시의 입자 직경(nm)의 도면이다.FIG. 5 is a plot of particle diameter (nm) measured by dynamic light scattering as a function of storage time at 4 ° C. for the plasmid-liposomal complex of the present invention. FIG.
도 6 은 본 발명의 표식된 플라스미드-리포좀 복합체의 마우스내 정맥주사후 시간의 함수로서의 주사량의 퍼센트의 도면이다.FIG. 6 is a plot of the amount of injection as a function of time after intravenous intravenous injection of a labeled plasmid-liposomal complex of the present invention.
도 7A-7E 는 전 히스톤으로 제조된 플라스미드-리포좀 복합체에 대한 폐(도 7A), 간(도 7B), 심장(도 7C), 비장 (도 7D) 및 신장(도 7E) 에서의 루시퍼라아제 발현 (상대 광 단위 (RLU)/10초/mg 단백질)을 나타낸다.7A-7E are luciferases in lung (FIG. 7A), liver (FIG. 7B), heart (FIG. 7C), spleen (FIG. 7D) and kidney (FIG. 7E) for plasmid-liposomal complexes prepared with whole histones. Expression (relative light unit (RLU) / 10 sec / mg protein).
도 8A-8E 는 히스톤 H1 로 제조된 플라스미드-리포좀 복합체에 대한 폐(도 8A), 간(도 8B), 심장(도 8C), 비장 (도 8D) 및 신장(도 8E) 에서의 루시퍼라아제 발현 (상대 광 단위 (RLU)/10초/mg 단백질)을 나타낸다.8A-8E show luciferase in the lung (FIG. 8A), liver (FIG. 8B), heart (FIG. 8C), spleen (FIG. 8D) and kidney (FIG. 8E) for plasmid-liposomal complexes prepared with histone H1. Expression (relative light unit (RLU) / 10 sec / mg protein).
도 9A-9E 는 히스톤 H4 로 제조된 플라스미드-리포좀 복합체에 대한 폐(도 9A), 간(도 9B), 심장(도 9C), 비장 (도 9D) 및 신장(도 9E) 에서의 루시퍼라아제발현 (상대 광 단위 (RLU)/10초/mg 단백질)을 나타낸다.9A-9E are luciferases in lung (FIG. 9A), liver (FIG. 9B), heart (FIG. 9C), spleen (FIG. 9D) and kidney (FIG. 9E) for plasmid-liposomal complexes prepared with histone H4. Expression (relative light unit (RLU) / 10 sec / mg protein).
도 10A-10E 는 양이온성 응축제로서 폴리-1-글루타민, 멜리틴 또는 폴리마이신 B 로 제조된 플라스미드-리포좀 복합체에 대한 폐(도 10A), 간(도 10B), 심장(도 10C), 비장 (도 10D) 및 신장(도 10E) 에서의 루시퍼라아제 발현 (pg 루시퍼라아제/mg 단백질)을 나타낸다.10A-10E show lung (FIG. 10A), liver (FIG. 10B), heart (FIG. 10C), spleen for plasmid-liposomal complexes prepared with poly-1-glutamine, melittin or polymycin B as cationic condensing agents. Luciferase expression (pg luciferase / mg protein) in (FIG. 10D) and kidney (FIG. 10E).
도 11A-11B 는 4℃ 에서 저장된 플라스미드-리포좀 복합체에 대한 시간(일)의 함수로서 폐(도 11A) 및 간(도 11B)에서의 루시퍼라아제 발현을 나타낸다.11A-11B show luciferase expression in lungs (FIG. 11A) and liver (FIG. 11B) as a function of time (days) for plasmid-liposomal complexes stored at 4 ° C. FIG.
도 12 는 루시퍼라아제 보유 플라스미드의 마이크로그램의 함수로서, 플라스미드-리포좀 복합체의 마우스내 정맥내 투여 24 시간후에서의 다양한 조직에서의 루시퍼라아제 (pg/mg 단백질)을 나타낸다.FIG. 12 shows luciferase (pg / mg protein) in various tissues 24 hours after intravenous intravenous administration of plasmid-liposomal complexes as a function of micrograms of luciferase bearing plasmids.
도 13 은 플라스미드-리포좀 복합체의 정맥내 투여 24 시간후 다양한 조직에서의 루시퍼라아제 활성 (RLU/mg 단백질) 을 나타낸다.FIG. 13 shows luciferase activity (RLU / mg protein) in various tissues 24 hours after intravenous administration of plasmid-liposomal complexes.
도 14A-14B 는 플라스미드 pHSVtk (도 14A), pCMVp53(도 14B) 및 pCMVIL2 (도 14C)를 포함한 플라스미드-리포좀 복합체로 처리한 동물에 대한, 루이스 폐 전이부의 접종후 일수의 함수로서 생존 동물의 퍼센트를 나타낸다.14A-14B show the percentage of surviving animals as a function of days post inoculation of Lewis lung metastases, relative to animals treated with plasmid-liposomal complexes comprising plasmids pHSVtk (FIG. 14A), pCMVp53 (FIG. 14B) and pCMVIL2 (FIG. 14C). Indicates.
도 15 는 시간(일)의 함수로서 루시퍼라아제를 코딩하는 pNSL 플라스미드로 제조된 플라스미드-리포좀 복합체의 투여후 마우스의 체중(g) 을 나타낸다. 마우스는 도면에서 화살표로 나타낸 바와 같이, 염수 (+), 및 50㎍ 플라스미드 (O), 75㎍ 플라스미드 (▲) 및 100㎍ 플라스미드 (▽) 의 투여량으로 플라스미드-리포좀 복합체로 1,8,15, 22 및 28 일째에 처리하였다.FIG. 15 shows the body weight (g) of mice after administration of plasmid-liposomal complexes prepared with pNSL plasmids encoding luciferase as a function of time in days. Mice were challenged with plasmid-liposomal complexes at doses of saline (+), and 50 μg plasmid (O), 75 μg plasmid (▲) and 100 μg plasmid (▽), as indicated by the arrows in the figure. Treatments were taken on days 22 and 28.
도 16 은 종양을 가진 마우스(루이스 폐 종양의 전이모델)에 루시퍼라아제를 코딩하는 pNSL 플라스미드로 제조된 플라스미드-리포좀 복합체의 투여 24 후 다양한 마우스 조직에서의 루시퍼라아제 발현(ng/mg)을 나타내는 도면이다.FIG. 16 shows luciferase expression (ng / mg) in various mouse tissues after administration of plasmid-liposomal complexes prepared with pNSL plasmid encoding luciferase to mice with tumors (metastatic model of Lewis lung tumor). It is a figure which shows.
I.플라스미드-리포좀 복합체 I. Plasmid-Liposome Complex
본 발명은 플라스미드-리포좀 복합체 및 숙주세포의 생체내 트랜스펙션에서 사용하기 위한 상기와 같은 복합체의 제조방법에서의 개선에 관한 것이다. 조성물은 다가양이온성 응축체로 응축시킨후 저이온강도의 매질에 현탁시킨 플라스미드 분자를 포함한다. 응축된 플라스미드 분자는, 리포좀과 같은 지질 입자와 혼합하여 플라스미드-리포좀 복합체를 형성시킨다. 후술되는 바와 같이 제조방법의 개선은 응축제의 선택, 현탁매질의 선택 및 리포좀 지질 대 플라스미드 비의 선택과 관련된다. 개선된 제조 절차를 상술하기 전, 플라스미드-리포좀 및 이의 구성성분을 기술하였다.The present invention relates to improvements in the method for preparing such complexes for use in in vivo transfection of plasmid-liposomal complexes and host cells. The composition comprises plasmid molecules suspended in a medium of low ionic strength after condensation with a polycationic condensate. The condensed plasmid molecules are mixed with lipid particles such as liposomes to form plasmid-liposomal complexes. Improvements in the method of manufacture, as described below, involve the selection of condensing agents, the selection of suspension media and the selection of liposome lipid to plasmid ratios. Before elaborating the improved preparation procedure, the plasmid-liposomes and components thereof were described.
A.양이온성 리포좀 성분 및 제조 A. Cationic Liposome Components and Preparation
전술한 바와 같이, 플라스미드-리포좀 복합체는 응축된 플라스미드 분자 및 리포좀을 포함한다. 여기에서 사용하는 리포좀은 통상적으로 수성 내용물을 봉입하는 하나이상의 지질 이중층상에 형성되는 외부 지질껍질을 갖는 지질 소포를 의미한다. 바람직한 구현예로서, 리포좀은 약 20-80 몰 퍼센트의 양은 양이온성 소포형성 지질로 구성되고, 나머지는 중성 소포형성 지질 및/또는 기타 성분으로 구성된 양이온성 리포좀이다. 여기에서 사용하는 "소포형성 지질"은 소수성및 극성 머리 그룹 부분을 가지며 그 자체로, 인지질에 의해 예시되는 바와 같이, 수중에서 자발적으로 이중층 소포를 형성할 수 있는 임의의 양쪽성 지질을 의미한다. 바람직한 소포형성 지질은 디아실사슬 지질, 예컨대, 인지질이며, 이의 아실 사슬은 통상적으로 약 14-22 탄소원자 길이이고 다양한 불포화도를 갖는다.As noted above, plasmid-liposomal complexes comprise condensed plasmid molecules and liposomes. Liposomes as used herein typically refer to lipid vesicles having an outer lipid shell formed on at least one lipid bilayer encapsulating an aqueous content. In a preferred embodiment, liposomes are cationic liposomes in an amount of about 20-80 mole percent comprised of cationic vesicle forming lipids and the remainder consisting of neutral vesicle forming lipids and / or other components. As used herein, “vesicle-forming lipid” refers to any amphoteric lipid that has hydrophobic and polar hair group moieties and, as such, is capable of spontaneously forming bilayer vesicles in water, as exemplified by phospholipids. Preferred vesicle-forming lipids are diacyl chain lipids, such as phospholipids, the acyl chains of which are typically about 14-22 carbon atoms in length and have varying degrees of unsaturation.
양이온성 소포 형성 지질은 극성 머리 그룹이 조작 pH, 예컨대 pH4-9 에서 순양전하를 갖는 지질이다. 통상의 예에는, 예컨대L-리신으로 유도된 지질 DOPE (LYS-DOPE)(Guo, et al., 1993) 에 대하여 설명된 바와 같이, 극성 머리 그룹이 양성 부분(예, 리신)으로 유도된, 포스파티딜에탄올아민과 같은 인지질이 포함된다. 또한 이 부류에는 양이온성 극성 머리그룹을 가지는 세레브로시드 및 간글리오시드와 같은 당지질이 포함된다.Cationic vesicle forming lipids are lipids in which the polar head group has a net positive charge at an operating pH, such as pH 4-9. Typical examples include, for example, a polar head group derived from a positive moiety (eg lysine), as described for L -lysine-induced lipid DOPE (LYS-DOPE) (Guo, et al., 1993). Phospholipids such as phosphatidylethanolamine. This class also includes glycolipids such as cerebrosides and ganglisides having cationic polar headgroups.
사용할 수 있는 다른 양이온성 소포형성 지질은 콜레스테롤 아민 및 관련 양이온성 스테롤이다. 양이온성 지질의 예로는 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB), 1,2-디올레일록시-3-(트리메틸아미노)프로판 (DOTAP), N-[1-(2,3-디테트라데실옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸암모늄 브로마이드 (DMRIE), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시 에틸암모늄 브로마이드 (DORIE), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 3β[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤 (DC-Chol), 및 디메틸디옥타데실암모늄 (DDAB) 를 들 수 있다.Other cationic vesicle forming lipids that can be used are cholesterol amines and related cationic sterols. Examples of cationic lipids include dimethyldioctadecylammonium (DDAB), 1,2-dioleyloxy-3- (trimethylamino) propane (DOTAP), N- [1- (2,3-ditetedecyloxy) Propyl] -N, N-dimethyl-N-hydroxyethylammonium bromide (DMRIE), N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N-dimethyl-N-hydroxyethylammonium bromide (DORIE), N- [1- (2,3-Dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA), 3β [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) car Barmoyl] cholesterol (DC-Chol), and dimethyl dioctadecyl ammonium (DDAB).
리포좀의 나머지는 중성 소포형성 지질로 형성되며, 이는 순전하를 갖지 않거나 극성 머리 그룹에 음전하를 갖는 소량의 지질을 포함할 수 있는 소포 형성 지질을 의미한다. 이런 부류의 지질에는 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린 (PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜리노시톨(PI) 및 스핀고미엘린(SM) 및 콜레스테롤, 콜레스테롤 유도체 및 기타 비전하 스테롤이 포함된다.The remainder of the liposomes is formed of neutral vesicle forming lipids, meaning vesicle forming lipids which may contain small amounts of lipids that do not have a net charge or have a negative charge on the polar head group. Lipids of this class include phospholipids such as phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylinositol (PI) and spinomielin (SM) and cholesterol, cholesterol derivatives and other non-charged sterols.
전술한 지질은 시중에서 구입하거나 또는 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명에 포함될 수 있는 기타 지질은 당지질, 예컨대 세레브로시드 및 강글리오시드이다.The aforementioned lipids can be purchased commercially or prepared according to known methods. Other lipids that may be included in the present invention are glycolipids such as cerebroside and ganglioside.
본 발명의 하나의 구현예로서, 플라스미드-리포좀 복합체에는 플라스미드/리포좀 복합체의 혈액순환시간을 확장시키는데 유효한 친수성 중합체 사슬의 표면 피복층을 갖는 리포좀이 포함된다. 적합한 친수성 중합체에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리비닐-피롤리돈, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리히드록시프로필 메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 및 유도된 셀룰로오스, 예컨대, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 히드록시에틸셀룰로오스가 포함된다. 바람직한 친수성 중합체 사슬은 폴리에틸렌글리콜(PEG)이며, 바람직하게는 500-10,000 달톤의 분자량, 좀더 바람직하게는 1,000-5,000 달톤의 분자량을 갖는 PEG 사슬이다. 친수성 중합체는 물 및 클로로포름과 같은 비수성 용매에서 용해될 수 있다.In one embodiment of the invention, the plasmid-liposomal complex includes liposomes having a surface coating layer of hydrophilic polymer chains effective for extending the blood circulation time of the plasmid / liposomal complex. Suitable hydrophilic polymers include polyethylene glycol (PEG), polylactic acid, polyglycolic acid, polyvinyl-pyrrolidone, polymethyloxazoline, polyethyloxazoline, polyhydroxypropyl methacrylamide, polymethacrylamide, polydimethylacrylic Amides and derived celluloses such as hydroxymethylcellulose or hydroxyethylcellulose. Preferred hydrophilic polymer chains are polyethylene glycol (PEG), preferably PEG chains having a molecular weight of 500-10,000 Daltons, more preferably of 1,000-5,000 Daltons. Hydrophilic polymers can be dissolved in non-aqueous solvents such as water and chloroform.
피복층은 바람직하게는 리포좀을 형성시키는 소포형성 지질내에 소포형성지질, 바람직하게는 인지질 또는 기타 디아실-사슬 지질(중합체 사슬을 갖는 이의 머리 그룹에서 유도된)을 1 내지 2 몰퍼센트 포함시켜 제조한다. 이러한 지질을제조하는 방법 및 이로 중합체 피복 리포좀을 형성시키는 예시적 방법이 미국특허 제 5,013,556 호 및 제 5,395,619 호에 기재되어 있다.The coating layer is preferably prepared by incorporating 1 to 2 mole percent of vesicle forming lipids, preferably phospholipids or other diacyl-chain lipids (derived from its head group with polymer chains) in the vesicle forming lipids that form liposomes. . Methods of making such lipids and exemplary methods of forming polymer coated liposomes therefrom are described in US Pat. Nos. 5,013,556 and 5,395,619.
친수성 중합체는 지질에 안정되게 결합하거나, 또는 혈류에서 순환중 또는 표적부위에 정착후, 중합체피복 플라스미드 리포좀 복합체가 친수성 중합체 피복층을 방출시키도록하는 불안정한 결합을 통해 결합될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 친수성 중합체, 특히 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 자극에 반응하여 중합체 사슬을 방출시키는데 효과적인 결합을 통한 소포형성 지질에의 부착은 예컨대, WO 98/16202 및 WO 98/16201, 및 문헌 (Kirptin, D et al., FEBS Letters, 388:115-118 (1996)) 에 기재되어 있다.It will be appreciated that the hydrophilic polymer can be bound stably to lipids or through unstable bonds that allow the polymer-coated plasmid liposome complexes to release the hydrophilic polymer coating layer after circulation in the bloodstream or after settling on the target site. Attachment to vesicle forming lipids via binding effective to release polymer chains in response to stimulation of hydrophilic polymers, in particular polyethylene glycol (PEG), is described, for example, in WO 98/16202 and WO 98/16201, and Kirptin, D et al. , FEBS Letters, 388: 115-118 (1996).
하나의 구현예로서, 방출성 결합은 적당한 방출제의 투여로 절단되거나 효소 또는 환원제의 존재와 같은 선택적인 생리학적 조건하에서 절단되는 화학적 방출성 결합이다. 예컨대, 에스테르 및 펩티드 결합은 에스테라아제 또는 펩티다아제 효소에 의해 절단된다. 디술피드 결합은 환원제, 예컨대, 글루타티온 또는 아스코르베이트의 투여 또는 생체내 존재하는 환원제, 예컨대, 혈장 및 세포내 존재하는 시스테인에 의해 절단된다.In one embodiment, the releasing bond is a chemical releasing bond that is cleaved by administration of the appropriate releasing agent or under selective physiological conditions such as the presence of an enzyme or reducing agent. For example, ester and peptide bonds are cleaved by esterase or peptidase enzymes. Disulfide bonds are cleaved by the administration of a reducing agent such as glutathione or ascorbate or by a reducing agent present in vivo such as plasma and intracellular cysteine.
기타 방출성 결합에는 pH 민감 결합 및 글루코오스, 빛 또는 열에 노출시 절단되는 결합이 포함된다. 예컨대, 친수성 중합체 사슬은 pH 민감 결합에 의해 리포좀에 부착될 수 있으며, 플라스미드-리포좀 복합체는 결합을 절단하고 친수성 사슬을 방출시키는데 효과적인 pH 를 갖는 부위, 예컨대, 종양영역으로 표적화시킨다. pH 민감 결합의 예에는 아실옥시알킬 에테르, 아세탈 및 케탈 결합이포함된다. 다른예는 절단성 결합이 여기에서는 넓게는 황함유 결합을 의미하는 디술피드 결합인 경우이다. 함황결합은 불안정성의 선택정도를 달성하도록 합성할 수 있고, 디술피드 결합, 혼합된 술피드-술폰결합 및 술피드-술폭시드결합을 포함할 수 있다. 이 세가지 결합중, 디술피드 결합이 황분해에 가장 덜 민감하고 술피드-술폭시드 결합이 가장 민감하다.Other release bonds include pH sensitive bonds and bonds that cleave upon exposure to glucose, light or heat. For example, hydrophilic polymer chains can be attached to liposomes by pH sensitive binding, and plasmid-liposomal complexes are targeted to sites, such as tumor regions, that have a pH effective to cleave the bonds and release the hydrophilic chains. Examples of pH sensitive bonds include acyloxyalkyl ethers, acetals and ketal bonds. Another example is where the cleavable bond is a disulfide bond, which broadly means a sulfur-containing bond. Sulfur-containing bonds may be synthesized to achieve a selectivity of instability and may include disulfide bonds, mixed sulfide-sulfone bonds and sulfide-sulfoxide bonds. Of these three bonds, disulfide bonds are least sensitive to sulfur degradation and sulfide-sulfoxide bonds are most sensitive.
이러한 방출성 결합은 플라스미드-리포좀 복합체로부터 친수성 중합체 단편의 방출 속도를 재단하는데 유용하다. 예컨대, 매우 불안정한 술피드 결합이 혈액세포 또는 내피 세포에 대한 표적화에 사용할 수 있으며, 이는 이러한 세포가는 접근하기에 용이하고, 짧은 리포좀 혈액순환 수명으로도 충분하기 때문이다. 정반대로, 장기지속 또는 강력한 디술피드 결합은 표적이 종양 조직 또는 복합체가 원하는 표적에 도달하는데 긴 리포좀 혈액순환 수명이 통상적으로 필요한 기타 기관인 경우에 사용할 수 있다.Such release bonds are useful for tailoring the release rate of hydrophilic polymer fragments from plasmid-liposomal complexes. For example, very unstable sulfide bonds can be used for targeting to blood cells or endothelial cells because these cells are easy to access and short liposome blood circulation life is sufficient. Conversely, long-lasting or strong disulfide binding can be used when the target is another organ where the tumor tissue or complex typically requires a long liposome blood circulation life to reach the desired target.
친수성 중합체 사슬을 리포좀에 부착시키는 방출성 결합은 통상적으로 환경의 변화의 결과로서, 예컨대, 리포좀이 약간 낮은 pH 를 갖는 특정부위, 예컨대, 종양 조직의 영역, 또는 환원조건을 갖는 부위, 예컨대, 저산소 종양에 도달하는 경우 통상적으로 생체내에서 절단된다. 또한 생체내 환원조건은 아스코르베이트, 시스테인 또는 글루타티온과 같은 환원제의 투여에 의해 영향을 받을 수 있다. 또한 절단성 결합은 외부자극, 예컨대, 빛 또는 열에 반응하여 절단될 수 있다.Release bonds that attach the hydrophilic polymer chain to the liposomes are typically the result of changes in the environment, such as for example, in areas where the liposomes have a slightly lower pH, such as areas of tumor tissue, or sites that have reducing conditions, such as hypoxia. When a tumor is reached it is usually cleaved in vivo. In vivo reducing conditions may also be affected by the administration of a reducing agent such as ascorbate, cysteine or glutathione. Cleavable bonds can also be cleaved in response to external stimuli such as light or heat.
또 하나의 구현예로서, 플라스미드-리포좀 복합체는 치료하고자 하는 표적 세포에 특이적으로 결합하는데 효과적인 표적화 리간드 또는 친화성 부분을 포함한다. 이러한 부분은 리포좀의 표면에 부착되거나 또는 친수성 중합체 사슬의 말단에 부착될 수 있다. 이러한 부분의 예에는, 예컨대, 국제출원 제 WO US94/03103, WO98/16202 및 WO98/16201 에 기재되어 있는 바와 같이, 항체, 표적세포 표면 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드 등이 포함된다. 또한 상기 부분은 복합체와 표적세포의 융합을 촉진시키는 소수성 단편일 수 있다.In another embodiment, the plasmid-liposomal complex comprises a targeting ligand or an affinity moiety that is effective for specifically binding to the target cell to be treated. Such moieties may be attached to the surface of liposomes or attached to the ends of the hydrophilic polymer chains. Examples of such moieties include antibodies, ligands that specifically bind to target cell surface receptors, and the like, as described, for example, in international applications WO US94 / 03103, WO98 / 16202 and WO98 / 16201. The moiety may also be a hydrophobic fragment that promotes fusion of the complex with the target cell.
B.응축된 플라스미드 B. Condensed Plasmids
본 섹션에서는 본 발명의 플라스미드-리포좀 복합체에서 사용하는 응축상 플라스미드의 제조를 기술한다.This section describes the preparation of condensed-phase plasmids for use in the plasmid-liposomal complexes of the present invention.
플라스미드를 응축시키기 위하여 사용하는 다가양이온성 응축제는 전하가 배가된 양이온성 중합체, 통상적으로 생중합체, 예컨대, 스퍼미딘, 스퍼민, 폴리리신, 프로타민, 전 히스톤, 특정 히스톤 단편, 예컨대, H1,H2,H3,H4 및 기타 다가양이온성 폴리펩티드이나, 또한 생상용성 중합체, 예컨대, 폴리마이신 B 가 포함될 수 있다. 이러한 다가양이온성 응축제는 유리 염기 또는 염형태로, 예컨대, 프로타민 술페이트 및 폴리리신 히드로브로마이드를 사용할 수 있다. 바람직한 구현예로서, 다가양이온성 응축제는 히스톤이고, 이는 여기에서 언급된 바와 같이 전 히스톤 또는 특정 히스톤 단편을 포함한다.Polycationic condensing agents used to condense plasmids are charge doubled cationic polymers, typically biopolymers such as spermidine, spermine, polylysine, protamine, whole histones, certain histone fragments such as H1, H2 , H3, H4 and other polycationic polypeptides, but may also include biocompatible polymers such as polymycin B. Such polycationic condensing agents can be used in free base or salt form, such as protamine sulfate and polylysine hydrobromide. In a preferred embodiment, the polycationic condensing agent is histone, which includes whole histones or specific histone fragments as mentioned herein.
복합체에서 사용하는데 적합한 플라스미드는 바람직하게는 5-40 Kbp(kilo basepair) 범위 크기를 갖는 환형 또는 폐쇄 이중가닥 분자이다. 이 플라스미드는 공지된 방법에 따라 구축되며, 치료 유전자, 즉, 적당한 프로모터 및 종결자 제어 요소 및 숙주 세포내에서 복제 및/또는 숙주세포 게놈내로 통합에 필요한 기타요소의 제어하, 유전자 치료시 발현되는 유전자를 포함한다. 유전자 또는 기타 포유류에서 유전자 치료에 유용한 플라스미드의 제조방법은 널리 공지되어 있고 참조되고 있다.Plasmids suitable for use in the complex are preferably cyclic or closed double-stranded molecules having a size in the range of 5-40 Kbp (kilo basepair). This plasmid is constructed in accordance with known methods and expressed during gene therapy under the control of therapeutic genes, ie, appropriate promoter and terminator control elements and other elements necessary for replication and / or integration into the host cell genome in the host cell. Contains the genes. Methods of making plasmids useful for gene therapy in genes or other mammals are well known and referenced.
본 발명의 복합체에 의해 유전자 치료를 위해 도입되는 유전자는 통상적으로 다음 3 범주중의 하나에 포함된다:Genes introduced for gene therapy by the complexes of the invention typically fall into one of three categories:
첫번째는 피험자에서 유전자의 결핍 또는 결함을 극복하기 위한 유전자이다. 즉, 피험자가 전혀 또는 정상수준내에서 활성의 내생 단백질을 생성시키지 못하는 경우이며, 플라스미드내 도입된 유전자는 이러한 결핍을 벌충하기 위한 것이다. 이런 부류의 유전자의 예에는 기간 세포 또는 림프구에서 유전자 발현를 위한, 아데노신 디아미나아제 (ADA)을 코딩하는 유전자; 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 결핍, 프로스타글란딘 G/H 신타아제에서의 결핍, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제의 결핍에 의해 유발되는 Lesch-Nyhan 증후군의 치료를 코딩하는 유전자, 혈우병, 겸상빈혈증 및 기타 혈액관련 질병의 치료를 위한, α1-항트립신, 응고 인자(예, VIII 인자, IX 인자)및 글로빈 (예,β-글로빈, 헤모글로빈)와 같은 다양한 순환 단백질을 코딩하는 유전자 및 호르몬 및 기타 펩티드 조절자를 코딩하는 유전자가 포함된다.The first is a gene for overcoming a deficiency or deficiency of the gene in a subject. In other words, the subject is unable to produce an active endogenous protein at all or within normal levels, and the gene introduced into the plasmid is intended to compensate for this deficiency. Examples of this class of genes include genes encoding adenosine deaminase (ADA) for gene expression in period cells or lymphocytes; Genes encoding the treatment of Lesch-Nyhan syndrome caused by purine nucleoside phosphorylase deficiency, deficiency in prostaglandin G / H synthase, deficiency of hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, hemophilia, sickle Genes and hormones encoding a variety of circulating proteins such as α 1 -antitrypsin, coagulation factors (e.g. VIII, IX) and globins (e.g., β-globin, hemoglobin) for the treatment of anemia and other blood related diseases And genes encoding other peptide modulators.
두번째 부류에는 종양과 같은 임의의 존재하는 병리 또는 바이러스 감염과 같은 병원성 상태를 치료하기 위한 폴리펩티드이다. 이 예에는 종양 치료용 p53 유전자, HIV 감염을 억제하는 CD4 펩티드용 유전자, 슈도모나스의 상피 세포 결합을 억제하는 슈도모나스 펩티드에 대한 유전자, 및 표적 병원체를 억제하는 특정 항체 유전자를 공급하는 유전자 치료가 포함된다.The second class is polypeptides for treating any existing pathology such as tumors or pathogenic conditions such as viral infections. Examples include gene therapy supplying p53 genes for tumor treatment, genes for CD4 peptides that inhibit HIV infection, genes for Pseudomonas peptides that inhibit epithelial cell binding of Pseudomonas, and gene therapies that supply specific antibody genes that inhibit target pathogens. .
세번째 부류에는 종양 성장에 특이적인 단백질의 과발현 또는 바이러스 단백질의 발현과 같은 바람직하지 못한 단백질 발현을 억제하는 안티센스 분자로서 작용할 수 있는 mRNA 전사체를 제조하도록된 유전가가 포함된다.The third class includes geneticists designed to produce mRNA transcripts that can act as antisense molecules that inhibit undesirable protein expression, such as overexpression of proteins specific for tumor growth or expression of viral proteins.
II복합체의 제조 및 특징화 Preparation and Characterization of II Complexes
본 발명에 따라, 응축상 플라스미드와 양이온성 리포좀을 저이온강도 매질에서 혼합하여 형성된 플라스미드-리포좀 복합체는 통상적으로 약 200nm 미만, 바람직하게는 50-20nm, 좀더 바람직하게는 100-200nm, 가장 바람직하게는 120-180nm의 실질적으로 균일한 크기를 갖는 복합체를 생성시킴이 발견되었다. 이 복합체는 추가로 코딩된 유전자의 발현의 활성의 보유, 즉 복합체는 트랜스펙션 안정성을 갖는 특징이 있다. 이는 후술되는 바와 같이, 4℃ 에서 30 일 저장후, 바람직하게는 90 일후, 세포를 트랜스펙션시키고 코딩된 유전자의 발현을 실현시키는 복합체의 능력에 의해 입증된다.According to the invention, the plasmid-liposomal complex formed by mixing the condensed plasmid and cationic liposomes in a low ionic strength medium is typically less than about 200 nm, preferably 50-20 nm, more preferably 100-200 nm, most preferably Was found to produce a composite with a substantially uniform size of 120-180 nm. This complex is further characterized by the retention of the activity of the expression of the encoded gene, ie the complex has transfection stability. This is evidenced by the ability of the complex to transfect cells and realize expression of the encoded genes after 30 days storage, preferably 90 days, at 4 ° C., as described below.
응축상 플라스미드는 플라스미드에 저이온강도 매질에서 전술한 유형의 다가양이온성 중합체 응축제를 부가하여 형성시킨다. 양이온성 중합체는 전하 화학양론이 달성되는 바람직한 농도로 플라스미드 용액에 첨가시킨다. 즉, 양이온성 중합체내 총 전하수 (중합체의 공지된 전하밀도/중량으로 결정)는 적어도 DNA 의 총 음전하 만큼 많다 (플라스미드중량 및 DNA의 공지된 전하 밀도/중량으로 결정). 통상적으로 첨가된 DNA 플라스미드 대 첨가된 중합체의 중량비는 약 0.1- 5.0, 좀더 바람직하게는 0.3-2.0 이다. 응축제는 바람직하게는 교반하면서 플라스미드 현탁액에 서서히 첨가, 예컨대 10 분에 걸쳐 첨가한다.Condensed phase plasmids are formed by adding to the plasmid a polycationic polymer condensing agent of the type described above in a low ionic strength medium. Cationic polymers are added to the plasmid solution at the desired concentrations at which charge stoichiometry is achieved. That is, the total number of charges (determined by the known charge density / weight of the polymer) in the cationic polymer is at least as large as the total negative charge of the DNA (determined by the plasmid weight and the known charge density / weight of the DNA). Typically the weight ratio of added DNA plasmid to added polymer is about 0.1-5.0, more preferably 0.3-2.0. The condensing agent is preferably added slowly to the plasmid suspension with stirring, eg over 10 minutes.
이어서, 저이온강도 매질에 함유된, 응축된 플라스미드 및 양이온성 리포좀을 혼합, 예컨대 리포좀에 응축된 플라스미드 분자를 서서히 첨가하여 혼합시킨다. 리포좀 지질 대 플라스미드의 비는 최대의 트랜스펙션을 달성하는데 중요한 변수이다. 이 비율 (nmole 리포좀 지질/㎍플라스미드)은 5 내지 25, 바람직하게는 8 내지 18, 좀더 바람직하게는 10 내지 15, 가장 바람직하게는 12-14 이다.The condensed plasmid and cationic liposomes, then contained in the low ionic strength medium, are mixed, such as by slowly adding condensed plasmid molecules to the liposomes. The ratio of liposome lipids to plasmids is an important variable in achieving maximum transfection. This ratio (nmole liposome lipid / μg plasmid) is 5 to 25, preferably 8 to 18, more preferably 10 to 15, most preferably 12-14.
전술한 바와 같이, 본 발명의 중요한 특징은 저이온강도의 매질에서 리포좀과 응축상 플라스미드의 혼합이다. 바람직하게는 DNA, 응축제 및 리포좀 지질종내 존재하는 이온을 포함하여, 매질의 최종 농도는 25 mM 단가 이온성 염(예, 염화나트륨)의 이온강도 미만, 바람직하게는 이러한 염의 10mM 미만, 좀더 바람직하게는 약 1 mM 미만이다. 통상적으로, 저이온강도는 유리염기 또는 유리산 플라스미드, 다가양이온 및 지질 종을 사용하고, 전해질 성분을 제거하거나, 이와는 달리 저이온강도를 유지하기에 충분히 희석된 농도의 구성성분을 사용하고/거나 투석등으로 구성성분으로부터 발생된 전해질을 제거하여 용이하게 수득한다. 동시에, 주사제로서의 삼투균형을 제공하는 글루코오스와 같은 비전해질 용질의 존재에서 조성물을 제조하는 것이 유용하다.As mentioned above, an important feature of the present invention is the mixing of liposomes and condensate plasmids in low ionic strength media. Preferably the final concentration of the medium, including the ions present in the DNA, the condensing agent and the liposome lipid species, is less than the ionic strength of the 25 mM monovalent ionic salt (eg sodium chloride), preferably less than 10 mM of such salt, more preferably Is less than about 1 mM. Typically, low ionic strengths use free base or free acid plasmids, polycationic and lipid species, and use components of a concentration sufficiently diluted to remove electrolyte components, or otherwise maintain low ionic strength. It is easily obtained by removing the electrolyte generated from the components by dialysis or the like. At the same time, it is useful to prepare the composition in the presence of a non-electrolyte solute such as glucose that provides osmotic balance as an injection.
도 1 은 실시예에서 기술된 바와 같이 제조된, 전 히스톤으로 응축된 루시퍼라아제 코딩 pNSL 플라스미드의 음염색 투과형 전자현미경사진의 컴퓨터 영상이다. 보는 바와 같이, 플라스미드는 직경 약 100nm 이하의 별개의 단일 입자로 응축된다.FIG. 1 is a computer image of a negative stain transmission electron micrograph of a whole histone condensed luciferase encoding pNSL plasmid, prepared as described in the Examples. As can be seen, the plasmid condenses into discrete single particles up to about 100 nm in diameter.
도 2 는 실시예 1 에 기술된 바와 같이 제조된 다가양이온 응축 플라스미드-리포좀 복합체의 음염색 투과형 전자현미경사진의 컴퓨터 영상이다. 도 1 의 순수하게 응축된 플라스미드 분자와 도 2 의 복합체를 비교시, 불투명하게 응축된 플라스미드가 도 2 에서 쉽게 눈에 띤다. 또한 도 2 에서 각 응축된 플라스미드를 둘러싼 투명막이 보인다. 이러한 투명막은 각 응축된 플라스미드를 피복하는 리포좀 지질 이중층이다.FIG. 2 is a computer image of a negative stain transmission electron micrograph of a polycationic condensation plasmid-liposomal complex prepared as described in Example 1. FIG. When comparing the purely condensed plasmid molecule of FIG. 1 with the complex of FIG. 2, an opaque condensed plasmid is readily visible in FIG. 2. Also shown in FIG. 2 is a clear membrane surrounding each condensed plasmid. This clear membrane is a liposome lipid bilayer covering each condensed plasmid.
도 3 A-3B 는 실시예 1 에 기술된 바와 같이 제조된 플라스미드-리포좀 복합체의 저온전자 및 냉동 단구 음염색 투과형 전자현미경사진의 컴퓨터 영상이다. 도 3A 의 현미경 사진은 플라스미드-리포좀 복합체 현탁액의 박막을 냉동시켜 저온저자 현미경하에서 층을 관찰하여 얻는다. 현미경사진에는 별개의 단일 플라스미드-리포좀 복합체가 보이며, 여기에서응축된 DNA 는 많은 입자들중에서 더 진한 중앙 영역으로 보인다. 도 3B 의 냉동 단구 현미경사진에는 명확한 집합체는 없고, 별개의 플라스미드-리포좀 복합체가 보인다.3 A-3B are computer images of cold electron and frozen monocyte negative stain transmission electron micrographs of plasmid-liposomal complexes prepared as described in Example 1. FIG. The micrograph of FIG. 3A is obtained by freezing a thin film of plasmid-liposomal complex suspension and observing the layer under cold author microscope. The micrograph shows a separate single plasmid-liposomal complex, where the condensed DNA appears as the darker central region of many particles. The frozen monocyte micrograph of FIG. 3B does not have a definite aggregate and shows a separate plasmid-liposomal complex.
동적광산란법을 사용하여 평균 복합체 크기 및 크기 분포를 측정하였다. 이 결과는 실시예 1 에서 제조한 복합체는 약 146nm (표준편차 45nm)의 평균 크기를 갖는 균질한 집단을 형성하는 것을 보여주는 도 4 에 나타내었다. 본 발명을 뒷받침하기 위해 수행된 본 연구 및 기타 연구는, 기술된 방법에 따라 제조한 경우 상대적으로 협소한 크기 분포를 갖는 복합체의 집단을 나타내는 단일 피크로 입증되는 바와 같이, 조성물이 완성되고, 복합체는 균일한 집단을 가짐을 알려준다.바람직하게는, 복합체는 200nm 미만, 좀더 바람직하게는 50-200nm, 가장 바람직하게는 100-200nm, 좀더 더 바람직하게는 120-180nm 의 크기를 갖는다.Dynamic light scattering was used to determine the average complex size and size distribution. This result is shown in FIG. 4 showing that the composite prepared in Example 1 forms a homogeneous population having an average size of about 146 nm (standard deviation 45 nm). The present and other studies carried out to support the present invention, when prepared according to the described method, demonstrate that the composition is complete, as evidenced by a single peak representing a population of complexes having a relatively narrow size distribution. Preferably has a uniform population. Preferably, the composite has a size of less than 200 nm, more preferably 50-200 nm, most preferably 100-200 nm, even more preferably 120-180 nm.
앞서 간략하게 논의한 바와 같이, 플라스미드-복합체는 안정하다. 즉, 복합체는 초기의 크기를 유지한다. 예컨대 거의 복합체의 집합체가 없으며, 복합체는 4℃ 에서 적어도 30일간 저장후에도 치료활성을 보유한다. 도 5 는 복합체 크기 안정성의 증거를 제공하고 시간의 함수로서, 동적광산란법으로 측정시 복합체 크기를 나타낸다. 물/글루코오스중 플라스미드-리포좀 복합체의 현탁액은 4℃ 에서 저장하고 저장 7,14,21,28,60 및 90 일후 분석하였다. 복합체 형성후 평균 복합체 크기는 약 150nm 이었고, 보는 바와 같이, 90 일저장후에도, 복합체 크기는 약 150nm 로 유지되었다. 치료활성의 보유와 관련한 복합체 안정성은 하기 도 11A-11B 에 논의되어 있다.As discussed briefly above, the plasmid-complex is stable. That is, the complex retains its initial size. For example, there are almost no aggregates of complexes, and the complexes retain therapeutic activity even after storage at 4 ° C. for at least 30 days. 5 provides evidence of complex size stability and shows complex size as measured by dynamic light scattering as a function of time. Suspensions of plasmid-liposomal complexes in water / glucose were stored at 4 ° C. and analyzed after 7,14,21,28,60 and 90 days of storage. The average complex size after complex formation was about 150 nm, and as seen, even after 90 days of storage, the complex size remained at about 150 nm. Complex stability with respect to retention of therapeutic activity is discussed in Figures 11A-11B below.
III.생체내 트랜스펙션 III. In vivo Transfection
본 발명에 따라 제조된 플라스미드-리포좀 복합체를 마우스에 투여하여 다양한 플라스미드-리포좀 복합체 제제의 트랜스펙션 효율을 측정하고, 트랜스펙션의 안정성, 복합체의 생분포, 약물동력학 및 투여량 반응을 측정하였다.Plasmid-liposomal complexes prepared according to the present invention were administered to mice to measure transfection efficiency of various plasmid-liposomal complex preparations, and stability of transfection, biodistribution of the complexes, pharmacokinetics and dose response were measured. .
플라스미드-리포좀 복합체의 약물동력학은 S35표식 DNA 플라스미드를 포함하는 복합체를 마우스에 주사하여 측정하였다. 도 6 은 정맥내 주사후 시간의 함수로서 주사량의 퍼센트를 나타낸다. 플라스미드-리포좀 복합체의 주사직후, 약 7% 의 주사량은 혈류내 존재한다. 기타 연구로 복합체의 나머지 퍼센티지는주사직후 폐에 집중되는 것이 측정되었다. 일정기간 경과후 복합체는, 5 시간째에서 약 22% 로 주사량의 퍼센티지가 증가하는 것에 의해 입증되는 바와 같이, 폐내 혈청 단백질에 의해 중화되어 혈류로 유입된다 (도 6). 이어서, 복합체는 혈류로부터 사라지고, 24 시간후 약 12% 의 주사량이 존재한다.The pharmacokinetics of the plasmid-liposomal complexes were determined by injecting mice with complexes comprising the S 35 labeled DNA plasmid. 6 shows the percentage of injection as a function of time after intravenous injection. Immediately after injection of the plasmid-liposomal complex, an injection of about 7% is present in the bloodstream. Other studies have determined that the remaining percentage of the complex is concentrated in the lungs immediately after injection. After a period of time, the complex is neutralized by serum proteins in the lungs and enters the bloodstream, as evidenced by an increase in the percentage of injection to about 22% at 5 hours (FIG. 6). The complex then disappears from the bloodstream and there is an injection of about 12% after 24 hours.
플라스미드-복합체는 리포좀 지질 대 플라스미드의 비를 다양화하여 생체내 투여를 위해 제조하였다. 이 복합체는 다가양이온 응축제의 양 및 리포좀 지질의 총량을 다양화하여 실시예 1 에 기재된 일반절차에 따라 제조하였다. 통상적으로, 다가양이온 응축제의 양은 100-500㎍ 이고, 리포좀 지질/플라스미드비는 8-18 nmole 지질/㎍ 플라스미드이다.Plasmid-complexes were prepared for in vivo administration by varying the ratio of liposome lipids to plasmids. This complex was prepared according to the general procedure described in Example 1 by varying the amount of polycationic condensing agent and the total amount of liposome lipids. Typically, the amount of polycationic condensing agent is 100-500 μg and the liposome lipid / plasmid ratio is 8-18 nmole lipid / μg plasmid.
도 7-9 는 다가양이온성 응축제로서 전 히스톤 (도 7A-7E), 히스톤 H1(도 8A-8B) 및 히스톤 H4(도 9A-9E)로 제조한 플라스미드-리포좀 복합체에 대한 결과를 나타낸다. 하기의 표에 나타낸 배합표로부터 제조된 복합체의 투여후, 루시퍼라아제 발현은 폐, 간, 심장, 비장 및 신장에서 측정하였다.7-9 show results for plasmid-liposomal complexes prepared with whole histones (FIGS. 7A-7E), histone H1 (FIGS. 8A-8B), and histone H4 (FIGS. 9A-9E) as polycationic condensing agents. After administration of the complexes prepared from the combination table shown in the table below, luciferase expression was measured in lung, liver, heart, spleen and kidney.
표 1 에는 다가양이온성 응축제로서 전 히스톤을 사용하여 제조된 플라스미드-리포좀 복합체에 대한 조성을 나타내었다. 전 히스톤의 양은 플라스미드/전히스톤의 비를 0.2-1.0 으로 변화시키기 위하여 100-500㎍ 사이에서 변화시킨다. 또한 리포좀 지질/플라스미드의 비는 변화시킬 수 있고 8, 14 및 18 nmole 리포좀 지질/㎍ 플라스미드의 비가 시험되었다.Table 1 shows the composition for plasmid-liposomal complexes prepared using all histones as polycationic condensing agents. The amount of total histone is varied between 100-500 μg to change the plasmid / total histone ratio to 0.2-1.0. In addition, the ratio of liposome lipid / plasmid can be varied and the ratio of 8, 14 and 18 nmole liposome lipid / μg plasmid was tested.
표 1 에 요약한 제제의 마우스내 생체내 투여의 결과는 도 7A-7E 에 나타내었고, 여기에서 간(도 7B), 심장(도 7C), 비장 (도 7D), 및 신장(도 7E)에서의 루시퍼라아제제 발현량을 (상대광단위(RLU)/10초/mg단백질)(도 7A)나타내었다. 도면은 트랜스펙션이 가장 높은 창이 존재함을 보여준다. 특히, 응축제로서 전 히스톤에 있어서, 트랜스펙션은 리포좀 지질/플라스미드 비가 8nmole 지질/㎍ 플라스미드 초과 및 18 nmole 지질/㎍ 플라스미드 미만 일때 가장 높다.Results of in vivo mouse administration of the formulations summarized in Table 1 are shown in FIGS. 7A-7E, where in liver (FIG. 7B), heart (FIG. 7C), spleen (FIG. 7D), and kidney (FIG. 7E). Luciferase expression of (relative light unit (RLU) / 10 seconds / mg protein) is shown (Fig. 7A). The figure shows that the window with the highest transfection exists. In particular, for all histones as condensing agents, transfection is highest when the liposome lipid / plasmid ratio is above 8 nmole lipid / μg plasmid and below 18 nmole lipid / μg plasmid.
표 2 에는 다가양이온성 응축제로서 히스톤 H1 을 이용하여 생체내에서 제조 및 시험된 플라스미드-리포좀 복합체 조성을 요약하였다. 플라스미드/히스톤 H1의 비는 0.3 또는 0.5 이고, 리포좀 지질/플라스미드 비는 8,14 및 18 nmole 지질/㎍ 플라스미드에서 변한다.Table 2 summarizes the plasmid-liposomal complex compositions prepared and tested in vivo using histone H1 as the polycationic condensing agent. The ratio of plasmid / histone H1 is 0.3 or 0.5 and the liposome lipid / plasmid ratio varies in 8,14 and 18 nmole lipid / μg plasmid.
표 2 에 요약된 제제를 마우스에 생체내 투여한 결과를 도 8A - 8E에 예시하였는데, 여기서, 폐 (도 8A), 간 (도 8B), 심장 (도 8C), 비장 (도 8D) 및 신장 (도 8E)에 있어서의 상대적 광 단위 (RLU)/ 10초/ mg 단백질 단위의 루시퍼라아제 발현량을 예시하였다. 도면은 최상의 트랜스펙션이 리포좀 지질/플라스미드의 비가 14 및 18인 경우 성취됨을 나타낸다.The results of in vivo administration of the formulations summarized in Table 2 to mice are illustrated in FIGS. 8A-8E, where lung (FIG. 8A), liver (FIG. 8B), heart (FIG. 8C), spleen (FIG. 8D) and kidneys. Luciferase expression amount of relative light unit (RLU) / 10 second / mg protein unit in (FIG. 8E) was illustrated. The figure shows that the best transfection is achieved when the ratio of liposome lipid / plasmid is 14 and 18.
표 3A 및 3B에는 다가 양이온성 응축제로 히스톤 H4를 사용하여 형성한 플라스미드-리포좀 복합체 제제가 요약되어 있다. 플라스미드/히스톤 H4 비는 0.2, 0.3 또는 0.5로 다양하며 리포좀 지질/플라스미드 비는 8, 14 또는 18 nmole의 지질/ μg의 플라스미드 로 다양하였다.Tables 3A and 3B summarize the plasmid-liposomal complex formulations formed using histone H4 as the polyvalent cationic condensing agent. The plasmid / histone H4 ratio varied from 0.2, 0.3 or 0.5 and the liposome lipid / plasmid ratio varied from 8, 14 or 18 nmoles of lipid / μg plasmid.
표 3A 및 3B에 요약된 제제를 마우스에 생체내 투여한 결과를 도 9A - 9E에 예시하였는데, 여기서, 폐 (도 9A), 간 (도 9B), 심장 (도 9C), 비장 (도 9D) 및신장 (도 9E)에 있어서의 상대적 광 단위 (RLU)/ 10초/ mg 단백질 단위의 루시퍼라아제 발현량을 예시하였다. 트랜스펙션이 1 μg의 플라스미드 당 8 nmoles보다 큰 리포좀 지질, 및 1 μg의 플라스미드 당 18 nmoles 미만의 리포좀 지질 에서 가장 큰 창이 존재하였다.In vivo administration of the formulations summarized in Tables 3A and 3B to mice is illustrated in FIGS. 9A-9E, where lung (FIG. 9A), liver (FIG. 9B), heart (FIG. 9C), spleen (FIG. 9D). And luciferase expression in relative light units (RLU) / 10 seconds / mg protein units in kidney (FIG. 9E). The largest window existed for liposome lipids with transfection greater than 8 nmoles per 1 μg plasmid, and liposome lipids less than 18 nmoles per 1 μg plasmid.
본 발명의 지지를 위해 수행한 다른 실험에 있어서, 폴리-1-글루타민, 멜리틴 (26개의 아미노산을 포함하는 저분자량 펩티드) 또는 폴리마이신 B 술페이트를 다가양이온성 응축제로 사용하여 플라스미드-리포좀 복합체를 제조하였다. 이들 각각은 Sigma Chemical Co.사로부터 구매가능한 것이다. 상기 복합체를 실시예 2에 기술된 바와 같이 마우스에 주입하고, 루시퍼라아제 발현량을 측정함으로써 생체내 트랜스펙션을 측정하였다.In another experiment conducted for the support of the present invention, a plasmid-liposome complex using poly-1-glutamine, melittin (low molecular weight peptide containing 26 amino acids) or polymycin B sulfate as a polycationic condensing agent Was prepared. Each of these is commercially available from Sigma Chemical Co. In vivo transfection was measured by injecting the complex into mice as described in Example 2 and measuring the amount of luciferase expression.
표 4 에는 다가양이온성 응축제로 폴리-1-글루타민, 멜리틴 또는 폴리마이신 B를 사용하여 제조한 플라스미드-리포좀 복합체 조성물이 요약되어 있다. 응축제의 양은 50 내지 200 μg으로 변화하였다.Table 4 summarizes the plasmid-liposomal complex compositions prepared using poly-1-glutamine, melittin or polymycin B as polycationic condensing agents. The amount of condensing agent varied from 50 to 200 μg.
표 4의 플라스미드-리포좀 복합체를 마우스에 생체내 투여한 결과를 도 10A - 10E에 예시하였는데, 여기서, 폐 (도 10A), 간 (도 10B), 심장 (도 10C), 비장 (도 10D) 및 신장 (도 10E)에 있어서의 pg 루시퍼라아제/mg 단백질 단위의 루시퍼라아제 발현량을 예시하였다. 제제 각각에 있어서의 지질/플라스미드 비는 14 nmoles의 지질/μg의 플라스미드에서 일정하였으며, 상기 비는 바람직한 5 - 25 nmoles의 리포좀 지질/μg 플라스미드 범위의 약 중간치였다.The results of in vivo administration of the plasmid-liposomal complexes of Table 4 to mice are illustrated in FIGS. 10A-10E, where lung (FIG. 10A), liver (FIG. 10B), heart (FIG. 10C), spleen (FIG. 10D) and Luciferase expression amount of pg luciferase / mg protein unit in kidney (FIG. 10E) was illustrated. The lipid / plasmid ratio for each formulation was constant at 14 nmoles of lipid / μg plasmid, which ratio was about midpoint of the preferred liposome lipid / μg plasmid range of 5-25 nmoles.
다양한 다가양이온성 응축제, 예를 들어 전 히스톤, 히스톤 H1, 히스톤 H4, 폴리-1-글루타민, 멜리틴 및 폴리마이신 B를 사용한 상기 연구에 의하면, 트랜스펙션은 리포좀 지질/플라스미드 비 (단위: nmoles의 지질/μg의 플라스미드)가 5 이상 약 25 미만인 경우 성취됨이 나타났다. 더 바람직하게는, 상기 비는 8 내지 18 사이, 훨씬 더 바람직하게는 10 내지 15 사이, 가장 바람직하게는 12 내지 14 nmoles의 리포좀 지질/μg 의 플라스미드 이다.According to the above studies using various polycationic condensing agents, for example whole histone, histone H1, histone H4, poly-1-glutamine, melittin and polymycin B, transfection results in liposome lipid / plasmid ratio (unit: lipids / μg of plasmid of nmoles) was found to be at least 5 and less than about 25. More preferably, the ratio is a plasmid of liposome lipids / μg of between 8 and 18, even more preferably between 10 and 15, most preferably between 12 and 14 nmoles.
상기에 논의한 바와 같이, 본 발명의 플라스미드/리포좀 복합체는, 4℃에서 90일 동안만큼 오래 입자 크기가 거의 변화하지 않는 것에 의해 입증되듯이, 안정하다 (도 5 참조). 본 복합체의 발현 안정성은 4℃에서 보관한 플라스미드-리포좀 복합체를 마우스에게 투여함으로써 측정하였다. 구체적으로는, 복합체의 제조 후 즉시 (0 일), 그리고 4℃에서 보관한지 7일, 14일, 21일, 28일, 30일 및 90일 후에 플라스미드-리포좀 복합체 현탁액을 마우스에게 정맥내 투여하였다. 실시예 2에 상세하게 설명한 방법에 따라, 폐 및 간에서의 루시퍼라아제 발현량을 측정하여, 결과를 도 11A - 11B 에 나타내었다.As discussed above, the plasmid / liposomal complexes of the present invention are stable, as evidenced by little change in particle size for as long as 90 days at 4 ° C. (see FIG. 5). The expression stability of this complex was measured by administering to the mice the plasmid-liposomal complex stored at 4 ° C. Specifically, mice were dosed intravenously with plasmid-liposomal complex suspensions immediately after preparation of the complex (day 0) and 7, 14, 21, 28, 30 and 90 days after storage at 4 ° C. . In accordance with the method described in detail in Example 2, luciferase expression in lungs and liver was measured, and the results are shown in FIGS. 11A-11B.
도 11A - 11B에서 알 수 있는 바와 같이, 폐 (도 11A) 및 간 (도 11B)에서의 루시퍼라아제 발현량은 복합체의 보관 시간과의 함수로 일정하게 유지되었다.As can be seen in FIGS. 11A-11B, luciferase expression levels in the lung (FIG. 11A) and liver (FIG. 11B) remained constant as a function of storage time of the complex.
복합체는 90일 동안의 시험 기간 동안 코딩 유전자를 발현하는 능력을 유지함이 명백하였다. 따라서, 본 발명의 한 구현예에 있어서, 복합체는 30일 이상, 더 바람직하게는 90일 동안 0 일에서 측정되는 발현 활성의 50% 이상을 유지하는 능력에 의해 특징지워진다.It was evident that the complex retained the ability to express the coding gene during the 90 day test period. Thus, in one embodiment of the present invention, the complex is characterized by the ability to maintain at least 50% of the expression activity measured at 0 days for at least 30 days, more preferably 90 days.
실시예 1에 기술한 바와 같이 제조한 플라스미드-리포좀 복합체를 사용하여 투여량-응답 연구를 수행하였다. 플라스미드-리포좀 복합체를 25, 50, 200, 250 및 200 μg의 5가지 플라스미드 투여 수준으로 마우스에게 정맥내 투여하였다. 투여한지 24시간 후에, 폐, 심장, 간, 신장 및 비장에서의 루시퍼라아제 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 12에 나타내었다. 측정된 루시퍼라아제 발현량은 투여량과 비례하였으며, 폐에서의 발현량이 가장 컸다.Dose-response studies were performed using the plasmid-liposomal complexes prepared as described in Example 1. Plasmid-liposomal complexes were administered intravenously to mice at five plasmid dose levels of 25, 50, 200, 250 and 200 μg. After 24 hours of administration, luciferase expression levels in lung, heart, liver, kidney and spleen were measured, and the results are shown in FIG. 12. Luciferase expression measured was proportional to dose, with the highest expression in lung.
마우스에서의 플라스미드-리포좀 복합체를 투여한지 24시간 후의 전신 루시퍼라아제 발현량을 도 13에 나타내었다. 플라스미드-리포좀 복합체는, 골수, 림프절 및 뇌에서의 루시퍼라아제 발현에 의해 입증되는 바와 같이, 광범위하게 분포한다.The amount of systemic luciferase expression 24 hours after administration of the plasmid-liposomal complex in mice is shown in FIG. 13. Plasmid-liposomal complexes are widely distributed, as evidenced by luciferase expression in bone marrow, lymph nodes, and brain.
실시예 3에 상술한 바와 같이, 본 발명의 지지를 위해 수행한 다른 연구에 있어서, 전이성 루이스 (Lewis) 폐 종양을 보유하는 마우스를 플라스미드-리포좀 복합체로 처리하였다. 종양 접종 후, 마우스를 실시예 3의 표 5에 나타낸 8가지의 처리법중 하나로 처리하였다. 처리는, p53 (pCMVp53) 및 인터루킨 2 (pCMVIL2)를 코딩하는 유전자를 보유하는 플라스미드를 사용하여 제조한 플라스미드-리포좀 복합체의 투여, 및 pHSVtk (헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제) 플라스미드로 제조한 플라스미드-리포좀 복합체와 간시클로비르의 병용 처리를 포함하였다. 대조 동물군에는 염수를 투여하였으며, 비교 동물군에는 단독의 루시퍼라아제 (실시예 1) 또는 간시클로비르를 코딩하는 pNSL 플라스미드로 제조한 복합체를 투여하였다.As detailed above in Example 3, in another study conducted for the support of the present invention, mice bearing metastatic Lewis lung tumors were treated with plasmid-liposomal complexes. After tumor inoculation, mice were treated with one of the eight treatments shown in Table 5 of Example 3. Treatment is administration of plasmid-liposomal complexes prepared using plasmids carrying genes encoding p53 (pCMVp53) and interleukin 2 (pCMVIL2), and plasmids prepared with pHSVtk (herpes simplex virus thymidine kinase) plasmid Combined treatment of liposome complexes and gancyclovir was included. Saline was administered to the control animals, and complexes prepared with the luciferase alone (Example 1) or pNSL plasmid encoding gancyclovir were administered to the control animals.
도 14A - 14C는 종양-세포 접종 후의 일수의 함수로서의 생존 동물의 퍼센트를 나타낸다. 도 14A - 14C 모두에 있어서, 염수로 처리한 동물을 ■으로 표시하였다. 예시된 바와 같이, 염수-처리 동물 모두는 종양 접종 후 24일에 죽었다. 도 14A에는, 50 μg (▼) 및 75 μg (□) pHSVtk 플라스미드를 포함하는 복합체, 및 간시클로비르로 처리한 동물이 예시되어 있다. 단독의 간시클로비르 (O)로 처리한 동물 모두는 37일에 죽었다. 대조로, 리포좀-플라스미드 복합체 및 간시클로비르의 병용 요법으로 처리한 동물은 양호하게 지냈으며, 고플라스미드 투여량으로 처리한 동물의 70%는 연구에서 생존하였다.14A-14C show the percentage of surviving animals as a function of days after tumor-cell inoculation. In all of Figs. 14A to 14C, animals treated with saline are indicated by ■. As illustrated, all saline-treated animals died 24 days after tumor inoculation. In FIG. 14A, a complex comprising 50 μg (▼) and 75 μg (□) pHSVtk plasmids and an animal treated with gancyclovir are illustrated. All animals treated with gancyclovir (O) alone died at 37 days. In contrast, animals treated with the combination therapy of liposome-plasmid complex and gancyclovir were well and 70% of animals treated with the high plasmid dose survived the study.
도 14B는 pCMVp53 (▼) 및 pNSL (루시퍼라아제 코딩) (O)을 포함하는 플라스미드-리포좀 복합체로 처리한 동물의 생존율을 나타낸다. 예시된 바와 같이, p53 유전자를 코딩하는 플라스미드를 포함하는 복합체로 처리한 동물의 20%는 연구기간 동안 생존하였으며, 반면, 염수 처리 동물 (■) 및 루시퍼라아제-리포터 유전자를 코딩하는 pNSL 플라스미드로 처리한 동물은 죽었다.14B shows survival of animals treated with plasmid-liposomal complexes comprising pCMVp53 (▼) and pNSL (luciferase coding) (O). As illustrated, 20% of animals treated with the complex comprising the plasmid encoding the p53 gene survived the study, whereas with the pNSL plasmid encoding the saline treated animals (■) and luciferase-reporter genes. The treated animals died.
도 14C는 50 μg의 플라스미드 DNA (▼) 및 75 μg의 플라스미드 DNA (□)를 투여한, pCMVIL2 플라스미드를 포함하는 복합체로 처리한 동물에서의 결과를 나타낸다. 예시된 바와 같이, 약 15 내지 20 % 사이의 동물이 처리 기간 마지막까지생존하였으며, 반면, 나머지 미처리 (염수 대조, ■) 동물 모두는 24일에 죽었다. 이와 유사하게, 루시퍼라아제 코딩 pNSL 플라스미드를 포함하는 복합체로 처리한 동물 (O)은 31일에 죽었다.FIG. 14C shows results in animals treated with a complex comprising a pCMVIL2 plasmid administered 50 μg of plasmid DNA (▼) and 75 μg of plasmid DNA (□). As illustrated, between 15 and 20% of animals survived to the end of the treatment period, while all remaining untreated (saline control, ■) animals died on day 24. Similarly, animals (O) treated with complexes comprising luciferase encoding pNSL plasmids died on day 31.
실시예 3의 표 5의 제제 번호 34, 즉, pNSL 루시퍼라아제-코딩 유전자를 포함하는 플라스미드-리포좀 복합체를, 50 μg의 플라스미드/ 0.7μmol의 지질, 75 μg의 플라스미드/1.05 μmol의 지질 및 100 μg의 플라스미드/1.4 μmol의 지질 의 투여량으로 마우스에게 투여하여, 제제의 독성 지표로서 마우스의 체중을 모니터링하였다. 도 15에서 알 수 있는 바와 같이, 복합체로 처리한 1일, 8일, 15일, 22일 및 28일째의 마우스는 플롯에서 화살표로 나타낸 바와 같이 제1 투여 후 체중이 약간 손실되었지만, 수일 내에 체중 손실을 회복하였다. 도면의 기호는 다음과 같다: 염수로 처리한 마우스 (+ 기호), 및 50 μg의 플라스미드 (O), 75 μg의 플라스미드 (▼), 및 100 μg의 플라스미드 (▽)로 처리한 마우스.Formulation No. 34 of Table 5 of Example 3, i.e., a plasmid-liposomal complex comprising the pNSL luciferase-encoding gene, was prepared in 50 μg of plasmid / 0.7 μmol of lipid, 75 μg of plasmid / 1.05 μmol of lipid and 100 Mice were dosed at a dose of μg plasmid / 1.4 μmol lipid to monitor the body weight of the mice as an indicator of toxicity of the formulation. As can be seen in FIG. 15, mice at days 1, 8, 15, 22 and 28 treated with the complex lost some weight after the first dose, as indicated by the arrows in the plot, but within days The loss was recovered. Symbols in the figures are as follows: mice treated with saline (+ sign), and mice treated with 50 μg of plasmid (O), 75 μg of plasmid (▼), and 100 μg of plasmid (▽).
루이스 폐 종양 모델을 사용한 다른 연구에 있어서, pNSL-루시퍼라아제-플라스미드-리포좀 복합체를 마우스에게 투여하여, 다양한 조직에서의 루시퍼라아제 발현량을 플라스미드-리포좀 복합체 투여 24시간 후에 조사하였다. 도 16에서 알 수 있는 바와 같이, 폐 및 종양에서 가장 큰 루시퍼라아제 발현이 관찰되었다.In another study using the Lewis lung tumor model, pNSL-luciferase-plasmid-liposomal complexes were administered to mice, and luciferase expression levels in various tissues were examined 24 hours after administration of the plasmid-liposomal complex. As can be seen in FIG. 16, the greatest luciferase expression was observed in lungs and tumors.
상기로부터, 어떻게 본 발명의 다양한 특징 및 목적이 충족되는지를 알 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 제조한 플라스미드-리포좀 복합체는 동적 광 산란법에 의해 입증되는 바와 같이 약 200 nm 미만의 크기를 가지는 실질적으로 균질한 집단을 형성한다. 본 복합체는 동적 광 산란법에 의해 입증되는 바와 같이 복합체의 응집 없이 90일 동안 안정하다. 본 복합체의 트랜스펙션 활성이 안정하다는 것도 또한 중요한데, 본 복합체는 4℃에서 30일 이상 동안 보관한 후에 50% 이상의 트랜스펙션 효율을 유지한다.From the above, it can be seen how various features and objects of the present invention are met. Plasmid-liposomal complexes prepared according to the methods of the present invention form a substantially homogeneous population with a size of less than about 200 nm, as evidenced by dynamic light scattering. The complex is stable for 90 days without aggregation of the complex as evidenced by dynamic light scattering. It is also important that the transfection activity of the present complex is stable, which maintains at least 50% transfection efficiency after storage at 4 ° C. for at least 30 days.
IV 실시예IV Example
하기 실시예에는 본 발명의 플라스미드-리포좀 복합체의 제조, 특징화 및 사용방법이 설명되어 있다. 이 실시예들은 결코 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.The following examples illustrate the preparation, characterization and use of the plasmid-liposomal complexes of the present invention. These embodiments are by no means intended to limit the scope of the invention.
재료 및 방법Materials and methods
A. 지질A. Geology
디메틸디옥타데실암모늄(DDAB)은 Avanti Polar Lipids Inc (Birmingham, AL) 사로부터 구입하였다. 순도 99% 이상의 콜레스테롤은 Nu-Chek (Elysian, MN) 사로부터 구입하였다.Dimethyldioctadecylammonium (DDAB) was purchased from Avanti Polar Lipids Inc (Birmingham, AL). Cholesterol greater than 99% purity was purchased from Nu-Chek (Elysian, MN).
B. 다가양이온성 응축제B. Polycationic Condensing Agents
H1,H2, H3 및 H4 를 포함한 히스톤의 혼합물로 구성된 전 히스톤, 히스톤 H1 및 히스톤 H4 는 Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) 사로부터 입수하였다. 폴리-1-글루타민, 멜리틴 및 폴리마이신 B 술페이트는 Sigma Chemical Co. (St.Louis, MO) 사로부터 입수하였다.All histones, histones H1 and histones H4 consisting of a mixture of histones including H1, H2, H3 and H4 were obtained from Boehringer Mannheim (Indianapolis, Ind.). Poly-1-glutamine, melittin and polymycin B sulphate are available from Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.).
C. 방법 : 동적광산란법C. Method: Dynamic Light Scattering
크기분포값은 제조사의 지시에 따라 작동시켜, Coulter N4MD 기구를 이용하여 동적광산란법(DLS)으로 얻었다. 이 결과는 평균직경(nm) 및 상대부피로 입자의 가우스 분포의 표준 편차로 나타내었다.The size distribution was operated according to the manufacturer's instructions and obtained by dynamic light scattering (DLS) using the Coulter N4MD instrument. The results are expressed as the standard deviation of the Gaussian distribution of the particles by mean diameter (nm) and relative volume.
실시예 1Example 1
플라스미드-리포좀 복합체의 제조Preparation of Plasmid-Liposome Complex
A. pNSL 플라스미드의 제조A. Preparation of pNSL Plasmids
루시퍼라아제를 코딩하는 pNSL 플라스미드는 두개의 시판 플라스미드, pGFP-N1 플라스미드 (Clontech, Palo Alto, CA) 및 pGL3-C (Promega Corporation, Madison,WI)로 구축하였다.The pNSL plasmid encoding luciferase was constructed with two commercial plasmids, the pGFP-N1 plasmid (Clontech, Palo Alto, Calif.) And pGL3-C (Promega Corporation, Madison, Wis.).
pGL3-C 는 Xbal 로 절단한후 대장균 DNA 폴리머라아제의 클레나우 단편을 이용하여 평활말단 결찰시켰다. 이어서 이것을 HindIII 로 절단시킨후, 루시퍼라아제 유전자를 보유하는 1689-bp 단편을 겔정제시켰다. pGFP-N1 플라스미드를 SmaI 및 HindIII 로 절단시킨후 아가로오스 겔로부터 단리시킨 4.7kb 단편을 루시퍼라아제 단편과 결찰시켰다. JM109 대장균 세포를 형질전환시켜, 20 개의 콜로니를 선택하였고; 이들중 약 절반은 삽입체의 존재를 보였으며; 삽입체를 가진 8 개의 클론을 NamHI 및 XhoI 로 절단하여 추가로 루시퍼라아제의 존재를 확인하였고; 이들중 7 개는 양성이었다.pGL3-C was digested with Xbal and blunt-ended ligation was performed using Klenow fragment of E. coli DNA polymerase. This was then cleaved with HindIII, followed by gel purification of the 1689-bp fragment carrying the luciferase gene. The 4.7 kb fragment isolated from the agarose gel after digesting the pGFP-N1 plasmid with SmaI and HindIII was ligated with the luciferase fragment. JM109 Escherichia coli cells were transformed to select 20 colonies; About half of them showed the presence of inserts; Eight clones with inserts were cleaved with NamHI and XhoI to further confirm the presence of luciferase; Seven of these were positive.
B. 양이온성 리포좀의 제조B. Preparation of Cationic Liposomes
양이온성 리포좀은 주로 CHCl3을 함유하는 유기 용매에 10 μmol DDAB 및 10 μmol 콜레스테롤를 용해시켜 표준 방법에 따라 제조하였다. 이 지질은 감압하 회전시켜 박막으로 건조시켰다. 이 지질막은 증류수를 첨가하여 수화시켜 20μmole/ml 의 농도에서 리포좀의 현탁액을 형성시켰다. 리포좀은 초음파로 크기대로 분류하거나 또는 기공크기 0.4 ㎛, 0.2㎛, 0.1㎛ 및 0.05㎛ 의 Nucleopore 폴리카르보네이트 막을 통해 순차적으로 압출시켜 약 200nm 미만 크기의 리포좀을 수득하였다 (Nucleopore Pleasanton, CA).Cationic liposomes were prepared according to standard methods by dissolving 10 μmol DDAB and 10 μmol cholesterol primarily in an organic solvent containing CHCl 3 . This lipid was spun under reduced pressure and dried into a thin film. This lipid membrane was hydrated with the addition of distilled water to form a suspension of liposomes at a concentration of 20 μmole / ml. Liposomes were sized by ultrasound or extruded sequentially through Nucleopore polycarbonate membranes of pore sizes 0.4 μm, 0.2 μm, 0.1 μm and 0.05 μm to obtain liposomes of size less than about 200 nm (Nucleopore Pleasanton, Calif.).
C. 응축된 플라스미드의 제조C. Preparation of Condensed Plasmids
전술한 바와 같이 제조된 루시퍼라아제를 코딩하는 DNA 플라스미드 pNSL 은 하기의 절차에 따라 응축시켰다. 400㎕ 의 플라스미드 (증류수중 1mg/ml)를 310㎕ 의 증류수로 희석시킨후 50% 글루코오스 90 ㎕와 혼합시켰다. 원액 (증류수중 1mg/ml)에서 취한 100 ㎕의 다가양이온성 응축제 (전 히스톤, 히스톤 H1, 히스톤 H4, 폴리-1-글루타민, 멜리틴 또는 폴리마이신 B)를 교반하면서 서서히 플라스미드 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 10 분간 교반시켰다.The DNA plasmid pNSL encoding luciferase prepared as described above was condensed according to the following procedure. 400 μl of plasmid (1 mg / ml in distilled water) was diluted with 310 μl of distilled water and mixed with 90 μl of 50% glucose. 100 μl of a polycationic condensate (former histone, histone H1, histone H4, poly-1-glutamine, melittin or polymycin B) taken from the stock solution (1 mg / ml in distilled water) was slowly added to the plasmid solution with stirring. . This mixture was stirred for 10 minutes.
D. 복합체의 제조D. Preparation of the Complex
14 nmole 지질/㎍ 플라스미드의 리포좀 지질/플라스미드 비를 갖는 플라스미드-리포좀 복합체를 280㎕의 리포좀을 350㎕의 증류수에 희석 현탁시킨후 70㎕ 의 50% 글루코오스를 첨가하여 제조하였다. 응축된 플라스미드의 현탁액을 10 분간 연속적으로 교반하면서 묽은 양이온성 리포좀 현탁액에 서서히 첨가시켰다.A plasmid-liposomal complex having a liposome lipid / plasmid ratio of 14 nmole lipid / μg plasmid was prepared by diluting and suspending 280 μl of liposome in 350 μl of distilled water and then adding 70 μl of 50% glucose. The suspension of condensed plasmid was slowly added to the dilute cationic liposome suspension with continuous stirring for 10 minutes.
실시예 2Example 2
생체내 트랜스펙션 절차In vivo Transfection Procedure
플라스미드-리포좀 복합체에 의한 생체내 트랜스펙션은 Simonsen(Gilroy, CA)사로 부터 입수한 BALB/c 마우스로 실시하였다. 각 플라스미드-리포좀 복합체 제제를 꼬리 정맥을 통해 3 마리의 마우스에 주사하였다. 이 마우스를 주사 24 시간후 죽여 조직 (폐, 간, 비장, 신장, 심장)를 채취한후 마취하 헤파린화 PBS(4C) 로 관류시켰다.In vivo transfection with plasmid-liposomal complexes was performed with BALB / c mice obtained from Simonsen (Gilroy, CA). Each plasmid-liposomal complex formulation was injected into three mice via the tail vein. The mice were killed 24 hours after injection to collect tissue (lung, liver, spleen, kidney, heart) and perfused with heparinized PBS (4C) under anesthesia.
0-4℃ 의 온도에서, 0.75ml의 세포 용해 시약 (Promega, Madison, WI)를 각각의 조직에 첨가하고, 이 조직을 20,000rpm 에서 1 분간 균질화시켰다. 상층액은 미세원심분리관에 넣어 10,000g 에서 5 분간 회전시켰다. 상층액을 수거하여 루시퍼라아제 및 단백질에 대해 분석하였다. 각 시료의 20 ㎕ 를 발광계로 즉시 측정하였다(100㎕의 루시페린 및 ATP 함유 분석 버퍼, 10초 측정). 상대광단위는 추출물내 단백질의 양으로 표준화하였다.At a temperature of 0-4 ° C., 0.75 ml of cell lysis reagent (Promega, Madison, Wis.) Was added to each tissue and the tissue was homogenized for 1 minute at 20,000 rpm. The supernatant was placed in a microcentrifuge tube and spun at 10,000 g for 5 minutes. Supernatants were harvested and analyzed for luciferase and protein. 20 μl of each sample was measured immediately with a luminometer (100 μl luciferin and ATP containing assay buffer, 10 second measurement). Relative light units were normalized to the amount of protein in the extract.
실시예 3Example 3
생체내 트랜스펙션 종양보유 마우스In vivo Transfection Tumor-bearing Mice
A. 플라스미드-리포좀 복합체의 제조A. Preparation of Plasmid-Liposome Complexes
플라스미드-리포좀 복합체는 하기의 플라스미드를 이용하여 실시예 1 의 절차에 따라 제조하였다: 실시예 1 에 기재된 바와 같이 제조된 루시퍼라아제를 코딩하는 pNSL, 및 pCMVp53, pCMVIL2 및 pHSVtK (모두 시판품임).Plasmid-liposomal complexes were prepared according to the procedure of Example 1 using the following plasmids: pNSL encoding luciferase prepared as described in Example 1, and pCMVp53, pCMVIL2 and pHSVtK (all commercially available).
B. 종양 접종B. Tumor Inoculation
80 마리의 B6C3-F1 수컷 마우스를 Taconic Farms (German Town, NY)사로 부터 입수하여 실험 개시전 3 일동안 순치시켰다. 이 동물들은 살균된 설치류 사료 및 산성화수가 공급된(12:12 명암주기) 적절히 분리된 우리에 수용시켰다. 이 동물들은 체중에 따라 종양 접종전 치료군으로 무작위로 추출하였다 이 동물들은종양의 접종전 치료군으로 무작위로 추출하였다.80 B6C3-F1 male mice were obtained from Taconic Farms (German Town, NY) and incubated for 3 days prior to the start of the experiment. These animals were housed in sterile rodent food and properly segregated cages fed with acidified water (12:12 contrast cycle). These animals were randomly extracted into pre-tumor treatment groups according to body weight. These animals were randomized into pre-inoculation treatment groups of tumors.
모든 동물에서 일반적 상태에 대하여 매일 관찰하였다. 이 동물들은 종양세포의 접종전 체중을 재고 이후 주마다 2 회 체중을 쟀다. 초기 체중보다 15% 이상 체중이 감소한 것으로 관찰되거나 또는 피로해 보이는 임의의 동물을 안락사시켜 폐, 간 및 비장에서 전이부위의 존재 및 크기에 대하여 조사하였다.All animals were observed daily for general condition. These animals were weighed before inoculation of tumor cells and weighed twice per week. Any animal that was observed to be at least 15% less than the initial body weight or was found to be tired was euthanized and examined for the presence and size of metastatic sites in the lungs, liver and spleen.
종양은 안락사후 멸균상태에서 수술로 다른 B6C3-F1 마우스로부터 성장중인 루이스 폐 종양을 취하여 접종시켰다. 이 종양은 가능한한 기계적으로 미세하게 잘게 썰어 콜라게나아제, 프로테아제 및 DNAse의 효소 혼합물에서 간략하게 분해시켰다(37℃). 배지(RPMI+15%FCS)에서 분해 및 세정시킨후, 혈구기로 세포를 계수하였다. 세포는 스핀다운시켜 배지에 106세포/ml(105세포/0.1ml 주사액)로 재현탁시켰다. 재현탁된 세포는 개별의 시린지 (0.1ml, 연속적으로 혼합하면서)로 빨아 올려 각 동물의 꼬리 정맥에 정맥주사하였다.Tumors were inoculated by taking Louis Lewis tumors growing from other B6C3-F1 mice surgically in sterile post euthanasia. The tumor was chopped as finely as possible mechanically and briefly digested (37 ° C.) in an enzyme mixture of collagenase, protease and DNAse. After digestion and washing in medium (RPMI + 15% FCS), cells were counted with hemocytometer. The cells were spun down and resuspended in medium at 10 6 cells / ml (10 5 cells / 0.1 ml injection). Resuspended cells were sucked up into individual syringes (0.1 ml, mixed continuously) and injected intravenously into the tail veins of each animal.
C. 처리C. Treatment
동물들은 종양 세포로 접종후 3 일째부터 하기 표5 에 기재된 8 개의 양생법중 하나로 처리하였다. 간시클로비르 처리군 번호 30 및 병행치료의 일부로 간시클로비르가 투여된 동물 (군번호 32,33)에 대하여 나타낸 경우만 제외하고, 각각의 군에서 10 마리를 1 주일 간격으로 5 회 처리하였다.Animals were treated with one of the eight curing methods described in Table 5 below from day 3 post inoculation with tumor cells. Ten animals in each group were treated five times at weekly intervals, except as indicated for Gancyclovir treated group No. 30 and animals administered Gancyclovir as part of the combination therapy (groups 32,33).
마지막 처리 24 시간후, 생존한 동물을 안락사시켜 조직 및 종양을 수거하여 조사하였다. 각 처리군에 대한 생존 동물의 퍼센트는 도 14A-14C 에 나타내었다. 제제 번호 34 의 독성은 도 15 에 나타내었고 제제 번호 34의 루시퍼라아제 발현량은 도 16 에 나타내었다.Twenty four hours after the last treatment, surviving animals were euthanized to collect and examine tissues and tumors. The percentage of surviving animals for each treatment group is shown in Figures 14A-14C. The toxicity of Formulation No. 34 is shown in FIG. 15 and the luciferase expression level of Formulation No. 34 is shown in FIG. 16.
비록 본 발명은 특정 구현예와 관련하여 기술되었지만, 당업자에게는 다양한 변경 및 변형이 본 발명에서 벗어나지 않으면서 행해질 수 있음이 명백하다.Although the present invention has been described in connection with specific embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made without departing from the invention.
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