KR20010103772A - 공유적으로 가교결합된 인슐린 이량체 - Google Patents

공유적으로 가교결합된 인슐린 이량체 Download PDF

Info

Publication number
KR20010103772A
KR20010103772A KR1020017010815A KR20017010815A KR20010103772A KR 20010103772 A KR20010103772 A KR 20010103772A KR 1020017010815 A KR1020017010815 A KR 1020017010815A KR 20017010815 A KR20017010815 A KR 20017010815A KR 20010103772 A KR20010103772 A KR 20010103772A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
insulin
insulin analogue
group
analogue
dimer
Prior art date
Application number
KR1020017010815A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100658961B1 (ko
Inventor
획커하르트빅
하베니트찬탈레
브란덴부르그디트리히
Original Assignee
로버트 흐라이탁, 미쉘 베스트
아벤티스 파마 도이칠란트 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 로버트 흐라이탁, 미쉘 베스트, 아벤티스 파마 도이칠란트 게엠베하 filed Critical 로버트 흐라이탁, 미쉘 베스트
Publication of KR20010103772A publication Critical patent/KR20010103772A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100658961B1 publication Critical patent/KR100658961B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 화학식 I의 인슐린 유사체(이때, X는 서로 독립적으로, 측쇄 또는 비측쇄 C1-C10-알킬 그룹, 일- 또는 다치환된 아릴 그룹, C1-C10-알킬 그룹, 일- 또는 다치환되거나 치환되지 않은 O-아릴 그룹, 아미노산 또는 이의 유도체, 또는 화학식 NRR'의 그룹이고; R 및 R'은 H, NH2, 측쇄 또는 비측쇄 C1-C10-알킬 잔기 또는 일- 또는 다치환되거나 치환되지 않은 아릴 그룹이며; n은 0 내지 16의 수이다)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 인슐린 유사체를 함유하는 약제, 당뇨병 치료용 약제의 제조 방법 및 인슐린 유사체의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

공유적으로 가교결합된 인슐린 이량체{Covalently bridged insulin dimers}
본 발명은 신규한 인슐린 유사체, 상기 인슐린 유사체를 포함하는 약제, 당뇨병 치료를 위한 약제 생산 방법, 및 인슐린 유사체의 제조 방법에 관한 것이다.
단백질호르몬인 인슐린은 랑게르한스 섬의 β세포에서 생산된다. 인슐린의 가장 중요한 생리학적 효과는 혈당 수준의 감소를 포함한다. 인슐린 결핍은 비정상적인 글루코오스 대사로 특성화되는 진성 당뇨병(I형)의 복합 병리학적 상태를 초래한다.
진성 당뇨병은 약제학적 제제 중 인슐린 및 인슐린 유사체를 사용하여 치료한다. 가장 광범위하게 사용되는 요법인 보충 요법(replacement therapy)에서, 인슐린은 피하로 투여된다. 이러한 방법의 가장 일반적인 부작용은 저혈당증(낮은 혈당 수준)이다. 당뇨병 요법을 위한 인슐린의 약제학적 제제의 지속적인 개발에도 불구하고, 부작용 감소와 함께 이의 효능을 기대할 만한 신규한 인슐린 유사체에 대한 탐색은 지속되고 있다. 따라서, 예를 들면, 즉효성 "인슐린 리스프로(insulin lispro)"가 아미노산 프롤린B28및 라이신B29를 교체함으로써 개발된 바 있다[EP 제0 383 472 B1호]. 마찬가지로, 지효성(long-acting) 인슐린 유도체가 라이신B29의 ε-아미노 그룹의 지방산 아실화에 의해 개발된 바 있다[J.Markussen, S. Havelund, P. Kurtzhals, A. A. Andersen, J. Halstrom, E. Hasselager, U.D. Larsen, U. Ribel, L. Schaffer, K. Vad, I. Jonassen, Diabetologia 1996, 39, pp. 281-288]. 사람 인슐린의 천연 구조에 대한 상기 변형으로 인슐린의 시간 경과에 따른 작용에 영향을 미치는 것이 가능하기는 하지만, 적지 않은 문제점들이 여전히 풀리지 않고 있다: 치료에 사용할 수 있으며 단지 일부 조직 특이성, 특히 간선택성 (hepatoselectivity)을 통해서 생리학적 상태에 적합한 보다 표적화된 치료를 가능하게 하는 어떠한 인슐린 유사체도 현존하지 않는다. 보다 큰 잠능으로 인해 천연 구조를 갖는 사람 인슐린 또는 동물 인슐린 보다 더 소량으로 사용할 수 있는 어떠한 유사체에 대한 기술도 존재하지 않는다.
당뇨병 치료에 사용되는 모든 인슐린은 항상 분자량 약 6000의 단량체성 인슐린 분자이다. 모든 단량체성 인슐린 유사체 및 유도체는 부분적인 또는 완전한 인슐린 효능제[S. Gammeltoft, Physiol. Rev. 1984, 64, p. 1321]인 것으로 입증되었으며 수용체 결합 및 생물학적 신호 유발 사이에 밀접한 상관 관계를 나타낸다. 단지 몇몇의 경우, 예를 들면, 공유적으로 가교결합된 인슐린 이량체의 경우, 수용체 결합 및 생물학적 활성 사이에서 차이점이 관찰되었다[A Schuttler, D. Brandenburg, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982, 363, pp. 317-330, M. Weiland, C. Brandenburg, D. Brandenburg, H.G. Joost, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990 87, pp. 1154-1158]. 또한, 인슐린 이량체는 상이한 조직에서 인슐린 수용체를 분화시키는데 유용한 것으로 입증되었다[M. Breiner, M. Weiland, W. Becker, D. Muller-Wieland, R. Streicher, M. Fabry, H.G. Joost, MolecularPharmacology 1993, 44, pp. 271-276]. 따라서, 인슐린 이량체는 병리학적 증상에서 진단에 기본적으로 중요하다.
현재까지 기술된 모든 이량체는 이의 천연 길이의 인슐린 두개의 공유결합과 관련된다. 인슐린 이량체는 주로 치료용으로 특별한 관심의 대상이 되고 있으며, 이들이 동물 실험에서 상대적으로 간선택성을 나타내기 때문에[천연 구조를 갖는 B1,B1'-서베로일-인슐린 이량체에 대해서 입증됨, F. Shojaee-Moradie, N.C. Jackson, M. Boroujerdi, D. Brandenburg, P.H. Sonksen, R.H. Jones, Diabetologia 1995, 38, pp. 1007-1013], 따라서 당뇨병 치료에서 현재까지 사용된 모든 인슐린 보다 혈당 수치를 더 많이 생리학적으로 감소시키는 것이 가능하다. 그러나, 상기 문헌에서 사용된 B1,B1'-서베로일-인슐린 이량체는 수용체 결합 보다 현저하게 보다 더 낮은 시험관내 생활성을 나타낸다[수용체 결합 157 내지 199%와 비교하여 생활성 28.8%, M.A. Tatnell, R.H. Jones, K.P. Willey, A. Schuttler, D. Brandenburg, Biochem. J. 1983, 216, pp. 687-694]. 따라서, 생활성 대 수용체 결합 비율은 0.15 내지 0.18로 매우 낮다. 본 발명자들은 당뇨병 치료를 향한 이러한 발견들의 응용 또는 추가의 발전에 대해 인지한 바 없다.
본 발명자들은 본원에 이르러, 이의 특성으로 인해 상기 언급된 문제점들에 대한 해결책 및 개선된 당뇨병 치료법을 기대할 수 있고, 이후 인슐린 유사체로서 인용되는, 신규한 인슐린 이량체를 디자인하고 합성하였다. 이와 관련하여, 단량체성 인슐린을 사용하는 현재까지의 치료법과 비교하여 본 발명자들의 방법의 독특한 특징은 인슐린 유사체가 가교를 통해 함께 공유결합된 두 개의 동일하거나 상이한 인슐린 단량체로 이루어진다는 것이며, 이때, 인슐린 단량체는 사람 인슐린 및 동물 인슐린, 상기 언급된 인슐린의 유도체를 포함하는 그룹으로부터 선택되며, 인슐린 유사체의 두 개의 인슐린 단량체 중 하나 이상은 유도체이며, 이의 생리학적으로 허용되는 염이 사용된다. 특히, B쇄의 C 말단이 말단 절단되고 B26 위치에서 변형된 인슐린 유사체가 사용된다. 상기 인슐린 단량체는 단백질을 결합하는데 적합한 물질에 의해 가교결합될 수 있다. 상기 물질 및 단백질 결합 방법은 오랫동안 공지되어져 왔다. 특히, 신규한 인슐린 유사체는 바람직하게는, 두 개의 인슐린 단량체의 B쇄의 N-말단 아미노 그룹 사이에 위치하는 가교 결합을 가지며, 화학식 (CRR')n(CO-)2(여기서, n, R, R'은 화학식 I에 대해서 하기 언급되는 바와 같이 정의된다)의 직쇄 또는 측쇄 이기능성 카복실산 잔기로부터 특히 바람직하게 형성된다. 동물 인슐린의 예는 돼지, 원숭이, 소 및 닭 인슐린이 있다. 인슐린 유도체는 상응하는 그밖에는 동일한 천연 발생 인슐린으로부터 천연 아미노산 잔기 하나 이상의 치환 및/또는 결실 및/또는 천연 아미노산 및/또는 유기 잔기 하나 이상의 부가로 인해 상이한 상기 인슐린의 유도체이다. 인슐린 유도체 단량체의 한 가지 예는 Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32) 사람 인슐린이 있고, 본 발명의 이량체성 인슐린 유사체의 한 가지 예는 B1,B1-Sub-[D-AlaB26]-des-[B27-B30]-인슐린-B26-아미드 인슐린 이량체이다. 상기 인슐린 유사체는 특히, 화학식 I로 기술할 수 있다.
상기식에서,
X는 서로 독립적으로, 측쇄 또는 비측쇄 C1-C10-알킬 그룹, 일- 또는 다치환된 아릴 그룹, C1-C10-알킬 그룹, 일- 또는 다치환되거나 치환되지 않은 O-아릴 그룹, 아미노산 또는 이의 유도체, 또는 화학식 NRR'의 그룹이고,
R 및 R'은 H, NH2, 측쇄 또는 비측쇄 C1-C10-알킬 라디칼 또는 일- 또는 다치환되거나 치환되지 않은 아릴 그룹이고,
n은 0 내지 16의 수이다.
본 발명은 추가로 X가 이의 카복실산 그룹이 아미드화되는 아미노산 유도체인, 상기된 화학식 I의 인슐린 유사체에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 X가 이의 카복실산이 아미드화되는 아미노산 사르코신 (sarcosine)인, 상기된 화학식 I의 인슐린 유사체에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 두 개의 B쇄 중 X 잔기가 서로 상이한, 상기된 화학식 I의 인슐린 유사체에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 X가 아미노 그룹인, 상기된 화학식 I의 인슐린 유사체에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 상기 인슐린 유사체를 포함하는 약제, 당뇨병을 치료하기 위한 약제 제조 방법 및 인슐린 유사체 제조 방법에 관한 것이다.
인슐린 유사체는 두 개의 임의로 부분적으로 보호된 단량체성 분자를 예비활성화된 디카복실산으로 가교결합시켜 공지된 방식으로 제조한다[A Schuttler, D. Brandenburg, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982, 363, pp. 317-330]. 상기 단량체성 유사체는 효소-촉매된 반합성법 또는 유전자 조작법(본 발명의 실시예 참조)으로 수득할 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가로,
(a) 단량체성 인슐린 유사체를 효소-촉매된 반합성법 또는 유전자 조작법으로 수득하는 단계,
(b) 단계 (a)로부터의 단량체성 인슐린 유사체를 보호 그룹으로 임의로 부분적으로 보호하는 단계,
(c) 단계 (b)로부터의 보호된 단량체성 인슐린 유사체 및/또는 단계 (a)로부터의 단량체성 인슐린 유사체를 예비활성화된 디카복실산과 반응시키는 단계, 및
(d) 단계 (c)에서 수득된 인슐린 유사체를 반응 혼합물로부터 분리시키는 단계를 포함하여, 상기 언급된 바와 같이 인슐린 유사체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
사람 인슐린 및 단량체성 인슐린 유사체와 비교하여, 본 발명의 이량체는 시험관내에서 인슐린 수용체에 대한 특히 높은 친화도 및 인슐린 효과의 20배에 달하는 강력한 잠능(superpotency)으로 구별된다.
이전에 기술된 공유결합 인슐린 이량체와는 상이하게, 신규한 이량체는 매우 높은 생활성을 나타낸다. 생활성 대 수용체 결합 비율은 2 이상, 및 일부의 경우에는 4 내지 5이다. 따라서, 이들은 현저하게 보다 더 생물학적으로 효과적이다. 이러한 몫과 B1,B1'-서베로일 이량체에 대해서 문헌에서 기술된 몫을 비교한 결과, 11 이상(0.18:2)의 역가 및 최고 28의 역가를 나타낸다.
본 발명의 인슐린 이량체를 사용하여 달성되는 잇점은 특히,
1. 현재까지 치료학적으로 사용되는 인슐린 및 모든 유사체와 비교하여, 상대적으로 간선택성이며, 따라서 효과가 보다 생리학적 방식(제1 효과 부위는 간이며 말초 조직이 아니다)인 것으로 예견되며,
2. 이전에 기술된 인슐린 이량체와 비교하여, 처음으로 현저하게 개선된 생물학적 효능이 존재하며,
3. 인슐린 및 단량체성 유사체와 비교하여 현저하게 증가된 생물학적 활성은 현저하게 더 적은 양의 활성 물질을 사용하여 동등한 효과를 달성할 수 있기 때문에, 사용시 매우 유리할 수 있는 것으로 나타난다는 점이다.
약어
AA 아미노산
Ac 아세테이트(CH3COO-)
Alox 산화알루미늄(Al2O3)
CZE 모세영역 전기영동
DIPEA N,N'-디이소프로필에틸아민
DMF 디메틸포름아미드
DMSO 디메틸 설폭사이드
DOI 데스옥타펩타이드 인슐린
Eq 당량
Fmoc 9-플루오레닐메톡시카보닐
HOBt 1-하이드록시벤조트리아졸
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
MALDI 매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화
MPLC 중간압 액체 크로마토그래피
Msc 메틸설포닐에톡시카보닐
MW 분자량
NaOH 수산화나트륨
NMM N-메틸모르폴린
RP 역상
ONSu N-옥시석신이미드 에스테르
Sar 사르코신
Sub 서베로일
TBTU 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄
테트라플루오로보레이트
TEA 트리에틸아민
TFA 트리플루오로아세트산
TOF 경과 시간
TPCK 토실-L-페닐알라닐 클로로메틸 케톤
Tris 트리스-(하이드록시메틸)아미노메탄
실시예 1
B1,B1'-Sub-[SarB26]-des-(B27-B30)-인슐린-B26-아미드 인슐린 이량체의 합성
테트라펩타이드 Gly-Phe-Phe-Sar-NH 2 의 합성
상기 펩타이드는 Fmoc 보호 그룹 전술을 사용하여 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)페녹시 수지 상에서 합성한다. 커플링에 사용되는 Fmoc-아미노산 에스테르는 TBTU/HOBt 방법으로 형성되며 소량의 수지 충전에 기초하여 3몰 과량으로 사용된다. 상기 펩타이드는 하기 합성 프로토콜에 따라서 합성한다.
번호 공정 시약/용매 지속 시간 반복
1 수지의 팽창 DMF 1분 1회
2 Fmoc 그룹의 제거 DMF중 20% 피페리딘 6분 3회
3 세척 DMF 0.5분 3회
4 세척 2-프로판올 0.5분 2회
5 케이저 시험*
6 수지의 팽창 DMF 1분 1회
7 AA의 커플링 Fmoc-AA 3당량,각각 TBTU, HOBt 3당량 및5㎖ DMF 중 NMM 4.5당량 45분 1회
8 세척 DMF 0.5분 3회
9 세척 2-프로판올 0.5분 2회
10 케이저 시험**
11 수지의 팽창 DMF 1분 1회
12 반응되지 않은 아미노 말단 그룹의 차단 DMF 5㎖ 중 Ac2O 400㎕ 및DIPEA 200㎕ 10분 1회
13 세척 DMF 0.5분
14 세척 2-프로판올 0.5분
*) 시험이 포지티브의 경우 계속**) 시험이 네가티브인 경우 계속; 시험 결과가 포지티브인 경우엔 단계 6 내지 9를 반복한다
상기 펩타이드는 양이온 트랩으로서 95% TFA, 4% H2O 및 1% 트리에틸실란으로 이루어진 제거 용액 10㎖를 부가하여 산용해에 의해 수지로부터 제거한다. 실온에서 2시간 동안 교반시킨 후, 상기 수지를 여과시켜 디클로로메탄으로 완전히 세척한다. 여액을 증발시켜 건조시킨다.
펩타이드의 추가의 정제는 선형 2-프로판올 구배(0.07% TFA 출발 완충액 및 피드 완충액 각각 400㎖ 중 0 내지 40% 2-프로판올)를 사용하여 RP-MPLC 컬럼 크로마토그래피로 수행한다. 뉴클레오실 20-C18을 정지상으로서 사용한다. 유속은 180 내지 200㎖/h(수율 82.6%)이다.
[Sar B26 ]-des-(B27-B30)-인슐린-B26-아미드의 반합성
B쇄의 말단 절단된 C 말단을 갖는 인슐린을 테트라펩타이드를 NαA1-Msc-des-(B23-B30)-인슐린에 효소적으로 커플링시켜 합성한다. 이러한 목적을 위해서, 우선 천연 인슐린을 DOI로 효소적으로 분해시키는 것이 필요하며, 이후 DOI를 보호 그룹과 함께 일부 제공한다.
des-(B23-B30)-인슐린의 합성
인슐린 300㎎(51.66μmol)을 반응 완충액(0.05M Tris, 1mmol CaCl2) 60㎖에 부가한다. 고체 Tris를 사용하여 pH를 9.5로 조정한 후, TPCK-처리된 트립신 16㎎을 부가하여 단백질 가수분해적 분해를 개시한다. 37℃ 수욕에서 약 6시간 동안 항온처리를 수행하면서, RP-HPLC로 반응을 모니터링한다. 반응은 빙초산 4㎖를 부가하여 종결시키고, 반응 혼합물을 회전 증발기에서 농축시킨다. 후처리는 우선 Sephadex G 25f 겔 여과 및 후속적인 Sephadex G 50f 겔 여과로 수행한다. 생성물을 동결건조시킨다(수율 73.3%). MW: 4865
N αA1 -(Msc)-des-(B23-B30)-인슐린의 합성
des-(B23-B30)-인슐린 300㎎(61.66μmol)을 TEA 225㎕를 부가하면서 DMSO 22.5㎖에 용해시킨다. 조심스럽게 교반시키면서, DMSO 5㎖ 중 Msc-ONSu 18㎎ (67.86μmol)의 용액을 부가한다. 20분의 반응 시간 후, 반응은 빙초산 750㎕를 부가하여 종결시키고, 반응 용액을 16시간 동안 4℃에서 탈염수에 대해서 투석시킨다. 보유액을 동결-건조시킨다. 추가 정제를 위해서, 이온-교환 크로마토그래피를 SP-Sepharose(pH 3; 출발 완충액 350㎖, 0.09M NaCl 피드 완충액 350㎖) 상에서 수행하고 탈염은 Sephadex G 25f 상에서 수행한다. 생성물은 동결건조시킨다(수율 30.8%). MW: 5015.16
Gly-Phe-Phe-Sar-NH 2 의 N αA1 -(Msc)-des-(B23-B30)-인슐린에 대한 트립신 커플링
Gly-Phe-Phe-Sar-NH2132.75㎎(300μmol) 및 NαA1-Msc-des-(B23-B30)-인슐린150.45㎎(30μmol)을 DMF(Alox 상에서 교반시킴) 2㎖, 1,4-부탄디올 2㎖ 및 0.05M Ca(CH3COO)2용액 400㎕에 용해시키거나 현탁시킨다. 겉보기 pH를 NMM을 사용하여 6.7 내지 7.0으로 조정한다. 후속적으로, 0.05M Ca(CH3COO)2용액 100㎕ 중에 용해시킨 TPCK-처리된 트립신 23㎎을 반응 혼합물에 부가한다. 반응 시간 동안, 반응의 진행은 RP-HPLC로 확인하고 pH를 확인하고 NMM을 사용하여 적합하게 재조정한다. 거의 90%의 전환이 4.5시간 후에 달성될 수 있다. 반응은 30% 아세트산 4.5㎖를 부가하여 종결시킨다. 효소, 펩타이드 및 기타 저분자량 물질은 Sephadex G 50f 겔 크로마토그래피로 제거한다. 반응하지 않은 펩타이드는 후속적으로 RP-MPLC로 정제하여 회수한다. 인슐린 유도체의 추가의 정제는 뉴클레오실 100-10C8상에서 예비 RP-HPLC(5.0㎝ 예비 컬럼을 갖는 2.0㎝ 직경, 25.0㎝ 길이)로 수행한다(수율 48.6%). MW: 5290.2
B1,B1'-Sub-[Sar B26 ]-des-(B27-B30)-인슐린-B26-아미드 인슐린 이량체의 합성
NαA1-Msc-[SarB26]-des-(B27-B30)-인슐린-B26-아미드 100㎎(18.9μmol)을 HOBt 5.5 당량의 부가와 함께, DMSO 400㎕, DMF 8.7㎕ 및 NMM 9.5㎕에 용해시킨다. 30분 후, 수베르산 비스-ONSu 에스테르 0.6당량을 고체 형태로 부가하고 8 내지 30시간 동안 교반시킨다. 전체 반응 혼합물을 빙초산 300㎕를 부가하면서 10% 아세트산 1.5㎖중에 부가하고 Sephadex G 50f 상에서 크로마토그래피한다. 이량체 분획을 동결건조시킨다. Msc 그룹을 제거하기 위해서, Msc-보호된 단백질 100㎎을 디옥산/물 혼합물(2/1, v/v) 5㎖에 용해시키고 0℃로 냉각시킨다. 2N NaOH 514㎕를 부가하고 혼합물을 120초 동안 0℃에서 교반시킨다. 반응은 빙초산 2.2㎖를 부가하여 종결시킨다. 반응 혼합물을 Sephadex G 25f 상에서 겔 크로마토그래피하고 동결건조시킨다(수율 11.9%).
상기 중간체들 및 최종 생성물의 특성화는 RP-HPLC, 산성 CZE 및 MALDI-TOF 질량분광분석에 의해 수행한다(표 1).
B1,B1'-Sub-[SarB26]-des-(B27-B30)-인슐린-B26-아미드 인슐린 이량체의 합성시 수율, RP-HPLC 및 CZE에 따른 순도 및 질량
유도체 수율(%) 순도(%)RP-HPLC CZE MW(g/mol)계산치 실측치
Gly-Phe-Phe-Sar-NH2 82.6 98.5 > 99 442.5 463.2*
A1-Msc-DOI-Gly-Phe-Phe-Sar-NH2 48.6 95.6 > 99 5441.2 5439
B1,B1'-Sub-DOI-Gly-Phe-Phe-Sar-NH2이량체 14.4 90 > 99 10,720 10,710
* 나트륨 부가물(M=23)
실시예 2
B1,B1'-Sub-[D-AlaB26]-des-(B27-B30)-인슐린-B26-아미드 인슐린 이량체의 합성
상기 말단 절단된 인슐린 이량체의 합성은 합성 테트라펩타이드 Gly-Phe-Phe-D-Ala-NH2를 사용한다는 것을 제외하고는, 본 발명의 실시예 1에서 기술된 합성과 유사하게 수행한다. 상응하는 수율, 순도 및 질량은 표 2에 나타낸다.
B1,B1'-Sub-[D-AlaB26]-des-(B27-B30)-인슐린-B26-아미드 인슐린 이량체의 합성시 수율, RP-HPLC 및 CZE에 따른 순도 및 질량
유도체 수율(%) 순도(%)RP-HPLC CZE MW(g/mol)계산치 실측치
Gly-Phe-Phe-D-Ala-NH2 61.6 99.1 > 99 442.5 463.2*
A1-Msc-DOI-Gly-Phe-Phe-D-Ala-NH2 53.9 95.1 > 99 5441.2 5439.4
B1,B1'-Sub-DOI-Gly-Phe-Phe-D-Ala-NH2이량체 11.9 88.1 > 99 10,720 10,713
* 나트륨 부가물
실시예 3
B1,B1'-Sub-[GluB26]-des-(B27-B30)-인슐린-B26-아미드 인슐린 이량체의 합성
상기 말단 절단된 인슐린 이량체의 합성은 합성 테트라펩타이드 Gly-Phe-Phe-Glu-NH2를 사용한다는 것을 제외하고는, 본 발명의 실시예 1에 기술된 합성과 유사하게 수행한다. 상응하는 수율, 순도 및 질량은 표 3에 나타낸다.
B1,B1'-Sub-[GluB26]-des-(B27-B30)-인슐린-B26-아미드 인슐린 이량체의 합성시 수율, RP-HPLC 및 CZE에 따른 순도 및 질량
유도체 수율(%) 순도(%)RP-HPLC CZE MW(g/mol)계산치 실측치
Gly-Phe-Phe-Glu-NH2 74.9 94.5 > 99 449.2 498.3
A1-Msc-DOI-Gly-Phe-Phe-Glu-NH2 38.6 95.7 > 99 5498.2 5497.6
B1,B1'-Sub-DOI-Gly-Phe-Phe-Glu-NH2이량체 15.8 > 99 > 99 10,826 10,833
실시예 4
본 발명의 실시예 1 내지 3의 생물학적 특성
본 발명의 실시예 1 내지 3에서 기술된 이량체 B1,B1'-Sub-[Sar, D-Ala 또는 GluB26]-des-(B27-B30)-인슐린-B26-아미드 이량체의 생물학적 특성은 한편으로는 수용체 결합에 기초하여, 및 다른 한편으로는 시험관내 생활성에 기초하여 결정한다.
수용체 결합은 IM-9 임파구에서 전위 연구로 결정한다. 상대적인 생물학적 활성은 글루코오스 수송 형태에서 배양한 3T3-L1 지방세포에서 결정한다. 표 4는 합성 인슐린 이량체의 결합 친화도 및 상대적인 생물학적 활성을 나타낸다.
천연 인슐린과 비교한 모든 인슐린 이량체의 상대적인 수용체 결합(IM-9 임파구에서 결정함) 및 상대적인 생물학적 활성(배양한 3T3-L1 지방세포에서 결정함)
이량체 상대적인 수용체결합(%) 상대적인 생물학적활성(%)
B1,B1'-Sub-[SarB26]-des-(B27-B30)-인슐린-B26-아미드인슐린 이량체 412 ±94.8 1957 ±575
B1,B1'-Sub-[D-AlaB26]-des-(B27-B30)-인슐린-B26-아미드인슐린 이량체 357 ±53.6 814 ±184
B1,B1'-Sub-[GluB26]-des-(B27-B30)-인슐린-B26-아미드인슐린 이량체 176 ±45.8 817.5 ±224
참고 문헌
1. J. Markussen, S. Havelund, P. Kurtzhals, A.A. Andersen, J. Halstrom, E. Hasselager, U.D. Larsen, U. Ribel, L. Schaffer, K. Vad, I. Jonassen, Diabetologia 1996, 39, pp. 281-288.
2. European patent EP 0 383 472 B1.
3. S. Gammeltoft, Physiol Rev. 1984, 64, p. 1321.
4. A Schuttler, D. Brandenburg, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982, 363, pp. 317-330.
5. M. Weiland, C. Brandenburg, D. Brandenburg, H.G. Joost, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990 87, pp. 1154-1158.
6. M. Breiner, M. Weiland, W. Becker, D. Muller-Wieland, R. Streicher, M. Fabry, H.G. Joost, Molecular Pharmacology 1993, 44, pp. 271-276.
7. F. Shojaee-Moradie, N.C. Jackson, M. Boroujerdi, D. Brandenburg, P.H. Sonksen, R.H. Jones, Diabetologia 1995, 38, pp. 1007-1013.
8. M.A. Tatnell, R.H. Jones, K.P. Willey, A. Schuttler, D. Brandenburg, Biochem. J. 1983, 216, pp. 687-694.

Claims (14)

  1. 인슐린 단량체가 사람 인슐린, 동물 인슐린 및 사람 인슐린과 동물 인슐린의 유도체를 포함하는 그룹으로부터 선택되며, 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 유도체 하나 이상이 인슐린 유사체내에 존재하는, 가교를 통해 함께 공유결합되는 두 개의 동일하거나 상이한 인슐린 단량체로 이루어진 인슐린 유사체, 및 이의 생리학적으로 허용되는 염.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 I의 인슐린 유사체.
    화학식 I
    상기식에서,
    X는 서로 독립적으로, 측쇄 또는 비측쇄 C1-C10-알킬 그룹, 일- 또는 다치환된 아릴 그룹, C1-C10-알킬 그룹, 일- 또는 다치환되거나 치환되지 않은 O-아릴 그룹, 아미노산 또는 이의 유도체, 또는 화학식 NRR'의 그룹이고,
    R 및 R'은 H, NH2, 측쇄 또는 비측쇄 C1-C10-알킬 라디칼 또는 일- 또는 다치환되거나 치환되지 않은 아릴 그룹이고,
    n은 0 내지 16의 수이다.
  3. 제2항에 있어서, X가 이의 카복실산 그룹이 아미드화되는 아미노산인 인슐린 유사체.
  4. 제3항에 있어서, X가 아미노산 사르코신인 인슐린 유사체.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 두 개의 B쇄 중 X 잔기가 서로 상이한 인슐린 유사체.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서, X가 아미노 그룹인 인슐린 유사체.
  7. B1,B1-Sub-[SarB26]-des-(B27-B30)-인슐린-B26-아미드 인슐린 이량체.
  8. B1,B1-Sub-[D-AlaB26]-des-(B27-B30)-인슐린-B26-아미드 인슐린 이량체.
  9. B1,B1-Sub-[GluB26]-des-(B27-B30)-인슐린-B26-아미드 인슐린 이량체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체, 및 아연 염, 페놀, m-크레졸, 글리세롤 및 완충 물질을 포함하는 그룹으로부터 선택된 부가물을 포함하는 약제학적 제제.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체를 포함하는 당뇨병 치료용 약제의 제조 방법.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서의 용도를 위한 인슐린 유사체.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체 하나 이상을 포함하는 진단 키트.
  14. (a) 단량체성 인슐린 유사체를 효소-촉매된 반합성법 또는 유전자 조작법으로 수득하는 단계,
    (b) 단계 (a)로부터의 단량체성 인슐린 유사체를 보호 그룹으로 임의로 부분적으로 보호하는 단계,
    (c) 단계 (b)로부터의 보호된 단량체성 인슐린 유사체 및/또는 단계 (a)로부터의 단량체성 인슐린 유사체를 예비활성화된 디카복실산과 반응시키는 단계, 및
    (d) 단계 (c)에서 수득된 인슐린 유사체를 반응 혼합물로부터 분리시키는 단계를 포함하여, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체의 제조 방법.
KR1020017010815A 1999-02-24 2000-02-24 공유적으로 가교결합된 인슐린 이량체, 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 진단 키트, 및 이의 제조방법 KR100658961B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19908041A DE19908041A1 (de) 1999-02-24 1999-02-24 Kovalent verbrückte Insulindimere
DE19908041.0 1999-02-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010103772A true KR20010103772A (ko) 2001-11-23
KR100658961B1 KR100658961B1 (ko) 2006-12-21

Family

ID=7898750

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020017010815A KR100658961B1 (ko) 1999-02-24 2000-02-24 공유적으로 가교결합된 인슐린 이량체, 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 진단 키트, 및 이의 제조방법

Country Status (16)

Country Link
US (1) US6908897B2 (ko)
EP (1) EP1161452B1 (ko)
JP (1) JP4519324B2 (ko)
KR (1) KR100658961B1 (ko)
CN (1) CN1200949C (ko)
AT (1) ATE428729T1 (ko)
AU (1) AU765076B2 (ko)
CA (1) CA2363639C (ko)
CY (1) CY1109241T1 (ko)
DE (2) DE19908041A1 (ko)
DK (1) DK1161452T3 (ko)
ES (1) ES2324093T3 (ko)
HK (1) HK1042710B (ko)
PT (1) PT1161452E (ko)
WO (1) WO2000050456A2 (ko)
ZA (1) ZA200106971B (ko)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6852694B2 (en) * 2001-02-21 2005-02-08 Medtronic Minimed, Inc. Stabilized insulin formulations
DE10114178A1 (de) * 2001-03-23 2002-10-10 Aventis Pharma Gmbh Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
US7713932B2 (en) 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US6713452B2 (en) 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828305B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6835802B2 (en) 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
US6828297B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
DE10227232A1 (de) * 2002-06-18 2004-01-15 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
EP2626368B1 (en) 2004-07-19 2016-12-21 Biocon Limited Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof
CN101062948B (zh) * 2006-04-29 2010-05-12 上海生物泰生命科学研究有限公司 单体速效胰岛素及其制法和用途
JP2009539778A (ja) * 2006-06-08 2009-11-19 ダイアベコア メディカル インコーポレイテッド インスリンオリゴマー誘導体
BRPI0818004B8 (pt) 2007-10-16 2021-05-25 Biocon Ltd composição farmacêutica sólida administrável por via oral e o processo da mesma.
WO2009099763A1 (en) 2008-01-30 2009-08-13 Indiana University Research And Technology Corporation Ester-based peptide prodrugs
LT2349324T (lt) 2008-10-17 2017-12-27 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulino ir glp-1 agonisto derinys
AR074811A1 (es) 2008-12-19 2011-02-16 Univ Indiana Res & Tech Corp Profarmaco de peptido de la superfamilia de glucagon basados en amida
CN102245624B (zh) * 2008-12-19 2016-08-10 印第安纳大学研究及科技有限公司 基于酰胺的胰岛素前药
CN102256992B (zh) 2008-12-19 2015-04-22 印第安纳大学研究及科技有限公司 胰岛素类似物
ES2534191T3 (es) 2009-11-13 2015-04-20 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Composición farmacéutica que comprende un agonista de GLP-1, una insulina y metionina
PL2498801T3 (pl) 2009-11-13 2018-08-31 Sanofi Aventis Deutschland Kompozycja farmaceutyczna zawierająca desPro<sup>36</sup>eksendyno-4(1-39)-Lys6-NH2 i metioninę
US8940860B2 (en) 2010-06-16 2015-01-27 Indiana University Research And Technology Corporation Single-chain insulin agonists exhibiting high activity at the insulin receptor
EP2585102B1 (en) 2010-06-24 2015-05-06 Indiana University Research and Technology Corporation Amide-based insulin prodrugs
HUE031181T2 (en) 2010-08-30 2017-06-28 Sanofi Aventis Deutschland Use of AVE0010 for the manufacture of a medicament for the treatment of type 2 diabetes
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
CN108079281A (zh) 2011-08-29 2018-05-29 赛诺菲-安万特德国有限公司 用于2型糖尿病患者中的血糖控制的药物组合
AR087744A1 (es) 2011-09-01 2014-04-16 Sanofi Aventis Deutschland Composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa
US9573987B2 (en) 2011-12-20 2017-02-21 Indiana University Research And Technology Corporation CTP-based insulin analogs for treatment of diabetes
AU2013323669B2 (en) * 2012-09-26 2018-03-01 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin analog dimers
AU2014241743B2 (en) 2013-03-14 2018-07-05 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin-incretin conjugates
US10385107B2 (en) 2014-09-24 2019-08-20 Indiana Univeresity Researc and Technology Corporation Lipidated amide-based insulin prodrugs
US10232020B2 (en) 2014-09-24 2019-03-19 Indiana University Research And Technology Corporation Incretin-insulin conjugates
PH12017500935A1 (en) * 2014-11-21 2017-11-27 Merck Sharp & Dohme Insulin receptor partial agonists
US9950039B2 (en) 2014-12-12 2018-04-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin glargine/lixisenatide fixed ratio formulation
TWI748945B (zh) 2015-03-13 2021-12-11 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患治療
TW201705975A (zh) 2015-03-18 2017-02-16 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患之治療
WO2017189342A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin dimer-incretin conjugates
EP3463429A4 (en) 2016-05-24 2020-07-22 Merck Sharp & Dohme Corp. PARTIAL INSULIN RECEPTOR AGONISTS AND GLP-1 ANALOGUES
EP3463413A4 (en) 2016-05-25 2020-03-04 Merck Sharp & Dohme Corp. PARTIAL INSULIN RECEPTOR AGONISTS

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9316895D0 (en) * 1993-08-13 1993-09-29 Guy S And St Thomas Hospitals Hepatoselective insulin analogues

Also Published As

Publication number Publication date
CY1109241T1 (el) 2014-07-02
CA2363639C (en) 2010-04-13
DE50015623D1 (de) 2009-05-28
ATE428729T1 (de) 2009-05-15
CN1200949C (zh) 2005-05-11
PT1161452E (pt) 2009-07-08
US20020160938A1 (en) 2002-10-31
JP2003525864A (ja) 2003-09-02
CN1341122A (zh) 2002-03-20
EP1161452B1 (de) 2009-04-15
ES2324093T3 (es) 2009-07-30
AU3160100A (en) 2000-09-14
JP4519324B2 (ja) 2010-08-04
DE19908041A1 (de) 2000-08-31
DK1161452T3 (da) 2009-08-17
ZA200106971B (en) 2003-01-29
EP1161452A2 (de) 2001-12-12
CA2363639A1 (en) 2000-08-31
HK1042710A1 (en) 2002-08-23
WO2000050456A2 (de) 2000-08-31
AU765076B2 (en) 2003-09-11
US6908897B2 (en) 2005-06-21
WO2000050456A3 (de) 2000-12-07
HK1042710B (zh) 2006-01-13
KR100658961B1 (ko) 2006-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100658961B1 (ko) 공유적으로 가교결합된 인슐린 이량체, 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 진단 키트, 및 이의 제조방법
FI79854B (fi) Foerfarande foer framstaellning av ett laekemedelspreparat som innehaoller ett insulinderivat.
FI79786C (fi) Foerfarande foer framstaellning ett farmaceutiskt medel foer behandling av diabetes.
KR20020073184A (ko) 글루카곤 유사 펩티드 1 화합물을 용해시키는 방법
DK164408B (da) Vaeksthormonfrigivende faktorforbindelser, forbindelserne til anvendelse som terapeutikum, fremgangsmaade til fremstilling af forbindelserne, farmaceutiske praeparater, der indeholder en effektiv maengde af en saadan forbindelse samt anvendelse af forbindelsen
EP1575490A2 (en) Modified glucagon-like peptide-1 analogs
JPH0314599A (ja) ペプチド誘導体類
EP0561412A1 (en) Parathyroid hormone derivatives
EP0748817A2 (en) Parathyroid hormone derivatives and their use
US4992417A (en) Superactive human insulin analogues
US4656158A (en) Peptide, and production and use thereof
EP0529487B1 (en) PACAP derivatives having c-AMP producing activity
JPH0273100A (ja) 医薬用化合物
KR970009353B1 (ko) 초고활성 인체 인슐린 동족체
CN113429471A (zh) 长效glp-1多肽类似物及其制备方法和应用
US5858975A (en) Oxyntomodulin peptide having cardiotonic activity and insulin release-bromating activity
JPH0786120B2 (ja) ポリペプチド
US4732972A (en) Polypeptides having growth hormone releasing activity
AU643349B2 (en) Short peptides with insulin activity
US4820804A (en) Analogs of [1,7-di-alanine, des-19-leucine]calcitonin
WO2002068457A2 (en) Antiangiogenic peptides derived from endostatin
CA2075240A1 (en) Chondromodulin-ii protein
KR920005659B1 (ko) 인슐린 유도체의 제조방법
CA1338584C (en) Superactive human insulin analogues
JPH0542264B2 (ko)

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20111122

Year of fee payment: 6

LAPS Lapse due to unpaid annual fee