KR20010103306A

KR20010103306A - 골 대체물로서의 키토산의 용도

Info

Publication number: KR20010103306A
Application number: KR1020000024671A
Authority: KR
Inventors: 정필훈
Original assignee: 정필훈
Priority date: 2000-05-09
Filing date: 2000-05-09
Publication date: 2001-11-23

Abstract

본 발명은 고형으로 성형 가공된 키토산의 골 대체물로서의 신규한 용도 및 골 형성 관련 유전자의 발현에 관한 것이다.

본 발명은 고형으로 성형 가공된 키토산의 구조를 확인하고 생체 적합성, 생분해성 및 골 형성 관련 유전자 발현 양상을 측정하여 골 대체물로서의 적합성을 규명하므로써 골 대체물로서의 새로운 용도를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

골 대체물로서의 키토산의 용도{Use of Kitosan as bone substitute}

본 발명은 성형 가공된 키토산의 골 대체물로서의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고형으로 성형 가공된 키토산의 골 형성 유전자 발현을 규명하여 골 대체물로서 사용하는 신규한 용도에 관한 것이다.

최근에 조직의 치유와 재생에 있어 생체조직 공학적인 접근이 시도되고 있다. 고분자 화합물을 이용하여 조직의 재생 및 치유과정에서 주변 조직으로부터 세포와 재생조직을 지지해 주는 뼈대의 역할을 하거나 주변 연조직의 성장을 차단하는 역할을 담당하게 하는 것은 그 시도의 일환으로 알려져 있으며(Hopper RA, Phillips JH, Hughes L:Use of a fibrillar polylatic acid homopolymer in sheep cranial defects. J Craniofac Surg 7:32-35, 1996), 조직의 이식체로서 여러가지 천연 또는 인공의 중합체에 대한 접근이 시도되고 있다.

생체조직공학은 3가지 측면에서 접근이 시도되고 있다. 첫째는 재생조직을 지지, 강화시켜 줄 수 있는 scaffold의 개발이고, 둘째는 이 scaffold가 성장인자에 대한 전달체로서의 역할을 할 수 있어야 하는 것이며, 셋째는 이식부에서 주위의 의도된 조직세포의 내성장을 촉진시켜 혈행 발달을 용이하게 하여야 한다는 것이다. 천연 또는 인공의 중합체는 scaffold로서 생체 조직 공학적인 측면에서 매우 중요한 역할을 한다. scaffold는 세포를 지지할 뿐만 아니라 성장인자에 대한 전달체로서 성장인자를 내재시키며 확산되도록 한다. 따라서 중합체는 몇 가지 조건을 갖고 있어야 한다. 첫째는 Cell seeding을 위한 충분한 공간과 표면적을 갖기 위해 다공성이 있어야 하며, 이러한 다공성의 scaffold는 seeded cell의 확산을 억제하지 말아야 하며 혈행 증식을 유도할 수 있어야 하고, 둘째는 생체내에서 완전히 분해, 제거되어져야 하며, 셋째로는 어떤 형태를 유지할 수 있는 성형 가공성이 있어야 한다는 것이다.

이 조건을 충족시키기 위해 많은 자연 또는 인공의 중합체들이 scaffold로서 연구되고 있다.

키토산은 자연계에서 갑각류의 외피, 오징어의 뼈 등에 존재하는 생체 고분자 물질인 키틴으로부터 유래된 산물로 곁가지에서 아세틸기의 부분적 제거로 만들어진다(Aiba SI, Minoura N, Taguchi K, Fujiwara Y : Covalent immobilization of chitosan derivatives onto polymeric film surfaces with the use of a photosensitive hetero-bifunctional crosslinking reagent. Biomaterials 8 : 481-488, 1987).

따라서, 본 발명은 생체공학적인 측면에서 고형으로 성형 가공된 키토산이 구조적으로 다공성을 갖고, scaffold로서 유용한 조건을 많이 갖추고 있다는 점에 착안하여 골 대체물로서 사용할 수 있는 것을 발견하고 완성한 것이다.

본 발명의 목적은 고형으로 성형 가공된 키토산를 scaffold로 사용하여 골 형성 관련 유전자의 높은 발현을 나타내어 골 대체물로서 사용하는 새로운 용도를 제공하는데 있다.

도1a는 40배율의 전자현미경하에 관찰한 키토산 시편의 외벽 인접부위 사진이다.

도1b는 200배율의 전자현미경하에 관찰한 키토산 시편의 내부구조 사진이다.

도2a는 위상차 현미경하에 관찰한 키토산 시편의 아가 오버레이 테스트 결과 사진이다.

도2b는 도2a의 키토산 시편 인접부위의 탈색 결과 사진이다.

도2c는 위상차 현미경하에 관찰한 정상적인 L929 세포의 사진이다.

도2d는 도2c의 용해 정도를 나타낸 사진이다.

도3은 키토산 시편의 방사선 투과 사진이다.

도4a는 2주된 골 시편의 HE 염색 결과를 10배율의 광학 현미경하에 관찰한 사진이다.

도4b는 도4a를 400배율의 광학 현미경하에 관찰한 사진이다.

도5a는 4주된 골 시편의 HE 염색 결과를 100배율의 광학 현미경하에 관찰한 사진이다.

도5b는 도5a를 200배율의 광학 현미경하에 관찰한 사진이다.

도6a는 8주된 골 시편의 HE 염색 결과를 10배율의 광학 현미경하에 관찰한 사진이다.

도6b는 도6a를 40배율의 광학 현미경하에 관찰한 사진이다.

도7a는 24주된 골 시편의 HE 염색 결과를 40배율의 광학 현미경하에 관찰한 사진이다.

도7b는 도7a를 100배율의 광학 현미경하에 관찰한 사진이다.

도8은 BMP-2 mRNA의 발현도이다.

도9는 BMP-4 mRNA의 발현도이다.

도10은 Osteocalcin mRNA의 발현도이다.

도11은 Osteopontin mRNA의 발현도이다.

도12는 Alkaline phosphatase mRNA의 발현도이다.

도13은 BMP-7 mRNA의 발현도이다.

본 발명의 상기 목적은 고형으로 성형 가공된 키토산을 전자현미경으로 관찰하여 다공질 구조를 확인하고, 독성검사를 통하여 세포독성 유무를 판정하며, 동물실험을 통하여 키토산의 생체적합성, 생분해성과 골 형성 능력을 측정하고, 세포수준에서 골 형성 관련 유전자의 발현에 대한 연구를 실시하여 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 상세히 설명한다.

위에서 언급한 것과 같이 고형으로 성형 가공된 키토산이 골 형성 대체물의 scaffold로 사용되기 위해서는 Cell seeding을 위한 충분한 공간과 표면적을 갖기 위해 다공성이 있어야 하고, 생체내에서 완전히 분해, 제거되면서 독성이 없어야 하며, 골 형성 능력이 있어야 한다.

따라서, 본 발명은 고형으로 성형 가공된 키토산을 전자현미경으로 관찰하여 다공질임을 확인하는 구조 분석 단계; L929 섬유세포를 이용한 독성검사를 통하여 세포독성 유무를 판정하는 단계; 동물실험을 통하여 키토산의 생체적합성, 생분해성과 골 형성 능력 측정 단계 및 세포수준에서의 골 형성 관련 유전자의 발현에 대한 연구 단계로 이루어진다.

이하, 본 발명의 단계별 구성 및 작용은 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명한다.

<실시예 1> 키토산 고형체의 구조 분석 단계

표면경도 55 VHM, 압축강도 80 MPa, 굴곡강도 60 MPa인 직경 8.0㎜, 두께 2.0㎜의 성형 가공된 원통형의 키토산 고형체를 전자현미경(JSM-840A, JEOL, Japan)으로 가속전압 15㎸에서 바깥쪽 표면 및 내부구조를 관찰하였다. 그 결과, 도1a에서 알 수 있듯이 고형체의 바깥쪽 표면은 50㎛ 이하의 소공들이 중간부에 비해 많이 형성되어 있었으며 내부는 도1b에서 알 수 있듯이 소공수는 적은 반면 50~200㎛의 큰 소공들이 존재하였다. 따라서, 키토산 고형체의 구조는 scaffold로유용한 다공성임을 알 수 있었다.

<실시예 2> 세포독성 검사 단계

실험예 1. 세포배양

마우스 피하조직의 결합조직 세포인 L929(한국 세포주 은행)를 10% horse serum(Biowhittaker, Salkersville, MD, USA), 10,000 unit/㎖ penicillin, 10,000 ㎍/㎖ streptomycin, 25㎍/㎖ fungizone 이 있는 Eagle's minimum essential medium(Biowhittaker, Salkersville, MD, USA), 0.01% neutral red(Sigma, St. Louis, MO, USA) 용액이 함유된 배양액을 이용하여 계대배양 하였다. 그 결과, 계대배양한 L929를 얻었다.

실험예 2. 시편제작

직경 8.0㎜, 두께 2.0㎜의 키토산 시편을 제작하고, 실리콘 카바이드 연마포(#600, #1000, #1500, #2000)로 미세하게 연마한 후 자외선 소독하였다. 양성 대조군은 키토산 시편과 크기가 같고 순도가 99% 이상인 구리(Cu)를 사용하였고, 음성 대조군은 실리콘을 사용하였다.

실험예 3. 세포독성 측정

상기 실험예1에서 얻은 L292 세포를 지름 60㎜ 플라스틱 배양접시(Corning, NY, USA)에 6 104 cell/㎖ 정도씩 넣고 위상차 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로관찰하여 거의 일정한 세포단층이 형성될 때까지 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다. 1.5% bactoagar(Difo, Detroit, MI, USA)를 넣은 overlay medium을 준비하여 45℃에서 보관한 후 배양접시에서 배지를 제거하여 5㎖의 overlay medium으로 대처하였다. agar를 실온에서 평평하게 굳힌 후 그 위에 상기 실험예 2에서 준비한 시편을 놓고 37℃ 및 5% CO2 조건의 배양기(Forma Scietific, Marietta, OH, USA)에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 경과 후 접시 바닥에 각 시편의 윤곽을 유성펜으로 표시한 후, 시편을 제거하고 0.01%의 neutral red 용액 2㎖을 넣고 1시간 동안 배양하였다. 과량의 용액을 제거한 후 시편과 대조군 주위의 탈색부위는 육안으로 관찰하였고, 용해(lysis)정도는 위상차 현미경으로 관찰하였다. 실험결과, 도2a 및 도2b를 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 키토산 시편은 하부에서만 탈색이 일어났고 도2c 및 도2d에서 볼 수 있듯이 시편 인접부위의 L929 세포에서는 용해가 일어나지 않았다. 이때, 탈색지수와 용해지수는 육안과 자로 하기 표1 및 표2를 각각 참조하여 판정하였고, 이들 반응지수를 토대로 하기 표3을 참조하여 세포 독성도를 판단하였다. 따라서, 키토산 시편은 탈색지수 1, 용해지수 0으로 거의 독성이 없음을 알 수 있었다.

탈색지수 기준

지수	반응부위
0	시편의 주변이나 아래에 전혀 탈색 부위가 없는 상태
1	시편의 아래부위가 약간 탈색된 상태
2	시편의 탈색부위가 0.5㎝를 넘지 않는 상태
3	시편의 탈색부위가 1㎝를 넘지 않는 상태
4	시편의 탈색부위가 1㎝를 이상이나 전체가 탈색되지 않는 상태
5	시편의 전체가 탈색된 상태

주 : 탈색지수는 육안으로 시편주위의 탈색부위를 측정함

용해지수 기준

지수	반응지수
0	용해 부위가 관찰되지 않음
1	용해 부위가 20% 미만임
2	용해 부위가 20 ~ 40% 범위임
3	용해 부위가 40 ~ 60% 범위임
4	용해 부위가 60 ~ 80% 범위임
5	용해 부위가 80% 이상임

주 : 용해지수는 탈색된 세포의 용해정도를 위상차 현미경으로 측정한 것임

반응지수와 세포독성도

세포독성도	반응 지수
무독성	0/0
저독성	1/1 ~ 1/5, 2/1
중독성	2/2 ~ 2/5, 3/1 ~ 3/5, 4/1 ~ 4/3
고독성	4/4, 4/5, 5/1 ~ 5/5

주 : 반응지수는 용해지수에 대한 탈색지수의 비율로 구한 것임

<실시예 3> 키토산의 골 대체물로서의 골형성 능력 측정 단계

실험예 1. 방사선 측정

체중 250g 내외의 수컷흰쥐(Sprague-Dawley rat)에 럼푼과 케타민을 1:4로 혼합한 주사액을 복강내 주입하여 전신마취를 유도한 후 두개골을 골막까지 일시에 절개한 후 지름이 8.0㎜되는 임계크기의 결손부를 형성하고 지름 8.0㎜, 높이 2.0㎜의 키토산 원판을 매식하였다. 수술 후 2주, 4주, 8주, 24주 되는 시기에 상기의 전신마취 주사액을 과량 주사하여 각각 2마리씩 희생한 후 방사선사진을 촬영하였다. 그 결과, 도3에서 볼 수 있듯이 방사선 사진상에서는 수술후 2주째 희미하게 키토산 시편의 윤곽을 볼 수 있었으나 4주째부터 키토산 시편이 흡수되면서 중앙부에서 약간의 방사선 투과상을 보이고 차차 결손부위 번연으로부터 중앙부로 방사선 불투과상이 많이 늘어나 24주째에는 일부분을 제외하고 결손부위 전체에서 방사선 불투과상을 보였다.

실험예 2. 광학현미경적 측정

상기 실험예 1과 동일한 조건으로 수술하고, 수술 후 2주, 4주, 8주, 24주 되는 시기에 상기의 전신마취 주사액을 과량 주사하여 각각 2마리씩 희생한 다음 조직편을 채취하여 10% 중성 포르말린에 고정하고, 이어서 5% 질산에 넣어 탈회과정을 거친 후 파라핀 포매를 하여 4㎛ 두께로 관상면으로 절단한 다음 hematoxilin-eosin으로 염색하고 광학현미경하에 관찰하였다. 실험결과, 도4a에서 알 수 있듯이 수술 후 2주에는 키토산 시편이 흡수되면서 증식성 조직반응이 관찰되었고 도4b에서 볼 수 있듯이 키토산 시편과 두개골 사이에 섬유 조직층이 개재되어 있었으며 조골세포의 활동성을 시사하는 보상성 육아조직성 반응이 관찰되었다. 수술 후 4주에는 도5a 및 도5b에서 볼 수 있듯이 키토산 시편이 거의 흡수되었고 결손변연부위의 두개골 인접면에서 thick woven bone structure 및 조골세포의 띠가 관찰되었다. 수술 후 8주에는 도6a에서 볼 수 있듯이 키토산 시편이 완전히 흡수되었고 날카로운 골결손변연은 보상성 골흡수에 의해 평평하게 되었으며 도6b에서 볼 수 있듯이 재생골판이 두뇌강을 덮고 있었다. 수술 후 24주에는 도7a에서 볼수 있듯이 결손변연부에서 두개골과 신생골이 중층을 이루며, 도7b에서 볼 수 있듯이 과형성된 골이 관찰되었다.

<실시예 4> 골형성 관련 유전자의 발현 단계

실험예 1. 총 리보핵산의 추출

체중 250g 내외의 수컷흰쥐(Sprague-Dawley rat)를 럼푼과 케타민을 1:4로 혼합한 주사액을 복강내 주입하여 전신마취를 유도한 후 두개골을 골막까지 일시에 절개한 후 지름 8.0㎜, 높이 2.0㎜의 키토산 원판을 두개골에 올려놓고 골막과 표피를 봉합하였다. 대조군은 골막절개 후 생리식염수를 넣고 봉합하였으며, 수술 후 3일, 7일, 14일에 두개골을 채취하였다. 실험에 쓰인 동물군은 하기 표4와 같다.

채취한 시편을 액화질소와 함께 넣고 간 후 TRI REAGENT(Molecular Research Center, Inc. Cincinnati, OH, USA) 1㎖ 당 조직 70㎎을 혼합하여 균질화시켰다. 균질액을 상온에서 5분간 보관한 다음 TRI REAGENT 1㎖당 0.2㎖의 클로로포름을 넣고 4℃에서 12,000g으로 15분간 원심분리 하였다. 원심분리 한 수용액을 새로운 튜브에 옮기고 초기 균질화를 위하여 사용한 TRI REAGENT 1㎖당 isopropanol 0.5㎖을혼합하여 RNA를 침전시켰다. 샘플을 상온에서 10분간 보관 후 4℃에서 12,000g으로 8분간 원심분리를 두 차례 시행하여 침전된 RNA를 확인하고 TRI REAGENT 1㎖당 1㎖의 에탄올을 사용하여 RNA 세척을 시행하고 4℃에서 7,500g으로 원심분리 하였다. RNA가 한쪽에 모아지면 에탄올을 버리고 RNA 침전물을 10분간 건조시켰다. RNA를 DEPC-treated water에 녹이고 55℃에서 15분간 항온 배양한 후 UV-spectrophotometer(Ultraspec 1000 UV/visible Spectrophotometer, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)를 이용하여 농도를 측정하였다. 그 결과, 리보핵산을 추출하였다.

실험예 2. 정량적 역전사-중합효소 연쇄반응

상기 실험예 1에서 추출한 리보핵산 5㎍과 RNase-free H2O를 혼합한 혼합액 17.325㎕를 10XTagMan 4.5㎕, 25mM MgCl2 9.9㎕, DeoxyNTPs mixture 9.0㎕, Random Hexamea 2.25㎕, RNase inhibitor 0.9㎕와 MultiScribTM Reverse 1.125㎕와 혼합하여 25℃에서 10분간 항온배양 후 48℃에서 30분간 역전사를 시행하였으며, 95℃에서 5분간 역전사효소를 불활성화시켰다. 역전사 산물 5㎍, 중합효소 연쇄반응 시발체(PCR primer)의 foreward와 reverse 각각 1㎕, RNase-free H2O 27.25㎕, 10XSYBR PCR Buffer 5.0㎕, 25mM MgCl2 6.0㎕, dNTP Blend(2.5mM dATP, 2.5mM dCTP, 2.5mM dGTP, 5.0mM dUTP) 4.0㎕, AmpliTag Gold(5U/㎕) 0.25㎕와 AmpErase UNG(1U/㎕) 0.05㎕를 혼합하여 중합효소 연쇄반응을 시행하고 정량분석 하였다. 이때 AmpErase UNG는 50℃에서 2분간 항온 배양시켰고, AmpliTag Gold는 95℃에서 10분간 활성화시켰으며 매회 95℃에서 10분간의 melting과 60℃에서 1분간의 annealing, extension을 40회 실행하였다. 상기 중합효소 연쇄반응 시발체는 하기 표5와 같이 제작한 BMP-2, BMP-4, BMP-7, alkaline phosphatase, oseopotin, osteocalcin을 각각 사용하였다.

본 발명에 사용된 PCR 프라이머

유전자형태	올리고뉴클레오타이드배열	cDNA위치	프레그멘트 크기	유전자은행
BMP-2	F 5'-GCTGTGTCCCACTGAGCTT-3'R 5'-GCAACCCTCCACAACCATGT-3'	1134-11531234-1215	101	Z25868
BMP-4	F 5'-CATCCCAGGGACCAGTGAGA-3'R 5'-GAAATAGCCGCAGCTCTGCA-3'	787-806887-868	101	Z22607
BMP-7	F 5'-TTAGCTTCCGAGACCTTGGCT-3'R 5'-AGCCTTCAGGTGCGATGATC-3'	182-202232-213	51	D29769
Osteocalcin	F 5'-AAGACCCGCTACAGACGCAT-3'R 5'-TCAAGTTCTGGAGAGCAGCCA-3'	414-433514-494	101	AI323083
Osteopontin	F 5'-TCCACTGAACTGAGAAATGAGCA-3'R 5'-GGCAAAAACACAGTTCCTTACTTTG-3'	319-341419-395	101	AW018363
Alkalinephosphatase	F 5'-TCATCCAGGGCTCCAATGA-3'R 5'-CCACTTACCGGTGTGTTTCGT-3'	1442-14621542-1524	101	J03572

실험결과, BMP-2 mRNA의 발현은 도8에서 볼 수 있듯이, 키토산을 매식한 실험군은 수술후 3일째 대조군에 비하여 약한 골형성 전사체 발현 양상을 보였으나 7일째는 최고의 발현 양상을 보였고, 14일째는 대조군의 2배에 해당하는 발현 양상을 보였다.

BMP-4 mRNA의 발현은 도9에서 볼 수 있듯이, 키토산을 매식한 실험군은 수술 후 3일째 대조군에 비하여 약한 골형성 전사체 발현 양상을 보였으나 7일째는 최고의 발현 양상을 보였고, 14일째는 대조군의 3배 이상의 높은 발현 양상을 보였다.

Osteocalcin mRNA의 발현은 도10에서 볼 수 있듯이, 키토산을 매식한 실험군은 수술 후 3일째 대조군 보다 큰 골형성 전사체 발현 양상을 보였는고 수술 후 7일째에는 최고의 발현 양상을 보였으며, 14일째는 대조군의 4배 이상의 발현 양상을 보였다.

Osteopontin mRNA의 발현은 도11에서 볼 수 있듯이, 키토산을 매식한 실험군은 수술 후 3일째 대조군 보다 약한 골형성 전사체 발현을 보였으나, 수술 후 7일째에는 대조군에 비하여 큰 발현 양상을 보였고 14일째에는 최고의 발현 양상을 보였다.

Alkaline phosphatase mRNA의 발현은 도12에서 볼 수 있듯이, 키토산을 매식한 실험군은 수술 후 14일째 대조군에서 보다 약한 골형성 전사체 발현 양상을 보였으나 전체적으로 볼 때 발현이 거의 안되었다.

BMP-7 mRNA의 발현은 도13에서 볼 수 있듯이, 키토산을 매식한 실험군은 수술 후 3일째 약한 골형성 전사체 발현 양상을 보였으나, 7일째, 14일째는 발현이 안되었다.

따라서, 키토산을 매식한 실험군이 골세포계 증식과 분화에 관여하는 BMP-2, BMP-4에서 큰 발현 양상을 보였으며 alkaline phosphatase, osteopontin과 osteocalcin과 같은 골세포 표지 유전자의 높은 발현을 보여 골 형성 능력이 우수하고, scaffold로 적합함을 알 수 있었다.

본 발명은 상기의 실시예 및 실험예를 통하여 알 수 있는 바와같이, 성형 가공된 키토산을 scaffold로서 유용한 다공질 조직을 갖고 있으며, 독성이 거의 없다. 또한 성형 가공된 키토산은 생체 적합성, 생분해성을 갖고 골 형성 관련 유전자의 높은 발현을 나타낸다. 따라서, 키토산은 단기간내에 골을 형성하여 결손부위를 재생시켜주는 골 대체물로서 사용할 수 있다.

Claims

고형으로 성형 가공된 키토산을 포함하는 골 대체물.
제 1항에 있어서, 상기 고형으로 성형 가공된 키토산은 다공질의 scaffold로 성형된 것을 특징으로 골 대체물.
제1항 기재의 상기 성형 가공된 키토산의 역전사-중합효소 연쇄반응 측정방법.
제3항에 있어서, 상기 역전사-중합효소 연쇄반응의 시발체는 BMP-2, BMP-4, BMP-7, Osteocalcin, Osteopontin, Alkaline phosphatase임을 특징으로 하는 역전사-중합효소 연쇄반응 측정방법.