KR20010103046A - 면역 관련 질환 치료용 조성물 및 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역 관련 질환의 진단 및 치료 방법 및 그를 위한 신규 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

면역 관련 질환 치료용 조성물 및 치료 방법 {Compositions and Methods for the Treatment of Immune Related Diseases}

면역 관련 질환 및 염증 질환은 정상적인 생리 상태에서는 상해 또는 손상에 대한 반응, 상해 또는 손상의 복구 개시 및 외래 유기체에 대항하는 선천성 또는 후천성 방어의 개시에 중요한, 아주 복잡하고 종종 복합적으로 상호연관된 생물학적 경로들의 징후 또는 결과이다. 이러한 정상적인 생리적 경로들이 반응의 강도에 직접적으로 연관되거나, 비정상적인 조절 또는 과도한 자극의 결과로서, 자가 (self)에 대한 반응으로, 또는 이들의 조합으로 추가의 상해 또는 손상을 초래하는 경우, 질환 또는 병이 발생한다.

이러한 질환의 발생에는 종종 다단계 경로 및 종종 다수의 상이한 생물학적 시스템/경로가 포함되지만, 이들 경로 중 하나 이상에 있는 중요한 지점에 개입함으로써 개선 효과 또는 치료 효과를 발생시킬 수 있다. 치료적 개입은 유해한 과정/경로의 길항작용 또는 유익한 과정/경로의 자극으로 일어날 수 있다.

많은 면역 관련 질환이 알려져 있고 광범위하게 연구되어 왔다. 이러한 질환으로는 면역매개성 염증 질환, 비면역매개성 염증 질환, 감염증, 면역결핍질환, 신생물 (neoplasia) 등이 있다.

T 림프구 (T 세포)는 포유동물 면역 반응의 중요 성분이다. T 세포는 주조직적합성복합체 (MHC)내 유전자에 의해 코딩되는 자가 분자와 결합된 항원을 인식한다. 이 항원은 항원제시세포, 바이러스로 감염된 세포, 암세포, 이식편(移植片) 등의 표면에서 MHC 분자들과 함께 제시될 수 있다. T 세포계는 숙주 포유동물에 건강상 위협을 주는 이들 변형 세포들을 제거한다. T 세포에는 헬퍼 T 세포 및 세포독성 T 세포 등이 있다. 헬퍼 T 세포는 항원제시세포 상의 항원-MHC 복합체를 인식한 후 광범위하게 증식한다. 또한, 헬퍼 T 세포는 B 세포, 세포독성 T 세포 및 면역 반응에 참여하는 기타의 다양한 세포들을 활성화시키는데 중추적 역할을 하는 여러가지 사이토카인, 즉 림포카인을 분비한다.

체액성 및 세포 매개 면역 반응 모두에서의 중추적 사건은 헬퍼 T 세포의 활성화 및 클론 증식 (clonal expansion)이다. 헬퍼 T 세포의 활성화는 T-세포 수용체 (TCR)-CD3 복합체와 항원제시세포 표면에 있는 항원-MHC의 상호작용에 의해 개시된다. 이러한 상호작용이 휴지기의 헬퍼 T 세포가 세포 주기로 들어가도록 (G0에서 G1으로의 전이) 유도하는 생화학적 사건의 케스케이드를 매개하여, 그 결과 IL-2 및 때때로 IL-4에 대한 고친화성 수용체가 발현된다. 활성화된 T 세포는 주기를 거치면서 증식하고 분화하여 기억 세포 또는 이펙터 세포 (effector cell)가 된다.

TCR을 통해 매개되는 신호 이외에도, T 세포의 활성화에는 항원제시세포가 분비하는 사이토카인 또는 항원제시세포 및 T 세포에 있는 막 결합 분자와의 상호작용을 통하여 유도되는 추가의 공동자극이 포함된다. 사이토카인 IL-1 및 IL-6은 공동자극 신호를 제공하는 것으로 밝혀져 있다. 또한, 항원제시세포 표면에서 발현되는 B7 분자와 T 세포 표면에서 발현되는 CD28 및 CTLA-4 분자의 상호작용도 T 세포 활성화에 영향을 미친다. 활성화된 T 세포는 ICAM-1, 인테그린, VLA-4, LFA-1, CD56 등과 같은 세포 부착 분자의 발현 개수를 증가시킨다.

혼합 림프구배양 또는 혼합림프구반응 (MLR)에서의 T 세포 증식은 화합물의 면역계 자극력에 관해 확립된 표시방법이다. 많은 면역 반응에서, 염증세포가 손상 또는 감염 부위에 침윤한다. 이러한 이동 세포는 손상된 조직을 조직검사하여 결정할 수 있는 바와 같이 호중구, 호산구, 단핵구 또는 림프구일 수 있다 (Current Protocols in Immunology, ed. John E. Coligan, 1994, John Wiley ＆ Sons, Inc.).

면역 관련 질환은 면역 반응을 저해함 (suppress)으로써 치료될 수 있다. 면역 자극 활성을 갖는 분자들을 억제하는 중성화 항체를 사용하면 면역매개성 질환 및 염증 질환의 치료에 유익할 것이다. 면역 반응을 억제하는 분자들을 사용하여 (단백질을 직접 사용하거나 항체 아고니스트의 사용을 통하여) 면역 반응을 억제하고 따라서 면역 관련 질환을 개선할 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 인간을 비롯한 포유동물에서 면역 관련 질환의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 그를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 포유동물에서 면역 반응을 자극하거나 억제하는 단백질 (아고니스트 및 길항제 항체를 포함함)의 확인을 기초로 한다. 면역 관련 질환은 면역 반응을 저해하거나 강화시켜 치료될 수 있다. 면역 반응을 강화하는 분자들은 항원에 대한 면역 반응을 자극하거나 증강시킨다. 면역 반응의 강화가 유익할 경우에는 면역 반응을 자극하는 분자를 치료적으로 사용할 수 있다. 또한, 면역반응의 저해가 가치있을 경우에는 이러한 자극성 분자들이 억제될 수도 있다.

중성화 항체는 면역 자극 활성을 갖는 분자들을 억제하고, 면역 관련 질환 및 염증 질환의 치료에 유익할 분자의 예이다. 또한, 면역 반응을 억제하는 분자들을 사용하여 (단백질을 직접 사용하거나 항체 아고니스트의 사용을 통하여) 면역 반응을 억제하여 면역 관련 질환을 개선할 수 있다.

따라서, PRO 폴리펩티드 및 항-PRO 항체 및 이의 단편은 면역 관련 질환의 진단 및(또는) 치료 (예방을 포함함)에 유용하다. 자극성 단백질에 결합하는 항체는 면역계 및 면역 반응의 저해에 유용하다. 억제성 단백질에 결합하는 항체는 면역계 및 면역반응의 자극에 유용하다. 또한, PRO 폴리펩티드 및 항-PRO 항체는 면역 관련 질환 및 염증 질환의 치료를 위한 의약 및 약제의 제조에 유용하다.

한 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.

한 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 기재된 바와 같은 전장 아미노산 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 아미노산 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본원에 기재된 바와 같이 전장 아미노산 서열의 임의의 다른 특별하게 정의된 단편을 갖는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 DNA 분자 (a)의 상보체와의 핵산 서열 동일성이 약 80 ％ 이상, 다르게는 약 81 ％ 이상, 다르게는 약 82 ％ 이상, 다르게는 약 83 ％ 이상, 다르게는 약 84 ％ 이상, 다르게는 약 85 ％ 이상, 다르게는 약 86 ％ 이상, 다르게는 약 87 ％ 이상, 다르게는 약 88 ％ 이상, 다르게는 약 89 ％ 이상, 다르게는 약 90 ％ 이상, 다르게는 약 91 ％ 이상, 다르게는 약 92 ％ 이상, 다르게는 약 93 ％ 이상, 다르게는 약 94 ％ 이상, 다르게는 약 95 ％ 이상, 다르게는 약 96 ％ 이상, 다르게는 약 97 ％ 이상, 다르게는 약 98 ％ 이상, 및 다르게는 약 99 ％ 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

다른 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 기재된 바와 같은 전장 PRO 폴리펩티드 cDNA의 코딩 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 PRO 폴리펩티드의 코딩 서열, 또는 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 막횡단 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 기재된 바와 같이 전장 아미노산 서열의 임의의 다른 특별하게 정의된 단편의 코딩 서열, 또는 (b) 상기 DNA 분자 (a)의 상보체와의 핵산 서열 동일성이 약 80 ％ 이상, 다르게는 약 81 ％ 이상, 다르게는 약 82 ％ 이상, 다르게는 약 83 ％ 이상, 다르게는 약 84 ％ 이상, 다르게는 약 85 ％ 이상, 다르게는 약 86 ％ 이상, 다르게는 약 87 ％ 이상, 다르게는 약 88 ％ 이상, 다르게는 약 89 ％ 이상, 다르게는 약 90 ％ 이상, 다르게는 약 91 ％ 이상, 다르게는 약 92 ％ 이상, 다르게는 약 93 ％ 이상, 다르게는약 94 ％ 이상, 다르게는 약 95 ％ 이상, 다르게는 약 96 ％ 이상, 다르게는 약 97 ％ 이상, 다르게는 약 98 ％ 이상, 다르게는 약 99 ％ 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 (a) 본원에 기재된 바와 같이 ATCC에 기탁된 인간 단백질 cDNA 중 임의의 것에 의해 코딩되는 것과 동일한 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 DNA 분자 (a)의 상보체와의 핵산 서열 동일성이 약 80 ％ 이상, 다르게는 약 81 ％ 이상, 다르게는 약 82 ％ 이상, 다르게는 약 83 ％ 이상, 다르게는 약 84 ％ 이상, 다르게는 약 85 ％ 이상, 다르게는 약 86 ％ 이상, 다르게는 약 87 ％ 이상, 다르게는 약 88 ％ 이상, 다르게는 약 89 ％ 이상, 다르게는 약 90 ％ 이상, 다르게는 약 91 ％ 이상, 다르게는 약 92 ％ 이상, 다르게는 약 93 ％ 이상, 다르게는 약 94 ％ 이상, 다르게는 약 95 ％ 이상, 다르게는 약 96 ％ 이상, 다르게는 약 97 ％ 이상, 다르게는 약 98 ％ 이상, 다르게는 약 99 ％ 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 막횡단 도메인이 결실되거나 막횡단 도메인이 불활성화된 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 이러한 코딩 뉴클레오티드 서열의 상보체를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공하며, 그러한 폴리펩티드의 막횡단 도메인(들)을 본원에 기재한다. 따라서, 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드들의 가용성 세포외 도메인이 고려된다.

또다른 실시양태는 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 경우에 따라 항-PRO 폴리펩티드 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 PRO 폴리펩티드의 코딩 단편에 대한 혼성화 프로브로 사용될 수 있는 PRO 폴리펩티드 코딩 서열 또는 그 상보체의 단편에 관한 것이다. 이러한 핵산 단편은 일반적으로 길이가 뉴클레오티드 약 20 개 이상, 다르게는 약 30 개 이상, 다르게는 약 40 개 이상, 다르게는 약 50 개 이상, 다르게는 약 60 개 이상, 다르게는 약 70 개 이상, 다르게는 약 80 개 이상, 다르게는 약 90 개 이상, 다르게는 약 100 개 이상, 다르게는 약 110 개 이상, 다르게는 약 120 개 이상, 다르게는 약 130 개 이상, 다르게는 약 140 개 이상, 다르게는 약 150 개 이상, 다르게는 약 160 개 이상, 다르게는 약 170 개 이상, 다르게는 약 180 개 이상, 다르게는 약 190 개 이상, 다르게는 약 200 개 이상, 다르게는 약 250 개 이상, 다르게는 약 300 개 이상, 다르게는 약 350 개 이상, 다르게는 약 400 개 이상, 다르게는 약 450 개 이상, 다르게는 약 500 개 이상, 다르게는 약 600 개 이상, 다르게는 약 700 개 이상, 다르게는 약 800 개 이상, 다르게는 약 900 개 이상, 다르게는 약 1000 개 이상, 다르게는 약 1500 개 이상, 다르게는 약 2000 개 이상, 다르게는 약 2500 개 이상, 다르게는 약 3000 개 이상, 다르게는 약 4000 개 이상, 다르게는 약 5000 개 이상이며, 이 때 본 문맥에서 용어 "약"은 언급한 뉴클레오티드 서열 길이±이 길이의 10 ％를 의미한다. 각각의 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 신규 단편은, 잘 알려진 많은 서열 정렬 프로그램 중 임의의 것을 사용하여 이 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 각각의 뉴클레오티드를 다른 공지된 뉴클레오티드 서열과 함께 정렬시키고, 어떤 뉴클레오티드 서열 단편(들)이 신규한 것인지를 결정함으로써 일상적인 방식으로 결정할 수 있음을 알아야 한다. 본원에서는 각각의PRO 폴리펩티드를 코딩하는 이러한 뉴클레오티드 서열 모두가 고려된다. 또한 PRO 폴리펩티드의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 분자, 바람직하게는 항-PRO 폴리펩티드 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드 단편들도 고려된다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 상기에서 확인된 단리된 핵산 서열들 중 임의의 것에 의해 코딩되는 단리된 PRO 폴리펩티드를 제공한다.

특정 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 전장 아미노산 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 아미노산 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본원에 기재된 바와 같이 전장 아미노산 서열의 임의의 다른 특별하게 정의된 단편을 갖는 PRO 폴리펩티드와의 아미노산 서열 동일성이 약 80 ％ 이상, 다르게는 약 81 ％ 이상, 다르게는 약 82 ％ 이상, 다르게는 약 83 ％ 이상, 다르게는 약 84 ％ 이상, 다르게는 약 85 ％ 이상, 다르게는 약 86 ％ 이상, 다르게는 약 87 ％ 이상, 다르게는 약 88 ％ 이상, 다르게는 약 89 ％ 이상, 다르게는 약 90 ％ 이상, 다르게는 약 91 ％ 이상, 다르게는 약 92 ％ 이상, 다르게는 약 93 ％ 이상, 다르게는 약 94 ％ 이상, 다르게는 약 95 ％ 이상, 다르게는 약 96 ％ 이상, 다르게는 약 97 ％ 이상, 다르게는 약 98 ％ 이상, 다르게는 약 99 ％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO 폴리펩티드에 관한 것이다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 ATCC에 기탁된 인간 단백질 cDNA들 중 임의의 것에 의해 코딩되는 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 80 ％ 이상, 다르게는 약 81 ％ 이상, 다르게는 약 82 ％ 이상, 다르게는 약 83 ％ 이상, 다르게는 약 84 ％ 이상, 다르게는 약 85 ％ 이상, 다르게는 약 86 ％ 이상, 다르게는 약 87 ％ 이상, 다르게는 약 88 ％ 이상, 다르게는 약 89 ％ 이상, 다르게는 약 90 ％ 이상, 다르게는 약 91 ％ 이상, 다르게는 약 92 ％ 이상, 다르게는 약 93 ％ 이상, 다르게는 약 94 ％ 이상, 다르게는 약 95 ％ 이상, 다르게는 약 96 ％ 이상, 다르게는 약 97 ％ 이상, 다르게는 약 98 ％ 이상, 다르게는 약 99 ％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO 폴리펩티드에 관한 것이다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 전장 아미노산 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 아미노산 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본원에 기재된 바와 같이 전장 아미노산 서열의 임의의 다른 특별하게 정의된 단편을 갖는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교할 때 약 80 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 81 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 82 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 83 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 84 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 85 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 86 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 87 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 88 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 89 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 90 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 91 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 92 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 93 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 94 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 95 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 96 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 97 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 98 ％ 이상의 양성, 다르게는 약 99 ％ 이상의 양성을 기록하는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO 폴리펩티드에 관한 것이다.

구체적인 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 상기 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되며 N-말단 신호 펩티드 및(또는) 개시 메티오닌을 갖지 않는 단리된 PRO 폴리펩티드를 제공한다. 또한 상기한 단리된 PRO 폴리펩티드의 제조 방법도 본원에 기재하며, 이들 방법은 적절한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 PRO 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 이 세포 배양물로부터 PRO 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.

다른 측면에서 본 발명은 막횡단 도메인이 결실되거나 막횡단 도메인이 불활성화된 단리된 PRO 폴리펩티드를 제공한다. 또한 상기한 단리된 PRO 폴리펩티드의 제조 방법도 본원에 기재하며, 이들 방법은 적절한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 PRO 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 이 세포 배양물로부터 PRO 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 또한 이러한 임의의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 예로서, 숙주 세포는 CHO 세포, 대장균 (E. coli) 또는 효모일 수 있다. 본원에 기재한 임의의 폴리펩티드를 제조하는 방법도 제공되는데, 이 방법은 원하는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고 이 세포 배양물로부터 원하는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 이러한 키메라 분자의 예로는 에피토프 태그 서열 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 융합된본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 게놈 및 cDNA 뉴클레오티드 서열을 단리하기에 유용하거나 안티센스 프로브로 유용한 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하며, 여기서 상기 프로브는 상기 또는 하기 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드의 기능 또는 활성 하나 이상을 모방하거나 억제하는, PRO 폴리펩티드의 아고니스트 및 길항제에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 아고니스트 및 길항제는 PRO 폴리펩티드 또는 소분자에 결합하는 항체이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 상기 또는 하기 폴리펩티드 중 임의의 것에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 경우에 따라 이 항체는 모노클로날 항체, 인간화 항체, 항체 단편 또는 단쇄 항체이다. 한 측면에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체에 관한 것이다. 다른 측면에서, 상기 항체는 PRO 폴리펩티드의 활성을 모방하거나 (아고니스트 항체), 또는 반대로 상기 항체는 PRO 폴리펩티드의 활성을 억제하거나 중화시킨다 (길항제 항체). 다른 측면에서, 상기 항체는 바람직하게는 비인간 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 및 인간 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 갖는 모노클로날 항체이다. 상기 항체는 표지될 수 있고, 고체 지지체상에 고정될 수 있다. 추가의 측면에서, 상기 항체는 항체 단편, 모노클로날 항체, 단쇄 항체 또는 항-이디오타입 항체이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시켜 이PRO 폴리펩티드에 의해 매개되는 생물학적 활성을 모니터링하는 것을 포함하는, PRO 폴리펩티드에 대한 아고니스트 또는 길항제의 확인 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, PRO 폴리펩티드는 천연 서열 PRO 폴리펩티드이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드에 결합하는 아고니스트 또는 길항제 항체를 담체 또는 부형제와의 부가혼합물 중에 포함하는 물질의 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 조성물은 치료 유효량의 상기 펩티드 또는 항체를 함유한다. 다른 측면에서, 상기 조성물이 면역 자극 분자를 포함하는 경우, 그 조성물은 (a) 조직으로의 염증세포 침윤을 증가시킬 필요가 있는 포유동물에서 조직으로의 염증세포 침윤을 증가시키거나, (b) 면역 반응을 자극 또는 강화시킬 필요가 있는 포유동물에서 면역 반응을 자극 또는 강화시키거나, (c) 항원에 대한 반응시 T-림프구의 증식을 증가시킬 필요가 있는 포유동물에서 항원에 대한 반응시 T-림프구의 증식을 증가시키는데 유용하다. 추가의 측면에서, 상기 조성물이 면역 억제 분자를 포함하는 경우, 그 조성물은 (a) 조직으로의 염증세포 침윤을 감소시킬 필요가 있는 포유동물에서 조직으로의 염증세포 침윤을 감소시키거나, (b) 면역 반응을 억제 또는 완화시킬 필요가 있는 포유동물에서 면역 반응을 억제 또는 완화시키거나, (c) 항원에 대한 반응시 T-림프구의 증식을 감소시킬 필요가 있는 포유동물에서 항원에 대한 반응시 T-림프구의 증식을 감소시키는데 유용하다. 다른 측면에서, 상기 조성물은 예를 들어 추가의 항체, 또는 세포독성제 또는 화학요법제일 수 있는 추가의 활성 성분을 포함한다. 이 조성물은 멸균되는 것이 바람직하다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 용도를 갖는 조성물 또는 의약의 제조를 위한, 본 발명의 폴리펩티드 및 항체의 용도에 관한 것이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 항-PRO200, 항-PRO204, 항-PRO212, 항-PRO216, 항-PRO226, 항-PRO240, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO172, 항-PRO273, 항-PRO272, 항-PRO332, 항-PRO526, 항-PRO701, 항-PRO361, 항-PRO362, 항-PRO363, 항-PRO364, 항-PRO356, 항-PRO531, 항-PRO533, 항-PRO1083, 항-PRO865, 항-PRO770, 항-PRO769, 항-PRO788, 항-PRO1114, 항-PRO1007, 항-PRO1184, 항-PRO1031, 항-PRO1346, 항-PRO1155, 항-PRO1250, 항-PRO1312, 항-PRO1192, 항-PRO1246, 항-PRO1283, 항-PRO1195, 항-PRO1343, 항-PRO1418, 항-PRO1387, 항-PRO1410, 항-PRO1917, 항-PRO1868, 항-PRO205, 항-PRO21, 항-PRO269, 항-PRO344, 항-PRO333, 항-PRO381, 항-PRO720, 항-PRO866, 항-PRO840, 항-PRO982, 항-PRO836, 항-PRO1159, 항-PRO1358, 항-PRO1325, 항-PRO1338, 항-PRO1434, 항-PRO4333, 항-PRO4302, 항-PRO4430 또는 항-PRO5727 항체를 코딩하는 핵산, 및 이런 핵산을 포함하는 벡터 및 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 본 발명은 상기 항체를 코딩하는 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 이 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 것을 포함하는, 상기 항체의 제조 방법에 관한 것이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 그의 상보체에 혼성화하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 핵산은 바람직하게는 DNA이고, 혼성화는 바람직하게는 엄격 조건에서 일어난다. 이러한 핵산 분자들은 본원에서 확인된 증폭된 유전자의 안티센스 분자로 작용해서 각각의 증폭된 유전자의 조정에 사용되거나, 증폭 반응에서 안티센스 프라이머로 이용될 수 있다. 또한, 이러한 서열은 리보자임 및(또는) 삼중나선 서열의 일부로 사용될 수 있어서 증폭된 유전자의 조절에 이용될 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 포함하고(거나) 발현할 것이라고 추측되는 세포를 항-PRO200, 항-PRO204, 항-PRO212, 항-PRO216, 항-PRO226, 항-PRO240, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO172, 항-PRO273, 항-PRO272, 항-PRO332, 항-PRO526, 항-PRO701, 항-PRO361, 항-PRO362, 항-PRO363, 항-PRO364, 항-PRO356, 항-PRO531, 항-PRO533, 항-PRO1083, 항-PRO865, 항-PRO770, 항-PRO769, 항-PRO788, 항-PRO1114, 항-PRO1007, 항-PRO1184, 항-PRO1031, 항-PRO1346, 항-PRO1155, 항-PRO1250, 항-PRO1312, 항-PRO1192, 항-PRO1246, 항-PRO1283, 항-PRO1195, 항-PRO1343, 항-PRO1418, 항-PRO1387, 항-PRO1410, 항-PRO1917, 항-PRO1868, 항-PRO205, 항-PRO21, 항-PRO269, 항-PRO344, 항-PRO333, 항-PRO381, 항-PRO720, 항-PRO866, 항-PRO840, 항-PRO982, 항-PRO836, 항-PRO1159, 항-PRO1358, 항-PRO1325, 항-PRO1338, 항-PRO1434, 항-PRO4333, 항-PRO4302, 항-PRO4430 또는 항-PRO5727 항체에 노출시키고, 상기 항체가 상기 세포에 결합하는지를 측정하는 것을 포함하는, PRO 폴리펩티드의 존재를 측정하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플, 및 (b) 세포 유형이 동일한 공지된 정상 조직 세포의 대조구 샘플에서 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하고, 이때 대조구 샘플에 비해 시험 샘플에서의 발현 수준이 더 높거나 낮은 것이 그 시험 조직 세포를 얻은 포유동물에서 면역 관련 질환의 존재를 지시하는 것인, 포유동물에서의 면역 관련 질환의 진단 방법에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 항-PRO 폴리펩티드 항체를 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플과 접촉시키고, (b) 상기 항체와 시험 샘플 중 각각의 PRO 폴리펩티드 사이의 복합체 형성을 각각 검출하는 것을 포함하고, 이때 상기 복합체 형성이 상기 질환의 존재 또는 부재를 지시하는 것인, 포유동물에서 면역 관련 질환의 진단 방법에 관한 것이다. 상기 검출법은 정량적 또는 정성적일 수 있고, 세포 유형이 동일한 공지된 정상 조직 세포의 대조구 샘플에서의 복합체 형성을 모니터링하여 비교함으로써 수행될 수 있다. 시험 샘플에서 더 많은 복합체가 형성되었음은 그 시험 조직 세포를 얻은 포유동물에서의 면역 관련 질환의 존재 또는 부재를 지시한다. 상기 항체는 검출가능한 표지를 갖는 것이 바람직하다. 복합체 형성은 예를 들어, 광학 현미경법, 유동세포측정법, 형광측정법, 또는 당업계에 공지된 기타의 기술로 모니터링 될 수 있다. 시험 샘플은 일반적으로 면역계가 결핍되어 있거나 비정상적이라고 추측되는 개체로부터 얻는다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 항-PRO200, 항-PRO204, 항-PRO212, 항-PRO216, 항-PRO226, 항-PRO240, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO172, 항-PRO273, 항-PRO272, 항-PRO332, 항-PRO526, 항-PRO701, 항-PRO361, 항-PRO362, 항-PRO363, 항-PRO364, 항-PRO356, 항-PRO531, 항-PRO533, 항-PRO1083, 항-PRO865, 항-PRO770, 항-PRO769, 항-PRO788, 항-PRO1114, 항-PRO1007, 항-PRO1184, 항-PRO1031, 항-PRO1346, 항-PRO1155, 항-PRO1250, 항-PRO1312, 항-PRO1192, 항-PRO1246, 항-PRO1283, 항-PRO1195, 항-PRO1343, 항-PRO1418, 항-PRO1387, 항-PRO1410, 항-PRO1917, 항-PRO1868, 항-PRO205, 항-PRO21, 항-PRO269, 항-PRO344, 항-PRO333, 항-PRO381, 항-PRO720, 항-PRO866, 항-PRO840, 항-PRO982, 항-PRO836, 항-PRO1159, 항-PRO1358, 항-PRO1325, 항-PRO1338, 항-PRO1434, 항-PRO4333, 항-PRO4302, 항-PRO4430 또는 항-PRO5727 항체 및 담체 (예를 들면, 완충액)를 적절한 포장 내에 포함하는 진단 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 PRO 폴리펩티드 검출을 위한 항체 사용 방법에 관한 지침서를 포함하는 것이 바람직하다.

추가의 실시양태에서 본 발명은, 용기, 용기상의 지침서, 및 상기 용기 내에 들어있는 활성제 함유 조성물을 포함하는 제조 용품에 관한 것이며, 상기 조성물은 포유동물에서 면역 반응의 자극 또는 억제에 효과적이고, 상기 용기상의 지침서는 상기 조성물이 면역 관련 질환의 치료에 사용될 수 있고, 이 조성물 중의 활성제가 PRO 폴리펩티드의 발현 및(또는) 활성을 자극 또는 억제하는 작용제임을 지시한다. 바람직한 측면에서, 상기 활성제는 PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325,PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727 폴리펩티드, 또는 항-PRO200, 항-PRO204, 항-PRO212, 항-PRO216, 항-PRO226, 항-PRO240, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO172, 항-PRO273, 항-PRO272, 항-PRO332, 항-PRO526, 항-PRO701, 항-PRO361, 항-PRO362, 항-PRO363, 항-PRO364, 항-PRO356, 항-PRO531, 항-PRO533, 항-PRO1083, 항-PRO865, 항-PRO770, 항-PRO769, 항-PRO788, 항-PRO1114, 항-PRO1007, 항-PRO1184, 항-PRO1031, 항-PRO1346, 항-PRO1155, 항-PRO1250, 항-PRO1312, 항-PRO1192, 항-PRO1246, 항-PRO1283, 항-PRO1195, 항-PRO1343, 항-PRO1418, 항-PRO1387, 항-PRO1410, 항-PRO1917, 항-PRO1868, 항-PRO205, 항-PRO21, 항-PRO269, 항-PRO344, 항-PRO333, 항-PRO381, 항-PRO720, 항-PRO866, 항-PRO840, 항-PRO982, 항-PRO836, 항-PRO1159, 항-PRO1358, 항-PRO1325, 항-PRO1338, 항-PRO1434, 항-PRO4333, 항-PRO4302, 항-PRO4430 또는 항-PRO5727 항체이다.

추가의 실시양태는 후보 화합물과 PRO 폴리펩티드의 상호작용에 충분한 시간 및 조건 하에 이 두 성분들을 접촉시켜 상기 PRO 폴리펩티드의 발현 및(또는) 활성을 억제할 수 있는 화합물을 확인하는 방법이다. 구체적인 측면에서, 후보 화합물 또는 PRO 폴리펩티드를 고체 지지체상에 고정시킨다. 다른 측면에서, 비고정된 성분은 검출가능한 표지를 갖는다.

본 발명의 다른 실시양태는 PRO 폴리펩티드, 또는 이의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체에 반응하는 상태의 치료에 유용한 의약의 제조에서 본원에 기재된 바와 같은 PRO 폴리펩티드, 또는 이의 아고니스트 또는 길항제의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 면역 관련 질환의 진단 및 치료 방법 및 그를 위한 조성물에 관한 것이다.

도 1은 DNA29101-1276 (서열 1)을 나타낸다.

도 2는 천연 서열 PRO200 폴리펩티드 UNQ174 (서열 2)를 나타낸다.

도 3은 DNA30871-1157 (서열 11)을 나타낸다.

도 4는 천연 서열 부분 길이 (partial-length) PRO204 폴리펩티드 UNQ178 (서열 12)을 나타낸다.

도 5는 DNA30942-1134 (서열 13)를 나타낸다.

도 6은 천연 서열 PRO212 폴리펩티드 UNQ186 (서열 14)을 나타낸다.

도 7은 DNA33087-1158 (서열 18)을 나타낸다.

도 8은 천연 서열 PRO216 폴리펩티드 UNQ190 (서열 19)을 나타낸다.

도 9는 DNA33460-1166 (서열 20)을 나타낸다.

도 10은 천연 서열 PRO226 폴리펩티드 UNQ200 (서열 21)을 나타낸다.

도 11은 DNA34387-1138 (서열 25)을 나타낸다.

도 12는 천연 서열 PRO240 폴리펩티드 UNQ214 (서열 26)를 나타낸다.

도 13은 DNA35558-1167 (서열 30)을 나타낸다.

도 14는 천연 서열 PRO235 폴리펩티드 UNQ209 (서열 31)를 나타낸다.

도 15는 DNA35638-1141 (서열 35)을 나타낸다.

도 16은 천연 서열 PRO245 폴리펩티드 UNQ219 (서열 36)를 나타낸다.

도 17은 DNA35916-1161 (서열 40)을 나타낸다.

도 18은 천연 서열 PRO172 폴리펩티드 UNQ146 (서열 41)을 나타낸다.

도 19는 DNA39523-1192 (서열 45)를 나타낸다.

도 20은 천연 서열 PRO273 폴리펩티드 UNQ240 (서열 46)을 나타낸다.

도 21은 DNA40620-1183 (서열 50)을 나타낸다.

도 22는 천연 서열 PRO272 폴리펩티드 UNQ239 (서열 51)를 나타낸다.

도 23은 DNA40982-1235 (서열 56)를 나타낸다.

도 24는 천연 서열 PRO332 폴리펩티드 UNQ293 (서열 57)을 나타낸다.

도 25는 DNA44184-1319 (서열 61)를 나타낸다.

도 26은 천연 서열 PRO526 폴리펩티드 UNQ330 (서열 62)을 나타낸다.

도 27은 DNA44205-1285 (서열 66)를 나타낸다.

도 28은 천연 서열 PRO701 폴리펩티드 UNQ365 (서열 67)을 나타낸다.

도 29는 DNA45410-1250 (서열 71)을 나타낸다.

도 30은 천연 서열 PRO361 폴리펩티드 UNQ316 (서열 72)을 나타낸다.

도 31은 DNA45416-1251 (서열 79)을 나타낸다.

도 32는 천연 서열 PRO362 폴리펩티드 UNQ317 (서열 80)을 나타낸다.

도 33은 DNA45419-1252 (서열 86)을 나타낸다.

도 34는 천연 서열 PRO363 폴리펩티드 UNQ318 (서열 87)을 나타낸다.

도 35는 DNA47365-1206 (서열 91)을 나타낸다.

도 36은 천연 서열 PRO364 폴리펩티드 UNQ319 (서열 92)을 나타낸다.

도 37은 DNA47470-1130 (서열 101)을 나타낸다.

도 38은 천연 서열 PRO356 폴리펩티드 UNQ313 (서열 102)을 나타낸다.

도 39는 DNA48314-1320 (서열 106)을 나타낸다.

도 40은 천연 서열 PRO531 폴리펩티드 UNQ332 (서열 107)를 나타낸다.

도 41은 DNA49435-1219 (서열 111)를 나타낸다.

도 42는 천연 서열 PRO533 폴리펩티드 UNQ334 (서열 112)를 나타낸다.

도 43은 DNA50921-1458 (서열 116)을 나타낸다.

도 44는 천연 서열 PRO1083 폴리펩티드 UNQ540 (서열 117)을 나타낸다.

도 45는 DNA53974-1401 (서열 123)을 나타낸다.

도 46은 천연 서열 PRO865 폴리펩티드 UNQ434 (서열 124)를 나타낸다.

도 47은 DNA54228-1366 (서열 133)을 나타낸다.

도 48은 천연 서열 PRO770 폴리펩티드 UNQ408 (서열 134)을 나타낸다.

도 49는 DNA54231-1366 (서열 139)를 나타낸다.

도 50은 천연 서열 PRO769 폴리펩티드 UNQ407 (서열 140)을 나타낸다.

도 51은 DNA56405-1357 (서열 141)을 나타낸다.

도 52는 천연 서열 PRO788 폴리펩티드 UNQ430 (서열 142)을 나타낸다.

도 53은 DNA57033-1403 (서열 143)을 나타낸다.

도 54는 천연 서열 PRO1114 폴리펩티드 UNQ557 (서열 144)을 나타낸다.

도 55는 DNA57690-1374 (서열 145)를 나타낸다.

도 56은 천연 서열 PRO1007 폴리펩티드 UNQ491 (서열 146)을 나타낸다.

도 57은 DNA59220-1514 (서열 147)를 나타낸다.

도 58은 천연 서열 PRO1184 폴리펩티드 UNQ598 (서열 148)을 나타낸다.

도 59는 DNA59294-1381 (서열 149)을 나타낸다.

도 60은 천연 서열 PRO1031 폴리펩티드 UNQ516 (서열 150)을 나타낸다.

도 61은 DNA59776-1600 (서열 151)을 나타낸다.

도 62는 천연 서열 PRO1346 폴리펩티드 UNQ701 (서열 152)을 나타낸다.

도 63은 DNA59849-1504 (서열 156)를 나타낸다.

도 64는 천연 서열 PRO1155 폴리펩티드 UNQ585 (서열 157)를 나타낸다.

도 65는 DNA60775-1532 (서열 158)를 나타낸다.

도 66은 천연 서열 PRO1250 폴리펩티드 UNQ633 (서열 159)을 나타낸다.

도 67은 DNA61873-1574 (서열 160)를 나타낸다.

도 68은 천연 서열 PRO1312 폴리펩티드 UNQ678 (서열 161)을 나타낸다.

도 69는 DNA62814-1521 (서열 162)을 나타낸다.

도 70은 천연 서열 PRO1192 폴리펩티드 UNQ606 (서열 163)을 나타낸다.

도 71은 DNA64885-1529 (서열 167)를 나타낸다.

도 72는 천연 서열 PRO1246 폴리펩티드 UNQ630 (서열 168)을 나타낸다.

도 73은 DNA65404-1551 (서열 169)을 나타낸다.

도 74는 천연 서열 PRO1283 폴리펩티드 UNQ653 (서열 170)을 나타낸다.

도 75는 DNA65412-1523 (서열 177)을 나타낸다.

도 76은 천연 서열 PRO1195 폴리펩티드 UNQ608 (서열 178)을 나타낸다.

도 77은 DNA66675-1587 (서열 179)을 나타낸다.

도 78은 천연 서열 PRO1343 폴리펩티드 UNQ698 (서열 180)을 나타낸다.

도 79는 DNA68864-1629 (서열 184)를 나타낸다.

도 80은 천연 서열 PRO1418 폴리펩티드 UNQ732 (서열 185)를 나타낸다.

도 81은 DNA68872-1620 (서열 186)을 나타낸다.

도 82는 천연 서열 PRO1387 폴리펩티드 UNQ722 (서열 187)를 나타낸다.

도 83은 DNA68874-1622 (서열 188)를 나타낸다.

도 84는 천연 서열 PRO1410 폴리펩티드 UNQ728 (서열 189)을 나타낸다.

도 85는 DNA76400-2528 (서열 190)을 나타낸다.

도 86은 천연 서열 PRO1917 폴리펩티드 UNQ900 (서열 191)을 나타낸다.

도 87은 DNA77624-2515 (서열 192)를 나타낸다.

도 88은 천연 서열 PRO1868 폴리펩티드 UNQ859 (서열 193)를 나타낸다.

도 89는 DNA30868-1156 (서열 228)을 나타낸다.

도 90은 부분 천연 서열 PRO205 폴리펩티드 UNQ179 (서열 229)를 나타낸다.

도 91은 DNA36638-1056 (서열 230)을 나타낸다.

도 92는 천연 서열 PRO21 폴리펩티드 UNQ21 (서열 231)을 나타낸다.

도 93은 DNA38260-1180 (서열 232)을 나타낸다.

도 94는 천연 서열 PRO269 폴리펩티드 UNQ236 (서열 233)을 나타낸다.

도 95는 DNA40592-1242 (서열 240)를 나타낸다.

도 96은 천연 서열 PRO344 폴리펩티드 UNQ303 (서열 241)을 나타낸다.

도 97은 DNA41374-1312 (서열 248)를 나타낸다.

도 98은 부분 길이 천연 서열 PRO333 폴리펩티드 UNQ294 (서열 249)를 나타낸다.

도 99는 DNA44194-1317 (서열 250)을 나타낸다.

도 100은 천연 서열 PRO381 폴리펩티드 UNQ322 (서열 251)를 나타낸다.

도 101은 DNA53517-1366 (서열 255)을 나타낸다.

도 102는 천연 서열 PRO720 폴리펩티드 UNQ388 (서열 256)을 나타낸다.

도 103은 DNA53971-1359 (서열 257)를 나타낸다.

도 104는 천연 서열 PRO866 폴리펩티드 UNQ435 (서열 258)를 나타낸다.

도 105는 DNA53987-1438 (서열 266)을 나타낸다.

도 106은 천연 서열 PRO840 폴리펩티드 UNQ433 (서열 267)을 나타낸다.

도 107은 DNA57700-1408 (서열 268)을 나타낸다.

도 108은 천연 서열 PRO982 폴리펩티드 UNQ483 (서열 269)을 나타낸다.

도 109는 DNA59620-1463 (서열 270)을 나타낸다.

도 110은 천연 서열 PRO836 폴리펩티드 UNQ545 (서열 271)를 나타낸다.

도 111은 DNA60627-1508 (서열 272)을 나타낸다.

도 112는 천연 서열 PRO1159 폴리펩티드 UNQ589 (서열 273)를 나타낸다.

도 113은 DNA64890-1612 (서열 274)를 나타낸다.

도 114는 천연 서열 PRO1358 폴리펩티드 UNQ707 (서열 275)을 나타낸다.

도 115는 DNA66659-1593 (서열 276)을 나타낸다.

도 116은 천연 서열 PRO1325 폴리펩티드 UNQ685 (서열 277)를 나타낸다.

도 117은 DNA66667-1596 (서열 278)을 나타낸다.

도 118은 천연 서열 PRO1338 폴리펩티드 UNQ693 (서열 279)을 나타낸다.

도 119는 DNA68818-2536 (서열 280)을 나타낸다.

도 120은 천연 서열 PRO1434 폴리펩티드 UNQ739 (서열 281)를 나타낸다.

도 121은 DNA84210-2576 (서열 285)을 나타낸다.

도 122는 천연 서열 PRO4333 폴리펩티드 UNQ1888 (서열 286)을 나타낸다.

도 123은 DNA92218-2554 (서열 292)를 나타낸다.

도 124는 천연 서열 PRO4302 폴리펩티드 UNQ1866 (서열 293)을 나타낸다.

도 125는 DNA96878-2626 (서열 294)을 나타낸다.

도 126은 천연 서열 PRO4430 폴리펩티드 UNQ1947 (서열 295)을 나타낸다.

도 127은 DNA98853-1739 (서열 296)를 나타낸다.

도 128은 천연 서열 PRO5727 폴리펩티드 UNQ2448 (서열 297)을 나타낸다.

I. 정의

용어 "PRO 폴리펩티드(들)" 및 "PRO"란 본원에 사용된 바와 같이 바로 뒤에 숫자가 붙어서 다양한 폴리펩티드를 의미하는데, 완전한 명칭 (즉, "PRO/숫자" 또는 더욱 구체적으로, PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387,PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727)은 본원에 기재된 바와 같은 특정 폴리펩티드 서열을 의미하는 용어이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "PRO/숫자 폴리펩티드" 및 "PRO/숫자"에서 "숫자"는 실제 수로 나타내며 (예를 들면, 상기 기재한 바와 같음), 이는 천연 서열 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체 (본원에서 추가로 정의됨)를 포함하는 용어이다. 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드는 인간 조직 또는 다른 출처와 같은 다양한 출처에서 단리되거나 재조합 또는 합성 방법으로 제조될 수 있다.

"천연 서열 PRO 폴리펩티드(들)"는 자연으로부터 유래한 대응하는 PRO 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 PRO/숫자 폴리펩티드는 자연으로부터 단리하거나 재조합 또는 합성 방법으로 제조될 수 있다. 용어 "천연 서열 PRO 폴리펩티드(들)"는 구체적으로는 특정 PRO/숫자 폴리펩티드의 자연발생적 말단 절단 (truncated) 형태 또는 분비 형태 (예를 들어 세포외 도메인 서열), 이러한 폴리펩티드의 자연발생적 변이체 형태 (예를 들면, 다르게 스프라이싱된 형태) 및 자연발생적 대립 변이체를 포함한다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 본원에서 기재된 천연 서열 PRO 폴리펩티드는 첨부된 도면에 나타낸 전장 아미노산 서열을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다. 개시 및 중지 코돈은 도면에서 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된다. 그러나, 본원에 첨부된 도면에 개시된 PRO/숫자 폴리펩티드는 도면에서 아미노산 위치 1로 지정된 메티오닌 잔기로 시작하는 것으로 나타나 있지만, 도면에서 아미노산 위치 1로부터 상류 또는 하류에 위치한 다른 메티오닌 잔기가 PRO 폴리펩티드의 출발 아미노산 잔기로 이용될 수 있음을 생각할 수 있으며 또한 가능하다.

"PRO 폴리펩티드(들) 세포외 도메인" 또는 "ECD"란 본질적으로 막횡단 및 세포질 도메인이 없는 상기 폴리펩티드 형태를 의미한다. 통상적으로 PRO 폴리펩티드 ECD는 이렇게 막횡단 및(또는) 세포질 도메인을 1 ％ 미만으로 포함할 것이며, 바람직하게는 상기 도메인들을 0.5 ％ 미만으로 포함할 것이다. 본 발명의 PRO 폴리펩티드에서 확인된 모든 막횡단 도메인은 당업계에서 소수성 도메인 유형을 밝히는데 통상적으로 사용되는 기준에 따라 확인된 것임을 이해할 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계선은 달라질 수 있지만, 대부분은 본원에서 처음 확인된 바와 같이 이 도메인의 어느쪽 말단이든지 약 5 개 아미노산 범위 내에 존재한다. 따라서, PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인은 경우에 따라 실시예 또는 상세한 설명에서 확인된 막횡단 도메인/세포외 도메인의 어느쪽 경계면이든지 약 5 개 이하의 아미노산을 포함할 수 있고, 수반되는 신호 펩티드가 있거나 없는 이러한 폴리펩티드, 및 이들을 코딩하는 핵산은 본 발명에 포함된다.

본원에 기재된 다양한 PRO/숫자 폴리펩티드의 "신호 펩티드"의 대략적인 위치는 본 명세서 및(또는) 첨부된 도면에 나타나 있다. 그러나 염두에 두어야 할 것은, 신호 펩티드의 C-말단 경계가 달라질 수 있지만, 대부분은 본원에서 처음 확인된 신호 펩티드 C-말단의 어느쪽 경계면이든지 아미노산은 약 5 개 이하라는 점이며, 여기서 신호 펩티드의 C-말단 경계는 당업계에서 아미노산 서열 요소의 유형을 확인하는데 통상적으로 이용되는 기준에 따라 확인될 수 있다 (예를 들면, 문헌 (Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6 (1997) 및 von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986) 참조). 게다가, 일부 경우에는 분비 폴리펩티드의 신호 서열의 절단이 전체적으로 동일하지 않아 1 종 이상의 분비된 폴리펩티드를 생성시킨다는 것을 인지해야 한다. 본원에서 확인된 신호 펩티드의 C-말단의 어느쪽 경계면이든지에 있는 약 5 개 이하의 아미노산 범위 내에서 신호 펩티드가 절단된 이들 성숙 폴리펩티드, 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 포함된다.

"PRO 폴리펩티드 변이체", "PRO/숫자 변이체" 또는 "PRO 변이체"는 본원에 기재된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 기재된 바와 같이 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편과 약 80 ％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 본원에서 (예를 들면, 하기에서) 정의된 활성 PRO 폴리펩티드을 의미한다. 이러한 PRO 폴리펩티드 변이체로는 예를 들어 전장 천연 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산 잔기가 첨가되거나 결실된 PRO 폴리펩티드 등이 있다. 통상, PRO 폴리펩티드 변이체는 본원에서 개시된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 기재된 바와 같이 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 특별하게 정의된 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80 ％ 이상, 다르게는 약 81 ％ 이상, 다르게는 약 82 ％ 이상, 다르게는 약 83 ％ 이상, 다르게는 약 84 ％ 이상, 다르게는 약 85 ％ 이상, 다르게는 약 86 ％ 이상, 다르게는 약 87 ％ 이상, 다르게는 약 88 ％ 이상, 다르게는 약 89 ％ 이상, 다르게는 약 90 ％ 이상, 다르게는 약 91 ％ 이상, 다르게는 92 ％ 이상, 다르게는 약 93 ％ 이상, 다르게는 약 94 ％ 이상, 다르게는 약 95 ％ 이상, 다르게는 약 96 ％ 이상, 다르게는 약 97 ％ 이상, 다르게는 약 98 ％ 이상, 다르게는 약 99 ％ 이상이다. 통상적으로, PRO 변이체 폴리펩티드는 그 길이가 약 10 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 20 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 30 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 40 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 50 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 60 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 70 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 80 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 90 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 100 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 150 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 200 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 300 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 400 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 500 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 600 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 700 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 800 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 900 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 1000 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 1200 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 1400 개 이상의 아미노산, 다르게는 약 1500 개 이상의 아미노산 또는 그 이상이다.

본원에서 밝혀진 PRO 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 (％)"은 특정 PRO 폴리펩티드 서열과 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우 서열 동일성 퍼센트의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 특정 PRO/숫자 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 (％)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대로 정렬시키기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 아미노산 서열 동일성 값 (％)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 하기 표 1에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크사 (Genenctech, Inc.)가 개발하였으며, 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (미국 20559 워싱톤 D.C. 소재)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며 미국 저작권 등록 제TXU510087호로서 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크사 (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)를 통해 공개적으로 입수할 수 있거나, 하기 표 1에 기재된 원시 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영체제, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 컴파일되어 이용되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정되며 변경되지 않는다.

ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (％) (또는 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 특정 아미노산 서열 동일성 (％)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:

X/Y ×100

여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 있는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (％)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (％)와 같지 않을 것임을 인지해야 할 것이다. 이 방법을 이용한 아미노산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 2 및 표 3은 "PRO"로 지칭하는 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 지칭하는 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성 (％)을 계산하는 방법을 나타내며, 여기서, "PRO"는 관심있는 가정의 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 관심있는 "PRO" 폴리펩티드와 비교될 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내며, "X", "Y" 및 "Z"는 각각 상이한 가정의 아미노산 잔기를 나타낸다.

달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 본원에 이용된 모든 아미노산 서열 동일성 값 (％)은 바로 앞선 단락에 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻는다. 그러나, 아미노산 서열 동일성 값 (％)은 하기한 바와 같이 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-80(1996))을 이용하여 얻을 수도 있다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정된다. 디폴트값으로 설정하지 않은 것들 즉, 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정된다: 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62. WU-BLAST-2를 이용하면 아미노산 서열 동일성 값 (％)은, (a) 천연 PRO 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 갖는 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관심있는 비교 아미노산 서열 (즉, 관심있는 PRO 폴리펩티드와 비교되는 서열로서 PRO 폴리펩티드 변이체일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 아미노산 잔기의 수를 WU-BLAST-2로 결정하여 얻고, 이를 (b) 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 총 잔기수로 나누어 결정한다. 예를 들어, 아미노산 서열 B와 80 ％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 A를 포함하는 폴리펩티드"라는 말에서, 아미노산 서열 A는 비교하는 관심있는 아미노산 서열이고 아미노산 서열 B는 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.

아미노산 서열 동일성 (％)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST-2를 이용하여 결정할 수도 있다 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). 상기 NCBI-BLAST-2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받거나 미국 메릴랜드주 베테스다 소재의 미국립보건원에서 얻을 수 있다. NCBI-BLAST-2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 디폴트값으로 설정되며, 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 =25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62이다.

NCBI-BLAST-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (％) (주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 특정 아미노산 서열 동일성 (％)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:

X/Y ×100

여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 있는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (％)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (％)과 같지 않을 것임을 인지해야 할 것이다.

"PRO 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO 변이체 핵산 서열"은 아래 정의된 바와 같은 활성 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, (1) 본원에 기재된 바와 같은 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, (2) 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, (3) 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 (4) 본원에 기재된 바와 같이 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 ％ 이상인 핵산 분자이다. 통상, PRO 폴리펩티드 변이체 폴리뉴클레오티드는 (1) 본원에 기재된 바와 같은 전장 천연 서열 PRO폴리펩티드 서열, (2) 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 PRO 폴리핍티드 서열, (3) 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO 폴리펩티드 서열의 세포외 도메인, 또는 (4) 본원에 기재된 바와 같이 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 ％ 이상, 다르게는 약 81 ％ 이상, 다르게는 약 82 ％ 이상, 다르게는 약 83 ％ 이상, 다르게는 약 84 ％ 이상, 다르게는 약 85 ％ 이상, 다르게는 약 86 ％ 이상, 다르게는 약 87 ％ 이상, 다르게는 약 88 ％ 이상, 다르게는 약 89 ％ 이상, 다르게는 약 90 ％ 이상, 다르게는 약 91 ％ 이상, 다르게는 약 92 ％ 이상, 다르게는 약 93 ％ 이상, 다르게는 약 94 ％ 이상, 다르게는 약 95 ％ 이상, 다르게는 약 96 ％ 이상, 다르게는 약 97 ％ 이상, 다르게는 약 98 ％ 이상, 다르게는 약 99 ％ 이상일 것이다. 변이체들은 천연 뉴클레오티드 서열을 포괄하지 않는다.

통상적으로, PRO 폴리펩티드 변이체 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 약 30 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 60 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 90 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 120 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 150 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 180 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 210 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 240 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 270 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 300 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 450 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 500 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 600 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 700 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 800 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 900 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 1000 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 1200 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 1400 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 1600 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 1800 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 2000 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 2500 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 3000 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 3500 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 4000 개 이상의 뉴클레오티드, 다르게는 약 5000 개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 이상이다.

본원에서 확인된 PRO 코딩 핵산 서열과 관련하여 "핵산 서열 동일성 (％)"은 특정 PRO 핵산 서열과 후보 서열을 정렬시키고, 필요한 경우 서열 동일성의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 특정 PRO 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열의 뉴클레오티드의 비율로서 정의된다. 핵산 서열 동일성 (％)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 핵산 서열 동일성 값 (％)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 하기 표 1에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크사가 개발하였으며, 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (미국 20559 워싱톤 D.C. 소재)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 제TXU510087호로서 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크사 (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)를 통해공개적으로 입수할 수 있거나, 하기 표 1에 기재된 원시 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영체제, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 컴파일되어 이용되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정되며 변경되지 않는다.

ALIGN-2가 핵산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (％) (주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (％)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:

W/Z ×100

여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에 있는 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (％)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (％)과 같지 않을 것임을 인지해야 할 것이다. 핵산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 4 및 표 5는 "PRO-DNA"로 지칭하는 핵산 서열에 대한 "비교 DNA"로 지칭하는 핵산 서열의 핵산 서열 동일성 (％)을 계산하는 방법을 나타내며, "PRO-DNA"는 관심있는 가정의 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산 서열을 나타내며, "비교 DNA"는 관심있는 "PRO-DNA" 핵산 분자를 비교할 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, "N", "L" 및 "V"는 각각 상이한 가정의 뉴클레오티드를 나타낸다.

달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 본원에 이용된 모든 핵산 서열 동일성값 (％)은 바로 앞선 단락에 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻는다. 그러나, 핵산 서열 동일성 값 (％)은 하기한 바와 같이 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996))을 이용하여 얻는다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정된다. 디폴트값으로 설정되지 않은, 즉 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정되었다: 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62. WU-BLAST-2가 사용된다면, 핵산 서열 동일성 값 (％)은 (a) 천연 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산으로부터 유도된 서열을 갖는 관심있는 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자 (즉, 참조 서열)의 핵산 서열과 비교되는 핵산 분자 (즉, 관심있는 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자와 비교되는 서열로서 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 뉴클레오티드의 수를 WU-BLAST-2로 얻은 후 이를 (b) PRO 참조 서열의 총 뉴클레오티드수로 나누어 얻는다. 예를 들어, 핵산 서열 B와 80 ％ 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 A를 포함하는 단리된 핵산 분자"라는 말에서, 핵산 서열 A는 비교하는 관심있는 핵산 분자의 서열이고 핵산 서열 B는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 관심있는 핵산 분자의 핵산 서열이다.

핵산 서열 동일성 (％)은 하기 기재된 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST-2를 이용하여 계산할 수도 있다 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). 상기 NCBI-BLAST-2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi. nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받거나 미국 메릴랜드주 베테스다 소재의 미국립보건원에서 얻을 수 있다. NCBI-BLAST-2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데,이러한 모든 검색 파라미터는 디폴트값으로 설정되며 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62이다.

NCBI-BLAST-2가 핵산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (％) (주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (％)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:

W/Z ×100

여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에 있는 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (％)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (％)과 같지 않을 것임을 인지해야 할 것이다.

다른 실시양태에서 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 전장 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 (바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건에서) 활성 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다. PRO 변이체 폴리펩티드는 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

상기한 바와 같이 수행되는 서열 비교와 관련하여 용어 "양성"은 동일하지는않으나 성질이 유사한 비교되는 서열의 잔기를 의미한다 (예를 들면 보존적 치환의 결과로, 하기 표 6 참조). 본원의 목적을 달성하기 위해, 양성 값 (％)은, (a) 천연 PRO 폴리펩티드 서열로부터 유도된 서열을 갖는 관심있는 PRO 폴리펩티드 서열과 비교되는 아미노산 서열 (즉, PRO 폴리펩티드 서열이 비교되는 아미노산 서열)과의 사이에서 양성 값을 기록한 아미노산 잔기의 수를 WU-BLAST-2의 BLOSUM 62 매트릭스에서 결정한 후, 이를 (b) 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총 수로 나누어 결정한다.

달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 양성값 (％)은 바로 앞선 단락에 기재된 바와 같이 계산한다. 그러나, 상기 ALIGN-2 및 NCBI-BLAST-2에 대해 기재한 바와 같이 수행되는 아미노산 서열 동일성 비교는 동일하지는 않으나 성질이 유사한 비교되는 서열의 아미노산 잔기를 포함한다. 관심있는 아미노산 잔기에 대해 양성값을 기록하는 아미노산 잔기는 관심있는 아미노산 잔기와 동일한 것이거나 관심있는 아미노산 잔기의 바람직한 치환 (하기 표 6에 기재되어 있음)이다.

ALIGN-2 또는 NCBI-BLAST-2를 이용한 아미노산 서열 비교를 위해서는, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 양성값 (％) (주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 양성값 (％)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:

X/Y ×100

여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 또는 NCBI-BLAST-2에 의해 상기에서 정의된 양성값을 기록하는 아미노산 잔기의 수이고,Y는 B에 있는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 양성값 (％)은 A에 대한 B의 양성값 (％)과 같지 않을 것임을 인지해야 할 것이다.

본원에 기재된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용된 "단리된"은 폴리펩티드가 확인되고, 그 자연 환경 요소로부터 분리 및(또는) 회수되었음을 의미한다. 폴리펩티드의 자연 환경의 오염 요소는 이 폴리펩티드의 진단 또는 치료적 사용을 일반적으로 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질 등이 있을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15 개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제될 것이다. PRO 폴리펩티드 자연 환경의 요소가 하나 이상 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포내의 계내 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 얻어질 것이다.

"단리된" PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 또는 기타 폴리펩티드 코딩 핵산이란 그 폴리펩티드 코딩 핵산의 천연 출처에서 통상적으로 결합되어 있는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자라는 의미이다. 단리된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다르게 존재한다. 따라서, 단리된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 폴리펩티드 코딩 핵산분자와 구별된다. 그러나, 예를 들어, 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하며 통상적으로 특정 폴리펩티드를 발현하는 세포에 포함된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자는 단리된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자에 포함된다.

용어 "조절 서열"이란 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적절한 조절 서열로는 예컨데 프로모터, 경우에 따라 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 들 수 있다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)의 DNA는 해당 폴리펩티드가 분비되기 전의 형태인 전단백질로서 발현되는 경우 그 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 그 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 위치할 뿐만 아니라 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.

혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도, 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로 보다 긴 프로브일수록 적절한 어닐링에 보다 높은 온도를 필요로하며, 보다 짧은 프로브일수록 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 자신들의 용융 온도보다 낮은 환경에 존재할 때 재어닐링되는 변성된 DNA의 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이의 원하는 동족성의 정도가 높을수록, 사용할 수 있는 상대적인 온도가 높아진다. 따라서, 상대적 온도보다 높아질수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 반면, 상대적 온도가 낮을수록 반응조건은 덜 엄격해진다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련한 더 자세한 정보 및 설명은 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995))을 참조한다.

본원에서 정의되는 "엄격 조건" 또는 "고엄격 조건"이란 (1) 세척시 이온 세기가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들면 50 ℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1 ％ 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 조건, 또는 (2) 혼성화시에 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, 예를 들어 42 ℃에서 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 포함된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)/0.1 ％ 소 혈청 알부민/0.1 ％ 피콜/0.1 ％ 폴리비닐피롤리돈이 포함된 50 ％ (부피/부피) 포름아미드를 사용하는 조건, (3) 50 ％ 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1 ％ 피로인산 나트륨, 5 x Denhardt's 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1 ％ SDS, 및 10 ％ 덱스트란 술페이트를 42 ℃에서 사용하고, 42 ℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 그리고 55 ℃에서 50 ％ 포름아미드로 세척하며, 55 ℃에서 EDTA가포함된 0.1 x SSC를 이용한 고엄격 세척을 수행하는 것이다.

"중간정도의 엄격 조건"이란 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press 1989)에 기재된 바와 같고, 상기한 것보다 엄격성이 낮은 혼성화 조건 (예를 들어 온도, 이온 세기 및 ％ SDS)의 이용을 말한다. 중간정도의 엄격 조건의 예는 20 ％ 포름아미드, 5 x SSC (150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x Denhardt's 용액, 10 ％ 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 잘린 연어 정자 변성 DNA를 포함하는 용액 중에서 37 ℃로 밤새 인큐베이션한 후 필터를 약 37 내지 50 ℃에서 1 x SSC로 세척하는 조건이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 요인에 맞추기 위해 필요한 온도, 이온 세기 등을 조절하는 방법을 잘 알 것이다.

"항체" (Ab) 및 "면역글로불린" (Ig)이란 일반적인 구조적 특징이 동일한 당단백질이다. 항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 보이나, 면역글로불린에는 항체 뿐 아니라 항원 특이성이 없는 다른 항체-유사 분자까지 포함된다. 면역글로불린의 폴리펩티드는 예를 들어, 림프계에 의해 적은 양으로 생성되고, 골수종에 의해서는 이보다 증가된 양으로 생성된다. 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 무손상의 모노클로날 항체 (아고니스트, 길항제 및 중화 항체 등), 폴리클로날 항체, 둘 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이성 항체 (예를 들면 이중특이성 항체), PRO 폴리펩티드 특이성 에피토프에 결합하는 단쇄 항체 및 원하는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편 등을 통칭하나 이에 제한되지 않는다. 항-PRO200, 항-PRO204, 항-PRO212, 항-PRO216, 항-PRO226, 항-PRO240, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO172, 항-PRO273, 항-PRO272, 항-PRO332, 항-PRO526, 항-PRO701, 항-PRO361, 항-PRO362, 항-PRO363, 항-PRO364, 항-PRO356, 항-PRO531, 항-PRO533, 항-PRO1083, 항-PRO865, 항-PRO770, 항-PRO769, 항-PRO788, 항-PRO1114, 항-PRO1007, 항-PRO1184, 항-PRO1031, 항-PRO1346, 항-PRO1155, 항-PRO1250, 항-PRO1312, 항-PRO1192, 항-PRO1246, 항-PRO1283, 항-PRO1195, 항-PRO1343, 항-PRO1418, 항-PRO1387, 항-PRO1410, 항-PRO1917, 항-PRO1868, 항-PRO205, 항-PRO21, 항-PRO269, 항-PRO344, 항-PRO333, 항-PRO381, 항-PRO720, 항-PRO866, 항-PRO840, 항-PRO982, 항-PRO836, 항-PRO1159, 항-PRO1358, 항-PRO1325, 항-PRO1338, 항-PRO1434, 항-PRO4333, 항-PRO4302, 항-PRO4430 또는 항-PRO5727 항체는 각각 PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727 폴리펩티드에 면역학적으로 결합하는 항체이다. 상기 항체는 이 항체와 접촉할 수 있는 PRO 폴리펩티드의 어떤 도메인과도 결합할 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 상기 폴리펩티드의 어떠한 세포외 도메인에도 결합할 수 있고, 전체 폴리펩티드가 분비되는 경우에는 항체와의 결합에 이용가능한, 폴리펩티드 상의 어떤 도메인에도 결합할 수 있다.

"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 일반적으로 2 개의 동일한 경쇄 (L) 및 2 개의 동일한 중쇄 (H)로 구성되는 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 결합의 개수는 중쇄의 상이한 면역글로불린 이소타입에 따라 다르다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄에는 규칙적인 간격의 쇄내 디술피드 결합이 있다. 각각의 중쇄에는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_H)이 있고, 그 뒤에 여러 개의 불변 도메인이 있다. 각각의 경쇄에는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_L)이 있고, 다른 쪽 말단에 불변 도메인이 있으며, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인불변 도메인과 일렬로 배열되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 일렬로 배열된다. 특정 아미노산 잔기들이 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 공유영역을 형성하는 것으로 생각된다.

용어 "가변"은 가변 도메인 중 특정 부분의 서열이 항체들 간에 크게 상이함을 의미하며, 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 균일하게 분포되어 있는 것이 아니다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에 있는, "상보성 결정 영역 (CDR)" 또는 "과가변 영역"으로 지칭되는 3 개 또는 4 개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인에서 보존성이 매우 높은 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄에 있는 각각의 가변 도메인은 β-시트 구조를 연결하거나 경우에 따라 그 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하고 있는 CDR로 연결되는, 주로 β-시트 배열을 갖는 4 개 또는 5 개의 프레임워크 영역을 포함한다. 각 쇄 내의 CDR은 FR 영역에 의해 서로 매우 근접하게 유지되고, 다른 쇄의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 (Kabat et al.,NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 (1991)) 참조). CDR의 정도를 측정하는 2 이상의 기술이 있다: (1) 종간 서열 변이성 정도에 기초한 접근법 (즉, 문헌 (Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest) (미국 메릴랜드주 베테스다 소재의 미국립보건원)); 및 (2) 항원-항체 복합체에 관한 결정학적 연구에 기초한 접근법 (문헌 (Chothia, C.et al., (1989),Nature 342: 877)). 또한, CDR은 상기 2 가지 기술 모두에 의해 확인된 잔기를 포함하는 것으로 하는 하이브리드 접근법을 사용하여 정의될 수도 있다. 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하지 않지만, 예를 들어 항체 의존성 세포독성에서의 항체 관여 등과 같은 여러 이펙터 기능을 보인다.

"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10):1057-1062 (1995)); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 있다.

항체를 파파인 (Papain) 분해하면 각각 단일 항원 결합 부위가 있는 2 개의동일한 항원 결합 단편 ("Fab" 단편이라 불림), 및 쉽게 결정화되는 능력을 반영하여 이름 붙여진 나머지 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2 개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')₂단편이 생성된다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비공유결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 이량체로 구성된다. 이러한 구조에서는 각 가변 도메인에 있는 3 개의 CDR이 상호작용하여 V_H-V_L이량체의 표면에 항원 결합 부위를 형성한다. 결론적으로 보면, 6 개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3 개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 항원에 결합하는 능력을 갖는다.

또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab 단편은 항체 힌지 (hinge) 영역으로부터 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 첨가되었다는 점에서 Fab' 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 지칭한다. F(ab')₂항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인이 있는 몇쌍의 Fab' 단편으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.

임의의 척추동물종으로부터 유래한 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2 개의 명백하게 상이한 유형 중의 하나로 분류될 수 있다.

면역글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5 개 주요 클래스가 있고, 이들 중 몇 개는 서브클래스 (이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε,γ및 μ로 지칭된다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3 차원 구조는 잘 알려져 있다.

본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종성인 항체들의 집단으로부터 얻은 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이체를 제외한, 한 집단을 이루는 동일한 개별 항체를 의미한다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이며 단일 항원 부위에 대해 지정된 항체이다. 또한, 통상적으로 상이한 결정부위 (에피토프)에 대해 지정된 상이한 항체들을 포함하는 통상의 항체 (폴리클로날 항체) 제조물과는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원에 있는 단일 결정부위에 대해 지정된다. 이들의 특이성 뿐 아니라, 모노클로날 항체는 하이브리도마 배양에 의해 합성되며, 다른 면역글로불린으로 오염되지 않는다는 장점이 있다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내는 것이며, 어떤 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에서 사용된 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler et al.,Nature,256: 495 (1975))에 최초로 기재된 하이브리도마 방법 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조될 수 있다. 또한, "모노클로날 항체"는 예를 들어 문헌 (Clackson et al.,Nature,352: 624-628 (1991) 및 Marks et al.,J. Mol. Biol.,222: 581-597 (1991))에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 또한, 파지미드 및 파지 벡터를 사용하는 항체 제조 방법에 대해 기술한 미국 특허 제5,750,373호, 제5,571,698호, 제5,403,484호 및 제5,223,409호를 참조한다.

본원의 모노클로날 항체는 구체적으로, 원하는 생물학적 활성을 나타낸다면 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분은 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에 있는 상응 서열과 동일하거나 동족성을 갖고, 쇄(들)의 나머지는 또다른 종으로부터 유래된 항체 또는 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 및 그러한 항체 단편과 동일하거나 동족성을 갖는 "키메라" 항체 (면역글로불린)를 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81: 6851-6855 (1984)).

비인간 (예를 들어, 뮤린 (murine) 동물) 항체의 "인간화" 형태는 키메라 면역글로불린, 비인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 포함하는 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂또는 항체의 다른 항원 결합 서브서열)이다. 대부분의 경우 인간화 항체는, 수용체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종 (공여 항체)의 CDR의 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열 어느 것에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 수행능을 개량하고 최대화하도록 만든다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비인간 면역글로불린의 영역에 대응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 영역에 대응한다. 또한, 인간화 항체는 경우에 따라 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세한 사항은 문헌 (Jones et al.,Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature,332: 323-327 (1988); 및 Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992))을 참조한다. 인간화 항체는 항체의 항원 결합 영역이 짧은꼬리원숭이를 관심 항원으로 면역화시켜 생산된 항체로부터 유도된 "영장류화 (primatized)" 항체를 포함한다. 또한, 구세계월드원숭이 (Old World monkey)로부터의 잔기를 포함하는 항체도 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,658,570호, 제5,693,780호, 제5,681,722호, 제5,750,105호 및 제5,756,096호를 참조한다.

또한, 본 발명의 항체 및 그의 단편은 항체 또는 그의 단편이 결합하는 항원에 대한 이들의 친화성을 변경시키기 위하여 CDR 영역 및(또는) 프레임워크 영역의 아미노산 서열 하나 이상을 변화시켜 항체를 개질한 "친화성 성숙 (affinitymatured)" 항체를 포함한다. 친화성 성숙은 출발 항체에 비해 성숙 항체의 항원에 대한 친화성을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 일반적으로, 출발 항체는 인간화된, 인간, 키메라 또는 뮤린 항체일 것이고, 친화성 성숙된 항체는 출발 항체보다 증가된 친화성을 가질 것이다. 성숙 과정동안 임의의 표준 방법으로 CDR 또는 프레임워크 영역에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기를 상이한 잔기로 변화시킨다. 적합한 방법으로는 잘 알려진 카세트 돌연변이 유발법 (Well et al., 1985, Gene, 34:315) 또는 올리고뉴클레오티드 매개 돌연변이 유발법 (Zoller et al., 1987, Nucleic Acids Res., 10:6487-6504)을 이용하는 점 돌연변이법 등이 있다. 또한, 친화성 성숙은, 많은 돌연변이를 발생시키고, 원하는 친화성을 갖는 돌연변이체를 항원 또는 리간드에 대한 개선된 친화성에 기초하여 돌연변이체들의 풀 (pool) 또는 라이브러리로부터 선택하는, 공지된 선택법을 이용하여 수행될 수도 있다. 이 접근법에는 공지된 파지 디스플레이 기술을 편리하게 사용할 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제5,750,373호 및 미국특허 제5,223,409호 등을 참조한다.

또한, 인간 항체는 본 발명의 항체의 범위에 속한다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯한 당업계에 공지된 여러 가지 기술을 사용하여 제조할 수도 있다 (Hoogenboom et al.,J. Mol. Biol.,227: 381 (1991); Marks et al.,J. Mol. Bio.,222: 581-597 (1991)). 또한, 코울 (Cole) 등 및 보에르너 (Boerner) 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용할 수 있다 (Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al.,J. Immunol.,147(1):86-95 (1991); 미국 특허 제5,750,373호).유사하게, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 전체적으로 불활성화된 트랜스제닉 동물 (예를 들어 마우스)에 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입하여 인간 항체를 제조할 수 있다. 항원투여 후, 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 목록을 비롯한 모든 면이 인간에서 관찰되는 바와 매우 유사한 인간 항체 생산이 관찰된다. 상기 사항은 문헌 (예를 들어 미국 특허 제5,545,807호, 동 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 5,661,016호 및 과학 간행물 (Marks et al.,Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al.,Nature 368, 856-859 (1994), Morrison,Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger,Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar,Intern. Rev. Immunol. 1365-93 (1995)))에 기재되어 있다.

"단쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재하는 항체의 V_H및 V_L도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 필요한 구조를 형성하도록 하는 V_H및 V_L도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다 (sFv에 관해서는 문헌 (Pluckthan inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)) 참조).

용어 "디아바디 (diabody)"는 동일한 폴리펩티드 사슬 (V_H-V_L) 내에 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함하는, 2 개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편을 말한다. 동일한 사슬에 있는 2 개의 도메인을 페어링시키기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제로 페어링시켜 2 개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097, WO93/11611 및 Hollinger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 보다 상세하게 기재되어 있다.

"표지 (label)"란 단어는 본원에서 사용될 때, 항체 또는 폴리펩티드 등의 화합물에 직간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체로 (방사성동위원소 표지 또는 형광 표지) 검출될 수 있거나, 효소 표지인 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.

"고상 (solid phase)"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 고상의 예는 부분적으로 또는 완전하게 형성된 유리 (예를 들어 세공 조절된 유리), 폴리사카라이드 (예를 들어 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘 등이 있다. 특정 실시양태에서, 내용에 따라 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며, 다른 실시양태에서 고상은 정제 컬럼 (예를 들어 친화성 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 별개 입자의 비연속적 고상도 포함한다.

용어 "면역 관련 질환"이란 포유동물 면역계의 어떤 구성성분이 그 포유동물에서의 질환을 야기하거나, 매개하거나 또는 그의 발병률에 기여하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 개입이 그 질환의 진행을 가속하는 효과를 갖는 질환도 포함한다. 상기 용어에는 면역매개성 염증 질환, 비면역매개성 염증 질환, 감염증, 면역결핍질환, 신생물 (neoplasia) 등이 포함된다.

용어 "T 세포 매개성" 질환은, T 세포가 직접 또는 간접적으로 그 포유동물에서의 질환을 매개하거나 또는 그의 발병률에 기여하는 질환을 의미한다. 상기 T 세포 매개성 질환은 세포 매개성 효과, 림포카인 매개성 효과 등과 관련있을 수 있고, 또한, 예를 들어 T 세포가 분비하는 림포카인에 의해 B 세포가 자극된다면 B 세포와 관련된 효과일 수도 있다.

일부가 면역 또는 T 세포 매개성이고 본 발명에 따라 처리될 수 있는 면역 관련 질환 및 염증 질환의 예로는, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 유년형 만성 관절염, 척추관절증, 전신성 경화증 (경피증), 특발성 염증성 근장애 (피부근염, 다발성 근염), 쇼그렌증후군 (Sjoegren's syndrome), 전신성 맥관염, 유육종증, 자가면역 용혈성 빈혈 (면역성 범혈구감소증, 발작성 야간혈색소뇨증), 자가면역성 혈소판감소증 (특발성 혈소판감소성자반병, 면역매개성 혈소판감소증, 갑상선염 (그레이브스병, 하시모도갑상선염, 유년형 림프종성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 진성당뇨병, 면역매개성 신장 질환 (사구체신염, 세뇨관간질성신염), 다발성 경화증, 특발성 탈수초다발성 신경염 또는 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome) 및 만성 염증성 탈수초다발성 신경염과 같은 중추 및 말초신경계의 탈수초 질환, 감염성 간염 (A,B,C,D,E형 간염바이러스 및 기타 비-간친화성 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염 및 경화성 담관염과 같은 간담즙성 질환, 염증성 장질환 (궤양성 대장염; 크론병 (Crohn'sdisease)), 글루텐 민감성 장질환 및 휘플병 (Whipple's diesase), 수포성 피부 질환, 다형홍반 및 접촉성 피부염 등과 같은 자가면역 또는 면역매개성 피부 질환, 건선, 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증 및 두드러기와 같은 알러지성 질환, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유종 및 과민성 폐렴과 같은 폐의 면역 질환, 이식 거부 및 이식편대숙주질환 등의 이식 관련 질환 등이 있다. 감염증으로는 AIDS (HIV 감염), A, B, C, D 및 E형 간염, 헤르페스 (herpes) 등의 바이러스 질환, 세균 감염, 진균성 감염, 원생동물 감염 및 기생충 감염 등이 있다.

"치료 (treatment)"란 장애의 발생을 예방하거나 장애의 병리를 변화시키기 위해 수행하는 개입을 의미한다. 따라서, "치료"는 치료적 처치 (therapeutic treatment)와 예방 또는 방지 조치 모두를 나타낸다. 치료를 요하는 대상은 이미 질환을 앓고 있는 대상 뿐만 아니라 장애를 예방하고자 하는 대상까지도 포함한다. 면역 관련 질환의 치료에서, 치료제는 면역 반응 성분의 반응 정도를 직접 증가 또는 감소시키거나, 그 질환이 예를 들어 항생제, 항진균제, 항염증제, 화학요법제 등의 다른 치료제에 더 민감해지도록 한다.

용어 "유효량"이란 시험관내 분석으로 측정된 바와 같이 포유동물의 면역 반응 성분의 검출가능한 개선 (예를 들면, 본원의 실시예에서 측정된 것처럼 T-세포 증식 및(또는) 혈관 투과성의 증가 또는 감소)을 초래하거나, 그러한 개선을 유도하거나 그러한 개선이 되도록하는 PRO 폴리펩티드 및(또는) 아고니스트/길항제의 최소 농도 또는 최소량이다. 또한, "치료 유효량"이란 포유동물의 면역 반응 성분에 대해 적어도 병리의 감쇠 (경우에 따라 증가 또는 감소일 수 있음)에 효과적이어서 앞 단락에 정의된 바와 같은 치료에 이로운 영향을 주게 되는, PRO 폴리펩티드 및(또는) 아고니스트/길항제의 최소 농도 또는 최소량이다.

"만성" 투여란 급성 방식과 반대로 연속 방식으로 작용제(들)를 투여하여, 초기 치료 효과 (활성)를 장기간 동안 유지하는 것을 말한다. "간헐적" 투여는 중단없이 계속해서 행하는 것이 아니라 성질상 주기적으로 이루어지는 처치를 의미한다.

면역 관련 질환의 "병리"는 환자의 건강을 손상시키는 모든 현상을 포함한다. 여기에는 비정상적이거나 제어불가능한 세포 성장, 항체 생산, 자가-항체 생산, 보체 생산 및 활성화, 이웃 세포의 정상 기능 방해, 사이토카인 또는 다른 분비물의 비정상적 수준의 분비, 임의의 염증 또는 면역 반응의 억제 또는 악화, 염증세포 (호중구, 호산구, 단핵구, 림프구)의 조직 공간으로의 침윤 등이 있으나 이에 한정되지 않는다.

치료에 맞는 "포유동물"은 인간, 가축과 사육 동물, 및 동물원용, 경기용 또는 애완용 동물, 예를 들면, 개, 말, 소, 돼지, 원숭이, 햄스터, 흰족제비, 고양이 등을 포함하는 포유동물로서 분류되는 모든 동물을 말한다. 바람직한 포유동물은 인간이다.

하나 이상의 다른 치료제와 "병행하여" 투여된다는 것은 동시에 (동시다발적으로) 투여하거나 어떤 순서로든 연속하여 투여하는 것을 포괄한다.

본원에서 사용되는 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다.생리학상 허용되는 담체는 pH 완충 수용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예는 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 포함한 항산화제; 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN^TM, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICS^TM를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 방해하고(하거나) 세포를 파괴시키는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰및 Re¹⁸⁶), 화학요법제 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편을 포함하는 것으로 의도된다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는 아드리아마이신, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 시톡신, 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔 (Taxol), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재의 브리스톨마이어스 스퀴브 온콜로지 (Bristol-Myers Squibb Oncology) 제품) 및 독세탁셀 (탁소테레 (Taxotere), 프랑스 안토니 소재 롱플랑 로레아 (Rhone-Poulenc Rorer) 제품), 톡소테레, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 다른 관련 질소 머스타드 등이 있다. 또한, 타목시펜 및 오나프리스톤과 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 호르몬 제제도 상기 화학요법제의 정의에 포함된다.

본원에 사용된 "성장억제제"는 세포, 특히 본원에서 확인된 임의의 유전자를 과다발현하는 암 세포의 시험관내 또는 생체내 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 말한다. 따라서, 성장억제제는 그런 유전자를 과다발현하는 세포 비율을 S기에 크게 감소시키는 물질이다. 성장억제제의 예에는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 시기에서) 차단하는 작용제, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 작용제가 포함된다. 전형적인 M기 차단제로는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔, 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 있다. 또한, G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메톡트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 S기 정지에도 작용한다. 추가 정보는 문헌 (Murakami et al.,The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" (WB Saunders: Philadelphia, 1995), Chapter 1, 특히 13면)에 기재되어 있다.

용어 "사이토카인"이란 하나의 세포 집단에 의해 방출되는, 세포간 매개인자로서 다른 세포에 작용하는 단백질의 일반명이다. 사이토카인의 예로는 림포카인, 모노카인 및 전형적인 폴리펩티드 호르몬 등이 있다. 사이토카인에는 성장 호르몬, 예를 들어, 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬, 부갑상선 호르몬, 티록신, 인슐린, 프로인슐린, 릴락신, 프로렐락신, 여포자극호르몬 (FSH), 갑상선자극호르몬 (TSH) 및 황체형성호르몬(LH) 등의 당단백질 호르몬, 간 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 프롤락틴, 태반 락토젠, 종양 괴사인자-α및 -β, 뮬러리안 억제 물질, 마우스 성선자극세포 관련 펩티드, 인히빈, 액티빈, 혈관 내피 성장 인자, 인테그린, 트롬보포이에틴 (TPO), 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-β; 혈소판 성장 인자; 형질전환 세포 성장 인자 (TGF), 예를 들어, TGF-α및 -β, 인슐린 유사 성장 인자-1 및 -Π, 에리트로포이에틴 (EPO), 골유도 인자, 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, -β및 -γ, 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 대식세포-CSF (M-CSF), 과립세포-대식세포-CSF (GM-CSF) 및 과립세포-CSF (G-CSF), 인터루킨(IL), 예를 들어 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; 종양 괴사인자, 예를 들어, TNF-α또는 TNF-β; 및 LIF 및 키트 리간드 (KL)를 비롯한 다른 폴리펩티드 인자 등이 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 사이토카인에는 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 동등물 등이 있다.

본원에 사용된 용어 "에피토프 태그가 부착된"은 "태그 폴리펩티드"에 융합된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. 태그 폴리펩티드는항체가 만들어질 수 있을 정도의 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 융합되는 PRO 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 또한 태그 폴리펩티드는 자신에 대한 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 교차반응하지 않도록 아주 독특한 것이 바람직하다. 적절한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6 개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 통상 약 8 내지 50 개 (바람직하게는 약 10 내지 20 개의 잔기)의 아미노산 잔기를 갖는다.

PRO 폴리펩티드의 변이체에 대해 사용된 "활성의" 또는 "활성"은 생물학적이고(거나) PRO 폴리펩티드가 갖는 항원성 에피토프에 대한 항체 생성 유도력을 보유하는 본 발명의 단백질 형태(들)을 말한다. 더욱 구체적으로, "생물학적 활성"이란 천연 서열 또는 자연발생적 PRO 폴리펩티드에 의한 생물학적 기능 (억제능 또는 자극능)을 지칭한다. 훨씬 더욱 구체적으로, 본원에 개시된 스크리닝 분석법으로 확인될 수 있는 항체 또는 다른 분자 (예를 들어, 유기 또는 무기 소분자, 펩티드 등)에 대하여 사용되는 "생물학적 활성"이란 그러한 분자에 의한, 염증세포의 조직 침윤에 대한 유도력 또는 억제력, T-세포 증식 또는 활성화에 대한 자극력 또는 억제력, 세포에 의한 사이토카인 방출에 대한 자극력 또는 억제력, 또는 혈관 투과성의 증가력 또는 감소력을 지칭한다. 다른 구체적인 생물학적 활성은 혈관 투과성의 증가 또는 이의 억제이다.

용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 기재된 천연 PRO 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 통칭한다. 이와 비슷하게 용어 "아고니스트"도 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 기재된 천연 PRO 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하거나 증폭시키는 모든 분자를 통칭한다. 적절한 아고니스트 또는 길항제 분자로는 구체적으로 아고니스트 또는 길항제의 항체 또는 항체의 단편, 천연 PRO 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 작은 유기분자 등을 들 수 있다. PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제를 확인하는 방법은 PRO 폴리펩티드를 후보 아고니스트 분자나 후보 길항제 분자와 접촉시키고, 이 PRO 폴리펩티드와 정상적으로 관련된 하나 이상의 생물학적 활성에서 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.

"소분자 (small molecule)"는 본원에서 분자량이 약 600 달톤 이하인 것으로 정의되며 일반적으로 유기 화합물이다.

"리포좀"은 약물 (경우에 따라 화학요법제를 포함)을 포유동물에게 전달하는데 유용한 여러 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 작은 베지클 (vesicle)이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생체막의 지질 정렬과 유사하게 이중층 형태로 정렬된다.

본원에 사용된 용어 "면역어드헤신"은 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 이종 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로 보면 면역어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌, 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열 (즉, 이종 (heterologous))과 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 면역어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 통상적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산서열이다. 면역어드헤신 중 면역글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 임의의 면역글로불린으로부터 얻을 수 있다.

II. 본 발명의 조성물 및 방법

A.본 발명의 PRO 폴리펩티드의 제조

본 발명은 본원에서 PRO 폴리펩티드로 언급된 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 특히, 하기 실시예에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 각종 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. 별도의 발현 라운드에서 생산된 단백질의 PRO 숫자는 다를 수 있지만 UNQ 수는 임의의 주어진 DNA 및 코딩된 단백질 특유의 것이며, 변하지 않을 것이다. 그러나, 본 명세서에서는 간단하게, 본원에 기재된 전장 천연 핵산 분자에 의해 코딩된 단백질, 및 상기 정의에 포함된 추가의 천연 동족체 및 변이체 모두를 이들의 출처 및 제조 방식과 상관없이 "PRO/숫자"로 언급하거나 "PRO"라고도 언급할 것이다.

특히, 하기 실시예에 보다 상세히 기재된 바와 같이, PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272,PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 및 PRO5727 폴리펩티드 (각각 UNQ174, UNQ178, UNQ186, UNQ190, UNQ200, UNQ214, UNQ209, UNQ219, UNQ146, UNQ240, UNQ239, UNQ293, UNQ330, UNQ365, UNQ316, UNQ317, UNQ318, UNQ319, UNQ313, UNQ332, UNQ334, UNQ540, UNQ434, UNQ408, UNQ407, UNQ430, UNQ557, UNQ491, UNQ598, UNQ516, UNQ701, UNQ585, UNQ633, UNQ678, UNQ606, UNQ630, UNQ653, UNQ608, UNQ698, UNQ732, UNQ722, UNQ728, UNQ900, UNQ859, UNQ179, UNQ21, UNQ236, UNQ303, UNQ294, UNQ322, UNQ388, UNQ435, UNQ433, UNQ483, UNQ545, UNQ589, UNQ707, UNQ685, UNQ693, UNQ739, UNQ1888, UNQ1866, UNQ1947 및 UNQ2448에 상응함)를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다.

더욱 특히, 본 명세서는 천연 서열 PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343,PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 및 PRO5727 폴리펩티드 각각을 코딩하는 cDNA인 DNA29101-1276, DNA30871-1157, DNA30942-1134, DNA33087-1158, DNA33460-1166, DNA34387-1138, DNA35558-1167, DNA35638-1141, DNA35916-1161, DNA39523-1192, DNA40620-1183, DNA40982-1235, DNA44184-1319, DNA44205-1285, DNA45410-1250, DNA45416-1251, DNA45419-1252, DNA47365-1206, DNA47470-1130, DNA48314-1320, DNA49435-1219, DNA50921-1458, DNA53974-1401, DNA54228-1366, DNA54231-1366, DNA56405-1357, DNA57033-1403, DNA57690-1374, DNA59220-1514, DNA59294-1381, DNA59776-1600, DNA59849-1504, DNA60775-1532, DNA61873-1574, DNA62814-1521, DNA64885-1529, DNA65404-1551, DNA65412-1523, DNA66675-1587, DNA68864-1629, DNA68872-1620, DNA68874-1622, DNA76400-2528, DNA77624-2515, DNA30868-1156, DNA36638-1056, DNA38260-1180, DNA40592-1242, DNA41374-1312, DNA44194-1317, DNA53517-1366, DNA53971-1359, DNA53987-1438, DNA57700-1408, DNA59620-1463, DNA60627-1508, DNA64890-1612, DNA66659-1593, DNA66667-1596, DNA68818-2536, DNA84210-2576, DNA92218-2554, DNA96878-2626, DNA98853-1739를 기술한다.

하기 실시예에 기재된 바와 같이, 여러가지 cDNA 클론을 ATCC에 기탁하였다. 당업자라면 당업계의 통상적인 방법을 이용하여 기탁된 클론의 서열을 분석함으로써 상기 클론의 실제 뉴클레오티드 서열을 쉽게 결정할 수 있다. 기탁된 서열과본원에 기재된 서열 사이에 차이점이 있는 경우, 기탁물의 서열이 올바른 서열을 포함하고 있는 것으로 이해된다. 통상의 기술을 사용하여 뉴클레오티드 서열로부터 예상되는 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산의 경우, 본 발명자들은 당시 이용할 수 있었던 서열 정보를 사용하여 가장 잘 확인할 수 있는 리딩 프레임으로 여겨지는 것을 확인하였다.

B.PRO 폴리펩티드 변이체

본원에서 설명되는 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 외에도, PRO 변이체를 제조할 수 있는 것으로 생각된다. PRO 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변화를 PRO DNA에 도입하고(거나) 목적 PRO 폴리펩티드를 합성함으로써 제조될 수 있다. 당업자라면 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경 또는 막 앵커링 특성의 변화와 같은 아미노산 변화가 PRO의 번역후 프로세싱을 변경시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본원에서 설명되는 전장 천연 서열 PRO 또는 PRO의 여러 도메인에서의 변이는 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 개시된 보존적 및 비보존적 돌연변이 기술 및 지침을 사용하여 제조할 수 있다. 변이는 PRO를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있어서 천연 서열 PRO와 비교시에 PRO의 아미노산 서열을 변화시킨다. 경우에 따라, 변이는 PRO의 하나 이상의 도메인 내의 하나 이상의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환함으로써 생성된다. 목적 활성에 유해한 효과를 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기는 PRO의 서열을 공지된 동족성 단백질 분자의 서열과 비교하고 동족성이 높은 영역에서 생성된 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환 (예를 들어 류신의 세린으로의 치환), 즉 보존적 아미노산 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 경우에 따라 약 1 내지 5 개 범위의 아미노산에서 발생할 수 있다. 허용되는 변이는 서열 내에 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시켜서, 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타났던 활성의 변이 결과를 시험함으로써 정할 수 있다.

본원은 PRO 폴리펩티드 단편들을 제공한다. 예를 들어 전장 천연 단백질과 비교하는 경우, 이 단편들은 N-말단 또는 C-말단이 잘리거나 내부 잔기가 결손될 수 있다. 몇몇 단편은 본 발명의 PRO 폴리펩티드의 목적 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결손되어 있다.

PRO 단편은 많은 통상의 기술 중 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 목적 펩티드 단편은 화학적으로 합성될 수 있다. 다른 방법은 효소적 분해 방법, 예를 들어 이 단백질을 특정 아미노산 잔기로 정의된 부위에서 자르는 것으로 알려진 효소로 처리하거나 이 DNA를 적합한 제한 효소로 잘라냄으로써 PRO 단편을 생성하는 단계 및 이 목적 단편을 단리하는 단계를 포함한다. 그러나, 또다른 적합한 기술은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 목적 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 증폭하는 단계를 포함한다. DNA 단편의 목적 말단부를 정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머로 사용된다. 바람직하게는, PRO 폴리펩티드 단편은 본원에서 개시된 천연 PRO 폴리펩티드와 하나 이상의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 공유한다.

구체적인 실시양태에서, 목적물의 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 표제로 표 6에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우, 하기 표 6에서 치환예로서 명명되거나 아미노산 종류에 대해서 하기에서 보다 상세하게 설명된 바와 같이 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다.

PRO 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 백본의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 유지하거나, (b) 표적 부위에서의 분자의 하전 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 측쇄의 크기를 유지하는데 미치는 영향을 상당하게 변경시키는 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:

(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족; trp, tyr, phe.

비보존적 치환은 상기 한 종류의 구성 성분을 다른 종류의 것으로 교환시킬 것이다. 또한, 이렇게 치환되는 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나 보다 바람직하게는 나머지 (비보존) 부위에 도입될 수 있다.

변이는 올리고뉴클레오티드 매개 (위치 지정 (site-directed)) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝법 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 위치 지정 돌연변이 유발법 (Carter et al.,Nucl. Acids Res.,13:4331 (1986); Zoller et al.,Nucl. Acids Res.,10:6487 (1987)), 카세트 돌연변이 유발법 (Wells et al.,Gene,34:315 (1985)), 제한 선택 돌연변이 유발법 (Wells et al.,Philos. Trans. R. Soc. London SerA,317:415 (1986)) 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 실시하여 PRO 변이체 DNA를 제조할 수 있다.

또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 사용하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 통상적으로, 이 중에서 알라닌이 베타-탄소 밖의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 형태를 변경시킬 가능성이 적기 때문에 바람직한 스캐닝 아미노산이다 (Cunningham and Wells,Science,244: 1081-1085 (1989)). 또한, 알라닌은 통상적으로 가장 흔한 아미노산이기 때문에 바람직하다. 또한, 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서 흔히 발견된다 (Creighton,The Proteins, (W.H. Freeman ＆ Co., N.Y.); Chothia,J. Mol. Biol.,150:1 (1976)). 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체 (isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.

C.PRO의 변형

PRO 폴리펩티드의 공유결합 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 변형의 한 형태는 PRO 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N-말단 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 PRO 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제를 사용한 유도체화는 예를 들어 항-PRO 항체 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 PRO를 교차결합시키거나 그 반대로 교차결합시키는데 유용하다. 통상 사용되는 교차결합제는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드 및메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질을 포함한다.

다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노기의 메틸화 (T.E. Creighton,Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.

본 발명의 범위에 포함되는 PRO 폴리펩티드의 공유결합 변형의 다른 형태는 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. 본원의 목적상 "천연 글리코실화 패턴의 변화"는 천연 서열 PRO 폴리펩티드에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 부분의 결실 (근원적인 글리코실화 부위를 제거하거나 화학적 및(또는) 효소적 방법에 의해 글리코실화를 결실시킴으로써) 및(또는) 천연 서열 PRO에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다. 또한, 이 용어는 존재하는 여러 가지 탄수화물 부분의 특성 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어서의 질적 변화를 포함한다.

PRO 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열을 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 변화는 예를 들어 천연 서열 PRO에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가 또는 치환시켜 이루어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우). PRO 아미노산 서열은 경우에 따라, 특히 원하는 아미노산으로 번역되는 코돈이 생성되도록 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이 시킴으로써, DNA 수준에서의 변화를 통해 변화시킬 수 있다.

PRO 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 부분의 수를 증가시키는 다른 방법은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 문헌 (Aplin and Wriston,CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981))에 기재되어 있다.

PRO 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 부분의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 달성되거나 글리코실화에 대한 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 (Hakimuddin, et al.,Arch. Biochem. Biophys.,259:52 (1987) 및 Edge et al.,Anal. Biochem.,118:131 (1981))에 기재되어 있다. 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 부분의 효소에 의한 절단은 문헌 (Thotakura et al.,Meth. Enzymol.,138:350 (1987))에 기재된 바와 같이 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다.

PRO의 공유결합 변형의 다른 형태는 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 기재된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 PRO 폴리펩티드를 연결시키는 것을 포함한다.

또한, PRO 폴리펩티드는 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수도있다.

한 실시양태에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 PRO의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 PRO의 아미노-말단 또는 카르복실-말단에 위치한다. 상기 에피토프 태그가 부착된 형태의 PRO 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 형태의 친화성 매트릭스를 사용하는 친화성 정제법으로 PRO를 쉽게 정제할 수 있게 된다. 여러 가지 태그 폴리펩티드 및 이들의 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘 (폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-his-gly) 태그, flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 (Field et al.,Mol. Cell. Biol.,8:2159-2165 (1988)), c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (Evan et al.,Molecular and Cellular Biology,5:3610-3636 (1985)), 및 단순포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 (Paborsky et al.,Protein Engineering,3(6):547-553 (1990)) 등이 있다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드 (Hopp et al.,BioTechnology,6:1204-1210 (1988)), KT3 에피토프 펩티드 (Martin et al.,Science,255:192-194 (1992)), 알파-튜불린 에피토프 펩티드 (Skinner et al.,J. Biol. Chem.,266:15163-15166 (1991)) 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 (Lutz-Freyermuth et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87:6393-6397 (1990))를 포함한다.

다른 실시양태에서, 키메라 분자는 PRO 폴리펩티드와 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역과의 융합체를 포함한다. 키메라 분자의 2 가 형태 ("면역어드헤신"으로 지칭되기도 함)의 경우, 상기 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역과의 융합체일 수 있다. 이 Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자내 하나 이상의 가변성 영역의 자리에 본 발명 폴리펩티드의 가용성 (결실 또는 불활성화된 막횡단 도메인) 형태가 치환되어 있는 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 면역글로불린 융합체는 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 면역글로불린 융합체를 생산하는 방법으로는, 1995년 6월 27일 공고된 미국 특허 제5,428,130호를 참조한다.

D.PRO의 제조

하기의 설명은 주로 PRO 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 PRO를 제조하는 방법에 관한 것이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 PRO를 제조할 수도 있다. 예를 들어, PRO 서열 또는 그의 부분들은 고상 기술을 사용하는 직접 펩티드 합성법에 의해 제조될 수 있다 (문헌 (Stewart et al.,Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield,J. Am. Chem. Soc.,85:2149-2154 (1963)) 참조). 시험관내 단백질 합성은 수동 기술이나 자동화로 수행될 수 있다. 자동 합성법은 예를 들어 Applied Biosystems Peptide Synthesizer (미국 캘리포니아주 포스터시티 소재)를 제조업자의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. PRO의 여러 가지 부분들을 개별적으로 화학적 합성한 후, 화학적 또는 효소에 의한 방법으로 조합함으로써 전장 PRO를 제조할 수 있다.

1. PRO 폴리펩티드(들)를 코딩하는 DNA의 단리

PRO를 코딩하는 DNA는 PRO mRNA를 보유하여 그를 검출가능한 수준으로 발현할 것으로 생각되는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 그러므로, 하기 실시예에서 설명되는 바와 같이 인간의 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 인간 PRO DNA를 편리하게 얻을 수 있다. 또한 게놈 라이브러리나 공지된 합성 방법 (예를 들어, 자동 핵산 합성법)으로 PRO 코딩 유전자를 얻을 수도 있다.

라이브러리는 관심 유전자 또는 이 유전자가 코딩하는 단백질을 확인하기 위해 고안된 프로브 (예를 들어 PRO에 대한 항체 또는 약 20 내지 80 개 이상의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드)로 스크리닝될 수 있다. 선택된 프로브를 사용하는 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 예를 들어 문헌 (Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989))에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 수행될 수 있다. PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 단리하기 위한 또다른 방법은 PCR 방법을 사용하는 것이다 (Sambrook et al.,상기 문헌; Dieffenbach et al.,PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995)).

하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가양성 (flase positive) 결과를 최소화하기 위해서 충분한 길이를 갖고 충분히 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리에서 DNA와의 혼성화 즉시 검출될 수 있도록 표지되는것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고,³²P 표지된 ATP와 같은 방사선 표지, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중간정도의 엄격도 및 고엄격도를 비롯한 혼성화 조건은 문헌 (Sambrook et al.,상기 문헌)에서 제공된다.

상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열을 젠뱅크 (GenBank)와 같은 공공 데이타베이스 또는 다른 민간 서열 데이타베이스에 기탁되어 있고 입수가능한 다른 공지된 서열과 비교하여 정렬시킬 수 있다. 분자의 한정된 영역 내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 선행 기술 공지된 방법 및 본원에서 설명된 방법을 이용하여 결정될 수 있다.

단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 먼저 본원에 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하여 (또한, 필요하다면 전구체를 검출하기 위해 문헌 (Sambrook et al.,상기 문헌)에 기재된 통상의 프라이머 신장법을 사용) 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, cDNA로 역전사되지 않은 mRNA의 중간체를 프로세싱하여 얻을 수 있다.

2. 숙주 세포의 선택 및 형질전환

숙주 세포는 PRO 폴리펩티드의 생산을 위해 본원에 기재된 발현 벡터나 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환되고 프로모터 유도, 형질전환체 선택 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자 증폭에 적합하게끔 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양된다. 당업자라면 과도한 시행착오 없이 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건을선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실시되는 기술은 문헌 (Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al.,상기 문헌)에 기재되어 있다.

형질감염 방법 (예를 들어 CaPO₄및 일렉트로포레이션)은 당업자에게 공지되어 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 문헌 (Sambrook et al.,상기 문헌)에 기재된 바와 같이 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리법 또는 일렉트로포레이션은 통상적으로 원핵세포 또는 실질적인 세포 벽 장벽을 포함하고 있는 기타의 세포들에 대해 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 문헌 (Shaw et al.,Gene,23:315 (1983) 및 1989년 6월 29일 공개된 WO 89/05859)에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 상기 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 문헌 (Graham and van der Eb,Virology,52:456-457 (1978))의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 측면은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모로의 형질전환은 통상적으로 문헌 (Van Solingen et al.,J. Bact.,130:949 (1977) 및 Hsiao et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),76:3829 (1979))의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 세포에 DNA를 도입시키기 위한 다른 방법 (예를 들어 핵내 미세주입, 일렉트로포레이션, 온전한 세포와 세균 프로토플라스트의 융합, 또는 고분자 양이온(polycation) (예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴))을 사용할 수도 있다. 포유동물 세포를 형질전환 시키기 위한 여러 가지 기술에 대해서는 문헌 (Keown et al.,Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 및 Mansour et al.,Nature, 336:348-352 (1988))을 참조한다.

본원에서 클로닝하거나 벡터 내 DNA를 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포이다. 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 생물 (예를 들어 대장균과 같은 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae))을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 여러 가지 대장균 균주, 예를 들어 대장균 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 대장균 X1776 (ATCC 31,537), 대장균 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)는 쉽게 입수가능하다. 다른 적합한 원핵 숙주 세포는 에셔리키아 (Esherichia)와 같은 엔테로박테리아세애, 예를 들어 대장균, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움 (typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스 (marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실러스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (B.subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (B.licheniformis) (예를 들어 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710호에 기재된 비. 리체니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사 (P.aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예는 설명을 위한 것이며 이에 제한되는 것은 아니다. 균주 W3110은 재조합 DNA 산물 발효를 위한 통상적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주의 하나이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질 가수 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110을 변형시켜 숙주의 내생성 단백질을 코딩하는 유전자에서 돌연변이가 일어나도록 할 수 있으며, 이러한 숙주의 예는 완전 유전형tonA를 갖는 대장균 W3110 균주 1A2, 완전 유전형tonA ptr3을 갖는 대장균 W3110 균주 9E4, 완전 유전형tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan ^r 를 갖는 대장균 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244), 완전 유전형tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan ^r 를갖는 대장균 W3110 균주 37D6, 비-카나마이신 내성degP결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 대장균 W3110 균주 40B4, 및 1990년 8월 7일자로 공고된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 페리플라즘 프로테아제 돌연변이체를 갖는 대장균 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 중합효소 반응이 적합하다.

원핵세포에 추가로, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물도 PRO를 코딩하는 벡터를 위한 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 통상 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 미생물에는 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (Beach and Nurse,Nature, 290: 140 (1989), 1985년 5월 2일 공개된 EP 139,383), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; Fleer et al.,Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를 들어 케이. 락티스 (K.lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al.,J. Baceriol., 154(2):737-742 (1983)), 케이. 프라길리스 (K.fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K.bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (K.wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K.waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K.drosophilarum) (ATCC 36,906; Van den Berg et al.,Bio/Technology, 8:135 (1990)), 케이. 테르모톨레란스 (K.thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (K.marxianus)); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070; Sreekrishna et al.,J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa) (Case et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)); 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis) (1990년 10월 31일 공개된 EP 394,538); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공개된 WO 91/00357) 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A.nidulans) (Ballance et al,,Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn et al.,Gene, 26:205-221 (1983); Yelton et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 (1984)) 및 에이. 니게르 (A.niger) (Kelly and Hynes,EMBO J., 4: 475-479 (1985))가 포함된다. 본 발명에서는 메틸 영양 요구성 효모가 적합하고, 한세눌라 (Hansenula), 칸디다, 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아, 사카라로마이세스, 토룰롭시스 (Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 구성되는 속으로부터 선택된, 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이런 클래스의 효모를 예시하는 구체적인 종의 목록을 문헌 (C. Anthony,The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982))에서 찾을 수 있다.

글리코실화된 PRO 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 드로소필라 (Drosophila) S2 및 스포도프테라 (Spodoptera) Sf9와 같은 곤충 세포 및 식물 세포를 포함한다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 COS 세포를 포함한다. 보다 구체적인 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아의 신장 라인 (293 세포 또는 현탁 배양액 중에서 성장하도록 서브클로닝된 293 세포, Graham et al.,J. Gen Virol., 36:59 (1997)), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather,Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)), 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065) 및 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)을 포함한다. 당업자라면 적합한 숙주 세포를 용이하게 선택할 수 있다.

3. 복제가능 벡터의 선택 및 사용

PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)을 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터에 삽입할 수 있다. 여러 가지 벡터들을 쉽게 구할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지 형태일 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법으로 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 DNA를 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 하나 이상의 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 성분을 하나 이상 포함하는 적합한 벡터의 제조는 당업자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 사용한다.

PRO는 재조합 방법에 의해 직접 생산될 수 있을 뿐만 아니라 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생산될 수도 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 벡터 내로 삽입되는 PRO를 코딩하는 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더로 구성되는 군으로부터 선택되는 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 (미국 특허 제5,010,182호)) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일 공개된 EP 362,179) 또는 1990년 11월 15일 공개된 WO 90/13646에 기재된 신호 서열일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열 (예를 들어 동일하거나 관련된 종의 분비 폴리펩티드로부터의 신호 서열 및 바이러스 분비 리더)은 단백질의 분비를 지시하기 위해 사용될 수 있다.

발현 벡터와 클로닝 벡터 모두 그 벡터를 1 종 이상의 선택된 숙주 세포에서복제가능하게 하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대개의 그람-음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 여러 가지 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다.

발현 벡터와 클로닝 벡터는 통상적으로 선택 유전자 (선택가능한 마커라고도 불림)를 포함할 것이다. 통상적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하는 단백질을 코딩하거나, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질을 코딩하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩 (예를 들어 바실러스 (Bacillus)의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자)한다.

포유동물 세포에 적합한 선택가능한 마커의 예는 PRO를 코딩하는 핵산을 수용할 수 있는 세포 성분의 확인을 가능하게 하는 것, 예를 들어 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR이 이용될 경우, 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 CHO 세포주이며, 문헌 (Urlaub et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))에 기재된 바와 같이 제조되고 증식된다. 효모에서 사용되기에 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al.,Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al.,Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al.,Gene, 10:157 (1980)). trp1 유전자는 트립토판으로의 성장능이 없는 효모의돌연변이주 (예를 들어 ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선택 마커를 제공한다 (Jones,Genetics, 85: 12 (1977)).

발현 벡터와 클로닝 벡터는 RNA 합성을 지시하는, PRO를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것이 보통이다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기 위한 적합한 프로모터는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 (Chang et al.,Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al.,Nature, 281:544 (1979)), 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (Goeddel,Nucleic acid Res., 8:4057 (1980); EP 36,776), 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터 (deBoer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983))를 포함한다. 또한, 세균계에서 사용하기 위한 프로모터는 PRO를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열도 포함할 것이다.

효모 숙주에 사용하기 위한 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 (Hitzeman et al.,J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) 또는 다른 당분해 효소 (Hess et al.,J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland,Biochemistry, 17:4900 (1978)), 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.

성장 조건에 의해 조절되는 추가의 전사 잇점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 디히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 및 말토스와 갈락토스의 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기 위한 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 EP 제73,657호에 기재되어 있다.

포유동물 숙주 세포에 있는 벡터의 PRO 전사는 바이러스 (예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (1989년 7월 5일 공개된 UK 2,211,504호), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40))의 게놈, 이종 포유동물 프로모터 (예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터), 열-충격 프로모터로부터 얻어진 프로모터들이 숙주 세포계에 적합하다면, 이들 프로모터에 의해 조절된다.

고등 진핵세포에 의한 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 DNA의 시스-액팅 요소로서 보통 약 10 내지 300 bp 길이이며 프로모터에 작용하여 그 DNA의 전사를 증가시킨다. 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터의 많은 인핸서 서열이 현재 알려져 있다. 그러나, 통상적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예로는 복제 기점 뒷쪽에 있는 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 뒷쪽에 있는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 인핸서는 PRO 폴리펩티드 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터로 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터의 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.

또한, 진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열도 포함할 것이다. 이러한 서열은 공통적으로 진핵세포나 바이러스의 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3'의 비번역 영역에서 구할 수 있다. 이들 영역은 PRO를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다.

재조합 척추동물 세포 배양에서 PRO 폴리펩티드의 합성에 적용하기에 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 (Gething et al.,Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al.,Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060 및 EP 117,058)에 기재되어 있다.

4. 유전자 발현의 검출

유전자 발현은 예를 들어 통상의 서던 블럿팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블럿팅 (Thomas,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), 도트 블럿팅 (DNA 분석) 또는 본원에서 제공된 서열을 기초로 적절하게 표지된 프로브를 사용한 계내 혼성화에 의해 샘플에서 직접 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중나선, RNA 이중나선 및 DNA-RNA 혼성 이중나선 또는 DNA-단백질 이중나선를 포함하는 특정 이중나선을 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 그리고 나서, 항체를 표지한 후, 상기 이중나선이 표면에 결합하는 분석법을 수행할 수 있어서, 표면상에 이중나선이 형성되면 이중나선에 결합한 항체의 존재를 검출할 수 있다.

별법으로, 유전자 발현은 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 산물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양물 또는 체액의 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 샘플 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 어떤 포유동물에서도 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연 서열 PRO 폴리펩티드 또는 본원에서 제공되는 DNA 서열을 기초로 한 합성 펩티드 또는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 특정 항체 에피토프를 코딩하는 DNA에 융합된 외인성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.

5. 폴리펩티드의 정제

여러 형태의 PRO는 배양 배지 또는 숙주 세포 용균물로부터 회수될 수 있다. 막 결합 형태라면, 적절한 세정제 용액 (예를 들어 Triton-X 100)을 사용하거나 효소에 의한 절단으로 막으로부터 방출시킬 수 있다. PRO의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 주기, 초음파 처리, 기계적 분쇄 또는 세포 용균제와 같은 여러 가지 물리적 또는 화학적 방법으로 분쇄시킬 수 있다.

재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 PRO를 정제하고자 할 수 있다. 적합한 정제 방법의 예로는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전법, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 DEAE) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전법, 예를 들어 Sephadex G-75를 사용하는 겔 여과법, IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼, 및 PRO 폴리펩티드의 에피토프 태그가 부착된 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이트 컬럼 등이 있다. 여러 가지 단백질 정제 방법을 사용할 수 있으며, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 (Deutscher,Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes,Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982))에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어 사용되는 생산 방법 및 생산되는 특정 PRO의 특성에 따라 결정될 것이다.

E.조직 분포

PRO를 발현하는 조직의 위치는 다양한 인간 조직에서 mRNA 발현을 측정함으로써 확인될 수 있다. 이러한 유전자의 위치는 어떠한 조직이 PRO 폴리펩티드를 자극하고 억제하는 활성에 의해 가장 많이 영향을 받을 것인지에 대한 정보를 제공한다. 또한, 특정 조직에서 유전자의 위치는 하기 논의된 활성 차단 분석을 위한 샘플 조직을 제공한다.

앞서 지적한 바와 같이, 여러 조직에서의 유전자 발현은 통상의 서던 블럿팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블럿팅 (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), 도트 블럿팅 (DNA 분석), 또는 본원에 제공된 서열을 기초로 적절하게 표지된 프로브를 사용한 계내 혼성화에 의해 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중나선, RNA 이중나선 및 DNA-RNA 혼성 이중나선 또는 DNA-단백질 이중나선 등을 포함하는 특정 이중나선을 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다.

별법으로, 여러 조직에서의 유전자 발현은 조직 절편의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 산물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양물 또는 유체 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 샘플 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 어떤 포유동물에서도 제조할 수 있다. 편리하게는, PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 기초로 PRO 폴리펩티드의 천연 서열 또는 합성 펩티드에 대한 항체를 제조할 수 있고, 또는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 특정 항체 에피토프를 코딩하는 DNA에 융합된 외인성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다. 항체 제조에 관한 일반적 기술 및 노던 블럿팅 및 계내 혼성화에 관한 구체적인 프로토콜은 하기에 제공된다.

F.항체 결합 연구

추가로, PRO 폴리펩티드의 활성은 항-PRO200, 항-PRO204, 항-PRO212, 항-PRO216, 항-PRO226, 항-PRO240, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO172, 항-PRO273, 항-PRO272, 항-PRO332, 항-PRO526, 항-PRO701, 항-PRO361, 항-PRO362, 항-PRO363, 항-PRO364, 항-PRO356, 항-PRO531, 항-PRO533, 항-PRO1083, 항-PRO865, 항-PRO770, 항-PRO769, 항-PRO788, 항-PRO1114, 항-PRO1007, 항-PRO1184, 항-PRO1031, 항-PRO1346, 항-PRO1155, 항-PRO1250, 항-PRO1312, 항-PRO1192, 항-PRO1246, 항-PRO1283, 항-PRO1195, 항-PRO1343, 항-PRO1418, 항-PRO1387, 항-PRO1410, 항-PRO1917, 항-PRO1868, 항-PRO205, 항-PRO21, 항-PRO269, 항-PRO344, 항-PRO333, 항-PRO381, 항-PRO720, 항-PRO866, 항-PRO840, 항-PRO982, 항-PRO836, 항-PRO1159, 항-PRO1358, 항-PRO1325, 항-PRO1338, 항-PRO1434, 항-PRO4333, 항-PRO4302, 항-PRO4430 또는 항-PRO5727 항체가 조직 세포에 대한 PRO200, PRO204, PRO212,PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727 폴리펩티드 각각의 효과를 억제하는 능력을 시험하는 항체 결합 연구로 더욱 증명될 수 있다. 항체의 예로는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체, 및 이종접합 항체 등이 있고, 이의 제조 방법은 하기에 기술될 것이다.

항체 결합 연구는 경쟁적 결합 분석법, 직접 및 간접 샌드위치 분석법 및 면역침전 분석법 등의 공지된 분석법으로 수행될 수 있다 (문헌 (Zola,Monoclonal Antibodies: A Manual of Technique, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)).

경쟁적 결합 분석법은 제한된 양의 항체와의 결합에 대해 시험 샘플 분석물과 경쟁하는 표지된 표준 물질의 능력에 의존한다. 시험 샘플에 있는 표적 단백질의 양은 항체에 결합하게 되는 표준 물질의 양에 반비례한다. 결합하게 되는 표준 물질의 양을 용이하게 결정하기 위해서, 바람직하게는 경쟁 이전 또는 이후에 항체를 불용화시켜, 편리하게도, 항체에 결합된 표준 물질 및 분석물이 결합되지 않은 채로 있는 표준 물질 및 분석물과 분리될 수 있다.

샌드위치 분석법은 각각 검출되는 단백질의 상이한 면역원 부분, 또는 에피토프에 결합할 수 있는, 2 가지 항체의 사용을 포함한다. 샌드위치 분석법에서, 시험 샘플 분석물은 고체 지지대 상에 고정화된 제1 항체와 결합되고, 이후 제2 항체가 이 분석물에 결합하여 불용성 3부분 복합체가 형성된다. 예를 들면, 미국 특허 제4,376,110호를 참조한다. 제2 항체 그 자체를 검출가능한 잔기로 표지할 수 있거나 (직접 샌드위치 분석법), 또는 검출가능한 잔기로 표지된 항-면역글로불린 항체를 사용하여 이를 측정될 수 있다 (간접 샌드위치 분석법). 예를 들면, 샌드위치 분석의 한 가지 유형이 ELISA 분석법이고, 이 경우에 검출가능한 잔기는 효소이다.

면역 조직 화학을 위해, 조직 샘플은 신선한 것이거나 동결될 수 있고, 또는 파라핀에 묻혀 포르말린 등의 방부제로 고정시킬 수 있다.

G.세포-기재 분석

면역 관련 질환을 위해 세포-기재 분석 및 동물 모델을 사용하여 본원에서 확인된 유전자와 폴리펩티드 사이의 관계 및 면역 관련 질환의 발생 및 병원(病原) (pathogenesis)을 추가로 이해할 수 있다.

다른 접근법에서, 특정 면역 관련 질환에 관여하는 것으로 알려진 세포 유형의 세포에 본원에 기재된 cDNA를 형질감염시켜, 이 cDNA에 의한 면역 기능의 자극 또는 억제력을 분석한다. 적합한 세포에 원하는 유전자를 형질감염시키고, 면역 기능 활성을 모니터링할 수 있다. 그 다음, 이렇게 형질감염된 세포주를 사용하여 폴리- 또는 모노클로날 항체 또는 항체 조성물의, T-세포 증식 또는 염증세포 침윤 조정 등의 면역 반응 자극 또는 억제력을 시험할 수 있다. 본원에서 확인된 유전자의 코딩 서열로 형질감염시킨 세포를 사용하여 면역 관련 질환의 치료를 위한 약물 후보를 확인할 수도 있다.

또한, 안정한 세포주가 바람직하지만, 트랜스제닉 동물 (하기 기술된 바와 같음)에서 유도된 초대 배양물도 본원의 세포-기재 분석에 사용할 수 있다. 트랜스제닉 동물로부터 연속 세포주를 유도시키는 기술은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들면, 문헌 (Small et al.,Mol. Cell. Bio.,5, 642-648 (1985)) 참조).

한가지 적합한 세포 기재 분석법이 혼합림프구반응 (MLR)이다 (문헌 (Current Protocols in Immunology, unit 3.12; J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Marglies, E. M. Shevach, W. Strober, National Institutes of Health, John Wiley ＆ Sons, Inc.). 이 분석법에서는, 활성화된 T 세포의 증식에 대한 시험 화합물의 자극 또는 억제력을 분석한다. 반응자 T 세포의 현탁액을 동종(同種) 자극자 세포와 함께 배양하고, 삼중수소화 티미딘의 흡수로 T 세포의 증식을 측정한다. 이 분석법이 T 세포 반응성에 관한 일반적 측정법이다. 대부분의 T 세포가 반응하여 활성화 직후 IL-2를 생성하므로, 이 분석법에서의 반응성 차이는 부분적으로 반응 세포에 의한 IL-2 생성 차이를 반영한다. MLR 결과는 표준 림포카인 (IL-2) 검출 분석법으로 증명될 수 있다 (문헌 (Current Protocols in Immunology, 3.15, 6.3)).

MLR 분석법에서 증식 T 세포 반응은 분석된 분자의 직접적인 유사분열촉진 성질 또는 외부 항원으로 유도된 활성화에 기인할 수 있다. PRO 폴리펩티드의 T 세포 자극 활성은 공동자극 분석법에 의해 추가로 증명될 수 있다. T 세포 활성화에는 T 세포 수용체 (TCR)를 통해 매개되는 항원 특이적 신호 및 제2 리간드 결합 상호작용 예를 들면, B7(CD80, CD86)/CD28 결합 상호작용을 통해 매개되는 공동자극 신호가 필요하다. CD28 교차결합은 활성화된 T 세포에 의한 림포카인 분비를 증가시킨다. T 세포 활성화는 음성 또는 양성 효과를 갖는 리간드의 결합을 통해 음성 및 양성 조절 둘다를 받는다. CD28 및 CTLA-4는 B7에 결합하는 Ig 거대족의 관련 당단백질이다. B7에 결합하는 CD28은 T 세포 활성화에 양성 공동자극 효과를 가지며, 반대로, B7에 결합하는 CTLA-4는 음성 T 세포 불활성화 효과를 갖는다 (문헌 (Chamners, C. A. and Allison, J. P., Curr. Opin. Immunol. (1997) 9:396. Schwartz, R. H., Cell (1992) 71:1065; Linsey, P. S. 및 Ledbetter, J. A., Annu. Rev. Immunol. (1993); June, C. H. et al., Immunol. Today (1994) 15:321; Jenkins, M. K., Immunity (1994) 1:405)). 공동자극 분석법에서, PRO 폴리펩티드는를 세포 공동자극 또는 억제 활성에 대해 분석한다.

PRO 폴리펩티드 및 본 발명의 다른 화합물은 MLR 및 공동자극 분석법에 의해 결정되는 바와 같이, 아고니스트, 예를 들면 아고니스트 항체이며, T 세포 증식의 자극자 (공동자극자)이고, 열악하고 차선(次善) (suboptimal)이거나 부적합한 면역 기능을 특징으로 하는 면역 관련 질환의 치료에 유용하다. 이들 질환은 T 세포의 증식 및 활성화 (및 T 세포 매개 면역성)를 자극시키고, 자극성 PRO 폴리펩티드 등의 자극 화합물을 투여하여 포유동물에서의 면역 반응을 강화시킴으로써 치료된다. 자극성 폴리펩티드는 예를 들면, PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701,PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727 폴리펩티드, 또는 이의 아고니스트 항체일 수 있다.

본 발명에서와 같은 자극 화합물의 직접적 용도는 프라이밍된 T 세포상에 발현된 리간드 (4-1BBL)에 결합하고, T 세포의 활성화 및 성장에 신호를 전달하는, 종양괴사인자 수용체족의 한 구성원인 4-1BB 당단백질을 사용한 실험으로 확인되었다 (문헌 (Alderson, M. E. et al., J. Immunol. (1994) 24:2219)).

또한, 아고니스트 자극 화합물의 용도가 실험적으로 검증되었다. 아고니스트 항-4-1BB항체 처리에 의한 4-1BB의 활성화는 종양 근절을 강화시킨다 (문헌 (Hellstrom, I. 및 Hellstrom, K. E., Crit. Rev. Immunol. (1998) 18:1). 하기에 더욱 상세히 기술된, 종양 치료를 위한 면역아주반트 요법은 본 발명의 자극 화합물 용도의 또다른 예이다.

또한, 면역 자극 또는 강화 효과는 MLR 분석에서 억제하는 것으로 나타났던 PRO의 활성을 길항하거나 차단함으로써 달성될 수 있다. 화합물의 억제 활성을 없애는 것은 순 (net) 자극 효과를 생성시킨다. 적합한 길항제/차단 화합물은 억제 단백질을 인식하고 결합하여, 단백질과 수용체의 효과적인 상호작용을 차단하고 수용체를 통한 신호전달을 억제하는 항체 또는 그의 단편이다. 이 효과는 T 세포 증식을 강화하는 항-CTLA-4 항체를 사용한 실험으로 검증하여, CTLA-4 결합에 의해 야기된 억제 신호 제거에 의해서임을 추측했다 (문헌 (Waluna, Y. L. et al., Immunity (1994) 1:405)).

별법으로, 면역 자극 또는 증가 효과는 혈관 투과성 강화 특성을 갖는 PRO를 투여하여 달성될 수도 있다. 혈관 투과성 강화는 면역 세포 (예를 들면, 단핵세포, 호산구, PMN)의 국소 침윤 및 염증에 의해 감쇠될 수 있는 장애에 유익할 것이다.

한편, PRO 폴리펩티드, 및 본 발명의 다른 화합물은 T 세포 증식/활성화, 림포카인 분비, 및(또는) 혈관 투과성에 대한 직접적인 억제제이며, 면역 반응 저해에 직접 사용될 수 있다. 이들 화합물은 면역 반응의 정도 완화, 및 반응성항진(反應性亢進), 차선(次善) (suboptimal) 또는 자가면역 반응을 특징으로 하는 면역 관련 질환의 치료에 유용하다. 본 발명의 화합물의 이러한 용도는 수용체 B7에 결합한 CTLA-4가 T 세포를 불활성화시키는 상기 기술된 실험에 의해 검증되었다. 본 발명의 직접적인 억제 화합물은 유사한 방식으로 기능한다. 혈관 투과성을 저해하는 화합물을 사용하는 것은 염증을 감소시킬 것이라 기대될 것이다. 이러한 사용은 과다한 염증과 관련된 상태의 치료에 유익할 것이다.

다르게는, 자극 PRO 폴리펩티드에 결합하고 이들 분자의 자극 효과를 차단하는 화합물, 예를 들면 항체는 순 (net) 억제 효과를 생성하고, T 세포 증식/활성화 및(또는) 림포카인 분비를 억제함으로써 T 세포 매개성 면역 반응의 억제에 사용될수 있다. 폴리펩티드의 자극 효과 차단은 포유동물의 면역 반응을 저해한다. 이러한 용도는 항-IL2 항체를 사용한 실험에서 검증되었다. 이 실험에서, 상기 항체는 IL2에 결합하고 IL2의 수용체에 대한 IL2의 결합을 차단하여 T 세포 억제 효과가 달성되었다.

H.동물 모델

세포 기재 시험관내 분석 결과는 생체내 동물 모델 및 T 세포 기능 분석을 사용하여 추가로 증명되었다. 공지된 여러가지 동물 모델을 사용하여

면역 관련 질환의 발생 및 병원(病原)에 있어서 본원에서 확인된 유전자의 역할을 더욱 이해할 수 있고, 항체, 및 소분자 길항제 등의 천연 폴리펩티드의 다른 길항제를 포함하는 후보 치료제의 효능을 시험할 수 있다. 이러한 모델들의 생체내 성질은 인간 환자에서의 반응을 예견하게 한다. 면역 관련 질환의 동물 모델에는 비재조합 (non-recombinant) 및 재조합 (트랜스제닉) 동물 둘다가 포함된다. 비재조합 동물 모델로는 예를 들어 뮤린 모델 등의 설치류 등이 있다. 이러한 모델은 예를 들면, 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 신피막(腎被膜)하로의 이식 등의 표준 기술을 사용하여 동계(同系) 마우스로 세포를 도입함으로써 생성될 수 있다.

면역적격 세포를 면역억제 또는 내성 환자에게 이식하는 경우, 이식편대숙주질환이 발생한다. 공여 세포는 숙주 항원을 인식하고 이에 반응한다. 이 반응은 생명을 위협하는 중증의 염증에서부터 설사 및 체중 감소의 경미한 경우까지 다양할 수 있다. 이식편대숙주질환 모델은 MHC 항원 및 소수의 이식 항원에 대한 T 세포 반응성을 평가하는 수단을 제공한다. 적합한 방법은 상기 문헌 (Current Protocols, unit 4.3)에 상세히 기술되어 있다.

피부 동종이계이식 거부반응에 대한 동물 모델은 T 세포의 생체내 조직 파괴 매개력을 시험하고, 이식 거부반응에서의 역할을 측정하는 수단이다. 가장 통상적으로 수용되는 모델은 뮤린 꼬리-피부 이식을 사용한다. 반복 실험으로 피부 동종이계이식 거부반응이 T 세포, 헬퍼 T 세포 및 킬러-이펙터 T 세포에 의해 매개되는 것이며 항체에 의한 것이 아님을 알아내었다 (문헌 (Auchincloss, HH. Jr. and Sachs, D. H.,Fundamental Immunology, 2nd ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992)). 적합한 방법은 상기 문헌 (Current Protocols in Immunology, unit 4.4)에 기술되어 있다. 본 발명의 화합물을 시험하는 데 사용할 수 있는 다른 이식 거부반응 모델은 문헌 (Tanabe, M.. et al., Transplantation (1994) 58:23 및 Tinubu, S. A. et al., J. Immunol. (1994) 4330-4338)에 기술된 동종(同種) 심장 이식 모델이다.

지연형과민증 동물 모델 역시 세포 매개 면역 기능에 관한 분석법을 제공한다. 지연형과민증은 항원을 투여한 지 얼마간의 시간이 경과된 후 최고조에 이르지 못하는 염증을 특징으로 하는 T 세포 매개성 생체내 면역 반응이다. 또한, 이러한 반응은 다발성 경화증 (MS) 및 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE, MS를 위한 모델) 등의 조직 특이적 자가면역 질환에서 발생한다. 적합한 방법은 상기 문헌 (Current Protocols, unit 4.5)에 상세히 기술되어 있다.

EAE는 T 세포 및 단핵세포 염증 및 그 후의 중추신경계에서의 축삭의 탈수초화를 특징으로 하는 T 세포 매개성 자가면역 질환이다. EAE는 일반적으로 인간의 MS와 관련된 동물 모델인 것으로 고려된다 (문헌 (Bolton, C.,Multiple Sclerosis(1995)1:143)). 급성 및 재발-이장(弛張) (relapsing-remitting) 모델이 개발되었다. 본 발명의 화합물은 상기 문헌 (Current Protocols in Immunology, unit 15.1 및 15.2)에 기술된 프로토콜을 사용하여 면역매개성 탈수초화 질환에 대한 T 세포 자극 또는 억제 활성에 대해 시험될 수 있다. 또한, 희소돌기아교세포 또는 쉬반세포가 문헌 (Duncan, I. D. et al., Molec. Med. Today (1997) 554-561)에 기술된 바와 같이 중추신경계로 이식되는 수초 질환에 관한 모델을 참조한다.

접촉성과민증은 세포 매개 면역 기능의 생체내 분석에서 단순한 지연형과민증이다. 이 방법에서, 지연형과민증 반응을 일으키는 외인성 합텐에 대한 피부 노출을 측정하고 정량했다. 접촉 민감성은 처음의 감응기에 이어 유발기를 포함한다. 유발기는 T 림프구가 이들이 이전에 접촉했던 항원을 만날 때 일어난다. 팽윤(膨潤) 및 염증이 발생하여 인간 알러지성 접촉 피부염의 우수한 모델이 된다. 적합한 방법은 문헌 (Current Protocols in Immunology, J. E. Cologan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1994, unit 4.2)에 상세히 기술되어 있다. 또한, 문헌 (Grabbe, S. and Schwartz, T.,Immun. Today19(1):37-44 (1998)을 참조한다.

관절염의 동물 모델은 콜라겐-유도 관절염이다. 이 모델은 인간의 자가면역 류마티스성 관절염에 관한 임상적, 조직학적 및 면역학적 특성을 가지며, 인간의 자가면역 관절염에 관한 허용가능한 모델이다. 마우스 및 래트 모델은 활막염, 연골 및 연골하골의 침식을 특징으로 한다. 본 발명의 화합물은 상기 문헌 (Current Protocols in Immunology, unit 15.5)에 기술된 프로토콜을 사용하여 자가면역 관절염에 대한 활성을 시험할 수 있다. 또한, 문헌 (Issekutz, A. C. et al., Immunology (1996) 88:569)에 기술된 CD18 및 VLA-4 인테그린에 대한 모노클로날 항체를 사용한 모델을 참조한다.

항원 유도 기도 반응성항진(反應性亢進), 폐 호산구증다증 및 염증이 난알부민으로 동물을 감작시킨 후, 그 동물에 동일 단백질을 에어로졸로 투여하여 유도된 천식 모델이 기술되어 있다. 몇몇 동물 모델 (기니아 피그, 래트, 비인간 영장류)에서는 에어로졸 항원을 투여한 직후, 인간에서의 아토피성 천식과 유사한 증후가 나타났다. 뮤린 모델은 인간 천식의 많은 특징을 갖는다. 천식 치료에서의 활성 및 유효성에 대한 본 발명의 화합물을 시험하기에 적합한 방법은 문헌 (Wolyniec, W. W. et al., Am. J. Respir. CEll Mol. Biol. (1998) 18:777) 및 본원에 인용된 참고 문헌에 기술되어 있다.

또한, 본 발명의 화합물을 건선류 질환의 동물 모델상에서 시험할 수도 있다. 건선에 대한 T 세포 병원(病原)을 제시하는 증거가 있다. 본 발명의 화합물은 문헌 (Schon, M. P. et al., Nat. Med. (1997) 3:183)에 기재된 scid/scid 마우스 모델에서 시험될 수 있고, 여기서 마우스는 건선과 유사한 조직병리학적 피부 병변을 설명한다. 다른 적합한 모델로는 문헌 (Nickoloff, B. J. et al., Am. J. Path. (1995) 146:580)에 기재된 바와 같이 제조된 인간 피부/scid 마우스 키메라 (chimera)가 있다.

재조합 (트랜스제닉) 동물 모델은 트랜스제닉 동물 제조를 위한 표준 기술을 사용하여 본원에서 확인된 유전자의 코딩 부분을 관심 동물의 게놈에 도입시킴으로써 조작될 수 있다. 트랜스제닉 조작을 위한 표적으로 기능할 수 있는 동물로는 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 비-인간 영장류, 예를 들면 비비원숭이, 침팬지 및 원숭이 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 형질도입유전자 (transgene)를 상기 동물에 도입하기 위한 당업계의 기술로는 전핵 미세주입법 (Hoppe and Wanger, 미국 특허 제 4,873,191호), 생식 계열 (germ line)로의 레트로바이러스 (retrovirus) 매개 유전자 전달법 (예를 들면 문헌 (Van der Putten et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82: 6148-615(1985)) 참조), 배아의 간세포(幹細胞)에서의 유전자 표적법 (Thompson et al.,Cell,56: 313-32 (1989)), 배의 일렉트로포레이션법 (Lo,Mol. Cell. Biol.,3: 1803-1814 (1983)); 정자 매개 유전자 전달법 (Lavitrano et al.,Cell. 57: 717-73 (1989)) 등이 있다. 이에 관해 살펴보기 위해서는 예를 들어 미국 특허 제 4,736,866호를 참조한다.

본 발명의 목적을 위해, 트랜스제닉 동물에는 세포의 일부에만 형질도입유전자를 지니고 있는 동물 ("모자이크 동물")이 포함된다. 형질도입유전자는 단일 형질도입유전자 또는 콘카타머 (concatamer), 예를 들면, 머리-머리 또는 머리-꼬리 배열로 통합될 수 있다. 또한, 형질도입유전자의 특정 세포 유형으로의 선택적 도입은 예를 들어 문헌 (Proc. Natl. Acd. Sci. USA. 89: 6232-636 (1992))의 기술에 의해 가능하다.

트랜스제닉 동물에서의 형질도입유전자 발현은 표준 기술을 사용하여 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 서던 블럿팅 분석 또는 PCR 증폭을 사용하여 형질도입유전자의 삽입을 증명할 수 있다. 그 다음, mRNA 발현 수준을 계내 혼성화, 노던 블럿팅 분석, PCR 또는 면역세포화학과 같은 기술을 이용하여 분석할 수 있다.

동물에서는 예를 들어 조직학적 조사로 면역 질환 병리의 신호를 추가로 조사하여 특정한 조직으로의 면역 세포 침윤을 결정할 수 있다. 또한, 트랜스제닉 동물을 본 발명의 화합물로 처리하여 이 화합물의 T 세포 증식 자극 또는 억제 정도를 측정하는 차단 실험을 수행할 수도 있다. 이들 실험에서는 상기 기술된 바대로 제조된, PRO 폴리펩티드에 결합하는 차단 항체를 동물에게 투여하여 면역 기능에 대한 효과를 측정한다.

별법으로, 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와 그 동물의 배아 세포에 도입된 동일 폴리펩티드를 코딩하는 변형된 게놈 DNA 사이의 동족성 재조합의 결과로, 본원에서 확인된 폴리펩티드를 코딩하는 결함 또는 변형 유전자를 갖는 "녹아웃" 동물을 제작할 수 있다. 예를 들어, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 그 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. 특정 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실되거나, 통합을 모니터링하는데 사용될 수 있는 선택가능한 마커를 코딩하는 유전자와 같은 다른 유전자로 치환될 수 있다. 일반적으로, 수천 개 염기의 비변형된 플랭킹 DNA (5' 및 3' 말단 모두에서)가 벡터에 포함된다 (예를 들어, 동족성 재조합 벡터에 대해서는 문헌 (Thomas and Capecchi,Cell, 51:503 (1987)) 참조). 이 벡터를 배아 간세포주에 도입 (예를 들어 일렉트로포레이션에 의해)하고, 도입된 DNA와 내인성 DNA 사이에동족성 재조합이 일어난 세포를 선택한다 (예를 들어, 문헌 (Li et al.,Cell, 69:915 (1992)) 참조). 그 다음, 선택된 세포를 동물 (예를 들어 마우스 또는 래트)의 배반포에 주입하여 응집 키메라를 형성한다 (예를 들어, 문헌 (Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152) 참조). 그 다음에, 키메라 배를 적합한 가임신 대리모 동물에 이식할 수 있으며 이 배가 "녹아웃" 동물을 생성하게 된다. 생식 세포내에 동족성 재조합 DNA를 보유하는 프로제니를 표준 기술로 확인할 수 있고, 이를 사용하여 모든 세포가 동족성 재조합된 DNA인 동물을 육종할 수 있다. 녹아웃 동물은 예를 들어 특정 병리학적 증상에 대한 방어 능력 및 폴리펩티드의 부재로 인한 병리학적 상태의 발생을 특징으로 할 수 있다.

I.면역아주반트 요법

한 실시양태에서, 본 발명의 면역 자극 화합물을 종양 (암) 치료를 위한 면역아주반트 요법에 사용할 수 있다. T 세포가 인간의 종양 특이적 항원을 인식함은 잘 확립되어 있다. MAGE, BAGE 및 GAGE 유전자족에 의해 코딩된, 한 군의 종양 항원은 모든 성인 정상 조직에서는 침묵하지만, 흑색종, 폐암, 두암, 목암, 및 방광암과 같은 종양에서는 현저한 양으로 발현된다 (DeSmet, C. et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7149). 시험관내 및 생체내 모두에서 T 세포의 공동자극이 종양 퇴행 및 항종양 반응을 유도하는 것으로 나타났다 (Melero, I. et al., Nature Medicine (1997) 3:682; Kwon, e. D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:8099; Lynch, D. H. et al., Nature Medicine (1997) 3:625;Finn, O. J. and Lotze, M. T., J. Immunol. (1998) 21:114). 본 발명의 자극 화합물은 T 세포 증식/활성화 및 종양 항원에 대한 항종양 반응을 자극하기 위한 아주반트로서 단독으로, 또는 성장조절제, 세포독성제 또는 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 성장조절제, 세포독성제, 또는 화학요법제는 공지된 투여 방법을 사용하여 통상적인 양으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물에 의한 면역 자극 활성은 성장조절제, 세포독성제, 또는 화학요법제의 양을 감소시켜 환자에 대한 독성을 잠재적으로 완화시킨다.

J.약물 후보 물질의 스크리닝 분석법

약물 후보 물질의 스크리닝 분석법은 본원에서 확인된 유전자가 코딩하는 폴리펩티드 또는 그의 생물학적 활성 단편에 결합하거나 이들과 복합체를 이루는 화합물, 그렇지 않으면 이 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포내 단백질과의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하기 위해서 고안된다. 이러한 스크리닝 분석법은 화학 물질 라이브러리에 대해 고처리 스크리닝할 수 있는 분석법을 포함하며, 이는 소분자의 약물 후보를 확인하는데 특히 적합할 것이다. 고려되는 소분자에는 펩티드, 바람직하게는 가용성 펩티드, (폴리)펩티드-면역글로불린 융합체, 및 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단쇄 항체, 항-이디오타입 항체 및 키메라 항체 또는 상기 항체 또는 단편의 인간화 항체, 및 인간 항체 및 항체 단편을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 항체를 포함하는 합성 유기 또는 무기 화합물이 포함된다. 분석법은 당업계에서 잘 특성화된 단백질-단백질 결합 분석법, 생화학적 스크리닝 분석법, 면역분석법 및 세포기재 분석법 등의 다양한 포맷으로 수행할 수있다.

모든 분석법의 공통점은 상호작용하기에 충분한 조건 및 시간 동안 약물 후보 물질와 본원에서 확인된 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드의 접촉을 요구된다는 점이다.

결합 분석법에서, 상호작용은 결합하는 것이며, 형성된 복합체를 단리하거나 반응 혼합물에서 검출할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 PRO 폴리펩티드 또는 약물 후보 물질은 공유적 부착 또는 비공유적 부착에 의해 고체상, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트에 고정된다. 비공유적 부착은 일반적으로 고체 표면을 PRO 폴리펩티드 용액으로 코팅하고 건조함으로써 달성된다. 별법으로, 고정화 항체, 예를 들어 고정된 PRO 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 그를 고체 표면에 앵커링할 수 있다. 이 분석은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 비고정 성분을 고정 성분, 예를 들어 앵커링된 성분을 포함하는 코딩 표면에 첨가함으로써 수행할 수 있다. 반응이 종결되었을 때, 반응하지 않은 성분은 예를 들어 세척에 의해 제거되며, 고체 표면에 앵커링된 복합체는 검출된다. 본래 고정되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 갖고 있는 경우, 표면에 고정된 표지의 검출은 복합화 반응이 일어났음을 의미한다. 본래 고정되지 않은 성분이 표지를 갖고 있지 않는 경우에는 예를 들어 고정된 복합체와 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 복합화 반응을 검출할 수 있다.

후보 화합물이 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 특정 PRO 폴리펩티드와 상호작용하지만 결합하지 않는 경우, 후보 화합물과 이 폴리펩티드의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용 검출용으로 잘 알려진 방법으로 분석될 수 있다. 이러한 분석법에는 통상의 방법, 예를 들어 교차형성법, 공동면역침전법, 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 공동정제법이 포함된다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 (Chevray and Nathans,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793 (1991))에 기재된 바와 같이 문헌 (Fields and Song,Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991))에 기재된 효모 기재 유전자 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다. 많은 전사 활성자 (예를 들어 효모 GAL4)는 물리적으로 구별되는 2 개의 모듈형 도메인으로 이루어져 있는데, 한 도메인은 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 나머지 한 도메인은 전사-활성 도메인으로 작용한다. 상기 간행물에 기재된 효모 발현계 (통상적으로, "2-하이브리드계"라고 지칭됨)는 이러한 특성을 활용하며, 2 가지 하이브리드 단백질을 사용하는데, 이 중 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인과 융합된 것이며, 다른 하나는 후보 활성 단백질이 활성화 도메인과 융합된 것이다. GAL4-활성 프로모터의 조절하에 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 따라 좌우된다. 상호작용하는 폴리펩티드를 포함하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 색소생산성 기질을 사용하여 검출된다. 2-하이브리드 기술을 사용하여 2 종의 특이적인 단백질사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 완성형 키트 (MATCHMAKER^TM)는 클론테크 (Clontech)사에서 구입할 수 있다. 또한, 이 시스템을 확장하여 특이적 단백질 상호작용에 관여하는 단백질도메인을 매핑할 수 있을뿐 아니라, 이러한 상호작용에 결정적인 아미노산 잔기의 위치를 정확하게 나타낼 수 있다.

본원에서 확인된 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 방해하는 화합물을 찾아내기 위해서 통상적으로 유전자 산물과 세포내 또는 세포외 성분을 포함하는 반응 혼합물을 두 생성물의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건 및 시간하에 제조하여 시험할 수 있다. 시험 화합물의 결합저해력을 시험하기 위해, 시험 화합물의 존재 및 부재하에 반응을 수행한다. 추가로, 양성 대조군 역할을 하는 제3 의 반응 혼합물에 위약을 첨가할 수 있다. 혼합물에 존재하는 시험 화합물과 세포내 또는 세포외 성분사이의 결합 (복합체 형성)을 상기 기재된 바와 같이 모니터링한다. 대조 반응물(들)에서는 복합체가 형성되나 시험 화합물을 포함하는 반응 혼합물에서는 복합체가 형성되지 않는다는 것은 시험 화합물이 시험 화합물과 그의 반응 대응물의 상호작용을 방해함을 의미한다.

K.면역 관련 질환 치료용 조성물 및 치료 방법

면역 관련 질환의 치료에 유용한 조성물에는 를 들면, T 세포 증식/활성화, 림포카인 방출, 또는 면역 세포 침윤 등의 면역 기능을 억제하거나 자극하는 단백질, 항체, 유기 및 무기 소분자, 펩티드, 포스포펩티드, 안티센스 및 리보자임 분자, 삼중나선 분자 등이 있으나 이에 한정되지 않는다.

예를 들면, 안티센스 RNA 및 RNA 분자는 표적 mRNA에 혼성화하여 단백질 번역을 억제해서 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 한다. 안티센스 DNA가 사용되는 경우, 예를 들면, 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 -10과 +10 위치 사이의 번역 개시 부위로부터 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 그와 상보적인 표적 RNA와 서열-특이적 혼성화한 다음, 엔도뉴클레아제성 절단을 함으로써 작용한다. 공지된 기술로 잠재적인 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있다. 보다 자세한 사항은 문헌 (예를 들어 Rossi,Current Biology, 4:469-471 (1994) 및 PCT 공개 No. WO 97/33551 (1997년 9월 18일 공개))을 참조한다.

전사를 억제하는데 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일-가닥이어야하며, 데옥시뉴클레오티드로 구성되어 있어야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 그가 훅스틴 (Hoogsteen) 염기쌍 규칙을 통해 삼중나선 형성을 촉진하게끔 고안되어 있는데, 삼중나선의 형성은 통상적으로 이중나선 중 한 쇄에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치를 필요로 한다. 보다 자세한 사항은 문헌 (예를 들어 PCT 공개 WO 97/33551, 상기 문헌)을 참조한다.

상기 분자들은 상기 논의된 한 가지 이상의 스크리닝 분석법 및(또는) 당업자에게 잘 알려진 다른 스크리닝 기술 어느 것에 의해서도 확인될 수 있다.

L.항체

본 발명은 T 세포 증식, 호산구 침윤, 혈관 투과성 등을 억제 (길항제)하거나 자극 (아고니스트)할 수 있는 항-PRO 항체 및 이의 단편을 추가로 제공한다. 상기 항-PRO 항체 및 이의 단편에는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종접합 (heteroconjugate) 항체 등이 있다.

1. 폴리클로날 항체

항-PRO 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 예를 들어 면역화제 및 필요한 경우 아쥬반트를 포유동물에 1 회 이상 주사함으로써 생성시킬 수 있다. 통상적으로, 면역화제 및(또는) 아쥬반트를 피하 또는 복강내로 여러 번 포유동물에 주사할 것이다. 면역화제는 PRO 폴리펩티드 또는 그의 융합 단편을 포함할 수 있다. 면역처리되는 포유동물에 면역원성인 것으로 공지된 단백질에 면역화제를 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예로는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 아쥬반트의 예로는 프로인트 (Freund's) 완전 아쥬반트 및 MPL-TDM 아쥬반트 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)가 포함된다. 당업자라면 과도한 시행착오 없이 면역화 프로토콜을 선택할 수 있다.

2. 모노클로날 항체

별법으로, 항-PRO 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler and Milstein,Nature,256:495 (1975))에 기재된 바와 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 통상적으로 면역화제로 면역화시켜 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 림프구를 시험관내 면역화시킬 수 있다.

면역화제는 통상적으로 PRO 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 통상적으로, 말초 혈액 림프구 ("PBL")를 사용하거나 (인간 기원의 세포를 원할 경우), 비장 세포 또는 림프절 세포를 사용 (비인간 포유동물 공급원을 원할 경우)한다. 이어서, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 림프구와 불멸화된 세포주를 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 (Goding,Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). 불멸화된 세포주는 보통 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화된 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 1 종 이상의 물질을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들면, 모세포가 히포크잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 통상적으로 히포크잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제시킨다.

바람직한 불멸화된 세포주는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 높은 수준의 안정한 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 보다 바람직한 불멸화된 세포주는 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 만사스)으로부터 입수가능한 뮤린 골수종 세포주이다. 또한, 인간모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 세포주 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주도 기술되어 있다 (Kozbor,J. Immunol., 133: 3001 (1984); 및 Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63).

하이브리도마 세포가 배양된 배양 배지가 PRO에 대해 지시된 모노클로날 항체의 존재에 대해 분석될 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침강법으로, 또는 방사선면역분석법 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡수 분석법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석법으로 측정한다. 이러한 기술 및 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은 예를 들어 스캐차르드 (Scatchard) 분석법 (Munson and Pollard,Anal. Biochem.,107:220 (1980))으로 결정될 수 있다.

원하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 제한희석법으로 서브클로닝하고 표준 방법 (Goding,상기문헌)으로 배양할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들면, Dulbecco's Modified Eagle's Medium 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 별법으로, 하이브리도마 세포를 포유동물에서 생체내 복수 (腹水)로 배양할 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로스 (Sepharose), 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제법에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리되거나 정제될 수 있다.

또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 방법를 이용하여 (예를 들면, 뮤린 동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함) 쉽게 단리하고 서열분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리하면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 그 다음에 이것을 별도로 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성시킬 수 있다. 또한, 예를 들어 동족성 뮤린 동물 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환하거나 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al.,상기 문헌), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시켜 DNA를 변형시킬 수도 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드를 본 발명의 항체의 불변 도메인에 대해 치환시키거나, 본 발명의 항체의 한 항체-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환시켜 키메라 2 가 항체를 생성시킬 수 있다.

바람직하게는, 항체는 1 가 항체일 수 있다. 1 가 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄는 중쇄 교차결합을 방지하기 위해 일반적으로 Fc 영역 임의의 지점에서 말단이 절단된다. 별법으로, 관련 시스테인 잔기는 교차결합을 방지하기 위해서 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실된다.

또한, 시험관내 방법도 1 가 항체의 제조에 적합하다. 항체 단편, 특히 Fab 단편을 제조하기 위한 항체의 절단은 당업계에 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다.

3. 인간 항체 및 인간화 항체

본 발명의 항-PRO 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 비인간 (예를 들어, 뮤린 동물) 항체의 인간화 형태는 키메라 면역글로불린, 비인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 포함하는 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂또는 항체의 다른 항원 결합 서브서열)이다. 인간화 항체는, 수용체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종 (공여 항체)의 CDR의 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열 어느 것에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비인간 면역글로불린의 영역에 대응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 영역에 대응한다. 또한, 인간화 항체는 경우에 따라 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 (Jones et al.,Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature,332: 323-327 (1988); 및 Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)).

비인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간 기원으로부터의 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트 (import)" 잔기라고 불리며, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 (Jones et al.,Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature,332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al.,Science,239: 1534-1536 (1988))을 사용하여 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 대응하는 서열을 치환함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 실질적으로 보다 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비인간 종의 대응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯한 당업계에 공지된 여러 가지 기술을 사용하여 제조할 수도 있다 (Hoogenboom et al.,J. Mol. Biol.,227: 381 (1991); Marks et al.,J. Mol. Bio.,222: 581-597 (1991)). 또한, 코울 (Cole) 등 및 보에르너 (Boerner) 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용할 수 있다 (Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, p. 77 (1985); 및 Boerner et al.,J. Immunol.,147(1):86-95 (1991)). 유사하게, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 전체적으로 불활성화된 트랜스제닉 동물 (예를 들어 마우스)에 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입하여 인간 항체를 제조할 수 있다. 항원투여 후, 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 목록을 비롯한 모든 면이 인간에서 관찰되는 바와 매우 유사한 인간 항체 생산이 관찰된다. 상기 사항은 문헌 (예를 들어 미국 특허 제5,545,807호, 동 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 5,661,016호 및 과학 간행물 (Marks et al.,Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al.,Nature 368, 856-859 (1994), Morrison,Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger,Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar,Intern. Rev. Immunol. 1365-93 (1995)))에 기재되어 있다.

또한, 항체는 상기 기재된 바와 같은 공지된 선택법 및(또는) 돌연변이유발법을 사용하여 친화성 성숙 (affinity matured)될 수도 있다. 바람직한 친화성 성숙 항체의 친화성은 성숙 항체가 제조된 출발 항체 (통상적으로 뮤린, 인간화 또는 인간 항체)의 5 배, 더욱 바람직하게는 10 배, 훨씬 더욱 바람직하게는 20 또는 30 배이다.

4. 이중특이적 항체

이중특이적 항체는 2 개 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 이 경우에, 결합 특이성 중하나는 PRO에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 바람직하게는 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.

이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기에서, 2 개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello,Nature,305: 537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10 가지의 상이한 항체 분자 혼합물이 가능하며, 이 중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 올바른 분자의 정제는 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계로 수행된다. 유사한 방법이 문헌 (1993년 5월 13일 공개된 WO 제93/08829호, 및 Traunecker et al.,EMBO J., 10: 3655-3659 (1991))에 기재되어 있다.

원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킬 수 있다. 이 융합은 바람직하게는 적어도 힌지의 일부와, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 적어도 하나의 융합체에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체, 및 필요하다면 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주 생물에 동시형질감염시킨다. 이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은 문헌(예를 들면, Suresh et al.,Methods in Enzymmology,121: 210 (1986))을 참조한다.

WO 96/27011에 개시된 다른 방법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자사이의 인터페이스를 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 헤테로다이머의 백분율을 최대화할 수 있다. 바람직한 인터페이스는 적어도 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자 인터페이스로부터 1 개 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체한다. 큰 아미노산 측쇄를 좀더 작은 것 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 큰 측쇄(들)과 동일하거나 유사한 크기의 보충적 "공동 (cavity)"이 제2 항체 분자의 인터페이스에 생성된다. 이는 헤테로다이머의 수율을 호모다이머와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물보다 높게 증가시키는 메카니즘을 제공한다.

이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')₂이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 제조하는 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 결합을 사용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 (Brennan et al.,Science229:81 (1985))에는 무손상 항체를 단백질 가수분해로 절단하여 F(ab')₂단편을 생성하도록 하는 방법이 기재되어 있다. 이러한 단편은 디티올 착화제인 소듐 아르세니트의 존재하에 환원되어 근처 디티올을 안정화시키고 분자간의 디술피드 형성을 방지한다. 그 후에, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후에, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환시키고 동몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로 사용될 수 있다.

대장균으로부터 Fab' 단편을 직접 회수하여 화학적으로 커플링시켜 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있다. 문헌 (Shalaby et al.,J. Exp. Med.175:217-225 (1992))에는 완전한 인간화 이중특이적 항체 F(ab')₂분자가 개시되어 있다. 각각의 Fab' 단편은 대장균으로부터 별도로 분비되었으며 지시된 시험관내 화학적 커플링으로 이중특이적 항체를 형성하였다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포와 결합할 수 있을 뿐 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용균 활성을 촉발시킬 수 있었다.

또한, 재조합 세포 배양물로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 만들고 단리하는 여러 가지 기술도 개시되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 제조되었다 (Kostelny et al.,J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 2 종의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합으로 연결시켰다. 항체 호모다이머를 힌지 영역에서 환원시켜 모노머를 형성하게 한 다음, 이를 재산화시켜 항체 헤테로다이머를 형성시켰다. 또한, 이 방법은 항체 호모다이머의 제조에도 이용될 수 있다. 문헌 (Hollinger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448 (1993))에 기재된 "디아바디 (diabody)" 기술은 이중특이적 항체 단편을 만드는 별도의 메카니즘을 제공한다. 이 단편에는 너무 짧아서 동일 쇄상의 두 도메인을 짝지을 수는 없는 링커로 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)이 포함된다. 따라서, 한 단편의 V_L및 V_H도메인은 다른 단편의 상보적인 V_H및 V_L도메인과 쌍을 이루게 되어, 2 개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단쇄 Fv (sFv) 다이머를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 만드는 또다른 전략이 보고되었다 (문헌 (Gruber et al.,J. Immunol.152:5368 (1994)) 참조).

2 가 이상의 결합가를 갖는 항체가 고려 대상이다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 (Tutt et al.,J. Immunol.147:60 (1991)).

예를 들어 이중특이적 항체는 주어진 PRO 폴리펩티드상의 2 가지 상이한 에피토프와 결합할 수 있다. 별법으로, 특정 PRO 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 대한 세포내 방어 메카니즘에 초점을 맞추기 위해, 항-PRO 폴리펩티드 팔 (arm)을 백혈구상의 촉발 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2, CD3, CD28 또는 B7), 또는 IgG의 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)와 결합하는 팔에 연결시킬 수 있다. 또한, 이중특이적 항체를 사용하여 특정 PRO 폴리펩티드를 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화시킬 수 있다. 이러한 항체는 PRO-결합 팔과 세포독성제 또는 방사선핵종 킬레이트제, 예를 들어 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA와 결합하는 팔을 가지고 있다. 관심있는 또다른 이중특이적 항체는 PRO 폴리펩티드와 결합하며 추가로 조직 인자 (TF)와 결합한다.

5. 이종접합 항체

이종접합 항체는 2 개의 공유결합으로 연결된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염의 치료를 위해 (WO 제91/00360호, 동 제92/200373호, 및 EP 제03089호) 제안되었다. 이종접합 항체는 교차결합제를 사용하는 방법을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 시험관내 제조할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 사용하거나 티오에테르 결합을 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트 및 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 시약이 포함된다.

6. 이펙터 기능 조작

이펙터 기능에 대해 본 발명의 항체를 변형하는 것 (예를 들어 면역 관련 질환의 치료에 있어 항체의 효과를 증대시키기 위해)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입하여 이 영역에서 쇄간의 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이렇게 생성된 호모다이머 항체는 내부화 능력이 강화되고(거나) 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포내 세포독성 (ADCC)이 증대될 수 있다 (문헌 (Caron et al.,J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes,J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)) 참조). 또한, 문헌 (Wolff et al.Cancer Research,53: 2560-2565 (1993))에 기재된 바와 같이 헤테로이관능성 교차결합제를 사용하여 항-종양 활성이 증대된 호모다이머 항체를 제조할 수도 있다. 별법으로, 이중의 Fc 영역을 갖는 항체를 조작하여 보체 용균성 및 ADCC 능력을 증대시킬수 있다 (문헌 (Stevenson et al.,Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)) 참조).

7. 면역접합체

또한, 본 발명은 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 독소 (예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사선동위원소 (즉, 방사선접합체)와 결합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.

이러한 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제는 상기에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데크신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 쓴 멜론 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테세네스가 포함된다. 다양한 방사선핵종을 방사선접합된 항체의 제조에 이용할 수 있다. 예를 들면²¹²Bi,¹³¹I,¹³¹In,⁹⁰Y 및¹⁸⁶Re가 포함된다.

다양한 이관능성 단백질-커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 접합체를 만들 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Vitetta et al.,Science,238:1098 (1987))에 기재된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사선뉴클레오디드와 항체를 연결하는 통상적인 킬레이트제이다 (WO 94/11026 참조).

또다른 실시양태에서, 종양 예비표적화에 사용하기 위해서 항체를 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)에 접합시키고, 이 항체-수용체 접합체를 투여 대상에게 투여한 다음, 제거제를 사용하여 순환계로부터 결합되지 않은 접합체를 제거하고 세포독성제 (예를 들어, 방사선뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.

8. 면역리포좀

본원에 개시된 단백질, 항체 등을 면역리포좀으로 제제화할 수도 있다. 이 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 (Epstein et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82:3688 (1985); Hwang et al.,Proc. Natl Acad. Sci. USA,77:4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호)에 기재된 방법으로 제조된다. 순환 시간이 증대된 리포좀은 문헌 (미국 특허제5,013,556호)에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 규정된 공극 크기의 필터를 통해 리포좀을 밀어내어 원하는 직경을 갖는 리포좀을 수득한다. 문헌 (Martin et al.,J. Biol. Chem.,257:286-288 (1982))에 기재된 바와 같이 디술피드-상호교환 반응을 통해 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 접합시킬 수 있다. 경우에 따라, 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신 (Doxorubicin))를 리포좀에 포함시킨다 (문헌 (Gabizon et al.,J. National Cancer Inst.,81(19):1484 (1989)) 참조).

M.제약 조성물

면역 관련 질환의 치료를 위해 본 발명의 활성 PRO 분자 (예를 들면, PRO 폴리펩티드, 항-PRO 항체, 및(또는) 각각의 변이체) 및 상기 기재된 스크리닝 분석법으로 밝혀진 기타의 분자들을 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다.

활성 PRO 분자, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체의 치료 제제는 저장을 위해, 소정의 순도를 갖는 항체를 임의의 제약적으로 허용가능한 담체, 부형체 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980))와 혼합하여 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조하였다. 제약적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 투여된 투여량 및 농도가 환자에 무독성이어야하며, 인산, 시트르산 및 기타 유기산의 완충액과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제, 방부제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸), 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 소수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 일당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터 이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및(또는) TWEEN (상표명), PLURONICS (상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제가 포함된다.

본원에 기재된 스크리닝 분석법으로 확인된 화합물들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 유사한 방식으로 제제화될 수 있다.

리포펙션 또는 리포좀을 사용하여 항체 또는 항체 단편을 세포내에 전달할 수도 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소의 저해성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열을 기초로, 표적 단백질 서열과 결합하는 능력을 지닌 펩티드 분자를 고안할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성되고(거나) 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Marasco et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993)) 참조).

또한, 본원의 제제는 특정 증상을 치료하기 위해 필요한 1 종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 상보적인 활성을 지닌 화합물을 포함할 수도 있다. 별법으로, 또는 추가로, 이 조성물은 그의 기능을 증대시키는 작용제, 예를 들어 세포독성제, 사이토카인, 화학요법제, 또는 증식-억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 배합물에 존재하는 것이 적합하다.

활성 PRO 분자는 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에서 예를 들어 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 봉입될 수도 있다. 상기 기술은 문헌 (Remington'sPharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))에 개시되어 있다.

생체내 투여용으로 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행된다.

서방형 제제 또는 PRO 분자를 제조할 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스 (상기 매트릭스는 성형품 형태 (예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐) 임)를 포함한다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3 ,773,919호), L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT^TM(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 구성된 주입가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 등이 있다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출할 수 있지만, 특정 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 오랫 동안 체내에 남아있는 경우, 이것들은 37 ℃에서 습기에 노출된 결과로 변성 또는 응집되어 생물학적 활성이 손실되고 면역원성이 변할 수 있다. 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 전략을 고안해낼 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간의 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화를 달성할 수 있다.

N.치료 방법

본 발명의 폴리펩티드, 항체 및 다른 활성 화합물을 사용하여 염증세포의 조직으로의 침윤, T 세포 증식 자극, T 세포 증식 억제, 혈관 침윤성의 증가 또는 감소 또는 이의 억제를 특징으로 하는 질환을 포함하는 T 세포 매개성 질환 등의 다양한 면역 관련 질환 및 상태를 치료할 수 있다고 생각된다.

본 발명의 폴리펩티드, 항체 및 다른 화합물로 치료되는 상태 또는 장애의 예로는 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 유년형 만성 관절염, 골관절염,척추관절증, 전신성 경화증 (경피증), 특발성 염증성 근장애 (피부근염, 다발성 근염), 쇼그렌증후군 (Sjoegren's syndrome), 전신성 맥관염, 유육종증, 자가면역 용혈성 빈혈 (면역성 범혈구감소증, 발작성 야간혈색소뇨증), 자가면역성 혈소판감소증 (특발성 혈소판감소성자반병, 면역매개성 혈소판감소증), 갑상선염 (그레이브스병, 하시모도갑상선염, 유년형 림프종성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 진성당뇨병, 면역매개성 신장 질환 (사구체신염, 세뇨관간질성신염), 다발성 경화증, 특발성 탈수초다발성 신경염 또는 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome) 및 만성 염증성 탈수초다발성 신경염과 같은 중추 및 말초신경계의 탈수초 질환, 감염성 간염 (A,B,C,D,E형 간염바이러스 및 기타 비-간친화성 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염 및 경화성 담관염과 같은 간담즙성 질환, 염증성 장질환 (궤양성 대장염; 크론병 (Crohn's disease)), 글루텐 민감성 장질환 및 휘플병 (Whipple's disease), 수포성 피부 질환, 다형홍반 및 접촉성 피부염 등과 같은 자가면역 또는 면역매개성 피부 질환, 건선, 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증 및 두드러기와 같은 알러지성 질환, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유종 및 과민성 폐렴과 같은 폐의 면역 질환, 이식 거부 및 이식편대숙주질환 등의 이식 관련 질환 등이 있다.

전신성 홍반성 루푸스에서, 질환의 중심 매개인자는 자가 단백질/조직에 대한 자가반응성 항체의 생성 및 그 이후의 면역매개성 염증의 발생이다. 항체는 직접 또는 간접적으로 조직 손상을 매개한다. T 림프구가 조직 손상에 직접 관여하는 것으로 나타나지 않더라도, T 림프구는 자가반응성 항체 생성에 필요하다. 그러므로, 질환은 T 림프구에 의존하여 발생한다. 신장, 폐, 근골격계, 피부점막, 눈, 중추신경계, 심혈관계, 위장관, 골수 및 혈액 등의 여러 조직 및 시스템이 임상적으로 영향을 받는다.

류마티스성 관절염 (RA)은 관절 연골의 손상과 함께 여러 관절의 활막이 주로 관련된 만성 전신성 자가면역 염증 질환이다. 병원(病原)은 T 림프구 의존성이고, 류마티스성 인자, 자가 IgG 에 대한 자가항체의 생성과 관련되어 있으며, 결과적으로 면역 복합체가 형성되어 관절액 및 혈액에 높은 수준으로 존재하게 된다. 관절내에서 이러한 복합체는 림프구 및 단핵세포를 활막으로 현저하게 침윤시키고 그후 활막의 상당한 변화를 유도할 수 있다 (수많은 호중구가 첨가되면서 유사한 세포들이 침윤하면 관절 공간/용액이 변화함). 영향을 받는 조직은 주로 관절이며, 흔히 대칭적인 패턴으로 나타난다. 그러나, 관절외 질환 또한 2 가지 주요 형태로 발생한다. 한 형태는 진행성 관절 질환이 진행중인 관절외 병변 및 폐 섬유증, 맥관염 및 피부 궤양의 전형적 병변의 발생이다. 다른 한 형태는 관절 질환이 나은 이후에 때때로 RA 질환 과정의 후기, 때로는 관절 질환의 진행이 정지한 후에 발생하는 소위 펠티증후군 (Felty's syndrome)이며, 호중구감소증, 혈소판감소증 및 비종대의 존재를 포함한다. 이는 다수의 기관에서 맥관염을 수반할 수 있으며, 경색증, 피부 궤양 및 괴저(壞疽)의 형성을 동반한다. 또한, 환자들에서는 흔히, 영향을 받은 관절 바로위의 피하 조직에서 류마티스성 결절이 일어나고, 결절 후기 단계에서는 혼합 염증세포 침윤으로 둘러싸인 괴사 중심을 갖게 된다. RA에서 발생할 수 있는 다른 증상은 다음을 포함한다: 심막염, 흉막염, 관상 동맥염, 폐섬유증을 동반한 간질성 폐렴, 건성각결막염, 및 류마티스성 결절.

유년형 만성 관절염은 흔히 16 세 미만에 시작하는 만성 특발성 염증 질환이다. 이 표현형은 RA와 몇가지 유사성이 있다: 류마티스성 인자가 양성인 몇몇 환자들은 유년형 류마티스성 관절염으로서 분류된다. 이 질환은 소수관절성(小數關節性), 다관절성, 및 전신성의 3 가지 주요 범주로 더욱 분류된다. 관절염은 중증일 수 있고 보통 파괴적이며, 관절 강직 및 성장 지연을 초래한다. 다른 증상으로는 만성 전포도막염 및 전신성 유전분증을 포함할 수 있다.

척추관절증은 HLA-B27 유전자 생성물의 발현과 일부 공통적인 임상적 특징 및 공통된 관련성을 갖는 장애군이다. 이 장애는 다음을 포함한다: 강직성 척추염, 라이터 증후군 (Reiter's syndrome) (반응 관절염), 염증성 장질환과 관련된 관절염, 건선과 관련된 경화증, 유년형 척추관절증 및 비분화 척추관절증. 구별되는 특징은 척추염이 있거나 없는 천장골염, 염증성 비대칭 관절염; HLA-B27과의 관련성 (클래스 I MHC의 HLA-B 좌의 혈청학적으로 한정된 대립 형질); 안구 염증, 및 다른 류마티스성 질환과 관련된 자가항체의 부재. 질환 유도의 핵심으로 가장 많이 관련된 세포는 CD8+ T 림프구이고, 이 세포는 클래스 I MHC 분자가 제시하는 항원을 표적으로 한다. CD8+ T 세포는 클래스 I MHC 대립 형질 HLA-B27에 대해서 MHC 클래스 I 분자에 의해 발현된 외래 펩티드인 것처럼 반응할 수 있다. HLA-B27의 에피토프는 세균 또는 다른 미생물의 항원성 에피토프를 모방할 수 있어서 CD8+ T 세포 반응을 유도할 수 있음이 가설로 되어 있다.

전신성 경화증 (경피증)의 병인(病因)은 알려져있지 않다. 이 질환을 표시(hallmark)하는 것은 피부 경화이고, 이는 활성 염증 과정에 의해 유도되기 쉽다. 경피증은 국소적 또는 전신적일 수 있다; 혈관 병변은 공통적이고, 미소혈관계에서의 내피세포 손상이 전신성 경화증의 발생의 주요한 초기 사건이며, 혈관 손상은 면역매개성일 수 있다. 피부 병변에서의 단핵세포 침윤물 존재 및 많은 환자에서의 항-핵 항체의 존재로 면역학적 근거가 암시된다. ICAM-1은 흔히 피부 병변에 있는 섬유아세포의 세포 표면상에서 상승조절되며, 이것은 이들 세포와 T 세포와의 상호작용이 질환의 병원(病原)에 역할을 할 수 있음을 시사한다. 기타의 관련 기관은 다음을 포함한다: 위장관 (비정상적인 연동운동/운동성을 초래하는 섬유증 및 평활근 위축); 신장 (소궁상동맥 (小弓狀動脈) 및 소엽간동맥(小葉間動脈)에 영향을 주어 결과적으로 신장 피질 혈류를 감소시키는 동심성 내피하층의 내막 증식은 단백뇨, 질소혈증 및 고혈압을 초래함); 골격근 (위측, 간질성 섬유증, 염증); 폐 (간질성 폐렴 및 간질성 섬유증); 및 심장 (수축 밴드 괴사, 반흔형성(班痕形成)/섬유증).

피부근염, 다발성 근염 등을 포함하는 특발성 염증성 근장애는 병인(病因)이 알려져있지 않은 만성 근육 염증 장애이며, 근육 약화를 초래한다. 근육 손상/염증은 흔히 대칭적이고 진행성이다. 자가항체는 대부분의 형태와 연관이 있다. 이러한 근염(筋炎)-특이적 자가항체는 단백질 합성과 관련된 성분, 단백질 및 RNA에 대해 지정되어 이들의 기능을 억제한다.

쇼그렌증후군 (Sjoegren's syndrome)은 면역매개성 염증 및 그 후의 누선 및 타액선(唾液腺)의 기능적 파괴에 기인한다. 이 질환은 염증성 결합 조직 질환과관련되거나 그것에 수반된다. 이 질환은 Ro 및 La 항원 (이 둘 모두가 작은 RNA-단백질 복합체임)에 대한 자가항체 생성과 관련되어 있다. 병변은 담도성경변증, 말초 또는 감각 신경병증, 및 촉지성자반병 등의 다른 증상 또는 관련성을 갖는, 건성각결막염, 구강건조증(口腔乾燥症)을 초래한다.

전신성 맥관염은 1 차 병변이 염증이고 그 후에 혈관을 손상시켜 이런 영향을 받은 혈관에 의해 공급되는 조직에 허혈/괴사/퇴행을 초래하고, 몇몇 경우에서는 사실상의 말단 기관 기능부전을 초래하는 질환이다. 또한, 맥관염은 류마티스성 관절염, 전신 경화증 등의 다른 면역 염증 매개 질환, 특히 면역 복합체 형성과도 관련된 질환의 2 차 병변 또는 후유증으로서 발생할 수도 있다. 1 차 전신성 맥관염 군에 속하는 질환은 다음을 포함한다: 전신성 괴사 맥관염: 결절성 다발 동맥염, 알러지성 맥관염 및 육아종증, 다발성 맥관염; 베게너육아종증; 림프종양 육아종증; 및 거대세포 동맥염. 기타 맥관염은 다음을 포함한다: 피부점막 림프절 증후군 (MLNS 또는 가와사키병 (Kawasaki's disease)), 단리된 CNS 맥관염, 베헤트병 (Behet's disease), 폐색성 혈전맥관염 (뷰르거병) 및 피부 괴사성 정맥염. 열거된 맥관염 유형 중 대부분의 병원성(病原性) 메카니즘은 주로 혈관벽에서의 면역글로불린 복합체의 침착 및 그 후에 ADCC, 보체 활성화, 또는 둘다를 통한 염증 반응의 유도에 기인하는 것으로 여겨진다.

유육종증은 체내 거의 모든 조직에서의 상피양 육아종증의 존재를 특징으로 하는, 병인(病因)이 알려져있지 않은 상태이다. 폐가 관련된다는 점이 가장 공통적이다. 병원(病原)은 질환 부위에서 활성화된 대식세포 및 림프양세포 존속을 수반하며, 이들 세포 형태에 의해 방출된 국소적 및 전신적 활성 생성물의 방출로부터 야기되는 후행하는 만성 후유증을 갖는다.

자가면역 용혈성 빈혈, 면역성 범혈구감소증, 및 발작성 야간혈색소뇨증을 포함하는 자가면역 용혈성 빈혈은 적혈구 (및 일부 경우에는 혈소판 등의 다른 혈액 세포) 표면에 발현된 항원과 반응하는 항체가 생성되어 야기된 결과이고, 보체 매개 용균작용 및(또는) ADCC/Fc 수용체 매개 메카니즘을 통해 이러한 항체로 코팅된 세포를 제거한 결과이다.

임상 상태가 다른 면역매개성 혈소판감소증 및 혈소판감소성자반병을 포함하는 자가면역성 혈소판감소증에서, 혈소판 파괴/제거는 혈소판에 대한 항체 또는 보체 부착 및 그후의 보체 용균작용, ADCC 또는 Fc 수용체 매개 메카니즘에 의한 제거의 결과로서 발생한다.

그레이브스병, 하시모도갑상선염, 유년형 림프종성 갑상선염, 및 위축성 갑성선염을 포함하는 갑상선염은 갑상선에 존재하고 흔히 갑상선에 특이적인 단백질과 반응하는 항체의 생성으로 갑상선 항원에 대한 자가면역 반응의 결과이다. 실험 모델은 다음과 같은 모델들을 포함한다: 자연적 모델-래트 (BUF 및 BB 래트) 및 닭 (비만 닭 종류 (strain)); 유도가능한 모델-티로글로불린, 갑상선 미소체 항원 (갑상선 퍼옥시다제)을 사용한 동물의 면역화.

제1 형 진성당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병은 췌장도(膵臟島) β세포의 자가면역 파괴인데, 이러한 파괴는 자가항체 및 자가반응성 T 세포에 의해 매개된다. 또한, 인슐린 또는 인슐린 수용체에 대한 항체는 인슐린 비반응성의 표현형을생산할 수 있다.

사구체신염 및 세뇨관간질성신염을 포함하는 면역매개성 신장 질환은 직접적으로 신장 항원에 대한 자가반응성 항체 또는 T 세포의 생성 결과이거나, 간접적으로 신장에서 다른, 비신장 항원에 반응성인 항체 및(또는) 면역 복합체 침착의 결과로서, 신장 조직에 대한 항체 또는 T 림프구 매개 손상의 결과이다. 그러므로, 면역 복합체의 형성을 초래하는 다른 면역매개성 질환은 간접적인 후유증으로 면역매개성 신장 질환을 유도할 수도 있다. 직접 및 간접 면역 메카니즘 모두가 신장 조직에서 병변 발생을 생성/유도하는 염증성 반응을 초래하여 기관 기능 손상 및 일부 경우에는 신부전(腎不全)으로의 진행을 초래하게 된다. 체액성 및 세포성 면역 메카니즘 모두가 병변의 병원(病原)에 관련될 수 있다.

다발성 경화증, 특발성 탈수초다발성 신경염 또는 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome), 및 만성 염증성 탈수초다발성 신경염을 포함하는 중추 및 말초신경계의 탈수초 질환은 자가면역성이며, 희소돌기아교세포 또는 마이엘린에 직접 발생되는 손상의 결과로서 신경의 탈수초를 초래한다고 여겨진다. 다발성 경화증에서, 질환 유도 및 진행은 T 림프구에 의존적임을 제안하는 증거가 있다. 다발성 경화증은 T 림프구 의존성이고 재발-이장(弛張) 과정 (relapsing-remitting course) 또는 만성 진행성 과정을 갖는 탈수초 질환이다. 병인(病因)은 알려져 있지 않지만, 바이러스 감염, 유전적 소인, 환경 및 자가면역성 모두가 관여한다. 병변은 주로 T 림프구 매개성, 소교세포(小膠細胞) 및 침윤성 대식세포의 침윤물을 포함하고, CD4+T 림프구는 병변에서의 주된 세포 유형이다. 희소돌기아교세포의사망 및 그 이후의 탈수초 메카니즘은 알려져있지 않지만, T 림프구에 의한 것으로 보인다.

호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유종, 및 과민성 폐렴을 포함하는 염증성 및 섬유성 폐 질환은 조절장애성 면역 염증 반응을 포함할 수 있다. 이러한 반응의 억제는 치료적으로 유익할 것이다.

수포성 피부 질환, 다형홍반 및 접촉성 피부염을 포함하는 자가면역 또는 면역매개성 피부 질환은 자가항체에 의해 매개되고, 이의 병원(病原)은 T 림프구 의존성이다.

건선은 T 림프구 매개성 염증 질환이다. 병변은 T 림프구, 대식세포 및 항원 프로세싱 세포, 및 몇몇 호중구의 침윤물을 포함한다.

천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증, 및 두드러기를 포함하는 알러지성 질환은 T 림프구 의존성이다. 이들 질환은 주로 T 림프구 유도성 염증, IgE 매개성 염증 또는 이 둘 모두의 조합에 의해 매개된다.

이식 거부 및 이식편대숙주질환 (GVHD)을 포함하는 이식 관련 질환은 T 림프구 의존성이고, T 림프구 기능을 억제하여 개선되었다.

면역 및(또는) 염증 반응의 개입이 유익한 다른 질환으로는 바이러스 감염 (AIDS, A,B,C,D,E형 간염 및 헤르페스 (herpes)를 포함하나 이것으로 한정되는 것은 아님), 세균 감염, 진균성 감염, 및 원생동물 감염 및 기생충 감염 (MLR을 자극하는 분자 (또는 유도체/아고니스트)는 감염제에 대한 면역 반응을 강화시키기 위해 치료적으로 이용될 수 있음), 면역 결핍 질환 (MLR을 자극하는 분자/유도체/아고니스트는 유전적, 후천적, (HIV 감염에서와 같은) 감염 유도적 상태, 또는 의원성(醫原性) (즉, 화학요법 등으로 인한) 상태에 대한 면역 반응을 강화시키기 위해 치료적으로 이용될 수 있음), 및 신생물 (neoplasia) 등을 포함하지만 이것으로 한정되지 않는 감염증이다.

몇몇 인간 암환자에서는 신생물 세포 (neoplastic cell)상에 있는 항원에 대한 항체 및(또는) T 림프구가 발생됨이 증명되었다. 또한, 면역 반응의 증가로 특정 신생물이 거부 또는 퇴행될 수 있음이 신생물 동물 모델에서 나타났다. MLR에서의 T 림프구 증식 반응을 강화시키는 분자 (또는 아고니스트 형태로 동일한 수용체에 영향을 주는 소분자 아고니스트 또는 항체)를 치료적으로 사용하여 암을 치료할 수 있다. 또한, MLR에서 림프구 반응을 억제하는 분자는 신생물 기간 동안 생체내에서 기능하여 신생물에 대한 면역 반응을 저해하는데, 이러한 분자가 신생물 세포 그 자체에 의해 발현될 수 있거나 이들의 발현이 다른 세포에 있는 신생물에 의해 유도될 수 있다. 이러한 억제 분자 (항체, 소분자 길항제 또는 다른 수단)의 길항작용은 면역매개성 종양 거부를 강화시킨다.

또한, 염증전 특성을 갖는 분자의 억제는 재관류 손상, 졸중, 심근 경색, 아테롬성 동맥경화증, 급성 폐 손상, 출혈성 쇼크, 화상, 패혈증/패혈성 쇼크, 급성 관상 괴사, 자궁내막증, 퇴행성 관절 질환 및 췌장염에서 치료적으로 유익할 수 있다.

본 발명의 화합물, 예를 들면, 폴리펩티드 또는 항체는 농축괴로서 또는 일정한 기간 동안의 연속 주입 (continuous infusion)에 의한 정맥내 투여 등의 공지된 방법에 따라, 근육내, 복강내, 뇌척수내 (intracerobrospinal), 피하, 동맥내, 활액낭내, 초내 (intrathecal), 경구, 국소, 또는 흡입 (비내, 폐내) 경로에 의해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 폴리펩티드 및 항체의 정맥내 또는 흡입 투여가 바람직하다.

면역아주반트 요법에서, 항암제 투여 등의 다른 치료 섭생(攝生)이 본 발명의 단백질, 항체 또는 화합물과 병행될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 면역아주반트로 치료되는 환자는 항암제 (화학요법제) 또는 방사선 요법도 받을 수 있다. 이러한 화학요법제를 위한 제제 및 투약 스케쥴은 제조업자의 지시에 따라 또는 당업자가 실험적으로 결정하여 사용할 수 있다. 이러한 화학 요법을 위한 제제 및 투약 스케쥴은 문헌 (Chemotherapy Service, M. C. Perry 편집, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD (1992))에도 기술되어 있다. 화학요법제는 면역아주반트 투여 이전 또는 이후에 투여되거나 이와 동시에 투여될 수 있다. 또한, 타목시펜 등의 항에스트로겐 화합물 또는 오나프리스톤 (EP 616812 참조) 등의 항프로게스테론은 공지된 투여량으로 제공될 수 있다.

또한, CD20, CD11a CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, 또는 혈관 내피 인자 (VEGF)에 결합하는 항체 등의, 기타 면역 질환 관련 또는 종양 관련 항원에 대한 항체를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 다르게는, 또는 또한, 본원에 개시된 동일하거나 2 개 이상의 상이한 항원에 결합하는 2 개 이상의 항체를 환자에게 동시투여 (coadministrate)할 수 있다. 또한, 때로는 환자에게 1 개 이상의 사이토카인을 투여하는 것이 유익할 수 있다. 한 실시양태에서는, PRO 폴리펩티드와 성장억제제를 동시투여한다. 예를 들면, 성장억제제를 먼저 투여한 후, PRO 폴리펩티드를 투여할 수 있다. 그러나, 동시에 투여하거나 먼저 투여하는 것 또한 고려된다. 성장억제제에 적합한 투여량은 현재 사용되는 양이며, 성장억제제 및 PRO 폴리펩티드의 병행 작용 (상승 작용)에 의해 낮춰질 수 있다.

면역 관련 질환의 치료 또는 중증도를 완화시키기 위해, 본 발명의 화합물의 적합한 투여량은 상기 정의된 바와 같이, 치료할 질환의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 상기 작용제가 예방 목적으로 투여되는지 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 요법, 환자의 임상 경력 및 상기 화합물에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 상기 화합물은 한 번에 또는 일련의 처치를 통해 환자에게 적합하게 투여된다.

예를 들면, 질환의 유형 및 중증도에 따라, 폴리펩티드 또는 항체 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들면, 0.1 - 20 mg/kg)이 예를 들면, 1 회 이상의 별도의 투여에 의해, 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1 일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 상태에 따라 수일 이상에 걸친 반복 투여기간동안, 질환의 증세가 원하는 정도로 저해될 때까지 처치를 지속한다. 그러나, 다른 투여 섭생이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행상태는 통상적인 기술 및 분석법으로 쉽게 모니터링된다.

O.제조 용품

본 발명의 또다른 실시양태에서, 상기 기술된 장애의 진단 또는 치료에 유용한 물질 (예를 들면, PRO 분자)을 포함하는 제조 용품이 제공된다. 제조 용품은 용기 및 지침서를 포함한다. 적합한 용기로는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 및 시험관 등이 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 용기는 상태의 진단 또는 치료에 효과적인 조성물을 보유하고 멸균 액세스 포트 (access port)를 가질 수 있다 (예를 들면 용기는 정맥내 용액 주머니 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 뚜껑이 있는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 활성 제제는 통상적으로 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체이다. 지침서 또는 라벨이 있거나 이와 관련된 용기는 이 조성물이 선택된 상태의 진단 또는 치료에 사용됨을 지시한다. 제조 용품은 인산염완충염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액 등의 제약상 허용가능한 완충제를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지침서가 있는 포장 삽입물을 포함하는, 상업적으로 및 사용자 입장에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

P.면역 관련 질환의 진단 및 예후

특정 면역 관련 질환에서 과다발현된 단백질 등의 세포 표면 단백질은 약물 후보 또는 질환 치료를 위한 훌륭한 표적이다. 면역 관련 질환 상태에서 증폭된 유전자가 코딩하는 분비 단백질과 함께 상기 단백질은 이들 질환의 진단 및 예후에 추가의 용도가 있다. 예를 들면, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 또는 다른 면역 관련 질환에서 증폭된 유전자의 단백질 생성물에 대한 항체를 사용하여 진단 또는 예후를 위해 사용할 수 있다.

예를 들면, 항체 단편을 포함하는 항체를 사용하여 증폭되거나 과다발현된유전자 ("마커 유전자 생성물")가 코딩하는 단백질의 발현을 정성적 또는 정량적으로 검출할 수 있다. 항체에는 예를 들어 형광 표지 등의 검출가능한 표지를 장착하는 것이 바람직하고, 광학 현미경법, 유동세포측정법, 형광측정법, 또는 당업계에 공지된 기타의 기술로 결합을 모니터링 할 수 있다. 이들 기술은 과다발현된 유전자가 세포 표면 단백질을 코딩하는 경우 특히 적합하다. 이러한 결합 분석은 본질적으로 상기 기술된 바대로 수행된다.

마커 유전자 생성물에 대한 항체의 계내 검출을 예를 들면, 면역형광법 또는 면역전자현미경법으로 수행할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 환자로부터 조직학적 표본을 취해, 표지된 항체를 바람직하게는 생물학적 샘플 상에 그 항체를 올려놓아 적용시킨다. 또한, 이 방법으로 조사되는 조직에서의 마커 유전자 생성물의 분포를 결정할 수 있다. 당업자에게는 광범위한 조직학적 방법이 계내 검출에 쉽게 이용가능함이 명백할 것이다.

하기 실시예는 오직 설명을 위한 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로도 제한하고자 함이 아니다.

본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고 문헌은 언급됨으로써 그 전체가 본원에 도입된다.

실시예에서 언급한 시판 시약들은 달리 지시하지 않는 한 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 명세서 전반에서 ATCC 기탁번호로 확인되는 세포들의 입수원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, 버지니아주 마나사스)이다. 별도의 언급이 없는 경우, 본 발명은 상기 기재한 문헌 및 하기 교과서 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, inc., N.Y., 1990; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, M.J., 올리고뉴클레오티드 Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R.I. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991) 등에 기술된 것과 같은 재조합 DNA 기술의 표준 방법을 사용하였다.

실시예 1

인간 PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 및 PRO5727 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

여러가지 기술들을 사용하여 하기에 기재된 cDNA 클론을 단리하였다. 사용한 방법에 관한 일반적인 사항들은 바로 그 다음에 기술하였지만, 단리된 특정 서열에 관한 상세한 것은 각각의 천연 서열에 대해 따로 언급했다. PRO 폴리펩티드의 실제 서열은 ATCC - 로 기탁된 클론에 포함되는 것이거나 그 클론에 의해 코딩되며 기탁된 서열과 본원에 기재된 서열 사이에 차이점이 있는 경우, 기탁물의 서열이 진짜 서열이라고 이해된다.

ECD 동족성:

스위스-프롯 (Swiss-Prot) 공공 데이타베이스로부터 약 950 개의 공지된 분비 단백질로부터의 세포외 도메인 (ECD) 서열 (분비 신호 서열이 존재하는 경우에는 이를 포함함)을 사용하여 EST 데이타베이스를 검색했다. EST 데이타베이스는 공공 EST 데이타베이스 (예를 들면, 젠뱅크 (Genbank)), 민간 EST 데이타베이스 (예를 들면, LIFESEQ (등록상표), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬), 및 제넨테크 소유의 EST를 포함했다. EST 서열의 6 개 프레임 번역에 대한 ECD 단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST-2 (Altschul et al.,Methods in Enzymology266: 460-480 (1996))를 이용하여 검색을 수행했다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 또는 그 이상의 BLAST 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (필 그린 (Phil Green), 미국 워싱턴주 시애틀 소재의 워싱턴 대학)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 조립했다.

공공 데이타베이스와 민간 데이타베이스 모두로부터의 여러가지 EST를 사용하여, 컨센서스 DNA 서열을 조립했다. 그 다음, 올리고뉴클레오티드를 합성하여,관심 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고, 본원에서 확인된 특정 천연 서열 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하였다.

전장 천연 서열 클론의 공급원을 위한 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 하기 확인된 PCR 프라이머 쌍을 사용한 PCR 증폭으로 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나로 특정 천연 서열 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 클론을 단리했다.

cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 태아의 폐, 태아의 간, 태아의 뇌, 소장, 평활근 세포 등의 여러가지 인간 조직 라이브러리로부터 단리했다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용되는 cDNA 라이브러리는 인비트로젠 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)으로부터의 시약들과 같은 시판 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작했다. cDNA를 NotI 부위를 갖는 올리고 dT로 프라이밍시키고, SalI 헤미키나제 처리된 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기에 따라 적절하게 분류하고, 적당한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조)내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 정해진 방향으로 클로닝했다. 상기 클론들을 공지되고 쉽게 이용가능한 방법으로 서열분석했다.

아밀라제 효모 스크리닝:

1.올리고 dT 프라이밍된 cDNA 라이브러리의 제조

인비트로젠 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)의 시약 및 프로토콜 (Fast Track 2)을 사용하여 여러가지 조직 (예를 들면, ECD 동족성 방법에 관해 상기 나타낸 조직)으로부터 mRNA를 단리했다. 미국 메릴랜드주 게터스버그 소재의 Life Technologies사의 시약 및 프로토콜 (Super Script 플라스미드 System)을 이용하여, 상기 RNA를 사용하여 벡터 pRK5D에 올리고 dT 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 이 과정에서, 이중 가닥 cDNA의 크기를 1000 bp보다 크게 만들고, SalI/NotI 링커 부착 cDNA를 XhoI/NotI 절단 벡터에 클로닝했다. pRK5D는 sp6 전사 개시 부위, SfiI 제한 효소 부위, XhoI/NotI cDNA 클로닝 부위를 순서대로 포함하는 클로닝 벡터이다.

2.랜덤 프라이밍된 cDNA 라이브러리의 제조

1 차 cDNA 클론의 5' 말단을 우선적으로 제공하기 위해 2 차 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 1 차 라이브러리 (상기한 바와 같음)로부터 sp6 RNA를 생성시키고, Life Technologies사의 시약 및 프로토콜 (Super Script 플라스미드 System, 상기한 바와 같음)을 이용하여 상기 RNA를 사용하여 벡터 pSST-AMY.0에 랜덤 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 이 과정에서, 이중가닥 cDNA를 500 내지 1000 bp의 크기로 만들고, NotI 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, SfiI로 절단하여 SfiI/NotI 절단 벡터에 클로닝했다. pSST-AMY.0은 cDNA 클로닝 부위 및 마우스 아밀라제 서열 (분비 신호 없는 성숙 서열) 앞에 효모 알콜 디히드로게나제 프로모터를 갖고 클로닝 부위 뒤에 효모 알콜 디히드로게나제 터미네이터를 갖는 클로닝 벡터이다. 따라서, 프레임 내에 아밀라제 서열과 융합된, 상기 벡터 내에 클로닝된 cDNA는 적절하게 형질감염된 효모 콜로니로부터 아밀라제를 분비할 것이다.

3.형질전환 및 검출

상기 단락 2에 기재된 라이브러리로부터의 DNA를 빙냉시키고 전기수용성 (electorcompetent) DH10B 세균 (Life Technologies) 20 ml을 첨가했다. 세균 및 벡터 혼합물을 제조업자의 지시대로 일렉트로포레이션시켰다. 그 후, SOC 배지 (Life Technologies) 1 ml을 첨가하고 혼합물을 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션했다. 그 후에, 형질전환체를 앰피실린을 포함하는 표준 150 mm LB 플레이트 20 개에 플레이팅하고 16 시간 동안 (37℃)에서 인큐베이션했다. 양성 콜로니를 플레이트로부터 떼어 내어 표준 프로토콜, 예를 들어 CsCL-구배법을 사용하여 DNA를 세균 펠렛으로부터 단리했다. 정제된 DNA를 사용하여 다음과 같은 효모 프로토콜을 수행했다.

효모 방법은 다음 세 개의 카테고리로 분류되었다: 1) 플라스미드/cDNA 조합 벡터를 사용하여 효모를 형질전환시키는 단계, 2) 아밀라제를 분비하는 효모 클론을 검출하고 단리하는 단계, 및 3) 효모 콜로니로부터 삽입체를 직접 PCR 증폭시키고 서열분석 및 추가의 분석을 위해 DNA를 정제하는 단계.

사용된 효모 균주는 HD56-5A (ATCC-90785)였다. 이 균주는 MAT 알파, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL⁺, SUC⁺, GAL⁺의 유전형을 갖는다. 바람직하게는, 번역 후 경로가 없는 효모 변이체를 사용할 수 있다. 이러한 변이체는 sec71, sec72, sec62, 바람직하게는 말단이 잘린 sec71에서 전좌 (translocation)로 인한 결핍 대립유전자를 가질 수 있다. 별법으로, 상기 유전자의 정상적인 작동을 방해하거나 상기 번역 후 경로에 관련된 다른 단백질 (예를 들어 SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p 또는 SSA1p-4p) 또는 이들 단백질의 복합체 형성을 방해하는 길항제 (안티센스 뉴클레오티드 및(또는) 리간드 포함)를 아밀라제 발현 효모와 함께 사용하는 것도 바람직할 수 있다.

형질전환은 문헌 (Gietz et al.,Nucl. Acid. Res., 20:1425 (1992))에 개관된 프로토콜에 기초하여 수행했다. 그 후, 형질전환된 세포를 아가로부터 YEPD 복합 배지 브로쓰 100 ml에 접종하고 30 ℃에서 밤새 성장시켰다. YEPD 브로쓰를 문헌 (Kaiser et al.,Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994))에 기재된 바와 같이 제조했다. 철야 배양물을 신선한 YEPD 브로쓰 500 ml로 약 2 x 10⁶세포/ml (약 OD₆₀₀= 0.1)가 되도록 희석하고 약 1 x 10⁷세포/ml (약 OD₆₀₀= 0.4 - 0.5)가 되도록 재성장시켰다.

세포를 회수한 다음, Sorval GS3 로터의 GS3 로터 바틀로 옮겨서 5,000 rpm에서 5 물분 동안 원심분리하고, 상층물을 버리고, 멸균수로 재현탁시켜 Beckman GS-6KR 원심분리기에서 3,500 rpm으로 50 ml 팔콘 튜브에서 다시 원심분리함으로써 형질전환을 준비했다. 상층물을 버리고, 세포를 LiAc/TE (10 ml, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7.5, 100 mM Li₂OOCCH₃)로 세척하고 LiAc/TE (2.5 ml)에 재현탁했다.

마이크로 원심분리 튜브에서, 준비한 세포 100 ㎕를 신선한 변성 단일 가닥 연어 고환 DNA (미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재 Lofstrand Lab) 및 형질전환 DNA 1 ㎍ (부피 < 10 ㎕)와 혼합하여 형질전환을 수행했다. 혼합물을 볼텍싱에 의해 잠깐 혼합한 후, 40 ％ PEG/TE 600 ㎕ (40 ％ 폴리에틸렌 글리콜-4000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li₂Ac, pH 7.5)를 첨가했다. 상기 혼합물을 완만하게 혼합하고 30 분 동안 교반하면서 30 ℃에서 인큐베이션했다. 그 다음에 세포를 42 ℃에서 15 분 동안 열 쇼크를 가하고, 반응 용기를 마이크로원심분리기에서 12,000 rpm으로 5 내지 10 초 동안 원심분리하여 상층물을 따라내 버리고, TE 500 ㎕ (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)에 재현탁시킨 후 재원심분리했다. 세포를 TE 1 ml로 희석하고 분액 200 ㎕를 150 mm 성장 플레이트 (VWR)에서 미리 제조한 선택 배지 상에 도말했다.

별법으로는 작은 다수 회의 반응 대신, 시약량을 증가시키면서 1 회의 대규모 반응으로 형질전환을 수행했다.

사용된 선택 배지는 문헌 (Kaiser et al.,Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994))에 기재된 바와 같이 제조된 우라실이 없는 합성 완전 덱스트로스 아가 (SCD-Ura)였다. 형질전환체를 30 ℃에서 2 내지 3 일 동안 성장시켰다.

아밀라제를 분비하는 콜로니의 검출은 선택 성장 배지 중에 적색 전분을 포함시켜 수행했다. 문헌 (Biely et al.,Anal. Biochem.,172:176-179 (1988))에기재된 바와 같은 방법에 따라 전분을 적색 염료 (반응성 Red-120, Sigma)와 커플링시켰다. 커플링된 전분을 최종 농도 0.15 ％ (w/v)로 SCD-Ura 아가 플레이트에 첨가하고, 인산칼륨을 써서 pH 7.0으로 완충시켰다 (최종 농도 50 내지 100 mM).

양성 콜로니를 선택하여 신선한 선택 배지 (150 mm 플레이트 상)에 스트리킹하여 잘 단리되며 확인가능한 단일 콜로리를 수득했다. 적색 전분을 완충된 SCD-Ura 아가에 직접 첨가하여 아밀라제 분비 양성인 잘 단리된 단일 콜로니를 검출했다. 양성 콜로니는 전분 분해력 (그 콜로니 주위에 직접 육안으로 확인할 수 있는 투명 원광 (halo)이 생성됨)으로 결정되었다.

표준 기술에 의한 단리 및 서열분석으로 하기 기재된 바와 같은 추가의 데이타베이스를 위한 기반으로 사용될 효모 EST 단편을 확인하였다.

4.조립

상기 확인된 효모 EST 단편을 사용하여 여러가지 발현 서열 태그 (EST) 데이타베이스를 검색하였다. EST 데이타베이스는 공공 데이타베이스 (예를 들면, 젠뱅크, 머크/와쉬 유 (Merck/Wash U))와 민간 데이타베이스 (LIFESEQ (등록상표), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬)를 포함했다. EST 서열의 6 개 프레임 번역에 대한 ECD 단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST-2 (Altschul et al.,Methods in Enzymology266: 460-480 (1996))를 이용하여 검색을 수행했다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 또는 그 이상의 BLAST 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (필그린, 미국 워싱턴주 시애틀 소재의 워싱턴 대학)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 조립했다.

컨센서스 DNA 서열을 phrap을 사용하여 다른 EST 서열에 대해 조립했다. 컨센서스 DNA 서열을 상기 논의한 EST 서열의 공급원 및 제넨테크 소유의 EST 서열을 사용하여 가능한 한 컨센서스 서열을 신장시키기 위해 BLAST와 phrap의 반복 사이클을 이용하여 이 컨센서스 서열을 신장시켰다.

상기 컨센서스 서열을 기준으로 올리고뉴클레오티드를 합성하여, 1) PCR에 의해 관심 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하는데 사용하고, 2) 특정 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하였다. 전장 클론을 위한 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology)에 따라 PCR 증폭으로 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 관심 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다.

cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 여러가지 인간 조직 라이브러리로부터 단리했다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용되는 cDNA 라이브러리는 인비트로젠 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)으로부터의 시약들과 같은 시판 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작했다. cDNA를 NotI 부위를 갖는 올리고 dT로 프라이밍시키고, SalI 헤미키나제 처리된 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기에 따라 적절하게 분류하고, 적당한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmeset al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조)내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 정해진 방향으로 클로닝했다.

신호 알고리즘:

공공 (예를 들어, 젠뱅크) 및(또는) 민간 (LIFESEQ (등록상표), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬) 데이타베이스로부터의 클러스터되고 조립된 EST 단편 및 발현 서열 태그 (EST)에 대해 제넨테크, 인크사 (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)가 개발한 독점 신호 서열 검색 알고리즘을 사용했다. 신호 서열 알고리즘은 고려 대상의 서열 또는 서열 단편의 5'-말단에서 첫번째 및 경우에 따라서는 두번재 메티오닌 코돈(들) (ATG) 주변의 DNA 뉴클레오티드의 특성을 토대로 분비 신호 스코어를 계산하였다. 첫번째 ATG 다음의 뉴클레오티드는 임의의 정지 코돈 없이 35 개 이상의 명백한 아미노산을 코딩해야 한다. 첫번째 ATG가 요구되는 아미노산을 갖는 경우, 두번째 ATG는 조사하지 않았다. 이 요건을 충족시키지 못하는 경우, 후보 서열은 스코어링하지 않았다. EST 서열이 분명한 신호 서열을 포함하는지 여부를 결정하기 위해, 분비 신호와 관련된 것으로 알려진 7 개의 센서(평가 파라미터) 한 세트를 사용하여 이 DNA 및 ATG 코돈 주변의 해당 아미노산 서열을 스코어링했다.

상기 방법으로 공공 EST 데이타베이스 (예를 들면, 젠뱅크)와 민간 EST DNA 데이타베이스 (LIFESEQ (등록상표), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬) 등의 다양한 발현 서열 태그 (EST) 데이타베이스와 비교된 EST 서열을 확인하였다. 동족성 검색은 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST-2 (Altschul etal.,Methods in Enzymology266: 460-480 (1996))를 이용하여 수행되었다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 또는 그 이상의 BLAST 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (필그린, 미국 워싱턴주 시애틀 소재의 워싱턴 대학)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 조립했다. 이것으로 조사하고 서열분석할 전장 클론에 상응하거나 클로닝 올리고뉴클레오티드 생성을 위한 주형으로 기능하여 여러 조직 라이브러리의 스크리닝에 이용되어 천연 서열 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 단리에 이용될 추가의 EST 서열이 확인되었다.

A.인간 PRO200 (UNQ174)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

VEGF와의 동족성에 기인하여 인사이트 파마슈티컬 데이타베이스로부터 확인된 발현 서열 태그 (EST) 기재의 프로브를 사용하여, 인간 글리오마 (glioma) 세포주 G61로부터 유도된 cDNA 라이브러리를 스크리닝했다. 스크리닝은 본 명세서의 다른 부분에 기재한 방법과 유사한 방식으로 수행될 수 있다. 특히, 인사이트 클론 "INC1302516"을 사용하여 하기의 4 가지 프로브를 생성하였다.

5'-ACTTCTCAGTGTCCATAAGGG-3' (서열 3)

5'-GAACTAAAGAGAACCGATACCATTTTCTGGCCAGGTTGTC-3' (서열 4)

5'-CACCACAGCGTTTAACCAGG-3' (서열 5)

5'-ACAACAGGCACAGTTCCCAC-3' (서열 6)

9 개의 양성을 확인하고 특성화했다. 3 개의 클론들이 완전한 코딩 영역을 포함하고 있었고, 서열이 동일했다. 또한, 부분적 클론들을 태아의 폐 라이브러리로부터 확인했고, 이들은 코딩되는 아미노산을 변형시키지 않는 1 개의 뉴클레오티드 변화를 제외하고는 글리오마로부터 유도된 서열과 동일하였다.

포유동물의 단백질 발현을 위해서, 전체 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 CMV-기재 발현 벡터로 클로닝했다. 에피토프-태그 (FLAG, 코닥 (Kodak)) 및 히스티딘-태그 (His8)를 ORF와 정지 코돈 사이에 삽입했다. UNQ174-His8 및 UNQ174-FLAG를 수퍼펙트 (SuperFect) (퀴아젠 (Qiagen))에 의한 인간 배 신장 293 세포로 형질감염시키고, 3 시간 동안 [³⁵S]메티오닌 및 [³⁵C]시스테인으로 펄스식 표지 (pelse-label)했다. 농도가 15 배인 무혈청 조정 배지 20 ㎕를 소듐 도데실 술페이트 샘플 완충액 중의 폴리아크릴아미드 겔 (노벡스 (Novex))상에서 전기영동시키는 경우 (SDS-PAGE), 에피토프 태그가 부착된 단백질들은 함께 이동했다. 인간 Fc (IgG) 서열 앞에 ORF를 클로닝하여 UNQ174-IgG 발현 플라스미드를 제작했다.

리포펙틴 (Lipofectin) (깁코 BRL (GibcoBRL))을 사용하여 UNQ174-IgG 플라스미드를 바쿨로골드 바쿨로바이러스 (Baculogold Baculovirus) DNA (파르밍겐 (Pharmingen))와 함께 10 ％ 소 태아 혈청으로 보충한 힌크 (Hink's) TNM-FH 배지 (JRH 바이오사이언스 (Biosciences)) 중에 배양한 Sf9 세포 10⁵개로 형질감염시켰다. 세포를 5 일동안 28 ℃에서 인큐베이션했다. 상층액을 수거한 후, 대략적 감염다중도 (multiplicity of infection) (MOI) 10으로 Sf9 세포를 감염시켜, 제1 바이러스 증폭에 사용했다. 세포를 3 일 동안 인큐베이션한 후, 상층물을 수거하고, 이 상층물 1 ml을 프로틴-A (Protein-A) 세파로스 CL-4B 비드 (파마샤 (Pharmacia)) 30 ㎕에 결합시킨 후, SDS-PAGE를 분석하여 재조합 플라스미드의 발현율을 측정했다. 제1 증폭 상층물을 사용하여 ESF-921 배지 (익스프레션 시스템스 LLC (Expression Systems LLC)) 중에 배양한 Sf9 세포의 500 ml 회전 배양물을 MOI 약 0.1로 감염시켰다. 세포를 상기와 같이 처리하되, 수거된 상충물을 멸균 여과 시켰다. 프로틴-A 세파로스 4 패스트 플로우 (파마샤) 컬럼에 결합시켜 특정 단백질을 정제했다.

확인된 클론 DNA29101의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 1 (서열 1)에 나타냈다. 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA29101 (서열 1)은 뉴클레오티드 잔기 285-287에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1320-1322의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 1, 서열 1). 예측되는 PRO200 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ174, 서열 2)는 아미노산 345 개 길이이며, 계산된 분자량은 39029 달톤이고, pI는 6.06이며, 이를 도 2 (서열 2)에 나타냈다. 잠재적인 N-글리코실화 부위는 아미노산 잔기 25, 54 및 254이다. CUB 도메인은 아미노산 잔기 52-65, 118-125 및 260-273이다.

UNQ174 (서열 2)를 코딩하는 DNA를 포함하는 cDNA를 1998년 3월 5일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209653을 배정받았다.

B.인간 PRO204 (UNQ178)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

발현 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ (등록상표), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬)를 검색하여 EST를 확인하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머로 인간 태아의 망막 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 EST 서열 기재의 합성 올리고뉴클레오티드 프로브와의 혼성화를 확인하였다.

혼성화 프로브:

5'-GGCATGCAGCAGCTGGACATTTGCGAGGGCTTTTGCTGGCTG-3' (서열 7)

전방향 PCR 프라이머:

5'-CTGCTGCAGAGTTGCACGAAC-3' (서열 8)

역방향 PCR 프라이머 1:

5'-CAGTTGTTGTTGTCACAGAGAAG-3' (서열 9)

역방향 PCR 프라이머 2:

5'-AGTTCGTGCAACTCTGCAGCAG-3' (서열 10)

cDNA 클론을 확인하고 전체를 서열분석하였다. 확인된 클론 DNA30871의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 3 (서열 11)에 나타냈다. 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA30871-1157 (서열 11)은 뉴클레오티드 위치 376-378에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1498-1500의 정지 코돈 (TAA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 3, 서열 11). 예측되는 PRO204 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ178, 서열 12)는 아미노산 374 개 길이이며, 계산된 분자량은 39,285 달톤이고, pI는 6.06이며, 이를 도 4에 나타냈다. UNQ178 (서열 12)를 코딩하는 DNA를 포함하는 cDNA를 1997년 10월 16일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209380를 배정받았다.

C.인간 PRO212 (UNQ186)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 폐 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여DNA30942에 대한 전장 DNA 서열 (도 5, 서열 13) 및 이로부터 유도된 단백질 서열 UNQ186 (도 6, 서열 14)을 확인했다.

이 방법에 사용한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 프로브는 다음과 같았다:

전방향 프라이머: 5'-CACGCTGGTTTCTGCTTGGAG-3' (서열 15)

역방향 프라이머: 5'-AGCTGGTGCACAGGGTGTCATG-3' (서열 16)

혼성화 프로브: (서열 17)

5'-CCCAGGCACCTTCTCAGCCAGCCAGCAGCTCCAGCTCAGAGCAGTGCCAGCCC-3'

DNA30942의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 5 (서열 13)에 나타냈다. 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA30942 (서열 13)은 뉴클레오티드 위치 101-103에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 위치 1001-1003의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 5, 서열 13). 예측되는 PRO212 폴리펩티드 전구체는 아미노산 300 개 길이이며, 계산된 분자량은 32680 달톤이고, pI는 8.70이며, 이를 도 6 (서열 14)에 나타냈다. 도 6 (서열 14)의 PRO212 서열은 막횡단 도메인이 없다고 여겨진다. 또한, 도 6 (서열 14)의 아미노산 1 내지 215는 4 개의 시스테인 풍부 도메인 (CDR)을 포함하고 있다고 여겨진다. DNA30942 (서열 13)를 포함하는 cDNA 클론 (DNA30942-1134로 확인됨)을 1997년 9월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209254로 배정받았다.

D.인간 PRO216 (UNQ190)을 코딩하는 cDNA 클론의 단리

PRO212의 단리에 사용된 상기 방법과 유사한 방법을 사용하여, PRO216 폴리펩티드 UNQ190 (서열 19) (도 8)를 코딩하는 DNA33087 (서열 18) (도 7)를 단리할 수 있다.

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, DNA33087은 뉴클레오티드 잔기 268-270에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 잔기 1531-1533의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 7, 서열 18). 예측되는 PRO215 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ190, 서열 19)는 아미노산 421 개 길이이며, 계산된 분자량은 49492 달톤이고, pI는 5.51이다 (도 8).

히드로패티 분석법 (hydropathy analysis)으로 아미노산 잔기 1 내지 20에 신호 서열, 아미노산 잔기 268-274 및 300-306에 티로신 키나제 인산화 부위, 및 잔기 230-235에 N-미리스토일화 부위, 및 잔기 146 내지 167 및 217 내지 238에 루이신 지퍼 (leucine zipper)가 존재함이 제안되었다. 전통적인 단리 방법 뿐 아니라, 상기 DNA 서열은 데이호프 (Dayhoff) 단백질 AB000114_1를 코딩하는, 기탁번호 AB000114로서 젠뱅크에서 공개적으로도 입수된다.

또한, 상기 서열은 문헌 (Ohno et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.228(2): 411-414 (1996))에 기재되어 있다. DNA33087를 포함하는 cDNA 클론 (DNA33087-1158로 확인됨)을 1997년 9월 16일에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209381를 배정받았다.

E.인간 PRO226 (UNQ200)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 폐 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 DNA33460에 대한 전장 DNA 서열 (도 9, 서열 20) 및 이로부터 유도된 천연 서열 단백질 UNQ200 (서열 21)을 확인했다.

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, DNA33460은 뉴클레오티드 잔기 62-64에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 잔기 1391-1393의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 9, 서열 20). 예측되는 PRO226 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ200, 서열 21)는 아미노산 443 개 길이이며, 계산된 분자량은 49,391 달톤이고, pI는 4.82이며, 이를 도 10에 UNQ200 (서열 21)로서 나타냈다. DNA33460-1166으로 지칭되는, DNA33460 (서열 20)를 코딩하는 cDNA 클론을 1997년 10월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209376을 배정받았다.

상기 방법에 사용된 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같았다:

28722.p (OLI488)(서열 22)

5'-TGTGTGGACATAGACGAGTGCCGCTACCGCTACTGCCAGCACCGC-3'

28722.f (OLI489)(서열 23)

5'-AGGACTGCCATAACTTGCCTG-3'

28722.r (OLI490)(서열 24)

5'-ATAGGAGTTGAAGCAGCGCTGC-3'

F.인간 PRO240 (UNQ214)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 폐 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 DNA34387에 대한 전장 DNA 서열 (도 11, 서열 25) 및 이로부터 유도된 천연 서열 단백질 UNQ214 (서열 26)을 단리했다.

DNA34387의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 11 (서열 25)에 나타냈다. 굵은밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA34387은 뉴클레오티드 위치 12-14에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 699-701의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 11, 서열 25). 예측되는 PRO240 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ214, 서열 26)는 아미노산 229 개 길이이며, 계산된 분자량은 24,689 달톤이고, pI는 7.83이며, 이를 도 12에 나타냈다. DNA34387 (서열 25)를 포함하는 cDNA를 1997년 9월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209260를 배정받았다.

상기 기재된 방법에 사용하기 위해 합성한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머:5'-TCAGCTCCAGACTCTGATACTGCC-3' (서열 27)

역방향 PCR 프라이머:5'-TGCCTTTCTAGGAGGCAGAGCTCC-3' (서열 28)

혼성화 프로브:(서열 29)

5'-GGACCCAGAAATGTGTCCTGAGAATGGATCTTGTGTACCTGATGGTCCAG-3'

G.인간 PRO235 (UNQ209)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 폐 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 DNA35558에 대한 전장 DNA 서열 (도 13, 서열 30) 및 이로부터 유도된 PRO235 천연 서열 단백질 UNQ209 (도 14, 서열 31)을 단리했다.

DNA35558의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 13 (서열 30)에 나타냈다. 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 도 13에 나타낸 DNA35558 클론은 뉴클레오티드 잔기 667-669에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 2323-2325의 정지 코돈(TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO235 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ209, 서열 31)은 아미노산 552 개 길이이며, 계산된 분자량은 61,674 달톤이고, pI는 6.95이다 (도 14). DNA35558를 포함하는 cDNA 클론을 1997년 10월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209374를 배정받았다.

상기 기재된 방법에 사용하기 위해 합성한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머:5'-TGGAATACCGCCTCCTGCAG-3' (서열 32)

역방향 PCR 프라이머:5'-CTTCTGCCCTTTGGAGAAGATGGC-3' (서열 33)

혼성화 프로브:

5'-GGACTCACTGGCCCAGGCCTTCAATATCACCAGCCAGGACGAT-3' (서열 34)

H.인간 PRO245 (UNQ219) 를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 폐 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 DNA35658에 대한 전장 DNA 서열 (도 15, 서열 35) 및 이로부터 유도된 PRO245 천연 서열 단백질 UNQ219 (도 16, 서열 36)를 단리했다.

상기 기재된 방법에 사용하기 위해 합성한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머5'-ATCGTTGTGAAGTTAGTGCCCC-3' (서열 37)

역방향 PCR 프라이머5'-ACCTGCGATATCCAACAGAATTG-3' (서열 38)

혼성화 프로브(서열 39)

5'-GGAAGAGGATACAGTCACTCTGGAAGTATTAGTGGCTCCAGCAGTTCC-3'

DNA35638 (서열 35)의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 15에 나타냈다. 클론 DNA35638은 뉴클레오티드 위치 89-91에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1025-1027의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 15, 서열 35). 예측되는 PRO245 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ219, 서열 36)는 아미노산 312 개 길이이며, 계산된 분자량은 34,554 달톤이고, pI는 9.39 (도 36)이다. DNA35638 (서열 35)를 포함하는 클론 (DNA35638-1141로 지칭됨)을 1997년 9월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209265를 배정받았다.

I.인간 PRO172 (UNQ146)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 신장 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 DNA35916에 대한 전장 DNA 서열 (도 17, 서열 40) 및 이로부터 유도된 PRO172 천연 서열 단백질 UNQ146 (도 18, 서열 41)을 단리했다.

도 17에 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA35916 (서열 40)은 뉴클레오티드 위치 38-40에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 2207-2209의 정지 코돈 (TAA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO172 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ146, 서열 41)는 아미노산 723 개 길이이며, 계산된 분자량은 78,055 달톤이고, pI는 6.17 (도 18)이다. DNA35916 (서열 40)을 포함하는 cDNA 클론 (DNA35916-1161로 지칭됨)을 1997년 10월 28일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209419를 배정받았다.

상기 방법에 사용한 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같았다:

28765.p (OLI633)

5'-AAATCTGTGAATTGAGTGCCATGGACCTGTTGCGGACGGCCCTTGCTT-3' (서열 42)

28765.f (OLI644)

5'-GGATCTCGAGAACAGCTACTCC-3' (서열 43)

28765.r (OLI645)

5'-TCGTCCACGTTGTCGTCACATG-3' (서열 44)

J.인간 PRO273 (UNQ240)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 신장 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 DNA39523에 대한 전장 DNA 서열 (도 19, 서열 45) 및 이로부터 유도된 PRO273 천연 서열 단백질 UNQ240 (도 20, 서열 46)을 단리했다.

합성한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머:5'-CAGCGCCCTCCCCATGTCCCTG-3' (서열 47)

역방향 PCR 프라이머:5'-TCCCAACTGGTTTGGAGTTTTCCC-3' (서열 48)

혼성화 프로브:

5'-CTCCGGTCAGCATGAGGCTCCTGGCGGCCGCTGCTCCTGCTGCTG-3' (서열 49)

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA39523 (서열 45)은 뉴클레오티드 위치 167-169에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 500-502의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 19). 예측되는 PRO273 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ240, 서열 46)는 아미노산 111 개 길이이며, 계산된 분자량은 13,078 달톤이고, pI는 10.37 (도 20)이다. DNA39523 (서열 45)를포함하는 cDNA 클론을 1997년 10월 31일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209424를 배정받았다.

K.인간 PRO272 (UNQ239)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 폐 조직으로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법, 및 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 사용하는 생체내 클로닝 방법을 함께 사용하여 DNA40620에 대한 전장 DNA 서열 (도 21, 서열 50) 및 이로부터 유도된 PRO272 천연 서열 단백질 UNQ239 (서열 51)을 단리했다.

DNA 서열을 코딩하는 PRO272의 단리에 사용한 전방향 및 역방향 PCR 프라이머 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머(.f1): 5'-CGCAGGCCCTCATGGCCAGG-3' (서열 52)

전방향 PCR 프라이머(.f2): 5'-GAAATCCTGGGTAATTGG-3' (서열 53)

역방향 PCR 프라이머:5'-GTGCGCGGTGCTCACAGCTCATC-3' (서열 54)

혼성화 프로브:

5'-CCCCCCTGAGCGACGCTCCCCCATGATGACGCCCACGGGAACTTC-3' (서열 55)

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA40620 (서열 50)은 뉴클레오티드 위치 35-37에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1020-1022의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 21). 예측되는 폴리펩티드 전구체는 아미노산 328 개 길이이고 (도 22), 계산된 분자량은 37,493 달톤이며, pI는 4.77이다. DNA40620 (서열 50)를 포함하는 cDNA 클론을 1997년 10월 17일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209388을 배정받았다.

L.PRO332 (UNQ293)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리 인간

인간 태아의 폐 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 DNA40982에 대한 전장 DNA 서열 (도 23, 서열 56) 및 이로부터 유도된 PRO332 천연 서열 단백질 UNQ293 (도 24, 서열 57)을 단리했다.

상기 방법에 사용하기 위해 합성한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

5'-GCATTGGCCGCGAGACTTTGCC-3' (서열 58)

5'-GCGGCCACGGTCCTTGGAAATG-3' (서열 59)

5'-TGGAGGAGCTCAACCTCAGCTACAACCGCATCACCAGCCCACAGG-3' (서열 60)

DNA40982 (서열 56)의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 23에 나타냈다. 도 23에서 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA40982 (서열 56)은 뉴클레오티드 위치 342-344에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 2268-2270의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO332 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ293, 서열 57, 도 24)는 아미노산 642 개 길이이고, 계산된 분자량은 72,067이며, pI는 6.60이다. DNA40982 (서열 56)를 포함하는 cDNA 클론 (DNA40982-1235로 지칭됨)을 1997년 11월 7일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209433을 배정받았다.

M.인간 PRO526 (UNQ330)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 폐 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 전장 DNA 서열 DNA44184 (도 25, 서열 61) 및 이로부터 유도된 PRO526 천연 서열단백질 UNQ330 (도 26, 서열 62)을 단리했다.

합성한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머: 5'-TGGCTGCCCTGCAGTACCTCTACC-3' (서열 63)

역방향 PCR 프라이머: 5'-CCCTGCAGGTCATTGGCAGCTAGG-3' (서열 64)

혼성화 프로브: (서열 65)

5'-AGGCACTGCCTGATGACACCTTCCGCGACCTGGGCAACCTCACAC-3' .

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA44184 (서열 61)는 뉴클레오티드 위치 514-516에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1933-1935의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 61). 예측되는 PRO526 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ330, 서열 62)는 아미노산 473 개 길이이다 (도 62). 도 62에 나타낸 UNQ330 (서열 62) 단백질의 추정 분자량은 약 50708 달톤이고, pI는 약 9.28이다. DNA44184를 포함하는 cDNA 클론 (DNA44184-1319로 지칭됨)을 1998년 3월 26일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209704를 배정받았다.

UNQ330 (서열 62)을 분석하여 신호 펩티드 서열이 아미노산 약 1-26에 있음을 밝혀냈다. 루이신 지퍼 패턴은 아미노산 약 135-156에 있었다. 글리코사미노글리칸 부착 부위는 아미노산 약 436-439였다. N-글리코실화 부위는 아미노산 약 82-85, 179-182, 237-240 및 423-426였다. C형-폰 빌레브란트 인자 (VWF) 도메인(들)은 아미노산 약 411-425에서 찾아냈다. 당업자라면 본원에 제공된 서열들을 기초로 어떤 뉴클레오티드가 이 아미노산에 상응하는지를 이해할 수 있다.

N.인간 PRO701 (UNQ365)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 폐 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 전장 DNA 서열 DNA44205 (도 27, 서열 66) 및 이로부터 유도된 PRO526 천연 서열 단백질 UNQ365 (도 28, 서열 67)을 확인했다.

상기 방법에 사용하기 위해 합성한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

5'-GGCAAGCTACGGAAACGTCATCGTG-3' (서열 68)

5'-AACCCCCGAGCCAAAAGATGGTCAC-3' (서열 69)

5'-GTACCGGTGACCAGGCAGCAAAAGGCAACTATGGGCTCCTGGATCAG-3' (서열 70)

도 27에서 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA44205 (서열 66)은 뉴클레오티드 위치 50-52에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 2498-3000의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO701 폴리펩티드 전구체 (즉, 도 28, UNQ365, 서열 67)는 아미노산 816 개 길이이고, 계산된 분자량은 91,794 달톤 (pI: 5.88)이다. DNA44205 (서열 66)를 포함하는 cDNA 클론 (DNA44205-1285로 지칭됨)을 1998년 3월 31일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209720를 배정받았다.

UNQ365 (서열 67)은 아미노산 위치 약 25에 잠재적인 신호 펩티드 절단 부위를 포함한다. 아미노산 위치 약 83, 511, 716 및 803에는 잠재적인 N-글리코실화 부위가 있다. B형-카르복실에스테라제 시그너쳐 2 서열은 잔기 약 125 내지 135에 있다. 또한, B형-카르복실에스테라제와의 동족성 영역은 잔기 약 54-74, 197-212및 221-261에 있다. 잠재적인 막횡단 영역은 대략적으로 아미노산 671 내지 약 700에 상응한다. 상응하는 핵산은 일반적으로 본원에서 제공된 서열로부터 결정될 수 있다.

O.인간 PRO361 (UNQ316)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재된 ECD 동족성 방법, 및 인간 태아의 신장 라이브러리로부터의 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 사용하는 생체내 클로닝 방법을 함께 사용하여 전장 DNA 서열 DNA45410 (도 29, 서열 71) 및 이로부터 유도된 PRO361 천연 서열 단백질 UNQ316 (도 30, 서열 72)을 확인했다.

상기 기재된 방법에 사용하기 위한 전방향 및 역방향 PCR 프라이머 및 혼성화 프로브를 다음과 같이 합성했다.

전방향 PCR 프라이머(.f1):

5'-AGGGAGGATTATCCTTGACCTTTGAAGACC-3' (서열 73)

전방향 PCR 프라이머(.f2):

5'-GAAGCAAGTGCCCAGCTC-3' (서열 74)

전방향 PCR 프라이머(.f3): 5'-CGGGTCCCTGCTCTTTGG-3' (서열 75)

역방향 PCR 프라이머(.r1): 5'-CACCGTAGCTGGGAGCGCACTCAC-3' (서열 76)

역방향 PCR 프라이머(.r2): 5'-AGTGTAAGTCAAGCTCCC-3' (서열 77)

혼성화 프로브:

5'- GCTTCCTGACACTAAGGCTGTCTGCTAGTCAGAATTGCCTCAAAAAGAG-3'(서열 78)

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA45410 (서열 71)은 뉴클레오티드 위치226-228에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1519-1521의 정지 코돈 (TAA)에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 29). 예측되는 PRO361 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ316, 서열 72)는 아미노산 431 개 길이이다 (도 30). 도 30에 UNQ316으로 나타낸 천연 서열 PRO361 단백질의 추정 분자량은 약 46810이고 pI는 약 6.45이다. 또한, 아르기나제 족 단백질들을 나타내는 영역은 잔기 약 F3 내지 V14 및 또한 I39 내지 T57에 존재하지만, 막횡단 도메인은 잔기 약 P380 내지 S409에 존재한다. DNA45410 (서열 71)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 2월 5일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209621를 배정받았다.

P.인간 PRO362 (UNQ317)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 뇌 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 전장 DNA 서열 DNA45416 (도 31, 서열 79) 및 이로부터 유도된 PRO362 천연 서열 단백질 UNQ317 (도 32, 서열 80)을 단리했다.

상기 방법에 사용하기 위해 합성한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머 1: 5'-TATCCCTCCAATTGAGCACCCTGG-3' (서열 81)

전방향 PCR 프라이머 2: 5'-GTCGGAAGACATCCCAACAAG-3' (서열 82)

역방향 PCR 프라이머 1: 5'-CTTCACAATGTCGCTGTGCTGCTC-3' (서열 83)

역방향 PCR 프라이머 2: 5'-AGCCAAATCCAGCAGCTGGCTTAC-3' (서열 84)

혼성화 프로브:

5'-TGGATGACCGGAGCCACTACACGTGTGAAGTCACCTGGCAGACTCCTGAT-3' (서열 85)

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA45416 (서열 79)은 뉴클레오티드 위치 119-121에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1082-1084의 정지 코돈 (TAA)에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 31). 예측되는 PRO362 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ317, 서열 80)는 아미노산 321 개 길이이다 (도 32). 도 32 에 나타낸 UNQ317 단백질 (서열 80)의 추정 분자량은 약 35,544 달톤이고, pI는 약 8.51이다. 도 32에 나타낸 바와 같이 UNQ317 폴리펩티드를 분석하여 아미노산 약 149 내지 아미노산 약 152에 글리코사미노글리칸 부착 부위가 존재하고, 아미노산 약 276 내지 아미노산 약 306에 막횡단 도메인이 존재함을 입증하였다. DNA45416 (서열 79)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 2월 5일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209620를 배정받았다.

Q.인간 PRO363 (UNQ318)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 신장 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 전장 DNA 서열 DNA45419 (도 33, 서열 86) 및 이로부터 유도된 PRO363 천연 서열 단백질 UNQ318 (도 34, 서열 87)을 단리했다.

상기 방법에 사용하기 위해 합성한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머:

5'-CCAGTGCACAGCAGGCAACGAAGC-3' (서열 88)

역방향 PCR 프라이머:

5'-ACTAGGCTGTATGCCTGGGTGGGC-3' (서열 89)

혼성화 프로브:

5'-GTATGTACAAAGCATCGGCATGGTTGCAGGAGCAGTGACAGGC-3' (서열 90)

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA45419 (서열 86)는 뉴클레오티드 위치 190-192에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1309-1311의 정지 코돈 (TGA)에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 33). 예측되는 PRO363 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ318, 서열 87)는 아미노산 373 개 길이이다 (도 34). 도 34에 나타낸 UNQ318 단백질 (서열 87)의 추정 분자량은 약 41,281 달톤이고, pI는 약 8.33이다. 도 34에 나타낸 바와 같이 UNQ318 폴리펩티드를 분석하여 막횡단 도메인이 아미노산 잔기 약 221 내지 잔기 약 254에 있음을 입증하였다. DNA45419 (서열 86)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 2월 5일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209616를 배정받았다.

R.인간 PRO364 (UNQ319)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간의 소장 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 종양괴사인자 수용체 (TNFR) 폴리펩티드 족의 구성원과 동족성이 있는 폴리펩티드를 코딩하는 발현 서열 태그 (EST) (인사이트 EST 3003460)를 확인하였다.

그 다음, ECD 동족성 방법에서 사용한 것과 유사한 방식으로 인사이트 3003460 EST에 대해 컨센서스 DNA 서열을 조립하여 전장 DNA 서열 DNA47365 (도 35, 서열 91) 및 이로부터 유도된 PRO364 천연 서열 단백질 UNQ319 (도 36, 서열 92)를 단리하였다.

상기 기재된 스크리닝 방법에 사용하기 위해 합성한 PCR 프라이머 (전방향및 역방향) 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머 (44825.f1): 5'-CACAGCACGGGGCGATGGG-3' (서열 93)

전방향 PCR 프라이머 (44825.f2): 5'-GCTCTGCGTTCTGCTCTG-3' (서열 94)

전방향 PCR 프라이머 (44825.GITR.f):

5'-GGCACAGCACGGGGCGATGGGCGCGTTT-3' (서열 95)

역방향 PCR 프라이머 (44825.r1): 5'-CTGGTCACTGCCACCTTCCTGCAC-3'(서열 96)

역방향 PCR 프라이머 (44825.r2): 5'-CGCTGACCCAGGCTGAG-3' (서열 97)

역방향 PCR 프라이머 (44825.GITR.r):

5'-GAAGGTCCCCGAGGCACAGTCGATACA-3' (서열 98)

혼성화 프로브 (44825.p1):

5'-GAGGAGTGCTGTTCCGAGTGGGACTGCATGTGTGTCCAGC-3' (서열 99)

혼성화 프로브 (44825.GITR.p):

5'-AGCCTGGGTCAGCGCCCCACCGGGGGTCCCGGGTGCGGCC-3' (서열 100)

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA47365 (서열 91)는 뉴클레오티드 위치 121-123에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 844-846 의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 35). 예측되는 PRO364 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ319, 서열 92)는 아미노산 241 개 길이이다 (도 36). 도 36에 나타낸 UNQ319 (서열 92) 단백질의 추정 분자량은 약 26,000 달톤이고, pI는 약 6.34이다. 도 36에 나타낸 아미노산 서열의 잠재적인 N-글리코실화 부위는 아미노산 146과 149 사이에 존재한다. 도 36에 나타낸 서열의 추정상의 신호 서열은 아미노산 1 내지 25에 있고 잠재적인 막횡단 도메인은 아미노산 162 내지 180 사이에 있다. DNA47365를 포함하는 cDNA 클론 (DNA47365-1206로 지칭됨)을 1997년 11월 7일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 ATCC 209436를 배정받았다.

S.인간 PRO356 (UNQ313)(NL4)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

발현 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ (등록상표), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬)를 검색하여 인간 TIE-2 L1 및 TIE-2 L2에 동족성을 나타내는 EST (#2939340)를 확인하였다.

EST를 기초로, 하기와 같은 한 쌍의 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 혼성화 프로브를 합성하였다:

NL4,5-1: 5'-TTCAGCACCAAGGACAAGGACAATGACAACT-3' (서열 103)

NL4,3-1: 5'-TGTGCACACTTGTCCAAGCAGTTGTCATTGTC-3' (서열 104)

NL4,3-3: 5'-GTAGTACACTCCATTGAGGTTGG-3' (서열 105).

미국 메릴랜드주 게터스버그 소재의 라이프 테크노로지 (Life Technologies)의 시약 및 프로토콜 (수퍼 스크립트 플라스미드 시스템 (Super Script Plasmid System))을 이용하여, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론테크, 인크. ((Clontech, INC)로부터 구입한 자궁 mRNA (카탈로그 번호 6537-1)를 사용하여 벡터 pRK5D에 올리고 dT 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 제조했다. pRK5D는 sp6 전사 개시 부위, SfiI 제한 효소 부위, XhoI/NotI cDNA 클로닝 부위를 순서대로 포함하는 클로닝 벡터이다. cDNA를 NotI 부위를 갖는 올리고 dT로 프라이밍시키고, SalI 헤미키나제 처리된 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동으로 1000 bp보다 큰 것으로 크기에 따라 적절하게 분류하고, XhoI/NotI으로 절단한 pRK5D에 정해진 방향으로 클로닝했다.

전장 클론의 공급원을 위한 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 상기에서 확인된 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭으로 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머들 중 하나를 이용하여 PRO356 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다.

상기 기재한 바와 같이 단리한 클론의 DNA 서열분석은 천연 서열 PRO356 (NL4)를 코딩하는 전장 DNA 서열 (즉, DNA47470, 서열 101) 및 이로부터 유도된 PRO356 단백질 서열 UNQ313 (서열 102)을 제공했다.

DNA47470의 전체 뉴클레오티드 서열이 도 37 (서열 101)에 나타나 있다. 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA47470 (서열 101)은 뉴클레오티드 위치 215-217에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1038-1040에 TAA 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO356 폴리펩티드는 46 개 길이이고 (즉, UNQ313 (서열 102)), 계산된 분자량은 40,018 달톤이며, pI는 8.19이다. DNA47470 (서열 101)를 포함하는 cDNA 클론을 1997년 10월 28일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209422를 배정받았다.

T.인간 PRO531 (UNQ332)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 뇌 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 전장 DNA 서열 DNA48314 (도 39, 서열 106) 및 이로부터 유도된 PRO531 천연 서열단백질 UNQ332 (도 40, 서열 107)을 단리했다.

합성한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머: 5'-CTGAGAACGCGCCTGAAACTGTG-3' (서열 108)

역방향 PCR 프라이머: 5'-AGCGTTGTCATTGACATCGGCG-3' (서열 109)

혼성화 프로브: (서열 110)

5'-TTAGTTGCTCCATTCAGGAGGATCTACCCTTCCTCCTGAAATCCGCGGAA-3'

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA48314 (서열 106)는 뉴클레오티드 위치 171-173에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 2565-2567의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 39). 예측되는 PRO531 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ332, 서열 107)는 아미노산 789 개 길이이다. 도 39에 나타낸 UNQ332 단백질 (서열 107)의 추정 분자량은 약 87552 달톤이고, pI는 약 4.84이다. DNA48314 (서열 106)를 포함하는 클론을 1998년 3월 26일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209702를 배정받았다.

서열 107의 UNQ332 아미노산 서열을 분석하여 아미노산 약 122-132, 231-241, 336-346, 439-449 및 549-559에 카드헤린 (cadherin) 세포외 반복 도메인 시그너쳐가 있음을 밝혀냈다. ATP/GTP-결합 부위 모티프 A (P-loop)는 서열 107의 아미노산 약 285-292에서 찾아냈다. 서열 107에서, N-글리코실화 부위는 적어도 아미노산 약 567-570, 786-790, 418-421 및 336-339에서 찾아냈고, 신호 펩티드는 아미노산 약 1-26에서, 막횡단 도메인은 아미노산 약 685-712에서 찾아냈다.

U.인간 PRO533 (UNQ334)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

EST 서열 기탁번호 AF007268의 뮤린 섬유아세포 성장인자 (FGF-15)를 사용하여 여러가지 공공 EST 데이타베이스 (예를 들면, 젠뱅크, 데이호프 등)를 검색했다. EST 서열의 6 개 프레임 번역에 대한 ECD 단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST-2 (Altschul et al.,Methods in Enzymology266:460-480 (1996))를 이용하여 검색을 수행했다. 이 검색으로 스트라타진 (stratagene) NT2 뉴런 전구체 937230로 확인되었던 젠뱅크 EST AA220994를 확인했다.

이 서열을 기초로 하여, 1) 관심 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고, 2) 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성했다. 전장 클론의 공급원을 위한 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 따라 PCR 증폭으로 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머들 중 하나를 이용하는 생체내 클로닝 방법에 따라 관심있는 PRO533 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다.

cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아의 망막으로부터 단리했다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용되는 cDNA 라이브러리는 시판 시약 (예를 들면, 인비트로젠 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), 클론테크 등)을 사용하여 표준 방법으로 제작했다. cDNA를 NotI 부위를 갖는 올리고 dT로 프라이밍시키고, SalI 헤미키나제 처리된 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동으로크기에 따라 적절하게 분류하고, 적당한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)) 참조)내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 정해진 방향으로 클로닝했다.

cDNA 클론을 전체적으로 서열분석했다. 전장 뉴클레오티드 서열 DNA49435 (서열 111)을 도 41에 나타냈다. 도 41에 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA49435 (서열 111)은 뉴클레오티드 위치 464-466에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 649-651의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO533 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ334, 서열 112)는 아미노산 216 개 길이이며, 계산된 분자량은 24,003 달톤이고, pI는 6.99이다. 클론 DNA49435-1219 (DNA49435-1219로 지칭)를 1997년 11월 21일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209480를 배정받았다.

상기 방법에 사용한 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같았다:

FGF15.f: 5'-ATCCGCCCAGATGGCTACAATGTGTA-3' (서열 113)

FGF15.p: 5'-GCCTCCCGGTCTCCCTGAGCAGTGCCAAACAGCGGCAGTGTA-3' (서열 114)

FGF15.r: 5'-CCAGTCCGGTGACAAGCCCAAA-3' (서열 115)

V.인간 PRO1083 (UNQ540)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 신장 조직으로부터 단리한 조직에 관해, 상기 기재한 아밀라제 효모 스크리닝 방법을 사용하여 하기의 올리고뉴클레오티드 생성의 주형으로 기능하는 EST 서열을 찾아, 인간 태아의 신장 라이브러리에서의 상기 스크리닝으로 전장 DNA 서열 DNA50921 (도 43, 서열 116) 및 이로부터 유도된 PRO1083 천연 서열 단백질 UNQ540 (서열 117)을 단리했다.

상기 방법에 사용하기 위해 합성한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 프라이머: (43422.f1): 5'-GGCATTGGAGCAGTGCTGGGTG-3' (서열 118)

전방향 프라이머: (43422.f2): 5'-AGAGCAACTCAGACAGCG-3' (서열 119)

역방향 프라이머: (43422.r1): 5'-TGGAGGCCTAGATGCGGCTGGACG-3'(서열 120)

역방향 프라이머: (43422.r2): 5'-CGAGGAGACCATCAGCAC-3' (서열 121)

혼성화 프로브: (43422.p1): (서열 122)

5'-CCCAAACATCCTGCTTCTGCAACCACTTGACCTACTTTGCAGTGC-3'

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA50921 (서열 116)은 뉴클레오티드 위치 154-156에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 2233-2235의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 43). 예측되는 PRO1083 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ540, 서열 117, 도 44)는 아미노산 693 개 길이이다. 도 44에 나타낸 UNQ540 (서열 117) 단백질의 추정 분자량은 약 77738이고 pI는 약 8.87이다. DNA50921를 포함하는 클론을 1998년 5월 12일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209859를 배정받았다.

아미노산 서열 UNQ540 (서열 117)를 분석하여 추정상의 신호 펩티드신호 펩티드는 아미노산 약 1-25에 있으며, 막횡단 도메인은 아미노산 약 382-398, 402-420, 445-468, 473-491, 519-537, 568-590 및 634-657에 있고, 미소체 C-말단 표적화 신호는 아미노산 약 691-693에 있고, cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 인산화 부위는 아미노산 약 198-201 및 370-373에 있고, N-글리코실화 부위는 아미노산 약 39-42, 148-151, 171-174, 234-237, 303-306, 324-227 및 341-344에 있으며, G-단백질과 커플링된 수용체 족 도메인은 아미노산 약 475-504에 있음을 밝혀냈다.

W.인간 PRO865 (UNQ434)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 신장 조직으로부터 단리한 조직에 관해, 상기 기재한 아밀라제 효모 스크리닝 방법을 사용하여 하기의 올리고뉴클레오티드 생성의 주형으로 기능하는 EST 서열을 찾아, 인간 태아의 신장 라이브러리에서의 상기 스크리닝으로 전장 DNA 서열 DNA53974 (도 45, 서열 123) 및 이로부터 유도된 PRO865 천연 서열 단백질 UNQ434 (서열 124)을 단리했다.

상기 방법에 사용하기 위해 합성한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 프라이머: (48615.f1): 5'-AAGCTGCCGGAGCTGCAATG-3' (서열 125)

전방향 프라이머: (48615.f2): 5'-TTGCTTCTTAATCCTGAGCGC-3' (서열 126)

전방향 프라이머: (48615.f3): 5'-AAAGGAGGACTTTCGACTGC-3' (서열 127)

역방향 프라이머: (48615.r1): 5'-AGAGATTCATCCACTGCTCCAAGTCG-3' (서열 128)

역방향 프라이머: (48615.r2): 5'-TGTCCAGAAACAGGCACATATCAGC-3' (서열 129)

혼성화 프로브: (43422.p1): (서열 130)

5'-AGACAGCGGCACAGAGGTGCTTCTGCCAGGTTAGTGGTTACTTGGATGAT-3'

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA53974 (서열 123)는 뉴클레오티드 위치173-175에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1577-1579의 정지 코돈 (TAA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 45). 예측되는 PRO865 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ865, 서열 124)는 아미노산 468 개 길이이다. 도 46에 나타낸 UNQ434 (서열 124) 단백질의 추정 분자량은 약 54,393이고 pI는 약 5.63이다. DNA53974 (서열 123)를 포함하는 클론을 1998년 4월 14일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209774를 배정받았다.

아미노산 서열 UNQ434 (서열 124)를 분석하여 추정상의 신호 펩티드는 아미노산 잔기 약 1-23에 있고, 잠재적인 N-글리코실화 부위는 아미노산 잔기 약 280 및 약 384에 있고, 잠재적인 아미드화 부위는 아미노산 잔기 약 94 내지 잔기 약 97에 있고, 글리코사미노클리칸 부착 부위는 아미노산 잔기 약 20 내지 약 23 및 잔기 약 223 내지 잔기 약 226에 있고, 아미노트랜스퍼라제 클라스-V 피리독실-포스페이트 아미노산 서열 블록은 아미노산 잔기 약 216 내지 잔기 약 222에 있으며, 인터루킨-7 단백질에서 발견되는 것과 유사한 아미노산 서열 블록은 아미노산 잔기 약 338 내지 잔기 약 343에 있음을 밝혀냈다.

X.PRO770 (UNQ408)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리 인간

전장 뮤린 m-FIZZ1 DNA (DNA 53517)를 사용하여 공공 발현 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스 (머크/워싱턴 대학)를 검색하여, m-FIZZ1 DNA에 동족성을 나타내는, AA524300로 지칭되는 EST를 확인하였다.

EST AA524300에 상응하는 전장 클론을 인사이트 (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬)에서 구입하여 전체를 서열분석했다.

이로써 얻어진 PRO770-코딩 전장 클론의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 47에 나타냈다. DNA54228 (서열 133)로 지칭되는 이 전장 클론은 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 뉴클레오티드 위치 100-102에 명백한 번역 개시 부위를 가지며 (도 47, 서열 133), 잔기 433-435의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO770 폴리펩티드 전구체 (아미노산 20 개의 추정상의 신호 서열 포함) (즉, UNQ408, 서열 134)는 아미노산 111 개 길이이며, 계산된 분자량은 11,730 달톤이고, pI는 7.82이다. m-FIZZ1에 대한 동족성 (ALIGN 소프트웨어를 사용했을 때, 50 ％)을 기초로, 상기 단백질은 m-FIZZ1의 인간 동족체라고 여겨지며, h-FIZZ1로 지칭되었다. DNA54228 (서열 133)를 포함하는 cDNA 클론을 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209801을 배정받았다.

m-FIZZ1 (DNA53517)의 확인 및 클로닝

마우스 천식 모델: 생후 6 내지 8 주된 암컷 Balb/C 마우스를 두 개의 시험군인 대조구와 천식 시험구로 나누었다. 천식 시험구에서는 10 ㎍의 난알부민 + 1 mg의 백반 (alum)을 복강내로 면역화시켰지만, 대조구에서는 그렇게 하지 않았다. 2 주 후에, 마우스에게 UltraNeb 분무기 (데빌비스 (DeVilbiss))를 사용하여 에어로졸화시킨 PBS 중의 난알부민 10 mg/ml의 에어로졸을 2 ml/분의 속도로 매일 30 분씩, 연속 7 일 동안 매일 노출시켰다. 마지막으로 에어로졸을 주입한 다음 날, 혈액, 혈청 및 기관지폐포 세척 (BAL) 샘플을 모두 모으고 폐를 꺼내 조직학적 조사, 면역조직화학 및 계내 혼성화를 위해 보관하였다.

BAL 샘플들의 겔 전기영동: 16％ 트리신 겔상 겔 전기영동에 의한 BAL샘플 조사는 천식 마우스의 BAL 샘플에서는 저분자량의 단백질이 발현되었으나 대조구 마우스의 BAL 샘플에서는 그렇지 않음을 나타냈다. 이러한 저분자량의 단백질은 m-FIZZ1이라 지칭되었고 8300 달톤의 마커 단백질과 함께 이동하는 것으로 관찰되었다.

부분 단백질 서열: 상기 관심 단백질을 PVDF 막 상으로 옮기고 에드만 분해법으로 서열분석했다. 이 서열은 하기 기재된 바와 같은 각종 클로닝 올리고를 위한 주형으로 기능했다.

부분 cDNA 서열: 본 발명자들은 상기 부분 단백질 서열의 아미노산 중 처음 7 개와 마지막 7 개에 대한 추정상의 DNA 서열에 상응하는 2 가지 변성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 설계했다.

올리고 #1:

5'-ACA AAC GCG TGA YGA RAC NAT HGA RAT-3' (서열 135)

올리고 # 2:

5'-TGG TGC ATG CGG RTA RTT NGC NGG RTT-3' (서열 136)

정상 마우스의 폐로부터 제조한 cDNA를 PCR 반응의 주형으로 사용하여 88 bp 생성물을 산출했다. 이 88 bp 생성물은 상기 PCR 프라이머를 코딩하는 공지된 54 bp 및 다른 부분 mFIZZ-1 서열을 코딩하는 신규 34 bp를 포함했다..

전장 cDNA 클론: 이 두번째 부분 서열로 프라이머를 고안하여, 마우스 폐 폴리(A)⁺RNA의 RT-PCR로 결국 전장 FIZZ 클론 (DNA53517)을 성공적으로 수득했다.

올리고 #3:

5'-ACA AAC GCG TGC TGG AGA ATA AGG TCA AGG-3' (서열 137)

이 올리고를 클론테크의 5' 및 3' 앰플리머와 함께 RT-PCR 프라이머로 사용했다.

올리고 #4:

5'-ACT AAC GCG TAG GCT AAG GAA CTT CTT GCC-3' (서열 138)

이 올리고를 올리고 d(T)와 함께 RT-PCR 프라이머로 사용했다.

Y.인간 PRO769 (UNQ407)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재한 전장 뮤린 m-FIZZ1 DNA (DNA 53517)를 사용하여 공공 발현 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스 (머크/워싱턴 대학)를 검색하여, EST W42069를 확인하였다.

EST 단편 W42069에 상응하는 전장 클론을 인사이트 파마슈티컬 (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로부터 구입하여, 전체를 서열분석한 결과, 궁극적으로 전장 뉴클레오티드 서열 DNA54231 (서열 139)을 확인하였다.

전장 천연 서열 PRO769 클론에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 도 49에 나타냈다. DNA 54231 (서열 139)로 지칭되는 이 클론은 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 뉴클레오티드 위치 75-77에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 잔기 417-419의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 49). 예측되는 PRO769 폴리펩티드 전구체 (아미노산 10 개로 된 신호 서열 포함) (즉, UNQ407, 서열 140)는 아미노산 114 개 길이이며, 계산된 분자량은 12,492 달톤이고, pI는8.19이다. m-FIZZ1와의 동족성 (ALIGN 소프트웨어를 사용했을 때, 34％)을 기초로, 상기 단백질은 m-FIZZ3로 지칭되었다. DNA54231를 포함하는 클론 (DNA54231-1366로 지칭됨)을 1998년 4월 23일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209804를 배정받았다.

Z.인간 PRO788 (UNQ430)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 확인된, ECD 동족성 방법을 사용하여 부분 길이 EST 서열 2777282를 확인했다. 또한, 이에 상응하는 전장 서열의 분석으로 DNA56405 (서열 141) 및 이로부터 유도된 천연 서열 PRO788 단백질 UNQ430 (서열 142)을 확인했다.

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA56405 (서열 141)는 뉴클레오티드 위치 84-86에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 459-461의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 51). 예측되는 천연 서열 PRO788 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ430, 서열 142)는 아미노산 125 개 길이이며 (도 52), 계산된 분자량은 13,115 달톤이고, pI는 5.90이다. 도 52에 나타낸 UNQ430 (서열 142) 단백질의 추정 분자량은 약 13115이고 pI는 약 5.90이다. DNA56405 (서열 142)를 포함하는 클론을 1998년 5월 6일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209849를 배정받았다. 기탁물의 뉴클레오티드 서열과 본원에 기재된 서열 사이에 차이점이 있는 경우, 기탁된 클론이 올바른 서열을 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 본원에 제공된 서열들의 서열분석 방법은 공지된 서열분석 기술을 기초로 한다.

도 52에 나타낸 UNQ430 (서열 52)을 분석하여 아미노산 약 1-17에 신호 펩티드가 있고, 아미노산 약 46에 N-글리코실화 부위가 있음을 밝혀냈다.

AA.인간 PRO1114 (UNQ557)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 신장 조직으로부터 단리한 조직에 관해, 상기 기재한 아밀라제 효모 스크리닝 방법을 사용하여 하기의 올리고뉴클레오티드 생성의 주형으로 기능하는 EST 서열을 찾아, 인간 유방암 라이브러리에서를 상기 기재한 바와 같이 스크리닝하여 전장 DNA 서열 DNA57033 (도 53, 서열 143) 및 이로부터 유도된 PRO1114 천연 서열 단백질 UNQ557 (도 54, 서열 144)을 단리했다.

상기 단락에 기재한 단리 스크리닝에 사용한 PCR 프라이머는 다음과 같았다:전방향 프라이머: (48466.f1): 5'-AGGCTTCGCTGCGACTAGACCTC-3' (서열 145)

역방향 프라이머: (48466.r1): 5'-CCAGGTCGGGTAAGGATGGTTGAG-3' (서열 146)

혼성화 프로브: 48466.p1):

5'-TTTCTACGCATTGATTCCATGTTTGCTCACAGATGAAGTGGCCATTCTGC-3' (서열 147)

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA57033 (서열 143)은 뉴클레오티드 위치 250-252에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1183-1185의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 53, 서열 143). 예측되는 PRO1114 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ557, 서열 144)는 아미노산 311 개 길이이며, 계산된 분자량은 대략 35,076 달톤이고 추정된 pI는 대략 5.04이다. 도 54 (서열 144)에 나타낸 전장 PRO1114 서열을 분석하여 다음이 존재함을 입증했다: 아미노산 약 1 내지 아미노산 약 29의 신호 펩티드, 아미노산 약 230 내지 아미노산 약 255의 막횡단 도메인, 아미노산 약 40 내지 아미노산 약 43 및 아미노산 약134 내지 아미노산 약 137의 잠재적인 N-글리코실화 부위, 아미노산 약 92 내지 아미노산 약 119의, 조직 인자 단백질과 동족성을 갖는 아미노산 서열 블록, 및 아미노산 약 232 내지 아미노산 약 262의, 인테그린 알파 쇄 단백질과 동족성을 갖는 아미노산 서열 블록. DNA57033 (서열 143)을 포함하는 cDNA 클론을 1998년 5월 27일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209905를 배정받았다.

AB.인간 PRO1007 (UNQ491)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 인간의 간 조직 (라이브러리 341로부터의 클론 83012)으로부터 유도된, 머크 EST T70513으로 지칭되는, EST 서열을 확인하였고 이를 더욱 조사하였다. 상응하는 전장 클론을 더욱 조사하고 서열분석하여, 전장 DNA 서열 DNA57690 (도 55, 서열 145) 및 이로부터 유도된 PRO1007 천연 서열 단백질 UNQ491 (도 56, 서열 146)을 단리했다.

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA57690 (서열 145)은 뉴클레오티드 위치 16-18에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1054-1056의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 55). 예측되는 PRO1007 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ491, 서열 146)는 아미노산 346 개 길이이며 (도 56), 계산된 분자량은 35,971 달톤이고, pI는 8.17이다. 도 56에 나타낸 UNQ491 (서열 146) 단백질의 추정 분자량은 약 35971 달톤이고, pI는 약 8.17이다. DNA57690 (서열 145)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 6월 9일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209950를 배정받았다.

UNQ491 (서열 146)의 아미노산 서열을 분석하여 아미노산 잔기 약 1-30에 추정상의 신호 펩티드가 존재하고, 아미노산 잔기 약 325-346에 막횡단 도메인이 존재하고, 아미노산 잔기 약 118, 129, 163, 176, 183 및 227에 N-글리코실화 부위가 존재하며, 아미노산 잔기 약 17-36 및 209-222에 Ly-6/u-Par 도메인 단백질이 존재함을 밝혀냈다. 본원에서 제공된 아미노산들의 상응하는 뉴클레오티드는 본원에서 제공된 서열에 따라 일반적으로 결정될 수 있다.

AC.인간 PRO1184 (UNQ598)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재한 신호 알고리즘 방법을 사용하여 회장 조직 라이브러리 (39, SINTBST01)로부터 유도된 인사이트 EST 1428374를 확인하였다. 이 서열에 상응하는 전장 클론을 추가로 조사하여 전장 DNA59220 (도 57, 서열 147) 및 이로부터 유도된 PRO1184 천연 서열 단백질 UNQ598 (도 58, 서열 148)을 단리하였다.

도 58에 나타낸 바와 같이, UNQ598 (서열 148)은 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼 뉴클레오티드 위치 106-108에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 532-534의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO1184 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ598, 서열 148)는 아미노산 142 개 길이이며, 계산된 분자량은 대략 15690 달톤이고 추정된 pI는 대략 9.64이다. UNQ598 (서열 148)을 분석하여 아미노산 약 1-38에 신호 펩티드가 존재함을 입증하였다. DNA59220 (서열 147)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 6월 9일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209962를 배정받았다. 기탁된 클론은 실제 서열을 가지며, 이에 관한 대표적인 것을 본원에 제시하였다.

AD.인간 PRO1031 (UNQ516)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 EST 서열 머크 W74558 (클론 344649)을 단리했다. 상응하는 전장 클론을 조사하고 서열분석하여 전장 DNA 서열 DNA59294 (도 59, 서열 149) 및 이로부터 유도된 PRO1031 천연 서열 단백질 UNQ516 (도 60, 서열 150)의 DNA 서열을 단리하였다.

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA59294 (서열 149)는 뉴클레오티드 위치 42-44에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 582-584 (도 59)의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO1031 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ516, 서열 150)는 아미노산 180 개 길이이다 (도 60). 도 60에 나타낸 UNQ516 단백질의 추정 분자량은 약 20437이고 pI는 약 9.58이다. 클론 DNA59294 (서열 149)를 1998년 5월 14일에 ATCC에 기탁하여, 기탁번호 209866를 배정받았다. 상기 서열과 관련해서, 기탁된 클론은 올바른 서열을 포함하며, 본원에 주어진 서열은 공지된 서열분석 기술을 기초로 하고 있음이 이해된다.

UNQ516 (서열 150)의 아미노산 서열분석으로 아미노산 잔기 약 1-20에 추정상의 신호 펩티드가 있고, 아미노산 잔기 약 75에 N-글리코실화 부위가 있음을 밝혀냈다. IL-17과 서열 동일성을 갖는 영역은 아미노산 잔기 약 96-180에 있다. 상응하는 뉴클레오티드는 본원에서 제공된 서열에 따라 일반적으로 결정될 수 있다.

AE.인간 PRO1346 (UNQ701)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 신장 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 전장 DNA 서열 DNA59776 (도 61, 서열 151) 및 이로부터 유도된 PRO1346 천연 서열 단백질 UNQ701 (도 62, 서열 152)을 단리했다.

DNA59776 (서열 151)의 단리에 사용한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머 (45668.f1): 5'-CACACGTCCAACCTCAATGGGCAG-3' (서열 153)

역방향 PCR 프라이머 (45668.r1): 5'-GACCAGCAGGGCCAAGGACAAGG-3' (서열 154)

혼성화 프로브 (45668.p1): (서열 155)

5'-GTTCTCTGAGATGAAGATCCGGCCGGTCCGGGAGTACCGCTTAG-3'

클론 DNA59776 (서열 151)은 뉴클레오티드 위치 1-3 (ATG)에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1384-1386의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO1346 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ701, 서열 152)는 아미노산 461 개 길이이다. 상기 단백질은 아미노산 위치 약 31 내지 약 50에 분명한 II형-막횡단 도메인을 포함하고, 아미노산 위치 약 409-421에 피브리노겐 베타 및 감마 쇄 C-말단 도메인 시그너쳐를 포함하며, 아미노산 위치 약 140-161, 147-168, 154-175 및 161-182에 루이신 지퍼 패턴을 포함한다.

DNA59776-1600로 지칭되는 DNA59776를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 8월 18일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203128을 배정받았다. 도 62에 나타낸 UNQ701 (서열 152) 단백질의 추정 분자량은 약 50744 달톤이고, pI는 약 6.38이다.

AF.인간 PRO1155 (UNQ585)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재한 신호 알고리즘 방법을 사용하여 회장 조직 라이브러리 (39,SININOT03)로부터 유도된 인사이트 EST 2858870를 확인하였다. 이 서열에 상응하는 전장 클론을 추가로 조사하여 전장 DNA 서열 DNA59849 (도 63, 서열 156) 및 이로부터 유도된 PRO1155 천연 서열 단백질 UNQ585 (도 64, 서열 157)를 단리하였다.

도 64에 나타낸 UNQ585 (서열 157) 폴리펩티드는 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼 뉴클레오티드 위치 158-160에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 563-565의 정지 코돈 (TAA)에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO1155 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ585, 서열 157)는 아미노산 135 개 길이이며, 신호 펩티드는 아미노산 잔기 약 1 내지 약 18에서 나타나고, 루이신 지퍼 패턴은 아미노산 잔기 약 43 내지 64에서 나타나며, 태치키닌 족 (tachykinin family) 시그너쳐는 아미노산 잔기 약 86 내지 약 91에서 나타난다. UNQ585 (서열 157)의 계산된 분자량은 대략 14833 달톤이고 추정된 pI는 대략 9.78이다. DNA59849-1504로 지칭되는 DNA59849 (서열 156)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 6월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209986를 배정받았다.

AG.인간 PRO1250 (UNQ633)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재한 신호 알고리즘 방법을 사용하여 인사이트 EST 클러스터 서열 56523으로 지칭되는, 인사이트 데이타베이스로부터의 EST 클러스터 서열을 확인했다. 그 다음, 상기 신호 알고리즘 방법에 대해 기재한 바처럼, 이 서열을 여러가지 각종 EST 데이타베이스와 비교하여 인사이트 EST 3371784를 추가로 확인하였다. 이 EST 서열에 상응하는 전장 클론을 추가로 조사하고 서열분석하여 전장 DNA 서열 DNA60775 (도 65, 서열 158) 및 이로부터 유도된 PRO1250 천연 서열 단백질 UNQ633(도 66, 서열 159)을 단리하였다.

클론 DNA60775 (서열 158)는 뉴클레오티드 위치 74-76에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 2291-2293의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 65). 예측되는 PRO1250 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ633, 서열 159)는 아미노산 739 개 길이이다 (도 66). 도 66에 나타낸 UNQ633 (서열 159) 단백질의 추정 분자량은 약 82,263 달톤이고, pI는 약 7.55이다. UNQ633 (서열 159)를 분석하여 다음이 존재함을 입증했다: 아미노산 잔기 약 61 내지 약 80의 II형-막횡단 도메인, 아미노산 잔기 약 314 내지 약 325의 추정상의 AMP-결합 도메인 시그너쳐 서열, 및 아미노산 잔기 약 102 내지 약 105, 아미노산 잔기 약 588 내지 약 591 및 아미노산 잔기 약 619 내지 약 622의 잠재적인 N-글리코실화 부위. DNA60775 (서열 158)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 9월 1일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203173를 배정받았다.

AH.인간 PRO1312 (UNQ678)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

효모 스크리닝법을 사용하여 인간 태아의 신장 cDNA 라이브러리에서 바람직하게는 1 차 cDNA 클론의 5' 말단을 나타내는 EST (DNA55773)를 확인했다. DNA55773 서열을 기초로, 올리고뉴클레오티드를 합성하여 전장 DNA 서열 DNA61873 (도 67, 서열 160) 및 이로부터 유도된 PRO1312 천연 서열 UNQ678 (서열 161)을 단리하기 위한 프로브로 사용했다. .

도 67 (서열 160)에 나타낸 전장 DNA61873 클론은 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼 뉴클레오티드 위치 약 7-9에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 약 643-645의 정지 코돈 (TGA)에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO1312 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ678, 서열 161)는 아미노산 212 개 길이이다. UNQ678 (서열 161)의 계산된 분자량은 대략 24,024 달톤이고 추정된 pI는 대략 6.26이다. 다른 특징들로는 아미노산 약 1-14의 신호 펩티드, 아미노산 약 141-160의 막횡단 도메인, 및 아미노산 약 76-79 및 93-96의 잠재적인 N-글리코실화 부위 등이 있다. DNA61873-1574으로 지칭되는 DNA61873 (서열 160)를 포함하는 클론을 1998년 8월 18일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 203132를 배정받았다.

AI.인간 PRO1192 (UNQ606)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 폐 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 전장 DNA 서열 DNA62814 (도 69, 서열 162) 및 이로부터 유도된 PRO1192 천연 서열 단백질 UNQ606 (도 70, 서열 163)을 단리했다.

DNA62814 (서열 162)의 단리에 사용한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머 (35924.f1): 5'-CCGAGGCCATCTAGAGGCCAGAGC-3' (서열 164)

역방향 PCR 프라이머 (35924.r1): 5'-ACAGGCAGAGCCAATGGCCAGAGC-3' (서열 165).

혼성화 프로브 (35924.p1): (서열 166).

5'-GAGAGGACTGCGGGAGTTTGGGACCTTTGTGCAGACGTGCTCATG-3'

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA62814 (도 69, 서열 162)는 뉴클레오티드 위치 121-123에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 766-768의 정지 코돈 (TAA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는PRO1192 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ606, 서열 163)는 아미노산 215 개 길이이다. 도 70에 나타낸 UNQ606 (서열 163) 폴리펩티드 전구체는 아미노산 약 1-21의 신호 펩티드, 아미노산 약 153-176의 막횡단 도메인, 아미노산 약 39-42 및 118-121의 잠재적인 N-글리코실화 부위, 및 아미노산 약 27-68 및 99-128의 마이엘린 (myelin) P0 단백질과의 동족성 부위를 포함한다. 도 70에 나타낸 UNQ606 (서열 163)의 추정 분자량은 약 24,484 달톤이고, pI는 약 6.98이다.

DNA62814-1521로 지칭되는 DNA62814 (서열 162)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 8월 4일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203093를 배정받았다.

AJ.인간 PRO1246 (UNQ630)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재한 신호 알고리즘 방법을 사용하여 인사이트 EST 클러스터 서열 56853으로 지칭되는, 인사이트 데이타베이스로부터의 EST 클러스터 서열을 확인했다. 그 다음, 상기 신호 알고리즘 방법에 대해 기재한 바처럼, 이 서열을 여러가지 각종 EST 데이타베이스와 비교하여 인사이트 EST 2481345를 추가로 확인하였다. 이 EST 서열에 상응하는 전장 클론을 추가로 조사하고 서열분석하여 전장 DNA 서열 DNA64885 (도 71, 서열 167) 및 이로부터 유도된 PRO1246 천연 서열 단백질 UNQ630 (도 72, 서열 168)을 단리하였다.

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA64885 (서열 167)는 뉴클레오티드 위치 119-121에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1727-1729의 정지 코돈 (TGA)에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 71). 예측되는 PRO1246 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ630, 서열 168)는 아미노산 536 개 길이이며,추정 분자량은 약 61,450 달톤이고, pI는 약 9.17이다 (도 72). UNQ630 (도 72, 서열 168)를 분석하여 다음이 존재함을 밝혀냈다: 아미노산 약 1 내지 아미노산 약 15의 신호 펩티드, 아미노산 약 108 내지 아미노산 약 111, 아미노산 약 166 내지 아미노산 약 169, 아미노산 약 193 내지 아미노산 약 196, 아미노산 약 262 내지 아미노산 약 265, 아미노산 약 375 내지 아미노산 약 378, 아미노산 약 413 내지 아미노산 약 416 및 아미노산 약 498 내지 아미노산 약 501의 잠재적인 N-글리코실화 부위, 및 아미노산 약 286 내지 아미노산 약 315, 아미노산 약 359 내지 아미노산 약 369 및 아미노산 약 78 내지 아미노산 약 97의, 술파타제 단백질에 동족성을 갖는 아미노산 서열 블록. DNA64885-1529로 지칭되는, DNA64885 (서열 167)를 포함하는 cDNA를 1998년 11월 3일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203457를 배정받았다.

AK.인간 PRO1283 (UNQ653)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 유방암 조직 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 전장 DNA 서열 DNA65404 (도 73, 서열 169) 및 이로부터 유도된 PRO1283 천연 서열 단백질 UNQ653 (도 74, 서열 170)을 단리했다.

DNA65404 (서열 169)의 단리에 사용한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머 (28753.f1):

5'-GGAGATGAAGACCCTGTTCCTG-3' (서열 171)

전방향 PCR 프라이머 (28753.f11):

5'-GGAGATGAAGACCCTGTTCCTGGGTG-3' (서열 172)

역방향 PCR 프라이머 (28753.r1):

5'-GTCCTCCGGAAAGTCCTTATC-3' (서열 173)

역방향 PCR 프라이머 (28753.r11):

5'-GCCTAGTGTTCGGGAACGCAGCTTC-3' (서열 174)

혼성화 프로브 (28753.p1): (서열 175)

5'-CAGGGACCTGGTACGTGAAGGCCATGGTGGTCGATAAGGACTTTCCGGAG-3'

혼성화 프로브 (28753.p11): (서열 176)

5'-CTGTCCTTCACCCTGGAGGAGGAGGATATCACAGGGACCTGGTAC-3'

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA65404 (서열 169)는 뉴클레오티드 위치 45-47에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 555-557 (도 73)의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO1283 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ653, 서열 170)는 아미노산 170 개 길이이다 (도 74). 도 74에 나타낸 UNQ653 (서열 170) 단백질의 추정 분자량은 약 19,457 달톤이고, pI는 약 9.10이다. UNQ653 (서열 170)을 분석하여 다음의 존재를 입증하였다: 아미노산 약 1 내지 아미노산 약 17의 신호 펩티드. DNA65404-1551로 지칭되는, DNA65404 (서열 169)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 9월 9일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203244를 배정받았다.

AL.인간 PRO1195 (UNQ608)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재한 신호 알고리즘 방법을 사용하여 인사이트 데이타베이스로부터의EST 클러스터 서열 32204를 확인하였다. 그 다음, 상기 신호 알고리즘 방법에 대해 기재한 바처럼, 이 서열을 여러가지 각종 EST 데이타베이스와 비교하여 인사이트 EST352980를 추가로 확인하였다. 이 EST 서열에 상응하는 전장 클론을 추가로 조사하고 서열분석하여 전장 DNA 서열 DNA65412 (도 75, 서열 177) 및 이로부터 유도된 PRO1195 천연 서열 단백질 UNQ608 (도 76, 서열 178)을 단리하였다.

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 전장 클론 DNA65412 (서열 177)는 뉴클레오티드 위치 58-60에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 511-513 (도 75)의 정지 코돈 (TAG)에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO1195 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ608, 도 76, 서열 178)는 아미노산 151 개 길이이며, 계산된 분자량은 17,227 달톤이고, pI는 5.33이다. UNQ608 (서열 178)를 분석하여 아미노산 약 1-22에 신호 서열이 있으며, 계산된 분자량은 대략 17277 달톤이고 추정된 pI는 대략 5.33임을 밝혀냈다. DNA65412-1523라고 지칭되는, DNA65412 (서열 177)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 8월 4일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203094를 배정받았다.

AM.인간 PRO1343 (UNQ698)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 평활근 세포 조직으로부터 단리한 조직에 관해, 상기 기재한 아밀라제 효모 스크리닝 방법을 사용하여 하기의 올리고뉴클레오티드 생성의 주형으로 기능하는 EST 서열을 찾아, 인간 평활근 세포 조직 라이브러리에서 상기 기재한 바처럼 스크리닝하여 전장 DNA 서열 DNA66675 (도 77, 서열 179) 및 이로부터 유도된 PRO1343 천연 서열 단백질 UNQ698 (도 78, 서열 180)을 단리했다.

사용한 올리고뉴클레오티드 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머(48921.f1) 5'-CAATATGCATCTTGCACGTCTGG-3' (서열 181)

역방향 PCR 프라이머(48921.r1) 5'-AAGCTTCTCTGCTTCCTTTCCTGC-3' (서열 182)

혼성화 프로브(48921.p1)

5'-TGACCCCATTGAGAAGGTCATTGAAGGGATCAACCGAGGGCTG-3' (서열 183)

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 전장 클론 DNA66675 (서열 179)는 뉴클레오티드 위치 71-73에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 812-814의 정지 코돈 (TAA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 77). 예측되는 PRO1343 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ698, 서열 180, 도 78)는 아미노산 247 개 길이이며, 계산된 분자량은 대략 25,335 달톤이고 추정된 pI는 대략 7.0이다. 도 78 (서열 180)에 나타낸 UNQ698 서열을 분석하여 다음이 존재함을 입증했다: 아미노산 약 1 내지 아미노산 약 25의 신호 펩티드 및 아미노산 약 35 내지 아미노산 약 225의 서컴스포로조이트 (circumsporozoite) 반복부와의 동족성 영역. DNA66675-1587라고 지칭되는 DNA66675 (서열 179)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 9월 22일에 ATCC에 기탁하고 ATCC 기탁번호 203282를 배정받았다.

또한, 상기 아밀라제 스크리닝으로 단리한 효모 EST 서열을 공공 및 민간 모두의 여러가지 EST 데이타베이스 (예를 들면, 상기 ECD 동족성 방법 참조)에 대해 스크리닝하여 인사이트 EST 클론 4701148을 확인하였다. 상응하는 전장 클론을 추가로 분석하고 서열분석하여 도 77에 나타낸 DNA66675 서열 (서열 179)을 단리하였다.

AN.인간 PRO1418 (UNQ732)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재한 신호 알고리즘 방법을 사용하여 EST 클러스터 서열 10698 (인사이트 클러스터 121480)을 확인하였다. 그 다음, 상기 신호 알고리즘 방법에 대해 기재한 바처럼, 이 서열을 여러가지 각종 EST 데이타베이스 (태반 조직 라이브러리에서 유도된 것 포함)와 비교하여 인사이트 EST1306026을 추가로 확인하였다. 이 EST 서열에 상응하는 전장 클론을 추가로 조사하고 서열분석하여 전장 DNA 서열 DNA68864 (도 79, 서열 184) 및 이로부터 유도된 PRO1418 천연 서열 단백질 UNQ732 (도 80, 서열 185)을 단리하였다.

도 79에 나타낸 전장 클론 (DNA68864, 서열 184)은 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼 뉴클레오티드 위치 138-140에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1188-1190의 정지 코돈 (TAA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO1418 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ732, 서열 185)는 아미노산 350 개 길이이고, 아미노산 약 1-19에 신호 펩티드가 존재하며, 계산된 분자량은 대략 39003 달톤이고 추정된 pI는 대략 5.59이다. DNA68864-1629로 지칭되는 DNA68864 (서열 184)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 9월 22일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203276를 배정받았다.

AO.인간 PRO1387 (UNQ722)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재한 신호 알고리즘 방법을 사용하여 EST 클러스터 서열 10298을 확인하였다. 그 다음, 상기 신호 알고리즘 방법에 대해 기재한 바처럼, 이 서열을 여러가지 각종 EST 데이타베이스와 비교하여 인사이트 EST3507924를 추가로 확인하였다. 이 EST 서열에 상응하는 전장 클론을 추가로 조사하고 서열분석하여 전장 DNA 서열 DNA68872 (도 81, 서열 186) 및 이로부터 유도된 PRO1387 천연 서열 단백질 UNQ722 (도 82, 서열 187)를 단리하였다.

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA68872 (서열 186)는 뉴클레오티드 위치 76-78에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1258-1260의 정지 코돈 (TAA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 81). 예측되는 PRO1387 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ722, 서열 187)는 아미노산 394 개 길이이다. 도 82에 나타낸 UNQ722 (서열 187)의 추정 분자량은 약 44,339 달톤이고, pI는 약 7.10이다. 또한, UNQ722 (서열 187)는 아미노산 잔기 약 1 내지 잔기 약 19에 신호 펩티드를 포함하고, 잔기 약 275 내지 잔기 약 296에 막횡단 도메인을 포함하고, 잔기 약 76, 231, 302, 307 및 376에 잠재적인 N-글리코실화 부위를 포함하며, 아미노산 잔기 약 210 내지 잔기 약 239 및 아미노산 잔기 약 92 내지 잔기 약 121에 마이엘린 p0 단백질과 동족성을 갖는 아미노산 서열 블록을 포함한다. DNA68872-1620로 지칭되는 DNA68872를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 8월 25일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203160를 배정받았다.

AP.인간 PRO1410 (UNQ728)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재한 신호 알고리즘 방법을 사용하여 EST 클러스터 서열 98502를 확인하였다. 그 다음, 상기 신호 알고리즘 방법에 대해 기재한 바처럼, 이 서열을 여러가지 각종 EST 데이타베이스와 비교하여 인사이트 EST1257046을 추가로 확인하였다. 이 EST 서열에 상응하는 전장 클론을 추가로 조사하고 서열분석하여 전장DNA 서열 DNA68874 (도 83, 서열 188) 및 이로부터 유도된 PRO1387 천연 서열 단백질 UNQ728 (도 84, 서열 189)을 단리하였다.

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA68874 (서열 188)는 뉴클레오티드 위치 152-154에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 866-868 (도 83)의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO1410 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ728, 서열 189)는 아미노산 238 개 길이이다 (도 84). 도 84에 나타낸 UNQ728 단백질 (서열 189)의 추정 분자량은 약 25,262 달톤이고, pI는 약 6.44이며, 아미노산 잔기 약 1 내지 잔기 약 20에 신호 펩티드가 있고, 아미노산 잔기 약 194 내지 잔기 약 220에 막횡단 도메인이 있으며, 아미노산 잔기 약 132에 잠재적인 N-글리코실화 부위가 있다. DNA68874 (서열 188)를 포함하는 클론을 1998년 9월 22일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203277를 배정받았다.

AQ.인간 PRO1917 (UNQ900)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재한 신호 알고리즘 방법을 사용하여 EST 클러스터 서열 85496을 확인하였다. 그 다음, 상기 신호 알고리즘 방법에 대해 기재한 바처럼, 이 서열을 여러가지 각종 EST 데이타베이스와 비교하여 인사이트 EST3255033을 추가로 확인하였다. 이 EST 서열은 자궁암 라이브러리로부터 유도된 것이었다. 이 EST 서열에 상응하는 전장 클론을 추가로 조사하고 서열분석하여 전장 DNA 서열 DNA76400 (도 85, 서열 190) 및 이로부터 유도된 PRO1917 천연 서열 단백질 UNQ900 (도 86, 서열 191)을 단리하였다.

도 85에 나타낸 전장 클론 DNA76400 (서열 190)은 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼 뉴클레오티드 위치 6 내지 9에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1467 내지 1469의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO1917 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ900, 서열 191)는 아미노산 487 개 길이이다. UNQ900 (서열 191)계산된 분자량은 대략 55,051 달톤이고 추정된 pI는 대략 8.14이다. 추가의 특징은 다음을 포함한다: 아미노산 잔기 약 1-30의 신호 펩티드; 아미노산 잔기 약 242 및 481의 잠재적인 N-글리코실화 부위, 아미노산 잔기 약 95-97, 182-184, 및 427-429의 단백질 키나제 C 인산화 부위; 아미노산 잔기 약 107-112, 113-118, 117-122, 118-123, 및 128-133의 N-미리스토일화 부위; 및 아미노산 잔기 약 484-487의 소포체 표적 서열.

AR.인간 PRO1868 (UNQ859)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 폐 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 EST 클론 2994689를 확인했다. 상응하는 전장 클론을 추가로 조사하고 서열분석하여 DNA77624 (도 87, 서열 192) 및 이로부터 유도된 PRO1868 천연 서열 단백질 UNQ859 (도 88, 서열 193)을 단리하였다.

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA77624 (도 88, 서열 193)는 뉴클레오티드 위치 51-53에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 981-983의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO1868 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ859, 서열 193, 도 89)는 아미노산 310 개 길이이다. 도 89에 나타낸 UNQ859 (서열 193) 단백질의 추정 분자량은 약 35,020 달톤이고, pI는 약 7.90이며, 아미노산 잔기 약 243 내지 잔기 약 263에 막횡단 도메인, 아미노산 잔기 약 104 및 192에 잠재적인 N-글리코실화 부위, 아미노산 잔기 약 107 내지 잔기 약 110에 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 인산화 부위, 아미노산 잔기 약 106 내지 잔기 약 109 및 아미노산 잔기 약 296 내지 잔기 약 299에 카제인 키나제 II 인산화 부위, 아미노산 잔기 약 69 내지 잔기 약 77에 티로신 키나제 인산화 부위, 및 아미노산 잔기 약 26 내지 잔기 약 31, 잔기 약 215 내지 잔기 약 220, 잔기 약 226 내지 잔기 약 231, 잔기 약 243 내지 잔기 약 248, 잔기 약 244 내지 잔기 약 249 및 잔기 약 262 내지 잔기 약 267에 잠재적인 N-미리스톨화 부위가 있다. DNA77624 (서열 193)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 12월 22일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203553를 배정받았다.

AS.인간 PRO205 (UNQ179)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 인간의 망막 라이브러리로부터 유도된 ECD 서열을 확인했다. 시험관내 클로닝 방법을 사용하여 전장 클론을 확인하기 위해 더 노력했지만, DNA 서열을 코딩하는 다른 PRO205는 확인할 수 없었다.

도 90의 UNQ179 (서열 229) 폴리펩티드에 실질적 동족성을 갖는 다른 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 젠뱅크 제출번호 AB033089_1 및 HSM802147_1로 확인될 수 있었다.

도 89에 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA30868 (서열 89)은 뉴클레오티드 위치 405-407에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 불완전한 오픈 리딩 프레임이라고 여겨지는 것을 포함한다. 예측되는 부분 길이 PRO1868 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ179, 서열 229)는 아미노산 343 개 길이이며, 계산된 분자량은 39285 달톤이고, pI는 6.06이다.

도 90에 나타낸 UNQ179 (서열 229)를 분석하여 아미노산 잔기 약 1 내지 20에 신호 펩티드가 있고, 아미노산 잔기 약 318-322에 N-글리코실화 부위가 있으며, 아미노산 잔기 약 21-29 및 211-220에 티로신 키나제 인산화 부위가 있고, 잔기 약 63-69, 83-89 및 317-323에 N-미리스톨화 부위가 있고, 잔기 약 260-271에 원핵생물 막 지단백질 지질 부착 부위가 있음을 밝혀냈다. DNA30868 (서열 228)를 포함하는 DNA30868-1156라고 지칭되는 cDNA 클론을 2000년 3월 2일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 ---------를 배정받았다.

AT.뮤린 PRO21 (UNQ21)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

천연 서열 PRO21 폴리펩티드 UNQ21 (도 92, 서열 231)를 코딩하는 DNA36638 (도 91, 서열 230)의 단리 방법은 미국 특허 제5,955,420호에 보고된 바 있다. 그 밖의 클로닝 및 특성화 정보는 문헌 (Schneider et al., Cell54(6): 787-93 (1988) 및 Manfioletti et al., Mol Cell Biol.13(8): 4976-85 (1993))에서 찾을 수 있다.

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA36638은 뉴클레오티드 잔기 168-170에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 잔기 2187-2189의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 91). 예측되는 PRO21 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ21, 서열 231)는 아미노산 673 개 길이이며, 계산된 분자량은 74,512 달톤이고, pI는 5.45이다. DNA36638-1056라고 지칭되는, DNA36638를 포함하는 cDNA 클론을 1997년 11월 12일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209456를 배정받았다.

도 92 (서열 231)의 UNQ21 폴리펩티드를 분석하여 아미노산 잔기 약 1-27에 신호서열이 있고, 아미노산 잔기 약 619-635에 막횡단 도메인이 있으며, 잔기 약 417-421 및 488-492에 N-글리코실화 부위가 있고, 아미노산 잔기 약 126-132, 135-141, 146-152, 173-179, 214-220, 253-259, 346-352, 374-380, 440-446, 479-485, 497-503, 517-523, 612-618에 N-미리스톨화 부위가 있고, 약 130-142, 168-180, 209-221 및 248-260에 아스파르트산 및 아스파라긴 히드록실화 부위 아미노산 잔기가 있고, 아미노산 잔기 약 139-151에 비타민 K-의존성 카르복실화 도메인 및 EGF-유사 도메인 시스테인 패턴 시그너쳐가 있음을 밝혀냈다.

AU.인간 PRO269 (UNQ236)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 신장 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법 및 하기의 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 사용하는 시험관내 클로닝 방법을 이용하여 전장 DNA 서열 DNA38260 (도 93, 서열 232) 및 이로부터 유도된 PRO269 천연 서열 단백질 UNQ236 (도 94, 서열 233)을 확인했다.

사용한 전방향 및 역방향 PCR 프라이머 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머(.f1): (서열 234)

5'-TGGAAGGAGATGCGATGCCACCTG -3'

전방향 PCR 프라이머(.f2): (서열 235)

5'-TGACCAGTGGGGAAGGACAG-3'

전방향 PCR 프라이머(.f3): (서열 236)

5'-ACAGAGCAGAGGGTGCCTTG-3'

역방향 PCR 프라이머(.r1): (서열 237)

5'-TCAGGGACAAGTGGTGTCTCTCCC-3'

역방향 PCR 프라이머(.r2): (서열 238)

5'-TCAGGGAAGGAGTGTGCAGTTCTG-3'

혼성화 프로브: (서열 239)

5'-ACAGCTCCCGATCTCAGTTACTTGCATCGCGGACGAAATCGGCGCTCGCT-3'

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA38260 (서열 232)은 뉴클레오티드 위치 314-316에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1784-1786의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 93). 예측되는 PRO269 폴리펩티드 전구체는 아미노산 490 개 길이이고 (즉, UNQ236, 도 94, 서열 233), 계산된 분자량은 51,636 달톤이며, pI는 6.29이다. DNA38260 (서열 232)를 포함하는 cDNA 클론을 1997년 10월 17일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209397를 배정받았다.

도 94 (서열 223)의 UNQ236 폴리펩티드를 분석하여 아미노산 잔기 약 1-16에 신호 서열이 있고, 잔기 약 399-418에 막횡단 도메인이 있으며, 아미노산 잔기 약 189-193 및 381-385에 N-글리코실화 부위가 있고, 아미노산 잔기 약 289-293에 글리코사미노클리칸 부착 부위가 있고, 아미노산 잔기 약 98-102 및 434-438에 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 인산화 부위가 있고, 아미노산 잔기 약 30-36, 35-41, 58-64, 59-65, 121-127, 151-157, 185-191, 209-215, 267-273, 350-356, 374-380, 453-459, 463-469 및 477-483에 N-미리스톨화 부위가 있으며, 아미노산 잔기 약 262-274에 아스파르트산 및 아스파라긴 히드록실화 부위가 있음을 밝혀냈다.

AV.인간 PRO344 (UNQ303)를 코딩하는 cDNA의 단리

인간 태아의 신장 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법 및 하기의 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 사용하는 시험관내 클로닝 방법을 이용하여 전장 DNA 서열 DNA40592 (도 95, 서열 240) 및 이로부터 유도된 PRO344 천연 서열 단백질 UNQ303 (도 96, 서열 241)을 확인했다.

사용한 전방향 및 역방향 PCR 프라이머 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:전방향 PCR 프라이머(34398.f1): (서열 242)

5'-TACAGGCCCAGTCAGGACCAGGGG-3'

전방향 PCR 프라이머(34398.f2): (서열 243)

5'-AGCCAGCCTCGCTCTCGG-3'

전방향 PCR 프라이머(34398.f3): (서열 244)

5'-GTCTGCGATCAGGTCTGG-3'

역방향 PCR 프라이머(34398.r1): (서열 245)

5'-GAAAGAGGCAATGGATTCGC-3'

역방향 PCR 프라이머(34398.r2): (서열 246)

5'-GACTTACACTTGCCAGCACAGCAC-3'

혼성화 프로브(34398.p1): (서열 247)

5'-GGAGCACCACCAACTGGAGGGTCCGGAGTAGCGAGCGCCCCGAAG-3'

클론 DNA40592 (서열 240)는 뉴클레오티드 위치 227-229에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 956-958의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 95). 예측되는 PRO344 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ303, 서열 241)는 아미노산 243 개 길이이며 (도 96), 계산된 분자량은 25,298 달톤이고, pI는 6.44이다. 도 96 (서열 241)의 UNQ303 폴리펩티드를 분석하여 아미노산 잔기 약 1-15에 신호 펩티드가 있고, 아미노산 잔기 약 11-17, 68-74, 및 216-222에 N-미리스톨화 부위가 있으며, 아미노산 잔기 약 77-80에 세포 부착 부위가 있음을 밝혀냈다. DNA40592 (서열 240)를 포함하는 cDNA 클론을 1997년 11월 21일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209492를 배정받았다.

AX.인간 PRO333 (UNQ294)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

ECD 동족성 방법 및 생체내 클로닝 방법을 함께 사용하여 부분 길이 서열 DNA41374 (서열 248, 도 97)를 확인하였다.

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA41374 (서열 248)는 뉴클레오티드 잔기 1185-1187에 명백한 번역 종료 부위 (즉, 정지 코돈, TGA)를 갖는 불완전한 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 부분 길이 PRO333 폴리펩티드 (즉, UNQ294, 서열 249)는 아미노산 394 개 길이이며, 계산된 분자량은 43,725 달톤이고, pI는 8.36이다.

도 98의 UNQ294 (서열 249) 폴리펩티드를 분석하여 아미노산 잔기 약 1-14에 신호 서열이 있고, 잔기 약 359-376에 막횡단 도메인이 있고, 아미노산 잔기 약166-172, 206-212, 217-223, 246-252, 308-314, 312-318, 361-367에 N-미리스토일화 부위가 있으며, 아미노산 잔기 315-323에 면역글로불린 및 주요 조직적합성 복합체 단백질 시그너쳐가 있음을 밝혀냈다. DNA41374를 포함하는 cDNA 클론을 ___________에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 ___________를 배정받았다.

AY.인간 PRO381 (UNQ322)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 신장 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 전장 DNA 서열 DNA44194 (도 99, 서열 250) 및 이로부터 유도된 PRO381 천연 서열 단백질 UNQ322 (도 100, 서열 251)을 단리했다.

사용한 전방향 및 역방향 PCR 프라이머 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머 (39651.f1): (서열 252)

5'-CTTTCCTTGCTTCAGCAACATGAGGC-3'

역방향 PCR 프라이머 (39651.r1): (서열 253)

5'-GCCCAGAGCAGGAGGAATGATGAGC-3'

혼성화 프로브 (39651.p1): (서열 254)

5'-GTGGAACGCGGTCTTGACTCTGTTCGTCACTTCTTTGATTGGGGCTTTG-3'

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA44194 (서열 250)는 뉴클레오티드 위치 174-176에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 807-809의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 99). 예측되는 PRO381 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ322, 도 100, 서열 251)는 아미노산 211 개 길이이며, 계산된 분자량은 24,172 달톤이고 pI는 5.99이다. 도 100에 나타낸UNQ322 (서열 251) 단백질은 다음의 특징을 갖는다: 아미노산 잔기 약 1 내지 약 20의 신호 펩티드, 아미노산 잔기 약 156의 잠재적인 N-글리코실화 부위, 아미노산 잔기 약 143 내지 약 146, 잔기 약 156 내지 약 159, 잔기 약 178 내지 약 181, 잔기 약 200 내지 약 203의 잠재적인 카제인 키나제 인산화 부위, 아미노산 잔기 약 78 내지 약 114 및 잔기 약 118 내지 약 131의 소포체 표적 서열, 아미노산 잔기 약 140 내지 약 159의 EF-핸드 칼슘 결합 도메인, 및 아미노산 잔기 약 183 내지 약 203의 S-100/ICaBP형-칼슘 결합 도메인. DNA44194 (서열 250)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 4월 28일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209808를 배정받았다.

AZ.뮤린 PRO720 (UNQ388)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

DNA53517 (서열 255)의 제조 방법은 상기 "X.인간 PRO770 (UNQ408)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리"에 기재되어 있다. 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA53517 (서열 255)은 뉴클레오티드 잔기 36-38에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 369-371의 정지 코돈 (TAA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 101). 예측되는 PRO720 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ388, 서열 256)는 아미노산 111 개 길이이고 (도 102), 계산된 분자량은 11,936 달톤이며, pI는 5.21이다.

도 102의 UNQ388 (서열 256) 폴리펩티드를 분석하여 신호 서열 at 아미노산 잔기 약 1-23에 신호 서열이 있고, 아미노산 약 잔기 70-76 및 75-81에 N-미리스톨화 부위가 있으며, 66-77 및 68-79에 원핵 생물 지단백질 지질 부착 부위가 있음을 밝혀냈다. DNA53517 (서열 255)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 4월 23일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209802를 배정받았다.

BA.인간 PRO866 (UNQ435)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간 태아의 신장 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 전장 DNA 서열 DNA53971 (도 103, 서열 257) 및 이로부터 유도된 PRO866 천연 서열 단백질 UNQ435 (도 104, 서열 258)을 확인했다.

사용한 전방향 및 역방향 PCR 프라이머 및 혼성화 프로브는 다음과 같았다:전방향 PCR 프라이머(44708.f1): (서열 259)

5'-CAGCACTGCCAGGGGAAGAGGG-3'

전방향 PCR 프라이머(44708.f2): (서열 260)

5'-CAGGACTCGCTACGTCCG-3'

전방향 PCR 프라이머(44708.f3): (서열 261)

5'-CAGCCCCTTCTCCTCCTTTCTCCC-3'

역방향 PCR 프라이머(44708.r1): (서열 262)

5'-GCAGTTATCAGGGACGCACTCAGCC-3'

역방향 PCR 프라이머(44706.r2): (서열 263)

5'-CCAGCGAGAGGCAGATAG-3'

역방향 PCR 프라이머(44706.r3): (서열 264)

5'-CGGTCACCGTGTCCTGCGGGATG-3'

혼성화 프로브(44708.p1): (서열 265)

5'-CAGCCCCTTCTCCTCCTTTCTCCCACGTCCTATCTGCCTCTC-3'

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA53971 (서열 257)은 뉴클레오티드 위치275-277에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1268-1270의 정지 코돈 (TAA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 103). 예측되는 천연 서열 PRO866 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ435, 서열 258)는 아미노산 331 개 길이이고 (도 104), 계산된 분자량은 35,844 달톤이며, pI는 5.45이다. 도 104에 나타낸 UNQ435 (서열 258) 단백질의 추정 분자량은 약 35,844 달톤이고, pI는 약 5.45이다. 더 분석하여 아미노산 잔기 약 1 내지 잔기 약 26에 신호 펩티드가 있고, 아미노산 잔기 약 131-135에 글리코사미노클리칸 부착 부위가 있고, 아미노산 잔기 약 144-148에 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 인산화 부위가 있으며, 아미노산 잔기 26-32, 74-80, 132-138, 134-140, 190-196, 287-293 및 290-296에 N-미리스토일화 부위가 있음을 밝혀냈다. DNA53971 (서열 257)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 4월 7일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209750을 배정받았다.

BB.인간 PRO840 (UNQ433)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간의 갑상선 라이브러리로부터 단리한 조직에 관해, 아밀라제 효모 스크리닝 방법을 사용하여 PCR 올리고뉴클레오티드 생성의 주형으로 기능하고 궁극적으로는 DNA53987 (서열 266, 도 105) 및 이로부터 유도된 PRO840 천연 서열 단백질 UNQ433 (서열 267, 도 106)를 단리하게 할 EST 서열을 얻었다.

또한, 도 106의 UNQ433 (서열 267)에 실질적인 동족성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열도 기탁번호 HEEPSSARC_1로 젠뱅크로부터 이용가능했다.

도 105에 나타낸 바와 같이, DNA53987 (서열 266)은 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼 뉴클레오티드 잔기 18-20에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 잔기 1329-1331의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 또한, 뉴클레오티드 잔기 90-92에 있는 두번째 메티오닌 코돈은 실제적인 번역 개시 부위일 수도 있고, 또는, 이것이 내부 메티오닌을 코딩하는 것일 수도 있다. 예측되는 PRO840 폴리펩티드 (즉, 보다 긴 번역체)는 UNQ433 (서열 267)이라 지칭되며 아미노산 437 개 길이이고 (도 106), 계산된 분자량은 49,851 달톤이며, pI는 6.47이다.

DNA53987 (서열 266)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 5월 12일에 ATCC 기탁번호 209858로 ATCC에 기탁했다.

도 106 (서열 267)의 UNQ433 폴리펩티드를 분석하여 아미노산 잔기 약 1-46에 신호 서열이 있고, 아미노산 잔기 약 319-338에 막횡단 도메인이 있고, 잔기 약 200-204에 N-글리코실화 부위가 있으며, 아미노산 잔기 23-27에 cAMP 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 인산화 부위가 있고, 아미노산 잔기 43-52에 티로신 키나제 인산화 부위가 있으며, 잔기 17-23, 112-118, 116-122 및 185-191에 N-미리스톨화 부위가 있음을 밝혀냈다.

BC.인간 PRO982 (UNQ483)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재된 신호 알고리즘 방법을 사용하여 EST 클러스터 서열 43715을 확인했다. 그 다음, 상기 신호 알고리즘 방법에 대해 기재한 바처럼, 이 서열을 여러가지 각종 EST 데이타베이스와 비교하여 머크 EST AA024389를 추가로 확인하였다. 이 EST에 상응하는 전장 클론으로 전장 서열 DNA57700 (도 107, 서열 268) 및이로부터 유도된 PRO982 천연 서열 단백질 UNQ483 (도 108, 서열 269)을 확인했다.

도 107의 DNA57700 서열 (서열 268)은 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼 뉴클레오티드 위치 26-28에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 401-403의 정지 코돈 (TAA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO982 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ982, 서열 191)는 아미노산 124 개 길이이고, 계산된 분자량은 대략 14,198 달톤이며 추정된 pI는 대략 9.01이다 (도 108). 도 108의 UNQ483 (서열 269) 폴리펩티드를 더욱 분석하여 아미노산 잔기 약 1 내지 약 21에 신호 펩티드가 있고, 아미노산 잔기 약 1 내지 잔기 약 59에 잠재적인 아나필라톡신 도메인이 있음을 밝혀냈다. DNA57700 (서열 268)를 포함하는 cDNA 클론을 1999년 1월 12일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203583를 배정받았다.

BD.인간 PRO836 (UNQ545)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재한 신호 알고리즘 방법을 사용하여 EST 클러스터 서열을 확인한 다음, 상기 신호 알고리즘 방법에 대해 기재한 바처럼, 이 서열을 여러가지 각종 EST 데이타베이와 비교하여 결장 종양 조직에서 유도된 EST인 인사이트 EST 2610075를 추가로 확인했다. 이 EST에 상응하는 전장 클론으로 전장 서열 DNA59620 (도 109, 서열 270) 및 이로부터 유도된 PRO836 천연 서열 단백질 UNQ545 (도 110, 서열 271)을 확인했다.

도 109에 나타낸 뉴클레오티드 서열 DNA59620 (서열 270)은 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼 뉴클레오티드 위치 65-67에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1448-1450의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을포함한다 (도 109). 예측되는 PRO836 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ545, 도 110, 서열 271)는 아미노산 461 개 길이이다. 도 110에 나타낸 UNQ545 (서열 271)의 추정 분자량은 약 52,085 달톤이고, pI는 약 5.36이다. 더 분석하여 아미노산 잔기 약 1 내지 약 29에 신호 펩티드가 있고, 아미노산 잔기 약 193 및 236에 N-글리코실화 부위가 있으며, 잔기 약 15, 19, 234, 251, 402 및 451에 N-미리스토일화 부위가 있고, 아미노산 잔기 약 364 내지 약 372에 YJL126w/YLR351c/yhcX 단백질 족에서 보존된 도메인이 있으며, 아미노산 잔기 약 68 내지 약 340에 SLS1 단백질과 서열 동일성을 갖는 영역이 있다.

DNA59620 (서열 270)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 6월 16일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209989를 배정받았다.

BE.인간 PRO1159 (UNQ589)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재한 신호 알고리즘 방법을 사용하여 EST 클러스터 서열 EST 클러스터 서열 77245를 확인한 다음, 상기 신호 알고리즘 방법에 대해 기재한 바처럼, 이 서열을 여러가지 각종 EST 데이타베이스와 비교하여 인사이트 EST 376776을 추가로 확인하였다. 이 EST 서열에 상응하는 전장 클론을 분석하여 전장 서열 DNA60627 (도 111, 서열 272) 및 이로부터 유도된 PRO1159 천연 서열 단백질 UNQ589 (도 112, 서열 273)을 확인하였다.

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA60627 (서열 272)은 뉴클레오티드 위치 92-94에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 362-364의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 111). 예측되는PRO1159 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ589, 서열 273)는 아미노산 90 개 길이이다 (도 112). 도 112에 나타낸 UNQ589 (서열 273) 단백질의 추정 분자량은 약 9,840 달톤이고, pI는 약 10.13이다.

도 112에 나타낸 UNQ589 (서열 273) 서열을 분석하여 다음의 존재를 입증했다: 아미노산 잔기 약 1 내지 잔기 약 15의 신호 펩티드, 및 아미노산 잔기 약 38의 잠재적인 N-글리코실화 부위. 클론 DNA60627 (서열 272)을 1998년 8월 4일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203092를 배정받았다.

BF.인간 PRO1358 (UNQ707)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재한 신호 알고리즘 방법을 사용하여 EST 클러스터 서열을 확인한 다음, 상기 신호 알고리즘 방법에 대해 기재한 바처럼, 이 서열을 여러가지 각종 EST 데이타베이스와 비교하여 간 조직 라이브러리로부터 유도한 단편인 인사이트 EST 088718을 추가로 확인하였다. 이 EST에 상응하는 전장 클론을 분석하여 전장 서열 DNA64890 (도 113, 서열 274) 및 이로부터 유도된 PRO1358 천연 서열 단백질 UNQ707 (도 114, 서열 275)을 확인하였다.

도 113에 나타낸 DNA64890 (서열 274) 클론은 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼 뉴클레오티드 위치 86 내지 88에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1418 내지 1420의 정지 코돈 (TAA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 113). 예측되는 PRO1358 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ707, 서열 275)는 아미노산 444 개 길이이며, 아미노산 잔기 약 1-18에 신호 펩티드가 있다. UNQ707 (서열 275)의 계산된 분자량은 대략 50719 달톤이고, 추정된 pI는 대략 8.82이다.DNA64890-1612로 지칭되는 DNA64890 (서열 274)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 8월 18일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203131를 배정받았다.

BG.인간 PRO1325 (UNQ685)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재한 신호 알고리즘 방법을 사용하여 EST 클러스터 서열 139524를 확인한 다음, 상기 신호 알고리즘 방법에 대해 기재한 바처럼, 이 서열을 여러가지 각종 EST 데이타베이스와 비교하여 인사이트 EST 3744079를 추가로 확인하였다. 이 EST에 상응하는 전장 클론을 분석하여 전장 서열 DNA66659 (도 115, 서열 276) 및 이로부터 유도된 PRO1325 천연 서열 단백질 UNQ685 (도 116, 서열 277)를 확인하였다.

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA66659 (도 115, 서열 276)는 뉴클레오티드 위치 51-53에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 2547-2549의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO1325 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ685, 서열 227)는 아미노산 832 개 길이이다. 도 116에 나타낸 UNQ685 (서열 227) 단백질의 추정 분자량은 약 94,454 달톤이고, pI는 약 6.94이다. UNQ685 (서열 227)를 더욱 분석하여 다음의 존재를 밝혀냈다: 아미노산 약 1 내지 아미노산 약 18의 신호 펩티드, 아미노산 약 292 내지 아미노산 약 317, 아미노산 약 451 내지 아미노산 약 470, 아미노산 약 501 내지 아미노산 약 520, 아미노산 약 607 내지 아미노산 약 627, 아미노산 약 751 내지 아미노산 약 770의 막횡단 도메인, 아미노산 약 497 내지 아미노산 약 518의 루이신 지퍼 패턴 서열 및 아미노산 약 27 내지 아미노산 약 30, 아미노산 약 54 내지 아미노산약 57, 아미노산 약 60 내지 아미노산 약 63, 아미노산 위치 약 123 내지 아미노산 위치 약 126, 아미노산 위치 약 141 내지 아미노산 위치 약 144, 아미노산 위치 약 165 내지 아미노산 위치 약 168, 아미노산 위치 약 364 내지 아미노산 위치 약 367, 아미노산 위치 약 476 내지 아미노산 위치 약 479, 아미노산 위치 약 496 내지 아미노산 위치 약 499, 아미노산 위치 약 572 내지 아미노산 위치 약 575, 아미노산 위치 약 603 내지 아미노산 위치 약 606, 및 아미노산 위치 약 699 내지 아미노산 위치 약 702의 잠재적인 N-글리코실화 부위. DNA66659 (서열 276)를 포함하는 cDNA 클론을 1998년 9월 22일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203269를 배정받았다.

BH.인간 PRO1338 (UNQ693)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

효모 스크리닝 방법을 사용하여 얻은 EST 서열로 ECD 동족성에 관해 상기 기술한 것과 유사한 방식으로 여러가지 공공 및 민간 EST 데이타베이스와 비교하여 담낭염 담낭 조직에서 유래한 EST인 인사이트 EST2615184를 확인하였다. 궁극적으로는, 상응하는 전장 서열을 분석하여 DNA66667 (서열 278, 도 117) 및 이로부터 유도된 PRO1338 천연 서열 단백질 UNQ693 (서열 279, 도 118)을 단리하였다.

도 117에 나타낸 바와 같이 DNA66667 (서열 278)은 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼 뉴클레오티드 잔기 약 115-117에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 2263-2265의 정지 코돈 (TAA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO1338 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ693, 서열 118)는 716 아미노산 716 개 길이이고 (도 118), 계산된 분자량은 80,716 달톤이며, pI는 6.06이다.

도 118의 UNQ693 폴리펩티드 (서열 278)를 분석하여 아미노산 잔기 약 1 내지 25에 신호 서열이 있고, 아미노산 잔기 약 629-648에 막횡단 도메인이 있고, 아미노산 잔기 약 69-73, 96-100, 106-110, 117-121, 385-389, 517-521, 582-586 및 611-615에 N-글리코실화 부위가 있고, 잔기 약 573-582에 티로신 키나제 인산화 부위가 있으며, 아미노산 잔기 약 16-22, 224-230, 464-470, 637-643 및 698-704에 N-미리스토일화 부위가 있음을 밝혀냈다.

DNA66667-1596이라 지칭되는 DNA66667 (서열 278)를 포함하는 cDNA를 1998년 9월 22일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203267을 배정받았다.

BI.인간 PRO1434 (UNQ739)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간의 망막 조직 라이브러리로부터 상기 기재된 ECD 동족성 방법을 사용하여 전장 DNA 서열 DNA68818 (도 119, 서열 280) 및 이로부터 유도된 PRO1434 천연 서열 단백질 UNQ739 (도 120, 서열 281)를 확인했다.

이 방법에 사용한 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향) 및 프로브는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머:

5'-GAGGTGTCGCTGTGAAGCCAACGG-3' (서열 282)

역방향 PCR 프라이머:

5'-CGCTCGATTCTCCATGTGCCTTCC-3' (서열 283)

혼성화 프로브: (서열 284)

5'-GACGGAGTGTGTGGACCCTGTGTACGAGCCTGATCAGTGCTGTCC-3'

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA68818 (서열 280)은 뉴클레오티드 위치 581-583에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1556-1558의 정지 코돈 (TAG)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 119). 예측되는 PRO1434 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ739, 서열 281)는 아미노산 325 개 길이이다 (도 120). 도 120에 나타낸 UNQ739 (서열 281) 단백질의 추정 분자량은 약 35,296 달톤이고, pI는 약 5.37이다. 더욱 분석하여 아미노산 잔기 약 1-27에 신호 서열이 있고, 아미노산 잔기 약 80-84에 글리코사미노클리칸 부착 부위가 있고, 아미노산 잔기 약 10-16, 102-108, 103-109에 M-미리스토일화 부위가 있으며, 아미노산 잔기 약 114-117에 세포 부착 서열이 있고, 아미노산 잔기 약 176-188에 EGF-유사 도메인 시스테인 패턴 시그너쳐가 있음을 밝혀냈다.

DNA68818-2536이라 지칭되는 DNA68818 (서열 280)를 포함하는 클론을 1999년 2월 9일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203657를 배정받았다.

BJ.인간 PRO4333 (UNQ1888)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

발현 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ (등록상표), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬)를 상기 기재한 ECD 동족성 방법과 유사한 방식으로 검색하여 림프독소-베타 수용체에 동족성을 보이는 EST를 확인했다.

EST가 올리고뉴클레오티드 프라이머 생성의 주형 및 프로브로 기능하여 ECD 동족성 방법에 대해 상기 기재한 것과 유사한 방식으로 인간 태아의 신장 라이브러리를 스크리닝하였다.

상기 방법을 위해 생성된 올리고뉴클레오티드는 다음과 같았다:

전방향 PCR 프라이머: (서열 287)

5'-GCAAGAATTCAGGGATCGGTCTGG-3'

프로브: (서열 288)

5'-CTGTGTTCCCTGCAACCAGTGTGGGCCAGGCATGG AGTTGTCTAAGG-3'

역방향: (서열 289)

5'-AGATGGCATCACTG GTGGCTGAAC-3'

전방향: (서열 290)

5'-CAGAAGGCAAATTGTTCAGCCACCAG-3'

역방향: (서열 291)

5'-ACAGTTTCCAGACCGATCCCTGAATTC-3'

그 결과 전장 DNA 서열 DNA84210 (서열 285, 도 121)을 단리했다. 도 121에 도시된 DNA84210 (서열 285) 클론은 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼 뉴클레오티드 위치 185-187에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 1436-1438의 정지 코돈 (TAA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO4333 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ1888, 서열 286)는 아미노산 417 개 길이이다. 도 121에 나타낸 UNQ1888 단백질 (서열 286)의 추정 분자량은 약 45305 달톤이고, pI는 약 5.12이다.

도 121의 UNQ1888 폴리펩티드 (서열 286)를 분석하여 아미노산 잔기 약 1-25에 신호 펩티드가 있고, 잔기 약 169-192에 막횡단 도메인이 있고, 잔기 약 105-109, 214-218, 319-323, 350-354, 368-372, 379-383에 N-글리코실화 부위가 있으며, 잔기 약 200-204 및 238-242에 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 단백질 키나제 인산화 부위가 있으며, 잔기 약 207-214에 티로신 키나제 인산화 부위가 있고, 잔기 약 55-61, 215-218 및 270-276에 N-미리스토일화 부위가 있고, 잔기 약 259-270에 원핵생물 막 지단백질 지질 부착 부위가 있고, 잔기 약 89-96에 TNFR/NGFR 족 시스테인-풍부 영역이 있음을 밝혀냈다.

DNA84210-2576로 지칭되는 DNA84210 (서열 285)를 포함하는 cDNA 클론을 1999년 3월 2일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203818을 배정받았다.

BK.인간 PRO4302 (UNQ1866)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

인간의 조직으로부터 단리한 조직에 관해, 상기 기재한 아밀라제 스크리닝 방법을 사용하여 EST 서열을 얻은 다음, 각종 EST 데이타베이스와 비교하여 아밀라제 효모 스크리닝 방법 및(또는) ECD 동족성 방법에 대해 상기 기재한 바와 같은 방법으로 컨센서스 서열을 생성했다. 이 컨센서스 서열을 추가로 분석하여 인사이트 EST 2408081H1를 확인했다. EST 2408081H1에 상응하는 전장 크론을 분석하여 전장 천연 서열 클론 DNA92218 (서열 292) 및 이로부터 유도된 PRO4302 전장 천연 서열 단백질 UNQ1866 (서열 293)을 단리했다.

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 도 123에 나타낸 전장 클론 DNA92218 (서열 292)은 뉴클레오티드 위치 174-176에 명백한 번역 개시 부위가 있고, 뉴클레오티드 위치 768-770에 정지 신호 (TAG)가 있는 단일 오픈 리딩 프레임을 갖는다. 예측되는 PRO4302 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ1866, 서열 293)는 아미노산 198 개 길이이며, 계산된 분자량은 대략 22,285 달톤이고 추정된 pI는 대략 9.35이다. UNQ1866 (도 124, 서열 293)을 분석하여 아미노산 잔기 약 1 내지 잔기 약 23에 신호 펩티드가 있고, 아미노산 잔기 약 111 내지 잔기 약 130에 막횡단 도메인이 있으며, 잔기 26-30에 cAMP 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 인산화 부위가 있고, 잔기 44-47 및 58-61에 카제인 키나제 II 인산화 부위가 있고, 잔기 36-43에 티로신 키나제 인산화 부위가 있고, 잔기 124-130, 144-150 및 189-195에 N-미리스토일화 부위가 있음을 밝혀냈다.

DNA92218-2554로 지칭되는 DNA92218 (서열 292)를 포함하는 cDNA 클론을 1999년 3월 9일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 203834를 배정받았다.

BL.인간 PRO4430 (UNQ1947)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

상기 기재한 신호 알고리즘 방법을 사용하여 EST 클러스터 서열을 확인한 다음, 상기 신호 알고리즘 방법에 대해 기재한 바처럼, 이 서열을 여러가지 각종 EST 데이타베이스와 비교하여 컨센서스 서열을 추가로 확인하였다. 컨센서스 서열을 추가로 분석하여 전장 서열 DNA96878 (도 125, 서열 294) 및 이로부터 유도된 PRO4430 천연 서열 단백질 UNQ1947 (도 126, 서열 295)을 확인했다.

도 125에 나타낸 천연 서열 DNA 서열 DNA96878 (서열 294)은 굵은 밑줄로 나타낸 것처럼 뉴클레오티드 위치 56-58에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 431-433의 정지 코돈 (TGA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO4430 폴리펩티드 전구체 (UNQ1947, 도 126, 서열 295)는 아미노산 125 개 길이이다. 도 126에 나타낸 UNQ4430 단백질 (서열 295)의 계산된분자량은 대략 13821 달톤이고 추정된 pI는 대략 8.6이다. 더욱 분석하여 아미노산 잔기 약 1 내지 약 18에 신호 서열이 있고, 잔기 약 77-80과 잔기 약 88-91에 N-글리코실화 부위가 있으며, 잔기 약 67-70에 카제인 키나제 II 인산화 부위가 있고, 잔기 약 84-89에 N-미리스토일화 부위가 있고 잔기 약 85-98에 Lys-6/u-PAR 도메인이 있음을 밝혀냈다.

DNA96878-2626으로 지칭되는 DNA96878 (서열 294)를 포함하는 클론을 1999년 5월 4일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 23-PTA를 배정받았다.

BM.인간 PRO5727 (UNQ2448)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

각종 공지된 TNF-수용체를 사용하여 공공 및 민간 EST 데이타베이스 (예를 들면, 상기 ECD 동족성 방법 참조)를 스크리닝하여 인사이트 클론 5091511H를 확인했다. 그 다음, 자궁암 조직에서 유도된 이 EST 서열은 하기 나타낸 클로닝 올리고 제조용 주형으로 기능하였고, 이를 사용하여 그 후에는 관심 서열을 포함하는 인간의 흉선 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인했다. 이 올리고뉴클레오티드는 다음과 같았다:

전방향 프라이머 (509-1):

5'-GAGGGGGCTGGGTGAGATGTG-3' (서열 298)

역방향 프라이머 (509-4AS):

5'-TGCTTTTGTACCTGCGAGGAGG-3' (서열 299)

전장 DNA98853 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 단리하기 위해서, 장거리 역 PCR (inverse long distance PCR) 방법을 수행했다 (도 129). PCR 프라이머의길이는 일반적으로 뉴클레오티드 20 내지 30 개의 범위에 있다. 장거리 역 PCR을 위해서, 프라이머 쌍들은 각 프라이머의 5' 내지 3' 방향이 서로 떨어지도록 고안되었다.

DNA98853를 클로닝하기 위한 한 쌍의 장거리 역 PCR 프라이머를 다음과 같이 합성했다:

프라이머 1 (왼쪽 프라이머) (509-P5):

5'-pCATGGTGGGAAGGCCGGTAACG-3' (서열 300)

프라이머 2 (오른쪽 프라이머) (509-P6):

5'-pGATTGCCAAGAAAATGAGTACTGGGACC-3' (서열 301)

장거리 역 PCR 반응에서, 주형은 플라스미드 cDNA 라이브러리이다. 결과적으로, PCR 산물은 가운데에 전체 벡터 서열이 있고, 양 끝에 관심있는 인서트 서열이 있게 된다. PCR 반응 후에, PCR 혼합물에 주형 플라스미드만을 절단하는 Dpn I을 처리한 후, 라이브러리 클로닝 벡터의 크기보다 큰 PCR 산물을 아가로스 겔 정제했다. 또한, 장거리 역 PCR에 사용한 프라이머도 5'-인산화되어있기 때문에, 정제된 생성물은 그 다음에 자가-라이게이션 (self-ligation)되어 대장균 감응성 세포로 형질전환된다. 5' 벡터 프라이머 및 적절한 유전자 특이성 프라이머를 사용하는 PCR로 콜로니를 스크리닝하여 더 큰 5' 서열을 갖는 클론을 확인했다. 양성 클론에서 제조한 플라스미드를 서열분석했다. 필요하다면, 상기 방법을 반복하여 앞서 실행에서 수득한 신규 서열을 기초로 보다 긴 5' 서열을 얻을 수 있다

장거리 역 PCR의 목적은 관심 유전자의 완전한 서열을 수득하는 것이다. 그다음, 통상적인 PCR로 전장 코딩 영역을 포함하는 클론을 수득하였다.

DNA98853 (서열 296)의 전장 코딩 영역을 클로닝하는 데 사용한 프라이머 쌍은 다음과 같았다:

전방향 프라이머(Cla-MD-509):

5'-GGAGGATCGATACCATGGATTGCCAAGAAAATGAG-3' (서열 302)

역방향 프라이머(509.TAA.not):

5'-GGAGGAGCGGCCGCTTAAGGGCTGGGAACTTCAAAGGGCAC-3' (서열 303)

클로닝하기 위해서, Cla I 부위 및 Not I 부위를 각각 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머에 포함시켰다.

정확한 PCR 생성물을 분명히 하기위해, 독립적인 PCR 반응들을 수행하고 여러 개의 클로닝된 생성물을 서열분석했다.

상기 기재된 바와 같이 단리된 클론들의 DNA 서열분석으로 전장 DNA 서열 for DNA98853 (서열 296, 도 127)의 전장 DNA 서열 및 이로부터 유도된 PRO5727 천연 서열 단백질 UNQ2448 (서열 297, 도 128)이 제공되었다.

굵은 밑줄로 나타낸 것처럼, 클론 DNA98853 (서열 296)은 뉴클레오티드 위치 1-3에 명백한 번역 개시 부위를 가지며, 뉴클레오티드 위치 901-903 (도 127)의 정지 코돈 (TAA)에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예측되는 PRO5727 폴리펩티드 전구체 (즉, UNQ2448, 서열 297)는 아미노산 299 개 길이이고 (도 128), 계산된 분자량은 32,929 달톤이며, pI는 4.95이다. 도 128에 나타낸 UNQ2448 폴리펩티드 (서열 297)의 추정 분자량은 약 3.3 킬로달톤이고, pI는 약4.72이다. 도 128에 나타낸 아미노산 서열의 잠재적인 N-글리코실화 부위는 아미노산 74와 77 사이에 존재한다. 도 128에 나타낸 아미노산 서열의 잠재적인 N-미리스토일화 부위는 아미노산 24와 29 사이에 존재한다. 도 128에 나타낸 아미노산 서열의 잠재적인 카제인 키나제 II 인산화 부위는 아미노산 123-126, 185-188, 200-203, 252-255, 257-260, 271-274, 및 283-286 사이에 존재한다. 도 128에 나타낸 서열의 잠재적인 막횡단 도메인은 아미노산 137 내지 158 사이에 존재한다. 상기 폴리펩티드는 신호 서열을 포함하지 않는 것으로 현재 생각된다.

DNA98853 (서열 296, DNA98853-1739로 지칭됨)을 포함하는 cDNA 클론을 1999년 4월 6일에 ATCC에 기탁하여 ATTC 기탁번호를 배정받았다.

실시예 2

혼합림프구반응 (MLR) 분석법에서의 자극 활성 (분석 24)

본 실시예에서는 본 발명의 폴리펩티드가 자극된 T-림프구 증식의 자극제로서 활성임을 나타낸다. 림프구 증식을 자극하는 화합물들은 면역 반응의 강화가 유익한 경우에 치료적으로 유용하다. 치료제는 본 발명의 폴리펩티드의 길항제 형태, 예를 들면, 상기 폴리펩티드에 대한, 뮤린-인간 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다.

본 분석을 위한 기본적인 프로토콜은 문헌 (Current 프로토콜s in Immunology, unit 3.12; edited by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Marglies, E. M. Shevach, W. Strober, National Institutes of Health, Published by John Wiley ＆ Sons, Inc.)에 기재되어 있다.

더욱 구체적으로, 한 분석 변형법에서는 말초혈 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cell) (PBMC)를 인간 지원자 등의 개별 포유동물에서 류코페레시스 (leukopheresis) (한 공여자는 자극세포 PBMC를 공급할 것이고, 다른 공여자는 반응세포 PBMC를 공급할 것임)로 단리한다. 필요하다면, 단리 후에 이 세포들을 소 태아 혈청 및 DMSO 중에 냉동시킨다. 냉동된 세포들을 분석 배지 (37 ℃, 5 ％ CO₂) 중에 밤새 해동한 다음, 세척하고 분석 배지 (RPMI; 10％ 소 태아 혈청, 1％ 페니실린/스트렙토마이신, 1％ 글루타민, 1％ HEPES, 1％ 불필수 아미노산, 1 ％ 피루브산염)에 세포 3 x 10⁶개/ml로 재현탁할 수 있다.

상기 세포를 조사(照射) (약 3000 Rads)하여 자극세포 PBMC를 제조했다. 이 분석은 1 ％ 또는 0.1 ％로 희석한 시험 샘플 100 ㎕, 조사된 자극세포 50 ㎕ 및 반응세포 PBMC 50 ㎕의 혼합물을 3 벌 웰에 플레이팅하여 준비되었다. 대조구로서 세포 배양 배지 100 ㎕ 또는 CD4-IgG 100 ㎕를 사용했다. 그 다음, 이 웰들을 37 ℃, 5％ CO₂에서 4 일 동안 인큐베이션했다. 5 일 째에 각 웰을 삼중수소화 티미딘 (1.0 mC/웰; 아머샴 (Amersham))으로 펄싱했다. 6 시간 후에, 세포를 3 회 세척한 후, 표지의 흡수량을 측정했다.

이 분석의 다른 변형법에서는 PBMC를 Balb/c 마우스 및 C57B6 마우스의 비장으로부터 단리했다. 분석 배지 (RPMI;10％ 소 태아 혈청, 1％ 페니실린/스트렙토마이신, 1％ 글루타민, 1％ HEPES, 1％ 불필수 아미노산, 1％ 피루브산염) 중에서 새로 수거된 비장으로부터 이들 세포를 떼어넣고, 이들 세포를 림포라이트 M(Lympholyte M) (오르가논 테크니카 (Organon Teknika)) 상에 올려놓고 2000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하고 단핵세포층을 수집하여 분석 배지 중에서 세척하고, 이들 세포를 분석 배지에 세포 1 x 10⁷개/ml로 재현탁시킴으로써 단리했다. 그 다음, 이 분석법을 상기 기재한 바와 같이 수행했다. 본 발명의 화합물에 대한 분석 결과를 하기에 나타냈다. 대조구에 대한 양성 증가분이 바람직하게는 180 ％ 이상 증가했을 경우, 양성으로 간주된다. 그러나, 대조구보다 값이 크다면 시험 단백질에 자극 효과가 있음을 암시한다.

실시예 3

무모(無毛) 기니피그 (Hairlesss Guinea Pig)에서의

염증전 (proinflammatory) 분석법 (분석 32)

본 분석법은 PRO 폴리펩티드가 혈관 투과성을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 고안되었다. 본 분석법에서 양성으로 시험된 폴리펩티드는 예를 들어, 국소적인 면역계 세포 침윤 강화가 유익할 수 있는 상태 등 혈관 투과성 강화가 유익할 상태에 대한 치료적 처치에 유용할 것이라 기대된다.

체중이 350 g 이상인 무모(無毛) 기니피그 (hairlesss guinea pig)를 근육내 케타민 (Ketamine) (75-80 mg/kg)과 5 mg/kg의 크실라진 (Xylazine)으로 마취시켰다. PRO 폴리펩티드를 포함하거나 시험 폴리펩티드 없는 생리 완충액을 포함하는 시험 샘플을 시험 동물의 등 피부에 주사 부위당 100 ㎕로 피내 주사했다. 동물마다의 주사 부위는 대략 16-24 군데였다. 그 다음에, 에반스 블루 (Evans blue) 염료 (PBS 중 1 ％) 1 ml을 심장내 주사했다. 시험 물질을 투여한지 1, 6 및(또는) 24 시간 후에 주사 부위로부터의 청색부 직경 (mm)을 측정하여 이 화합물에 대한 피부 혈관 투과성 (즉, 주사시 주사부위의 반점(斑点) (blemish))을 시각적으로 스코어링했다. 주사 부위에서 청색부의 직경 (mm)을 관찰하고, 동일 동물 대조구에 대한 표준 편차가 4 이상을 기록하는 값에 대한 혈관 누출의 중증도 역시 기록하였다. 이 분석에서는 정제 단백질을 시험하였을 때 반점의 직경이 5 mm 이상이면 양성으로 간주했으며, 이는 혈관 누출 또는 투과 유도력이 있음을 나타낸다. 조정 배지 샘플의 경우에는 직경이 7 mm보다 큰 반응을 양성으로 간주했다. 인간 VEGF를 양성 대조구로 사용하였고, 이는 0.1 ㎍/100 ㎕에서 직경 4-8 mm의 반응을, 1 ㎍/100 ㎕에서 직경 15-23 mm의 반응을 유도했다.

시험 폴리펩티드를 초기 스톡 용액의 1％로 희석했다. UNQ 585는 10 mM HEPES/140 mM NaCl/4 ％ 만니톨/1 mg/ml BSA (pH 6.8) 중에 희석했고, UNQ334는140 mM NaCl, 10 mM Hepes, 4 ％ 만니톨 (pH 7.4) 중에 희석했다.

실시예 4

피부 혈관 투과성 분석 (분석 64)

본 분석은 특정 PRO 폴리펩티드가 동물의 주사 부위에 단핵세포, 호산구 및 PMN 침윤을 유도함으로써 면역 반응이 자극되고 염증이 유도됨을 나타낸다. 이러한 피부 혈관 투과성 분석을 다음과 같이 수행했다. 체중이 350 g 이상인 무모 기니피그를 근육내 (IM) 케타민 (75-80 mg/Kg)과 5 mg/Kg 크실라진으로 마취시켰다. 정제된 PRO 폴리펩티드 샘플 또는 조정 배지 시험 샘플을 시험 동물의 등에 주사 부위당 100 ㎕로 피내 주사했다. 동물마다의 주사 부위는 약 10-30 군데, 바람직하게는 약 16-24 군데일 수 있다. 그 다음에, 에반스 블루 염료 (생리적 완충 염수 중 1％) 1 ml을 심장내 주사했다. 그 다음, 주사 부위에서의 반점을 주사한지 1 시간, 6 시간 및 24 시간 후에 측정했다 (직경 mm). 동물들을 주사한 지 6 시간 후에 희생시켰다. 각각의 피부 주사 부위를 생검(生檢)하고 파라포름알데히드 중에 고정시켰다. 그 다음, 조직병리 검사를 위해 상기 피부를 준비했다. 각 부위를 피부로의 염증세포 침윤에 대해 검사했다. 가시적인 염증세포 침윤이 있는 부위를 양성으로 스코어링했다. 염증세포는 호중구, 호산구, 단핵세포 또는 림프구일 수 있다.

주사 부위에 적어도 최소한의 혈관주위 침윤이 있는 경우 양성으로 스코어링했고, 주사 부위에 침윤이 전혀 없는 경우는 음성으로 스코어링했다.

실시예 5

혼합림프구반응 (MLR) 분석에서의 억제 활성 (분석 67)

본 실시예는 하나 이상의 PRO 폴리펩티드가 자극된 T-림프구의 증식 억제제로서 활성이 있음을 보여준다. 림프구의 증식을 억제하는 화합물은 면역반응의 억제가 유익한 경우에 치료상 유용하다.

본 분석법을 위한 기본적인 프로토콜은 문헌 (Current Protocols in Immunology, unit 3.12; edited by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Marglies, E. M. Shevach, W. Strober, National Institutes of Health, Published by John Wiley ＆ Sons, Inc.)에 기재되어 있다.

더욱 구체적으로, 한 분석 변형법에서는 말초혈 단핵세포 (PBMC)를 인간 지원자 등의 개별 포유동물에서 류코페레시스 (leukopheresis) (한 공여자는 자극세포 PBMC를 공급할 것이고, 다른 공여자는 반응세포 PBMC를 공급할 것임)로 단리한다. 필요하다면, 단리 후에 이 세포들을 소 태아 혈청 및 DMSO 중에 냉동시킨다. 냉동된 세포들을 분석 배지 (37 ℃, 5 ％ CO₂) 중에 밤새 해동한 다음, 세척하고 분석 배지 (RPMI; 10％ 소 태아 혈청, 1％ 페니실린/스트렙토마이신, 1％ 글루타민, 1％ HEPES, 1％ 불필수 아미노산, 1 ％ 피루브산염)에 세포 3 x 10⁶개/ml로 재현탁할 수 있다. 상기 세포를 조사(照射) (약 3000 Rads)하여 자극세포 PBMC를 제조했다.

이 분석은 1 ％ 또는 0.1 ％로 희석한 시험 샘플 100 ㎕, 조사된 자극세포 세포 50 ㎕ 및 반응세포 PBMC 세포 50 ㎕의 혼합물을 3 벌 웰에 플레이팅하여 준비되었다. 대조구로서 세포 배양 배지 100 ㎕ 또는 CD4-IgG 100 ㎕를 사용했다. 그 다음, 이 웰들을 37 ℃, 5％ CO₂에서 4 일 동안 인큐베이션했다. 5 일 째에 각 웰을 삼중수소화 티미딘 (1.0 mC/웰; 아머샴)으로 펄싱했다. 6 시간 후에, 세포를 3 회 세척한 후, 표지의 흡수량을 측정했다.

이 분석의 다른 변형법에서는 PBMC를 Balb/c 마우스 및 C57B6 마우스의 비장으로부터 단리했다. 분석 배지 (RPMI;10 ％ 소 태아 혈청, 1 ％ 페니실린/스트렙토마이신, 1 ％ 글루타민, 1 ％ HEPES, 1 ％ 불필수 아미노산, 1 ％ 피루브산염) 중에서 새로 수거된 비장으로부터 이들 세포를 떼어넣고, 이들 세포를 림포라이트 M (오르가논 테크니카) 상에 올려놓고 2000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하고 단핵세포층을 수집하여 분석 배지 중에서 세척하고, 이들 세포를 분석 배지에 세포 1 x 10⁷개/ml로 재현탁시킴으로써 단리했다. 그 다음, 이 분석법을 상기 기재한 바와 같이 수행했다.

대조구 미만으로의 감소는 억제성 화합물에 대한 양성 결과로 간주되며, 80 ％ 이하의 감소가 바람직하다. 그러나, 대조구보다 값이 작다면 시험 단백질에 억제 효과가 있음을 암시한다.

실시예 6

계내 혼성화

계내 혼성화는 세포 및 조직 표본 내 핵산 서열의 검출 및 위치 파악을 위한 강력한 다용도 기술이다. 예를 들면, 유전자 발현 부위 확인, 전사의 조직 분포 분석, 바이러스 감염 확인 및 위치 파악, 특정 mRNA 합성의 변화 추적 및 염색체 맵핑에 유용할 수 있다.

PCR로 생성된³³P-표지된 리보프로브를 이용하여 문헌 (Lu and Gillett, Cell division 1:169-176 (1994))에 따른 최적 버전의 프로토콜로 계내 혼성화를 수행하였다. 간략하게, 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 묻힌 인간 조직을 절단하고, 파라핀을 제거한 후, 37 ℃에서 15 분 동안 프로테이나제 K (20 g/ml)로 단백질을 제거하고, 문헌 (Lu and Gillett, 상기 문헌)에 기재된 바와 같이 계내 혼성화를 위해 추가의 처리를 하였다. PCR 산물로 생성된 (³³P) UTP-표지된 안티센스 리보프로브로 55 ℃에서 밤새 혼성화시켰다. 상기 슬라이드를 코닥 (Kodak) NTB2 핵 트랙 에멀젼 (nuclear track emulsion) 중에 담그고 4 주 동안 노출시켰다.

³³ P-리보프로브 합성

6.0 ㎕ (125 mCi)의³³P-UTP (아머샴 BF 1002, SA < 2000 Ci/mMol)를 고속 진공 (speed vac) 건조시켰다. 건조된³³P-UTP가 들어있는 각 튜브마다 하기의 성분들을 첨가하였다: 2.0 ㎕ 5x 전사 완충액, 1.0 ㎕ DTT (100 mM), 2.0 ㎕ NTP 혼합물 (2.5 mM: 10 mM GTP, CTP 및 ATP 각각 10 μ+ 10 ㎕ H₂O), 1.0 ㎕ UTP (50 μM), 1.0 ㎕ RNasin, 1.0 ㎕ DNA 주형 (l ㎍), 1.0 ㎕ H₂0

37 ℃에서 1 시간 동안 상기 튜브를 인큐베이션하였다. 1.0 ㎕의 RQ1 DNase를 첨가한 후에 37 ℃에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 90 ㎕의 TE (10 mM Tris (pH 7.6)/l mM EDTA (pH 8.0))를 첨가하고 상기 혼합물을 DE81 페이퍼에 피펫으로 가하였다. 마이크로콘 (Microcon)-50 초미세여과 유니트에 잔류 용액을 로딩하고 프로그램 10으로 6 분 동안 스피닝했다. 여과 유니트를 제2 튜브로 옮기고 프로그램 2로 3 분 동안 스피닝했다. 마지막 회수 (recovery) 스피닝 후에, 100 ㎕의 TE를 첨가하였다. DE81 페이퍼 상에 최종 생성물 1 ㎕를 피펫으로 가하고 6 ml의 바이오플라워 (Bioflour) Ⅱ로 계수하였다.

TBE/우레아 겔 상에 프로브를 전기영동시켰다. 3 ㎕의 로딩 완충액에 1 내지 3 ㎕의 프로브 또는 5 ㎕의 RNA Mrk Ⅲ를 첨가하였다. 95 ℃의 가열 블록 (heat block)에서 3 분 동안 가열한 후에, 즉시 겔을 빙상으로 옮겼다. 겔의 웰을 세척한 후, 샘플을 로딩하여 180 내지 250 볼트에서 45 분 동안 전기영동시켰다. 사란 (saran) 랩으로 겔을 싸고, 이를 -70 ℃의 냉동실에서 1 시간 내지 밤새도록 신호 증강 스크린 상에서 XAR 필름에 노출시켰다.

³³ P-혼성화

동결 절편의 예비처리: 냉동실에서 슬라이드를 꺼내 알루미늄 트레이에 놓고 실온에서 5 분 동안 녹였다. 응축 감소를 위해, 트레이를 55 ℃ 인큐베이터에 5 분 동안 넣어 두었다. 슬라이드를 발연 후드 (fume hood)에서 빙상 4 ％ 파라포름알데히드 중에 10 분 동안 고정시키고, 실온에서 0.5x SSC (25 ml 20x SSC + 975 ml SQ H₂O)로 5 분 동안 세척하였다. 0.5 ㎍/ml의 프로테이나제 K로 37 ℃에서 10 분 동안 단백질을 제거한 후에 (RNase가 없는 예열된 RNase 완충액 250 ml 중 10 mg/ml 스톡 12.5 ㎕), 실온에서 10 분 동안 0.5x SSC로 절편을 세척하였다. 70％, 95 ％, 100 ％ 에탄올로 각각 2 분 동안 절편을 탈수시켰다.

파라핀에 묻힌 절편의 예비처리:슬라이드의 파라핀을 제거해 SQ H₂O 중에 놓고 실온에서 2x SSC 로 5 분씩 2 번 헹궈내었다. 20 ㎕/ml의 프로테이나제 K (RNase가 없는 RNase 완충액 250 ml 중 10 mg/ml, 500 ㎕, 37 ℃, 15 분) (인간 배 (embryo)), 또는 8x 프로테이나제 K (RNase 완충액 250 ml 중 100 ㎕, 37 ℃, 30 분) (포르말린 조직)으로 절편의 단백질을 제거하였다. 이어서, 상기 기재된 바와 같이 0.5x SSC로 헹궈내고 탈수화시켰다.

예비혼성화:박스 (Box) 완충액 (4x SSC, 50 ％ 포름아미드)으로 포화된 필터 페이퍼가 놓여진 플라스틱 상자에 슬라이드를 얹어 놓았다. 조직을 50 ㎕의 혼성화 완충액 (3.75 g의 덱스트란 술페이트 + 6 ml의 SQ H2O)으로 덮고 볼텍싱 후, 뚜껑을 느슨하게 한 상태로 2 분 동안 극초단파로 가열하였다. 빙냉 후에, 18.75 ml의 포름아미드, 3.75 ml의 20x SSC 및 9 ml의 SQ H₂O를 첨가하고 조직을 잘 볼텍싱한 후, 42 ℃에서 1 내지 4 시간 동안 인큐베이션했다.

혼성화:슬라이드마다 1.0 x 10⁶cpm의 프로브 및 1.0 ㎕의 tRNA (50 mg/ml 스톡)를 넣고 95 ℃에서 3 분 동안 가열하였다. 빙냉 후에, 슬라이드마다 48 ㎕의 혼성화 완충액을 첨가하였다. 볼텍싱한 후에, 슬라이드 상의 50 ㎕의 예비혼성화 샘플에 50 ㎕의³³P 혼합물을 첨가하였다. 이 슬라이드를 55 ℃에서 밤새 인큐베이션했다.

세척:실온에서 2x SSC, EDTA로 10 분씩 2 번 세척한 후에 (400 ml의 20x SSC + 16 ml의 0.25 M EDTA, 최종 부피=4 ℓ), 37 ℃에서 30 분 동안 RNase A를 처리하였다 (RNase 완충액 250 ml 중 10 mg/ml, 500 ㎕ = 20 ㎍/ml). 슬라이드를 실온에서 2x SSC, EDTA로 10 분씩 2 번 세척하였다. 엄격한 세척 조건은 다음과 같다: 0.1x SSC 및 EDTA로 55 ℃에서 2 시간 (20 ml의 20x SSC + 16 ml의 EDTA, 최종 부피 = 4 ℓ).

또한, 여러가지 인간 조직으로부터의 폴리 A⁺RNA (레인 당 2 ㎍)를 포함하는 여러 조직 블럿을 클론테크 (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로부터 구입했다. DNA 프로브를 랜덤 프라이밍 DNA 표지 비드 (파마샤 바이오테크) (Pharmacia Biotech)를 사용하여 [α-³²P]dCTP로 표지했다. 68 ℃에서 1 시간 동안 익스프레스하이브 (Expresshyb) (클론테크)로 혼성화했다. 그 다음에, 블럿들을 상온에서 2X SSC/0.05 ％ SDS 용액으로 40 분 동안 세척한 후, 55 ℃에서 0.1X SSC/0.1 ％ SDS 용액으로 40 분 동안 세척하면서 한번 신선한 용액으로 교체했다. 상기 블럿들을 포스포이미저에 노출시켰다.

DNA 29101 (VEGFB9)

DNA29101 (서열 1)를 다음의 프로브를 사용한 3 번의 별도의 계내 연구로 조사했다:

VEGFB9-p1 (서열 194):

5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGGCGGAATCCAACCTGAGTAG-3'

VEGFB9-p2 (서열 195):

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GCG GCT ATC CTC CTG TGC TC-3'

IS97-029:

발생중인 하부 사지 뼈의 연골성 원기 가장자리(즉, 외부 가장자리 둘레)에서 발현이 관찰되었고, 발생중인 건(腱)에서는 혈관 평활근 및 발생중인 골격근 근세포 및 근관을 둘러싸는 세포에서 발현이 관찰되었다. 또한, 다음의 조직에서도 발현이 관찰되었다: 뼈끝 성장판; 림프절-가장자리동(洞); 흉선-흉선 피질의 피막하 영역, 가능하게는 피막하 상피 세포 또는 이 영역에서 발견되는 증식중인 이중 음성 흉선세포; 기관 평활근; 뇌 (대뇌 피질)-피질 뉴런에서 집중적 발현; 소장-평활근; 갑상선-갑상선 상피세포; 간-관상판 (ductal plate); 위-위벽 평활근; 태아 피부-편평 상피의 기저층; 태반-영양아세포성 융모의 간질성(間質性) 세포 (interstitial cell); 척수-동맥벽 및 정맥벽을 제외하고는 전혀 발현되지 않음. 비장 및 부신에서는 발현이 전혀 관찰되지 않았다.

상기 발현 패턴은 DNA29101가 세포 분화/증식에 관련될 수 있음을 암시한다.

IS97-037:

과다배란된 래트 난소에서의 발현은 안티센스 및 센스 프로브를 사용한 모든 절편에서 음성이었다. 이 모델에서는 메세지가 발현되지 않거나 인간 프로브가 래트와 교차결합하지 않았다.

IS97-087:

높은 수준의 발현이 다음의 부위에서 관찰되었다: 침팬치 난소 - 성숙한 여포의 과립막세포, 포막세포에서는 약한 강도의 신호가 관찰됨; 침팬치 부갑상선-주세포에서 높은 수준의 발현이 관찰됨; 인간 태아 고환-발생중인 관을 둘러싸는 간질(間質)세포 (stromal cell)에서 중간 수준의 발현이 관찰됨; 인간 태아의 폐-발생중인 기관지수상구조의 연골세포에서는 높은 수준의 발현이 관찰되고, 분지중인 기관지 상피 전체에서는 낮은 수준의 발현이 관찰됨.

조사된 태아 (E12-E16 주) 조직에는 태반, 제대, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하부 사지 등이 있다. 조사된 성체 조직에는 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐, 피부, 대뇌 피질 (붉은털원숭이 (rm)), 해마 (붉은털원숭이), 소뇌 (붉은털원숭이), 음경, 눈, 방광, 위, 위암종, 결장, 결장암종 및 연골육종 등이 있다. 또한, 아세트아미노펜으로 유도된 간손상 및 간경변을 유도함이 조사되었다.

DNA30871:

IS97-044:

태아 조직에서, 태아의 대뇌 피질, 척수, 척수 신경절 및 태아 위벽에 있는 장 뉴런에 있는 뉴런 전체에서 강한 신호가 관찰되었다. 또한, 대동맥근 주변의 세포 (가능하게는, 흥분전도계), 부신 수질, 신경혈관속 (neurovascular bundle) 내의 간엽세포, 골격근 근세포들 사이에 놓인 신장 실질(實質) 및 세포에서도 신호가 관찰되었다. 기타 모든 태아 조직은 음성이었다.

성체 조직에서는 발현이 전혀 관찰되지 않았다. 다음을 포함하는 태아 (12-16 주) 조직을 시험했다: 태반, 제대, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하부 사지. 다음을 포함하는 성체 조직을 조사했다: 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐 및 피부.

상기 분석에 사용된 프로브는 다음과 같았다:

DNA30871-p1 (서열 196):

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CTC CCG TCT CCT CCT GTC CTC-3'

DNA30871-p2 (서열 197):

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CCT CGG CAT CTT CGT CAC ATT-3'

DNA30942:

DNA30942 (서열 13)를 다음의 프로브를 사용한 4 번의 별도의 계내 연구 (다음의 프로브를 사용한 실시예 7의 질환에 걸린 조직 연구 2 번 포함함)로 조사했다:

DNA30942-p1 (서열 198)

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC TCG CTG CTG TGC CTG GTG TTG-3'

DNA30942-p2: (서열 199)

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CCG CTG CAG CCT CTT GAT GGA-3'

IS97-043:

태아 조직에서는 발현이 전혀 관찰되지 않았다. 다음을 포함하는 태아 조직을 조사했다: 태반, 제대, 뇌, 척수, 눈, 시신경, 기관, 폐, 심장, 흉선, 간, 비장, 식도, 소장, 췌장, 부신, 갑상선, 체벽 및 하부 사지.

성체 조직에서는 발현이 전혀 관찰되지 않았다. 다음을 포함하는 성체 조직을 조사했다: 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐 및 피부.

DNA33087 (IS97-051):

태아 조직에서, DNA33087 (서열 18)의 발현은 연골내 및 골막내 새로운 뼈 형성의 모든 부위에 있는 조골세포, 발생중인 폐동맥 및 대동맥 간(幹)에서 관찰되었다. 다음을 포함하는 태아 조직을 조사했다: 태반, 제대, 뇌, 척수, 눈, 시신경, 기관, 폐, 심장, 흉선, 간, 비장, 식도, 소장, 췌장, 부신, 갑상선, 체벽 및 하부 사지 조직.

다음을 포함하는 성체 조직에서는 발현이 전혀 관찰되지 않았다: 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐 및 피부.

뼈 매트릭스 침착 및(또는) 조골세포 성장 조절에서 역할을 할 것이 가능하다.

멀티블록 (multiblock)의 모든 성체 조직은 베타-액틴에 대해 양성이었다.

이 방법에 사용한 프로브는 다음과 같았다:

DNA33087-p1 (서열 200):

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CCC GAG TGT TTT CCA AGA-3'

DNA33087-p2 (서열 201):

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CAA GTT TAC TAG CCC ATC CAT-3'

DNA33087-p3 (서열 202):

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC TGG ATG GGC TAG TAA ACT TGA-3'

DNA33087-p4 (서열 203):

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CCC TTC TGC TCC TTC TTG TT-3'

DNA34387 (IS97-109):

DNA34387 (서열 25)의 발현 패턴을 다음 부위의 태아 및 성체 인간 조직에서 관찰했다:

태아 - 갑상선 상피, 소장 상피, 성샘 (gonad), 췌장 상피, 간의 간세포 및 세뇨관. 또한, 발현은 발생중인 장골(長骨)의 혈관 조직에서도 관찰되었다.

성체-태반의 세포영양막, 세뇨관 상피, 방광 상피, 부갑상선 및 상피성종양에서 중간정도의 신호가 관찰되었다.

다음을 포함하는 태아 (E12-E16 주) 조직을 조사했다: 태반, 제대, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하부 사지.

다음을 포함하는 성체 인간 조직을 조사했다: 신장 (정상 및 말기), 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 담낭, 췌장, 폐, 피부, 눈 (망막 포함), 전립선, 방광, 간 (정상, 경변(硬變), 급성 기능부전).

다음을 포함하는 비인간 영장류 조직을 조사했다:

침팬치 조직: 타액선(唾液腺), 위, 갑상선, 부갑상선, 피부, 흉선, 난소, 림프절.

붉은털원숭이 조직: 대뇌 피질, 해마, 소뇌, 음경.

이 방법에 사용한 프로브는 다음과 같았다:

DNA34387-p1 (서열 206):

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CCG AGA TAT GCA CCC AAT GTC-3'

DNA34387-p2 (서열 207):

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TCC CAG AAT CCC GAA GAA CA-3'

DNA35638:

IS97-078:

DNA35638 (서열 35)의 발현은 태아 및 태반 혈관의 서브세트를 연결하는 내피에서 관찰되었다. 내피에서의 발현은 이러한 조직 블록에만 한정되었다. 또한, 발현은 태반의 중간 영양세포에서도 관찰되었다.

다음을 포함하는 태아 (E12-E16 주) 조직을 조사했다: 태반, 제대, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하부 사지.

다음을 포함하는 성체 조직을 조사했다: 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐, 피부, 대뇌 피질 (붉은털원숭이), 해마 (붉은털원숭이), 소뇌 (붉은털원숭이), 음경, 눈, 방광, 위, 위암종, 결장, 결장암종, 갑상선 (침팬치), 부갑상선 (침팬치), 난소 (침팬치) 및 연골육종. 또한, 아세트아미노펜으로 유도된 간손상 및 간경변(肝硬變) 조직도 조사했다.

상기 방법에 사용한 올리고는 다음과 같았다:

DNA35638-p1 (서열 208):

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGG AAG ATG GCG AGG AGG AG-3'

DNA35638-p2 (서열 209):

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CCA AGG CCA CAA ACG GAA ATC-3'

DNA39523:

계내 연구에 사용한 프로브는 다음과 같았다:

DNA39523-p1 (서열 210):

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AGC GCA CGG CCA CAG ACA-3'

DNA39523-p2 (서열 211):

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GAC CCT GCG CTT CTC GTT CCA-3'

I98-052:

DNA39523 (서열 45)은 정상 인간 피부 (신생아의 포피) 및 성체 건선(乾癬) 피부 모두에서 기저층 상피세포 - 피부에서, 위에 있는 표피세포 모두에 대한 선조인, 기저막을 따르는 단일층-에서 특히 강한 발현을 보였다.

위에 놓인 층 (유극층, 과립층 등)에 있는 표피세포에서는 발현이 전혀 없었다. 신호의 강도는 건선 피부에서 다소 증가했다. 또한, 발현은 정상 피부 및 건선 피부 모두의 진피 (표피 바로 아래 있는 결합 조직)에서도 뚜렷했다. 상기 발현은 콜라겐 매트릭스내의 방추형 세포-간질의 섬유아세포-에서 가장 뚜렸했다.

뇌에서, 대뇌 절편은 표면 피질 뉴런들의 서브세트-특정 집단의 피질 뉴런을 암시하는 뚜렷한 패턴-에서 특히 강한 발현을 보였다.

염증성 및 정상 장에서: 정상적인 인간 대장 및 크론병 또는 궤양성대장염에 걸린 장에서는 융모 고유판에서 다병소성 패턴으로 중간정도 내지 강한정도의 특이적인 발현이 있었다. 계내 표지된 세포는 섬유아세포로 가장 잘 설명되는 방추형 (spindloid) 간질세포였다. 장의 상피세포에서는 전혀 발현이 없었고, 질환에 걸린 장에서도 뚜렷한 발현 증가 (강도 또는 빈도)가 전혀 없었다. 구체적으로, 염증성 장에서 발현과 병변 사이의 상관관계 역시 전혀 없었다.

인간 태아의 신장에서, 다병소성의 발생중인 세관에서 약한 발현 내지 중간정도의 특이적인 발현이 있었다. 발현은 이 병소의 관상 상피에서 발생했다.

DNA39523 (서열 45)가 피부에서 발현하며 표피세포의 기저 상피세포에 특히 편재한다는 것은, 이것이 기저 표피세포의 분화/유지에서 잠재적 역할을 한다는 것을 암시한다. 기저판에 바로 인접해 있는 세포에서 발현한다는 사실과 더불어 이러한 발현 패턴은 이 세포들이 백혈구들의 표피로의 교통 (trafficking)을 조절함을 암시한다. 이 결과, DNA39523 (서열 45)는 수상돌기세포/랑게르한세포 또는 백혈구들의 표피로의 교통을 위해 구조적으로 발현된 신호일 수 있다. 이러한 교통은 정상 피부에서 일어나는 정상적인 생리적 사건이며 피부의 면역감시에 포함되는 사건이라고 여겨진다.

염증성 장질환에서 DNA39523 (서열 45)의 발현은 정상 조직에서보다 증가하지 않았고, 염증성 병변과 이의 발현은 상관관계가 전혀 없었다. 유사하게, 건선 피부 병변에 있는 기저 표피세포에서의 이것의 발현은 정상적인 신생아의 피부에서 관찰되는 것과 동등하거나 단지 조금 높았다 (그러나, 연령이 매치되는 대조구 성체 피부는 이 연구 시점에서 이용할 수 없었다).

IS97-128:

DNA39523 (서열 45)의 발현은 마우스 배아(embryo) 피부의 상피 뿐 아니라 인간 태아 피부의 기저 상피 및 진피에서도 관찰되었다. 또한, 침팬치 혀에 있는 편평 (squamous) 점막의 기저 상피성 돌출부위도 양성이었다. 또한, 태아 신장의 발생중인 사구체, 성체의 세뇨관, 및 말기 신질환(腎疾患)의 "갑상선양외견(甲狀腺樣外見) (thyroidized)" 상피에 있는 세포들의 서브세트에서도 발현함이 관찰되었다. 그러나, 신장 세포 암종에서도, 가능하게는 상피세포에서도 낮은 발현이 관찰되었다. 또한, (1) 태아 폐의 간질세포 (낮은 수준으로), 및 (2) 위선의 선단(先端) 부위의 간질세포에서의 발현도 관찰되었다. 태아 소장 융모의 고유판, 정상 결장 점막 및 결장암종의 간질세포에서 높은 발현이 나타났다. 육종의 힐란화 간질 (hylanized stroma)에 있는 양성(良性) (benign) 결합 조직 세포에서 강한 발현이 일어났다. 또한, 적색비수 (splenic red pulp) 및 태반 융모의 간질세포에서도발현이 일어났다. 뇌에서는, 피질 뉴런에서 발현이 일어났다.

또한, DNA39523 (서열 45)은 태아의 신경초 세포 및 발생 중인 뼈 주위의 결합 조직에서도 발현되었다.

다음을 포함하는 태아 (E12-E16 주) 조직을 조사했다: 태반, 제대, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하부 사지. 다음을 포함하는 성체 조직을 조사했다: 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐, 피부, 대뇌 피질 (붉은털원숭이), 해마 (붉은털원숭이), 눈, 위, 위암종, 결장, 결장암종, 갑상선 (침팬치), 부갑상선 (침팬치), 난소 (침팬치) 및 연골육종. 또한, 아세트아미노펜으로 유도된 간손상 및 간경변 조직도 조사했다.

IS98-092:

DNA39523 (서열 45)의 발현은 원숭이 대뇌 피질의 외층 (I 및 II)에 있는 여러 세포에서 일어났다. 또한, 심부 피질층에 있는 세포들의 작은 서브세트도 케모카인 (chemokine) 동족체에 대한 mRNA를 발현했다. 해마의 분자층 안에 있고, 치상회(齒狀回)의 내연에 접해있는 분산된 세포들은 DNA39523 (서열 45)를 발현하는 것으로 나타났다. 소뇌 피질에서는 발현이 전혀 검출되지 않았다. DNA39523 (서열 45)의 발현은 케모카인 동족체가 정상적으로 발현되는 영역에서 세포 사멸이 일어난, 경색된 뇌에서는 관찰되지 않았다. DNA39523 (서열 45)은 가능하게는 대뇌 피질 외층에 있는 뉴런 서브세트의 마커로 기능할 수 있고, 가능하게는 뉴런 이동 장애를 밝혀낼 수 있다. 비정상적인 뉴런 이동은 일부의 발작 장애 및 정신분열증의 원인일 수 있다.

IS98-128:

DNA39523 (서열 45)은 생후 (P) 10 일 이내의 마우스 및 성체 마우스의 뇌에서 흥미롭고 특이적인 혼성화 패턴을 보였다. P10 마우스 뇌의 한 시상 절편에서, 해마의 분자층 및 치상회의 내연부에 분산된 강한 신호가 관찰되었다. 전구상회(前鉤狀回)의 세포를 적당히 표지하였다; 신호는 후판상근 피질에서 후두 피질의 외층을 통해 강한 밴드로 신장되어 나타났고, 후두 피질에서 백그라운드 수준으로 감소되었다. 양성 뉴런의 소세트를 P10 운동 피질의 심층 영역에서 검출하였다; P10 피질 외층의 뉴런은 백그라운드 수치보다 큰 신호를 나타내지 않았다. 또한, 하구에서 중간정도의 혼성화 신호가 검출되었다. 성체 마우스 뇌의 3 개의 관상 절편에서 케모카인 동족체 신호가 다른 수준으로 평가되었다. 삼차 신경의 교핵 및 운동근의 격벽 및 분산 뉴런에서 강한 신호가 검출되었다; 해마의 분자층 및 후판상근 피질의 외층에서 중간정도의 신호가 관찰되었다.

IS99-027:

볼레카인 (bolekine) (또한, BRAK로도 공지되어 있음-DNA39523 (서열 45)과 상당한 동족성을 갖는 케모카인)은 cys-x-cys (CXC) 모티프, 및 아미노-말단 glu-leu-arg (ELR)의 부재를 특징으로 하는 케모카인 서브그룹에 속한다. 비-ELR CXC 케모카인 (SDF-1, IP10, Mig 및 PF4를 포함함)은 B 및 T 림프구 등 백혈구의 서브세트에 대해 주화성이 있다. 또한, 이들은 지혈 (angiostatic) 활성도 갖는다.

DNA39523 (서열 45)는 생후 (P) 1 일된 마우스 뇌에서 검출되었고, 볼레카인신호는 해마 (라쿠노섬 분자층 (stratum lacunosum moleculare) 및 치상회문(齒狀回門)) 및 전방 후각핵에서 검출되었으나, 발생중인 대뇌 피질 또는 소뇌에서는 검출되지 않았다. P10까지는, 신호가 대뇌 피질의 1 및 2 층에 있는 세포들의 서브세트에 존재했다. 또한, 심부층에 있는 세포들의 소집단도 DNA39523 (서열 45)을 발현했다. 해마에서의 패턴은 P1 뇌에서의 패턴과 유사했다. 약한 신호는 소뇌, 특히 소엽 IX 및 X에 존재했다. 또한, 신호는 배측 선조체(線條體) 및 소구(小丘)에도 존재했다.

성체 마우스 뇌에서, 성체 대뇌 피질에서는 볼레카인-양성 세포를 검출하기 어려웠으나, 전방 후각핵 및 해마에는 신호가 존재했다. 그러나, 허혈성 마우스 뇌에서, 볼레카인 신호는 명암선반영부분 (penumbra)에서 유도되었다.

발생중인 대뇌 피질에서, 볼레카인 발현은 뉴런 이동의 최종 단계와 축삭돌기 형성 및 시냅스 형성 (synaptogenesis)과 상관관계가 있다. 기타 CXC 케모카인은 중추신경계에서의 뉴런 이동 및 패턴형성 (SDF-1), 및 뉴런 활성의 조정 (IL-8 및 GRO-a)에서 기능을 한다.

볼레카인 발현은 뇌에서 허혈성-재관류 손상을 유도하지만 다른 염증성 상태에서는 그렇지 않다.

DNA47365 (IS97-142):

태아 조직에서, DNA47635 (서열 91)의 발현은 척추체 전면을 연결하는 근막에서 관찰되었다. 태아의 망막에서 발현이 있었다. 태아 뉴런에서는 낮은 수준의발현이 있었다.

상기 분석에 사용한 프로브는 다음과 같았다:

DNA47365-p1 (서열 214):

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AAC CCG AGC ATG GCA CAG CAC-3'

DNA47365-p2 (서열 215):

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TCT CCC AGC CGC CCC TTC TC-3'

DNA49435 (IS97-136):

DNA49435 (서열 111)는 태아 뇌의 피질 뉴런에서 중간정도로 발현함이 관찰되었다. 또한, 태아 망막의 안쪽 면에서도 발현했고, 가능하게는 발생중인 렌즈에서 발현했다. 태아의 피부, 연골, 소장, 태반 융모 및 제대에서도 발현함이 관찰되었다. 성체 조직에서는, 담낭 상피에서 극히 높은 수준의 발현이 있었다. DNA49435 (서열 111)은 성체 신장, 위 및 결장 상피에서 중간정도로 발현함이 관찰되었다.

다음을 포함하는 태아 (E12-E16 주) 조직을 시험했다: 태반, 제대, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반, 고환 및 하부 사지. 다음을 포함하는 성체 인간 조직을 시험했다: 신장 (정상 및 말기), 부신, 비장, 림프절, 췌장, 폐, 눈 (망막 포함), 방광, 간 (정상, 경변, 급성 기능부전).

시험된 비인간 영장류 조직에는 침팬치 조직의 부신, 및 붉은털원숭이 조직의 대뇌 피질, 해마 및 소뇌 등이 있다.

상기 분석에 사용한 프로브는 다음과 같았다:

DNA49435-p1 (서열 218):

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGA TCC TGG CCG GCC TCT G-3'

DNA49435-p2 (서열 219):

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GCC CGG GCA TGG TCT CAG TTA-3'

DNA54228 (IS98-105):

DNA54228 (서열 133)의 발현은 다음과 같은 뼈의 골편(骨片)에서 관찰되었다: 태아의 골간단(骨幹端) 뼈, 태아의 두개관 (두개골) 및 인간 신생물 (neoplasia) (골육종 및 연골육종)의 뼈 조직. 약하지만 끊임없는 신호가 태아 뼈의 골간단에 있는 작은 뼈의 골편 및 연골육종 및 골육종의 골화(骨化) 골편에 존재했다. 인간의 폐, 간, 흉선, 신장, 갑상선, 뇌, 비장, 및 부신, 뇌, 연골, 폐, 간, 장, 성샘 (gonad), 심장 및 피부 등을 포함하는 태아 조직에서는 신호가 전혀 검출되지 않았다.

상기 방법에 사용한 프로브는 다음과 같았다:

hmDETI-p1 (서열 220):

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC ACC ACC ACC CAG GAG C-3'

hmDETI-p2 (서열 221):

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA AAT GAA GTG GGA CGT TTG AGT-3'

DNA54228-p1 (서열 222):

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CTT CTT TCC TTC ACC ACC ACC-3'

DNA54228-p2 (서열 223):

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TCT GCC TTG GCT TTT GAC AC-3'

DNA54231 (mFIZZ3):

IS98-070:

DNA54231 (서열 139)은 지방세포에 특이적인 중간정도의 신호를 나타냈다. 이 신호는 기관 주위의 목에 있는 간질성 지방 및 장간막 지방에 존재했다. 발현 패턴은 성체 지방에 특이적인 것으로 보인다.

IS98-109:

DNA54231 (서열 139)의 발현은 지방세포에 특이적이었고, 이 연구에서 조사한 복강 장간막, 신장 골반에 있는 신장주위 지방, 및 유방의 지방패드 등 이 세포들이 존재하는 곳이라면 어디에서도 발현했다. 정상적인 뮤린 뇌, 간, 신장, 유선(乳腺), 췌장, 비장, 췌장, 골수, 위, 십이지장, 공장, 회장, 결장, 맹장, 고환, 피부, 또는 폐에 있는 다른 어떤 유형의 세포에서도 전혀 발현되지 않았다.

이 분자가 지방세포에 선택적으로 분포하는 것은 이것이 비만에 중요한 지방 대사 또는 지방 세포의 생성/형성에서 기능함을 암시한다.

상기 방법에 사용한 프로브는 다음과 같았다:

DNA54231-p1 (서열 224):

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CGA GGG GGA CAG GAG CTA ATA-3'

DNA54231-p2 (서열 225):

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GTC CCA CGA GCC ACA GG-3'

DNA59294 (IS98-138):

DNA 59294 (서열 149)을 정상 성체 및 태아 조직, 및 염증, 주로 만성 림프구성 염증이 있는 조직으로 구성된 패널에서 평가했다. 요약하면, 이것의 발현은 성체에서는 근육, 특정 유형의 평활근에 특이적이었고, 인간 태아에서는 골격근 및 평활근에서 특이적이었다. 성체 인간에서는 결장 및 담낭 등 평가한 관상 기관의 평활근에서 발현했다. 기관지 또는 혈관의 평활근에서는 발현이 전혀 없었다. 성체 인간의 골격근은 전혀 평가하지 않았다. 태아 조직에서는, 축골격 및 사지의 골격근에서 중간정도 내지 높은 확산 발현이 있었다. 장관벽의 평활근에서는 약하게 발현했으나 심장 근육에서는 전혀 발현되지 않았다.

성체 조직에서는, 결장에서 만성 염증성 장질환이 있는 5 개 표본의 평활근 (근육층)에서 낮은 수준으로 확산 발현했다. 담낭에서는, 담낭의 평활근에서 약한 발현 내지 낮은 발현이 있었다.

인간 태아 조직에서는, 골격근에서 중간정도로 확산 발현했고, 평활근에서는 약한 발현 내지 낮은 발현이 있었다. 그러나, 태아의 심장, 또는 간, 비장, CNS, 신장, 원장관 (gut), 폐 등을 비롯한 기타 다른 어떠한 태아의 기관에서도 발현은 검출되지 않았다.

검출가능한 발현이 전혀 없는 것으로 시험된 기타의 인간 조직은 다음을 포함했다: 만성 육아종 염증 및 만성 기관지염이 있는 폐 (환자 5명), 말초 신경, 전립선, 심장, 태반, 간 (아세토미호핀으로 유도한 상해 및 경변(硬變)을 포함하는 질환 멀티블록), 뇌 (대뇌 및 소뇌), 편도 (반응성 과형성), 말초성 림프절, 흉선.

상기 방법에 사용한 프로브는 다음과 같았다:

626.p1 (서열 226):

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CGG AAT GGA CTG GCC TCA CAA-3'

626.p2 (서열 227):

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA AGG ATG GTC TCG GGC TGC TG-3'

DNA30868(IS97-044)

DNA30868 발현은 다음의 태아 조직에서 발견되었다: 척수, 자율신경절, 소장 신경, 천골신경총, 말초 신경 및 뇌신경.

다음을 포함하는 태아 조직을 조사했다: 태반, 제대, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하부 사지.

다음을 포함하는 성체 조직을 조사했다: 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐 및 피부.

상기 방법에 사용한 프로브는 다음과 같았다:

DNA30868.p1 (C111-G): (서열 304)

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AGA GAC AGG GCA AGC AGA ATG-3'

DNA30868.p2 (C111-H): (서열 305)

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GAA GGG GAT GAC TGG AGG AAC-3'

DNA53517:

IS98-070:

정상적인 성체 뮤린 폐에서 DNA53517 (서열 255)의 발현은 패치 (patchy)여서, 대기도(大氣道) (기관지/세기관지)에 있는 점막 상피세포의 서브세트에서는 발현했다. 또한, 대기도(大氣道)에 인접한 점막하조직의 간질에 드물게 있는 별개의 세포들에서도 발현했다. 전형적으로 양성 병소에 1-3 개 있는 이러한 세포들은 대혈관에 인접해있으며, 평활근 세포, 말초 신경 또는 쉬반세포, 또는 림프관일 수 있다.

알러지성 염증 (호산성, 림프구성맥관염, 세기관지염 및 폐간질염)에 걸린 뮤린 성체 폐에서, 폐의 모든 대기도(大氣道) (기관지/세기관지)의 모든 점막 상피세포에서 강하게 확산 발현했다. 또한, 폐포를 연결하는 상피세포의 서브세트인 별개의 세포에서도 강한 발현이 있었다; 이 세포들은 제II형 폐포세포였다. 또한, 대기도(大氣道)에 인접한 점막하조직의 간질에 드물게 있는 별개의 세포들에서도 발현했다.

정상적인 성체 뮤린 소장 및 대장에서는, 점막하조직, 근육층 및 장간막에 존재하는 몇 개의 다병소성 단일 세포들에서 강한 발현이 있었다. 상기 신호를 발현하는 세포는 이 지역안의 신경, 정맥, 동맥의 삼련구조와 거의 언제나 관련이 있었다. 이 세포들은 방추 형태이고, 상기 신경과 연결된 말초 신경, 쉬반세포이거나 혈관 또는 림프관과 연결된 일부 유형의 지지세포일 수 있다. 흥미롭게도, 동일시할 수 있는 근육층 내 근층간신경총 (myenteric plexi)에서는 발현이 전혀 없었다.

염증성 대장 (IL10R KO 마우스로부터 얻음)에서, 발현 패턴은 유사했으나 발현 수준은 상당히 감소했다.

IS98-093:

DNA53715 (서열 255)의 분포를 정상적인 뮤린 조직을 폭넓게 스크리닝하여 좀더 검사했다. 정상적인 폐에서, 뮤린 기관지의 상피세포 및 폐의 제II형 폐포 세포로 제한하는 경우, 발현은 가변적이었다. 염증성 폐 (기관지 점막의 비대/과형성이 있는 알러지성 염증; 천식 모델)에 있는 이 세포들에서의 발현은 두드러지게 증가했다. 장에서 DNA53715 (서열 255)의 발현은 결장에서 가장 현저했고, 점막하조직 및 점막 근육, 장의 근벽 (muscle wall)과 그의 점막 사이에 있는 얇고, 혈관이 잘 분포되어 있는 조직층 안에 있는 몇 개의 별개 세포에 존재했다. 이 세포들이 무엇인지 정확히 밝혀지지 않았으나, 이들의 방추형 모양 및 점막하조직 내 모세혈관 및 소혈관과의 밀접한 관련성은 다음의 가능성을 시사한다: 혈관주위세포 또는 무수 신경 섬유의 서브세트.

장의 점막하조직에 있는 별개 세포들에서의 DNA53715 (서열 255)의 발현은 결장에 국한되는 것이며, 공장. 회장, 근위 십이지장 또는 위 절편에서는 발현되지않았다. 다음의 정상 뮤린 조직에서는 발현이 전혀 검출되지 않았다: 간, 신장, 비장, 골수, 폐, 췌장, 위, 근위 십이지장, 공장, 회장, 뇌, 피부, 고환, 또는 유선.

DNA53715 (서열 255)이 폐에서 점막 면역성을 강화시키거나 자극시키는 기능을 하는 것이 가능하다.

상기 방법에 사용한 프로브는 다음과 같았다:

DNA53517.p1 (C301-P): (서열 308)

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CCC AGG ATG CCA ACT TTG A-3'

DNA53517.p2 (C301-Q): (서열 309)

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA AGG AGG CCC ATC TGT TCA TAG-3'

실시예 7

세포 및 질환에 걸린 조직에서의 계내 혼성화

실시예 6의 계내 혼성화 방법을 사용하여 특정 질환을 앓는 인간 개개인에서 단리한, 질환에 걸린 조직에서 본 발명의 유전자/DNA 및 단백질에 관해 유전자 발현을 측정하고, 전사물의 조직 분포를 분석한 후, 특정 mRNA 합성 변화를 조사했다. 더욱 구체적으로, 이 결과는 질환에 걸린 조직의 어느 곳에서 본 발명의 유전자가 발현되는가를 보여주며, 그 질환에서 본 발명의 억제성 또는 자극성 화합물 (및 이의 아고니스트 또는 길항제)의 치료 효과가 나타날 특정 위치가 더욱 잘 예측된다. 하나 이상의 하기 조직 및 세포 샘플을 사용하여 실시예 6의 방법에 따라 혼성화를 수행했다:

(a) 림프구 및 항원제시세포 (수상돌기세포, 랑게르한스세포, 대식세포 및 단핵세포, NK 세포);

(b) 림프양 조직: 정상 및 반응성 림프절, 흉선, 기관지 관련 림프양 조직 (Bronchial Associated Lymphoid Tissues (BALT)), 점막 관련 림프양 조직 (Mucosal Associated Lymphoid Tissues (MALT));

(c) 인간 질환 조직:

·관절염 및 퇴행변성관절질환을 앓는 환자의 활막 및 관절;

·궤양성대장염 및 크론병 등의 염증성 장질환을 앓는 환자의 결장;

·건선(乾癬) 및 다른 형태의 피부염이 있는 피부 병변(病變);

·만성 및 급성 기관지염, 폐렴, 폐간질염, 흉막염이 있는 BALT 및 조직 림프절 등의 폐 조직;

·천식이 있는 BALT 및 조직 림프절 등의 폐 조직; ;

·비염 또는 정맥동염(靜脈洞炎)을 앓는 환자의 비측(鼻側) 및 정맥동도관 조직;

·다발성 경화증, 알쯔하이머병 및 졸증이 있는 뇌 및 척수. ;

·신장염, 사구체신염 및 전신성 홍반성 루푸스가 있는 신장;

·감염성 및 비감염성 간염 및 아세트아미노펜으로 유도된 간경변이 있는 간;

·신생물 (neoplasm)/암 조직.

하나 이상의 세포 또는 조직에서 발현이 관찰되었으며, 이는 상기 세포 또는조직 샘플과 관련한 질환에서 본 발명의 화합물 (및 이의 아고니스트 또는 길항제)의 치료 효과가 나타남을 지시한다.

앞서 보고한, 비질환 조직 분포와 중첩되는 곳에서의 발현에 사용한 올리고뉴클레오티드 서열들은 실시예 6에서 인용했다.

DNA30942:

IS98-021:

발현은 정상 침팬치 흉선 뿐 아니라, 위암종 (1/1), 직장결장 암 (1/1), 유방암 (2/5) 및 폐암 (1/4)의 단핵식세포에서도 관찰되었다. 골육종 및 별로 분화되지 않은 지방육종에서는 악성세포에 의해 발현되었다. 고환 기형종 및 유방암 (1/5)의 악성세포에서 가능한 신호가 관찰되었다. 폐암 중 하나에서, 분산된 신호가 폐의 림프양 조직내의 고내피성소정맥(高內皮性小靜脈)에서 관찰되었다. 다음을 포함하는 태아 (E12-E16 주) 조직을 검사했다: 태반, 제대, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하부 사지. 다음을 포함하는 성체 인간 조직을 검사했다: 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 폐, 피부, 연골육종, 눈, 위, 위암종, 결장, 결장암종, 신장세포 암종, 전립선, 방광 점막 및 담낭. 또한, 아세트아미노펜으로 유도된 간손상 및 간경변이 있는 조직도 조사했다. 다음을 포함하는 붉은털원숭이 조직을 조사했다: 대뇌 피질 (붉은털원숭이), 해마 (붉은털원숭이). 다음을 포함하는 침팬치 조직을 조사했다: 갑상선, 부갑상선, 난소, 신경, 혀, 흉선, 부신, 위 점막및 타액선.

IS98-085:

8 개의 선암 및 7 개의 편평 폐암종에서 발현이 관찰되었다. 액틴은 모든 종양에서 강한 양성이었으며, 이들 모두가 계내 혼성화 분석에 적합함을 지시했다. DNA30942의 발현은 다음과 같은 종양 6 개에서 관찰되었다:

6727-95 / 편평 암종 - 신생물 상피에서 강하게 발현됨;

9558-95 / 편평 암종 - 신생물 상피에서 발현됨;

12235-95 / 선암 - 계내 및 침윤성 종양 세포에서 발현됨;

6545-95 및 4187-96 / 편평 암종 - 종양 간질의 세포에서 발현됨, 종양세포에서는 전혀 발현되지 않음;

12954-94 / 편평 암종 - 간질세포에서 약한 발현이 가능함.

IS99-112:

DNA30942 (서열 13)의 계내 발현을 여러 만성 염증 상태 및 림프양 기관에서 평가했다. 요약하면, DNA30942 (서열 13)는 만성 천식이 있는 편도, 폐문림프절, 기관지 점막-관련 림프양 조직 (BALT)의 고내피성소정맥(高內皮性小靜脈) (HEV)에서 강하게 발현했고, 결장 점막에서는 패치 발현했으며, 원장관-점막 관련 림프양 조직 (GALT) HEV에서 약하고 불규칙하게 발현했다.

림프양 조직에서는, 만성 천식의 경우, 편도, 폐문림프절, 기관지 점막-관련 림프양 조직 (BALT)의 단일 절편들, 및 IBD (GALT/MALT) 절편들의 원장관 점막 관련 림프양 조직에서 강하고 특이적인 발현이 관찰되었다. 이러한 림프양 기관 각각에서, 발현은 고내피성소정맥(高內皮性小靜脈) (HEV)에 특이적으로 존재했다.

만성 천식성 폐 조직에서, BALT HEV에서의 발현 뿐 아니라, 염증성 기관지의 점막하조직에 있는, 고팽윤(高膨潤) 또는 반응성 팽윤 내피세포와 연결된 작은 모세혈관에서도 특이적인 발현이 관찰되었다. 이 영역은 BALT와 친밀하게 연결된 것이 아니라 기관지로의 염증세포 교통을 위해 점막하조직 부위에 특이적이었다. 이 지역에는 호산구들의 상당한 점막하조직 침윤이 있었다. 질환(COPD 및 만성 간질성 폐렴)에 걸린 폐의 다른 절편에서는 DNA30942 (서열 13)가 전혀 발현되지 않았고, 이 절편들에 약간의 인위적 손실이 있었다 (슬라이드로부터의 조직 손실).

건선 조직에서는, 건선 플라크에 있는 몇 개의 작은 피부 모세혈관에서 약한 발현이 있었다. 편도 조직에서는, 소포 (follicle)와 연결된 HEV에서 발현했을 뿐 아니라, 망상형 편도음와(扁桃陰窩) 상피에서도 강한 발현이 있었다. 또한, 작은 상피내 모세혈관의 혈관에서도 발현이 있었다. 또한, 일부의 상피세포에서도 발현이 있었다. 이는 중요한 면역학적 부위이며 항원 제시와 관련되어 있고, 내성 유도에서 기능할 수 있다.

크론병 및 궤양성대장염을 앓는 환자에게서 단리한 조직에서, 결장에서의 발현은 모두가 아닌 일부의 경우에서 점막에 패치 분포로 존재했다. GALT의 HEV에서의 발현은 다른 림프양 조직에서 관찰된 신호보다 상당히 더 약하게 존재했고, 강하지만 패치 발현이 있었던 점막 절편에서조차 일정하게 존재하지 않았다.

아세트아미노펜으로 유도한 간손상 및 경변에서 단리한 조직에서는, 만성 림프구성 염증이 있는 문맥로(門脈路) 지역 내의 작은 모세혈관에서 약한 발현이 있었다.

DNA33460 (IS98-015):

DNA33460 (서열 20)의 발현은 태아 눈에 있는 발생중인 외안근(外眼筋)에 바로 인접해 있는 소성결합조직(疎性結合組織)의 세포에서 관찰되었다. 연부조직(軟部組織) 육종에 중간정도의 발현이 있었다. 다음을 포함하는 태아 (E12-E16 주) 조직을 조사했다: 태반, 제대, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하부 사지. 조사한 성체 조직은 간, 신장, 신장세포 암종, 부신, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐, 심근, 피부, 대뇌 피질 (붉은털원숭이), 해마 (붉은털원숭이), 소뇌 (붉은털원숭이), 방광, 전립선, 위, 위암종, 결장, 결장암종, 갑상선 (침팬치), 부갑상선 (침팬치) 난소 (침팬치) 및 연골육종을 포함했다. 또한, 아세트아미노펜으로 유도한 간손상 및 간경변에서 추출한 조직도 조사했다.

상기 방법에 사용한 프로브는 다음과 같았다:

DNA33460-p1 (서열 204):

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CAG CAC TGC CGG GAT GTC AAC-3'

DNA33460-p2 (서열 205):

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GTT TGG GCC TCG GAG CAC TG-3'

DNA34387 (IS98-083):

발현은 폐암 종양에서 관찰되었고, 모든 8 개의 편평 암종 및 8 개 중 6 개의 선암에서 양성이었다. 발현은 선암에서는 낮은 수준 내지 중간정도의 수준이었고 편평 암종에서는 매우 강한 수준이었다. 종양 간질, 폐포 또는 정상적인 호흡 상피에서는 발현이 전혀 관찰되지 않았다. 림프절에서는 낮은 수준의 발현이 가능했다.

발현은 폐암에서 관찰되었다. 이 유전자를 폐종양 패널의 태크맨 (Taqman) 분석법으로 증폭시켰다. 발현은 8 개의 편평 암종 및 8 개 중 6 개의 선암에서 관찰되었다. 발현은 계내 및 침윤 성분에서 관찰되었다. 발현은 선암에서는 낮은 수준 내지 중간정도의 수준이었다. 일반적으로 편평 암종에서의 발현이 더 많았고, 2 개에서 발현이 강했다. 림프절에서는 낮은 수준의 발현이 가능했다.

DNA35638:

IS98-124:

본 연구에서는 인간의 염증성 조직 (건선, IBD, 염증성 신장, 염증성 폐, 간염 (간 블록), 정상적인 편도, 성체 및 침팬치 멀티블록)에서 DNA35638 (서열 35)의 발현을 조사했다. 본 명세서의 다른 부분에서는 DNA35638 (서열 35)이 면역자극 특성 (MLR에서의 T 림프구증식 및 공동자극 강화) 및 염증전 (proinflammatory) 특성 (생체내 호중구 침윤 유도)을 가짐을 보였다.

본 연구에서는 인간의 염증성 조직에 있는 혈관에서 이 분자의 차별적 발현을 평가하여 비염증성 조직과 비교했다. 요약하면, 발현은 만성 염증에 걸린 폐의에 있는 대혈관의 내피/맥관내막, 건선 피부의 표층 피부 혈관, 만성 경화성신염 표본의 소동맥, 및 편도 소포주위의 동(洞)을 포함하는 모세혈관에서 일어났다. DNA35638 (서열 35)은 정상적인 피부 (인간 포피 표본), 정상적인 폐, 염증성 (8 개의 IBD 표본) 또는 정상적인 대장, 만성 염증성 또는 경변 간, 정상적인 성체 심장 조직, 또는 부신에서는 발현되지 않았다 (이 방법으로는 검출가능하지 않았음).

DNA39523:

I98-052:

정상 인간 피부 (신생아의 포피) 및 성체 건선 피부 모두에서 DNA39523 (서열 45)은 기저층 상피세포 - 피부에서, 위에 있는 표피세포 모두에 대한 선조인, 기저막을 따르는 단일층-에서 특히 강한 발현을 보였다.

위에 놓인 층 (유극층, 과립층 등)에 있는 표피세포에서는 발현이 전혀 없었다. 신호의 강도는 건선 피부에서 다소 증가했다. 또한, 발현은 정상 피부 및 건선 피부 모두의 진피 (표피 바로 아래 있는 결합 조직)에서도 뚜렷했다. 상기 발현은 콜라겐 매트릭스내의 방추형 세포-간질의 섬유아세포-에서 가장 뚜렸했다.

염증성 및 정상 장에서: 정상적인 인간 대장 및 크론병 또는 궤양성대장염에 걸린 장에서는 융모 고유판에서 다병소성 패턴으로 중간정도 내지 강한정도의 특이적인 발현이 있었다. 계내 표지된 세포는 섬유아세포로 가장 잘 설명되는 방추형 (spindloid) 간질세포였다. 장의 상피세포에서는 전혀 발현이 없었고, 질환에 걸린 장에서도 뚜렷한 발현 증가 (강도 또는 빈도)가 전혀 없었다. 구체적으로, 염증성 장에서 발현과 병변 사이의 상관관계 역시 전혀 없었다.

DNA39523 (서열 45)가 피부에서 발현하며 표피세포의 기저 상피세포에 특히 편재한다는 것은, 이것이 기저 표피세포의 분화/유지에서 잠재적 역할을 한다는 것을 암시한다. 기저판에 바로 인접해 있는 세포에서 발현한다는 사실과 더불어 이러한 발현 패턴은 이 세포들이 백혈구들의 표피로의 교통 (trafficking)을 조절함을 암시한다. 이 결과, DNA39523 (서열 45)는 수상돌기세포/랑게르한세포 또는 백혈구들의 표피로의 교통을 위해 구조적으로 발현된 신호일 수 있다. 이러한 교통은 정상 피부에서 일어나는 정상적인 생리적 사건이며 피부의 면역감시에 포함되는 사건이라고 여겨진다.

염증성 장질환에서 DNA39523 (서열 45)의 발현은 정상 조직에서보다 증가하지 않았고, 염증성 병변과 이의 발현은 상관관계가 전혀 없었다. 유사하게, 건선 피부 병변에 있는 기저 표피세포에서의 이것의 발현은 정상적인 신생아의 피부에서 관찰되는 것과 동등하거나 단지 조금 높았다 (그러나, 연령이 매치되는 대조구 성체 피부는 이 연구 시점에서 이용할 수 없었다).

DNA45416 (IS98-140):

DNA45416 (서열 79)의 발현을 다양한 인간 및 비인간 영장류 조직에서 평가하였고, 매우 특이적임을 발견했다. 이는 폐에 있는 폐포 대식세포 및 간 동양혈관(洞樣血管)의 쿠퍼세포 (Kupffer cell)에서만 발현되었다. 이들 세포에서의 발현은 이들 별개의 세포군이 활성화될 때 상당히 증가되었다. 이들 조직 대식세포의 2 가지 서브 집단이 상이한 기관에 위치해 있긴 하지만, 이들은 유사한 생물학적 기능을 갖는다. 이들 2 가지 유형의 식세포는 생물학적 필터로 작용하여 혈류 또는 기도로부터 병원균, 노화된 세포 및 단백질 등의 물질을 제거하며, 둘다 광범위하게 다양한 중요한 염증전 사이토카인을 분비할 수 있다.

염증성 폐 (환자 7 명의 샘플)에서, 발현은 크고, 엷으며 단독으로 존재하는 소포화 세포 (vacuolated cell)로 종종 정의되는 반응성 폐포 대식세포 집단 또는 폐포내 응집체에서 현저했고, 정상적인, 비반응성 대식세포 (정상 크기의 단일 분산 세포)에서는 약한 발현 내지 음성 발현이었다. 폐포 대식세포에서의 발현은 염증이 있는 동안 증가하여 이 세포들의 개수와 크기 모두가 증가했다 (활성화). 이 조직에 있는 간질성 염증 및 기관지주위의 림프양 과형성 지역에는 조직구도 있지만, 발현은 폐포 대식세포에 제한되어 일어났다. 또한, 많은 염증성 폐도 어느 정도의 화농성(化膿性) 염증이 있었다; 호중구성 과립구에서는 발현이 없었다.

간에서는, 급성 소엽중심 괴사 (아세트아미노펜 독성) 또는 아주 두드러진 문맥주위 염증이 있는 간의 반응성/활성화 쿠퍼세포에서 강한 발현이 있었다. 그러나, 정상적인 간 또는 단지 경미한 (mild) 정도의 염증 또는 경미한 내지 중간정도의 소엽 과형성/비대증이 있는 간의 쿠퍼세포에서는 발현이 약하거나 전혀 없었다. 그러므로, 폐에서와 같이, 활성화/반응성 세포에서는 발현 증가가 있었다.

염증성 장, 과형성/반응성 편도 또는 정상 림프절에 존재하는 조직구/대식세포에서는 이 분자의 발현이 전혀 없었다. 모두가 조직구 염증 또는 잔류 대식세포 집단을 포함하고 있는 이 조직에서 발현이 없다는 것은 폐포 대식세포 및 간의 쿠퍼세포로 한정되는 유일한 대식세포 서브세트 집단에 제한되어 발현됨을 강하게 지지한다. 그러나, 비장 또는 골수에서는 DNA454216 (서열 79)의 발현을 평가할 수 없었다.

검출가능한 발현이 전혀 없는 것으로 평가된 인간 조직은 다음을 포함했다: 염증성 장질환 (중간정도 내지 중증의 질환을 앓는 환자 7 명의 샘플), 반응성 과형성이 있는 편도, 말초성 림프절, 건선 피부 (경미한 내지 중간정도의 질환을 앓는 환자 2 명의 샘플), 심장, 말초 신경. 검출가능한 발현이 전혀 없는 것으로 평가된 침팬치 조직은 다음을 포함했다: 혀, 위, 흉선.

상기 연구에 사용한 프로브는 다음과 같았다:

628.p1 (서열 212):

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CTC CAA GCC CAC AGT GAC AA-3'

628.p2 (서열 213):

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CCT CCA CAT TTC CTG CCA GTA-3'

DNA41374:

IS-98-077:

DNA41374 (서열 248)는 흉선의 T 림프구에서 발현했다.

요약: 평가한 여러 조직에서, 발현은 흉선의 T 림프구에서의 약한 확산 발현으로만 검출되었다. 이러한 제한된 분포 패턴은 T 림프구, 또는 항원제시세포 (수상돌기세포 집단 등) 등 T 림프구와 밀접하게 관련된 세포에 의한 발현임을 암시한다. 상당한 림프구성 염증이 있고, 반응성 소포 형성이 존재하는 인간의 염증성 조직 (염증성 장질환 및 만성 림프구성 간질성 폐렴/기관지염)에서 상당수의 T 림프구를 포함하는 지역에서는 검출가능한 발현이 전혀 없었다. 검출가능한 발현이 전혀 없는 것으로 시험된 조직은 다음을 포함했다: 인간의 정상 조직: 태반, 폐, 비장, 부신, 피부, 신장, 눈, 간; 질환에 걸린 인간 조직: 간질환: 만성 간염, 만성 담관염, 급성 소엽중심 괴사 (아세트아미노펜 독성); 신생물 (neoplasia) (종양 멀티블록): 골육종, 편평 세포암종; 인간의 태아 조직: 뇌, 척수, 폐, 심장, 신장, 축 및 사지 근골격 혈관, 제대; 비인간 영장류: 혀, 갑상선, 부갑상선, 위, 타액선.

IS98-125.

DNA41374 (서열 248)는 T 림프구 특이적 영역에 있는 인간 편도 및 비인간 영장류 흉선에서 낮은 수준으로 발현했다. 이러한 제한된 분포 패턴은 T 림프구, 또는 항원제시세포 (수상돌기세포 집단 등) 등 T 림프구와 밀접하게 관련된 세포에 의한 발현임을 암시한다. 상당한 림프구성 염증이 있고, 반응성 소포 형성이 존재하는 인간의 염증성 조직 (염증성 장질환 및 만성 림프구성 간질성 폐렴/기관지염)에서 상당수의 T 림프구를 포함할 수 있는 지역에서는 검출가능한 발현이 전혀 없었다.

염증성 폐: (만성 림프구성 및 육아종 폐간질염): 간질 (interstitium)에서의 약한 신호 내지 음성 신호와 비교하여 센스 프로브를 조절했다. 정상적인 침팬치 흉선 (인간 흉선은 이용할 수 없었음) 및 인간 편도에서 약한 발현이 있었다.인간 편도에서의 발현은 주로 소포주위(小胞周圍)의 변연대(邊緣帶)를 포함하는 이 구조의 T 림프구 지역 및 부피질에서 일어났다.

다음의 인간 조직에서는 검출가능한 발현이 전혀 없었다: 염증성 장질환 (환자 8 명의 표본), 만성 염증성 및 정상 폐 (환자 6 명의 표본), 만성 경화성신염 (1), 만성 및 급성 염증성 및 경변성 간 (10 개의 표본 멀티블록), 정상 및 건선 피부, 말초성 림프절 (비반응성).

상기 방법에 사용한 프로브는 다음과 같았다:

41374.p1 (C337-G): (서열 306)

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CTC CAC AGA ACC TCG CCA TCA-3'

41374.p2 (C337-H): (서열 307)

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TGG GGC AAG ACT CAC AAG CAG-3'

DNA53517:

IS98-070:

정상적인 성체 뮤린 폐에서 DNA53517 (서열 255)의 발현은 패치 (patchy)여서, 대기도(大氣道) (기관지/세기관지)에 있는 점막 상피세포의 서브세트에서는 발현했다. 또한, 대기도(大氣道)에 인접한 점막하조직의 간질에 드물게 있는 별개의 세포들에서도 발현했다. 전형적으로 양성 병소에 1-3 개 있는 이러한 세포들은 대혈관에 인접해있으며, 평활근 세포, 말초 신경 또는 쉬반세포, 또는 림프관일 수 있다.

알러지성 염증 (호산성, 림프구성맥관염, 세기관지염 및 폐간질염)에 걸린 뮤린 성체 폐에서, 폐의 모든 대기도(大氣道) (기관지/세기관지)의 모든 점막 상피세포에서 강하게 확산 발현했다. 또한, 폐포를 연결하는 상피세포의 서브세트인 별개의 세포에서도 강한 발현이 있었다; 이 세포들은 제II형 폐포세포였다. 또한, 대기도(大氣道)에 인접한 점막하조직의 간질에 드물게 있는 별개의 세포들에서도 발현했다.

정상적인 성체 뮤린 소장 및 대장에서는, 점막하조직, 근육층 및 장간막에 존재하는 몇 개의 다병소성 단일 세포들에서 강한 발현이 있었다. 상기 신호를 발현하는 세포는 이 지역안의 신경, 정맥, 동맥의 삼련구조와 거의 언제나 관련이 있었다. 이 세포들은 방추 형태이고, 상기 신경과 연결된 말초 신경, 쉬반세포이거나 혈관 또는 림프관과 연결된 일부 유형의 지지세포일 수 있다. 흥미롭게도, 동일시할 수 있는 근육층 내 근층간신경총에서는 발현이 전혀 없었다.

염증성 대장 (IL10R KO 마우스로부터 얻음)에서, 발현 패턴은 유사했으나 발현 수준은 상당히 감소했다.

IS98-135:

다음의 인간 조직에서 DNA53715 (서열 255, 마우스 FIZZ-1)를 검출 프로브로 사용했다: 위암종, 염증성 폐 (환자 3 명) (혈관, 폐포, 대기도(大氣道) 및 점액선), 대동맥, 심장, 태반 및 담낭.

마우스 DNA53715 (서열 255)는 대기도(大氣道) 상피에 있는 정상적인 마우스 폐에서 발현했고, 염증성 뮤린 폐 (기도 상피, 제II형 폐포세포)에서는 두드러진발현 증가가 있었다. 또한, 혈관 통로 주위 대장의 점막하조직에 있는 별개의 세포에서도 발현했다.

DNA84210:

하기에 나타낸 계내 연구에 다음의 프로브를 사용했다:

84210.p1 (F-79619): (서열 310)

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GCG GTC GCA GGA CAT TCA GTA-3'

84210.p2 (F-79620): (서열 311)

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA ACT CTT TGG GTT CCA GCA CAC-3'

DNA84210 (서열 285)은 태아 신장, 주로 피질 지역의 발생중인 사구체 및 세뇨관에서 발현했고, 또한 태아의 폐 및 척수에서도 약하게 발현했다. 또한, 발생중인 연골 및 뼈에 인접한 간질세포에서도 발현했다. 성체 조직에서는, 정상 기관지의 상피, 5 개의 폐종양 (2 개의 편평 및 3 개의 선암) 중 1 개 (선암) 및 연골육종에서 약한 발현이 관찰되었다. 피부 및 이의 부속물에서의 발현도 가능하지만, 이 절편은 접혀있어서, 검사하기 어려웠다.

IS99-102:

DNA84210 (서열 285)는 악성흑색종, 폐종양, 결장종양, 세포 펠렛, 마우스 조직, 태아 조직에서 발현했다.

DNA84210 (서열 285)의 발현은 여러 성체 (신생물 및 비-신생물) 및 태아 조직에서 관찰되었다. 정상 성체 조직에 관해서, DNA84210 (서열 285)은 피부의 표피 (대개는, 기저에 위치한 세포) 및 모낭(毛囊) 및 이들과 연결된 피지선 등의 피부 부속물에서 관찰되었다. 또한, 기관지 상피 및 점막하조직의 기관지선에서도 발현됨이 관찰되었다. 인간의 태아 조직에서는, DNA84210 (서열 285)의 발현이 피부 및 피부 부속물, 폐, 신장 피질 및 췌관에서 관찰되었다. 또한, 이는 발생중인 뼈 및 연골에 인접한 간엽세포에서도 관찰되었다. 마우스 배아에서는 혼성화 신호가 전혀 없었다. DNA84210 (서열 285)은 6 개의 직장결장 선암 중 1 개에서 발현 (약함)했고, 3 개의 폐 선암 중 2 개에서 발현 (하나는 강하지만 매우 국소적으로 발현했고, 하나는 매우 약한 양성이었음)했으며, 3 개의 폐 편평 세포 암종에서는 발현하지 않았고, 1 개의 연골육종에서는 발현 (약함)했다. 또한, 5 개의 악성흑색종 중 5 개에서 발현했고, 발현 강도의 범위는 매우 약함 내지 강함이었다. 또한, 이 절편들은 DNA84210 (서열 285)가 정상적인 표피 및 피부 부속물에서 발현함을 증명했다.

실시예 8

핵산의 혼성화 프로브로서의 PRO 폴리펩티드의용도

다음 방법은 PRO를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 혼성화 프로브로서의 용도를 기술한다.

인간 조직 cDNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리에서 동족성 DNA (예를 들면, 천연 변종을 코딩하는 것)를 스크리닝하기 위한 프로브로 전장 또는 성숙 PRO 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함하는 DNA가 사용된다.

이들 라이브러리 DNA를 포함하는 필터의 혼성화 및 세척을 다음의 고엄격 조건 하에 수행한다. 방사선 표지된 PRO 유도 프로브 (예를 들면, PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727)의 필터로의 혼성화를 42 ℃에서 50 ％ 포름아미드, 5×SSC, 0.1 ％ SDS, 0.1 ％ 피로인산나트륨, 50 mM 인산나트륨, pH 6.8, 2×덴하르트 (Denhardt's) 용액 및 10 ％ 덱스트란 술페이트 용액 중에 20 시간 동안 수행한다. 필터의 세척을 42 ℃에서 0.1×SSC 및 0.1 ％ SDS의 수용액 중에 수행한다.

그 후, 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 원하는 서열 동일성을 갖는 DNA를 당업계에 공지된 표준 방법으로 확인한다.

실시예 9

대장균에서 PRO 폴리펩티드의 발현

본 실시예는 대장균 내의 재조합 발현에 의해 PRO 폴리펩티드를 비글리코실화된 형태로 제조하는 방법을 설명한다.

먼저 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 증폭시킨다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위를 포함해야만 한다. 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예로는 앰피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 포함하는 pBR322 (대장균에서 유래; 문헌 (Bolivar et al., Gene 2:95 (1977)) 참조)가 있다. 벡터를 제한 효소로 절단하고 탈인산화시킨다. 그 후, PCR 증폭된 서열을 벡터에 라이게이션시킨다. 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리his 리더 (처음 6 개의 STII 코돈, 폴리his 서열 및 엔테로키나제 절단 부위를 포함), PRO 코딩 영역, 람다 전사 터미네이터 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 것이다.

그 후, 라이게이션 혼합물을 사용하여 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에 기재된 방법으로 선택된 대장균 균주를 형질전환시킨다. LB 플레이트에서의 성장 능력으로 형질전환체를 확인하고 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선택한다. 플라스미드 DNA를 제한 분석법 및 DNA 서열분석을 이용하여 단리하고 확인할 수 있다.

선택된 클론을 항생제가 보충된 LB 브로스와 같은 액체 배양 배지에서 밤새 배양한다. 이 철야 배양물을 더 큰 규모의 배지에 접종할 수 있다. 그 후, 세포를 발현 프로모터가 작동되는 동안 원하는 광학 밀도까지 배양시킨다.

수시간 이상 동안 세포를 배양한 후에 원심분리로 세포를 회수할 수 있다. 원심분리로 얻어진 세포 펠렛을 당업계에 공지된 여러가지 시약을 사용해서 용해시킬 수 있고, 용해된 PRO 폴리펩티드 단백질을 단백질이 강하게 결합하도록 하는 조건 하에 금속 킬레이트 컬럼을 사용하여 정제할 수 있다.

다음 방법을 사용하면 대장균에서 폴리-his 태그가 부착된 형태로 PRO 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 먼저 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 증폭시킨다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위, 및 효율적이고 신뢰할 만한 번역 개시, 금속 킬레이트 컬럼을 통한 빠른 정제, 엔테로키나제를 사용한 단백질 가수 분해 제거를 제공하는 다른 유용한 서열을 포함할 것이다. 그 후 PCR 증폭된, 폴리-his 태그가 부착된 서열을 발현 벡터에 라이게이션시키고 이것을 사용하여 대장균 숙주 (균주 52 (W3110fuhA (tonA) lon galE rpoHts (htpRts) clpP (lacIq))를 형질전환시킨다. 우선 형질전환체를 50 ㎎/㎖의 카르베니실린 (carbenicillin)을 포함하는 LB에서 O.D.600이 3 내지 5에 도달할 때까지 30 ℃에서 진탕 배양한다. 그 후, 배양물을 CRAP 배지 (물 500 ㎖ 중에 3.57 g의 (NH₄)₂SO₄, 0.71 g의 시트르산나트륨·2H₂O, 1.07 g의 KCl, 5.36 g의 Difco 효모 추출물, 5.36 g의 쉐필드 히카제 (Sheffield hycase) SF 뿐 아니라 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55 ％ (w/v) 글루코스 및 7 mM MgSO₄을 혼합하여 제조함)로 50 내지 100 배 희석하고, 약 20 내지 30 시간 동안 30 ℃에서 진탕 배양시킨다. 샘플을 취해 SDS-PAGE 분석법으로 발현을 확인하고 대량 배양물을 원심분리하여 세포를 펠렛으로 만든다. 정제하고 리폴딩시킬 때까지 세포 펠렛을 냉동시킨다.

0.5 내지 1 ℓ 발효액으로부터 얻은 대장균 페이스트 (펠렛 6 내지 10 g)를 10 배 부피 (w/v)의 7 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 8 완충액에 재현탁시킨다. 고체 아황산나트륨 및 테트라티온산나트륨을 각각 최종 농도 0.1 M과 0.02 M이 되도록 첨가하고 이 용액을 4 ℃에서 밤새 교반한다. 이 단계에서 모든 시스테인 잔기가 아황산염화에 의해 차단된 변성 단백질이 생성된다. 이 용액을 벡크만 (Beckman) 초원심 분리기로 40,000 rpm에서 30 분간 원심분리한다. 상층액을 3 내지 5 배 부피의 금속 킬레이트 컬럼 완충액 (6 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 7.4)으로 희석하고 0.22 마이크론 필터로 여과시켜 정화한다. 조건에 따라서 정화된 추출물을 금속 킬레이트 컬럼 완충액으로 평형화된 5 ㎖ 퀴아젠 Ni-NTA 금속 킬레이트 컬럼에 로딩한다. 컬럼을 50 mM 이미다졸 (칼바이오켐 (Calbiochem), 우트롤 (Utrol) 등급)을 포함하는 추가의 완충액 (pH 7.4)으로 세척한다. 단백질을 250 mM 이미다졸을 포함하는 완충액으로 용출시킨다. 목적 단백질을 포함하는 분획을 모아 4 ℃에 보관한다. 아미노산 서열을 기초로 계산된 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서의 흡광도로 단백질 농도를 측정한다.

새로 제조한 리폴딩 완충액 (20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mM 시스테인, 20 mM 글리신 및 1 mM EDTA로 구성됨)으로 샘플을 천천히 희석시켜 단백질을 리폴딩시킨다. 리폴딩 부피는 최종 단백질 농도가 50 내지 100 ㎍/㎖가 되도록 정한다. 리폴딩 용액을 4 ℃에서 12 내지 36 시간 동안 완만하게 교반한다. 최종 농도가 0.4 ％ (약 pH 3)가 되도록 TFA를 첨가하여 리폴딩 반응을 정지시킨다. 추가로 단백질을 정제하기 전에, 용액을 0.22 마이크론 필터로 여과시키고 아세토니트릴을 최종 농도 2 내지 10 ％가 되도록 첨가한다. 리폴딩된 단백질을 0.1 ％ TFA의 이동 완충액을 사용하는 Poros R1/H 역상 컬럼에 크로마토그래피시켜 10 내지 80 ％의 아세토니트릴 구배로 용출시킨다. A280 흡광도를 보이는 분획의 분액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하여 균질하게 리폴딩된 단백질을 포함하는 분획을 모은다. 일반적으로, 리폴딩된 단백질은 역상 수지와의 상호작용으로부터 가려지는 소수성 내부를 가져서 가장 압축되어 있기 때문에, 대부분의 단백질중에서 적절하게 리폴딩된 단백질 종 (species)은 아세토니트릴의 가장 낮은 농도에서 용출된다. 응집된 종은 보통 좀더 높은 아세토니트릴 농도에서 용출된다. 역상 단계는 원하는 형태의 단백질로부터 잘못 폴딩된 형태의 단백질을 분리해 낼 뿐 아니라, 샘플로부터 내독소를 제거하기도 한다.

원하는 폴딩된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모으고, 이 용액으로 질소 기류를 흘려주어 아세토니트릴을 제거한다. 투석법, 또는 제제화 완충액으로 평형화되고 멸균 여과된 G25 수퍼파인 (G25 Superfine) (파마샤) 수지를 사용한 겔 여과법을 사용하여 단백질을 0.14 M 염화나트륨 및 4 ％ 만니톨을 포함하는 20 mM Hepes, pH 6.8로 제제화한다.

실시예 10

포유류 세포에서 PRO 폴리펩티드의 발현

본 실시예는 포유류 세포내의 재조합 발현에 의해 잠재적 글리코실화된 형태의 PRO 폴리펩티드를 제조하는 방법을 설명한다.

벡터 pRK5 (1989년 3월 15일 공개된 EP 307,247 참조)를 발현 벡터로 사용한다. 경우에 따라, 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에 기재된 바와 같은 라이게이션 방법처럼 PRO DNA를 선택된 제한 효소를 사용하여 pRK5에 라이게이션시켜, 각각의 PRO DNA를 삽입시킨다. 생성 벡터는 예를 들면 pRK5-PRO라고 지칭된다.

한 실시양태에서, 선택된 숙주 세포는 293 세포일 수 있다. 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573)를 소 태아 혈청 및 경우에 따라 영양소 및(또는) 항생제가 보충된 DMEM과 같은 배지 중에 조직 배양 플레이트에서 전면 생장할 때까지 배양한다. pRK5-PRO DNA 약 10 ㎍을 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA (Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982)) 약 1 ㎍과 혼합하고, 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl₂500 ㎕ 중에 용해시킨다. 이 혼합물에 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO₄를 500 ㎕ 적가하고 25 ℃에서 10 분간 침전물을 형성하게 한다. 침전물을 현탁시켜 293 세포에 첨가하고 37 ℃에서 약 4 시간 동안 침강시킨다. 배양 배지를 흡인 제거하고 PBS 중의 20 ％ 글리세롤 2 ㎖를 30 초 동안 첨가한다. 그 후, 293 세포를 무혈청 배지로 세척하고 신선한 배지를 첨가하여 약 5 일 동안 인큐베이션한다.

형질감염 약 24 시간 후에 배양 배지를 제거하고 배양 배지 (단독) 또는 200 μCi/㎖³⁵S-시스테인 및 200 μCi/㎖³⁵S-메티오닌을 포함하는 배양 배지로 교체한다. 12 시간의 인큐베이션 후, 조정배지를 모아 스핀 필터로 농축시켜 15 ％ SDS 겔에 로딩한다. 처리된 겔을 건조시키고 적절한 시간동안 필름에 노출시켜 본 발명의 폴리펩티드 중 이 폴리펩티드의 존재를 확인할 수 있다. 형질감염된 세포를 포함하는 배양물을 추가로 인큐베이션할 수 있고 (무혈청 배지 중에), 선택한 생물분석법으로 배지를 시험한다.

별법의 기술로, 문헌 (Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981))에 기재되어 있는 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 pRK5-PRO를 293 세포에 일시적으로 도입시킬 수도 있다. 293 세포를 스핀 플라스크에서 최고 밀도가 되도록 배양하고 700 ㎍의 pRK5-PRO DNA를 첨가한다. 우선, 세포를 원심분리하여 스핀 플라스크로부터 농축하고 PBS로 세척한다. DNA-덱스트란 침전물을 4 시간 동안 세포 펠렛 상에서 인큐베이션한다. 세포를 20 ％ 글리세롤로 90 초 동안 처리하고 조직 배양 배지로 세척한 후, 조직 배양 배지, 5 ㎍/㎖의 소 인슐린 및 0.1 ㎍/㎖의 소 트랜스페린을 포함하는 스핀 플라스크에 다시 넣었다. 약 4 일 후에 조정배지를 원심분리하고 여과시켜 세포와 부스러기를 제거한다. 발현된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 농축시켜, 선택한 방법 (예를 들어 투석 및(또는) 컬럼 크로마토그래피)으로 정제할 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드를 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다. pRK5-PRO를 공지된 시약 (예를 들어 CaPO₄또는 DEAE-덱스트란)을 사용하여 CHO 세포로 형질감염시킬 수 있다. 상기한 바 같이, 세포 배양물을 인큐베이션할 수 있고, 배지를 배양 배지 (단독) 또는³⁵S-메티오닌과 같은 방사선 표지를 포함하는 배지로 교체할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 존재를 확인한 후, 배양 배지를 무혈청 배지로 교체할 수 있다. 바람직하게는, 배양물을 약 6 일 동안 인큐베이션하고 조정 배지를 회수한다. 발현된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 배지를 농축하여 선택한 어떤 방법으로도 정제할 수 있다.

에피토프 태그가 부착된 본 발명의 폴리펩티드도 CHO 숙주세포에서 발현시킬 수 있다. 본 발명의 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 pRK5 벡터로부터 서브클로닝할 수 있다. 서브클론 삽입체를 PCR을 통해 폴리-his 태그와 같은 선택된 에피토프 태그가 부착된 형태로 바쿨로바이러스 발현 벡터에 융합시킬 수 있다. 폴리-his 태그가 부착된 본 발명의 폴리펩티드 삽입체를 안정한 클론 선택을 위해 DHFR과 같은 선택 마커를 포함하는 SV40 유도 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 최종적으로, CHO 세포에 (상기에서와 같이) SV40 유도 벡터를 형질감염시킬 수 있다. 발현을 확인하기 위해서 상기와 같은 방법으로 표지할 수 있다. 그 후, 폴리-his 태그가 부착된 본 발명의 폴리펩티드의 발현물을 포함하는 배양 배지를 농축시켜 Ni²⁺-킬레이트 친화성 크로마토그래피와 같이 선택된 어떤 방법으로도 정제할 수 있다.

실시예 11

효모에서 PRO 폴리펩티드의 발현

다음 방법은 효모에서 원하는 PRO의 재조합 발현에 대해 기술한다.

우선, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 PRO 폴리펩티드를 세포내 생산 또는 분비하도록 효모 발현 벡터를 구축한다. 본 발명의 폴리펩티드 및 프로모터를 코딩하는 DNA를 PRO의 세포내 발현을 위해 선택한 플라스미드의 적합한 제한 효소 부위에 삽입한다. 분비의 경우, PRO를 코딩하는 DNA를 본 발명의 폴리펩티드 발현을 위해 ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 서열 PRO 신호 펩티드 또는 기타의 포유류 신호 펩티드또는 예를 들어 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 신호/리더 서열, 및 링커 서열 (필요한 경우)을 코딩하는 DNA와 함께 선택된 플라스미드에 클로닝할 수 있다.

그 후, 효모 세포 (예를 들어 효모 균주 AB110)를 상기 기재된 발현 플라스미드로 형질전환시키고 선택된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질전환된 효모 상층액을 10 ％ 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리한 후 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 분석할 수 있다.

이어서, 원심분리로 발효 배지로부터 효모 세포를 제거하고 선택된 카트리지 필터를 사용하여 배지를 농축시켜 재조합 PRO를 단리하고 정제할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 농축액을 선택된 컬럼 크로마토그래피 수지를 사용해서 더 정제할 수 있다.

실시예 12

바쿨로바이러스로 감염된 곤충 세포에서 PRO의 발현

다음 방법은 바쿨로바이러스로 감염된 곤충 세포에서 PRO의 재조합 발현에 대해 기술한다.

PRO를 코딩하는 서열을 바쿨로바이러스 발현 벡터에 포함되어 있는 에피토프 태그의 상류에 융합시킨다. 상기 에피토프 태그는 폴리-his 태그 및 면역글로블린 태그 (IgG의 Fc 영역과 같이)를 포함하고 있다. 시판되는 플라스미드, 예를 들어 pVL1393 (Novagen)에서 유도된 플라스미드를 포함하여 여러 가지 플라스미드를 사용할 수 있다. 간략하게, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열 또는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 코딩 서열의 원하는 부분 (예를 들어 막횡단 단백질의 세포외도메인을 코딩하는 서열 또는 단백질이 세포외 단백질이라면 성숙 단백질을 코딩하는 서열)을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭한다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 그 후 생산물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝한다.

재조합 바쿨로바이러스는 리포펙틴 (깁코-비알엘 (GIBCO-BRL)로부터 구입)을 이용하여 상기 플라스미드 및 BaculoGold™ 바이러스 DNA (파밍젠 (Phamingen))를 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)에 동시에 형질감염시켜 생성된다. 28 ℃에서 4 내지 5 일 동안 인큐베이션한 후에, 방출된 바이러스를 회수하여 이후의 증폭에 사용한다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌 (O'Reilley et al., Baculovirus Expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994))에 기재된 바와 같이 수행된다.

그 후, 폴리-his 태그가 부착된 본 발명의 폴리펩티드를 예를 들어 Ni²⁺-킬레이트 친화성 크로마토그래피로 다음과 같이 정제할 수 있다. 문헌 (Rupert et al.,Nature,362: 175-179 (1993))에 기재된 바와 같이 재조합 바이러스로 감염된 Sf9 세포로부터 추출액을 제조한다. 간략하게, Sf9 세포를 세척하여 초음파 처리 완충액 (25 ㎖ Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl₂; 0.1 mM EDTA; 10 ％ 글리세롤; 0.1 ％ NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고 빙상에서 20 초 동안 두 번 초음파 처리한다. 초음파 처리물을 원심분리로 제거하고 상층액을 로딩 완충액 (50 mM 인산,300 mM NaCl, 10 ％ 글리세롤, pH 7.8)에 50 배 희석하여 0.45 ㎛ 필터로 여과시킨다. Ni²⁺-NTA 아가로스 컬럼 (Quiagen으로부터 구입)을 5 ㎖ 충진 부피로 준비하여 물 25 ㎖로 세척하고 로딩 완충액 25 ㎖로 평형화시킨다. 여과시킨 세포 추출물을 분당 0.5 ㎖로 컬럼에 로딩한다. 컬럼을 로딩 완충액으로 A₂₈₀이 기준선에 도달할 때까지 세척하고, 점 분획 회수를 시작한다. 다음으로, 2 차 세척 완충액 (50 mM 인산; 300 mM NaCl, 10 ％ 글리세롤, pH 6.0)으로 컬럼을 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시킨다. A₂₈₀이 기준선에 다시 도달하면, 컬럼을 2 차 세척 완충액 중의 0 내지 500 mM의 이미다졸 구배로 전개시킨다. 1 ㎖ 분획들을 모아 SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알칼리 포스파타제에 결합된 Ni²⁺-NTA (퀴아젠)로 웨스턴 블럿팅하여 분석한다. 용출된 His₁₀태그가 부착된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모아 로딩 완충액으로 투석한다.

별법으로, IgG 태그가 부착된 (또는 Fc 태그가 부착된) PRO 폴리펩티드의 정제는 공지된 크로마토그래피 기술 (예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피)을 사용하여 수행될 수도 있다.

실시예 13

PRO에 결합하는 항체의 제조

본 실시예는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 제조 방법을 설명한다.

모노클로날 항체의 생산 기술은 당업계에 공지되어 있으며 문헌 (예를 들어 Goding, 상기 문헌)에 기재되어 있다. 이용할 수 있는 면역원으로는 정제된 본 발명의 폴리펩티드 자체, 본 발명의 폴리펩티드 각각을 포함하는 융합 단백질 및 세포 표면에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포가 포함된다. 당업자는 과도한 시행착오 없이도 면역원을 선택할 수 있다.

프로인드 (Freund's) 완전 아쥬반트에 에멀젼화시킨 본 발명의 폴리펩티드 면역원을 1 내지 100 ㎍의 양으로 피하 또는 복강내 주사하여 마우스 (예를 들어 Balb/c)를 면역화시킨다. 별법으로는 면역원을 MPL-TDM 아쥬반트 (미국 몬타나주 해밀톤 소재의 리비 이뮤노케미칼 리서치 (Ribi Immunochemical Research))에 에멀젼화시켜 동물의 뒷발바닥에 주사한다. 면역화된 마우스를 10 내지 12 일 후에, 선택된 아쥬반트에 에멀젼화시킨 추가의 면역원으로 부스팅한다. 그 이후, 수 주 동안 마우스를 추가의 면역화 주사로 부스팅할 수도 있다. 역회전 출혈법 (retro-orbital bleeding)으로 마우스로부터 혈청 샘플을 주기적으로 채취하여, ELISA 분석법을 시험하여 본 발명의 폴리펩티드 각각에 특이적인 항체를 검출할 수 있다.

적합한 항체 역가가 검출되면, 항체에 대해 "양성"인 동물에게 본 발명의 폴리펩티드 각각을 최종 정맥주사한다. 3 내지 4 일 후, 마우스를 희생시켜 비장 세포를 회수한다. 그 후, 비장 세포를 선택된 쥐의 골수종 세포주 (예를 들어 ATCC 번호 CRL 1597로부터 입수가능한 P3X63AgU.1)와 융합시킨다 (35 ％ 폴리에틸렌 글리콜 사용). 융합체는 비 융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장세포 하이브리드의 증식을 억제하는 HAT (히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지가 들어있는96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅될 수 있는 하이브리도마 세포를 생성한다.

본 발명의 폴리펩티드 각각에 대한 반응성으로 하이브리도마 세포를 ELISA로 스크리닝한다다. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 원하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 결정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

동계의 Balb/c 마우스가 항-PRO200, 항-PRO204, 항-PRO212, 항-PRO216, 항-PRO226, 항-PRO240, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO172, 항-PRO273, 항-PRO272, 항-PRO332, 항-PRO526, 항-PRO701, 항-PRO361, 항-PRO362, 항-PRO363, 항-PRO364, 항-PRO356, 항-PRO531, 항-PRO533, 항-PRO1083, 항-PRO865, 항-PRO770, 항-PRO769, 항-PRO788, 항-PRO1114, 항-PRO1007, 항-PRO1184, 항-PRO1031, 항-PRO1346, 항-PRO1155, 항-PRO1250, 항-PRO1312, 항-PRO1192, 항-PRO1246, 항-PRO1283, 항-PRO1195, 항-PRO1343, 항-PRO1418, 항-PRO1387, 항-PRO1410, 항-PRO1917, 항-PRO1868, 항-PRO205, 항-PRO21, 항-PRO269, 항-PRO344, 항-PRO333, 항-PRO381, 항-PRO720, 항-PRO866, 항-PRO840, 항-PRO982, 항-PRO836, 항-PRO1159, 항-PRO1358, 항-PRO1325, 항-PRO1338, 항-PRO1434, 항-PRO4333, 항-PRO4302, 항-PRO4430 또는 항-PRO5727 모노클로날 항체를 포함하는 복수 (腹水)를 생산하도록 양성 하이브리도마 세포를 복강 내에 주사할 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포를 조직 배양 플라스크 또는 롤러병에서 배양할 수도 있다. 황산암모늄 침전법에 이어 겔 배제 크로마토그래피를 수행하여 복수에서 생성된 모노클로날 항체를 정제할 수 있다. 별법으로, 항체의 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 결합을 기초로 하는 친화성 크로마토그래피를 이용할 수도 있다.

물질의 기탁

다음 물질들은 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었다.

물질 UNQ PRO ATCC # ATCC 기탁일

DNA29101-1276 174 200 209653 1998년 3월 5일

DNA30871-1157 178 204 209380 1997년 10월 16일

DNA30942-1134 186 212 209254 1997년 9월 16일

DNA33087-1158 190 216 209381 1997년 9월 16일

DNA33460-1166 200 226 209376 1997년 10월 16일

DNA34387-1133 214 240 209260 1997년 9월 16일

DNA35558-1167 209 235 209374 1997년 10월 16일

DNA35638-1141 219 245 209265 1997년 9월 16일

DNA35916-1161 146 172 209419 1997년 10월 28일

DNA39523-1192 240 273 209424 1997년 10월 31일

DNA40620-1183 239 272 209388 1997년 10월 17일

DNA40982-1235 293 332 209433 1997년 11월 7일

DNA44184-1319 330 526 209704 1998년 3월 26일

DNA44205-1285 365 701 209720 1998년 3월 31일

DNA45410-1250 316 361 209621 1998년 2월 5일

DNA45416-1251 317 362 209620 1998년 2월 5일

DNA45419-1252 318 363 209616 1998년 2월 5일

DNA47365-1206 319 364 209436 1997년 11월 7일

DNA47470-1130 313 356 209422 1997년 10월 28일

DNA48314-1320 332 531 209702 1998년 3월 26일

DNA49435-1219 334 533 209480 1997년 11월 21일

DNA50921-1458 540 1083 209859 1998년 5월 12일

DNA53974-1401 434 865 209774 1998년 4월 14일

DNA54228-1366 408 770 209801 1998년 4월 23일

DNA54231-1366 407 769 209804 1998년 4월 23일

DNA56405-1357 430 788 209849 1998년 5월 6일

DNA57033-1403 557 1114 209905 1998년 5월 27일

DNA57690-1374 491 1007 209950 1998년 6월 9일

DNA59220-1514 598 1184 209962 1998년 6월 9일

DNA59294-1381 516 1031 209866 1998년 5월 14일

DNA59776-1600 701 1346 203128 1998년 8월 18일

DNA59849-1504 585 1155 209986 1998년 6월 16일

DNA60775-1532 633 1250 203173 1998년 9월 1일

DNA61873-1574 678 1312 203132 1998년 8월 18일

DNA62814-1521 606 1192 203093 1998년 8월 4일

DNA64885-1529 630 1246 203457 1998년 11월 3일

DNA65404-1551 653 1283 203244 1998년 9월 9일

DNA65412-1523 608 1195 203094 1998년 8월 4일

DNA66675-1587 698 1343 203282 1998년 9월 22일

DNA68864-1629 732 1418 203276 1998년 9월 22일

DNA68872-1620 722 1387 203160 1998년 8월 25일

DNA68874-1622 728 1410 203277 1998년 9월 22일

DNA76400-2528 900 1917 203573 1999년 1월 12일

DNA77624-2515 859 1868 203553 1998년 12월 22일

DNA30868-1156 179 205 ----- 2000년 3월 2일

DNA36638-1056 21 21 209456 1997년 11월 12일

DNA38260-1180 236 269 209397 1997년 10월 17일

DNA40592-1242 303 344 209492 1997년 11월 21일

DNA41374-1312 294 333 ----- -------------

DNA44194-1317 322 381 209808 1998년 4월 28일

DNA53517-1366 388 720 209802 1998년 4월 23일

DNA53971-1359 435 866 209750 1998년 4월 7일

DNA53987-1438 433 840 209858 1998년 5월 12일

DNA57700-1408 483 982 203583 1999년 1월 12일

DNA59620-1463 545 836 209989 1998년 6월 16일

DNA60627-1508 589 1159 203092 1998년 8월 4일

DNA64890-1612 707 1358 203131 1998년 8월 18일

DNA66659-1593 685 1325 203269 1998년 9월 22일

DNA66667-1596 693 1338 203267 1998년 9월 22일

DNA68818-2536 739 1434 203657 1999년 2월 9일

DNA84210-2576 1888 4333 203818 1999년 3월 2일

DNA92218-2554 1866 4302 203834 1999년 3월 9일

DNA96878-2626 1947 4430 23-PTA 1999년 5월 4일

DNA98853-1739 2448 5727 203906 1999년 4월 6일

이들 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙 (부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정 하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30 년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크, 인크사와 ATCC 사이의 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시 (이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙 (37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.

본 출원의 양수인은 적합한 조건 하에 배양할 때 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 그 통지시 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.

앞서 기술한 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 본 발명은 기탁된 실시양태는 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되는 것이므로 기탁된 구조물의 범위에 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의 구조물은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 임의의 측면을 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명에 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업자에게는 명백하고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위 내에 있을 것이다.

Claims (44)

1. PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727 폴리펩티드, 이의 아고니스트 또는 단편 및 담체 또는 부형제를 포함하며, (a) 조직으로의 염증세포 침윤을 증가시킬 필요가 있는 포유동물에서 조직으로의 염증세포 침윤을 증가시키는 특성, (b) 면역 반응을 자극 또는 강화시킬 필요가 있는 포유동물에서 면역 반응을 자극 또는 강화시키는 특성, 또는 (c) 항원에 대한 반응시 T-림프구의 증식을 증가시킬 필요가 있는 포유동물에서 항원에 대한 반응시 T-림프구의 증식을 증가시키는 특성을 갖는, 면역 관련 질환의 치료에 유용한 조성물.
2. 제1항에 있어서, 유효량의 PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865,PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727 폴리펩티드, 이의 아고니스트, 길항제 또는 단편을 포함하는 조성물.
3. 제2항에 있어서, 성장억제제, 세포독성제 또는 화학요법제를 추가로 포함하는 조성물.
4. PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727 폴리펩티드, 이의 아고니스트 또는 단편의, (a) 조직으로의 염증세포 침윤을 증가시킬 필요가 있는 포유동물에서 조직으로의 염증세포 침윤을 증가시키는 특성, (b) 면역 반응을 자극 또는 강화시킬 필요가 있는포유동물에서 면역 반응을 자극 또는 강화시키는 특성, 또는 (c) 항원에 대한 반응시 T-림프구의 증식을 증가시킬 필요가 있는 포유동물에서 항원에 대한 반응시 T-림프구의 증식을 증가시키는 특성을 갖는 조성물의 제조를 위한 용도.
5. 제4항에 있어서, 유효량의 PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430, PRO5727 폴리펩티드, 이의 아고니스트, 길항제 또는 단편을 포함하는 것의 용도.
6. 제2항에 있어서, 성장억제제, 세포독성제 또는 화학요법제를 추가로 포함하는 조성물.
7. 면역 관련 장애의 치료가 필요한 포유동물에서 그 포유동물에게 유효량의 PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364,PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727 폴리펩티드, 이의 아고니스트 항체, 길항제 항체, 또는 단편을 투여하는 것을 포함하는, T 세포 매개성 장애 등과 같은 면역 관련 장애의 치료 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 장애가 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 골관절염, 유년형 만성 관절염, 척추관절증, 전신성 경화증, 특발성 염증성 근장애, 쇼그렌증후군 (Sjoegren's syndrome), 전신성 맥관염, 유육종증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판감소증, 갑상선염, 진성당뇨병, 면역매개성 신장 질환, 다발성 경화증, 특발성 탈수초다발성 신경염 또는 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome) 및 만성 염증성 탈수초다발성 신경염과 같은 중추 및 말초신경계의 탈수초 질환, 감염성 및 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염 및 경화성 담관염과 같은 간담즙성 질환, 염증성 장질환, 글루텐 민감성 장질환 및 휘플병 (Whipple's diesase), 수포성 피부 질환, 다형홍반 및 접촉성 피부염 등과 같은 자가면역 또는 면역매개성 피부 질환, 건선, 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증 및 두드러기와 같은 알러지성 질환, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유종 및 과민성 폐렴과 같은 폐의 면역 질환, 이식 거부 및 이식편대숙주질환 등의 이식 관련 질환에서 선택된 것인 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아고니스트 또는 길항제가 모노클로날 항체인 조성물 또는 이의 용도.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아고니스트 또는 길항제가 항체 단편 또는 단쇄 항체인 조성물 또는 이의 용도.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 항체가 비인간 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 및 인간 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 갖는 것인 조성물 또는 이의 용도.
12. PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430, PRO5727 폴리펩티드를 포함할 것이라고 추측되는 세포를 각각항-PRO200, 항-PRO204, 항-PRO212, 항-PRO216, 항-PRO226, 항-PRO240, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO172, 항-PRO273, 항-PRO272, 항-PRO332, 항-PRO526, 항-PRO701, 항-PRO361, 항-PRO362, 항-PRO363, 항-PRO364, 항-PRO356, 항-PRO531, 항-PRO533, 항-PRO1083, 항-PRO865, 항-PRO770, 항-PRO769, 항-PRO788, 항-PRO1114, 항-PRO1007, 항-PRO1184, 항-PRO1031, 항-PRO1346, 항-PRO1155, 항-PRO1250, 항-PRO1312, 항-PRO1192, 항-PRO1246, 항-PRO1283, 항-PRO1195, 항-PRO1343, 항-PRO1418, 항-PRO1387, 항-PRO1410, 항-PRO1917, 항-PRO1868, 항-PRO205, 항-PRO21, 항-PRO269, 항-PRO344, 항-PRO333, 항-PRO381, 항-PRO720, 항-PRO866, 항-PRO840, 항-PRO982, 항-PRO836, 항-PRO1159, 항-PRO1358, 항-PRO1325, 항-PRO1338, 항-PRO1434, 항-PRO4333, 항-PRO4302, 항-PRO4430 또는 항-PRO5727 항체에 노출시키고, 상기 항체가 상기 세포에 결합하는지를 측정하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드의 존재를 측정하는 방법.
13. (a) 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플, 및 (b) 세포 유형이 동일한 공지된 정상 조직 세포의 대조구 샘플에서 PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344,PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하고, 이때 대조구 샘플에 비해 시험 샘플에서의 발현 수준이 더 높거나 낮은 것이 그 시험 조직 세포를 얻은 포유동물에서 면역 관련 질환의 존재를 지시하는 것인, 포유동물에서의 면역 관련 질환의 진단 방법.
14. (a) 항-PRO200, 항-PRO204, 항-PRO212, 항-PRO216, 항-PRO226, 항-PRO240, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO172, 항-PRO273, 항-PRO272, 항-PRO332, 항-PRO526, 항-PRO701, 항-PRO361, 항-PRO362, 항-PRO363, 항-PRO364, 항-PRO356, 항-PRO531, 항-PRO533, 항-PRO1083, 항-PRO865, 항-PRO770, 항-PRO769, 항-PRO788, 항-PRO1114, 항-PRO1007, 항-PRO1184, 항-PRO1031, 항-PRO1346, 항-PRO1155, 항-PRO1250, 항-PRO1312, 항-PRO1192, 항-PRO1246, 항-PRO1283, 항-PRO1195, 항-PRO1343, 항-PRO1418, 항-PRO1387, 항-PRO1410, 항-PRO1917, 항-PRO1868, 항-PRO205, 항-PRO21, 항-PRO269, 항-PRO344, 항-PRO333, 항-PRO381, 항-PRO720, 항-PRO866, 항-PRO840, 항-PRO982, 항-PRO836, 항-PRO1159, 항-PRO1358, 항-PRO1325, 항-PRO1338, 항-PRO1434, 항-PRO4333, 항-PRO4302, 항-PRO4430 또는 항-PRO5727 항체를 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플과 접촉시키고, (b) 상기 항체와 시험 샘플 중의 PRO 폴리펩티드 사이의 복합체 형성을 검출하는 것을 포함하는, 포유동물에서의 면역 관련 질환의 진단 방법.
15. 항-PRO200, 항-PRO204, 항-PRO212, 항-PRO216, 항-PRO226, 항-PRO240, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO172, 항-PRO273, 항-PRO272, 항-PRO332, 항-PRO526, 항-PRO701, 항-PRO361, 항-PRO362, 항-PRO363, 항-PRO364, 항-PRO356, 항-PRO531, 항-PRO533, 항-PRO1083, 항-PRO865, 항-PRO770, 항-PRO769, 항-PRO788, 항-PRO1114, 항-PRO1007, 항-PRO1184, 항-PRO1031, 항-PRO1346, 항-PRO1155, 항-PRO1250, 항-PRO1312, 항-PRO1192, 항-PRO1246, 항-PRO1283, 항-PRO1195, 항-PRO1343, 항-PRO1418, 항-PRO1387, 항-PRO1410, 항-PRO1917, 항-PRO1868, 항-PRO205, 항-PRO21, 항-PRO269, 항-PRO344, 항-PRO333, 항-PRO381, 항-PRO720, 항-PRO866, 항-PRO840, 항-PRO982, 항-PRO836, 항-PRO1159, 항-PRO1358, 항-PRO1325, 항-PRO1338, 항-PRO1434, 항-PRO4333, 항-PRO4302, 항-PRO4430 또는 항-PRO5727 항체 또는 이의 단편 및 담체를 적절한 포장 내에 포함하는, 면역 관련 질환의 진단 키트.
16. 제15항에 있어서, PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325,PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727 폴리펩티드 검출을 위한 항체 사용 방법에 관한 지침서를 추가로 포함하는 키트.
17. 용기,

    용기상의 지침서, 및

    상기 용기 내에 들어있는 활성제 함유 조성물을 포함하며,

    상기 조성물은 포유동물에서 면역 반응의 억제 또는 완화에 효과적이고, 상기 용기상의 지침서는 상기 조성물이 면역 관련 질환의 치료에 사용될 수 있고, 이 조성물 중의 활성제가 PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727 폴리펩티드의 발현 및(또는) 활성을 억제하는 작용제임을 지시하는 것인 제조 용품.
18. 제17항에 있어서, 상기 활성제가 항-PRO200, 항-PRO204, 항-PRO212, 항-PRO216, 항-PRO226, 항-PRO240, 항-PRO235, 항-PRO245, 항-PRO172, 항-PRO273, 항-PRO272, 항-PRO332, 항-PRO526, 항-PRO701, 항-PRO361, 항-PRO362, 항-PRO363, 항-PRO364, 항-PRO356, 항-PRO531, 항-PRO533, 항-PRO1083, 항-PRO865, 항-PRO770, 항-PRO769, 항-PRO788, 항-PRO1114, 항-PRO1007, 항-PRO1184, 항-PRO1031, 항-PRO1346, 항-PRO1155, 항-PRO1250, 항-PRO1312, 항-PRO1192, 항-PRO1246, 항-PRO1283, 항-PRO1195, 항-PRO1343, 항-PRO1418, 항-PRO1387, 항-PRO1410, 항-PRO1917, 항-PRO1868, 항-PRO205, 항-PRO21, 항-PRO269, 항-PRO344, 항-PRO333, 항-PRO381, 항-PRO720, 항-PRO866, 항-PRO840, 항-PRO982, 항-PRO836, 항-PRO1159, 항-PRO1358, 항-PRO1325, 항-PRO1338, 항-PRO1434, 항-PRO4333, 항-PRO4302, 항-PRO4430 또는 항-PRO5727 항체인 제조 용품.
19. 후보 화합물과 PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727 폴리펩티드의 상호작용에 충분한 시간 및 조건 하에 이 두 성분들을 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 PRO 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물의 확인 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 후보 화합물 또는 상기 PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727 폴리펩티드가 고체 지지체상에 고정된 것인 방법.
21. 제20항에 있어서, 비고정 성분이 검출가능한 표지를 갖는 것인 방법.
22. 도 1 (서열 1), 도 3 (서열 11), 도 5 (서열 13), 도 7 (서열 18), 도 9 (서열 20), 도 11 (서열 25), 도 13 (서열 30), 도 15 (서열 35), 도 17 (서열 40), 도 19 (서열 45), 도 21 (서열 50), 도 23 (서열 56), 도 25 (서열 61), 도 27 (서열 66), 도 29 (서열 71), 도 31 (서열 79), 도 33 (서열 86), 도 35 (서열 91), 도 37 (서열 101), 도 39 (서열 106), 도 41 (서열 111), 도 43 (서열 116), 도 45 (서열 123), 도 47 (서열 133), 도 49 (서열 139), 도 51 (서열 141), 도 53 (서열 143), 도 55 (서열 145), 도 57 (서열 147), 도 59 (서열 149), 도 61 (서열 151),도 63 (서열 156), 도 65 (서열 158), 도 67 (서열 160), 도 69 (서열 162), 도 71 (서열 167), 도 73 (서열 169), 도 75 (서열 177), 도 77 (서열 179), 도 79 (서열 184), 도 81 (서열 186), 도 83 (서열 188), 도 85 (서열 190), 도 87 (서열 192), 도 89 (서열 228), 도 91 (서열 230), 도 93 (서열 232), 도 95 (서열 240), 도 97 (서열 248), 도 99 (서열 250), 도 101 (서열 255), 도 103 (서열 257), 도 105 (서열 266), 도 107 (서열 268), 도 109 (서열 270), 도 111 (서열 272), 도 113 (서열 274), 도 115 (서열 276), 도 117 (서열 278), 도 119 (서열 280), 도 121 (서열 285), 도 123 (서열 292), 도 125 (서열 294) 또는 도 127 (서열 296)에 나타낸 아미노산 서열로 구성되는 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과의 핵산 서열 동일성이 80 % 이상인 단리된 핵산.
23. 도 1 (서열 1), 도 3 (서열 11), 도 5 (서열 13), 도 7 (서열 18), 도 9 (서열 20), 도 11 (서열 25), 도 13 (서열 30), 도 15 (서열 35), 도 17 (서열 40), 도 19 (서열 45), 도 21 (서열 50), 도 23 (서열 56), 도 25 (서열 61), 도 27 (서열 66), 도 29 (서열 71), 도 31 (서열 79), 도 33 (서열 86), 도 35 (서열 91), 도 37 (서열 101), 도 39 (서열 106), 도 41 (서열 111), 도 43 (서열 116), 도 45 (서열 123), 도 47 (서열 133), 도 49 (서열 139), 도 51 (서열 141), 도 53 (서열 143), 도 55 (서열 145), 도 57 (서열 147), 도 59 (서열 149), 도 61 (서열 151), 도 63 (서열 156), 도 65 (서열 158), 도 67 (서열 160), 도 69 (서열 162), 도 71 (서열 167), 도 73 (서열 169), 도 75 (서열 177), 도 77 (서열 179), 도 79 (서열184), 도 81 (서열 186), 도 83 (서열 188), 도 85 (서열 190), 도 87 (서열 192), 도 89 (서열 228), 도 91 (서열 230), 도 93 (서열 232), 도 95 (서열 240), 도 97 (서열 248), 도 99 (서열 250), 도 101 (서열 255), 도 103 (서열 257), 도 105 (서열 266), 도 107 (서열 268), 도 109 (서열 270), 도 111 (서열 272), 도 113 (서열 274), 도 115 (서열 276), 도 117 (서열 278), 도 119 (서열 280), 도 121 (서열 285), 도 123 (서열 292), 도 125 (서열 294) 또는 도 127 (서열 296)에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 구성되는 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열과의 핵산 서열 동일성이 80 % 이상인 단리된 핵산.
24. 도 1 (서열 1), 도 3 (서열 11), 도 5 (서열 13), 도 7 (서열 18), 도 9 (서열 20), 도 11 (서열 25), 도 13 (서열 30), 도 15 (서열 35), 도 17 (서열 40), 도 19 (서열 45), 도 21 (서열 50), 도 23 (서열 56), 도 25 (서열 61), 도 27 (서열 66), 도 29 (서열 71), 도 31 (서열 79), 도 33 (서열 86), 도 35 (서열 91), 도 37 (서열 101), 도 39 (서열 106), 도 41 (서열 111), 도 43 (서열 116), 도 45 (서열 123), 도 47 (서열 133), 도 49 (서열 139), 도 51 (서열 141), 도 53 (서열 143), 도 55 (서열 145), 도 57 (서열 147), 도 59 (서열 149), 도 61 (서열 151), 도 63 (서열 156), 도 65 (서열 158), 도 67 (서열 160), 도 69 (서열 162), 도 71 (서열 167), 도 73 (서열 169), 도 75 (서열 177), 도 77 (서열 179), 도 79 (서열 184), 도 81 (서열 186), 도 83 (서열 188), 도 85 (서열 190), 도 87 (서열 192), 도 89 (서열 228), 도 91 (서열 230), 도 93 (서열 232), 도 95 (서열 240), 도 97(서열 248), 도 99 (서열 250), 도 101 (서열 255), 도 103 (서열 257), 도 105 (서열 266), 도 107 (서열 268), 도 109 (서열 270), 도 111 (서열 272), 도 113 (서열 274), 도 115 (서열 276), 도 117 (서열 278), 도 119 (서열 280), 도 121 (서열 285), 도 123 (서열 292), 도 125 (서열 294) 또는 도 127 (서열 296)에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 서열로 구성되는 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열과의 핵산 서열 동일성이 80 % 이상인 단리된 핵산.
25. ATCC 기탁번호 209653, 209380, 209254, 209381, 209376, 209260, 209374, 209265, 209419, 209424, 209388, 209433, 209704, 209720, 209621, 209620, 209616, 209436, 209422, 209702, 209480, 209859, 209774, 209801, 209802, 209849, 209905, 209950, 209962, 209866, 203128, 209986, 203173, 203132, 203093, 203457, 203244, 203094, 203282, 203276, 203160, 203277, 203573, 203553, ---------, 209456, 209397, 209492, ---------, 209808, 209802, 209750, 209858, 203583, 209989, 203092, 203131, 203269, 203267, 203657, 203818, 203834, 23-PTA, 203906으로 기탁된 DNA의 전장 코딩 서열과의 핵산 서열 동일성이 80 % 이상인 단리된 핵산.
26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
27. 제26항에 있어서, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포에 의해 인식되는 조절서열에 작동가능하게 연결된 벡터.
28. 제26항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
29. 제28항에 있어서, CHO 세포인 숙주 세포.
30. 제28항에 있어서, 대장균인 숙주 세포.
31. 제28항에 있어서, 효모 세포인 숙주 세포.
32. 제28항의 숙주 세포를 PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건으로 배양하고 이 세포 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드의 제조 방법.
33. 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 12), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 19), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16 (서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 57), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 80), 도 34 (서열 87), 도 36 (서열 92), 도 38 (서열 102), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 124), 도 48 (서열 134), 도 50 (서열 140), 도 52 (서열 142), 도 54 (서열 144), 도 56 (서열 146), 도 58 (서열 148), 도 60 (서열 150), 도 62 (서열 152), 도 64 (서열 157), 도 66 (서열 159), 도 68 (서열 161), 도 70 (서열 163), 도 72 (서열 168), 도 74 (서열 170), 도 76 (서열 178), 도 78 (서열 180), 도 80 (서열 185), 도 82 (서열 187), 도 84 (서열 189), 도 86 (서열 191), 도 88 (서열 193), 도 90 (서열 229), 도 92 (서열 231), 도 94 (서열 233), 도 96 (서열 241), 도 98 (서열 249), 도 100 (서열 251), 도 102 (서열 256), 도 104 (서열 258), 도 106 (서열 267), 도 108 (서열 269), 도 110 (서열 271), 도 112 (서열 273), 도 114 (서열 275), 도 116 (서열 277), 도 118 (서열 279), 도 120 (서열 281), 도 122 (서열 286), 도 124 (서열 293), 도 126 (서열 295) 또는 도 128 (서열 297)에 나타낸 아미노산 서열로 구성되는 군에서 선택된 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 80 % 이상인 단리된 폴리펩티드.
34. 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 12), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 19), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16 (서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 57), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 80), 도 34 (서열 87), 도 36 (서열 92), 도 38 (서열 102), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 124), 도 48 (서열 134), 도 50 (서열 140), 도 52 (서열 142), 도 54 (서열 144), 도 56 (서열 146), 도 58 (서열 148), 도 60 (서열 150), 도 62 (서열 152), 도 64 (서열 157), 도 66 (서열 159), 도 68 (서열 161), 도 70 (서열 163), 도 72 (서열 168), 도 74 (서열 170), 도 76 (서열 178), 도 78 (서열 180), 도 80 (서열 185), 도 82 (서열 187), 도 84 (서열 189), 도 86 (서열 191), 도 88 (서열 193), 도 90 (서열 229), 도 92 (서열 231), 도 94 (서열 233), 도 96 (서열 241), 도 98 (서열 249), 도 100 (서열 251), 도 102 (서열 256), 도 104 (서열 258), 도 106 (서열 267), 도 108 (서열 269), 도 110 (서열 271), 도 112 (서열 273), 도 114 (서열 275), 도 116 (서열 277), 도 118 (서열 279), 도 120 (서열 281), 도 122 (서열 286), 도 124 (서열 293), 도 126 (서열 295) 또는 도 128 (서열 297)에 나타낸 아미노산 서열로 구성되는 군에서 선택된 아미노산 서열과 비교할 때, 80 % 이상의 양성을 기록하는 단리된 폴리펩티드.
35. ATCC 기탁번호 209653, 209380, 209254, 209381, 209376, 209260, 209374, 209265, 209419, 209424, 209388, 209433, 209704, 209720, 209621, 209620, 209616, 209436, 209422, 209702, 209480, 209859, 209774, 209801, 209802,209849, 209905, 209950, 209962, 209866, 203128, 209986, 203173, 203132, 203093, 203457, 203244, 203094, 203282, 203276, 203160, 203277, 203573, 203553, ---------, 209456, 209397, 209492, ---------, 209808, 209802, 209750, 209858, 203583, 209989, 203092, 203131, 203269, 203267, 203657, 203818, 203834, 23-PTA, 203906으로 기탁된 DNA의 전장 코딩 서열이 코딩하는 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 80 % 이상인 단리된 폴리펩티드.
36. 이종 아미노산 서열에 융합된, 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자.
37. 제36항에 있어서, 상기 이종 아미노산 서열이 에피토프 태그 (tag) 서열인 키메라 분자.
38. 제36항에 있어서, 상기 이종 아미노산 서열이 면역글로불린의 Fc 영역인 키메라 분자.
39. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체
40. 제39항에 있어서, 모노클로날 항체, 인간화 항체 또는 단쇄 항체인 항체.
41. (a) 결합된 신호 펩티드가 없고, 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 12), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 19), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16 (서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 57), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 80), 도 34 (서열 87), 도 36 (서열 92), 도 38 (서열 102), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 124), 도 48 (서열 134), 도 50 (서열 140), 도 52 (서열 142), 도 54 (서열 144), 도 56 (서열 146), 도 58 (서열 148), 도 60 (서열 150), 도 62 (서열 152), 도 64 (서열 157), 도 66 (서열 159), 도 68 (서열 161), 도 70 (서열 163), 도 72 (서열 168), 도 74 (서열 170), 도 76 (서열 178), 도 78 (서열 180), 도 80 (서열 185), 도 82 (서열 187), 도 84 (서열 189), 도 86 (서열 191), 도 88 (서열 193), 도 90 (서열 229), 도 92 (서열 231), 도 94 (서열 233), 도 96 (서열 241), 도 98 (서열 249), 도 100 (서열 251), 도 102 (서열 256), 도 104 (서열 258), 도 106 (서열 267), 도 108 (서열 269), 도 110 (서열 271), 도 112 (서열 273), 도 114 (서열 275), 도 116 (서열 277), 도 118 (서열 279), 도 120 (서열 281), 도 122 (서열 286), 도 124 (서열 293), 도 126 (서열 295) 또는 도 128 (서열 297)에 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는

    (b) 결합된 신호 펩티드를 가지며, 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 12), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 19), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31),도 16 (서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 57), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 80), 도 34 (서열 87), 도 36 (서열 92), 도 38 (서열 102), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 124), 도 48 (서열 134), 도 50 (서열 140), 도 52 (서열 142), 도 54 (서열 144), 도 56 (서열 146), 도 58 (서열 148), 도 60 (서열 150), 도 62 (서열 152), 도 64 (서열 157), 도 66 (서열 159), 도 68 (서열 161), 도 70 (서열 163), 도 72 (서열 168), 도 74 (서열 170), 도 76 (서열 178), 도 78 (서열 180), 도 80 (서열 185), 도 82 (서열 187), 도 84 (서열 189), 도 86 (서열 191), 도 88 (서열 193), 도 90 (서열 229), 도 92 (서열 231), 도 94 (서열 233), 도 96 (서열 241), 도 98 (서열 249), 도 100 (서열 251), 도 102 (서열 256), 도 104 (서열 258), 도 106 (서열 267), 도 108 (서열 269), 도 110 (서열 271), 도 112 (서열 273), 도 114 (서열 275), 도 116 (서열 277), 도 118 (서열 279), 도 120 (서열 281), 도 122 (서열 286), 도 124 (서열 293), 도 126 (서열 295) 또는 도 128 (서열 297)에 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는

    (c) 결합된 신호 펩티드가 없고, 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 12), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 19), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16 (서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 57), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 80), 도 34 (서열 87), 도 36 (서열 92), 도 38 (서열 102), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 124), 도 48 (서열 134), 도 50 (서열 140), 도 52 (서열 142), 도 54 (서열 144), 도 56 (서열 146), 도 58 (서열 148), 도 60 (서열 150), 도 62 (서열 152), 도 64 (서열 157), 도 66 (서열 159), 도 68 (서열 161), 도 70 (서열 163), 도 72 (서열 168), 도 74 (서열 170), 도 76 (서열 178), 도 78 (서열 180), 도 80 (서열 185), 도 82 (서열 187), 도 84 (서열 189), 도 86 (서열 191), 도 88 (서열 193), 도 90 (서열 229), 도 92 (서열 231), 도 94 (서열 233), 도 96 (서열 241), 도 98 (서열 249), 도 100 (서열 251), 도 102 (서열 256), 도 104 (서열 258), 도 106 (서열 267), 도 108 (서열 269), 도 110 (서열 271), 도 112 (서열 273), 도 114 (서열 275), 도 116 (서열 277), 도 118 (서열 279), 도 120 (서열 281), 도 122 (서열 286), 도 124 (서열 293), 도 126 (서열 295) 또는 도 128 (서열 297)에 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과의 핵산 서열 동일성이 80 % 이상인 단리된 핵산.
42. (a) 결합된 신호 펩티드가 없고, 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 12), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 19), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16 (서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 57), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 80), 도 34 (서열 87), 도 36 (서열 92), 도 38 (서열 102), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 124), 도 48 (서열 134), 도 50 (서열 140), 도 52 (서열 142), 도 54 (서열 144), 도 56 (서열 146), 도 58 (서열 148),도 60 (서열 150), 도 62 (서열 152), 도 64 (서열 157), 도 66 (서열 159), 도 68 (서열 161), 도 70 (서열 163), 도 72 (서열 168), 도 74 (서열 170), 도 76 (서열 178), 도 78 (서열 180), 도 80 (서열 185), 도 82 (서열 187), 도 84 (서열 189), 도 86 (서열 191), 도 88 (서열 193), 도 90 (서열 229), 도 92 (서열 231), 도 94 (서열 233), 도 96 (서열 241), 도 98 (서열 249), 도 100 (서열 251), 도 102 (서열 256), 도 104 (서열 258), 도 106 (서열 267), 도 108 (서열 269), 도 110 (서열 271), 도 112 (서열 273), 도 114 (서열 275), 도 116 (서열 277), 도 118 (서열 279), 도 120 (서열 281), 도 122 (서열 286), 도 124 (서열 293), 도 126 (서열 295) 또는 도 128 (서열 297)에 나타낸 폴리펩티드, 또는

    (b) 결합된 신호 펩티드를 가지며, 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 12), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 19), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16 (서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 57), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 80), 도 34 (서열 87), 도 36 (서열 92), 도 38 (서열 102), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 124), 도 48 (서열 134), 도 50 (서열 140), 도 52 (서열 142), 도 54 (서열 144), 도 56 (서열 146), 도 58 (서열 148), 도 60 (서열 150), 도 62 (서열 152), 도 64 (서열 157), 도 66 (서열 159), 도 68 (서열 161), 도 70 (서열 163), 도 72 (서열 168), 도 74 (서열 170), 도 76 (서열 178), 도 78 (서열 180), 도 80 (서열 185), 도 82 (서열 187), 도 84 (서열 189), 도 86 (서열 191), 도 88 (서열 193), 도 90 (서열 229), 도 92 (서열 231), 도 94(서열 233), 도 96 (서열 241), 도 98 (서열 249), 도 100 (서열 251), 도 102 (서열 256), 도 104 (서열 258), 도 106 (서열 267), 도 108 (서열 269), 도 110 (서열 271), 도 112 (서열 273), 도 114 (서열 275), 도 116 (서열 277), 도 118 (서열 279), 도 120 (서열 281), 도 122 (서열 286), 도 124 (서열 293), 도 126 (서열 295) 또는 도 128 (서열 297)에 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는,

    (c) 결합된 신호 펩티드가 없고, 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 12), 도 6 (서열 14), 도 8 (서열 19), 도 10 (서열 21), 도 12 (서열 26), 도 14 (서열 31), 도 16 (서열 36), 도 18 (서열 41), 도 20 (서열 46), 도 22 (서열 51), 도 24 (서열 57), 도 26 (서열 62), 도 28 (서열 67), 도 30 (서열 72), 도 32 (서열 80), 도 34 (서열 87), 도 36 (서열 92), 도 38 (서열 102), 도 40 (서열 107), 도 42 (서열 112), 도 44 (서열 117), 도 46 (서열 124), 도 48 (서열 134), 도 50 (서열 140), 도 52 (서열 142), 도 54 (서열 144), 도 56 (서열 146), 도 58 (서열 148), 도 60 (서열 150), 도 62 (서열 152), 도 64 (서열 157), 도 66 (서열 159), 도 68 (서열 161), 도 70 (서열 163), 도 72 (서열 168), 도 74 (서열 170), 도 76 (서열 178), 도 78 (서열 180), 도 80 (서열 185), 도 82 (서열 187), 도 84 (서열 189), 도 86 (서열 191), 도 88 (서열 193), 도 90 (서열 229), 도 92 (서열 231), 도 94 (서열 233), 도 96 (서열 241), 도 98 (서열 249), 도 100 (서열 251), 도 102 (서열 256), 도 104 (서열 258), 도 106 (서열 267), 도 108 (서열 269), 도 110 (서열 271), 도 112 (서열 273), 도 114 (서열 275), 도 116 (서열 277), 도 118 (서열 279), 도 120 (서열 281), 도 122 (서열 286), 도 124 (서열 293), 도 126 (서열 295) 또는 도 128 (서열 297)에 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인과의 아미노산 서열 동일성이 80 % 이상인 단리된 폴리펩티드.
43. 유효량의 PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381, PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727 폴리펩티드를 PBMC 세포와 접촉시키고, 대조구 수준과의 T 세포 증식 변화치를 측정하는 것을 포함하는, T 세포 증식에 영향을 주는 방법.
44. 유효량의 PRO200, PRO204, PRO212, PRO216, PRO226, PRO240, PRO235, PRO245, PRO172, PRO273, PRO272, PRO332, PRO526, PRO701, PRO361, PRO362, PRO363, PRO364, PRO356, PRO531, PRO533, PRO1083, PRO865, PRO770, PRO769, PRO788, PRO1114, PRO1007, PRO1184, PRO1031, PRO1346, PRO1155, PRO1250, PRO1312, PRO1192, PRO1246, PRO1283, PRO1195, PRO1343, PRO1418, PRO1387, PRO1410, PRO1917, PRO1868, PRO205, PRO21, PRO269, PRO344, PRO333, PRO381,PRO720, PRO866, PRO840, PRO982, PRO836, PRO1159, PRO1358, PRO1325, PRO1338, PRO1434, PRO4333, PRO4302, PRO4430 또는 PRO5727 폴리펩티드를 시험 동물에 주사하고, 이로 인한 혈관 투과성 정도를 측정하는 것을 포함하는, 혈관 투과성에 영향을 주는 방법.