KR20010102961A - Integrated Portable Biological Detection System - Google Patents
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Abstract
본 발명자들은 미소조립된 전자칩에서 유전이동 (dielectrophoresis)에 의해 말초인간혈액으로부터 세균 및 암세포의 분리를 수행하였다. 분리된 세포는 형광성 염료로 핵을 염색하고, 이어서 레이저-유도된 형광성 영상에 의해서 검사하였다. 본 발명자들은 또한, 전자적으로 분리된 세포로부터 DNA 및 RNA를 유리시키고, DNA 증폭에 이어서 고정화된 포착프로브에 대해 전자적 하이브리드화시킴으로써 특이적 마커서열을 검출하였다. "칩상 실험실 (laboratory-on-a-chip)" 시스템을 제작하기 위한 노력이 제공되었으며, 여기에는 DNA 프로브, 염료, 시약 및 완전히 집적된 휴대용 기구의 기본형을 제공하는 것이 포함된다.The inventors have isolated bacteria and cancer cells from peripheral human blood by dielectrophoresis in microfabricated electronic chips. The isolated cells were stained nuclei with fluorescent dyes and then examined by laser-induced fluorescent imaging. We also detected specific marker sequences by releasing DNA and RNA from electronically isolated cells, and then DNA amplification followed by electronic hybridization to immobilized capture probes. Efforts have been made to build a “laboratory-on-a-chip” system, including providing a prototype of DNA probes, dyes, reagents and fully integrated handheld instruments.
Description
정부보조Government assistance
선진기술프로그램 (Advanced Technology Program)에 의해 수여된 허가번호 (Grant No.) ATP:70NANB7H3001에 따라 정부는 본 발명에 대해 권리를 갖는다.In accordance with Grant No. ATP: 70NANB7H3001 awarded by the Advanced Technology Program, the government has rights to the present invention.
이하의 설명은 본 발명과 관련된 정보에 대해 요약된 내용을 제공하는 것이다. 본 명세서에 제공된 정보 중의 어떤 것이라도 본 명세서에서 청구된 발명에 대한 선행기술로 인정되지 않으며, 또한 구체적으로 또는 암시적으로 언급된 문헌들 중의 어떤 것도 본 발명에 대한 선행기술로 인정되지 않는다.The following description provides a summary of the information related to the present invention. None of the information provided herein is recognized as prior art to the invention claimed herein, and none of the documents specifically or implicitly referred to is recognized as prior art to the present invention.
일반적으로, 생물학적으로 유도된 샘플물질의 분석은 샘플을 다수의 전-분선단계를 통해서 처리할 때 까지는 수행할 수 없다. 종종, 제조과정은 시간이 소모되고 노력이 많이 든다. 예를들어, 혈액 또는 조직세포와 같은 임상적 샘플에 대한 다수의 면역학적 및 분자-생물학적 진단분석은 세포를 파괴시키거나 용해시켜 목적하는 단백질 및 핵산 (즉, DNA 및 RNA)을 포함하는 분자를 유리시킨 다음에 이러한 단백질 및/또는 핵산을 정제함으로써 조샘플로부터 목적하는 분자를 분리하여야 한다. 처리단계를 수행한 후에야만 목적하는 분자의 분석을 시작할 수 있다. 또한, 샘플의 실제적인 분석에 사용되는 프로토콜 (protocol)은 유용한 데이타를 얻기 전에 다수의 더 많은 단계를 필요로 한다.In general, analysis of biologically derived sample material cannot be performed until the sample has been processed through a number of pro-stage steps. Often, the manufacturing process is time consuming and laborious. For example, many immunological and molecular-biological diagnostic assays for clinical samples, such as blood or tissue cells, destroy or lyse cells to produce molecules containing the proteins and nucleic acids of interest (ie, DNA and RNA). After release, the desired molecule must be separated from the crude sample by purifying these proteins and / or nucleic acids. Only after carrying out the treatment step can the analysis of the desired molecules begin. In addition, the protocol used for the actual analysis of the sample requires many more steps before obtaining useful data.
예를들어, 용액 중의 하전 및 비하전된 미립자 (예를들어, 세포성 물질 또는 그의 단백질 또는 핵산의 조추출물)는 유전이동 (dielectrophoresis)에 의해서 분리될 수 있다. 마이크로스케일 (microscale)에서, 유전이동은 슬라이드의 표면상에 도금된 노출된, 즉 벌거벗은 상호조합된 (interdigitated) 전극을 가지며 수백 마이크로리터의 부피를 갖는 유동챔버 (flow chamber)를 갖는 유리슬라이드-기본장치를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 장치를 사용하여 세포, 단백질 및 핵산은 적절한 전도성을 갖는 분리완충액 및 적합한 진폭 및 주파수를 갖는 AC 신호 (signal)를 사용함으로써 그들 각각의 유전적 특성을 기준으로하여 분리시킬 수 있다. 그러나, 이러한 장치는 유리표면 및 전극의 노출된 부분에 분리 및 비분리된 세포가 모두 비특이적으로 결합하는 것을 포함한 몇가지 문제점을 가지고 있다. 이러한 장치는 또한 유동챔버의 부피 (수백 마이크로리터)가 너무 커서 열대류가 일차적으로 전극에 유인되고 전극에 의해 보유된 세포 및 큰 분자와 같은 물질들을 교란시키고 전극에서 밀어낼 수 있다는 점에서 문제가 있다. 또한, 원치않는 세포 및 분자는 유체의 유동을 방해할 수 있고, 따라서 세척단계 중에 유동을 차단할 수 있기 때문에, 이러한 세포 및 분자는 목적하는 세포를 교란시키고 해체시키지 않으면서 표면에서 용이하게 세척되지 않는다.For example, charged and uncharged particulates (eg, crude extracts of cellular material or proteins or nucleic acids thereof) in solution can be separated by dielectrophoresis. In the microscale, the dielectric movement is a glass slide having a flow chamber with exposed, ie, bare interdigitated electrodes plated on the surface of the slide and having a volume of several hundred microliters. This can be done using the base unit. Using such a device, cells, proteins and nucleic acids can be separated on the basis of their respective genetic characteristics by using a separation buffer having appropriate conductivity and an AC signal having a suitable amplitude and frequency. However, these devices have some problems, including both non-specific binding of isolated and non-isolated cells to the glass surface and exposed portions of the electrodes. These devices are also problematic in that the volume of the flow chamber (hundreds of microliters) is so large that tropical flow is primarily attracted to the electrode and can perturb and repel materials such as cells and large molecules retained by the electrode. have. In addition, since unwanted cells and molecules can impede the flow of the fluid and thus block the flow during the washing step, these cells and molecules are not easily washed off the surface without disturbing and disassembling the desired cells. .
단백질 및 핵산을 유리시키기 위해서 전세포를 파괴시키는 통상적인 방법은 마이크로칩-기본 장치에 대해 반대되는 것으로서 마크로장치 (macrodevice)에서 일련의 고전압 DC 펄스 (pulse)를 사용하는 방법을 이용하는 것이다. 이러한 통상적인 전자용해기술 (electronic lysis technique)은 몇가지 문제를 갖는다. 예를들어, 일부 시판되고 있는 마크로-장치는 고분자량 (20 Kb 이상) 핵산을 유리시키지 않는 용해조건을 사용하는데, 이는 고분자량 분자는 이러한 방법을 사용하여 세포막에서 형성된 공극에 맞을 수 없기 때문이다. 또한, 유리된 핵산은 이들의 용해챔버의 표면에 대한 비특이적 결합으로 인하여 종종 소실된다. 이러한 물질의 손실은 특히 목적하는 분자가 저농도로 존재하는 경우에, 유전이동성 세포분리 마크로장치 시스템이 독립적으로 존재하는 시스템이어서 샘플분리가 진행됨에 따라 한 장치로부터 다른 장치로 물질을 이동시킬 때 샘플의 손실이 일어난다는 사실로 인해서 더욱 심하게 된다.A common method of destroying whole cells to release proteins and nucleic acids is to use a series of high voltage DC pulses in a macrodevice as opposed to microchip-based devices. This conventional electronic lysis technique has several problems. For example, some commercially available macro-devices use lysis conditions that do not liberate high molecular weight (20 Kb or more) nucleic acids because high molecular weight molecules cannot fit into the pores formed in the cell membrane using this method. . In addition, liberated nucleic acids are often lost due to nonspecific binding to the surface of their lysis chamber. This loss of material is a system in which the genetically mobile cell separation macrodevice system is an independent system, especially when the desired molecule is present in low concentrations, so that when the material is transferred from one device to another as the sample separation proceeds, This is made worse by the fact that losses occur.
조용해물의 처리는 종종 특별히 목적하는 성분으로부터 원치않는 세포성 성분들을 제거하기 위한 화학반응을 필요로 한다. 이들 반응은 일반적으로 용해물을 프로테이나제 K 및 제한효소 또는 뉴클레아제와 같은 효소반응에 적용시키는 것을 포함한다. 처리는 또한 스트랜드 치환증폭 (SDA) 또는 폴리머라제 연쇄반응 (PCR) 방법 등에 의한 증폭반응을 수행함으로써 목적하는 분자, 특히 핵산의 존재를 증진시키는 것을 포함할 수 있다. 이들 반응은 또한 독립적인 방법으로 수행된다. 이들 샘플 제조 및 처리단계를 수행한 후에만 데이타 검색 (data retrieval)을 위한 분석을 시작할 수 있다. 샘플 수집과 분석 사이에 다수의 단계가 존재하기 때문에, 대부분의 기술들은 감수성, 특이성 또는 재현성의 결여로 인하여 그의 적용이 제한된다.Treatment of crude lysates often requires chemical reactions to remove unwanted cellular components from the particular component of interest. These reactions generally involve lysates of proteinase K and enzymatic reactions such as restriction enzymes or nucleases. Treatment may also include enhancing the presence of the desired molecule, in particular nucleic acid, by carrying out an amplification reaction, such as by strand substitution amplification (SDA) or polymerase chain reaction (PCR) methods. These reactions are also carried out in independent ways. Only after performing these sample preparation and processing steps can the analysis for data retrieval begin. Since there are multiple steps between sample collection and analysis, most techniques are limited in their application due to lack of sensitivity, specificity or reproducibility.
전세포를 분리하고 동정하기 위해서 유전이동을 사용하기 위한 시도가 이루어졌다. 예를들어, 미합중국특허 제 4,326,934호 (Pohl)에는 연속적 유전이동에 의한 세포 분류를 위한 방법 및 기구가 기술되어 있다. 이러한 방법에 의해서 세포는 세포입자의 양성 및 음성 유전이동성 운동 둘다를 사용하여 분리된다. 분리된 세포는 양성 및 음성 전극을 통한 세포운동의 특징적인 편향거리 (deflection distance)를 조사함으로써 특정화시키고/시키거나 분류한다.Attempts have been made to use genetic migration to isolate and identify whole cells. For example, US Pat. No. 4,326,934 (Pohl) describes a method and apparatus for cell sorting by continuous genetic migration. By this method cells are separated using both positive and negative genophoretic movement of the cell particles. Isolated cells are characterized and / or classified by examining the characteristic deflection distances of cell movement through the positive and negative electrodes.
또 다른 예에서, 미합중국특허 제 5,344,535호 (Belts et al.)에는 유전이동에 의해서 미생물 및 다른 입자들을 특정화하기 위한 방법 및 기구가 기술되어 있다. 이 시스템에서, 세포는 이들의 특징적인 유전이동성 수집율을 매치시킴으로써 특정화된다.In another example, US Pat. No. 5,344,535 (Belts et al.) Describes a method and apparatus for characterizing microorganisms and other particles by genetic transfer. In this system, cells are characterized by matching their characteristic rate of genetic mobility collection.
또 다른 예로서, 미합중국특허 제 5,569,367호 (Belts et al.)에는 기구를 통한 세포의 유동을 방해하고 불균일 교류성 장을 적용하여 세포 타입이 분획으로 분화하는 것을 유도하도록 배열한 인터위브된 그리드-상 구조 (interweaved grid-like structure)로 이루어진 에너지가 주입된 상호조합 전극의 쌍을 사용하여 세포의 혼합물을 분리시키는 방법 및 기구가 기술되어 있다.As another example, US Pat. No. 5,569,367 (Belts et al.) Discloses an interweave grid-arranged to impede the flow of cells through the instrument and apply heterogeneous alternating growth to induce cell types to differentiate into fractions. A method and apparatus are described for separating a mixture of cells using a pair of energized intercombination electrodes made of an interweaved grid-like structure.
또한, 특정의 처리단계 또는 서브스텝 (substep)들을 함께 조합시키기 위한 다른 시도들이 있었다. 예를들어, 지지물질 상에서 DNA 프로브의 어레이 (array)를 제조하기 위한 다양한 마이크로로보트 시스템 (microrobotic system)이 제안되었다. 베아티 (Beattie) 등은 문헌 ("The 1992 San Diego Conference: Genetic Recognition", 1992. 11)에 유리기판 상의 각각의 미소조립된 샘플웰 내에 특정 DNA서열을 함유하는 마이크로-소적을 침착시키기 위한 마이크로로보트 시스템의 사용을 기술하였다.In addition, other attempts have been made to combine certain processing steps or substeps together. For example, various microrobotic systems have been proposed for producing arrays of DNA probes on support materials. Beattie et al. Described in "The 1992 San Diego Conference: Genetic Recognition", 1992.11, for micro-deposits containing specific DNA sequences in each microassembled sample well on a glass substrate. The use of the robotic system has been described.
단일 칩 또는 기판 상에 형성된 집적된 시스템을 설명하기 위한 그밖의 다양한 시도가 이루어졌는데, 여기에서는 전반적인 샘플제조 및 진단시스템의 다단계가 포함된다. 문헌 (A. Manz et al., "Miniaturized Total Chemical analysis System: A Novel Concept For Chemical Sensing",Sensors and Actuators, B1 (1990), pp. 244-248)에는 소형화된 TAS의 모듈라 (modular) 구조를 포함하는 '전화학분석시스템 (total chemical analysis system)' (TAS)이 기술되어 있다. 이 시스템에서는 샘플수송, 화학반응, 크로마토그라피 분리 및 검출이 자동으로 수행되도록 하였다.Various other attempts have been made to describe an integrated system formed on a single chip or substrate, which includes multiple steps in the overall sample manufacturing and diagnostic system. A. Manz et al., “Miniaturized Total Chemical Analysis System: A Novel Concept For Chemical Sensing”, Sensors and Actuators , B1 (1990), pp. 244-248, describe the modular structure of miniaturized TAS. Including 'total chemical analysis system' (TAS) is described. In this system, sample transport, chemical reactions, chromatographic separation and detection were performed automatically.
스태플톤 (Stapleton)에 의해서 제안된 또 다른 집적된 시스템으로 미합중국특허 제 5,451,500호에는 표적 핵산서열의 자동화된 검출을 위한 시스템이 기술되어 있다. 이 시스템에서는 다중 생물학적 샘플을 이차원 형식으로 캐리어를 함유하는 매트릭스에 개별적으로 혼입시킨다.Another integrated system proposed by Stapleton, US 5,451,500, describes a system for automated detection of target nucleic acid sequences. In this system, multiple biological samples are separately incorporated into a matrix containing carriers in a two-dimensional format.
다중적 관점의 생물학적 샘플 제조 또는 분석을 수행하기 위한 다양한 다중전극시스템이 공지되었다. 미합중국특허 제 4,908,112호 (Pace; 발명의 명칭 "Silicon Semiconductor Wafer for Analyzing Micronic Biological Samples")에는 모세관 크기의 도관이 반도체 장치 내의 채널 (channel)에 의해서 형성되어 있으며, 전극이 도관을 통한 액체의 운동을 활성화시키도록 채널 내에 배치되어 있는 분석용 분리장치가 기술되어 있다. 또한, 미합중국특허 제 5,126,022호 (Soane et al.; 발명의 명칭 "Method and Device for Moving Molecules by the Application of a Plurality of Electrical Fields")에는 전극에 전위를 적용함으로써 물질들이 트렌치 (trench)를 통해서 이동하도록 한 시스템이 기술되어 있는데, 여기에서 선택된 성분들은 매질내에서 이동하거나 보조성분, 염료, 형광성 태그 (tags), 방사성표지물, 효소-특이적 태그, 또는 물리적 또는 화학적 성질의 다양한 변형과 같은 다수의 목적을 위한 다른 형태의 화학물질과 접촉하도록 이동하는 소정의 하전된 입자와 반응성인 항원-항체로 충진된 다양한 트렌치쪽으로 이동하도록 유도된다.또한, 미합중국특허 제 5,194,133호 (Clark, et al.; 발명의 명칭 "Sensor Devices")에는 유체가 채널을 따라서 통과함에 따라 샘플유체의 분리가 일어나도록 하기 위해서 전분, 아가로즈, 알기네이트, 카라게난 또는 폴리아크릴아미드 폴리머겔과 같은 물질을 함유하는 연장된 마이크로-기계화 채널이 형성되어 있는 표면을 갖는 기판을 포함하는 샘플유체 분석용 센서장치가 기술되어 있다. 생물학적 물질은 예를들어, 결합단백질, 항체, 렉틴, 효소, 효소의 서열 또는 지질을 함유할 수 있다.Various multielectrode systems are known for performing biological sample preparation or analysis from multiple perspectives. In US Pat. No. 4,908,112 (Pace; invention titled "Silicon Semiconductor Wafer for Analyzing Micronic Biological Samples"), a conduit of capillary size is formed by a channel in a semiconductor device, the electrode of which is responsible for the movement of liquid through the conduit. An analytical separation device is described that is disposed within the channel for activation. In addition, U.S. Patent No. 5,126,022 (Soane et al .; titled "Method and Device for Moving Molecules by the Application of a Plurality of Electrical Fields") also applies materials to electrodes by moving potentials through trenches. A system is described which allows the selected components to move in the medium or to be subjected to a number of modifications, such as auxiliary components, dyes, fluorescent tags, radiolabels, enzyme-specific tags, or various modifications of physical or chemical properties. It is directed to migrate toward various trenches filled with antigen-antibodies that are reactive with certain charged particles that move to contact other types of chemicals for purposes. See also US Pat. No. 5,194,133 (Clark, et al .; The name "Sensor Devices" is used to control starch, agarose, A sensor apparatus for sample fluid analysis is described that includes a substrate having a surface on which extended micro-mechanized channels containing materials such as alginate, carrageenan or polyacrylamide polymer gels are formed. Biological substances may contain, for example, binding proteins, antibodies, lectins, enzymes, sequences of enzymes or lipids.
다양한 표면으로부터 DNA를 용출시키기 위한 다양한 장치가 공지되어 있다. 예를들어, 미합중국특허 제 5,340,449호 (Shukla; 발명의 명칭 "Apparatus for Electroelution")는 전기장에서 폴리아크릴아미드, 아가로즈 및 PVDF와 같은 막 등의 고체상 매트릭스물질로부터 단백질 및 핵산과 같은 거대분자를 용출시키기 위한 시스템 및 방법을 기술하고 있다. 물질들은 분자량 컷오프 (cut-off) 막에 의해서 부분적으로 규정된 부피로 고체상으로부터 용출된다. 또한, 미합중국특허 제 5,434,049호 (Okano, et al.; 발명의 명칭 "Separation of Polynucleotides Using Supports Having a Plurality of Elelctrode-Containing Cells")는 샘플 내의 다수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 방법을 기술하고 있는데, 이 방법은 각각의 챔버에 전위를 적용하여 전극으로 작용하도록 함으로써 포착된 표적 폴리뉴클레오타이드를 용출시키는 단계를 포함하며, 용출된 물질은 그후에 수집에 이용할 수 있다.Various devices are known for eluting DNA from various surfaces. For example, US Pat. No. 5,340,449 (Shukla; invention name "Apparatus for Electroelution") elutes macromolecules such as proteins and nucleic acids from solid phase matrix materials such as polyacrylamide, agarose and PVDF in an electric field. Systems and methods are described for this purpose. The materials are eluted from the solid phase in a partially defined volume by a molecular weight cut-off membrane. In addition, US Pat. No. 5,434,049 (Okano, et al .; titled “Separation of Polynucleotides Using Supports Having a Plurality of Elelctrode-Containing Cells”) describes a method for detecting multiple target polynucleotides in a sample. The method includes eluting the captured target polynucleotide by applying an electric potential to each chamber to act as an electrode, and the eluted material can then be used for collection.
핵산 진단을 수행하기 위한 그밖의 다른 장치도 디자인되었는데, 여기에서는미합중국특허 제 5,856,174호 (R. Lipshutz et al.; 발명의 명칭 "Integrated Nucleic Acid Diagnostic Device") 및 미합중국특허 제 5,922,591호 (R. Anderson, et al.; 발명의 명칭 "Integrated Nucleic Acid Diagnostic Device")에서와 같이 샘플 제조 및 분석을 수행하기 위해 적어도 2개의 반응챔버가 필요하다.Other devices for designing nucleic acid diagnostics have also been designed, including U.S. Pat. At least two reaction chambers are required to perform sample preparation and analysis, as in the et al. (Integrated Nucleic Acid Diagnostic Device).
문헌 (P. Wilding, et al., "Integrated cell isolation and PCR analysis using silicon microfilter-chambers,"Anal. Biochem., '257, pp. 95-100, 1998; 및 P.C.H. Li and D.J. Harrison, "Transport, manipulation, and reaction of biological cells on-chip using electrokinetic effects,"Anal. Chem., 69, pp. 1564-1568, 1997)에서와 같이 완전한 샘플취급 시스템의 부분집적에 대하여 또 다른 성취가 이루어졌다.P. Wilding, et al., "Integrated cell isolation and PCR analysis using silicon microfilter-chambers," Anal. Biochem. , '257, pp. 95-100, 1998; and PCH Li and DJ Harrison, "Transport, Another achievement has been made for partial integration of a complete sample handling system, as in manipulation, and reaction of biological cells on-chip using electrokinetic effects, " Anal. Chem. , 69, pp. 1564-1568, 1997).
또한, 문헌 (M.A. Burns, et al., "An integrated nanoliter DNA analysis device,"Science, 282, pp. 484-487, 1998; S.C. Jacobson and J.M. Ramsey, "Integrated microdevice for DNA restriction fragment analysis,"Anal. Chem., 68, pp. 720-723, 1996; L.C. Waters, et al., "Microchip device for cell lysis, multiplex PCR amplification, and electrophoretic sizing,"Anal. Chem., 70, pp. 158-162, 1998; 및 A.T. Woolley et al., "Functional integration of PCR amplification and capillary electrophoresis in a microfabricated DNA analysis device,"Anal. Chem., 68, pp. 4081-4086, 1996)에서와 같이 검출과 화학반응을 통합시키는 또 다른 시도들이 이루어졌다.See also, MA Burns, et al., "An integrated nanoliter DNA analysis device," Science , 282, pp. 484-487, 1998; SC Jacobson and JM Ramsey, "Integrated microdevice for DNA restriction fragment analysis," Anal. Chem. , 68, pp. 720-723, 1996; LC Waters, et al., "Microchip device for cell lysis, multiplex PCR amplification, and electrophoretic sizing," Anal. Chem. , 70, pp. 158-162, 1998 And AT Woolley et al., "Functional integration of PCR amplification and capillary electrophoresis in a microfabricated DNA analysis device," Anal. Chem. , 68, pp. 4081-4086, 1996). Another attempt was made.
일반적으로, 전술한 예로부터 알 수 있는 바와 같이, 전자적으로 활성인 마이크로칩을 사용하는 시스템에 응답하도록 완전히 집적된 일체 완비된 샘플에 대해 충분히 준비되지 않은 시스템 및 방법이 기술되어 있다. 더구나, 다수의 기술된 시스템은 다단계 및 공정 중이나 공정들 사이에 사람이 개입해야 할 필요성이 있어서 매우 노동 및 시간 집약적이며, 이들은 함께 샘플의 손실, 오염 및 작동자의 실수를 참작한다면 최적 이하이다. 또한, 개개 공정을 수행하기 위해서 복합적인 기계 또는 복잡한 로보트 시스템을 사용하는 다중 공정단계의 사용은 경비 및 물리적 공간의 필요성 둘다의 관점에서 대규모 실험실을 제외하고는 종종 금지되고 있다. 상기 언급한 바와 같은 이유로, 이들 기술은 한정적이며 부족하다. 이들은 단일의 전자적으로 어드레스 가능한 마이크로칩 상에서, 완전한 일체 구비된 집적된 진단분석, 특히 핵산 및 단백질-유도된 정보을 위한 데이타 검색을 위한 분석을 수행할 수 있는 시스템을 형성하도록 용이하게 조합되지 않는다. 복잡한 유체공학 및 부적합한 밸브 시스템이 없는 이러한 집적시스템에 대해서 오랫동안 인식되어 온 필요성에도 불구하고, 만족스러운 해결책은 아직 제안되지 않았다. 따라서, 분리된 세포의 개선된 생물학적 안정성 뿐 아니라 생물학적 세포의 개선된 유전이동성 분리를 유도하는 방법 및 장치에 대한 필요성이 지속되고 있고, 또한 세포 제조 및 분석을 개선시키고 복잡한 유체공학이 없이 단일의 일체 구비된 시스템에서 세포분리, 제조, 정제 및 분석을 통합시킬 수 있는 방법 및 장치에 대한 필요성도 지속되고 있다.In general, as can be seen from the examples above, systems and methods are described that are not sufficiently prepared for fully-integrated samples that are fully integrated to respond to systems using electronically active microchips. Moreover, many of the described systems are very labor and time intensive due to the need for human intervention between the multistage and in-process or between processes, which together are less than optimal given the loss of samples, contamination and operator error. In addition, the use of multiple process steps using complex machines or complex robotic systems to perform individual processes is often prohibited except in large laboratories in terms of both cost and physical space needs. For the reasons mentioned above, these techniques are limited and lacking. They are not easily combined to form a system capable of performing a fully integrated integrated diagnostic assay on a single electronically addressable microchip, especially for data retrieval for nucleic acid and protein-derived information. Despite the long recognized need for such integrated systems without complex fluid engineering and inadequate valve systems, satisfactory solutions have not yet been proposed. Thus, there is a continuing need for methods and apparatus for inducing improved genetic mobility of biological cells as well as improved biological stability of isolated cells, and also to improve cell manufacturing and analysis and to integrate a single unit without complex fluid engineering. There is a continuing need for methods and apparatus that can integrate cell separation, preparation, purification and analysis in the system provided.
발명의 요약Summary of the Invention
따라서, 본 발명에서는 전자적으로 어드레스 가능한 마이크로칩을 최소의 수로 사용하여 활성인 집적된 다단계 샘플 분리 및 생물학적 샘플의 분자진단분석을 수행하기 위한 집적된 휴대용 시스템 및 장치가 제공된다.Accordingly, the present invention provides an integrated portable system and apparatus for performing active integrated multistage sample separation and molecular diagnostic analysis of biological samples using a minimal number of electronically addressable microchips.
바람직한 구체예에서, 시스템 및 장치는 세포의 혼합된 집단으로부터 사전선택된 진핵 및/또는 원핵세포의 분리, 제조 및 분석을 수행하기 위해서 단일 유동셀 요소 (single flow cell element)를 갖는다. 이 단일 유동셀 요소는 그 안에 개개 전극의 그리드 (grid)를 갖는 전자적으로 어드레스 가능한 마이크로칩을 포함한다. 그리드는 다수의 개개 전극을 함유할 수 있으며, 전자기술분야에서 잘 이해되고 있는 바와 같이 실리콘 웨이퍼 (wafer) 상에서 제작될 수 있다. 일반적으로, 이러한 그리드는 대략 4 내지 25 내지 100 또는 10,000 또는 그 이상 까지의 개개 전극을 포함할 수 있다. 이 단일 유동셀의 구체예는 전자그리드를 포함하는 유동셀이 목적하는 세포-유도된 물질 각각의 분리, 용해, 세정, 및 이러한 물질의 분석을 위한 세포의 단순한 유체조작을 성취할 수 있도록 고안된 것이다. 사전선택된 진핵 및 원핵세포는 어떠한 타입 (예를들어, 혈액세포, 암세포, 간세포, 세균 등)이라도 될 수 있으며, 어떠한 공급원 (예를들어, 동물, 조직생검, 혈액, 기관, 법정상의 샘플, 변, 물 등)으로부터도 수득될 수 있다. 예를들어 전혈액으로부터 분리될 수 있는 세포의 구체적인 예에는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 스타필로코커스 에피더무스 (Staphylococcus epidermus), 마이크로코커스 라이소데이크티쿠스 (Micrococcus lysodeikticus) 및 배양된 경부암세포가 포함된다.In a preferred embodiment, the systems and devices have a single flow cell element to perform isolation, preparation and analysis of preselected eukaryotic and / or prokaryotic cells from a mixed population of cells. This single flow cell element comprises an electronically addressable microchip having a grid of individual electrodes therein. The grid may contain a number of individual electrodes and may be fabricated on a silicon wafer as is well understood in the art. In general, such grids may include approximately 4 to 25 to 100 or 10,000 or more individual electrodes. This single flow cell embodiment is designed so that a flow cell comprising an electronic grid can achieve simple fluid manipulation of the cells for separation, lysis, washing, and analysis of each of the desired cell-derived materials. . Preselected eukaryotic and prokaryotic cells can be of any type (e.g., blood cells, cancer cells, hepatocytes, bacteria, etc.) and can be of any source (e.g. animal, tissue biopsy, blood, organ, legal sample, stool). , Water and the like). For example, specific examples of cells that can be isolated from whole blood include Escherichia coli , Salmonella typhimurium , Staphylococcus epidermus , Microcacus lysodate tea Cocous ( Micrococcus lysodeikticus ) and cultured cervical cancer cells are included.
대체가능한 구체예로, 본 발명의 장치는 다양한 샘플 제조단계를 수행하거나 제조된 샘플을 분석하기 위한 적어도 하나의 추가의 유동챔버를 포함할 수 있다. 예를들어, 한가지 대체가능한 구체예에서 시스템은 각각 전자적으로 어드레스 가능한 마이크로칩을 갖는 제 1 및 2 유동셀 챔버를 포함한다. 이 대체가능한 구체예에서는, 제 1 챔버를 사용하여 세포를 분리 및 용해시키고 샘플 제조단계를 수행할 수 있는 반면에, 제 2 챔버를 사용하여서는 제 2 유동셀 마이크로칩 상에서 직접적으로 샘플 물질을 분석한다.In an alternative embodiment, the apparatus of the present invention may comprise at least one additional flow chamber for performing various sample preparation steps or for analyzing the produced sample. For example, in one alternative embodiment the system includes first and second flow cell chambers each having an electronically addressable microchip. In this alternative embodiment, the first chamber can be used to separate and lyse the cells and perform sample preparation steps, while the second chamber is used to analyze the sample material directly on the second flow cell microchip. .
적어도 2개의 유동셀을 포함하는 또 다른 대체가능한 구체예에서, 제 1 유동셀은 전자적으로 어드레스 가능한 그리드를 갖지 않으며, 여기에는 적어도 셀 내에서 물질의 온도를 조절하기 위해서 사용될 수 있는 가열요소가 부착되어 있다. 제 2 유동셀은 샘플물질의 분석을 수행하는데 사용하기 위한 전자적으로 어드레스 가능한 마이크로어레이 (microarray)를 갖도록 고안된다.In another alternative embodiment comprising at least two flow cells, the first flow cell does not have an electronically addressable grid, to which is attached at least a heating element which can be used to regulate the temperature of the material in the cell. It is. The second flow cell is designed to have an electronic addressable microarray for use in conducting analysis of the sample material.
이용되는 구체예와 관계없이, 본 발명의 시스템은 (1) 진핵세포 타입을 서로 분리시킬 뿐 아니라 진핵세포 타입을 원핵세포 타입으로부터 분리시키고, (2) 샘플물질을 직접 처리하여 조물질 상태로부터 더 순화된 상태로 만들고, (3) 마이크로칩 상에서 샘플물질을 직접 분석하는 능력을 제공한다. 이러한 능력은 1 레벨의 전압에서 전자 바이아싱 (electronic biasing)을 유전전류 형태로 새롭게 사용하여 세포의 유전이동을 야기시키고, 이어서 전압을 상승시켜 포착된 세포를 용해시킨 다음, 다시 유동셀(들)의 어레이 상에서 특정 전극의 어드레스를 위하여 바이아싱의 방식을 교류 모드로부터 직류 모드로 변화시켜 전극 어레이에 이미 결합된 프로브에 대한 포착/하이브리드화를 위해서 목적하는 분자의 이송을 유도함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명의 시스템은 또한, 다른 적절한 샘플제제 시약을 배관 (tubing) 및 솔레노이드 (solenoid) 구동 밸브 및 펌프의 단순화된 배열에 의해서 유동셀(들)에 이송되고 유동셀(들)로부터 제거하도록 고안된다. 또한, 마이크로칩이 없는 제 1 유동챔버를 갖는 구체예에서 시스템은 샘플 내의 세포를 직접 용해시키고 목적하는 물질을 세포 타입을 분리할 필요없이 직접 분석하는 능력을 갖도록 만든다. 이러한 구체예에서, 유동셀은 샘플 내의 세포의 직접적인 용해를 위해서 온도를 상승시키기 위해 사용될 수 있는 가열요소를 갖는다. 이러한 용해에 이어서, 프로테아제 처리 또는 핵산 증폭과 같은 샘플제조단계를 수행할 수 있고, 계속해서 증폭된 종을 전자적으로 어드레스 가능한 마이크로칩을 함유하는 제 2 유동셀에 이송시킬 수 있다.Regardless of the embodiment used, the system of the present invention (1) not only separates the eukaryotic cell types from each other, but also separates the eukaryotic cell types from the prokaryotic cell types, and (2) processes the sample material directly to further remove it from the crude state. It is purified and (3) provides the ability to directly analyze the sample material on the microchip. This ability uses electronic biasing in the form of dielectric currents at one level of voltage, causing cell migration, then raising the voltage to dissolve the captured cells and then back to the flow cell (s). By changing the method of biasing from alternating current mode to direct current mode for the address of a particular electrode on the array of s, it is possible to induce the transfer of the desired molecule for capture / hybridization of the probe already bound to the electrode array. The system of the present invention is also designed to transfer and remove other suitable sample preparation reagents to and from the flow cell (s) by a simplified arrangement of tubing and solenoid drive valves and pumps. . In addition, in embodiments with a first flow chamber without microchip, the system allows the ability to directly lyse the cells in the sample and directly analyze the desired material without the need to separate cell types. In this embodiment, the flow cell has a heating element that can be used to raise the temperature for direct lysis of the cells in the sample. Following this dissolution, sample preparation steps such as protease treatment or nucleic acid amplification can be performed and the amplified species can then be transferred to a second flow cell containing an electronically addressable microchip.
또 다른 구체예에서, 집적된 시스템은 제 1 챔버에서 선택적으로 분리되거나 용해된 세포를 직접적으로 처리하여 이러한 세포로부터 목적하는 물질을 수득하도록 고안된다. 이러한 처리는 일반적으로 세포성 오염물로부터 단백질 및 핵산을 분리 및 정제하도록 지시된다. 목적하는 분자의 제조시에는 프로테아제 K를 사용한 효소처리에 의해 목적하는 핵산으로부터 단백질성 물질을 제거하는 기술, 뉴클레아제를 사용한 효소처리에 의해 단백질로부터 핵산을 제거하는 기술, 소화성 잔류물 흡착, 핵산 증폭 (예를들어, PCR 및 SDA에 의함), 동일반응계 내에서의 완충액 교환 및 항체의 결합, 또는 목적하는 단백질을 결합시키기 위한 수용체-리간드 또는 효소-기질과 같은 다른 단백질-단백질 결합반응을 포함한 다수의 기술이 수행될 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.In another embodiment, the integrated system is designed to directly process cells that have been selectively isolated or lysed in the first chamber to obtain the desired material from these cells. Such treatment is generally directed to separating and purifying proteins and nucleic acids from cellular contaminants. In the preparation of the desired molecule, a technique for removing proteinaceous material from the desired nucleic acid by enzymatic treatment with protease K, a technique for removing nucleic acid from protein by enzymatic treatment with nuclease, adsorptive residue adsorption, nucleic acid Amplification (eg by PCR and SDA), buffer exchange and binding of antibodies in situ, or other protein-protein binding reactions such as receptor-ligand or enzyme-substrate to bind the protein of interest. Many techniques can be performed, but are not limited to these.
또 다른 구체예에서, 제조된 샘플물질의 분석은 다수의 사전선택된 하이브리드화 형식으로도 이루어질 수 있다. 바람직한 형식에서는, 목적하는 핵산을 전자적으로 어드레스 가능한 마이크로칩의 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 바와 같이 전자적으로 지시된 과정을 통해서 선택적으로 하이브리드화시킨다. 이러한 하이브리드화 형식은 마이크로어레이에 고정된 프로브에 핵산 (RNA, DNA, pNA)를 결합시키는 것으로 이루어진다. 시스템에 의해서 사용되도록 고안된 다른 형식에는 전자그리드에 부착된 항체 또는 그밖의 다른 단백질 결합 프로브들에 의한 목적하는 단백질의 선택적 포착이 포함된다. 이들은 수용체-리간드 및 효소-기질 결합과 같은 다른 단백질-단백질 상호작용을 포함할 수 있다.In another embodiment, analysis of the prepared sample material can also be made in a number of preselected hybridization formats. In a preferred form, the nucleic acid of interest is selectively hybridized via an electronically directed procedure as known to those skilled in the art of electronically addressable microchips. This hybridization format consists of binding nucleic acids (RNA, DNA, pNA) to probes immobilized on a microarray. Other formats designed for use by the system include selective capture of the protein of interest by antibodies or other protein binding probes attached to the electronic grid. These may include other protein-protein interactions such as receptor-ligand and enzyme-substrate binding.
또 다른 구체예에서, 장치는 샘플, 완충액, 효소 및 시약들을 유동셀(들)에 및 유동셀(들)로부터 운반하고 이송하기 위한 요소 (예를들어, 완충액 바이알, 배관, 소형 솔레노이드 밸브, 및 적어도 하나의 펌프)를 포함한다. 또한, 시험하고자 목적하는 피분석물 및 분자를 검출하기 위한 그밖의 다른 구체예도 제공된다. 바람직한 구체예에서, 이러한 요소들에는 배터리 구동되는 다이오드 레이저 (diode laser) (바람직하게는 635 ㎚의 파장을 가짐), 및 제 1 및/또는 2 유동셀 챔버(들)의 마이크로칩 그리드(들)의 개개 전극의 천문학용 필터 및 줌렌즈와 커플링된 CCD 카메라가 포함된다. 또 다른 검출방법은 또한 문헌 (P. Ropp and H. Holden Thorp,Chemistry & Biology, 1999, Vol. 6, No.9, pp. 599-605)에 기술된 바와 같이 검출의 기술분야에서 숙련자에게 잘 알려져 있는 것으로 직접적인 전기화학적검출과 같은 광방출장치 (light emitting device)에 의한 조명을 필요로하지 않도록 고안된다. 이들 전자식 성분들은 또한 각각 전자기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 인지되고 있는 것으로 컴퓨터 및 적절한 프로그래밍 소프트웨어를 통해서 조정되도록 고안된다.In another embodiment, the apparatus comprises elements (eg, buffer vials, tubing, miniature solenoid valves, and the like for transporting and transporting samples, buffers, enzymes and reagents to and from the flow cell (s), and At least one pump). Also provided are other embodiments for detecting analytes and molecules of interest for testing. In a preferred embodiment, these elements include a battery powered diode laser (preferably having a wavelength of 635 nm), and the microchip grid (s) of the first and / or second flow cell chamber (s). A CCD camera coupled with an astronomical filter and a zoom lens of each of the electrodes. Another method of detection is also well known to those skilled in the art of detection as described in P. Ropp and H. Holden Thorp, Chemistry & Biology , 1999, Vol. 6, No. 9, pp. 599-605. It is known that it is designed not to require illumination by light emitting devices such as direct electrochemical detection. These electronic components are each well known to those skilled in the art of electronics and are designed to be adjusted via computer and appropriate programming software.
본 발명은 생물학적 물질의 활성 다단계 샘플제조 및 분자진단분석을 수행하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 일체 완비된 샘플 (self-contained sample)이 시스템에 응답하도록하는 집적된 컴팩트 휴대용 장치 (integrated, compact, portable device)에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 두개 또는 단지 하나의 마이크로칩 (microchip) 상에서 다단계 샘플제조 및 분석을 수행하는 장치 및 방법에 관한 것이다. 이러한 집적된 시스템의 적용분야의 예에는 식품 및/또는 품질 모니터, 감염성 질환 및 암의 진단, 골수 플라스테시스 (bone marrow plastesis) (예를들어, 간세포 분리 및 분석), 및 법정상의 목적에 따른 개체의 유전자-기본 동정을 포함한다.The present invention relates to apparatus and methods for performing active multistage sample preparation and molecular diagnostic assays of biological materials. More particularly, the present invention relates to an integrated, compact, portable device that allows a self-contained sample to respond to the system. In particular, the present invention relates to apparatus and methods for performing multistage sample preparation and analysis on two or only one microchip. Examples of applications for such integrated systems include food and / or quality monitors, diagnosis of infectious diseases and cancers, bone marrow plastesis (eg, liver cell isolation and analysis), and for legal purposes. Gene-based identification of the individual.
관련 출원Related Applications
본 출원은 1998년 12월 23일에 출원된 가특허출원 제 60/113,730호 (발명의 명칭: "Fluorescent Imaging of Cells and Nucleic Acids in Bioelectronic Chips")의 권리를 청구하며, 1994년 7월 7일에 출원되고 현재 특허허여된 된 특허출원 제 08/271,882호 (발명의 명칭: "Methods for Electronic Stringency Control for Molecular Biological Analysis and Diagnostics")의 부분연속출원으로 1994년 9월 9일에 출원하여 현재 미합중국특허 제 5,632,957호로 특허허여된 특허출원 제 08/304,657호 (발명의 명칭: "Automated Molecular Biological Diagnostic System")의 부분연속출원으로 1995년 9월 27일에 출원하여 현재 미합중국특허 제 5,849,486호로 특허허여된 특허출원 제 08/534,454호 (발명의 명칭: "Apparatus and Methods for Active Programmable Matrix Devices")의 부분연속출원으로 1997년 12월 5일에 출원한 계류중인 특허출원 제 08/986,065호 (발명의 명칭: "Self-Addressable Self-Assembling Microelectronic Integrated Systems, Component Devices, Mechanisms, Methods, and Procedures for Molecular Biological Analysis and Diagnostics")의 부분연속출원이며, 또한 1996년 9월 6일에 출원하여 계류중인 특허출원 제 08/709,358호 (발명의 명칭: "Apparatus and Methods for Active Biological Sample Preparation")의 부분연속출원인 1998년 1월 30일에 출원하여 계류중인 특허출원 제 09/016,596호 (발명의 명칭: "Channel-Less Separation of Bioparticles on a Bioelectric Chip by Dielectrophoresis")의 부분연속출원이고, 이들 선출원의 명세서는 본 명세서에 참고로 상세히 기술되어 있다.This application claims the rights of Provisional Patent Application No. 60 / 113,730, filed December 23, 1998, entitled "Fluorescent Imaging of Cells and Nucleic Acids in Bioelectronic Chips," July 7, 1994. Patent Application No. 08 / 271,882, filed and filed here, entitled "Methods for Electronic Stringency Control for Molecular Biological Analysis and Diagnostics", filed September 9, 1994, Patent application No. 08 / 304,657 (named "Automated Molecular Biological Diagnostic System"), filed with patent number 5,632,957, filed on September 27, 1995 and currently patented in US Patent No. 5,849,486. Pending Patent Application No. 08 / 534,454, filed December 5, 1997, as part of a continuous application of Patent Application No. 08 / 534,454, entitled "Apparatus and Methods for Active Programmable Matrix Devices." : "Self- Patent Application No. 08 / 709,358, which is a part of a continuous application of "Addressable Self-Assembling Microelectronic Integrated Systems, Component Devices, Mechanisms, Methods, and Procedures for Molecular Biological Analysis and Diagnostics", and also filed on September 6, 1996. Patent Application No. 09 / 016,596, filed on January 30, 1998, which is part of a serial application of the invention ("Apparatus and Methods for Active Biological Sample Preparation"), entitled "Channel-Less Separation of Bioparticles." on a Bioelectric Chip by Dielectrophoresis ", the specifications of which are described in detail herein by reference.
본 특허출원의 화일은 적어도 하나의 색상을 넣은 도면을 포함한다. 색상을 넣은 도면(들)을 갖는 이 특허출원의 사본은 출원서 및 필요한 비용의 지불시에 특허청에 제출된다. 본 발명은 이하의 첨부된 도면을 참고로하여 더 상세히 설명된다:The file of this patent application includes a drawing with at least one color. Copies of this patent application with colored drawing (s) are filed with the Patent Office upon application and payment of the necessary fee. The invention is explained in more detail with reference to the accompanying drawings in which:
도 1은 샘플제조, 화학반응 및 피분석물 검출을 포함하는 시스템의 3개의 기본단계를 나타내는 시스템의 간략화된 작업공정도 (flow chart)이다.1 is a simplified flow chart of a system showing three basic steps of a system including sample preparation, chemical reactions, and analyte detection.
도 2는 시스템의 간단한 전체 하드웨어 디자인을 나타내는 개략도이며, 여기에는 가열요소 12를 갖는 유동챔버 11, 소형 탈염칼럼 13, 광로 (optical path) 15를 갖는 레이저 14, 및 CCD 카메라 17과 같은 검출기가 포함된다.2 is a schematic representation of a simple overall hardware design of the system, which includes a detector such as flow chamber 11 with heating element 12, small desalting column 13, laser 14 with optical path 15, and CCD camera 17; do.
도 3은 본 발명의 휴대용 시스템을 위한 외부 디자인의 한가지 예를 보여주는 투시도이다. 휴대용 시스템은 케이블 19를 통해서 컴퓨터 및 모니터 20과 집적된 하우징 (housing) 18을 포함한다.3 is a perspective view showing one example of an external design for a portable system of the present invention. The portable system includes a housing 18 integrated with a computer and monitor 20 via cable 19.
도 4는 샘플 및 시약 바이알 21a-e, 가열요소 12, CCD 카메라 17, 레이저 14, 각각의 시약 바이알을 위한 일련의 펌프 46, 및 촛점조정 손잡이 4 및 전자성분을 위한 영역 5 등의 그밖의 다른 특징들과 같은 시스템의 다양한 성분을 나타내는 집적된 시스템의 내부도이다.4 shows sample and reagent vials 21a-e, heating element 12, CCD camera 17, laser 14, a series of pumps 46 for each reagent vial, and focus knob 4 and area 5 for electronic components. An internal view of an integrated system showing various components of the system such as the features.
도 5는 마이크로칩 그리드를 갖는 유동셀에 대한 단면도이다. 전체적으로 유동셀은 유동셀 챔버 29의 내부 바닥면 상에 마이크로칩 그리드 23을 포함한다. 유동셀은 석영창 28로 덮는다. 마이크로칩 기판의 하면에는 가열요소 12가 부착되어 있다. 유동셀은 적어도 두개의 입구포트 (inlet ports) 30을 갖는다.5 is a cross-sectional view of a flow cell with a microchip grid. The flow cell as a whole comprises a microchip grid 23 on the inner bottom surface of the flow cell chamber 29. The flow cell is covered with quartz window 28. A heating element 12 is attached to the bottom surface of the microchip substrate. The flow cell has at least two inlet ports 30.
도 6은 두개의 유동셀을 갖는 대체가능한 구체예를 나타내는 개략도이다. 이 구체예에서, 제 1 유동셀은 전자적으로 어드레스 가능한 마이크로칩을 갖는 셀 31a이거나, 또는 이러한 마이크로칩을 갖지 않는 셀 31b로 이루어질 수 있다. 어떤 경우든지, 유동셀 31a,b에는 가열요소 12가 부착되어 있다. 이 구체예에서, 제 2 유동셀 32는 가열요소 12에 부착된 전자적으로 어드레스 가능한 마이크로칩을 갖는다. 도 2에 도식화된 바람직한 구체예의 경우에서와 같이, 집적된 시스템은 추가로 탈염칼럼 13, 광로 15를 갖는 레이저 14, 및 어느 하나의 유동셀의 천문학을 위한 검출기를 배치시키기 위한 이동가능한 트랙 33 상에 배치된 검출기 17을 포함한다.6 is a schematic diagram showing an alternative embodiment with two flow cells. In this embodiment, the first flow cell may be a cell 31a with an electronically addressable microchip, or may consist of a cell 31b without such a microchip. In any case, heating element 12 is attached to flow cell 31a, b. In this embodiment, the second flow cell 32 has an electronically addressable microchip attached to the heating element 12. As in the case of the preferred embodiment illustrated in FIG. 2, the integrated system further comprises a desalting column 13, a laser 14 with an optical path 15, and a movable track 33 on which a detector for astronomy of either flow cell is placed. And a detector 17 disposed in the.
도 7은 제 1 유동셀 31a와 제 2 유동셀 32가 서로 인접하게 배열되어 있는 두개의 유동챔버 구체예를 나타내는 개략도이다. 또한, 유동셀을 통해서 완충액, 시약 및 피분석물을 채널화시키기 위한 유동시스템 및 시스템의 탈염칼럼도 역시 도시되어 있다.7 is a schematic view showing two flow chamber embodiments in which the first flow cell 31a and the second flow cell 32 are arranged adjacent to each other. Also shown is a desalting column of the flow system and system for channeling buffers, reagents and analytes through the flow cell.
도 8은 진핵세포 또는 원핵세포의 분리를 위해 유전력 (dielectric force)의패턴을 발생시키는데 사용될 수 있는 바이아스 패턴 형식을 나타낸 것이다. (A)에는 사각형-벽 (square-wall) 유전력 패턴을 도시하였다. (B)에서는 체커판 (checkerboard) 유전력 패턴을 도시하였다.FIG. 8 shows a bias pattern format that can be used to generate a pattern of dielectric force for isolation of eukaryotic or prokaryotic cells. (A) shows a square-wall dielectric pattern. (B) shows a checkerboard dielectric force pattern.
도 9 및 10은 각각 사각형-벽 또는 체커판 유전력 패턴에 상응하는 유전장 분포의 두가지 컴퓨터적 표현을 나타낸 것이다.9 and 10 show two computer representations of the dielectric field distribution corresponding to square-wall or checkerboard dielectric patterns, respectively.
도 11은 세포분리 중에 유동셀 내의 전자적으로 어드레스 가능한 마이크로어레이의 사진을 나타낸 것이다. 사진은 특히 유동챔버의 전극에 적용된 체커판 유전력 패턴을 사용하여 전혈액으로부터 분리된 세균종을 도시하고 있다. 세균은 어레이의 전극 바로 위에서 최대인 장전하 (field charge)에서 광착색된 집중부인 반면에, 혈액세포는 전극 사이에서 장전하 최소영역으로 존재한다.11 shows photographs of electronically addressable microarrays in flow cells during cell separation. The photograph shows bacterial species isolated from whole blood, in particular using a checkerboard dielectric pattern applied to the electrodes of the flow chamber. Bacteria are photopigmented concentrations at field charges that are maximum just above the electrodes of the array, while blood cells are present as the minimum charge region between the electrodes.
도 12, 13A 및 13B는 혈액세포로부터 분리된 진핵세포 (배양된 HeLa 세포) (도 12), 및 세척 (도 13A) 및 프로피듐요오다이드로 염색 (도 13B)한 후의 진핵세포를 나타낸 것이다. 정상적인 인간 백혈구 및 적혈구의 혼합물을 핑크색을 띤 다이아몬드-형 스폿트로 반영되는 것으로서 전기장이 최소인 전극 사이의 공간으로 밀려간다 (도 12).12, 13A and 13B show eukaryotic cells (cultured HeLa cells) (FIG. 12) isolated from blood cells and eukaryotic cells after washing (FIG. 13A) and staining with propidium iodide (FIG. 13B). The mixture of normal human leukocytes and red blood cells is pushed into the space between the electrodes with the smallest electric field as reflected by the pinkish diamond-like spot (FIG. 12).
도 14-17은 사각형-벽 또는 체커판 유전장 패턴을 사용하여 혈액세포들로부터 분리된 세균세포에 대한 일련의 사진을 나타낸 것이다. 도 14 및 도 15는 각각 사각형-벽 및 체커판 패턴의 경우의 이러한 분리를 나타낸 것이다. 도 16 및 도 17은 각각 세척한 후의 분리된 세균의 사각형-벽 및 체커판 패턴을 나타낸 것이다.14-17 show a series of photographs of bacterial cells isolated from blood cells using square-wall or checker plate dielectric field patterns. 14 and 15 show this separation in the case of a square-wall and checkerboard pattern, respectively. 16 and 17 show square-wall and checkerboard patterns of isolated bacteria after washing, respectively.
도 18은 전자용해 (electronic lysis)에 의해서 세균으로부터 유리된 핵산의분석을 나타내는 PAGE의 사진이다. 레인 1 및 6은 마커 (marker)이고, 레인 4 및 5는 각각 RNase 처리를 하거나 하지 않은 전세균 DNA이며, 레인 2 및 3은 세균으로부터 유리된 초나선형 및 선형 플라스미드 pCR2.1 DNA이다.FIG. 18 is a photograph of a PAGE showing the analysis of nucleic acids liberated from bacteria by electronic lysis. Lanes 1 and 6 are markers, lanes 4 and 5 are pre-bacterial DNAs with or without RNase treatment, respectively, and lanes 2 and 3 are ultra-helix and linear plasmid pCR2.1 DNA freed from bacteria.
도 19 및 20은 본 발명의 유동셀 내에서 SDA에 의한 두개의 에스. 엔테리카 (S. enterica) 유전자spa Q및inv A의 증폭을 나타내는 PAGE 사진이다. 도 19에서는, 왼쪽에서 오른쪽으로 레인 1 및 6은 크기 마커이고, 레인 2 및 3은 각각 음성 및 양성 대조군이며, 레인 5는 본 발명의 장치를 사용하여 증폭된inv A유전자 특이적 DNA 서열의 증폭의 결과이다. 도 20에서, 레인 2는 마커이고, 레인 1 및 4는 각각 양성 및 음성 대조군이며, 레인 3은spa Q유전자에 대한 증폭결과이다.19 and 20 are two S. by SDA in the flow cell of the present invention. It is a PAGE photograph showing the amplification of S. enterica gene spa Q and inv A. In Figure 19, left to right lanes 1 and 6 are size markers, lanes 2 and 3 are negative and positive controls, respectively, and lane 5 is amplification of the inv A gene specific DNA sequence amplified using the device of the present invention. Is the result. In FIG. 20, lane 2 is a marker, lanes 1 and 4 are positive and negative controls, respectively, and lane 3 is amplification results for the spa Q gene.
도 21은spa Q유전자에 대한 하이브리드화 결과를 나타내는 사진이며, 여기에서는spa Q유전자에 대한 특이적 프로브가 장치된 두개의 전극패드를 하이브리드화에 대하여 두번 시험하였으며, 유전자에 대해 특이적인 세번째 패드는 양성 튜브반응으로부터 유래한 증폭된 물질에 의해 하이브리드화되었고, 비특이적 프로브가 장치된 네번째 패드는 유동셀 내에서 생산된 증폭생성물에 대한 하이브리드화에 대하여 시험하였다.Figure 21 is a picture showing an hybridization results for spa Q gene, in which were twice tested for the two electrode pads of the specific probe device for a spa Q genes in the hybridization, it is specific for the third pad for a gene A fourth pad, hybridized with amplified material from a positive tube reaction, and equipped with a nonspecific probe was tested for hybridization to the amplification product produced in the flow cell.
도 22는 두개의 상이한 바이아싱 조건을 사용하여 마이크로어레이의 전극의 포착부위에 대해 어드레스된 증폭된spa Q유전자 생성물을 나타내는 사진이다. 윗줄에서는spa Q유전자에 대해 특이적인 포착 프로브를 갖는 패드에 대해 중복해서 어드레스시킨 것 (레인 3 및 4)인 반면에, 레인 1 및 5는 비특이적 프로브를 갖는다. 윗줄에서는 사인파 AC 형식이 사용되었으며, 아랫줄에서는 직류 (DC) 형식이 사용되었다. 결과는, DC 프로토콜이 더 고도의 앰플리콘 (amplicon)을 결합시키기 때문에 핵산을 전극에 이송하는데 있어서 DC 형식을 사용한 것이 AC 형식 보다 약간 더 탁월함을 시사한다.FIG. 22 is a photograph showing the amplified spa Q gene product addressed for the capture site of the electrode of the microarray using two different biasing conditions. In the upper row are duplicate addresses (lanes 3 and 4) for pads with capture probes specific for the spa Q gene, while lanes 1 and 5 have nonspecific probes. The upper line uses the sine wave AC form, and the lower line uses the direct current (DC) form. The results suggest that the use of the DC format for transferring nucleic acids to the electrodes is slightly better than the AC format because the DC protocol binds higher amplicons.
바람직한 구체예의 상세한 설명Detailed Description of the Preferred Embodiments
본 발명의 특정한 구체예를 참고로하여, 샘플을 적어도 전자적으로 어드레스 가능한 마이크로칩을 포함하는 단일 유동셀에서 처리하고 분석할 수 있는 휴대용 칩상 실험실 (lab-on-a-chip) 시스템이 제공된다. 장치의 요소들은 샘플 제조 및 분석 유동챔버, 유체 취급시스템, 및 조명원 (예를들면, 배터리 구동되는 635 ㎚ 다이오드 레이저) 및 검출전자공학 (예를들어, 마이크로칩의 천문학을 위한 필터와 줌렌즈의 셋트와 커플링된 CCD 카메라)을 함유하는 휴대용 케이싱 (casing) 또는 하우징 내에 수용된다. 휴대용 케이싱에 대해 외부에는 케이블에 의해서 휴대용 하우징에 연결된 개인용 컴퓨터와 같은 컴퓨터가 있다.With reference to certain embodiments of the present invention, a portable lab-on-a-chip system is provided that can process and analyze a sample in a single flow cell comprising at least an electronically addressable microchip. Elements of the device include sample fabrication and analysis flow chambers, fluid handling systems, and illumination sources (e.g., battery powered 635 nm diode lasers) and detection electronics (e.g., filters and zoom lenses for astronomy in microchips). Is housed in a portable casing or housing containing a CCD camera coupled to the set. Outside the portable casing there is a computer, such as a personal computer, connected to the portable housing by a cable.
도 1을 참고로하여, 작업공정도는 본 발명의 칩상 실험실 시스템을 사용하도록 고안된 것으로서, 생물학적검정을 수행하기 위한 3개의 별개의 샘플취급단계를 도시하여 나타낸 것이다. 이들은 (1) 샘플처리, (2) 화학반응 및 (3) 피분석물 검출이다.Referring to FIG. 1, the workflow is designed to use the on-chip laboratory system of the present invention, showing three separate sample handling steps for performing a bioassay. These are (1) sample processing, (2) chemical reactions, and (3) analyte detection.
단계 (1) 처리과정에서의 샘플취급은 핵산 및 단백질과 같은 목적하는 분자를 분리하기 위한 목적으로 조생물학적 샘플 (예를들어, 혈액으로부터의 세포, 뇨, 변, 혼합된 세포집단 등)을 처리하는 것으로 이루어진다. 화학반응단계 (2)에서의샘플취급은 목적하는 분자의 세정 (clean-up) 및 더 나아가 분리, 정제 또는 증폭을 위하여 프로테아제, 뉴클레아제 및 제한효소분해에 의한 처리와 같은 효소-기본 반응, PCR 및 SDA-기본 핵산증폭, 동일계 완충액 교환, 방사성동위원소 및 형광성 마커 등에 의한 화학적 표지, 및 항체-항원, 리간드-수용체 및 효소-기질 반응과 같은 면역-기본 및 단백질-단백질 반응을 포함한 많은 형태의 분자생물학적 반응 (단, 이들로 제한되는 것은 아니다)을 잠재적으로 포함한다. 피분석물 검출단계 (3)에서의 샘플취급은 형광방출의 광학적 검출, 전기화학적 검출 및 방사성동위원소 검출을 포함하는 다수의 형식을 통해서 이루어질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이 검출은 전자그리드에 대한 핵산 또는 포착된 단백질의 하이드리드화 및 형광성 영상을 이용한 검출을 포함한다.Step (1) Sample handling in the treatment process treats microbiological samples (e.g., cells from the blood, urine, feces, mixed cell populations, etc.) for the purpose of separating the desired molecules such as nucleic acids and proteins. It consists of doing Sample handling in chemical reaction step (2) involves enzyme-based reactions, such as treatment by protease, nuclease and restriction enzyme digestion, PCR for clean-up and further isolation, purification or amplification of the desired molecule. And many forms, including SDA-based nucleic acid amplification, in situ buffer exchange, chemical labeling with radioisotopes and fluorescent markers, etc., and immune-base and protein-protein responses such as antibody-antigens, ligand-receptors and enzyme-substrate reactions. Potentially including, but not limited to, molecular biological reactions. Sample handling in the analyte detection step (3) can be through a number of formats including optical detection, fluorescence detection and radioisotope detection of fluorescence emission. In a preferred embodiment, the detection comprises detection using a fluoridation and hydriding of the nucleic acid or captured protein against the electronic grid.
도 2에서, 시스템은 기본성분의 상-하 또는 가장자리를 따라 관찰된 것을 나타내는 개략도의 형식으로 도시되어 있다. 이 도면에서 지지체 10은 유동셀 11을 장착하여 사용한다. 지지체에 장착된 유동셀 11의 배면에는 가열요소 12가 있다. 또한, 유동셀은 다양한 완충액을 정제하고, 탈염시키고 유동스트림 내로 도입시키기 위해서 중공섬유에 의해서 포트 및 탈염칼럼 13에 연결될 수 있다. 가열요소를 사용하여 챔버 내에서 세포의 직접적인 가열-유도된 용해를 위해, 또는 효소를 억제하고 핵산 증폭을 위해 온도 주기를 이용하는 것과 같은 단계 2에서의 공정반응에서 사용하기 위해서 유동셀을 가열할 수 있다.In FIG. 2, the system is shown in the form of a schematic diagram showing what is observed along the top-bottom or edge of the base component. In this figure, the support 10 is used by mounting the flow cell 11. At the back of the flow cell 11 mounted to the support is a heating element 12. The flow cell may also be connected to the port and desalting column 13 by hollow fibers to purify, desalting and introducing various buffers into the flow stream. The heating element can be used to heat the flow cell for direct heat-induced lysis of the cells in the chamber or for use in the process reaction in step 2, such as using temperature cycles to inhibit enzymes and amplify nucleic acids. have.
본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 인지되어 있는 바와 같이, 유동셀, 및 솔레노이드 구동밸브 및 펌프와 같이 전기적으로 구동되는 그밖의 다른 성분, 레이저 및 검출카메라는 모든 프로그래밍 및 제어를 목적으로 하우징 18에 대한 케이블 19에 의해서 컴퓨터 20과 전자적으로 상호연결된다. 예를들어, 동력원 및 컴퓨터는 프로그래밍 및 조작을 위해 유동셀 11의 전극에 연결된다. 바람직한 구체예에서, 시스템과 함께 사용된 컴퓨터 소프트웨어에 의해 발생될 수 있는 전자신호에는 사인파 모양이고 유전이동에서 사용되는 AC 성분과 같은 AC 성분 및 사각형이고 하이브리드화에 사용되는 것과 같은 DC 성분을 포함한다. 또 다른 추가의 관점에서, 시스템에서 또한 사용되는 시간에 따라 변화하는 전자신호는 옵셋트 신호 (offset signal)가 DC 신호인 경우에서와 같이 옵셋트 신호를 포함하는 것이 바람직하다.As will be appreciated by those skilled in the art, flow cells and other electrically driven components such as solenoid drive valves and pumps, lasers and detection cameras may be provided for housing 18 for all programming and control purposes. The cable 19 is electronically interconnected with the computer 20. For example, a power source and a computer are connected to the electrodes of flow cell 11 for programming and manipulation. In a preferred embodiment, the electronic signal that can be generated by the computer software used with the system includes an AC component such as an AC component that is sinusoidal and used in dielectric transfer and a DC component such as square and used for hybridization. . In yet a further aspect, the electronic signal that changes over time, which is also used in the system, preferably includes an offset signal as in the case where the offset signal is a DC signal.
도 2는 또한 레이저비임 15를 방출하는 조명원 14를 나타내고 있다. 바람직하게는, 조명원 14는 다이오드 레이저이다. 비임 15는 바람직하게는 샘플분석을 위한 유동셀 11 마이크로칩 쪽으로 비임 15의 적어도 일부분이 향하도록 하는 비임분할기 (beam splitter) 16 상에 입사한다. 마이크로칩 그리드 전극으로부터 방출된 방사선은 입사로 (incident path)를 다시 투사하고, 이 방사선의 적어도 일부분은 비임분할기 16을 통해서 검출기 17로 보내진다. 바람직한 구체예에서, 검출기 17은 전하결합소자 (CCD) 검출기로 이루어진다. 그 대신에, 다른 검출기가 사용될 수도 있다. 그러나, 조밀화 (compactness)를 위해서는 일반적으로 그의 깊이 (방출된 방사선의 방향으로)에 비해서 비교적 더 큰 면적범위를 갖는 검출기를 갖는 것이 바람직하다.2 also shows an illumination source 14 emitting a laser beam 15. Preferably, illumination source 14 is a diode laser. Beam 15 is preferably incident on beam splitter 16 with at least a portion of beam 15 directed towards flow cell 11 microchip for sample analysis. The radiation emitted from the microchip grid electrode projects back an incident path, at least a portion of which is sent to detector 17 through subdivider 16. In a preferred embodiment, detector 17 consists of a charge coupled device (CCD) detector. Instead, other detectors may be used. However, for compactness it is generally desirable to have a detector with a relatively larger area range compared to its depth (in the direction of emitted radiation).
도 3은 전체적인 휴대용의 집적된 칩상 실험실 시스템에 대한 하나의 디자인 또는 스타일의 투시도를 나타낸 것이다. 컴퓨터 20, 바람직하게는 휴대용 노트북개인용 컴퓨터는 키보드, 기능키, 모니터 및 입력장치, 예를들어 트랙볼 (trackball), 및 마우스와 같은 통상적인 요소를 포함한다. 하우징 18은 유동셀을 포함하는 제조, 반응 및 분석 플랫폼 (platform) 뿐 아니라 시스템의 구동을 위해서 컴퓨터 20과 함께 이용되는 추가의 설비를 포함하도록 제공된다. 예를들어, 하우징 18은 동력공급, 파형발생기 (waveform generator), 레이저, 유동셀(들), CCD 카메라 및 그밖의 다른 전자공학 유체시스템 및 시스템의 구동 및 제어에 필요한 시약을 함유할 수 있다 (도 4).3 shows a perspective view of one design or style of the overall portable integrated on-chip laboratory system. Computer 20, preferably a portable notebook personal computer, includes conventional elements such as keyboards, function keys, monitors and input devices such as trackballs and mice. The housing 18 is provided to include a manufacturing, reaction and analysis platform containing a flow cell as well as additional equipment used with the computer 20 to drive the system. For example, housing 18 may contain reagents for driving and controlling power, waveform generators, lasers, flow cell (s), CCD cameras and other electronic fluid systems and systems ( 4).
유동셀 디자인의 한 예로서, 도 5는 이러한 셀의 단면을 보여주고 있다. 전자적으로 어드레스 가능한 마이크로어레이 23은 1.0 인치 제곱의 핀그리드 어레이 (pin grid array; PGA) (068 PPGA, 400 Square Cavity, Spectrum Semiconductor Materials, San Jose, CA)를 함유하는 기판 10 상에 장착된다. 기판 10의 배면에는 세라믹칩 가열기요소 12 (Dawn 505, Dawn Electronics, Carson City, Nevada)가 부착되어 있다. 가열요소 12는 다수의 방법으로 부착될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 부착은 전자마이크로칩의 배면과 세라믹 가열기 사이에 열전도성 가요성 접착제 22를 배치시킨 다음, 적절한 온도 및 시간에서 인큐베이트하여 접착제를 고정시킴으로써 이루어질 수 있다. 또한, 본 기술분야에서 잘 인지되고 있는 바와 같이, 이들 마이크로칩은 하이드로겔, 아가로즈, 아크릴아미드의 폴리머, 또는 졸-겔 매트릭스 등과 같은 얇은 투과층 25으로 피복시킨다. 이 투과층 25는 생물학적 물질을 전극에 직접 노출시키는 경우에 이 물질을 손상시키는 (또는 이들을 분석하는 능력이 있는)것으로서 전극표면에서 나타나는 전기화학으로부터 목적하는 세포및 분자 (즉, 생물학적 물질)를 보호한다.As an example of a flow cell design, FIG. 5 shows a cross section of such a cell. The electronically addressable microarray 23 is mounted on a substrate 10 containing a 1.0 inch square pin grid array (PGA) (068 PPGA, 400 Square Cavity, Spectrum Semiconductor Materials, San Jose, Calif.). A ceramic chip heater element 12 (Dawn 505, Dawn Electronics, Carson City, Nevada) is attached to the back of the substrate 10. The heating element 12 can be attached in a number of ways. In a preferred embodiment, the attachment can be made by placing the thermally conductive flexible adhesive 22 between the backside of the electron microchip and the ceramic heater and then incubating at the appropriate temperature and time to fix the adhesive. In addition, as is well recognized in the art, these microchips are coated with a thin permeable layer 25 such as a hydrogel, agarose, a polymer of acrylamide, or a sol-gel matrix or the like. The permeable layer 25 protects the cells and molecules of interest (ie biological material) from the electrochemistry that appears on the surface of the electrode by damaging (or being capable of analyzing them) when the biological material is directly exposed to the electrode. do.
그 다음에, 마이크로칩은 성형되거나 기계화된 의료용 등급의 플라스틱 유동셀 27에 부착시켜 전자 마이크로어레이 23이 유동챔버 내의 웰 (well)의 내부 바닥표면을 구성하도록 한다. 유동셀 27은 마이크로칩의 상부에 적층되는 생물학적 샘플물질 및 완충액을 함유하는 구획 29를 제공한다. 유동셀은 추가로 샘플송달 및 추출을 위한 적어도 2 내지 4개의 포트 30을 갖도록 디자인할 수 있다. 유동셀 27은 추가로 외부 유체송달 및 제거 시스템과 접속시키기고 탈염시키기 위한 배관을 수용하도록 제작될 수 있다. 추가로, 유동셀 구획은 마이크로어레이 분석부위 또는 포착패드에 대한 시각적 접근을 위한 융합된 석영창 또는 리드 (lid) 28에 의해서 피복 및 밀봉된다. 이 창 28은 어떤 두께의 석영으로도 이루어질 수 있지만, 일반적으로는 약 0.015 인치 두께이다.The microchip is then attached to a molded or mechanized medical grade plastic flow cell 27 such that the electronic microarray 23 constitutes the inner bottom surface of the well in the flow chamber. Flow cell 27 provides section 29 containing the biological sample material and buffer deposited on top of the microchip. The flow cell can be further designed to have at least two to four ports 30 for sample delivery and extraction. Flow cell 27 may be further configured to receive tubing for connecting and desalting with external fluid delivery and removal systems. In addition, the flow cell compartment is covered and sealed by a fused quartz window or lid 28 for visual access to the microarray analysis site or capture pad. This window 28 may be made of quartz of any thickness, but is generally about 0.015 inch thick.
창 28은 다수의 방법에 의해서 유동셀에, 유동셀은 칩에 부착될 수 있으며, 이들 중의 바람직한 방법은 광학적 조립을 위해서 개발된 자외선 (UV) 경화성 접착제 26을 사용한다. 칩에 대한 유동셀의 부착은 칩의 비피복 표면에 직접 시행될 수 있거나 접착제 26을 사용하여 마이크로어레이를 또한 피복시킨 투과층에 대해서 시행될 수 있다. 배관은 배관크기, 부속품 (fittings) 및 배관 기본물질에 따라 다양한 방법을 사용하여 입구 및 출구 포트에 부착된다.Window 28 may be attached to the flow cell by a number of methods, the flow cell to the chip, of which a preferred method uses ultraviolet (UV) curable adhesive 26 developed for optical assembly. The attachment of the flow cell to the chip can be effected directly on the uncovered surface of the chip or on a permeable layer also coated with a microarray using adhesive 26. Piping is attached to the inlet and outlet ports using a variety of methods depending on the pipe size, fittings and piping base material.
대체가능한 구체예에서, 집적된 시스템은 두개의 유동셀을 사용할 수 있으며, 이중 하나는 샘플제조를 위한 것이고 두번째의 것은 분석을 위한 것이다. 도 6은 이러한 구체예의 개략적 형태를 나타낸 것이다. 제 1 유동챔버 31은 가열요소12에 부착되며, 임의로 전자적으로 어드레스 가능한 마이크로칩 31a를 가질 수 있거나, 이러한 마이크로칩을 갖지 않을 수 있다 31b. 어떤 형식에서든지, 즉 전자마이크로칩이 있든지 없든지, 유동셀 31을 사용하여 단계적 방식으로 세포분리 및/또는 세포용해, 및 용해된 세포로부터 회수된 목적하는 분자의 세정 및 추가의 제조를 수행한다. 목적하는 분자의 추가의 제조는 목적하는 특정 단백질을 분리하고, 프로테아제로 처리함으로써 핵산으로부터 단백질성 물질을 제거하는 등의 방식으로 목적하는 핵산을 분리하고, PCR 및 SDA와 같은 방법에 의해서 목적하는 핵산을 증폭시키는 것과 같은 상기 언급한 바와 같은 다수의 화학반응 및 단계를 포함하도록 계획된다.In alternative embodiments, the integrated system may use two flow cells, one for sample preparation and the second for analysis. 6 shows a schematic form of this embodiment. The first flow chamber 31 is attached to the heating element 12 and may optionally have an electronically addressable microchip 31a or may not have such a microchip 31b. In any form, i.e. with or without an electron microchip, flow cell 31 is used to perform cell separation and / or cytolysis in a stepwise manner, as well as washing and further preparation of the desired molecules recovered from lysed cells. . Further preparation of the desired molecule can be performed by isolating the desired nucleic acid, for example, by removing the proteinaceous material from the nucleic acid by isolating the specific protein of interest and treating it with a protease, and by the method such as PCR and SDA. It is intended to include a number of chemical reactions and steps as mentioned above, such as to amplify a.
제 2 유동셀 32는 샘플 분석을 위해서 사용된다. 바람직한 구체예에서, 유동셀 31 및 32 둘다는 지지체 10의 동일한 면에 배치된다. 그러나, 이들 유동셀은 등을 맞댄 (back-to-back) 배열 또는 중첩된 (stacked) 배열을 포함한 다른 식의 정렬방식으로 배치될 수도 있다. 또한, 이들 두개의 유동셀은 다양한 완충액을 정제하고, 탈염시키고 유동스트림 내로 도입시키기 위해서 중공섬유에 의해 연결될 수 있다. 또한, 각각의 유동셀은 목적하는 바와 따라 독립적인 온도조절요소를 갖도록 디자인될 수도 있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해 인지되고 있는 바와 같이, 유동셀 내의 전자적으로 어드레스 가능한 각각의 마이크로칩, 및 솔레노이드 구동 밸브 및 펌프와 같은 그밖의 다른 전기적으로 구동되는 요소는 단일 유동셀 배열에서와 같이 모든 프로그래밍 및 제어를 목적으로하여 케이블에 의해서 컴퓨터 20과 전자적으로 상호연결된다.The second flow cell 32 is used for sample analysis. In a preferred embodiment, both flow cells 31 and 32 are arranged on the same side of support 10. However, these flow cells may be arranged in other forms of alignment, including back-to-back arrangements or stacked arrangements. In addition, these two flow cells can be connected by hollow fibers to purify, desalting and introducing various buffers into the flow stream. In addition, each flow cell may be designed to have independent temperature control elements as desired. As will be appreciated by those skilled in the art, each electronically addressable microchip in the flow cell, and other electrically driven elements such as solenoid driven valves and pumps, may be used in a single flow cell arrangement. Likewise, they are electronically interconnected with the computer 20 by cables for all programming and control purposes.
도 6은 또한 레이저비임 15를 방출하고 상술한 바와 동일한 방식으로 구동하는 조명원 14를 나타낸다. 유동셀의 전자그리드의 천문학을 위한 줌렌즈 17을 갖는 카메라가 또한, 제 1 및 2 유동셀 전자마이크로어레이 그리드 둘다를 관찰할 수 있도록 이동가능한 트랙 33 상에 통합된다.6 also shows an illumination source 14 emitting laser beam 15 and driving in the same manner as described above. A camera with zoom lens 17 for the astronomy of the electronic grid of the flow cell is also integrated on the movable track 33 to observe both the first and second flow cell electron microarray grids.
도 7은 샘플제조를 위한 유동셀 31a (전극을 포함하는 유동셀로서 도시됨) 및 분석을 위한 유동셀 32 (25 전극그리드로서 도시됨)를 포함하는 지지체 10을 보여주는 대체 시스템의 개략도이다. 각각의 유동셀은 바람직하게는 전기적으로 구동되는 3-방향 (3-way) 밸브까지 이어지는 배관 또는 중공섬유 44에 연결된 다수의 포트 42를 포함한다. 제조용 유동셀 31a와 관련하여 셀은 적어도 2개의 포트 42, 임의로는 적어도 3개의 포트 및 바람직한 구체예에서는 4개의 포트를 갖도록 고안된다. 분석용 유동셀 32와 관련하여, 이 셀은 바람직하게는 2개의 포트를 갖는다. 이들 포트 42 및 이들 각각의 배관 44는 다양한 시점에서 다양한 기능으로 이용될 수 있다. 예를들어, 3-방향 밸브 45의 설정에 의해서 지시되는 것으로서 유동셀 31 및 32 내로 또는 이들 셀로부터의 유동의 방향지시성 (directionality) 및 펌프 46의 방향지시성을 기준으로하여 한 시점에서는 포트가 입력포트로서 간주될 수 있는 반면에 다른 시점에서는 이것이 출력포트를 구성할 수도 있다. 챔버내의 유체는 포트를 통해서 다양한 순서로 액체를 "밀고 (pushing)" "당김 (pulling)"으로써 혼합될 수 있다. 이러한 혼합은 예를들어 증폭과정 중에 유리할 수 있다.FIG. 7 is a schematic diagram of an alternative system showing support 10 comprising flow cell 31a for sample preparation (shown as flow cell with electrodes) and flow cell 32 for analysis (shown as 25 electrode grid). Each flow cell preferably includes a number of ports 42 connected to a hollow fiber 44 or tubing leading to an electrically driven three-way valve. In the context of the manufacturing flow cell 31a the cell is designed to have at least two ports 42, optionally at least three ports and in a preferred embodiment four ports. In the context of the analytical flow cell 32, this cell preferably has two ports. These ports 42 and their respective pipes 44 may be used for various functions at various times. For example, the port is input at a point in time based on the directionality of the flow into and out of flow cells 31 and 32 as indicated by the setting of the three-way valve 45 and the flow direction of the pump 46. While it can be considered as a port, at other times it may also configure an output port. The fluid in the chamber may be mixed by "pushing" "pulling" the liquid in various orders through the port. Such mixing may be advantageous, for example, during the amplification process.
도 7은 또한 일체 구비된 시스템의 다른 성분들을 도시하고 있다. 한가지 구체예에서, 용기 (receptacle) 21a-e는 세척, 증폭, 하이브리드화 및 폐기 등을위해서 샘플 및 시약을 운반하기 위해서 제공된다. 또 다른 구체예에서, 지지체 10에는 작은 부피의 샘플을 탈염시키기 위한 소형 탈염칼럼 또는 중공섬유 이온교환 유니트 13이 부착된다. 종종, 탈염단계를 수행하여 마이크로어레이의 특이적 포착패드에 대한 증폭된 핵산의 전자적 어드레스를 시도하기 전에 샘플의 이온강도를 저하시키는 것이 필요하다. 이것은 증폭단계에서 사용된 시약들이 전자적 어드레싱 프로토콜 하에서 목적하는 분자의 이동을 방해하는 이온강도를 갖기 때문이다. 일단 증폭된 샘플을 탈염시킨 다음에는, 이것을 마이크로어레이 상에서 분석하기 위해 유동셀 32로 보낼 수 있다.7 also shows other components of the integrated system. In one embodiment, receptacle 21a-e is provided for carrying samples and reagents for washing, amplification, hybridization, and disposal. In another embodiment, the support 10 is attached with a small desalting column or hollow fiber ion exchange unit 13 for desalting a small volume of sample. Often, it is necessary to lower the ionic strength of the sample before performing the desalting step to attempt the electronic address of the amplified nucleic acid to the specific capture pad of the microarray. This is because the reagents used in the amplification step have ionic strengths that interfere with the movement of the molecules of interest under electronic addressing protocols. Once the amplified sample is desalted, it can be sent to flow cell 32 for analysis on a microarray.
본 발명의 단일 유동셀 집적된 시스템을 사용하든지 다중 유동셀 집적된 시스템을 사용하든지, 세포분리는 유전이동 기술에 의해서 이루어진다. 이러한 방법에서, 순전하를 갖지 않는 것을 포함한 편극성 입자 (예를들어, 진핵 및 원핵세포)는 불균일 전기장의 "유전이동력 (dielectrophoretic force)"에 적용시킨다. 입자의 유효편극성이 주위 매질과 다른 한은, 세포가 유전력에 적용된 채로 유지된다. 상이한 세포 타입의 이동방향은 (1) 세포 바이리피드막 (bilipid membrane)의 세포벽 또는 막의 표면전하, (2) 이러한 세포막 및 벽의 전도성 및 허용성 (permitivity), 및 (3) 세포의 형태학 및 구조적 양식에 의해서 결정된다. 본 발명에서 실시된 유전이동은 혼합 세포집단 (예를들어, 혈액세포)으로부터 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 마이크로코커스 라이소데이크티쿠스 (Micrococcus lysodeikticus) 및 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis)를 포함한 여러가지 타입의 세균 뿐아니라 배양된 경부암세포와 같은 암세포를 선택적으로 분리시키기 위해서 사용되어 왔다.Whether using a single flow cell integrated system of the present invention or multiple flow cell integrated systems, cell separation is achieved by genetic transfer techniques. In this method, polarized particles (eg, eukaryotic and prokaryotic cells), including those that do not have a net charge, are subjected to the "dielectrophoretic force" of the heterogeneous electric field. As long as the effective polarization of the particles differs from the surrounding medium, the cells remain applied to the dielectric force. The direction of movement of the different cell types is defined by (1) the surface charge of the cell wall or membrane of the cell bilipid membrane, (2) the conductivity and permittivity of these cell membranes and walls, and (3) the morphology and structural of the cells. It is determined by the form. Genetic transfers carried out in the present invention are carried out from mixed cell populations (e.g., blood cells), Escherichia coli , Salmonella typhimurium , Micrococcus lysodeikticus , and It has been used to selectively isolate cancer cells such as cultured cervical cancer cells as well as various types of bacteria, including Staphylococcus epidermidis .
바람직한 구체예에서, 본 발명에서 수행되는 바와 같이 세포를 분리시키는데 유용한 유동셀은 유전력 패턴이 마이크로칩 전자그리드를 가로질러서 발생될 수 있도록 개별적으로 바이아싱될 수 있는 적어도 100개의 개별적으로 어드레스 가능한 미소전극을 갖는 전자적으로 어드레스 가능한 마이크로칩을 포함하도록 디자인될 수 있다. 예를들어, 도 8은 두가지의 이러한 유전력 패턴을 보여준다. 도 8A는 사각형-벽 패턴인 반면에 도 8B는 체커판 패턴을 나타낸다. 이들 각각의 패턴은 상이한 세포타입을 분리시키기에 충분한 유전력을 제공하는 독특한 강 및 약 이온장강도 패턴을 제공한다. 유전력 패턴은 또한 사각형-벽 및 체커판 각각에 대해 도 9 및 10에서 나타낸 컴퓨터 형성된 전기장 패턴으로 도시된다.In a preferred embodiment, the flow cells useful for isolating cells as performed in the present invention include at least 100 individually addressable microelectrodes that can be individually biased such that the dielectric pattern can be generated across the microchip electronic grid. It can be designed to include an electronically addressable microchip with. For example, FIG. 8 shows two such dielectric patterns. 8A shows a square-walled pattern while FIG. 8B shows a checkerboard pattern. Each of these patterns provides unique strong and weak ionic strength patterns that provide sufficient heritability to separate different cell types. The dielectric force pattern is also shown in the computerized electric field pattern shown in FIGS. 9 and 10 for the square-wall and checker plate respectively.
또한, 유동셀(들)에서 마이크로어레이의 전극은 세포분리, 용해 및 분석을 수행하기 위한 단일 어레이로서 모두 함께 바이아싱될 수 있거나, 분리, 용해 및 분석 단계들을 수행하기 위한 서브어레이를 다수의 패턴으로 형성하도록 프로그래밍될 수도 있다. 즉, 하나의 서브셋트 (subset)는 세포를 분리시키도록 바이아싱될 수 있고 또 다른 셋트는 세포용해를 야기시키도록 바이아싱될 수 있으며, 또 다른 셋트는 분석을 위해서 사용될 수도 있다.In addition, the electrodes of the microarray in the flow cell (s) can be biased together as a single array for performing cell separation, lysis and analysis, or a plurality of patterns for subarrays for performing separation, lysis and analysis steps. It may be programmed to form. That is, one subset may be biased to separate cells, another set may be biased to cause cytolysis, and another set may be used for analysis.
세포분리의 예로서, 도 11은 전혈액으로부터 마이크로코커스 라이소데이크티쿠스 (Micrococcus lysodeikticus)의 분리를 나타낸 것이다. 세균은 전극상에 집중되는 반면에, 원치않는 혈액세포인 적혈구 및 백혈구 둘다는 전극들 사이의 어두운 영역이다. 세포는 10 kHz에서 10 V 피크-대-피크 (peak-to-peak)의 사인파 신호를 포함하는 바이아싱의 프로토콜을 사용하여 분리되도록 하였다. 이 경우에는 이 신호값이 사용되었지만, 일반적으로 세포분리는 볼트가 2 내지 20 피크-대-피크이고 주파수는 5 내지 50 kHz인 사인파 신호를 사용하여 수행할 수 있다.As an example of cell separation, FIG. 11 shows the isolation of Micrococcus lysodeikticus from whole blood. Bacteria concentrate on the electrodes, while unwanted blood cells, both red blood cells and white blood cells, are dark areas between the electrodes. Cells were allowed to separate using a biasing protocol that included a 10 V peak-to-peak sine wave signal at 10 kHz. In this case, this signal value was used, but in general cell separation can be performed using a sinusoidal signal with 2-20 peak-to-peak volts and 5-50 kHz frequency.
원치않는 세포는 목적하는 세포는 잔류시키면서 유동챔버로부터 세척된다. 이것은 목적하는 세포를 위한 인력 바이아스 (attractive bias)를 유지시키고 유동챔버를 통해서 세척완충액의 유동을 발생시킴으로써 이루어진다. 일단 목적하는 세포가 유동챔버에서 분리되면, 이들은 추가의 처리를 위한 다수의 방법으로 처리될 수 있다. 한가지 구체예에서는 세포를 문헌 (J. Cheng, et al., "Preparation and hybridization analysis of DNA/RNA fromE. colion microfabricated bioelectronic chips",Nature Biotechnol., 16, pp. 541-546, 1998)에 기술된 바와 같이 펄스폭이 10 ㎲ 내지 50 ㎲인 450 볼트 이하의 고전압 펄스를 적용함으로써 용해된다. 또 다른 예에서는, 도 14-17에 도시된 바와 같이 혈액세포로부터 이. 콜라이 (E. coli) 세포를 분리시켰다. 도 14에서는 사각형-벽 유전력 패턴을 사용하였으며, 그 반면에 도 15에서는 체커판 패턴이 사용되었다. 예를들어, 체커판 패턴에 대한 분리는 10 kHz에서 10 V 피크-대-피크의 사인파 신호의 바이아스 형식을 사용하였다. 도 16 및 17은 사각형-벽 및 체커판 패턴의 분리를 세척한 후에 얼마나 깨끗하게 세균세포가 분리되는지를 나타낸 것이다.Unwanted cells are washed out of the flow chamber while retaining the desired cells. This is achieved by maintaining an attractive bias for the cells of interest and generating a flow of wash buffer through the flow chamber. Once the desired cells have been separated from the flow chamber, they can be treated in a number of ways for further processing. In one embodiment the cells are described in J. Cheng, et al., "Preparation and hybridization analysis of DNA / RNA from E. coli on microfabricated bioelectronic chips", Nature Biotechnol. , 16, pp. 541-546, 1998. It is dissolved by applying a high voltage pulse of 450 volts or less with a pulse width of 10 kV to 50 kV as described. In another example, E. coli from blood cells as shown in Figures 14-17. E. coli cells were isolated. In FIG. 14, a square-wall dielectric pattern was used, whereas in FIG. 15, a checkerboard pattern was used. For example, the separation for the checkerboard pattern used a bias form of a sine wave signal of 10 V peak-to-peak at 10 kHz. 16 and 17 show how cleanly bacterial cells are separated after washing the separation of the square-wall and checkerboard patterns.
또 다른 예에서는, 포유동물 세포를 유동챔버의 전자그리드 상에서 분리한다. 도 12, 13A 및 13B는 경부암세포의 분리를 나타내고 있다. 도 12는 세포를양성 유전이동력에 적용시킴으로써 전기장이 최대인 그리드의 전극 상으로 세포가 이동한 초기분리를 보여주는 것이다. 암세포와 혼합된 정상적인 인간의 백혈구 및 적혈구의 혼합물은 핑크색을 띤 다이아몬드-형 스폿트로 반영되는 것으로 전기장이 최소인 전극들 사이의 공간으로 밀려간다. 세척한 후에, 암세포는 전극에 의해서 보유되는 (도 13A) 반면에 정상적인 혈액세포는 모두 세척되어 나왔다. 도 13B는 프로피듐요오다이드로 염색한 후의 세포를 나타낸 것이다. 예를들어, 포유동물 세포는 체커판 형식을 사용하고 3분 동안 30 kHz에서 6 V 피크-대-피크의 사인파 신호를 적용함으로써 분리될 수 있었다 (J. Cheng, et al., "Isolation of Cultured Cervical Carcinoma Cells Mixed With Peripheral Blood Cells on a Bioelectronic Chip,"Anal. Chem.v. 70, pp 2321-26, 1998).In another example, mammalian cells are separated on the electronic grid of the flow chamber. 12, 13A and 13B show the isolation of cervical cancer cells. FIG. 12 shows the initial separation of cells as they move onto the electrodes of the grid with the largest electric field by applying the cells to positive genetic mobility. The mixture of normal human leukocytes and red blood cells mixed with cancer cells is reflected in the pinkish diamond-like spots and is pushed into the space between the electrodes with the least electric field. After washing, the cancer cells were retained by the electrode (FIG. 13A) while the normal blood cells were all washed out. Figure 13B shows the cells after staining with propidium iodide. For example, mammalian cells could be isolated by using a checkerboard format and applying a 6 V peak-to-peak sine wave signal at 30 kHz for 3 minutes (J. Cheng, et al., “Isolation of Cultured Cervical Carcinoma Cells Mixed With Peripheral Blood Cells on a Bioelectronic Chip, " Anal. Chem. V. 70, pp 2321-26, 1998).
용해시킨 후에, 세포성 단백질 및 핵산 둘다는 분석을 위해서 보유될 수 있다. 핵산이 용해된 세포로부터 보유될 수 있다는 것을 보여주는 한가지 예는 도 18에 제공되어 있다. 여기에서는 이. 콜라이 (E. coli) DNA를 PAGE 겔상에서 처리하여 염색체성 및 플라스미드 DNA 둘다가 보유됨을 나타내고 있다.After lysis, both cellular proteins and nucleic acids can be retained for analysis. One example showing that nucleic acids can be retained from lysed cells is provided in FIG. 18. This here. E. coli DNA was processed on a PAGE gel to show that both chromosomal and plasmid DNA were retained.
분석을 위해서 핵산이 필요한 경우에, 추가의 세정 (clean-up) 및 정제에는 프로테이나제 K와 같은 프로테아제에 의한 처리가 포함될 수 있다. 이러한 처리를 한 후에, 용해물은 즉시 분석할 수 있거나, 증폭시킨 다음에 분석할 수 있다. 대체용 구체예가 사용되는 경우에, 샘플른 유동챔버 내에서 더 처리할 수 있거나, 이러한 프로테아제 처리, 증폭 및 분석을 위해서 제 2 챔버에 보내질 수 있다. 일반적으로, 프로테아제 처리는 60℃의 적절한 완충액 중에서 15분 동안 수행할 수 있다. 온도조절은 마이크로칩의 배면에 부착된 세라믹 가열기요소를 사용함으로써 이루어질 수 있다. 프로테이나제 K의 불활성화는 샘플을 95℃에서 2분 동안 가열함으로써 이루어질 수 있다. 전체적으로 세포 분리, 용해 및 프로테아제 처리과정은 15-25분이 소요될 수 있다.If nucleic acids are needed for analysis, further clean-up and purification may include treatment with proteases such as proteinase K. After this treatment, the lysate can be analyzed immediately or after amplification. If alternative embodiments are used, the sample may be further processed in the flow chamber or may be sent to a second chamber for such protease treatment, amplification and analysis. In general, protease treatment can be performed for 15 minutes in a suitable buffer at 60 ° C. Temperature control can be achieved by using a ceramic heater element attached to the back of the microchip. Inactivation of proteinase K can be achieved by heating the sample at 95 ° C. for 2 minutes. Overall, cell separation, lysis and protease treatment can take 15-25 minutes.
단백질을 목적으로 하는 경우에는, 샘플을 제한효소 및 뉴클레아제로 처리함으로써 핵산을 제거할 수 있다. 단백질은 다양한 효소 및 부분 프로테아제 처리에 의해 더 처리하여 세포막 및 다른 세포성분으로부터 목적하는 특정 단백질을 유리시킬 수 있다. 상기한 샘플처리단계에 이어서 증폭 (예를들어, PCR 및 SDA에 의함) 및 방사성동위원소 또는 형광성 마커에 의한 표지를 포함하는 추가의 처리단계가 수행될 수도 있다.In the case of proteins, nucleic acids can be removed by treating the sample with restriction enzymes and nucleases. Proteins can be further processed by various enzyme and partial protease treatments to release the particular protein of interest from cell membranes and other cellular components. Subsequent sample processing steps may be followed by further processing steps including amplification (eg, by PCR and SDA) and labeling by radioisotopes or fluorescent markers.
화학반응단계 처리의 예로서, 특정 핵산서열 (즉, 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica)의invA및spa Q유전자)을 SDA를 사용하여 증폭시켰다. 본 휴대용 시스템에서는 SDA가 바람직한데, 이는 증폭을 50℃ 내지 60℃에서 등열조건하에 수행하여 PCR과 관련된 고온 변성사이클을 제거할 수 있기 때문이다. 그러나, 한가지 구체예에서 휴대용 시스템은 유동챔버에 반복적인 고온사이클링을 완수할 수 있는 능력을 갖는 전술한 가열요소가 장치됨으로써 PCR 증폭을 수행할 수도 있다.As an example of the chemical reaction step treatment, certain nucleic acid sequences (ie, invA and spa Q genes of Salmonella enterica ) were amplified using SDA. In this portable system, SDA is preferred because the amplification can be performed under isothermal conditions at 50 ° C. to 60 ° C. to eliminate high temperature denaturation cycles associated with PCR. However, in one embodiment, the portable system may perform PCR amplification by equipping the flow chamber with the aforementioned heating element having the ability to complete repetitive hot cycling.
도 19 및 20에 나타낸 바와 같이, SDA는 장치내에서 효과적으로 수행되어 통상적인 반응튜브 내에서 수행된 양성대조군과 동등한 생성물 수율을 제공할 수 있다. 이 실시예에서는 50 ㎕ 부피로 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica) 및혈액세포를 혼합시켜 10,000 부위 전극어레이를 함유하는 유동셀 내에 주입시켰다. 세균세포를 체커판 패턴을 사용하여 주파수가 10 내지 15 kHz인 사인파 파형을 갖는 10 V 피크-대-피크 신호의 바이아싱 프로토콜을 사용하는 유전이동에 의해서 혈액세포로부터 분리시켰다. 세포혼합물을 유동챔버가 충전될 때 까지 분당, 31 ㎕의 비율로 유동셀에 부은 다음에, 총 50 ㎕ 부피가 챔버를 통과할 때 까지 유속을 12.4 ㎕/분으로 조정하였다. 세포는 프로토콜에 의해서 성립된 양성 유전이동력의 영향에 의해서 전극상에 보유되었다. 그후, 유동셀을 물로 세척하여 완충액을 114 ㎕/분의 속도로 10분 동안 역방향으로 주입함으로써 양성 바이아스에 의해 보유되지 않은 세포를 제거하였다. 그후, 유동셀의 유체 내용물을spa Q또는inv A유전자 서열을 증폭시키기 위한 SDA 시약의 용액으로 교환시켰다.As shown in Figures 19 and 20, SDA can be effectively performed in the apparatus to provide product yields equivalent to the positive control group performed in conventional reaction tubes. In this example, Salmonella enterica and blood cells were mixed in a 50 μl volume and injected into a flow cell containing 10,000 site electrode arrays. Bacterial cells were isolated from blood cells using a checker plate pattern by genetic migration using a 10 V peak-to-peak signal biasing protocol with a sinusoidal waveform with a frequency of 10-15 kHz. The cell mixture was poured into the flow cell at a rate of 31 μl per minute until the flow chamber was filled, and then the flow rate was adjusted to 12.4 μl / min until a total of 50 μl volume passed through the chamber. Cells were retained on the electrodes by the effect of positive heritability established by the protocol. The flow cell was then washed with water to inject buffer in the reverse direction for 10 minutes at 114 μl / min to remove cells not retained by positive vias. The fluid contents of the flow cell were then exchanged with a solution of SDA reagent to amplify the spa Q or inv A gene sequences.
세균세포로부터의 총 핵산은 10 ms의 기간 및 총 40회의 별도의 펄스로 사각형 파동형을 갖는 200 V의 펄스파 직류로 전극에 에너지를 줌으로써 세포를 일차 용해시켜 분리시켰다 (또 다른 방법으로, 세포는 챔버를 5분 동안 95℃로 가열함으로써 용해시킬 수 있다). 농축된 SDA 시약 및 완충액 저장혼합물을 유동셀에 도입시키고 변성된 표적 핵산과 혼합시켜 다음과 같은 최종농도의 SDA 반응성분을 제공하였다: 500 mM 증폭프라이머, 50 nM '범퍼 (bumper)' 프라이머, 9.5 mM 마그네슘아세테이트, 35 mM 칼륨포스페이트 완충액 pH 7.6, 80 ㎍/㎖ 소혈청알부민, 및 각각 1.4 mM인 dATP, dGTP, TTO 및 알파-티올레이트화 dCTP. 증폭프라이머는inv A또는spa Q유전자의 81 염기쌍을 증폭시키도록 디자인되고, 다음과 같은 핵산서열로 이루어진다:Total nucleic acids from bacterial cells were first lysed and isolated by energizing the electrodes with a pulse wave direct current of 200 V having a rectangular wave shape for a period of 10 ms and a total of 40 separate pulses. Can be dissolved by heating the chamber to 95 ° C. for 5 minutes). The concentrated SDA reagent and buffer stock mixture was introduced into the flow cell and mixed with the denatured target nucleic acid to give the following final concentration of SDA reactivity: 500 mM amplified primer, 50 nM 'bumper' primer, 9.5 mM magnesium acetate, 35 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 80 μg / ml bovine albumin, and dATP, dGTP, TTO and alpha-thiolated dCTP, respectively, 1.4 mM. Amplification primers are designed to amplify 81 base pairs of the inv A or spa Q gene and consist of the following nucleic acid sequences:
spa QSeq. Id. No. 1 5'-accgcatcgaatgcatgtctcgggtcctggtagggttattc-3' spa Q Seq. Id. No. 1 5'-accgcatcgaatgcatgtctcgggtcctggtagggttattc-3 '
spa QSeq. Id. No. 2 5'-cgattccgctccagacttctcgggaacacacgccaagta-3' spa Q Seq. Id. No. 2 5'-cgattccgctccagacttctcgggaacacacgccaagta-3 '
inv ASeq. Id. No. 3 5'-accgcatcgaatgcatgtctcgggtttcaacgtttcctgcg-3' inv A Seq. Id. No. 3 5'-accgcatcgaatgcatgtctcgggtttcaacgtttcctgcg-3 '
inv ASeq. Id. No. 4 5'-cgattccgctccagacttctcgggatcgataatgccagacg-3' inv A Seq. Id. No. 4 5'-cgattccgctccagacttctcgggatcgataatgccagacg-3 '
범퍼프라이머는 다음의 서열로 이루어진다:The bumper primer consists of the following sequence:
spa QSeq. Id. No. 5 5'-gcaacgattatcggc-3' spa Q Seq. Id. No. 5 5'-gcaacgattatcggc-3 '
spa QSeq. Id. No. 6 5'-ccagacagtaaaaac-3' spa Q Seq. Id. No. 6 5'-ccagacagtaaaaac-3 '
inv ASeq. Id. No. 7 5'-ttgacagaatcctca-3' inv A Seq. Id. No. 7 5'-ttgacagaatcctca-3 '
inv ASeq. Id. No. 8 5'-taagacggctggta-3' inv A Seq. Id. No. 8 5'-taagacggctggta-3 '
유리된 핵산은 그 다음에 챔버를 5분 동안 90℃로 가열함으로써 변성시켰다. 그후 챔버를 60℃가 되도록 하고, 효소를 함유하는 SDA 시약완충액 10 ㎕를 챔버에 도입시켜 증폭을 개시시켰다 (즉, BsoB1 제한엔도뉴클레아제 40 유니트 및 엑소-Bst DNA 폴리머라제 16 유니트).The liberated nucleic acid was then denatured by heating the chamber to 90 ° C. for 5 minutes. The chamber was then brought to 60 ° C. and 10 μl of SDA reagent buffer containing enzyme was introduced into the chamber to initiate amplification (ie 40 units of BsoB1 restriction endonuclease and 16 units of exo-Bst DNA polymerase).
본 발명의 시스템에서, SDA를 사용한 증폭반응은 25 내지 35분 동안 수행할 수 있다. 본 실시예에서는, 30분 동안 반응시킨 후에 반응액 부피중의 5 ㎕ 분취액을 PAGE 분석을 위해서 분리시켰다 (도 19 및 20).In the system of the present invention, the amplification reaction using SDA can be performed for 25 to 35 minutes. In this example, 5 μl aliquots in the reaction volume were separated for PAGE analysis after reaction for 30 minutes (FIGS. 19 and 20).
목적하는 분자의 검출을 포함하는 샘플취급의 제 3 단계는 바람직하게는 목적하는 단백질 및 핵산에 대해 수행한다. 이러한 검출은 마이크로어레이에 미리 부착시킨 프로브에 대한 다양한 형태의 하이브리드화를 사용할 수 있다. 예를들어, 핵산 (예를들어, RNA, DNA 및 pNA)은 하이브리드화에 의해 샘플-유도된 핵산피분석물 (예를들어, 증폭되거나 비증폭된 표적 핵산)을 결합시키기 위해서 사용될 수 있다. 단백질도 어레이에 부착된 포착분자에 결합하도록 만들 수 있다 (즉, 단백질-리간드 결합 상호작용). 이러한 포착분자는 단백질 또는 다른 분자들을 함유할 수 있으며, 결합 상호작용은 항원-항체, 효소-기질 및 수용체-리간드 결합과 같은 상호작용으로 이루어질 수 있다.The third step of sample handling involving the detection of the molecule of interest is preferably performed on the protein and nucleic acid of interest. Such detection can use various forms of hybridization for probes previously attached to the microarray. For example, nucleic acids (eg, RNA, DNA and pNA) can be used to bind sample-derived nucleic acid analytes (eg, amplified or unamplified target nucleic acids) by hybridization. Proteins can also be made to bind to capture molecules attached to the array (ie, protein-ligand binding interactions). Such capture molecules may contain proteins or other molecules, and binding interactions may consist of interactions such as antigen-antibodies, enzyme-substrate and receptor-ligand bonds.
핵산과 관련하여, 표적 핵산종은 증폭된 것이든지 안된 것이든지, 고정되어 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브에 의한 포착을 위해 단일 (또는 이차) 유동챔버의 마이크로어레이의 특이적 포착패드에 전자적으로 어드레스된다. 바람직하게는, 유동셀 (즉, 사용된 구체예 및 프로토콜에 따라 유동셀 11, 31a 또는 32)의 전극 어레이는 투과층 (예를들어, 아크릴아미드-기본 하이드로겔)으로 피복된 적어도 25개의 개별적으로 어드레스 가능한 전극을 갖는다. 표적 핵산은 기능발생기/임의의 파형발생기 (33120A, Hewlett Packard, Santa Clara, CA)를 사용하여 발생된 양성 사인파 신호를 사용하여 바이아싱된다. 그후, 포착 프로브-표적 하이브리드는 형광단-표지된 리포터 프로브 및 도 2에 도시된 휴대용 기구에 사용된 CCD-기본 광학적 영상시스템 (optical imaging system)을 사용하여 검출된다. 이 배열에 의한 검출을 수행하는데는 약 5분이 소요된다.With respect to the nucleic acid, the target nucleic acid species, whether amplified or not, is electronically addressed to the specific capture pad of the microarray of a single (or secondary) flow chamber for capture by immobilized oligonucleotide probes. Preferably, the electrode array of the flow cell (ie flow cell 11, 31a or 32, depending on the embodiment and protocol used) is at least 25 individual coated with a permeable layer (eg acrylamide-based hydrogel). Has an addressable electrode. Target nucleic acids are biased using positive sine wave signals generated using a function generator / arbitrary waveform generator (33120A, Hewlett Packard, Santa Clara, Calif.). The capture probe-target hybrid is then detected using a fluorophore-labeled reporter probe and a CCD-based optical imaging system used in the handheld instrument shown in FIG. 2. It takes about 5 minutes to perform the detection by this arrangement.
상기한 실시예를 계속하여,spa Q또는inv A유전자의 증폭생성물을 포착 및 분석에 이용할 수 있었다. 포착시키기 전에, SDS 반응용액 및 증폭생성물을 약 75 ㎕ 부피로 탈염칼럼에 통과시키고, 이어서 완충액을 50 mM 히스티딘 완충액으로 교환시켰다. 그후, 증폭생성물은 전극을 피복시킨 투과층에 부착된 유전자 특이적프로브를 함유하는 전극의 특이적 패드에 어드레스시켰다. 이어서, 챔버를 200 mM NaCl, 10 mM 트리스 pH 8.0, 1 mM EDTA로 세척한 다음, 다시 200 mM NaCl, 10 mM 트리스 pH 8.0, 1 mM EDTA 및 100 ㎍/㎖ 송아지흉선 DNA 중에 0.5 μM 의 농도로 함유된 증폭생성물에 대해 특이적인 보디피 (bodipy) 630-표지된 프로브 올리고뉴클레오타이드를 도입시켰다. 리포터 프로브 용액을 분석용 셀에 10분 동안 잔류시킨 다음, 50 mM 히스티딘 완충액 7-800 ㎕로 세척하였다. 그후, 챔버를 630 nM 헬륨-네온 레이저 및 컴퓨터 제어되는 CCD 카메라를 사용하여 가시화시켰다. 도 21은 유동챔버 내의 전극의 각각의 패드에 대한spa Q유전자 증폭생성물의 결합의 결과를 나타낸 것이다. 결합은 유동셀 내에서 생산된 증폭생성물이 반응튜브에서 대조군으로서 생산된 증폭생성물의 어니일링에 비해서 만족스럽게 포착패드 (분획 1 및 2)에 어니일링하였음을 나타내었으며, 그 다음에 분획 1 및 2를 어드레스시킨 후에 유동셀 챔버 내로 도입시켰다. 대조반응에서 수득된 더 높은 증폭레벨로 인하여 대조 증폭생성물에 대한 결합레벨이 더 높았다. 본 발명자들은 유동셀 반응으로부터 증폭된 생성물의 매우 적은 비특이적 결합이 비특이적 포착프로브를 갖는 포착부위에 결합하였음을 확인하였다.Continuing the above examples, the amplification products of the spa Q or inv A gene could be used for capture and analysis. Prior to capture, the SDS reaction solution and amplification product were passed through a desalting column in a volume of about 75 μl, and then the buffer was exchanged for 50 mM histidine buffer. The amplification product was then addressed to the specific pad of the electrode containing the gene specific probes attached to the electrode-coated permeable layer. The chamber was then washed with 200 mM NaCl, 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, then again at a concentration of 0.5 μM in 200 mM NaCl, 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA and 100 μg / ml calfthyma DNA. A bodipy 630-labeled probe oligonucleotide specific for the amplification product contained was introduced. The reporter probe solution was left in the assay cell for 10 minutes and then washed with 7-800 μl 50 mM histidine buffer. The chamber was then visualized using a 630 nM helium-neon laser and a computer controlled CCD camera. Figure 21 shows the results of the binding of the spa Q gene amplification product to each pad of electrodes in the flow chamber. The binding indicated that the amplification product produced in the flow cell annealed to the capture pads (fractions 1 and 2) satisfactorily compared to the annealing of the amplification product produced as a control in the reaction tube, and then fractions 1 and 2 Was addressed and then introduced into the flow cell chamber. The binding level to the control amplification product was higher due to the higher amplification level obtained in the control reaction. We found that very little nonspecific binding of the product amplified from the flow cell reaction bound to the capture site with the nonspecific capture probe.
도 22에서는,spa Q유전자에 대한 증폭된 SDA 생성물도 또한 두개의 대체용 바이아싱 형식을 사용하여 마이크로어레이 상의 특이적 패드에 어드레스되었다. 하나의 바이아싱 프로토콜에서는, 앰플리콘을 1 kHz에서 3.5 V 피크-대-피크의 사인파 기본 AC 형식을 사용하여 어드레스시켰다. 이 프로토콜은 또한 5분 동안 +2.3 V의 DC 옵셋트 전압을 사용하였다. 다른 프로토콜에서는, 2분 동안 +2.5 V로이루어지는 직류 (DC) 형식을 사용하였다. 여기에서 볼 수 있는 바와 같이, DC 바이아싱된 패드가 더 큰 결합신호를 나타내기 때문에 DC 프로토콜은 목적하는 분자를 더 큰 효율로 포착부위에 이송시킬 수 있다. 이 결과는 또한, 샘플물질 (세포 및 분자)의 처리가 이 전자-기본 칩상 실험실 시스템을 사용하여 이루어질 수 있는 넓은 조정범위 내에서 조작될 수 있다는 점에서 시스템의 융통성을 나타낸다. 예를들어, 상기 실시예에서는 AC 형식이 특이적 서열에 대해 더 낮은 이송운동성을 제공하는 것으로 나타났지만, AC 형식의 사용은 전압범위가 2.0 내지 5.0 피크-대-피크이고, 주파수범위는 1 내지 10 kHz이며, DC 옵셋트는 1-5 볼트의 범위인 경우에 수행될 수 있다. 이러한 범위의 융통성은 가변적인 완충액 조건하에서 분자의 이송을 제공한다.In FIG. 22, the amplified SDA product for the spa Q gene was also addressed to specific pads on the microarray using two alternative biasing formats. In one biasing protocol, the amplicons were addressed using a 3.5 V peak-to-peak sine wave basic AC format at 1 kHz. The protocol also used a DC offset voltage of +2.3 V for 5 minutes. In another protocol, a direct current (DC) form of +2.5 V was used for 2 minutes. As can be seen here, since the DC biased pads exhibit a larger combined signal, the DC protocol can transfer the desired molecules to the capture site with greater efficiency. This result also shows the flexibility of the system in that the treatment of sample material (cells and molecules) can be manipulated within the wide range of adjustments that can be made using this electronic-based on-chip laboratory system. For example, in the above examples, the AC format has been shown to provide lower transfer motility for specific sequences, but the use of the AC format has a voltage range of 2.0 to 5.0 peak-to-peak, and a frequency range of 1 to At 10 kHz, a DC offset can be performed in the range of 1-5 volts. This range of flexibility provides for the transport of molecules under variable buffer conditions.
프로브 하이브리드화에 의한 증폭반응생성물의 가시적 검출은 적어도, 635 ㎚의 방출파장을 갖는 약 2 밀리왓트의 레이저 파워를 발생시킬 수 있는 능력을 갖는 배터리 구동되는 다이오드 레이저를 조정함으로써 수행될 수 있다. 레이저를 사용하여 형광성 염료-표지된 리포터 프로브 (예를들어, BODIPY-630)를 여기시킨다. 방출필터의 파장은 670 ㎚이다. 이색성 거울은 645 ㎚에서 파장 컷오프를 갖는다. 또 다른 방식으로, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 인지되고 있는 바와 같이 광-기본 검출 대신에 직접적인 전기화학적 전압전류 검출시스템을 사용할 수도 있다.Visible detection of the amplification reaction product by probe hybridization may be performed by adjusting a battery powered diode laser having the ability to generate at least about 2 milliwatts of laser power with an emission wavelength of 635 nm. A laser is used to excite fluorescent dye-labeled reporter probes (eg, BODIPY-630). The wavelength of the emission filter is 670 nm. The dichroic mirror has a wavelength cutoff at 645 nm. Alternatively, a direct electrochemical voltammetry detection system may be used instead of photo-base detection as would be appreciated by those skilled in the art.
전술한 본 발명은 명확성 및 이해를 목적으로 설명 및 실예를 들어 어느 정도 상세히 기술하였지만, 본 발명의 내용에 비추어서 첨부된 청구범위의 의의 또는범주를 벗어나지 않고 특정한 변화 및 변형이 이루어질 수도 있다는 것은 본 기술분야에서 통상의 기술을 갖는 숙련자에게 용이하게 명백해 질 수 있을 것이다.While the foregoing invention has been described in some detail by way of illustration and example for purposes of clarity and understanding, it is to be understood that certain changes and modifications may be made without departing from the spirit or scope of the appended claims in light of the teachings of the invention. It will be readily apparent to those skilled in the art.
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