KR20010101162A - 항산화 파이토슈티칼 또는 뉴트라슈티칼의 잇점을제공하는 체리 단리물의 이용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포유류, 특히 인간에게 체리 유도체를 이용하여 뉴트라슈티칼 또는 파이토슈티칼의 잇점을 제공하는 방법에 관한 것이다. 또한, 생물질의 산화를 억제하는 방법에 관한 것이다. 체리로부터 얻은 안토시아닌, 바이오플라보노이드, 페놀류 또는 이들의 혼합물이 본 방법에서 사용된다.
Description
본 발명은 유익한 뉴트라슈티칼 (Neutraceutical) 또는 파이토슈티칼 (Phytoceutical)의 잇점을 지닌 체리 단리물의 이용 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 체리로부터 얻은 조성물을 이용하여 산화 억제가 요구되는 생물질의 산화를 억제하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 건강보조식품 또는 식품 첨가물로서의 화합물 또는 조성물에 관한 것이다. 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류의 혼합물을 함유하는 조성물이 가장 바람직하다.
식물로부터 유래된 많은 화합물이, 반응성 산소 중간체 수준을 낮게 유지함으로써 세포 산화방지제로서 작용하거나, 프로스타글란딘 합성을 저해함으로써 항염증제로서 작용하거나, 세포 증식에 관여하는 효소의 저해제로서 작용함으로써, 중요한 긍정적인 약학적 또는 "뉴트라슈티칼" 특성을 식품에 부여할 수 있다. 이러한 활성은 암, 관절염 및 심혈관 질환을 포함하는 만성 질환의 개선에 중요할 수 있다 (킨셀라 (Kinsella) 등의 문헌 [Food Tech. 85-89(1993)]을 참조). 따라서, 건강보조식품/식품 산업 및 뉴트로슈티칼 회사는 천연 물질을 사용하여 합성 산화방지제와 동등하게 효과적으로 식품 안정성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 소비자에게 현저한 건강상 잇점을 줄 수 있는 화합물을 이용하는 기회를 갖게 된다.
체리는 일반적으로 건강상 잇점을 갖는 것으로 생각된다. 미국에서 상업적으로 재배되는 주된 산미 (酸味) 체리인 프루누스 세라수스 엘. (Prunus Cerasus L.) (로제이시즈(Rosacease)), 재배변아종 몬트모렌시 (MONTMORENCY)가 바람직한 체리이다. 몬트모렌시의 단일 경작에 대한 도전으로서, 신형 재배변아종인 발라톤 (BALATON, 등록상표) 산미의 체리 (유페르베르토이 푸르토스 (Ujferbertoi furtos))가 1984년 미국에 도입되었고, 미시간주, 유타주 및 위스콘신주에서 시험 경작되고 있다. 발라톤은 몬트모렌시보다 더 거무스름한 열매를 맺는다.
최근의 연구 결과는 안토시아닌, 예를 들면 시아니딘-3-글루코시드가 강한 항산화 활성을 지님을 나타내고 있다 (쯔다 (Tsuda, T) 등의 문헌 [J. Agric. Food Chem. 42:2407-2410 (1994)] 참조). 산화방지제의 첨가는 지질 과산화 반응과 연관되어 있는 것으로 생각되는 식품류의 저장 기간을 연장시키기 위한 대표적인 방법 중 하나이다. 천연 산화방지제는 발암의 방지에 중요한 역할을 담당할 수 있다. 건강보조식품 산화방지제는 생체계의 과산화 반응에 의한 손상에 효과적일 수 있다 (할리웰 및 구테리지 (Halliwell, B. and J.M.C. Gutteridge)의 문헌 [Free radicals in boilogy and medicine. Oxford University Press, New York 416-494 (1989)]; 오자와 (Osaea, T.) 등의 문헌 [Role of dietary antioxidants in protection against oxidative damage]; 구로다 (Kuroda, Y.)의 문헌 [In antimutagenesis and anti carcinogenesis Mechanism, 샨켈 (Shankel, D.M.), 워터스 (Water, M.D.) 편집, Plenum Publishing. New York 139-153 (1990)] 참조).
초기 연구에서는 몬트모렌시 체리가 시아니딘-3-젠티오바이오시드 및 시아니딘-3-루티노시드라는 안토시아닌을 함유한다는 것이 밝혀졌다 (리 (Li, K.C.) 등의 문헌 [J. Am. Chem. Soc.78:979-980(1956)] 참조). 시아니딘-3-글루코실루티노시드 역시 7가지의 산미의 체리 변종들 중 6가지에서 발견되었다 (하보른 (Harborne, J.B.) 등의 문헌 [Phytochemistry 3:453-463(1964)] 참조). 데카조스 (Dekazos)는 몬트모렌시 체리내의 안토시아닌 색소는 페오니딘-3-루티노시드, 페오니딘 및 시아니딘과 함께 시아니딘-3-소포로시드, 시아니딘-3-루티노시드 및 시아니딘-3-글루코시드라고 보고하였다 (데카조스 (Dekazos, E.D.)의 문헌 [J. Food Sci. 35:237-241(1970)] 참조). 그러나, 시아니딘-3-글루코시드, 시아니딘-3-소포로시드 및 시아니딘-3-루티노시드 뿐만 아니라 시아니딘-3-글루코실루티노시드가 산미의 체리의 주요 색소인 것으로 밝혀졌다. HPLC 체류값을 사용하여, 산드라 (Chandra) 등은 시아니딘-3-소포로시드 및 시아니딘-3-글루코시드가 미시간주에서 재배되는 몬트모렌시 체리에서 각각 주된 색소 및 보조 색소라고 하였다 (산드라 (Chandra, A) 등의 문헌 [J. Agric. Food Chem. 40:967-969(1992)] 참조). 이와 유사하게, 시아니딘-3-크실로실루티노시드는 몬트모렌시 체리에서 보조 색소라는 것이 밝혀졌다(쉬리크한드 (Shrikhande, A.J.) 및 프란시스 (F.J. Francis)의 문헌 [J. Food Sci. 38:649-651(1973)] 참조).
종래 기술에서, 발라톤과 몬트모렌시 체리 즙으로부터 순수한 안토시아닌 (도 1의 화합물 1 내지 3)의 생산은, 우선 이 색소를 앰버라이트 XAD-2 (AMBERLITE XAD-2, 시그마 케미칼스(Sigma Chemicals)) 칼럼에 흡착시킴으로써 수행되었다 (산드라 에이 등의 문헌 [J. Agric. Food Chem. 41:1062-1065(1993)]을 참조). 이 칼럼은 용리액이 약 7.0의 pH를 나타낼 때까지 물로 세척되었다. 흡착된 색소와 기타 페놀류는 MeOH로 용출되었다. 이렇게 얻어진 조질 안토시아닌은, 각각 스펙트럼 연구를 위한 순수 안토시아닌을 얻기 위해, 분획화되고 C-18 MPLC 및 HPLC에 의해 정제되었다. 앰버라이트 XAD-2로부터 얻어진 500㎎의 조질 몬트모렌시 안토시아닌으로부터는 60㎎의 순수 안토시아닌 1 내지 3이 얻어진 반면, 발라톤으로부터는 391.43㎎이 얻어졌다. 이 연구 결과는 XAD-2로부터 얻어진 몬트모렌시 체리의 조질 안토시아닌은 기타 유기 화합물을 높은 비율로 함유하고 있음을 말해준다. 앰버라이트 XAD-2는 수지를 재활용할 수가 없었다. 플라보노이드, 이소플라보노이드, 페놀류와 안토시아닌의 조질 혼합물을 어떠한 용도로도 사용하기 위한 시도는 전혀 없었다. 가부트 (Garbutt)에 허여된 미국 특허 제 5,266,685 호 및 카트자키안 (Katzakian) 등에 허여된 미국 특허 제 5,665,783 호 및 모자파(Mozaffar)에 허여된 미국 특허 제 5,817,354 호에는 다양한 흡착성 수지 및 이를 서로 관련이 없는 생성물들의 분리에 사용하는 용도가 기술되어 있다. 이 특허들은 흡착 수지의 용도에 대한 종래 기술의 일반적인 상황을 설명할 뿐이다.
플레바 (Pleva)에게 허여된 미국 특허 제5,503,867호에서는 분쇄한 육류에 완전히 분쇄한 체리 및 귀리 밀기울을 사용하는 것을 개시하고 있다. 사용된 체리의 양은 10 내지 15 중량%이고 귀리 밀기울은 체리 즙을 보상하기 위해 첨가하는 것으로 여겨진다. 여하간, 체리는 확실히 육류에 풍미를 부여하지만, 제품이 보편적으로 입맛에 맞는 것은 아니다. 상기 특허에서는 뉴트라슈티칼 또는 파이토슈티칼의 잇점을 기술하지 않고 있다. 저지방의 분쇄한 쇠고기를 체리 조직으로 안정화하는 것에 관한 최근 연구는 이와 같은 식물원이 지질 과산화를 억제할 뿐만 아니라 튀길때 헤테로시클릭 방향족 아민 및 콜레스테롤 산화 생성물의 형성을 억제하는 효능있는 산화방지제를 함유한다는 것을 시사하고 있다 (고마 (Gomaa) 등의 문헌 [ITF Abstracts No, 68E-7 (1996)]). 이와 같은 관찰을 설명하는데 사용되는 가설은 체리와 같은 고등 식물의 액포중에서 흔히 발견되는 폴리페놀, 예를 들면 플라보노이드, 안토시아닌 및 안토시아니딘이 이와 같은 항산화 효과를 나타낸다는 것이었다.
특히, 건강보조식품/뉴트라슈티칼 또는 식품 첨가물로 이용하기 위한 천연 체리-유래의 조성물이 요구되고 있다.
도 1은 발라톤 및 몬트모렌시 체리로부터 분리된 특정 안토시아닌(색소)의구조를 보여준다. 아글리콘인 시아니딘은 3번 위치에서 히드록실기를 갖는다.
도 2 및 도 3은 체리로부터 분리된 주요 바이오플라보노이드를 보여주는 도면이다.
도 4는 산미의 체리로부터 분리된 특정 페놀류를 보여준다.
도 5는 체리로부터 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 분리시키는 방법의 단계를 보여준다.
도 6은 도 5에 도시된 방법에서 사용될 수 있는 장치를 보여주는 개략도이다.
도 7은 리포좀 모델계에서 안토시아닌 및 시판되는 산화방지제의 항산화 효능을 나타낸 그래프이다. 산화는 제1 철 이온을 첨가함으로써 개시되었다. 시험 화합물의 존재시에는, 형광의 감쇠 속도가 감소하였다. 대조 표준 샘플은 어떠한 Fe2+도 함유하지 않고, Fe2+는 어떠한 시험 화합물도 함유하지 않았다. 다른 샘플은 Fe2+및 시험 화합물 2 μM을 함유하였다.
도 8은 10 μM 농도의 단리된 화합물 1 내지 4, 7 및 8 및 시판되는 산화방지제 TBHQ 및 BHT의 항산화 활성을 나타낸 그래프이다. 데이터는 2회 실험을 평균한 것이다. 화합물 1은 나린제닌 (R1-OH, R4-OH 및 R6-OH; R2, R3, R5및 R7-H)이다. 화합물 2는 제니스테인 (도 3)이다. 화합물 3은 클로로젠산이다. 화합물 4는 쿠에르세틴 3-람노시드 (도 2)이다. 화합물 7은 제니스테인 7-글루코시드 (도 3)이다. 화합물 8은 6,7-디메톡시-5,8,4'-트리하이드록시플라본 (도 2)이다.
도 9는 20 μM 농도의 단리된 화합물 1, 3 및 4 (도 4) 및 몇가지 시판되는 산화방지제의 항산화 활성을 나타낸 그래프이다. 화합물 2의 항산화 활성은 100 μM에서 측정하였다. 과산화 반응의 속도는 시간의 함수로 형광 세기의 감소에 의해 모니터링된다. 상대 세기는 소정 시간에서의 형광 세기를 분석 개시 시점에서의 초기 세기로 나눈 것으로 표시된다. 그 값은 2회 측정한 값의 평균이다.
<바람직한 실시양태의 설명>
체리로부터의 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 포함하는 혼합물을 조성물로 제조하기 위한 바람직한 방법은, 체리로부터 얻은 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 함유하는 수용액을 제공하는 단계, 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 수용액으로부터 수지 표면상에로 이동시키는 단계, 용리액을 이용하여 수지 표면을 용출시켜 그로부터 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 제거하는 단계, 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류로부터 용리액을 분리시키는 단계를 포함한다.
특히, 체리로부터의 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 조성물로 제조하기 위한 바람직한 방법은, 신선하거나 급속 냉동하여 해동한 제1의 체리 배치를 제공하는 단계, 체리를 분쇄하고 즙과 과육을 분리하는 단계, 과육으로부터 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 수용액으로 추출하는 단계, 과육으로부터 분리된 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 함유하는 수용액으로부터 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 흡착 수지 입자로 이동시키는 단계, 수지 입자를 저급 알칸올로 세척하여 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 수지 입자로부터 떼어내는 단계, 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류로부터 알칸올을 분리하는 단계, 및 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류가 제거된 수지 입자와 상기 분리된 알칸올 그리고 제2의 체리 배치를 이용하여 상기 단계를 반복하는 단계를 포함한다.
또한, 본 방법에서 사용하기에 바람직한 섭취용 조성물에는 체리로부터의 단리된 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류의 건조 혼합물과 식용 담체의 혼합물이 포함되며, 혼합물 대 담체의 중량비는 약 0.1:100 내지 100:0.1이다.
마지막으로, 체리로부터의 단리된 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류의 건조 혼합물, 및 식용 담체의 혼합물을 포함하며, 혼합물 대 담체의 중량비는 약 0.1:100 내지 100:0.1인 섭취용 조성물을 포유류에 공급하는 것을 포함하는 포유류의 바람직한 산화 억제 방법을 제공한다. 조성물이 적어도 부분적으로 건조된 체리 과육을 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용된 체리는 감미 또는 산미일 수 있다. 산미의 체리는 고농도의 말산 외에도 산미의 체리의 산미에 기여하는 다른 유기산을 함유한다. 본 발명의 방법은 식품에 사용되어 산미 및 풍미를 제공할 수 있는 말산 및 당류를 함유하는 다른 유기산을 단리한다. 가장 바람직한 것은 발라톤 및 몬트모렌시 체리이다.
안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류의 단리된 혼합물은 천연 뉴트라슈티칼/건강보조식품으로 사용될 수 있다. 이 점에 있어서 단리된 혼합물은 분말, 액상 또는 고상 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면, 혼합물은 물, 우유 또는 다른유사 액체에 녹여 음료로 만들 수 있는 녹는 분말 조성물일 수 있다. 또는, 혼합물은 정제, 겔 캡슐, 연질 겔 등과 같은 고상 형태일 수 있다. 또한, 혼합물은 식품에 혼입될 수 있다.
일반적으로, 혼합물은 전체 조성물의 약 0.01 중량% 내지 약 50 중량%, 바람직하게는 약 0.1 중량% 내지 약 30 중량%, 보다 바람직하게는 약 0.5 중량% 내지 약 25 중량%의 양으로 존재하는 형태로 제공될 수 있다.
예를 들면, 혼합물이 정제 형태로 제공될 경우, 정제는 안토시아닌 및 바이오플라보노이드 약 0.1 mg 내지 300 mg, 바람직하게는 1 내지 200 mg의 일일 투여량, 바람직하게는 60 내지 100 mg의 일일 투여량으로 제공될 수 있다. 체리 100개는 안토시아닌 60 내지 100 mg을 제공한다. 페놀류 (도 4)는 0.1 내지 50 mg의 일일 투여량으로 제공될 수 있다. 체리 100개는 페놀류 1 내지 50 mg을 제공한다. 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류의 양은 각 화합물을 단리하고 이들을 함께 블렌딩함으로써 조정할 수 있다. 한 실시양태로 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류의 천연 혼합물이 사용된다. 또한, 조성물은 등량의 투여량을 사용하는 액상 형태로 제공될 수도 있다.
수지는 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류가 흡착되는 표면을 갖는다. 바람직한 부류의 흡수성 수지는 스티렌과 디비닐벤젠으로 이루어진 교차결합된 중합체 수지, 예를 들면 앰버라이트 계열 수지, 예를 들면 미국 팬실바니아주 필라델피아 소재의 롬 앤드 하스 캄파니 (Rohm & Hass Co.)에서 시판되는 앰버라이트 XAD-4 및 앰버라이트 XAD-16이다. 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 또다른교차결합된 중합체 스티렌 및 디비닐벤젠 흡수성 수지는 미국 미시간주 미들랜드 소재의 더 다우 케미칼 캄파니 (The Dow Chemical Company)에 의해 제조되는 XFS-4257, XFS-4022, XUS-40323 및 XUS-40322 등이다.
시판되는, 국가 공인된 (필요한 경우) 스티렌-디비닐-벤젠 (SDVB) 교차결합된 공중합체 수지 (예를 들면 앰버라이트 XAD-16)를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시양태에서는, 미국 특허 제 4,297,220 호에 기술된, 롬 앤드 하스 캄파니에서 시판되는 앰버라이트 XAD-16이 수지로서 사용된다. 이 수지는 비이온성 소수성 교차결합된 폴리스티렌 디비닐 벤젠 흡수성 수지이다. 앰버라이트 XAD-16은 거대망상 (macroreticular) 구조를 갖고 연속 중합체상과 연속 기공상을 둘다 갖는다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 사용된 수지는 100 내지 200마이크론의 입경을 갖는다.
소수성 거대망상 수지 비드를 함유하고, 입경이 100 내지 200 마이크론인, 앰버라이트 XAD 흡착제 계열에 속하는 것들과 같은 기타 흡착제도 본 발명의 방법에서 효과적일 수 있다고 생각된다. 더우기, 입경이 100 내지 200 마이크론인, 애머크롬 CG (AMERCHROM CG) 흡착제 계열과 같은, 상이한 변형 앰버라이트도 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있다. 앰버라이트 XAD-16이 여러번 (100회 이상) 재사용될 수 있기 때문에 바람직하다. 그러나, 식품의 경우, 본 발명에서는 국가 공인된 수지를 사용하는 것이 중요하고/하거나 바람직하다고 생각된다.
흡착된 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 수거하는 데에 임의의 용매를 사용할 수 있다. 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 저급 알칸올이 바람직하며, 식품에 사용하도록 허가된 에탄올(에틸 알콜)이 가장 바람직하다. 전형적으로 에탄올은 물과 공비 증류되지만, 무수 에탄올도 사용될 수 있다. 체리내의 말산 및 당을 함유하는 물은 칼럼을 통과해 나간다. 이를 수거하고 식품에서 향미제로서 사용할 수 있다.
안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 바람직하게는 발라톤 및 몬트모렌시 체리로부터 얻는다. 이 체리들의 조성은 1997년 2월 12일자로 출원된 미국 특허원 제 08/799,788 호에 일부 개시되어 있고, 1998년 12월 11일자로 출원된 미국 특허원 제 60/111,945 호에 일부 개시되어 있다. 이들 특허원에 기술된 바와 같이, 몬트모렌시(프루누스 세라수스) 변종은 미국 미시간주에서 재배되는 산미의 체리의 95% 이상을 차지한다. 그러나, 신형 산미의 체리 재배변아종인 발라톤 산미의 체리(프루누스 세라수스)는 미시간주의 몇몇 과수원에서 몬트모렌시 대신에 경작되고 있다. 이 체리는 더 높은 안토시아닌 함량을 갖고 더 좋은 변종으로 간주되고 있다. 몬트모렌시 및 발라톤 산미의 체리의 안토시아닌 함량은 기록되어 있다 (왕 (Wang) 등, 1997 및 산드라 (Chandra) 등, 1993). 그러나, 발라톤 산미의 체리내의 기타 페놀류 화합물에 대한 상세한 연구는 이전에는 수행되지 않았다. 초기 연구에 따르면, 몬트모렌시 체리는 시아니딘-3-젠티오바이오시드 및 시아니딘-3-루티노시드를 함유한다 (리 등의 문헌 [J. Am. Chem. Soc. 78:979-980(1956)]을 참조). 시아니딘-3-글루코실루티노시드 역시 7가지의 산미의 체리 변종들 중 6가지에서 발견되었다 (하보른 등의 문헌 [Phytochemistry 3:453-463(1964)] 참조). 데카조스는 몬트모렌시 체리내의 안토시아닌 색소는 페오니딘-3-루티노시드, 페오니딘 및 시아니딘과 함께 시아니딘-3-소포로시드, 시아니딘-3-루티노시드 및 시아니딘-3-글루코시드라고 보고하였다 (데카조스의 문헌[J.Food Sci. 35:237-241(1970)] 참조). 그러나, 시아니딘-3-글루코시드, 시아니딘-3-소포로시드 및 시아니딘-3-루티노시드 뿐만 아니라 시아니딘-3-글루코실루티노시드가 산미의 체리의 주요 색소인 것으로 밝혀졌다. HPLC 체류값을 사용하여, 산드라 등은 시아니딘-3-소포로시드 및 시아니딘-3-글루코시드가 미시간주에서 재배되는 몬트모렌시 체리에서 각각 주된 색소 및 보조 색소라고 하였다 (산드라 등의 문헌 [J. Agric. Food Chem. 40:967-969(1992)] 참조). 이와 유사하게, 시아니딘-3-크실로실루티노시드는 몬트모렌시 체리에서 보조 색소라는 것이 밝혀졌다 (쉬리크한드 및 프란시스의 문헌 [J. Food Sci. 38:649-651(1973)] 참조).
"담체" 또는 "증량제(bulking agent)"란 체리로부터 정제된 조성물의 부피를 증가시키는데 사용되는 조성물을 의미한다. 건조 체리 과육이 바람직하다. 담체로는 식이성 전분을 함유하는 물질 또는 단백질, 예를 들면 탈지 분유가 포함되었다. 밀가루, 설탕, 대두분, 말토덱스트린 및 다양한 조미료, 예를 들면 소금, 후추, 향신료 및 허브가 이 군에 속한다. 증량제는 바람직하게는 혼합물에 대해 약 10-6내지 106중량부의 양으로 사용된다.
조성물은 식품 활성 성분이 약 0.1 내지 10 mg/g의 양이 되도록 식품에 넣는다. 공급량은 바람직하게는 식품의 맛에 영향을 미치지 않고 가장 유익한 결과를 얻도록 선택된다. 식품은 당업계의 숙련자들에게 잘알려진 바와 같이 고수분 (습윤) 또는 저수분 (건조) 상태일 수 있다. 건강보조식품으로 사용될 경우, 정제는 활성 성분 0.1 내지 1 g을 함유한다. 구체적인 식품으로는, 조성물이 식품에 항산화 특성 및 임의로는 색상을 제공하는 조리된 육류 및 다른 제조된 식품이다. 조성물은 조제된 식품에 조미료로 사용되어 뉴트라슈티칼 또는 파이토슈티칼의 잇점을 제공할 수 있다.
파이토케미칼 (phytochemical)의 추출 및 분리 방법 (산드라 등의 문헌 [J. Agric. Food Chem. 41:1062(1992); 왕 등의 문헌 [J. Agric. Food Chem. 45:2556-2560(1997)] 참조) 및 항산화 활성의 고속 스크리닝 방법 (아로라 (Arora, A.) 및 스트라스버그 (G.M.,Strasburg))의 문헌 [J. Amer. Oil Chem. Soc.74:1031-1040(1997) 참조)이 개발되어 왔다. 이 방법은 발라톤 및 몬트모렌시 체리로부터 얻어진 항산화 화합물을 확인하고, 특성짓고, 시험하는데 사용된다. 즙을 낸 체리 조직을 헥산, 에틸 아세테이트 및 메탄올로 순차적으로 추출하였다. 메탄올 분획과 에틸 아세테이트 분획 둘다가 이 스크리닝 분석 방법에서 강한 항산화 활성을 나타내었다. 에틸 아세테이트 분획을 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하여 4개의 소분획 (subfraction)을 얻었고, 이 소분획을 제조용 역상 HPLC에 의해 7개의 분획으로 추가로 분리시켰다. 도 2 및 도 3은 발라톤 체리로부터 분리된 바이오플라보노이드를 보여준다. 산미의 체리내에는 수많은 유사 또는 동족 화합물이 많다.
두 개의 신규한 페놀류 화합물, (I) 1-(3'-4'-디하이드록시 신나모일)-2,3-디하이드록시 시클로펜탄 및 (II) 1-(3'-4'-디하이드록시 신나모일)-2,5-디하이드록시 시클로펜탄을 확인하였다.
체리 열매의 에틸 아세테이트 추출물로부터 단리되고 특별한 방법에 의해 분석된 다른 화합물로는 1-(3'-메톡시,4'-하이드록시 신나모일)퀸산, 2-하이드록시-3-(2'-하이드록시페닐)프로판산, 메틸 2-하이드록시-3-(2'-하이드록시페닐)프로파노에이트, D(+)-말산, β-시토스테롤 및 β-시토스테롤 글리코시드가 포함된다. 도 4는 몇가지의 단리된 페놀류를 나타낸다. 또한, 즙 분획으로부터 얻은 안토시아닌 성분도 확인되고 완전히 분석되었으며 (산드라 등의 문헌 [J. Agric. Food Chem. 41:1062 (1992)]; 왕 등의 문헌 [J. Agric. Food Chem. 45:2556-2560 (1997)]), 그 결과는 이와 같은 화합물이 강력한 항산화 활성을 함유하고 있음을 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 화합물은 R1및 R2가 히드록실 및 수소로 이루어진 군에서 선택되고 R1및 R2중 어느 하나가 히드록실인 이성체 또는 순수한 형태로 존재할 수 있다. 화합물은 R1이 히드록실이고 R2가 수소인 상기 화합물의 이성체일 수 있다. 상기 화합물의 특별한 이성체로는 산미의 체리로부터 순수한 화합물로 단리가능한 1-(3',4'-디하이드록시신나모일)-시클로펜타-2,5-디올이 있다. 또한, 화합물은 R1이 수소이고 R2가 히드록실인 상기 화합물의 이성체일 수 있다. 상기 화합물의 구체적인 이성체로는 산미의 체리로부터 순수한 화합물로 단리가능한 1-(3',4'-디하이드록시신나모일)-시클로펜타-2,3-디올이 있다.
또한, 본 발명은 R1및 R2가 히드록실 및 수소로 이루어진 군에서 선택되고 R1및 R2중 어느 하나가 히드록실인, 산미의 체리로부터 단리가능한 상기 화학식의 화합물 또는 이성체의 혼합물 및 순수한 형태의 화합물을 물질의 산화 억제량으로 제공하는 것을 포함하는, 산화의 억제가 요구되는 물질의 산화를 억제하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서 본 방법은 R1이 히드록실이고 R2가 수소인 상기 화합물의 이성체를 사용한다. 상기 화합물의 구체적인 이성체로는 산미의 체리로부터 순수한 화합물로 단리가능한 1-(3',4'-디하이드록시신나모일)-시클로펜타-2,5-디올이 있다. 또 다른 실시양태에서 본 방법은 R1이 수소이고 R2가 히드록실인 상기 화합물의 이성체를 사용하는 것을 포함한다. 상기 화합물의 구체적인 이성체로는 산미의 체리로부터 순수한 화합물로 단리가능한 1-(3',4'-디하이드록시신나모일)-시클로펜타-2,3-디올이 있다. 또 다른 실시양태에서 본 방법은 이성체의 혼합물을 사용하는 것을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 산미의 체리로부터 단리가능한 순수 화합물로 또는 1-(3',4'-디하이드록시신나모일)-시클로펜타-2,5-디올과의 혼합물로 1-(3',4'-디하이드록시신나모일)-시클로펜타-2,3-디올, 및 상기 화합물에 대한 비독성 담체 또는 증량제를 포함한다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 조성물은 산미의 체리로부터 단리가능한 순수 화합물로 또는 1-(3',4'-디하이드록시신나모일)-시클로펜타-2,3-디올과의 혼합물로 1-(3',4'-디하이드록시신나모일)-시클로펜타-2,5-디올, 및 상기 화합물에 대한 비독성 담체 또는 증량제를 포함한다. 또한, 조성물은 순수한 화합물에 첨가되는 안토시아닌, 플라보노이드 또는 다른 페놀류과 같이 체리로부터 얻는 다른 산화방지제를 함유할 수 있다. 또한, 조성물에 사용된 담체 또는 증량제는 동물 또는 인간에 사용하기에 적합한 담체이다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 산화방지제 및 본 발명의 조성물 1 부당 약 0.1 내지 30 부인 미립상의 식용 증량제로 구성되어 있으며, 제품은 산화성 물질이 들어오면 그 물질의 산화를 억제한다. 본 발명의 산화방지제를 함유하는 조성물은 임의의 적합한 고상 또는 액상 투여 형태로 형성될 수 있고 뉴트라슈티칼/건강보조식품으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 선택된 투여 형태는 순수 화합물로 또는 두 이성체를 함유하는 혼합물로 또는 다른 산화방지제 화합물과의 혼합물로 1-(3',4'-디하이드록시신나모일)-시클로펜타-2,5-디올 또는 1-(3',4'-디하이드록시신나모일)-시클로펜타-2,3-디올의 일일 투여량을 제공한다. 본 발명은 조성물, 혼합물 또는 순수한 형태로 항염증제로서 또는 만성 질환의 치료 또는 질환의 예방, 질환에 대한 효과 개선, 또는 보다 효과적으로 질환에 대응하기 위한 면역 반응의 자극에 유용할 수 있다. 특히, 본 발명은 조성물, 혼합물 또는 순수한 형태로 자유 라디칼에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 야기되는 다양한 형태의 질환의 예방 또는 치료에 유용할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 조성물에는 안토시아닌, 바이오플라보노이드, 페놀류 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 산화방지제가 포함될 수 있다. 안토시아닌, 바이오플라보노이드, 페놀류는 바람직하게는 체리, 특히 발라톤 및 몬트모렌시 체리로부터 단리된다.
바람직한 실시양태에서, 안토시아닌은 시아니딘-3-2"-o-∃-D-글루코피라노실-6"-o-∀-L-람노실-∃-D-글루코피라노시드, 시아니딘-3-6"-o-∀-L-람노실-∃-D-글루코피라노시드, 시아니딘-3-∃-D-글루코피라노시드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 바이오플라보노이드는 7-메톡시-5,8,4'-트리하이드록시플라본이다.
본 발명의 산화방지제 또는 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물은 통상의 항산화 식품 첨가제로 식품에 첨가될 수 있다. 특히, 식품 첨가제에는 순수 화합물로 또는 두 이성체를 함유하는 혼합물로 1-(3',4'-디하이드록시신나모일)-시클로펜타-2,3-디올 또는 1-(3',4'-디하이드록시신나모일)-시클로펜타-2,5-디올이 포함될 수 있다. 또한, 식품 첨가제로는 안토시아닌, 바이오플라보노이드, 페놀류 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 다른 산화방지제가 포함될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 안토시아닌은시아니딘-3-2"-o-∃-D-글루코피라노실-6"-o-∀-L-람노실-∃-D-글루코피노라시드, 시아니딘-3-6"-o-∀-L-람노실-∃-D-글루코피라노시드, 시아니딘-3-∃-D-글루코피라노시드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 바이오플라보노이드는 7-메톡시-5,8,4'-트리하이드록시플라본이다. 안토시아닌, 바이오플라보노이드, 페놀류는 바람직하게는 체리, 특히 발라톤 및 몬트모렌시 체리로부터 단리된다. 본 발명의 산화방지제 또는 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물은 고수분 (습윤) 또는 저수분 (건조), 신선하거나 조리되지 않은, 경화되거나 조리된 식품에 첨가될 수 있다. 지질 함유 식품에 첨가할 경우, 산화방지제 화합물 또는 조성물은 지질의 산화를 억제하고 따라서 악취의 발생을 억제한다. 조리하기 전에 육류에 조성물을 첨가하여 조리 중 발생하고 발암성을 나타내는 헤테로시클릭 방향족 아민 (HAA)의 형성을 억제한다.
<발명의 요약>
본 발명은 항산화성을 비롯한 뉴트라슈티칼 또는 파이토슈티칼의 잇점을 살아있는 포유류에 제공하는 방법에 관한 것으로 이 방법은 체리로부터 단리된 안토시아닌, 바이오플라보노이드, 페놀류 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 조성물을 뉴트라슈티칼 또는 파이토슈티칼의 잇점을 제공하는 양으로 포유류에게 공급하는 것을 포함한다.
본 발명은 생물질의 산화를 억제하는 양으로, 체리로부터 단리된 안토시아닌, 바이오플라보노이드, 페놀류 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 조성물을 생물질에 제공하는 것을 포함하는, 산화 억제가 요구되는 생물질의 산화 억제 방법에 관한 것이다.
용어 "생물질"은 동물 또는 인간의 생체내 또는 시험관내 배양중인 생조직을 의미한다.
용어 "안토시아닌"은 체리에 함유된 발색 화합물을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서 상기 용어에는 아글리콘인 시아니딘이 포함된다.
용어 "바이오플라보노이드"는 체리에 함유된 이소플라보노이드 및 플라보노이드 화합물을 의미한다.
용어 "페놀류"란 페닐기 및 하나 이상의 히드록실기를 갖는 화합물을 의미한다.
용어 "뉴트라슈티칼"은 비타민과 같이 포유류의 장기간 건강상태에 영향을 미치는, 포유류에 유익한 물질을 의미한다.
용어 "파이토슈티칼"은 뉴트라슈티칼의 잇점을 제공하는 식물에서 유래된 산물을 의미한다.
<목적>
따라서, 본 발명의 목적은 생조직의 산화를 방지하는 산화방지제로 식품에 사용되거나 건강보조식품 또는 뉴트라슈티칼로 사용될 수 있는 천연 체리 조성물을 제공하는 것이다. 이와 같은 목적은 하기 상세한 설명 및 도면을 참조로 하여 보다 명백해질 것이다.
<실시예 1 및 2>
도 5에 나타낸 바와 같이, 개별 급속 냉동된(IQF: individual quick frozen) 체리(씨를 뺀 것)를 해동시키고 공업용 와링(WARING) 블렌더에서 블렌딩시켰다. 이 혼합물을 10000rpm에서 원심분리시키고 즙을 기울여 따라내었다. 잔사인 과육을 추가로 치즈 클로쓰(cheese cloth)로 압착시켜 임의의 여분의 즙을 제거하였다.
과육을 15℃에서 동결건조시켰다. 즙을 앰버라이트 XAD-16 HP 수지상에서 처리하여 체리 산미 성분인 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 얻었다. XAD-16 수지 1 ㎏을 에탄올(1 내지 2 ℓ)로 세척하고 물(6 ℓ)로 세척하였다.XAD-16 수지를 물에서 1시간동안 정치시킨 후, 솜마개(cotton plug)를 갖는 유리 칼럼(10ID×90 ㎝ 길이)에 넣었다. 분리를 위해 즙을 넣기 전에 충전된 칼럼을 물(2 ℓ)로 세척하였다. 매번 800 ㎖의 즙을 정제시켰다. 즙을 칼럼 표면에 첨가하고 흐름이 없게 가만히 정치시켰다. 이어서 이를 물로 용리시키고 처음 1 ℓ를 폐기시켰다. 그 다음 2 ℓ의 세척물을 수거하였는데, 왜냐하면 여기에는 체리로부터 얻어지는 말산과 당을 함유하기 때문에 산미를 갖는 체리 즙이 함유되어 있기 때문이다. 이어서 칼럼을 발라톤 체리 즙의 경우 추가의 4 ℓ의 물로 세척하고, 몬트모렌시 체리 즙의 경우 5 ℓ의 물로 세척하였다. 체리 즙이 일단 수거되면, 물로 세척된 나머지 세척물을 폐기시켰다. 이어서 칼럼을 에탄올 (1.3 ℓ 내지 1.5 ℓ)로 용리시키고 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 함유하는 적색 용액 (700 내지 800 ㎖)을 수거하였다. 이어서 칼럼을 건조시키고 10 ℓ의 물로 세척한 후, 이 과정을 여러번 (100회 이상) 반복하였다. 이어서 적색 알콜성 용액을 진공 (20 mTorr)중에서 증발시켜 에탄올 및 수용액을 제거하고, 50ppm의 아스코르브산으로 안정화시키고, 10℃에서 동결건조시켰다. 적색 분말을 수거하고 보관하였다.
실시예 1의 결과
발라톤 체리
IQF 체리의 중량 15.74 ㎏
건조 과육의 중량 605 g
즙의 부피 12.16 ℓ
안토시아닌, 바이오플라보노이드
및 페놀류(적색 분말)의 중량 31.35 g
산미 부산물(말산 및 당)의 부피 약 35 ℓ
실시예 2의 결과
몬트모렌시 체리
IQF 체리의 중량 30.45 ㎏
건조 과육의 중량 895 g
즙의 부피 24.03 ℓ
안토시아닌, 바이오플라보노이드
및 페놀류(적색 분말)의 중량 47 g
체리 부산물(말산 및 당)의 부피 약 75 ℓ
실시예 1 및 2의 적색 분말을 바람직하게는 담체로서의 건조 과육과 혼합하고, 담체를 포함하여 1 내지 1000 ㎎의 정제로 정제화시켰다(성인 1인분의 1일 투여량).
분해를 방지하기 위해서, 다양한 식품 등급 산을 분리된 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류에 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 이들은 맛을 부가하지 않는다. 아스코르브산(비타민 C)이 바람직하다. 산을 체리 화합물의 건조 전 또는 후에 첨가할 수 있다.
소규모의 공정에서는, 동결건조를 사용하여 물을 제거한다. 보다 큰 규모의 공정에서는, 공기 순환 오븐을 사용하여 건조시키는 것이 바람직하다.
<실시예 3>
도 6에 도시된 바와 같이, 개방 용기 (10)에는 각각 밸브 (13 및 14)를 갖는 유입관 (11) 및 배출관 (12)이 장착되어 있다. 수지 비드 (15)가 개방 용기 (10)내에 충전되어 있다. 물은 용기 (10)에 도입된 후 배출관 (12)을 통해 제거되고 폐기된다. 실시예 1에서 사용된 것과 같은 체리 즙(과육 또는 씨를 포함하지 않는 것)은 용기 (10)로 도입되어 25분동안 정치된다. 물과 즙의 온도는 약 20 내지 30℃이다. 이어서 말산 및 당을 함유하는 체리 즙 잔사가 배출관 (12)을 통해 제거되고 식품 향미제로서 사용된다. 이어서 용기내의 수지 (15)가 유입관 (11)으로 들어오는 물로 다시 세척되고 물은 배출관 (12)을 통해 제거되고 폐기된다. 이어서 유입관 (11)을 통해 도입된 95% 에탄올에 의해 수지 입자상의 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류가 추출된다. 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류를 함유하는 에탄올이 용기 (10)로부터 수거된다. 에탄올은 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류로부터 제거되고 잔류물은 질소중에서 플래시 (flash) 건조된다. 이렇게 얻어진 분말은 바람직하게는 실시예 1과 같이 건조된 체리 과육 또는 기타 담체와 혼합된다. 수지 입자는 물로 세척되며, 수지 및 에탄올은 수회 재순환된다.
<실시예 4>
체리로부터 얻은 조질의 에틸 아세테이트 추출물 (안토시아닌, 바이오플라보노이드, 페놀류 함유)을 다양한 조건하에 항산화 활성에 대한 형광 분석을 이용하여 수용액중에서 시험하였다. 형광 분석법을 우선 설명한다.
다수의 화합물 또는 추출물에 대한 항산화 활성 검사의 필요성은 조성물 단독 또는 식료품 내에서의 조성물의 구조 및 기능적 특징을 적합하게 잘 나타내는 모델계(들)의 이용을 요한다. 또한, 시험은 감도가 좋고, 신속하며 비용이 적게 들어야 한다. 항산화 효능을 평가하기 위해 형광에 기초한 분석이 사용되었다 (아로라 및 스트라스버그의 문헌 [J. Am. Chem. Soc. 1996]). 1-스테아로일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린으로 이루어진 큰 단층 액포를 제조하였고, 이는 과산화되는 주요 위치 중 하나인 생물학적 막의 특성과 아주 유사하다. 형광 프로브인 1,6-디페닐헥사트리엔 프로피온산은, 극성 헤드기가 프로브를 수성 계면 근처에 붙잡아 두는 한편, 소수성 부분이 지방산 쇄와 평행하게 배열되도록 막으로 혼입된다. 이 프로브는 과산화 반응중 생성되는 자유 라디칼과 반응하여, 시간의 경과에 따라 형광의 세기를 감소시킨다. 과산화 반응 개시제 (예를 들면, 제1 철 금속 이온 또는 자유 라디칼 발생제 AAPH (아조비스-[2-아미디노 프로판 히드로클로라이드]))를 사용하여 반응을 개시하고 형광 감소 속도를 시험될 항산화 조성물의 존재 또는 부재하에 측정하였다. 소정 농도에서의 화합물에 대한 분석은 단지 21분이 소요되었고, 단지 수 마이크로그램의 지질이 소비되었으며, 간단한 형광측정기로 용이하게 수행될 수 있었다.
큰 단층 액포 (LUV)를 1-스테아로일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린으로부터 맥도널드 (McDonald, R. C.) 등의 문헌 [Biochim. Biophys. Acta 1061;297-303 (1991)]에 기술된 방법에 따라 제조하였다. 간략하게, 지질을 클로로포름에 용해시키고 회전 증발기를 이용 건조시켜 박막을 만들었다. 건조된 막을완충 수용액에 재현탁시키고 기공 크기 100 nm의 폴리카르보네이트 필터를 통해 리포소패스트 피포좀 압출기 (Liposofast piposome extruder, 아베스틴, 인크.(Avestin, Inc., Ottwa, Canada)사 제품)를 이용하여 압출하였다. 크기의 균질성 (80 내지 100 nm) 및 액포의 단층 특성은 동결-파쇄 주사 전자 현미경을 이용하여 확인하였다. 형광 프로브인 디페닐헥사트리엔-프로피온산 (DPH-PA)을 제조 중에 1:350의 몰비 (프로브:지질)로 액포에 혼입하였다. 형광 실험을 위해, DPH-PA를 함유한 LUV를 NaCl 100 mM, pH 7의 트리스-HEPES 완충액 50 mM 중에 최종 농도 100 μM로 현탁시켰다. 형광 프로브를 384 nm에서 여기시키고 423 nm에서 발광을 모니터링하였다. LUV 중에서의 지질 산화 반응은 제1 철 이온 또는 자유 라디칼 발생제 AAPH의 첨가에 의해 억제된다. 21분에 걸쳐 발생된 자유 라디칼과의 반응으로 인한 DPH-PA의 형광 세기 감소를 통해 그 진행 상황을 모니터링하였다. 시간의 함수로 형광 세기의 감소를 플롯팅하여 지질 산화 반응 속도를 결정하였다. 상기 결과는 조질의 안토시아닌 추출물과 에틸 아세테이트의 혼합물이 산화 억제에 효과적임을 나타냈다.
안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류의 용매 추출이 사용될 수 있지만, 생성물이 식품으로 사용될 경우 및 비용 문제로 인해 바람직하지 않다. 바람직한 흡착 수지가 사용될 경우, 이 단계는 불필요하다. 또한, 크로마토그래피를 사용하여 성분을 분리하고 재혼합할 수 있지만, 본 발명의 목적에 있어서 이와 같은 단계는 고압 액상 크로마토그래피를 수반하기 때문에 너무 비용이 많이 소요된다.
<실시예 5>
아로라 및 스트라스버그에 의해 개발된 방법을 사용하여 체리 안토시아닌의 항산화 활성을 분석하였다. 반응이 진행됨에 따라, 형광 프로브가 분해되고 이로 인해 형광의 세기가 감소할 것이다. 따라서, 산화방지제의 존재하에 형광 감쇠 속도가 감소된다. 실험은 안토시아닌 1 내지 3 및 아글리콘인 시아니딘의 항산화 활성이 시판되는 산화방지제인 부틸레이트화 하이드록시아니솔 (BRA) 및 부틸레이트화 하이드록시 톨루엔 (BHT) (도 7)에 필적함을 나타냈다. 또한, 이와 같은 체리 화합물은 α-토코페롤보다 양호한 항산화 활성을 나타냈다. 2 mM 농도에서, 토코페롤을 함유한 샘플의 과산화도가 어떠한 산화방지제의 첨가없이 Fe2+함유 샘플의 것과 구별할 수 없음을 나타냈다 (도 7).
안토시아닌의 아글리콘인 시아니딘은 그의 글리코시드보다 높은 효능을 지니는데, 이는 안토시아닌의 항산화 활성이 그의 아글리콘 잔기로 인한 것임을 시사한다. 안토시아닌 1 내지 3은 각각 3, 2 및 1개의 당류 잔기를 함유하며, 이로써 안토시아닌 1에서 가장 낮은 항산화 활성이 관찰되는 이유가 설명된다. C3위치에서의 당류 잔기의 수는 항산화 활성에 있어서 매우 중요한 것으로 보인다. 또한, 아릴옥시 라디칼의 안정성은 화합물의 항산화 활성에 영향을 미치고 산화-촉진 효과를 야기할 수 있음이 보고되어 있다. 따라서, 시아니딘의 항산화 활성은 그의 아릴옥시 라디칼의 안정성에 좌우될 수 있다. 안토시아닌 및 시아니딘의 B-고리에서의 오르쏘-디하이드록시 치환은 3' 및 4'-OH 잔기를 통해 생성된 자유 라디칼을 안정화시키는데 중요하다. 또한, 안토시아닌의 오르쏘-디하이드록시기는 금속 이온을 착화하는데 효과적이고 따라서 철-유도의 지질 과산화 반응을 방지한다.
시아니딘의 제조에서, 안토시아닌 1 내지 3 (500 mg)을 함유하는 안토시아닌 혼합물을 3N HCl (20 ㎖)와 80℃에서 10시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 안토시아닌 제조시와 마찬가지로 XAD-4 칼럼상에서 정제하였다. 시아니딘의 MeOH 용액을 증발 건조시켜 적색 무정형 분말 (190 mg)을 얻고 이를 사용할 때까지 -30℃에서 보관하였다.
항산화 분석에서, 완충액을 셀렉스 100에 보관하여 금속 이온을 제거하였다. 1-스테아로일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 5 nM (아반티 폴라 리피즈, 인크 (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL)사 제품) 및 형광 프로브 3-(p-(6-페닐)-1,3,5-헥사트리에닐)페닐프로피온산 15 nM (몰리큘라 프로브즈, 인크 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)사 제품)을 함유하는 혼합물을 진공하에 건조하였다. 생성된 막을 완충액 500 ㎖ (NaCl 0.15 M; EDTA 0.1 mM; MOPS 10 mM)에 현탁하고 EtOH-드라이아이스 배스에서 10회의 냉동-해동 사이클을 수행하였다. 이어서 현탁액을 기공 크기 100 nm의 폴리카르보네이트 막을 통해 리포소패스트 압출기 (아베스틴사 제품)를 이용하여 29회 통과시켰다. 이어서, 생성된 리포좀 (200 nM)을 완충액 2 ㎖ (100 mM NaCl, 50 mM HEPES, pH 7.0)에 현탁시켰다. 과산화 반응은 Fe2+4 nM을 첨가하여 개시하였다. 안토시아닌, BHT, 프로필 갈레이트 및 ∀-토코페롤 (비타민 E)를 2 mM 농도에서 시험하였다. 대조 표준 샘플은 첨가된 Fe2+또는 시험 화합물을 함유하지 않았다. 지질 현탁액의 형광 세기는 시험 화합물의 존재 또는 부재하에 Fe2+의 첨가 직후 SLM 4800 분광형광측정기 (SLM 인스트루먼츠, 인크 (SLM Instruments, Inc.)사 제품)을 이용하여 21분 동안 모니터링하였다. 상대 형광의 값은 소정 시간에서의 형광값을 t = 0분에서의 형광값으로 나누어서 얻었다. 결과를 도 7에 나타냈다. 산미의 체리에서 단리된 안토시아닌 (1 내지 3, 도 1) 및 시아니딘은 시판되는 제품에 필적하는 시험관내 항산화 활성을 나타냈다. 안토시아닌 1 내지 3 및 이들의 아글리콘인 시아니딘의 지질 과산화 억제는 2 mM 농도에서 각각 39, 70, 75 및 57%였다. 안토시아닌 1 내지 3 및 시아니딘의 항산화 활성은 2 mM 농도에서 tert-부틸히드로퀴논 및 부틸레이트화 하이드록시톨루엔에 필적하고 비타민 E보다 우수하였다.
<실시예 6 및 7>
실시예 5에서와 마찬가지로, 도 2, 3 및 4에 나타낸 바와 같은 선택된 화합물의 항산화 활성을 시험하였다. 결과를 도 8 및 9에 나타냈다. 실시예 6에서는 하기 화합물의 항산화 활성을 도 8에 나타냈다.
화합물 1 = 나린제닌
화합물 2 = 제니스테인
화합물 3 = 클로로젠산
화합물 4 = 쿠에르세틴 3-람노시드
화합물 5 = 카엠프페롤 3-루티노시드
화합물 6 = 3'-메톡시 카엠프페롤 3-루티노시드
화합물 7 = 제니스틴 7-글루코시드
화합물 8 = 5,8,4'-트리히드록실-6,7-디메톡시플라본
실시예 7에서는 하기 화합물의 항산화 활성을 도 9에 나타냈다.
화합물 1 = 클로로젠산 메틸 에스테르
화합물 2 = 2-하이드록시-3-(o-하이드록시페닐)-프로판산
화합물 3 = 1-(3'-4-디하이드록시 신나모일)-2,5-디하이드록시 시클로펜탄
화합물 4 = 1-(3'-4-디하이드록시 신나모일)-2,3-디하이드록시 시클로펜탄
도 9에서는 항산화 화합물 1, 2, 3 및 4 (도 4에 나타냄)을 다양한 산화방지제와 비교하였다. 시험된 산화방지제는 카페산, 페룰산, 클로로젠산, p-하이드록시신남산 및 시판되는 산화방지제, tert-부틸히드로퀴논 (TBHQ) 및 부틸레이트화 하이드록시톨루엔 (BHT)이다.
도 8 및 9에 나타낸 데이타는 항산화 활성을 측정하기 위한 Fe2+-유도 지질 과산화 분석을 이용하여 얻었다. Fe2+-유도 지질 과산화 분석에 사용된 기질을 제조하기 위해, 1-스테아로일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 5 μmol (아반티 폴라 리피즈, 인크사 제품) 및 0.015 μmol의 형광 프로브 3-(p-(6-페닐)-1,3,5-헥사트리에닐)페닐프로피온산 (몰리큘라 프로브즈, 인크사 제품)을 함유하는 혼합물을, 회전 증발기를 이용하여 진공하에 건조하였다. 생성된 지질 막을 실시예 6의 경우 NaCl 0.15 M, EDTA 0.1 mM 및 4-모르폴린프로판술폰산 (MOPS) 완충액0.01 M 함유 용액 1000 ㎕에 현탁하고, 실시예 7의 경우 상기 용액 1000 ㎕에 현탁하였다. MOPS 완충액은 셀렉스 100 (시그마 케미칼스 (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri)사 제품)을 사용하여 5 g/100 ㎖ 완충액의 농도에서 미리 처리하여 임의의 잔존 금속 이온을 제거하였다. 이어서, 현탁액을 드라이아이스/에탄올 배스를 사용하여 10회의 냉동-해동 사이클을 수행하였다. 이어서, 지질-완충액 현탁액을 기공 크기 100 nm의 폴리카르보네이트 막을 통해 리포소패스트 압출기 (아베스틴사 제품)를 이용하여 29회 통과시켜 단층 리포좀을 제조하였다.
Fe2+-유도 지질 과산화 분석을 수행하기 위해 상기 리포좀 현탁액의 분취액 20 ㎕을, 실시예 6의 경우 NaCl 100 mM, pH 7.0의 N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES) 완충액 50 mM을 함유하는 셀렉스 100 처리된 완충액 (실시예 7의 경우 NaCl 200 mM, pH 7.0의 HEPES 완충액 100 mM)에서 2 ㎖로 희석시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 23℃로 고정된 분광형광측정기의 항온 큐벳 홀더에서 5분 동안 더 인큐베이션하였다. 이어서, 0.5 mM의 FeCl220 ㎕를 첨가하여 임의의 시험 화합물의 존재 또는 부재하에 Fe2+의 최종 농도를 0.5 μM로 함으로써 과산화 반응을 개시하였다. 대조 표준 샘플은 Fe2+또는 어떠한 시험 화합물도 함유하지 않았다. 이와 같은 리포좀 용액의 형광 세기는 형광 분광형광측정기 (SLM4800, SLM 인스트루먼츠, 인크.사 제품)를 이용하여 384 nm의 여기 파장에서 21분에 걸쳐 매 3분마다 측정하였다. 시간의 경과에 따른 상대 형광 세기의 감소는 과산화 반응의 속도를 나타냈다. 지질 산화의 억제 백분율 (PI)는 하기 수학식으로 계산하였다
PI = {[(Frel)P1-(Frel)Fe/[(Fref)c-(Frel)Fe]} x 100
식중, (Frel)P1은 21분의 측정 시간 말렵에서의 Fe(II)와 시험 샘플에 대한 상대 형광이고, (Fref)c는 21분의 측정 시간 말렵에서의 대조 표준 샘플에 대한 상대 형광이고, (Frel)Fe는 21분의 측정 시간 말렵에서의 Fe(II)-함유 샘플에 대한 상대 형광이다 (아로라 등의 문헌 [(1997), J. Amer. Oil Chem. Soc. 74: 1031-1040]).
실시예 6에서는 화합물 1, 2, 3, 4, 7 및 8의 항산화 활성을 10 μM의 농도에서 분석하였다. Fe2+지질 산화에 대한 플라보노이드의 억제 효과는 Fe2+와 착화하여 과산화 반응을 개시할 수 없는 불활성 착체를 형성하는 그의 착화능으로 인한 것이었다 (아파나스 (Afanas) 등의 문헌, 1989). 또한, 플라보노이드 Fe2+의 착제는 자유 라디칼 포착능을 보유하기 때문에 지질 과산화 중의 자유 라디칼 중간체를 제거할 수 있다고 생각된다. 또한, 플라보노이드는 자유 라디칼 제거제로 작용할 수 있다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 화합물 8 (5,8,4-트리히드록실-6,7-디메톡시플라본)의 항산화 활성은 연구된 10 μM 농도에서 화합물 1, 2, 4 및 7의 항산화 활성보다 우수하였다.
종래의 문헌에서는 B 고리 상의 오르쏘-디하이드록시기 (보르스 (Bors)등의 문헌, 1990), C 고리상의 3번 위치의 히드록실기 (아파나 등의 문헌, 1989; 모라(Mora) 등의 문헌, 1990) 및 4-옥소 관능기와 함께 C2-C3의 이중 결합 (보르스 등의 문헌, 1990)의 존재가 플라보노이드에 의한 효과적인 라디칼 제거에 필수적인 것으로 생각된다고 제안하였다. 화합물 8이 3-히드록실기를 지니지 않고 B-고리상에 오직 하나의 히드록실기를 지니고 있지만, 화합물 8의 항산화 활성은 쿠에르세틴 3-람노시드보다 높다. 쿠에르세틴 3-람노시드는 B 고리 상의 오르쏘-디하이드록시기 외에도 3-히드록실기 및 4-옥소 관능기와 함께 C2-C3의 이중 결합을 함유한다. 화합물 8의 향상된 항산화 활성은 추측컨대 A 고리의 히드록실 및 2개의 메톡시기로 인한 것이었다. 아로라 등은 (1997) 7,8-디하이드록시플라본은 B 고리 및 3번 위치에 치환기가 존재하지 않지만 쿠에르세틴과 유사한 항산화 활성을 나타냄을 보고하였다.
도 9에서 큰 단층 액포 중 Fe2+유도 지질 과산화 반응에 대한 화합물 3 및 4의 억제 활성은 20 μM에서 약 80%였다. 화합물 1은 약 50%의 억제 활성을 나타냈다. 그러나, 화합물 2는 100 μM 농도에서 시험한 경우에도 항산화 활성을 나타내지 않았다. 또한, 분석 결과는 p-하이드록시신남산이 페룰산과 비교하여 약한 산화방지제임을 나타냈다. 그러나, 카페산 동족체인 화합물 3 및 4는 이 분석에서 최고의 항산화 활성을 나타냈다. 지질 과산화 반응에 대한 TBHQ 및 BHT의 억제 백분율은 20 μM 농도에서 90%를 초과하였다. 분석은 카페산이 가장 우수한 산화제이고, 화합물 4, 화합물 3, 클로로젠산 및 클로로젠산 메틸 에스테르 순서임을 나타냈다.
<실시예 8>
실시예 1 및 2의 조성물의 항산화 활성을 시험하였고 그 활성이 실시예 5에 필적함을 발견하였다.
항산화 화합물의 잠재적인 용도는 세포의 산화에 의한 손상의 감소 또는 제거, 세포사를 감소시키기 위한 자유 라디칼의 제거, 아테롬성경화증 또는 동맥 경화의 감소, 심장 마비의 발생 감소, 관절염의 발생 감소 및 통풍에 관련된 통증 및 노화 감소이다.
상기 기재사항은 단지 본 발명의 설명을 위한 것이며 본 발명은 하기 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다.
Claims (45)
- 뉴트라슈티칼 또는 파이토슈티칼의 잇점을 포유류에 제공하는 양으로 체리로부터 단리되는 안토시아닌, 바이오플라보노이드, 페놀류 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는, 조성물을 포유류에게 공급하는 것을 포함하는, 항산화 잇점을 포함하는 뉴트라슈티칼 또는 파이토슈티칼의 잇점을 포유류에 제공하는 방법.
- 제1항에 있어서, 포유류가 인간이고 조성물이 제조된 식품으로 제공되는 방법.
- 제1항에 있어서, 조성물이 건조된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 조성물이 건조되고 식용 담체를 함유하는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 담체가 건조된 체리 과육인 방법.
- 제1항에 있어서, 조성물이 담체를 함유하고 조성물 대 담체의 비율이 0.1:100 내지 100:0.1인 방법.
- 제1항에 있어서, 조성물이 액상 형태인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류의 혼합물인 방법.
- 제1항에 있어서, 조성물이 산미의 체리로부터 단리된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 조성물이 감미의 체리로부터 단리된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 조성물이 몬트모렌시 (MONTMORENCY) 체리로부터 단리된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 조성물이 발라톤 (BALATON) 체리로부터 단리된 것인 방법.
- 생물질의 산화를 억제하는 양으로 체리로부터 단리된 안토시아닌, 바이오플라보노이드, 페놀류 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 조성물을 생물질에 제공하는 것을 포함하는, 산화 억제가 요구되는 생물질의 산화 억제 방법.
- 제13항에 있어서, 생물질이, 조성물이 공급되는 인간에 존재하는 방법.
- 제13항에 있어서, 생물질이, 조성물이 공급되는 동물에 존재하는 방법.
- 제13항에 있어서, 조성물이 건조된 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 조성물이 건조되고 건조된 식용 담체를 함유하는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 담체가 건조된 체리 과육인 방법.
- 제13항에 있어서, 조성물이 담체를 함유하고 조성물 대 담체의 비율이 0.1:100 내지 100:0.1인 방법.
- 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 안토시아닌, 바이오플라보노이드 및 페놀류의 혼합물인 방법.
- 제13항에 있어서, 조성물이 산미의 체리로부터 단리된 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 조성물이 감미의 체리로부터 단리된 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 조성물이 몬트모렌시 (MONTMORENCY) 체리로부터 단리된 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 조성물이 발라톤 (BALATON) 체리로부터 단리된 것인 방법.
- 산화를 억제하기 위해 체리로부터 단리된 1종 이상의 화합물을 생물질에 투여하는 것을 포함하는, 생물질의 산화 억제 방법.
- 제25항에 있어서, 물질이, 산화방지제 화합물이 공급되는 포유류에 존재하는 방법.
- 제25항에 있어서, 물질이, 산화방지제 화합물이 공급되는 포유류로 인간에 존재하는 방법.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 화합물이 포유류에게 제조된 식품으로 공급되는 방법.
- a. 안토시아닌, 바이오플라보노이드, 페놀류 및 이들의 혼합물로부터 단리된 조성물을 식품에 첨가하여 식품의 품질 및 저장 기간을 향상시키고,b. 포유류에게 뉴트라슈티칼 또는 파이토슈티칼의 잇점을 제공하는 양의 식품으로 제공되는 조성물을 포유류에게 제공하는 것을 포함하며, 조성물이 식품에 존재하고 식품의 품질을 보존하는, 항산화 특성을포함하는 뉴트라슈티칼 또는 파이토슈티칼의 잇점을 포유류에 제공하는 방법.
- 프루누스 (Prunus)로부터 얻을 수 있는 이성체와 하기 화학식의 순수한 형태의 혼합물 또는 화합물.(식중, R1및 R2는 히드록실 및 수소로 이루어진 군에서 선택되는 것이고, R1및 R2중 어느 하나는 히드록실임)
- 제30항에 있어서, R1은 히드록실이고, R2는 수소인 화합물.
- 제30항에 있어서, R1은 수소이고, R2는 히드록실인 화합물.
- 제30항에 있어서, 프루누스 아비움 (Prunus avium), 프루누스 세라수스 (Prunus Cerasus) 또는 이들의 혼합물로부터 얻을 수 있는 화합물.
- 프루누스 아비움, 프루누스 세라수스 또는 이들의 혼합물로부터 얻을 수 있는 순수한 화합물로서의 1-(3',4'-디하이드록시신나모일)-시클로펜타-2,3-디올.
- 프루누스 아비움, 프루누스 세라수스 또는 이들의 혼합물로부터 얻을 수 있는 순수한 화합물로서의 1-(3',4'-디하이드록시신나모일)-시클로펜타-2,5-디올.
- 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 비독성 담체를 더 포함하는 화합물.
- 제36항에 있어서, 비독성 담체가 인간에 사용하기에 적합한 것인 화합물.
- 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 안토시아닌, 시아니딘, 바이오플라보노이드, 페놀류 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 산화방지제와 혼합되는 화합물.
- 제37항에 있어서, 안토시아닌이 시아니딘-3,2"-O-β-D-글루코피라노실-6"-O-α-L-람노실-β-D-글루코피라노시드, 시아니딘-3-6"-O-α-L-람노실-β-D-글루코피라노시드 시아니딘-3-β-D-글루코피라노시드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 화합물.
- 제37항에 있어서, 바이오플라보노이드가 7-메톡시-5,8,4'-트리하이드록시플라본인 화합물.
- 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 억제 방법으로 사용되기 위한 화합물.
- 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 염증 억제 방법으로 사용되기 위한 화합물.
- 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 건강보조식품으로 사용하기 위한 화합물.
- 조직에서의 산화를 방지하기 위한, 체리로부터 얻을 수 있는 1종 이상의 화합물의 용도.
- 조직에서의 산화를 방지하기 위한, 체리로부터 얻을 수 있는 하나 이상의 안토시아닌, 바이오플라보노이드 또는 페놀류의 용도.
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