KR20010100600A - Immobilized penicillin G acylase - Google Patents
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Abstract
본 발명은 페니실린 G, 세팔로스포린 C 등으로부터 6-아미노 페니실란산(6-APA), 7-아미노데스아세토옥시세팔로스포린산(7-ADCA), 7-아미노세팔로스포린, 아목시실린, 세파클러, 세팔렉신, 세파드록실 등과 같은 베타락탐계 항생제를 제조하는 데 사용되는 새로운 고정화 페니실린 아실라제에 관한 것으로서, 이는 페니실린 아실라제와 고정화 담체를 공유결합을 통해 고정화하여 얻어지되 이때 고정화 담체는 80∼400㎛의 입자크기를 가지는 충격보강제가 첨가된 아크릴계 수지조성물인 것으로, 이는 교반에 의해 고정화 담체가 깨어지는 것을 방지하여 궁극적으로는 효소의 재사용 횟수를 늘릴 수 있게 되어 더 나아가서는 베타락탐계 항생제 제조원가를 절감할 수 있다.The present invention provides 6-amino peniclanic acid (6-APA), 7-aminodesacetooxycephalosporinic acid (7-ADCA), 7-aminocephalosporin, amoxicillin, cepha from penicillin G, cephalosporin C and the like. A novel immobilized penicillin acylase used to prepare beta-lactam antibiotics such as chlorine, cephalexin, and cepadroxyl, which is obtained by covalently immobilizing penicillin acylase with an immobilized carrier, wherein the immobilized carrier is 80 It is an acrylic resin composition to which an impact modifier having a particle size of ˜400 μm is added, which prevents the immobilization of the immobilized carrier from agitation, thereby ultimately increasing the number of reuse of enzymes. Manufacturing cost can be reduced.
Description
본 발명은 페니실린으로부터 베타락탐계 항생제를 제조하는 데 있어서 사용되는 효소인 페니실린 아실라제의 기계적 강도를 높임으로써 효소의 재사용 횟수를 획기적으로 개선시킨 새로운 고정화 페니실린 아실라제에 관한 것이다.The present invention relates to a new immobilized penicillin acylase that significantly improves the number of times the enzyme is reused by increasing the mechanical strength of the penicillin acylase, an enzyme used to prepare betalactam antibiotics from penicillin.
효소와 같이 생리적 활성이 있는 물질을 담체에 고정화하는 방법은 매우 다양하며 많은 연구가 이루어지고 있다. 그 종류를 크게 나누면, 흡착 등과 같은 비공유결합에 의한 고정화 방법과 공유결합을 이용한 고정화 방법으로 나눌 수 있으며, 이중 공유결합에 의한 고정화 방법이 산업적으로 많이 적용되는 추세이다. 이때 사용되는 고정화 담체로는 천연 또는 합성 유기 또는 무기계 물질이 사용되며,단백질의 아미노산의 반응성이 있는 작용기와 담체의 활성화된 반응기와의 공유결합에 의해 고정화가 이루어진다. 산업적으로는 폴리사카라이드, 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트 등과 같은 유기계 담체를 이용하게 되는데, 이런 유기계 담체들은 일반적인 화학적 방법에 의해 단백질과 공유결합을 형성하기 쉽도록 반응성을 띠게 만들어진다.Methods of immobilizing physiologically active substances such as enzymes on a carrier are very diverse and many studies have been made. If the type is largely divided, it can be divided into immobilization method by non-covalent bond such as adsorption and immobilization method by covalent bond, and the immobilization method by double covalent bond is applied to many industries. At this time, as the immobilization carrier, natural or synthetic organic or inorganic materials are used, and immobilization is performed by covalent bonding of a reactive functional group of an amino acid of a protein to an activated reactor of the carrier. Industrially, organic carriers such as polysaccharides, polystyrenes, polyacrylates, and the like are used, and these organic carriers are made to be reactive to form covalent bonds with proteins by general chemical methods.
한편, 베타락탐계 항생제는 페니실린으로부터 효소에 의한 선택적 가수분해 반응으로 6-아미노 페니실란산(6-APA)을 얻은 후, 여기에 적절한 측쇄를 도입하여 원하는 베타락탐계 항생제를 합성하는 방법으로 제조되고 있다. 현재, 6-아미노 페니실란산을 제조하는 데 있어서 사용되는 효소는 페니실린 아미다제 또는 페니실린 아실라제로, 적절한 형태로 고정화되어 여러번 재사용이 가능한 형태로 상업화되어 있다.Meanwhile, beta-lactam antibiotics are prepared by obtaining 6-amino peniclanic acid (6-APA) from the penicillin by enzyme-selective hydrolysis reaction, and then introducing appropriate side chains to synthesize desired beta-lactam antibiotics. It is becoming. Currently, the enzymes used to prepare 6-amino penicillane acid are penicillin amidase or penicillin acylase, which have been commercialized in a form that can be immobilized in a suitable form and reused several times.
미합중국 특허 제5,782,260호에서는 유기실록산계 수지를 고정화 담체로 사용하여 페니실린 아실라제를 비롯한 몇몇 효소들을 고정화하여 높은 단위체적당 효소 활성을 보이는 효소를 제조하는 방법을 개시하고 있으나, 효소의 기계적 특성에 대한 언급이 없어 장기 사용시의 담체의 손상여부를 알 수가 없다.U.S. Patent No. 5,782,260 discloses a method of preparing an enzyme having high enzymatic activity per unit volume by immobilizing some enzymes including penicillin acylase using an organosiloxane resin as an immobilization carrier, but referring to the mechanical properties of the enzyme. It is not known whether the carrier is damaged during long term use.
WO 97/04086에는 젤라틴과 같은 겔 형성물질과 키토산 등과 같은 아미노기가 포함된 폴리머를 사용하여 제조된 페니실린 아실라제를 사용함으로써 효소에 의한 베타 락탐계 항생제 제조시에 측쇄의 합성반응에 대한 선택성을 높힐 수 있음이 개시되어 있으나, 효소를 장기사용시 안정성에 대한 언급이 없다.WO 97/04086 uses penicillin acylase prepared using a gel-forming substance such as gelatin and a polymer containing an amino group such as chitosan to increase the selectivity for the synthesis of side chains in the preparation of beta lactam antibiotics by enzymes. Although it is disclosed that there is no mention of stability in the long term use of the enzyme.
그리고, 유럽특허 0730035A1에 의하면 아즈락톤 폴리머에 페니실린 아실라제를 고정화시킴으로써 측쇄 및 최종 생성물인 베타락탐 항생제의 가수분해 비율을 낮출 수 있음을 개시하고 있으나, 역시 효소의 장기사용에 따른 안정성에 대한 언급이 없다.In addition, European Patent 0730035A1 discloses that by immobilizing penicillin acylase in an azlactone polymer, the ratio of hydrolysis of betalactam antibiotics, which are side chains and end products, can be lowered. none.
일반적으로 효소에 의한 페니실린 또는 세팔로스포린의 선택적 가수분해 바응 내지 베타락탐계 항생제 제조반응에 있어서, 고가인 페니실린 아실라제의 재사용 횟수가 공정의 경제성에 있어서 매우 큰 비중을 차지하는 것으로 알려져 있으며, 교반에 의해 고정화 담체가 깨어지는 것과 같은 기계적, 물리적 안정성이 효소의 장기 안정성에 매우 큰 영향을 미치게 된다.In general, in the reaction of the selective hydrolysis of penicillin or cephalosporin by enzymes to the production of beta-lactam antibiotics, the number of reuse of expensive penicillin acylase is known to be very important in the economics of the process. Mechanical and physical stability, such as breaking an immobilized carrier, has a great impact on the long-term stability of the enzyme.
또한, 효소반응 후 효소와 생성물은 주로 100㎛ 내외의 메쉬망을 이용하여 효소는 반응기 내에 잔류시키고 생성물만을 통과시키는 방법으로 분리시키게 되는데, 이때 깨어진 효소조각들은 망을 통과하게 되므로 이후 새로운 효소를 투입하여 손실된 효소량을 보충해야하고, 깨어져 반응기로부터 빠져나온 효소 조각들에 의해 최종 제품이 오염되는 등의 문제점이 발생하게 된다.In addition, after the enzymatic reaction, the enzyme and the product are mainly separated by using a mesh network of about 100 μm by the method of remaining the enzyme in the reactor and passing only the product. In this case, the broken enzyme fragments pass through the network, and then a new enzyme is added. The amount of enzyme lost must be replenished, and the end product is contaminated by the fragments of enzymes broken out of the reactor.
이러한 문제점들은 6-아미노페니실란산으로부터 반합성 베타락탐계 항생제를 제조하는 반응에 있어서 그 문제가 더욱 심화된다. 즉, 효소에 의한 베타락탐계 항생제 제조반응에서는 6-아미노페니실란산, 사용되는 측쇄 및 최종 생성물이 반응액 내에서 고체로 존재하는 비율이 높아지므로 반응액이 고점도가 되며, 이에 따라 교반에 의해 효소가 받는 충격이 페니실린 가수분해 반응에 비해 커지게 되고, 효소 손상 때문에 효소의 재사용 횟수가 급격히 줄게된다.These problems are further exacerbated in the reaction to prepare semi-synthetic beta-lactam antibiotics from 6-aminophenicsilane acid. That is, in the production of beta-lactam antibiotics by enzymes, the proportion of 6-aminophenic silane acid, the side chains used, and the final product as solids in the reaction solution increases, resulting in a high viscosity of the reaction solution. The impact of the enzyme is greater than that of the penicillin hydrolysis reaction, and due to enzyme damage, the number of enzyme reuses is drastically reduced.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 페니실린 아실라제 고정화 효소에 있어서 교반 등의 물리적인 충격에 의해 고정화 담체가 쉽게 손상되는 단점을 개선하기 위해 연구하던 중, 충격보강제가 첨가된 폴리메타크릴레이트 수지를 사용한 결과, 고정화 효소의 충격강도를 향상시킬 수 있음을 알게되어 본 발명을 완성하게 되었다.Thus, the present inventors while studying to improve the disadvantage that the immobilized carrier is easily damaged by physical impact such as stirring in the penicillin acyla immobilized enzyme as described above, using a polymethacrylate resin to which the impact modifier is added As a result, it was found that the impact strength of the immobilized enzyme can be improved, thereby completing the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 충격보강제를 함유한 수지를 효소 고정화 담체로 사용함으로써 교반에 의해 담체가 깨어지는 정도를 개선하여 효소의 재사용 횟수를 늘릴 수 있는 페니실린 아실라제를 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a penicillin acylase that can increase the number of times of reuse of the enzyme by improving the degree of breakage of the carrier by stirring by using a resin containing an impact modifier as an enzyme immobilization carrier.
이와같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 고정화 페니실린 아실라제는 페니실린 아실라제와 고정화 담체를 공유결합을 통해 고정화하여 얻어지는 것으로서, 이때 고정화 담체는 80∼400㎛의 입자크기를 가지는 충격보강제가 첨가된 아크릴계 수지조성물인 것임을 그 특징으로 한다.The immobilized penicillin acylase of the present invention for achieving the above object is obtained by immobilizing the penicillin acylase and the immobilized carrier through a covalent bond, wherein the immobilized carrier is acrylic-based to which an impact modifier having a particle size of 80 ~ 400㎛ is added It is characterized by being a resin composition.
도 1은 본 발명에 따라 제조된 고정화 페니실린 아실라제(-)와 종래의 로슈(Roche)사의 페니실린 아실라제인 PGA-450(-)의 활성저하 추이를 비교하여 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing a comparison of the activity of the immobilized penicillin acylase ( - ) prepared according to the present invention and the activity of PGA-450 (-), a conventional penicillin acylase of Roche (Roche).
이와같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.The present invention will be described in more detail as follows.
본 발명은 페니실린 G, 세팔로스포린 C 등으로부터 6-아미노 페니실란산(6-APA), 7-아미노데스아세토옥시세팔로스포린산(7-ADCA), 7-아미노세팔로스포린, 아목시실린, 세파클러, 세팔렉신, 세파드록실 등과 같은 베타락탐계 항생제를 제조하는 데 사용되는 새로운 고정화 페니실린 아실라제에 관한 것이다.The present invention provides 6-amino peniclanic acid (6-APA), 7-aminodesacetooxycephalosporinic acid (7-ADCA), 7-aminocephalosporin, amoxicillin, cepha from penicillin G, cephalosporin C and the like. A novel immobilized penicillin acylase used to prepare betalactam antibiotics such as chlor, cephalexin, cepadroxyl and the like.
본 발명에서는 종래 페니실린 아실라제 고정화 효소가 교반 등에 의한 물리적 충격에 의해 고정화 담체가 쉽게 손상되는 단점을 개선하기 위하여, 충격보강제가 첨가된 아크릴계 수지, 구체적으로는 폴리메틸메타크릴레이트 수지를 고정화 담체로 사용한다.In the present invention, in order to improve the disadvantage that the penicillin acylase immobilizing enzyme is easily damaged by the physical impact such as agitation, the immobilization carrier is added to the acrylic resin, specifically, polymethyl methacrylate resin as the immobilization carrier. use.
구체적인 고정화 담체 조성물은 아크릴계 열가소성 수지 100중량부, 충격보강제 10∼250중량부 및 가공첨가제 0.1∼5.0중량부로 이루어진 것인 바, 여기서 충격보강제로는 입자크기가 80∼400㎛이며 3층 구조를 갖는 특정의 것을 사용한다.Specific immobilization carrier composition is composed of 100 parts by weight of the acrylic thermoplastic resin, 10 to 250 parts by weight of the impact modifier and 0.1 to 5.0 parts by weight of the processing additive, wherein the impact modifier has a particle size of 80 to 400㎛ and has a three-layer structure Use a specific one.
이와같은 충격보강제는 본 출원인에 의하여 2000년 5월 1일자로 출원된 것(특허출원 제2000-23253호)으로서, 개략적인 구성을 살펴보면 다음과 같다;Such an impact modifier is filed by the present applicant as of May 1, 2000 (Patent Application No. 2000-23253), the schematic configuration is as follows;
메틸메타크릴레이트 또는 메틸메타크릴레이트와 아크릴산 공중합체 이루어진 최내각층; 부틸아크릴레이트 공중합체 또는 부타디엔 공중합체로 이루어진 중간층; 및 메틸메타크릴레이트 또는 메틸메타크릴레이트와 아크릴산 공중합체로 이루어진 최외각층의 3층 구조를 가지되, 최내각층과 최외각층의 메틸메타크릴레이트의 몰비가 1:0.5∼1:15이며, 중간층 중합시 자외선 안정제 및 조색제를 포함하여 제조된 것.An innermost layer made of methyl methacrylate or methyl methacrylate and an acrylic acid copolymer; An intermediate layer made of butyl acrylate copolymer or butadiene copolymer; And it has a three-layer structure of the outermost layer consisting of methyl methacrylate or methyl methacrylate and acrylic acid copolymer, wherein the molar ratio of methyl methacrylate of the innermost layer and the outermost layer is 1: 0.5 to 1:15, intermediate layer Prepared by including a UV stabilizer and a colorant in the polymerization.
이와같은 충격보강제가 첨가된 아크릴계 수지, 즉 폴리메틸메타크릴레이트 수지는 외부에서 가해진 충격은 최외각층으로부터 고무층으로 전달되고, 그 에너지는 다시 고무층에서 흡수 및 발산되어 충격보강효과를 가지게 된다.The acrylic resin, ie, polymethyl methacrylate resin, to which the impact modifier is added, is transmitted from the outermost layer to the rubber layer from the outermost layer, and the energy is absorbed and diverged from the rubber layer to have an impact reinforcing effect.
상기와 같은 충격보강제를 중합하는 데 있어서 중합조건을 적절히 변경하면 그 크기와 물성을 효소 고정화 담체에 적당하도록 조절할 수 있다.In the polymerization of the impact modifier as described above, by appropriately changing the polymerization conditions, the size and physical properties can be adjusted to be suitable for the enzyme immobilization carrier.
충격보강제의 최외각층은 폴리메타크릴레이트 수지와 아크릴산 단량체와의공중합을 통해 카복실기를 갖게 되며, 이러한 카복실기를 이용하여 효소와의 공유결합을 형성할 수 있게 된다.The outermost layer of the impact modifier has a carboxyl group through copolymerization of a polymethacrylate resin with an acrylic acid monomer, and can form a covalent bond with an enzyme using such a carboxyl group.
카복실기와 효소를 공유결합할 수 있는 방법은 여러 가지가 있으나, 일반적으로 카르보디아미드를 사용한 방법으로 카복실기를 활성화시킨 후, 효소와 공유결합을 이루도록 하는 방법이 사용된다.There are many ways to covalently bond an enzyme with a carboxyl group. In general, a method using carbodiamide is used to activate a carboxyl group and then form a covalent bond with an enzyme.
본 발명에서 사용되는 효소는 베타락탐환의 아실화 반응을 촉매작용할 수 있는 효소로서, 이러한 효소들은 1961년경부터 알려져 왔다. 구체적으로는, 페니실린 아미다제 또는 페니실린 아실라제(E.C. 3.5.5.11)계통의 효소로서 이러한 촉매활성을 보이는 효소를 생산하는 미생물로는 대장균, 아세토박터 파스테리아늄(Acetobacter pasteurianum), 잔토모나스 시트리(Xanthomonas citri), 클루이베라 시트로필라(Kluyvera citrophila) 또는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 등을 들 수 있다. 이중 대장균으로부터 유래된 효소의 경우 상업적으로 판매되고 있다.The enzyme used in the present invention is an enzyme capable of catalyzing the acylation reaction of the beta lactam ring, and these enzymes have been known since 1961. Specifically, microorganisms that produce such catalytic activity as an enzyme of penicillin amidase or penicillin acylase (EC 3.5.5.11) system include Escherichia coli, Acetobacter pasteurianum , Xanthomonas citri ( Xanthomonas citri ), Kluyvera citrophila or Bacillus megaterium . Enzymes derived from double E. coli are commercially available.
담체를 활성화시키기 위해서는To activate the carrier
N-사이클로헥실-N'-β[(N-메틸몰포린)-에틸)]-카르보디이미드 파라 톨루엔설포네이트, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염 등과 같은 카르보디이미드 화합물을 사용하며, 특히 수용성 카르보디이미드 화합물이 본 발명에 적합하다.N-cyclohexyl-N'-β [(N-methylmorpholine) -ethyl)]-carbodiimide para toluenesulfonate, N-ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride and the like Carbodiimide compounds are used, in particular water soluble carbodiimide compounds are suitable for the present invention.
페니실린 아실라제는 활성화된 담체에 pH 4.5∼8.5의 수용액으로 투입되며, 특히 0.1몰농도의 인산칼륨 완충액(pH 7.0)의 용액으로 투입되는 것이 유리하다.카르보디이미드 화합물에 의해 담체와 결합된 고정화 효소는 이미 알려진 방법 등으로 세척한 후 0∼4℃에서 보관한다.Penicillin acylase is added to the activated carrier in an aqueous solution of pH 4.5-8.5, particularly in a solution of 0.1 molar potassium phosphate buffer (pH 7.0). Immobilization bound to the carrier by a carbodiimide compound Enzyme is washed by known methods and stored at 0-4 ° C.
본 발명에 따라 충격보강제를 담체로 하여 고정화된 페니실린 아실라제는 그램당 100∼500U 정도의 촉매활성을 보이며, 이는 기존의 페니실린 아실라제와 유사한 수준이다. 기계적 강도에 있어서는 동일한 교반조건에서 깨어져 크기가 줄어드는 효소의 양이 기존의 고정화 효소에 비해 10∼20%이상 감소되어, 결과적으로는 효소의 재사용 횟수를 늘릴 수 있는 효과가 있다.The penicillin acylase immobilized according to the present invention as a carrier has a catalytic activity of about 100 to 500 U per gram, which is similar to that of the conventional penicillin acylase. In terms of mechanical strength, the amount of the enzyme that is broken down under the same stirring conditions and reduced in size is reduced by 10-20% or more compared with the conventional immobilized enzyme, and as a result, the number of times of reuse of the enzyme is increased.
이하, 본 발명을 실시예에 의거 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited by the Examples.
정의 및 분석방법Definition and analysis method
효소: 효소 활성도의 단위 U는 1μmol의 페니실린 G 칼륨염을 1분 동안 가수분해하는데 필요한 효소의 양에 해당된다.Enzyme: The unit U of enzyme activity corresponds to the amount of enzyme required to hydrolyze 1 μmol of penicillin G potassium salt for 1 minute.
반응조건-100g/ℓ 페니실린 G 칼륨염, 0.05M 인산칼륨 완충액(pH8.0)Reaction conditions-100 g / l penicillin G potassium salt, 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 8.0)
HPLC 분석조건: 컬럼-Waters μBondapak C18 ColumnHPLC analysis conditions: Column-Waters μBondapak C18 Column
이동상-0.25M 인산칼륨 완충액, pH 5.0, 0.7%(v/v) 아세토니트릴Mobile phase-0.25 M potassium phosphate buffer, pH 5.0, 0.7% (v / v) acetonitrile
유속-1㎖/분, 측정파장-230nmFlow rate-1 ml / min, measurement wavelength -230 nm
입도분석: Fritsch analysette 22 입도분석기, non-sonic modeParticle size analysis: Fritsch analysette 22 particle size analyzer, non-sonic mode
참조예 1: 고정화 담체용 충격보강제 제조 Reference Example 1 Preparation of Impact Reinforcement Agent for Immobilized Carrier
2차 증류수 75kg을 150ℓ 반응기에 투입하여 질소기류 하에서 내부온도를 80℃까지 가열한 후, 메틸메타크릴레이트 12.77kg, 에틸아크릴레이트 1.68kg, 알릴메타크릴레이트 73g, 나트륨 디오틸설포석시네이트 120g의 혼합용액 2.97kg을 반응기에 가한 후 15분간 교반하였다. 그후 1% 칼륨 퍼설페이트 용액 720g을 가한 후 60분간 교반하였다. 중합이 거의 완료되었을 때 잔여분의 혼합용액을 분당 220g의 속도로 반응기에 적가하였다. 적가종료후 60분간 더 반응을 진행하였다. 여기에 1% 칼륨퍼설페이트 용액 945g을 가한 후 15분간 교반한 다음 부틸아크릴레이트 19.77g, 스티렌 4.49kg, 알릴메타크릴레이트 480g 및 나트륨디옥틸설포석시네이트 185g의 혼합용액을 분당 350g의 속도로 반응기에 적가하였다. 적가완료 후 1% 칼륨 퍼설페이트 용액 250g을 반응기에 가하여 15분간 더 중합을 행하였다. 전환율이 93% 이상이 되었을 때 메틸메타크릴레이트 7.13kg, 에틸아크릴레이트 0.37kg, 그리고 아크릴산 0.87kg의 혼합용액을 분당 150g의 속도로 반응기에 적가한 후 50분간 더 중합을 진행시킴으로써 중합을 완료하였다.75 kg of secondary distilled water was added to a 150 L reactor, and the internal temperature was heated to 80 ° C. under a nitrogen stream, followed by 12.77 kg of methyl methacrylate, 1.68 kg of ethyl acrylate, 73 g of allyl methacrylate, and 120 g of sodium diotylsulfosuccinate. 2.97 kg of the mixed solution was added to the reactor and stirred for 15 minutes. Then 720 g of a 1% potassium persulfate solution was added and stirred for 60 minutes. When the polymerization was almost complete, the remaining mixed solution was added dropwise to the reactor at a rate of 220 g per minute. After completion of the dropwise addition, the reaction proceeded for 60 minutes. 945 g of 1% potassium persulfate solution was added thereto, followed by stirring for 15 minutes. A mixed solution of 19.77 g of butyl acrylate, 4.49 kg of styrene, 480 g of allyl methacrylate, and 185 g of sodium dioctylsulfosuccinate was charged at a rate of 350 g per minute. Dropped in After completion of the dropwise addition, 250 g of a 1% potassium persulfate solution was added to the reactor, and polymerization was further performed for 15 minutes. When the conversion rate was 93% or more, 7.13 kg of methyl methacrylate, 0.37 kg of ethyl acrylate, and 0.87 kg of acrylic acid were added dropwise to the reactor at a rate of 150 g per minute, and then polymerization was completed for 50 minutes. .
중합 후에 얻은 에멀젼의 평균입자경은 310nm였으며, 분산도가 매우 낮은 균일한 입자를 얻었다. 전환율은 전과정을 기준으로 하여 95%였다.The average particle diameter of the emulsion obtained after polymerization was 310 nm, and uniform particles with very low dispersion were obtained. The conversion rate was 95% based on the life cycle.
이와같이 얻어진 에멀젼을 분무건조기를 이용하여 최종 생성물을 얻었다. 최종 생성물의 평균입자크기는 120∼300㎛였다.The emulsion thus obtained was obtained using a spray dryer to obtain the final product. The average particle size of the final product was 120-300 μm.
실시예 1: 충격보강제 담체를 이용한 고정화 페니실린 아실라제의 제조 Example 1 Preparation of Immobilized Penicillin Acylase Using Impact Enhancer Carrier
상기 참조예 1에서 얻은 최종 입자 100mg을 0.1M 인산칼륨 완충용액(pH 7.0) 5㎖에 현탁시키고, 여기에 103mg의 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염을 2.5㎖의 완충용액(4℃)에 녹여 투입하였다. 10분간 교반한 후, 페니실린 아실라제 50U(시그마)를 넣고 0∼4℃로 48시간 방치한다. 방치 중에 6시간씩두 번 교반하여 주었다.100 mg of the final particles obtained in Reference Example 1 was suspended in 5 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0), and 103 mg of N-ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride was added thereto. It was dissolved in 2.5 ml of buffer (4 ° C) and added. After stirring for 10 minutes, 50U (sigma) of penicillin acylase was added thereto, and the mixture was left to stand at 0 to 4 ° C for 48 hours. The mixture was stirred twice for 6 hours.
얻어진 고정화 효소를 걸러내고 0.1M 인산칼륨 완충용액(pH 7.0)으로 세 번 세척한 후, 증류수로 3번 세척하였다. 250mg(wet)의 고정화 페니실린 아실라제를 얻었다. 페니실린 G 칼륨염의 가수분해반응으로 활성도를 측정한 결과, 그램당 활성도는 130U/g wet enzyme이었다.The obtained immobilized enzyme was filtered off and washed three times with 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) and three times with distilled water. 250 mg (wet) of immobilized penicillin acyla was obtained. The activity was measured by hydrolysis reaction of penicillin G potassium salt, and the activity per gram was 130 U / g wet enzyme.
실시예 2: 고정화 페니실린 아실라제를 이용한 6-아미노페니실란산의 제조 Example 2 Preparation of 6-Aminophenicylanic Acid Using Immobilized Penicillin Acylase
바닥에 100㎛의 메쉬망이 설치된 1.5ℓ 반응기에 페니실린 G 칼륨염 0.15BOU을 넣고 순수 1ℓ를 넣은 후, 28℃에서 교반하였다. 상기 실시예 1로부터 얻어진 고정화 페니실린 아실라제 58g을 넣고, 반응을 진행하였다. 이때, pH는 8% 암모니아수를 이용하여 7.8∼8.0으로 유지하였다. 1시간 내지 2시간 후, pH의 감소가 일어나지 않으면, 약 30분간 더 교반해준 후, 반응액을 새로운 반응기로 이송하였다. 이송된 반응액에 염화메틸렌 0.5ℓ를 넣고 0∼4℃로 냉각해준 후, 진한염산으로 pH를 1.0∼1.5로 낮추었다. 10분간 교반한 후, 30분간 정치시키고, 염화메틸렌층을 추출해내어 반응부산물인 페닐아세트산을 제거하였다. 이후 반응액의 pH를 4.0으로 맞추어 6-아미노페니실란산을 석출시키고, 여과, 세정 및 건조하여 6-아미노페니실란산 53.5g을 얻었다(수율 88%).0.15 BOU of penicillin G potassium salt was added to a 1.5 L reactor provided with a 100 μm mesh network at the bottom, followed by stirring at 28 ° C. after adding 1 L of pure water. 58 g of immobilized penicillin acylase obtained in Example 1 was added thereto, and the reaction was carried out. At this time, pH was maintained at 7.8-8.0 using 8% ammonia water. After 1 hour to 2 hours, if no decrease in pH occurred, the mixture was stirred for about 30 minutes and then the reaction solution was transferred to a new reactor. 0.5 L of methylene chloride was added to the transferred reaction solution and cooled to 0-4 ° C., and then the pH was lowered to 1.0-1.5 with concentrated hydrochloric acid. After stirring for 10 minutes, the mixture was allowed to stand for 30 minutes, and the methylene chloride layer was extracted to remove phenylacetic acid as a reaction byproduct. Thereafter, the pH of the reaction solution was adjusted to 4.0 to precipitate 6-aminophenic silane acid, which was filtered, washed and dried to obtain 53.5 g of 6-aminophenic silane acid (yield 88%).
실험예 1: 고정화 페니실린 아실라제의 장기운전시 활성저하추이 Experimental Example 1 : Deactivation Trend of Long-Term Operation of Immobilized Penicillin Acylase
상기 실시예 2와 같은 반응장치를 2개 준비한 뒤, 한쪽에는 실시예 1로부터 제조된 고정화 페니실린 아실라제를 사용하고, 다른 쪽은 독일 Roche사의 PGA-450 페니실린 아실라제를 사용하여 반응을 진행시키고, 상기 실시예 2와 동일하게 반응을 반복해서 진행시키면서 반응에 소요되는 시간을 확인하였다.After preparing two reaction apparatuses as in Example 2, one side was immobilized penicillin acylase prepared in Example 1, the other was proceeded with the reaction using PGA-450 penicillin acylase from Roche, Germany, While repeating the reaction in the same manner as in Example 2, the time required for the reaction was confirmed.
그 결과를 도 1에 나타내었다.The results are shown in FIG.
도 1의 결과로부터, 본 발명에 따른 고정화 페니실린 아실라제는 종래 Roche사의 PGA-450에 비하여 장기 안정성이 우수함을 알 수 있다.From the results of Figure 1, it can be seen that the immobilized penicillin acylase according to the present invention is superior in long-term stability compared to PGA-450 of the conventional Roche.
실험예 2: 기계적 성질 Experimental Example 2 : Mechanical Properties
상기 실시예 1에서 제조된 고정화 페니실린 아실라제 1g을 50㎖의 증류수에 넣고 스크류 타입의 교반기를 이용하여 300rpm으로 24시간 교반하였다.1 g of the immobilized penicillin acylase prepared in Example 1 was placed in 50 ml of distilled water and stirred at 300 rpm for 24 hours using a screw-type stirrer.
교반 전과 후의 입자크기 분포 및 평균입자크기를 측정하여 그 결과를 다음 표 1에 나타내었다.The particle size distribution and average particle size before and after stirring were measured and the results are shown in Table 1 below.
비교실험예 1Comparative Experimental Example 1
상기 실시예 2와 동일한 조건으로 이태리 레코다티(Recordati)사의 Superzyme을 사용하여 교반 전후의 입도분석을 하여 그 결과를 다음 표 2에 나타내었다.Particle size analysis before and after stirring using Superzyme of Recordati, Italy, under the same conditions as in Example 2, and the results are shown in Table 2 below.
비교실험예 2Comparative Experimental Example 2
상기 실시예 2와 동일한 조건으로 독일 로슈(Roche)사의 PGA-450을 사용하여교반 전후의 입도분석을 하여 그 결과를 다음 표 3에 나타내었다.Particle size analysis before and after stirring using PGA-450, Roche, Germany, under the same conditions as in Example 2, and the results are shown in Table 3 below.
상기 표 1 내지 3의 결과로부터, 본 발명에 따른 고정화 담체를 사용한 페니실린 아실라제는 교반시험 전후 입도분포가 균일하고 입자크기 변화가 적은 반면, 종래의 고정화 페니실린 아실라제는 평균입자크기가 상당히 줄어들었음을 알 수 있다. 이는 교반을 통해 고정화 페니실린 아실라제가 깨어짐을 의미한다.From the results of Tables 1 to 3, the penicillin acylase using the immobilized carrier according to the present invention had a uniform particle size distribution and a small change in particle size before and after the agitation test, whereas the conventional immobilized penicillin acylase significantly reduced the average particle size. It can be seen. This means that the immobilized penicillin acylase breaks through stirring.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따라 특정의 충격보강제를 포함하는 폴리메틸메타크릴레이트 수지를 고정화 담체로 사용하여 페니실란 아실라제와 공유결합시켜 얻어진 고정화 페니실린 아실라제는 종래의 고정화 페니실린 아실라제에 비하여 단위무게당 활성도는 유지된 채 기계적 강도가 10∼20% 정도 향상되어 베타락탐계 항생제 제조에 있어서 재사용 횟수를 늘릴 수 있다.As described above in detail, an immobilized penicillin acylase obtained by covalently bonding with a penicsilane acylase using a polymethylmethacrylate resin containing a specific impact modifier according to the present invention as an immobilization carrier is a conventional immobilized penicillin acylase. Compared with the activity per unit weight, the mechanical strength is improved by about 10 to 20%, and the number of reuse can be increased in the production of beta-lactam antibiotics.
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