KR20010100277A - Bioreactor for the culture of microorganisms - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미생물 배양용 생물반응기에 관한 것으로서, 소정지점에서 수직방향에 대하여 내측으로 30 내지 60°테이퍼진 원통형의 배양용기, 상기 배양용기의 밑면에 장착된 공기주입 장치 및 상기 배양용기의 내부에 위치하는 교반기를 포함하는 미생물 배양용 생물반응기에 관한 것이다.The present invention relates to a bioreactor for culturing microorganisms, wherein a cylindrical culture vessel tapered inward with respect to the vertical direction at a predetermined point is 30 to 60 °, an air injection device mounted on the underside of the culture vessel, and inside the culture vessel. It relates to a bioreactor for culturing microorganisms comprising a stirrer located.
Description
본 발명은 미생물 배양용 생물반응기에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 호기성 미생물 배양에 있어서 배양물의 침전이 발생하지 않고, 세포순환이 원활할 뿐만 아니라, 세포엉김이 억제되고 물질순환이 원활히 이루어져 배양 수율이 우수한 생물반응기에 관한 것이다.The present invention relates to a bioreactor for culturing microorganisms, and more particularly, in the aerobic microbial culture, not only precipitation of cultures occurs, but also cell circulation is smooth, cell entanglement is inhibited, and material circulation is smoothly achieved, resulting in culture yield. It relates to an excellent bioreactor.
미생물을 배양하기 위한 기본적인 생물반응기는, 1932년 세척과 멸균을 위해 물과 스팀(steam)을 공급하기 위하여 제작한 공기 부양식 튜브에서 출발하였다. 그 후 1944년, 이스트 발효를 위해 수직원통형 생물반응기로 발전되었다. 이를 기초로 세포의 고농도 배양을 위해 반응기의 직경 및 높이에 변화를 준 다양한 형태의 생물반응기가 개발되었으나, 기본적인 형태는 모두 수직원통형이다.The basic bioreactor for cultivating microorganisms started in 1932 with an air incubation tube designed to supply water and steam for cleaning and sterilization. It was then developed in 1944 as a vertical cylindrical bioreactor for yeast fermentation. Based on this, various types of bioreactors have been developed for varying the diameter and height of the reactor for high concentration culture of cells, but the basic forms are all vertical cylinders.
그러나, 이러한 수직원통형 반응기는 고농도 배양시 반응기 하부 코너의 사각지대에 침전현상이 나타나 다량의 세포사가 발생한다. 이들 세포사를 회피하기 위한 방법으로 교반 속도를 높이는 방안이 제시되었으나, 이 경우 사각지대의 침전현상은 극복할 수 있지만, 전단응력이 약한 생물에 대해서는 치명적인 결과를 초래하는 한계가 있었다. 도 1은 이러한 종래의 수직원통형 반응기의 일 예를 나타내는 사진이다. 도 1에 나타난 바와 같이, 수직원통형 반응기에서 미생물을 고농도로 배양하였을 경우에는 상당한 양의 침전이 형성된다.However, this vertical cylindrical reactor has a large amount of cell death occurs due to precipitation phenomenon in the dead zone of the lower corner of the reactor during high concentration culture. In order to avoid these cell death, a method of increasing the agitation speed has been proposed, but in this case, the precipitation phenomenon of the dead zone can be overcome, but there is a limit that causes fatal results for the organisms with weak shear stress. 1 is a photograph showing an example of such a conventional vertical cylindrical reactor. As shown in FIG. 1, a significant amount of precipitation is formed when microorganisms are cultured at high concentration in a vertical cylindrical reactor.
이러한 침전 현상을 방지하기 위한 방안으로, 유선형의 공기부양식 생물반응기가 개발되었다(공개번호 특1999-012384호). 그러나, 이 반응기는 배양초기에는 세포의 밀도가 낮기 때문에 상대적으로 배지순환이 용이한 장점이 있기는 하나, 배양중기 이후 세포밀도가 높아지기 시작하면 물질순환이 제대로 이루어지지 않고 세포의 엉김현상이 발생하는 단점이 있었다.In order to prevent such precipitation phenomenon, a streamlined air floating bioreactor has been developed (Publication No. 1999-012384). However, this reactor has the advantage of relatively easy medium circulation because of the low density of cells in the early stage of culture.However, if the cell density starts to increase after the middle of culture, the mass circulation does not occur properly and the cells become entangled. There was a downside.
한편, 호기성 미생물 배양에서 미생물로의 산소전달능력을 제공하는 공기주입 장치는 배양 수율에 중요한 요소로 작용하는데, 기존의 공기주입 장치에는 스테인레스판, 세라믹판, 유리판 또는 스테인레스 링에 직경이 약 1㎜이상이고 다수의 구멍을 갖는 다공성 스파자(porous spargar), 또는 한 개의 구멍을 가진 오리피스 스파자(orifice spargar)가 구비된 형태가 있다.On the other hand, the air injection device that provides oxygen transfer ability to the microorganism in the aerobic microorganism culture acts as an important factor in the culture yield, the conventional air injection device is about 1mm in diameter on the stainless steel plate, ceramic plate, glass plate or stainless ring There is a form provided with a porous spargar having a plurality of holes or an orifice spargar having a single hole.
이때, 스파자를 통해 공급되는 산소가 배양액으로 쉽게 녹아들어가 생물이 이용할 수 있도록 하기 위해서는 공기방울의 크기를 되도록 작게 하여 표면적을 증가시키는 것이 바람직하다. 공기방울의 표면적을 증가시키기 위해서 보통 교반속도를 증가시키는데, 이를 전단응력이 약한 생물에 적용하는 데에는 한계가 있었다.In this case, in order for the oxygen supplied through the spar to easily dissolve into the culture medium and be used by the organism, it is preferable to increase the surface area by making the size of the air bubble as small as possible. In order to increase the surface area of the air bubbles, the stirring speed is usually increased. However, there is a limit in applying this to the organisms with weak shear stress.
이러한 결과는 궁극적으로 세포의 고농도 성장을 저해하는 요인으로 대두되고 있다. 특히 곰팡이 배양시에는 세포의 무게로 인하여 사각지대로의 침전현상이 가속화되어 문제가 더욱 심각해진다.This result is emerging as a factor that ultimately inhibit the high growth of cells. Especially in mold culture, the weight of the cells accelerates the precipitation of the blind spots, which makes the problem more serious.
본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 예의 연구를 한 결과, 반응기의 사각지대로 인한 침전 현상을 방지하고, 또한 공기공급 장치의 산소 전달능력을 증가시킴으로써 배양 수율이 뛰어난 본 발명의 생물반응기를 개발하게 되었다.The present inventors earnestly researched to solve the above problems, and thus prevented precipitation due to the dead zone of the reactor, and also increased the oxygen transfer capacity of the air supply device, thereby developing the bioreactor of the present invention having excellent culture yield. .
즉, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 배양 미생물의 침전 현상이 방지되고, 반응기 내부로의 산소 전달량이 높아서 배양 수율이 뛰어난 미생물 배양용 생물반응기를 제공하는 것이다.That is, the technical problem to be achieved by the present invention is to provide a bioreactor for culturing microorganisms having excellent culture yield because the phenomenon of precipitation of cultured microorganisms is prevented and the oxygen transfer amount into the reactor is high.
도 1은 종래의 수직원통형 생물반응기에서 미생물을 고농도로 배양하였을 경우 침전이 일어나는 현상을 나타내는 사진이다.1 is a photograph showing a phenomenon that precipitation occurs when the microorganisms are cultured at a high concentration in a conventional vertical cylindrical bioreactor.
도 2는 본 발명의 생물반응기의 배양 용기의 일 예를 나타내는 사진이다.Figure 2 is a photograph showing an example of the culture vessel of the bioreactor of the present invention.
도 3은 본 발명의 생물반응기의 일 예를 나타내는 모식도이다.3 is a schematic diagram showing an example of the bioreactor of the present invention.
도 4(a)~(d)는 본 발명의 생물반응기의 공기공급 장치의 일 예를 나타내는 사진 및 도면으로, (a)는 공기공급 장치의 표면의 사진, (b)는 공기공급 장치의 이면의 사진, (c)는 공기공급 장치가 배양 용기에 장착된 경우의 사진, (d)는 공기공급 장치의 단면도이다.4 (a) to (d) are photographs and drawings showing an example of the air supply device of the bioreactor of the present invention, (a) is a photograph of the surface of the air supply device, (b) is the back of the air supply device (C) is a photograph when the air supply device is mounted on the culture vessel, (d) is a cross-sectional view of the air supply device.
도 5(a)~(b)는 본 발명의 5L급 생물반응기에서 미생물을 고농도로 배양하였을 경우를 나타내는 사진으로, (a)는 배양전 사진이고 (b)는 배양후 사진이다.Figure 5 (a) ~ (b) is a photograph showing a case of culturing microorganisms in a high concentration in the 5L bioreactor of the present invention, (a) is a photograph before the culture and (b) is a photograph after the culture.
도 6은 본 발명의 500L급 생물반응기에서 미생물을 고농도로 배양하였을 경우를 나타내는 사진이다.6 is a photograph showing a case where the microorganisms were cultured at a high concentration in the 500L-class bioreactor of the present invention.
도 7은 본 발명의 500L급 생물반응기에서 교반 속도에 따른 산소전달계수를 나타내는 그래프이다.7 is a graph showing the oxygen transfer coefficient according to the stirring speed in the 500L-class bioreactor of the present invention.
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명><Description of the symbols for the main parts of the drawings>
10. 배양 용기 11. 맨홀10. Culture Vessel 11.Manhole
13. 테이퍼부13. Taper part
30. 공기주입 장치 31. 스파자(spargar)30. Air injector 31. Spargar
33. 메쉬(mesh) 34. O 링33.mesh 34.O-ring
35. 멸균공기 주입부 36. 스파자 조임 나사35. Sterile air inlet 36. Spare captive screw
37. 배지 수집관37. Badge Collection
50. 교반기 51. 교반모터50. Stirrer 51. Stirring motor
53. 교반축 55. 교반날개53. Stirring shaft 55. Stirring blade
본 발명은 소정지점에서 수직방향에 대하여 내측으로 30 내지 60°테이퍼진 원통형의 배양용기 및 상기 배양용기의 밑면에 장착된 공기주입 장치를 포함하는 미생물 배양용 생물반응기에 관한 것이다.The present invention relates to a microorganism culturing bioreactor comprising a cylindrical culture vessel of 30 to 60 ° tapered inward with respect to the vertical direction at a predetermined point and an air injection device mounted on the underside of the culture vessel.
본 발명의 생물반응기는 바람직하게는, 상기 배양용기의 내부에 교반기를 더 포함한다.The bioreactor of the present invention preferably further includes an agitator inside the culture vessel.
본 발명의 생물반응기에 있어서, 상기 공기주입 장치는 한 개 내지 복수개의 메쉬형 스파자를 구비한 원판 형태로서, 스파자의 구경은 0.05 내지 10㎛이다.In the bioreactor of the present invention, the air injection device is in the form of a disk having one to a plurality of mesh-type spar, the spar diameter is 0.05 to 10㎛.
이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명을 보다 자세하게 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings.
도 2는 본 발명의 생물반응기의 배양 용기의 일 예를 나타내는 사진이다.Figure 2 is a photograph showing an example of the culture vessel of the bioreactor of the present invention.
도 3은 본 발명의 생물반응기의 일 예를 나타내는 모식도이다. 도 3을 참조하면, 본 발명의 생물반응기는 배양 용기(10), 공기주입 장치(30) 및 교반기(50)를 포함한다.3 is a schematic diagram showing an example of the bioreactor of the present invention. Referring to FIG. 3, the bioreactor of the present invention includes a culture vessel 10, an air injection device 30, and an agitator 50.
배양용기(10)는 하단부가 수직방향에 대하여 내측으로 30 내지 60°테이퍼 진 테이퍼부(13)로 이루어진 원통형으로서, 종래의 반응기에서와 같이 배양용기 코너의 사각 지대가 없어 배양 중기 이후의 미생물 세포의 침전 현상을 방지할 수 있다. 배양용기(10)의 윗면에는 배지조제 및 세척을 위한 맨홀(11)이 구비되어 있다. 다음으로, 공기주입 장치(30)의 아래쪽에는 멸균공기 주입부(35)가 구비되어 있어 이를 통해 공기가 공기주입 장치(30)을 거쳐 배양 용기(10) 내로 주입된다. 또한, 본 발명의 교반기(50)는 배양 용기(10) 윗면의 교반 모터(51), 교반모터(51)와 축(53)으로 연결되어 배양 용기(10)의 내부에 위치하는 교반날개(55)로 이루어진다.The culture vessel 10 has a cylindrical shape consisting of a tapered portion 13, 30-60 ° tapered inward with respect to the vertical direction, and has no blind spot at the corner of the culture vessel as in a conventional reactor, and thus microbial cells after the intermediate stage of culture. Precipitation can be prevented. The upper surface of the culture vessel 10 is provided with a manhole 11 for media preparation and washing. Next, the sterile air injection unit 35 is provided below the air injection device 30 so that air is injected into the culture vessel 10 through the air injection device 30. In addition, the stirrer 50 of the present invention is connected to the stirring motor 51, the stirring motor 51 and the shaft 53 on the upper surface of the culture vessel 10, the stirring blade 55 is located inside the culture vessel 10. )
도 4(a)~(d)는 본 발명의 생물반응기의 공기공급 장치(30)의 일 예를 나타내는 사진 및 도면으로서, 도 4(a)를 참조하면, 공기공급 장치(30)는 한 개 내지 복수개의 스파자(31)가 구비된 원판 형태로서, 각 스파자(31)는 메쉬형으로서 구경이 약 0.05 내지 10㎛이다. 이러한 본 발명의 메쉬형 스파자(31)에 의해 교반 속도를 증가시키지 않고서도 배양용기 내부로 주입되는 공기방울의 크기가 작게 조절되어 반응 용기(10) 내부로의 산소전달능력이 증가되어 고밀도 세포성장을 유도할 수 있다.4 (a) to 4 (d) are photographs and drawings showing an example of the air supply device 30 of the bioreactor of the present invention. Referring to FIG. 4 (a), one air supply device 30 is provided. To a plurality of spar (31) is provided in the form of a disc, each spar 31 is a mesh-shaped, the diameter of about 0.05 to 10㎛. The mesh spar 31 of the present invention controls the size of air bubbles injected into the culture vessel without increasing the stirring speed, thereby increasing the oxygen transfer capacity into the reaction vessel 10, thereby increasing the density of cells. May induce growth.
도 4(b)는 공기공급 장치(30)의 이면의 사진으로서, 각 스파자(31)는 배지수집관(37)과 연결되어 있다. 도4(c)는 공기공급 장치(30)가 배양 용기에 장착된 경우의 사진이고, 도4(d)는 공기공급 장치의 단면도이다.4 (b) is a photograph of the rear surface of the air supply device 30, and each spar 31 is connected to the medium collection pipe 37. Figure 4 (c) is a photograph when the air supply device 30 is mounted on the culture vessel, Figure 4 (d) is a cross-sectional view of the air supply device.
도 5(a)~(b)는 본 발명의 5L급 생물반응기에서 미생물을 고농도로 배양하였을 경우를 나타내는 사진으로, (a)는 배양전 사진이고 (b)는 배양후 사진이고, 도 6은 본 발명의 500L급 생물반응기에서 미생물을 고농도로 배양하였을 경우를 나타내는 사진이다. 사진에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 생물반응기를 사용하여 배양한 후에는 침전이 거의 발생하지 않는다.Figure 5 (a) ~ (b) is a photograph showing a case of culturing microorganisms in a high concentration in the 5L-class bioreactor of the present invention, (a) is a photograph before the culture and (b) is a photograph after the culture, Figure 6 In the 500L bioreactor of the present invention is a photograph showing the case of culturing the microorganisms in high concentration. As can be seen from the photograph, after incubation using the bioreactor of the present invention, precipitation hardly occurs.
이하에서, 본 발명의 생물반응기의 성능을 실시예를 통하여 더욱 자세히 설명하기로 하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the performance of the bioreactor of the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
<실시예 1: 균사체 성장속도>Example 1: Mycelial Growth Rate
상황버섯(Phellinus linteus) 균사체를 분리하여 생물반응기 형태에 따른 균사체 성장속도를 관찰하였다. 사용된 생물반응기는 유리로 된 5L 용량의 종래의 수직 원통형 생물반응기와 본 발명의 생물반응기로서 교반기는 장착하지 않았다. 상황버섯 균사체는 100ml의 감자 덱스트로즈 브로쓰(Difco. Co.) 복합배지가 함유된 500ml 삼각플라스크에서 5일 내지 10일 배양한 균사체를 다시 200ml 내지 300ml의 CVM 완전배지가 들어있는 1L 삼각플라스크에 종균 10(v/v)으로 접종한 후, 5일 내지 10일 배양한 배양액을 10(v/v) 종균으로 사용하였다. 종균으로 사용하는 균사체를 멸균된 믹서기에 넣은 후 균질화시켜 수직 원통형 생물반응기 및 본 발명의 생물반응기에 각각 접종하였다. 상황버섯 균사체의 배양환경은 공기주입속도를 0.1vvm 내지 1vvm으로 조정하여 공급하였다. 공기주입속도 1vvm 이상에서는 다량의 거품발생으로 인하여 균사체가 배양기 벽면에 붙어 자라는 경향이 있어서 공기주입속도는 1vvm 이하로 조정하였다. 배양온도는 배양실내에 온냉방기를 설치하여 실내 온도를 20℃ 내지 35℃로 조정하여 5일 내지 10일간 배양하였다. 생물반응기는 오토클레이브를 이용하여 121℃로 20분에서 1시간 동안 실시하였고, 멸균 후 배양기내의 수분을 제거하기 위하여 건조기에서 1시간 동안 건조하였다. 배양종료 후 배양 균사체는 여과지로 여과하고 증류수로 2-3회 세척한 후 건조기에서 105℃, 8시간 동안 건조한 다음 균사체의 무게를 측정하였다. 이의 결과는 하기 표 1에 기술된 바와 같다. Mycelial growth of Phellinus linteus was isolated and observed according to the bioreactor type. The bioreactor used was a conventional 5L volume of conventional vertical cylindrical bioreactor with glass and no stirrer as the bioreactor of the present invention. The situation mushroom mycelium is a 1L Erlenmeyer flask containing 200ml to 300ml of CVM complete medium again in the mycelium cultured for 5-10 days in 500ml Erlenmeyer flask containing 100ml of potato dextrose broth (Difco. Co.) complex medium. After inoculation with spawn 10 (v / v), the culture medium incubated for 5 days to 10 days was used as the 10 (v / v) spawn. The mycelium used as a spawn was placed in a sterile blender and then homogenized to inoculate each of the vertical cylindrical bioreactor and the bioreactor of the present invention. The culture environment of the situation mushroom mycelium was supplied by adjusting the air injection rate from 0.1vvm to 1vvm. At the air injection speed of 1vvm or more, mycelium tends to grow on the wall of the incubator due to the formation of a large amount of bubbles, so the air injection speed is adjusted to 1vvm or less. The culture temperature was installed in a culture chamber to adjust the room temperature to 20 ℃ to 35 ℃ incubated for 5 days to 10 days. The bioreactor was carried out at 121 ° C. for 20 minutes to 1 hour using an autoclave, and after sterilization, the bioreactor was dried for 1 hour in a dryer to remove moisture in the incubator. After completion of the culture, the cultured mycelium was filtered through filter paper, washed 2-3 times with distilled water, dried in a drier at 8O < 0 > C for 8 hours, and the weight of the mycelium was measured. The results are as described in Table 1 below.
위 결과로부터 알 수 있듯이 본 발명의 생물반응기에서의 건조 균사체 건조무게는 13g/L로 나타났으며, 종래와 같은 균사체 침전현상은 나타나지 않았다. 그러나, 수직원통형 생물반응기에서는 건조균사체 무게는 9g/L로서 균사체 성장이 원활하지 못했으며 또한 배양기 하부에 사각지대로 인한 균사체 침전현상이 발생하였다.As can be seen from the above results, the dry mycelium dry weight in the bioreactor of the present invention was found to be 13g / L, the mycelial precipitation did not appear as in the prior art. However, in the vertical cylindrical bioreactor, the dry mycelium weight was 9 g / L, which resulted in poor mycelial growth and precipitation of mycelium due to the dead zone at the bottom of the incubator.
<실시예 2: 배양 용기의 테이퍼 각도에 따른 균사체 생산성>Example 2: Mycelial Productivity According to Taper Angle of Culture Vessel
유리 재질로서 5L들이 용량이고, 배양 용기의 테이퍼 각도가 수직방향에 대하여 각각 90°(즉, 수직원통형), 60°, 45°, 37.5°, 30°, 15°인 생물반응기를제작하여 실험에 사용하였다. 상황버섯 균사체는 100ml의 감자 덱스트로즈 브로쓰(Difco. Co.) 복합 배지가 함유된 500ml 삼각 플라스크에서 5일 내지 10일 배양한 균사체를 다시 200ml 내지 300ml의 CVM 완전 배지가 들어있는 1L 삼각 플라스크에 종균 10(v/v)으로 접종한 후, 5일 내지 10일 배양한 다음 이 배양액을 10(v/v) 종균으로 사용하였다. 종균으로 사용하는 균사체를 멸균된 믹서기에 넣은 후 균질화시켜 각각의 생물반응기에 접종하였다. 상황버섯 균사체 배양환경은 공기주입속도를 0.1vvm 내지 1vvm으로 조정하여 공급하였다. 공기주입속도 1vvm 이상에서는 다량의 거품발생으로 인하여 균사체가 배양기 벽면에 붙어 자라는 경향이 있어서 공기주입속도는 1vvm 이하로 조정하였다. 배양온도는 배양실내에 온냉방기를 설치하여 실내 온도를 20℃ 내지 35℃로 조정하여 5일 내지 10일간 배양하였다. 생물반응기는 오토클레이브를 이용하여 121℃로 20분에서 1시간동안 실시하였고, 멸균 후 배양기내의 수분을 제거하기 위하여 건조기에서 1시간동안 건조하였다. 배양종료 후 배양 균사체는 여과지로 여과하고 증류수로 2-3회 세척한 후 건조기에서 105℃로 8시간 동안 건조 후 균사체 무게를 측정하였다. 이 결과는 하기 표 2에 나타나 있다.Glass reactors were 5L in volume and the bioreactors with taper angles of 90 ° (ie vertical cylinder), 60 °, 45 °, 37.5 °, 30 °, and 15 ° with respect to the vertical direction were fabricated. Used. Situation mushroom mycelium is a 1 L Erlenmeyer flask containing 200 ml to 300 ml of CVM complete medium in the mycelium cultured in a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of potato Dextco. Co. complex medium for 5 to 10 days. Inoculated with spawn 10 (v / v), and then cultured for 5 to 10 days, this culture was used as 10 (v / v) spawn. The mycelium used as a spawn was placed in a sterile blender and then homogenized to inoculate each bioreactor. Situation mushroom mycelium culture environment was supplied by adjusting the air injection rate from 0.1vvm to 1vvm. At the air injection speed of 1vvm or more, mycelium tends to grow on the wall of the incubator due to the formation of a large amount of bubbles, so the air injection speed is adjusted to 1vvm or less. The culture temperature was installed in a culture chamber to adjust the room temperature to 20 ℃ to 35 ℃ incubated for 5 days to 10 days. The bioreactor was run at 121 ° C. for 20 minutes to 1 hour using an autoclave, and after sterilization, the bioreactor was dried for 1 hour in a drier to remove water in the incubator. After the end of the culture, the cultured mycelium was filtered through filter paper, washed 2-3 times with distilled water, and dried at 105 ° C. for 8 hours in a drier, and the weight of the mycelium was measured. The results are shown in Table 2 below.
위 결과로부터 알 수 있듯이, 배양 용기의 테이퍼 각도가 60°에서 30°인생물반응기에서의 균사체 성장속도는 양호하였다. 그러나, 각도가 30°이하가 되면 공기의 급격한 상승으로 배양배지의 거품이 과다하게 발생하였고, 똑같은 배양부피를 맞추기 위해서는 배양기 높이가 다른 배양기에 비해 너무 높아져서 향후 배양공정 대형화(scale up)에 문제가 발생할 수 있는 것으로 나타났다.As can be seen from the above results, the growth rate of the mycelium in the bioreactor having a taper angle of 60 ° to 30 ° in the culture vessel was good. However, when the angle is less than 30 °, the bubbles of the culture medium are excessively generated due to the rapid rise of the air, and the height of the incubator is too high compared with other incubators to meet the same culture volume, which causes problems in the scale up of the incubation process in the future. It has been shown to occur.
<실시예 3: 교반 효과>Example 3: Stirring Effect
생물반응기는 유리 재질 및 5L 용량으로 종래의 수직원통형 반응기 및 본 발명의 반응기로 제작하고, 여기에 각각 교반기(IKA, RW-20.n)를 장착하였다. 상황버섯 균사체는 100ml의 감자 덱스트로즈 브로쓰(Difco. Co.) 복합배지가 함유된 500ml 삼각플라스크에서 5일 내지 10일 배양한 균사체를 다시 200ml 내지 300ml의 CVM 완전배지가 함유된 1L 삼각플라스크에 종균 10(v/v)으로 접종한 후 5일 내지 10일 배양한 다음 이 배양액을 10(v/v) 종균으로 사용하였다. 종균으로 사용하는 균사체는 멸균된 믹서기에 넣은 후 균질화시켜 각각의 생물반응기에 접종하였다. 상황버섯 균사체 배양환경은 공기주입속도를 0.1vvm 내지 1vvm으로 조정하여 공급하였다. 공기주입속도 1vvm 이상에서는 다량의 거품발생으로 인하여 균사체가 배양기 벽면에 붙어자라는 경향이 있어서 공기주입속도는 1vvm 이하로 조정하였다. 교반속도는 교반모터에 장착되어 있는 교반속도 조절기로 50rpm에서 300rpm으로 조절하였다. 배양온도는 배양실내에 온냉방기를 설치하여 실내 온도를 20℃ 내지 35℃로 조정하여 5일 내지 10일간 배양하였다. 생물반응기는 교반축을 장착한 후 오토클레이브를 이용하여 121℃로 20분에서 1시간동안 실시하였고, 멸균 후 배양기내의 수분을 제거하기 위하여 건조기에서 1시간동안 건조하였다. 멸균 후 교반축을장착한 생물반응기는 외부에서 교반모터와 연결하였다. 배양종료 후 배양 균사체는 여과지로 여과하고 증류수로 2-3회 세척한 후 건조기에서 105℃, 8시간 동안 건조 후 균사체 무게를 측정하였다. 이의 결과는 하기 표 3에 기술되어 있다.The bioreactor was made of a conventional vertical cylindrical reactor and a reactor of the present invention with a glass material and 5L capacity, and equipped with agitators (IKA, RW-20.n), respectively. The situation mushroom mycelium is a 1L Erlenmeyer flask containing 200ml to 300ml of CVM complete medium again in the mycelium cultured in 500ml Erlenmeyer flask containing 100ml of potato dextco broth (Difco. Co.) complex medium for 5-10 days. After inoculation with spawn 10 (v / v) was incubated for 5 to 10 days, this culture was used as 10 (v / v) spawn. The mycelium used as a spawn was placed in a sterile blender, homogenized and inoculated into each bioreactor. Situation mushroom mycelium culture environment was supplied by adjusting the air injection rate from 0.1vvm to 1vvm. At the air injection speed of 1vvm or more, mycelium tends to adhere to the wall of the incubator due to the formation of a large amount of bubbles, so the air injection speed was adjusted to 1vvm or less. Stirring speed was adjusted from 50rpm to 300rpm with a stirring speed controller mounted on the stirring motor. The culture temperature was installed in a culture chamber to adjust the room temperature to 20 ℃ to 35 ℃ incubated for 5 days to 10 days. The bioreactor was mounted at 121 ° C. for 20 minutes at 1 hour using an autoclave after mounting a stirring shaft, and dried for 1 hour in a dryer to remove water in the incubator after sterilization. After sterilization, the bioreactor equipped with the stirring shaft was connected to the stirring motor from the outside. After the completion of the culture, the cultured mycelium was filtered through filter paper, washed 2-3 times with distilled water, and dried at 105 ° C. for 8 hours in a drier, and the weight of the mycelia was measured. The results are shown in Table 3 below.
위 결과로부터 수직원통형 생물반응기에서는 건조균사체 무게는 17g/L로서 균사체 성장이 원활하지 못했다. 또한 배양기 하부에 사각지대로 인하여 균사체량이 7g/L이상 되었을 때부터 침전현상이 관찰되었다. 반면에, 본 발명의 교반기가 장착된 생물반응기에서 건조 균사체 건조무게는 26g/L로 교반기가 장착되지 않은 본 발명의 생물반응기의 13g/L(실시예 1) 보다 균사체 생산수율이 2배 이상 증가하였다.From the above results, the dry mycelium weight was 17g / L in the vertical cylindrical bioreactor. In addition, the precipitation phenomenon was observed when the mycelial body weight was more than 7g / L due to the dead zone in the lower part of the incubator. On the other hand, in the bioreactor equipped with the stirrer of the present invention, the dry mycelium dry weight was 26 g / L, and the mycelial production yield was more than doubled by 13 g / L (Example 1) of the bioreactor without the stirrer (Example 1). It was.
<실시예 4 : 스파자에 따른 산소전달계수>Example 4 Oxygen Transfer Coefficient According to Spars
산소전달계수 측정은 이를 위해 비교적 간단하게 수행할 수 있는 '다이나믹 방법(dynamic method)'을 사용하였다(Stanbury, P.F., Whitaker, A., and S.J. Hall 1994, In principles of Fermentation Technology, 2nd ed.). 다이나믹 방법은 기체 산소의 용존산소로의 전달률(oxygen transfer rate)과 미생물의 산소 흡수율(oxygen uptake rate)을 측정하여 용존산소에 근거한 물질수지식으로부터 산소전달계수(oxygen transfer rate coefficient,k L a)를 측정하는 방법으로 세포배양액과 미생물이 존재하는 실제 발효 진행시에도 산소전달계수를 간편하고 정확하게 측정할 수 있다. 다이나믹 방법에서 사용되는 용존산소에 대한 물질수지식은 다음과 같다.Oxygen transfer coefficient measurements used a relatively simple 'dynamic method' for this purpose (Stanbury, PF, Whitaker, A., and SJ Hall 1994, In principles of Fermentation Technology, 2nd ed.) . Dynamic method transmissibility (oxygen transfer rate) and the oxygen absorption rate (oxygen uptake rate) the measured oxygen transfer coefficients (oxygen transfer rate coefficient, k L a) from the substance can be knowledge based on the dissolved oxygen in the microorganism of a dissolved oxygen in the gaseous oxygen By measuring the oxygen transfer coefficient can be easily and accurately measured even during the actual fermentation in the presence of cell culture fluid and microorganisms. The mass balance equation for dissolved oxygen used in the dynamic method is as follows.
상기식에서, CL은 발효배양액 내의 용존산소 농도 (mg O2/L)이고, C* L는 포화 용존산소 농도(mg O2/L)이며, qO2는 세포당의 산소흡수율(specific oxygen uptake rate, mg O2/g cell/h)이며, X는 배양액 내의 세포농도(g cell/L)이다.Where C L is the dissolved oxygen concentration (mg O 2 / L) in the fermentation broth, C * L is the saturated dissolved oxygen concentration (mg O 2 / L), q O2 is the specific oxygen uptake rate per cell , mg O 2 / g cell / h), and X is the cell concentration (g cell / L) in the culture.
배양중 어느 한 시점에서 공기의 공급을 멈추면 상기식의 kLa는 0이므로 배양액의 용존 산소농도는 다음 식을 만족하면서 감소하게 된다.When the supply of air is stopped at any point in the culture, k L a in the above equation is 0, so that the dissolved oxygen concentration of the culture solution decreases while satisfying the following equation.
따라서, t에 대한 CL선의 기울기를 측정함으로서 세포의 산소흡수율 qO2X를 측정할 수 있다. 일정 시점이 지난 후 공기를 다시 발효조로 공급하면, 배양액내의 용존산소는 (1)식의 물질수지식을 만족하면서 증가할 것이다. 이 때 (1)식을 다시 정리하여 직선관계식으로 재배열하면 다음과 같다.Therefore, the oxygen absorption rate q O 2 X of the cell can be measured by measuring the slope of the C L line with respect to t. If the air is fed back to the fermentor after a certain point, the dissolved oxygen in the culture will increase while satisfying the mass balance equation (1). In this case, rearranging Equation (1) and rearranging it in a linear relationship is as follows.
상기 (3)식으로부터에 대한 CL의 플롯은 기울기가이며 y축의 절편이 C* L인 직선이므로 이로부터 기울기를 계산함으로써 산소전달계수인k La 가 측정된다. 여기서 CL=C0 L(final steady dissolved-oxygen concentration)일 때, qO2X =k L a(C* L- C0 L) 이므로 (1)식은From the above formula (3) Plot of C L for Since the intercept on the y-axis is a straight line C * L , the oxygen transfer coefficient k La is measured by calculating the slope therefrom. Where C L = C 0 L (final steady dissolved-oxygen concentration), q O2 X = k L a (C * L -C 0 L )
이 된다. (4)식을 t2와 t1사이에서 적분하여 정리하면Becomes Integrating the expression (4) between t 2 and t 1
가 되므로 좌변을 Y 좌표로 우변의 (t2-t1)을 X 좌표로 교반속도나 공기유량 변화에 따른 CL을 도시하여 그 기울기로부터 산소전달계수를 구할 수 있게 된다.Since the left side is the Y coordinate and the right side (t 2 -t 1 ) is the X coordinate, C L is plotted according to the stirring speed or air flow change, and the oxygen transfer coefficient can be obtained from the slope.
상기 수식에 의해 본 발명의 생물반응기에서 공기주입 장치가 3.14㎠의 동전형태이고, 스파자의 개수가 4, 8, 16개이고, 구경이 각각 0.5㎛, 2㎛, 5㎛, 10㎛일 경우의 산소전달계수를 측정하여, 일반적으로 미생물 배양에 많이 사용하고 있는구경이 1mm인 스파자와 비교하였다. 그 결과, 표 4과 같이 산소전달계수로서 나타났다.Oxygen when the air injection device in the bioreactor of the present invention by the above formula is 3.14cm 2 coin type, the number of spar is 4, 8, 16, the aperture is 0.5㎛, 2㎛, 5㎛, 10㎛, respectively The transfer coefficient was measured and compared with a spar with a diameter of 1 mm, which is generally used for culturing microorganisms. As a result, it was shown as the oxygen transfer coefficient as shown in Table 4.
위 결과로부터, 본 발명의 메쉬형 스파자자 종래의 일반 스파자에 비해 산소 전달 계수가 높으며, 그 효과는 스파자 수가 증가할 수록 증대됨을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that the oxygen transfer coefficient is higher than the conventional spar in the mesh type spar of the present invention, the effect is increased as the number of sparse increases.
<실시예 5: 교반속도에 따른 산소 전달계수>Example 5 Oxygen Transfer Coefficient According to Stirring Speed
본 발명의 생물반응기에서 공기주입속도를 0.1vvm으로 고정하고 교반속도(agitation speed)를 0rpm, 100rpm, 150rpm 및 200rpm로 하여, 각 산소전달계수를 측정하여 그 결과를 도 7에 도시하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, 실험 결과 교반을 하지 않고 공기만 주입하였을 경우 산소전달계수가 0.13(min-1)이었으나 속도를 100rpm로 교반한 경우는 산소전달계수가 0.2828(min-1), 150rpm로 교반한 경우는 산소전달계수가 0.4841(min-1)로서 최대 3.7배 정도 산소전달율이 증가하였다.In the bioreactor of the present invention, the air injection speed was fixed at 0.1 vvm and the agitation speed was 0 rpm, 100 rpm, 150 rpm and 200 rpm, and the respective oxygen transfer coefficients were measured and the results are shown in FIG. 7. As shown in FIG. 7, when only air was injected without stirring, the oxygen transfer coefficient was 0.13 (min −1 ), but when the speed was stirred at 100 rpm, the oxygen transfer coefficient was 0.2828 (min −1 ) and 150 rpm. In the case of stirring, the oxygen transfer coefficient was 0.4841 (min -1 ), and the oxygen transfer rate increased up to 3.7 times.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 생물반응기는 반응기의 하단면을 30 내지 60°로 테이퍼 처리함으로써 배양생물의 침전현상을 방지하고, 복수개의 메쉬형 스파자를 갖는 공기공급 장치를 설치함으로써 세포순환이 원활할 뿐만 아니라, 배양중기 이후 배양기내 세포의 밀도가 높아지는 경우를 대비하여 교반기를 장착하여 산소전달계수를 약 3.7배 이상 향상시킴으로써 세포엉김을 억제하고 물질순환이 원활히 이루어져, 결과적으로 고밀도 세포성장을 유도하는 효과를 제공하므로 산업적으로 매우 유용하게 이용될 것으로 기대된다.As described above, the bioreactor according to the present invention prevents precipitation of cultured organisms by tapering the bottom surface of the reactor at 30 to 60 °, and installs an air supply device having a plurality of mesh-type sparges for cell circulation. In addition to this, in addition to the increase in the density of cells in the incubator after the middle of the culture by adding a stirrer to improve the oxygen transfer coefficient by about 3.7 times to suppress cell tangling and smooth material circulation, resulting in high density cell growth It is expected to be very useful industrially because it provides an effect of inducing a.
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