KR20010089904A - p53 MORPHOLINO-BASED ANTISENSE - Google Patents

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Abstract

Antisense oligonucleotides useful for treating a disease state characterized by p53 induction, such as proliferative cell disorders, e.g. cancer, or a hypoxic state induced by an ischemic attack, such as stroke, are described. The antisense agents are preferably of the class known as "steric blocker" type oligonucleotides, including morpholino oligonucleotides, peptide nucleic acids, 2'-O-allyl or 2'-O-alkyl modified oligonucleotides, or N3'->P5' phosphoramidate oligonucleotides.

Description

ｐ53 모르폴리노-기초 안티센스{p53 MORPHOLINO-BASED ANTISENSE}p53 morpholino-basal antisense {p53 MORPHOLINO-BASED ANTISENSE}

세포 증식에 있어서 p53 의 중요성은 모든 인간 암의 반이상이 p53 돌연변이를 나타낸다는 관찰로부터 분명하다(Levine, 1997). p53 발현의 유발은 DNA 알킬화제, 산화질소(Messmer, 1994), 이온화 및 자외선 조사(Lu 및 Lane, 1993), 염색체손상을 유발하는 제한 효소 PvuII(Lu 및 Lane, 1993), 및 DNA 스트랜드 깨짐을 유발할 수 있는 다른 약제(Nelson and Kastan, 1994)에 노출된 세포에서 관찰된다. 국소빈혈/재살포상해 (Raafat,1997), 간질의 모델(Xiang,1996), 및 저산소증 (Graeber, 1994)이 또한 p53을 유발하는 것으로 증명되었다. 본 명세서 및 이전의 연구 (Rininger,1997) 에서 밝혀진대로, p53 단백질 수준도 또한 부분적인 간절제술후의 간 재생 과정동안 매우 상향조절되어, 내인성 원인의 손상 역시 생체내에서 p53 의 유발를 야기할 수 있다는 것을 보여준다.The importance of p53 in cell proliferation is evident from the observation that more than half of all human cancers exhibit p53 mutations (Levine, 1997). The induction of p53 expression results in a DNA alkylating agent, nitric oxide (Messmer, 1994), ionization and ultraviolet irradiation (Lu and Lane, 1993), restriction enzymes PvuII (Lu and Lane, 1993) (Nelson and Kastan, 1994). (Raafat, 1997), a model of epilepsy (Xiang, 1996), and hypoxia (Graeber, 1994) have also been shown to induce p53. As revealed in the present specification and in previous studies (Rininger, 1997), p53 protein levels are also highly upregulated during liver regeneration following partial hepatectomy, suggesting that damage to endogenous causes may also result in the induction of p53 in vivo Show.

p53 에 대한 역할이 세포 주기 체크 포인트 활성, 아포토시스, 분화 및 DNA 수복에서 요구되어왔다 (Magnelli,1997). 세포 주기 체크포인트는 두 가지 중요한 기능을 한다. 하나는, 세포주기에서 필수적인 사건들이 후속 사건 전에 완결되도록하는 것을 보장하는 것이다; 다른 하나는 DNA 복제 및 유사분열이 일어나기 전에 손상된 DNA 의 수복을 위한 더 많은 시간을 제공하는 것이다. (Hartwell,1994). p53 의 체크포인트 활성은 세포 주기의 S-기(DNA 합성)로 진입하는 세포 수준에서 우세하게 나타난다(Kastan,1992). p53 에 대한 G2-M 체크포인트 활성도 또한 p21waf-1의 업스트림 조절자로서의 p53 역할로 인해 보고되었다. 어느 단백질도 없을 때, DNA-손상된 세포는 G2-유사 상태에서 정지하나, 그때 정상적인 유사분열(M 기)을 방해하지 않고 추가적인 S 기로 진행하여 예를 들어 다배수와 같은 핵이상을 유도하여 아포토시스를 가져온다.(Waldman,1996)The role for p53 has been required for cell cycle checkpoint activity, apoptosis, differentiation and DNA repair (Magnelli, 1997). Cell cycle checkpoints have two important functions. One is to ensure that events essential to the cell cycle are completed before a subsequent event; The other is to provide more time for the repair of damaged DNA before DNA replication and mitosis take place. (Hartwell, 1994). Checkpoint activity of p53 is predominant at the cell level entering the S-phase (DNA synthesis) of the cell cycle (Kastan, 1992). G 2 -M checkpoint activity for p53 was also reported due to p53 role as an upstream regulator of p21 waf-1 . In the absence of any protein, DNA-damaged cells stop at the G 2 -like state, but then proceed to the additional S phase without interfering with normal mitosis (M phase) to induce a nuclear anomaly, (Waldman, 1996).

발명의 개요Summary of the Invention

한 측면에서, 본 발명은 대상 포유 동물에서 p53 유발을 특징으로하는 질병 상태를 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 방법은 적당한 제약학적 담체중의 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3' 로 확인되는 염기 서열 SEQ ID NO:1, 또는 5'-CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC-3' 로 확인되는 염기서열 SEQ ID NO:2 를 가지는 안티센스 약제의 제약학적 유효량을 대상에 투여하는 것을 포함하며, 여기에서 안티센스 약제는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드,펩티드 핵산,2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬 변형된 올리고뉴클레오티드, N3'→P5' 포스포르아미데이트 올리고뉴클레오티드, 또는 C-5-프로핀 피리미딘-변형된 올리고뉴클레오티드이다. 바람직한 구체예에서, 안티센스 약제는 바람직하게는 포스포로디아미데이트 골격 결합에 의해 연결된 모르폴리노 서브유닛을 가지는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드이다. 다른 바람직한 구체예에서, 안티센스 약제는 C-5-프로핀 피리미딘-변형된 올리고뉴클레오티드이다.In one aspect, the invention relates to methods and compositions for treating disease states characterized by p53 induction in a subject mammal. This method is based on the base sequence identified as 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3 'in a suitable pharmaceutical carrier, or a 5'-CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC-3' Comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of an antisense agent having the sequence SEQ ID NO: 2 wherein the antisense agent is selected from the group consisting of morpholino oligonucleotides, peptide nucleic acids, 2'-O-allyl or 2'-O-alkyl A modified oligonucleotide, an N3 'to P5' phosphoramidate oligonucleotide, or a C-5-propynopyrimidine-modified oligonucleotide. In a preferred embodiment, the antisense agent is a morpholino oligonucleotide having a morpholino subunit linked by a phosphorodiamidate backbone linkage. In another preferred embodiment, the antisense agent is a C-5-propynopyrimidine-modified oligonucleotide.

본 발명은 또한 이러한 질병 상태 치료에 사용하기 위한 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 적당한 제약학적 담체내에 상기에 기술된 안티센스 약제를 포함한다.The present invention also includes compositions for use in the treatment of such disease states. Such compositions comprise the antisense agents described above in a suitable pharmaceutical carrier.

본 발명의 방법의 바람직한 이용에서, 대상은 인간 대상이다. 질병 상태는 국소빈혈 또는 뇌졸증 또는 기관 이식 휴유증과 같은 국소빈혈/재살포 상해로부터 야기된 것일 수 있다. 대안적으로, 질병 상태는 암일 수 있고, 이 경우에 바람직한 구체예는, 세포 수준에서 라디칼 산소 종을 증가시키기에 효과적인 약제의 투여를 더 포함한다. 이러한 약제는 방사선 증감제, 이온화 방사선, 고압 산소 환경,및 세포 수준에서 라디칼 산소 종을 증가시키는 안트라사이클린 또는 안트라퀴논과 같은 화학요법제를 포함한다.In a preferred use of the method of the present invention, the subject is a human subject. The disease state may be caused by an ischemia / resuspension injury such as ischemia or stroke or organ transplantation infertility. Alternatively, the disease state can be cancer, and preferred embodiments in this case further comprise the administration of a medicament effective to increase the radical oxygen species at the cellular level. Such agents include radiation sensitizers, ionizing radiation, high-pressure oxygen environments, and chemotherapeutic agents such as anthracycline or anthraquinone that increase radical oxygen species at the cellular level.

암 치료를 위해서, 또한 방법은 세포 주기의 G2기로부터 M 기로의 진행 방해에 효과적인 약제의 투여를 포함한다. 이러한 약제는 포스포키나제 C (PKC) 억제제, 비스(클로로에틸)니트로소우레아(BCNU),펜톡시필린, 실리마린, 스타우로스포린, 페닐아히스틴, 파클리탁셀, 레티노산, 플라보피리돌, 메틸-2,5-디히드로신나메이트, 헤르복시디엔, 9-니트로캠프토테신, 마이토톡신, 아피게닌, 노코다졸, 및 콜세미드를 포함한다.For cancer treatment, the method also from the G 2 period of the cell cycle include administration of a drug effective to interfere with progression of the M phase. Such agents include, but are not limited to, phosphokinase C (PKC) inhibitors, bis (chloroethyl) nitroso urea (BCNU), pentoxifylline, silymarin, staurosporine, phenylaustine, paclitaxel, retinoic acid, 2,5-dihydrocinnamate, herboside diene, 9-nitrocamptothecin, mitotoxin, apigenin, nocodazole, and callide.

또 다른 측면에서, 본 발명은 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3' 로 확인되는 SEQ ID NO:1, 및 5'-CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC-3' 로 확인되는 SEQ ID NO:2 로 구성되는 군으로부터 선택된 염기 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 제공하고, 여기에서 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드,펩티드 핵산, 2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬 변형된 올리고뉴클레오티드, 및 N3'→ P5' 포스포르아미데이트 올리고뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 포스포로디아미데이트 골격 결합에 의해 연결된 모르폴리노 서브유닛을 포함하는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명은 또한 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3' 로 확인되는 SEQ ID NO:1, 및 5'-CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC-3' 로 확인되는 SEQ ID NO:2 로 구성되는 군으로부터 선택된 염기 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 제공하고 여기에서 올리고뉴클레오티드는 C-5-프로핀 피리미딘-변형된 올리고뉴클레오티드이다.In another aspect, the invention provides a 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3 'and a 5'-CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC-3' identified by SEQ ID NO: 2, wherein the oligonucleotide is selected from the group consisting of morpholino oligonucleotides, peptide nucleic acids, 2'-O-allyl or 2'-O-alkyl modified oligonucleotides, and oligonucleotides having a base sequence selected from the group consisting of N3 '- > P5 ' phosphoramidate oligonucleotides. In a preferred embodiment, the oligonucleotide is a morpholino oligonucleotide, preferably comprising a morpholino subunit linked by a phosphorodiamidate backbone linkage. The present invention also provides a 5'-TCA GTC TGA GTC AGG consisting of SEQ ID NO: 1 identified as AGG CCC-3 'and SEQ ID NO: 2 identified as 5'-CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC-3' Wherein the oligonucleotide is a C-5-propynopyrimidine-modified oligonucleotide.

본 발명의 목적들과 특징은 하기의 발명의 상세한 설명을 첨부한 도면과 결부하여 읽을 때 더욱 분명해 질 것이다.The objects and features of the present invention will become more apparent when the following detailed description of the present invention is read in conjunction with the accompanying drawings.

도면의 간단한 설명Brief Description of Drawings

도 1 은 포스포로디아미데이트-결합된 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 유사체의 구조를 보여주고; 그리고Figure 1 shows the structure of a phosphorodiamidate-linked morpholino oligonucleotide analog; And

도 2 는 부분적인 간절제술 및 각각 SEQ ID NOs 1 및 2 를 가진 안티센스 올리고뉴클레오티드 즉, 포스포로티오에이트(S-ODN,1mg/200g); C-5-P 변형된 포스포로티오에이트 (C-5-P, 0.1 mg/200g); 및 중성 골격(포스포로디아미데이트) 모르폴리노 올리고뉴클레오티드(3.4 mg/200g)의 투여 후 24 시간된 래트에서 잔유 재생 간의 습윤 중량(in gm)을 보여준다. 에러 바는 각 개개의 군을 식염수-처리한 대조군에 대한 p＜ 0.05 의 통계학적인 차이를 나타낸다.Figure 2 shows a partial hepatectomy and an antisense oligonucleotide with SEQ ID Nos. 1 and 2, namely phosphorothioate (S-ODN, 1 mg / 200 g); C-5-P modified phosphorothioate (C-5-P, 0.1 mg / 200 g); (In gm) between remnant regeneration in 24 hour-old rats following administration of a neutral skeleton (phosphodiamidate) morpholino oligonucleotide (3.4 mg / 200 g). Error bars represent a statistical difference of p < 0.05 for each individual group versus a saline-treated control.

본 발명은 p 53 의 유발을 특징으로 하는 질병 상태의 치료를 위한 안티센스 약제 및 방법에 관한 것이다. 이러한 상태는 암, 레스테노시스, 및 건선과 같은 증식성 세포 장애, 및 뇌졸증과 같은 국소빈혈 공격에 의해 유발된 저산소증 상태를포함한다.The invention relates to antisense agents and methods for the treatment of disease states characterized by the induction of p53. Such conditions include proliferative cell disorders such as cancer, restenosis, and psoriasis, and hypoxic conditions caused by ischemic attacks such as stroke.

참고문헌references

정의Justice

" 안티센스 올리고뉴클레오티드" 또는 "안티센스 약제" 는 골격에 의해 지지되는 퓨린 및 피리미딘 헤테로고리 염기 서열을 포함하며, 표적 핵산 서열내의 상응하는, 연속적인 염기와의 수소-결합에 효과적인 분자를 언급한다. 골격은 이러한 수소 결합을 허용하는 위치에서 퓨린 및 피리미딘 헤테로고리 염기를 지지하는 서브유닛 골격 부분을 포함한다. 이러한 골격 부분은 1 내지 3 원자 길이의 인 함유 결합으로 서로 연결된, 길이가 5 내지 7 원자인 고리 부분이다.&Quot; Antisense oligonucleotide " or " antisense agent " refers to a molecule that contains a purine and pyrimidine heterocyclic base sequence supported by a backbone and is effective for hydrogen-bonding with a corresponding, contiguous base in a target nucleic acid sequence. The backbone comprises a subunit backbone that supports the purine and pyrimidine heterocyclic bases at positions permitting such hydrogen bonding. These backbone moieties are ring moieties of 5 to 7 atoms in length, linked together by phosphorus containing linkages of 1 to 3 atoms in length.

"모르폴리노" 올리고뉴클레오티드는 (i) 구조는 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소가 인접 서브유닛의 5' 환외 탄소와 연결된 1 내지 3 원자 길이의 인-함유 결합으로 서로 연결되고, (ii) B 는 폴리뉴클레오티드의 염기와 염기-특이적 수소 결합으로 결합하기에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 부분인 도 1 에서 보여진 형태의 모르폴리노 서브유닛 구조로 구성된다. 도 1 은 포스포로디아미데이트 결합에 의해 연결된 이러한 두개의 서브유닛을 도해한다.(I) the structure is such that the morpholino nitrogen of one subunit is linked together by a phosphorus-containing linkage of 1 to 3 atoms long connected to the 5 'uncharged carbon of the adjacent subunit, (ii) the morpholino oligonucleotide ) B is composed of a morpholino subunit structure of the type shown in Figure 1, which is a purine or pyrimidine base pair moiety effective to bind with a base of a polynucleotide in a base-specific hydrogen bond. Figure 1 illustrates these two subunits linked by phosphorodiamidate linkages.

"N3'- P5' 포스포르아미데이트" 올리고뉴클레오티드는 2'-데옥시리보스의 3'-산소가 예를 들어, Gryaznovet al. 및 Chenet al에 기술된대로 3'-아민에 의해 치환된 것이다.The "N3'-P5'phosphoramidate" oligonucleotide is a 3'-oxygen of 2'-deoxyribose, for example as described in Gryaznov et al . And 3'-amine as described in Chen et al .

"2'-0 -알릴(또는 알킬)변형된 올리고뉴클레오티드"는 2' 히드록실이 알릴 또는 알킬 에테르로 전환된 올리고뉴클레오티드이다. 알킬 에테르는 전형적으로 메틸 에테르이다.A "2'-O-allyl (or alkyl) modified oligonucleotide" is an oligonucleotide in which the 2'hydroxyl is converted to an allyl or alkyl ether. Alkyl ethers are typically methyl ethers.

"C-5-프로핀 피리미딘-변형된 올리고뉴클레오티드"는 티미딘 염기의 C-5 메틸기 및/또는 시티딘 염기의 C-5 수소가 프로핀기에 의해 치환된 올리고뉴클레오티드이다.&Quot; C-5-Propynylpyrimidine-modified oligonucleotide " is an oligonucleotide in which the C-5 methyl group of the thymidine base and / or the C-5 hydrogen of the cytidine base is replaced by a propyne group.

"펩티드 핵산"에서, 올리고뉴클레오티드 골격의 데옥시리보스 인산염 단위는 폴리아미드 결합으로 치환된다. 예를 들어, Nielsenet al. 및 Hanveyet al. 에 기술된 대로, 적당한 공간을 차지하는 골격은 메틸렌카르보닐기에 의해 각 2-아미노기에 부착한 뉴클레오티드 염기를 가진 2-아미노에틸 글리신 단위의 사용에 의해 얻어진다.In " peptide nucleic acid ", the deoxyribose phosphate unit of the oligonucleotide backbone is replaced by a polyamide linkage. For example, Nielsen et al . And Hanvey et al . , The skeleton occupying an appropriate space is obtained by the use of a 2-aminoethylglycine unit having a nucleotide base attached to each 2-amino group by a methylene carbonyl group.

"RNase-불활성" 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 포스포로티오에이트와 같은 RNase-활성 올리고뉴클레오티드와 달리, RNase-독립적 기작에 의해 작용하는 것이다. 그들은 표적 RNA 형성, 핵세포질 수송 또는 번역을 입체적으로 차단하여 기능하는 것으로 믿어지고, 따라서 또한 "입체 차단제"로 언급된다. 이 종류에는 예를 들어, 메틸포스포네이트, 여기에 언급된 대로 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산(PNA's), 2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬 변형된 올리고뉴클레오티드, 및 N3'→P5' 포스포르아미데이트를 포함한다.An " RNase-inactive " oligonucleotide or oligonucleotide analogue, unlike an RNase-active oligonucleotide, such as a phosphorothioate, acts by an RNase-independent mechanism. They are believed to function by sterically blocking target RNA formation, nuclear cytoplasmic transport or translation, and are therefore also referred to as " stere blockers ". This class includes, for example, methylphosphonates, morpholino oligonucleotides, peptide nucleic acid (PNA's), 2'-O-allyl or 2'-O-alkyl modified oligonucleotides as mentioned herein, → P5 'phosphoramidate.

"p53 의 유발을 특징으로 하는" 상태는 감염된 세포에서 p53 의 수준 또는 발현이 비-질병 상태에 비하여 상대적으로 증가하는 질병상태이고/또는 때때로 다른 치료와 결합된 p53 발현의 억제가 유리한 치료적 효과를 가지는 상태이다. 예는 암, 뇌졸증의 결과인 국소빈혈, 심근경색증, 또는 간질성 경련, 및 결과적인 저산소증상태, 및 기관 이식에서 발생가능성이 있는 국소빈혈/재살포 상해이다." A condition characterized by the induction of p53 " is a disease state in which the level or expression of p53 is relatively increased in infected cells relative to the non-diseased state and / or the therapeutic effect of inhibiting p53 expression, . Examples are ischemia / ischemic injury, which is the result of cancer, myocardial infarction, or interstitial seizure, and the resulting hypoxic condition, which is the result of cancer, and organ transplantation.

약어:Abbreviation:

ON = 올리고뉴클레오티드ON = oligonucleotide

ODN = 올리고데옥시리보뉴클레오티드ODN = oligodeoxyribonucleotide

S-ODN = 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드S-ODN = phosphorothioate oligonucleotide

C-5-P = C-5-프로핀 피리미딘-변형된 올리고뉴클레오티드C-5-P = C-5-propynylpyrimidine-modified oligonucleotide

II.안티센스 올리고뉴클레오티드 II. Antisense oligonucleotides

A.서열 A. Sequence

본 발명의 안티센스 약제는 표적 RNA 서열과의 혼성화를 위한 뉴클레오티드염기를 제공하는 뉴클레오티드간 골격 결합에 의해 연결된 뉴클레오티드 서브유닛을 포함한다. 이러한 안티센스 약제의 염기 서열은 p53 mRNA 부분에 상보적(안티센스)이다. SEQ ID NO:1에 상응하는 제 1 의 염기서열은 래트 p53 mRNA 의 독특한 부분(잔기 1182 내지 1199; Genbank accession # X13058)에 상보적이고 여기에서 p53T 로 언급된다. 이 서열은 래트, 마우스, 원숭이 , 및 인간 mRNA 에서 동일하고, 따라서, 동물 모델에서 생체내 시험에 이상적으로 적합하다.The antisense agents of the present invention comprise a nucleotide subunit linked by an internucleotide backbone linkage to provide a nucleotide base for hybridization with a target RNA sequence. The nucleotide sequence of these antisense agents is complementary (antisense) to the p53 mRNA region. The first base sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 is complementary to a unique portion of rat p53 mRNA (residues 1182 to 1199; Genbank accession # X13058) and is referred to herein as p53T. This sequence is identical in rat, mouse, monkey, and human mRNA and is therefore ideally suited for in vivo testing in animal models.

OL(1)p53으로 명명된 SEQ ID NO:2 에 상응하는 제 2 의 서열은 인간 p53 에 대한 안티센스이고 따라서, 인간에서 p53의 발현을 억제하기에 효과적이다. (Iverson ,U.S.Pantent No.5,641,754). 이 서열은 래트 서열과 4 개의 미스매치 (mismatch)를 가지기 때문에, 래트에서 p53의 발현을 변형시키지 않고 따라서, 래트 모델 연구에서 유용한 대조군이다.The second sequence corresponding to SEQ ID NO: 2, named OL (1) p53, is an antisense to human p53 and thus is effective in inhibiting the expression of p53 in humans. (Iverson, U.S. Patent No. 5,641,754). Since this sequence has a rat sequence and four mismatches, it does not alter the expression of p53 in rats and is therefore a useful control in rat model studies.

B.올리고뉴클레오티드 구조 B. Oligonucleotide Structure

당업계에서 공지된 다양한 올리고뉴클레오티드 유사체는 안정성, 특히 뉴클레아제 내성, 비-특이적 결합의 감소, 및 생체이용율(즉, 세포에의 접근)과 같은 영역에서 "천연" 폴리뉴클레오티드보다 잇점을 제공한다. 이 구조는 골격, 당 부분, 또는 염기 그 자체에서 변형될 수 있다. 이러한 유사체는 예를 들어, 포스포로티오에이트(여기에 S-ODN으로 명명됨), 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, C-5-프로핀 피리미딘-변형된 올리고뉴클레오티드(C-5-P), 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA's),2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬 변형된 올리고뉴클레오티드, 및 N3'→P5' 포스포르아미데이트이다.A variety of oligonucleotide analogs known in the art provide advantages over " natural " polynucleotides in regions such as stability, particularly nuclease resistance, reduced non-specific binding, and bioavailability do. This structure can be modified in the framework, sugar moiety, or base itself. Such analogs include, for example, phosphorothioates (termed S-ODN), methylphosphonates, phosphotriesters, C-5-propynopyrimidine-modified oligonucleotides ), Morpholino oligonucleotides, peptide nucleic acid (PNA's), 2'-O-allyl or 2'-O-alkyl modified oligonucleotides, and N3 '→ P5' phosphoramidate.

이러한 안티센스 약제의 조제물은 당업계에서 잘 알려져있고, 종종 자동화된 합성기에서 용이하게 수행된다. S-ODN, C-5-P, 및 비전하 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오티드의 합성에 관한 일반적인 절차가 실시예 1 에서 보여진다.Preparations of such antisense agents are well known in the art and are often easily performed in automated synthesizers. A general procedure for the synthesis of S-ODN, C-5-P, and non-hypomorpholino antisense oligonucleotides is shown in Example 1.

2 개의 일반적인 기작이 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 발현 억제를 설명하기 위해 제시되었다.(예를 들어, Agrawal; Bonham; Boudvillain; 및 여기에 언급된 참고문헌을 참조) 제 1 의 기작은, 올리고뉴클레오티드 및 mRNA 사이에 형성된 헤테로듀플렉스가 RNaseH 에 대한 기질로서 작용하여 mRNA 의 절단을 유발한다. 이 종류에 속하는, 또한 속하도록 제안된 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 및 포스포디에스테르(즉, 변형되지 않은 "천연" 올리고뉴클레오티드)를 포함한다. 이러한 화합물은 일반적으로 높은 활성을 나타내고, 포스포로티오에이트는 통상적으로 안티센스 이용에 가장 넓게 이용되는 올리고뉴클레오티드이다. 그러나, 이러한 화합물은 세포 단백질과의 비-특이적 결합(Gee)뿐만 아니라 비-표적 RNA 이형체의 부적당한 RNase 절단(Giles)으로 인한 바람직하지않은 부작용을 일으키는 경향이 있다.Two common mechanisms have been proposed to explain the inhibition of expression by antisense oligonucleotides (see, for example, Agrawal; Bonham; Boudvillain; and references cited therein). The first mechanism is that oligonucleotides and mRNA Lt; RTI ID = 0.0 > RNaseH < / RTI > to cause cleavage of mRNA. Oligonucleotides which belong to this class and which are proposed to belong also include phosphorothioates, phosphotriesters, and phosphodiester (i.e., unmodified "natural" oligonucleotides). Such compounds generally exhibit high activity, and phosphorothioates are the most widely used oligonucleotides for antisense use. However, such compounds tend to cause non-specific binding (Gee) with cellular proteins as well as undesirable side effects due to inadequate RNase cleavage (Giles) of non-target RNA variants.

"입체 차단제" 또는, 대안적으로, "RNase 불활성" 또는 "RNase 내성" 으로 언급된 올리고뉴클레오티드 유사체의 제 2 의 종류는 RNase H 를 활성화시키는 것이 관찰되지 않고, 표적 RNA 형성, 핵세포질 송달 또는 번역을 입체적으로 차단하여 작용하는 것으로 믿어진다. 이 종류는 메틸포스포네이트(Toulme)뿐만 아니라 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산(PNA's), 2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬 변형된 올리고뉴클레오티드(Bonham), 및 N3'→P5' 포스포르아미데이트(Gee)를 포함한다. 그들은 AUG 개시 코돈, 5'-스플라이스(splice) 위치, 또는 mRNA 의 5'-비번역 부위에 표적화될 때 가장 효과적인 것으로 보고된다. 지금까지, 암호화 부위의 다운스트림(downstream)에 표적화될 때, 그들은 상대적으로 낮거나(Bonham), 더욱 빈번하게는 어떠한 활성도 보이지 않았다. (예를 들어, 메틸포스포네이트에 대한 Toulme; PNA's 에 대한 Gambacorti; 이중가닥 형성 PNA's 에 대한 Knudsen; 및 PNS's 및 N3' →P5' 포스포르아미데이트에 대한 Gee 참조). 암호화 부위로 지시될 때, ON's 에 의해 형성된 혼성체는 번역동안 리보솜 복합체의 풀림 작용에 의해 대체되는 것을 피할 수 있을만큼 충분히 안정적이지는 않다는 것이 제안되어왔다. (Boudvillain,Gee) 이 문제를 풀기 위한 하나의 접근으로 ON 을 그것의 표적 서열에 공유결합으로 연결 또는 삽입해왔다.(Gee,Johansson). 그러나, 이러한 변형없이는, ON's 의 입체 차단의 활성은 일반적으로 상기에 언급된 개시 부위에 제한되어왔다.A second class of oligonucleotide analogues referred to as " steric hindrance agents " or alternatively, " RNase inactive " or " RNase resistant " By acting as a three-dimensional block. This class includes methylphosphonates (Toulme) as well as morpholino oligonucleotides, peptide nucleic acid (PNA's), 2'-O-allyl or 2'-O-alkyl modified oligonucleotides (Bonham) 'Phosphoramidate (Gee). They are reported to be most effective when targeted to the AUG initiation codon, 5'-splice site, or 5'-untranslated region of mRNA. So far, when targeted at the downstream of the coding site, they were relatively low (Bonham), and did not show any activity more frequently. (See, for example, Toulme for methylphosphonate; Gambacorti for PNA's; Knudsen for double-stranded PNA's; and Gee for PNS's and N3 '? P5' phosphoramidates). It has been suggested that when directed to the coding site, the hybrid formed by ON's is not stable enough to avoid being displaced by the loosening action of the ribosome complex during translation. (Boudvillain, Gee) has linked or inserted ON into its target sequence as a covalent bond (Gee, Johansson) as an approach to solving the problem. Without this modification, however, the activity of stereoselective blocking of ON's has generally been limited to the above-mentioned initiation sites.

III.증식하는 세포에 p53 의 유발 및 안티센스 p53 에 의한 억제 III. Induction of p53 in proliferating cells and inhibition by antisense p53

이전에 발표된 논문에서 (Arora, 1998), 상기에 기술된 안티센스 약제 p53T 및 ON(1)p53 은 실시예 2 에 기술된 대로, 부분적인 간절제수술후 직시 래트에 투여되었다. 재생 래트 간은 천연 조직 환경에서 성장 조절 및 세포 증식의 기작을 연구하기에 훌륭한 생체내 모델 시스템이다. 재생 간에서 빠르게 증식하는 세포는 세포주기 사이에 DNA 수복을 위해 최소한의 시간만이 이용가능하므로 가장 암화되기 쉽다.(Grisham,1983). 상기에 언급된 대로, ON(1)p53 은 래트에서 p53 발현을 변형하지 않고, 대조군으로 사용되었다.In the previously published paper (Arora, 1998), the antisense agents p53T and ON (1) p53 described above were administered to the immediate-onset rats after partial hepatectomy, as described in Example 2. [ Regenerating rat liver is a good in vivo model system for studying the mechanisms of growth regulation and cell proliferation in natural tissue environments. Cells that proliferate rapidly in regeneration are the most likely to become cancerous (Grisham, 1983) because they are available only for a minimum of time to restore DNA between cell cycles. As mentioned above, ON (1) p53 did not alter p53 expression in rats and was used as a control.

PH (post-hepatectomy) 래트내에 재생 과정 동안 p53 의 대량 유발가 관찰되었다. 안티센스 ON 투여에 따른 결과 즉, 재생간의 중량 증가; p53 ,PCNA, p21 및 NADPH 수준; 분리된 세포의 DNA 함량 ; 마이크로솜 단백질 함량; 다양한 마이크로솜 효소 분석법; 지질 과산화에 의한 증거로서 산화 스트레스; 및 유사분열 지표가 측정되었다.In the post-hepatectomy (PH) rats, a large amount of p53 was observed during the regeneration process. The result of antisense ON administration, i.e., the weight gain between regeneration; p53, PCNA, p21 and NADPH levels; DNA content of isolated cells; Microsomal protein content; Various microsomal enzyme assays; Oxidative stress as evidence of lipid peroxidation; And mitotic index were measured.

안티센스 p53T(SEQ ID NO:1)으로 처리될 때, 중량 증가(대조군과 상대적임), 유사분열지표 및 세포 증식의 정확한 마커인 PCNA 발현(Assy,1998), 및 G1세포 군의 5-배 감소에 의한 증거대로, 간은 그들의 G1-S 세포 주기 체크포인트 활성을 잃는다. p53T - 처리된 PH 래트 간은 또한 많은 다핵세포를 나타낸다. 효소 분석법에 의해 결정된대로, 재생 간의 기능적인 수복은 p53 억제에 의해 역시 증가되었다.PCNA expression (Assy, 1998), which is an accurate marker of mitosis index and cell proliferation (Assy, 1998), and the 5-fold increase in G 1 cell population when treated with antisense p53T (SEQ ID NO: As evidenced by the reduction, the liver loses their G 1 -S cell cycle checkpoint activity. The p53T-treated PH rat liver also represents many polynuclear cells. As determined by enzyme assay, functional restoration between regeneration was also increased by p53 inhibition.

요약적으로, 데이타는 p53 발현은 안티센스 p53T (SEQ ID NO:1) 처리된 간절제수술후 래트의 재생 간에서 억제된다는 것과, 이러한 억제는 증가된 유사분열, 증가된 PCNA 발현, 및 세포 주기의 G1기에서 감소된 세포 수를 야기한다는 것을 보여주었다. 결과는 p53 의 G1-S 세포 주기 체크포인트 활성과 일치한다.In summary, the data indicate that p53 expression is suppressed in the regenerating liver of rats after antisense p53T (SEQ ID NO: 1) treated hepatectomy, and that such inhibition is associated with increased mitosis, increased PCNA expression, 1 cells in the first cycle. The results are consistent with the G 1 -S cell cycle checkpoint activity of p53.

IV.S-ODN,C-5-P, 및 모르폴리노 안티센스 약제의 비교 결과 IV. Comparison results of S-ODN, C-5-P, and morpholino antisense drugs

SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2 로 주어진 염기 서열을 가진 중성-골격 모르폴리노 안티센스 약제를 실시예 1 에 기술된대로 준비했다. 이러한 모르폴리노 올리고머는 RNA 표적에 높은 결합 친화성을 나타냈고, 비전하 골격은 세포에의 흡수에 유리하고 포스포로티오에이트와 같은 전하 유사체와 비교하여 비-특이적 결합 상호작용이 감소한다. 또한 상응하는 C-5-프로핀 시토신 변형된 (C-5-P) 포스포로티오에이트가 준비되었다. 상기에 논의된 대로, 모르폴리노 유사체는 "입체 차단제" 로서 작용하는 것으로 여겨진다. 일반적으로 포스포로티오에이트에 속하는 C-5-P 포스포로티오에이트는 RNase-H 의존 기작(Wagner)에 의해 작용하는 것으로 보고된다.A neutral-skeletal morpholino antisense drug with the nucleotide sequence given in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 was prepared as described in Example 1. [ These morpholino oligomers exhibit high binding affinity to RNA targets, and the non-charged subunit is advantageous for absorption into cells and reduces non-specific binding interactions as compared to charge analogues such as phosphorothioates. The corresponding C-5-propyne cytosine modified (C-5-P) phosphorothioate was also prepared. As discussed above, the morpholino analogs are believed to act as " steric hindrance " agents. It is generally reported that C-5-P phosphorothioate belonging to phosphorothioate acts by the RNase-H dependent mechanism (Wagner).

단락 III 및 실시예 2 에 기술된 대로 PH 후 24 시간 경과된 잔유 재생 간의 습윤 중량 증가에 관하여, 안티센스 약제의 복강내 투여의 결과가 비변형 포스포로티오에이트(S-ODNs)의 결과와 비교되었다. 도 2 에서 보여지는 데이타는 p53T 서열이 시험된 대안적인 유사체, 및 시험된 투여량에서 대안적 유사체를 가지고 불활성(기대된 대로임)으로 남아있는 OL(1)p53 서열 모두에 대해 간 재생 모델에서 활성이 있는 것을 보여준다.With respect to wet weight gain between residual regeneration after 24 hours after PH as described in paragraph III and Example 2, the results of intraperitoneal administration of antisense agents were compared with those of unmodified phosphorothioate (S-ODNs) . The data shown in FIG. 2 show that the p53T sequence is an alternative analogue tested, and that for both OL (1) p53 sequences that remain inactive (as expected) with alternative analogs at the tested doses, Lt; / RTI >

S-ODN p53T 의 1mg/200gm 투여량과 유사한 효험이 100㎍/200gm 의 C-5-P 변형된 S-ODN 및 50 nM/200 gm (대략 3.7 mg/200g)의 모르폴리노 안티-p53T 올리고뉴클레오티드(SEQ ID NO:1을 가짐)로 관찰되었다. 모르폴리노 안티센스 올리고머가 5'-비번역 부위 또는 ANG 개시 코돈보다는 유전자의 암호화 부위의 엑손 10 에 표적화될 때 활성이 있다는 것은 특히 가치있다. 상기에 언급된 대로, "입체 차단제" 안티센스 약제는 일반적으로 AUG 번역 개시 시점으로부터 다운스트림에 표적화 될 때 중요한 활성을 나타내지 않았다. 이 암호화 서열은 안티센스 ON 결합에 특히 유리하여 입체적으로 번역을 차단할 많큼 안정한 이중가닥을 형성한다. 게다가, 상기에 언급된 대로, 모르폴리노 올리고머는 RNA-결합 분자에 특히 효과적인 것이 증명되었다. 발명이 특정 기작에 국한되지 않는한, RNA 헬릭스는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드의 결합에 의해 변형되고, 이 변형은 리보솜의 결합을 방해한다는 것이 예상된다.Similar efficacy to the 1 mg / 200 gm dose of S-ODN p53T was achieved with 100 ug / 200 gm C-5-P modified S-ODN and 50 nM / 200 gm (approximately 3.7 mg / 200 g) morpholino anti- Nucleotide (with SEQ ID NO: 1). It is particularly valuable that the morpholino antisense oligomer is active when it is targeted to the exon 10 of the coding region of the gene rather than the 5'-untranslated region or the ANG initiation codon. As mentioned above, the " stereospermic " antisense agents generally did not show significant activity when targeted downstream from the AUG translation initiation time point. This coding sequence is particularly advantageous for antisense ON binding to form a double strand that is more stable to sterically block translation. In addition, as mentioned above, morpholino oligomers have proven to be particularly effective for RNA-binding molecules. Unless the invention is limited to a particular mechanism, it is expected that RNA helices are modified by the binding of the morpholino oligonucleotides, and this modification interferes with the binding of ribosomes.

본 발명을 뒷받침하기 위한 연구는 C-5-P 프로핀 변형된 ODN 의 프로핀기가 RNA 이중가닥의 메이저 그루브(groove)내로 돌출되어 또한 입체적으로 리보솜 결합을 방해할 수 있다는 것을 제안했다. 따라서, 프로핀기의 t-부틸과 같은 다른 전자 구조를 가지는 기를 포함하는 다른 입체적으로 부피가 큰 기로의 치환은 유사한 억제 효과를 나타낼 수 있다.Studies to support the present invention suggest that the propyne group of the C-5-P proline modified ODN may protrude into the major groove of the RNA double strand and may interfere with ribosome binding sterically. Thus, substitution with other sterically bulky groups, including groups with other electronic structures such as t-butyl of the propyne group, may exhibit similar inhibitory effects.

V.치료법 V. Therapy

본 발명은 p53 유발을 특징으로 하고, p53 의 억제가 치료적인 잇점을 나타내는 세포에서 특히 p53 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 p53 유발을 특징으로하는 질병 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 에 상응하는 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 이러한 상태를 가지는 대상, 또는 이러한 대상으로부터 수집된 세포로의 투여를 포함한다. 바람직하게는, 대상은 인간 대상이다. (상기에 언급된 대로, SEQ ID NO:2 는 래트 모델에는 효과적이지 않다.) 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산, 2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬 변형된 올리고뉴클레오티드, N3'→P5' 포스포르아미데이트 올리고뉴클레오티드, 또는 C-5-프로핀 피리미딘-변형된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드이다. 모르폴리노 올리고뉴클레오티드는 특히 양 서열에 바람직하다. C-5-P 변형된 모르폴리노 올리고뉴클레오티드가 또한 기대된다.The invention features p53 induction and provides a method of inhibiting p53 expression, particularly in cells where inhibition of p53 shows therapeutic benefit. The methods of the invention can be used to treat disease states characterized by p53 induction. The method of the present invention comprises administration of an oligonucleotide having a sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 to a subject having such a condition, or to a cell collected from such subject. Preferably, the subject is a human subject. (As noted above, SEQ ID NO: 2 is not effective for rat models.) Oligonucleotides are preferably selected from the group consisting of morpholino oligonucleotides, peptide nucleic acids, 2'-O-allyl or 2'- N3 ' to P5 ' phosphoramidate oligonucleotides, or C5-propynylpyrimidine-modified phosphorothioate oligonucleotides. Morpholino oligonucleotides are particularly preferred for both sequences. C-5-P modified morpholino oligonucleotides are also expected.

본 명세서에서 보여지고 Arora ,1998 에 보고된 데이타에서 증명된대로, 항(anti)-p53 ON 은 간절제술 후의 래트에서 p53 의 발현을 억제한다. 모르폴리노 및 C-5-P ON's 가 재생 간의 중량 증가에 의해 결정된 대로 동량의 비변형 포스포로티오에이트(S-ODN)보다 더욱 효과적임이 밝혀졌다. 모르폴리노 올리고머가 RNAse-불활성("입체 차단제") 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 종래의 표적인 AUG 개시 부위에서 상당히 다운스트림인 암호화 부위(엑손10)에 표적화된 점을 고려하면 이외로 효과적이다.As demonstrated in the data presented here and in the data reported in Arora, 1998, anti (anti) -p53 ON inhibits the expression of p53 in rats following liver resection. Morpholino and C-5-P ON's were found to be more effective than equivalent amounts of unmodified phosphorothioate (S-ODN) as determined by weight gain between regeneration. Other than considering the fact that the morpholino oligomer is targeted to the coding region (exon 10) which is considerably downstream at the AUG initiation site which is a conventional target for RNAse-inactive (" steric hindrance ") antisense oligonucleotides.

A.항-증식적인 치료법 A. Anti-proliferative therapy

상기에 언급된 대로, p53 발현의 유발은 다양한 DNA -손상 약제에 노출된 세포에서 관찰된다. 손상된 DNA 는 대부분 일반적으로 비계획적인 DNA 합성에 의해 수복된다. 이러한 수복은 일반적으로 S (합성) 기에 선행하는 세포주기의 G1기동안에 발생한다. 그러나, 만약 변형된 DNA 염기가 수복되지 않고 남아 있다면 (G1-S 세포 주기 체크포인트의 배제로 미성숙한채로 세포를 S 기로 보냄), 결과는 손상된 DNA 뉴클레오티드 염기 주형의 잘못된 복제로 인한 돌연변이화, 및 /또는 세포의 손상된 DNA 위치를 지나 그것의 게놈 복제불능으로 인한 세포 사멸을 포함할 수 있다.As mentioned above, the induction of p53 expression is observed in cells exposed to various DNA-damaging agents. Damaged DNA is mostly restored by generally unplanned DNA synthesis. This restoration usually occurs within the G 1 sequence of the cell cycle preceding the S (synthesis) phase. However, if the altered DNA base remains untreated (cells immortalized to the S phase with the exclusion of the G 1 -S cell cycle checkpoint), the result is mutation due to incorrect replication of the damaged DNA nucleotide base template, And / or cell death due to its genomic cloning ability past the damaged DNA location of the cell.

p53 의 발현 억제는 이 세포 주기 체크포인트를 억제하고 따라서, 선택적으로 DNA-손상된 세포를 죽이는데 사용될 수 있다. 서열 OL(1)p53(SEQ ID NO:2)을 가진 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 투여는 인간 간 세포에서생체외 및 생체내에서 아포토시스를 생산했다는 것이 U.S. 특허번호 5,641,764 (Iverson)에 개시되었다. 효과는 세포를 증가된 세포내 순 반응성 산소 함유량이 증가된 조건에 노출하는 것에 의해 증가되었다. 정상적인 조직은 암 세포보다 산소 스캐빈저 활성이 더 크기 때문에 이러한 처리는 정상적인 조직에는 효과가 거의 없거나 역효과가 없었다. 예를 들어, 일반적으로 SOD, 카탈라제, 또는 글루타티온 퍼옥시다제와 같은 하나 이상의 효소를 포함하는 대부분의 세포는 빠르게 산소종과 결합하고 과도한 반응성 산소종을 불활성화시킨다. 상기에 기술된 대로, p53 의 억제에 의한 G1-S 체크포인트의 억제는 손상된 DNA 의 수복을 방해하여 돌연변이화 및 세포 사멸을 유발하는 것으로 여겨진다.Inhibition of p53 expression inhibits this cell cycle checkpoint and thus can be used to selectively kill DNA-damaged cells. Administration of antisense phosphorothioate oligonucleotides with the sequence OL (1) p53 (SEQ ID NO: 2) has been described in US Pat. No. 5,641,764 (Iverson) to produce apoptosis in vitro and in vivo in human liver cells . The effect was increased by exposing the cells to conditions with increased intracellular net reactive oxygen content. Since normal tissue has a greater oxygen scavenger activity than cancer cells, this treatment has little or no adverse effect on normal tissues. For example, most cells that contain one or more enzymes, such as SOD, catalase, or glutathione peroxidase, rapidly bind to oxygen species and inactivate excess reactive oxygen species. As described above, it is believed that inhibition of G 1 -S checkpoint by inhibition of p53 interferes with repair of damaged DNA, leading to mutagenesis and apoptosis.

따라서, 본 발명의 특히 암세포에 유용한 바람직한 방법에서, ON 은 세포독성으로 유발된 라디칼 산소를 증가할 수 있는 약제와 결합하여 투여된다. 올리고뉴클레오티드 및 약제는 우선 투여된 어떤 치료 약제와 실제로 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 그러나, 최상의 결과는 치료적인 혈액 수준이 획득되도록 허용하는 올리고뉴클레오티드가 미리 충분하게 투여될 때 얻어진다.Thus, in a preferred method, particularly useful in cancer cells of the present invention, the ON is administered in combination with a medicament capable of increasing cytoxicity-induced radical oxygen. The oligonucleotides and agents may be administered, in fact, either simultaneously or sequentially with any therapeutic agent administered first. However, the best results are obtained when oligonucleotides that allow therapeutic blood levels to be obtained are administered sufficiently beforehand.

증가된 라디칼 산소 수준은 예를 들어, 방사선 또는 안트라사이클린 세포독성 항체 (e.g.,독소루비신)와 같은 세포독성으로 유발된 라디칼 산소를 포획할 수 있는 약제, BCNU, BSO (뷰티오닌 술폭스아민), 과산화수소, 또는 SOD의 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제제(슈퍼옥사이드 디스뮤타제), 카탈라제, GSH 합성효소, GSH 환원제, 또는 GSH 퍼록시다제에 대한 세포 노출로 생산된다.Increased levels of radical oxygen include, for example, agents capable of capturing cytotoxic-induced radical oxygen such as radiation or anthracycline cytotoxic antibodies (eg, doxorubicin), BCNU, BSO (boutionin sulfoxamine), hydrogen peroxide , Or antisense oligonucleotide inhibitors of SOD (superoxide dismutase), catalase, GSH synthase, GSH reductase, or GSH peroxidase.

세포독성으로 유발된 라디칼 산소를 포획할 수 있는 약제는 예를 들어, 방사선 증감제, 라디칼 산소를 생산하는 화학치료 약제, 또는 히드록시 라디칼 형성을 야기하는 숙주 세포와 상호작용 할 수 있는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. (예를 들어, 여기에 참고로서 수록된 문헌명 " 올리고뉴클레오티드와 세포 결합에 의해 유발된 돌연변이화의 억제" 1991 년 7 월 25 일 접수된 Iversen, U.S. Ser.No. 07/735,067 참조). 환자의 표적 세포에 대해 하나 이상의 증감제에 의해 증가될 수 있는 치명적인 효과를 가지는 많은 세포독성 약제가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 방사선(방사선 치료가 내부적으로 송달되거나 또는 외부 수단에 의해 투여됨) 및 세포독성 약제가 포함된다. 많은 이러한 약제의 어떤 예는 L-페닐알라닌 니트로겐 머스타드(멜파란)와 같은 니트로겐 머스타드, 다우노루비신 및 독소루비신 (doxorubicin)과 같은 안트라사이크린 화학치료제, 및 시스-디아미노디클로로 플라티늄(시스-플라틴)과 같은 백금 화합물이다.Agents capable of capturing cytotoxically induced radical oxygen include, for example, radiation sensitizers, chemotherapeutic agents that produce radical oxygen, or oligonucleotides capable of interacting with host cells causing hydroxy radical formation . (See, for example, Iversen, U.S. Ser. No. 07 / 735,067, filed July 25, 1991, entitled " Inhibition of Mutagenesis Induced by Cell Binding to Oligonucleotides, " Many cytotoxic agents that have a lethal effect that can be increased by one or more sensitizers on the target cells of a patient can be used in the methods of the invention. Radiation (radiation therapy is administered internally or by external means) and cytotoxic agents. Some examples of many such agents include anthracycline chemotherapeutic agents such as Nitrogen mustard, daunorubicin and doxorubicin, such as L-phenylalanine Nitrogen mustard (Melparan), and cis-diaminodichloro platinum Latin).

내부적으로 송달된 방사선은 환자에 주입된 치료적으로 유용한 방사성동위원소를 포함한다. 이러한 방사성동위원소는 방사성 핵종 금속186Re,188Re,64Cu ,67Cu,109Pd,212Bi,203Pb,212Pb,211At,97Ru,105Rh,198Au,199Ag,131I 를 포함하나,여기에 한정된 것은 아니다. 이러한 방사성동위원소는 환자에게 투여될 때, 일반적으로 담체 분자(예를 들어, 킬레이트-항체 결합체의 형태)와 결합할 것이다. 내부적으로 송달된 방사선치료약제의 예는 예를 들어, EP 공개 번호. 188,256 에 기술된 대로 항체에 결합한 금속 방사성 핵종 킬레이트이다. 외부적 수단에 의해 투여된 방사선은 코발트 치료와 같은 외부 빔(beam) 방사선이다.Internally delivered radiation includes therapeutically useful radioisotopes injected into a patient. These radioisotopes are radioisotope metals186Re,188Re,64Cu ,67Cu,109Pd,212Bi,203Pb,212Pb,211At,97Ru,105Rh,198Au,199Ag,131I, but are not limited thereto. Such a radioisotope, when administered to a patient, will generally bind to a carrier molecule (e.g., in the form of a chelate-antibody conjugate). Examples of internally delivered radiotherapeutic agents are described, for example, in EP Publication No. < RTI ID = 0.0 > 188,256. ≪ / RTI > Radiation administered by external means is external beam radiation, such as cobalt therapy.

증감제의 선택은 치료될 특정 형태의 종양 및 투여될 세포독성 약제와 같은 요인에 의존한다. 바람직하게는, 화합물은 암 세포와 같은 생체내의 어떤 표적 위치에 대해 선택적이다. 예를 들어, U.S. 특허 번호, 4,628,047 은 독소루비신과 같은 세포독성 약제에 대한 다양한 형태의 암세포의 감도를 증가시키는 딜티아젬의 사용을 보고한다. 세포독성 약제와 증감제의 다른 결합뿐만 아니라 이러한 약제에 의한 치료에 대한 암세포의 서로 다른 형태의 감도에 있어서의 기대된 차이가종양학에서의 중요한 진전에 논의된다. (DeVitaet al., editiors, J.B. Lippincott Co.,Philadelphia (1986),pp.145-157)The choice of sensitiser depends on such factors as the particular type of tumor to be treated and the cytotoxic agent to be administered. Preferably, the compound is selective for any target location in the body, such as a cancer cell. For example, US Patent No. 4,628,047 reports the use of diltiazem to increase the sensitivity of various forms of cancer cells to cytotoxic agents such as doxorubicin. The expected differences in sensitivity of different types of cancer cells to treatment with these agents, as well as other combinations of cytotoxic agents and sensitizers, are discussed in important advances in oncology . (DeVita et al ., Editiors, JB Lippincott Co., Philadelphia (1986), pp. 145-157)

바람직한 증감제는 γ-글루타밀시스테인 합성효소를 억제하는 합성 아미노산인 BSO(뷰티오닌 술폭스아민, Chemical Dynamics Corporation, South Plainfield, N.J.)이고, 세포에서 글루타티온(GSH)의 눈에 띄는 감소를 유발한다. 따라서, BSO 는 세포의 글루타티온 수준의 감소로 향상된 세포독성 효과를 가진 약제에 대한 증감제로서 작용하는 것으로 생각된다. 세포내에서 글루타티온을 완전히 제거하는 BSO 의 S-이성질체가 특히 바람직하다. (U.S. 특허 번호 5,171,885 및 5,245,077 참조)A preferred sensitizer is a synthetic amino acid, BSO (butionon sulfoxamine, Chemical Dynamics Corporation, South Plainfield, NJ), which inhibits the gamma -glutamylcysteine synthase, resulting in a noticeable decrease in glutathione (GSH) . Thus, it is believed that BSO acts as a sensitizer for drugs with improved cytotoxic effects due to a decrease in glutathione levels in the cells. The S-isomer of BSO which completely removes glutathione in the cell is particularly preferred. (See U.S. Patent Nos. 5,171,885 and 5,245,077)

증감제 및 세포독성제의 추가적인 결합은 바람직한 표적 세포(예를 들어, 특정 암 세포 라인)에 상응하는 배양 세포를 사용한 시험관내 분석법과 같은 방법을 통해 확인될 수 있다. 예를 들어, Russoet al.은 BSO 가 특정 형태의 세포 라인에서 클루타티온 합성효소 수준을 낮추는데 효과적인지를 결정하기 위한 분석법을 개시한다.Additional combinations of sensitizers and cytotoxic agents may be identified by methods such as in vitro assays using cultured cells corresponding to the desired target cells (e.g., specific cancer cell lines). For example, Russo et al. Discloses an assay for determining whether BSO is effective in lowering the level of clathathione synthetase in certain types of cell lines.

라디칼 산소 생성 종의 상기 논의에서, 세포독성제 및 증감제는 우선적으로 바람직한 대상 세포, 즉, p53 발현을 특징으로하는 암 세포로 방향지워진다. 이러한 암은 방광암, 뇌암, 유방암, 경부암, 결장암, 식도암, 후두암, 간암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 위암 및 갑상선암을 포함한다.In the above discussion of radical oxygen producing species, the cytotoxic agent and sensitizer are directed to a preferred target cell, i. E., A cancer cell characterized by p53 expression. Such cancers include bladder cancer, brain cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, esophageal cancer, laryngeal cancer, liver cancer, lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, skin cancer, stomach cancer and thyroid cancer.

다른 바람직한 방법에서, 안티센스 ON 의 투여는 세포 주기의 G2기에서 M(유사분열)기로의 진행을 방해하는데 효과적인 약제의 투여를 수반한다. 이러한 약제는 예를 들어, 펜톡시필린(Russell,1996),실리마린(Ahmad,1998), 스타우로스포린 (Swe,1997), 페닐아히스틴 (Kanoh,1997), 파크릴탁셀 (Shu,1997), 레티노산 (Zhu, 1997),플라보피리돌(Sedlacek,1996), 메틸-2,5-디히드로신나메이트(Koch,1996),헤르복시딘(Horiguchi,1996),9-니트로캠프토테신(Khooustov,1995),마이토톡신(VanDolah,1996), 아피게닌(Sato,1994), 노코다졸, 및 콜세미드(Zhang,1998)를 포함한다. 최근의 보고(Cross,1995)는 p53 은 세포주기의 유사분열(M)기 동안에 방추 장치의 조합을 완성하도록 보장하는 방추 체크포인트의 도구라는 것을 제안했다. 본 발명을 뒷받침하기 위한 연구에서, p21-결핍 마우스를 상기에 목록화된 것과 같은 G2- M 억제제로 처리할때 감염된 세포에서 높은 정도의 이수배수체를 보였다. 억제제는 세포가 유사분열기를 통해 정상적인 진행을 하는 것과 유사분열(및 G1-S 기)체크포인트의 결핍을 방지하고, 연속적인 합성(S)기를 수행한 세포가 결과적으로 이수배수체를 생산하는 것으로 가정된다. p53 은 p21 의 전사 활성에 필요하기 때문에,p53 이 본 발명의 안티센스 약제에 의해 억제된 세포가 유사한 결과를 보인다.In another preferred method, the administration of antisense ON involves the administration of a medicament that is effective in inhibiting the progression of the cell cycle from the G 2 phase to the M (mitotic) phase. Such agents include, for example, pentoxifylline (Russell, 1996), silymarin (Ahmad, 1998), staurosporine (Swe, 1997), phenylaustine (Kanoh, 1997), paclitaxel (Koch, 1996), herbicides (Horiguchi, 1996), 9-nitrocamptothecin (see, for example, Khooustov, 1995), mitotoxins (VanDolah, 1996), apigenin (Sato, 1994), nocodazole, and callemide (Zhang, 1998). A recent report (Cross, 1995) suggested that p53 is a tool of spindle checkpointing to ensure that a combination of spindle devices is completed during mitosis (M) of the cell cycle. In studies to support the present invention, the p21- deficient mice G 2 as listed in the above-showed a high degree of completion diploid in the infected cells when treated with M inhibitor. Inhibitors prevent cells from undergoing normal progression through mitosis and deficiency of mitosis (and G 1 -S group) checkpoints, and cells that have undergone a continuous synthesis (S) eventually produce isozyme Is assumed. Since p53 is required for the transcriptional activity of p21, cells in which p53 is inhibited by the antisense agent of the present invention show similar results.

노코다졸 또는 콜세미드(Cross,Zhang) 방추 억제제는 또한 항 p53 안티센스 약제와 결합하여 사용될 수 있다. p53-의존적인 방추 체크포인트의 부재에서, 이러한 세포는 비정상적인 또는 불완전한 유사분열 기를 가진 연속적인 세포 주기를 수행할 것으로 기대되고, 또한 다배수체 도는 이수배수체를 유발한다.Nochodazole or Cross, Zhang spasm inhibitors can also be used in combination with anti-p53 antisense agents. In the absence of p53-dependent speckle checkpoints, such cells are expected to carry out a continuous cell cycle with abnormal or incomplete mitotic division, and also induce polyhydramides or diploids.

다른 과증식성 장애가 또한 치료될 수 있다. 과증식성 피부 장애의 예는 일반적으로 사마귀와 결합된 인간 파필로마 바이러스(HPV)-감염된 세포, 흑색종과 같은 피부의 피상적 종양, 전-악성 및 악성 암종, 자외선 각막염, 홍반성 루푸스, 피부염, 및 건선이다. 다른 상피조직(예를 들어, 내피, 중피)의 과증식성 질병은 천식 및 기관지염과 같은 가역적인 폐쇄성 기도 질병을 포함한다. 원뿔 각막, 각결막염, 춘계결막염, 및 각막염 백반을 포함하는 눈의 다양한 과증식성 장애가 또한 치료될 수 있다. 이 방법은 초기의 평활근 세포 증식, 혈관 폐색, 및 레스테노시스와 같은 과증식성 혈관질병을 치료하는데 사용될 수 있다.Other hyperproliferative disorders can also be treated. Examples of hyperproliferative skin disorders include, but are not limited to, human papillomavirus (HPV) -infected cells commonly associated with warts, superficial tumors of skin such as melanoma, pre-malignant and malignant carcinomas, UV keratitis, It is psoriasis. Hyperproliferative diseases of other epithelial tissues (e.g., endothelium, mesothelioma) include reversible obstructive airways diseases such as asthma and bronchitis. A variety of hyperproliferative disorders of the eye, including conical corneas, angular conjunctivitis, spring conjunctivitis, and keratitis albedo, can also be treated. This method can be used to treat hyperplastic vascular disease such as early smooth muscle cell proliferation, vascular occlusion, and restenosis.

B.저산소증 또는 국소빈혈 상태의 치료 B. Treatment of hypoxia or ischemic conditions

p53 유발를 특징으로하는 다른 질병 상태는 뇌졸증과 같은 국소 빈혈 공격의 결과와 같은 저산소증 상태를 포함한다. 예를 들어, p53 은 대뇌(Li), 및 국소빈혈 및 간질(Xiang) 모델의 손상된 뉴우론에서의 국소빈혈 후의 아포토시스 세포에서 우선적으로 발현되는 것이 관찰되었다. Raafat 는 신장의 국소빈혈/재살포후에 증가된 수준의 p53 을 관찰했고, 그 증가가 아포토시스를 촉진할 수 있다는 것을 제안했다. 열쇼크는 또한 p53 을 유발하는 것으로 보고되었다.(Graeber) 그러므로,다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 항-p53 안티센스 약제에 의한 열쇼크, 간질성 경련, 뇌졸증, 및 국소빈혈 및/또는 재살포의 다른 발생(e.g. 기관 이식에 따름)과 같은 스트레스에 놓은 조직의 치료를 포함한다.Other disease states characterized by p53 induction include hypoxic conditions such as those resulting from an ischemic attack such as stroke. For example, it has been observed that p53 is preferentially expressed in apoptotic cells following ischemia in injured neurons in cerebral (Li), and ischemia and epilepsy (Xiang) models. Raafat observed an increased level of p53 after ischemia / resuspension of the kidney, suggesting that the increase could promote apoptosis. Heat shocks have also been reported to induce p53. (Graeber) Therefore, in another aspect, the present invention provides a method for the treatment of heat shock, interstitial seizures, stroke, and ischemia and / Or other occurrences of resuspension (eg, following tracheal transplantation).

VI.조제물 및 투여 VI. Preparations and administration

A.치료적 조제물 A. Therapeutic preparations

본 발명의 치료 방법에 따른 투여를 위해서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 적당한 액체 부형제 또는 부형제, 및 선택적인 보조 첨가제와 같은 제약학적으로 허용가능한 담체와 결합한다. 액체 부형제 및 부형제는 종래의 상업상 이용가능한 것이다. 이의 예로는 증류수, 생리적 식염수, 덱스트로스의 수용액, 그 밖의 것등이다.For administration according to the therapeutic methods of the present invention, the antisense oligonucleotides preferably bind to a pharmaceutically acceptable carrier such as suitable liquid excipients or excipients, and optional supplemental excipients. Liquid excipients and excipients are conventional commercially available. Examples thereof include distilled water, physiological saline solution, aqueous solution of dextrose, and others.

일반적으로, 활성 화합물에 추가하여, 본 발명의 제약학적 조성물은 활성 화합물을 제약학적으로 이용가능한 조제물로 가공처리를 용이하게하는 적당한 부형제 및 보조제를 포함할 수 있다. 특히, 적당한 부형제는 예를 들어, 락토우스 또는 수크로스, 만니톨 또는 솔비톨, 셀룰로스 조제물인 당과 같은 첨가제 및/또는 칼슘 포스페이트, 및 전분, 겔라틴, 검 트라가칸트(gum tragacanth), 메틸 셀루로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐 피롤리돈과 같은 결합제이다. 바람직하다면, 상기 언급된 전분뿐만 아니라 카르복시메틸 전분, 교차결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 알긴산, 또는 이들의 염과 같은 붕괴제가 첨가될 수 있다. 보조제는 예를 들어, 실리카, 활석, 스테아르산 또는 이들의 염, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 유량-조절제 및 윤활제를 포함한다.In general, in addition to the active compounds, the pharmaceutical compositions of the present invention may include suitable excipients and adjuvants that facilitate processing of the active compounds into pharmaceutically usable formulations. In particular, suitable excipients include, for example, excipients such as lactose or sucrose, mannitol or sorbitol, additives such as sugars, such as sugars, and / or calcium phosphate, and starch, gelatin, gum tragacanth, , Hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, and / or polyvinylpyrrolidone. If desired, a disintegrating agent such as carboxymethyl starch, cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid, or a salt thereof, as well as the above-mentioned starches may be added. Adjuvants include, for example, silica, talc, stearic acid or salts thereof, and / or flow-adjusting agents such as polyethylene glycol and lubricants.

당제 코어는 바람직하다면, 위액에 내성이 있는 적당한 피복으로 제공될 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 선택적으로 아라비아 고무, 활석, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜, 및/또는 이산화 티탄, 래커 용액, 및 적당한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 포함할 수 있는 농축된 당 용액이 사용될 수 있다. 위액에 내성이 있는 피복을 생산하기 위해서 아세틸셀룰로스 프탈레이트 또는 히드록시프로필메틸-셀룰로스 프탈레이트와 같은 적당한 셀룰로스 조제물 용액이 사용된다. 색소 및 염료가 동정 또는 서로 다른 조합의 활성 화합물 투여량을 특징화하기 위해서 당제의 정제에 첨가될 수 있다.The core may be provided with suitable coatings resistant to stomach fluids, if desired. For this purpose, concentrated sugar solutions which may optionally comprise gum arabic, talc, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, and / or titanium dioxide, lacquer solutions, and suitable organic solvents or solvent mixtures may be used . To produce a gastric resistant coating, a suitable solution of cellulose preparation, such as acetylcellulose phthalate or hydroxypropylmethyl-cellulose phthalate, is used. Dyes and dyes may be added to the tablets of the glyphosate to characterize or differentiate the dose of active compound.

구강용으로 사용될 수 있는 다른 제약학적 조제물은 겔라틴으로 만들어진 눌러 끼워맞춘(push-fit) 캡슐뿐만 아니라 겔라틴으로 만들어진 부드러운, 밀봉 캡슐 및 글리세롤 또는 솔비톨과 같은 가소제를 포함한다. 눌러 끼워맞춘 캡슐은 락토스와 같은 첨가제, 전분과 같은 결합제, 및/또는 활석 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제 및 선택적으로 안정제와 혼합될 수 있는 과립형태로 활성 화합물을 포함할 수 있다. 부드러운 캡슐에서, 활성 화합물은 바람직하게는 지방유, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적당한 액체에 용해되거나 현탁된다.게다가, 안정제가 첨가될 수 있다.Other pharmaceutical formulations that can be used for oral use include soft, sealed capsules made of gelatin, and plasticizers such as glycerol or sorbitol, as well as push-fit capsules made of gelatin. Press fit capsules may contain the active compound in granular form which may be mixed with additives such as lactose, a binder such as starch, and / or a lubricant such as talc or magnesium stearate and optionally a stabilizer. In soft capsules, the active compound is preferably dissolved or suspended in a suitable liquid such as fatty oil, liquid paraffin, or liquid polyethylene glycol. In addition, stabilizers may be added.

직장으로 사용될 수 있는 제약학적 조제물은 예를 들어, 활성 화합물과 좌약 염기의 결합으로 구성된 좌약을 포함할 수 있다. 적당한 좌약 염기는 천연 또는 합성 트리글리세라이드, 파라핀 탄화수소, 폴리에틸렌글리콜, 또는 고급의 알칸올을 포함한다. 게다가, 염기와 활성 화합물의 결합으로 구성된 겔라틴 직장 투여 캡슐을 사용하는 것이 가능하다 . 가능한 염기 물질은 액체 트리글리세라이드,폴리에틸렌 글리콜, 또는 파라핀 탄화수소를 포함한다.Pharmaceutical preparations which can be used in rectal applications may, for example, comprise a suppository consisting of a combination of an active compound and a suppository base. Suitable suppository bases include natural or synthetic triglycerides, paraffin hydrocarbons, polyethylene glycols, or higher alkanols. In addition, it is possible to use a gelatin rectal administration capsule consisting of a combination of a base and an active compound. Possible base materials include liquid triglycerides, polyethylene glycols, or paraffin hydrocarbons.

비경구적 투여를 위한 적당한 액체 조성물은 수용성 또는 물-분산가능한 형태에서 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 게다가, 활성 화합물의 현탄액이 적당한 오일 주입 현탄액으로 투여될 수 있다. 적당한 친유성 용매 또는 부형제는 예를 들어, 참깨유와 같은 지방유 또는 예를 들어, 에틸 올레인산염 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 수성 주입 현탄액은 현탄액의 점도를 증가시키는 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 솔비톨, 및/또는 덱스트란과 같은 물질을 함유할 수 있다. 현탄액은 또한 안정제를 함유할 수 있다.Suitable liquid compositions for parenteral administration include aqueous solutions of the active compounds in water-soluble or water-dispersible form. In addition, the active saline solution of the active compound can be administered as a suitable oil-in-water emulsion. Suitable lipophilic solvents or excipients include, for example, fatty oils such as sesame oil or synthetic fatty acid esters such as, for example, ethyl olefins or triglycerides. The aqueous injection suspensions may contain materials such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol, and / or dextran that increase the viscosity of the present liquor. The present liquor may also contain stabilizers.

종래의 담체에 의한 투여에 추가적으로, 활성 성분은 다양한 특화된 송달 기법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 리포솜에 봉입되어 투여될 수 있다. 용해도에 의존적인 활성 성분은 수성 페이즈 및 지질층(들) 모두, 또는 일반적으로 리포솜 현탄액으로 명명된 것에 존재할 수 있다. 지질층은 일반적으로 렉틴 또는 스핑고마이린과 같은 인지질, 콜레스테롤와 같은 스테로이드, 디아세틸포스페이트와 같은 이온성 계면활성제, 스테아릴아민, 또는 인지질산, 및/또는 다른 소수성 물질을 포함한다. 리포솜의 직경은 일반적으로 약 15 nm 내지 약 5 μ의 범위이다.In addition to administration by conventional carriers, the active ingredient may be administered by a variety of specialized delivery techniques. For example, a compound of the present invention may be encapsulated in liposomes and administered. Active ingredients that are dependent on solubility can be present in both the aqueous phase and the lipid layer (s), or what is commonly referred to as liposomal entrained liquid. The lipid layer generally comprises phospholipids such as lectin or sphingomyelin, steroids such as cholesterol, ionic surfactants such as diacetyl phosphate, stearylamine, or acetic acid, and / or other hydrophobic materials. The diameter of the liposome is generally in the range of about 15 nm to about 5 mu.

이러한 당제 형태를 준비하는 방법은 공지되거나 또는 당업계의 숙련자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 레밍톤의 제약학(Remington's Pharmaceutical Science) (19 th., Ed., William & Wilkins,1995) 참조. 제약학적 조제물은 당업계에 잘 알려진 공정을 따라 제조된다. 예를 들어, 종래의 혼합, 과립형성, 당제-제조, 용해, 또는 동결건조과정에 의해 만들수 있다. 사용되는 과정은 궁극적으로 사용되는 활성 성분의 물리적인 특성에 의존할 것이다.Methods for preparing such sugar forms are known or will be apparent to those skilled in the art. See, for example, Remington's Pharmaceutical Science (19 th., Ed., William & Wilkins, 1995). Pharmaceutical preparations are prepared according to processes well known in the art. For example, by conventional mixing, granulation, sugar-making, dissolving, or lyophilizing processes. The process used will depend on the physical properties of the active ingredient ultimately used.

B.종양의 치료 B. Treatment of tumors

조성물은 대상에 구강으로 투여되거나, 예를 들어, 정맥내주사,피하주사, 복강내주사, 또는 근육내주사에 의해 경피적으로 또는 비구강적으로 투여될 수 있다. 생체내에서 항종양제 사용을 위해서, p53 mRNA 안티센스 올리코뉴클레오티드는 바람직하게는 정맥내로 투여된다.The composition may be administered orally to the subject, or percutaneously or non-intravaginally, for example, by intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, or intramuscular injection. For in vivo antitumor use, the p53 mRNA antisense oligonucleotide is preferably administered intravenously.

본 발명에 따라서, p53 의 발현을 억제하여 산화 수복 경로 하향조절자로 작용하는 올리고뉴클레오티드는 세포독성에 의해 유발된 라디칼 산소를 포획할 수 있는 약제의 투여 이전에 또는 이와 공동으로 환자에 투여된다. 동시에 투여될 때, 두 활성 약제는 결합된 형태 또는 비결합 형태일 수 있다. 결합된 형태라면, 결합체는 쪼개질수 있는 결합을 포함하여 표적위치에서 올리고뉴클레오티드 및 세포독성 약제가 해리되도록 하는 것이 바람직하다.According to the present invention, oligonucleotides that inhibit the expression of p53 and function as oxidative restoration path downregulators are administered to patients prior to or in conjunction with the administration of agents capable of capturing radical oxygen induced by cytotoxicity. When administered simultaneously, the two active agents may be in a combined form or in an unconjugated form. In the combined form, it is preferred that the conjugate comprises a cleavable bond such that the oligonucleotide and the cytotoxic agent are dissociated at the target location.

투여될 각각의 약제량은 제약학적으로 유효한 두가지 형태의 약제의 결합이다. 투여량은 나이, 건강, 성별, 환자의 키 및 몸무게, 투여 경로, 약의 독성, 및 올리고뉴클레오티드 및 세포 독성 약제에 대한 암의 상대적인 감도와 같은 요인에 따라 다양할 것이다. 대부분의 세포 독성 약제에 대한 추천되는 투여량 및 투여형태가 확립되었고 Medical Economics Company,Inc.,Oradell,N.J. 에 의해서 출판된 의사의 탁상용 참고(Physicians Desk Reference)와 같은 종래의 자료로부터 얻을수 있다. 필요하다면, 이러한 지표는 예를 들어, 임상학적 시도와 같은 잘 확립된 절차 및 분석에 의해 각 시스템에 대해 결정될 수 있다.The amount of each drug to be administered is the combination of two pharmaceutically effective forms of the drug. The dosage will vary depending on factors such as age, health, sex, height and weight of the subject, route of administration, drug toxicity, and relative sensitivity of the cancer to oligonucleotides and cytotoxic agents. Recommended dosage and dosage forms for most cytotoxic agents have been established and are available from Medical Economics Company, Inc., Oradell, N.J. Such as the Physicians Desk Reference published by the Physicians & If necessary, these indicators can be determined for each system by well-established procedures and analyzes such as, for example, clinical trials.

생체내 사용을 위해서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 바람직한 투여량은 약 0.01 내지 1 μ몰/1 의 혈액내 농도에 도달하기에 필요한 전형적인 양이다. 이 농도는 다양한 방법으로 획득될 수 있다; 연속적인 IV 주입에 의한 약 0.05 내지 약 0.2mg/kg/시간 범위내의 투여량이 허용가능한 것으로 밝혀졌다. 더 많거나 적은양의 올리고뉴클레오티드가 필요량으로 투여될 수 있다.For in vivo use, a preferred dosage of an oligonucleotide of the invention is a typical amount necessary to reach a concentration in blood of about 0.01 to 1 [mu] mol / l. This concentration can be obtained in a variety of ways; Doses within the range of about 0.05 to about 0.2 mg / kg / hour by continuous IV infusion have been found acceptable. More or less amounts of oligonucleotides can be administered in the required amount.

하기의 실시예 3 은 인간 B-세포 림프종의 치료에서의 본 발명의 이용을 증명한다.The following Example 3 demonstrates the use of the invention in the treatment of human B-cell lymphoma.

C.국소빈혈 상해의 치료 C. Treatment of ischemic injury

국소빈혈 상태는 심부전증에 의해 야기되는 것과 같은 뇌순환의 단속 또는 뇌에의 혈액 공급의 전면적인 손실을 야기하는 다른 상태, 또는 뇌출혈로 인한 것과 같은 혈액 출혈에서의 국부적인 단속, 또는 국부적인 혈전성 또는 색전성 이벤트, 또는 머리 외상때문일 수 있다. 치료되는 국소빈혈 상태는 일반적으로 뇌의 혈관의 폐색 또는 파열에 의해 야기되는 신경계 기능의 감작스러운 감소 또는 손실로 정의되는 뇌졸증과 연결된다. 본래의 국소빈혈 사건의 결과로서 2차적인 뇌 손상은 전형적으로 국소빈혈 상해를 둘러싼 부위, 국한성 국소빈혈의 경우, 및 또는 해마 또는 대뇌기저핵과 같은 병소의 선택적 취약한 부위, 전(grobal) 국소빈혈에서의 뇌 세포 파괴, 또는 병소를 포함한다. 2차적인 손상은 종종 단-기간 또는 장-기간 기억상실과 같은 기능적 장애에 의해 발현될 수 있다.The ischemic condition may be caused by intermittent cerebral circulation, such as caused by heart failure, or other conditions causing total loss of blood supply to the brain, or local intervention in blood haemorrhage, such as due to cerebral hemorrhage, Or a malformed event, or head trauma. The ischemic condition to be treated is usually associated with a stroke which is defined as a gradual decrease or loss of nervous system function caused by occlusion or rupture of blood vessels in the brain. Secondary brain injury as a result of an intrinsic ischemic event typically occurs in the area surrounding ischemic injury, in the case of localized ischemia and / or in selective vulnerable areas of the hippocampus or cerebral basal ganglia, in grobal ischemia Of brain cells, or lesions. Secondary impairment can often be manifested by functional disturbances such as short-term or long-term memory loss.

ON 은 비구강적 투여를 위해 무균의 생리적인 식염수 용액과 같은 적당한 불활성 담체로 조제된다. 투여되는 투여량은 투여경로에 따라 결정될 것이다. 하나의 적당한 경로는 약 50㎍-5㎎ ON/kg 체중의 투여량 수준에서 인트라셀레브로벤티큐라(intracerebroventicular)(ICV)이다. 제약학적 유효 투여량 즉, 해부학적 및/또는 기능적 손상에서 상당한 감소를 나타내기에 효과적인 투여량은 국소빈혈 및 뇌졸증 손상에 대한 모델 시스템에서 보여지는 투여량/반응으로부터 측정될 수 있다. 이러한 모델 시스템은 게르빌루쉬 쥐 모델의 목의 경동맥의 순간적인 폐색에 의해 생산되는 전 국소빈혈 및 래트 4- 혈관 폐색 모델을 포함한다. 조직은 해부학적 손상을 위해 조사되고, 기능적인 손상은 동물에서 대뇌 국소빈혈의 일반적인 결과인 활동항진 또는 단기간 기억력에 대한 영향을 관찰하여 평가될 수 있다. 이러한 과정은 당업계에 공지된다; 예를 들어, U.S. 특허 번호, 5,051,403 참조.ON is prepared with a suitable inert carrier such as sterile physiological saline solution for non-invasive administration. The dosage administered will depend on the route of administration. One suitable route is intracerebroventicular (ICV) at a dose level of about 50 μg-5 mg ON / kg body weight. Effective doses to exhibit significant reductions in the pharmacologically effective dose, i. E. Anatomical and / or functional impairment, can be determined from the dose / response seen in the model system for ischemia and stroke injury. This model system includes an ischemic and rat 4-vessel occlusion model that is produced by the instantaneous occlusion of the carotid artery of the neck of a Gerbil-Russisch model. Tissue is examined for anatomical damage, and functional impairment can be assessed by observing the effect on hyperactivity or short term memory, which is a common result of cerebral ischemia in animals. Such processes are known in the art; For example, U.S. Pat. Patent No. 5,051,403.

D.레스테노시스 (Restenosis) D. Restenosis

특히 안티센스 약제와 관련된 성공적인 항-레스테노시스의 치료법의 중요한 측면은 안티센스 올리고머를 감염된 세포에 효과적으로 운반하는 것이다. 체계적으로 투여된 항-레스토노시스 약제는 허용가능하지 않은 높은 농도의 약제를 사용하지 않으면, 혈관 상해 위치에 효과적인 농도를 얻는 것에 전형적으로 실패한다. 발명의 명칭 " CMV 의 안티센스 표적화에 의한 레스토노시스 치료 방법" , 공유되고 공유출원계류중인 U.S. 출원 일련 번호 09/062,160 에 개시된 것과 같은 송달 장치는 올리고머를 환자의 혈관확장술의 위치에 송달하는데 사용될 수 있다. 올리고머는 바람직하게는 모르폴리노 올리고머이고, 바람직하게는 제약학적으로 허용가능한 담체안에 함유된다. 올리고머는 또한 상기 참고 출원에 또한 개시된 생물학적양립가능한 중합체 담체에 함유될 수 있다.An important aspect of the successful treatment of anti-restenosis, particularly in connection with antisense agents, is the effective delivery of antisense oligomers to infected cells. Systemically administered anti-restonocis drugs typically fail to obtain an effective concentration at the site of vascular injury unless an unacceptable high concentration of drug is used. &Quot; Method for Treating Restonosis by Antisense Targeting of CMV ", Shared & A delivery device such as that disclosed in Application Serial No. 09 / 062,160 may be used to deliver the oligomer to the site of the patient's vasodilation. The oligomer is preferably a morpholino oligomer and is preferably contained in a pharmaceutically acceptable carrier. Oligomers may also be contained in the biocompatible polymeric carrier also disclosed in the reference application.

바람직하게는, 올리고머는 혈관확장술 절차와 동시에 송달된다. Farrell 에 보고된 것과 같이 화합물이 풍선-상해 동맥(ballon-injured arteries)에 투여될 때, 세포에 의한 올리고뉴클레오티드의 흡수는 정상 동맥에 의한 흡수와 비교하여 눈에 띄게 증가할 수 있다. 본 발명의 조제물을 사용한 약제 치료법은 방사선 또는 광역학 치료법과 결합될 수 있다.Preferably, the oligomer is delivered simultaneously with the angioplasty procedure. As reported in Farrell, when a compound is administered to balloon-injured arteries, the uptake of oligonucleotides by cells may be significantly increased compared to the uptake by normal arteries. Pharmaceutical treatments using the formulations of the present invention can be combined with radiation or photodynamic therapy.

투여량은 대상의 크기, 투여 경로, 및 표준 제약학적 경험에 따른 감염된 조직의 범위에 따라 결정된다. 약제의 바람직한 수준은 허용될 수 없는 부작용없이 , p53 발현을 억제하고, 레스테노시스를 감소하거나 방지하는데 효과적인 수준이다. 성인의 경우에, 추천된 투여량은 1내지 25μ몰의 범위의 안티센스 올리고머이고, 바람직하게는 2내지 15μ몰이다. 투여 경로에 대한 최적의 투여량은 당업계에 공지된 방법에 따른 통상의 실험에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 혈관 상해 위치에의 투여의 경우에, Edelman 및 Rosenberg 에 기술된 것과 같은 생체내 모델이 사용가능하다.The dosage will depend on the size of the subject, the route of administration, and the extent of the infected tissue according to standard pharmaceutical experience. The desired level of drug is a level effective to inhibit p53 expression and reduce or prevent restenosis, without unacceptable side effects. In the case of an adult, the recommended dosage is an antisense oligomer in the range of 1 to 25 mu mol, preferably 2 to 15 mu mol. The optimal dose for the route of administration can be determined by routine experimentation according to methods known in the art. For example, in the case of administration to a venous injury site, in vivo models such as those described in Edelman and Rosenberg are available.

올리고머가 약 송달 장치에 결합될 때, 상기에 기술된 대로, 장치는 적당한 투여량의 약제를 송달하기에 효과적이다. 치료될 조직의 표면적에 관하여, 효과적인 투여량은 전형적으로 혈관벽의 ㎠ 당 30 내지 3000㎍ 의 범위이고, 더욱 바람직하게는 약 300 내지 1500 ㎍/㎠ 이다. 환자는 또한 혈관확장술 후에 주기적 기초하에 레스테노시스를 더 억제하기에 충분한 투여량 수준에서 조성물을 투여받을 수있다.When the oligomer is combined with a weak delivery device, as described above, the device is effective to deliver the appropriate dosage of the drug. With respect to the surface area of the tissue to be treated, an effective dose is typically in the range of 30 to 3000 μg per cm 2 of vessel wall, more preferably about 300 to 1500 μg / cm 2. The patient can also be administered the composition at dosage levels sufficient to further inhibit restenosis on a cyclic basis after angioplasty.

본 발명이 특정한 방법 및 구체예에 관하여 기술되었던 반면에, 다양한 변형이 본 발명의 취지에서 벗어나지 않고 만들어질 수 있다.While the invention has been described with reference to particular methods and embodiments, various modifications may be made without departing from the spirit of the invention.

실시예 1Example 1

올리고뉴클레오티드 합성Oligonucleotide synthesis

모든 사슬-연장 합성을 1μ몰 컬럼 지지를 사용한 응용 바이오시스템 모델(Applied Biosystems Model) 380B DNA 합성기(Foster City, CA) 및 ABI User Bulletin ,번호. 58.1991 에 개시된 바와 같은 포스포르아미데이트 화학을 사용한 시아노에틸 접급상에서 수행했다. 합성기를 사용자 매뉴얼의 프로토콜로 프로그램했다.Applied Biosystems Model 380B DNA Synthesizer (Foster City, Calif.) And ABI User Bulletin, no. Lt; RTI ID = 0.0 > phosphoramidate < / RTI > The synthesizer was programmed with the protocol of the user manual.

전형적인 합성 개요는; 3' 히드록시기에 의해 연결된 ODN 의 3' 염기(즉, 비변형 뉴클레오티드, C-5-프로핀 뉴클레오티드, 또는 모르폴리노 뉴클레오티드 유사체)를 1μ몰 실리카 겔 지지체 컬럼에 삽입하고, 합성을 3' 에서 5' 방향으로 염기형태에 따라 하나씩 수행한다. 모든 액체 시약은 Applied Biosystems,Inc 에 의해 공급된다. 아르곤 개스가 Air Products(Omaha)에 의해 공급된다. 첫번째 단계는, 아세톤니트릴, 그 다음 컬럼내의 어떤 잔여물을 제거하는 아르곤 개스로 컬럼을 플러싱(flushing)한다. 다음에, 트리콜로아세틱산은 ODN 합성동안 뉴클레오티드의 5'산소에 캡을 형성하는 디메톡시트리틸(DMT)기를 양자화한다. 다음에, 양자화된 DMT는 염기로부터 제거된다. 컬럼을 아세톤니트릴 및 아르곤으로 다시 플러시한다.DMT 잔여물을 DMT 잔여물 포트로 수거하고 시험 튜브로 옮겨서 밝은 오렌지 색상인지를 체크했다. 색상 체크를 디트리틸화가 성공적인지를 확인하기위해 수행한다. DMT 기는 498 nm 에서 해독 흡광도로 분광광도적으로 정량화될 수 있다. 색상이 밝은 오렌지가 아니라면, 다음에 염기의 디트리틸화는 성공적으로 수행될 수 없을 것이고 불순한 ODNs 의 합성이 일어날 수 있다. 합성의 다음 단계는 ODN 서열의 다음 염기의 결합이다. 시아노에틸 포스포르아미데이트로 변형된 적당한 뉴클레오티드 염기는 아세톤니트릴에서 용해되고 테트라졸로 컬럼에 운반된다. 염기는 반응하여 뉴클레오티드간 포스파이트 결합을 형성한다. 컬럼을 아세톤니트릴 및 아르곤으로 플러시한다. 컬럼을 아세트산 무수물 및 1-메틸이미디졸로 플러시하여 어떤 비결합의 5'히드록시기를 아세틸기로 캡핑한다. 캡은 비결합 염기를 합성동안에 결합에 의한 어떤 연속으로부터 방지하고 불순물의 길이를 감소시킬것이다. 컬럼을 다시 플러시하고 3 가 포스파이트를 테트라에틸티우람 디설파이드 및 아세톤니트릴에 의해 5 가 포스포로티오에이트 트리에스테르로 산화한다. 컬럼을 아세톤니트릴 및 아르곤으로 플러시한다. 다음에, 디트릴화 단계에서 시작하여 서열내의 다음 염기에 대한합성을 다시 반복한다. 컬럼에 알루미늄 히드록사이드를 통과시키고 용출액을 수거하여 S-ODNs 를 컬럼으로부터 절단한다. 알루미늄 히드록사이드 및 시아노에틸(포스페이트 결합으로부터)을 하룻밤동안 진공 원심분리기로 S-ODN 용액의 증류에 의해 제거한다. 건조된 ODN 를 무균 식염수로 희석한다. S-ODN 의 순도를 10% 폴리아크릴아마이드 겔상에 물로 희석된 S-ODN 의 샘플을 처리하여 체크한다. S-ODN 의 농도를 260 nm 흡광도에서 해독하고 소광율로 흡광도를 증가시키는것에 의해 결정한다.A typical synthesis outline is: The 3 'base (i.e., unmodified nucleotide, C-5-propyne nucleotide, or morpholinonucleotide analogue) of the ODN linked by the 3' hydroxyl group was inserted into a 1 mu mol silica gel support column, 'One by one depending on the type of base. All liquid reagents are supplied by Applied Biosystems, Inc. Argon gas is supplied by Air Products (Omaha). The first step is flushing the column with acetone nitrile, then argon gas to remove any residues in the column. Next, the tricholaiacetic acid quantizes dimethoxytrityl (DMT) groups that cap to the 5 'oxygen of the nucleotides during ODN synthesis. Next, the quantized DMT is removed from the base. The column was flushed again with acetone nitrile and argon. The DMT residue was collected into a DMT residue port and transferred to a test tube to check for a bright orange color. The color check is performed to verify that the diteritization is successful. The DMT group can be spectrophotometrically quantified by reading absorbance at 498 nm. If the color is not a bright orange then the base dityrylation will not be successful and synthesis of impure ODNs may occur. The next step in the synthesis is the binding of the next base of the ODN sequence. Suitable nucleotide bases modified with cyanoethylphosphoramidate are dissolved in acetone nitrile and carried on a tetrazolone column. The base reacts to form a phosphite bond between the nucleotides. The column is flushed with acetone nitrile and argon. The column is flushed with acetic anhydride and 1-methylimidizole to cap any unconjugated 5'hydroxy groups with an acetyl group. The cap will prevent unconjugated bases from any sequencing by binding during synthesis and reduce the length of the impurities. The column is again flushed and the trivalent phosphite is oxidized to pentavalent phosphorothioate triester by tetraethylthiuram disulfide and acetone nitrile. The column is flushed with acetone nitrile and argon. Then, starting from the trimerization step, the synthesis for the next base in the sequence is repeated again. The aluminum hydroxide is passed through the column and the eluate is collected to cut the S-ODNs from the column. Aluminum hydroxide and cyanoethyl (from the phosphate linkage) are removed by distillation of the S-ODN solution with a vacuum centrifuge overnight. Dilute the dried ODN with sterile saline. The purity of the S-ODN is checked by treating a sample of S-ODN diluted with water on a 10% polyacrylamide gel. The concentration of S-ODN is determined by reading at 260 nm absorbance and increasing absorbance at extinction ratio.

모르폴리노 올리고뉴클레오티드의 제조에 있어 더욱 자세한 사항은 예를 들어, Summerton and Weller,안티센스 및 핵산 약제 발전.7:187-195(1997)에서 밝혀질 수 있다.Further details in the preparation of morpholino oligonucleotides are described, for example, in Summerton and Weller, Antisense and Nucleic Acid Drug Development . 7 : 187-195 (1997).

실시예 2Example 2

부분적인 간절제술Partial hepatectomy

부분적인 간절제술 연구를 무게 200 내지 220 그램의 수컷 Sprague Dawley 래트(Sasco,Omaha NE)에서 수행했다. 동물을 UNMC's AAALAC-승인된 시설에서 깨끗한 플라스틱 케이즈에서 12 시간씩 낮/밤 주기로 사육했고, Purina 래트 식사 및 무제한적인 담수에의 접근을 허용했다. 동물 프로토콜을 대학의 제도적인 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)로부터 승인받았다.Partial liver resection studies were performed in male Sprague Dawley rats (Sasco, Omaha NE) weighing 200-220 grams. The animals were housed in clean plastic casings at UNMC's AAALAC-approved facility on a 12-hour day / night cycle and allowed access to Purina rat meals and unlimited fresh water. Animal protocols were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee.

절차를 Higgins 및 Anderson 에 개시된대로 수행했다.(1931) 무균의 외과 수술 기법을 사용했다. 래트를 메톡시플루란(Mallinckrodt Veterinary, Mundelin, IL)을 사용하여 마취했고 래트의 복부면이 노출되도록 위치시켰다. 3 내지 4 cm 길이 부위를 검상돌기 바로 후측의 정중앙 선을 따라 면도했고 베타다인으로 면봉했다. 정중앙선을 따라 절개하여 간을 노출시켰다. 중앙 및 왼쪽 측면의 엽(lobe)을 안전하게 연결하고 다음에 절개했다. 이것은 총 간의 대략 65 내지 70% 의 제거를 초래했다. 복강 절개를 두 층으로 폐쇄했다. 부분적인 간절제술을 받지않은 대조군 래트를 동일하나 그들의 간을 단지 노출시키고 부분적으로 절개하지 않는 허위 외과수술을 수행했다.Procedures were performed as described in Higgins and Anderson (1931). Sterile surgical techniques were used. The rats were anesthetized with methoxyflurane (Mallinckrodt Veterinary, Mundelin, IL) and placed so that the abdominal surface of the rats was exposed. A 3 to 4 cm long section was shaved along the midline just behind the dentate gyrus and swabbed with Betadine. The liver was exposed by incising along the right median line. The central and left side lobes were securely connected and then incised. This resulted in a removal of approximately 65 to 70% of the total. The abdominal incision was closed in two layers. The control rats that did not undergo partial hepatectomy were the same but underwent false surgical procedures that only exposed their liver and did not incise partially.

올리고뉴클레오티드 투여Oligonucleotide administration

ODNs 를 1 mg/200gm/ 일 S-ODN , 0.1mg/220g/ 일 C-5-P S-ODN, 및 50 nM (대략. 3.4 mg)200g/일 모르폴리노의 투여량으로 복강내로 주사했다. 모든 래트에 실험의 길이에 따라, 외과수술후 의식을 얻은 직후, 및 매 24 시간 후에 각각의 ODNs를 투여했다. 다음에, 래트를 외과수술후 1,2,5 또는 7 일 동안 수복을 허용했다. 습윤 체중증가를 도 1 에서 보여지는 데이타를 나타내는 ODN 의 투여 후 24 시간만에 결정했다.ODNs were injected intraperitoneally into a dose of 1 mg / 200 gm / day S-ODN, 0.1 mg / 220 g / day C-5-P S-ODN, and 50 nM (approximately 3.4 mg) 200 g / day morpholino . All rats were dosed with ODNs immediately after receiving post-surgical consciousness, and after 24 hours, depending on the length of the experiment. Next, the rats were allowed to rest for 1, 2, 5, or 7 days after surgery. The wet weight gain was determined 24 hours after administration of the ODN indicating the data shown in Fig.

실시예 3Example 3

인간 B-세포 림프종의 치료Treatment of human B-cell lymphoma

약물 치료 섭생법: 0 일에서 시작하여, 환자는 정맥 접근 장치를 통해 7일동안 연속적인 IV 주입으로서 0.2 mg/kg/hr 의 투여량으로 SEQ ID NO:1 을 가지는 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여받는다. MINE 화학치료법을 4 일에서 시작하여 하기의 스케쥴에 따라 수행한다.Medication regimen: Starting at day 0, the patient was administered a morpholino antisense oligonucleotide with SEQ ID NO: 1 at a dose of 0.2 mg / kg / hr as a continuous IV infusion over a 7 day period via a vein access device Receive. The MINE chemotherapy is started on the 4th day according to the following schedule.

Mesna Injection(MESNEXTM, Bristol-Meyers Oncology) : Ifosfamide 전에 30 분 동안 500mg/M2IV, Ifosfamide 후에 4 시간 동안 250mg/M2IV, 4 일부터 7일 까지 매일 Ifosfamide 후에 8 시간 동안 구강으로 250mg/M2. Mesna Injection (MESNEX ™ , Bristol-Meyers Oncology): 500 mg / M 2 IV for 30 minutes before Ifosfamide, 250 mg / M 2 IV for 4 hours after Ifosfamide, 4 to 7 days after Ifosfamide, 250 mg / M 2 .

Ifosfamide (IFEXTM, Bristol-Meyers Oncology) : 4-7일동안 매일 1.33 g/M2IV. Ifosfamide (IFEX ™ , Bristol-Meyers Oncology): 1.33 g / M 2 daily for 4-7 days IV.

Mitoxantrone hydrochloride(NOVANTRONETM,Lederle Laboratories) : 4 일째만 10 mg/M2IV. Mitoxantrone hydrochloride (NOVANTRONE TM , Lederle Laboratories): 10 mg / M 2 on day 4 IV.

Etoposide(VEPESIDTM,Bristol-meyers Oncology) : 4-7 일동안 매일 80 mg/M2IV. Etoposide (VEPESID ™ , Bristol-meyers Oncology): 80 mg / M 2 daily for 4-7 days IV.

환자를 그들의 질병의 독성 및 반응에 대하여 규칙적인 평가를 한다. 환자는 매주 CBC(complete blood count)및 혈소판 계수를 받는다. 순환을 최대 6 번동안 4 주마다 한번씩 반복한다. 환자를 건강진단에 의해 측정가능한 질병에 대하여 매 순환마다의 반응에 관해 평가한다. 환자를 반응(완전한 반응, 부분적인 반응, 안정한 반응, 또는 진행성 질병)에 따라 분류한다.Patients are regularly assessed for toxicity and response to their disease. Patients receive weekly complete blood count (CBC) and platelet counts. Repeat the cycle once every four weeks for up to six times. Patients are assessed for each cycle of response to measurable disease by a health check. Classify patients according to the response (complete response, partial response, stable response, or progressive disease).

환자는 안티센스 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO:1 (OL(1)p53)의 사용을 포함하지 않는 전통적인 MINE 치료법과 상반되는 본 발명의 치료법으로 향상된 임상적 반응을 보일것으로 기대된다. OL(1)p53 은 세포주기 수복 기작 억제에 의하여 암세포를 MINE 의 효과에 증감시켜서 p53-비독립적인 아포토시스에 의해 암세포를 우선적으로 죽일것으로 기대된다.The patient is expected to show improved clinical response to the treatment of the present invention, which is contrary to traditional MINE therapy, which does not involve the use of antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 1 (OL (1) p53). OL (1) p53 is expected to preferentially kill cancer cells by p53-independent apoptosis by increasing or decreasing the effect of MINE on cancer cells by inhibiting the cell cycle repair mechanism.

Claims (30)

적당한 제약학적 담체중의 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3' 로 확인되는 염기 서열 SEQ ID NO:1, 또는 5'-CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC-3' 로 확인되는 염기서열 SEQ ID NO:2 를 가지는 안티센스 약제의 제약학적 유효량을 대상에 투여하는 것을 포함하는 포유 동물 대상에 p53 의 유발을 특징으로하는 질병 상태를 치료하는 방법으로서, 안티센스 약제는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산, 2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬 변형된 올리고뉴클레오티드, N3'-P5' 포스포르아미데이트 올리고뉴클레오티드, 또는 C-5-프로핀 피리미딘-변형된 올리고뉴클레오티드인 방법.The nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 identified as 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3 'in a suitable pharmaceutical carrier, or the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 identified as 5'-CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC-3' 1. A method for treating a disease state characterized by the induction of p53 in a mammalian subject comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of an antisense agent having a NO: 2, wherein the antisense agent is selected from the group consisting of morpholino oligonucleotides, 2'-O-allyl or 2'-O-alkyl modified oligonucleotides, N3'-P5 'phosphoramidate oligonucleotides, or C-5-propynopyrimidine-modified oligonucleotides. 제 1 항에 있어서, 안티센스 약제는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the antisense agent is a morpholino oligonucleotide. 제 2 항에 있어서, 모르폴리노 올리고뉴클레오티드는 포스포로디아미데이트 골격 결합에 의해 연결된 모르폴리노 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.3. The method of claim 2, wherein the morpholino oligonucleotide comprises a morpholino subunit linked by a phosphorodiamidate backbone bond. 제 1 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 C-5-프로핀 피리미딘-변형된 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the oligonucleotide is a C-5-propynopyrimidine-modified oligonucleotide. 제 1 항에 있어서, 안티센스 약제는 서열 SEQ ID NO:1 을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the antisense agent has the sequence SEQ ID NO: 1. 제 1 항에 있어서, 안티센스 약제는 서열 SEQ ID NO:2 을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the antisense agent has the sequence SEQ ID NO: 2. 제 1 항에 있어서, 상기 대상은 인간 대상인 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the subject is a human subject. 제 1 항에 있어서, 상기 질병 상태는 암인 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein the disease state is cancer. 제 8 항에 있어서, 세포 수준에서 라디칼 산소 종을 증가시키기에 효과적인 약제로 상기 대상의 치료를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.9. The method of claim 8, further comprising treatment of said subject with a medicament effective to increase a radical oxygen species at the cellular level. 제 9 항에 있어서, 상기 약제는 방사선 증감제, 이온화 방사선, 고압 산소 환경, 및 세포 수준에서 라디칼 산소 종을 증가시키는 화학요법제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.10. The method of claim 9, wherein the agent is selected from a radiation sensitizer, ionizing radiation, a high-pressure oxygen environment, and a chemotherapeutic agent that increases radical oxygen species at the cellular level. 제 10 항에 있어서, 상기 화학요법제는 안트라사이클린 또는 안트라퀴논인 것을 특징으로 하는 방법.11. The method of claim 10, wherein the chemotherapeutic agent is an anthracycline or anthraquinone. 제 8 항에 있어서, 세포 주기의 G2기로부터 M 기로의 진행 방해에 효과적인 약제에 의한 상기 대상의 치료를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 8, wherein G 2 from the group of the cell cycle method further comprising the treatment of the target by the drug effective to interfere with progression of the M phase. 제 12 항에 있어서, 상기 약제는 포스포키나제 C (PKC) 저해제, 비스(클로로에틸)니트로소우레아(BCNU), 펜톡시필린, 실리마린, 스타우로스포린, 페닐아히스틴,파클리탁셀, 레티노산, 플라보피리돌, 메틸-2,5-디히드로신나메이트, 헤르복시디엔, 9-니트로캠프토테신, 마이토톡신, 아피게닌, 노코다졸, 및 콜세미드로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.13. The method of claim 12, wherein the agent is selected from the group consisting of a phosphokinase C (PKC) inhibitor, bis (chloroethyl) nitroso urea (BCNU), pentoxifylline, silymarin, staurosporine, phenylaxystine, paclitaxel, retinoic acid, Characterized in that it is selected from the group consisting of bipyridol, methyl-2,5-dihydrocinnamate, herboxydiene, 9-nitrocamptothecin, mitotoxin, apigenin, . 제 1 항에 있어서, 상기 질병 상태는 국소 빈혈 또는 국소빈혈/재살포 상해로부터 유발되는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein said disease state is caused by ischemia or ischemia / resuspension injury. 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3' 으로 확인되는 SEQ ID NO:1, 및 5'-CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC-3' 로 확인되는 SEQ ID NO:2 로 구성되는 군으로부터 선택된 염기 서열을 가지는 안티센스 약제, 및 적당한 제약학적 담체를 포함하며, 안티센스 약제는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드,펩티드 핵산,2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬 변형된 올리고뉴클레오티드, 및 N3'→ P5' 포스포르아미데이트 올리고뉴클레오티드, 또는 C-5-프로핀 피리미딘-변형된 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 대상에 p53 유발을 특징으로하는 질병 상태 치료에 사용하기 위한 조성물.2 identified from the group consisting of SEQ ID NO: 1 identified as 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3 'and 5'-CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC-3' Wherein the antisense agent comprises a morpholino oligonucleotide, a peptide nucleic acid, a 2'-O-allyl or 2'-O-alkyl modified oligonucleotide, and a N3 'to P5 Or a C5-propynylpyrimidine-modified phosphorylated oligonucleotide, or a C5-propynylpyrimidine-modified phosphorylated oligonucleotide, or a C5-propynylpyrimidine-modified oligonucleotide. 제 15 항에 있어서, 안티센스 약제는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.16. The composition of claim 15, wherein the antisense agent is a morpholino oligonucleotide. 제 16 항에 있어서, 모르폴리노 올리고뉴클레오티드는 포스포로디아미데이트 골격 결합에 의해 연결된 모르폴리노 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.17. The composition of claim 16, wherein the morpholino oligonucleotide comprises a morpholino subunit linked by a phosphorodiamidate backbone bond. 제 15 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 C-5-프로핀 피리미딘-변형된 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.16. The composition of claim 15, wherein the oligonucleotide is a C-5-propynopyrimidine-modified oligonucleotide. 제 15 항에 있어서, 안티센스 약제는 서열 SEQ ID NO:1 을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.16. The composition of claim 15, wherein the antisense agent has the sequence SEQ ID NO: 제 15 항에 있어서, 안티센스 약제는 서열 SEQ ID NO:2 를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.16. The composition of claim 15, wherein the antisense agent has the sequence SEQ ID NO: 2. 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3 으로 확인되는 SEQ ID NO:1, 및 5'-CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC-3' 로 확인되는 SEQ ID NO:2 로 구성되는 군으로부터 선택된 염기 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드로서, 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산, 2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬 변형된 올리고뉴클레오티드, 및 N3'→ P5' 포스포르아미데이트 올리고뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드.A nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 identified as 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3, and SEQ ID NO: 2 identified as 5'-CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC- Wherein the oligonucleotide is selected from the group consisting of morpholino oligonucleotides, peptide nucleic acids, 2'-O-allyl or 2'-O-alkyl modified oligonucleotides, and N3 '- P5' phosphoramidate oligonucleotides Lt; / RTI > oligonucleotides. 제 21 항에 있어서, 염기 서열 SEQ ID NO:1 을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.23. The oligonucleotide of claim 21, having the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1. 제 21 항에 있어서, 염기 서열 SEQ ID NO:2 를 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.29. The oligonucleotide of claim 21, having the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2. 제 23 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.24. The oligonucleotide of claim 23, wherein the oligonucleotide is a morpholino oligonucleotide. 제 24 항에 있어서, 포스포로디아미데이트 골격 결합에 의해 연결된 모르폴리노 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드.25. The morpholino oligonucleotide of claim 24, comprising a morpholino subunit linked by a phosphorodiamidate backbone bond. 제 23 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.24. The oligonucleotide of claim 23, wherein the oligonucleotide is a morpholino oligonucleotide. 제 26 항에 있어서, 포스포로디아미데이트 골격 결합에 의해 연결된 모르폴리노 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드.27. The morpholino oligonucleotide of claim 26 comprising a morpholino subunit linked by a phosphorodiamidate backbone bond. 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3' 로 확인되는 SEQ ID NO:1, 및 5'-CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC-3' 로 확인되는 SEQ ID NO:2 로 구성되는 군으로부터 선택된 염기 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드로서, C-5-프로핀 피리미딘-변형된 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.2 identified from the group consisting of SEQ ID NO: 1 identified as 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3 'and 5'-CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC-3' An oligonucleotide having a sequence, wherein the oligonucleotide is a C-5-propynopyrimidine-modified oligonucleotide. 제 28 항에 있어서, 염기서열 SEQ ID NO:1 을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.29. The oligonucleotide of claim 28, having the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1. 제 28 항에 있어서, 염기서열 SEQ ID NO:2 를 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.29. The oligonucleotide of claim 28, having the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2.
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