KR20010082543A - Ｄｎａ 재편성을 이용한 내병충성 유전자의 최적화 방법 - Google Patents

Ｄｎａ 재편성을 이용한 내병충성 유전자의 최적화 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20010082543A
KR20010082543A KR1020007012152A KR20007012152A KR20010082543A KR 20010082543 A KR20010082543 A KR 20010082543A KR 1020007012152 A KR1020007012152 A KR 1020007012152A KR 20007012152 A KR20007012152 A KR 20007012152A KR 20010082543 A KR20010082543 A KR 20010082543A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
recombinant
disease
genes
library
Prior art date
Application number
KR1020007012152A
Other languages
English (en)
Inventor
스테머윌렘피씨
캐슬린다
야마모토다카시
Original Assignee
추후제출
맥시겐, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 추후제출, 맥시겐, 인크. filed Critical 추후제출
Publication of KR20010082543A publication Critical patent/KR20010082543A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 내병충성을 식물에 부여하는 데 사용하기 위한 자연 발생적 유전자보다 개선된 내병충성 유전자를 얻는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 내병충성 유전자의 DNA 재편성을 이용하여 재조합 내병충성 유전자의 라이브러리를 생성하며, 해당 개선된 특성(들)을 나타내는 유전자들을 검색하여 확인한다.

Description

ＤＮＡ 재편성을 이용한 내병충성 유전자의 최적화 방법{OPTIMIZATION OF PEST RESISTANCE GENES USING DNA SHUFFLING}
살충 활성이 있는 단백질을 암호화하는 유전자는 특정 해충을 제어하기 위해 농업분야에서 현재 이용되고 있다(Asgrow Reports-Genetic Engineering for Pest Control-Len Copping, 2.1-2.4장). 예를 들면, 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis(Bt)) 결정 단백질을 암호화하는 유전자는 몇몇 작물에 안정하게 도입되었으며, 곤충 제어제로서 널리 이용되고 있다(Pest. Sci.(1998) 52:165-175, 상기 Asgrow Reports 문헌 참조). 살충 활성을 암호화하는 상이한 유전자들의 일부 예도 공지되어 있다(상기 Asgrow Reports의 문헌 참조). 그러나, 이들 다수의 유전자들를 이용하는데 있어서 가장 큰 제한 요인은 충분한 활성(효능)의 결핍 및/또는 유용한 활성 범위의 부족이다. 예를 들면, 가장 널리 이용되고 있는 결정 단백질을 암호화하는 유전자 계통도 이들이 제어하는 해충과 효능 대 각종 경제적으로 중요한 해충에 관하여 제한이 있다(상기 Asgrow Report 문헌 참조). 예를 들어, Bt 독소는 옥수수 근충과 기타 딱정벌레목 해충에 대해 약한 독소이다.
따라서, 각종 식물 해충에 대해 개선된 특성을 나타내는 독소와 이러한 독소를 얻는 방법이 필요하다. 놀랍게도, 본 발명은 전술한 각각의 문제점들 해결할 수 있을 뿐 아니라, 하기 내용의 완전한 검토로부터 명백해지는 각종 기타 특성들을 제공하는 방법을 제공한다.
관련 출원의 참조
본 출원은 1998년 5월 1일에 출원된 09/071,816호(가명세서 출원 일련번호 60/122,054호)와 1998년 7월 28일 출원된 가명세서 출원 60/094,462호의 이익을 주장한다.
기술분야
본 발명은 식물체에 곤충, 선충류, 진균류 및 기타 해충에 대한 내성을 부여하는 최적화된 유전자의 개발 분야에 속한다.
도 1은 유전자의 시험관내 재편성, "반복되는 서열 재조합"의 개략도이다.
도 2는 바실러스 투린지엔시스 독소 유전자의 계통수를 도시한다.
도 3은 더욱 많은 수의 Bt 독소 유전자의 계통수를 도시한다.
도 4는 각종 유형의 독소 Cry1, Cry3, Cry7, Cry8, Cry14 및 Cry18 사이의 유사성을 나타내는 계통수를 도시한다.
도 5는 A. 리조제네스(A. Rhizogenes)를 이용하여 재편성된 독소 유전자를 모상 뿌리에 삽입시킨 후, 관심있는 해충에 대한 독소 활성의 존재 유무를 검색하는 방법의 개략도이다.
정의
"검색"이란 용어는 일반적으로 두 단계 과정, 즉 우선 세포가 검색 마커를발현하는지 여부를 결정하는 단계와 다음으로 원하는 특성을 갖는 세포를 물리적으로 분리하는 단계를 나타낸다. 선별은 선별 마커의 발현으로 확인 및 물리적 분리를 동시에 수행할 수 있는 검색의 한 형태로서, 어떤 유전자 환경하에서는 마커를 발현하는 세포는 생존하지만 그 외의 세포는 사멸하거나, 또는 그 반대의 경우가 된다. 검색 마커의 예로는 루시퍼라제, 베타갈락토시다제 및 녹색 형광 단백질 등이 있다. 선별 마커는 약물 및 독소 내성 유전자를 포함한다. 자연 진화 과정에서는 자발적인 선별이 발생할 수 있고, 실제로 발생하지만, 본 발명에서 선별은 인간이 수행한다.
본 발명에서 사용되는 "외인성 DNA 분절", "이종 서열" 또는 "이종 핵산"은 특정 숙주 세포에 대해 외래원으로부터 유래하는 것, 또는 같은 근원에서 유래하는 경우에는 원형으로부터 변형된 것이다. 따라서, 숙주 세포에 존재하는 이종 유전자는 특정 숙주 세포에 내인성이지만 변형되어진 유전자를 포함한다. 본 출원에 기술된 이종 서열의 변형은 DNA 재편성을 이용하여 이루어진다. 따라서, 이 용어들은 세포에 대해 외래성 또는 이종인 DNA 분절 또는 세포에 대해 상동성이지만, 숙주 세포내 일정 위치에서 성분이 보통 발견되지 않는 핵산인 DNA 분절을 의미한다. 외인성 DNA 분절은 발현하여 외인성 폴리펩티드를 산출한다.
"유전자"란 광범위하게는 생물학적 기능과 관련된 임의의 DNA 분절을 의미하는데 사용된다. 따라서 유전자는 이들이 발현하는데 필요한 암호화 서열 및/또는 조절 서열을 포함한다. 또한 유전자는, 예컨대 기타 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는 발현되지 않은 DNA 분절을 포함한다. 유전자는 다양한 출처, 예컨대 관심있는 출처로부터의 클로닝 또는 공지되었거나 예측된 서열 정보를 통한 합성으로 얻을 수 있으며, 원하는 변수를 가지도록 고안된 서열을 포함할 수도 있다.
내병충성 유전자의 "살충 활성이 있는 부분"이란 내병충성 유전자가 암호화하는 각각의 전장 폴리펩티드보다 아미노산 수가 적지만, 여전히 표적 해충에 대해 독성을 나타내는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 말한다.
핵산 또는 단백질에 적용되는 "분리된"이란 용어는 핵산 또는 단백질이 자연 상태로 존재할 때 회합되어 있는 기타 세포 성분이 거의 없는 것을 의미한다. 이것은 무수 용액 또는 수용액에 존재할 수 있지만, 균질 상태로 존재하는 것이 바람직하다. 순도와 균질성은 통상적으로 분석화학 기술, 예를 들면 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 결정한다. 제제에 존재하는 주된 종류인 단백질은 실질적으로 정제된다. 특히, 분리된 유전자는 유전자의 측면에 존재하며, 해당 유전자가 아닌 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임과 분리한다. "정제된"이란 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔 상에서 거의 하나의 띠를 형성하는 것을 나타낸다. 특히 핵산 또는 단백질은 순도가 약 50% 이상, 더욱 바람직하게는 약 85%이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상인 것을 의미한다.
"자연적으로 발생하는"이란 용어는 인간이 인위적으로 생산한 것과는 달리, 자연에서 발견할 수 있는 대상을 의미한다. 예를 들면, 자연에 존재하는 공급원으로부터 분리할 수 있는 유기체(바이러스 포함)에 존재하며, 실험실에서 인간이 의도적으로 변형시키지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연적으로 발생한 것이다.
"핵산"이란 1본쇄 또는 2본쇄 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드와 이들의 중합체를 의미한다. 특별히 제한하지 않는다면, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며, 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함하는 핵산을 통칭한다. 다른 언급이 없으면, 특정 핵산 서열은 또한 보존적으로 변형된 변형체(예, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보 서열과, 명시적으로 나타낸 서열도 포함한다. 특히, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선별된 (또는 모든) 코돈의 세번째 위치를 혼합형 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환시킨 서열을 형성함으로써 달성할 수 있다(Batzeret al.(1991)Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsukaet al.(1985)J. Biol. Chem. 260:2605-2608; Cassolet al.(1992); Rossoliniet al.(1994)Mol. Cell. Probes 8: 91-98). 이 핵산이란 용어는 유전자, cDNA 및 유전자가 암호화하는 mRNA와 호환적으로 사용되어 질 수 있다.
"유전자로부터 유래된 핵산"이란 유전자 또는 이의 부분 서열이 궁극적으로 주형으로 작용하여 합성한 핵산을 말한다. 따라서, mRNA, mRNA로부터 역전사된 cDNA, cDNA로부터 전사된 RNA, cDNA로부터 증폭된 DNA, 증폭된 DNA로부터 전사된 RNA 등은 모두 유전자로부터 유래된 것이고, 이러한 유래된 생성물이 검출된다는 것은 시료 속에 원래의 유전자 및/또는 유전자 전사체가 존재하고/또는 다량 존재한다는 것을 의미한다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적으로 관련을 갖도록 배치되면 "작동가능하게 결합" 되었다고 말한다. 예를 들면, 프로모터 또는 인핸서가 암호화 서열의 전사를증가시킨다면, 이는 암호화 서열에 작동가능하게 결합된 것이다. 작동가능하게 결합되었다는 것은 결합될 DNA 서열이 통상적으로 인접하고 있으며, 2개의 단백질 암호화 영역을 결합시켜야 하는 경우에는 인접하고 있으면서 동시에 리딩 프레임내에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 일반적으로 프로모터와는 수킬로염기 떨어진 곳에서 작용하고, 인트론 서열이 가변 길이로 존재할 수도 있기 때문에, 몇몇 폴리뉴클레오티드 성분들을 작동가능하게 결합시킬 수 있지만 인접해서 위치하지는 않는다.
두 분자(예를 들면, 리간드와 수용체) 사이의 특이적인 결합 친화력이란 분자들의 혼합물 속에서 어느 한 분자가 다른 분자에 대해 우선적으로 결합하는 것이다. 분자의 결합은 결합 친화력이 약 1×104M-1내지 1×106M-1또는 그 이상이면 특이적인 것으로 간주할 수 있다.
세포와 관련하여 사용되는 "재조합체"란 용어는 세포가 이종 핵산을 복제하거나, 또는 이종 핵산이 암호화하는 펩티드나 단백질을 발현하는 것을 나타낸다. 재조합 세포는 천연(비재조합) 형태의 세포 내에서는 발견되지 않는 유전자를 포함할 수 있다. 재조합 세포는 또한, 인위적인 수단으로 유전자를 변형시킨 다음 그 세포에 유전자를 재도입한 천연 형태의 세포 내에서 발견되는 유전자를 포함할 수 있다. 이 용어는 또한, 세포로부터 핵산을 제거하지 않은 상태에서 변형시킨 세포에 대해 내인성인 핵산을 함유하는 세포를 포함한다; 이러한 변형은 유전자 대체법, 부위 특이적 돌연변이 및 관련 기술로 얻을 수 있는 것들을 포함한다.
"재조합 발현 카세트" 또는 간단히 "발현 카세트"는 재조합의 방법으로 또는합성을 통해 만들어지는 핵산 작제물로서, 서열에 적합한 숙주 내에서 구조 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 핵산 성분을 포함하고 있다. 발현 카세트는 최소한 프로모터를 포함하며, 선택적으로 전사 종결 신호를 포함한다. 통상적으로 재조합 발현 카세트는 전사하고자 하는 핵산(예, 원하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산) 및 프로모터를 포함한다. 또한, 발현에 영향을 미치는데 필요하거나 도움이 되는 추가적인 인자도 본 발명에 기재된 대로 이용할 수 있다. 예를 들면, 발현 카세트는 숙주 세포로부터 발현된 단백질의 분비를 유도하는 신호 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 유전자 발현에 영향을 미치는 전사 종결 신호, 인핸서 및 기타 핵산 서열도 발현 카세트가 포함할 수 있다.
2 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 관계에 있어서 "동일한" 또는 "동일성(%)"이란 용어는 하기 서열 비교 알고리즘들 중의 하나 또는 시각적 관찰을 통해서 측정되는 바와 같이, 최대 상응성을 위해 비교 및 정렬할 때 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산을 명기된 백분율로 보유하거나, 또는 동일한 2 이상의 서열 또는 부분 서열을 말한다.
"실질적으로 동일한"이란 2 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 관계에 있어서, 하기 서열 비교 알고리즘들 중의 하나 또는 시각적 관찰을 통해서 측정되는 바와 같이, 최대 상응성을 위해 비교 및 정렬할 때, 60% 이상, 바람직하게는 80%, 가장 바람직하게는 90∼95%의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 가지는 2 이상의 서열 또는 부분 서열을 말한다. 실질적인 동일성은 길이에 있어서 약 50개 이상의 잔기, 더욱 바람직하게는 약 100개 이상의 잔기, 가장 바람직하게는 약 150개이상의 잔기에 걸쳐 실질적으로 동일한 서열 영역에 존재한다. 가장 바람직한 일양태에서, 서열은 암호화 영역 전체 길이에 걸쳐서 실질적으로 동일하다.
서열 비교를 위해, 일반적으로 한 서열은 시험 서열을 비교하는 기준 서열로서 기능한다. 서열 비교 알고리즘을 이용해서 시험 서열과 기준 서열을 컴퓨터에 입력하면 부분 서열 좌표가 표시되며, 필요에 따라, 서열 알고리즘 프로그램 변수도 지정된다. 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 변수를 기초로 하여, 기준 서열에 대한 시험 서열(들)의 서열 동일성(%)을 계산한다.
서열 비교를 위한 최적의 정렬은 예를 들면, Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘(Adv. Appl. Math.2:482(1981)), Needleman 및 Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘(J. Mol. Biol.48:443(1970)), Pearson 및 Lipman의 유사성 방법을 위한 조사(Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA85:2444(1988)), 이들 알고리즘의 전산화 실행법(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) 또는 시각적 관찰(일반적으로 하기 Ausubel 등의 문헌 참조)로 수행할 수 있다.
서열 동일성(%) 및 서열 유사성(%)을 결정하는데 적합한 알고리즘의 한 예로는 BLAST 알고리즘이 있는데, 이것은 Altschul 등의 문헌[J. Mol. Biol.215:403-410(1990)]에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보센터(National Center for Biotechnology Information) (http://wwww.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공공연히 이용되고 있다. 이 알고리즘은 먼저 찾는 서열에서 짧은 단어 길이 W를 확인함으로써 고득점 서열쌍(HSPs)을 확인하는데, 데이타베이스 서열에 있는 동일한 길이의 단어와 정렬시켰을 때 일부 양의 값의 한계값인 T와 일치하거나 이를 만족시킨다. T는 이웃하는 단어 점수 한계값으로 불리운다(상기 Altschul 등의 문헌 참조). 이러한 초기의 이웃 단어의 적중은 그들을 포함하는 더 긴 HSPs를 찾기 위한 초기 조사의 출발점으로 작용한다. 그런 다음 이 단어 적중은 누적된 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 누적된 점수는, 뉴클레오티드 서열의 경우 변수 M(한 쌍의 정합 잔기에 대한 보상점수; 항상 > 0) 및 N(부정합 잔기에 대한 벌칙점수; 항상 < 0)을 이용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 누적된 점수를 계산하기 위해 점수 행렬을 사용한다. 각 방향으로의 단어 적중 연장은, 누적 정렬 점수가 이것의 최대치로부터 X양 만큼 떨어진 경우; 하나 이상의 음의 점수 잔기 정렬의 축적 때문에 누적 점수가 0 이하가 되는 경우; 또는 서열의 한 말단에 도달한 경우에 정지된다. BLAST 알고리즘 변수인 W, T, 및 X는 정렬의 속도와 민감도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 단어길이(W) 11, 기대값(E) 10, 컷오프(cutoff) 100, M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 디폴트값으로 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 단어길이(W) 3, 기대값(E) 10 및 BLOSUM62 점수 행렬을 디폴트값으로 사용한다(Henikoff & Henikoff(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89: 10915 참조).
서열 동일성(%)을 계산하는 것 뿐만 아니라, BLAST 알고리즘은 두 서열간의 유사성의 통계적 분석도 수행한다(예, Karlin & Altschul (1993)Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA90:5873-5787 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한척도는 최소 합 확률(P(N))인데, 이것은 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 정합이 우연히 일어날 확률을 나타내는 것이다. 예를 들면, 시험 핵산을 기준 핵산과 비교했을 때, 최소 합 확률이 약 0.1 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 기준 핵산과 유사한 것으로 간주한다.
두 분자가 엄중 조건 하에서 서로 하이브리드화한다는 것도 두 핵산 서열이 실질절으로 동일하다는 또 다른 표시가 된다. "특이적으로 하이브리드화하는"이란 서열이 복합 혼합물(예, 총 세포 DNA 또는 RNA)에 존재하는 경우 엄중 조건 하에서 특정 핵산 서열에만 분자가 결합, 두가닥화 또는 하이브리드화하는 것을 말한다. "실질적으로 결합한"이란 프로브 핵산과 표적 핵산 사이의 상보적 하이브리드화를 의미하며, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 소정의 검출을 달성하기 위해서 매체의 엄중도를 감소시킴으로써 조절할 수 있는 작은 부정합을 포함한다.
서던 및 노던 하이브리드화 방법과 같은 핵산의 하이브리드화 실험에 있어서 "엄중 하이브리드화 조건" 및 "엄중 하이브리드화 세척 조건"은 서열 의존적이며, 상이한 환경 변수 하에서 다를 수 있다. 더 긴 서열은 더 고온에서 특이적으로 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 지침은 Tijssen의 문헌[(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probespart I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York]에 개시되어 있다. 일반적으로 고엄중 하이브리드화 및 하이브리드화 세척 조건은 지정된 이온 강도와 pH에서의 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮은 온도를 선택한다. 일반적으로 "엄중 조건"하에서 프로브는 표적 서열에 하이브리드화하지만 기타 서열에는 하이브리드화하지 않는다.
Tm(지정된 이온 강도와 pH 하에서)은 표적 서열의 50%가 완벽하게 정합된 프로브에 하이브리드화하는 온도이다. 매우 엄중한 조건은 특정 프로브에 대한 Tm과 동일하게 선택한다. 서던 또는 노던 블롯 중 필터상에 100개 이상의 상보성 잔기를 갖는 상보성 핵산의 하이브리드화를 위한 엄중 하이브리드화 조건의 예는 42℃, 1 mg의 헤파린이 첨가된 50% 포름아미드로 수행하는 것이며, 하룻밤 동안 하이브리드화시킨다. 고도의 엄중 세척 조건의 한 예는 0.15M NaCl로 72℃에서 약 15분 동안 수행하는 것이다. 엄중 세척 조건의 예는 65℃에서 15분 동안 0.2×SSC로 세척하는 것이다(SSC 완충액의 상세설명은 하기 Sambrook의 문헌 참조). 종종 고엄중 세척은 배경 프로브의 신호를 제거하기 위해서 저 엄중 세척보다 먼저 수행한다. 예컨대 100 뉴클레오티드 이상의 두가닥용 중간 엄중 세척 조건은 45℃에서 15분 동안 1×SSC를 이용하여 세척하는 것이다. 예를 들어 100 뉴클레오티드 이상의 두가닥용 저 엄중 세척 조건의 예는 40℃ 에서 15분 동안 4-6×SSC로 세척하는 것이다. 짧은 프로브(예, 약 10 내지 50 뉴클레오티드)를 위한 엄중 조건은 통상적으로 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 통상적으로 약 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)의 염 농도를 포함하며, 반응 온도는 통상적으로 약 30℃ 이상이다. 엄중 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가함으로써 얻을 수 있다. 일반적으로 특정 하이브리드화 분석에서 미관련 프로브에 대해 관찰되는것 보다 2배(또는 그 이상)의 신호 대 노이즈 비율은 특이적 하이브리드화를 검출할 수 있는 표시가 된다. 엄중 조건 하에서 서로 하이브리드화하지 않는 핵산은 그들이 암호화하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다면 여전히 실질적으로 동일한 것이다. 이는, 예컨대 유전자 코드가 인정하는 최대 코돈 축퇴성을 이용하여 핵산 사본을 형성하는 경우 발생한다.
두 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 것을 나타내는 또 다른 지표는 제1 핵산이 암호화하는 폴리펩티드가 제2 핵산이 암호화하는 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응성이 있어나 특이적으로 결합하는 것이다. 따라서, 예를 들면 두 펩티드가 보전적 치환에 의해서만 차이가 있는 경우 한 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다.
단백질 또는 펩티드에 대해서, "항체에 특이적으로(또는 선택적으로) 결합한다" 또는 "특이적(또는 선택적) 면역반응성이 있는"이란 용어는 단백질과 기타 생물제제의 존재 하에 이종군의 단백질 존재를 결정하는 결합 반응을 말한다. 따라서, 지정된 면역 분석 조건 하에서, 특정 항체는 특정 단백질에 결합하지만, 시료에 존재하는 다른 단백질들과는 유의할 정도의 양으로 결합하지 않는다. 그러한 조건 하에서 항체에 대한 특이적 결합은 특정 단백질에 대한 특이성을 위해 선택된 항체를 필요로 한다. 예를 들면, 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 아미노산 서열을 가진 단백질에 대해 생성된 항체를 선별하여 그 단백질에 특이적으로 면역반응성을 가지고, 다형성 변형체를 제외한 다른 단백질과는 면역반응성이 없는 항체를 얻을 수 있다. 각종 면역분석법을 사용하여 특정 단백질과 특이적으로면역반응성이 있는 항체를 선별할 수 있다. 예를 들면, 고상 ELISA 면역 분석법, 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학법은 한 단백질과 특이적으로 면역반응성이 있는 모노클로날 항체를 선별하는데 통상적으로 사용된다. 특이적 면역반응성을 결정하는데 사용할 수 있는 면역 분석법의 형식과 조건에 관한 설명은 Harlow and Lane의 문헌[(1988)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York "Harlow and Lane"]을 참조하면 된다. 통상적으로 특이적 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 노이즈보다 2배 이상, 더욱 통상적으로는 배경의 10 내지 100배일 것이다.
특정 폴리뉴클레티드 서열의 "보존적으로 변형된 변형체"란 동일한 또는 거의 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리뉴클레오티드가 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우에는, 실질적으로 동일한 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴성 때문에 기능적으로 동일한 많은 수의 핵산이 어떤 일정한 폴리펩티드를 암호화한다. 예를 들면, 코돈 CGU, CGC, CGA, CGG, AGA 및 AGG는 모두 아미노산 아르기닌을 암호화한다. 따라서, 아르기닌이 한 코돈에 의해 특정된 모든 위치에서 코돈은 암호화된 폴리펩티드를 변경시키지 않고 기술된 상응하는 임의의 코돈으로 변경할 수 있다. 그러한 핵산의 변형체를 "침묵 변형체"라고 하며, 이것은 "보존적으로 변형된 변형체"의 일종이다. 특별한 언급이 없으면, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드를 암호화하는 모든 플리뉴클레오티드 서열은 또한 모든 가능한 침묵 변형체를 포함한다. 핵산에 있는 각각의 코돈(보통 메티오닌의 경우 유일한 코돈인 AUG를 제외함)은 표준 기술에 의해 기능적으로 동일한 분자를 생산하도록 변형시킬 수 있음을 당업자라면 알 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 각 "침묵 변형체"는 각 개시된 서열에 포함된다.
나아가, 당업자는 암호화된 서열에서 단일 아미노산 또는 소량의 아미노산(%)(일반적으로 5% 미만, 더욱 일반적으로 1% 미만)을 변경, 첨가 또는 결실시킨 개개의 치환체, 결실체 또는 첨가체는 "보존적으로 변형된 변형체" 임을 인식할 것이며, 여기서 변경은 하나의 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환하는 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 기술분야에 공지되어 있다. 하기 5개 군은 각각 상호간에 보존적 치환이 가능한 아미노산을 포함한다: 지방족: 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 루신(L), 이소루신(I); 방향족: 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 황 함유: 메티오닌(M), 시스테인(C); 염기성: 아르기닌(R), 리신(K), 히스티딘(H); 산성: 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 글루타민(Q). Creighton의 문헌[(1984)Ptoetins, W.H. Freeman and Company]를 참조할 수 있다. 또한, 암호화 된 서열에서 단일 아미노산 또는 소량의 아미노산(%)을 변경, 첨가 또는 결실시킨 개개의 치환체, 결실체 또는 첨가체도 "보존적으로 변형된 변형체"이다.
두 핵산이 동일한 서열을 가지고 있을 때, 또는 한 핵산이 다른 핵산의 부분 서열일 때, 또는 한 서열이 자연적으로 또는 인위적으로 다른 서열로부터 유래되었을 때 두 핵산은 "상응한다"고 한다. 한 핵산이 단백질 또는 단백질의 실질적인 단편(통상적으로 단백질의 약 5% 이상의 단편)을 암호화할 때 이 핵산은 이 단백질에 상응한다.
"부분 서열"이란 각각 더욱 긴 핵산 서열이나 아미노산 서열(예, 폴리펩티드)의 일부를 포함하는 핵산 또는 아미노산 서열을 말한다.
추가의 뉴클레오티드(또는 기타 유사 분자)가 핵산내에 삽입될 때 핵산은 "연장된다". 가장 일반적으로, 예컨대 핵산의 3' 말단에 서열을 추가시키는 폴리머라제(예, DNA 폴리머라제)로 연장시킨다.
두 핵산의 각각으로부터 유래한 서열이 자손 핵산에서 조합되면 두 핵산은 "재조합"된다. 두 핵산 모두가 재조합의 기질일 때, 두 서열은 직접적으로 재조합된다. 서열이 교차 올리고뉴클레오티드와 같은 중간물을 이용하여 재조합되면 두 서열은 "간접적으로 재조합"된다. 간접 재조합에 대해서는 서열 중 하나는 재조합을 위한 실질적 기질이고, 어떤 경우에는 두 서열 모두 재조합의 기질이 아니다.
상세한 설명
I. 서론
본 발명은, 비제한적인 예로서 곤충, 선충류, 진균류 및 거미류를 포함하는 해충에 대한 내성을 식물에 부여하는데 유용한 특성 또는 특징을 획득하거나 또는 이를 개선시키기 위해 핵산을 진화시키는 방법, 즉 변형시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물체 내에 또는 위에 존재하여 해충에 대한 식물의 방어능을 향상시키는 재조합 내병충성 유전자를 얻기 위하여 DNA 재편성을 이용한다. 본 발명은 내병충성 유전자를 최적화시키기 위해 이전에 사용된 방법을 능가하는 중요한 장점들을 제공한다. 예를 들면, DNA 재편성은 특정 특성이 매개되는 기작에 대한 상세한 이해가 없어도 바람직한 특성을 최적화시킬 수 있다. 서열 재조합은 하기 더욱 상세히 기재되는 바와 같이 여러 상이한 형태 및 교환 형태로 수행할 수 있다. 이러한 형태는 몇가지 공통된 원리를 공유한다.
이러한 변형 또는 진화를 위한 기질은, 획득하거나 개선시키고자 하는 특성들에서와 같이. 용도에 따라 다르다. 특성을 얻거나 개선시키기 위한 후보 기질의 예는 살충 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다. 이 방법은 출발 기질의 최소한 두 가지 변이 형태를 요구한다. 후보 기질의 변이 형태는 서로간의 실질적인 서열 유사성 또는 2차 구조의 유사성을 나타낼 수 있지만, 2개 이상의 위치에서 상이해야 한다. 형태간의 초기 다양성은 자연적 변이의 결과일 수 있는데, 예를 들면 상이한 변이 형태(상동체)는 유기체(지리학적 변형체 포함)의 상이한 개체 또는 종으로부터 얻어지거나, 또는 같은 유기체에서 유래한 관련 서열(예, 대립유전자 변형체)로 구성된다. 대안적으로, 초기 다양성은 유도 가능한데, 예컨대 착오형 PCR 또는 제1 변이 형태의 교정 활성(proof-reading activity)이 결핍된 폴리머라제의 이용(Liao(1990)Gene88:107-111 참조)과 같은 착오형 전사, 또는 돌연변이 유발종의 제1 형태의 복제(돌연변이 유발 숙주 세포는 하기 상세히 논의됨)로 제2 변이 형태를 형성할 수 있다. 기질들 사이의 초기 다양성은 재조합의 후속 단계에서 상당히 증대된다.
획득하거나 개선시키고자 하는 특성 또는 특징은 매우 다양하고, 물론 기질의 선택에 좌우된다. 예를 들면 내병충성 유전자의 경우 향상시킬 수 있는 특성으로는 특정 내성 유전자가 효력을 나타내는 해충의 범위 증가, 해충에 대한 효능 증대, 해충이 유전자 산물에 대한 내성을 형성하는 능력 지연 또는 제거, 내성 유전자의 발현량 증가, 프로테아제의 분해 작용 및 낮거나 높은 pH와 같은 탈안정화 조건에 대한 내성 증가, 숙주 식물에 대한 독성 감소 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 내병충성을 부여할 수 있는 2 이상의 변이 형태의 핵산을 재조합하여 재조합 내병충성 유전자의 라이브러리를 생성할 수 있다. 그 다음 라이브러리를 검색해서 원하는 특정 특성(들)에 대해 최적화된 1종 이상의 재조합 내병충성 유전자를 확인한다. 변이 형태의 후보 내병충성 유전자는 서로 실질적인 서열 유사성 또는 2차 구조의 유사성을 가질 수 있으나, 2 이상의 위치에서 서로 상이해야 한다. 형태 간의 초기 다양성은 자연적 변이의 결과일 수 있는데, 예를 들면 상이한 변이 형태(상동체)는 유기체의 다른 개체들 또는 종들(지리학적 변형체 포함; "계통 재편성"이라 칭함)로부터 얻거나, 같은 유기체로부터의 관련된 서열(대립유전자 변형체)들로 구성된다. 대안적으로, 초기 다양성은 유도가능한데, 예컨대 착오형 PCR 또는 제1 변이 형태의 교정 활성이 결핍된 폴리머라제의 이용(Liao(1990)Gene88:107-111 참조)과 같은 착오형 전사, 또는 돌연변이 유발종의 제1 형태의 복제(돌연변이 유발 숙주 세포는 하기 상세히 논의됨)로 제2 변이 형태를 형성할 수 있다.
흔히, 1 회의 재조합과 선별 후에 개선된다. 그러나, 소정의 특성이 추가로 개선되도록 하기 위해서 반복적인 서열 재조합을 이용할 수 있다. 반복적인 서열 재조합은 연속적인 사이클의 재조합을 수반하여 분자 다양성을 형성한다. 즉, 서로에 대해 일부의 서열 동일성을 나타내지만 돌연변이 존재에 있어서는 차이가 있는 핵산 분자 계통을 형성한다. 임의의 제공된 사이클에서 재조합은 생체내 또는 시험관내, 세포내 또는 세포외에서 일어날 수 있다. 추가로 재조합으로부터 유래되는 다양성은 종래의 돌연변이유발 방법(예, 착오형 PCR 또는 카세트 돌연변이 유발)을 재조합용 기질 또는 생성물에 적용함으로써 임의의 사이클에서 증가시킬 수 있다. 일부 경우, 신규하거나 개선된 특성 또는 특징은, 서열의 상이한 변이 형태(예, 유기체의 다른 개체 또는 다른 종으로부터 유래한 상동체 또는 대립 유전적 변형체와 같이 동일한 유기체의 관련된 서열)를 이용할 때, 1 사이클의 생체내 또는 시험관내 재조합을 수행한 후에 얻을 수 있다.
일반적으로 재조합 사이클을 수행한 후 원하는 특성 또는 특징을 가지는 분자에 대한 1회 이상의 검색 또는 선별 사이클을 수행한다. 재조합이 시험관내에서 수행되면, 재조합 산물, 즉 재조합 분절은 때로는 검색 단계를 수행하기 전에 세포로 도입된다. 또한, 재조합 단편은 검색 수행 전에 적절한 벡터 또는 다른 조절 서열에 연결할 수 있다. 대안적으로, 시험관내에서 생성된 재조합 산물은 때로는 검색 전에 바이러스로서 패키지징 된다. 재조합이 생체내에서 수행되는 경우, 재조합 산물은 때로는 재조합이 일어난 세포에서 검색할 수 있다. 기타 용도에서, 재조합 분절을 세포로부터 추출하여 검색전에 바이러스로서 패키징할 수도 있다.
검색 또는 선별의 특성은 획득하려는 특성 또는 특징이 무엇인가, 또는 개선시키고자 하는 특성 또는 특징이 무엇인가에 따라 좌우되며, 여러 실시예들이 하기에 논의되어 있다. 일반적으로 특정 재조합 생성물(재조합 분절)이 출발 기질과 비교하여 신규하거나 개선된 특성 또는 특징을 획득한 분자 기초를 이해해야 하는 것은 아니다. 예를 들면 내병충성 유전자는 각각이 다른 계획된 역할을 하는 여러 성분 서열(예, 암호화 서열, 조절 서열, 표적 서열, 안정성 부여 서열 및 통합에 영향을 주는 서열)을 보유할 수 있다. 이들 각각의 성분 서열은 다양하고, 동시에 재조합할 수 있다. 그 다음, 식물체에 내병충성을 부여하는 능력이 증가된 재조합 분절을 위해 검색/선별을 수행할 수 있으며, 이러한 개선은 벡터의 개개의 성분 서열 중 어느 하나에 의한 것일 필요는 없다.
소정의 특성을 위해 사용된 특정 검색 프로토콜에 따라서, 초기 라운드(들)의 검색은, 고 효율의 형질감염과 배양의 용이성 때문에 종종 박테리아 세포를 이용하여 수행할 수 있다. 이후에 수행하는 라운드와 박테리아 세포를 검색하는데 적합하지 않은 다른 형태의 검색들을 식물 세포에서 수행하여 계획된 용도로 이용될 환경과 유사한 환경에서 이용하기 위해서 재조합 분절을 최적화시킨다. 마지막 라운드의 검색은 계획된 용도의 세포와 정확히 같은 유형의 세포(예, 식물체에 존재하는 세포)에서 수행할 수 있다. 일부 방법에서는 재조합 내병충성 유전자의 이용 그 자체를 검색 라운드로서 사용할 수 있다. 즉, 목적하는 표적 세포가 성공적으로 취하고/또는 발현하는 재조합 내병충성 유전자는 이러한 표적 세포로부터 회수하고 다른 식물체에 내성을 부여하기 위해 사용한다. 제1 표적 세포로부터 회수한 재조합 내병충성 유전자는, 이 유전자의 특이적 흡수 및 통합, 해충에 대한 효능, 안정성 등에 대한 개선되거나 신규한 특성 또는 특징을 제공하는 방향으로 진화된 유전자, 즉 반복적인 서열 재조합에 의해 변형된 유전자들이 풍부하다.
검색 또는 선별 단계는, 식물체에 내병충성을 부여하는데 유용한 신규하거나 개선된 특성 또는 특징을 획득하는 방향으로 진화된 재조합 분절들의 아군을 확인한다. 검색에 따라서, 재조합 분절들을 세포의 성분, 바이러스의 성분 또는 유리 형태로서 확인할 수 있다. 각 라운드의 재조합 후에 1 라운드 이상의 검색 또는 선별 단계를 수행할 수 있다.
특성이 더 개선되기를 원한다면, 하나 이상, 일반적으로 제1 라운드의 검색/선별에서 생존한 재조합 분절의 집합을 이용하여 추가 라운드의 재조합을 수행한다. 이들 재조합 분절은 서로 또는 본래의 기질 또는 그것들의 다른 변형체를 나타내는 외인성 분절들과 재조합 수 있다. 또, 시험관내 또는 생체내에서 재조합을 진행할 수 있다. 이전의 검색 단계를 통해 원하는 재조합 분절이 세포 성분임을 확인한 경우, 이 성분에 대해 시험관내 재조합을 추가로 수행하거나, 또는 생체내 재조합을 추가로 수행하거나, 또는 시험관내 재조합 라운드를 수행하기 전에 분리할 수 있다. 역으로, 이전의 검색 단계를 통해 원하는 재조합 분절을 나출 형태 또는 바이러스 성분으로서 확인한 경우, 이러한 분절을 세포내로 도입하여 1 라운드의 생체내 재조합을 수행할 수 있다. 제2 라운드의 재조합은, 수행 방법과 무관하에, 이전 라운드로부터 생긴 재조합 분절에 존재하는 것보다 다양성이 추가된 재조합 단편을 더 생성한다.
제2 라운드의 재조합을 수행한 후에 제1 라운드에 대해 논의된 원리에 따라서 추가 라운드의 검색/선별을 수행할 수 있다. 검색/선별의 엄중도는 매 라운드마다 증가시킬 수 있다. 또한 검색의 본질 및 검색하고자 하는 특성은, 하나 이상의 특성이 개선되기를 원하거나 또는 하나 이상의 신규한 특성을 획득하기를 원하는 경우, 라운드마다 다르게 할 수 있다. 그 다음, 재조합 분절이 충분히 진화하여 소정의 신규하거나 또는 개선된 특성 또는 기능을 획득할 때 까지 추가 라운드의 재조합 및 검색을 수행할 수 있다.
본 발명의 실시는 재조합 핵산의 작제 및 형질감염된 숙주 세포에서의 유전자 발현을 포함한다. 이러한 목적를 달성하기 위한 분자 클로닝 기술들은 당업계에 공지되어 있다. 발현 벡터와 같은 재조합 핵산의 작제에 적합한 각종 클로닝 및 시험관내 증폭 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 여러 클로닝 실행을 통해 당업자를 지도하기에 충분한 기법 및 지침서의 예는 문헌[Sambrook 등(1989)Molecular Cloning: A Laboratoty Manual, 2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory("Sambrook"); Berger 및 Kimmel,Guide to Molecular CloningTechniques, Methods in Enzymologyvolume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA("Berger"); 및Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel 등, eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.,(1994 Supplement)("Ausubel")]에서 찾을 수 있다.
II. 서열 재조합 형식
본 발명의 방법은 재조합("재편성") 및 검색 또는 선별을 수행하여 개개 유전자, 전체 플라스미드 또는 바이러스, 복수 유전자 클러스터 또는 전체 게놈도 "진화시킨다"(Stemmer(1995)Bio/Technology13:549-553). 반복적인 재조합 및 검색/선별 사이클을 수행하여 관심있는 핵산을 추가로 진화시킬 수 있다. 이러한 기법들은 폴리펩티드 공학을 위한 종래의 방법들에 의해 요구되는 광범위한 분석및 컴퓨터의 사용이 필요하지 않다. 재편성은 자연적인 쌍으로 일어나는 재조합 사건(예, 성 복제 동안 일어나는 바와 같은 것)과는 대조적으로, 최소한의 선별 사이클을 통해 많은 수의 돌연변이를 재조합시킨다. 따라서, 본 명세서에 기재된 서열 재조합 기술은, 이들이 일부 또는 모든 돌연변이 사이에서 재조합을 발생시켜 상이한 돌연변이 조합이 소정의 결과에 영향을 줄 수 있는 방법을 찾는 매우 신속한 방법을 제공한다는 점에서 특히 유용하다. 그러나, 어떤 경우에는 서열 재조합에는 필요하지 않지만, 기술의 변형 기회를 제공하는 구조적 및/또는 기능적 정보가 이용가능하다.
발명자들과 그 동료들에 의한 많은 공보들에는 DNA 재편성에 관해 기술되어 있다. 문헌[Stemmer 등(1994) "Rapid Evolution of a Protein"Nature370:389-391; Stemmer(1994)"DNA Shuffling by Random Fragmentation and Reassembly: in vitro Recombination for Molecular Evolution,"Proc. Natl. Acad. USA91:10747-10751; Stemmer 미국 특허 제5,603,793호 METHODS FOR IN VITRO RECOMBINATION; Stemmer 등 미국 특허 제5,830,721호 DNA MUTAGENESIS BY RANDOM FRAGMENTATION AND REASSEMBLY 및 Stemmer 등 미국 특허 제5,811,238호 METHODS FOR GENERATING POLYNUCLEOTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS BY ITERATIVE SELECTION AND RECOMBINATION]에는, 예를 들면 시험관내 단백질 재편성 방법, 예컨대 반복되는 돌연변이 유발에 의한 재편성 방법, 재편성 및 선별 뿐만 아니라 디스플레이된 펩티드와 항체의 라이브러리를 생성하는 각종 방법, DNA를 단편화한 후에 수행하는 다양한 DNA 재집합 기술 및 시험관내 및 생체내에서 돌연변이 유발법에 대한 이들의응용 등이 개시되어 있다.
DNA 재편성 기술의 응용 방법도 본 발명자들과 그 동료들이 개발하였다. 전술한 공보들 뿐만 아니라 Minshull 등의 미국 특허 제5,837,458호[METHODS AND COMPOSITIONS FOR CELLULAR AND METABOLIC ENGINEERING]는 반복적인 재편성 기술을 통한 새로운 대사 경로의 진화 및 생체 프로세싱의 향상을 제공한다. Crameri 등의 문헌[(1996), "Construction And Evolution Of Antibody-Phage Libraries By DNA Shuffling"Nature Medicine2(1):100-103]은 항체 파지 라이브러리용 항체 재편성 방법을 기술하고 있다. 또한 DNA 재편성에 대한 추가의 상세한 설명은 WO 95/22625호, WO 97/20078호, WO 96/33207호, WO 97/33957호, WO 98/27230호, WO 97/35966호, WO 98/31837호, WO 98/13487호, WO 98/13485호 및 WO 98/42832호에 개시되어 있다.
또한, 본 발명의 발명자들과 동료들 뿐 아니라 당업계의 다른 연구자들의 여러 공보들에는, 예컨대 유전자의 소단편 유래의 유전자 또는 유전자 단편을 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 재집합시켜 DNA 재편성을 용이하게 하는 기술들을 설명하고 있다. 예를 들면, 전술한 공보들 외에도, Stemmer 등의 미국 특허 제5,834,252호[(1998), END COMPLEMENTARY POLYMERASE REACTION]는 단편으로부터 거대 폴리펩티드를 집합시키는 것 뿐만 아니라 (예컨대, 핵산의 혼합물중에서) 표적 서열을 증폭 및 검출하는 공정을 기술하고 있다.
재조합 라이브러리 형성
본 발명은 폴리뉴클레오티드의 재조합 라이브러리를 제조하고 검색하여 원하는 특성을 나타내는 라이브러리의 구성원(예컨대, 살충 활성을 암호화함)을 확인하는 단계를 포함한다. 재조합 라이브러리는 당업자에게 명백한 다른 여러 방법들 뿐만아니라 본 명세서에 개시된 다양한 방법들 중 어느 하나를 이용하여 제조할 수 있다.
재조합 플리뉴클레오티드를 생산하는 방법 및/또는 하기에 개시된 바와 같이 DNA 재편성 기질로서 사용되는 핵산의 다양성을 얻는 방법으로는, 상동성 재조합(PCT/US98/05223; 공개 번호 WO 98/42727호);올리고뉴클레오티드 지향형 돌연변이 유발법(Smith,Ann. Rev. Genet.19:423-462(1985); Botstein 및 Shortle, Science 229: 1193-1201(1985); Carter, Biochem. J. 237:1-7(1986); Kunkel, "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis"in Nucleic acids & Molecular Biology, Eckstein 및 Lilley, eds., Springer Verlag, Berlin(1987) 참조) 등이 있다. 이러한 방법들 중에는 올리고뉴클레오티드 지향형 돌연변이 유발법(Zoller 및 Smith,Nucl. Acids Res.10:6487-6500(1982),Methods in Enzymol.100:468-500(1993), 및Methods in Enzymol.154:329-350(1987)), 포스포티오에이트 변형된 DNA 돌연변이 유발법(Taylor 등, Nucl. Acids. Res. 13:8749-8764(1985); Taylor 등,Nucl. Acids Res.13:8765-8787(1985); Nakamaye 및 Eckstein,Nucl. Acids Res.14:9679-9698(1986); Sayers 등,Nucl. Acids Res.16:791-802(1988); Sayers 등,Nucl. Acids Res.16:803-814(1988)), 우라실 함유 주형을 이용한 돌연변이 유발법(Kunkel,Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA82:488-492(1985) 및 Kunkel 등,Methods in Enzymol.154:367-382)); 틈이 있는 두가닥DNA를 이용한 돌연변이 유발법(Kramer 등,Nucl. Acids Res.12:9441-9456(1984); Kramer and Fritz,Methods in Enzymol.154:350-367(1987); Kramer 등,Nucl. Acids Res.16:7207(1988)); 및 Fritz 등,Nucl. Acids Res.16:6987-6999(1988)) 등이 있다. 추가의 적합한 방법으로는 점 부정합 복원법(point mismatch repair)(Kramer 등,Cell38:879-887(1984)), 복원 결핍 숙주종을 이용한 돌연변이 유발법(Carter 등,Nucl. Acids Res.13:4431-4443(1985); Carter,Methods in Enzymol.154:382-403(1987)), 결실 돌연변이 유발법(Eghtedarzadeh 및 Henikoff,Nucl. Acids Res.14:5115(1986)), 제한-선별 및 제한-정제법(Wells 등,Phil. Trans. R. Soc. Lond.A 317:415-423(1986)), 총 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발법(Nambiar 등,Science223:1299-1301(1984); Sakamar 및 Khorana,Nucl. Acids Res.14:6361-6372(1988); Wells 등,Gene34:315-323(1985); 및 Grundstorm 등,Nucl. Acids Res.13:3305-3316(1985) 등이 있다. 돌연변이 유발을 위한 키트는 시판되고 있다(예, 바이오-라드, 아머샴 인터내쇼날, 앤글리안 바이오테크놀러지)
현재 선호되는 일양태에 있어서, 재조합 라이브러리는 DNA 재편성을 이용하여 제조한다. 재편성 및 검색 또는 선별을 이용하여 개개의 유전자, 총 플라스미드 또는 바이러스, 복수 유전자 클러스터 또는 전체 게놈도 "진화"시킬 수 있다(Stemmer(1995)Bio/Technology13:549-553).
반복되는 재조합 및 검색/선별 사이클을 수행하여 관심있는 핵산을 추가로 진화시킬 수 있다. 이러한 기술들은 폴리펩티드 공학을 위한 종래의 방법들에 의해 요구되는 광범위한 분석 및 컴퓨터 사용이 필요하지 않다. 재편성은 통상적인 쌍으로 일어나는 재조합 사건과는 대조적으로, 최소한의 선별 사이클을 통해 많은 수의 돌연변이를 재조합시킨다. 따라서, 본 명세서에 기재된 서열 재조합 기술은, 이들이 임의의 또는 모든 돌연변이 사이에서 재조합을 발생시켜 상이한 돌연변이 조합이 소정의 결과에 영향을 줄 수 있는 방법을 찾는 매우 신속한 방법을 제공한다는 점에서 특히 유용하다. 그러나, 어떤 경우에는 서열 재조합에는 필요하지 않지만, 기술의 변형 기회를 제공하는 구조적 및/또는 기능적 정보가 이용가능하다.
때로는 DNA 재편성, 진화 또는 분자 증가로 언급되는 서열 재조합을 위한 대표적인 형식과 실시예는, 본 발명자들과 그 연구진들의 공계류 중인 특허 출원인 미국 특허 출원 일련번호 08/198,431호(1994년 2월 17일에 출원됨), PCT/US95/02126호(1995년 2월 17일에 출원됨), 08/425,684호(1995년 4월 18일에 출원됨), 08/537,874호(1995년 10월 30일에 출원됨), 08/564,955호(1995년11월 30일에 출원됨), 08/621,859호(1966년 3월 25일에 출원됨), 08/621,430호(1996년 3월 25일에 출원됨), PCT/US96/05480호(1996년 4월 18일에 출원됨), 08/650,400호(1996년 5월 20일에 출원됨), 08/675,502호(1996년 7월 3일에 출원됨), 08/721,824호(1996년 9월 27일에 출원됨), PCT/US97/17300(1997년 9월 26일에 출원됨), PCT/US97/24239(1997년 12월 17일에 출원됨); 및 문헌[Stemmer,Science270:1510(1995); Stemmer 등,Gene164:49-53(1995); Stemmer,Bio/Technology13:549-553(1995); Stemmer,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.91:10747-10751(1994); Stemmer,Nature370:389-391(1994); Crameri 등,Nature Medicine2(1):1-3(1996); Crameri 등,Nature Biotechnology14:315-319(1996)]에 기술되어있으며, 이들 각각은 모든 목적을 위해 그 전문을 참고로 인용한다.
추가의 재편성 형식 정보
본 발명의 방법은 재조합("재편성") 및 검색 또는 선별을 수행하여 개개의 유전자, 전체 플라스미드 또는 바이러스, 복수 유전자 클러스터 또는 전체 게놈도 "진화"시킨다(Stemmer(1995)Bio/Technology13:549-553). 반복적인 재조합 및 검색/선별 사이클을 수행하여 관심있는 핵산을 추가로 진화시킬 수 있다. 이러한 기법들은 폴리펩티드 공학을 위한 종래의 방법들에 의해 요구되는 광범위한 분석 및 컴퓨터의 사용이 필요하지 않다. 재편성은 통상적인 쌍으로 일어나는 재조합 사건과는 대조적으로, 최소한의 선별 사이클을 통해 많은 수의 돌연변이를 재조합시킨다. 따라서, 본 명세서에 기재된 서열 재조합 기술은, 이들이 임의의 또는 모든 돌연변이 사이에서 재조합을 발생시켜 상이한 돌연변이 조합이 소정의 결과에 영향을 줄 수 있는 방법을 찾는 매우 신속한 방법을 제공한다는 점에서 특히 유용하다. 그러나, 어떤 경우에는 서열 재조합에는 필요하지 않지만, 기술의 변형 기회를 제공하는 구조적 및/또는 기능적 정보가 이용가능하다.
때로는 DNA 재편성, 진화 또는 분자 증가로 언급되는 서열 재조합을 위한 대표적인 형식과 실시예는 본 발명자들과 그 연구진들의 하기 특허와 특허 출원에 기술되어 있다. 미국 특허 제5,605,793호; PCT 출원 WO 95/22625호(PCT/US95/02126, 1955년 2월 17일에 출원됨), 미국 출원 일련번호 08/425,684호(1995년 4월 18일에 출원됨), 미국 출원 일련번호 08/621,430호(1996년 3월 25일에 출원됨), PCT 출원 WO 97/20078호(PCT/US96/05480, 1996년 4월 18일에 출원됨); PCT 출원 WO 97/35966호(1997년 3월 20일에 출원됨); 미국 출원 일련번호 08/675,502호(1996년 7월 3일에 출원됨); 미국 출원 일련번호 08/721,824호(1996년 9월 27일에 출원됨), PCT 출원 WO 98/13487호(1997년 9월 26일에 출원됨); Stemmer,Science270:1510(1995); Stemmer 등,Gene164:49-53(1995); Stemmer,Bio/Technology13:549-553(1995); Stemmer,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.91:10747-10751(1994); Stemmer,Nature370:389-391(1994); Crameri 등,Nature Medicine2(1):1-3(1996); Crameri 등,Nature Biotechnology14:315-319(1996). 이들 각각은 모든 목적을 위해 그 전문을 참고로 인용한다.
증식(breeding) 절차는 일반적으로 서로에 대해 실질적인 서열 동일성(즉, 약 30% 이상, 50%, 70%, 80% 또는 90%)을 나타내지만 일부 위치에서 서로 다른 2개 이상의 기질들로 개시한다. 차이는 돌연변이 중 임의 형태, 예를 들면 치환, 삽입 및 결실일 수 있다. 흔히 상이한 분절들은 5∼20개 위치에서 서로 다르다. 출발 물질에 비해 다양성이 증가된 재조합의 경우, 출발 물질은 2개 이상의 뉴클레오티드 위치에서 서로 달라야 한다. 즉, 기질이 2개 뿐이면, 2 이상의 분기점이 있어야 한다. 기질이 3개면, 예컨대 한 기질은 제2 기질과 한 지점에서 다르고 제2 기질은 제3 기질과 한 지점에서 다를 수 있다. 출발 DNA 분절은 서로의 천연 변형체 예를 들면, 대립 유전자 또는 변이종일 수 있다. 분절은 어느 정도 구조적 관련성 및 일반적으로 기능성 관련성을 나타내는 비대립 유전자(예, 바실러스 투린지엔시스 독소 계통과 같은 아과내 상이한 유전자)로부터 유래할 수 있다. 또한 출발 DNA 분절은 서로의 유도된 변형체일 수 있다. 예를 들면, 한 DNA 분절은 다른 것의 착오형PCR 복제 또는 돌연변이유발 카세트의 치환에 의해 생성할 수 있다. 유도된 돌연변이는 돌연변이 유발종의 분절 중 하나(또는 둘 다)를 증식시킴으로써 제조할 수 있다. 이들 상황에서, 엄격히 말하면, 두번째 DNA 분절은 단일 분절이 아니라 관련된 분절의 거대 계통이다. 출발 물질을 형성하는 상이한 분절들은 종종 동일한 길이이거나 또는 거의 동일한 길이이다. 그러나 이 경우에는 반드시 그럴 필요는 없다. 예를 들면 한 분절이 다른 것의 부분 서열일 수 있다. 이 단편들은 거대 분자들의 일부, 예를 들면 벡터의 일부로서 존재할 수 있고 또는 분리된 형태로 존재할 수 있다.
출발 DNA 분절은 본 명세서에 의해 제공되는 임의의 서열 재조합 형식으로 재조합하여 재조합 DNA 분절들의 다양한 라이브러리를 형성할 수 있다. 그러한 라이브러리는 크기면에서 매우 다양하여, 10 이하 내지 105, 109또는 1012구성원에 이른다. 일부 양태들에서, 출발 분절 및 형성된 재조합 라이브러리는 전길이 암호화 서열과 발현에 필요한 임의의 필수 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 기타 양태에 있어서, 라이브러리내 재조합 DNA 분절은 검색/선별을 수행하기 전에 발현에 필요한 서열을 제공하는 통상의 벡터내로 삽입할 수 있다.
A. 돌연변이를 재조합하기 위한 제한효소 부위의 이용
어떤 경우에는 핵산 내의 제한 효소 부위를 이용하여 해당 핵산 서열의 돌연변이 재조합을 유도하는 것이 유리하다. 이러한 기술은 반복되는 DNA 또는 다른 문제가 되는 1차 서열 모티프가 존재하기 때문에 기존의 방법에 의해 쉽게 재편성할수 없는 단편들을 진화시키는데 특히 바람직하다. 이러한 경우는 또한 돌연변이되지 않은 일부 서열을 보유하는 것이 바람직한 재조합 형식도 포함한다. 제한 효소 부위를 이용하는 것도 거대 단편들(일반적으로 10 kb 이상), 예컨대 크기로 인하여 쉽게 재편성할 수 없고 "PCR 증폭"할 수 없는 유전자 클러스터을 재편성하는데 바람직하다, 50 kb 이하의 단편들은 PCR에 의해 증폭되는 것으로 보고되고 있지만(Barnes,Proc. Natl. Acad. sci. U.S.A.91:2216-2220(1994)) 10 kb 이상의 단편의 경우에는 증폭에 문제가 있고, 따라서 10 내지 50 kb 및 그 이상의 범위내 단편들을 재편성하기 위한 대안적인 방법이 바람직하다. 바람직하게, 사용되는 제한 엔도뉴클레아제는 클레스 II형(Sambrook 등,Molecular Cloning, CSH Press, 1987)이며, 이들 중에서 Alwn I, SfiI 또는 Bst X1과 같은 비회문형 점착형 말단 돌출부를 생성하는 것들이 바람직하다. 이들 효소는 비회문형 말단을 생성시켜 DNA 리가제로 효율적인 정돈형 재집합을 가능하게 한다. 일반적으로 제한효소(또는 엔도뉴클레아제) 부위는 종래의 제한효소 지도 작동 기술(상기 Sambrook 등), 그 유전자에 대한 서열 정보 분석 또는 합성을 통해 원하는 제한 부위를 핵산 서열내로 도입(즉, 침묵 돌연변히 도입)에 의해 확인할 수 있다.
분해하고자 하는 DNA 기질 분자들은 플라스미드 제제와 같은 생체내 복제 DNA로부터 유래하거나, 또는 바람직하게는 단편의 양끝에 근접하여 관심있는 제한 효소 인식 부위를 보유하는 증폭된 PCR 핵산 단편으로부터 유래할 수 있다. 통상적으로 각각 하나 이상의 돌연변이를 가지는 해당 유전자의 2 이상의 변형체는 해당 핵산 서열 내에서 절단하도록 결정된 1종 이상의 제한 효소로 분해한다. 이어서,제한 단편들을 DNA 리가제로 연결하여 재편성된 영역을 보유하는 전길이 유전자를 생성한다. 재편성된 영역의 수는 해당 핵산 서열 내의 절단 수에 좌우될 것이다.재편성된 분자는 전술한 바와 같이 세포내로 도입하여, 본 명세서에 기술된 바와 같은 소정의 특성에 대해 검색 또는 선별할 수 있다. 그 후에 소정의 특성을 갖는 푸울(라이브러리) 또는 클론으로부터 핵산을 분리할 수 있으며, 목적하는 정도로 개선될 때 까지 동일한 절차를 반복한다.
일부 양태에서, 1종 이상의 DNA 기질 분자 또는 이의 단편을 분리하여 돌연변이 유발시킨다. 일부 양태에서, 재결찰된 제한 단편의 푸울 또는 라이브러리에 대해 돌연변이 유발시킨 후 분해-결찰 과정을 반복한다. 본 발명에서 사용된 "돌연변이 유발"은 당업계에 공지된 기법, 예컨대 PCR 돌연변이 유발, 올리고뉴클레오티드 지향성 돌연변이 유발, 부이 지향적 돌연변이 유발 및 본 발명에 기술된 임의의 기법에 의한 반복적인 서열 재조합을 포함한다.
B. 재집합 PCR
핵산 서열의 돌연변이를 재조합하기 위한 그 밖의 기술로는 "재집합 PCR"을 이용한다. 이 방법을 사용하여 개별적으로 진화된 복수의 분절을 유전자와 같은 전길이 핵산 주형으로 집합시킬 수 있다. 이 기법은 유리한 돌연변이체 푸울이 기존의 작업으로부터 알려져 있거나 기술분야에 공지된 임의의 돌연변이 유발 기술들, 예컨대, PCR 돌연변이 유발, 카세트 돌연변이 유발, 도핑형 올리고 돌연변이 유발, 화학적 돌연변이 유발 또는 돌연변이유발 종에서 DNA 주형의 생체내 증식 방법에 의해 생성될 수 있는 돌연변이를 검색함으로써 확인한 경우 수행한다. 해당 핵산서열의 분절을 한정하는 경계는 유전자간 영역, 인트론 또는 해당 돌연변이를 보유할 것 같지 않은 유전자 부위에 존재하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드 프라이머(올리고)는 해당 핵산 서열의 분절의 PCR 증폭을 위해 합성하여 올리고뉴클레오티드의 서열이 두 분절의 연결부를 중첩시키도록 한다. 중첩 영역은 통상적으로 길이가 약 10 내지 100 뉴클레오티드이다. 각각의 분절들은 한 세트의 프라이머로 증폭된다. 그 다음 PCR 생성물은 본 발명에 기술된 바와 같이 재집합 프로토콜에 따라서 "재집합"시켜 무작위로 단편화된 유전자들을 재집합시킨다. 요약하면, 재집합 프로토콜에서 PCR 생성물은 먼저, 예컨대 겔 전기영동 또는 크기 배제 크로마토그래피로 프라이머로부터 정제한다. 정제된 생성물을 함께 혼합하여 추가의 프라이머("자가-프라이밍")의 부재하에 적절한 완충 염과 폴리머라제 및 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP's)의 존재하에서 약 1 내지 10 사이클의 변성, 재어닐링 및 연장을 수행한다. 유전자의 측면에 있는 프라이머로 계속하여 PCR을 수행하여 완전히 재집합되고 재편성된 유전자의 수율을 증폭시킨다.
일부 양태에서, 생성 재집합된 유전자를 돌연변이 유발시킨 후 이 공정을 반복한다.
추가의 양태에 있어서, 해당 핵산 서열의 분절을 증폭시키기 위한 PCR 프라이머를 사용하여 다음과 같이 해당 유전자내로 변형체를 도입한다. 핵산 서열의 해당 위치에 발생된 돌연변이는 검색 또는 선별, 핵산 서열의 상동체 서열 결정 등으로 확인한다. 다음으로, 해당 위치에서 야생형 또는 돌연변이 정보를 암호화하는 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 합성한다. 이들 프라이머는 PCR 돌연변이 유발에 사용하여 지정된 위치에서 야생형 및 돌연변이 정보의 교환을 암호화하는 전길이의 유전자 라이브러리를 형성한다. 이 기술은 일반적으로 검색 또는 선별 과정이 비용이 많이 들고, 귀찮거나, 해당 돌연변이체의 유전자를 서열 결정하고 돌연변이 올리고뉴클레오티드를 합성하는데 드는 비용에 비해 실용적이지 못한 경우에 유리하다.
C. 상동체 돌연변이를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 이용한 부위 지향적 돌연변이 유발(SDM)과 재편성
본 발명의 일부 양태에 있어서, 1종 이상의 기질 서열로부터 얻은 서열 정보는, 검색 또는 선별의 라운드 중간에 후속 재조합 과정으로 제공된 해당 "모"서열에 첨가한다. 통상적으로, 이 과정은, 주형으로서의 한 기질과 다른 기질 서열(예, 상동체 유전자)로부터 유래한 하나 또는 복수의 돌연변이를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 기술분야에 잘 알려진 기술(상기의 Sambrook 등의 문헌 참조)에 의해 수행된 부위 지향적 돌연변이 유발법으로 행해진다. 해당하는 개선된 표현 형질을 검색 또는 선별한 후에, 선별된 재조합체는 본 발명에 기재된 RSR 기술을 이용하여 추가로 진화시킬 수 있다. 검색 또는 선별 후에, 상동 돌연변이를 암호화하는 또 다른 올리고뉴클레오티드의 집합체로 다시 부위 지향적 돌연변이 유발법을 수행하고, 원하는 특성이 얻어질 때까지 상기 과정을 반복한다.
2개의 상동체 사이의 차이가 코돈 내에서의 하나 이상의 단일점 돌연변이일 때, 양 상동체의 서열을 암호화하는 축퇴성 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 하나의 올리고뉴클레오티드는 여러 축퇴성 코돈을 포함할 수 있으며, 서열 블록에걸쳐 모든 교환을 철저히 조사할 수 있다.
상동체 서열 공간이 매우 클 경우, 조사 대상을 일부 변형체로 제한하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 예컨대 컴퓨터 모델링 도구(Lathrop 등(1996)J. Mol. Biol., 255:641-665)를 사용하여 각 상동체 돌연변이를 표적 단백질에 맞춰서, 구조와 기능을 크게 파괴하는 것으로 예견되는 돌연변이를 버릴 수 있다.
D. 시험관내 DNA 재편성 형식
시험관내 DNA 서열 재편성에 대한 구체적인 한 예가 도 1에 예시되어 있다. 재조합을 위한 초기 기질들은 관련된 서열, 예컨대 한 유기체의 상이한 개체, 계통 또는 종에서 유래한 상동체로서 상이한 변이 형태, 또는 대립 변형체로서 동일한 유기체에서 유래한 관련 서열의 푸울이다. 도 1, 패널 A의 X's는 서열이 분기되는 위치를 도시한다. 서열은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 유전자의 크기 또는 재조합 또는 재집합시키고자 하는 DNA 단편의 크기에 따라 길이가 다양할 수 있다. 바람직하게는 서열은 50 염기쌍(bp) 내지 50 킬로염기(kb)이다.
관련 기질의 푸울은, 도 1의 패널B에 제시된 바와 같이, 예컨대 약 5 염기쌍(bp) 내지 5 킬로염기쌍(kb)의 중접 단편으로 전환시킨다. 흔히, 예를 들면 단편의 크기는 약 10 bp 내지 1000 bp이고 때로는 DNA 단편의 크기가 약 100 bp 내지 500 bp이다. 여러 상이한 방법, 예컨대 DNase I 또는 RNase 분해, 무작위 전단 또는 부분 제한효소 분해로 전환시킬 수 있다. 핵산의 분리, 조작, 효소 분해 등을 위한 프로토콜에 관한 논의는, 예컨대 상기 Sambrook 등의 문헌 및 Ausubel의 문헌를 참조하면 된다. 특정 길이 및 서열의 핵산 단편들의 농도는 흔히 총 핵산의 0.1중량% 또는 1 중량% 미만이다. 혼합물 중 상이한 특정 핵산 단편의 수는 일반적으로 약 100 이상, 500 이상 또는 1000 이상이다.
핵산 단편들의 혼합 군은, 예컨대 가열, 화학 변성, DNA 결합 단백질의 이용 등을 비롯한 각종 기법을 사용하여 적어도 부분적으로 1본쇄인 형태로 전환시킨다. 약 80℃ 내지 100℃, 더욱 바람직하게는 90℃ 내지 96℃로 가열함으로써 1본쇄 핵산 단편들을 형성한 다음, 재어닐링시켜 전환을 실시할 수 있다. 전환은 또한 1본쇄 DNA 결합 단백질(Wold(1997)Annu. Rev. Biochem.66:61-92 참조) 또는recA 단백질(예, Kiianitsa(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA94:7837-7840 참조)로 처리함으로써 실시할 수 있다. 그 다음, 다른 1본쇄 핵산 단편들과의 서열 동일성 영역을 보유한 1본쇄 핵산 단편들은 20℃ 내지 75℃, 바람직하게는 40℃ 내지 65℃로 냉각시킴으로써 재어닐링시킬 수 있다. 재생은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 기타 부피 배제(volume-excluding) 시약 또는 염을 첨가하여 가속화할 수 있다. 염의 농도는 바람직하게는 0 mM 내지 200 mM이며, 더욱 바람직하게는 10 mM 내지 100 mM이다. 염은 KCl 또는 NaCl일 수 있다. PEG의 농도는 바람직하게는 0% 내지 20% 이고, 보다 바람직하게는 5% 내지 10%이다. 재어닐링된 단편은 도 1의 패널 C에 도시된 상이한 기질들로부터 유래할 수 있다. 어닐링된 핵산 단편은 핵산 폴리머라제, 예컨대 Taq 또는 Klenow 및 dNTP's(즉, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP)의 존재하에 항온처리한다. 서열 동일성 영역이 거대한 경우 Taq 폴리머라제는 45℃ 내지 65℃의 어닐링 온도에서 사용할 수 있다. 동일성 영역이 작은 경우, 클레노우 폴리머라제는 20℃ 내지 30℃의 어닐링 온도에서 사용할 수 있다. 폴리머라제는 어닐링 전, 어닐링과 동시에, 또는 어닐링 후에 무작위 핵산 단편에 참가할 수 있다.
단편의 상이한 교환을 포함하는 폴리뉴클레오티드 집합체를 형성하기 위해서 폴리머라제의 존재하의 중첩 단편의 변성, 재생 및 항온처리 과정은 때로는 시험관내 핵산 재편성 과정으로 언급된다. 이러한 사이클은 소정의 횟수 만큼 반복한다. 바람직하게는 이 사이클은 2 내지 100회 반복되며, 더욱 바람직하게는 10 내지 40회 반복된다. 결과로서 얻어지는 핵산은 도 1의 패널 D에 도시된 바와 같이, 약 50 bp 내지 약 100 kb, 바람직하게는 500 bp 내지 50 kb의 2본쇄 폴리뉴클레오티드의 계통이다. 이 군은 실질적인 서열 동일성을 나타내지만 일부 위치에서 분기하는 출발 기질의 변형체를 제시한다. 이 군은 출발 기질보다 더 많은 수의 구성원을 보유한다. 재편성 결과 생긴 단편군을 사용하여, 필요에 따라 벡터내로 클로닝한 후에 숙주 세포를 형절전환시킨다.
시험관내 재편성을 이용한 일양태에서, 재조합 기질들의 부분 서열은 불완전하게 연장된 증폭 생성물의 실질적인 부분, 통상적으로 20% 이상을 생성하는 조건하에서 전길이의 서열을 증폭시켜 형성할 수 있다. 또 다른 일양태는 전체 주형 DNA를 개시하기 위해 랜덤 프라이머를 이용하여 전 길이 미만의 증폭 생성물을 형성한다. 불완전하게 연장된 증폭 생성물을 비롯한 증폭 생성물을 변성시키고, 추가의 1회 이상의 재어닐링 및 증폭 사이클을 수행한다. 1회 이상의 재어닐링 및 증폭 사이클로 불완전하게 연장되는 생성물의 실질적인 부분을 제공하는 변형을 "스터터링(stuttering)"이라고 한다. 후속 증폭 라운드에서, 부분적으로 연장된(전길이 미만) 생성물을 상이한 서열 관련 주형 종에 재어닐링시키고 연장 개시한다. 또 다른양태에서, 기질을 단편으로 전환시키는 것은 기질의 부분적 PCR 증폭으로 실시할 수 있다.
또 다른 일양태에 있어서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 단편 혼합물에 매립(spike)시킨다. 이 올리고뉴클레오티드는 미리 특성 규명된 야생형 서열의 돌연변이, 또는 개체나 종간의 천연 변형체의 부위를 포함하도록 고안할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 야생형 단편과 어닐링할 수 있는 돌연변이 또는 변형체와 인접하여 충분한 서열 또는 구조적인 상동성을 포함한다. 어닐링 온도는 상동체 길이에 따라 조정할 수 있다.
또 다른 양태에서 재조합은, 예컨대 하나의 주형으로부터 유도된 DNA 단편이 관련되어 있으나 상이한 주형의 상동성 위치상에서 개시되는 경우와 같이, 주형 변환에 의해 1 사이클 이상 일어난다. 주형 변환은 recA(상기 Kiianitsa(1997) 참조), rad51(Namsaraev(1997)Mol. Cell. Biol.17:5359-5368 참조), rad55(Clever(1997)EMBO J.16:2535-2544 참조), rad57(Sung(1997)Genes Dev.11:1111-1121 참조) 또는 기타 폴리머라제(예, 바이러스 폴리머라제, 역전사 효소)를 증폭 혼합물에 첨가함으로써 유도할 수 있다. DNA 주형 농도를 증가시킴으로써 주형 변환을 증가시킬 수 있다.
또 다른 구체적인 예는 1 사이클 이상의 증폭을 이용하는 것으로서, 관련된 서열이고 길이는 다른 중첩 1본쇄 DNA 단편의 집합을 이용하여 실시할 수 있다. 단편은 M13과 같은 1본쇄 DNA 파지를 이용하여 제조할 수 있다(Wang(1997)Biochemistry36:9486-9492 참조). 각각의 단편은 집합의 제2 단편에 하이브리드화하고 폴리뉴클레오티드 사슬 연장을 개시하여, 서열-재조합된 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 추가의 변형예에서, 가변 길이의 ssDNA 단편은 Pfu, Taq, Vent, Deep Vent, U1Tma DNA 폴리머라제 또는 기타 DNA 폴리머라제에 의해 단일 프라이머로부터 제1 DNA 주형위에 생성할 수 있다(Cline(1996)Nucleic Acids Res.24:3546-3551 참조). 1본쇄 DNA 단편은 우라실-함유 환형 ssDNA로 구성되는 제2의 Kunkel-형 주형에 대한 프라이머로 사용한다. 이는 제1 주형을 제2 주형으로 다중 치환시킨다. (Levichkin(1995)Mol. Biology29:572-577; Jung(1992)Gene121:17-24 참조).
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 반복적인 재조합 방법을 이용하여 얻은 재편성된 핵산을 세포 및/또는 유기체로 삽입시켜 검색을 수행한다. 재편성된 곤충 내성 유전자를 초기 검색을 위해서, 예컨대 박테리아 세포, 효모 세포 또는 식물 세포로 도입할 수 있다. 바실러스 종(예, B. 서브틸리스) 및 E. 콜리는 재편성된 곤충 내성 유전자를 삽입 및 발현시킬 수 있는 적합한 박테리아 세포의 두가지 예가 된다. 재편성된 유전자는 염색체 DNA에 삽입하거나 또는 플라스미드로서 박테리아 또는 효모 세포로 도입할 수 있다. 재편성된 유전자는 검색을 목적으로 식물 세포에 도입할 수 있다. 따라서, 해당 돌연변이 유전자는 본 발명의 시험관내 반복적인 서열 재조합 방법을 이용하여 변형시키고 세포내로 재삽입시켜 신규한 또는 개선된 특성에 대해 생체내/동일계 선별을 수행할 수 있다.
E. 생체내 DNA 재편성 형식
본 발명의 일부 양태에서, DNA 기질 분자는 세포에 도입되며, 세포내 세포기구가 재조합을 유도한다. 예를 들면 돌연변이체의 라이브러리를 작제하고, 본원에 개시된 임의의 기법으로 개선된 특성을 보유한 돌연변이체를 검색 또는 선별한다. 최상 후보를 암호화하는 DNA 기질 분자는 본원에 개시된 임의의 기법으로 회수한 다음, 단편화하고, 식물 숙주를 형질감염시키는데 사용하여 개선된 기능을 검색 또는 선별한다. 추가의 개선을 목적하는 경우, DNA 기질 분자는 PCR과 같은 방법에 의해 식물 숙주 세포로부터 회수하고, 원하는 정도의 개선을 달성할 때 까지 그 과정을 반복한다. 일부 양태에서, 단편을 형질감염 전에 변성 및 재어닐링시키고, recA와 같은 재조합 자극 단백질로 피복하거나, 또는 NeoR과 같은 선별 마커로 동시 형질감염시켜서 해당 유전자의 재조합체를 수용한 세포에 대해 양성 선별을 한다. 생체내 재편성 방법은, 예컨대 PCT 출원 WO 98/13487호에 기술되어 있다.
생체내 재편성의 효율은 숙주 세포내에 해당 유전자의 사본수를 증가시켜 개선할 수 있다. 예를 들면, 영양 배지에서 증식된 정지기 배양물 중 대부분의 박테리아 세포는 2, 4 또는 8개의 게놈을 포함한다. 최소 배지에서 세포는 1 또는 2개의 게놈을 포함한다. 따라서 박테레아 세포 당 게놈의 수는 정지기에 진입할 때 세포의 증식율에 좌우된다. 그 이유는 급격히 성장하는 세포가 다중 복제 포크를 포함하고 있어서 종료 후 세포 내 여러개의 게놈을 초래하기 때문이다. 시험된 모든 종이 정지기에서 하나 이상의 염색체를 가지고 있지만, 게놈의 수는 종에 따라 다르다. 정지기 세포의 게놈 수는 시간에 따라 감소한다. 이것은 전체 염색체의 단편화 및 분해 때문에 나타나며, 포유류 세포에서의 고사와 유사하다. 이러한 다중 게놈 사본을 포함하는 세포내 게놈 단편화는 대량의 재조합과 돌연변이유발을 초래한다. 이러한 세포 내에 다중 게놈 사본이 존재하면, 세포 내 상이한 게놈에 존재하는 유전자 사본 사이와, 세포 내의 게놈 및 형질감염된 단편 사이에서, 이들 세포내 상동성 재조합의 빈도를 높이는 결과를 초래한다. 재조합 빈도 증가는 진화된 유전자를 더욱 신속하게 진화시켜서 최적화된 특성을 획득할 수 있다.
천연적으로, 세포 유형 내 다중 게놈 사본의 존재는 이러한 사본수를 유지하는데 필요한 영양 요구가 더 크기 때문에 유리하지 않다. 그러나, 인위적인 조건을 고안하여 높은 카피 수를 선별할 수 있다. 재조합체 게놈을 보유한 변형된 세포는 영양 배지(이 조건에서 다중 사본수는 불리하지 않아야 한다)에서 증식한 다음, 돌연변이원, 예컨대 자외선 또는 감마선 조사 또는 화학적 돌연변이원, 예 미토마이신, 아질산, 광활성화된 소라렌스(psoralens)에 단독으로 또는 조합하여 노출시켜 재조합에 의해 복원가능한 DNA 파손을 유도한다. 이러한 조건은 더 높은 효율로 돌연변이를 제거할 수 있기 때문에 다중 사본수를 보유하는 세포를 선별한다. 돌연변이원에 노출 후 살아남은 변형된 세포는 다중 게놈 사본을 보유한 세포이다. 필요에 따라, 선별된 세포는 개별적으로 게놈 사본 수(예, 적절한 대조군과 정량적 하이브리드화 수행)를 분석할 수 있다. 예를 들면, 개개 세포는 더 많은 DNA를 포함하는 세포를 세포 분류기, 예컨대 DNA 특이적 형광 화합물의 이용 또는 광선 분산을 이용한 증가된 크기별 분류 방법을 사용하여 분류할 수 있다. 선별에서 생존한 세포 집단의 일부 또는 전부는, 소정의 특성에 대해 최적화된 유전자의 존재 여부를 시험한다.
F. 전체 게놈 재편성
일양태에서, 본 발명의 선별 방법은 "전체 게놈 재편성" 형식으로 이용된다. 전체 게놈 재편성의 여러 형식에 대한 광범위한 지침서는 본 발명자와 그 연구진들의 선도적인 출원["EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION", 대리인 문서 번호 018097-020720US, Cardayre 등에 의해 1998년 7월 15일에 출원됨 (USSN 09/116188)]에서 찾을 수 있다.
요약하면, 전체 게놈 재편성은 핵산이 원하는 특성을 부여할 수 있는가에 관해 어떠한 가정도 하지 않는다. 대신에, 전체 게놈(예, 게놈 라이브러리 또는 유기체로부터 분리됨)은 세포에서 재편성하고, 선별 프로토콜을 그 세포에 적용한다.
반복되는 전체 게놈 재편성의 한 가지 응용은 바람직한 살충 단백질 생산 특성을 획득하기 위해 식물 세포, 동일한 식물 세포에서 유래한 돌연변이 식물을 진화시키는 것이다. 재조합 기질은, 예를 들면 전체 게놈 라이브러리, 그것의 일부 또는 전술한 물질 중 어느 하나에 대한 내성을 부여한다고 알려져 있거나 추정되는 유전자의 변형체를 함유하는 포커스 라이브러리일 수 있다. 종종, 라이브러리 단편은 진화시킬 식물과 다른 종으로부터 얻는다. 사용되는 정확한 재편성 방법과는 무관하게, 본 발명에서 언급한 바람직한 형질 중 어느 하나를 선별하는 것을 비롯하여 살충 단백질 선별을 위해 전술한 선별 방법을 수행할 수 있다.
DNA 단편은, 전기사출(From 등,Proc. Natl. Acad. Sci USA82,5824(1985)), 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)와 같은 바이러스 벡터에 의한 감염(Hohn 등,Molecular Biology of Plant Tumors,(Academic Press, New York, 1982) pp.549-560; Howell, 미국 특허 제4,407,956호), 작은 비드나 입자의 매트릭스 내에 또는표면에 핵산을 보유한 작은 입자를 고속으로 탄도 침투시키는 방법(Klein 등,Nature327, 70-73(1987)), 벡터로서 수분을 이용하는 방법(WO 85/01856) 또는 DNA 단편이 클로닝된 T-DNA 플라스미드를 보유한 A.리조제네스 또는 아그로박테리움 투메페이션스의 이용과 같은 표준의 방법으로 식물 조직, 배양된 식물 세포 또는 식물 원형질내로 도입할 수 있다. T-DNA 플라스미드는 아그로박테리움 투메페이션스에 의해 감염시 식물 세포에 전달되고, 일부는 안정하게 식물 게놈에 통합된다(Horsch 등,Science233, 496-498(1984); Fraley 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA80, 4803(1983)).
다양성은 식물 원형질 간의 유전자 교환에 의해서 생성할 수도 있다. 식물 원형질의 형성과 융합 절차는 Takahashi 등의 미국 특허 제4,677,066호; Akagi 등의 미국 특허 제5,360,725호; Shimamoto 등의 미국 특허 제5,250,433호; Cheney 등의 미국 특허 제5,426,040호에 기재되어 있다.
재조합이 일어나고 재조합 유전자가 발현되기 위한 적절한 기간의 항온처리 후에 식물 세포를 살충 단백질에 대해 분석하고, 적절한 식물 세포를 수거한다. 이들 식물 세포의 일부 또는 전부에 대해 추가 라운드의 재조합과 검색을 수행할 수 있다. 결국 요구되는 정도의 살충 활성을 가진 식물 세포를 얻는다.
그 다음, 이들 세포는 돌연변이 식물내에서 배양할 수 있다. 배양된 원형질 유래의 식물의 재생은 Evans 등의 문헌["Protoplast Isolation and Culture,"Handbook of Plant Cell Cultures 1, 124-176(MacMillan Publishing Co., New York, 1983); Davey, "Recent Developments in the Culture and Regeneration ofPlant Protoplasts,"Protoplasts,(1983) pp. 12-29,(Birkhauser, Basal 1983); Dale, "Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops,"Protoplast(1983)pp.31-41, (Birkhauser, Basel 1983); Binding,"Regeneration of Plants,"Plant Protoplasts, pp.21-73,(CRC Press, Boca Raton,1985)] 및 당업자에게 유용한 다른 참조 문헌에 기재되어 있다. 세포로부터의 식물 재생에 관한 추가의 상세한 설명은 후술되어 있다.
전술한 방법의 변형예에서, 1회 이상의 재조합 및 검색의 예비 라운드를 식물 세포에 대해 기술한 것과 동일한 일반적 방법에 따라서 박테리아 세포내에서 수행할 수 있다. 박테리아 세포 내에서는 더욱 신속하게 진화시킬 수 있는데, 이것은 박테리아의 증식 속도가 빠르고 DNA가 그러한 세포 내로 도입될 수 있는 유효성이 더 크기 때문이다. 1회 이상의 재조합/검색 후에, DNA 단편 라이브러리를 박테리아로부터 회수하고 식물내로 형질전환시킨다. 라이브러리는 완전한 라이브러리 또는 포커스 라이브러리일 수 있다. 포커스 라이브러리는 식물 서열, 특히 곤충 내성 또는 관련 특성을 부여하는 역할을 하는 것으로 추정되거나 알려져 있는 식물 서열에 특이적인 프라이머로부터 증폭시켜 생성할 수 있다.
식물 게놈 재편성은 반복적인 사이클을 통해 목적하는 식물 종에 개선된 특성을 부여하는 경로 또는 유전자의 도입 및 재조합을 가능하게 한다. 곤충 내성과 같은 소정의 형질을 나타내는 잡초와 야생 재배종을 비롯한 어떤 식물 종은, 작물이나 원예 숙주 식물 종에 도입되는 DNA원으로서 사용할 수 있다.
공급원 식물로부터 제조된 게놈 DNA를 단편화되고(예, DNaseI 및 제한 효소에 의해 또는 기계적으로) 식물 게놈 라이브러리를 만드는데 적합한 벡터, 예컨대 pGA482(An. G., 1995,Methods Mol. Biol.44:47-58)로 클로닝한다. 이 벡터는 유전자를 식물체에 전달하는데 필요한 A. 투메페이션스 좌측 경계 및 우측 경계와 E. 콜리, 아그로박테리움 및 식물 세포에서의 선별용 항생제 마커를 포함한다. 다중클로닝 부위는 게놈 단편의 삽입을 위해 제공한다. cos 서열은, 1차 라이브러리를 E. 콜리내로 형질감염시키기 위해 박테리오파지 람다 머리에 효율적으로 DNA를 패키징하기 위해 제공된다. 이 벡터는 25 내지 40 kb의 DNA 단편들을 수용한다.
또한 1차 라이브러리는 숙주 식물 세포를 감염시키고 형질전환시키는데 사용되는 A. 투메페이션스 또는 A. 리조제네스 종내로 직접 전기사출시킬 수 있다(Main, GD 등, 1995,Methods Mol. Biol.44:405-412). 대안적으로, DNA는 수용 식물 종의 원형질내로 전기사출 또는 PEG 매개된 흡수(Bilang 등,(1994)Plant Mol. Biol Manual, Kluwer Academic Publishers, A1:1-16), 또는 세포나 조직의 입자 충격(Christou, 동일 문헌, A2:1-15)에 의해 도입할 수 있다. 필요에 따라, 형질이 선별 가능하기만 하다면 T-DNA 영역내 항생제 마커를 제거하여 최종 식물 생성물이 항생제 유전자를 포함하지 않도록 할 수 있다.
안정하게 형질전환되어 형질을 획득한 전체 세포는 고상 또는 액상 배지에서 선별한다. 문제의 형질을 직접 선별할 수 없는 경우, 형질전환된 세포는 항생제를 이용해 선별하고, 캘러스를 형성하거나 전체 식물체로 재생시킨 다음 소정의 특성에 대해 검색할 수 있다.
제2 및 추가 사이클은 각 돌연변이주로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계와 하나 이상의 다른 돌연변이주로 도입하는 단계로 구성된다. 매 라운드에서, 형질전환된 세포는 통상적으로 증가 방식으로(예를 들면, 용량 증가) 선별 또는 검색한다. 다중 사이클의 형질전환을 이용한 공정을 가속화하기 위해, 최종 라운드까지 식물의 재생을 제외할 수 있다. 원형질로부터 발생된 캘러스 조직 또는 형질전환된 조직은 게놈 DNA와 새로운 숙주 세포원으로서 작용할 수 있다. 최종 라운드 후에, 번식력이 있는 식물은 재생되고 그 자손은 삽입된 DNA의 동종접합성에 대해 선별한다. 결국, 부가적으로 또는 공동작용으로 결합하여 고레벨의 소정 형질을 부여하는 다중 삽입체를 보유하는 신규 식물이 형성된다.
또한, 소정의 형질을 부여하는 도입된 DNA는, 벡터내 기지 서열의 옆에 존재하기 때문에 추적이 가능하다. PCR이나 플라스미드 구조(rescue)를 이용하여 서열을 분리하고 더욱 상세히 특성규명한다. 전체 25 내지 40 kb 삽입체의 긴 PCR(Foord, OS 및 Rose, EA, 1995,PCR Primer:A Laboratory Manual, CSHL Press, pp63-77)은 적절한 시약과 프라이머로서 T-DNA 경계 서열을 사용한 기법으로 수행한다. 벡터가 T-DNA 경계 사이에 이.콜리 복제 원점과 항생제 마커를 포함하도록 변형된 경우, 삽입된 DNA의 양 말단에서만 절단하는 NotI이나 SfiI과 같은 희귀 절단 제한 효소를 이용하여 공급원 식물 DNA를 함유하는 단편을 형성한 다음, 자가 결찰시키고 플라스미드로서 복제되는 이.콜리내로 형질전환시킨다. 전달된 형질을 담당하는 총 DNA 또는 부분 단편은 DNA 재편성을 통해 시험관내 진화를 수행할 수 있다. 그 다음 재편성된 라이브러리는 숙주 식물 세포에 도입하고, 더욱 개선된 형질에 대해 검색한다. 이러한 방식으로, 단일 및 복수 유전자 형질을 하나의 종에서다른 종으로 전달하고, 높은 발현 또는 활성을 위해 최적화시켜 전체 유기체 개선을 유도할 수 있다.
G. 올리고뉴클레오티드 및 실리코내(in silico) 재편성 형식
전술한 재편성 형식 외에도, 두 개 이상의 추가의 관련 형식이 본 발명의 수행에 유용하다. 첫번째로는, "실리코내(in silico)" 재편성이라 불리는 방법으로서, 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 컴퓨터내 유전자 오퍼레이터를 사용한 가상 재편성을 수행하는 것이다. 본 발명에 응용된 바와 같이, 곤충 내성에 상응하는 일련의 유전자 서열 문자열은 컴퓨터 시스템에서 재조합되고, 바람직한 생성물은, 예컨대 합성 올리고뉴클레오티드의 재집합 PCR에 의해 만들어진다. 실리코내 재편성은 USSN 60/118854호(Selifonov 및 Stemmer "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS", 1999년 2월 5일에 출원됨)에 상세하게 기재되어 있다.
두번째의 유용한 형식은 "올리고뉴클레오티드 매개 재편성"이라 명명되는 것으로서, 관련된 상동성 핵산 계통(예, 본 발명에 적용된 바와 같이, 곤충 내성 핵산의 이종간의 또는 대립유전자 변형체)에 대응하는 올리고뉴클레오티드를 재조합하여 선별가능한 핵산을 형성한다. 이 형식은 USSN 60/118,813호(Crameri 등, "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION", 1999년 2월 5일에 출원됨)에 자세히 개시되어 있다.
요약하면, 한 계통의 상동성 핵산 서열은 먼저, 예컨대 동일성/유사성 영역과 다양성 영역을 선별하는 데 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용해서 정렬한다. 1 이상의 다양성 영역에 상응하는 다수의(예, 2, 5, 10, 20, 50, 75 또는 100 또는 그 이상)의 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 직접적으로 재편성하거나, 또는 하나 이상의 계통의 핵산과 재조합할 수 있다. 상동성 핵산을 재편성하기에 유용한 몇가지 절차들이 있는데, 예를 들면 DNase로 핵산을 분해하여 재조합시킨 다음, 미국 특허 제5,830,721호(Stemmer(1998) DNA MUTAGENESIS BY RANDOM FRAGMENTATION AND REASSEMBLY)에 개시된 바와 같이 전 길이 주형을 재생시키는 절차가 있다. 따라서, 일양태에서, 하나 이상의 상동성 핵산과 동일하거나 또는 상동성이 있는 전길이의 핵산이 제공되고, DNase로 절단하여, 그 결과로서 생긴 핵산 단편 세트를 다수의 계통 유전자 재편성 올리고뉴클레오티드와 재조합시킨다.
계통 유전자 재편성 올리고뉴클레오티드의 라이브러리도 올리고뉴클레오티드 재편성으로 제공한다. 예를 들면, 해당 상동성 유전자는 전술한 바와 같이 BLAST와 같은 서열 정렬 프로그램을 이용하여 정렬한다. 상동체간의 아미노산 변형에 해당하는 뉴클레오티드가 주목된다. 합성 유전자 재편성용 올리고뉴클레오티드는 임의의 정렬된 상동성 서열에 대해 하나(또는 그 이상)의 뉴클레오티드 차이를 포함하도록 고안한다. 즉, 제1 핵산에 동일하지만, 핵산 상동체의 잔기에 해당하는 위치에 잔기를 도입한 올리고뉴클레오티드는 제1 핵산과 동일하지 않다.
통상적으로 모든 가능한 핵산 변형체를 도입한 선별된 길이(예를 들면 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 또는 그 이상)의 올리고뉴클레오티드 일부 또는 전부가 만들어진다. 이것은 X 서열 변형체 당 X 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 X는 한 위치에서 상이한 서열의 수를 말한다. X 올리고뉴클레오티드는 변형체 뉴클레오티드(들)를 나타내는 뉴클레오티드(들)를 제외하면 대개 서열이 동일하다. 이러한 유사성 때문에, 단일 합성 반응 또는 한 세트의 시약을 사용하여 각 올리고뉴클레오티드의 공통된 부분을 만든 평행 또는 푸울형 합성 방법을 이용하는 것이 유리할 수 있다. 이는, 예컨대 잘 알려진 고상 핵산 합성기술에 의해 또는 어레이계 올리고뉴클레오티드 합성 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
가장 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 효과적인 재조합을 합리적으로 확인하기 위해 가변 영역 측과 약 10개 이상의 염기 서열이 동일하다. 그러나, 동일한 염기를 보유한 인접 영역은 더 적은 수의 동일한 염기(예를 들면, 5, 6, 7, 8, 또는 9)를 가질 수 있고, 물론 더 큰 동일성 영역(예, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 50 또는 그 이상)을 가질 수 있다.
유전자 집합 과정에서, 올리고뉴클레오티드는 함께 항온처리하여, 예컨대 본 발명에 기술되어 있고 당업자에게 공지된 바와 같이 임의의 각종 폴리머라제-매개된 재집합 방법으로 재집합시킬 수 있다. 선별된 올리고뉴클레오티드는 임의의 선택된 농도의 재조합 혼합물에서 "매립"시킬 수 있고, 따라서 원하는 변형의 바람직한 혼입을 유발한다.
III. 작물에 유용한 최적화된 유전자의 진화용 기질
본 발명은 식물체에 내병충성을 부여할 수 있는 능력이 개선된 내병충성 유전자를 얻는 방법을 제공한다. 이 방법은 DNA 재편성을 이용하여 재조합 내병충성 유전자의 라이브러리를 형성하고, 이들 라이브러리를 검색하여 목적하는 개선된 특성을 나타내는 재조합 유전자를 확인하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 식물 내에, 또는 식물 위에 존재하는 경우 내병충성을 부여할 수 있는 임의의 핵산에 적용할 수 있다. 그러한 핵산의 몇가지 예가 본 발명에 포함된다; 이들 및 기타 핵산의 예는 문헌[Advances in insect control:The role of transgenic plants, Carozzi 및 Koziel, eds., Taylor & Francis, New York, 1997]에 기술되어 있다. 또한 식물체에 이로운 효과를 부여하도록 최적화된 기타 유전자를 얻는 방법도 제공된다. 이들 유전자의 예로는 제초제 선택성 및 질소 고정과 관련된 유전자가 있다.
A. 바실러스 독소 및 관련 폴리펩티드
본 발명은 최적화된 재조합 Bt 독소를 얻는 방법을 제공한다. 바실러스와 같은 그람 양성 토양 박테리아의 일부 종들은 곤충, 거미류, 선충류에 대해 독성을 나타내는 단백질을 생산한다. 이러한 단백질들은 "Bt 독소"라고 알려진 결정 단백질을 포함하는데, 이 단백질은B.투린지엔시스 및 기타 바실러스 종이 생산한다. Bt 독소는 통상적으로 약 130 kDa 내지 140 kDa 또는 약 70 kDa의 폴리펩디드이며, 60 +/- 10 kDa의 독소 단편을 포함한다(Hofte 및 Whiteley(1989)Microbiol. Rev.53:242-255). Bt 독소는 고도로 특이적이며, 인간과 기타 동물, 및 식물에 대한 독성은 결핍되어 있다. Bt 독소는, 예를 들면 Kumar 등의 문헌[(1996)Adv. Appl. Microbiol.42: 1-43] 및 상기 Peferoen의 문헌[(1996)Advances in Insect Control, 2장 pp. 21-48]에 기재되어 있다.
상이한 바실러스 종이 생산한 Bt 독소는 핵산 및 아미노산 서열의 유사성을기초로 하여 분류할 수 있고, 또한 독소의 작용이 유효한 해충을 기준으로 해서 분류할 수 있다(상기 Hofte 및 Whiteley; Ogiwara 등(1995)Curr. Microbiol.30:227-235). 살충 Bt 독소는, 예컨대 1종 이상의 레피돕테라, 디프테라, 콜레옵테라 또는 프티랍테라에 대해 활성이 있다(상기 Kumar 등의 문헌 참조). Bt 유전자는 6종 이상의 주요 부류로 분류할 수 있다:cryI(레피돕테라 특이적),cryII(레피돕테라 및 디프테라 특이적),cryIII(콜레옵테라 특이적),cryIV(디프테라 특이적),cryV및cryVI(Hopte 및 Whiteley의 상기 문헌; Feitelson 등(1992)Biotechnol.10:271-276). 아군, 예컨대cryIC, cryIIA,및cryIIB는 그 살충 범위의 차이에 따라 제안된다(상기 Kumar 등의 문헌 참조). 또 다른 분류는 Bt 독소 유전자의 전길이 산물의 아미노산 동일성을 기초로 한다(Crickmore 등(1996)Genes Micobiol. Res.;상기 Kumfar 등의 문헌). 상기 안(案)에 따르면 Bt 독소는 몇가지 상동성 군으로 나뉘어지는데, Cry1, Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9 및 Cry10은 최대 군을, Cry2, cry11 및 Cry18은 제2 군을, Cry5, Cry12, Cry13 및 Cry14은 제3 군을, Cyt 단백질은 제4 군을 형성한다. Cry6, Cry15 및 Cry16은 이러한 분류체계 하에서 고유 단백질이다. 진화 관계를 보여주는 계통수를 포함하는 Bt 결정 단백질 유전자의 분류는 또한 Yamamoto 및 Powell(1993)의 문헌[Advnaces Engineered Pesticides, Kim, Ed., Marcel Dekker, pp.3-42]에 기술되어 있다.
본 발명의 방법은 기질로서 Bt 독소 유전자를 암호화하는 핵산을 이용하여 DNA 재편성을 수행하는 것을 포함한다. Bt 독소를 암호화하는 여러 핵산 서열들의 특성이 규명되었다. 예컨대, 미국 특허 제5,683,691호, 제5,633,446호,제5,651,965호, 제5,635,480호, 제4,766,203호, 제4,448,885호, 제4,467,036호, 제4,797,276호, 제4,853,331호, 제4,918,006호, 제4,849,217호, 제5,151,363호, 제4,948,734호 및 제4,771,131호; 그리고 유럽 특허 공보 0,149,162호, 0,213,818호 및 193259호 참조. 다수의 추가 Bt 독소 유전자는 젠뱅크 및 기타 데이타베이스에 제공되어 있다. 적어도 일부 Bt 독소는 플라스미드계 유전자가 암호화한다(Stahly 등(1978)Biochem. Biophys. Res. Commun.84: 581-588; Debaboc 등(1977) Genetika 13:496-501).
재조합 Bt 독소 유전자의 라이브러리는 DNA 재편성으로 제조한다. 바람직한 양태에서, DNA 재편성을 위한 기질은 Bt 독소 계통으로부터 유래된다. 도 2는 다수의 Bt 독소 유전자 사이의 관계를 나타내는 계통수를 제공한다. 데이타베이스 접근 번호와 함께 Bt 정기준표본 독소의 목록은 표 1에 제공된다. 이들 및 기타 Bt 독소유전자의 목록은 표 2에 제공되어 있다.
재편성된 유전자들은 적당한 발현 벡터를 사용하여 E.콜리 또는 임의의 바실러스균에서 발현될 수 있다. 모든 경우는 아니지만, 대부분의 경우cry유전자와 관련된 Bt 독소 프로모터는 E.콜리 및 바실러스균에서 작용할 것이다. E.콜리 숙주 세포내에서 사용되기에 적당한 벡터의 예에 관하여는 Sasaki 등의 문헌[(1996)Curr. Microbiol.31:195-200]에 기술되어 있다. E.콜리내에서의 발현을 증가시키기 위해서,ApaI 및NdeI 위치 사이의 cry 프로모터의 일부를 Sasaki 등의 문헌에 기술된 벡터로부터 분리한다. 본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 프레임내에서 재편성된 유전자의 암호화 서열에 연결될 경우, 상기 벡터는 또한 용이하게 검출될 수 있으며/또는 고정될 수 있는 태그(예를 들어, 복수개의 His 잔기)를 암호화하는암호화 서열을 포함한다.
cry유전자는 절두되어 예비 활성 Cry 단백질을 합성할 수 있다. 절두된 유전자가 E.콜리에 대해 실질적으로 독성인 단백질을 생성한다는 사실은 다수의 경우에서 살펴볼 수 있다. 그러나, 바람직한 양태에서, 상기 절두된 cry 유전자는 바실러스균[예를 들어, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 B.튜린지엔시스(B.thuringiensis)]에서 발현된다. 단백질이 배양 배지로 분비되도록 cry 유전자에 리더 서열을 부가할 수 있다. 이와 같은 방법으로 단백질 분리 공정에 소모되는 시간을 단축시킬 수 있다.
하나 이상의 의도로 하는 특성이 개선된 Bt 독소를 암호화하는 재조합 유전자는 본원에 기술된 바와 같이 동정된다. 이와 같은 몇몇 특성에 대한 검색 방법은 Kumar 등의 문헌(상동)에 기술되어 있다.
최적화된 재조합 Bt 독소 유전자는 식물에 직접 살포되는 농약 단백질을 생성 하는데에 사용할 수 있으며, 식물에 침투하는 미생물내에서 발현시킬 수 있거나 또는 형질 전환된 식물에 도입할 수 있다. Bt 유전자는 26개 이상의 상이한 식물종에서 발현될 수 있다[Schuler 등(1998), Tibtech 16:168-175]. 각각의 투여 방법들에 관해서는 이하에 더욱 상세히 설명되어 있다.
B. 프로테아제 및 α아밀라제 억제제
본 발명의 방법을 사용하여 최적화될 수 있는 추가의 내병충성 유전자는 프로테아제 억제제를 암호화하는 유전자이다. 프로테아제 억제제는 곤충의 발생을 억제할 수 있으며[참고로, 예를 들어, Reeck 등(1997),Advances in Pest Control,상동, 제 10 장, pp157-183 ; Ryan(1990)Annu. Rev. Phytopathol.28:425-449 참조], 곤충 및 선충류를 사멸시킬 수도 있다[Jongsma(1997)J.Insect Physiol.43:885-895 참조]. 식물 조직에서 발견된 프로테아제 억제제는 곤충 및 선충류의 공격에 대한 방어 기작 요소의 일부인 것으로 생각된다. 곤충 제어용 프로테아제 억제제에 있어서의 문제점은 곤충이 상기 억제제에 대하여 내성을 갖게 된다는 점인데, 이에 대하여 Jongsma 및 Bolter(1997) 등의 문헌[J.Insect.Physiol.43, 885-895]에서는 곤충들이 상기 억제제를 섭취하였을때 소화기관내에서프로테아제의 성분을 바꾸기 때문이라고 기술하고 있다. 다양한 종류의 곤충 프로테아제를 억제하는 억제제를 발견하거나 또는 생성시키는 것은 매우 중요한 것이다. 본 실시예에서는, DNA 재편성에 의해서 식물 시스테인 억제제를 개선시키고자 하였다.
재편성에 유용한 프로테아제 억제제 유전자로서는 식물, 동물 및 미생물을 포함하는 모든 생물학적 근원으로부터 유래된 것들을 포함한다. 식물내의 10 개 이상의 계통[대두 트립신 억제제(Kunitz), Bowman-Birk 억제제, 감자 억제제 Ⅰ, 감자 억제제 Ⅱ, 호박 억제제, 왕바랭이(Ragi) 1-2/옥수수 이기능성 억제제, 카르복시펩티다제 A, B 억제제, 시스테인 프로테인아제 억제제(시스타틴스), 아스파틸 프로테인아제 억제제, 및 보리 트립신 억제제][예를 들어, Ignacimuthu,Biotechnological perspsctives in chemical ecology of insects, T. Ananthakrishnan, ed., Science Publishers, Inc., pp.277-283 참조]을 비롯한 프로테아제 억제제의 몇몇 비상동성 계통에 관하여는 이미 공지되어 있다(Laskowski 등, (1980) Annu.Rev.Biochem. 49:593-626]. 4가지 기작에 따른 단백질 분해 효소의 군들(세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르트 프로테아제 및 메탈로 프로테아제) 각각에 대하여 억제제 계통이 공지되어 있다(Ryan, 상동). 시스테인 프로테아제 억제제의 서열은, 예를 들어 Reddy 등의 문헌[(1975)J.Biol.Chem.250:1741-1750] 및 Abe 등의 문헌[(1987) J.Biol.Chem. 262:16793-16797]에 기술되어 있다. 세린 프로테아제 억제제는, 예를 들어 미국 특허 제5,151,509호에 기술되어 있다.
일부는 프로테아제 억제제와 같이 이기능성인, α아밀라제 억제제를 암호화하는 핵산은 본 발명의 DNA 재편성 방법을 사용한 최적화에 적당한 후보이기도 하다. 상기 다수의 α아밀라제 억제제는 4가지의 식물 프로테아제 억제제 계통(즉, Kunitz, 보리, Bowman-Birk 및 왕바랭이/옥수수 이기능성 억제제 계통)과 아미노산 유사성을 나타낸다 [예를 들어, Ryan 등의 상기 문헌참조]. 왕바랭이 α아밀라제/프로테아제 억제제에 관해서는, 예를 들어 Shivaraj 등의 문헌[(1981)Biochem. J.193:29-36] 및 Svendsen 등의 문헌[(1986)Carlsberg Res. Commun. 51:43-50]에 개시되어 있다. 또한 Schuler 등의 상기 문헌 참조.
기타의 식물 종에 조작되어 도입된 식물원성 프로테아제 억제제는, 예를 들어 Schuler 등의 문헌[(1998)Tibtech16:168-175]; Hilder 등의 문헌[(1993)Transgenic Plants, Vol.1, Kung 및 Wu, Eds., Academic Press, pp.317-338] 참조. 만두카 섹스타(Manduca sexta) 프로테아제 억제제를 보유하는 형질 전환 식물에 관하여는 미국 특허 제5,436,392호에 기술되어 있다. 프로테아제 억제제를 사용한 선충류 제어 방법에 관하여는 미국 특허 제5,494,813호에 기술되어 있다.
식물내에서 내병충성 유전자로서 사용하기 위한 개선된 특성을 보유하는 프로테아제 억제제를 암호화하는 재조합 유전자를 확인하기 위해서, 본원에 기술된 바와 같은 검정법을 사용할 수 있다. 하나의 적당한 검정법은 파지 디스플레이로 재조합 유전자 라이브러리를 발현시킨 후 프로테아제 기질을 사용한 패닝법(panning)을 수행하는 단계를 포함한다[예를 들어, Jongsma 등의 문헌(1995)Molecular Breeding1:181-191] 참조.
C. 콜레스테롤 옥시다제
콜레스테롤 옥시다제를 포함하여, 폴레페놀 옥시다제를 암호화하는 유전자들은 본 발명의 방법에 사용하기에 적당한 다른 기질이다. 콜레스테롤 옥시다제는, 예를 들어 Shen 등의 문헌[(1997)Arch. Insect Biochem. Physiol.34:429-442] 및 Purcell의 문헌[(1997)Advances in Insect Control, 제6장, pp.95-108], 미국 특허 제5,665,560호 및 제5,602,017호 및 PCT 특허 출원 WO 9425603호에 기술되어 있으며, Genbank 수탁 번호 제 I64550, E07692, E07691, E03850, E03828, E03827, U13981 및 D00712로 기탁되어 있다.
D. 살충 프로테아제
본 발명의 DNA 재편성 방법을 사용한 최적화 방법에 사용되는 추가의 표적은 살충 프로테아제를 암호화하는 유전자이다.
E. 식물성 살충 단백질
본 발명의 DNA 재편성 방법은 또한 식물성 살충 단백질(Vegetative Insecticidal Proteins ; VIPs)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 적용할 수 있다.상기 VIPs는 영양 성장기 동안 일부 바실러스 종(튜린지엔시스 및 세레우스를 포함)이 생성할 수 있다[예를 들어, Warren(1997)Advances in Insect Control(상동), 제 7 장, pp. 109 - 121 참조]. 상기 VIPs는 B.튜린지엔시스가 생성하는 δ내독소와 유사하지는 않다.
옥수수 근충(corn rootworm)과 같은 중요한 옥수수 해충에 효과적인 VIPs로는, 예를 들어 Vip1A(a) 및 Vip2A(a) 등이 있다(Warren, 상동). Vip3A는 광범위한 인시목 곤충들에 효과적이다[Estruch 등 (1996)Proc.Nat'l. Acad.Sci.USA 93:5389-5394 ; Yu 등 (1997)Appl. Environ. Microbiol.63:532-536].
F. 살충 경로
본 발명은 또한 해충 억제 활성을 보유하는 천연 생성물의 생합성에 관여하는 경로를 암호화하는 유전자를 얻기 위하여 DNA 재편성을 적용하는 방법을 제공하는 것이다.
(1) 폴리케티드(Polyketide)
살충제 생합성에 관여하는 경로를 재편성하는데에 특히 유용한 하나의 연구 방법은 돌연 변이를 재조합시키는 제한 위치를 사용하는 것을 포함한다 폴리케티드 클러스터, 예를 들어 스피노신(Khosla 등의 문헌,TIBTECH14, 1996년 9월)은 통상적으로 길이가 10 내지 100 kb로서, 매우 거대한 다중성 효소 복합체로 조립되는 다중성 거대 폴리펩티드를 지정한다. 상기 복합체들의 모듈 특성 및 생합성 경로의 조절 특성으로 인하여, 단백질 모듈을 암호화하는 핵산들은 상이한 폴리케티드 클러스터 사이에서 교환되어 신규의 기능성 키메라 폴리케티드를 형성할 수 있다.SfiI(8개의 염기 인식, 비회문식 돌출부)와 같은 희귀한 제한 엔도뉴클레아제 위치를 폴리펩티드 사이 또는 폴리펩티드내에 조작되어 도입된 인트론의 비필수 위치에 도입시킴으로써 전술한 기술을 사용하여 핵산 절편의 교환을 조작하는 "취급(handle)" 방법을 제공할 수 있다.
(2) 기타 천연 생성물
살충 능력을 보유하는 천연 생성물의 몇몇 예가 공지되어 있다. 상기 생성물들은 미생물, 진균류 또는 식물에 의하여 생성된다. 살충성을 보유하는 천연의 식물 생성물 및 미생물 생성물의 몇몇 예가 있다. 상기 생성물들의 생합성에 관여하는 유전자들은 재편성되어 화합물의 수율을 증가시킬 수 있다. 다수의 천연 생성물을 특정화하는 생합성 경로에 관여하는 유전자의 수는 생성물의 특성에 따라 다양하다. DNA 재편성은 상기 천연 생성물의 합성에 대한 생화학적 경로에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 전체 세트에 적용될 수 있다. 결과적으로, 상기 생성물중 다수는 발효기(미생물용) 또는 곤충의 척(in planta)에서 더욱 높은 농도로 생성될 수 있다. 다른 양태에서, 재편성된 유전자는, 예를 들어 독성 증가 및/또는 숙주 범위의 확장을 포함하는 기타의 개선된 특성에 대하여 선택한다. 식물을 곤충들로부터 보호하기 위하여 상기 재편성된 유전자들을 곤충의 척에 도입할 수 있다.
G. 바큘로바이러스(Baculoviruses)
내병충성을 부여하는 재조합 핵산을 생성시키는 DNA 재편성에 대한 기질로서 사용되기에 적당한 것은 바큘로바이러스를 포함하는 살충 바이러스로부터 유래된 유전자 및 게놈이다. 살충제로서의 바큘로바이러스의 용도 및 살충 단백질을 암호화하는 바큘로바이러스 유전자의 동정법은, 예를 들어 미국 특허 제5,662,897호에 기술되어 있으며, 예를 들어 Miller L.K.의 문헌[(1981)Genetic Engineering in the Plant Sciences, Panopoulous(ed.), Praeger Publ., New York, pp.203-224 ; Carstens(1980) Trends Biochem. Sci. 52:107-110 ; Harrap 및 Payne의 문헌[(1979) Advances in Virus Research, Vol.25, Lawfer 등 (eds.), Academic Press, New York, pp.273-355 ;The Biology of Baculoviruses,Vol.I 및 II, Granados 및 Federici(eds.), CRC Press, Boca Raton, Fla., 1986] 참조.
본 발명의 DNA 재편성 방법 및 검색 방법은 안정성의 증가(UV 안정성 포함), 감염성 증가 및 숙주 범위의 확대, 독성의 증가 및 해충 사멸 시간의 단축 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 개선된 특성을 보유하는 살충 바이러스를 얻는데에 유용하다. 바큘로바이러스 섭취 및 곤충 사멸 사이의 시간의 길이는 종종 살충제로서의 바큘로바이러스의 효능을 제한할 수 있는데, 왜냐하면 상기 곤충은 살충제 적용 및 곤충 사멸 사이의 시간 동안 계속해서 곡물을 먹어치워 곡물에 해를 입히기 때문이다. 본원에 기술된 DNA 재편성 및 검색 방법을 사용함으로써, 자연 발생적 바큘로바이러스보다 더욱 신속하게 곤충을 박멸시킬 수 있는 바큘로바이러스를 얻을 수 있다. 바큘로바이러스의 독성 및 감염성을 측정하는 생물 검정법에 관하여는 미국 특허 제5,662,897호에 기술되어 있다.
바큘로바이러스는 생체내에서 재조합하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, Croizier 등의 문헌[(1980)C. R. Acad. Sci. Paris Ser. D290:579-582]에서는 갤러리아(Galleria) 유충에서 재조합되는 AcNPV 및 갤러리아 멜로넬라(Galleriamellonella) 바이러스에 관하여 보고하고 있다. 더욱 최근들어, Kondo 및 Maeda의 문헌[(1991) J. Virol. 65:3625-3632]에서는 곤충 세포내에서 재조합법을 통하여 NPV의 숙주 특이성을 증가시키는 방법에 관하여 보고하고 있다. DNA 재편성은 상기 방법을 증가 및 촉진할 수 있다. 예를 들어, 숙주 특이성이 상이한 몇몇 NPV 종 사이에서의 바이러스 게놈 재편성은 숙주 범위를 넓히는데에 사용될 수 있다. 이는 오토그래파 캘리포니카(Autographa californica), 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 및 헬리오티스 비레스센스(Heliothis virescens)와 같은 NPV를 얻어 이로부터 DNA를 분리함으로써 성취될 수 있다. 이들 DNA 시료들은 혼합되어 재편성될 수 있다. Sf9 세포는 재편성된후 재조립된 DNA로 형질감염시킬 수 있으며, 이로써 재조합된 바이러스가 분리된다. 이후 분리된 바이러스 시료들은, 예를 들어 트리코플러시아 니(Trichoplusia ni), 헬리오티스 비레스센스 및 스포돕테라 엑시규어(Spodoptera exigua)와 같은 곤충 종들에 대한 감염성에 관하여 시험한다. 이때, 원래의 숙주 또는 관련 숙주(예를 들어, AcNPV 대 T.니 ; SfNPV 대 S.엑시규어)와 야생형 바이러스에 대해서 측정되는, 치사량 이하의 투여량이 사용된다.
본 발명의 방법을 사용하여 얻은 살충 바이러스는 식물에 적용하는데에 유용하다. 제조 및 적용 방법은 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있으며, 예를 들어 Couch 및 Ignoffo(1981)의 문헌[Microbial Control of Pests and Plant Disease1 970-1980, Burges(ed.), 제 34 장, pp.621-634] ; Corke 및 Rishbeth의 문헌[상동, 제 39 장, pp. 717-732]; Brockwell의 문헌[(1980)Methods for EvaluatingNitrogen Fixation, Bergersen(ed.) pp. 417-488] ; Burton(1982)의 문헌[Biological Nitrogen Fixation Technology for Tropical Agriculture, Graham 및 Harris(eds.) pp. 105-114]; 및 Roughley의 문헌[(1982) 상동., pp. 115-127] 참조.
Ⅳ. 내병충성 유전자 및 검색 방법의 개선된 특성
본원에 기술된 DNA 재편성 방법을 사용하여 제조된 재조합 내병충성 유전자 라이브러리를 검색하여 해충으로부터 식물을 보호하는데 사용한 개선된 특성을 나타내는 유전자를 동정한다. 개선된 내병충성 유전자를 얻는데에 유용한 본 발명의 방법의 특성들로서는 다음과 같은 것들을 포함한다. 적당한 검색 기술을 선택함으로써, 이와 동시에 또는 연속적으로 한가지 이상의 특성에 대해서 최적화된 유전자들을 얻을 수 있다. 예를 들어, 하나의 기질로서 독성이 매우 강한 독소를 암호화하는 유전자를 사용하고, 다른 기질로서는 표적에 의한 유전자 생성물에 대한 내성을 발현시킴으로써 용이하게 극복할 수는 없는 유전자를 사용하는 재편성 방법을 수행함으로써, 매우 독성이 강하고 표적 내성의 발현에 영향을 받지 않는 2가지의 특성들을 결합시키는 최적화된 유전자를 얻을 수 있다.
그러므로 본 발명은 농업 유기체에 곤충 내성을 부여하는 재편성된 폴리뉴클레오티드 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열 재편성 방법에 의하여 제조된 변형된 농업 유기체를 제공한다. 상기 제조된 폴리뉴클레오티드 서열 및 변형된 농업 유기체의 정확한 구조는 이들이 발생된 방법을 참조로 하여 매우 용이하게 정의될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 바람직한 표현형을 부여하는 재편성된 폴리뉴클레오티드서열, 또는 본원에 기술된 방법에 의하여 제조된 서열들을 포함한다. 이와 같이 제조된 재편성된 폴리뉴클레오티드는 정상의 경우에는 자연 발생적 농업 유기체 군집에 존재하지 않는 이의 비정상적으로 변형된 표현형 또는 신규의 표현형에 의하여 자연 발생적 게놈 서열과 용이하게 구별할 수 있다. 재편성된 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 서열 데이터베이스 및 공개된 서열 데이터를 참조로 하여 자연 발생적 식물, 동물 또는 미생물 게놈 서열과 구분될 수도 있는데, 이때 재편성된 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 당업계의 숙련자에 의하여 실질적으로 자연적 진화 또는 고전적 육종 방법에 의하여 진화될 가능성이 없는 폴리뉴클레오티드로서 인식될 참고 데이터와 유사한 돌연 변이 배열을 포함할 것이다.
A. 표적 해충에 대한 독성의 증가
본 발명의 방법은 표적 해충에 대한 독성을 증가시키는 내병충성 유전자를 얻는데에 유용한 방법이다. 전술한 바와 같이 제조된 재편성된 곤충 내성 유전자는 고 살충 활성에 대하여 검색된다. 이러한 유전자들은, 예를 들어 재편성된 유전자 라이브러리 구성원들을 발현시켜 EC50(곤충 생장률이 50% 감소되는 농도) 및/또는 LC50(곤충 사멸률이 50%가 되는 농도)를 증가시키는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 동정할 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명은 의도로 하는 특이성을 보유하지만, 상대적으로 세포 독성이 낮은 독소를 암호화하는 유전자를 세포 독성이 높은 다른 독소 유전자와 재편성시키는 단계를 포함한다. 예시적인 예로서는 바실러스 파필리아(Bacilluspopilliae)가 있는데, 이는 일본 딱정 벌레와 같은 스카라베 풍뎅이에 독성이 있으며 Cry 18 Aa로 공지된 살충 단백질을 합성한다[Zhang 등의 문헌(1997) J.Bact. 179:4336-4341]. 그러나, 상기 단백질의 살충 활성은 식물을 딱정벌레 섭식으로부터 보호하는데에 사용될 정도로 충분히 높지는 않다. Cry 18 Aa의 세포 독성을 개선시키기 위하여, 상기 독소를 암호화하는 유전자를 클로닝한 후 이것을 다른 바실러스 종으로부터 얻은 이의 하나 이상의 상동성 유전자와 재편성시킨다. 예를 들어, Cry 18 Aa를 암호화하는 유전자를 Cry2를 암호화하는 B.튜린지엔시스 유전자와 재편성시킬 수 있다. cry 18 Aa에 상동성인 다른 유전자들은 또한 클로닝되어 cry 18 Aa와 재편성될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 B.튜린지엔시스 및 B.파필리아 균주의 게놈성 라이브러리는 클로닝된 cry 18 Aa 유전자를 하이브리드화 프로브로서 사용하여 검색될 수 있다.
일단 재편성이 완결되면, 생성된 재편성 독소 유전자 라이브러리를 검색하여 살충 활성이 강화된 유전자를 동정할 수 있다. 이러한 검색 방법을 수행하는 한가지 방법은 재편성된 유전자의 단백질 암호화 영역을 E.콜리와 같이 선택된 숙주 세포내에서 유전자를 발현시키는데에 적당한 발현 벡터로 클로닝시키는 것이다. 최근의 바람직한 양태에 있어서, 상기 벡터는 재편성된 유전자의 암호화 서열의 프레임과 연결될 경우, 용이하게 검출 가능하고/또는 고정화 가능한 태그(예를 들어, 복수개의 His 잔기)를 암호화하는 암호화 서열을 보유하게 된다. 상기 벡터는 E.콜리 및 예를 들어 B.튜린지엔시스의 cry-균주와 같은 다른 숙주 세포에 도입될 수 있다. 원한다면, 재조합체를 예비 검색(예를 들어, 면역 검정법)시켜 살충 단백질을합성하는 유전자를 동정할 수 있다. 이후 예비 검색법에서 양성을 나타내는 개체들을 기능성 검색법으로 시험하여 의도로하는 만큼 활성이 증가된 독소를 암호화하는 재편성된 유전자를 동정하게 된다.
종종 생체내 검정법이라고 불리워지는, 전체 해충 검정법(whole pest assay)은 독성을 측정하는데에 사용될 수 있다. 상기 검정법에 있어서는, 재편성된 유전자로부터 발현된 독소 폴리펩티드를 해충의 먹이에 피복시킨후 표적 해충에 의하여 섭취되도록 만든다. 바람직하게, 상기 재편성된 폴리펩티드들은 최소한 부분적으로는 검색에 앞서서 정제된다. 예를 들어, E.콜리가 상기 재편성된 폴리펩티드 발현용 숙주 세포로서 사용되는 경우, 폴리펩티드는 종종 봉입체(inclusion body)로서 합성된다. 상기 봉입체는 당업계의 숙련자들에게 공지된 방법을 사용하여 방출될 수 있다. 예를 들어, 상기 E.콜리 세포는 제조자 지침에 따라서 B-PER 박테리아 단백질 추출 시약(Pierce)과 같은 세제를 사용하여 해리될 수 있다. 상기 세제는, 예를 들어 여과법에 의하여 제거될 수 있으며, 상기 봉입체는, 예를 들어 0.02N NaOH에 용해될 수 있다. 이후 상기 용액의 pH를 100 mM Tris-HCl, pH 8.0를 첨가하여 중화시킨다. 최근의 바람직한 양태에 있어서, 재편성된 유전자에 의하여 암호화되는 살충 단백질이 정제되었다. 편리하게, 이는 친화도 시약[히스티딘 태그를 갖는 폴리펩티드용 Ni-NTA 아가로즈(Qiagen)]을 보유하는 96 웰 또는 그 이상의 웰을 갖는 여과 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다. 특정 폴리펩티드의 발현량에는 상관없이, 충분한 수의 숙주 세포를 추출하여 필터를 통과하는 폴리펩티드의 양이 친화도 시약의 용량을 초과한다는 사실을 확인하는 것이 바람직하다. 상기 친화도 시약으로부터 해리된 후 각 시료는 거의 동일한 양의 단백질을 함유할 것이다.
각각의 전체 해충 시험에 사용된 폴리펩티드의 양은 재편성에 사용된 독소 유전자에 의하여 암호화된 야생형 폴리펩티드를 사용하여 측정된, 치사량 미만의 투여량이다. 상기 해충의 사멸률은 각각의 폴리펩티드 시료의 활성 수준을 평가하는 것으로 관찰된다. 상기 검색 검정법의 효능을 증가시키기 위하여, 시료를 수집한후 활성을 시험할 수 있다. 몇몇 해충의 사멸률을 나타내는 수집된 시료들은 각각의 수집 성분들로 분리되어 사멸의 원인이 되는 시료들을 동정하게 된다. 양성 시료들이 본 발명의 방법에 사용되기 위하여 선택되거나, 또는 상기 재편성의 제 2 라운드용으로 선택된다.
그러나, 바람직한 양태에 있어서, 세포 사멸 또는 세포 생장을 검출하는 검정법으로서는 고처리량 검색법이 더욱 용이한 방식으로 수행된다. 예를 들어, 시험관내 검정법이 사용될 수 있는데, 이와 같은 검정법은 통상적으로 검색될 특정 독소에 민감한 배양된 곤충 세포 및/또는 특정 독소, 즉 자연적으로 또는 이종 유전자의 발현 결과로 생성되는 특정 독소에 대한 수용기를 발현하는 세포를 사용하는 단계를 포함한다. 그러므로, 곤충 세포에 더하여, 포유 동물(예를 들어, CHO 세포), 박테리아 세포 및 효모 세포는 생체내 검정법에 유용한 세포들이다. 배양된 곤충 세포에 대한 독성을 측정하는 시험관내 생체 검정법에 관해서는, 예를 들어 Johnson의 문헌[(1994)J.Invertebr. Pathol. 63:123-9]에 기술되어 있다. 통상적인 방법에 있어서, 96 개 또는 그 이상의 웰을 갖는 플레이트를 사용한다. 재편성된 유전자의 라이브러리에 의하여 발현된 독소를 상기 웰에 가하여 이들의 세포 생존 및/또는 증식에 끼치는 영향을 측정한다.
이러한 검정법 중 한가지 방법은 DNA 재편성을 이용하여 얻은 최적화된 독소에 의하여 사멸되는 세포에 의하여 ATPase가 방출되는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 독소에 의하여 방출된 ATPase 수준은 감도가 매우 높은 예를 들어, 루시퍼라제 검정법에 의하여 측정될 수 있다.
다른 검정법으로서는 물을 흡수함에 따라서 세포의 형태가 변화하는 것을 검출하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 곤충 세포를 Bt Cry 단백질로 처리할 경우 세포 형태는 실질적으로 물을 흡수함에 따라서 변화한다. 상기 Cry 단백질이 세포를 매우 투과적으로 만들기 때문에, 세포가 저장 용액(low osmotic solution)에 방치될 경우 상기 세포는 다량의 물을 흡수하게 된다. 이러한 형태적 변화는 광 분산에 의해서 검출될 수 있다.
세포 사멸 또는 세포 성장을 검출하는 염료 및 표지는 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있다. 상기 검정법에 있어서는, 세포들이 세정후 염료 또는 표지를 흡수 또는 보유하는지 여부를 플레이트 판독기 또는 플레이트 신틸레이션 카운터를 사용하여 측정한 이후에, 예를 들어 미세 적정 플레이트에서 상기 세포들을 독소와 접촉시킨다.
적정한 염료로서는 이하의 것들을 포함하는데, 이에 한정되는 것은 아니다.
알라마 블루: 본 알라마 블루 검정법은 대사 활성 검출법을 기초로 하는 형광계/비색계 생장 지시약을 결합시킨다. 본 시스템은 세포 생장에 따른 생장 배지의 화학적 환원에 대응하여 형광성 및 변색을 나타내는 산화 환원 (Redox) 지시약을 포함한다. 배양 마지막 단계 8 시간 동안 알라마 블루의 분취량(예를 들어, 20㎕)만큼을 각각의 웰에 가하였다. 이후 상기 플레이트의 흡광도(O.D. 570/600) 또는 형광도를 측정하였다.
3 H-티미딘 결합: 본 방법에서는 이의 종말점으로서3H-티미딘이 세포성 DNA에 결합되었는지 여부를 측정하는 세포 증식 측정법을 사용하였다. 배양 후기의 4 내지 24 시간 동안 방사능 표지의 분취량(예를 들어, 1μCi)만큼을 첨가하였다. 이후 반자동화된 세포 수집 장치를 사용하여 상기 세포들을 물로 용해시키고 유리 섬유 필터상에 표지화된 DNA를 침전시킬 수 있었다. 이후 상기 필터 패드를 건조시켜 표준적인 액체 신틸레이션 계수법으로 측정하였다.
중성 레드: 중성 레드는 세포의 세포질 입자들을 염색하는데에 사용되는 양이온성 아진 염료이다. 예를 들어, 배양의 마지막 단계에서, 분취량[예를 들어, 0.5 % 중성 레드(Sigma Chemical, St. Louis MO)의 1:500 희석액 100 ㎕]만큼을 각각의 웰에 가하였다. 이후 상기 세포들을 37℃에서 2 내지 4 시간 동안 5 % CO2존재하에서 항온 처리시켰다. 상기 색을 50 % 메탄올(1 % 아세트산과 함께)로 탈색시켰으며, 이때의 흡광도를 540 파장에서 측정하였다.
세포 생존률에 대한 트립판 블루 시험: 세포 현탁액내에 존재하는 생존 세포 수를 측정하는데에 염료 배출 시험법을 사용하였다. 상기 방법은 생존 세포들은 임의의 염료를 배출시키는 원형 세포막을 보유하는 반면에, 사멸 세포들은 그렇지 않다는 원리에 기초를 둔 것이다. 상기 시험법에 있어서, 세포 현탁액은 단순히 염료와 혼합하여 세포가 염료를 흡수하였는지 배출하였는지 여부를 시각적으로 관찰함으로써 측정된다. 생존 세포는 분명한 형태의 세포질을 갖는 반면에 사멸 세포는 푸른색 세포질을 갖는다. 상기 검정법은 예를 들어, 5분 동안 100×g에서 분취량 만큼의 세포 현탁액을 원심 분리한 다음 상등액을 폐기함으로써 수행될 수 있다. 상기 세포 펠렛을 1㎖ PBS 또는 혈청 부재 배지에 재현탁시켰다. 1 부의 0.4 %의 트립판 블루를 1부의 세포 현탁액(세포 희석액)과 혼합하였다. 이후 상기 혼합물을 약 3분 동안 실온에서 항온 처리하였다. 이후 상기 트립판 블루/세포 혼합물을 혈구 측정기에 넣은후 쌍안 현미경으로 관찰하였다.
배양된 곤충 세포를 사용하는 적당한 시험관내 검정법의 하나의 예는 Bt Cry1C 단백질에 관한 것이다. Sf9(스포돕테라 프루기페르다) 세포를 사용하는데, 왜냐하면 이들 세포주들은 Cry1C 단백질에 감수성이기 때문이다. 예를 들어 헬리오티스 종 및 트리코플루시아 종과 같은 다른 곤충 세포군들은 또한 Cry1C 용으로 사용될 수도 있다. Sf9은 Cry1A 단백질에 그다지 감수성이지는 않다. Cry1A 및 Cry1F 및 Cry1G와 같은 관련 단백질의 경우, CF1[코리스토넨라 퓨미페라나(Choristonenra fumiferana)] 세포가 사용될 수 있다. CF1 세포는 Cry1A 형 단백질에 대하여 매우 감수성이 높다. 활성화된 Cry1C 단백질이 Sf9 세포와 혼합될 경우, 상기 Cry 단백질은 세포막을 물과 같은 작은 분자에 대해서 매우 투과성 있도록 만든다. 트립판 블루와 같은 염료가 상기 세포 현탁액에 첨가될 경우, Cry 단백질에 의하여 사멸된 세포들은 상기 염료로 염색된다. 그러므로, 살충 활성 레벨은 이미지 분석에 의하여 측정된다.
추가의 시험관내 검정법은 특정 독소에 대한 수용기를 사용하는 단계를 포함한다. Bt Cry 단백질을 포함하는 몇몇 살충 단백질에 대한 곤충내 표적 위치는 중장 표피 세포이다. 독소 단백질은 세포상의 수용기를 발견하여 특정 수용기 Cry 단백질 복합체를 형성한다. 상기 수용기에 결합한 이후, 상기 Cry 단백질은 세포막으로 침투하여 세포막의 투과성을 고도로 높여주는 공극을 형성한다. 그러므로 세포들은 삼투압 조절 능력을 상실하여 영구적으로 사멸하게 된다. 상기 수용기 결합 단계에서, 또는 수용기에 대한 Cry 단백질의 친화도는 살충 활성 수준에 매우 중요한 역할을 갖는다. 수용기에 대한 Cry 변이체의 고친화도는 살충 활성이 높다는 의미를 갖는다. 그러므로, 해충에 대하여 강화된 효능을 나타내는 독소를 암호화하는 재편성된 유전자들은 독소에 대한 특정 수용기의 친화도를 기초로 하여 동정될 수도 있다.
이와 같은 형태의 검색 검정법의 하나의 실시예에 있어서는, 브러쉬 경계막 소낭(brush border membrane vesicles)[BBMV ; 예를 들어 Lee 등(1995)Appl.Environ.Microbiol.61:3836-42]이 사용된다. 고농도의 수용기를 함유하는 BBMV는 곤충으로부터 분리되거나 또는 분리된 중창 조직 또는 곤충의 전신으로부터 분리된다. BBMV를 사용하는 데에 있어서 한가지 이점은 이것들이 의도로 하는 대부분의 임의의 곤충들로부터 수득될 수 있다는 점이다. 통상적으로 BBMV는 곤충 전신을 단순히 균질화한후, 예를 들어 3000 내지 12000 rpm 사이와 같이, rpm 에 차이를 두면서 원심분리를 반복 실시함으로써 수득될 수 있다. BBMV 분획물이 다른 분획물보다 무겁기 때문에, 원심 분리에 의하여 용이하게 분리될 수 있다. 상기 형태의 검색 방법의 하나의 양태에 있어서, 방사성의 재편성된 독소 단백질은 요오드화에 의하여 제조될 수 있다. 이후 상기 방사성 단백질은 96 웰 플레이트내의 BBMV와 혼합하여 결합된다. 상기 BBMV는 여과에 의하여 세정되며 이로써 유리 분자들(결합하지 않은 단백질)이 제거된다. 동일한 시료 세트로 제작된 2 세트의 플레이트를 사용하는데, 이들 중 한 세트는 10분 동안 항온 처리하며 다른 세트는 2 시간 동안 항온 처리한후, 여기에 100 ×의 표지화되지 않은 야생형 단백질을 첨가한다. 가역적 수용기 결합(즉, 수용기 결합 측정)의 정도를 측정하는데에는 단시간 반응을 수행하며, 비가역적 막 삽입 여부를 측정하는데에는 장시간의 항온 처리 반응을 수행한다. 이와 같이 2개의 상이한 항온 처리 기간을 적용함으로써, 단백질의 작용 방식을 파악할 수 있었다. 재편성된 단백질이 고도의 활성을 띄고 있지 않는 경우, 과도의 냉각 야생형 단백질은 재편성된 단백질들이 BBMV에 결합하지 못하도록 막는다. 표지의 존재량을 측정한 이후 BBMV를 여과하여 상등액을 제거한다. 이로써 BBMV상에 잔류하는 재편성된 단백질의 양을 측정할 수 있다.
경쟁적 결합 검정법은 수용기에 대한 친화도가 증가된 독소를 암호화하는 재편성된 유전자를 동정하는 적당한 방법이다. 예를 들어, 표지된 독소 단백질(예를 들어, 방사능 표지된 독소 단백질), 비변이성(야생형 독소 단백질) 독소 단백질을 고정화된 수용기(예를 들어, BBMV 결합성 수용기)에 결합시킨다. 과량의 단백질(결합하지 않은 단백질)을 세정한후, 전술된 바와 같이 DNA 재편성된 변이체 푸울로부터 분리한 냉각된(표지화되지 않은) 독소 단백질을 비변이성 독소 단백질과 경쟁적으로 결합시키는데에 사용한다. 변이된 독소 단백질의 수용기 친화도가 비변이성단백질보다 높은 경우, 변이체는 수용기 결합형 비변이성 단백질과 치환된다. 따라서, 상기 수용기와 결합된 표지의 양은 감소된다. 예를 들어, 여과된 BBMV와 결합된 표지의 양을 측정함으로써, 상기 수용기에 대한 친화도가 더욱 높은 변이체를 동정할 수 있다. 전술한 전체 곤충 검정법 또는 세포 검정법에 의하여 수용기 친화도가 높은 변이체들의 살충 활성이 증가되었음을 확인할 수 있다.
전술한 수용기 결합 검정법은 곤충 세포들에 적용될 수 있다. Keeton 및 Bulla 등의 문헌[(1997)Appl. Environ. Microbiol.63:3419-3425]에 의하면 "Bt 독소 수용기"를 발현하는 포유 동물 세포군은 Cry1A 라 칭하여지는 Cry 단백질 군에 대한 감수성이 있다고 기술하고 있다. Keeton 및 Bulla에 의하여 사용된 "수용기" 유전자는 카데린(cadherin)과 유사히며, 소수의 선택된 Cry 단백질만이 상기 수용기와 결합하는 것으로 공지되어 있기 때문에, 상기 유전자는 사용이 매우 제한적이라고 한다. Bt Cry 단백질에 대한 기타의 수용기들이 동정되었다. 이들 대부분은 아미노펩티다제 N으로 보고되고 있다. 그러나, 아미노펩티다제 N 또한 그의 Cry 단백질에 대한 특이성 법위가 협소하기 때문에 사용이 제한적이다. 예를 들어, Cry1C 는 상기 수용기 단백질을 인지하지 않는다. 그러나, DNA 재편성으로 연구된 Cry 단백질에 특이적인 수용기 유전자를 세포군으로 클로닝하여, 특이적 결합 검정법을 개발할 수 있다. 다수의 Bt 독소에 대한 수용기는 담배 박각시나방(hornworm)인 만두카 섹스타[Keeton 등 (1997)Appl.Environ. Microbiol.63:3419-25; Knight 등 (1994)Mol. Microbiol.11:429-36; Knight 등 (1995)J.Biol.Chem.270:17765-70; Masson 등 (1995)J.Biol.Chem.270:20309-15 ; Vadlamudi 등 (1995)J.Biol.Chem.270:5490-4], 짚시 나방(리만트리아 디스파르;Lymantria dispar)[Rajamohan 등 (1996)Proc. Nat'l Acad. Sci.USA 93:25, 14338-43], 헬리오티스 비레스센스[Luo 등 (1997)Insect Biochem. Mol. Biol.27:35-43 및 Gill 등 (1995) J.Biol.Chem. 270:27277-82]로부터 특징화되었다. Bt 독소에 있어서, 바이오틴화된 단백질도 결합 검정법에 사용될 수 있다[Du 등의 문헌(1996)Appl. Environ. Microbiol.62:2932-9]. Bt Cry 단백질은 활성화될 경우, 인지질 및 염료 또는 방사성 동위 원소로 구성된 리포솜에 공극을 형성시킬 수 있다. Cry 단백질로 인한 공극 형성 여부는 염료 또는 방사성 동위원소의 누출 여부를 모니터하여 측정할 수 있다.
다른 양태에 있어서, 검색법은, 예를 들어 파지 또는 기타 복제 가능한 유전자 패키지의 표면상에 디스플레이되는 융합 단백질인 재조합 내병충성 유전자 발현물로써 수행될 수 있다. 선택된 표적에 결합하는 폴리펩티드 라이브러리를 제조 및 검색하는 파지 디스플레이 기술을 사용하는 방법에 관하여는 예를 들어 Cwirla 등의 문헌[(1990)Proc. Nat'l Acad. Sci.USA 87:6378-6382]; Devlin 등의 문헌[(1990)Science249:404-406]; Scott & Smith 등의 문헌[(1990) Science 249:386-388]; Ladner 등의 미국 특허 제5,571,698호에 기술되어 있다. 재조합 내병충성 유전자 라이브러리 또한 다른 파지보다도, 진핵 바이러스 및 박테리아과 같은 복제 가능한 유전자 패키지로부터 디스플레이 될 수 있다. Bt Cry1A(a) 살충 활성 독소가 파지상에서 디스플레이되는 것에 관하여는 Marzari 등의 문헌[(1997) FEBS Lett.411:27-31]에 논의되어 있다. 상기 파지 디스플레이 라이브러리는 예를들어, 곤충의 중장 또는 독소와 결합하는 수용기 폴리펩티드에 대한 친화도가 강화된 재조합 폴리펩티드를 디스플레이하는 파지를 동정할 수 있다.
다른 양태에 있어서는, 파지 디스플레이 라이브러리를 표적 곤충에게 섭식시킨다. 이후 재조합 내병충성 유전자를 암호화하는 DNA를 상기 파지를 섭식한후 사멸한 각각의 곤충들로부터 증폭시켰다. 이를 위해서는 예를 들어, 프라이머로서 삽입된 재조합 내병충성 유전자에 측접하는 위치에서 발현 벡터에 하이브리드화되는 2개의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응을 수행할 수 있다.
다른 검색 방법으로서는 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes)에 의하여 제조된 형질 전환 "뿌리털(hairy roots)"을 사용하는 단계를 포함한다. 상기 박테리아는 DNA의 일부분을 Ri(뿌리로부터 유래) 플라스미드로부터 감염된 식물 세포로 전이시켜 다수의 식물 개체내에서 뿌리털 질환을 발병시킨다 [Zambryski 등 (1989)Cell56:193-201]. 전이된 DNA(T-DNA)에 존재하는 유전자들은 식물 세포내 호르몬의 균형을 변경하여 뿌리를 발생시킨다. 정상적인 식물 뿌리와는 달리, 상기 뿌리털은 Murashige 및 Skoog 배지[MS:(1962)Physiol. Plant15:473-497]와 같은 단순 배지에서 용이하게 무한정 배양될 수 있다. 상기 뿌리털은 또한 전체 식물체로의 재생을 유도시킬 수 있다[Tepfer(1984)Cell37:959-967]. T-DNA용으로서 필요한 크기는 특히 정해진 바 없기 때문에, 목적하는 임의의 유전자를 삽입하여 식물 세포에 이전시킬 수 있다. 상기 시스템을 통하여 시험관내 재편성을 통해서 제조된 유전자를 발현시키는 수백개의 또는 수천개의 형질 전환 뿌리 개체를 신속하게 제조할 수 있다. 뿌리 조직은 선충류 내성 및 근충 내성을검색하는데에 특히 유용하다.
상기 검색 방법의 개략도를 도 4에 나타내었다. 재편성된 유전자 라이브러리를 전술한 바에 의하여 제조하고 이것을 항생제(예를 들어, 카나마이신) 내성 유전자, E.콜리 복제 원점(개체내 유지용) 및 Ri T-DNA(Tepfer 및 Casse-Delbart(1987)Microbiol.Sci.4:24-28)를 함유하는 플라스미드내에 결찰시켰다. 이후 상기 플라스미드 라이브러리를 전기 사출법에 의해서 A.리조제네스 세포에 도입한후(Main 등의 문헌 (1995) Methods Mol. Biol. 44:405-412) 상기 세포들을 적당한 배지[예를 들어, 25 ∼ 200 ㎍/㎖ 카나마이신 또는 기타 선별 시약을 함유하는 MYA 배지(8.0 g/L 만니톨, 5.0 g/L 효모 추출물, 2.0 g/L 암모늄 설페이트, 0.5 g/L 카사미노산 및 5.0 g/L 염화나트륨, pH 6.6)]상에 도말한후, 약 28℃에서 며칠 동안 항온 처리하였다. 플라스미드가 A. 리조제네스에서 자유롭게 복제될 수 없었기 때문에, T-DNA 지역내에 상동성 재조합법에 의하여 내인성 Ri 플라스미드가 통합화된 세포들만이 선별시 생존하였다. 식물 조직 접종용으로 사용하기 위해서 상기 플레이트로부터 모든 콜로니들을 세정하여 수집하였다.
이후 식물 조직을 상기 콜로니로 접종하였다. 대두(글리신 맥스 ;Glycin max)를 포함하는 다수의 상이한 쌍자엽 식물 및 단자엽 식물 종들이 A. 리조제네스에 의하여 유도되어 뿌리털을 형성하였다[De Clee 및 De Ley(1981) Bot. Rev. 47:147-94]. 일반적으로 식물 조직(예를 들어 종자 식물)은 표면 살균된 것으로서, 24 웰 또는 48 웰 플레이트내 고체 MS 배지에서 배축 절편을 절단하여 말단부에 삽입한후 살균 처리된다. A. 리조제네스 접종액을 조직 절편의 말단부에 적가한후 그플레이트를 뿌리가 나올때 까지(1 ∼ 4주) 암실, 26 ∼ 28℃에서 항온 처리하였다. 형질 전환되지 않은 식물 세포들은 MS 배지상에서 뿌리를 발생시키지 않을 것이다. 그러므로, 형성된 뿌리는 형질 전환되어 항생제 선별법을 수행할 필요가 없을 것으로 추정된다. 그러나, 바람직하게는 상기 A.리조제네스는 엽병으로부터 뿌리를 제거한후 500 ㎍/㎖의 카베니실린 또는 세포탁심으로 보강된 MS 배지상에서 배양하여 사멸시킬 수 있다. 배양된 뿌리털은 급속하게 생장하여 추가로 수회 나누어서 검색 실험용 복사본을 만들수 있었다.
독립적으로 형질전환된 뿌리군을 선충류로 감염시킨후 낭종 형성 및 선충류 사멸에 대해서 검정하였으며, 또는 이들을 제 2 령 또는 제 3 령의 유충에 감염시켜 살충 활성(유충 사멸률)에 대해서 검색하였다. 선충류 또는 곤충의 공격으로부터 살아남은 최상의 뿌리군들을 선별하여 독소 유전자를, 예를 들어 재편성된 유전자가 삽입된 클로닝 위치를 둘러싸고 있는 플라스미드 서열과 매치되는 프라이머를 사용하는 PCR에 의하여 재분리하였다. 바람직한 양태에 있어서, 상기 유전자들을 혼합한후 DNase 처리하여, 재조립시켜 재편성하였다. A.리조제네스로의 제 2 도입 단계에서 식물 조직을 감염시켰다. 상기 순환 단계는 목적 수준의 내병충성이 수득될 때까지 반복 수행되었다. 최종적으로 진화된 독소 유전자를 분리하여 시판되고 있는 생식 식물을 재생시키는 방법으로 목적 식물 재배 변종에 형질 전환시키는데에 사용하였다.
상기 시스템은 또한 미지의 독소 또는 미지의 유전자에 의하여 합성되는 독소를 암호화하는 유전자들을 동정하는데에 유용하다. 검색의 제 1 단계의 목적이미지의 독소 유전자를 확인하기 위한 것일 경우, 근원 유기체로부터의 게놈성 라이브러리를 Ri 플라스미드내에 만들 수 있다. 클로닝을 촉진시키기 위하여, 특이적으로 절단되는 제한 위치(예를 들어,NotI)를 포함하는 링커를 게놈성 단편에 부가한후 A. 리조제네스로 운반시키기 위하여 E.콜리 벡터에 클로닝시켰다. 상기 검정법의 잔류물은 생존 뿌리 조직으로부터 초기에 수득한후 게놈성 서열의 전부 또는 일부에 대해서 유전자 특징화 및 재편성되었다는 것을 제외하고는 기술된 바와 같았다.
독소 유전자를 얻는 데에 바람직한 곤충 병원균으로서는, 예를 들어 바실러스 튜린지엔시스*(Bacillus thuringiensis)(다수의 곤충), 바실러스 스패리쿠스*(Bacillus sphaericus)(모기), 바실러스 파필리아*(Bacillus popilliae)(딱정 벌레), 바실러스 렌티모르버스(Bacillus lentimorbus)(딱정 벌레), 바실러스 라바애(Bacillus larvae)(벌), 바실러스 모리타이(Bacillus moritai)(집파리), 클로스트리디움 브레비패이션스*(Clostridium brevifaciens)(모충), 클로스트리디움 말라코소마애(Clostridium malacosomae)(모충), 슈도모나스 애어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)(여치를 포함한 다수의 곤충), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae)(메뚜기), 엔테로박터 애어로제네스(Enterobacter aerogenes), 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens)(다수의 곤충), 세라티아 엔토모필리아(Serratia entomophila)(딱정 벌레), 세라티아 리크패이션스(Serratia liquefaciens)(다수의 곤충), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)(여치), 제노랩두스 네마토필러스 네마토필러스*(Xenorhabdus nematophilus)(딱정 벌레), 스트렙토코커스 패칼리스(Streptococcus faecalis)(다수의 곤충), 리켓치엘라 파필리아애*(Rickettsiella popilliae)(딱정 벌레), 리켓치엘라 멜로론타애*(Rickettsiella melolonthae)(딱정 벌레, 모충) 및 마이코플라스마(Mycoplasma)/스피로플라스마(Spiroplasma)와 같은 미생물을 포함한다 [단, * 는 살충 단백질을 합성하는 것으로 현재 공지되어 있는 병원균을 의미하며, 나머지는 상기 독소를 합성할 수 있는 병원균을 의미].
바이러스 병원균으로서는, 예를 들어 바큘로바이러스"(Baculovirus) [핵상 다면체 바이러스(Nuclear polyhedrosis virus), 입자상 바이러스(Granulosis virus) 및 비차폐성 바이러스(Nonoccluded virus)], 폴리드나 바이러스(Polydnavirus)[이시노바이러스(Ichinovirus) 및 브라코바이러스(Bracovirus) 포함], 폭스바이러스(Poxvirus), 아스코바이러스(Ascovirus), 이리도바이러스(Iridovirus), 노드바이러스(Nodvirus), 피코 RNA 바이러스(Pico RNA virus), 테트라바이러스(Tetravirus), 레오바이러스(Reovirus)[세포질성 다면체 바이러스 및 무스카레오바이러스(Muscareovirus) 포함], 비르나바이러스(Virnavirus), 랩도바이러스(Rhabdovirus), 토가바이러스(Togavirus), 플라비바이러스(Flavivirus) 및 뷰니아바이러스(Bunyavirus)를 포함한다.
진균성 곤충 병원균으로서는, 예를 들어 코르디셉스 종(Cordycepsspp.), 스트롱웰시아 종(Strongwellseaspp.), 주프토라 애뉴이엔시스(Zoophthora anuiensis), 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana), 보베리아 브롱니아르티(Beauveria brongniartii), 패실로마이시스 퓨모소로세우스(Paecilomyces fumosoroseus), 버티실리움 레카니(Verticilium lecanii), 메타리지움 플라보비리대(Metarhizium flavoviridae), 메타리지움 어니소플리아에(Metarhizium anisopliae), 라제니디움 자이겐튬(Lagenidium gigantum), 노무라애아 릴레이(Nomuraea rileyi), 노무라애아 실린드로스포라애(Nomuraea cylindrosporae), 판도라 네오아피디스(Pandora neoaphidis), 판도라 델파시스(Pandora delphacis), 네오자이기트 플로리다나(Neozygites floriana), 히르수텔라 톰소니(Hirsutella thompsonii), 닐라파르바타 루겐스(Nilaparvata lugens), 에리니아 네오아피디스(Erynia neoaphidis) 및 매조스포라 종(Massosporaspp.)을 포함한다.
곤충에 대하여 병원성인 선충류로서는, 독소를 생성하는, 예를 들어 테트라도네마 플리칸스(Tetradonema plicans)(파리), 메르미스 니그레센스(Mermis nigrescens)(여치), 로마노메르미스 큘리시보랙스(Romanomermis culicivorax)(모기), 아그라메르미스 데카우다타(Agramermis decaudata)(여치), 랩디티스 인섹티보라(Rhabditis insectivora)(딱정 벌레), 스타이너네마 종(Steinermaspp.)(딱정 벌레, 모충)(상기 선충류와 공생하는 박테리아)[예를 들어, 제노랩두스(Xenorhabdus)/포토랩두스 종(Photorhabdusspp.)], 스타이너네마 카르포캡사에(Steinermae carvocapsae), 스타이너네마 글라세리(Steinermae glaseri), 스타이너네마 쿠시다이(Steinermae kusidai), 유디플로개스터 아포디(Eudiplogaster aphodii)(딱정 벌레), 델라데누스 시리시디콜라(Deladenus siricidicolaisp.)(아종), 콘토르틸렌커스 종(Contortylenchusspp.)(딱정 벌레), 헤테로틸렌커스 오텀낼리스(Heterotylence autumnnalis)(파리) 및 스패룰라리아 밤비(Sphaerularia bombi)(벌)을 포함한다.
재편성된 라이브러리로 형질 전환된 뿌리군을 사용한 다른 방법으로서는 용질, 영양소, 또는 화학 물질의 흡수 및 이용을 포함한다[Tepfer 등의 문헌(1989) Plant Mol. Biol. 13:295-302]. 또한 진균 감염, 리조비움 뿌리혹 형성 및 2차 대사 생성물도 뿌리털을 사용하여 검색될 수 있다[Tepfer 및 Casse-Delbart(1987) Microbiol.Sci. 4:24-28 ; Saito 등의 문헌(1992) J. Natl. Prod. 55:149-162].
본원에 기술된 형질 전환 식물 조직 검색 방법에 있어서 몇몇 변이가 발생할 수 있다. 첫째, A.리조제네스보다 더욱 널리 사용되는 A.튜미패시엔스는 재편성된 유전자 라이브러리를 운반할 수 있다. 상기 양 균주의 병원성을 미약화시킨(disarmed), 이원체는 천연 T-DNA 발병 유전자가 존재하지 않는 경우 유전자를 항생제 마커를 보유한채로 전이시켜 공격 받을 가능성이 있는 조직에 따라서 캘러스, 뿌리, 어린싹 또는 전체 식물체를 유도시킬 수 있다. 곡류 및 곡물 생산 식물종에 있어서, 예를 들어 입자 총 발포법(particle gun bombardment)[Barcelo 및 Lazzari(1995) Methods Mol. Biol. 49:113-123]과 같은 기타의 식물 형질 전환 방법을 사용하여 검색용 형질 전환 조직을 제조할 수 있다.
B. 표적 범위의 확대
본 발명은 또한 DNA 재편성법을 사용하여 자연 발생적 유전자보다 더욱 광범위한 곤충, 선충류, 또는 기타 해충에 효과적인 내병충성 유전자를 얻는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상이한 표적 특이성을 보유하는 독소를 암호화하는 유전자 계통에 대해서 DNA 재편성법을 사용하여, 목적으로 하는 표적 해충에 독성을 나타내는 자연 발생적 유전자에 의하여 암호화되는, 독소의 효능이 다소 떨어지는 독소에 대하여 검색을 수행할 수 있다. 재편성되어 표적 범위가 확대된 유전자의 특정 양태로서는 이하의 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
(ⅰ) 더욱 높은 활성을 수득하도록 재편성될 수 있는 Bt 독소 유전자 대 옥수수 근충 및 기타 초시류 해충.
(ⅱ) 활성을 강화시키도록 재편성될 수 있는 Bt 독소 유전자 대 인시류 및 쌍시류와 같은 상이한 목에 속하는 기타 특정 해충.
(ⅲ) 신규한 활성을 수득하도록 재편성될 수 있는 Bt 독소 유전자 계통 대 내성이 개선되어(Nature Biotech, Sep. 1997-p.816) 독소를 보유하는 곤충성 해충
(ⅳ) 재편성되어 효능 및 표적 스펙트럼이 증가될 수 있는, 예를 들어 콜레스테롤 옥시다제, 프로테아제 억제제, 렉틴등과 같은 독소를 암호화하는 기타 유전자[Asgrow Reports-Genetic Engineering for Pest Control, Len Copping, 제 2.1 내지 제 2.4].
독소 범위가 증가된 독소를 암호화하는 재편성된 유전자 라이브러리 구성원들을 동정하는 검색 방법으로서는 전술한 바와 같이, 생체내 및 시험관내 검정법모두를 포함한다. 다시말하면, 일반적으로 시험관내 검정법이 바람직한데, 왜냐하면 고처리량 검색법에 대한 이들의 순응성이 더욱 강하기 때문이다. 곤충 유충 중장을 사용하여 살충 스펙트럼에 대한 검정법을 수행할 수 있다[예를 들어, Van Rie 등 (1998)Eur. J. Biochem.186:239-47 참조]. 상기 독소들에 대한 수용기, 즉 세포군에서 BBMV로서 발현되는 수용기는 전술한 바와 같이 사용될 수 있다.
일반적으로, 목적의 자연 발생적 독소에 영향을 받지 않거나 또는 강하게 결합하지 않는 세포 또는 수용기가 본 검정법 수행에 사용하기 위하여 선택된다. 재조합 독소 라이브러리는 시험되어 표적 세포에 활성이며/또는 상기 표적 수용기에 대한 친화도가 높은 독소가 동정된다.
C. 해충의 내성 형성에 대한 감수성 감소
생물 살충제를 사용할 경우 종종 관찰되는 한 가지 문제점은 표적 해충이 상기 살충제에 대하여 내성을 갖게 된다는 점인데, 이는 해충 군집에 대하여 선택적 압력으로서 작용하기 때문이다[예를 들어, Kumar 등의 문헌(상동)을 참조하시오]. 본 발명은 내성을 보유하게 되는데에 있어서 자연 발생적 유전자의 경우보다 감수성이 떨어지는 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법을 제공한다.
내성을 갖게 되는 해충에 대하여 감수성이 떨어지는 최적화된 재조합 내병충성 유전자에 대한 선택에는, 예를 들어 육종하는 곤충 군집에 다양한 먹이(예를 들어, 재편성된 유전자 라이브러리의 구성원)를 섭식시켜 각 클론에 대하여 내성이 얼마나 신속하게 발생하는지 여부를 측정하는 단계를 포함한다. 임의의 영구적 방법은 2 이상의 Bt 독소, 바람직하게는 다양한 Bt 독소를 사용하여 상기 양 경우에대한 내성을 용이하게 수득하지 못하도록 만드는 것이다. 유전자의 상이한 조합체들은 전술한 바와 같이 검정되어 상기 양 유전자에 대한 내성 발생의 용이성을 측정할 수 있다.
내성 발생에 대한 감수성이 떨어지는 Bt 독소를 얻는 하나의 양태에 대한 개요는 다음과 같다. 다이아몬드등 나방(diamondback moth)은, 즉 유효하며 널리 사용되는 Bt 독소인 Cry1A에 대한 내성을 용이하게 개선시킬 수 있다. 이들 내성 나방은 Cry1C에 대해서는 여전히 감수성을 갖는데 상기 Cry1C 가 Cry1A의 수용기와 상이한 수용기에 결합하기 때문이나, 상기 Cry1C는 Cry1A 보다 그 효능이 더욱 떨어지기 때문이다. 본원에 기술된 바와 같은 DNA 재편성 방법을 사용하여 내성 곤충에 더욱 효과적이도록 Cry1C의 효능을 증가시킬 수 있다. 이러한 검색 시험은 스포돕테라 프루기페르다 Sf9 곤충 세포내에서 수행될 수 있는데, 왜냐하면 Sf9 세포들은 Cry1C 에 감수성이지만 Cry1A 에 대해서는 그렇지 못하기 때문이다. 상기 검정법은 Cry1C 수용기 유전자로 형질 전환된 비개질성 Sf9 세포 또는 기타 곤충 세포군[예를 들어, 헬리오티스 종, 트리코플러시아 니 또는 다이아브로티카 종(옥수수 근충)]에서 수행될 수 있다[예를 들어, de Maagd 등(1996) Appl.Environ. Microbiol. 62:2753-7 를 참조하시오].
D. 증가된 발현량
다른 양태에 있어서, 본 발명은 내병충성 유전자의 발현량을 증가시키는 방법을 제공한다. 이는 예를 들어 유전자의 GC 함량을 식물의 것과 더욱 유사하게 매치되도록 바꾸거나, 또는 본 발명의 DNA 재편성 방법을 사용하여 코돈의 사용 방법을 개선시킴으로써 유전자 자체를 최적화시킴으로써 수행될 수 있다.
이와는 달리, 발현량은 DNA 재편성법을 사용하여 개선된 프로모터 및 기타 유전자 발현 조절 시그널을 수득함으로써 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 내병충성 유전자는 조절 서열과 같은 부가적인 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있어서, 이의 발현을 보장할 수 있다. 이들 조절 서열들은 다음과 같은 인자들을 하나 이상 포함할 수 있다 : 강화 유전자, 프로모터, 시그널 펩티드 서열, 인트론 및/또는 폴리아데닐화 서열. 내병충성 유전자의 효능은 종종 식물 또는 기타 숙주에 의한 유전자 산물의 발현량에 의존적이다. 최적화된 프로모터 및/또는 기타 조절 서열은 해충에 대한 내성을 개선시키는 것으로 보인다. 더욱이, 때때로 유전자가 발현되는 세포의 형태 및/또는 내병충성 유전자 발현의 시간을 조절하는 것도 바람직하다. 에를 들어, 내병충성 유전자에 대한 내성을 발생시키는 단계는 지연되거나 또는 유도적이거나 내성 유전자를 불연속적으로 발현시킬 수 있는 프로모터를 사용하여 차단될 수 있다. 본 발명의 방법은 프로모터 또는 기타 조절 서열에 의하여 영향 받는 유전자 및 기타 인자들을 제공한다.
발현량은 발현 산물의 생성 속도의 증가, 발현 산물의 분해 속도의 감소 또는 발현 산물의 효능 개선을 포함하는, 다양한 방법을 통하여 효율적으로 개선될 수 있다. 상기 방법에는 유전자 발현 조절에 관여하는 폴리뉴클레오티드를 DNA 재편성시키는 것을 포함한다. 조절 서열을 포함하며, 각각 2 이상의 상이한 뉴클레오티드를 생성시키는 제 1 형태 및 제 2 형태를 최소한 전술한 바와 같이 재조합시켜야 한다. 결과로 얻은 재조합 조절 서열 라이브러리를 검색하여 강도, 유도성 또는특이성이 개선된 하나 이상의 최적화된 재조합 조절 서열을 동정할 수 있다.
재조합 기질은 전체 길이 백터이거나, 또는 이들의 단편일 수 있는데, 여기에는 암호화 서열 및/또는 암호화 서열과 작동 가능하도록 연결된 조절 서열을 포함한다. 상기 기질은 벡터내에 존재하는 임의의 조절 서열 및/또는 암호화 서열의 변이체들을 포함할 수 있다. 재조합이 단편의 수준에서 수행되면, 재조합 단편은 검색 수행 이전에 벡터에 삽입되어야 한다. 만일 재조합이 시험관내에서 수행되면, 재조합 단편을 함유하는 벡터는 일반적으로 검색 이전에 세포에 도입된다.
상기 재조합 단편을 포함하는 세포들은 선별 마커에 의하여 암호화되는 유전자의 발현 여부를 측정함으로써 검색될 수 있다. 선별 및/또는 검색의 목적으로, 벡터로부터 발현된 유전자 산물은 실질적으로 치료용 생성물이라기 보다는, 예를 들어 녹색 형광 단백질[Crameri(1996) Nature Biotechnol. 14:315-319 참조]이거나 또는 세포 표면 단백질과 같이, 종종 용이하게 검출되는 마커이다. 예를 들어, 상기 마커가 녹색 형광 단백질인 경우, 최고의 발현량을 나타내는 세포 는 유동 혈구 측정법을 기초로 하는 세포 분류법에 의하여 동정될 수 있다. 상기 마커가 세포 표면 단백질인 경우, 세포들은 항체와 같은 단백질에 대하여 친화도를 갖는 시약으로 염색되어, 다시 유동 혈구 측정법을 기초로 하는 세포 분류법에 의하여 분석된다. 약품 내성 유전자는 또한 선별 마커로서 제공된다. 이와는 달리, 유전자 산물은 임의의 검출 및 선별 마커의 조합체를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 내부 참고 마커 유전자는 벡터내에 포함되어 복사본의 수 또는 삽입 위치내 변이를 검출하여 보상할 수 있다.
만일 추가의 개선이 바람직한 경우, 추가의 재조합 및 검색 단계에서의 기질의 일부 또는 전부로서 마커 유전자의 발현량이 최고인 세포로부터 얻은 재조합 단편이 사용될 수 있다. 이후 형질 전환된 식물에서, 또는 식물을 감염시킬 수 있는 미생물을 포함하는, 목적 식물에 적용되는 미생물에서 내병충성 유전자를 발현시키는데에 최적화된 조절 지역이 사용될 수 있다.
E. 프로테아제 분해에 대한 증가된 내성
곤충 중장 체액 프로테아제를 함유하므로, 프로테아제 분해에 대한 내성은 내병충성 유전자 산물의 바람직한 특성이다. 본 발명은 프로테아제 내성이 증가된 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법을 제공한다. 통상적으로, 재조합 유전자 라이브러리는 상기 유전자 산물을 발현시켜 프로테아제 존재시 보유하는 보전성(integrity) 및 살충 활성(pesticidal activity)을 복구시키는 산물들을 동정할 수 있다. 예를 들어, 재편성된 유전자 푸울이 발현될 수 있으며, 곤충 중장 체액 또는 관련된 프로테아제를 함유하는 기타의 배지 존재하에서 상기 유전자 산물을 항온 처리하였다. 상기 폴리펩티드의 보전성은, 예를 들어 겔 전기영동법 또는 적당한 생물 검정법에 의하여 측정될 수 있다. 프로테아제 내성 유전자 산물을 함유하는 푸울을 다시 분할후 재시험하여 프로테아제 내성 유전자 산물을 암호화하는 라이브러리 구성원을 동정할 수 있다.
F. 환경 조건에서의 증가된 안정성
개선을 필요로 하는 다른 특성은 내병충성 유전자 산물이 극한의 pH를 견뎌내는 능력과 표적 해충의 작용 부위에서 우세한 기타의 조건들이다. 예를 들어, 초시류 및 반시류의 중장 체액은 pH가 상대적으로 낮은 반면에(약 pH 3 내지 6), 대부분의 곤충의 내방 체액의 pH는 상대적으로 높다(약 pH 8 내지 11). 자외선에 노출에 의한 불활성화는, 예를 들어 분무형 살충제의 형태로 곤충 병원성 바이러스 제형을 사용할 경우에 있어서 주요한 한계점으로서 작용할 수 있다. 곤충의 피해로부터 보호하기 위하여 곡물에 살충제를 분무한후, 바이러스는 태양 광선, 구체적으로 UV 광선에 의하여 급속하게 불활성화되었다.
상기와 같이 최적화된 유전자의 검색된 전술한 프로테아제 내성 시험 방법과 유사한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 내병충성 유전자 산물은 작동 위치에서 발견 된다. 상기 시험 조건하에서 안정성이 증가된 유전자 산물을 암호화하는 라이브러리 구성원들이 동정되었다.
UV 광선 감수성이 감소된 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 수득할 확률을 높이기 위하여, UV 광선에 그다지 감수성이지 않은 아미노산 코돈을 포함하는 재편성 반응 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. UV 내성 병원성 바이러스 제형을 검색하는 적당한 방법중 하나는 다음과 같다. 오토그라파 캘리포니카 핵형 다면체 바이러스(AcNPV)의 경우, 바이러스 게놈 전체가 재편성된다. 우선, AcNPV를 5 % 의 바이러스만이 생존할 수 있는 양인 투여량 만큼의 UV에 노출시켰다. UV 처리시 생존한 바이러스를, 트리코플러시아 니(양배추 벌레)에서 증식된 Sf9(스포돕테라 프루기페르다) 세포상에서 플라크 형태로 분리한후 제 2 차 UV 처리를 수행하였다. 이러한 과정을 수 회 반복 실시하였다. UV하에서 수 회 통과시킨후 생존한 군집 푸울로부터 바이러스 게놈을 분리해냈다. 상기 UV 내성 바이러스 DNA를 야생형 바이러스로부터 수득한 DNA와 혼합한후 재편성시켰다. Sf9 세포를 재조립된 DNA로 트랜스펙팅시킨후, 바이러스를 분리하였다. 이와 같은 UV 선별 순환이후, UV에 대한 내성이 있으며 예를 들어 감염성 및 사멸 속도와 같은 표현형에 있어서의 분명한 변화를 관찰할 수 없는 몇몇 바이러스 클론을 수득하였다.
G. 숙주 식물에 대한 감소된 독성
본 발명의 DNA 재편성 방법을 사용하여 제조된 재편성된 유전자도 또한 검색되어 숙주 식물에 대한 독성이 자연 발생적 유전자에 비해서 감소된 개체들을 선별할 수 있다. 상기 유전자들을 식물 또는 식물 세포에 도입하여 상대적으로 비독성인 개체들을 동정할 수 있거나, 또는 유전자 산물을 식물 또는 식물 세포에 대한 독성에 관해서 검정할 수 있다.
Ⅴ. 최적화된 내병충성 유전자의 용도
본 발명의 방법을 사용하여 제조된 최적화된 내병충성 유전자로부터 시험관내 및 생체내에서의 이들의 용도를 파악할 수 있다. 해충으로부터 식물을 보호할 수 있는 기작을 연구하고 식물에 적용시킬 수 있는 살충제를 생산하기 위하여, 예를 들어 항 해충 활성이 개선된 유전자들을 생체내에서 사용할 수 있다. 최적화된 내병충성 유전자를 식물 표면에 콜로니를 형성한 미생물에 도입시키거나 또는 식물체에 도입시킬 수 있다. 각각의 경우에, 내병충성 유전자의 발현은 식물체에 해충에 대한 내성을 부여할 수 있다.
A. 살충제 합성
최적화된 내병충성 유전자가 살충제로서 유용한 폴리펩티드 합성에 사용될수 있다. 일반적으로 최적화된 유전자는 목적으로 하는 숙주 세포에서 높은 수준으로 발현하기 위하여 발현 카세트내에 도입된다. 통상적인 발현 카세트는 목적 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 프로모터를 함유한다. 하나 이상의 최적화된 내성 유전자는 단일 발현 벡터내에 복수개의 전사 카세트를 도입시키거나, 하나 이상의 내병충성 유전자로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 구성하거나, 또는 클로닝 단계에서 사용되는 각각의 발현벡터에 대한 상이한 선별 마커를 사용함으로써 단일의 원핵 세포내에서 발현될 수 있다.
본 발명의 최적화된 내병충성 유전자는 E.콜리, 기타 박테리아 숙주, 효모 및 예를 들어, COS, CHO 및 HeLa 세포군 및 골수종 세포군과 같은 다양한 진핵세포를 포함하는 다양한 숙주 세포내에서 발현될 수 있다. 유용한 박테리아의 예로서는 에스케리치아속(Escherichia), 엔테로박터속(Enterobacter), 아조토박터속(Azotobacter), 어위니아속(Erwinia), 바실러스속(Bacillus), 슈도모나스속(Pseudomonas), 크렙시엘리아속(Klebsielia), 프로테우스속(Proteus), 살모넬라속(Salmonella), 세라티아속(Serratia), 쉬겔라속(Shigella), 리조비아속(Rhizobia), 비트레오실라속(Vitreoscilla) 및 파라코커스속(Paracoccus)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 재조합 유전자는 각 숙주에 대하여 적당한 발현 조절 서열과 작동 가능하도록 연결될 것이다. E.콜리에 있어서, 상기 조절 서열로서는, 예를 들어 T7, trp 또는 람다 프로모터, 리보좀 결합 위치를 포함하며 바람직하게는 전사 종결 시그널을 포함한다. 진핵 세포에 있어서, 조절 서열로서는 프로모터를 포함할 것이며 바람직하게는 면역 글로불린 유전자, SV40, 시토메갈로바이러스 등으로부터 유래된 강화 유전자, 그리고 폴리아데닐화 서열을 포함할 것이며, 스플라이싱 공여 서열 및 수용 서열을 포함할 수 있다.
바람직한 양태에서, 발현 카세트가 원핵 숙주 세포에서 내병충성 유전자를 발현시키는데에 유용하다. 본원에서 리보좀 결합 위치 서열을 따라서 임의적으로는 작동 유전자와 함께 연결된, 전사 개시용 프로모터를 포함하는 것으로 정의되는, 일반적으로 사용되는 원핵 조절 서열로서는 일반적으로 사용되는 프로모터인 베타 락타마제(페니실리나제) 및 락토즈(lac) 프로모터 시스템 [Change 등의 문헌, Nature(1977)198:1056], 트립토판(trp) 프로모터 시스템 [Goeddel 등의 문헌, Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057], tac 프로모터 [DeBoer 등의 문헌, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1983) 80:21-25]; 및 람다 유래 PL프로모터 및 N 유전자 리보좀 결합 위치 [Shimatake 등의 문헌, Nature(1981)292:128]를 포함한다. 특정 프로모터 시스템은 본 발명에서 중요한 의미를 갖지는 않지만, 원핵 세포네서 작용하는 임의의 유용한 프로모터가 사용될 수 있다.
본질적 프로모터(constitutive promoter) 또는 조절 프로모터(regulated promoter)가 본 발명에서 사용될 수 있다. 고밀도로 생장한 후 내병충성 폴리펩티드의 발현이 유도될 수 있기 때문에, 조절 프로모터가 유리할 수 있다. 어떠한 경우에는 이종 단백질의 발현량이 높아짐에 따라서 세포가 서서히 생장하기도 한다. 특히 E.콜리에 사용하는데에 적합한 조절된 프로모터로서는 박테리오파지 람다 PL프로모터, 혼성체 trp-lac 프로모터[Amann 등의 문헌, Gene(1983) 25:167 ; de Boer 등의 문헌, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1983) 80:21] 및 박테리오파지 T7 프로모터[Studier 등의 문헌, J.Mol.Biol.(1986); Tabor 등의 문헌(1985)]를 포함한다. 상기 프로모터 및 이의 사용 방법에 관하여는 Sambrook 등의 문헌(상동)에 기술되어 있다.
E.콜리를 제외한 원핵 세포내에서 내병충성 폴리펩티드의 발현시키는데에 있어서는, 특정 원핵 세포 종에서 작용하는 프로모터가 필요하다. 이와 같은 프로모터들은 상기 종들로부터 클로닝한 유전자로부터 얻은 프로모터를 사용할 수 있거나 또는 이종 프로모터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 혼성체 trp-lac 프로모터는 E.콜리 이외에 바실러스속에서 작용할 수 있다. 진핵 숙주 세포에서 사용하기에 적당한 프로모터는 당업계의 숙련자에게 널리 공지된 것이다.
편리하게는 리보좀 결합 위치(RBS)는 원핵 숙주 세포에 사용되도록 제조된 본 발명의 발현 카세트내에 포함될 수 있다.예를 들어, E.콜리의 RBS는 개시 코으로부터 3 내지 11 뉴클레오티드 업스트림에 위치하며 길이 3 내지 9 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 서열로 구성된다[Shine 및 Dalgarno, Nature(1975) 254:34 ; Steitz, In Biological regulation and developement : Gene expression(ed. R.F. Goldberger), vol.1, p.349, 1979, Plenum Publishing, NY].
발현을 강화시키기 위하여 번역 커플링법이 적용될 수 있다. 상기 방법은 번역 시스템으로부터 유래된 고도로 발현된 유전자로부터 수득한 짧은 업스트림 개방 판독틀을 사용하는 방법으로서, 상기 판독틀은 프로모터의 다운스트림에 배치되고리보좀 결합 위치로부터 몇개의 아미노산 코돈 만큼 떨어진 부위에 종결 코돈을 배치한다. 상기 종결 코돈의 바로 앞 부분은 제 2의 리보좀 결합 위치이며, 상기 종결 코돈의 후속부에는 번역 개시용 개시 코돈이 존재한다. 상기 시스템은 RNA에 2 차 구조로서 존재하며, 이로써 번역이 효율적으로 개시될 수 있다. Squires 등의 문헌(1988) J. Biol. Chem. 263:16297-16302를 참조하시오.
내병충성 폴리펩티드는 세포내에서 발현될 수 있거나, 또는 상기 세포로부터 분비될 수 있다. 세포내 발현은 종종 고수율을 나타낸다. 필요한 경우, 재굴곡 과정(refolding process)을 통하여, 가용성이며 활성인 내병충성 폴리펩티드의 양을 증가시킬 수 있다[예를 들어, Sambrook 등의 문헌(상동) ; Marston 등의 문헌, Bio/Technology(1984) 2:800 ; Schoner 등의 문헌, Bio/Technology(1985) 3:151을 참조하시오]. 내병충성 폴리펩티드가 세포로부터 주변 세포질 또는 세포외 배지로 분비되는 양태에 있어서, DNA 서열은 절단 가능한 시그널 펩티드 서열에 연결된다. 상기 시그널 서열은 세포막을 통하여 내병충성 폴리펩티드의 전좌를 유발시킨다. E.콜리에서 사용하기에 적당한 벡터의 예로서는 프로모터 시그널 서열 단위를 포함하는 pTA1529가 있는데, 이는 E.콜리 phoA 프로모터 및 시그널 서열을 보유한다 [예를 들어, Sambrook 등의 문헌(상동) ; Oka 등의 문헌, Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1985) 82:7212 ; Talmadge 등의 문헌, Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1980) 77:3988 ; Takahara 등의 문헌, J.Biol.Chem.(1985)260:2670].
본 발명의 내병충성 폴리펩티드는 또한 융합 단백질로서도 합성될 수 있다. 정상적인 원핵 세포 조절 서열에 의하여 전사 및 번역이 유도되기 때문에, 상기 연구 방법은 종종 고수율을 나타낸다. E.콜리에 있어서, lacZ 융합체는 종종 이종 단백질 발현에 사용된다. 예를 들어, pUR, pEX 및 pMR100 시리즈 [예를 들어, Sambrook 등의 문헌(상동) 참조]와 같은 적당한 벡터들이 용이하게 사용될 수 있다. 어떠한 경우에 있어서는, 비 내병충성 폴리펩티드 아미노산을 단백질 정제후 융합 단백질로부터 절단하는 것이 바람직하다. 이는 브롬화 시아노겐, 프로테아제 또는 인자 Xa에 의한 절단 방법을 포함하는, 당업계의 공지된 몇몇 방법들 중 임의의 방법에 의해서 수행될 수 있다[예를 들어, Sambrook 등의 문헌(상동) ; Itakura 등의 문헌, Science(1977) 198:1056; Goeddel 등의 문헌, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1979) 76:106 ; Nagai 등의 문헌, Nature(1984) 309:810 ; Sung 등의 문헌, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1986) 83:561을 참조하시오]. 절단 위치는 목적 절단 지점의 융합 단백질 유전자내에 조작될 수 있다.
N 말단을 보유하는 E.콜리로부터 재조합 단백질을 얻는데에 적당한 시스템에 관하여는 Miller 등의 문헌[(1989) Biotechnology 7:698-704]에 기술되어 있다. 상기 시스템에서, 목적 유전자는 펩티다제 절단 위치를 함유하는 효모 유비퀴틴 유전자의 처음 76 잔기에 융합된 C 말단 융합체로서 제조된다. 상기 두 부분의 접합점이 절단되면 원형의 진정 N 말단 잔기를 보유하는 단백질이 합성된다. 본 발명의 발현 벡터는 E.콜리 세포에 대해서는 염화 칼슘 형질 전환법을, 또는 포유 동물 세포에 있어서는 전기 사출법과 같이 널리 공지된 방법에 의해서, 선택된 숙주 세포내에 전이될 수 있다. 플라스미드로 형질 전환된 세포들은, 예를 들어amp,gpt,neo및hyg유전자와 같은, 상기 플라스미드내의 유전자에 의해 부여된 항생제 내성에 따라 선택될 수 있다.
일단 발현되면, 재조합 내병충성 폴리펩티드는 황산 암모늄 침전법, 친화성 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기 영동 등과 같은, 당업계의 표준적인 방법에 따라서 정제될 수 있다[R.Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.(1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol.182 : Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y.(1990)참조]. 균질도가 약 90 내지 95 % 이상인 실질적으로 순수한 조성물이 바람직하며, 균질도가 98 내지 99 % 이상인 것이 가장 바람직하다. 일단 정제되면, 의도하는 바와 같이 부분적으로 균질하거나 또는 거의 균질한 폴리펩티드(예를 들어, 항체 생성에 대한 면역원으로서)가 사용될 수 있다.
당업계의 숙련자는 내병충성 폴리펩티드의 생물학적 활성을 감소시키지 않으면서 이들을 변형하여 사용하는 것이 가능하다는 사실을 인식하게 될 것이다. 표적 분자를 융합 단백질로 클로닝, 발현 또는 결합시키는 것을 촉진시키기 위하여 몇가지 변형이 가해질 수 있다. 이와 같은 변형은 당업계의 숙련자들에게 널리 공지된 것들로서, 예를 들어 개시 위치를 제공하기 위하여 아미노 말단에 부가된 메티오닌, 또는 편리하게 배치된 제한 위치 또는 종결 코돈 또는 정제 서열을 제조하기 위하여 양 말단 중 하나에 위치하는 부가적인 아미노산(예를 들어, 폴리 His)을 포함한다.
최적화된 내병충성 유전자에 의하여 암호화되는 폴리펩티드는 당업계의 숙련자들에게 공지된 바와 같이 식물에 적용시키기 위한 제형일 수 있다. 예를 들어 Bt 독소에 있어서, 상기 독소들 중 하나 이상의 형태가 식물에 적용되거나 또는 살충활성 검정법에 사용되기 위하여 제형화될 수 있다. 활성 내병충성 폴리펩티드는 적당한 담체, 희석제, 유화제 및/또는 분산제와 힘께 제형화될 수 있다. 상기 살충 조성물은, 예를 들어 습윤성 분말, 펠렛, 입자 또는 분상체, 또는 거품, 겔, 현탁액, 농축액등과 같은 수성 또는 비수성 용매와 함께 제조된 액상 제형과 같은 다수의 형태중 임의의 형태로 제형화될 수 있다. 이러한 조성물에 있어서 활성 성분의 농도는 제형의 성질 및 의도로 하는 이의 사용 방식에 의존성일 것이다.
연장된 보호 기간 동안(예를 들어, 전체 생장 기간 동안), 추가의 상기 조성물이 주기적으로 제공될 수 있다.
살충 폴리펩티드는 건조하며, 목적량만큼의 활성 화합물을 함유하는, 예를 들어 캡슐, 알약 또는 타뷸렛과 같은 고체상의 단위 투여량의 형태로 제형화될 수 있다. 이와 같은 투여 형태는 적당한 희석제, 증량제, 분해제 및/또는 예를 들어 녹말, 락토즈, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 식물성 고무등과 같은 고착제와 활성 성분을 혼합하여 제조된다. 이와 같은 단위 투여 제형은, 처리된 식물의 형태 및 감염의 심각성과 형태와 같은 인자들에 의존적인, 총중량과 살충제의 함량에 따라 다양할 수 있다.
B. 최적화된 내병충성 유전자를 발현하는 미생물로 식물 처리
최적화된 곤충 내성 유전자, 또는 이의 살충 효과를 보유하는 부분은 식물을 콜로니화시킬 수 있는 미생물로 도입될 수 있다. 상기 미생물들이 존재하는 식물의 해충에 의하여 잠식되면 상기 해충을 사멸시키는 내병충성 유전자 산물을 합성할 수 있다. 식물 피이토스피어(phytosphere)를 콜로니화시킬 수 있는 미생물은, 예를들어 미국 특허 제 5,281,532 호 및 유럽 특허 출원 제 0 200 344 호에 기술되어 있다. 유전자를 미생물에 도입시켜 발현시키는 방법은 본원에 기술되어 있거나 또는 당업계의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다[예를 들어, 미국 특허 제 5,135,867 호 참조].
미생물 숙주로서는 목적으로 하는 하나 이상의 곡물의 "피이토스피어(phytosphere)" 를 감염시키는 것으로 공지된 것을 선택한다. 만일 폴리펩티드 살충제를 발현하는 유전자를 안정적으로 유지시키고 발현시키는 경우, 바람직하게는 상기 폴리펩티드가 환경에 의하여 분해되어 불활성화되지 못하도록 보호하는 능력이 개선된 경우, 상기 미생물들은 특정 환경(곡물 및 곤충의 서식지)에서 야생형 미생물과 성공적으로 경쟁하여 선택된다. 특정 목적을 갖는 숙주 미생물로서는 원핵 생물 및 예를 들어 진균류와 같은 하등 진핵 생물을 포함한다. 그램 음성 및 그램 양성인 원핵 생물의 예로서는 에스케리치아속, 어위니아속, 쉬겔라속, 살모넬라속 및 프로테우스속과 같은 엔테로박테리아세아애속 ; 바실라세아애속 ; 예를 들어, 리조비움속과 같은 리조비세아애속 ; 스피릴라세아애속(Spirillaceae)(광박테리아를 포함), 자이모모나스속(Zymomonas), 세라티아속(Serratia), 애어로모나스속(Aeromonas), 비브리오속(Vibrio), 디설포비브리오속(Desulfovibrio), 스피릴륨속(Spirillum) ; 락토바실라세아애속(Lactobacillaceae) ; 예를 들어, 슈도모나스속(Pseudomonas) 및 아세토박터속(Acetobacter)과 같은 슈도모나다세아속(Pseudomonadaceae) ; 아조토박터아세아애속(Azotobacteradeae) 및 니트로박터라세아애속(Nitrobacteraceae)을 포함한다. 진핵 생물로서는 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)와 같은 효모를 포함하는 피이코마이세츠속(Phycomycetes) 및 아스코마이세츠속(Ascomycetes)과 같은 진균류 ; 및 로도토룰라속(Rhodotorula), 아우레오바시디움속(Aureobasidium), 스포로볼로마이세스속(Sporobolomyces)등과 같은 바시디오마이세스속(Basidiomycete) 효모가 있다.
당업계의 숙련자들에게 공지된 최적화된 내병충성 유전자로 형질 전환된 미생물을 식물에 적용할 수 있다 [예를 들어, 미국 특허 제 5,281,532 호 참조]. 통상적으로, 형질 전환된 미생물은, 예를 들어 해충으로부터 보호 받을 식물의 리조스피어 또는 필로플레인과 같은, 이의 자연적 서식지에 적용될 수 있다. 상기 제제는 유충 또는 성충 해충에 의하여 흡수 및/또는 섭식되거나, 또는 이들의 알에 독성을 나타낸다. 상기 식물의 장기적인 보호는 상기 미생물들을 지속시킴으로써 달성될 수 있으나, 때로는 반복적인 투여에 의해서도 달성될 수 있다. 재조합 유기체는 토양, 종자의 외피에 도포, 함침, 주사되어 적용될 수 있거나, 또는 종자를 피복시키거나 도포함으로써 적용될 수도 있다. 환경에 투여되는 경우, 일반적으로 유기체의 농도는 106내지 1010cell/㎖, 부피는 단위 헥타르당 0.1 oz 내지 2 lb 이상일 것이다. 식물에 직접적으로 투여되는 경우, 상기 유기체의 농도는 일반적으로 103내지 106cell/cm2일것이다.
C. 식물 세포로의 곤충 내성 유전자의 도입
다른 양태에 있어서, 최적화된 재조합 내병충성 유전자는 본원에 기술된 바와 같이 제조되어 원형 식물 또는 식물의 일부로서 존재하는 식물 세포를 포함하는, 식물 세포로 도입된다. 이후 재조합 내성 유전자가 발현함으로써 상기 식물 및 식물의 일부분이 내성을 보유하게 된다.
본 발명은 식물내에서 최적화된 내병충성 유전자를 발현시키는데에 유용한 발현 카세트를 제공한다. 상기 최적화된 내성 유전자에 더하여, 발현 카세트는 상기 유전자의 발현을 유도시키는 기능을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 발현 카세트는 통상적으로 목적 숙주 식물내에서 인지되는 적당한 전사 개시 조절 지역, 즉 프로모터 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 지역을 포함하는데, 이들 모두는 핵내에서 암호화 서열을 전사시킨후 계속해서 프로세싱되도록 연결되어 있다. 이들 서열은 바이러스, 식물 또는 박테리아 유전자와 같은 임의의 근원으로부터 유도될 수 있다. 전사 프로모터 및 종결 인자의 바람직한 근원 중 하나의 예로서는 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)와 같은 식물 바이러스가 있으며, 이는 Hohn 등의 문헌(1982) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:194-220 및 A 내지 G까지의 부록편에 기술되어 있다. 상기 CaMV는 식물에서 기능을 갖는 2 이상의 프로모터, 즉 CaMV의 유전자 Ⅵ의 전사 산물인 19S 프로모터와 35S 전사 산물의 프로모터를 보유하고 있다. 상기 CaMV 35S 또는 19S 프로모터는 Kay 등의 문헌(1987) Science 236:1299-1302에 기술된 방법에 의하여 강화될 수 있다.
식물 유전자로부터 수득한 프로모터 및 기타 조절 서열은 또한 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 내병충성 유전자 발현에 사용하기에 적당하다. 양태로서는리불로스 비스포스페이트 카복실라제의 소 단위체를 암호화하는 유전자로부터 수득한 서열과 클로로필 a/b 결합 단백질을 암호화하는 유전자로부터 수득한 서열을 포함한다. 예를 들어 Morelli 등의 문헌(1985) Nature 315:200-204를 참조하시오. 기타의 적당한 프로모터로서는 Figwort 모자이크 바이러스, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 히스톤 프로모터, 튜블린 프로모터, 또는 만노파인 합성 효소 프로모터(MAS)로부터 수득한 전체 길이 전사 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리 또는 분열 조직과 같은 특정 조직에서 바람직하게 발현되는 프로모터를 사용할 수 있으며, 상기 프로모터 발현은 빛, 열 자극, 물 자극 또는 화학 약품 처리 또는 식물 생성물에 의해서 유도될 수 있다. 모범적인 녹색 조직 특이적 프로모터로서는 옥수수 포스포에놀 피루베이트 카복실라제(PEPC) 프로모터, 소 단위체의 리불로스 비스 카복실라제 프로모터(ssRUBISCO) 및 클로로필 a/b 결합 단백질 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 또한, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 공보 제 wo 93/07278에 기재된 바와 같은 식물 TrpA 유전자로부터 분리된 프로모터와 같은, 유조직 특이적 프로모터일 수도 있다.
적당한 조절 지역의 다른 근원으로서는 식물에서 발현되는 박테리아 유전자가 있다. 여기에는, 예를 들어 A.튜미패시언스의 Ti 플라스미드와 A.리조제네스와 같은 Ri 플라스미드와 같은, 아그로박테리움(Agrobacterium) 플라스미드의 T-DNA 지역에 존재하는 플라스미드가 포함된다. 특히 바람직한 아그로박테리움속 프로모터 및 최적화된 내병충성 유전자를 발현시키는데에 사용되는 5' 및 3'의 비번역 지역으로서는, 예를 들어 옥토파인 합성 효소 및 노팔린 합성 효소를 암호화하는 유전자들을 포함한다. 예를 들어, Bevan 등의 문헌(1983) Nature 304:184-187을 참조하시오.
유전자를 식물 세포로 도입시켜 그 유전자를 발현시키는 다수의 기술들이 당업계에 공지되어 있다. 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물 모두에서 이종 유전자를 도입시켜 발현시키는 방법들이 공지되어 있다. Berger, Ausubel 및 Sambrook의 저서 이외에 식물 세포 클로닝, 배양 및 재생에 대한 참고 문헌으로서 유용한 것으로는 Payne 등의 문헌(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid SystemsJohn Wiley & Sons, Inc. New York, NY(Payne); 및 Gamborg and Phillips (eds)(1995)Plant Cell, Tissue and Organ Culture;Fundamental MethodsSpringer Lab Manual, Springer-Verlag(Berlin Heidelberg, New York)(Gamborg). 세포 배양 배지에 관하여는 Atlas 및 Parks(eds) The Handbook of Microbiological Media(1993) CRC Press, Boca Raston, FL(Atlas)에 기술되어 있다. 추가의 정보는 Sigma, Aldrich, Inc.(St Louis, MO)(Sigma-LSRCCC)로부터 시판중인 Life Science Research Cell Culture 카탈로그(1998), 및 예를 들어 Sigma, Aldrich, Inc.(St Louis, MO)(Sigma-PCCS)로부터 출판되는 Plant Culture Catalogue 및 부록(1997)에서 찾아볼 수 있다. 또한 미국 특허 제 5,633,446 호, 제 5,317,096 호, 제 5,689,052 호, 제 5,159,135 호 및 제 5,679,558 호 ; Weising 등의 문헌(1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477를 참조하시오, 적당한 방법의 예로서는 아그로박테리움 튜미패시언스 매개성 형질 전환, 유전자의 원형질체로의 직접 이전, 미세 투영성 장전(microprojectile bambardment), 원형질체, 배양 세포 및 조직 또는 분열조직으로의 주입 및 전기 사출법을 포함한다. 미세 주입 기술은 당업계에 공지되어 있으며 과학 논문 또는 특허 문헌에 상세히 기술되어 있다.폴리에틸렌 글리콜 침전법을 사용하여 DNA 구성물을 도입 하는 방법에 관하여는 Paszkowski 등의 문헌(1984) EMBO J.3:2717-2722에 기술되어 있다. 전기 천공 기술에 관하여는 Fromm 등의 문헌(1985) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:5824에 기술되어 있다. 탄도 형질 전환 기술 (ballistic transformation technique)에 관해서는 Klein 등의 문헌(1987) Nature 327:70-73에 기술되어 있으며 ; 상기 방법들은 작은 비드 또는 입자의 매트릭스내에, 또는 그 표면에 핵산을 보유하는 작은 입자를 침투시키는 단계를 포함한다. 일반적으로 신규 핵산 단편은 단 1 회만으로 도입되어야 하지만, 상기 방법은 구체적으로 수회 도입되어야 한다. 단자엽 식물의 형질 전환은 전기 사출법[예를 들어, Shimamoto 등의 문헌(1992) Nature 338:274-276) ; 탄도법(bolistics)(예를 들어, 유럽 특허 출원 제 270, 356 호) ; 및 아그로박테리아 이용법 (예를 들어, Bytebier 등의 문헌(1987) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:5345-5349)를 포함하는 다수의 기술을 사용하는 것으로 공지되어 있다.
아그로박테리움 튜미패시언스 매개성 형질 전환 기술은 과학 논문에 상세히 기술되어 있다. 예를 들어, Horsh 등의 문헌(1984) Science 233:496-498 및 Fraley 등 (1983) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80:4803 을 참조하시오.상기 방법에서는, 예를 들어 외이식 세포, 분열 조직 또는 종자와 같은 식물 세포를 상기 단편으로 형질 전환시킨 아그로박테리움 튜미패시언스로 감염시켰다. 당업계에 공지된 적당한 조건하에서, 형질 전환된 식물 세포는 생장하여 어린 싹, 뿌리를 형성하고 계속하여 식물 개체로 발생하게 된다. 곤충 내성 유전자는 적당한 식물 세포에, 예를 들어 아그로박테리움 튜미패시언스의 T-DNA 함유 Ti 플라스미드가 도입될 수 있다. 아그로박테리움속의 T-DNA는 일반적으로 이종 DNA를 식물체내이 도입시키는 벡터로서 사용된다. 이원성 삽입 벡터에 관하여는, 예를 들어, 유럽 특허 제 0 120 516 호, Hoekema(1985)의 The binary plant vector system, Offset-drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, 제 5 장 ; Fraley 등의 문헌, Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-46 ; An 등의 문헌(1985) EMBO J.4:277-287 에 공지되어 있다. 상기 Ti 플라스미드는 아그로박테리움 튜미패시언스에 의하여 감염될 경우, 식물 세포내로 이전되며, 식물 게놈내에 안정하게 통합화된다[Horsh 등의 문헌(1984) Science 233:496-498 및 Fraley 등 (1983) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80:4803].
통상적으로, 곤충 내성 유전자를 식물에 도입시키는데에 사용된 벡터는 선별 마커를 포함할 것이다. 선별 마커는 형질 전환된 식물 세포에, 예를 들어 카나마이신, G418, 블레오마이신, 하이그로마이신 또는 클로로암페니콜과 같은 살생물제 또는 항생제, 클로로설퓨론 또는 바스타(Basta)와 같은 제초제에 대한 내성을 부여한다. 선별 마커에 대한 적당한 암호화 서열의 예로서는 다음과 같은 것들이 있다. 항생제 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 효소 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 암호화하는neo유전자[Beck 등의 문헌(1982) Gene 19:327] ; 효소 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제를 암호화하고 항생제 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는hyg유전자 ; 및 제조제 화합물인 포스피노트리신 및 비아라포스에 대한 내성을 부여하는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제를 암호화하는 bar 유전자(EP 242236).
해충의 병원체는 또한 최적화된 내병충성 유전자를 표적 해충에 도입시키는데에 사용될 수도 있다. 예를 들어, 외래 유전자는 도포성 살충제로서의 바이러스 효능을 개선시키기 위하여 바큘로바이러스(곤충 감염 바이러스)내에서 발현된다. 하나의 양태에서, 천연의 BmNPV 보다 조기에 사멸시키며 곤충 유충 체액 대사를 효과적으로 교란시키는 곤충 이뇨 호르몬 유전자를 발현하는 재조합 밤빅스 모리(Bombyx mori)(누에) 핵성 다면체 바이러스(BmNPV)를 들 수 있다. 숙주 곤충을 사멸시키는 임의의 단백질을 암호화하는 재편성된 유전자가 바큘로바이러스내에 삽입될 수 있다. 바이러스 뿐만 아니라 박테리아류, 진균류, 선충류등과 같은, 표적 해충의 임의의 병원체가 상기 재편성된 유전자를 해충에 도입시켜 이의 병원성을 강화시키는데에 사용될 수 있다.
하나의 양태로서, 재편성된 Bt 살충성 단백질 유전자가 사용될 수 있다. Bt 단백질 결정의 막 지간 부위("도메인 I")가 적당한 프라이머 세트를 사용하는 PCR에 의해서 몇몇 cry I 형 유전자로부터 클로닝될 수 있다. 이와 같이 증폭된 유전자들은 혼합되어 재편성된다. 이후 재편성된 유전자를 바이러스 게놈성 DNA와 함께 초기 단계 프로모터(예를 들어 p10, gp64) 또는 후기 단계 프로모터(예를 들어, 다면체; polyhedron)를 포함하는 바큘로바이러스(AcNPV) 발현 벡터로 클로닝하였다. 상기 벡터 구성물이 독립적으로 Sf9 세포를 바이러스 DNA로 코트랜스팩팅 시킬 경우, 벡터 통합 위치를 절단하여 개방하고, 그 결과 바이러스를 수득하였다. Sf9 세포에서 증식된 바이러스들은 이들의 사멸 속도에 관하여 T.니에서 시험되었다. 초기 단계 프로모터하의 재편성된 Bt cryI의 도메인 I을 함유하는 클론들중 하나의세트는 그의 사멸 속도가 상당히 개선되었다.
선충류도 또한 살충 단백질 전이에 유용하다. 상기 선충류들은 그램 음성 공생 박테리아를 함유하기 때문에 구체적으로, 스테리너네마 종(Sterinernema spp.)이 상기의 경우에 적합하다. 실제로, 이들 공생 박테리아는 그들 자신의 살충 단백질 세트를 생산한다[Bowen 등의 문헌(1998) Science 280:2129-2132]. 포토랩두스 루미네스센스(Phtorhabdus luminescens)로부터 수득한 살충 유전자는 재편성되어 이의 특이 활성 및/또는 숙주 특이성을 개선시킬 수 있다. 공생 박테리아를 보유하는 선충류는 곤충의 유충에 침투한후, 박테리아 개체들을 상기 곤충의 체강에 방출시킨다. 이후 상기 박테리아 개체들은 곤충내에서 생장하여 살충 단백질을 생산한다.
최적화된 내병충성 유전자로 형질 전환된 식물 세포들은 형질 전환된 세포들을 보유하는 원형 식물체로 재생된다. 예를 들어, 유럽 특허 공개 공보 0,116,718 및 0,270,822, PCT 공개 공보 WO 84/02,913 및 유럽 특허 출원 제 87/400,544.0 호를 참조하시오. 식물체들은 생식 세포를 형성한후 상기 내병충성 유전자를 자손 식물체에 전이시킬 수 있는데, 이때 상기 후손 식물체는 정상적인 방식으로 생장하여 다른 식물체와 교차될 수 있다. 이러한 재생 기술은 일반적으로 조직 배양 생장 배지내에서 임의의 식물 호르몬을 조작함으로써 가능하며, 통상적으로는 재편성된 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 살생물제 및/또는 제초제 마커에 의존성이다. 배양된 원형질체로부터 재생된 식물에 관하여는 Evans 등의 문헌,Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp.124-176, MacMillanPublishing Company, New York, 1983 ; 및 제본판,Regerneration of Plants, Plant Protoplast,pp21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985에 기술되어 있다. 재생 기술에 관하여는 일반적으로 Kleen 등의 문헌(1987) Ann.Rev.of Plant Phys. 38:467-486에 기술되어 있다. 개선된 유전자와 동형 접합체인 식물체를 얻기 위하여, 식물체를 재생한후 후손 식물체들이 특정 병원체에 대하여 내성을 갖는지 여부를 시험함으로써 수행할 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 방법에 의하여 제조된 최적화된 내병충성 유전자를 함유하는 식물체, 식물체 일부 및 식물 세포를 포함한다. 후손 및 이러한 식물체들의 기타 자손들도 또한 본 발명의 범위내에 포함된다.
D. 내병충성 유전자의 곤충 바이러스로의 도입
본원에 기술된 방법을 사용하여 얻은 최적화된 내병충성 유전자도 또한 해충을 감염시키는 바이러스내에 도입될 수도 있다. 내병충성 유전자를 곤충 바이러스로 도입시키면 바이러스의 병원성을 강화시킬 수 있다. 곤충을 감염시키는 바이러스로서는, 예를 들어 바큘로바이러스 및 엔토모폭스바이러스를 포함한다. 유전자를 곤충 바이러스에 삽입시키는 방법에 관하여는 널리 공지되어 있으며 당업계의 숙련자들에 의하여 용이하게 수행될 수 있다[예를 들어, Merryweather 등의 문헌(1990) J.Gen.Virol. 71:1535-1544 및 Martens 등의 문헌(1990) Appl. Environmental Microbiol. 56:2764-2770 참조].
종 개선 및 통합 시스템용 자동화
종을 개선시키는 한 가지 방법은 생산물 수율 또는 곤충 내성/독성 활성을잠재적으로 미묘하게나마 증진시키는 수천개의 변이체들 중 소수의 변이체들을 동정하는데에 신뢰성 있게 사용될 수 있는 검정법이다. 다수의 검정법 방법에 있어서의 제한 인자는 라이브러리 세포(또는 바이러스 세포)의 생장이 균일하다는 점이다. 이와 같은 변이는 후속 검정법에서 기준이 되는 변이의 근원이 된다. 접종량 및 배양 환경 (온도/습도)은 세포 생장 변이의 원인이 된다. 접종자에 의하여 제어되는 초기 배양 조건 및 당업계의 상용화된 온도 및 습도를 확정하는 모든 측면에 있어서 자동화는 변이 가능성을 감소시키는데에 유용하다.
하나의 측면에서, 라이브러리 구성원, 예를 들어 세포, 바이러스 플라크, 포자등은 고체 배지상에서 분리되어 각각의 콜로니(또는 플라크)를 생산한다. 자동화 콜로니 채집기(예를 들어, Q-bot, Genetix, U.K.)를 사용하여 콜로니를 동정하고, 채집하여 10,000 개의 상이한 변이체를 웰 하나당 3 ㎜의 유리 볼을 함유하는 96 웰 미세적정 디쉬에 접종시켰다. 상기 Q-bot는 전체 콜로니를 채집하지는 않지만 상기 콜로니의 중앙에 핀을 삽입한후, 소량의 세포(또는 균사) 및 포자(또는 플라크내 바이러스) 시료를 빼낸다. 상기 핀이 콜로니내에 머무르는 시간, 배양 배지에 접종시키기 위하여 찍는 횟수, 그리고 상기 핀이 배지내에 머무르는 시간은 각각 접종량과 관련되어 있으며, 각각은 제어 및 최적화될 수 있다. Q-bot의 균일화 방법은 사람의 취급에 따른 오류를 감소시키며 배양액을 조성하는 속도를 증가시킬 수 있다(약 10,000 / 4 시간). 이후 상기 배양액을 접종자에 의하여 제어될 수 있는 온도 및 습도에서 교반시켰다. 미세 적정 플레이트내 유리 볼은 발효조의 블레이드와 유사하게, 세포 배양액을 균일하게 통기시키며, 균사체 단편들을 고르게 분산시키는 역할을 한다.
분석 분자들을 복합 생물학적 매트릭스로부터 검출하는 고처리량 방법은 "HIGH THROUGHPUT MASS SPECTROMETRY"(Sun Ai Raillard 저), USSN 60/119,766(1999년 11월 2일 출원)에 교시되어 있는 바와 같이, 미세 도포 직렬식 질량 분광법(Electrospray tandem mass spectrometry)에 의하여 수행된다. 일반적으로 '766 방법, 즉 오프 라인 평행 시료 정제 및 급속 유체 주입 분석법을 이용하는 방법은 분석 시간을 시료당 30 내지 40 초로 단축시킨다.
일반적으로, 세포 채집을 시작으로하는 모든 단계에서, 시료 제조 및 분석은 자동화되어 있기 때문에 다수의 자동화 공정에 의하여 밤새 동안 수행될 수 있다. 검정법 시스템에서 유용한 액상 화학 물질용으로 널리 공지된 자동화 시스템의 수는 증가해 오고 있다. 상기 시스템에는 Takeda Chemical Industries, LTD 에 의하여 개발된 자동화 합성 장치(Osaka, Japan) 및 로보트 팔을 이용하는 다수의 자동화 시스템(Zymate Ⅱ, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.;Orca, Hewlett, Palo Alto, Calif.)과 같은 자동화 워크스테이션을 포함하는데, 이것들은 과학자에 의하여 수행되는 수동 작동과 거의 유사하다. 상기 장치들중 임의의 것은 본 발명에 사용되기에 적당한 것들로서, 예를 들어 본원에 기술된 다수의 올리고뉴클레오티드 세트로부터 조립된 분자의 고 처리량 검색법에 사용하기에 적당하다. 통합화 시스템을 참고로 하여 본원에서 논의된 바와 같이 작동 가능한 장치들의 변형물의 성질 및 수행 방법은 관련 업계의 숙련자들에게 명백할 것이다.
고 처리량 검색 시스템이 시판중에 있다[예를 들어, Zymark Corporation,Hopkinton, MA. ; Air Technical Industries, Mentor, OH ; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA ; Precision Systems, Inc., Natick, MA 등 참조]. 상기 시스템은 통상적으로 모든 시료 및 시약 피펫팅 단계, 액체 분배 단계, 시간 조정된 항온 처리 단계, 및 검정법에 적합한 검출기내 미세 플레이트의 최종 판독을 포함하는 전체 공정을 자동화한다. 상기 유기적 관련 시스템은 고 처리량 및 공정의 신속한 개시 및 높은 정도의 응용성 및 맞춤성을 제공한다. 이와 같은 시스템의 제조자들은 상기 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 그러므로, 예를 들어 Zymark Corp. 은 유전자 전사, 리간드 결합 등의 조절 방식을 검출할 수 있는 검색 시스템을 설명하는 기술적 문헌을 제공한다. 시판중인 다수의 주변 장치 및 소프트웨어는, 예를 들어 PC (Intel ×86 또는 Pentium 칩 상용성 DOS™, OS2™ WINDOWS™, WINDOWS NT™또는 WINDOWS 95-98™ 사양 기계), MACINTOSH™, LINUX 또는 UNIX 사양 컴퓨터(예를 들어, SUN™ 워크 스테이션)를 사용하여, 데이터의 디지탈화, 저장 및 분석에 유용하다.
본 발명의 검정법 분석용 통합 시스템은 통상적으로, 예를 들어 고 처리량 액체 컴퓨터 제어 소프트웨어, 데이터 디지탈화 소프트웨어, 데이터 판독 소프트웨어, 솔루션을 소스로부터 디지털 컴퓨터에 작동 가능하도록 연결된 목적지까지로 운반시키는 자동 액체 제어 아마츄어, 즉 자동화 제어 아마츄어에 의하여 고 처리량 액체의 운반을 제어하기 위하여 데이터를 디지털 컴퓨터에 입력시키기 위한 입력 장치(예를 들어, 컴퓨터 키보드), 검정법의 구성 성분들로부터 수득되는 시그널을 디지털화시키는 이미지 스캐너를 장착한 디지털 컴퓨터를 포함한다.
물론, 상기 검정 시스템은 또한, 예를 들어 컴퓨터, 목적 핵산 서열에 대한 데이터베이스, 서열 얼라인먼트 소프트웨어 등과 같은, 검색 수행용 핵상 선별 요소들과 결합된 통합화 시스템을 포함한다. 더욱이, 상기 소프트웨어는 선택된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 곤충 내성 유전자의 올리고뉴클레오티드 매개형 재편성에 사용된)로의 명령 부여 및/또는 작동 가능하도록 연결된 올리고뉴클레오티드 합성기에 의한 올리고뉴클레오티드 또는 유전자 합성의 유도시키는 요소`들을 포함할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 통합화 시스템 요소들은 임의적으로는 상기 구성 요소들중의 임의의 것을 포함하여 고 처리량 재조합 및 선별을 촉진시킨다. 상기 고 처리량 재조합 요소들은 선택 검정법 수행용 장치들로부터 고립된 시스템내에 존재하거나, 또는 상기 장치들이 통합화되어 존재할 수도 있다.
본 발명의 고 처리량 검정법에 있어서, 수천개 이상의 상이한 재편성된 변이체들을 하루만에 검색하는 것이 가능하다. 구체적으로, 미세 적정 플레이트의 각각의 웰들은 개별적인 검정법을 수행하는데에 사용될 수 있거나, 또는 농도나 항온 처리 시간에 따른 효과를 관찰하는 경우, 매 5개 내지 10개의 웰마다 하나의 변이체를 시험할 수 있다. 그러므로, 단일의 표준 적정 플레이트는 약 100 개(예를 들어, 96 개)의 반응에 대하여 검정할 수 있다. 1536 웰 플레이트가 사용될 경우, 단일 플레이트는 약 100 내지 1500개의 상이한 반응을 통하여 용이하게 검정될 수 있다. 매일 몇몇 상이한 플레이트를 검정할 수 있으며 ; 약 6,000 내지 20,000개 이상의 상이한 검정법(즉, 상이한 핵산, 암호화된 단백질, 농축물 등)을 위한 검색 검정법은 본 발명의 통합 시스템을 사용할 수 있다. 더욱 최근에는, 예를 들어Caliper Technologies(Mountain View, CA)에 의하여 시약 조작에 관한 미세 유동성 연구법이 개발되었다.
발명의 개요
본 발명은 유전자가 발현되는 식물체에 내병충성을 부여할 수 있는 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법을 제공한다. 이 방법은(1)식물체에 내병충성을 부여할 수 있는 유전자로부터 유래된 분절들을 포함하는 다수의 핵산 형태(여기서, 다수의 핵산 형태는 2개 이상의 뉴클레오티드가 서로 다름)를 재조합하여 재조합 내병충성 유전자의 라이브러리를 생성하는 단계; 및(2)라이브러리를 검색하여, 비재조합 내병충성 유전자와 비교하여 개선된 내병충력을 나타내는 하나 이상의 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 확인하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법은(3)1종 이상의 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 다른 형태의 내병충성 유전자((1)의 다수의 핵산 형태 중 하나 이상과 같거나 또는 다른 유전자)와 재조합하여 추가의 재조합 내병충성 유전자의 라이브러리를 생성하는 단계;(4)추가의 라이브러리를 검색하여, 비재조합 내병충성 유전자와 비교하여 더욱 개선된 내병충력을 나타내는 1종 이상의 추가의 최적화된 내병충성 유전자를 확인하는 단계; 및(5)필요에 따라, 비재조합 내병충성 유전자와 비교하여 더욱 개선된 내병충력을 나타내는 추가의 최적화된 재조합 벡터 모듈을 생성할 때까지 (3) 및 (4)를 반복수행하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 다수의 재조합 내병충성 유전자를 포함하는 라이브러리를 제공하는데, 여기서 각각의 재조합 내병충성 유전자는 식물체에 내병충성을 부여할 수 있는 유전자 분절의 상이한 교환을 포함한다.
하기 실시예는 단지 예시를 목적으로 제공된 것이며, 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
DNA 재편성에 의한 CRY1 독소의 최적화
자체 프로모터(5' 영역 최대 -260 nt)를 포함하는 cry1C 유전자를 DNA 재편성용 기질로서 사용한다. DNA 재편성 후, 단백질 암호화 영역을 발현 벡터내로 클로닝하고, 이.콜리를 형질전환시킨다. 형질전환된 세포는 박테리아 배양 배지(영양 육즙)에서 72 시간 동안 30℃하에 항온처리한 다음, 세포는 Cry1C 단백질로 구성된 봉입체를 형성한다. 그 다음 원심분리 및 여과로 세포를 수거하고, 리소자임으로 용해시켜 유리 봉입체를 방출시킨다. 대안적으로, 세제, 초음파 처리 또는 당업계에 공지된 기타 방법으로 처리하여 세포 용해시킬 수 있다. 봉입체는 원심 분리 또는 여과로 수거하고, 이황화 결합 환원제(예, 2-머캅토에탄올)의 존부와 상관없이 알카리 용액(pH 10.5)에 노출시켰다. 알카리 용액에 용해된 Cry1C 단백질을 트립신으로 활성화시킨다. 트립신은 Cry1C 단백질을 66 kDa 코어로 분해한다. 이 트립신 분해된 코어는, Cry1C와 같은 Cry1형 Bt 살충 단백질의 활성 형태인데, DEAE 이온 교환 수지로 정제한다. 활성화된 Cry1C 단백질을 pH10.5에서 DEAE 이온 교환 수지에 흡착시킨 다음, 염화나트륨 또는 아세트산암모늄과 같은 염으로 용출시킨다. 아세트산암모늄이 특히 바람직한데, 그 이유는 후속 농축 공정 과정에서 증발시킬 수 있기 때문이다. 이어서, 활성화된 단백질을 진공하에서 동결건조 또는 증발시켜 농축하고, 검색에 사용한다. 전술한 모든 단백질 분리 공정은 로봇을 사용한 고처리량 방식으로 96-웰 평판에서 수행한다. DNA/RNA 분리용으로 고안된 로봇을 변형시켜 이 용도로 이용한다.
cry1C 유전자는 cry1C에 상동성인 기타 cry 유전자로 재편성한다. 상동 유전자를 얻기 위해서, 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 리보좀 결합 부위 및 트립신 활성화 부위를 포함하는 Cry1C 5' 영역을 기초로 합성한다(Cry1C 단백질 암호화 영역내 대략 1800 뉴클레오티드). 이들 프라이머를 사용하여 기존에 공지되어 있지 않은 B. 투린지엔시스(B. thruingiensis) 분리체로부터 유래한 cry 유전자의 독소 부분을 증폭시킨다. 통상적으로, B. 투린지엔시스 균주는 다중 cry 유전자(7개 이상)를 포함하며, 이들 유전자는 종종 cry1C에 대한 서열과 상당히 유사하다. 하나의 B.투린지엔시스 분리체로부터, 4개의 cry 유전자를 증폭시킨다. 증폭된 클론을 이.콜리내로 클로닝하고, 선별된 클론은 제한 지도작성으로 서열 다양성에 대해 시험한다. 지도 작성을 위해서, 4 bp 인식 서열(예,Sau3A)을 보유한 제한 효소를 사용한다. cry1C의 제한 지도와 유사하지만, 실질적으로는 상이한 제한 지도를 보유한 이들 클로닝된 유전자를 cry1C를 이용한 재편성을 위해서 선별한다. 대안적으로, 클로닝된 cry 유전자는 Kalman 등의 문헌[(1993)Appl.Environ.Microbiol.59:1131-1137]에 개시된 바와 같이 다중 프라이머 PCR 분석으로 다양성에 대해 분석하였다.
DNA 재편성 후에, 숙주 세포(이.콜리 또는 바실러스)는 가끔 전길이 Cry 단백질을 생성하지 못한다. 이는 이.콜리 세포내에서도 Cry 단백질을 불안정하게 만드는 바람직하지 못한 돌연변이에 의한 것이다. Cry 단백질의 불안정한 돌연변이체는 통상적으로 곤충에서 불활성화되는데, 그 이유는 곤충은 단백질을 비활성 단편으로 분해할 수 있기 때문이다. 따라서, 이들 불안정한 돌연변이체를 미리 선별하는 것이 바람직하다. Cry 단백질을 생성하지 못하는 것을 발견하기 위해서, 면역분석(예, ELISA)을 수행한다. Cry 단백질의 C 말단 부분에 대해 만들어진 항혈청을 사용한다. Cry 단백질이 전길이의 안정한 단백질(즉, 135 kDa)로서 형성되지 않는 경우, C-말단 Cry 단백질에 대해 만들어진 항혈청은 반응하지 않는다. C-말단 부분에 대해 유도된 항혈청은 C-말단이 누락된 절두형 Cry 단백질을 이용하여 전길이 Cry 단백질에 대해 제조된 항혈청을 흡착시켜 제조한다. 대안적으로, C-말단은 공통 마커, 예컨대 히스티딘 잔기로 태그할 수 있다. 또 다른 분석 방법은 돌연변이 Cry 단백질에 대해 SDS-PAGE 분석을 수행하는 단계를 포함한다.
실시예 2
바실러스 포필리아( Bacillus popilliae )의 살충 독소 유전자의 재편성
바실러스 포필리아는 일본 갑충과 같은 딱정벌레과 갑충의 병원체로서 알려져 있으며, Cry18Aa라고 불리우는 살충 단백질을 생성한다(Zhang 등, (1997) J. Bacteriol. 179: 4336-4341). 그러나, 이 단백질의 살충 활성은 대규모로 사용하기에 충분히 높지 않아서, 갑충 감염으로 유발되는 작물 손상을 예방할 수 없다. 본 실시예는 B. 포필리아의 cry18Aa 유전자와 B.투린지엔시스의 상동 유전자인 cry2를재편성하여 Cry18Aa의 최적화하는 방법을 개시하고 있다.
cry18Aa 유전자는, 공개된 서열에 따라 고안한 2개의 프라이머를 사용하여 B.포필리아 유래의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시킨다(젠뱅크 수탁 번호 X99049). 정방향 프라이머(5'-gaaggaggctattggCCatgGac-3')은 리보좀 결합 부위 및 해독 개시 신호 주변의 서열을 기초로 한 것이다. 대문자로 표시한 바와 같이 서열은 해독 개시 부위에서 NcoI 부위를 포함하도록 변형시킨다. 역방향 프라이머(5'-ATATGGATCCTTAGTGATGGTGATGGTGATGataaagaggagtgtcatctgc-3')은 해독 종결 부위의 서열을 기초로 한 것이다. 프라이머는 cry18Aa 단백질 암호화 영역의 말단에서 6개의 보존적 히스티딘 잔기와BamHI 제한 부위(대문자)에 대한 암호화 서열을 포함한다. His 태그는 재편성된 유전자를 포함하는 이.콜리 세포가 생성하는 단백질을 정제하는데 나중에 사용한다. 하기 cry2 유전자의 경우에 개시된 바와 같이 표준 PCR 방법을 사용하여 세포 용해된 B. 포필리아 세포로부터 증폭시킨다.
일부 상이한 유전자 라이브러리는 클로닝된 cry18Aa 유전자 및 그의 상동성 유전자 사이의 DNA 재편성으로 생성한다. B.투린지엔시스의 cry2 유전자는 B.포필리아 cry18Aa 유전자에 대해 상동성인 것으로 알려져있다. 기존의 cry2 유전자는 B.투린지엔시스의 일부 균주(예, Bt 쿠르스타키 HD1 균주)로부터 PCR로 증폭한다. B.투린지엔시스 세포는 100℃하에 PCR 관내에서 용해시키고, 주형으로서 사용한다. cry2 유전자는 공개된 cry2A 서열을 기초로 고안된 적절한 프라이머(예, 젠뱅크 수탁번호 M31738, M23724, X57252 등)와 표준 PCR 프로토콜을 사용하여 PCR로 증폭시킨다. cry18Aa에 상동성인 추가의 유전자를 클로닝하고 cry18Aa로 재편성한다. 일부 B.투린지엔시스 및 B.포필리아 균주의 게놈 라이브러리는 서던 블롯으로 클로닝된 cry18Aa 유전자로 검색한다. 게놈 라이브러리를 만들기 위해서 일부 B.투린지엔시스 및 B.포필리아 유래의 DNA는Sau3A로 부분적으로 분해하여 1∼10 kb 단편을 생성한다. 약 4kb(3∼5 kb 범위)의 단편을 겔 전기영동으로 분리하고, p블루스크립트(스트라타젠)내에 클로닝한다. 일부 cry18Aa 상동성 유전자는 각종 B. 포필리아 분리체 및 B.투린지엔시스 균주, 예컨대 Bt 쿠르스타키(kurstaki), Bt 켄야(Kenyae) 및 Bt 톨보르티(tolworthi) 아종으로부터 클로닝한다.
재편성된 유전자의 단백질 암호화 영역은 PCR로 증폭하고 Sasaki 등의 문헌[(1996)Curr.Micorbiol. 31, 195-200]에 개시된 바와 같은 발현 벡터내로 클로닝한다. 이.콜리내 고발현을 위해서,ApaI 및NdeI 부위 사이의 cry 프로모터의 일부를 Sasaki 등의 문헌에 개시된 본래 벡터로부터 제거하고, cry-B. 투린지엔시스를 재편성된 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환시킨다. 형질전환체는 살충 단백질의 제조를 위해 항-6X-His-항혈청을 이용한 면역분석으로 검색하고, 양성 클론은 전술한 바와 같이 검색을 위해 보관한다.
재편성된 cry 유전자를 이.콜리내 발현시키는 경우, 세포는 통상적으로 봉입체와 같은 독소 폴리펩티드를 생성한다. 봉입체는 제조업자의 권장 절차에 따라서 B-PER 박테리아 단백질 추출 시약(피어스)과 같은 저해제로 이.콜리 세포를 해리시켜 유리시킨다. 세제를 여과시켜 제거하고, 봉입체는 0.02N NaOH로 용해시킨다. 용액의 pH를 100 mM 트리스-HCl(pH8)로 중화시킨 다음, 재편성된 유전자가 암호화하는 살충 단백질을 96-웰 여과 평판에서 Ni-NTA 아가로스(퀴아겐)로 정제한다. 충분한 양의 이.콜리 세포를 사용하여 살충 단백질을 생성하는데, 이는 발현량과 무관하에 Ni-NTA 아가로스의 용량을 초과한다. 각 96웰로부터 거의 동량의 단백질을 얻는다.
재편성된 유전자가 생성하는 단백질을 곤충 먹이에 두고, 오이 갑충이 섭취하도록 하였다. 사망률을 관찰하여 각 단백질 시료의 활성 레벨을 평가한다. 검색 효율을 증가시키기 위해서, 10개의 단백질 시료를 모으고, 활성에 대해 시험한다. 각 시험에서 사용되는 단백질의 양은 치사량 이하의 용량으로 감소시키는데, 그 용량은 야생형 Cry18Aa 단백질을 이용하여 결정한다. 일부 곤충 사망율을 나타내는 모아진 시료를 10개의 개개 성분으로 해독하여 사망율과 관계가 있는 시료(들)를 정확히 알아낸다. 양성 시료는 제2 회의 재편성을 위해 선별한다.
B.포필리아 Cry18Aa 살충 단백질을 실질적으로 증가시키기 위해서 수회 재편성을 수행한다.
실시예 3
살충 단백질을 암호화하는 곤충 병원체에서 유래한 미지의 유전자 클로닝
게놈 DNA는 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 세라티아 엔토모필라(Serratia entomophila)와 같은 일부 곤충 병원체로부터 제조한다. DNA 시료는NotI,BamHI 및SphI를 포함하는 일부 효소로 분해한다. 이들 효소로 생성된 단편을 크기별로 분류하고, 크기에 따라 코스미드 벡터, 예컨대 슈퍼코스(스트라타젠) 또는 람다 벡터(예, 람다 Zap(스트라타젠))내에 클로닝한다. 이어서, 곤충 병원체 DNA를 함유하는 이.콜리 라이브리러에 대하여 토마토 박각시 나방 및 오이갑충을 사용하여 살충 활성에 대해 검색한다. 이.콜리 세포는 LB 육즙에서 48 시간 동안 30℃에서 배양하고 원심분리하여 수거한다. 침전된 세포는 최소량의 물에 재현탁시키고, 곤충 먹이에 둔다. 곤충이 3일 동안 이 음식을 먹도록 한다. 살충 활성을 보여주는 일부 코스미드 클론을 확인하고, DNA를 분리한다.
살충 활성을 갖는 이들 세포에서 유래한 코스미드 DNA를 부분적으로Sau3a로 분해하여 약 4 kb의 단편을 얻는다. 단편은 클레노우로 말단 복원하고, p블루스크립트(스트라타젠)의SmaI 부위내로 클로닝한다. 하나의 곤충 병원체에서 유래한 약 4000개의 p블루스크립트 부분 클론을 검색한 후에, 통상적으로 살충 활성을 나타내는 일부 클론을 얻는다. 이들 양성 클론을 프로브로서 사용하여 서던 하이브리드화로 검색하여, 동일한 속에 속하는 상동성 살충 유전자를 발견한다.
살충 활성을 나타내는 슈도모나스 및 세라티아 종에서 유래한 상동성 유전자를 2개의 군으로 조합하여, 본 발명에 개시된 바와 같이 보다 높은 활성을 위해 재편성하였다. 재편성된 유전자를 이.콜리내 클로닝하고, B.포필리아 Cry18Aa에 대해 실시예 2에 개시된 바와 같이 더 높은 살충 활성에 대해 선별한다.
실시예 4
DNA 재편성으로 얻은 옥수수 근충에 대해 개선된 활성을 보유한 독소
본 실시예는 상동성 유전자 계열을 재편성하여 옥수수 근충에 대한 개선된 활성을 나타내는 독소를 얻는 방법을 개시하고 있다. 일부 Btcry유전자 세트를 재편성한다. 다수의 BtCry단백질은 갑충에 대해 활성인 것으로 알려져 있다(예, cry3Ba, cry3Bb, cry3Aa, cry3Ca, cry1Ia, cry1Ib, cry1Bc, cry1Bb, cry1Ba,cry1Ka, cry7Aa, cry7Ab, cry8Aa, cry8Ba, cry8Ca, cry9Da, cry2Aa, cry2Ab, cry18Aa 및 cry14Aa). 불행히도, 이들 유전자가 암호화하는 독소는 옥수수 근충에 대하여 불활성이거나 또는 약하게 활성인 것으로 알려져 있다. 따라서 이들 유전자는 DNA 재편성에 대한 우수한 후보임을 제시하는 것이다. 서열을 비교한 경우, 본 발명자들은 서열 상동성에 따라 4개의 계열로 나눌 수 있다. 제1 계열은 cry3Ba, cry3Bb, cry3Aa 및 cry3Ca를 포함하고, 제2 계열은 cry1Ia, cry1Ib, cry1Bc, cry1Bb, cry1Ba 및 cry1Ka을 포함하며; 제3 계열은 cry7Aa, cry7Ab, cry8Aa, cry8Bb, cry8Ca 및 cry9Da을 포함하고, 제4 계열은 cry2Aa, cry2Ab, cry18Aa 및 cry14Aa를 포함한다. 이들 유전자는 적절한 Bt 균주로부터 PCR 증폭할 수 있다. 또는, 신규의 알려지지 않은 유전자는 이들 공개된 서열을 기초로 합성된 DNA 프로브를 사용한 서던 블롯으로 Bt 분리체를 검색함으로써 Bt로부터 클로닝할 수 있다.
각각의 계열은 개별적으로 재편성한다. 이들은 모두 갑충에 대해서 활성이고, 일부(예, cry3Bb)는 옥수수 근충에 대하여 활성이기 때문에, 옥수수 뿌리 벌레에 대해 개선된 호라성을 나타내는 독소를 암호화하는 재편성된 유전자를 확인할 수 있다. 재편성, 유전자 발현, 단백질 분리 및 검색은 본원에 개시된 방법에 의해 실질적으로 수행한다.
실시예 5
선충류에 대한 개선된 활성을 갖는 독소
이 실시예에서, cry 유전자 세트를 재편성하여 선충류에 대한 활성이 증가된 독소를 암호화하는 유전자를 얻는다. 재편성된 유전자는 Bt cry5Aa, cry5Ab,cry5Ac, cry6Aa, cry6Ba, cry12Aa, cry13Aa 및 cry21Aa를 포함한다. 이들은 전술한 바와 같이 군으로 분류하고 재편성할 수 있다. 재편성된 유전자가 암호화하는 독소는 표적 선충류에 대한 활성에 대해 시험한다.
실시예 6
해충내로 최적화된 유전자를 도입하기 위한 선충류의 용도
본 실시예는 곤충내로 재편성된 유전자를 도입하는데 있어서 선충류의 사용 방법에 관한 것이다. Bt 유래의 Cyt 유전자는 더 우수한 세포 용해 활성에 대해 재편성한다. Bt의 Cyt 단백질은 곤충 세포상의 특정 인지질을 인식하여, 세포막내로 분자를 삽입하여 막 기능을 중단시키는 것으로 알려져 있다. 이의 작용 방식은 Cry 단백질의 작용 방식과 실질적으로 상이하며, Bt의 작용 방식과도 실질적으로 다르다. cyt 유전자 계열내 일부 유사체가 있다(예, cyt1Aa, cyt1Ab, cyt1Ba, cyt2Aa, cyt2Ba 및 cyt2Bb). cyt1Aa, cyt1Ba 및 cyt2Ba를 비롯한 이들 유전자 중 일부는 전술한 바와 같이 PCR 기법을 이용하여 적절한 Bt 숙주로부터 클로닝한다. 클로닝된 유전자를 혼합하고 재편성한다. 재편성된 유전자는 Sasaki 등의 문헌[(1996)Curr.Microbiol.31: 195-200]에 개시된 바와 같은 바실러스 발현 벡터내로 클로닝하고 cry 음성 Bt 균주를 형질전환시키는데 사용한다. Bt내에서 발현된 Cyt 단백질은 Sf9 세포를 사용하여 세포 독성에 대해 시험한다.
개선된 세포 독성을 나타내는 이들 클론을 제노합더스 루미네슨스(Xenorhabdus luminescens)(살충 선충류의 동일계 박테리아)내로 도입할 수 있다. Cyt 유전자는 벡터 부분에서 만들어진 프라이머를 사용하여 개선된 세포독성을 나타내는 Bt 클론으로부터 증폭하고, 증폭된 유전자하는 1 이상의 적절한 제한 효소로 절단하여 인접 영역의 일부 및 암호화 영역을 방출한다. 이 단편은 Bt 아이스라엘렌시스(Bt israelensis)내 cyt1A와 관련이 있는 20 kDa 단백질 유전자와 함께 pTZ19R내로 클로닝하고, 제노합더스 루미네슨스를 형절전환시키는데 사용한다. 20 kDa 단백질은 숙주 세포의 생존력을 보존하고 재편성된 cyt 유전자의 발현을 촉진한다(Wu 등, (1993) J.Bacteriol. 175: 5276-5280). 재조합체 X.루미네슨스를 선충류인 스테이너네마 글라세리(Steinernema glaseri)와 동시배양한다. 딱정벌레과 갑충에 대해 시험 한 결과, 재조합체 X.루미네슨스를 보유한 선충류는 비재조합체 X. 루미네슨스를 보유한 선충류보다 곤충을 사멸시키는데 휠씬 저용량을 필요로 한다는 것이 발견된다.
실시예 7
프로테아제 억제제 유전자의 최적화
시스테인 프로테아제 억제제 유전자는 보고된 DNA 서열(젠뱅크: D38130)을 이용하여 옥수수 c-DNA로부터 PCR로 증폭한다. 벼, 사탕수수, 동부, 대두, 양배추, 감자 등에서 발견되는 다수의 상동성 유전자가 있다. 벼, 대두 및 양배추 시스테인 프로테아제 억제제 유전자의 일부(25∼100 aa)를 암호화하는 DNA를 합성한다. 이들 합성된 유전자는 옥수수 억제제 유전자와 혼합하고 재편성한다. 재편성된 유전자를 이.콜리 발현계인 pQE-60(퀴아겐에서 입수)내에 클로닝한다. 재편성된 유전자를 발현시키고, 단백질은 96-웰 평판에서 Ni-NTA 아가로스로 정제한다. 그 다음 정제된 단백질은 백색 굼뱅이로부터 제조한 시스테인 프로테아제의 미정제 제제를 사용하여 프로테아제 활성에 대해 검사한다. 능동적으로 먹이를 공급받은 백색 굼뱅이를 밭에서 수거하고, 균질화한다. 세포 파편을 원심분리로 제거한 다음, 상청액을 추가의 정제없이 프로테아제 제제로서 사용한다. 굼뱅이 프로테아제 제제를 재편성된 억제제와 혼합하고, 20분 동안 항온처리한다. 프로테아제 활성은 몰리큘라 프로브에서 입수한 Enzchek를 사용한 형광 분석으로 측정한다. Enzchek는 염료 분자를 형광이 억제되는 방식으로 배열한 형광 염료 표지된 단백질을 이용한다. 프로테아제가 단백질을 분해하면 염료는 형광이 된다. 다수의 재편성된 억제제 클론은 프로테아제 분석 결과 활성으로 확인된다. 이들 활성 클론은 본 발명에 개시된 아그로박테리움 리조젠(Agrobacterium rhizogenes) 방법에 의해 살충 활성에 대해 검색한다.
실시예 8
세포독성 분석
본 발명에 개시된 것들을 비롯한 살충 단백질은 종종 세포독성이다. 예를 들어, Bt Cry 및 Cyt 단백질은 적절히 활성화된 경우 배양된 곤충 세포를 사멸시키는 것으로 알려져있다. 하기에 개시한 본 실시예에서, 본 발명자들은 재편성된 살충 유전자 생성물을 검색하는데 사용한 방법을 개시한다.
살충 단백질에 의해 분쇄된 경우, 곤충 세포는 실질적인 양의 ATPase를 방출한다. 상청액 중 ATPaes 활성은 살충 단백질의 세포독성의 지표로서 사용할 수 있다. 6X-His로 태그한 재편성된 Bt Cry 단백질은 전술한 바와 같이 Ni-NTA 아가로스로 정제한다. 이어서, 정제된 단백질은 1/100 부피(w/w) 트립신으로 30분 동안 분해하여 단백질을 활성화시킨다. 일부 인시류 곤충 세포주, 예컨대 Sf9 및 TN368(트리코플러시아 니)를 사용한다. 트립신 활성화된 Cry 단백질을 96-웰 평판에서 0.1∼1 ppm의 세포와 혼합한 다음, 60분 동안 항온처리한다. 항온처리 후에, 세포를 여과시켜 제거하고, ATPase 활성을 루시퍼라제-루시페린 분석(시그마)로 측정한다. 이 ATPase 방법은, 세포 사멸이 트립신 블루와 같은 염료로 염색하여 측정되는 염료 배제 방법과 같은 기타 방법보다 더 감수성이 뛰어나다. 사멸 세포는 트립신으로 염색하고, 생세포는 염색하지 않는다.
실시예 9
Bt cry 유전자 재편성
재편성된 유전자 라이브러리의 다양성을 증가시키기 위해서, Bt cry 유전자(들)(주요 유전자라고 명명)는 합성 올리고뉴클레오티드 재편성을 이용하여 재편성한다(Crameri 등이 1999년 2월 5일 출원한 "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION", USSN 60/118,813 참고). 간단히 요약하면, 한 계열의 상동성 곤충 내성 핵산 서열은, 예컨대 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 먼저 정렬시켜 동일성/유사성 영역 및 다양성 영역을 선별한다. 1종 이상의 다양성 영역에 상응하는 다수(예, 2, 5, 10, 20, 50, 75 또는 100 이상)의 올리고뉴클레오티드 를 합성한다. 이들 올리고뉴클레오티드를 직접 재편성하거나, 또는 1종 이상의 핵산 계열과 조합할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 서열은 2차 유전자라고 불리우는 기타 유전자로부터 취할 수 있다. 2차 유전자는 1차 유전자에 대해 일정한 정도의 상동성을 보유한다.올리고뉴클레오티드 합성용 2차 유전자의 일부를 선별하는 몇가지 방법이 있다. 예를 들어, 2차 유전자의 일부는 무작위로 선별할 수 있다. DNA 재편성 과정으로 이들 올리고뉴클레오티드를 선별하고, 재편성된 유전자내로 혼힙할 수 있다. 선별된 부분은 합성하기에 적절한 임의의 길이일 수 있다. 1차 유전자와 2차 유전자 사이의 상동성을 기초로 올리고뉴클레오티드를 고안할 수 있다. 일정한 정도의 상동성이 교차에 필요한데, 교차는 재편성 과정에서 DNA 단편사이에 발생한다. 동시에, 강한 이질성이 재편성된 유전자 라이브러리의 다양성을 위해 바람직하다. 또한, 2차 유전자의 특정 부분은 단백질 서열과 기능 관계에 대한 지식을 기초로 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 선별할 수 있다. 다수의 보고서(검토 논문에 광범위하게 인용됨: "Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.", Schnepf, E 등, 1998, Micorbiology and Molecular Biology Reviews, vol 62, p775)에서는 통상적으로 완전히 활성화된 Bt 결정 단백질의 중간 부분인 "도메인 II"가 Bt 활성에 중요하다는 것을 제시한다.
Cry1A-형 단백질의 경우, 도메인 II는 약 200번 아미노산 잔기에서 개시하여, 약 401번 아미노산 잔기에서 종료된다. 이 도메인은 Bt 독소의 곤충 특이성에 중요한 것으로 밝혀졌다. 곤충 특이성을 DNA 재편성 기법으로 본 발명에 의해 변형시킨 경우, 2차 유전자의 뉴클레오티드 서열의 도메인 II 부분은 올리고뉴클레오티드 재편성 절차에 사용된 올리고뉴클레오티드를 합성하는 표적 영역으로서 선별할 수 있다.
도메인 II에 인접하여 완전히 활성화된 Bt 결정 단백질 N-말단부인 도메인 I은 Cry의 막 스패닝 기능과 관련이 있다(Schnepf 등의 문헌 검토). Bt 결정 단백질의 살충 활성은, 최소한 부분적으로, 이 기능과 관련이 있기 때문에, 2차 유전자의 도메인 I 부분은 살충 활성이 증가된 올리고뉴클레오티드 재편성을 위해 선별할 수 있다. 도메인 II의 다음에 있고 완전히 활성화된 Bt 결정 단백질의 C-말단부인 도메인 III은 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 선별할 수 있다. 이 도메인은 때로는 곤충 특이성과 관련이 있다(Schnepf 등의 문헌 참조).
일 측면에서, 1차 cry2Aa 및 cry2Ab 유전자는 2차 cry2Ac 유전자 서열을 기초로 합성한 일부 올리고뉴클레오티드로 재편성하였다. Cry2Aa 및 cry2Ab는 고도의 상동성이 있지만, cry2Ac는 이들 유전자와는 실질적으로 다르다(예컨대 도 3 참조). 따라서, cry2Aa 및 cry2Ab와 함께 cry2Ac를 재편성하여 그 결과 재편성된 재조합체 핵산의 다양성을 증가시키는 것이 바람직하였다. cry2Aa 및 cry2Ab와는 실질적으로 상이한 cry2Ac 서열의 일부를 선별하고, 이들 부분을 포함하는 일련의 50량체 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 이들 올리고뉴클레오티드를 cry2Aa 및 cry2Ab의 단백질 암호화 영역으로 재편성하였다. 일정 수의 클론을 재편성된 유전자 라이브러리로부터 선별하고 제한 지도작성으로 다양성에 대해 검사했을 때, 우수한 다양성이 관찰되었다. 다양성은 cry2Aa 및 cry2Ab 단독의 재편성으로부터 통상적으로 예측되는 것보다 컸다.
대안적으로, 2차 유전자의 일부는 PCR 증폭으로 얻었다. PCR 증폭된 DNA를 1차 유전자로 재편성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 상기 언급한 선별 기준을 PCR 증폭에 적용할 수 있다. 증폭하고자 하는 부분을 무작위로 선별할 수 있다.또는, 서열 상동성 및 이질성을 기준으로 선별할 수 있다. 또한, 서열 및 기능 관계를 기준으로 선별할 수도 있다. PCR 증폭된 부분은 상이한 곤충 특이성에 대한 도메인 II/III이거나 또는 더 높은 살충 활성에 대한 도메인 I일 수 있다. 합성된 올리고뉴클레오티드와 같이, 2차 유전자의 PCR 증폭된 부분은 1차 유전자로 재편성할 수 있다.
실시예 10
살충 활성에 대한 고 처리량 검색
본 실시예는 신규 살충 유전자 및 단백질을 얻기 위한 고 처리량 방법을 제공한다. 먼저, 선택한 핵산(예, Bt 유전자 또는 유전자 단편)을 재조합한다. 생성된 재조합체 핵산은 활성 단백질 형태로 재조합된 핵산을 발현하는 바실러스 투린지엔시스의 균주내로 형질전환시킨다. 콜로니를 상기 개시한 바와 같이 Q-bot로 취한다. 필요에 따라, 형질전환된 세포의 푸울을 각 웰에서 증식시켜 초기 검색 라운드에서 선별되는 다수의 콜로니를 증가시킨다. 예를 들어, 10,000 웰의 경우 웰 당 100개 콜로니를 선별하면 106콜로니 선별을 제공한다.
포자 형성은 표준 96 웰(또는 그 이상) 웰 방식으로 유도된다. 일부 유충을 각 웰에 첨가한다. 평판은 유충이 위치한 웰내 유충을 보유하는 공기 투과성 막으로 덮는다. 유충이 살충 단백질을 발현하는 임의의 포자로부터 치사량을 수용할 때까지 유충에게 먹이를 공급한다. 유충을 항온실로 옮기고, 곤충으로 성숙시킨다. 성숙 곤충은 화학 유인제 또는 화학 기피제로 수동적으로 날게 한다. 사멸된 모든 유충을 수거한다. 유충은 살충 포자를 포함한다(통상적으로 살충 단백질에 의해서라기 보다는 실험 조작으로 인해 사멸되는 유충이 있기 때문에 이 단계에서 일부 가성 양성이 생긴다). 유충에서 유래한 DNA를 회수하고, 재편성된 유전자를 PCR로 회수한다. 유전자를 다시 클로닝하고, 과정을 반복하여(예, 상이한 양성 클론의 의석율 제한) 살충 단백질을 추가로 농축시킨다. 살충 활성이 농축된 이러한 유전자의 라이브러리를 작제한다. 이 라이브러리를 선별하고, 재편성하며, 본원에 개시된 임의의 방법으로 조작할 수 있다.
따라서, 이 실시예는 재편성된 Bt 유전자를 암호화하는 포자 환괴가 유충을 사멸하는 능력을 이용한다. 농축 단계는 독성이 없는 재편성된 Bt 독소를 섭취한 유충으로부터 죽은 유충을 분리하는 것을 기초로 한다. Bt 유전자를 회수하고 과정을 반복한다.
관련 측면에서, 이 분석은 재편성된 유전자로 박테리아나 진균류를 감염시키고, 예컨대 FACS로 죽은 세포로부터 생세포를 분리하여 살균 또는 살진균 단백질에 적용할 수 있다.
청구한 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 전술한 바와 같은 방법 및 재료에 대해 변형을 가할 수 있으며, 본 발명은 다음과 같은 다수의 상이한 용도로 이용할 수 있다.
예컨대 반복 과정에서, 재편성된 DNA의 곤충 내성을 시험하기 위한 통합형 시스템의 용도. 통합형 시스템은 통상적으로 곤충 내성 또는 독성을 평가하기 위한 분석을 위해 전술한 바와 같이 유체 및 세포의 조작을 유도하는 소프트웨어가 있는 컴퓨터를 포함한다.
전술한 임의의 선별 방법, 재료, 성분, 방법 또는 기질을 사용한 분석, 키트 또는 시스템. 키트는 방법 또는 분석을 수행하기 위한 지시사항, 포장 재료, 분석, 장치 또는 시스템 부품을 포함하는 1 이상의 용기 등을 추가로 포함할 수도 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법 및 장치를 구체화한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 다음 (1) 내지 (5) 중 하나 이상을 포함한다. (1) 본원에 개시된 재편성된 성분; (2) 본원에 개시된 방법을 실시하고/또는 본원에 개시된 선별 절차를 조작하기 위한 지시사항; (3) 1종 이상의 곤충 내성 또는 독성 분석 성분; (4) 살충 단백질, 핵산, 식물, 곤충, 세포 등을 보유하기 위한 용기 및 (5) 포장 재료.
또 다른 측면에서, 본 발명은 임의의 성분 또는 키트의 사용, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 분석의 실시, 및/또는 본원에 개시된 임의의 분석 또는 방법을 실시하기 위한 임의의 장치, 조성물, 라이브러리 또는 키트를 제공한다.
전술한 본 발명은 명확성 및 이해를 목적으로 다소 상세히 기재하였지만, 본원의 개시 내용을 읽은 당업자에게는 본 발명의 진정한 범위를 벗어나지 않고 형태 및 세부사항의 각종 변화를 적용할 수 있다는 것이 자명할 것이다. 예를 들어, 전술한 모든 기법 및 재료는 각종 조합으로 사용할 수 있다. 본원에서 인용한 모든 공보 및 특허 문서는 각각의 개개 공보 또는 특허 문서가 개별적으로 인용되는 바와 동일한 범위로 그 전체를 참고로 인용한다.

Claims (33)

  1. (1) 내병충성을 식물에 부여할 수 있는 유전자로부터 유래된 분절을 포함하는 다수 형태의 핵산(이들 핵산은 서로 2개 이상의 뉴클레오티드가 상이함)을 재조합하여 재조합 내병충성 유전자의 라이브러리를 생성하는 단계; 및
    (2) 그 라이브러리를 검색하여 비재조합 내병충성 유전자와 비교하여 개선된 내병충성 능력을 나타내는 1종 이상의 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 확인하는 단계를 포함하여, 유전자가 발현되는 식물에 내병충성을 부여할 수 있는 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법이
    (3) 상기 (1)의 1종 이상의 다수의 핵산 형태와 동일하거나 상이한 내병충성 유전자의 추가의 형태와 1종 이상의 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 재조합하여 재조합 내병충성 유전자의 추가의 라이브러리를 생성하는 단계;
    (4) 추가의 라이브러리를 검색하여 비재조합 내병충성 유전자와 비교하여 내병충성 능력이 추가로 개선된 1종 이상의 추가로 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 확인하는 단계; 및
    (5) 필요에 따라, 비재조합 내병충성 유전자와 비교하여 내병충성 능력에 있어서 추가의 개선을 나타내는 추가의 최적화된 재조합 백터 모듈을 얻을 때까지 상기 (3) 및 (4)를 반복하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 내병충성 능력의 개선이 해충에 대한 효능 증가를 포함하는 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 다수 형태의 핵산이 cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ad, cry1Ae, cry1Af, cry1Ag, cry1Ba, cry1Bb, cry1Bc, cry1Bd, cry1Ca, cry1Cb, cry1Da, cry1Db, cry1Ea, cry1be, cry1Fa, cry1Fb, cry1Ga, cry1Gb, cry1Ha, cry1Hb, cry1Ia, cry1Ib, cry1Ic, cry1Ja, cry1Jb, cry1Ka, cry1Jc, cry2Aa, cry2Ab, cry2Ac, cry3Aa, cry3Ba, cry3Bb, cry3Ca, cry4Aa, cry4Ba, cry5Aa, cry5Ab, cry5Ac, cry5Ba, cry6Aa, cry6Ba, cry7Aa, cry7Ab, cry8Aa, cry8Ba, cry8Ca, cry9Aa, cry9Ba, cry9Ca, cry9Da, cry9Ea, cry10Aa, cry11Aa, cry11Ba, cry11bb, cry12Aa, cry13Aa, cry14Aa, cry15Aa, cry16Aa, cry17Aa, cry18Aa, cry19Aa, cry20Aa, cry21Aa, cry22Aa, cry23Aa, cry24Aa, cry25Aa, cry26Aa, cry27Aa, cry28Aa, cyt1Aa, cyt1Ab, cyt1Ba, cyt2Aa, cyt2Ba, cyt2Bb 중 하나 이상에 상응하거나 또는 이로부터 유도된 1종 이상의 핵산을 포함하는 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 핵산이 cry1Aa1, cry1Aa2, cry1Aa3, cry1Aa4, cry1Aa5, cry1Aa6, cry1Ab1, cry1Ab2, cry1Ab3, cry1Ab4, cry1Ab5, cry1Ab6, cry1Ab7,cry1Ab8, cry1Ab9, cry1Ab10, cry1Ac1, cry1Ac2, cry1Ac3, cry1Ac4, cry1Ac5, cry1Ac6, cry1Ac7, cry1Ac8, cry1Ac9, cry1Ac10, cry1Ad1, cry1Ae1, cry1Af1, cry1Ba1, cry1Ba2, cry1Bb1, cry1Bc1, cry1Bd1, cry1Ca1, cry1Ca2, cry1Ca3, cry1Ca4, cry1Ca5, cry1Ca6, cry1Ca7, cry1Cb1, cry1Da1, cry1Db1, cry1Ea1, cry1Ea2, cry1Ea3, cry1Ea4, cry1Eb1, cry1Fa1, cry1Fa2, cry1Fb1, cry1Fb2, cry1Ga1, cry1Ga2, cry1Gb1, cry1Ha1, cry1Hb1, cry1Ia1, cry1Ia2, cry1Ia3, cry1Ia4, cry1Ia5, cry1Ib1, cry1Ic1, cry1Ja1, cry1Jb1, cry1Ka1, cry2Aa1, cry2Aa2, cry2Aa3, cry2Aa4, cry2Ab1, cry2Ab2, cry2Ac1, cry3Aa1, cry3Aa2, cry3Aa3, cry3Aa4, cry3Aa5, cry3Aa6, cry3Ba1, cry3Ba2, cry3Bb1, cry3Bb2, cry3Ca1, cry4Aa1, cry4Aa2, cry4Ba1, cry4Ba2, cry4Ba3, cry4Ba4, cry5Aa1, cry5Ab1, cry5Ac1, cry5Ba1, cry6Aa1, cry6Ba1, cry7Aa1, cry7Ab1, cry7Ab2, cry8Aa1, cry8Ba1, cry8Ca1, cry9Aa1, cry9Aa2, cry9Ba1, cry9Ca1, cry9Da1, cry9Da2, cry9Ea1, cry10Aa1, cry11Aa1, cry11Aa2, cry11Ba1, cry11Bb1, cry11Bb1, cry12Aa1, cry13Aa1, cry14Aa1, cry15Aa1, cry16Aa1, cry17Aa1, cry18Aa1, cry19Aa1, Cry19Ba1, cTy20Aa1, cry21Aa1, cry22Aa1, cry24Aa1, cry25Aa1, cry26Aa1, cry28Aa1, cyt1Aa1, cyt1Aa2, cyt1Aa3, cyt1Aa4, cyt1Ab1, cyt1Ba1, cyt2Aa1, cyt2Ba1, cyt2Ba2, cyt2Ba3, cyt2Ba4, cyt2Ba5, cyt2Ba6, cyt2Bb1, 40kDa, cryC35, cryTDK cryC53, vip1A, vip2A, vip3A(a), vip3A(b), 및 p21med로부터 선택된 1종 이상의 핵산을 포함하는 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 내병충성 능력의 개선이 내병충성 유전자에 대해 감수성인 해충의 범위 증가를 포함하는 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 내병충성 능력의 개선이 내병충성 유전자에 대한 내성을 형성하는 해충 개체군의 능력 감소를 포함하는 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 내병충성 능력의 개선이 내병충성 유전자가 암호화하는 폴리펩티드의 발현량 증가를 포함하는 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 최적화된 재조합 내병충성 유전자가 내병충성 유전자의 자연발생적 형태와 비교하여 G-C 함량의 증가를 포함하는 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 내병충성 능력의 개선이 프로테아제 절단 또는 높은 pH나 낮은 pH 레벨에 대한 내병충성 유전자가 암호화하는 폴리펩티드의 감수성의 감소를 포함하는 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 내병충성 능력의 개선이 숙주 식물에 대한 내병충성 유전자가 암호화하는 폴리펩티드의 독성 감소를 포함하는 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 해충이 선충류, 바이러스 및 박테리아로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 해충이 곤충인 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 곤충이 유충인 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 다수 형태의 핵산이 바실러스(Bacillus) 독소를 암호화하는 유전자에서 유도되는 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 바실러스가 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)인 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 바실러스 투린지엔시스 독소가 δ-내독소인 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 다수 형태의 핵산이 프로테아제 억제제, 폴리페놀 옥시다제, 살충 프로테아제, 식물계 살충 단백질, 레시틴 또는 살충제용 생합성 경로를 암호화하는 1종 이상의 유전자로부터 유도된 분절을 포함하는 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 유전자가 바실러스 종의 식물계 살충 단백질을 암호화하는 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 바실러스 종이 B. 세레우스(B.cereus), B.포필리아(B.popilliae), B.스페라커스(B.spheracus) 및 B.투린지엔시스로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 내병충성 유전자가 콜레스테롤 옥시다제를 암호화하는 것이 특징인 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 얻는 방법.
  22. 내병충성을 식물에 부여할 수 있는 유전자의 분절의 상이한 교환을 포함하는다수의 재조합 내병충성 유전자를 포함하는 라이브러리.
  23. 제22항에 있어서, 라이브러리가 비재조합 내병충성 유전자와 비교하여 개선된 내병충성 능력을 식물에게 부여하는 능력에 대해 검색된 다수의 재조합 내병충성 유전자를 포함하는 것이 특징인 라이브러리.
  24. 제23항에 있어서, 라이브러리가 파지 디스플레이 라이브러리인 것이 특징인 라이브러리.
  25. 제24항에 있어서, 검색 단계가 폴리펩티드용 수용체에 대한 증강된 결합을 보유한 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 내병충성 유전자를 포함하는 라이브러리 구성원을 확인함으로써 수행되는 것이 특징인 라이브러리.
  26. 제24항에 있어서, 검색 단계가 곤충 중장에 대한 증강된 결합을 보유한 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 내병충성 유전자를 포함하는 라이브러리 구성원을 확인함으로써 수행되는 것이 특징인 라이브러리.
  27. 제26항에 있어서, 중장이 역전되는 것이 특징인 라이브러리.
  28. 제24항에 있어서, 상기 검색 단계가 곤충에게 파지를 소비시킨 후, 재조합내병충성 유전자를 포함하는 발현 벡터에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 쌍을 프라이머로써 사용하여 죽은 곤충으로부터 얻은 DNA를 증폭시켜 수행되는 것이 특징인 라이브러리.
  29. 제23항에 있어서, 라이브러리는 곤충 세포를 라이브러리 구성원과 접촉시키는 단계, 및 곤충 세포에 대해 독성인 라이브러리 구성원을 확인하는 단계로 검색되는 것이 특징인 라이브러리.
  30. 제22항에 있어서, 라이브러리가
    (1) 내병충성을 식물에 부여할 수 있는 유전자로부터 유래된 다수 형태의 핵산(이들 핵산은 서로 2개 이상의 뉴클레오티드가 상이함)을 재조합하여 재조합 내병충성 유전자의 라이브러리를 생성하는 단계; 및
    (2) 그 라이브러리를 검색하여 비재조합 내병충성 유전자와 비교하여 개선된 내병충성 능력을 나타내는 1종 이상의 최적화된 재조합 내병충성 유전자를 확인하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것이 특징인 라이브러리.
  31. (1) 다수의 유기체 분리물로부터 유래된 다수 형태의 게놈 핵산(이들 게놈 핵산은 서로 2개 이상의 뉴클레오티드가 상이함)을 재조합하여 재조합 게놈의 라이브러리를 생성하는 단계;
    (2) 게놈의 라이브러리를 식물 해충내로 도입하는 단계; 및
    (3) 비재조합 병원체 게놈 핵산과 비교하여 해충에 대한 개선된 병원성 활성을 나타내는 1종 이상의 최적화된 재조합 게놈을 확인하는 단계를 포함하여, 식물 해충에 대해 병원성인 유기체를 얻는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 유기체가 바이러스인 것이 특징인 식물 해충에 대해 병원성인 유기체를 얻는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 바이러스는 바큘로바이러스이고, 유기체는 곤충인 것이 특징인 식물 해충에 대해 병원성인 유기체를 얻는 방법.
KR1020007012152A 1998-05-01 1999-04-22 Ｄｎａ 재편성을 이용한 내병충성 유전자의 최적화 방법 KR20010082543A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12205498P 1998-05-01 1998-05-01
US60/122,054 1998-05-01
US9446298P 1998-07-28 1998-07-28
US60/094,462 1998-07-28
PCT/US1999/008473 WO1999057128A1 (en) 1998-05-01 1999-04-22 Optimization of pest resistance genes using dna shuffling

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20010082543A true KR20010082543A (ko) 2001-08-30

Family

ID=26788913

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020007012152A KR20010082543A (ko) 1998-05-01 1999-04-22 Ｄｎａ 재편성을 이용한 내병충성 유전자의 최적화 방법

Country Status (11)

Country Link
US (1) US6500617B1 (ko)
EP (1) EP1073670A1 (ko)
JP (1) JP2002513550A (ko)
KR (1) KR20010082543A (ko)
CN (1) CN1314911A (ko)
AU (1) AU747190B2 (ko)
BR (1) BR9910174A (ko)
CA (1) CA2325567A1 (ko)
IL (1) IL139093A0 (ko)
NZ (1) NZ507591A (ko)
WO (1) WO1999057128A1 (ko)

Families Citing this family (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6326204B1 (en) 1997-01-17 2001-12-04 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
US6399383B1 (en) 1997-10-28 2002-06-04 Maxygen, Inc. Human papilloma virus vectors
US6337186B1 (en) 1998-06-17 2002-01-08 Maxygen, Inc. Method for producing polynucleotides with desired properties
US6605430B1 (en) 1998-08-12 2003-08-12 Maxygen, Inc. DNA shuffling of monooxygenase genes for production of industrial chemicals
JP2002526107A (ja) 1998-10-07 2002-08-20 マキシジェン， インコーポレイテッド マイコトキシンの解毒のための核酸を生成するためのｄｎａシャッフリング
WO2000028018A1 (en) 1998-11-10 2000-05-18 Maxygen, Inc. Modified adp-glucose pyrophosphorylase for improvement and optimization of plant phenotypes
US6436675B1 (en) 1999-09-28 2002-08-20 Maxygen, Inc. Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling
US6376246B1 (en) 1999-02-05 2002-04-23 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US7384387B1 (en) 1999-02-11 2008-06-10 Maxygen, Inc. High throughput mass spectrometry
US6531316B1 (en) 1999-03-05 2003-03-11 Maxyag, Inc. Encryption of traits using split gene sequences and engineered genetic elements
US6686515B1 (en) 1999-11-23 2004-02-03 Maxygen, Inc. Homologous recombination in plants
WO2001070947A2 (en) * 2000-03-20 2001-09-27 Maxygen, Inc. Method for generating recombinant dna molecules in complex mixtures
US20020035739A1 (en) * 2000-05-05 2002-03-21 Michael Lassner Evolution of plant disease response plant pathways to enable the development of based biological sensors and to develop novel disease resistance strategies
CA2411828A1 (en) 2000-06-23 2002-01-03 Maxygen, Inc. Novel co-stimulatory molecules
US6858422B2 (en) 2000-07-13 2005-02-22 Codexis, Inc. Lipase genes
US7462481B2 (en) 2000-10-30 2008-12-09 Verdia, Inc. Glyphosate N-acetyltransferase (GAT) genes
US20090011938A1 (en) * 2000-10-30 2009-01-08 Pioneer Hi--Bred International, Inc. Novel glyphosate-n-acetyltransferase (gat) genes
AR035799A1 (es) 2001-03-30 2004-07-14 Syngenta Participations Ag Toxinas insecticidas aisladas de bacillus thuringiensis y sus usos.
EP1417306A2 (de) * 2001-08-10 2004-05-12 Xantos Biomedicine AG Hochdurchsatz dna-isolierung und -transfektion zur analyse der funktion von genen bzw. genprodukten
US7378493B2 (en) * 2002-03-06 2008-05-27 Syngenta Participations Ag Vip3 toxins and methods of use
EP2213681A1 (en) * 2002-03-22 2010-08-04 Bayer BioScience N.V. Novel Bacillus thuringiensis insecticidal proteins
EP1511851A4 (en) * 2002-07-15 2006-11-22 Baylor College Medicine METHOD FOR IDENTIFYING BIOLOGICALLY ACTIVE AGENTS
US20040072262A1 (en) * 2002-10-11 2004-04-15 Montero-Julian Felix A. Methods and systems for detecting MHC class I binding peptides
AU2004252481B2 (en) * 2003-06-06 2011-01-27 Arborgen Inc. Compositions and methods for regulating polysaccharides of a plant cell
HUE028143T2 (en) * 2004-02-25 2016-12-28 Pioneer Hi Bred Int New crystalline bacillus thuringiensis polypeptides, polynucleotides, and compositions thereof
US7405074B2 (en) * 2004-04-29 2008-07-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Glyphosate-N-acetyltransferase (GAT) genes
US7799906B1 (en) 2004-09-22 2010-09-21 Arborgen, Llc Compositions and methods for modulating lignin of a plant
AU2005297362A1 (en) * 2004-10-19 2006-04-27 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food. Method for controlling insects of the Order Diptera using a Bacillus thuringiensis strain
MX2008002616A (es) * 2005-08-24 2008-03-14 Pioneer Hi Bred Int Composiciones que proporcionan tolerancia a multiples herbicidas y metodos de uso de las mismas.
WO2007062064A2 (en) * 2005-11-23 2007-05-31 Regents Of The University Of California, San Diego Methods and compositions for controlling parasitic infections with bt crystal proteins
US8143474B2 (en) * 2006-04-18 2012-03-27 Rutgers, The State University Of New Jersey Compositions and methods for increasing transgene expression in the plastids of higher plants
MX2009010062A (es) * 2007-03-28 2009-10-13 Syngenta Participations Ag Proteinas insecticidas.
US9522937B2 (en) 2007-03-28 2016-12-20 Syngenta Participations Ag Insecticidal proteins
WO2009023639A1 (en) * 2007-08-10 2009-02-19 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Modified peptides having toxin-enhancing effects
TWI349526B (en) * 2007-12-31 2011-10-01 Taiwan Agricultural Chemicals And Toxic Substances Res Inst Council Of Agricult Novel bacillus thuringiensis strain for inhibiting insect pests
US8461421B2 (en) * 2008-06-25 2013-06-11 Athenix Corp. Toxin genes and methods for their use
US20100077507A1 (en) * 2008-09-22 2010-03-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Lepidopteran Activity
WO2010053517A2 (en) 2008-10-29 2010-05-14 Aroian Raffi V Combination therapy to combat helminth resistance
US9464319B2 (en) 2009-03-24 2016-10-11 California Institute Of Technology Multivolume devices, kits and related methods for quantification of nucleic acids and other analytes
US9447461B2 (en) 2009-03-24 2016-09-20 California Institute Of Technology Analysis devices, kits, and related methods for digital quantification of nucleic acids and other analytes
US10196700B2 (en) 2009-03-24 2019-02-05 University Of Chicago Multivolume devices, kits and related methods for quantification and detection of nucleic acids and other analytes
US9415392B2 (en) 2009-03-24 2016-08-16 The University Of Chicago Slip chip device and methods
MX358710B (es) * 2009-12-16 2018-08-31 Dow Agrosciences Llc Uso combinado de proteínas cry1da y cry1fa para el control de la resistencia de los insectos.
US20120324605A1 (en) * 2009-12-16 2012-12-20 Dow Agrosciences Llc Insectcidal protein combinations for controlling fall armyworm and european corn borer, and methods for insect resistance management
NZ601097A (en) * 2009-12-16 2014-10-31 Dow Agrosciences Llc Insect resistance management with combinations of cry1be and cry1f proteins
US20110191903A1 (en) * 2009-12-31 2011-08-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Engineering plant resistance to diseases caused by pathogens
CN102031266B (zh) * 2010-03-25 2013-05-01 浙江大学 抗虫融合基因、融合蛋白质及其应用
MX2011000894A (es) * 2010-12-17 2012-06-18 Ct De Investigacion Cientifica Y De Educacion Superior De Ensenada B C Proteinas cry insecticidas de bacilus thuringiensis con actividad anticancerígena.
MX2015010527A (es) * 2013-02-13 2016-03-04 Athenix Corp Uso de axmi184 para el control de los insectos del gusano de raiz.
CN103421840A (zh) * 2013-08-01 2013-12-04 华中农业大学 利用转基因技术提高油菜对鳞翅目害虫抗性的方法
CN103408643A (zh) * 2013-08-15 2013-11-27 浙江大学 苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3DAa及其编码基因和应用
WO2016061377A2 (en) * 2014-10-16 2016-04-21 Monsanto Technology Llc Lepidopteran-active cry1da1 amino acid sequence variant proteins
CN104861074B (zh) * 2015-04-14 2018-05-01 中国农业科学院作物科学研究所 融合杀虫蛋白Cry1Am、其编码基因及应用
CN105331620A (zh) * 2015-11-04 2016-02-17 吉林省农业科学院 一种人工合成的BT抗虫基因FLAc及其应用
CN105349555B (zh) * 2015-12-11 2018-02-13 吉林省农业科学院 一种人工合成的Bt抗虫基因FLIa及其制备方法和应用
WO2017193022A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Codexis, Inc. Penicillin-g acylases
CN106565832B (zh) * 2016-11-09 2020-07-10 湖南省植物保护研究所 防治根结线虫的伴胞晶体蛋白组合物及其应用
CA3175100A1 (en) 2017-02-03 2018-08-09 Codexis, Inc. Engineered glycosyltransferases and steviol glycoside glucosylation methods
NZ755628A (en) 2017-02-13 2023-09-29 Codexis Inc Engineered phenylalanine ammonia lyase polypeptides
WO2018200214A2 (en) 2017-04-27 2018-11-01 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides and polynucleotides
BR112019023337A2 (pt) 2017-05-08 2020-06-16 Codexis, Inc. Ligase engenheirada, sequência de polinucleotídeo, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos para produzir um polipeptídeo da ligase engenheirada, um produto de ligação, uma biblioteca de dna e uma pluralidade de fragmentos de dna adequados para sequenciamento, e, composição
EP3638688A4 (en) 2017-06-14 2021-07-07 Codexis, Inc. MODIFIED TRANSAMINASE POLYPEPTIDES INTENDED FOR INDUSTRIAL BIOCATALYSIS
WO2019005337A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Codexis, Inc. PENICILLIN G ACYLASES
US11319531B2 (en) 2017-11-07 2022-05-03 Codexis, Inc. Transglutaminase variants
CA3081950A1 (en) 2017-12-13 2019-06-20 Codexis, Inc. Carboxyesterase polypeptides for amide coupling
US10900055B2 (en) 2018-06-12 2021-01-26 Codexis, Inc. Engineered tyrosine ammonia lyase
US11034948B2 (en) 2018-07-09 2021-06-15 Codexis, Inc. Engineered phosphopentomutase variant enzymes
SG11202012111UA (en) 2018-07-09 2021-01-28 Codexis Inc Engineered purine nucleoside phosphorylase variant enzymes
WO2020014049A1 (en) 2018-07-09 2020-01-16 Codexis, Inc. Engineered galactose oxidase variant enzymes
WO2020014050A1 (en) 2018-07-09 2020-01-16 Codexis, Inc. Engineered pantothenate kinase variant enzymes
US11274286B2 (en) 2018-07-09 2022-03-15 Codexis, Inc. Engineered deoxyribose-phosphate aldolases
SG11202012198QA (en) 2018-07-12 2021-01-28 Codexis Inc Engineered phenylalanine ammonia lyase polypeptides
WO2020028039A1 (en) 2018-07-30 2020-02-06 Codexis, Inc. Engineered glycosyltransferases and steviol glycoside glucosylation methods
AU2019373208A1 (en) 2018-10-29 2021-05-13 Codexis, Inc. Engineered DNA polymerase variants
CN110129345A (zh) * 2018-12-06 2019-08-16 天津市天大天福生物技术有限公司 一种人工设计合成的Bt抗虫基因JBT-FD及其应用
CN110229829A (zh) * 2018-12-06 2019-09-13 天津市天大天福生物技术有限公司 一种人工设计合成的Bt抗虫基因JBT-FB及其应用
AU2019397401A1 (en) 2018-12-14 2021-06-17 Codexis, Inc. Engineered tyrosine ammonia lyase
AU2020336468A1 (en) 2019-08-30 2022-03-03 Societe Des Produits Nestle S.A. Engineered lipase variants
US11970722B2 (en) 2019-12-20 2024-04-30 Codexis, Inc. Engineered acid alpha-glucosidase variants
CA3179751A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Codexis, Inc. Engineered transaminase polypeptides
EP4204554A1 (en) 2020-08-28 2023-07-05 Codexis, Inc. Engineered protease variants
CA3191900A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Codexis, Inc. Engineered amylase variants
WO2022133289A2 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Codexis, Inc. Engineered uridine phosphorylase variant enzymes
CN117120599A (zh) 2021-04-02 2023-11-24 科德克希思公司 工程化鸟苷酸激酶变体酶
CA3214975A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 Codexis, Inc. Engineered cyclic gmp-amp synthase (cgas) variant enzymes
WO2022212824A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 Codexis, Inc. Engineered adenylate kinase variant enzymes
IL305928A (en) 2021-04-02 2023-11-01 Codexis Inc Transgenic enzymes of acetate kinase variant
CN114591984B (zh) * 2022-03-29 2023-09-19 广西大学 OsAP79基因诱导水稻抗褐飞虱的应用

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4448885A (en) 1981-04-27 1984-05-15 Board Of The Regents Of The University Of Washington Bacillus thuringiensis crystal protein in Escherichia coli
US4467036A (en) 1981-11-12 1984-08-21 The Board Of Regents Of The University Of Washington Bacillus thuringiensis crystal protein in Escherichia coli
DE3346138A1 (de) 1983-12-21 1985-07-11 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Bacillus thuringiensis var. tenebrionis sowie ein insektizid wirkendes, hieraus erhaeltliches praeparat bzw. toxin sowie deren verwendung zur bekaempfung von coleoptera
US4693972A (en) 1984-01-16 1987-09-15 Becton, Dickinson And Company Composition and method for rapid detection of microorganisms in clinical samples
BR8600161A (pt) 1985-01-18 1986-09-23 Plant Genetic Systems Nv Gene quimerico,vetores de plasmidio hibrido,intermediario,processo para controlar insetos em agricultura ou horticultura,composicao inseticida,processo para transformar celulas de plantas para expressar uma toxina de polipeptideo produzida por bacillus thuringiensis,planta,semente de planta,cultura de celulas e plasmidio
US4797276A (en) 1985-03-22 1989-01-10 Mycogen Corporation Control of cotton boll weevil, alfalfa weevil, and corn rootworm via contact with a strain of Bacillus thuringiensis
GB2183661B (en) 1985-03-30 1989-06-28 Marc Ballivet Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptides or proteins by means of a dna recombinant technique
US4918006A (en) 1985-07-01 1990-04-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Gene coding for insecticidal crystal protein
US4771131A (en) 1985-08-16 1988-09-13 Mycogen Corporation Cloning and expression of Bacillus thuringiensis toxin gene encoding a protein toxic to beetles of the order Coleoptera
US4853331A (en) 1985-08-16 1989-08-01 Mycogen Corporation Cloning and expression of Bacillus thuringiensis toxin gene toxic to beetles of the order Coleoptera
US5866363A (en) 1985-08-28 1999-02-02 Pieczenik; George Method and means for sorting and identifying biological information
CA1341092C (en) 1985-12-12 2000-09-05 David L. Edwards Process for altering the host range of bacillus thuringiensis toxins, and novel toxins produced thereby
US5824469A (en) 1986-07-17 1998-10-20 University Of Washington Method for producing novel DNA sequences with biological activity
US5218104A (en) 1986-12-19 1993-06-08 Agricultural Genetics Company Limited Bowman-Birk trypsin inhibitor isolated from Vigna unguiculata
US4948734A (en) 1987-08-12 1990-08-14 Mycogen Corporation Novel isolates of bacillus thuringiensis having activity against nematodes
US5151363A (en) 1990-07-27 1992-09-29 Mycogen Corporation Isolates of Bacillus thuringiensis that are active against nematodes
US4849217A (en) 1987-11-19 1989-07-18 Mycogen Corporation Novel isolates of bacilus thuringiensis having activity against the alfalfa weevil, hypera brunneipennis
EP0348348B1 (de) 1988-06-20 2000-08-09 Novartis AG Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzenschädlingen mit nicht-pflanzlichen Proteinase-Inhibitoren
US5683691A (en) 1989-02-15 1997-11-04 Plant Genetic Systems, N.V. Bacillus thuringiensis insecticidal toxins
US5633446A (en) 1990-04-18 1997-05-27 Plant Genetic Systems, N.V. Modified Bacillus thuringiensis insecticidal-crystal protein genes and their expression in plant cells
US5436002A (en) 1991-01-29 1995-07-25 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensisisolate PS201T6 toxin
US5512463A (en) 1991-04-26 1996-04-30 Eli Lilly And Company Enzymatic inverse polymerase chain reaction library mutagenesis
US5743477A (en) 1992-08-27 1998-04-28 Dowelanco Insecticidal proteins and method for plant protection
EP0623672A1 (en) 1993-05-04 1994-11-09 Research Institute For Plant Protection New alkaline serine protease of Paecilomyces lilacinus
EP0733112B1 (en) 1993-12-08 2007-01-10 Royal Veterinary & Agricultural University Cytochrome p-450 monooxygenases
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US6165793A (en) 1996-03-25 2000-12-26 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5928905A (en) 1995-04-18 1999-07-27 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5629469A (en) 1994-03-10 1997-05-13 Sandoz Ltd. Thiol protease inhibitor
US5662897A (en) 1994-07-27 1997-09-02 U. Of Ga Research Foundation Insect viruses, sequences, insecticidal compositions and methods of use
US5659123A (en) 1994-08-26 1997-08-19 Plant Genetic Systems, N.V. Diabrotica toxins
US5640804A (en) 1994-09-14 1997-06-24 The Regents Of The University Of California Pest trap plants and crop protection
US5514588A (en) 1994-12-13 1996-05-07 Exxon Research And Engineering Company Surfactant-nutrients for bioremediation of hydrocarbon contaminated soils and water
US5824864A (en) 1995-05-25 1998-10-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize gene and protein for insect control
US5958672A (en) 1995-07-18 1999-09-28 Diversa Corporation Protein activity screening of clones having DNA from uncultivated microorganisms
US6030779A (en) 1995-07-18 2000-02-29 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
US6168919B1 (en) 1996-07-17 2001-01-02 Diversa Corporation Screening methods for enzymes and enzyme kits
US6004788A (en) 1995-07-18 1999-12-21 Diversa Corporation Enzyme kits and libraries
US6057103A (en) 1995-07-18 2000-05-02 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
WO1997007206A1 (en) 1995-08-11 1997-02-27 Okkels, Jens, Sigurd Method for preparing polypeptide variants
US5962258A (en) 1995-08-23 1999-10-05 Diversa Corporation Carboxymethyl cellulase fromthermotoga maritima
US5830696A (en) 1996-12-05 1998-11-03 Diversa Corporation Directed evolution of thermophilic enzymes
US6171820B1 (en) 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US5962283A (en) 1995-12-07 1999-10-05 Diversa Corporation Transminases and amnotransferases
US5814473A (en) 1996-02-09 1998-09-29 Diversa Corporation Transaminases and aminotransferases
US5939250A (en) 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US20030215798A1 (en) 1997-06-16 2003-11-20 Diversa Corporation High throughput fluorescence-based screening for novel enzymes
US5773221A (en) 1995-12-15 1998-06-30 Oceanix Biosciences Corporation Method of recovering a biological molecule from a recombinant microorganism
EP0873398B1 (en) 1996-01-10 2005-04-20 Novozymes A/S A method for in vivo production of a mutant library in cells
US5942430A (en) 1996-02-16 1999-08-24 Diversa Corporation Esterases
US5958751A (en) 1996-03-08 1999-09-28 Diversa Corporation α-galactosidase
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
US5919658A (en) 1996-04-03 1999-07-06 Human Genome Sciences, Inc. Human cystatin F
US5789228A (en) 1996-05-22 1998-08-04 Diversa Corporation Endoglucanases
US5877001A (en) 1996-06-17 1999-03-02 Diverso Corporation Amidase
US5763239A (en) 1996-06-18 1998-06-09 Diversa Corporation Production and use of normalized DNA libraries
ATE278416T1 (de) 1996-06-19 2004-10-15 Diversa Corp Thermostabilen phosphatasen
US5939300A (en) 1996-07-03 1999-08-17 Diversa Corporation Catalases
CA2266423A1 (en) 1996-09-27 1998-04-02 Maxygen, Inc. Methods for optimization of gene therapy by recursive sequence shuffling and selection
AU4597197A (en) 1996-09-27 1998-04-17 Introgene B.V. Methods for optimization of gene therapy by recursive sequence shuffling and selection
DE69733322T2 (de) 1996-12-06 2006-02-02 Diversa Corp., San Diego Glycosidase-enzyme
EP0948615B1 (en) 1996-12-20 2004-12-15 Novozymes A/S In vivo recombination
DE69835360T2 (de) 1997-01-17 2007-08-16 Maxygen, Inc., Redwood City EVOLUTION Prokaryotischer GANZER ZELLEN DURCH REKURSIVE SEQUENZREKOMBINATION
PL335144A1 (en) 1997-02-13 2000-04-10 Dow Chemical Co Recombined halogeno-aliphatic dehalogenases
CA2283434A1 (en) 1997-03-07 1998-09-11 Tropix, Inc. Protease inhibitor assay
NZ337910A (en) 1997-03-18 2001-10-26 Novo Nordisk As Shuffling of heterologous DNA sequences using conserved regions
ATE418608T1 (de) 1997-03-18 2009-01-15 Novozymes As Methode zur herstellung einer bibliothek mittels dna-shuffling
US6057491A (en) 1997-05-29 2000-05-02 Borad Of Regents For University Of Oklahoma Protein having insecticidal activities and method of use
US5874288A (en) * 1997-07-31 1999-02-23 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis toxins with improved activity
US5948666A (en) 1997-08-06 1999-09-07 Diversa Corporation Isolation and identification of polymerases
US5876997A (en) 1997-08-13 1999-03-02 Diversa Corporation Phytase
US6060594A (en) * 1997-12-18 2000-05-09 Ecogen, Inc. Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins
US6077824A (en) * 1997-12-18 2000-06-20 Ecogen, Inc. Methods for improving the activity of δ-endotoxins against insect pests

Also Published As

Publication number Publication date
EP1073670A1 (en) 2001-02-07
IL139093A0 (en) 2001-11-25
NZ507591A (en) 2002-03-28
BR9910174A (pt) 2001-03-06
AU3650899A (en) 1999-11-23
WO1999057128A1 (en) 1999-11-11
JP2002513550A (ja) 2002-05-14
CN1314911A (zh) 2001-09-26
CA2325567A1 (en) 1999-11-11
US6500617B1 (en) 2002-12-31
WO1999057128A8 (en) 2001-02-15
AU747190B2 (en) 2002-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20010082543A (ko) Ｄｎａ 재편성을 이용한 내병충성 유전자의 최적화 방법
CN107635396B (zh) 杀昆虫蛋白及其使用方法
RU2593961C2 (ru) КОМБИНИРОВАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВ CRY1Ca И CRY1Fa ДЛЯ БОРЬБЫ С РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ У НАСЕКОМЫХ
US9139842B2 (en) Methods and compositions for targeting sequences of interest to the chloroplast
CN101686705B (zh) 来自Bacillus thuringiensis的半翅目和鞘翅目活性的毒素蛋白
AU2004213873C1 (en) Delta-endotoxin genes and methods for their use
CN1849397B (zh) 苏云金芽孢杆菌分泌的杀虫蛋白及其应用
RU2603257C2 (ru) КОМБИНИРОВАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВ Cry1Da И Cry1Fa ДЛЯ ВЫРАБАТЫВАНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К НАСЕКОМЫМ
US8237021B2 (en) Insecticidal proteins derived from Bacillus thuringiensis
JP6648127B2 (ja) 鱗翅類活性Ｃｒｙ１Ｄａ１アミノ酸配列変異体タンパク質
US20040197916A1 (en) AXMI-004, a delta-endotoxin gene and methods for its use
EA020327B1 (ru) Гены токсинов и способы их применения
SK93197A3 (en) Insecticidal protein toxins from photorhabdus
CA2618430A1 (en) Insecticidal compositions and methods for making insect-resistant transgenic plants
KR20120115979A (ko) 곤충 내성 관리를 위한 ｖｉｐ３ａｂ 및 ｃｒｙ１ｃａ의 병용 용도
KR20120115978A (ko) 곤충 내성 관리를 위한 ｃｒｙ１ｄａ 및 ｃｒｙ１ｃａ의 병용 용도
US20020199215A1 (en) Novel toxins
MXPA04009206A (es) Nuevas proteinas insecticidas de bacillus thuringiensis.
US20040221333A1 (en) Novel toxins
CA2409031A1 (en) Insecticidal secreted proteins of brevibacillus laterosporus
MXPA00010504A (es) Optimizacion de los genes de resistencia a las plagas utilizando redistribucion de adn
AU2013203135B2 (en) Delta-endotoxin genes and methods for their use
RU2575084C2 (ru) ПРИМЕНЕНИЕ Vip3Ab В СОЧЕТАНИИ С Cry1Ca ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ НАСЕКОМЫМИ
CN116745425A (zh) 杀虫基因及使用方法
AU2005242140A1 (en) Optimization of pest resistance genes using DNA shuffling

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid