KR20010078585A - An enzymatic method for rapid quantitation of oxidized·reduced glutathione - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 동·식물 및 미생물의 세포 내에 수 내지 수십 mM 정도의 농도로 존재하는 트리펩타이드 수황 화합물(tripeptide sulfhydryl compound)인 글루타치온(Glutathione : γ-glutamylcysteinylglycine)의 신규한 정량적 측정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 5,5'-디치오비스(2-니트로벤조산)(5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid), 이하 "DTNB"라 약칭함)와 같은 산화제와 글루타치온 환원효소를 이용한 글루타치온 분석 방법에 N-에틸말레이마이드(N-ethylmaleimide, 이하 "NEM"이라 약칭함)와 같은 환원형 글루타치온의 불활성화제(trapping agent) 처리 과정을 도입하여 산화형·환원형 글루타치온(GSSG·GSH)의 양을 동시에 정확히 정량하고, 다중 홈 플레이트(multi well plate)를 사용하여 다량의 시료를 한번에 손쉬운 방법으로 측정할 수 있는 분석 시스템에 관한 것이다.The present invention relates to a novel quantitative measuring method of glutathione (glutathione: γ-glutamylcysteinylglycine), which is a tripeptide sulfhydryl compound present in cells of plants, plants and microorganisms at a concentration of several to several tens of mM. Specifically, glutathione using glutathione reductase and an oxidizing agent such as 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid, hereinafter abbreviated as "DTNB") and glutathione reductase In the analysis method, a treatment agent for reducing glutathione, such as N-ethylmaleimide (hereinafter, abbreviated as "NEM"), was introduced to treat oxidized and reduced glutathione (GSSG, GSH). The present invention relates to an analytical system capable of accurately quantitating quantities simultaneously and measuring a large amount of samples at once using a multi well plate.
글루타치온은 저분자량의 황화합물(low molecular-weight thiol compound)로서 세포 내에서 주로 자유형태(free form)로 존재하나, 일부는 단백질을 비롯한 다른 종류의 수황 화합물, 예를 들면 시스테인이나 조효소 A(coenzyme A)등과 결합하여 혼합 이황화물(mixed-disulfide)을 형성하기도 한다.Glutathione is a low molecular-weight thiol compound that exists mainly in free form in cells, but some are proteins and other types of sulfur compounds, such as cysteine or coenzyme A (coenzyme A). And the like to form mixed-disulfides.
한편, 글루타치온은 세포의 산화·환원 상태에 따라 환원형(reduced glutathione, 이하 "GSH"라 약칭함)과 산화형(oxidized glutathione 또는glutathione disulfide, 이하 "GSSG"라 약칭함)으로 존재하는데, 정상적인 세포 환경에서 자유 글루타치온은 거의 대부분이 환원형(GSH)으로 존재하고 산화형(GSSG)은 극히 소량 존재한다. 예를 들면, 진핵세포에서는 GSH가 세포질내 전체 저분자 황화물의 80%를 차지하고, 마이토콘드리아 내에 약 10% 내지 15% 존재하는 것으로 알려져 있다.On the other hand, glutathione exists in reduced form (reduced glutathione, hereinafter abbreviated as "GSH") and oxidized form (oxidized glutathione or glutathione disulfide, hereinafter abbreviated as "GSSG"), depending on the oxidation and reduction state of the cell. In the environment, almost all free glutathione is present in reduced form (GSH) and in very small amounts in oxidized form (GSSG). For example, in eukaryotic cells, GSH accounts for 80% of all low molecular weight sulfides in the cytoplasm and is present in the mitochondria about 10% to 15%.
이처럼 대부분이 환원형으로 존재하는 생체 내(in vivo) 글루타치온의 분포는 일반적인 생리적 조건하에서 세포 내에 활성산소체(reactive oxygen species, 이하 "ROS"라 약칭함)가 계속적으로 발생하여 글루타치온을 산화시킴에도 불구하고, 세포 내 글루타치온 환원효소와 NADPH 등의 항산화 방어기작에 의해 일정하게 유지된다.The distribution of in vivo glutathione, most of which is present in the reduced form, allows the generation of reactive oxygen species (abbreviated as "ROS") in cells under normal physiological conditions to oxidize glutathione. Nevertheless, it is kept constant by antioxidant defense mechanisms such as intracellular glutathione reductase and NADPH.
구체적으로, 건강한 호기성 생물일 경우, ROS의 발생은 항산화 방어기작(antioxidant defense system)에 의해 조절되는데, 일반적으로 ROS가 발생하여 세포가 산화 상태가 되면, ROS가 GSH를 GSSG로 산화시키므로 세포 내 다량 존재하던 GSH의 비율이 감소하게 되고, 이때 대부분의 세포들은 생성된 GSSG를 세포 밖으로 배출하여 세포 내의 GSH/GSSG의 존재 비율을 일정하게 유지하게 된다. 그러나, 방사선 조사, 병적 혹은 약물 등의 요인에 의해 ROS가 과다하게 발생하여 항산화 방어기작과의 심각한 불균형이 초래되면, 산화적 스트레스(oxidative stress) 상태가 되어 염증 및 면역 시스템 손상(inflammatory and immune injury), 국소빈혈(ischemia), 약물과 독성 유도 반응(drug- and toxin-induced reaction) 및 노화 등 많은 병적 상태를 초래하게 된다. 따라서, 세포 내의 항산화 방어기작은 세포내 항상성 유지에 있어 매우 중요한 조절기작 중의 하나이다.Specifically, in the case of healthy aerobic organisms, the generation of ROS is regulated by an antioxidant defense system. In general, when ROS are generated and the cells become oxidized, ROS oxidize GSH to GSSG, thereby increasing the amount of ROS. The ratio of GSH present is reduced, where most cells release the generated GSSG out of the cell to maintain a constant ratio of GSH / GSSG in the cell. However, if excessive ROS are caused by factors such as irradiation, pathology or drugs, causing severe imbalance with antioxidant defense mechanisms, oxidative stress may result in inflammatory and immune injury. This can lead to many pathological conditions, including ischemia, drug- and toxin-induced reactions, and aging. Thus, intracellular antioxidant defenses are one of the most important regulatory mechanisms for maintaining intracellular homeostasis.
이렇게 세포 내 글루타치온의 상태는 세포의 산화·환원 상태를 반영하므로, 세포 내 산화형 글루타치온과 환원형 글루타치온의 양을 정량하면 세포 내 산화·환원 상태의 척도로 이용할 수 있다. 이처럼 세포 내 산화·환원 상태를 나타내는 척도로서 글루타치온을 사용하려면 세포 내 글루타치온의 전체량 뿐 아니라 글루타치온의 산화정도, 즉 GSH/GSSG 비율도 매우 중요하므로, 세포 내 GSH와 GSSG를 각각 정확하게 정량하는 것이 필수적이다.In this way, the state of intracellular glutathione reflects the oxidation and reduction states of the cells, so that the amount of the oxidizing glutathione and the reduced glutathione in the cells can be used as a measure of the oxidation and reduction states of the cells. In order to use glutathione as a measure of cellular oxidation / reduction status, the amount of glutathione in the cell as well as the degree of oxidation of glutathione, that is, the GSH / GSSG ratio, are very important. Therefore, it is essential to accurately quantify GSH and GSSG in each cell. to be.
세포 내 산화·환원 상태를 나타내기 위한 글루타치온의 정량방법은 화학적, 효소학적 및 크로마토그래피 방법으로 나뉘는데, 일반적으로 HPLC(high performance liquid chromatography) 이용방법(Sies, H., Assay of glutathione, glutathione disulfide, and glutathione mixed disulfides in biological samples.Methods Enzymol.77, 373-383, 1981)이나 분광분석기를 이용한 효소활성도 측정방법(Tietze, Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues.Anal. Biochem.27, 502-522, 1969), 글루타치온에 특이적으로 작용한다고 알려진 o-프탈알데하이드(o-phthalaldehyde, 이하 "OPT"라 약칭함) 등으로 처리하여 정량하는 방법(Mokrasch, l. C. and Teschike, E. J., Glutathione content of cultured cells and rodent brain regions: A specific fluorometric assay.Anal. Biochem.140, 506-509, 1984) 등이 쓰이고 있다.Methods for quantifying glutathione to express intracellular oxidation and reduction state are divided into chemical, enzymatic and chromatographic methods. Generally, high performance liquid chromatography (HPLC) is used (Sies, H., Assay of glutathione, glutathione disulfide, and glutathione mixed disulfides in biological samples.Methods Enzymol. 77, 373-383, 1981) or method for measuring enzymatic activity using a spectrometer (Tietze, Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues.Anal.Biochem . 27, 502-522, 1969), and quantitatively by treating with o-phthalaldehyde (hereinafter abbreviated as "OPT") known to specifically act on glutathione (Mokrasch). , l C. and Teschike, EJ, Glutathione content of cultured cells and rodent brain regions:.... , etc. a specific fluorometric assay Anal Biochem 140, 506-509, 1984) Tsutsui There.
HPLC를 이용한 크로마토그래피 방법은 글루타치온이 포함된 시료에 흡광을 하는 물질이나 형광을 내는 물질을 처리하여 HPLC로 분리한 후 흡광도 또는 형광 측정에 의해 정량하는 방법이다. 이 방법은 10-9 mol 정도의 글루타치온도 정확히 측정할 수 있는 반면, HPLC로 시료를 한 번 분석하는데 30 분 이상이 소요되며 한개 시료 내의 GSH와 GSSG 정량을 위해서는 두 번의 HPLC 작동이 필요하므로 매우 시간 소모적이다. 따라서 다량의 시료를 분석해야 하는 경우에는 매우 부적절하다.The chromatographic method using HPLC is a method in which a sample containing glutathione or a fluorescent material is processed and separated by HPLC, and then quantified by absorbance or fluorescence measurement. While this method can accurately measure the glutathion temperature of about 10-9 mol, it takes more than 30 minutes to analyze a sample once by HPLC and requires two HPLC operations to quantify GSH and GSSG in one sample. Exhaustive Therefore, it is very inappropriate when a large amount of sample needs to be analyzed.
또 다른 글루타치온 정량방법인 효소학적 방법은 DTNB와 같은 산화제와 글루타치온 환원효소를 사용한 정량법과, GSH와 메틸글리옥살(methylglyoxal)간의 글리옥살라제-촉매반응(glyoxalase I-catalyzed reaction)으로부터 형성되는 락토일글루타치온(lactoylglutathione)을 정량하는 글리옥살라제 정량법 등이 있다. 또한, 클로로디니트로벤젠(chlorodinitrobenzene)과 GSH 혼합물의 형성을 촉진시키는 GSH 전달효소(GSH transferase)를 사용하는 방법도 있다. 상기의 효소를 사용한 정량방법들은 하나의 시료 분석에 걸리는 시간이 수 분 정도로 짧은 장점이 있는 반면, 효소 반응이므로 시료를 다루는 것이 까다롭고 경우에 따라서는 여러 단계의 반응을 연계하여야 하므로 분석에 필요한 시약의 종류가 많아져 시약제조가 번거로운 단점이 있다. 무엇보다도, 하나의 시료를 분석할 때마다 여러 가지 시약을 분석 직전에 섞어야하고, 효소 및 온도 등의 환경에 예민한 시약들은 제조 후 오래 유지 할 수가 없어 일정 시간마다 시약을 새로 준비해야 하는 문제점이 따른다.Another glutathione quantitative enzymatic method is the lactose formed from a glyoxalase I-catalyzed reaction between an oxidant such as DTNB and glutathione reductase, and GSH and methylglyoxal. Glyoxalase assay for quantifying lactoylglutathione. There is also a method of using GSH transferase which promotes the formation of chlorodinitrobenzene and GSH mixture. The above quantitative methods using enzymes have the advantage that the time required to analyze a sample is as short as a few minutes.However, because it is an enzymatic reaction, it is difficult to handle the sample and in some cases, it is necessary to link the reactions of several steps. Many types of reagents are cumbersome to produce. Best of all, each time a sample is analyzed, several reagents must be mixed immediately before the analysis, and reagents sensitive to the environment such as enzymes and temperature cannot be maintained for a long time after preparation. Follow.
반면, 비교적 간단한 글루타치온 분석방법으로 OPT와의 반응에 의한 플루오메트릭(fluoremetric) 글루타치온 정량방법(Mokrasch, l. C. and Teschike, E. J. (1984) Glutathione content of cultured cells and rodent brain regions: A specific fluorometric assay.Anal. Biochem.140, 506-509)이 있다. OPT는 다른 황화물 분자들이 없을 때, GSH나 GSSG와 반응하여 형광물질을 형성한다. OPT를 이용한 플루오메트릭 방법은 매우 간편하고 특히 다량의 시료를 측정하는데 유용하다. 하지만 이 방법은 세포 내 존재하는 다른 황화물 분자들과 아미노산들에 의해 OPT와 GSH 혹은 GSSG의 반응이 심각한 저해를 받기 때문에 특이성이 매우 낮다. 그리고 OPT를 사용한 NEM 처리 시료의 GSSG 측정은 높은 pH에서 이루어짐으로 조직시료에 적당하지 못하고, 상기 방법을 다중 홈 플레이트(multi well plate)에 적용시킨 최근의 분석방법 역시 GSSG의 양을 정량하는 데는 부적절하였다.On the other hand, a relatively simple glutathione assay is a method of quantifying fluoremetric glutathione by reaction with OPT (Mokrasch, l. C. and Teschike, EJ (1984) Glutathione content of cultured cells and rodent brain regions: A specific fluorometric assay. Anal. Biochem. 140, 506-509). OPT reacts with GSH or GSSG to form fluorescent materials when no other sulfide molecules are present. Fluorometric methods using OPT are very simple and particularly useful for measuring large volumes of samples. However, this method is very specific because the reaction of OPT with GSH or GSSG is severely inhibited by other sulfide molecules and amino acids in the cell. In addition, GSSG measurement of NEM-treated samples using OPT is not suitable for tissue samples because it is performed at high pH, and recent analytical methods in which the method is applied to multi well plates are also inadequate for quantifying GSSG. It was.
따라서, 다량의 조직 시료 내 글루타치온을 정확하게 정량하기 위해서는 첫째, 분석 방법이 충분히 예민하여 10-9mol 이하의 양도 정확히 측정할 수 있어야 하고, 둘째, GSH와 GSSG를 각각 정확히 측정할 수 있어야 하며, 셋째, 분석하는 데 걸리는 시간이 비교적 짧아야 하고, 분석을 위한 시료 및 시약들의 준비가 너무 번거롭지 않아야 한다. 본 발명자들은 공지의 글루타치온 정량방법의 단점들을 극복하고 상기의 조건들을 만족시킬 수 있는 신규한 글루타치온 정량방법을 개발하기 위하여 티에츠 등(Tietze, F., Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues.Anal. Biochem., 27, 502-522, 1969)의 DTNB와 같은 산화제와 글루타치온 환원효소를 이용한 효소학적인 글루타치온 분석방법에 NEM과 같은 GSH 불활성화제 처리과정을 도입하여 GSH와 GSSG를 동시에 정확히 정량하고, 다중 홈 플레이트를 사용하여 다량의 시료를 한번에 측정할 수 있는 분석방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.Therefore, in order to accurately quantify glutathione in a large amount of tissue samples, first, the analytical method should be sufficiently sensitive to accurately measure the amount of 10-9 mol or less, and secondly, the GSH and GSSG should be accurately measured respectively. The time it takes to analyze should be relatively short and the preparation of samples and reagents for analysis should not be too cumbersome. In order to overcome the shortcomings of known glutathione quantification methods and to develop a novel glutathione quantitative method that can satisfy the above conditions, Tietze, F., Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and Oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues.Anal.Biochem . , 27, 502-522, 1969), GSH inactivator treatment such as NEM in enzymatic glutathione assay using glutathione reductase The present invention was completed by precisely quantifying GSH and GSSG at the same time and developing an analytical method capable of measuring a large amount of samples at once using multiple groove plates.
본 발명의 목적은 DTNB와 같은 산화제와 글루타치온 환원효소를 이용한 글루타치온 분석방법에 NEM과 같은 GSH 불활성화제 처리 과정을 도입하여 조직내 환원형 글루타치온과 산화형 글루타치온의 양을 측정하는데 매우 민감하고 정확하며 빠르고 편리한 정량적 측정방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to introduce a GSH inactivator treatment process such as NEM into a glutathione analysis method using an oxidant such as DTNB and glutathione reductase, and to measure the amount of reduced glutathione and oxidized glutathione in tissues very sensitive, accurate, and fast. It is to provide a convenient quantitative measurement method.
또한, 본 발명의 목적은 상기의 정량적 측정방법에 다중 홈 플레이트 사용을 도입하여 다량의 시료를 한번에 손쉬운 방법으로 측정할 수 있는 분석 시스템을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide an analytical system capable of measuring a large amount of samples in one easy way by introducing the use of multiple groove plates in the above quantitative measurement method.
도 1a는 NEM을 처리하지 않은 시료로부터 얻은 산화형 글루타치온(GSSG)과 환원형 글루타치온(GSH)의 HPLC 결과를 나타낸 것이고, Figure 1aIs HPLC results of oxidized glutathione (GSSG) and reduced glutathione (GSH) obtained from NEM-treated samples,
도 1b는 NEM을 처리한 시료로부터 얻은 GSSG와 GSH의 HPLC 결과를 나타낸 것이고, 1bIs HPLC results of GSSG and GSH obtained from NEM-treated samples,
도 2는 DTNB 및 글루타치온 환원효소를 처리한 시료에서 생성된 TNB의 양을 일정시간 동안 흡광도를 측정하여 나타낸 그래프이고, Figure 2 is a graph showing the absorbance measured for a certain time the amount of TNB produced in the sample treated with DTNB and glutathione reductase,
도 3a는 GSH의 일정량에 대한 흡광도의 기울기 변화를 나타낸 표준곡선이고, Figure 3a is a standard curve showing the change in the slope of the absorbance for a certain amount of GSH,
도 3b는 GSSG의 일정량에 대한 흡광도의 기울기 변화를 나타낸 표준곡선이고, Figure 3b is a standard curve showing the change in the slope of the absorbance for a certain amount of GSSG,
도 3c는 브래드포드 방법에 의한 단백질 정량 표준곡선을 나타낸 것이고, Figure 3c shows the protein quantification standard curve by the Bradford method,
도 4a는 조직시료의 양을 증가시키면서 측정한 총 글루타치온의 양을 흡광도의 기울기 변화로 나타낸 것이고, Figure 4a shows the total amount of glutathione measured by increasing the amount of tissue samples as a change in the slope of the absorbance,
도 4b는 조직시료의 양을 증가시키면서 측정한 GSSG의 양을 흡광도의 기울기변화로 나타낸 것이다. Figure 4b shows the amount of GSSG measured by increasing the amount of tissue samples as a change in the slope of the absorbance.
본 발명에서는 트리펩타이드 수황 화합물인 글루타치온을 DTNB와 같은 산화제와 글루타치온 환원효소를 이용한 글루타치온 분석 방법에 NEM과 같은 GSH 불활성화제 처리 과정을 도입하여 분석하는 새로운 정량적 측정방법을 제공한다.The present invention provides a novel quantitative measurement method for analyzing glutathione, a tripeptide sulfur compound, by introducing a GSH deactivator treatment process such as NEM into a glutathione analysis method using an oxidizing agent such as DTNB and a glutathione reductase.
글루타치온 정량에서 특히 주의해야 할 점은 조직 또는 세포 시료 내 글루타치온을 추출하는 과정 중에 시료 내에 공존하는 글루타치온 대사 관련 효소에 의해 글루타치온이 사용되므로, 분석결과가 시료의 본래 상태를 반영하지 못할 수 있다는 점이다. 또한, 시료의 산 추출물을 글루타치온 정량을 위해 처리하는 과정 중에 시료 내에 공존하는 산소와 금속이온 등이 환원형 글루타치온(GSH)의 수황기와 반응하여 산화형 글루타치온(GSSG)으로 산화될 수 있다는 점이다. 이런 경우 측정된 글루타치온의 전체량에는 변화가 없으나, 시료의 본래 상태보다 환원형 GSH는 적고 산화형 GSSG는 많은 수치를 보이게 된다. 따라서, 시료 내 정확한 GSH와 GSSG의 양을 원래 상태 그대로 정량하려면 상기 문제점들을 극복해야 한다.Particular attention to glutathione quantification is that glutathione is used by glutathione metabolism-related enzymes coexisting in the sample during the extraction of glutathione in the tissue or cell sample, so the analytical results may not reflect the original state of the sample. . In addition, oxygen and metal ions, which coexist in the sample, may be oxidized to oxidized glutathione (GSSG) by reacting with a sulfur group of reduced glutathione (GSH) during the treatment of the acid extract of the sample for the determination of glutathione. . In this case, there was no change in the total amount of glutathione, but the reduced GSH and the oxidized GSSG showed higher values than the original state of the sample. Therefore, the above problems must be overcome to quantify the exact amount of GSH and GSSG in the sample as it is.
이를 위하여 본 발명자들은 다음과 같은 방법들을 도입하여 상기 문제점들을 극복하였다. 우선, 조직 내 정확한 글루타치온의 양을 측정하기 위해서는 동물로부터 조직을 제거한 후에도 원래 상태의 글루타치온 풀(pool)에 인공적인 변화가 일어나지 못하도록 억제하였다. 조직이 적출된 후에도 조직 내에서는 일정시간 대사작용이 진행되어 글루타치온 환원효소와 NADPH 같은 대사 관련 효소들에 의해 글루타치온의 산화·환원 상태가 변하게 되는데, 이러한 대사작용에 의한 변화는 동물로부터 조직을 제거한 후 곧바로 동결시켜 모든 대사를 멈추게 함으로써 방지할 수 있다. 이를 위하여 본 발명자들은 액화질소를 사용하여 조직을 고정시킴과 동시에 동결시켜 분석 전까지 -70℃에 얼려 보관하였다. 대사작용의 억제를 위한 또 다른 방법은 조직을 추출하는 과정에서 글루타치온 대사 관련 효소 단백질들을 변성시키는 것으로, 이를 위해 본 발명자들은 얼린 조직을 5% PCA에 직접 균질화하여 대사 관련 효소 단백질들을 변성시켜 대사 진행을 억제하였다.To this end, the present inventors overcome the above problems by introducing the following methods. First, in order to measure the exact amount of glutathione in a tissue, even after removing the tissue from the animal, the artificial glutathione pool was prevented from occurring in the original state. Even after the tissue is extracted, metabolism progresses in the tissue for a certain time, and the metabolism-related enzymes such as glutathione reductase and NADPH change the oxidation / reduction state of glutathione. This can be prevented by freezing immediately to stop all metabolism. To this end, the inventors fixed the tissues using liquid nitrogen and simultaneously frozen them and stored them at -70 ° C until analysis. Another method for suppressing metabolism is to denature glutathione metabolism-related enzyme proteins during tissue extraction. For this purpose, the present inventors homogenize frozen tissue directly to 5% PCA to denature metabolism-related enzyme proteins to proceed metabolism. Was suppressed.
본 발명의 효소활성 글루타치온 분석방법에서 이용되는 반응과 원리를 GSH의 산화제로 DTNB를 사용하여 설명하면 다음과 같다.The reaction and principle used in the enzyme activity glutathione analysis method of the present invention will be described using DTNB as an oxidizing agent of GSH.
상기의 반응원리를 이용한 본 발명에서 GSH의 양은 GSH와 DTNB의 반응에 의한 DTNB의 TNB로의 지속적인 환원비로부터 결정되고, 시료 내 원래부터 존재하거나 GSH와 DTNB의 반응에 의해 생성된 GSSG는 글루타치온 환원효소와 NADPH에 의해 다시 GSH로 환원된다. 그러므로, 전체 글루타치온의 양을 GSH와 GSSG의 합으로서 TNB의 환원비를 측정하여 나타낼 수 있다. TNB 환원비는 시료 내 글루타치온의 전체량에 정확하게 비례하고 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정된다.In the present invention using the above reaction principle, the amount of GSH is determined from the sustained reduction ratio of DTNB to TNB by the reaction of GSH and DTNB, and the GSSG originally present in the sample or produced by the reaction of GSH and DTNB is glutathione reductase. And reduced to GSH again by NADPH. Therefore, the total amount of glutathione can be expressed by measuring the reduction ratio of TNB as the sum of GSH and GSSG. The TNB reduction ratio is determined by measuring the absorbance at 405 nm exactly proportional to the total amount of glutathione in the sample.
본 발명의 정량법에서 시료 내 GSSG의 양을 측정하기 위해서는 시료 내 GSH를 제거해야만 한다. 또한, 실제의 산화형 글루타치온량을 정량하기 위해서는 GSH의 GSSG로의 인공적인 산화를 방지해야만 하는데, 이는 글루타치온의 수황기를 불활성화 시키는 방법을 이용하여 방지할 수 있다. 이를 위하여 본 발명자들은 글루타치온 수황기와 공유결합을 형성하여 수황기 끼리의 이황화결합을 방지하는 NEM과 같은 GSH 불활성화제를 사용하여 PCA 추출 시료 내의 GSH를 바로 불활성화시켜 GSSG로의 산화를 방지하였다. NEM은 중성 pH에서 1분안에 반응이 완결되는 빠른반응속도를 가지고 있어 효과적으로 사용될 수 있다.In order to measure the amount of GSSG in a sample in the quantitative method of the present invention, the GSH in the sample must be removed. In addition, in order to quantify the actual amount of oxidized glutathione, it is necessary to prevent artificial oxidation of GSH to GSSG, which can be prevented by using a method of inactivating a sulfur group of glutathione. To this end, the present inventors inactivated GSH in the PCA extracted sample to prevent oxidation to GSSG by using a GSH inactivating agent such as NEM, which forms a covalent bond with glutathione sulfur group to prevent disulfide bonds between the sulfur groups. NEM can be used effectively because it has a fast reaction rate at 1 minute at neutral pH.
구체적으로, 시료 내의 정확한 GSH와 GSSG의 양을 정량하기 위해서 조직을 PCA로 추출한 후, 추출액을 두 분획으로 나누어 한 분획에는 NEM을 첨가하여 시료의 글루타치온 수황기와 결합시켜 GSH의 GSSG로의 산화를 방지함으로써 시료 내 GSSG의 양을 정확하게 측정하였다. 실제로 본 발명자들은, 시료용액이 중화되기 전까지는 PCA 추출물에 첨가한 NEM이 GSH의 수황기와 지속적으로 반응하다가, 일단 중화가 되면 그와 동시에 NEM 반응이 완결됨을 확인하였다. 그러나, NEM은 글루타치온 환원효소의 활성을 저해하기 때문에, GSH가 완전히 불활성화된 후에도 시료 내에 반응하지 않고 남아있는 NEM은 반드시 제거해 주어야만 하므로, 본 발명에서는 NEM 반응용액을 동량의 에테르로 추출하여 제거한 후, GSSG 분석에 사용하였다.Specifically, in order to quantify the exact amount of GSH and GSSG in the sample, the tissue is extracted with PCA, and the extract is divided into two fractions, and NEM is added to one fraction to combine the sample with glutathione hydrosulfur to prevent oxidation of GSH to GSSG. This accurately measured the amount of GSSG in the sample. In fact, the inventors confirmed that the NEM added to the PCA extract continuously reacts with the hydrous group of GSH until the sample solution is neutralized, and at the same time, the NEM reaction is completed at the same time. However, since NEMs inhibit the activity of glutathione reductase, the NEMs that remain in the sample must be removed even after GSH is completely inactivated. Therefore, in the present invention, the NEM reaction solution is extracted with an equivalent amount of ether and then removed. , GSSG analysis was used.
반면, NEM을 첨가하지 않은 다른 분획으로부터는 GSH와 GSSG의 합인 글루타치온의 전체량을 측정하였다. 이와 같은 방법을 통해 GSSG의 양은 NEM 처리 시료로부터, GSH의 양은 NEM 미처리 시료로부터 얻어진 글루타치온 전체량에서 NEM 처리 시료로부터 얻은 GSSG의 양을 뺌으로써 계산하였다.On the other hand, the total amount of glutathione, which is the sum of GSH and GSSG, was measured from other fractions without NEM. Through this method, the amount of GSSG was calculated by subtracting the amount of GSSG obtained from the NEM treated sample from the total amount of glutathione obtained from the NEM treated sample and the amount of GSH from the NEM untreated sample.
또한, 본 발명에서는 다량의 시료를 손쉬운 방법으로 측정할 수 있는 분석 시스템인 다중 홈 플레이트를 이용한 정량적 측정방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a quantitative measuring method using a multi-groove plate which is an analysis system capable of measuring a large amount of samples by an easy method.
다중 홈 플레이트를 이용한 글루타치온 정량방법은 다음과 같다.The glutathione quantification method using the multi-groove plate is as follows.
ⅰ) 인산염 완충용액, 증류수 및 NADPH를 포함하는 혼합용액을 다중 홈 플레이트에 분주하는 단계;Iii) dispensing a mixed solution comprising phosphate buffer, distilled water and NADPH in multiple groove plates;
ⅱ) 각 홈에 NEM 처리 시료 및 NEM 미처리 시료를 첨가한 후 글루타치온 환원효소와 DTNB를 섞은 혼합용액을 가하여 반응시키는 단계; 및,Ii) adding an NEM treated sample and an NEM untreated sample to each groove, and then reacting by adding a mixed solution of glutathione reductase and DTNB; And,
ⅲ) 상기 반응 용액을 마이크로플레이트 분석기를 이용하여 흡광도를 측정하는 단계로 구성된다.Iii) measuring the absorbance of the reaction solution using a microplate analyzer.
상기 방법에 의하여 미처리 시료로부터 흡광도가 일직선으로 증가하는 구간의 기울기를 구하여 시료 내에 존재하는 GSH와 GSSG의 총량을 GSH의 양으로 환산하여 총 글루타치온의 양을 결정하고, NEM 처리 시료로부터는 시료 내에 존재하는 산화형 글루타치온(GSSG)의 양을 흡광도를 측정하여 구한다.By the above method, the slope of the section in which the absorbance increases in a straight line from the untreated sample is converted to the total amount of GSH and GSSG present in the sample by the amount of GSH to determine the amount of total glutathione, and is present in the sample from the NEM treated sample. The amount of oxidized glutathione (GSSG) is determined by measuring absorbance.
한편, 산화형 및 환원형 글루타치온의 일정량에 대한 흡광도를 측정하여 표준곡선을 작성한 후, 상기와 같이 측정한 총 글루타치온과 GSSG의 흡광도를 표준곡선에서의 흡광도와 비교하여 GSSG의 양을 결정하고 이를 조직시료의 단백질을 정량하여 nmol 글루타치온/mg 단백질로 환산한다.On the other hand, after measuring the absorbance of a certain amount of oxidized and reduced glutathione to prepare a standard curve, by comparing the absorbance of the total glutathione and GSSG measured above with the absorbance in the standard curve to determine the amount of GSSG and tissue Quantify the protein in the sample and convert it to nmol glutathione / mg protein.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1> 시약의 제조Example 1 Preparation of Reagent
본 발명에서 GSH 불활성화제로서 사용되는 NEM은 실온에서 매우 불안정하므로 사용 직전에 만들고 얼음에 채워 사용하는 반면, 낮은 pH에서는 비교적 안정하므로 5% PCA(perchloric acid)에 250 mM 농도로 용해시켜 제조하였다. 완충용액은 EDTA를 5 mM 포함한 pH 7.0의 500 mM 인산염 완충용액(5×)을 사용하였다. 본 발명에서 GSH의 산화제로서 사용되는 DTNB(50×)는 매일 새로 제조하는데, 0.5% (w/v) NaHCO3 용액에 3 mM 농도로 녹이고 사용 직전에 증류수로 5배 희석한 후 사용하였으며, NADPH(50×)는 사용 직전에 증류수에 10 mM 농도로 제조하였다. 글루타치온 환원효소는 상기 완충용액을 1×로 희석시켜 농도가 6 units/ml이 되게 만들어 얼음에 채워 준비하고, 시료에 가하기 직전에 다시 상기 완충용액으로 5배 희석하여 사용 하였다. GSH와 GSSG 표준용액은 1 mM GSH와 1 mM GSSG 용액을 만들어 2 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM로 희석하여 사용하였다.NEM used as a GSH deactivator in the present invention is very unstable at room temperature, so prepared immediately before use and used in ice, while relatively low at pH, it was prepared by dissolving at 250 mM concentration in 5% PCA (perchloric acid). As a buffer, 500 mM phosphate buffer (5 ×) at pH 7.0 containing 5 mM EDTA was used. In the present invention, DTNB (50 ×), which is used as an oxidizing agent of GSH, was prepared daily, dissolved in 3 mM concentration in 0.5% (w / v) NaHCO3 solution, diluted 5 times with distilled water immediately before use, and used as NADPH ( 50 ×) was prepared at a concentration of 10 mM in distilled water immediately before use. Glutathione reductase was prepared by diluting the buffer solution to 1 × so as to have a concentration of 6 units / ml, filling it with ice, and diluting it five times with the buffer solution immediately before adding it to the sample. GSH and GSSG standard solutions were prepared by diluting 1 mM GSH and 1 mM GSSG solutions to 2 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM.
<실시예 2> 글루타치온 정량을 위한 조직시료의 추출 및 NEM의 처리Example 2 Extraction of Tissue Sample and Treatment of NEM for Glutathione Determination
마우스(C3H, C57B/L) 또는 SD 레트로부터 얻은 조직의 대사작용을 멈추게 하기 위하여 본 발명자들은 적출된 조직을 동결-고정기(Freeze-clamping)에 의해 순간적으로 얼려 -70℃에 보관하였다. 얼린 조직 약 20 mg을 언 상태 그대로 5% PCA 용액 500 ㎕를 넣어 글래스 호모제나이저(glass homogenizer)로 균질화하였다.In order to stop the metabolism of tissues obtained from mice (C3H, C57B / L) or SD retro, the inventors temporarily frozen the extracted tissues by freeze-clamping and stored at -70 ° C. About 20 mg of frozen tissue was added to 500 µl of a 5% PCA solution as it was frozen and homogenized with a glass homogenizer.
GSSG의 정확한 측정을 위해서는 적당한 시약으로 GSH를 불활성화시켜야 하는데, 본 발명에서는 GSH의 불활성화제로서 NEM을 사용하였다. 상기에서 준비된 PCA 균질액을 두 분획(60 ㎕, 400 ㎕)으로 나누어 400 ㎕ 분획에는 NEM의 최종농도가 50 mM이 되도록 250 mM NEM 100 ㎕를 첨가하고, 즉시 2 M KHCO3 용액 210 ㎕를 가하여 중화시킨 후 30분간 실온에서 반응시켰다. 정확하게 GSH와 GSSG를 정량하기위해서는 이 NEM 반응의 완결 여부가 관건인데, NH2 칼럼을 사용하여 HPLC로 확인해 본 결과 NEM 처리 분획에는 GSH가 전혀 보이지 않으므로 반응이 완결되었음을 확인하였다(도 1a및도 1b).In order to accurately measure GSSG, GSH should be inactivated with a suitable reagent. In the present invention, NEM was used as an inactivating agent of GSH. The PCA homogenate prepared above was divided into two fractions (60 µl, 400 µl), and 400 µl fractions were neutralized by adding 100 µl of 250 mM NEM so that the final concentration of NEM was 50 mM, and immediately adding 210 µl of 2 M KHCO3 solution. After reacting for 30 minutes at room temperature. In order to accurately quantify GSH and GSSG, the completion of this NEM reaction is a key factor. As a result of confirming by HPLC using an NH2 column, it was confirmed that the reaction was completed because no GSH was seen in the NEM treated fraction ( FIG. 1A and FIG. 1B ). .
상기에서 얻은 NEM 미처리 분획과 NEM 처리 분획을 각각 원심 분리하여 상층액을 취한 후 NEM 미처리 시료의 상층액은 100 mM 인산염 완충용액으로 5 내지 10배 희석한 후 그대로 분석에 사용하여 총 글루타치온을 정량하였고, NEM 처리 시료는 반응하지 않고 남아있는 NEM을 제거하기 위하여 상층액에 동량의 에테르를 가하여 10번 반복 추출한 후, 잔존 에테르를 진공펌프를 이용하여 증발시키고 남은 시료를 분석하여 GSSG를 정량하였다. NEM 처리 시료 내 잔존하는 NEM은 글루타치온 정량방법에 사용되는 글루타치온 환원효소의 강력한 저해제이므로 에테르 추출법으로 최대한 제거하였다. 반면, 상기에서 NEM 미처리 균질액을 원심분리하여 침전시킨 단백질은 브래드포드 방법으로 정량하였다.The supernatant was collected by centrifugation of the NEM untreated fraction and the NEM treated fraction obtained above, and the supernatant of the NEM untreated sample was diluted 5 to 10 times with 100 mM phosphate buffer, and then used for analysis to quantify total glutathione. In order to remove the remaining NEM without reacting the NEM treated sample, the same amount of ether was added to the supernatant and extracted 10 times. After that, the remaining ether was evaporated using a vacuum pump and the remaining sample was analyzed to quantify GSSG. NEM remaining in the NEM-treated samples was removed as much as possible by ether extraction because it is a strong inhibitor of glutathione reductase used in the glutathione quantification method. On the other hand, the protein precipitated by centrifugation of the NEM untreated homogenate in the above was quantified by the Bradford method.
<실시예 3> 산화형·환원형 글루타치온의 정량Example 3 Determination of Oxidized / Reduced Glutathione
본 발명에서는 다량의 시료를 손쉬운 방법으로 측정할 수 있는 다중 홈 플레이트를 이용하여 조직 내의 글루타치온을 정량하였는데, 다음과 같은 방법을 이용하였다.In the present invention, the glutathione in the tissue was quantified using a multi-groove plate capable of measuring a large amount of samples by an easy method, and the following method was used.
(1) 사용하고자 하는 홈의 수를 고려하여 각 홈 당 5× 완충용액(500 mM 인산염 완충용액, 5 mM EDTA, pH 7.0) 50 ㎕, 증류수 125 ㎕, 10 mM NADPH 5 ㎕를 포함하도록 세 가지를 섞어 다중채널(multichannel) 피펫으로 180 ㎕ 씩 각 홈에 가한다.(1) Considering the number of grooves to be used, each of three grooves contains 50 µl of 5 × buffer solution (500 mM phosphate buffer, 5 mM EDTA, pH 7.0), 125 µl of distilled water, and 5 µl of 10 mM NADPH. Mix and add 180 µl to each groove with a multichannel pipette.
(2) 각 홈에 시료를 20 ㎕ 씩 가하고, 표준곡선 작성을 위해 표준 글루타치온 용액 20 ㎕ 씩을 포함하는 홈들도 준비한다.(2) Add 20 µl of sample to each groove, and prepare grooves containing 20 µl of standard glutathione solution to prepare standard curve.
(3) 각 홈당 10× 글루타치온 환원효소(1.2 u/ml) 25 ㎕, 10× DTNB(0.6 mM) 25 ㎕를 포함하도록 두 가지를 섞어 다중채널 피펫으로 50 ㎕ 씩 가하여 반응을 개시한다.(3) Initiate the reaction by adding 50 μl of a multichannel pipette to mix 25 μl of 10 × glutathione reductase (1.2 u / ml) and 25 μl of 10 × DTNB (0.6 mM) for each groove.
(4) 마이크로플레이트 분석기(Microplate reader)로 405 nm에서의 흡광도를 5분간 기록한다.(4) Record the absorbance at 405 nm for 5 minutes with a Microplate reader.
(5) 흡광도가 일직선으로 증가하는 구간의 기울기를 구한다.(5) Find the slope of the section where the absorbance increases linearly.
(6) 표준 글루타치온의 흡광도 기울기 변화로부터 표준곡선을 작성하여 조직 시료의 결과와 비교하여 조직 시료의 글루타치온의 양을 nmol/㎖ 시료로 환산한다.(6) Prepare a standard curve from the change in absorbance slope of standard glutathione and convert the amount of glutathione in the tissue sample into nmol / ml sample in comparison with the result of the tissue sample.
(7) 단백질 정량 결과로부터 조직시료의 nmol 글루타치온 (총 또는 GSSG)/㎖ 시료를 nmol 글루타치온/mg 단백질로 환산한다.(7) From the protein quantification results, nmol glutathione (total or GSSG) / ml samples of tissue samples are converted to nmol glutathione / mg protein.
상기에서 이미 설명한 반응 원리에 따라 반응 혼합액의 반응속도, 즉 DTNB의 TNB로의 지속적인 환원비는 반응액에 존재하는 글루타치온의 총량에 비례하므로, 표준곡선에서도 볼 수 있듯이 글루타치온의 양이 많을수록 흡광도가 증가하는 구간의 기울기도 급해진다. 이와 같은 반응이 계속 진행되면 시료 내 글루타치온과 반응할 NADPH와 DTNB가 고갈되어 결국에는 흡광도의 변화가 관찰되지 않게 된다. 따라서, 반응초기에 흡광도가 일직선으로 증가하는 구간의 기울기를 취하면 이는 시료 내 존재하는 글루타치온의 양을 반영하게 된다.According to the reaction principle described above, the reaction rate of the reaction mixture, that is, the continuous reduction ratio of DTNB to TNB is proportional to the total amount of glutathione present in the reaction solution, and as the standard curve shows, the higher the amount of glutathione, the higher the absorbance. The slope of the section is also urgent. If this reaction continues, the NADPH and DTNB which will react with glutathione in the sample will be depleted and eventually no change in absorbance will be observed. Therefore, taking the slope of the section in which the absorbance increases linearly at the beginning of the reaction reflects the amount of glutathione present in the sample.
즉, 시료 내 총 글루타치온의 양은 반응용액 내의 DTNB의 TNB로의 지속적인환원비로부터 결정되는데, 이는 마이크로플레이트 분석기를 이용하여 405 nm에서 측정되는 흡광도의 변화를 계산하여 얻었다. 반응 혼합액의 총 부피는 250 ㎕이고 반응액은 100 mM 인산염 완충용액(pH 7.0, 1 mM EDTA), 0.2 mM NADPH, 60 μM DTNB와 0.03 unit/㎖의 글루타치온 환원효소를 포함하여 만들었다. 반응은 글루타치온 환원효소와 DTNB의 혼합액을 첨가하면서 시작되며, 마이크로플레이트 분석기(microplate reader, CERES 900C, Bio-Tek Instruments)를 사용하여 역학분석 소프트웨어(kinetic assay software)에 의해 405 nm에서의 흡광도를 5 분간 측정하여 얻은 기울기로부터 반응속도(ΔA/min)를 구하였다.도 2에서 보듯이, 흡광도가 2 내지 3분 이상 일직선으로 증가하여 반응 조건이 최적상태에 있음을 알 수 있으며, 이로부터 정확한 반응속도를 구할 수 있다.That is, the amount of total glutathione in the sample was determined from the sustained reduction ratio of DTNB to TNB in the reaction solution, which was obtained by calculating the change in absorbance measured at 405 nm using a microplate analyzer. The total volume of the reaction mixture was 250 μl and the reaction solution was made up of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0, 1 mM EDTA), 0.2 mM NADPH, 60 μM DTNB and 0.03 unit / ml glutathione reductase. The reaction begins with the addition of a mixture of glutathione reductase and DTNB, and the absorbance at 405 nm is measured by kinetic assay software using a microplate reader (CERES 900C, Bio-Tek Instruments). The reaction rate (ΔA / min) was determined from the slope obtained by measuring the minute. As shown in Figure 2 , the absorbance increases in a straight line for more than 2 to 3 minutes it can be seen that the reaction conditions are in an optimal state, from which an accurate reaction rate can be obtained.
<실험예 1> 글루타치온 표준곡선의 작성Experimental Example 1 Preparation of Glutathione Standard Curve
하기표 1과표 2의 농도를 갖는 표준 GSH와 GSSG 용액을 상기와 같은 방법으로 반응시키면서 흡광도가 일직선으로 증가하는 구간의 기울기를 구하여도 3a및도 3b와 같은 총 글루타치온 표준곡선 및 GSSG 표준곡선을 작성하였다. 총 글루타치온 표준곡선에서 흡광도가 일직선으로 증가하는 구간의 기울기는 3.1871 이었고, GSSG 표준곡선에서 흡광도가 일직선으로 증가하는 구간의 기울기는 5.1794 이었다.The total glutathione standard curves and GSSG standard curves as shown in FIGS . 3A and 3B were obtained by obtaining the slopes of the sections in which the absorbances were linearly reacted while reacting the standard GSH and GSSG solutions having the concentrations of Tables 1 and 2 in the same manner . Created. The slope of the increase in absorbance in a straight line in the total glutathione standard curve was 3.1871. The slope of the increase in absorbance in a straight line in the GSSG standard curve was 5.1794.
<표 1>TABLE 1
<표2><Table 2>
<실험예 2> 조직 시료 내 글루타치온의 정량Experimental Example 2 Determination of Glutathione in Tissue Samples
마우스(C3H mouse)로부터 적출한 간조직 20 mg을 500 ㎕의 5% PCA 용액에 넣고 균질화시키고 실시예 2의 과정에 따라 NEM을 처리한 후, 상기에 단계별로 기재된 글루타치온 정량방법에 따라 반응시키면서 흡광도가 일직선으로 증가하는 구간의 기울기를 구하여 실험예 1에서 구한 총 글루타치온과 GSSG의 표준곡선과 비교하여 조직시료 내 총 글루타치온(도 3a의 총 글루타치온 표준곡선으로부터)과 GSSG(도 3b의 GSSG 표준곡선으로부터)의 양을 구하였다.20 mg of liver tissue extracted from mouse (C3H mouse) was added to 500 µl of 5% PCA solution, homogenized, and treated with NEM according to the procedure of Example 2, and then absorbed while reacting according to the glutathione quantitative method described above step by step. The total glutathione (from the total glutathione standard curve of FIG. 3a ) and the GSSG (from the GSSG standard curve of FIG. 3b ) in the tissue sample were compared with the standard curves of total glutathione and GSSG obtained in Experimental Example 1 ) Is calculated.
20 배로 희석한 조직시료 내 총 글루타치온의 흡광도를 측정하였는데, 흡광도가 일직선으로 증가하는 구간의 분광 흡광도의 변화량이 74.49로 측정되었고, 이로부터 조직시료 내 총 글루타치온의 양을 구하기 위하여도 3a의 총 글루타치온 표준곡선을 이용하여 상기 분광 흡광도의 변화량에 상응하는 총 글루타치온의 양을 환산한 결과 467.45 nmole/㎖ 시료의 값을 얻었다. 또한, GSSG 역시 상기와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여 28.49의 분광 흡광도의 변화량을 얻었고,도 3b의 GSSG 표준곡선으로부터 상기 기울기 값에 상응하는 GSSG의 양을 환산한 결과 9.63 nmole/㎖ 시료의 값을 얻었다.The absorbance of total glutathione in tissue samples diluted 20-fold was measured, and the change in spectral absorbance of the section in which the absorbance increased in a straight line was measured as 74.49. From this, the total glutathione in FIG. A standard curve was used to calculate the total amount of glutathione corresponding to the change in spectral absorbance to obtain a value of 467.45 nmole / ml sample. In addition, GSSG also measured the absorbance in the same manner as described above to obtain a change in the spectral absorbance of 28.49, converting the amount of GSSG corresponding to the inclination value from the GSSG standard curve of Figure 3b, the value of 9.63 nmole / ㎖ sample Got it.
<실험예 3> 단백질 농도에 대한 정량된 글루타치온 양의 환산Experimental Example 3 Conversion of Quantified Glutathione Amount to Protein Concentration
실험예 2에서 구해진 총 글루타치온 농도 및 GSSG 농도(nmol/㎖ 시료)를 단백질 양에 대해 보정하여 조직시료 내 글루타치온 양을 nmol/㎎ 단백질로 환산하여 나타내었다. 이 때, 사용되는 단백질의 양은 실시예 2에서 NEM 미처리 균질액을 원심분리하여 침전시킨 단백질을 브래드포드 방법으로 정량한 것이다. 브래드포드 방법에 의해 하기표 3의 농도를 갖는 소혈청단백질(BSA)을 표준 단백질로 사용하여 단백질 정량 표준곡선을 얻었다(도 3c). 조직시료 내 단백질은 실시예 2에서총 글루타치온의 양을 측정하기 위한 NEM 미처리 시료 분획으로부터 상층액을 제거한 후 남은 침전물을 1 N 수산화나트륨 용액 100 ㎕에 녹이고 이를 다시 10 배 희석하여 브래드포드 방법으로 정량하였다. 실험예 2의 마우스 간 조직 내 단백질의 양을 정량하였는데, 브래드포드 방법에 의한 흡광도 값이 0.477로 측정되었고 이를도 3c의 단백질 표준 정량곡선으로부터 상응하는 단백질 양을 환산한 결과 13.88 ㎎ 단백질/㎖ 시료의 값을 얻었다. 최종적으로, 실험예 2에서 정량된 총 글루타치온(467.45 nmole/㎖ 시료) 및 GSSG(9.63 nmole/㎖ 시료)의 값을 상기와 같이 측정된 조직시료 내 단백질 양을 이용하여 보정하면, 총 글루타치온의 양은 33.68 nmole/㎎ 단백질이고 GSSG의 양은 0.69 nmole/㎎ 단백질이었다. 따라서, 조직시료 내 GSH의 양은 32.99 nmole/㎎ 단백질이었다.The total glutathione concentration and the GSSG concentration (nmol / ml sample) obtained in Experimental Example 2 were corrected for the amount of protein, and the amount of glutathione in the tissue sample was expressed in terms of nmol / mg protein. At this time, the amount of the protein used was quantified by the Bradford method of protein precipitated by centrifuging the NEM untreated homogenate in Example 2. A protein quantification standard curve was obtained using the bovine serum protein (BSA) having the concentrations shown in Table 3 below as a standard protein by the Bradford method ( FIG. 3C ). The protein in the tissue sample was removed from the supernatant from the NEM untreated sample fraction for measuring the total glutathione amount in Example 2, and the remaining precipitate was dissolved in 100 µl of 1 N sodium hydroxide solution, diluted 10-fold, and quantified by the Bradford method. It was. The amount of protein in the mouse liver tissue of Experimental Example 2 was quantified. The absorbance value of the Bradford method was determined to be 0.477, and the corresponding protein amount was converted from the protein standard quantification curve of FIG. 3C. The value of was obtained. Finally, if the values of total glutathione (467.45 nmole / ml sample) and GSSG (9.63 nmole / ml sample) quantified in Experimental Example 2 were corrected using the amount of protein in the tissue sample measured as above, the amount of total glutathione was The amount of 33.68 nmole / mg protein and GSSG was 0.69 nmole / mg protein. Therefore, the amount of GSH in the tissue sample was 32.99 nmole / mg protein.
<표 3>TABLE 3
<실시예 4> 글루타치온 정량 방법의 검정Example 4 Assay of Glutathione Determination Method
본 발명의 정량방법에 의한 조직 시료 내 글루타치온 측정의 타당성을 검토하기 위하여 시료의 양을 증가시켜 가면서 총 글루타치온과 GSSG를 정량하였다. 조직 내 총 글루타치온의 정량은 표준곡선의 측정범위 전체에 걸쳐 시료의 양이 증가함에 따라 글루타치온의 양도 거의 정량적으로 증가하였다(도 4a). 반면, GSSG의 정량 결과는 30 내지 40 ㎕까지는 시료의 양이 증가함에 따라 GSSG의 양도 증가하는 결과를 보이다가 시료의 양이 40 ㎕ 이상이 되면 증가하는 정도가 떨어지기 시작하였다(도 4b). 본 발명자들은 이러한 결과가 에테르 추출로 NEM을 제거하더라도 NEM이 완전히 제거되지 않고 시료 내에 미량 잔존하게 되어, 이 NEM이 증가된 시료의 반응 혼합액에 포함되어 있는 글루타치온 환원효소를 저해하기 때문인 것으로 분석하였다. 따라서 반응측정에 가해주는 시료의 적당한 부피는 20 ㎕로 결정하였다. 이를 기준으로 앞에서 상술한 바와 같이, 시료 20 ㎕에 포함된 총 글루타치온과 GSSG를 정량하고, 이 결과를 단위 단백질 양에 대해 보정하여 조직 시료 내 글루타치온의 양을 nmol/mg 단백질로 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 정량법으로 허용되는 측정 가능한 정량 범위는 0 내지 0.4 nmol/시료로 HPLC 분석방법에 못지 않게 매우 민감한 분석방법임을 알 수 있다.In order to examine the validity of the glutathione measurement in tissue samples by the quantification method of the present invention, total glutathione and GSSG were quantified while increasing the amount of the sample. The amount of glutathione in the tissues increased almost quantitatively with the amount of glutathione as the amount of the sample increased over the measurement range of the standard curve ( FIG. 4A ). On the other hand, the GSSG quantitative results showed that the amount of GSSG increased as the amount of the sample increased up to 30 to 40 μl, but when the amount of the sample became more than 40 μl, the increase began to drop ( FIG. 4B ). The present inventors analyzed that the result was that even if the NEM was removed by ether extraction, the NEM was not completely removed and remained in the sample, and this NEM inhibited glutathione reductase contained in the reaction mixture of the increased sample. Therefore, the appropriate volume of the sample to be added to the reaction measurement was determined to 20 μl. Based on this, as described above, the total glutathione and GSSG contained in 20 μl of the sample may be quantified, and the result may be corrected for the unit protein amount to express the amount of glutathione in the tissue sample as nmol / mg protein. In addition, it can be seen that the measurable quantitative range allowed by the quantitative method of the present invention is 0 to 0.4 nmol / sample, which is as sensitive as the HPLC method.
본 발명의 효소 역학을 이용한 산화형·환원형 글루타치온의 정량적 고속측정방법은 DTNB와 같은 산화제와 글루타치온 환원효소를 이용한 글루타치온 분석방법에 NEM과 같은 GSH 불활성화제 처리과정을 도입하여 GSH와 GSSG를 동시에 정확히 정량하고, 다중 홈 플레이트를 사용하여 다량의 시료를 한번에 손쉬운 방법으로 측정할 수 있는 분석 시스템으로서, 다량의 조직 시료로부터 방사선 조사, 병적 혹은 약물의 영향 등 여러 가지 요인에 의해 변화하는 글루타치온의 양을 정확하게 측정함으로써, 세포 내 산화·환원 상태의 비정상으로 인하여 유발되는 염증 및 면역 시스템 손상, 국소빈혈, 약물과 독성 유도 반응 및 노화와 같은 질병의 진단 및 치료에 기여할 수 있으므로 의학 산업상 매우 유용하다.The quantitative high-speed measurement method of oxidized / reduced glutathione using enzymatic dynamics of the present invention introduces the treatment of GSH deactivator such as NEM to GSH and GSSG at the same time by introducing an oxidizing agent such as DTNB and glutathione analysis using glutathione reductase. An analytical system that quantifies and easily measures a large amount of samples at once using multiple groove plates.It is possible to measure the amount of glutathione that is changed by various factors such as irradiation, pathology or drug effects from a large amount of tissue samples. Accurate measurement is very useful in the medical industry because it can contribute to the diagnosis and treatment of diseases such as inflammatory and immune system damage, ischemia caused by abnormal intracellular oxidation / reduction conditions, ischemia, drug and toxic induction reactions, and aging.
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