KR20010074493A

KR20010074493A - 레트로바이러스 전달 시스템

Info

Publication number: KR20010074493A
Application number: KR1020007011917A
Authority: KR
Inventors: 미트라파노우스키리아코스앤드류; 파틸데바; 킹스만알란존; 킹스만수산마리; 엘라르드피오나마가레트
Original assignee: 찰스 굿맨; 옥스포드 바이오메디카(유케이) 리미티드
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2001-08-04
Also published as: AU763007B2; WO1999061639A2; EP1080216B1; CN1302334A; WO1999061639A3; AU3947399A; ATE435297T1; CN1325653C; JP2002518997A; EP1080216A2; DE69941049D1; JP4612950B2; GB0024915D0; CA2328491A1; GB2351290A

Abstract

목표 사이트에 형질도입 시킬 수 있는 레트로바이러스 전달 시스템에 관한 것이다. 레트로바이러스 전달 시스템은 외피 단백질의 적어도 일부를 코딩하는 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 및 레트로바이러스 전달 시스템에 의해 목표 사이트의 형질도입을 확실하게 하는 레트로바이러스로부터 유래된 하나 또는 그 이상의 다른 뉴클레오타이드 서열로 구성되고, 상기 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 다른 뉴클레오타이드 서열의 적어도 하나에 대해 이형이고 목표 사이트를 인식할 수 있는 광견병 G 단백질 또는 돌연변이체, 변이체, 유도체 또는 그들의 단편의 일부를 코딩한다.

Description

레트로바이러스 전달 시스템{Retroviral delivery system}

유전자 치료는 예를 들어 목표 셀과 같이 하나 또는 그 이상의 목표 사이트에 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 서열의 첨가(addition), 치환(replacement), 삭제(deletion), 보충(supplementation), 조작(manipulation) 등의 어느 하나 또는 그 이상을 포함한다. 목표 사이트가 목표 셀 이라면, 그러면 셀은 조직 또는 기관의 일부분일 것이다. 유전자 치료에서 일반적인 지침은Molecular Biology(Ed Robert Meyers, Pub VCH, pp556-558)에서 제공될 것이다.

그 이상의 실시예를 통하여, 또한 유전자 치료는 유전자와 같은 뉴클레오타이드 서열에 결함이 있는 유전자를 치환하거나 보충하여 수행될 수 있고; 병원성 유전자 또는 유전자 생성물이 제거 될 수 있고; 새로운 유전자는 예를 들어 더 많은 유리한 표현형을 만들기 위해서 첨가될 수 있고; 셀은 면역(immune), 심장 혈관(cardiovascular), 신경(neurological), 염증(inflammatory) 또는 감염(infectious ) 병과 같은 암 또는 다른 상태를 치료하기 위해 분자적 수준에서 조작될 수 있고(Schmidt-Wolf and Schmidt-Wolf, 1994, Annals of Hematology 69:273-279); 항체는 유전적인 백신접종과 같은 면역 반응을 이끌어내기 위한 조작 및/또는 도입될 수 있는 어느 하나 또는 그 이상의 방법에 의하여 제공한다.

최근 몇 년에, 레트로바이러스는 유전자 치료에 대한 사용이 제안되었다. 본래, 레트로바이러스는 리틱(lytic) 바이러스와 다른 생활주기(life cycle)를 가지는 RNA 바이러스이다. 이점에 있어서, 레트로바이러스가 셀을 감염시킬 때, 그것의 게놈은 DNA 형태로 변환된다. 바꾸어 말하면, 레트로바이러스는 DNA 중간체를 통하여 복제하는 감염체이다. 레트로바이러스 감염 등의 자세한 사항은 이후에 기술한다.

다음과 같은 많은 레트로바이러스가 존재하고 예들로는: 쥐과 백혈병 바이러스(murine leukemia virus, MLV), 인간 면역결핍증 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV), 말의 전염빈혈증 바이러스(equine infectious anaemia virus, EIAV), 생쥐 유방암 바이러스(mouse mammary tumour virus, MMTV), 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV), 퓨지나미 육종 바이러스(Fujinami sarcoma virus, FuSV), 몰로니 생쥐 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus, Mo-MLV), FBR 생쥐 골육종 바이러스(FBR murine osteosarcoma virus, FBR MSV), 몰로니 생쥐 육종 바이러스(Moloney murine sarcoma virus, Mo-MLV), 아벨슨 생쥐 백혈병 바이러스(Abelson murine leukemia virus, A-MLV), 아비안 골수구종증 바이러스-29(Avian myelocytomatosis virus-29, MC29) 및 아비안 적아구증 바이러스(Avian erythroblastosis virus, AEV)를 포함한다.

레트로바이러스의 자세한 사항은 Coffin et al("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp758-763)에 근거로 하였다.

어떤 레트로바이러스의 게놈 구조에 대한 자세한 사항은 공지되어 있다. 예로서, HIV에 대한 자세한 것은 NCBI Genbank(즉 Genome Accession No. AF033819)로부터 얻을 수 있다.

모든 레트로바이러스는 필수적인 비리온 단백질을 코딩하는 gag, pol, env의 세 개의 주요한 코딩 도메인을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 레트로바이러스는 넓게, 즉 "단순(simple)"과 "복합(complex)" 두 개의 종류로 나뉠 수 있다. 이 분류는 그들의 게놈의 구성에 의해 구별된다. 단순 레트로바이러스는 일반적으로 단지 기본정보를 전달한다. 이와 다르게, 복합 레트로바이러스는 또한 다중의 스플라이싱된 메시지로부터 유도된 부가적인 조절 단백질을 코딩한다.

레트로바이러스는 7개의 그룹으로 더욱 나뉘어 질 수 있다. 이 그룹의 5개는 발암 가능성을 지니는 레트로바이러스를 나타낸다. 나머지 두 개의 그룹은 렌티바이러스(lentiviruses)와 포말바이러스(spumaviruses)이다. 이 바이러스들에 대한 사항은 "Retroviruses"(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 1-25)에 나타나 있다.

인간 T-셀 백혈병 바이러스-소과 백혈병 바이러스(human T-cell leukemia virus-bovine leukemia virus , HTLV-BLV) 그룹을 제외한 모든 발암성 멤버들은 단순 레트로바이러스이다. HTLV, BLV와 렌티바이러스 및 포말바이러스는 복합 레트로바이러스이다. 가장 잘 연구된 발암성 레트로바이러스들로는 라우스 육종 바이러스(RSV), 생쥐 유방암 바이러스(MMTV), 생쥐 백혈병 바이러스(MLV) 및 인간 T-셀 백혈병 바이러스(human T-cell leukemia virus, HTLV)이다.

게다가, 렌티바이러스 그룹은 "영장류(primate)"와 "비영장류(non-primate)"로 더욱 분류될 수 있다. 영장류 렌티바이러스의 예로는 인간 면역결핍증 바이러스(HIV), 인간 자동-면역결핍증 증후군의 원인성 에이전트(causative agent of human auto-immunodeficiency syndrome, AIDS) 및 원숭이 면역결핍증 바이러스(simian immunodeficiency virus, SIV)이다. 비영장류 렌티바이러스 그룹은 관련 염소 관절염-뇌염 바이러스(caprine arthritis-encephalitis virus, CAEV), 말의 전염빈혈증 바이러스(EIAV), 좀더 최근에 제시되는 고양이과 면역결핍증 바이러스(feline immunodeficiency virus, FIV) 및 소과 면역결핍증 바이러스(bovine immunodeficiency virus, BIV) 뿐만 아니라 대표형 "슬로우 바이러스(slow virus)" 비스나/메디(visna/maedi) 바이러스를 포함한다.

렌티바이러스 패밀리와 다른 레트로바이러스 형태 사이의 차이점은 레틴바이러스가 분열(dividing)과 비분열(non-dividing) 셀을 둘다 감염시킬 수 있다는 것이다(Lewis et al, 1992 EMBO. J 11; 3053-3058, Lewis and Emerman 1994 J. Virol. 68: 510-516). 이와 다르게, MLV와 같은 다른 레트로바이러스는 예를 들어 근육, 뇌, 폐, 간 조직을 구성하는 것들과 같은 비분열 셀을 감염시킬 수 없다.

감염 과정동안, 레트로바이러스는 처음에 특정 셀 표면 리포터에 부착한다. 감염되기 쉬운 호스트 셀에 들어가는 동안, 그런후 레트로바이러스 RNA 게놈은 바이러스성 코딩되는 역전사 효소(reverse transcriptase)에 의해 모체 바이러스속으로 전달되는 DNA로 복사된다. DNA는 그 후에 호스트 게놈으로 융합되는 호스트 셀 핵(nucleus)으로 이동된다. 이 단계에서 이것은 전형적인 프로바이러스(provirus)로 불리어진다. 프로바이러스는 셀 분열하는 동안 호스트 염색체에서 안정하고 다른 세포 단백질처럼 전사된다. 프로바이러스는 그 이상의 바이러스 만드는데 필요한 단백질과 패키징(packaging) 조직을 코딩하며, 때때로 "버딩(budding)"이라고 불리는 과정에 의해 셀에서 떨어져 나갈 수 있다.

이미 언급된 것처럼, 각각의 레트로바이러스성 게놈은 비리온 단백질과 효소를 코딩하는 gag, pol 및 env라고 불리는 유전자로 구성된다. 이런 유전자들은 긴 말단 반복부분(LTRs)이라고 불리는 영역에 의해 양쪽 말단에 위치한다. LTRs는 프로바이러스의 융합과 전사를 담당한다. 또한 그들은 인핸서-프로모터 서열로 제공된다. 바꾸어 말하면, LTRs는 바이러스의 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 레트로바이러스 RNAs를 단백질막으로 싸는 것은 바이러스 게놈의 5' 말단에 위치한 psi 서열에 의해 일어난다.

LTRs 그들 자신은 U3, R 및 U5로 불리는 세 개의 요소로 나뉠 수 있는 서열과 동일하다. U3는 RNA 3' 말단에 독특한 서열로부터 얻어진다. R은 RNA의 양쪽 말단에 반복되는 서열로부터 얻어지고 U5는 RNA 5' 말단에 독특한 서열로부터 얻어진다. 세 개의 요소들의 크기는 갖가지의 레트로바이러스 중에 상당히 달라질 수 있다.

각각의 경우의 이해를 위해서, LTRs, gag, pol 및 env의 기본적인 특징을 보여주는 레트로바이러스 게놈의 단순한 일반적인 도식(개략적으로)은 도 6에 나타나 있다.

바이러스 게놈에 있어서, 전사 시작 위치는 왼쪽 LTR(상기에 나타남)에서 U3와 R의 사이 경계에 있고(도 6에 나타난 것처럼), 폴리 (A) 첨가(종결부분)의 위치는 오른쪽 LTR(상기에 나타남)에서 R과 U5의 사이 경계에 있다(도 6에 나타난 것처럼). U3는 프로바이러스의 전사 조절 요소의 대부분을 포함하며, 세포와 다른 경우에 반응하는 바이러스 전사 활성체 단백질인 프로모터와 복합 증진제 서열을 지닌다. 약간의 레트로바이러스는 유전자 발현의 조절에 관여하는 단백질을 코딩하는 다음의 유전자; tat, rev, tax 및 rex를 어느 하나 또는 그 이상을 가진다.

구조적 유전자 gag, pol 및 env에 관해서는, gag는 바이러스의 내부 구조적 단백질을 코딩한다. Gag는 단백질 가수분해에 의해 성숙한 단백질 MA(matrix), CA(capsid), NC(nucleocapsid)로 된다. 유전자 pol은 두 개의 DNA 중합효소를 포함하는 역전사 효소(RT)를 코딩하고, 게놈 복제를 조정하는 RNase H 활성도 및 융합효소(integrase, IN)와 연관된다. 유전자 env는 특히 세포 수용체 단백질과 상호작용 하는 복합체를 형성하는 비리온의 표면(SU) 당단백질과 트렌스멤브레인(transmembrane, TM) 단백질을 코딩한다. 이 상호작용은 결국 바이러스 막과 셀 막을 융합하게 한다.

레트로바이러스의 외막 당 단백질 복합체는 외부의 글라이코실레이트된 친수성 폴리펩타이드(glycosylated hydrophilic polypeptide, SU)와 멤브레인-스패닝 단백질(TM)인 두 개의 폴리펩타이드를 포함한다. 동시에, 이것은 비리온의 표면에 올리고형(oligomeric) "혹(knob)" 또는 "혹으로 된 스파이크(knobbed spike)"를 형성한다. 양쪽 폴리펩타이드들은 env 유전자에 의해 코딩되고, 셀 표면으로 이동하는 동안 단백질 가수분해로 분리되는 폴리단백질의 전구체 형태로 합성된다. 분리되지 않은 Env 단백질이 수용체에 결합하더라도, 분리 자체는 단백질의 융합을 활성화시키는데 필요하고 호스트 셀로 바이러스가 들어가는데 필요하다. 전형적으로, 양쪽 SU와 TM 단백질은 다중 위치에 글리코실레이트된다. 그러나 MLV, TM의 예로, 약간의 바이러스에 있어서는 글리코실레이트 되지 않는다.

SU와 TM 단백질은 항상 그렇게 외막 비리온 입자의 구성에 필요한 것은 아닐지라도, 그들은 침입 과정에서 필수적인 역할을 한다. 이것에 관해서, SU 도메인은 목표 셀에서 수용체 분자-때로는 특정 수용체 분자-에 결합한다. 결합은 바이러스와 셀 막이 융합된 후에 TM 단백질의 막 융합-유도(fusion-inducing)를 활성화시키는 것으로 여겨진다. 다른 바이러스에서, 특히 MLV, TM의 세포질 말단에 짧은 부분의 제거로 생기는 분리는 단백질의 전체 융합 활성을 밝히는데 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다(Brody et al 1994 J. Virol. 68:4620-4627, Rein et al1994 J. Virol. 68:1773-1781). TM의 멤브레인-스패닝 부분의 말단에서 세포질 "말단(tail)"은 바이러스 멤브레인의 내부에 남아 있고, 갖가지 레트로바이러스의 길이에서 상당히 다르다.

그러므로, SU/수용체간 상호작용의 특이성은 레트로바이러스의 호스트 범위와 조직 향성(tropism)을 한정할 수 있다. 약간의 경우에 있어서, 특이성은 재조합 레트로바이러스 벡터의 형질도입을 제한할 수 있다. 이런 이유로, 많은 유전자 치료실험은 MLV를 사용해 왔다. 4070A 라고 불리는 외포(envelope) 단백질을 지니는 특정한 MLV는 암포트로픽 바이러스(amphotropic virus)라고 알려져 있고, 또한 사람과 쥐 사이에 보존되는 인산 운반 단백질을 지니는 외포 단백질 "독(docks)" 때문에 인간 셀을 감염시킬 수 있다. 이 운반체는 광범위해서 이러한 바이러스들은 많은 셀 타입을 감염시킬 수 있다. 그러나 어떤 경우에 있어서, 특히 안정성 관점에서 특히 한정된 목표 셀까지 이로울 수 있다. 이것 때문에, 여러 그룹들은 특히 인간 셀을 감염시키기 위해서 그것의 암포트로픽 바이러스가 보통은 단지 쥐 셀을 감염시키는 것과 다른 쥐 에코트로픽 레트로바이러스(ecotropic virus)를 연구하였다. 외포 단백질 단편을 에리쓰로포이에틴(erythropoietin) 부분으로 치환하여 적혈수 셀 전구체와 같은 셀 표면의 에리쓰로포이에틴을 발현시키는 사람 셀에 특히 결합하는 재조합 레트로바이러스를 생성하였다(Maulik and Patel 1997 "Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies" 1997. Wiley-Liss Inc. pp 45.).

gag, pol 및 env에 더하여, 또한 복합 레트로바이러스는 보조(accessory) 및 조단백질(auxillary protein)을 코딩하는 "보조(accessory)" 유전자를 포함한다. 보조 및 조단백질은 보통 증식 또는 구조 유전자, gag, pol 및 env에 의해 코딩되는 것에 더하여 보조 유전자에 의해 코딩되는 단백질로서 정의된다. 이런 보조 단백질은 tat, rev, tax 및 rex에 의해 코딩되는 단백질들과 같이 유전자 발현 조절에서 수반되는 단백질들과는 다르다. 이런 보조 유전자들의 예로는 vif, vpr, vpx, vpu 및 nef의 하나 또는 그 이상을 포함한다. 보조 유전자들은 예를 들어, HIV에서 발견될 수 있다(참고: "Retroviruses" Ed. Coffin et al Pub. CSHL 1997, pp802-803). 비필수 보조 단백질은 세포 단백질에 의해 제공되는 기능을 적어도 일부분 이중 작용을 제공하면서 특정한 셀 타입에서 기능을 할 수 있다. 전형적으로 보조 유전자는 LTR의 U3 영역 또는 env의 중복되는 부분 및 서로를 포함하는 env의 다운스트림(downstream)인 pol과 env 사이에 위치한다.

복합 레트로바이러스는 세포 전사 요인들뿐만 아니라 바이러스의 코딩되는 전사 활성체를 사용하는 조절 메카니즘을 발전시켰다. 트렌스-활성(trans-acting) 바이러스의 단백질은 LTRs에 의해 유도되는 RNA 전사의 활성체로서 역할을 한다. 렌티바이러스의 전사 트렌스-활성체는 바이러스의 tat 유전자에 의해 코딩된다. Tat은 안정한 RNA 2차 구조인 스템-루프(stem-loop)에 결합하고, 트렌스-활성화 전사에 Tat의 최적의 위치를 잡게 하는 역할을 하는 TAR로서 설명된다.

이전에 언급한 것처럼, 레트로바이러스는 NOI 또는 복수의 NOIs를 특히 하나 또는 그 이상의 관심 위치에 전달시키기 위한 운반시스템으로 제안되고 있다(다르게 운반 비이클 또는 운반 벡터로 표현). 전달은 in vitro, ex vivo, in vivo 또는 그것의 결합에 의해 일어난다. 현재에 사용될 때, 레트로바이러스는 전형적으로 레트로바이러스 벡터 또는 재조합 레트로바이러스 벡터로 불린다. 레트로바이러스 벡터는 수용체 사용, 역전사 및 RNA 패키징을 포함한 레트로바이러스의 생활환(life cycle)을 여러 가지 각도에서 연구하기 위해 개발되어 왔다(Miller, 1992 Curr Top Microbiol. Immunol. 158:1-24).

유전자 치료에서 전형적인 재조합 레트로바이러스 벡터의 사용에 있어서, 적어도 하나 또는 그 이상의 gag, pol 및 env 단백질 코딩 영역의 일부는 바이러스로부터 제거될 수 있다. 이것은 레트로바이러스 벡터를 복제-결함(replication-defective)이 있는 것으로 만든다. 제거된 부분은 그것의 게놈을 호스트 게놈으로 융합할 수 있는 바이러스를 발생시키기 위해 NOI에 의해 대치될 지라도, 그러나 변경된 바이러스 게놈은 구조 단백질의 결여로 자신을 증식시킬 수 없다. 호스트 게놈으로 융합되었을 때, NOI의 발현은 예를 들어 치료효과에 나타나는 결과에서 일어난다. 그러므로 NOI의 관심있는 위치로의 전달은 일반적으로 NOI를 재조합 바이러스 벡터로 융합; 변형된 바이러스 벡터를 비리온 코트로 패키징; 및 목표 셀 또는 목표 셀 개체와 같은 관심 위치의 형질도입에 의해 이루어질 수 있다.

예를 들어 패키징의 결합 또는 헬퍼셀 라인(helper cell line) 및 재조합 벡터의 사용에 의해 관심위치의 순차적인 형질도입을 위해서 많은 레트로바이러스 벡터(레트로바이러스 벡터의 적당한 농도를 준비하는 것)를 증식하고 분리하는 것은 가능하다.

어떤 경우에, 증식 및 분리는 레트로바이러스의 gag, pol 및 env 유전자의 분리와 "패키징 셀 라인(packaging cell line)"을 생성하기 위해서 호스트 셀로 그들의 개별적인 삽입을 필요로 한다. 패키징 셀 라인은 레트로바이러스의 DNA를 패키징 하는데 필요한 단백질을 형성하나, psi 영역의 결여로 단백질 막으로 둘러쌀 수는 없다. 그러나, NOI와 psi 영역을 운반하는 재조합 벡터가 패키징 셀 라인으로 삽입될 때, 헬퍼 단백질은 재조합 바이러스 스톡(stock)을 생성하기 위해 psi-양성(psi-positive) 재조합 벡터를 패키징할 수 있다. 이것은 NOI를 셀의 게놈으로 도입하는 셀을 감염시키는데 사용될 수 있다. 바이러스의 단백질을 만드는데 필요한 모든 유전자가 결여된 재조합 바이러스의 게놈은 단지 한번 감염시킬 수 있고 증식할 수는 없다. 그러므로, NOI는 유해한 레트로바이러스의 발생가능성 없이 호스트 셀 게놈으로 삽입된다. 유용한 패키징 라인에 대한 개요는 "Retroviruses"에 소개되어 있다(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmun p 449).

그러나, 이 기술은 적정 수준이 반드시 만족스러운 수준이 아니라는 점에서 문제가 있을 수 있다. 그럼에도 불구라고, 레트로바이러스 패키징 셀 라인의 디자인은 자주 이전의 디자인에서 제기되었던 특히 자발적인 헬퍼 바이러스를 형성하는 문제점을 처리하기 위해 발전하였다. 재조합이 상동성(homology)에 의해 많이 용이해졌기 때문에, 벡터의 게놈과 헬퍼 사이에 상동성의 감소와 제거는 헬퍼 바이러스 형성의 문제점을 감소시킨다.

좀더 최근에, 패키징 셀은 세 개의 재조합 결과가 야생형의 바이러스 형성에 필요로 되도록 gag, pol 및 env 바이러스 코딩 영역을 독립적으로 패키징 셀 라인으로 감염시켜 분리된 발현 플라스미드로 운반한다는 것을 발전시켰다. 이 방법은 때때로 세 개의 플라스미드 트랜스펙션(transfection) 방법으로 불린다(Soneoka et al 1995 Nucl. Acids Res. 23:628-633).

또한 일시적인 트랜스펙션은 벡터가 형성될 때 벡터 형성을 측정하는데 사용될 수 있다. 이런 점에서, 일시적인 트랜스펙션은 안정한 벡터-형성 셀 라인을 생성하는데 필요한 긴 시간을 피하고, 벡터 또는 레트로바이러스 패키징 성분이 셀에 유독하다면 사용된다. 일반적으로, 레트로바이러스 벡터를 생성시키는데 필요한 구성성분은 Gag/Pol 단백질을 코딩하는 플라스미드, Env 단백질을 코딩하는 플라스미드 및 NOI를 포함하는 플라스미드를 포함한다. 벡터 생성은 다른 필요한 구성성분을 포함하여 하나 또는 그 이상의 이런 구성성분의 셀에 대한 일시적인트랜스펙션을 필요로 한다. 벡터가 셀 주기의 억제제 또는 세포사멸을 유도하는 유전자와 같이 호스트 셀의 복제를 조정하는 유독한 유전자 또는 유전자들을 코딩한다면, 안정한 벡터-생산 셀 라인을 생성하는 것은 어려울 수 있으나, 일시적인 트랜스펙션은 셀이 죽기 전에 벡터를 형성하는데 사용될 수 있다. 또한, 셀 라인은 안정한 벡터-생산 셀 라인으로부터 얻어지는 수준에 비교하여 적정 수준에서 벡터를 생산하는 일시적인 감염을 사용하여 형성된다(Pear et al 1993, PNAS 90:8392-8396).

안정한 HIV-기초로 한 패키징 셀을 생산하는 것을 어렵게 하는 HIV 단백질의 독성에 대해서, HIV 벡터는 대개 벡터와 헬퍼 바이러스의 일시적인 트랜스펙션에 의해 만들어진다. 연구가들은 HIV Env 단백질을 소포성의 스토마티스 바이러스(vesicular stomatis virus, VSV)의 단백질로 대치하기까지 했다. VSV의 Env 단백질의 삽입은 적정량 5 x 10⁵(나중에 10⁸농도)을 가진 HIV/VSV-G 벡터가 일시적인 트랜스펙션에 의해 형성되는 것(Naldini et al 1996 Science 272: 263-267)과 같이 벡터 농도를 조정한다. 그러므로, HIV 벡터의 일시적인 트랜스펙션은 매우 적정량의 벡터(Yee et al 1994 PNAS. 91:9564-9568)를 생성하는데 유용한 방법을 제공할 것이다. 그러나, 이 연구법에 대한 단점은 VSV-G 단백질이 셀에 상당히 유독하다는 것이다.

env 유전자를 이형의(heterologous) env 유전자로 치환하는 것은 슈도타이핑(pseudotyping)이라고 불리는 기술 또는 방법의 예이다. 슈도타이핑은 새로운 것은 아니고 예로는 WO-A-98/05759, WO-A-98/05754, WO-A-97/17457, WO-A-96/09400, WO-A-91/00047 및 Mebatsion et al(1997 Cell 90, 841-847)에 나타나 있다.

슈도타이핑은 하나 또는 그 이상의 이점을 준다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터를 가지고, HIV 기초로한 벡터의 env 유전자 생성물은 CD4 라고 불리는 단백질을 발현시키는 셀을 단지 감염시키는 이러한 벡터들을 제한한다. 그러나, 이런 벡터에서 env 유전자는 다른 RNA 바이러스로부터 env 서열로 치환되고, 그런 후 더 광범위한 감염 스펙트럼을 지닐 수 있다(Verma and Somia 1997 Nature 389: 239-242). 실시예를 통하여, 연구자들은 VSV로부터 당단백질을 지니는 HIV 기초로한 벡터를 슈도타이핑하였다(Verma and Somia 1997 ibid).

또한, 실시예를 통하여 레트로바이러스 Env 단백질의 상대적 취약성은 레트로바이러스를 농축하는 능력을 제한하고, 바이러스 농축은 바이러스의 복원을 미약하게 할 것이다. 어느 정도까지, 이 문제는 더 나은 수율을 지니는 유효한 벡터 농도를 지니도록 더욱 안정한 VSV-G 단백질을 지닌 레트로바이러스 Env 단백질로 치환하여 극복될 수 있다(Naldini et al 1996. Science 272:263-267).

그러나 VSV-G 단백질로 슈도타이핑 하는 것은 항상 바람질할 수는 없다. VSV-G 단백질은 세포를 파괴하기 때문이다(Chen et al 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 10057 및 여기에 인용된 참고문헌).

그러므로, 레트로바이러스 벡터를 슈도타이핑 하는데 사용될 수 있고 유독하지 않는 다른 단백질을 발견하는 것이 바람직하다.

본 발명은 전달 시스템에 관한 것이다. 특히 본 발명은 관심 있는 뉴클레오타이드 서열(이하, "NOI"로 단축해서 씀)을 -또는 다중(plurality)의 NOIs- 관심 있는 사이트로 전달시킬 수 있는 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다.

더욱 상세하게는, 본 발명은 유전자 치료에서 유용한 레트로바이러스(retroviral) 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 다음의 실시예에 의하여, 도면들에 관해 기술될 것이다.

도 1은 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.

도 2는 젤의 사진을 나타낸 것이다.

도 3은 개략적 다이아그램의 세트를 나타낸 것이다.

도 4는 그래프를 나타낸 것이다.

도 5는 2개의 그래프를 나타낸 것이다.

도 6은 개략적 다이아그램을 나타낸 것이다.

그러므로, 본 발명은 개선된 레트로바이러스 벡터를 제공하려고 한다.

본 발명의 첫 번째 측면에서, 목표 사이트에 형질도입할 수 있는 레트로바이러스 시스템을 제공하는 것으로, 상기 레트로바이러스 전달시스템은 외피(envelope) 단백질의 적어도 일부를 코딩하는 첫 번째 뉴클레오타이드 서열과 레트로바이러스 전달 시스템에 의해 목표 사이트의 형질도입을 확실하게 하는 레트로바이러스로부터 유래된 하나 또는 그 이상의 다른 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 다른 뉴클레오타이드 서열의 적어도 하나에 대해서 이형(heterologous)이고; 상기 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 목표 사이트를 인식할 수 있는 광견병 G 단백질 또는 돌인변이체, 변이체, 유도체 또는 그들의 단편의 일부를 코딩한다.

본 발명의 레트로바이러스 전달 시스템은 하나의 단위(entity)의 포함할 수 있다. 대신에 본 발명의 레트로바이러스 전달 시스템은 본 발명의 레트로바이러스 전달 시스템을 조합으로 제공하는 다수의 단위를 포함할 수 있다. 이런 바이러스 전달 시스템의 예로는 한정하는 것은 아니지만 Savard et al 1997, J Virol 71(5): 4111-4117; Feng et al 1997, Nat Biotechnol 15(9): 866-870; and UK Patent Application No. 9720465.5에 기술된 헤르페스바이러스 및 아데노바이러스를 포함할 수 있다.

용어 "유래된(derivable)"은 반드시 레트로바이러스로부터 얻을 필요가 있는 것은 아니고 대신에 그것으로부터 얻을 수 있는 서열을 의미하는 것으로서 일반적 의미로 사용된다.

본 발명의 두 번째 측면에서, 본 발명에 따른 레트로바이러스 전달 시스템으로부터 얻을 수 있는 바이러스 입자를 제공한다.

본 발명의 세 번째 측면에서, 본 발명의 첫 번째 측면에 따른 레트로바이러스 전달 시스템 또는 그것으로부터 얻을 수 있는 레트로바이러스 벡터를 제공한다.

본 발명의 네 번째 측면에서, 본 발명에 따른 레트로바이러스 전달 시스템또는 본 발명에 따른 바이러스 입자 또는 본 발명에 따른 레트로바이러스 벡터를 지니는 형질 도입된 셀을 제공한다.

본 발명의 다섯 번째 측면에서, 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 레트로바이러스 전달 시스템 또는 본 발명에 따른 바이러스 입자 또는 본 발명에 따른 레트로바이러스 벡터를 제공한다.

본 발명의 여섯 번째 측면에서, 동일한 필요에서 NOI를 목표 셀로 전달시키기 위한 약학적 조성의 제조에서 본 발명에 따른 레트로바이러스 전달 시스템 또는 본 발명에 따른 바이러스 입자 또는 본 발명에 따른 레트로바이러스 벡터의 사용방법을 제공한다.

본 발명의 일곱 번째 측면에서, 본 발명에 따른 레트로바이러스 전달 시스템 또는 본 발명에 따른 바이러스 입자 또는 본 발명에 따른 레트로바이러스 벡터에 셀을 접촉시킴을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 여덟 번째 측면에서, 본 발명에 따른 레트로바이러스 전달 시스템 또는 본 발명에 따른 바이러스 입자 또는 본 발명에 따른 레트로바이러스 벡터를 제조하기 위한 벡터를 제공하는 것으로, 상기 벡터는 광견병 G 단백질 또는 돌인변이체, 변이체, 유도체 또는 그들의 단편의 일부를 적어도 코딩하는 뉴클레오타이드서열을 포함한다.

본 발명의 아홉번째 측면에서, 본 발명에 따른 레트로바이러스 전달 시스템 또는 본 발명에 따른 바이러스 입자 또는 본 발명에 따른 레트로바이러스 벡터를 제조하기 위한 플라스미드를 제공하는 것으로, 상기 플라스미드는 광견병 G 단백질 또는 돌인변이체, 변이체, 유도체 또는 그들의 단편의 적어도 일부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 열번째 측면에서, 다수의 플라스미드를 제공하는 것으로, 상기 적어도 하나의 플라스미드는 본 발명에 따른 플라스미드이고, 상기 적어도 하나의 다른 플라스미드는 레트로바이러스로부터 유래된 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 열한번째 측면에서, 레트로바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 입자의 감염 프로파일에 영향을 주기 위해서 레트로바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 입자를 슈도타이핑하는 광견병 G 단백질의 사용을 제공한다.

본 발명의 열두번째 측먼에서, 레트로바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 입자의 호스트 범위 및/또는 셀 향성(tropism)에 영향을 주기위해서 레트로바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 입자를 슈도타이핑하는 광견병 G 단백질의 사용을 제공한다.

본 발명의 열세번째 측면에서, 광견병 G 단백질로 슈도타이핑된 레트로바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 입자를 제공한다.

본 발명의 열네번째 측면에서, 이형의 env 영역을 포함하는 레트로바이러스 시스템을 제공하는 것으로, 상기 이형의 env 영역은 광견병 G 단백질에 대해 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 적어도 일부를 포함한다.

본 발명의 열다섯번째 측면에서, 이형의 env 영역을 포함하는 레트로바이러스 시스템을 제공하는 것으로, 상기 이형의 env 영역은 광견병 G 단백질에 대해 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

바람직하게, 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 광견병 G 단백질 또는 돌연변이체, 변이체, 유도체 또는 그들의 단편의 모두를 코딩한다.

바람직하게, 다른 뉴클레오타이드 서열의 적어도 다른 하나는 렌티바이러스 또는 온코레트로바이러스(oncoretrovirus)로부터 얻을 수 있다.

바람직하게, 다른 뉴클레오타이드 서열은 렌티바이러스 또는 온코레트로바이러스(oncoretrovirus)로부터 얻을 수 있다.

바람직하게, 다른 뉴클레오타이드 서열은 MLV, HIV 또는 EIAV로부터 얻을 수 있다.

바람직하게, 레트로바이러스 전달 시스템은 적어도 하나의 NOI를 포함한다.

바람직하게, NOI는 치료효과를 지니거나 치료효과를 지니는 단백질을 코딩한다.

바람직하게 목표 사이트는 셀이다.

그러므로, 본 발명은 이형의 외피를 지닌 레트로바이러스 벡터를 제공하는 것이다. 이 레트로바이러스 벡터는 유전자 치료에서 유용하다.

본 발명의 중요한 측면은 광견병 단백질, 특히 광견병 G 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 지닌 레트로바이러스 및/또는 같은 것으로 얻을 수 있거나 기초로한 레트로바이러스 벡터의 슈도타이핑이다. 여기서 용어 슈도타이핑은 바이러스 게놈 또는 다른 바이러스로부터의 단백질인 바이러스 벡터의 적어도 일부를결합시키거나 치환하거나 또는 모두를 대체하는 것을 의미한다.

광견병 G 단백질 및 그들의 돌연변이체에 대한 연구는 Rose et al., 1982 J. Virol. 43:361-364, Hanham et al., 1993 J. Virol., 67, 530-542, Tuffereau et al., 1998 J. Virol., 72, 1085-1091, Kucera et al., 1985 J. Virol 55, 158-162, Dietzschold et al., 1983 PNAS 80, 70-74, Seif et al., 1985 J. Virol., 53, 926-934, Coulon et al., 1998 J. Virol., 72, 273-278, Tuffereau et al., 1998 J. Virol., 72, 1085-10910, Burger et al., 1991 J.Gen, Virol. 72. 359-367, Gaudin et al 1995 J Virol 69, 5528-5534, Benmansour et al 1991 J Virol 65, 4198-4203, Luo et al 1998 Microbiol Immunol 42, 187-193, Coll 1997 Arch Virol 142, 2089-2097, Luo et al 1997 Virus Res 51, 35-41, Luo et al 1998 Microbiol Immunol 42, 187-193, Coll 1995 Arch Virol 140, 827-851, Tuchiya et al 1992 Virus Res 25, 1-13, Morimoto et al 1992 Virology 189, 203-216, Gaudin et al 1992 Virology 187, 627-632, Whitt et al 1991 Virology 185, 681-688, Dietzschold et al 1978 J Gen Virol 40, 131-139, Dietzschold et al 1978 Dev Biol Stand 40, 45-55, Dietzschold et al 1977 J Virol 23, 286-293 및 Otvos et al 1994 Biochim Biophys Acta 1224, 68-76 에 발견될 수 있다. 광견병 G 단백질은 또한 EP-A-0445625에 기술되어 있다.

본 발명에 따른 광견병 G 단백질의 사용은 광견병 바이러스가 우선적으로 감염시키는 목표의 셀을 선택적으로 생체내에서 형질도입하는 벡터를 제공하는 것이다. 이것은 특히 생체내에서 신경의 목표 셀을 포함한다. 신경-목표 벡터에 있어서, ERA와 같은 광견병의 병원성 균주로부터 얻은 광견병 G는 특히 효과적일 것이다. 반면, 광견병 G 단백질은 거의 모든 포유류 및 테스트된 조류 셀 타입을 포함하여 생체외에서 광범위한 셀 타입의 범위를 지닌다(Seganti et al., 1990 Arch Virol. 34, 155-163; Fields et al., 1996 Fields Virology, Third Edition, vol.2, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, New York). 또한 관심의 다른 셀 타입을 감염시킬 수 있는 것도 가능할 것이다. 그러므로 본 발명에 따른 광견병 G 단백질의 사용은 또한 생체외 및 생체내에서 넓게 다양한 셀 타입을 형질도입하는 벡터를 제공할 수 있다는 것이다. 생체내 및 생체외에서 광견병 바이러스의 다른 향성은 단지 생체외에서 활성인 일련의 수용체에 결합하는 광견병 G의 능력 때문으로 생각된다.

대신에, 본 발명에 따른 슈도타이핑된 벡터 입자들의 향성은 세포외 도메인에서 변형된 돌인변이 광견병 G의 사용에 의해 변형될 수 있다. 광견병 G 단백질은 목표 셀 범위를 제한하기 위해 돌인변이 할 수 있는 장점을 지닌다. 세포내에서 목표 셀에 의한 광견병 바이러스의 이용은 단지 생체내에서 결합하는 다른 수용체인 아세틸콜린 수용체(AchR)에 의해 매개되는 것으로 생각된다(Hanham et al., 1993 J. Virol., 67,530-543; Tuffereau et al., 1998 J. Virol 72, 1085-1091). 바이러스 향성에 대한 광견병 G 단백질의 항원 사이트 Ⅲ에서의 돌연변이 효과는연구되었고, 이 영역은 아세틸콜린 수용체에 대한 바이러스의 결합에 관여하는 것으로 생각되지 않는다(Kicera et al., 1985 J. Virol 55, 158-162; Dietzschold et al., 1983 Proc Natl Acad Sci 80, 70-74; Sief et al., 1985 J. Virol., 53, 926-934; Coulon et al., 1998 J. Virol., 72, 273-278; Tuffereau et al., 1998 J. Virol., 72, 1085-10910). 예를 들어, 성숙한(mature) 단백질의 아미노산 333번인 아르기닌을 글루타민으로 변경하는 것은 중추신경 시스템으로 증식을 감소시키는 반면 생체외에서 바이러스 단위를 후각 및 말초 신경으로 제한하는데 사용될 수 있다. 이런 바이러스들은 wt 바이러스와 같이 효과적으로 모노뉴런 및 감각신경을 통과할 수 있었으나, 트랜스뉴런의 전달은 일어나지 않았다(Coulon et al., 1989, J. Virol. 63, 3550-3554). 아미노산 330번이 변경된 바이러스는 더욱 약화되어, 근육내 주사 후에 모노뉴런 또는 감각신경을 감염시킬 수 없다(Coulon et al., 1998 J. Virol., 72, 273-278).

대신에 또는 추가로, 실험으로 광견병 균주로부터 얻은 광견병 G 단백질을 사용할 수 있다. 이것을 향성에서 변경에 대해 스크린 할 수 있다. 그러한 균주들은 다음을 포함한다.

진뱅크 수탁번호 광견병 균주J02293 ERAU52947 COSRVU27214 NY 516U27215 NY771U27216 FLA125U52946 SHBRVM32751 HEP-Flury

예로서, ERA 균주는 광견병의 병원성 균주이고, 이 균주로부터 얻은 광견병 G 단백질은 신경 셀의 형질도입을 위해 사용될 수 있다. ERA 균주로부터 얻은 광견병 G의 서열은 진뱅크(GenBank) 데이터베이스(수탁번호 J02293)에 있다. 이 단백질은 19개 아미노산의 시그날 펩타이드를 지니고, 성숙한 단백질은 번역 시작 메티오닌으로부터 라이신 잔기 20개 아미노산에서 시작한다. HEP-Flury 균주는 성숙한 단백질에서 아미노산 위치 333번에서 아르기닌을 글루타민으로 변경하는 것을 포함하고, 이것은 감소되는 병원성과 관련되어 있고 바이러스 외피의 형성을 제한하는데 사용될 수 있다.

광견병 G 단백질의 예는 서열번호 2에 나타난 있고, 그것의 코딩 서열은 서열번호 1에 나타나 있다. 본 발명은 변이체, 상동체 또는 그들 서열의 유도체를 포함한다.

본 발명의 바람직한 효소에 대한 아미노산과 관련된 용어 "변이(variant)", "상동(homologue)" 또는 "단편"은 바람직하게 적어도 서열번호 2에 나타난 G 단백질과 같이 생물학적으로 활성이고 결과적인 단백질은 G 단백질 활성 및/또는 G 단백질 특성 또는 프로파일을 지니는 서열에 또는 서열로부터 하나(또는 그 이상의)의 아미노산의 대체(substitution), 변이(variation), 변형(modification), 치환(replacement), 삭제(deletion) 또는 첨가(addition)를 포함한다. 특히, 용어 "상동"은 구조 및/또는 기능에 관한 상동성을 포함한다. 서열 상동성에 관해서, 서열번호 2에 나타난 서열에 바람직하게 적어도 75%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 바람직하0게 90%의 상동성이다. 더욱 바람직하게는 서열번호 2에 나타난 서열에 적어도 95%, 더욱 바람직하게 적어도 98%의 상동성이다.

본 발명의 바람직한 효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 관련된 용어 "변이(variant)", "상동(homologue)" 또는 "단편"은 바람직하게 적어도 서열번호 1에 나타난 서열에 의해 코딩되는 G 단백질과 같이 생물학적으로 활성이고 결과적인 뉴클레오타이드 서열은 G 단백질 활성 및/또는 G 단백질 특성 또는 프로파일을 지니는 단백질을 코딩하거나 코팅할 수 있는 서열에 또는 서열로부터 하나(또는 그 이상의)의 핵산의 대체(substitution), 변이(variation), 변형(modification), 치환(replacement), 삭제(deletion) 또는 첨가(addition)를 포함한다. 특히, 용어 "상동"은 결과적인 뉴클레오타이드 서열은 G 단백질 활성 및/또는 G 단백질 특성 또는 프로파일을 지니는 단백질을 코딩하거나 코팅할 수 있는 구조 및/또는 기능에 관한 상동성을 포함한다. 서열 상동성에 관해서, 서열번호 1에 나타난 서열에 바람직하게 적어도 75%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 바람직하게 90%의 상동성이다. 더욱 바람직하게는 서열번호 1에 나타난 서열에 적어도 95%, 더욱 바람직하게 적어도 98%의 상동성이다.

특히, 여기서 사용된 용어 "상동성"은 용어 "동일성(identity)"과 같을 것이다. 상대적인 서열 상동성은(즉, 서열동일성) 두 개 또는 그 이상의 서열들 사이의 % 상동성을 계산할 수 있는 상업적으로 유용한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 그러한 컴퓨터 프로그램의 대표적인 예는 CLUSTAL 이다.

용어 "변이", "상동" 또는 "단편"은 서열의 대립형질 변이와 동일한 것이다.

또한 용어 "변이"는 여기에 나타난 뉴클레오타이드 서열에 혼성할 수 있는 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 바람직하게, 용어 "변이"는 여기에 나타난 뉴클레오타이드 서열의 핍박한 조건(즉, 65℃ and 0.1 SSC {1x SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 Na₃citrate pH 7.0})하에 혼성할 수 있는 서열에 상보적인 서열을 포함한다.

또한 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 혼성할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다(여기에 나타난 상보적인 서열을 포함). 바람직한 관점에서, 본 발명은 여기에 나타난 뉴클레오타이드 서열의 핍박한 조건(65℃ and 0.1 SSC)하에 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 혼성할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을포함한다(여기에 나타난 상보적인 서열을 포함).

VSV 당단백질과 비교하여 광견병 당단백질을 사용하는 주요한 장점은 광범위한 광견병 백신의 사용에 따른 인간 및 다른 동물에 대한 그것의 독성에 대한 상세한 지식이 있다는 것이다. 특히, 1 단계 임상 시험은 인간 백신으로서 카나리폭스(canarypox) 재조합 바이러스로부터 발현된 광견병 당단백질의 사용을 보고하였고, 이런 연구들은 백신이 인간 사용에 안전하다는 것을 결론내고 있다.

본 발명의 레트로바이러스 벡터들은 하나 또는 그 이상의 NOIs를 셀로 생체내 및 생체외에서 운반하는데 유용하며, 특히 치료학적으로 활성의 NOI(s)의 운반에 있어서 유용하다. 하나 또는 그 이상의 선택된 NOI(s)는 목표 셀에서 발현을 위해 벡터 게놈으로 결합된다. NOI(s)는 그들 자신의 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열을 가질 수 있고, 또는 그들의 발현은 벡터 LTRs에 의해 조절될 수 있다. NOI(s)의 적절한 발현을 위해서, 프로모터는 우선적으로 어떤 조건하에 또는 어떤 셀 타입에서 활성인 LTRs내에 또는 LTRs 사이에 포함될 수 있다. NOI는 센스(sense) 서열 또는 안티센스(antisense) 서열일 것이다. 게다가, 다수의 NOIs가 있다면, 그때에 NOIs는 센스 서열 또는 안티센스 서열 또는 그들의 조합일 것이다.

본 발명의 레트로바이러스 벡터 게놈은 일반적으로 5' 및 3' 말단에 LTRs,치료학적으로 활성 유전자 및/또는 표지 유전자를 포함하는 하나 또는 그 이상의 NOI(s) 및/또는 표지 유전자 또는 하나 또는 그 이상의 NOI(s)을 삽입하기 위한 적당한 삽입 사이트 및 생산 셀에서 게놈을 벡터 입자로 패키징할 수 있는 패키징 시그날로 구성된다. 오히려 벡터 RNA를 DNA로 역전사하고 프로바이러스 DNA를 목표 셀 게놈으로 융합하기 위한 적당한 프라이머 결합 사이트와 융합 사이트 일 것이다. 바람직한 실시태양에서, 레트로바이러스 벡터 입자는 역전사 시스템(호환적인 역전사 및 프라이머 사이트 위치) 및 융합 시스템(호환적인 인테그레이즈 및 융합 사이트)을 지닌다.

본 발명에 따라, 바이러스 유전자를 하나 또는 그 이상의 NOIs로 치환하고 보충하도록, 바이러스 게놈 또는 레트로바이러스 벡터 뉴클레오타이드 서열을 조작하는 것이 가능하다. NOI(s)는 하나 또는 그 이상의 선택유전자, 표지유전자 및 치료유전자일 것이다. 많은 다른 선택한 표지물질들이 레트로바이러스 벡터에서 성공적으로 사용된다. "Retroviruses"(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds; JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 444)에 나타나 있으며, 한정하는 것은 아니지만 각각 G418 및 히그로마이신(hygromycin)에 내성인 박테리아 네오마이신(bacterial neomycin) 및 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제(phosphotransferase) 유전자; 메토트렉세이트(methotrexate)에 내성인 돌연변이 쥐과 디히드로폴레이트(dihydrofolate) 환원효소 유전자; 셀을 미코페놀산(mycophenolic acid), 크산틴 (xanthine) 및 아미놉테린(aminopterin)을포함하는 배지에서 성장시키는 박테리아 gpt 유전자; 셀을 히스티딘이 아닌 히스티놀(histidinol)을 포함하는 배지에서 성장시키는 박테리아 hisD 유전자; 다양한 약물에 내성인 다중약물 내성유전자(mdr); 및 푸로마이신(puromycin) 또는 플레오마이신(phleomycin)에 내성인 박테리아 유전자를 포함한다. 이런 모든 표지물질들은 우세하게 선택할 수 있고 이런 유전자를 발현하는 대부분의 셀을 화학적으로 선택할 수 있다.

그러므로, 본 발명에 따라서, 유전자 자체가 치료효과를 유도하거나 치료효과를 유도할 수 있는 생성물을 코딩할 수 있다는 점에서 NOI는 치료유전자일 수 있다.

치료 NOIs의 비-한정 예로는 종양 억제 단백질, 시토키닌, 안티-바이러스 단백질, 면역조절 단백질, 항체, 공학적 면역글로불린-같은 분자, 융합 단백질, 호르몬, 멤브레인 단백질, 혈관구에 영향을 미치는 단백질(vasoactive protein) 또는 펩타이드, 성장인자, 리보자임, 안티센스 RNA, 효소, 효소를 활성화하는 약물의 전구물질과 같은 약물의 전구물질(pro-drugs), 세포독성 물질 및 효소 억제자를 코딩하는 유전자를 포함한다.

약물의 전구물질의 예로는 한정하는 것은 아니고 에토포사이드 포스페이트(etoposide phosphate, 염기성 포스페이트를 가지고 사용됨); 5-플루오르시토신(5-fluorocytosine, 시토신 디아미나제를 가지고 사용됨); 도소루빈-N-p-히드록시페녹시아세트아마이드(Doxorubin-N-p-hydroxyphenoxyacetamide, 페니실린-V-아미다제를 가지고 사용됨); 파라-N-비스(Para-N-bis, 2-chloroethyl) 아미노벤조일 글루타메이트(aminobenzoyl glutamate, 카르복시펩티다제 G2를 가지고 사용됨); 세팔로스포린 니트로겐 머스타드 카르바메이트(Cephalosporin nitrogen mustard carbamates, B-락타메이즈를 가지고 사용됨), SR4233(p450 환원효소를 가지고 사용됨); 칸시클로비르(Canciclovir, HSV 티미딘 키나제를 가지고 사용됨); 니트로환원효소(nitroreductase)를 가지는 머스타드 약물의 전구물질(mustard pro-drugs) 및 시클로포스파마이드(cyclophosphamide) 또는 아이포스파마이드(ifosfamide, 시토크롬 p450을 가지고 사용됨)을 포함한다.

치료될 수 있는 질환으로는 한정하는 것은 아니고 암(cancer), 심장질환(heart disease), 스토크스(stoke), 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease), 관절염(arthritis), 바이러스 감염(viral infection), 박테리아 감염(bacterial infection), 기생충 감염(parasitic infection), 면역 시스템의 질환(disease of immune system), 종양(tumours), 혈액응고 질환(blood clotting disorders) 및 만성 육아종증(chronic granulmatosis), 레쉬-니한 증후근(Lesch-Nyhan syndrome), 파킨슨 병(Parkinson's disease), 축농(empysema), 페닐케톤뇨증(phenylketonuria), 겸상 적혈구증(sickle cell anaemia), α-해양 빈혈(thalasemia), β-해양 빈혈, 가우처 병(Gaucher disease)과 같은 유전적 질환들을 포함한다.

레트로바이러스 벡터를 사용하여 유전자 치료를 위한 목표셀은 한정하는 것은 아니고 헤마토포이에틱 셀(haematopoietic cell; 단핵세포(monocytes), 대식세포(macrophages), 임파구(lymphocytes), 과립 백혈구(granulocytes) 또는 이들의 원조셀(progenitor cell)을 포함); 내피세포(endothelial cell), 종양세포, 기질세포(stromal cell), 성상세포(astrocytes), 또는 신경교 세포(glial cell), 근육세포, 상피세포(epithelial cell), 신경, 섬유세포(fibroblasts), 간세포(hepatocyte) 및 폐 세포들을 포함한다.

본 발명의 레트로바이러스 벡터내에서, 하나 또는 그 이상의 NOIs는 바이러스의 LTRs의 전사조절하에 있을 수 있다. 대신에, 인핸서-프로모터 요소의 결합은 높은 수준의 발현을 이루기 위해서 존재할 수 있다. 바람직하게 프로모터-인핸서 요소는 강하게 활동적이고 또는 목표 셀에서 강하게 유도된다. 강하게 활동적인 프로모터-인핸서 결합의 예로는 인간 시토메갈로바이러스(human cytomegalovirus, HCMV)의 주요 중간 초기(major intermediate early, MIE) 프로모터/인핸서 결합이 있다. 프로모터-인핸서 결합은 조직일 것이고 또는 시간적으로 그들의 활동에 제한된다. 프로모터-인핸서 결합으로 제한되는 알맞은 셀의 예로는 MUC1 유전자 또는 CEA 유전자로부터 프로모터-인핸서 결합과 같은 종양셀에서 매우 활동적인 것들이다.

저산소증(hypoxia) 또는 허혈(ischaemia)을 조절하는 발현은 또한 특히 어떤 환경 하에서도 유용하다. 저산소증은 광범위한 다른 셀 타입에서 유전자 발현의 강력한 조절자이고, 다양한 유전자 프로모터에서 저산소증 반응 요소(hypoxia responsive elements, HREs)인 같은 종류의 DNA 인식 위치에 결합하는 저산소증 유도 인자-1(hypoxia-inducible facotr-1, HIF-1; Wang and Semenza 1993 PNAS. (USA) 90: 430)과 같은 저산소증-유도 전사 인자의 활성 유도에 의해 작용한다. 쥐과 포스포글리세라이트 키나제-1(phosphoglycerate kinase-1, PGK-1) 유전자로부터 HRE의 다중결합 형태는 생체외 및 생체내의 충실성종양(solid tumours)내에 저산소증에 반응하여 인간 섬유육종(fibrosarcoma) 셀에 의한 표지 및 치료유전자의 발현을 조절하는데 사용된다(Firth et al 1994, PNAS 91(14):6496-6500; Dachs et al 1997 Nature Med. 5:515). 대신에, 글루코스 부족이 또한 종양의 허혈 영역에 존재한다는 사실은 특히 종양에서 본 발명에 따른 NOI와 같은 이형 유전자 DNA 발현을 활성화하는데 사용될 수 있다. 글루코스 부족에 의해 활성화되는 것으로 알려진 grp 78 유전자 프로모터의 절단형 632 염기 쌍 서열은 생체내 쥐과 종양에서 높은 수준으로 리포터 유전자의 발현을 유도할 수 있는 것으로 나타난다(Gazit et al 1995 Cancer Res. 55: 1660).

유전자 치료에서 다음의 사용에 있어서 본 발명의 레트로바이러스 벡터 게놈은 바람직하게 벡터로서 효과적인 기능에 필수적인 최소의 레트로바이러스 물질을포함한다. 이것의 목적은 NOI(s)의 결합 및 안정성의 이유로 공간을 고려하는 것이다. 바람직하게, 레트로바이러스 벡터 게놈은 gag-pol 및 env 유전자에 의해 코딩되는 하나 또는 그 이상의 구조적(또는 패키징) 구성성분을 코딩하는 기능 유전자가 없기 때문에 불완전한 복제이다. 입자 생성에 필요한 결여된 구성성분은 생산 셀 쪽에서 제공된다. 또한 게놈에서 바이러스 구조적 구성성분의 결여는 목표셀에서 발현되는 바이러스 단백질에 대해 일어나는 바람직하지 않은 면역 반응이 감소되거나 피할 수 있는 것을 의미한다. 게다가, 감염 바이러스 입자의 가능한 재구조는 바람직하게 생체내 사용이 고려되는 곳에서 피해진다. 그러므로 바이러스 구조적 성분은 바람직하게 성공적인 재조합의 기회를 줄이기 위해서 가능한 게놈으로부터 차단된다.

본 발명의 레트로바이러스 벡터 입자는 일반적으로 적합한 생산 셀에서 생성된다. 생산 셀은 일반적으로 포유류 셀이나 예를 들어 곤충셀일 수 있다. 생산 셀은 보통 그것의 게놈으로 융합된 바이러스 구조적 유전자를 포함하는 패키징 셀일 수 있다. 패키징 셀은 그 후 감염시킨 불완전한 복제 벡터 입자들을 생성하기 위해서 벡터 게놈을 코딩하는 핵산으로 감염된다. 대신에, 생산 셀은 벡터 게놈과 구조적 성분을 코딩하는 핵산 서열 및/또는 플라스미드, 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 헤르페스(herpes) 바이러스 벡터, 종두(vaccinia) 바이러스 벡터와 같은 하나 또는 그 이상의 발현벡터에 존재하는 핵산 서열 또는 기능적 DNA를 목표 셀로 운반하는 것으로 알려진 어떤 방법으로 상호 감염될 수 있다.

본 발명의 매우 바람직한 실시태양에 따라, 놀랍게도 광견병 G 단백질인 광견병 바이러스의 외피 단백질은 효과적으로 다양한 종류의 레트로바이러스를 슈도타이핑 할 수 있다는 것을 발견하였다. 이것은 MLV와 같은 온코레트로바이러스로(oncoretrovirus)로부터 조립된 벡터뿐만 아니라 HIV와 같은 영장류 렌티바이러스 및 말의 전염빈혈증 바이러스(equine infectious anaemia virus, EIAV)와 같은 비-영장류 렌티바이러스로부터 조립된 벡터를 포함한다.

실시태양에서, 본 발명의 벡터는 렌티바이러스로부터 얻을 수 있거나 렌티바이러스부터 제조될 수 있다. 이것은 벡터가 비-분열과 분열 셀을 형질도입할 수 있다는 점에서 장점이다.

그러므로 본 발명에 따른 슈도타이핑을 위한 바람직한 레트로바이러스 벡터는 HIV 또는 EIAV 벡터와 같은 렌티바이러스 이다. 이것은 상기 언급한 장점을 지닌다. 특히 광견병 바이러스 목표 셀 범위를 지닌 광견병 G로 슈도타이핑된 렌티바이러스 벡터는 신경과 같은 중추 신경 시스템의 비-분열 셀을 형질도입할 수 있다.

본 발명의 발견은 매우 놀라운 것이다. 이 측면에서, 광견병과 VSV는 다섯개의 다른 서브-그룹을 포함하는 매우 큰 패밀리인 Rhabdoviridae일지라고, 그들은(즉, VSV와 광견병) 다른 서브-그룹이다. 게다가, 광견병 G 단백질은 VSV-G와 거의 상동성을 지니지 않는다(Rose et al., 1982 J. Virol. 43:361-364). 또한 광견병 G 단백질은 28∼31개 아미노산의 VSV-G 세포질 도메인인 VSV-G 보다 일반적으로 약 44개의 아미노산(길이에서)을 지니는 더 긴 세포질 도메인을 지닌다. 144개의 아미노산 HIV-1 세포질 테일(tail)의 절단이 MLV 입자의 효과적인 슈도타이핑에 필요하다면 광견병 G 단백질이 MLV를 슈도타이핑 할 수 있다는 발견은 따라서 기대되지 않는다(Mammano et al., 1997 J. Virol. 71:3341-3345). 또한 광견병 G 단백질이 추가적으로 렌티바이러스 그룹에 바이러스와 같은 다른 레트로바이러스를 슈도타이핑 할 수 있다는 것은 놀라운 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 광견병 바이러스 G 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 레트로바이러스 벡터 게놈을 코딩하는 핵산 서열 및 게놈을 포함하는 감염 레트로바이러스 벡터 입자의 생성에 필요한 패키징 성분을 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열을 선택적으로 더욱 포함하는 레트로바이러스 벡터 생산 시스템을 제공하는 것이다.

그 이상의 측면에서, 발명은 레트로바이러스 벡터의 목표 셀 범위를 변경하는 광견병 바이러스 G 단백질의 사용을 제공하는 것이다.

다른 측면에서, 발명은 광견병 바이러스 G 단백질을 구성하는 외피를 지니는 레트로바이러스 벡터 입자를 생성하는 방법을 제공하는 것으로, 방법은 생산 셀에서 생산 셀을 벡터 입자 성분의 발현과 벡터 입자의 생산에 적합한 조건에서 상층액으로부터 벡터 입자를 획득하는 여기에 기술된 레트로바이러스 생산 시스템을 제공하는 것으로 구성된다.

그러나 다른 측면에서, 발명은 NOI를 지닌 목표 셀을 형질도입하는 방법을 제공하는 것으로, 방법은 NOI가 목표 셀 게놈에 들어가도록 셀로 부착하고 벡터가 들어가기 위한 조건하에 NOI를 운반하여 여기 기술된 것과 같이 셀을 레트로바이러스 벡터 입자에 접촉시키는 것으로 구성된다.

본 발명에 따른 벡터의 외피에 존재하는 광견병 G 단백질 외에, 하나 또는 그 이상의 외피 단백질도 또한 존재할 것이다. 이것은 예를 들어 레트로바이러스의 원래의 외피 단백질을 포함할 것이다. 슈도타이핑 단백질에 더하여 원래의 외피 단백질의 사용은 외피의 안정성 및/또는 기능에 이롭다. 그것은 오히려 벡터의 감염 프로파일을 넓힐 수 있다.

본 발명은 또한 유전자 치료에 의해 개체를 치료하기 위한 약제학 조성을 제공하고, 조성은 본 발명에 따른 조성의 치료학적으로 효과적인 양 또는 본 발명에 의해 생성된 바이러스 입자로 구성된다. 약제학적 조성은 인간 또는 동물 사용을 위한 것이다. 전형적으로 의사는 개개의 환자에게 가장 적당한 실제적인 적량을 결정할 것이고, 그것은 나이, 몸무게 및 개개의 환자의 반응에 다르다.

선택적으로, 조성은 약제학적으로 수용할 수 있는 담체(carrier), 희석제(diluent), 부형제(excipient) 또는 보조제(adjuvant)로 구성된다. 약제학적 담체, 부형제, 희석제의 선정은 투여하려는 루트 및 표준 약제학적 실시에 따라서 선택된다. 약제학적 조성은 담체, 부형제 또는 희석제에 더하여 어떤 적당한 바인더(binedrs), 윤활제(lubricants), 현탁제(suspending agents), 용해제(solubilising agents) 및 목표 위치(지질 운반 시스템과 같은)에 바이러스의 도입을 보조하거나 증가시키는 다른 담체를 포함한다.

적당한 곳에서, 약제학적 조성은 어느 하나 또는 그 이상의 : 흡입(inhalation), 좌약(suppository) 또는 자궁전(pessary)의 형태, 국소적으로 로션, 용액, 크림, 연고(ointment) 또는 가루 살포(dusting powder)의 형태, 피부 패치(skin patch), 경구로 전분 또는 락토오스와 같은 부형제를 포함하는 정제 형태, 부형제를 포함한 단독 또는 혼합물의 캡슐 또는 소란(ovules), 향기 또는 착색제를 포함하는 엘릭시르, 용액 또는 현탁의 형태로 투여되며, 그들은 예를 들어 폐강내(intracavernosally), 정맥(intravenously), 근육내(intramuscularly) 또는 피하에(subcutaneously) 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여에 있어서, 조성은 예를 들어 혈액 등장액을 만들기 위한 염 또는 단당류의 다른 성분들을 포함하는무균 용액의 형태로 가장 좋게 사용될 수 있다. 조성의 구강(buccal) 또는 혀밑 (sublingual) 투여는 종래의 방법으로 공식화된 정제 또는 마름모꼴 정제(lozenges)의 형태로 이루어진다.

그러므로, 요약으로 본 발명은 이형의 외피 단백질, 특히 광견병 바이러스 G 단백질을 지니는 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다. 또한 본 발명은 광견병 G 단백질로 구성된 외피를 지니는 레트로바이러스 벡터의 생산을 위한 레트로바이러스 생산 시스템뿐만 아니라 벡터와 시스템을 생성하는 방법 및 벡터와 시스템의 사용을 포함한 방법에 관한 것이다.

(실시예 1)

광견병 G 단백질을 발현하는 벡터의 생산 및 사용된 다른 벡터의 상세한 설명

광견병 G에 대한 발현 벡터는 pSG5rabgp(Burger et al., 1991 J.Gen. Virol. 72. 359-367)로부터 1.7 kbpBblⅡ 광견병 G 단편(균주 ERA)을 gpt 유전자를 BamHI로 절단하고 재결합시켜 제거된 pGW1HG(Soneoka et al 1995 Nucl. Acids Res. 23:628-633)의 유도체인 pSA91(도 1)로 클로닝하여 조립된다. 이것은 인간 시토메갈로바이러스(human cytomegalovirus, HCMV)의 초기 근처(immediate early) 유전자 프로모터/인핸서로부터 광견병 G를 발현하게 하는 pSA92RbG를 제조한다. 293T 셀은 pONY3(후에 제조에 대한 상세한 것은 참조)과 pONY2.1nlsLacZ(후에 제조에 대한 상세한 것은 참조)와 함께 Soneoka et al 1995(ibid)에 의해 기술된 방법에 의해 플라스미드를 감염시키고 감염된 셀에서 광견병 G의 발현은 웨스턴 블럿팅에 의해 확인되었다. VSV-G가 HCMV 조건하에 발현된 VSV-G 발현 플라스미드는 pSA91에서 광견병 G 대신에 네가티브 컨트롤(negative control)로서 사용되었다. 감염된 셀은 PBS로 세척되고, 신선하게 제조된 1mM PMSF를 포함하는 RIPA 완충용액에서 용해시켰고, 제품 설명서에 따라 BCA 단백질 정량시약 키트(BCA Inc., USA)를 사용하여전체 단백질 농도를 결정하였다. 셀 용해질의 50㎍을 10% SDS/PAGE에 실시하였다. 젤은 임모빌론 멤브레인(Millipore Inc.)위에 일렉트로블럿 되었다. 웨스턴 블럿 분석은 광견병 G에 대한 생쥐 모노클로날 항체 17D2를 1:3000으로 희석하고 컨쥬게이트된 안티-생쥐 IgG에 대해 토끼 퍼옥시다제(peroxidase)를 1:1000로 희석하여 수행되었다(Vector Laboratories, Peterborough, UK). 화학적발광(chemiluminescence)에 의한 검출은 ECL 키트(Amersham International, UK)를 사용하여 수행되었다. 광견병 G에 대해 보고된 사이즈에 대한 68kD 밴드는 pSA91RbG로 감염된 셀에서 분명하다(도 2).

다음의 모든 실시예에서 이미 기술된(Soneoka et al., 1995, ibid) 따른 세 개의 플라스미드 감염 방법은 슈도타이핑 벡터를 생산하는데 사용되었다. 이 실험에서 사용된 플라스미드는 다음과 같았다. pHIT111과 pHIT60은 각각 E.coli lacZ 표지 유전자와 MLV gag-pol를 포함하는 MLV 벡터를 발현시킨다(Soneoka et al., 1995). pH3Z와 pGP-RRE3는 대응하는 HIV 벡터 성분이다(Kim et al., 1998 J. Virol. 72:811-816). pONY2.1nlsLacZ와 pONY3은 대응하는 EIAV 벡터 성분이다(GB 특허출원 9727135.7). 이 벡터들의 중요한 특징은 EIAV 벡터의 특징을 포함함하여 도 3에 나타나 있다.

도 3에 사용된 약어와 라벨의 설명은 다음과 같다:

CMV 인간 시토메갈로바이러스 초기 근처(human cytomegalovirusimmediate early) 프로모터/인핸서 영역SV40 원숭이 바이러스 40 인핸서 및 초기 프로모터 영역LTR 긴 말단 반복부분R LTR의 반복영역U3 LTR의 3' 독특한 서열△U3 불완전한 U3 서열U5 LTR의 5' 독특한 서열ψ 게놈 패키징 시그날tat조절 단백질rev조절 단백질RRE rev 반응 요소env외피 단백질을 코딩하는 유전자△env불완전한 캡시드 단백질 시리즈가 생성되도록 삭제부분을 포함하는 env 영역gag캡시드 단백질을 코딩하는 영역△gag불완전한 캡시드 단백질 시리즈가 생성되도록 삭제부분을 포함하는 gag 영역pol효소 단백질을 코딩하는 영역vif바이러스 감염 요인pA 폴리아데닐레이션 시그날lacZβ-갈락토시다제를 코딩하는 유전자neo네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자

EIAV 벡터의 조립은 다음과 같다.

Payne et al.(1994, J.Gen.Virol. 75:425-9)에 기술된 것에 따라 감염 프로바이러스 클론 pSPEIAV19는 시작 포인트로서 사용되었다. 플라스미드 pSPEIAV△H는 외피 단백질을 코딩하는 플라스미드 영역으로부터 HindⅢ 단편 5835-6571를 삭제하여 조립되었다. 벡터 게놈 플라스미드는 pSPEIAV19로부터 PCR로 증폭된 EIAV LTR을 pBluescript Ⅱ KS+(Stratagene)에 삽입하여 조립되었다. 그 다음 pSPEIAV△H의 MluⅠ/MluⅠ(216/814) 단편은 pONY2를 생성하기 위해 LTR/Bluescript 플라스미드로 삽입된다. 게다가, pol(1901/4949) 내에 BglⅡ/NcoⅠ 단편은 삭제되고HCMV IE 인핸서/프로모토에 의해 작동되는 핵 배치 Β-갈락토시다제 유전자는 그것의 위치에 삽입되었다. 이것을 pONY2.1nlsLacZ로 나타낸다.

gagpol 유전자를 코딩하는 EIAV 플라스미드(pONY3)는 gag-pol 단백질이 HCMV IE 인핸서/프로모터로부터 발현되도록 그 다음 pONY2△H로부터 MluⅠ/MluⅠ 단편을 포유류 발현 플라스미드 pCI-neo(Promega)에 삽입하여 만들었다.

Gag-pol 발현 벡터	lacZ-포함 벡터	바이러스 벡터 타입
pHIT60	pHT111	MLV
pGP-RRE1	pH3Z	HIV
pONY3	pONY2.1nlsLacZ	EIAV

(실시예 2)

레트로바이러스 벡터를 광견병 G 단백질로 슈도타이핑

상기 기술된(Soneokaet al1995) 세 개의 플라스미드 트랜스펙션(transfection) 방법은 슈도타이핑된 벡터들을 발생시키는데 사용되어진다. 10 ㎍의 pSA91RbG는 플라스미드를 발현하는 gag-pol과 6-웰 조직 배양 디쉬의 웰당E. coli lacZ유전자를 발현할 수 있는 레트로바이러스 벡터 각각 10 ㎍으로 코-트랜스펙트된다. VSV-G로 슈도타이핑하는 것은 10 ㎍의 pRV67을 사용함으로써 이러한 실험에 대한 양성 조절로 사용되어지는데, pRV67은 pSA91에서 인간 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터/인핸서 조절하에서 광견병 G 대신VSV-G가 발현되는 VSV-G 발현 플라스미드이다.

트랜스펙션은 벡터 비리온(virion)을 만들기 위해 인간 신장 셀 라인 293T에서 실행된다(Soneokaet al., 1995에 기술된 대로). 배양 상층액(supernatant)은 36시간 트랜스펙션 후에 얻어지며 0.45 ㎜ 구멍 크기의 필터(Millipore)로 여과된다.

생체내(in vivo) 광견병의 신경 특성과는 대조적으로, 광견병 바이러스의 실험 균주는 다양한 생체외(in vitro) 셀 라인들과 상호작용할 수 있는 것으로 알려졌다(Reagan and Wunner 1985 Arch. Virol. 84:277-282). 2개의 셀 라인, 즉 새끼 햄스터 신장 셀 라인인 BHK21 셀과 개 멜라노마 셀 라인인 D17 셀은 광견병 G로 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터에 대한 목표 세포로 평가되어진다.

세포들은 감염되기 전날 웰당 3 ×10⁵세포씩 6-웰 조직 배양 플레이트에 뿌려진다. 상기 기술된 대로 EIAV, HIV-1과 MLV 벡터를 슈도타입하기 위해 293T 세포들을 적당한 플라스미드로 감염시켜 준비한 바이러스 상층액이 이 세포들로 첨가된다. 감염을 위해 사용되는 배양 상층액 1 ㎖로 형질도입할 때 폴리브렌(8 ㎍/㎖)이 각 웰로 첨가된다. 12시간 감염 후, 배양 상층액은 신선한 메디움으로 교환된다. 바이러스 적정농도를 측정하기 위해, 48시간 감염 후 세포들을 세척, 고정하고 스테인한다.

우리는 세 개의 레트로바이러스 벡터 제조물 모두를 pSA91RbG와 pRV67로 트랜스펙션한 경우에 D17 세포의 β-갈락토시다제 양성 콜로니를 관찰할 수 있었다. pSA91RbG 또는 pRV67 없이 트랜스펙션한 경우에는 β-갈락토시다제 양성 콜로니가 없어서 외피(envelope)가 형질도입에 필요함을 나타내었다. BHK21 세포로 감염시킨 경우에 우리는 MLV 슈도타입에서만 β-갈락토시다제 양성 콜로니를 관찰할 수 있었으며 EIAV와 HIV-1 슈도타입에서는 관찰할 수 없었다. 이는 세포 타입에서 EIAV와 HIV-1에 대한 포스트-바인딩(post-binding) 블록에 기인하는 것이다. 이러한 결과는 광견병 G가 EIAV, HIV와 MLV 벡터를 슈도타이핑할 수 있음을 보여준다.

슈도타이핑의 효율은 이러한 슈도타이핑된 벡터의 바이러스 적정농도를 비교함으로써 연구된다. 바이러스 적정농도는 β-갈락토시다제 양성 콜로니의 수로부터 추정된다(표 1).

광견병 G 단백질로 레트로바이러스 벡터를 슈도타이핑할 때의 상대적인 효율

바이러스 성분	다음의 세포에 가해진 ㎖당 트랜스듀싱 입자의 수D17 BHK-21
레트로바이러스 벡터	대응 플라스미드 제조물	Gag-pol 발현 플라스미드	외피 발현 플라스미드	결과로 슈도타이핑된 벡터
1EIAV	pONY2.1nlsLacZ	pONY3	pRV67	EIAV-VSVG	8.4 ×10⁴	< 10¹
2EIAV	pONY2.1nlsLacZ	pONY3	pSA91RbG	EIAV-RbG	3.2 ×10⁴	< 10¹
3HIV	pH4Z	pGP-RRE1	pRV67	HIV-VSVG	3.0 ×10⁴	< 10¹
4HIV	pH4Z	pGP-RRE1	pSA91RbG	HIV-RbG	6.4 ×10³	< 10¹
5MLV	pHIT111	pHIT60	pRV67	MLV-VSVG	6.3 ×10⁶	4.8 ×10⁶
6MLV	pHIT111	pHIT60	pSA91RbG	MLV-RbG	1.6 ×10⁶	7.8 ×10⁶
7Mock	-	-	-	-	< 10¹	< 10¹

테스트한 양쪽 셀 라인에서 광견병 G로 슈도타이핑된 MLV 바이러스 적정농도는 VSV-G 슈도타입에서 관찰된 것에 비교할 만하다(VSV-G와 광견병 G에 대해 BHK21에서 각각 4.8 ×10⁶과 7.8 ×10⁶; VSV-G와 광견병 G에 대해 D17 세포에서 각각 6.3 ×10⁶과 1.6 ×10⁶).

D17 세포에서 VSV-G와 광견병 G로 슈도타이핑된 EIAV와 HIV-1의 경우에도 동일한 결과가 관찰되었다. VSV-G와 광견병 G로 슈도타이핑된 벡터에 대한 EIAV 바이러스 적정농도는 각각 8.4 ×10⁴과 3.2 ×10⁴이다. HIV-1의 경우에, 바이러스 적정농도는 VSV-G와 광견병 G로 슈도타이핑한 경우에 각각 3.0 ×10⁴과 6.4 ×10³이다. 이러한 결과는 광견병 G가 세 개의 레트로바이러스 벡터 모두를 슈도타이핑하는 데 있어서 VSV-G 만큼 효율적임을 보여준다.

이러한 결과는 광견병 G 단백질이 레트로바이러스 벡터 EIAV, HIV-1과 MLV 를 VSV-G 에서 얻어지는 것에 비교할 만큼 높은 적정농도로 슈도타이핑할 수 있음을 보여준다.

(실시예 3)

변경된 아미노산 333으로 광견병 G 단백질 생산과 특성화

pSA91RbG 에서 광견병 글리코프로테인 유전자의 코딩 서열은 오버랩 PCR을 이용하여 조작되어, 그 결과 단백질은 333 포지션에 아르기닌보다는 글루타메이트를 갖게 된다. 이 변화는 광견병 바이러스에서 감쇠(attenuation)와 변경된 세포 향성(tropism)을 일으키는 것으로 보고되어 졌다. 돌연변이발생(mutagenesis)에 이용되는 프라이머는 다음과 같다.

포워드 프라이머

⁵`GATGCTCACTACAAGTCAGTCCAGACTTGGAATGAGA³TCCTCCC

리버스 프라이머

⁵`GGGAGGATCTCATTCCAAGTCTGGACTGACTTGTAGT³GAGCATC

조작된 단편은SphⅠBglⅡ 단편으로써 pSA91Rg 로 재도입되어, 그 결과 플라스미드는 pSA91RM 이 된다. 이 벡터로부터 얻어진 조작된 광견병 G 단백질은 MLV 입자들을 슈도타이핑하기 위한 능력을 테스트 받는다. Soneokaet al1995에 기술된 대로 플라스미드는 pHIT60과 pHIT111과 함께 293T 세포로 감염된다 ; pSA91Rg는 양성 조절로 사용된다. 이러한 트랜스펙션으로부터의 상층액은 상기 기술된 대로 얻어지며, MLV 입자들을 슈도타이핑하기 위한 두 외피의 능력은 BHK-21 또는 쥐과 뉴로블라스토마(neuroblastoma) 셀 라인인 C-1300 클론 NA를 트랜스듀스하는 능력에 의해 과해진다(표 2).

MLV 입자들을 슈도타이핑하기 위하여 변경된 아미노산 333으로 광견병 G 단백질 능력의 특성화

바이러스 성분	다음의 세포에 가해진 ㎖당 트랜스듀싱 입자의 수BHK-21 C-1300
레트로바이러스 벡터	대응 플라스미드 제조물	Gag-pol 발현 플라스미드	외피 발현 플라스미드	결과로 슈도타이핑된 벡터
1MLV	pHIT111	pHIT60	pSA91RbG	MLV-RbG	4.2 ×10⁶	6.1 ×10⁶
2MLV	pHIT111	pHIT60	pSA91RM	MLV-RMG	3.1 ×10⁵	7.2 ×10⁶
3Mock	-	-	-	-	< 1	< 1

광견병 백신을 만들기 위해 일반적으로 사용되는 셀 라인인 BHK-21 세포에서 얻어진 적정농도가 조작된 광견병 G 단백질보다 낮지만, C-1300 세포에서는 두 외피에 대해 비교할 만한 적정농도가 얻어진다. 이러한 결과는 조작된 단백질이 MLV 입자들을 효율적으로 슈도타이핑할 수 있음을 보여준다.

(실시예 4)

광견병 G 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터의 적정농도의 활용

3-플라스미드 트랜스펙션 시스템에 첨가된 pSA91RbG DNA 의 양은 최적의 바이러스 적정농도를 결정하기 위해 다른 두 성분에 대하여 적정된다.

이 실험에서, COS-1 세포는 pSA91RbG, pHIT111과 pHIT60 플라스미드와의 CaPO₄침전을 이용하여 트랜스펙트된다. 뒤의 두 플라스미드는 동일한 양으로 사용되며(35 ㎜ 조직 배양 디쉬당 트랜스펙션당 8 ㎍) pSA91RbG의 양은 연속적으로 감소한다. 트랜스펙션으로부터의 상층액은 36시간 트랜스펙션 후 얻어지며 존재하는 형질도입 입자의 수는 HT1080 세포에서 결정된다. 결과는 도 4에서 보여진다. 다른 플라스미드에 비교하여 pSA91RbG DNA의 양이 8배 감소함은 가장 높은 적정농도를 만들어낸다. 전체적인 적정농도는 실시예 1의 293T 세포에서 얻어진 것보다 낮다.

EIAV에 기초한 벡터를 만들기 위해 필요한 두 성분에 대한 pSA91RbG의 적정 또한 이루어진다. 이 경우에, 293T 세포는 gag/pol(pONY3)을 코딩하는 플라스미드 8 ㎍과 β-갈락토시다제(pONY2.1lnlacZ)를 코딩하는 EIAV 벡터를 발현하는 플라스미드 8 ㎍과의 CaPO₄침전을 이용하여 트랜스펙트된다. 상기와 같이 광견병 G 또는 VSV-G로 각각 슈도타이핑된 벡터를 제공하기 위해 다양한 양의 pSA91RbG 또는 pRV67이 첨가된다. 트랜스펙션으로부터의 상층액은 36시간 트랜스펙션 후 얻어지며 존재하는 형질도입 입자의 수는 D17 세포에서 결정된다. 결과는 도 5에서 보여진다. 다른 플라스미드에 비교하여 pSA91RbG DNA의 양이 2배에서 4배 감소함은 가장 높은 적정농도를 만들어낸다. pRV67이 다른 두 플라스미드에 같은 양 사용되면 적정농도에서 중요한 감소는 관찰되지 않았다.

이러한 결과는 광견병 G와 생산 세포에서 발현된 다른 벡터 성분의 상대적인양을 조절함으로써 광견병 G 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터의 향상된 적정농도가 얻어질 수 있음을 보여준다.

(실시예 5)

광견병 G 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터의 농도

우리는 초원심분리로 VSV-G 슈도타이핑된 MLV 기초 벡터와 ㎖당 10⁹형질도입 입자의 바이러스 적정농도로 얻어진 바이러스 상층액을 초원심분리(Burnset al., 1993 PNAS 90:8033-8037)를 이용하여 농축함으로써 바이러스 적정농도를 증가시킬 수 있는지를 연구하였다.

상기 기술된(Soneokaet al., 1995) 세 개의 플라스미드 트랜스펙션(transfection) 방법은 광견병 G 또는 VSV-G로 슈도타이핑된 입자들을 발생시키는데 사용되어진다. 초원심분리로 농축되고 D17 세포에서 적정된 형질도입 입자들은 36시간 트랜스펙션 후 얻어진다. 48시간 후 이 세포들은 β-갈락토시다제에 스테인된다. 적정농도는 세 개의 독립적인 실험으로부터 평균으로 얻어지며 ㎖당 β-갈락토시다제 생산 단위로 계산된다. 실험간 10% 편차만 있었다. 두 외피 중의 하나로 슈도타이핑한 EIAV와 MLV 입자들에 대해 형질도입 입자의 상당한 손실로 수득물의 부피를 130배 감소시키는 것이 가능함이 증명되었다(표 3).

광견병 G 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터에서 농도의 영향

바이러스 성분	농축전 적정농도	농축후 적정농도	부피 감소비	적정농도 증가비	회수율(%)
레트로바이러스 벡터	대응 플라스미드 제조물	Gag-pol 발현 플라스미드	외피 발현 플라스미드	결과로 슈도타이핑된 벡터
EIAV	pONY2.1nlsLacZ	pONY3	pRV67	EIAV-VSVG	2.0 ×10⁵	2.5 ×10⁷	130	125	96
EIAV	pONY2.1nlsLacZ	pONY3	pSA91RbG	EIAV-RbG	1.0 ×10⁵	1.2 ×10⁷	130	120	96
EIAV	pONY2.1nlsLacZ	pONY3	Mock		< 1	< 1	130	N.A.	N.A.
MLV	pHIT111	pHIT60	pRV67	MLV-VSVG	4.0 ×10⁵	4.8 ×10⁷	130	119	92
MLV	pHIT111	pHIT60	pSA91RbG	MLV-RbG	3.5 ×10⁵	4.5 ×10⁷	130	128	98
MLV	pHIT111	pHIT60	Mock		< 1	< 1	130	N.A.	N.A.

이러한 결과는 광견병 G로 슈도타이핑된 벡터가 VSV-G에서 관찰된 것에 비교할 만한 벡터 적정농도로 증가시키면서 초원심분리로 농축될 수 있음을 보여준다.

신경 세포에 대한 광견병 G의 생체내 특성과 함께 이러한 성질은 광견병 G로 슈도타이핑하는 것이 어떠한 치료 유전자를 신경 시스템으로 옮기는 레트로바이러스 벡터의 쉬운 타겟팅에 흥미로운 제안을 되게 한다.

(실시예 6)

배양된 인간 타겟 세포를 형지도입하기 위한 광견병 G 슈도타입의 능력 선택도

광견병 G로 슈도타이핑된 벡터의 세포 특성은 신경과 비-신경 오리진의 인간 셀 라인을 이용하여 결정된다. VSV-G로 슈도타이핑하는 것은 양성 조절로 이용된다. 세 개의 플라스미드 트랜스펙션으로부터 준비된 바이러스 상층액은 인간 뉴로블라스토마 셀 라인인 IMR-32와 인간 T 셀 라인인 CEM-A를 감염하는데 사용된다. 바이러스 적정농도는 β-갈락토시다제 양성 조절로부터 계산된다(표 4).

배양된 인간 목표 세포를 형질도입하기 위한 광견병 슈도타입의 능력 선택도

바이러스 성분	다음의 세포에 가해진 ㎖당 형질도입 입자의 수IMR32 CEM-A
레트로바이러스 벡터	대응 플라스미드 제조물	Gag-pol 발현 플라스미드	외피 발현 플라스미드	결과로 슈도타이핑된 벡터
1MLV	pHIT111	pHIT60	pRV67	MLV-VSVG	4.9 ×10³	7.3 ×10²
2MLV	pHIT111	pHIT60	pSA91RbG	MLV-RbG	3.1 ×10⁵	1.7 ×10¹
3Mock	-	-	-	-	0	0

광견병 G와 VSV-G로 슈도타이핑된 MLV 벡터는 IMR-32 세포를 감염시킬 수 있다. 그러나 광견병 G로 슈도타이핑된 MLV 벡터는 VSV-G로 슈도타이핑된 것(4.9 ×10³)보다 100배 높은 적정농도(3.1 ×10⁵)를 갖는다. CEM-A 세포에서, 광견병 G로 슈도타이핑된 MLV 벡터는 1.7 ×10¹의 낮은 농도를 나타내었다. 이 낮은 효율은 이러한 세포를 형질도입하는 MLV의 무능력함에 기인하는 것이 아니다. 이는 VSV-G(7.3 ×10²)로 슈도타이핑 하였을 때 동일한 벡터에 대한 더 높은 적정농도로 명백해진다.

우리의 결과는 VSV-G와 달리 광견병 G 슈도타입이 인간 타겟 세포를 형질도입하는 능력에 있어서 T-셀 라인에서보다 신경 세포에서 더 높은 형질도입 효율을 갖는 선택도를 보임을 증명해 준다.

(실시예 7)

두뇌 세포를 생체외(일차 배양)와 생체내(랫/마우스 모델 시스템)로 형질도입하는 광견병 G 슈도타입의 능력

적어도 다른 두 개의 리셉터가 생체내(Hanhamet al., 1993 J. Virol. 67:530-542 ; Tuffereauet al., J. Virol. 72:1085-1091) 광견병 바이러스에 의해 이용된다는 증거가 있는데, 그중 하나는 니코티닉 아세틸콜린 수용체일 것이다. 감염된 신경 세포의 타입과 신경 시스템을 통한 바이러스의 확산에 대한 상세한 연구는 마우스 모델 시스템에서 wt 광견병(CVS 스트레인)와 이 스트레인(아미노산 330과 333에서 변경된)의 더블 돌연변이체로 행해졌다(Coulonet al., 1989 J.Virol. 63:3550-3554 ; Lafayet al., 1991 Virology 183:320-330). 이러한 연구는 돌연변이된 바이러스의 확산과 범위가 주로 wt에 비교하여 한정된다는 것을 보여준다.

광견병 G 단백질로 슈도타이핑된 EIAV 벡터의 향성(tropism)을 결정하기 위하여, 다음 분석들을 하였다. 성장한 암컷 AO 랫은 마취되고 선조체(striatum) 또는 다른 두뇌 영역에 2 ×1 ㎕의 바이러스 스톡이 스테레오택시컬하게(stereotaxically) 주입된다. 주입 후 7 또는 30일에 랫은 마취되고 4% 파라포름알데하이드로 인트라카디얼하게(intracardially) 살포된다. 뇌를 제거하고 24시간동안 고정하고 30% 수크로즈에 젖게 하고 냉동 저온유지장치(50 ㎛)에 조각을 만들어둔다. 조각들을 3시간에서 밤새도록 X-gal 용액으로 스테인하고, 유리 슬라이드에 올려서 광선 현미경으로 분석한다. 형질도입된 특이 세포 타입의 확인은 종-특이(species-specific) 이차 항체와 결합하여 신경(NeuN 또는 다른 것), 애스트로사이트(GFAP) 또는 올리고덴드로사이트(GalC)와 β-갈락토시다제에 특이한 항체를 이용하여 임뮤노플루오레선스(immunofluorescence) 트리플 라벨링으로 행한다. 트랜스듀스된 두뇌 영역 이매징은 공초점(confocal) 현미경 사용으로 분석한다.

생체외 형질도입 실험에서, 일차 신경은 랫 태아(embryo)로부터 배양되고 완전히 분화할 때까지 성장한다. 바이러스 벡터는 4 ㎍/㎖의 폴리브렌을 이용하여5시간 동안 첨가된다. 배지를 바꾸고 2일 후에 X-gal 스테이닝 또는 항체를 이용하여 발현 분석을 한다.

(실시예 8)

광견병 G 슈도타이핑된 HIV-1 벡터의 농축과 그러한 벡터를 만들기 위한 VSV-G와 광견병 외피 사용간의 비교

실시예 5는 광견병-G로 슈도타이핑된 EIAV 벡터가 VSV-G 슈도타이핑된 벡터에서 보고된 대로 초원심분리에 의해 효율적으로 농축될 수 있음을 증명해 준다. 우리는 광견병 G가 HIV-1 벡터를 슈도타이핑하는데 사용될 수 있고, 이러한 입자들이 초원심분리로 효율적으로 농축될 수 있고, D17 세포에서 얻어진 적정농도가 VSV-G 슈도타이핑된 벡터로 얻어진 것과 같음을 보이기 위해 이러한 관찰을 확대하였다.

상기 기술된(Soneokaet al., 1995) 세 개의 플라스미드 트랜스펙션(transfection) 방법은 광견병 G 또는 VSV-G로 슈도타이핑된 입자들을 발생시키는데 사용되어진다. 이 실험에서 사용된 HIV-1 플라스미드, pH4Z와 pGP-RRE3은 Kimet al.(1998 Journal of Virology 72:811-816)에서 기술되었다. 이 실험에서 사용된 성분의 비는 광견병 G의 경우 gag/pol:게놈:외피가 1:1:1이며, VSV-G의 경우 gag/pol:게놈:외피가 1:1:1인데, 이는 293T 세포가 COS 세포보다 광견병 G 단백질의 발현에 더 저항성이 있어서 COS 1 세포에 사용된 비를 변화시킨 것이다. 형질도입 입자들을 감염 48시간 후에 얻어 초원심분리로 농축하고 D17 세포에서 적정하였다. 48시간 후에 이 세포들을 β-갈락토시다제에 스테인하였다. 두 외피 중의 하나로 슈도타이핑된 HIV-1 입자들로 수득물의 적정농도를 약 100배 증가시키는 것이 가능함이 증명되었다(표 5). 외피 중의 하나로 슈도타이핑된 벡터에서 얻어진 적정농도는 중요할 만큼 다르지 않다. 이러한 결과는 광견병 G로 슈도타이핑된 벡터가 VSV-G에서 관찰된 것에 비교할 만한 벡터 적정농도로 증가시키면서 초원심분리로 농축될 수 있고 두 외피가 D17 세포에서 동일하게 유효함을 보여준다.

제조	0.5 ㎖당 LacZ 콜로니 형성 유니트	㎖당 평균 적정농도
농축전 광견병 슈도타이핑된 HIV-1	3.4 ×10⁵	4.1 ×10⁵		7.5 ×10⁶
농축후 광견병 슈도타이핑된 HIV-1	3.5 ×10⁸	3.3 ×10⁸	3.6 ×10⁸	6.9 ×10⁸
농축전 VSV-G 슈도타이핑된 HIV-1	3.7 ×10⁶	4.0 ×10⁶		7.7 ×10⁶
농축후 VSV-G 슈도타이핑된 HIV-1	4.8 ×10⁸	4.6 ×10⁸	3.9 ×10⁸	8.9 ×10⁸

토론 및 요약

상기에 지적한 대로, 레트로바이러스와 그로부터 얻어진 벡터는 목표 세포를 효율적으로 형질도입하기 위해 특이한 외피 단백질을 필요로 한다. 외피 단백질은 바이러스 또는 벡터를 생산하는 세포에서 발현되어 바이러스 또는 벡터 입자로 섞이게 된다. 레트로바이러스 입자는 바이러스 RNA를 싸고 있는gag유전자로부터 얻어진 프로테이너셔스 코어(proteinaceous core)로 구성된다. 코어는 바이러스env유전자로부터 얻어진 외피 단백질을 포함하는 세포 멤브레인의 일부분으로 싸인다. 외피 단백질은 전구체(precursor)로 만들어지며, 둘 또는 세 개의 유닛으로 진행된다. 이들은 외피에 완전히 외부인 표면 단백질(SU), SU와 상호작용하고 멤브레인 스패닝 영역을 포함하는 트랜스멤브레인 단백질(TM)과 세포질 테일(cytoplasmic tail)이다(Coffin 1992 In The Retroviridae, Pleum Press, ed Levy). 어떤 레트로바이러스에서는, 작은 펩타이드가 TM으로부터 제거된다. 목표 세포 표면에 결합하고 바이러스 엔트리를 매개할 수 있는 효율적인 외피 단백질로 작용하기 위해서 외피 단백질은 타겟 세포에서 적절한 수용체와 정확하게 상호작용해야 하는데, 생산적인 감염이 일어나도록 세포의 정확한 구획에 게놈을 전달하기 위한 적절한 방법으로 바이러스 입자의 인터날리세이션(internalisation)이 되도록 한다.

하나의 바이러스로부터 얻어진 외피를 다른 바이러스를 패키지하는데 이용하기 위한 많은 시도가 있었는데, 이를 슈도타이핑이라 한다. 슈도타이핑의 효율은 고도로 변화하며 외피의 세포질 테일과 바이러스 입자의 코어 단백질간의 상호작용에 의해 영향을 받도록 나타난다. 외피 단백질이 버딩(budding) 비리온으로 회복되는 과정은 대부분의 세포 단백질이 레트로바이러스 입자로부터 제외되기 때문에그 과정이 선택적이라고 알려져 있고(Hunter 1994 Semin. Virol. 5:71-83) 외피 단백질이 없으면 버딩이 일어나는 어떤 레트로바이러스에서 기록되어 왔지만(Einfeld 1996 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 214:133-176 ; Krausslich and Welker 1996 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 214:25-63) 잘 이해가 되지 않는다. 외피 단백질의 세포질 영역과 어떤 레트로바이러스에서의 바이러스 코어간의 정확한 분자 상호작용에 대한 증거가 있다. Januszeskiet al(1997 J. Virol. 71:3613-3619)은 쥐과 백혈병 바이러스(MLV) 외피 단백질의 세포질 테일에서의 마이너 삭제 또는 치환이 외피 단백질의 바이러스 입자로의 통합에 강하게 방해한다는 것을 보여 주었다. HIV-1의 경우에, Cosson(1996 EMBO J. 15:5783-5788)은 HIV-1의 매트릭스 단백질과 그 외피 단백질의 세포질 영역간의 직접적인 상호작용을 보여 주었다. 매트릭스와 외피 단백질간의 상호작용은 외피 단백질의 버딩 HIV-1 비리온으로의 통합에 중요한 역할을 한다. 이는 비스나(visna) 바이러스 gag 폴리단백질의 매트릭스 영역의 아미노 터미널이 동등한 HIV-1 매트릭스 영역에 의해 대체될 때 비스나 바이러스가 HIV-1 env로만 효율적으로 슈도타이핑될 수 있다는 사실로부터 알 수 있다(Dorfmanet al., 1994 J. Virol. 68:1689-1696). 그러나 HIV-1 Env의 절단이 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스의 효율적인 슈도타이핑에 필요하므로(Mammanoet al., 1997 J. Virol. 71:3341-3345) 상황은 복잡하며, 반면에 인간 포미(foamy) 바이러스 외피 단백질의 절단은 쥐과 백혈병 바이러스를 슈도타이핑하는 능력을 감소시킨다(Lindemannet al., 1997 J. Virol. 71:4815-4820). 레트로바이러스의 코어와 그 외피 단백질의 세포질 테일간의 상호작용에 환경적인 요소가 있다. 어떤 셀 라인에서 EIAV의 연장된 이동은 외피 단백질의 C-터미널 영역에 기초하여 호스트 세포 인자가 바이러스에 대해 선택할 수 있음을 제안하는 당단백질의 절단을 가져온다(Riceet al., 1990 J. Virol. 1990 64:3770-3778).

이러한 결과는 밀접하게 관련된 레트로바이러스조차 서로 슈도타이핑할 수 있다고 예측하는 것이 가능하지 않다는 것을 가리킨다. 또한, 주어진 외피가 특별한 바이러스를 슈도타이핑하지 못한다면 슈도타이핑하는 능력을 주는 분자 변화를 예측하는 것이 가능하지 않다. 슈도타이핑은 성공적이지만, 바이러스 성분과 이종의 외피 단백질간의 양립성(compatibility) 필요에 의해 억제된다.

레트로바이러스 벡터의 조립에서, 유전 물질의 확장된 또는 변경된 세포 타입의 범위로의 전달이 가능하도록 원래의 바이러스에 대해 다른 목표 세포 특이성을 지닌 벡터를 조작하는 것이 바람직하다. 이것을 이루는 한가지 방법은 그 특이성을 변경하도록 바이러스 외피 단백질을 조작하는 것이다. 또 다른 방법은 바이러스의 원래 외피 단백질을 치환하거나 첨가하기 위해 이종의 외피 단백질을 벡터로 도입하는 것이다.

MLV 외피 단백질은 많은 다른 레트로바이러스들을 슈도타이핑할 수 있다. 암포트로픽(amphotropic) 바이러스로부터의 MLV 외피 단백질은 인간 세포를 포함하여 넓은 범위의 세포 타입의 형질도입을 허용한다. 그러나, 많은 수의 세포 타입을 감염시키는 레트로바이러스 벡터를 갖는 것이 항상 바람직한 것은 아니다.

소포 스토마티스 바이러스(VSV)의 외피 글리코프로테인(G), 라브도바이러스(rhabdovirus)는 어떤 레트로바이러스를 슈도타이핑할 수 있는 것으로 알려진 또다른 외피 단백질이다. 레트로바이러스 MLV는 성공적으로 슈도타이핑되어(Burnset al1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-7) 원래 형태에서 MLV와 비교되는 변경된 호스트 범위를 갖는 벡터를 가져온다. VSV-G 슈도타이핑된 벡터는 포유류 세포 뿐만 아니라 어류, 파충류와 곤충의 셀 라인도 감염시킬 수 있는 것으로 알려졌다(Burnset al1993). VSV-G 단백질은 그의 세포질 테일이 레트로바이러스 코어와 상호작용할수 있기 때문에 어떤 레트로바이러스를 슈도타이핑하는데 사용될 수 있다. VSV-G와 MLV 외피 단백질은 둘다 28에서 30, 그리고 32 아미노산의 짧은 세포질 테일을 가지고 있으며, 동일한 길이를 갖는다.

VSV-G 단백질과 같은 넌-레트로바이러스 슈도타이핑 외피의 공급은 벡터 입자가 감염도의 손실없이 높은 적정농도로 농축될 수 있는 이점을 준다(Akkinaet al1996 J. Virol. 70:2581-5). 레트로바이러스 외피 단백질은 두 개의 비공유결합된 서브유닛으로 이루어져 있어 초원심분리동안 전단력을 견디지 못한다. 서브유닛간의 상호작용은 원심분리로 망가질 것이다. VSV와 비교해 볼 때 당단백질은 싱글 유닛으로 구성된다.

따라서 VSV-G 단백질 슈도타이핑은 잠재적인 이점을 제공할 수 있다. 그러나, VSV-G 단백질을 사용하여 얻어진 것보다 목표 세포 특이성이 바람직하다. 목표 사이트를 단백질로 조작함으로써 VSV-G의 목표 세포 범위를 변경하려는 시도가 있었다. 치료 유전자 전달을 위한 벡터 타겟팅 전략(Cold Spring Harbor, USA)에 대한 1997 회의에서 보고된 이러한 시도(Chenet al.)는 성공적이지 못했다. 따라서 레트로바이러스 벡터 목표 세포 범위를 변경하는 다른 방법이 필요하다.

레트로바이러스를 다른 라브도바이러스 외피로 효율적으로 슈도타이핑하려는 시도가 있었다. 치료 유전자 전달을 위한 벡터 타겟팅 전략(Cold Spring Harbor, USA)에 대한 1997 회의에서 싱글 리포트(Reiseret al.)는 광견병 바이러스와 모콜라(Mokola) 바이러스의 당단백질이 HIV-1 입자들을 슈도타이핑할 수 있으나 "얻어진 적정농도는 VSV G 단백질로 얻어진 것보다 매우 낮다" 라고 주장했다.

본 발명은 광견병 단백질, 특별히 광견병 G 단백질로 표현된(phenotyped) 레트로바이러스 전달 시스템을 제공함으로써 이러한 문제를 극복하고자 하였다.

상기 명세서내에 언급된 모든 간행물들은 참고문헌에 의해 여기에 포함된다. 본 발명의 기술된 방법과 시스템의 다양한 변경과 변형은 발명의 범위와 정신으로부터 벗어남이 없이 이 분야의 당업자에게는 명확할 것이다. 발명이 특정 바람직한 실시태양에 관련하여 기술되었을 지라도, 청구된 발명은 그러한 특정 실시태양을 부당하게 한정하는 것은 아니다. 실제로, 분자 생물학 또는 관련된 분야의 당업자가 명백하게 발명을 수행하기 위한 기술된 방법의 다양한 변형은 다음의 청구항 범위내에 있을 것이다.

Claims

외피 단백질의 적어도 일부를 코딩하는 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 및 레트로바이러스 전달 시스템에 의해 목표 사이트의 형질도입을 확실하게 하는 레트로바이러스로부터 유래된 하나 또는 그 이상의 다른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 레트로바이러스 전달 시스템으로 목표 사이트에 형질도입 시킬 수 있는 레트로바이러스 전달 시스템에 있어서, 상기 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 다른 뉴클레오타이드 서열의 적어도 하나에 대해 이형(heterologous)이고; 목표 사이트를 인식할 수 있는 광견병 G 단백질 또는 돌연변이체, 변이체, 유도체 또는 그들의 단편의 일부를 코딩함을 특징으로 하는 레트로바이러스 전달 시스템
제 1항에 있어서, 상기 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 광견병 G 단백질 또는 돌연변이체, 변이체, 유도체 또는 그들의 단편의 모두를 코딩함을 특징으로 하는 레트로바이러스 전달 시스템
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 다른 뉴클레오타이드 서열의 적어도 하나는 렌티바이러스 또는 온코레트로바이러스(oncoretrovirus)로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 레트로바이러스 전달 시스템
상기 청구항의 어느 하나에 있어서, 상기 다른 뉴클레오타이드 서열은 렌티바이러스 또는 온코레트로바이러스(oncoretrovirus)로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 레트로바이러스 전달 시스템
상기 청구항의 어느 하나에 있어서, 상기 다른 뉴클레오타이드 서열은 MLV, HIV 또는 EIAV로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 레트로바이러스 전달 시스템
상기 청구항의 어느 하나에 있어서, 상기 레트로바이러스 전달 시스템은 적어도 하나의 NOI를 포함함을 특징으로 하는 레트로바이러스 전달 시스템
제 6항에 있어서, 상기 NOI는 치료효과를 지니거나 치료효과를 지니는 단백질을 코딩함을 특징으로 하는 레트로바이러스 전달 시스템
상기 청구항의 어느 하나에 있어서, 상기 목표 사이트는 셀임을 특징으로 하는 레트로바이러스 전달 시스템
상기 청구항의 어느 하나에 따른 레트로바이러스 전달 시스템으로부터 유래된 바이러스 입자
제 1항 내지 제 8항의 어느 한항에 따른 레트로바이러스 전달 시스템이거나 그것으로부터 유래된 레트로바이러스 벡터
제 1항 내지 제 8항의 어느 하나에 따른 레트로바이러스 전달 시스템 또는 제 9항에 따른 바이러스 입자 또는 제 10항에 따른 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 셀
의약품으로 사용하기 위한 제 1항 내지 제 8항의 어느 하나에 따른 레트로바이러스 전달 시스템 또는 제 9항에 따른 바이러스 입자 또는 제 10항에 따른 레트로바이러스 벡터
같은 필요에서 NOI를 목표 사이트로 전달시키기 위한 약제학적 조성의 제조에서 제 1항 내지 제 8항의 어느 하나에 따른 레트로바이러스 전달 시스템 또는 제 9항에 따른 바이러스 입자 또는 제 10항에 따른 레트로바이러스 벡터의 사용
제 1항 내지 제 8항의 어느 하나에 따른 레트로바이러스 전달 시스템 또는 제 9항에 따른 바이러스 입자 또는 제 10항에 따른 레트로바이러스 벡터에 셀을 접촉시킴으로 구성된 방법
제 1항 내지 제 8항의 어느 하나에 따른 레트로바이러스 전달 시스템 또는 제 9항에 따른 바이러스 입자 또는 제 10항에 따른 레트로바이러스 벡터를 제조하기 위한 벡터에 있어서, 상기 벡터는 광견병 G 단백질 또는 돌연변이체, 변이체, 유도체 또는 그들의 단편의 일부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함함을 특징으로 하는 벡터
제 1항 내지 제 8항의 어느 하나에 따른 레트로바이러스 전달 시스템 또는 제 9항에 따른 바이러스 입자 또는 제 10항에 따른 레트로바이러스 벡터를 제조하기 위한 플라스미드에 있어서, 상기 플라스미드는 광견병 G 단백질 또는 돌연변이체, 변이체, 유도체 또는 그들의 단편의 일부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함함을 특징으로 하는 플라스미드
적어도 하나의 플라스미드는 제 16항에 따른 플라스미드이고 적어도 다른 하나의 플라스미드는 레트로바이러스로부터 유래된 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함함을 특징으로 하는 다수의 플라스미드
레트로바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 입자의 감염 프로파일에 영향을 주기 위해 레트로바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 입자를 슈도타이핑하는 광견병 G 단백질의 사용
레트로바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 입자의 호스트 범위 및/또는 셀 향성(tropism)에 영향을 주기 위해 레트로바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 입자를 슈도타이핑하는 광견병 G 단백질의 사용
광견병 G 단백질로 슈도타이핑된 레트로바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 입자
광견병 G 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 적어도 일부를 포함하는 이형의 env 영역으로 구성된 레트로바이러스 전달 시스템
광견병 G 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이형의 env 영역으로 구성된 레트로바이러스 전달 시스템
실질적으로 여기에 기재된 것과 같이 슈도타이핑된 레트로바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 입자