KR20010071552A - Method and device for imaging and analysis of biopolymer arrays - Google Patents

Abstract

전체 내부 반사 형광이 바이오폴리머 어레이의 영상화에 이용된다. 광의 빔(2)은 소정의 각도로 고체 지지체(1)내에 가이드되어, 고체 지지체에서 전체 내부 반사를 일으킨다. 광의 소정의 부분은 유리 표면으로부터 반사되지 않고 미미한 파로서 유리로부터 통과해버린다. 그것은 지지체의 표면에 인접하게 부착되어 바이오폴리머 분자들에 결합된 플루오르포르를 여기시킨다. 따라서 여기된 형광은 감광성 소자(7)에 가이드되어, 지지체의 표면에 부착된 형광 분자들에 대한 데이터를 제공한다. 형광 신호의 검출은 신속하여서 형광 채널당 약 10초가 소요된다.Total internal reflection fluorescence is used for imaging of the biopolymer array. The beam of light 2 is guided into the solid support 1 at an angle, causing full internal reflection in the solid support. Certain portions of light pass from the glass as slight waves without being reflected from the glass surface. It is attached adjacent the surface of the support to excite the fluorine bound to the biopolymer molecules. The excited fluorescence is thus guided to the photosensitive element 7 to provide data for fluorescent molecules attached to the surface of the support. Detection of the fluorescence signal is rapid and takes about 10 seconds per fluorescence channel.

Description

바이오폴리머 어레이의 영상화 및 분석을 위한 방법과 장치{Method and device for imaging and analysis of biopolymer arrays}Method and device for imaging and analysis of biopolymer arrays

2차원 구조에서 고체 투명 지지물(유리) 상에 미리 제조된 짧은 바이오폴리머들(핵산, 펩타이드 등)의 화학적 결합에 있어, 상기 어레이 구조는 예컨대 결합된 뉴클리오타이드 폴리머들의 어레이에 샘플 타겟 핵산을 부가(하이브리다이징)하는 경우에 진단용으로 이용될 수 있다. 타겟 샘플은 하이브리다이제이션 이전에 플루오로포르(fluorophore)로 라벨될 수 있지만, 그 라벨의 결합은 스캐닝 직전에 일어날 수 있다. 핵산 어레이를 영상화하고 분석하기 위하여, 주로 두 개의 카테고리들, 즉 첫째로는 검출기들, 그리고 둘째로는 초점 공유 현미경 사용에 기초하고 있는 스캐너들인 상이한 물리적 원리들에 기초한 장치들이 사용도리 수도 있다.For chemical bonding of short biopolymers (nucleic acid, peptide, etc.) prefabricated on a solid transparent support (glass) in a two-dimensional structure, the array structure adds sample target nucleic acid to, for example, an array of bound nucleotide polymers. It can be used for diagnosis in the case of (hybridizing). The target sample may be labeled with a fluorophore prior to hybridization, but binding of that label may occur just before scanning. In order to image and analyze nucleic acid arrays, devices based on different physical principles may be used, primarily scanners based on two categories, firstly detectors, and secondly using a focal sharing microscope.

본 발명에서 기술되는 장치에 가장 근접한 모델, 즉 전체 내부 반사에 기초한 형광 검출기는 Vysis사(미합중국, 일리노이스, 다우너즈 그로브 소재)가 제조하는 GenoSensor^TM이라 칭하여지는 CCD 카메라에 기초한 기구이다.The model closest to the device described in the present invention, the fluorescence detector based on total internal reflection, is an instrument based on a CCD camera called GenoSensor ^™ manufactured by Vysis (Downers Grove, Illinois, USA).

CCD 카메라 기반의 기구 GenoSensor^TM은 다음과 같이 기능한다. 유리 지지체상에 결합된 DNA 프로브들에 하이브리다이즈된, 형광적으로 라벨된 타겟 분자들은 DNA 어레이(도 1)를 가로지르는 광에 의한 여기에 이어 검출된다. 그 광은 크세논 전구에 의해 발생되고 필요한 스펙트럼 밴드를 위해 선택하도록 필터를 통고하게 된다. 플루오르포르에 의해 발광된 광은 발광 필터를 통해 필터되고 광학 시스템을 통해 고해상도 쿨형 CCD 카메라상에 가이드된다. 얻어진 신호들은 컴퓨터에서 처리된다.The GenoSensor ^TM instrument, based on a CCD camera, functions as follows: Fluorescently labeled target molecules hybridized to DNA probes bound on the glass support are detected following excitation by light across the DNA array (FIG. 1). The light is generated by the xenon bulb and passed through the filter to select for the required spectral band. Light emitted by fluorine is filtered through a luminescent filter and guided on a high resolution cool CCD camera through an optical system. The signals obtained are processed in a computer.

핵산 어레이는 고체 투명 지지체에 결합된 핵산 분자들의 고밀도 2차원 구조이다. 어레이 상에서 이루어진 생물학적 반응의 결과를 분석하는 것은 낮은 감도 및 선택도(플루오르크롬의 여기를 위해 광을 가로지르게 하는 것을 이용하는 것은 여기를 위한 밴드가 완전 스펙트럼으로부터 필터되어야 하기 때문에 불충분하다)와 검출 속도(스캐닝은 통상 시간 소모적이다)로 인해 문제가 된다. APEX(arrayed extension reaction)의 경우에서와 같이, 다른 플루오로포르를 각각 운반하는 4개의 다른 다이디옥시뉴클리오타이드 또는 터미네이터들은 반응에 있어 동시적으로 이용되고, 4개의 스펙트럼 영역에서 기능하는 검출기는 핵산 어레이를 영상화하는데 요구된다. 상기 검출기는 합성 반응 결과의 어셈블리를 가능하게 하는 각 플루오로포르의 최대 여기 및 신호 포획을 행할 수 있을 것이다.The nucleic acid array is a high density two dimensional structure of nucleic acid molecules bound to a solid transparent support. Analyzing the results of biological reactions made on an array requires low sensitivity and selectivity (using cross light for excitation of fluorochromes is insufficient because the band for excitation must be filtered from the full spectrum) and detection rate ( Scanning is usually time consuming). As in the case of an AREX (arrayed extension reaction), four different didioxynucleotides or terminators, each carrying a different fluorophore, are used simultaneously in the reaction and a detector functioning in the four spectral regions Required to image nucleic acid arrays. The detector will be able to perform maximum excitation and signal capture of each fluorophore which allows assembly of the synthesis reaction results.

본 발명은 분자 생물학, 분자 진단학, 및 레이저 광학의 분야에 속하는 것이다. 본 발명은 보다 구체적으로는 전체 내부 반사 형광을 이용하여 2차원 어레이 상의 형광적으로 라벨된 바이오폴리머 분자들의 병렬 검출 및 분석의 방법과, 형광 검출을 위한 장치에 관한 것이다.The present invention belongs to the field of molecular biology, molecular diagnostics, and laser optics. More particularly, the present invention relates to a method for parallel detection and analysis of fluorescently labeled biopolymer molecules on a two dimensional array using total internal reflection fluorescence, and to an apparatus for fluorescence detection.

도 1은 가로지르는 광에 의해 바이오폴리머 어레이의 표면상의 플루오르크롬의 여기를 도시한 도면.1 shows excitation of fluorochromes on the surface of a biopolymer array by light traversing.

도 2는 본 발명의 방법에 따르는 전체 내부 반사 형광에 의한 상기 여기를 도시하는 도면.2 shows the excitation by total internal reflection fluorescence according to the method of the invention.

도 3은 전체 내부 반사를 일으키기 위한 레이저 빔이 지지체의 두께보다 적은 직경을 갖는 원통형 렌즈를 통해 초점이 맞춰지는 본 발명의 방법의 응용예를 도시한 도면.3 shows an application of the method of the invention in which the laser beam for producing total internal reflection is focused through a cylindrical lens having a diameter less than the thickness of the support.

도 4는 프리즘을 사용하여 지지체 내로 레이저 빔이 향하도록 하는 본 발명의 방법의 응용으로서, 프리즘 및 지지체의 굴절율과 근사한 굴절율을 갖는 투명 액체가 프리즘 및 지지체 사이에 존재하는 것을 도시한 도면.FIG. 4 shows the application of the method of the present invention to direct a laser beam into a support using a prism, in which a transparent liquid having a refractive index close to that of the prism and the support is present between the prism and the support.

도 5는 본 발명의 장치인 형광 검출기의 원리적인 설계를 도시하는 도면.Fig. 5 shows the principle design of the fluorescence detector which is the device of the present invention.

상술한 문제점들에 대한 해결책으로서, 본 발명은 바이오폴리머 어레이들(타겟 DNA의 시퀀스들을 결정하는 것과 유사)을 영상화하기 위해 전체 내부 반사 형광(도 2)을 포함하는 방법, 및 4개의 다른 스펙트럼 밴드에서 핵산 어레이에 대한 반응 결과의 신속하고 정확한 추정을 가능하게 하는 형광 검출기의 장치를 제안한다.As a solution to the above-mentioned problems, the present invention provides a method comprising total internal reflection fluorescence (FIG. 2) for imaging biopolymer arrays (similar to determining sequences of target DNA), and four different spectral bands. We propose an apparatus for a fluorescence detector that enables a quick and accurate estimation of the reaction result for a nucleic acid array.

본 발명의 목적은 바이오폴리머 어레이 또는 "칩"상에서 이루어진 생물학적 반응의 분석을 위한 장치 및 방법을 제공하는데 있다. 핵산들의 어레이들은 주로 2가지 방식으로 이용될 수 있다. 첫째로는, 하이브리다이제이션만을 기초한 분석의 경우에, 분석될 형광성 있게 라벨된 타겟은 어레이 상에 고정된 유전 물질에 하이브리다이즈된다. 그 라벨은 증폭 동안에 결합된 것이다. 이중 스트랜드 핵산에서의 질소 염기들 간에 형성된 수소 결합의 에너지가 제한되기 때문에, 이런 유형의 하이브리다이제이션 기반 반응 메카니즘은 특히 선택적이지 않고 신호와 잡음 간의 뚜렷한 구별을 허용하지 않는다.It is an object of the present invention to provide an apparatus and method for the analysis of biological reactions made on a biopolymer array or "chip". Arrays of nucleic acids can be used primarily in two ways. First, in the case of assays based only on hybridization, the fluorescently labeled targets to be analyzed are hybridized to the dielectric material immobilized on the array. The label is bound during amplification. Because of the limited energy of hydrogen bonds formed between nitrogen bases in double stranded nucleic acids, this type of hybridization-based reaction mechanism is not particularly selective and does not allow a clear distinction between signal and noise.

또다른 가능성은 고정된 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 타겟 핵산의 하이브리다이제이션에 대한 효소 반응의 부가에 있다. 한 예로 폴리머레이즈 조정 확장이 있다. 여기서, 모든 고정된 올리고뉴클레오타이드는 하나의 형광성 있게 라벨된 뉴클레오타이드에 의해 길게 늘어지게 된다. DNA 폴리머레이즈는 타겟 DNA의유전 정보에 대해 뉴클레오타이드를 부가한다.Another possibility lies in the addition of enzyme reactions to hybridization of immobilized oligonucleotide probes and target nucleic acids. One example is the polymerase adjustment extension. Here, all immobilized oligonucleotides are elongated by one fluorescently labeled nucleotide. DNA polymerase adds nucleotides to the genetic information of the target DNA.

어레이된 DNA 확장 반응은 플루오르포르로 라벨된 다이디옥시뉴클레오타이드를 DNA 폴리머레이즈를 위한 기판으로서 이용한다. 상이하게 라벨된 4개의 다이디옥시뉴클레오타이드는 동시에 이용되지만, 하나만이 타겟 핵산의 기본 구조에 대응하는 프로브에 결합될 것이다.Arrayed DNA expansion reactions use didioxynucleotides labeled with fluorine as substrates for DNA polymerase. Four differently labeled didioxynucleotides are used simultaneously, but only one will bind to a probe corresponding to the basic structure of the target nucleic acid.

상기 효소 메카니즘은 하이브리다이제이션에만 기초한 반응에 대한 하기의 이점들만을 갖는다:The enzyme mechanism has only the following advantages for reactions based only on hybridization:

1. 고정된 프로브 및 타겟 간의 하이브리다이제이션이 완전하지 못한 경우, 폴리머레이즈는 구조를 인식하지도 못하고 반응을 행하지도 못할 것이다.1. If the hybridization between the immobilized probe and the target is incomplete, the polymerase will not recognize the structure and will not react.

2. 하이브리다이제이션이 완전한 경우에, 효소는 안정한 공유 결합을 합성하여 프로브내에 다이디옥시뉴클레오타이드를 결합시킬 것이다. 이것은 반응 이후에 그리고 비특정적으로 결합된 생물학적 물질을 제거한 후에 어레이의 세정을 가능하게 한다. 따라서, 실질적으로 향상된 신호/잡음 비가 달성되어, 상기 시스템이 이질 접합 변환을 검출할 수 있게 한다.2. If hybridization is complete, the enzyme will synthesize a stable covalent bond to bind didioxynucleotides in the probe. This allows for cleaning of the array after the reaction and after removal of nonspecifically bound biological material. Thus, substantially improved signal / noise ratios are achieved, allowing the system to detect heterojunction transformations.

본 발명의 방법은 바이오폴리머 어레이의 분석에 이용된다. 공지된 파장의 광(레이저 빔)의 빔이 그 빔의 전체 내부 반사를 일으키는 각에서 지지체(유리)의 단부내로 향하게 된다. 그 지지체는 도파관이 된다(도 2). 광의 소정 부분은 유리의 내면으로부터 반사하는 것이 아니라 희미한 파로서 유리로부터 관통해나간다. 그것의 세기는 지수함수적으로 감소하지만 파장의 1/4의 간격으로 충분히 유지된다. 이 간격은 유리에 즉각적으로 결합된 프로브내에 결합된 플루오르포르를 여기시키는데 충분하다. 4개의 다른 뉴클레오타이드/라벨이 존재하는 폴리머레이즈 확장의 경우에서와 같이, 4개의 다른 파장의 레이저 빔은 형광 라벨의 최대 여기를 달성하는데 이용된다. 발광된 광은 배경 광을 없애버리도록 각각의 방사 필터를 통해 모아지고 광학 시스템을 통해 CCD 카메라(대물렌즈)내로 초점이 맞춰진다. 사용된 카메라가 냉각되기 때문에, 영상화 시간은 단축되어 각각의 뉴클레오타이드/형광 채널에 대해 약 10초가 소요된다.The method of the present invention is used for the analysis of biopolymer arrays. A beam of light (laser beam) of known wavelength is directed into the end of the support (glass) at an angle that causes full internal reflection of the beam. The support becomes a waveguide (FIG. 2). Certain portions of light pass through the glass as faint waves rather than reflecting from the inner surface of the glass. Its intensity decreases exponentially but is well maintained at intervals of a quarter of the wavelength. This spacing is sufficient to excite the bound fluorine in the probe immediately bound to the glass. As in the case of polymerase extension where four different nucleotides / labels are present, four different wavelength laser beams are used to achieve maximum excitation of the fluorescent label. The emitted light is collected through each radiation filter to eliminate background light and focused through the optical system into the CCD camera (objective). Since the camera used is cooled, the imaging time is shortened and takes about 10 seconds for each nucleotide / fluorescent channel.

도 2 내지 도 4는 바이오폴리머 어레이들을 영상화하기 위한 본 발명의 방법을 도시한다. 형광성 있게 라벨된 바이오폴리머 분자들은 평행한 벽(1)들을 갖는 얇은 투명 지지체에 결합된다. 형광 분자들의 여기를 최대화하기 위하여 레이저 빔(2)이 사용된다. 빔은 단부(1)보다 더 얇은 팬의 형태로 원통형 렌즈(3)를 통해 초점이 맞춰지고, 그 빔은 지지체가 전체 내부 반사의 도파관이 되도록 하는 각하에서 단부(1)내로 향하게 된다.2-4 illustrate the method of the present invention for imaging biopolymer arrays. Fluorescently labeled biopolymer molecules are bound to a thin transparent support with parallel walls 1. The laser beam 2 is used to maximize the excitation of the fluorescent molecules. The beam is focused through the cylindrical lens 3 in the form of a fan thinner than the end 1, and the beam is directed into the end 1 at an angle such that the support is a waveguide of the total internal reflection.

레이저 빔에 의해 얻어진 형광은 광학적으로 감광성 소자로 향하게 되고, 상기 감광성 소자는 지지체(1)상에 결합된 형광 분자들의 영상을 제공해준다. 상술한 메카니즘에 의해 얻어진 형광은 감광성 소자로 투사되고, 상기 소자는 도 5에 도시된 바와 같이 레이저 빔 형광 분자들에 의해 여기되고 결합된 것들의 영상을 지지체(1)에 대해 얻도록 할 수 있게 한다. 레이저 빔은 측면을 통해 지지체로 향하게 된다. 디지털적으로 제어되는 CCD 카메라는 감광성 소자로서 사용된다. 레이저 빔은 투명 슬랩 또는 헥사헤드론(4)을 통해 산란되고 광학적 웨지(5)로 동일시간에 변조된다. 이들 조합된 소자들은 미러(6)로부터 지지체(1)내로 인입되는 레이저 빔의 각을 변경할 수 있다.The fluorescence obtained by the laser beam is optically directed to the photosensitive device, which provides an image of the fluorescent molecules bound on the support 1. The fluorescence obtained by the above-described mechanism is projected onto the photosensitive element, which makes it possible to obtain an image of the ones excited and bound by the laser beam fluorescent molecules as shown in FIG. 5 to the support 1. do. The laser beam is directed through the side to the support. Digitally controlled CCD cameras are used as photosensitive elements. The laser beam is scattered through the transparent slab or hexaheadron 4 and modulated at the same time with the optical wedge 5. These combined elements can change the angle of the laser beam entering from the mirror 6 into the support 1.

단부면을 통해 지지체(1)내로 빔이 향하도록, 프리즘(8)이 도 4에 도시된 바와 같이 사용된다. 프리즘(8)으로부터 지지체(1)로의 광의 천이시의 반사 손실을 경감시키기 위하여, 프리즘(8) 및 지지체(1)의 굴절율에 근사한 굴절율의 마이크로스코피에 사용된 이머션 오일 등의 투명 액체(9)가 사용된다.A prism 8 is used as shown in FIG. 4 so that the beam is directed through the end face into the support 1. In order to reduce the reflection loss at the time of the light transition from the prism 8 to the support 1, a transparent liquid 9 such as immersion oil used in microscopy of refractive index approximating the refractive index of the prism 8 and the support 1. ) Is used.

본 발명을 실제적인 양호한 실시예와 관련하여 기술하였지만, 본 발명은 상술한 실시예에 국한된 것이 아니라 첨부된 특허청구범위의 사상 및 범위에 포함되는 균등한 장치들 및 다른 수정예들을 포함하는 것임을 이해한다.While the invention has been described in connection with practical preferred embodiments, it is to be understood that the invention is not limited to the embodiments described above but includes equivalent devices and other modifications that fall within the spirit and scope of the appended claims. do.

Claims (11)

바이오폴리머 어레이의 영상화 및 분석 방법에 있어서,In the imaging and analysis method of the biopolymer array, 소정 파장의 광의 빔이 지지체에서 전체 내부 반사를 일으키도록 하는 각하에서 어레이 지지체 내로 향하게 되고, 상기 지지체는 도파관이 되며 광의 일부분은 미미한 파로서 지지체의 표면으로부터 통과해버리고 표면에 즉각 부착된 분자들내에 결합된 플루오르포르를 여기시키는 것을 특징으로 하는, 바이오폴리머 어레이의 영상화 및 분석 방법.A beam of light of a predetermined wavelength is directed into the array support under an angle that causes full internal reflection in the support, which becomes a waveguide and a portion of the light passes through the surface of the support as a slight wave and within the molecules immediately attached to the surface. A method of imaging and analyzing a biopolymer array, characterized by exciting the bound fluorine. 제 1 항에 있어서,The method of claim 1, 상기 광의 빔은 레이저 빔인 것을 특징으로 하는, 바이오폴리머 어레이의 영상화 및 분석 방법.And the beam of light is a laser beam. 디지털 제어 CCD 카메라(7), 대역 통과 필터들, 및 조광 영역을 넓히기 위한 산란 원통형 렌즈(3)를 포함하는, 제 1 항 또는 제 2 항의 방법을 적용하기 위한 형광 검출기.A fluorescence detector for applying the method of claim 1, comprising a digitally controlled CCD camera (7), band pass filters, and a scattering cylindrical lens (3) for widening the illumination area. 제 3 항에 있어서,The method of claim 3, wherein 상기 바이오폴리머 어레이 지지체 내의 상기 영역의 광대화는 상기 레이저 빔의 스캐닝 이동에 의해 달성되고, 투명 헥사헤드론 또는 슬랩(4)에 의해 달성된상기 스캐닝은 회전하여서 상기 지지체(1)내로의 상기 레이저 빔의 입사각을 변화시키게 하는 것을 특징으로 하는 형광 검출기.The enlargement of the area within the biopolymer array support is achieved by the scanning movement of the laser beam, and the scanning achieved by the transparent hexaheadron or slab 4 rotates the laser into the support 1. Fluorescence detector, characterized in that for changing the incident angle of the beam. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,The method according to claim 3 or 4, 상기 지지체(1)에서의 광의 보다 균일한 분포를 위해 변조 소자가 사용되는 것을 특징으로 하는 형광 검출기.A fluorescence detector, characterized in that a modulation element is used for a more uniform distribution of light at the support (1). 제 5 항에 있어서,The method of claim 5, 상기 변조 소자는 그 축 둘레로 회전하는 광학적 웨지(5)이고, 상기 광학적 웨지의 축은 상기 레이저 빔의 광학적 축에 근접하게 놓이는 것을 특징으로 하는 형광 검출기.The modulating element is an optical wedge (5) rotating about an axis thereof, wherein the axis of the optical wedge lies close to the optical axis of the laser beam. 제 3 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,The method according to any one of claims 3 to 6, 상기 지지체(1)내로 상기 레이저 빔이 입사하는 단부면 또는 측면은 상기 지지체에서의 상기 레이저 빔의 보다 균등한 분포를 위한 광의 분산을 위해 프로스트되는 것을 특징으로 하는 형광 검출기.An end face or side on which the laser beam is incident into the support (1) is frosted for the distribution of light for a more even distribution of the laser beam at the support. 제 3 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서,The method according to any one of claims 3 to 7, 상기 지지체(1)내로 상기 레이저 빔이 입사하는 단부면 또는 측면은 상기 지지체에서의 상기 레이저 빔의 보다 강한 세기를 위해 폴리싱되는 것을 특징으로 하는 형광 검출기.An end face or side on which the laser beam is incident into the support (1) is characterized in that it is polished for stronger intensity of the laser beam at the support. 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,The method according to any one of claims 3 to 8, 상기 지지체(1) 상에 인가된 회절 격자는 상기 지지체(1)내로 상기 레이저 빔을 향하게 하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 형광 검출기.A diffraction grating applied on the support (1) is used to direct the laser beam into the support (1). 제 3 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,The method according to any one of claims 3 to 9, 상기 레이저 빔은 광학적 프리즘(8)을 이용하여 측면을 통해 지지체내로 향하게 되는 것을 특징으로 하는 형광 검출기.Said laser beam is directed to the support through the side using an optical prism (8). 제 3 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,The method according to any one of claims 3 to 10, 상기 지지체(1) 및 상기 프리즘(8) 사이에는, 상기 지지체(1) 및 상기 프리즘(8)의 굴절율과 근사한 굴절율의 예컨대 이머션 오일의 투명 액체(9)가 배치되는 것을 특징으로 하는 형광 검출기.Between the support 1 and the prism 8, a fluorescent detector, for example a transparent liquid 9 of immersion oil having a refractive index close to that of the support 1 and the prism 8, is arranged. .