KR20010042373A - 핵 수용체 활성을 조절하는 방법 및 화합물 - Google Patents

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KR20010042373A
KR20010042373A KR1020007010940A KR20007010940A KR20010042373A KR 20010042373 A KR20010042373 A KR 20010042373A KR 1020007010940 A KR1020007010940 A KR 1020007010940A KR 20007010940 A KR20007010940 A KR 20007010940A KR 20010042373 A KR20010042373 A KR 20010042373A
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nuclear
ligand
nuclear receptor
residues
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KR1020007010940A
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앤드류 시아우
피터 제이. 쿠쉬너
데이비드 에이. 아가드
제프리 엘. 그린
Original Assignee
린다 에스. 스티븐슨
더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
추후보정
에이알시에이치 디벨러프먼트 코포레이션
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Abstract

본 발명은 핵 수용체 활성 및 핵 수용체 리간드 결합을 조절하기 위한 방법 및 아고니스트/안타고니스트에 관한 것이다. 본 발명은 관심있는 핵 수용체에 대한 리간드 결합 도메인을 포함하는 잔기를 동정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에는 핵 수용체, 특히 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 도메인에 결합하는 아고니스트 및/또는 안타고니스트를 동정하는 방법이 포함된다. 본 발명은 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 도메인 및 이 부위에 결합하는 화합물의 동정 및 조작에 의해 예시된다. 본 발명의 방법은 TR, GR 및 PR을 포함하는 그 밖의 핵 수용체에 적용될 수 있다.

Description

핵 수용체 활성을 조절하는 방법 및 화합물 {METHODS AND COMPOUNDS FOR MODULATING NUCLEAR RECEPTOR ACTIVITY}
SEQUENCE LISTING
〈110〉 Shiau, Andrew
Kushner, Peter J
Agard, David A
Greene, Geoffrey L
〈120〉 Methods and Compounds for Modulating Nuclear Receptor
Activity
〈130〉 UCAL 256/01WO
〈140〉
〈141〉
〈150〉 60/079,956
〈151〉 1998-03-30
〈150〉 60/113,146
〈151〉 1998-12-16
〈150〉 60/113,014
〈151〉 1998-12-16
〈160〉 26
〈170〉 PatentIn Ver. 2.0
〈210〉 1
〈211〉 5
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈220〉
〈221〉 BINDING
〈222〉 (1)..(5)
〈223〉 residues 2 and 3 can be any amino acid
〈400〉 1
Leu Xaa Xaa Leu Leu
1 5
〈210〉 2
〈211〉 5
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈220〉
〈221〉 BINDING
〈222〉 (1)..(5)
〈223〉 residues 2 and 3 can be any amino acid
〈400〉 2
Leu Xaa Xaa Met Leu
1 5
〈210〉 3
〈211〉 5
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 3
Leu Leu Gln Met Leu
1 5
〈210〉 4
〈211〉 13
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 4
Lys His Lys Ile Leu His Arg Leu Leu Gln Asp Ser Ser
1 5 10
〈210〉 5
〈211〉 33
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 5
Thr Pro Ala Ile Thr Arg Val Val Asp Phe Ala Lys Lys Leu Pro Met
1 5 10 15
Phe Cys Glu Leu Pro Cys Glu Asp Gln Ile Ile Leu Leu Lys Gly Cys
20 25 30
Cys
〈210〉 6
〈211〉 12
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 6
Leu Phe Pro Pro Leu Phe Leu Glu Val Phe Glu Asp
1 5 10
〈210〉 7
〈211〉 33
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 7
Thr Pro Ala Ile Thr Arg Val Val Asp Phe Ala Lys Lys Leu Pro Met
1 5 10 15
Phe Ser Glu Leu Pro Cys Glu Asp Gln Ile Ile Leu Leu Lys Cys Cys
20 25 30
Cys
〈210〉 8
〈211〉 12
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 8
Leu Phe Pro Pro Leu Phe Leu Glu Val Phe Glu Asp
1 5 10
〈210〉 9
〈211〉 33
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 9
Thr Lys Cys Ile Ile Lys Ile Val Glu Phe Ala Lys Arg Leu Pro Gly
1 5 10 15
Phe Thr Gly Leu Ser Ile Ala Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Ala
20 25 30
Cys
〈210〉 10
〈211〉 12
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 10
Pro Met Pro Pro Leu Ile Arg Glu Met Leu Glu Asn
1 5 10
〈210〉 11
〈211〉 33
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 11
Asp Lys Gln Leu Phe Thr Leu Val Glu Trp Ala Lys Arg Ile Pro His
1 5 10 15
Phe Ser Glu Leu Pro Leu Asp Asp Gln Val Ile Leu Leu Arg Ala Gly
20 25 30
Trp
〈210〉 12
〈211〉 12
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 12
Pro Ile Asp Thr Phe Leu Met Glu Met Leu Glu Ala
1 5 10
〈210〉 13
〈211〉 33
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 13
Val Glu Ala Val Gln Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Asn Ile Pro Gly
1 5 10 15
Phe Ile Asn Leu Asp Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys Tyr Gly
20 25 30
Val
〈210〉 14
〈211〉 12
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 14
Ser Leu His Pro Leu Leu Gln Glu Ile Tyr Lys Asp
1 5 10
〈210〉 15
〈211〉 33
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 15
Ser Tyr Ser Ile Gln Lys Val Ile Gly Phe Ala Lys Met Ile Pro Gly
1 5 10 15
Phe Arg Asp Leu Thr Ser Glu Asp Gln Ile Val Leu Leu Lys Ser Ser
20 25 30
Ala
〈210〉 16
〈211〉 12
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 16
Lys Leu Thr Pro Leu Val Leu Glu Val Phe Gly Asn
1 5 10
〈210〉 17
〈211〉 33
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 17
Asp Arg Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala
20 25 30
Trp
〈210〉 18
〈211〉 12
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 18
Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asp Ala
1 5 10
〈210〉 19
〈211〉 33
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 19
Gly Arg Gln Val Ile Ala Ala Val Lys Trp Ala Lys Ala Ile Pro Gly
1 5 10 15
Phe Arg Asn Leu His Leu Asp Asp Gln Met Thr Leu Leu Gln Tyr Ser
20 25 30
Trp
〈210〉 20
〈211〉 12
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 20
Glu Phe Pro Glu Met Leu Ala Glu Ile Ile Thr Asn
1 5 10
〈210〉 21
〈211〉 33
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 21
Glu Arg Gln Leu Leu Ser Val Val Lys Trp Ser Lys Ser Leu Pro Gly
1 5 10 15
Phe Arg Asn Leu His Ile Asp Asp Gln Ile Thr Leu Ile Gln Tyr Ser
20 25 30
Trp
〈210〉 22
〈211〉 12
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 22
Glu Phe Pro Glu Met Met Ser Glu Val Ile Ala Ala
1 5 10
〈210〉 23
〈211〉 33
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 23
Gly Lys Gln Met Ile Gln Val Val Lys Trp Ala Lys Val Leu Pro Gly
1 5 10 15
Phe Lys Asn Leu Pro Leu Glu Asp Gln Ile Thr Leu Ile Gln Tyr Ser
20 25 30
Trp
〈210〉 24
〈211〉 12
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 24
Glu Phe Pro Ala Met Leu Val Glu Ile Ile Ser Asp
1 5 10
〈210〉 25
〈211〉 33
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 25
Glu Arg Gln Leu Val His Val Val Lys Trp Ala Lys Ala Leu Pro Gly
1 5 10 15
Phe Arg Asn Leu His Val Asp Asp Gln Met Ala Val Ile Gln Tyr Ser
20 25 30
Trp
〈210〉 26
〈211〉 12
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 26
Asp Phe Pro Glu Met Met Ala Glu Ile Ile Ser Val
1 5 10
세포는 단백질, 호르몬 및/또는 약제를 포함하는 다양한 분자와 결합하여 생물학적 반응을 제거할 수 있는 수용체를 포함한다. 핵 수용체는 세포형 의존성 방법, 리간드 의존성 방법, 및 프로모터 의존성 방법으로 전사를 강화 또는 억제하는 호르몬/리간드 활성화된 전사 인자인 단백질의 수퍼패밀리를 나타낸다. 종래의 핵 수용체, 에스트로젠 수용체 α(ERα)은 신경, 뼈, 심장 혈관, 및 복제 조직의 분화 및 유지를 조절하는 주요 인자이다(Korach, Science 266:1524-1527 (1994); Smith, et al., New Engl. J. Med. 331:1056-1061 (1994)). 핵 수용체 패밀리는 또한 글루코코르티코이드, 안드로젠, 미네랄코르티코이드, 프로제스틴, 티로이드 호르몬, 비타민 D, 퍼록시좀 프롤리퍼레이터(proliferator) 및 아이코사노이드에 대한 수용체를 포함한다. 핵 수용체 패밀리의 서브세트는 스테로이드계 수용체이며, 이는 에스트로젠, 글루코코르티코이드 및 프로제스틴 수용체를 포함한다.
핵 수용체 상의 전체 서열 보존은 수용체 패밀리의 종류에 따라 다르다; 그러나, 수용체의 기능성 영역 사이, 또는 모듈 사이의 서열 보존율이 높다. 예를 들어, 핵 수용체는 N-말단 전사활성 도메인, 중심 DNA 결합 도메인(DBD), 및 C-말단 리간드 결합 도메인(LBD)를 포함하는 기능성 모듈내로 결합될 수 있다. 핵 수용체의 LBD 모듈은 호르몬/리간드 의존성 분자 스위치를 나타내며, 그 크기, 모양, 및 화학적 성질이 다른 많은 화합물을 인식한다. 따라서, 에스트로젠 호르몬은 그의 생리학적 효과를 에스트로젠 수용체에 대한 결합에 의해 나타낸다(BEATRO, et al., Cell83(6):851-857(1995): Tsai. et al., Annu. Rev. Biochem. 63:451-86 (1994)). 핵 수용체의 LBD에 대한 호르몬의 결합은, 비록 하기 변화가 전사 의존성일지라도 또한 DNA 전사를 조절하는 그의 능력을 변화시킨다.
모든 ERα 리간드는 C-말단의 LBD와 배타적으로 결합한다. 이들 리간드중 몇몇은 내인성 에스트로젠, 17-에스트라디올(E2), 및 합성 비스테로이드계 에스트로젠, 디에틸스틸베스트롤(DES)을 포함하고 순수한 작용제로서 작용하는 반면에, 예컨대, ICI-164,384와 같은 다른 것은 순수 길항제로서 작용한다. 합성 리간드 예를 들어, 타목시펜(tamoxifen) 및 랄록시펜(RAL)와 같은 리간드는 선택성 에스트로젠 수용체 모듈레이터(SERMs)로서 알려진 증식 계열 분자에 속하며, 이들은 특정 조직 및 프로모터 콘텍스트에서 길항제로서 작용한다(Grese, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:14105-10 (1997)). 타목시펜의 뛰어난 조직 특이적 성향이 최근 보고된 유방암 예방 시험에서 입증되었으며(참고문헌: Samigel, J. Natl. Cancer Inst, 90:647-8)(1998)), 여기서 6년 동안 타목시펜 치료를 받은 유방암에 걸릴 위험성이 큰 일군의 여성들은 자궁내막 암의 증가된 발병을 보였으나, 특정 골절의 발생 빈도의 감소 및 45%의 현격한 유방암 감소를 보였다. 신규 SERMs의 설계 및 노출원의 최적화는 ERα 전사활성에 대한 다른 리간드 화학 및 구조의 효과에 대한 이해를 요구한다.
핵 수용체는 또한 수용체 기능에 관련되는 샤페론 복합체, 보조억제제, 또는 보조활성제와 같은 단백질과 결합한다. 특히, 핵 수용체에 의한 전사의 리간드 의존성 활성화는 다른 조활성제와의 상호 작용에 의해 조절된다. 수용체 작용제는 보조활성제 결합 및 길항제 블록 보조활성제 결합을 촉진한다. 핵 수용체에 의한 호르몬 결합은 이들 단백질에 대한 결합 친화성을 감소 또는 증가시킬 수 있으며, 핵 수용체의 전사에 대한 다중 작용에 영향을 주거나 조절할 수 있다.
ERα에 의한 전사활성은 단백질의 다른 도메인에 위치한 두개 이상의 분리된 활성 기능(AFs)에 의해 조절되며, AF-1은 N-말단에 AF-2는 LBD에 존재한다. 이들 AFs는 세포 유형 및 프로모터 콘텍스트에 따라 독립적으로 또는 협조하여 작용할 수 있다. 상기 AF-1은 MAP 키나제 경로(Kato, et al., Science 270:1491-1494 (1995))에 의해 조절되고, 통상 리간드 의존성 방법에 의해 활성화되는 것으로 믿어지는 반면에, AF-2 활성("전사활성")은 리간드 결합에 대해 반응성이다(Kumar, et al., Cell 51(6):941-951(1987)). 작용제의 결합은 전사활성을 일으키는 반면에 길항제의 결합은 그렇지 않다(Berry, et al., EMBO J. 9:2811-8(1990)). 또한, 보조활성제가 전사활성을 조절한다. 보조활성제가 결합하는 부위의 구조 및 기능적 특성은 최근에서야 밝혀졌다. 1998년 3월 30일자에 출원된 아프릴레티 등 (Apriletti. et al.)의 미국 가출원 제 60/079,956호가 본원에 참고로서 통합된다.
최근의 구조에 대한 연구는, 리간드가 LBD의 구조에 직접적으로 영향을 미침에 의해 전사활성을 조절함을 암시한다. 리간드 결합이 없는 인간 레티노이드 X 수용체 α LBD(Bourguet, et al., Nature 375:377-82(1995))와 인간 레티노인산 수용체 γ (RARγ)(Renaud, et al., Nature 378:681-689(1995) 및 Wurtz, et al., Nat. Struct. Biol. 3:87-94(1996)), 티로이드 호르몬 수용체 α(TRα)(Wagner, et al., Nature 378:690-697(1995)), 프로제스테론 수용체(Williams, et al., Nature 393: 392-395(1998)) 및 ERα(Brzozowski, et al., Nature 389:753-758(1977); Tanenbaum, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5998-6003(1998))의 리간드 결합된 LBDs의 비교는 LBD의 C-말단 헬릭스인 헬릭스 12의 재배치를 포함하는 작용제에 의해 유도된 구조적 변화가 전사활성에 필수적임을 암시한다. 헬릭스 3, 5, 및 12에서의 어떤 점 변이가 전사활성을제거하나 리간드 또는 DNA 결합에 영향을 미치지 않기 때문에, LBD의 상기 영역은 작용제의 존재하에 생성된 것으로서, 일반적인 전사 기구와 수용체를 연결시켜주는 분자에 대한 인식 표면의 일부를 형성할 것으로 예측되었다(Danielian, et al., EMBO J. 11:1025-33(1992); Feng, et al., Science 280:1747-9(1998); Henttu, et al., Mol. Cell. Biol. 17:1832-9(1997); Wrenn et al., Biol. Chem. 268:24089-24098(1993)). E2및 RAL과 함께 복합체로 형성된 LBD의 구조는, 비록 두개의 리간드 모두가 LBD(상기 Brozozowski, et al.)의 중심내의 동일한 부위와 결합한다고 하더라도, 이들 리간드 각각은 헬릭스 12의 다른 콘포메이션을 유도함을 제시했다. E2-LBD 복합체 내의 헬릭스 12가 다른 작용제 결합의 NR LBD 구조 내의 대응하는 헬릭스에 대해 관찰된 콘포메이션중의 헬릭스 3, 5/6, 및 11에 대해 패킹하는 반면에, RAL-LBD 복합체중의 헬릭스 12는 헬릭스 3 및 5로부터의 잔기로 구성된 소수성 그루브(groove)내로 결합된다. 이러한 헬릭스 12의 선택적인 배향은 전사활성에 필수적인 잔기를 부분적으로 그루브내에 함입시키며, 이는 RAL 및 다른 가능한 길항제가 보조활성제 결합부위 표면의 토포그래피를 손상시킴에 의해 전사활성을 블로킹함을 암시한다.
생화학적 및 유전적 접근이 SRC-1/N-CoA1(Onate, et al., Science 270:1354- 1357(1995)), GRIP1/TIF2/SRC-2(Hong, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (10): 4948-4952(1996) 및 Vogel, et al., EMBO J. 15:3667-3675(1996)), p/CIP/ RAC3/ACTR/AIBI/SRC-3(Anzick, et al.,Science 277:965-968(1997), Chen, et al., Cell 90(3):569-80(1997), Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:8479-84 (1997) 및 Torchia et al., Nature 387:677-684(1997) 및 CBP/p300(Hanstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11540-11545(1996))를 포함하는 ERα와 리간드 의존성 방법으로 연관되는 수개의 단백질의 동정을 가져왔다. 이들 단백질은 ERα 및 수개의 다른 NRs(상기 Glass, et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9:222-32 (1997): Torchia, et al)에 의한 리간드 의존성 전사활성을 증강시키기 때문에 전사 보조활성제로서 분류되었다. 분열된 SRC-1 유전자(Xu, et al., Science 279: 1922-1925 (1998))를 지닌 마우스에서의 부분적인 호르몬 내성의 관찰은 체내에서NR의 작용에 보조활성제가 필요하다는 것에 대한 강력한 증거이다. 전사활성을 가져오는 AF-2에서의 제안된 역할과 함께, SRC-1은 히스톤 아세틸라제 활성 및 작용제 결합 수용체 뿐만아니라 다른 보조활성제 및 수개의 통상적인 전사인자와 상호작용할 수 있는 능력을 갖는다(Kamei, et al., Cell 85(3):403-14(1996); 상기 Onate, et al.; Spencer, et al., Nature 389:194-8(1977); Takeshita, et al., Endocrinology 137:3594-7(1996)). SRC-1 및 GRIP1는 또한 추정의 보조활성제 결합부위를 이용하여 인간 TRβ 및 ERα 양자 모두의 작용제 결합 LBDs와 결합한다(상기, Feng, et al.).
보조활성제의 p160 패밀리의 일원 예를 들어, SRC-1, GRIP1/TIF2/SRC-2, 및 p/CIP/RAC3/ACTR/AIB1/SRC-3 및 다른 보조활성제는 NR 박스로 알려진 짧은 시그너쳐 서열 모티프, LXXLL(서열번호: 1)(여기서, L은 루이신이고, X는 임의의 아미노산이다)을 통해 작용제 결합 NR LBDs를 인식한다(참고문헌: Ding, et al., Mol. Endoocrinol. 12:302-313(1998); Heery, et al., Nature 387:733-736(1997); Le Douarin, et al., EMBO J. 15:6701-15(1996); 상기 Torchia, et al.). 돌연변이의 연구는 보조활성제의 LBDs에 대한 친화력이 주로, 이에 한정된 것은 아니라도, 이들 NR 박스(상기, DING, et al.)에 의해 결정됨을 지시한다. p160 보조활성제의 각각은 수개의 NR 박스를 함유한다. SRC-1, GRIP1, 및 TIF 내의 상기 NR 박스가 다른 NRs를 다른 친화력으로 인식함이 밝혀졌으나(상기, Ding, et al.; Kalkhoven, et al., EMBO J. 17:232-43(1998); Vogel, et al., EMBO J. 17:507-19(1998)), 이들 결합 친화성에 대한 이유는 알려진 바 없다.
문헌(Darimont, et al., "Structure and specificity of nuclear receptor- coactivator interactions" Genes Dev. 12:3343-3356(1998))은 TRβ 및 GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드사이의 복합체에 대한 구조적 연구, 및 TRβ 및 GR과 결합하는 GRIP1의 생화학적 연구를 기술한다.
핵 수용체는 의학적으로 매우 중요하다. 이들은 유방암, 전립선암, 심장부정맥질환, 불임, 골다공증, 갑상선항진, 콜레스테롤과잉혈증, 비만, 및 다른 질환에 관여한다. 예를 들어, ERα 전사활성을 조절하는 화합물은 현재 골다공증, 심장혈관질환, 및 유방암의 치료에 사용되고 있다(Gradishar, et al., J. Clin. Oncol. 15:840-52(1997) 및 Jordan. J. Natl. Cancer Inst. 90:967-71(1998)).
핵 수용체의 리간드 결합 도메인 내의 주요 잔기, 및 이들 결합부위에 결함함에 의해 영향을 미치는 분자에 대한 추가적인 동정과 특성화에 대한 필요성이 존재한다. 이러한 상호작용의 이해는 반복적인 약제 설계, 합성, 및 선택에 대한 기초를 제공한다. 이러한 결합부위를 표적화하는 화합물을 발견하는데 소요된는 시간을 줄이기 위한 방법 및 조성물을 설계하고, 핵 수용체, 특히 에스트로젠 수용체에 의해 조절되는 생리적 과정을 조절하기 위해 상기 조성물을 기관에 투여하는 것이 또한 장점이 될 것이다.
본 발명은 핵 활성의 조절을 위한 개선된 방법 및 화합물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 에스트로젠 수용체 활성의 조절을 위한 방법 및 화합물에 관한 것이다.
도 1은 복합체의 전자밀도에 대한 입체도로서, 도 1a는 DES-ERα LBD-GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드 복합체의 전자밀도에 대한 입체도이고, 도 1b는 OHT-ERα LBD 복합체의 전자밀도에 대한 입체도이다. 도 1은 BOBSCRIPT(Esnouf, J. Mol. Graph. Model. 15, 132-4. 112-3(1997))에 의해 생성되고, Raster3D(Merritt, et al., Acta Crystallogr. D 50:869-873(1994))를 사용하여 작성된 흑백 그래픽이다.
도 2는 상기한 바와 같이 BOBSCRIPT에 의해 생성되고 Raster3D를 사용하여 작성된다. 도 2a는 DES-ERα LBD-GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드 복합체의 전체 구조를 두개의 직교도로 제시한다. 도 2b는 OHT-ERα LBD 복합체의 전체 구조를 도 2a의 작용제 복합체에 대한 도면과 유사하게 두개의 직교도로 제시한다.
도 3a 및 3b는 BOBSCRIPT에 의해 생성되고 Raster3D를 사용하여 작성된다. 도 3c 및 3d는 GRASP(Nicholls, GRASP Manual(New York: Columbia University, 1992))를 사용하여 생성시켰다. 도 3a는 LBD와 결합된 보조활성제 즉, NR 박스 Ⅱ 펩티드/LBD 경계면(interface)의 확대도이다. 펩티드와 상호작용하지 않는 LBD 영역은 명확성을 위해 제거했다. 헬릭스 3, 4, 및 5를 각각 H3, H4, 및 H5로 표시했다. 펩티드와 상호작용하는 수용체 잔기의 측쇄를 Lys362(청색) 및 Glu542(적색)을 제외하고 나타냈으며, 상기 측쇄를 원자 유형에 따라 색을 달리했다(탄소 및 황 원자는 녹색, 산소 원자는 적색, 및 질소 원자는 청색으로 했다). 헬릭스 12는 자홍색이다. 금색인 펩티드는 Cα 웜(worm)으로 제시된다: 단지 Ile 689의 측쇄 및 3개의 모티프 루이신(Leu 690, Leu 693, 및 Leu 694)만을 도시했다(도 3c). 도 3b는 보조활성제 결합부위의 일부와 결합된 헬릭스 12를 제시하는 OHT-LBD의 확대도로서 헬릭스 12/LBD를 도시한다. 단지 헬릭스 12와 상호작용하는 잔기의 측쇄만을 도시했다(명확성을 위해 H373의 측쇄는 생략했다). Lys362(청색) 및 Glu380(적색)을 제외하고, 측쇄를 도 3a에서 특정한 바와 같이 원자형에 따라 색을 달리하였다. 잔기 530-551은 Cα 웜으로 나타냈고; 잔기 536-544는 자홍색이다. Leu 536, Tyr 537, Leu 540, Met 543, 및 Leu544의 측쇄를 도시했다. 도 3c는 GRASP로 계산된 것으로서, 양성(청색) 및 음성(적색) 영역으로 NR 박스 Ⅱ와 결합된 ERα LBD 분자의 정전(electrostatic) 표면을 도시한 분자 표면을 나타내는 도면이다. 보조활성제 펩티드를 도 3a에 도시했으며, 상기 도면은 도 3a와 균등하다. Leu690 및 Leu694의 측쇄는 소수성 그루브와 결합되고, Ile689 및 Leu693의 측쇄는 상기 그루브의 말단에 놓인다. 도 3d는 OHT와 함께 복합된 ERα LBD의 정전 표면을 도시하며, 도 3c에서와 같은 양성(청색) 및 음성(적색) 영역을 도시한다. 잔기 530-511가 도 3b에서와 같이 도시되고, 상기 도면은 도 3b의 경우와 균등하다. Leu540 및 Leu544의 측쇄가 소수성 그루브에 함입된 반면에, Met543의 측쇄는 상기 그루브의 말단을 따라 놓인다.
도 4는 LIGPLOT(Wallace, et al., Protein Eng, 8:127-34(1995))를 사용하여 생성되고, LBD와 DES의 상호작용(도 4a) 및 리간드 결합 포켓과 OHT 상호작용을 도시하는 개략도이다(도 4b). 리간드와 상호작용하는 잔기가 대략적인 실제 위치에 도시된다. 리간드와 반데르 발스 결합을 형성하는 잔기를, 표면이 상호작용하는 리간드 원자를 향하는 방사상 스포크를 지닌 표지된 원호로 나타냈다. 리간드에 수소 결합된 이러한 잔기를 구와 막대로 나타냈다. 수소결합을 청록색의 점선으로 나타내고, 각 결합의 간격을 표시한다. 리간드 고리 및 독립적인 리간드 원자를 표지하였다.
도 5는 상기와 같이 BOBSC0RIPT를 사용하여 작성하고 Raster3D를 사용하여 생성되고, OHT 복합체로부터의 헬릭스 12와 NR 박스 Ⅱ 펩티드의 비교를 도시한다. 도 5a 및 5b는 입체도이다. OHT-LBD 복합체 및 DES-LBD-NR 박스 Ⅱ 펩티드 복합체의 구조는 LBD의 잔기 306-526의 Cα 좌표를 사용하여 겹치게 하였다. DES-LBD-보조활성제 펩티드 복합체로부터의 헬릭스 12는 명확성을 위해 생략했다. OHT-LBD로부터의 잔기 536-551(헬릭스 12 = 잔기 536-544) 복합체는 자홍색이며, 펩티드는 금색으로 제시된다. Lys362의ε-아미노 기와 헬릭스 12의 잔기 543 및 544의 골격 카르보닐 사이의 수소결합을 자홍색의 점선으로 나타냈다. Lys362의ε-아미노 기와 보조활성제 펩티드의 잔기 693 및 696의 골격 카르보닐 사이의 수소결합을 오렌지색의 점선으로 나타냈다. 헬릭스 12에서 하기의 약어를 사용한다: L540=Leu540, M543= Met543, 및 L544=Leu544. 펩티드에서 하기 약어를 사용한다: L690=Leu690, L693=Leu693 및 L694=Leu694.
도 6a 및 6d는 상기한 바와 같이 BOBSC0RIPT를 사용하여 생성되고 Raster3D를 사용하여 도시된다. 도 6b 및 6c는 MidasPlus(Huang, et al., J. Mol. Graph. 9:230-6,242(1991))를 이용하여 도시된다. 도 6a는 예를 들어, 상기 타넨바움 등(Tanenbaum et. al.)에 기술된 것과 같이 DES 복합체(보조활성제 펩티드 부재), OHT 복합체, 및 E2복합체를 리본(ribbon)으로 도시하므로써, 다른 LBD 콘포메이션을 촉진시키는 작용제와 길항제를 도시한다. 상기 호르몬은 공간-충전 상태로 도시된다. 각각의 복합체에서, 헬릭스 12는 자홍색이며, 잔기 339-341, 421-423, 및 527-530의 주요 사슬은 적색이다. 헬릭스 3, 8, 및 11(각각 H3, 8, 및 11)을 DES 복합체중에 표지했다. 도 6b는 리간드 결합 공동내에 결합된 DES를 도시한다. DES(녹색)와 결합된 LBD의 공간 충전 모델의 단면은 상기 리간드가 리간드 결합 공동내에 완전히 함입됨을 보여준다. 상기 DES의 A' 고리(A'), Phe404(404), Met421 (421), 및 Phe425(425)를 표지했다. Met421의 측쇄의 탄소원자는 자홍색이며, 황원자는 노란색이다. 도 6c는 리간드 결합 포켓내에 결합된 OHT(적색)의 공간 충진 모델의 단면도이다. 상기 도는 도 6b와 균등하다. 상기 OHT의 B 고리(B), Phe404 (404), Met421(421), 및 Phe425 (425)를 표지했다. Met421의 측쇄는 상기 도 6b와 같다. 상기 B고리의 콘포메이션은 Met421이 DES복합체내에서 취하는 것과는 다른 콘포메이션을 갖도록 한다(도 6b와 비교). 도 6d는 DES(녹색) 및 OHT(적색)과 결합한 리간드 결합 포켓의 비교를 제공한다. 상기 OHT 복합체 및 DES 복합체의 구조를 도 5에서와 같이 겹치도록했다. 양 리간드의 A고리는 지면의 밖의 지점이며, OHT의 B고리 및 DES의 A'고리는 지면내의 지점이다. 상기 OHT와 결합된 LBD는 청색이며, DES와 결합된 LBD는 옅은 청회색이다. 상기 두 개의 복합체의 콘포메이션이 현저히 상이한 몇몇 잔기의 측쇄를 도시했다: Met342 (342), Met343(343), Phe404(404), Met421(421), Ile424(424), Phe425 (425), His 524(524), Leu525(525), Met528(528). 상기 Met421의 황원자는 두 개의 구조 모두에서 노란색으로 나타낸다.
도 7은 길항제 작용의 모델을 예시한다. 작용제(흰색의 3각형) 결합이 보조활성제(노란색) 결합을 촉진하는 LBD의 콘포메이션을 안정화시킨다. 잔기 527-530 (적색)은 헬릭스 11(청색)의 일부이며 헬리칼 사이의 루프의 길이는 헬릭스 12(자홍색)가 전사활성에 포함되는 표면의 정전(stactic) 영역과 결합하는 것을 방해한다. 길항제(흰색 크로스) 측쇄는 헬릭스 12가 리간드 결합 포켓상에 위치하지 못하게 한다. 잔기 527-530(적색)은 리간드 결합 포켓내 또는 주변의 길항제에 의해 유도된 구조적 방해의 결과로서 연장된 콘포메이션을 갖는다. 헬릭스 11과 헬릭스 12 사이의 루프의 길이는 헬릭스 12가 상기 표면의 정전 영역과 결합하도록하고, 보조활성제 인식을 저해한다.
도 8은 수개의 핵 수용체의 보조활성제 결합부위를 형성하는 잔기를 함유하는 아미노산 서열(단일문자 지정 아미노산 서열)의 배열을 도시한다: 인간 및 재조합 티로이드 호르몬(hTRβ 및 rTRα)(서열번호:5 및 6 및 서열번호:7 및 8), 레티노이드(hPARγ 및 hRXRα)(서열번호:9 및 10 및 서열번호: 11 및 12) 퍼록시좀(hPPARγ)(서열번호: 13 및 14), 비타민 D(hVDR)(서열번호: 15 및 16), 에스트로젠(hERα)(서열번호: 17 및 18), 글루코코르티코이드(hGR)(서열번호: 19 및 20), 프로제스틴(hPR)(서열번호: 21 및 22), 미네랄코르티코이드(hMR)(서열번호: 23 및 24), 및 안드로젠(hAR)(서열번호: 25 및 26). 상기 박스는 알파 헬릭스의 잔기를 나타내며(H3, H4, H5, H6, 및 H12); 소문자 "h" 및 "q"는 각각 소수성 및 극성 잔기를 나타낸다. 표의 상부의 숫자, 280, 281 등은 hTRβ 잔기에 대응한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 핵 수용체 활성, 특히 스테로이드 수용체 활성, 보다 더 특별하게는 에스트로젠 수용체 활성을 조절하는 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 화합물은 리간드 결합 도메인과 결합하는 핵 수용체 작용제 또는 길항제이다. LBD와 결합하는 화합물이 또한 제공된다. 상기 화합물은 천연물이거나 합성물이다. 바람직한 화합물은 작은 유기 분자, 펩티드 및 펩티도미메틱스(예를 들어, 시클릭 펩티드, 펩티드 유사체, 또는 속박된 펩티드).
특히, 중요한 ERα LBD내의 특정 잔기가 동정되었다: Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525, 및 Met528(도 4a참조). 이들 중 몇몇이 직접 또는 간접적으로 헬릭스 12의 위치에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다: Met 343, Met421, His524, Leu525 및 Met528. 예를 들어, DES가 수용체와 결합하는 경우에 발생하는 이들 특정 잔기와의 상호작용은 보조활성제의 결합을 촉진하는 LBSD의 콘포메이션을 안정화시킨다. 이들 잔기와 결합 또는 상호작용을 증진시키는 리간드에 대한 변형이 개선된 수용체 활성을 제공한다. 유사하게, 이들 잔기와의 결합 또는 상호작용에 역효과를 미치는 리간드의 변형이 개선된 길항제를 위해 제공된다.
또한, ERα Tyr537 잔기가 리간드 결합되지 않은 수용체를 안정화시키는 역할을 하고, 헬릭스 12가 보조활성제 결합부위와 자유롭게 상호작용하는 것으로 믿어진다. 상기 ER은 hTRβ, rTRα, hRARγ, hGR, hPR, hMR, 및 hAR이 모두 프롤린 잔기를 갖고, hRXRα가 아스파르트산 잔기를 가지며, hPPARγ가 히스티딘 잔기를 갖고, hVDR이 트레오닌 잔기를 hERα의 Tyr537잔기와 대응하는 위치에 가짐에 따라, 상기 위치에 티로신을 갖는다는 점에서 매우 독특하다. 따라서, 선택적인 작용제 및 길항제가 Tyr537과 상호작용하는 에스트로젠에 대한 설계를 가능하게할 수 있다.
OHT 또는 RAL과 같은 종래의 길항제는 작용제 복합체(DES 또는 E2)중에 존재하므로써 헬릭스 12의 배치를 직접적으로 블로킹하는 측쇄를 갖는다. 또한, 헬릭스 12가 보조활성제 헬릭스 결합부위내로 도달하는 것을 허용하여 보조활성제 결합을 블로킹하고 전사활성을 저해하도록 하기 위해, 리간드 유도 교란이 필요하다. 하나 이상의 LBD 잔기와의 상호작용에 대한 이러한 교란 및 간섭이 수용체를 이완시키고, 수용체의 이차 구조를 해체시키며 그 결과 헬릭스 11을 언와인딩(unwinding)함이 밝혀졌다. 상기 언와인딩된 헬릭스 11은 헬릭스 11과 12 사이의 루프의 길이를 증가시키고, 헬릭스 12를 리간드 결합 포켓으로부터 이격시켜 보조활성제 결합부위로 향하게 하며, 여기서 헬릭스 12는 보조활성제의 작용을 흉내내어 보조활성 인식부위를 차지하므로써 보조활성제 인식을 저해한다(도 7). 지적한 하나 이상의 아미노산 지점과의 결합 또는 상호작용을 방해하는 리간드에 대한 변형은 수용체의 이완을 초래하고, 수용체의 2차 구조에 영향을 주어 헬릭스 12의 언와인딩을 유발한다. 이러한 변형된 리간드에 따른 화합물은 길항제로서 작용할 것이다.
따라서, 본 발명의 일면은 핵 활성을 조절(예를 들어, 증가 또는 감소)하는 화합물을 동정하는 방법으로서, 에스트로젠 α 수용체 리간드 결합 도메인 또는 이의 일부의 원자 구조 모델을 사용하여 관심있는 핵 수용체 리간드 결합 도메인과 공간적으로 합치되는 시험 화합물을 모델링하는 단계; 시험 화합물의 리간드 결합 도메인에 대한 결합을 특징으로 하는 검정 예를 들어, 생물학적 검정으로 시험 화합물을 스크리닝 하는 단계; 및 핵 수용체 활성을 조절하는 시험 화합물을 동정하는 단계를 포함하며, 여기서 원자 구조 모델은 인간 에스트로젠 수용체 α Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525 및 Met528, 바람직하게는 Met343, Met421 His524, Leu525 및 Met528의 잔기와 대응하는 아미노산 잔기의 원자 좌표를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 핵 수용체는 ER이다. 상기 시험 화합물은 작용제일 수 있으며, 핵산 수용체 활성은 보조활성제 또는 보조활성제를 흉내내는 화합물이 하기 정의된 바와 같이 보조활성의 결합부위와 결합함에 의해 조절된다. 한편, 상기 시험 화합물은 길항제일 수 있으며, 핵 수용체의 활성은 헬릭스 12의 언와인딩 및/또는 보조활성제 결합부위에 대한 보조활성제의 결합의 블로킹에 의해 측정된다. 상기 스크리닝은 시험관내에서의 고처리량(high throughput) 스크리닝이 바람직하다. 후술하는 바와 같이, 적절한 시험 화합물이 설계되거나, 화합물 라이브러리로부터 수득할 수 있으며, 작은 유기 분자, 펩티드, 및 펩티도미메틱스를 포함하나 이는 예시일 뿐 이에 제한되는 것은 아니다. 상기한 방법은 또한 에스트로젠 수용체 α 리간드 결합 도메인 또는 이의 일부를 상기 모델링 단계에 앞서 컴퓨터화된 모델링 시스템에 제공하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서, "이의 일부"이란 용어는 LBD의 부위와 결합할 수 있는 화합물과 상호작용할 수 있는 LBD의 충분한 숫자의 잔기 또는 그의 원자에 대응하는 원자 좌표를 의미하는 것을 의도한다. 이는 결합 화합물 또는 그의 단편의 4.5Å이내의 원자를 가지는 수용체 잔기를 포함한다. 따라서, 예를 들어 모델링 시스템에 제공된 상기 원자 좌표는 핵 수용체 LBD, LBD의 일부 예컨대, LBD와 결합하는 화합물의 모델링 및 설계에 유용한 LBD에 대응하는 원자 또는 원자의 서브세트를 포함할 수 있다.
리간드 결합 도메인과 합치되는 화합물의 원자 좌표는 또한 부위와 결합하는 화합물 또는 단편을 동정하기 위한 모델링에 사용될 수 있다. "모델링"은 원자 구조 정보 및 수용체 리간드 작용제/길항제 상호작용 모델에 기초한 분자 구조/기능의 정성적 및 정량적 분석을 의도한다. 이는 종래의 수-기초 분자 동력학(dynamic) 및 에너지 최소화 모델, 상호작용성 컴퓨터 그래픽 모델, 변형된 분자 기구(mechenic) 모델, 간격 지오메트리, 및 구조-기초 속박체(constraint) 모델을 포함한다. 바람직하게는, 모델링은 컴퓨터를 사용하여 수행되고, 공지의 방법을 사용하여 보다 더 최적화 될 수 있다. "공간적으로 합치되는"은 화합물의 3차원 구조가 핵 수용체 LBD의 공동(cavity) 또는 포켓에 의해 기하학적으로 수용됨을 의미한다.
대응하는 아미노산을 다른 핵 수용체에 표적화시키는 것이 동일한 효과를 가질 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 하나의 구체예는 핵 수용체의 LBD와는 결합하지만, LBD내의 하나 이상의 잔기와는 상호작용하지 않는 길항제를 설계하는 방법에 관한 것이며, 상기 잔기는 인간 ERα 잔기 Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525 및 Met528, 바람직하게는 Met343, Met421 His524, Leu525 및 Met528에 대응한다(즉, 동일하거나 균등하다). 유사하게, 본 발명의 다른 구체예는 핵 수용체의 LBD와 결합하고 LBD내의 하나 이상의 잔기와 증가된 상호작용을 가지는 작용제를 설계하는 방법에 관한 것이며, 상기 잔기는 인간 ERα 잔기 Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525 및 Met528, 바람직하게는 Met343, Met421 His524, Leu525 및 Met528에 대응한다. 증가된 상호작용의 한 예는 내재성 리간드와 비교하여 하나 이상의 상기 잔기에 대해 보다 더 큰 결합 친화성을 가지는 작용제를 들 수 있다. 핵 수용체 패밀리의 다른 일원에 대해, 이와 같이 대응하는 지점을 표 1에 도시하며, 이는 인간 에스트로젠 수용체(hERα): 재조합 티로이드 호르몬(rTRα), 레티노이드(hPARγ 및 hRXRα), 글루코코르티코이드(hGR), 프로제스틴(hPR), 미네랄코르티코이드(hMR), 및 안드로젠(hAR)상의 지정된 지점과 대응하는 수 개의 핵 수용체의 리간드 결합 도메인으로부터의 잔기를 포함하는 아미노산 서열(단일 문자 지정)의 배열을 제공한다. 하기 표 1은 단지 예시일 뿐이며 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 따라서, 다른 핵 수용체 예를 들어, 다른 에스트로젠 수용체, 티로이드 수용체, 안드로젠 수용체, 퍼록시좀 수용체, 및 비타민 D 수용체가 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
표 1
본원에서 "보조활성제 결합부위"는 결합 보조활성제에 대해 적절한 기하구조 및 아미노산 잔기를 제공하도록 폴딩된 핵 수용체 폴리펩티드 사슬의 구조적 분편 또는 분편을 의미한다. 이는 보조활성제 결합부위 포켓 또는 공동을 형성하는 3차원 공간내의 단백질 원자의 물리적 배열이다. 상기 아프릴레티 등(Apriletti, et al.)이 기술한 바와 같이, 핵 수용체상의 보조활성제 결합부위를 형성하는 잔기는 도 8에 제시한 바와 같이, C-말단 헬릭스 3(Ile280, Thr281, Val283, Val284, Ala287, 및 Lys288), 및 헬릭스 4(Phe293), 헬릭스 5(Gln301, Ile302, Leu305, Lys306), 헬릭스 6(Cys309), 및 헬릭스 12(Pro453, Leu454, Glu457, Val458, 및 Phe459)에 대응하는(즉, 동일하거나 균등한) 아미노산 잔기이다. 상기 보조활성제 결합부위는 핵 수용체 수퍼패밀리중에서 고도로 보존성이다. 따라서, 상기 부위는 현저한 소수성 클레프트(cleft)를 형성하는 LBD의 표면상의 놀랍게도 작은 잔기 군(cluster)에 대응한다. 상기 소수성 부분은 C-말단 헬릭스 3(Ile280, Val283, Val284, 및 Ala287), 및 헬릭스 4(Phe293), 헬릭스 5(Ile302 및 Leu305), 헬릭스 6(Cys309), 및 헬릭스 12(Leu454, Val458, 및 Phe459)에 대응하는 소수성 잔기에 의해 형성된다. 이들 보조활성제 결합부위의 소수성 부분은 또한 핵 수용체 수퍼패밀리중에서 고도로 보존성이다.
본원의 상기 실시예에 의거하여, 에스트로젠 수용체상의 보조활성제 결합부위를 형성하는 잔기가 상기 인간 TR에 대해 기술한 지점과 대응하는 것이 밝혀졌다. 따라서, ERα상의 보조활성제 결합부위를 형성하는 잔기는 도 8에 제시한 바와 같이, C-말단 헬릭스 3(Leu354, Val355, Met357, Ile358, Ala361, 및 Lys 362), 및 헬릭스 4(Phe367), 헬릭스 5(Gln375, Val376, Leu379, Glu380), 헬릭스 6(Trp383), 및 헬릭스 12(Asp538, Leu539, Glu542, Met543, 및 Leu544)의 인간 ERα 잔기이다. 상기, 핵 수용체 패밀리에 대한 일반적인 기술에서와 같이, 상기 부위는 현저한 소수성 부분을 형성하는 LBD의 표면상의 잔기와 대응하며, C-말단 헬릭스 3(Leu354, Val355, Met357, Ile358, Ala361, 및 Lys 362), 및 헬릭스 4(Phe367), 헬릭스 5(Gln375, Val376, Leu379, Glu380), 헬릭스 6(Trp383), 및 헬릭스 12(Asp538, Leu539, Glu542, Met543, 및 Leu544)의 인간 ERα 잔기에 대응하는 소수성 잔기에 의해 형성된다. 이는 핵 수용체 패밀리 대해 상기 아프릴레티 등이 제시한 데이터를 확증한다.
구조적 분석은 타목시펜 및 다른 SERMs이 리간드 결합 도메인과 결합하는 기전, 블록 보조활성제 결합, 그에 따른 전사활성을 밝혔다. 이에 따라, 리간드 및 보조활성제 결합이 이해되었다. 따라서, 상기한 보조활성제 결합부위 잔기는 본 발명의 방법에 광범위한 적용성을 갖는 보조활성제 의사물질(mimics)를 설계하는데 유용하다. 이러한 "보조활성제 의사물질"은 보조활성제 표면상의 보조활성제 결합부위 인식 영역을 흉내내어 "보조활성제 의사물질"이 보조활성제 결합부위에 대한 보조활성제의 경쟁적 저해제로서 작용하도록 하는, 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 보조활성제 의사물질은 수용체 활성의 측정하고, 작용제는 보조활성제가 보조활성제 결합부위와 결합하는 것을 허용하는 반면에, 길항제가 이러한 결합을 방해한다는 점에서, 시험 화합물의 작용제 또는 길항제 특성을 검정하는데 사용될 수 있다. 또한, 보조활성제 의사물질은 본 발명의 작용제 화합물과 조합하여 투여되는 경우에 치료적 유용성을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 실시예는 일반적으로 리간드 결합 도메인과 결합함에 의해 리간드 수용체와 핵 수용체의 결합을 조절하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 에스트로젠 α 수용체 리간드 결합 도메인 또는 이의 일부의 원자 구조 모델을 사용하여 관심있는 핵 수용체 리간드 결합 도메인과 공간적으로 합치되는 시험 화합물을 모델링하는 단계; 시험 화합물과 상기 결합 도메인의 결합을 특징으로 하는 검정으로 시험 화합물을 스크리닝 하는 단계; 및 핵 수용체와의 리간드 결합을 조절하는 시험 화합물을 동정하는 단계를 포함하며, 상기 원자 구조 모델은 인간 에스트로젠 수용체 α Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525 및 Met528, 바람직하게는 Met343, Met421 His524, Leu525 및 Met528의 잔기와 대응하는 아미노산 잔기의 원자 좌표를 포함한다. 바람직한 방법에서, 상기 핵 수용체는 ER, TR, GR, 및 PR이다. 상기 스크리닝은 통상 시험관내에서 고처리량 스크리닝에 의한다. 적절한 시험 화합물이 설계되거나, 화합물 라이브러리로부터 수득할 수 있으며, 작은 유기 분자, 펩티드, 및 펩티도미메틱스를 포함하나 이는 예시일뿐 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 시험 화합물은 리간드 결합의 작용제 또는 길항제일 수 있다.
본 발명은 또한 핵 수용체의 리간드 결합 도메인내의 주요 잔기를 동정하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 상기 방법은 리간드 및/또는 보조활성제 결합을 조절하는 잔기를 동정하기 위해 관심있는 핵 수용체의 표면을 조사하는 것을 포함한다. 상기 잔기는 본원에 기술된 LBD상의 주요 잔기에 대한 상동성에 의해 동정될 수 있다. 바람직한 방법은, Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525 및 Met528, 바람직하게는 Met343, Met421, His524, Leu525 및 Met528의 인간 ERα 잔기와 대응하는(즉, 균등한) 임의의 핵 수용체의 잔기와의 배열이다. 핵 수용체 LBD, 또는 상기 잔기 또는 대응하는 잔기를 포함하는 이의 일부의 3차원 모델과의 오버래잉 또는 수퍼포지셔닝이 또한 본 목적에 사용될 수 있다. 예를 들어, TR, GR, PR, 및 LBDs의 3차원 구조가 본 목적에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상동성 배열에 의해 동정할 수 있는 핵 수용체는 정상적인 핵 수용체 또는 인간에서 발견되는 핵 수용체와 구조적으로 연관된 단백질, 인간에서 발견되는 핵 수용체의 천연 돌연변이, 동물 및 포유류를 제외한 동물의 기관 예를 들어, 페스트 또는 감염성 기관, 또는 바이러스에서 발견되는 정상 또는 돌연변이 수용체를 포함한다.
배열 및/또는 모델링은 또한 세포의 콘텍스트내의 부위의 특징을 특성화하기 위한, LBD 표면상의 돌연변이의 배치를 위한 가이드로서 사용될 수 있다. 선택된 수용체는 작용제의 경우 글로벌(global) 수용체 구조, 및 용해성을 보존하기 위해, 또는 그러한 구조를 해체시키기 위해, 및 헬릭스 12가 언와인딩되도록 하기 위해, 길항제의 경우에서 처럼 돌연변이 된다. 돌연변이체는 리간드 결합 및 결합 상호작용의 강도에 있어서의 상대적 변화에 대해 시험될 수 있다. 리간드 의존성 보조활성제 상호작용 검정이 또한 본원에서 기술된 바와 같이 이러한 목적을 위해 시험될 수 있다.
특히, 본 발명은 두 개의 화학적으로 관련된 화합물의 결합인 에스트로젠 수용체의 LBD, 작용제, 디에틸스텔베스트롤(DES), 및 타목시펜의 활성 대사산물인 선택적 길항제 4-히드록시타목시펜(OHT)에 대한 구조적 및 기능적 효과에 관한 것이다. 실시예서 기술하는 바와 같이, 공결정으로부터 유도된 원자 모델의 검정과 결합된 돌연변이 및 결합의 연구는 보조활성제 결합부위 및 작용제, DES와 결합된 GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드 서열(서열번호: 4)(즉, p160 보조활성제 GRIP1의 NR 박스 Ⅱ 영역으로부터 유도된 펩티드)을 포함하는 펩티드 분자와 함께 공결정화된 인간 에스트로젠 수용체 리간드 결합 도메인(ERα LBD)의 구조를 제시한다. 또한, 길항제 OHT와 공결정화된 ERα LBD 구조를 보여준다. 실시예는 DES와 결합된 hERα LBD의 2.03Å 간격 결정구조, 보조활성제, 및 OHT와 결합된 hERα LBD의 1.9Å x-선 결정 구조를 제공한다. 즉, 상기 결정은 각각 2.03Å 또는 1.9Å 간격으로 회절한다.
본 발명의 다른 면에서, 관심있는 화합물 즉, 리간드 결합의 작용제 및 길항제가, 핵 수용체와의 리간드 결합의 작용제 또는 길항제를 동정하는 방법에 의해 발견되었다. 상기 방법은 ERα LBD 또는 그의 일부의 원자 좌표를 컴퓨터화된 모델링 시스템에 제공하는 단계, LBD와 공간적으로 합치되는 화합물을 모델링하는 단계, 및 핵 수용체 활성에 대한 검정으로 핵 수용체의 LBD와 결합함에 의해 핵 수용체의 활성을 증가시키거나 감소시키는 화합물을 동정하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 원자 좌표는 인간 에스트로젠 수용체 α Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525 및 Met528, 바람직하게는 Met343, Met421 His524, Leu525 및 Met528의 잔기와 대응하는 아미노산 잔기이다. 특히 관심있는 화합물은 리간드 결합 도메인과 공간적 및 우선적으로 합치되는 화합물이다. "그의 공간적 및 우선적으로"는 핵 수용체 LBD와 선택적으로 상호작용하기 위한 3차원의 구조 및 콘포메이션을 갖는 화합물이다. LBD와 공간적 및 우선적으로 합치되는 화합물은 상기 부위의 소수성 부분을 형성하는 아미노산 잔기와 상호작용한다. 본 발명은 또한 핵 수용체의 활성을 선택적으로 조절할 수 있는 화합물을 동정하기 위한 방법을 포함한다. 상기 방법은 핵 수용체의 원자 구조 모델을 이용하여 관심있는 핵 수용체의 LBD와 공간적 및 우선적으로 합치되는 시험 화합물을 모델링하는 단계, 핵 수용체의 LBD와 시험 화합물의 우선적 결합을 특징으로 하는 핵 수용체 활성에 대한 검정으로 시험 화합물을 스크리닝 하는 단계, 및 핵 수용체 활성을 선택적으로 조절하는 시험 화합물을 동정하는 단계를 포함한다. 이러한 수용체 특이적 화합물이 선택되어 핵 수용체의 제 1 유형 대 핵 수용체의 제 2 유형의 LBDs 사이의 차이를 이용할 수 있게 한다.
본 발명은 또한 핵 수용체 아이소폼을 구별하는 신규 화합물의 제조에 적용될 수 있다. 이는 조직 특이적이거나 기능 특이적인 화합물의 제조에 사용될 수 있다. 예를 들어, GR 서브패밀리의 일원은 통상, 비록 예외가 있기는 하지만, 하나의 유전자에 의해 엔코딩된 하나의 수용체를 갖는다. 예를 들어, 다른 AUG 코돈으로부터의 선택적 개시에 의해 동일한 mRNA로부터 번역된 PR 아이소폼, A 및 B가 존재한다. 두 개의 GR 형태가 존재하며, 이중 하나는 리간드와 결합하지 않는다. 상기 방법은 특히, 일반적으로 두 개 이상(ER:α,β)의 유전자에 의해 엔코딩된 수개의 수용체를 갖거나, 선택적인 RNA 스플라이싱(splicing)을 가지는 ER 서브패밀리에 적용할 수 있다.
본 발명의 상기 수용체 특이적 화합물은 바람직하게는 핵 수용체의 제 2 유형과 비교하여 제 1 유형의 핵 수용체중에 보존된 LBD의 콘포메이션적으로 속박된 잔기와 상호작용한다. "콘포메이션적으로 속박"은 다양한 국소 기하학 및 물리-화학적 속박에 의해 고정된 결합의 주변으로 특정 회전을 가지는 화학물 또는 그의 부분의 3차원 구조를 의미한다. LBD의 콘포메이션적으로 속박된 구조의 특색은 다양한 기하학적 및 물리-화학적 속박 예를 들어, 국소 골격, 국소 측쇄, 및 토폴로지성 속박에 의해 고정된 본래의 유연성 콘포메이션을 가지는 잔기를 포함한다. 이러한 유형의 속박은 수용체-보조활성제 인식 및 결합내에 포함된 원자의 배치를 제한하는데 이용된다.
본 발명은 또한 핵 수용체 결정에 기초한 핵 수용체의 3차원 모델을 이용하는 컴퓨터화된 방법을 제공한다. 일반적으로, 핵 수용체 리간드의 컴퓨터화된 설계 방법은 핵 수용체 LBD의 어느 아미노산 또는 아미노산들이 리간드의 화학 성분(하나 이상)과 상호작용하는가를 결합 리간드를 지닌 핵 수용체 LBD를 포함하는 결정화 단백질의 3차원 모델을 사용하고, 상호작용성 아미노산과 화학 성분과의 상호작용을 증가시키거나 감소시키는 구조를 지닌 2차 화학 성분을 생성시키는 화학 성분의 변형(하나 이상)을 선택하여 결정한다. 본 발명에서, DES/펩티드를 지닌 hERα의 구조와 OHT를 지닌 hERα의 결정 구조는 상기 아미노산 잔기가 hERα Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525, 및 Met528, 바람직하게는 Met343, Met421 His524, Leu525 및 Met528의 잔기와 대응함을 보여주었다.
따라서, 본 발명의 한 구체예는 핵 수용체 리간드를 설계하는 컴퓨터화된 방법이며, 여기서 인간 수용체 에스트로젠 α Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525, 및 Met528, 바람직하게는 Met343, Met421 His524, Leu525 및 Met528의 잔기와 대응하는 핵 수용체 LBD의 하나 이상의 아미노산 잔기가 리간드의 하나 이상의 제 1 화학 성분과 상호작용하고, 아미노산과 제 1 화학성분 사이의 상호작용과 비교하여, 아미노산과 제 2 화학성분과의 상호작용을 증가시키거나 감소시키는 구조를 지닌 제 2 화학성분을 생성시키기 위한, 제 1 화학 성분의 하나 이상의 화학적 변형을 선택하는 단계를 포함한다.
상기 컴퓨터화된 방법은 제 1 화학 성분의 화학적 변형 후에, 상호작용하는 아미노산과 리간드 사이의 상호작용의 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 화학적 변형은 제 1 화학 성분과 상호작용하는 아미노산과의 상호작용과 비교하여, 제 2 화학 성분과 상호작용하는 아미노산 사이의 수소결합 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용, 반데르 발스 상호작용 또는 양극성 상호작용을 증강시키거나 감소시킬 수 있다.
화학적 변형은 종종 LBD 아미노산의 원자와 LBD 리간드의 원자의 상호작용을 증가시키거나 감소시킨다. 입체적인(steric) 방해가 활성화 도메인을 지닌 LBD 결합 공동의 상호작용을 변화시키는 공통적인 수단이 될 것이다. 화학적인 변형은 바람직하게는 리간드의 C-H, C-, 및 C-OH 지점에서 유도되며, 여기서 탄소 부분은 변형 종결 후에 동일한체로 유지되는 리간드의 구조 부분이다. C-H의 경우에, C는 1, 2, 또는 3개의 수소원자를 가질 수 있으나, 통상 단지 하나의 수소원자가 치환된다. 상기 H 또는 OH는 변형후에 제거되고, 바람직한 성분으로 치환된다.
이러한 화학적인 변형은 바람직하게는 우선적으로 hERα Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525, 및 Met528, 바람직하게는 Met343, Met421 His524, Leu525 및 Met528에 대응하는 하나 이상의 잔기와 상충되거나 결합하도록, DES의 A'고리의 유리 탄소중 어느 하나상에 상기 치환체를 배치시키는 치환체의 부가를 포함한다. 일반적인 치환체로는 소수성기, 알킬기 예를 들어, 에틸, 프로필, 이소프로필 등, 및 방향족기 예를 들어, 벤질기 등을 포함하나 이는 예시이며 이에 한정되는 것은 아니다.
실질적으로, 당업자는 화학적 골격으로서 관심있는 핵 수용체에 대한 공지의 리간드로부터 시작하여, 이에 기초하여 작용제/길항제를 설계할 수 있다. 공지의 리간드는 상기한 바와 같이 변형될 수 있다. 예를 들어, 17β-에스트라디올은 hERα에 대한 내재성 리간드이다. 에스트라디올의 경우에, 관심있는 지점은 C6α, C7α, C12α, C15α, 및 C17α이다. 17β-에스트라디올 골격상의 하나 이상의 상기 유리 탄소의 변형은 하나 이상의 Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525, 및 Met528, 바람직하게는 Met343, Met421 His524, Leu525, 및 Met528 잔기와의 상호작용에 영향을 줄 것이다.
다른 공지 리간드의 화학적 골격이 유사한 방법으로 이용될 수 있다. 예를 들어, 다른 공지의 작용제는 디에틸스틸베스트롤(합성), 모제스트롤(합성), 메소헥세스트롤(합성), 코우메스트롤(클로버), △9-THC(canabis), o.p-DDT(살충제), 지아랄레논(진균류), 및 케톤(살충제)를 포함한다. 공지의 에스트로젠 수용체 길항제는 변형된 스테로이드의 ICI 계열 예를 들어, ICI 164,384, 및 EM800를 포함한다. 공지의 SERM's는 타목시펜, 라프록시펜, 및 GW5638을 포함한다.
또한, 공지의 작용제는 컴퓨터화되거나 매뉴얼상의 도킹을 통해 리간드 결합 포켓내로 배치될 수 있다. 다음, 치환을 위한 배치는 이들 화합물의 예측되는 결합 배향에 기초하여 선택된다. 또한, 헬릭스 12가 작용제 결합 지점을 차지하는 것을 방지하는 측쇄를 갖는 하이브리드 분자가 생성될 수 있다. 신규한 SERMs가 두 개의 다른 효과 즉, 헬릭스 12의 치환 및 2차 구조의 해제를 변형시킴에 의해 제조될 수 있다.
길항제를 제조하기 위한 종래의 노력은 커다란 크기의 치환체를 통상 시행착오를 통해 작용제에 부착시키는 것을 포함하며, 본원에 기술된 상기 약제의 설계는 새로운 강력한 길항제의 개발에 매우 중요할 수 있는, 리간드 설계의 대안적인 전략을 제공한다.
모델링을 위해, 도킹 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램이 리간드 결합 도메인과 합치되는 화합물을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 도킹 프로그램이 어떻게 관심있는 분자가 핵 수용체 LBD와 상호작용할 수 있는가를 예측하는데 사용될 수 있다. 단편-기재 도킹이 또한 분자내 상호작용을 최적화시키기 위해, 부위를 보충하는 화학적 단편을 치환시킴에 의해 LBD내의 de novo 분자를 구축하는데 사용될 수 있다. 상기 기술은 결합 상호작용의 기하구조를 최적화시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 설계 접근은 LBD구조의 동정을 가능하게하며, 따라서 분자 인식 원칙이 상기 부위에 상보적인 화합물의 설계에 이용될 수 있다. LBD와 합치되는 화합물은 반복적인 설계, 합성, 및 이에 대한 개시 지점으로서 작용하며, 여기서 신규 화합물이 친화성, 효율, 및 선택성을 포함하는 바람직한 특성에 대해 선택된다. 예를 들어, 상기 화합물은 추가적인 변형 예를 들어, 특정 계열의 결합 화합물에 대해 동정된 중심 구조의 R-기 치환체의 치환 및/또는 첨가, 필요한 경우 모델링 및/또는 활성 스크리닝을 수행시킬 수 있으며, 다음 부가의 시험 단계를 수행시킬 수 있다.
컴퓨터화된 작은 분자의 데이터베이스가 관심있는 핵 수용체 리간드 결합 도메인과 전체 또는 부분적으로 결합할 수 있는 화학물체(chemical entities) 또는 화합물을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 스크리닝에서, 상기 화학물체 또는 화합물이 결합부위와 꼭 합치되는 자질은 형상 상보성에 의해 판단되거나(DesJalais et al., J. Med. Chem. 31:722-729(1988)), 상호작용 에너지에 의해 판단될 수 있다(Meng, et al., J. Comp. Chem. 13:505-524(1992)). 상기 분자 데이터 베이스는 임의의 시각적 또는 물리적 데이터베이스 예를 들어, 전자적 및 물리적 화합물 라이브러리 데이터베이스를 포함하며, 바람직하게는 보조활성제 결합을 조절하는 화합물의 개발에 사용된다.
화합물은 정량적인 구조 활성에 대한 이해에 의한 이용가능한 구조 및 기능 정보를 사용함에 의해 지적으로 설계될 수 있으며, 이러한 이해를 신규 화합물 라이브러리 특히, 하나 이상의 중심구조의 특정 기의 화학적 다양성을 가지는 라이브러리에 포커싱된 라이브러리를 이용하고, 임의의 구조적 데이터를 반복적인 설계과정에 통합시킴에 의한다. 예를 들어, 당업자는 화학물체 또는 단편을 연관시킬 수 있는 이들의 능력을 스크리닝하기 위한 수개의 방법 중 어느 하나를 사용할 수 있을 것이다. 이러한 방법은 예를 들어, 컴퓨터 스크린상의 LBD의 육안관찰로부터 시작할 수 있다. 다음 선택된 단편 및 화학물은 부위의 전부 또는 일부내로 배치될 수 있다. 도킹은 소프트웨어 예를 들어, Quanta and Sybyl을 사용하여 수행되고, 후속하여 표준 분자 역학 역장(force-field) 예를 들어, CHARMM 및 AMBER을 사용하여 에너지 최소화 및 분자 동력학을 수행할 수 있다.
전문화된 컴퓨터 프로그램이 화학 물질 단편 또는 전체 화합물의 선택공정을 보조할 수 있다. 이는 하기를 포함한다: GRID(Goodford. J. Med. Chem. 28:849- 857(1985), 옥스포드 대학으로부터 입수가능, Oxford UK); MCSS(Miranker. et. al., "Proteins: Structure, Function and Genetics" 11:29-34(1991), Molecular Simulations로부터 입수가능, Burlington, MA); AUTODOCK(Goodsell, et. al., "Proteins: Structure, Function and Genetics" 8:195-202(1990), Scripps Research Institute로부터 입수가능, La Jolla, CA); 및 DOCK(Kuntz, et al., J. Mol. Biol. 161:269-288(1982), 캘리포니아 대학으로부터 입수가능, San Francisco, CA).
작은 분자 화합물을 위한 부가의 시판중인 컴퓨터 데이터 베이스는 Cambridge Structural Database and Fine Chemical Database(Rusinko, Chem. Des. Auto. News8:44-47(1993))을 포함한다.
일단 적합한 화학물질 또는 단편이 선택되면, 이들은 하나의 화합물로 합체될 수 있다. 합체는 핵 수용체의 구조 좌표와 관련하여 컴퓨터 스크린상에 제시된 3차원 영상위에 단편들 상호간의 관련성에 대한 육안조사가 수행된다.
독립적인 화학물체 또는 단편을 연결시키는데 있어, 당업자가 이용할 수 있는 것으로는 하기를 포함한다: CAVEAT(Bartlett, et al., "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules", in Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems, Special Pub., Royal Chem. Soc. 78:182-196(1989), 캘리포니아 대학으로부터 입수 가능, Berkeley, CA); 3D 데이터 베이스 시스템 예를 들어, MACCS-3D(MDL Informational Systems, San Leandro, CA, reviewed in Martin, J. Med. Chem. 35:2145-2154(1992)); 및 HOOK(분자 시뮬레이션으로부터 입수가능, Burlington, MA).
또한, 단계적으로 화합물을 구축시키기 위해, 관심있는 리간드 결합 도메인과 결합하는 화합물, 상기한 화학물질 또는 단편이, 전체로서 또는 de novo 형식으로, 채워지지 않은 LBD 또는 임의의 부위와 결합하는 것으로 알려진 분자의 일부 예컨대, 공지의 리간드를 포함하는 LBD를 이용하여 설계될 수 있다. 이러한 방법은 하기를 포함한다: LUDI(Bohm, J. Comp. Aid. Molec. Design 6:61-78(1992), Biosm Technologyes로부터 입수가능, San Diego, CA); LEGEND(Nishbata, et al., Tetrahedron 47:8985(1991), Molecular Simulations로부터 입수 가능, Burlinton, MA); 및 Leapfrog(Tripos Associations로부터 입수 가능, St. Louis, MO).
다른 분자 모델링 기법이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Cohen et al., J. Med. Chem. 33:883-894(1990) and Navia, et al., Current Opinions in Structural Biology 2:202-210(1991))을 참고할 수 있다. 예를 들어, 시험 화합물의 구조가 알려진 경우에, 시험 화합물 모델은 본 발명의 구조 모델과 포개어질 수 있다. 이러한 과정을 수행하기 위한 다양한 방법 및 기법이 당업계에 알려졌으며, 이중 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Farmer, "Drug Design" 10:119-143, Ariens, ed., Academic Press, New York(1980); 미국 특허 제 5,331,573호; 미국 특허 제 5,500,807호; Verlinde, Structure 2:577-587(1994); 및 Kuntz, et al., Science 257:1078-1082(1992))을 참고할 수 있다. 본원에 기술된 모델 구축 기법 및 컴퓨터 평가 시스템은 본 발명에 제한되는 것은 아니다.
이러한 컴퓨터 모델링 시스템을 사용하여, 많은 화합물이 신속하고 용이하게 조사될 수 있으며, 고비용과 장시간의 생화학적 시험을 회피할 수 있다. 또한, 많은 화합물에 대한 실제 합성의 필요성이 실질적으로 감소되고/또는 효과적으로 제거되었다.
모델링을 통해 동정된 화합물은 당업계에 잘 알려진 것과 같은 검정으로 스크리닝될 수 있다. 이러한 검정은 생물학적 검정을 포함하며, 화합물과 리간드 결합 활성에 대해 관심있는 리간드 결합 도메인과의 결합을 특징으로 한다. 스크리닝은 예를 들어, 시험관내에서 및/또는 체내에서, 세포 배양액에서 수행할 수 있다. 바람직하게는, 생물학적 스크리닝은 활성-기제 반응 모델, 결합 검정(이는 화합물이 수용체와 얼마나 잘 결합하는가를 측정한다), 및 세균, 효모, 및 동물 세포주(이는 세포내에서의 화합물의 효과를 측정한다)에 중점을 둔다. 이러한 검정은 고용량-고처리량 스크리닝을 위해 자동화 될 수 있으며, 여기서 많은 수의 화합물이 목적하는 활성을 지닌 화합물의 동정을 위해 시험될 수 있다.
예를 들어, 시험관내 결합 검정이 수행되고, 여기서 화합물이 관심있는 리간드 결합 도메인과 리간드, 단편, 융합 또는 그의 펩티드의 결합을 블로킹하는 능력에 대해 시험된다. 세포 및 조직 배양물 검정에서, 화합물이 세포 보조활성제 예를 들어, 보조활성제 단백질의 p160 패밀리 예컨대, SRC-1, AIB1, RAC3, p/CIP, 및 GRIP1 및 이의 상동체 TIF2 및 NcoA-2, 및 수용체 및/또는 아이소폼 특이적 결합 활성을 나타내는 보조활성제의 기능을 블로킹하는 능력에 대한 시험이 수행된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 화합물은 리간드 결합 화합물과 내재성 리간드 보다 훨씬 더 큰 친화성으로 결합한다. 조직 프로필링 및 적절한 동물 모델이 또한 화합물을 선택하는데 사용될 수 있다. 다른 세포형 또는 조직이 이러한 생물학적 검정을 위해 사용될 수 있다. 이러한 스크리닝을 위한 적절한 검정이 문헌에 기술되어 있으며(Shibata, et al., Recent Prog. Horm. Res. 52:141-164(1997); Tagami, et al., Mol. Cell. Biol. 17(5):2642-2648(1997); Zhu, et al., J. Biol. Chem. 272(14):9048-9054(1997); Lin. et al., Mol. Cell. Biol. 17(10):6131-6138 (1997); Kakizawa, et al., J. Biol. Chem. 272(38):23799-23804(1997); 및 Chang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(17):9040-9045(1997)), 이들 문헌은 본원에 참고로서 통합된다.
상기 선택된 화합물은 작용제 및/또는 길항제로서 특성을 가질 수 있다. 상기 화합물은 또한, 호르몬 의존성이거나 호르몬 의존성이 아닌, 핵 수용체의 다른 활성의 콘텍스트내에서 선택적 리간드 결합의 효과에 따르는, 작용제와 길항제 활성의 다양한 혼합에 따라 신규한 특성을 나타내는 화합물을 포함할 수 있으며, 이들 화합물은 보조활성제 보다는 단백질에 의해 매개되고, 보조활성제 결합부위에서 보다는 로케이션에서 수용체와 상호작용한다. 상기 화합물은 또한 호르몬 결합에 대해 콘포메이션적으로 민감성인 수용체 로케이션과의 결합을 통해 수용체의 호르몬 결합 콘포메이션을 안정화 또는 탈안정화시킴에 의해거나, 또는 호르몬의 결합에 의해 수용체내에 유도되는 동일, 유사, 또는 다른 콘포메이션 변화를 직접 유도함에 의해, 수용체상에 알로스테릭(allosreric) 효과를 가져온다.
특별한 관심은 공간적 및 우선적으로 관심있는 핵 수용체의 리간드 결합 도메인내에 합치되는 화합물을 이를 필요로하는 포유동물에 충분한 양으로 투여함에 의해 포유동물내에서 핵 수용체 활성을 조절하는 방법에 상기 화합물을 이용하는 용도이다. "조절"은 핵 수용체의 활성을 증가시키거나 감소시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 예비 임상 화합물이 적절한 포유동물 모델내에서 효율, 흡착, 약동학 및 독성을 측정하기 위해 시험될 수 있으며, 후속하여 당업계에 공지인 표준 방법이 사용될 수 있다. 다음, 목적하는 특성을 보이는 화합물이 다양한 핵 수용체 관련 질환의 치료용 용도에 대해 임상 시험될 수 있다. 이는 ER 관련 질환 예를 들어, 에스트로젠 생성의 손실로부터 초래되는 페경기 후의 징후 및 암, 및 종래의 에스트로젠 대체 치료에 의해 기인되는 골다공증 및 심장혈관을 포함한다. 다른 것은 Ⅱ형 당뇨병 및 감염성 질환 예를 들어, 관절염을 포함하는 GR 관련 질환을 포함한다.
비록 많은 핵 수용체에 있어, 그 목적은 신규한 합성 작용제 또는 길항제를 발견하는 것일지라도, 표적 조직에 대한 바람직한 작용제 및 길항제 효과를 갖는 개발중인 화합물의 핵 수용체 특히, 에스트로젠 수용체에 대한 가치를 파악하는 것은 중요하다. 이러한 화합물은 본원에 기슬된 방법에 따라 발견 및/또는 설계될 수 있으며, 당업계의 공지의 방법에 따라 조직 특이성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 현재의 치료법 및 심장혈관 및 뇌 조직에서의 에스트로젠 수용체와 같이 작용하는 신규 작용제, 및 자궁 및 유방 조직에서 에스트로젠에 작용하는 신규한 길항제의 개발에 대한 개선의 필요성이 매우 크다. 이상적으로, 하나 이상의 이러한 특성을 가진 화합물 즉, 하나의 조직에서 작용제로서 작용하는 반면에, 다른 조직에서는 길항제로서 작용하는 화합물이 있을 수 있다. SERMs의 상기 조직 특이적 길항제 예를 들어, OHT 및 RAL은 다양한 요인(Grainger, et al., Nature Medicine 2(4):381-385(1996); 상기 Grease, et al.; alc Jordan, J. Natl. Cancer Inst. 90:967-71(1998)), 이들 리간드의 기전의 해체는 이들이 LBD에 어떻게 작용하고, 다른 세포 인자와의 작용을 어떻게 조절하는가에 대한 이해가 요구된다. 본 발명은 놀랍게도, 리간드 매개 구조가 리간드 결합 포켓 내부 및 주변을 교란시키고, 단순한 측쇄 효과만은 아니며, 수용체 길항작용에 기여하는 것을 보여주었다. 따라서, 이들 두가지 효과 사이의 균형을 조절함에 의해 개선된 SERMs의 설계에 대한 신규한 전략을 제공한다.
이러한 지식을 토대로, 인간 에스트로젠 수용체 α Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525, 및 Met528, 바람직하게는 Met343, Met421 His524, Leu525 및 Met528의 잔기와 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시키는 치료적 화합물을 설계하는 것이 특수한 관심이다. 따라서, 본 발명의 일면은 핵 수용체 활성이 필요한 포유동물에 관심있는 핵 수용체의 리간드 결합 도메인과 공간적 및 우선적으로 합치되는 충분한 양의 리간드를 투여함에 의해 핵 수용체 활성을 조절하는 방법이며, 여기서 상기 리간드는 컴퓨터화된 방법에 의해 설계되고, 여기서 hERα Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394,Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525, 및 Met528, 바람직하게는 Met343, Met421 His524, Leu525 및 Met528와 대응하는 하나 이상의 핵 수용체 LBD의 아미노산 잔기가 리간드의 제 1화학 성분과 상호작용한다. 이러한 방법은 상호작용성 아미노산과 제 1 화학 성분의 상호작용과 비교하여, 상호작용성 아미노산과 제 2 화학 성분사이의 상호작용을 증가시키거나 감소시키는 구조를 지닌 제 2 화학 성분을 생성시키기 위해, 제 1 화학 성분의 하나 이상의 변형을 선택하는 것을 포함한다.
상기 방법에 의해 설계된 화합물은 작용제이거나 길항제이며, 핵 수용체 활성을 조절하는 방법은 작용제 단독 투여, 길항제 단독 투여 또는 보조활성제 또는 보조활성제 결합부위와 결합하여 보조활성제를 모방하는 화합물과 함께 결합시킨 작용제를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
상기 보조활성제는 공지의 보조활성제일 수 있다. 상기 보조활성제는 컴퓨터화된 방법으로 설계될 수 있으며, 여기서 hERα 헬릭스 3 잔기 Leu354, Val355, Met357, Ile358, Ala361, 및 Lys 362, 및 헬릭스 4 잔기 Phe367, 헬릭스 5 잔기 Gln375 Val376, Leu379, 및 Glu380, 헬릭스 6 잔기 Trp383, 및 헬릭스 12 잔기 Asp538, Leu539, Glu542, Met543, 및 Leu544에 대응하는 핵 수용체 보조활성제의 하나 이상의 아미노산 잔기가 보조활성제 유사체의 하나 이상의 제 1 화학 성분과 상호작용한다. 상기 방법은 상호작용성 아미노산과 제 1 화학 성분의 상호작용과 비교하여, 상호작용성 아미노산과 제 2 화학 성분사이의 상호작용을 증가시키거나 감소시키는 구조를 지닌 제 2 화학 성분을 생성시키기 위해, 제 1 화학 성분의 하나 이상의 변형을 선택하는 것을 포함한다.
보조활성제 또는 보조활성제 의사물질과 결합한 작용제의 용도는 또한 신규한 조직 특이성 효과를 가지는 치료제를 전달하기 위한 독특한 수단을 제공한다. 예를 들어, 보조활성제 의사물질은 헬릭스 12가 그의 작용제 결합부위에 있는 경우에 한하여 전사활성과 관련된 부위로 결합되도록 설계될 수 있다. 만약 이러한 보조활성제 의사물질이 특정 수용체의 상기 부위에 대해 특이적인 경우, 상기 수용체를 단지 작용제가 있을 경우에만 선택적으로 저해할 수 있도록 할 수 있다. 이는 내재 작용제의 수준에 기초한 신규하고, 조직 특이적인 길항제를 유도할 수 있다. 본 발명에 의해 설계된 작용제는 보조활성제 의사물질의 특이성을 측정하기 위한 검정에 사용될 수 있다. 또한, 주어진 조직내의 유효 수준은 본 발명의 방법에 따라 설계된 공지의 작용제 또는 길항제에 의해 조절될 수 있다. 본원에 기술된 상기 LBD/DES/GRIP1 펩티드 복합체의 결정구조는 표적화될 것이 요구되는 결합부위를 정확하게 한정한다.
실시에에 기술한 바와 같이, ER LBDs는 보조활성제 결합부위와 결합된 GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드 서열(서열번호: 4) 및 2.03Å의 간격으로 정제된 공결정 구조를 지닌 DES를 포함하는 펩티드 분자와 함께 공결정화되고, 1.9Å 간격의 정제된 공결정 구조를 지닌 OHT와 공결정화된다. 따라서, 본 발명은 또한 리간드 결합 도메인과 결합된 리간드 및 보조활성제 결합부위와 결합된 분자를 지닌 핵 수용체 리간드 결합 도메인으로부터 제조된 결정을 제공하기 위한 방법이다. 바람직하게는, 상기 공결정 구조는 3.6Å 초과의 간격으로 정제 즉, 3.6Å 미만의 간격을 갖는다. 보다 더 바람직하기로는, 상기 공결정은 3.4Å, 3.2Å, 3.0Å, 2.8Å, 2.6Å, 2.4Å, 2.2Å 초과로 정제되며, 훨씬 더 바람직하기로는 2.03Å 초과의 간격으로 정제된다. 본 발명은 리간드 결합 도메인과 결합된 리간드를 지닌 핵 수용체 리간드 결합 도메인으로부터 제조된 공결정을 추가로 제공한다. 바람직하게는, 상기 공결정 구조는 3.6Å 초과의 간격으로 정제된 즉 3.6Å 미만의 간격을 갖는다. 보다 더 바람직하기로는, 상기 공결정은 3.4Å, 3.2Å, 3.0Å, 2.8Å, 2.6Å, 2.4Å, 2.2Å 초과로 정제되며, 훨씬 더 바람직하기로는 1.9Å 초과의 간격으로 정제된다.
결정은 일반적으로 예를 들어, E. coli와 같은 세포 배양물에 의해 발현된 정제 핵 수용체 LBDs로부터 제조된다. E. coli는 종종 바람직한 발현 시스템이다. 상기 티로이드 수용체가 E. coli에서 성공적으로 발현되었다(참고문헌: 상기 Apriletti et al.). 그러나, 인간의 열 쇼크 단백질이 에스트로젠 수용체의 성공적인 재조합 발현에 요구된다는 것이 오랜기간 믿어져왔다. 따라서, 에스트로젠 수용체가 E. coli내의 활성 단백질로서 발현될 수 있을 것이라고는 예상되지 않았다.
바람직하게는, 동일한 핵 수용체에 대한 다른 결정(공결정)이 다른 보조활성제 계열 단백질 예를 들어, 단백질 단편, 융합 또는 작은 펩티드를 사용하여 분리적으로 제조된다. 상기 보조활성제 계열 단백질은 바람직하게는 보조활성제 결합부위, 또는 NR 박스 서열의 유도체와 결합하는데 필요한, NR 박스 서열을 함유한다. 다른 분자 예를 들어, 보조활성제 또는 호르몬 결합부위와 결합하는 작은 기관이 공결정화에 사용될 수 있다. 무거운 원소 치환체가 LBD 및/또는 공결정화 분자중에 사용될 수 있다.
공결정의 3차원 구조에 대한 측정 후, 상기 구조 정보는 핵 수용체에 대한 합성 화합물을 설계하기 위해 컴퓨터화된 방법 중에 이용될 수 있으며, 구조 활성 관계가 본원 및 공지의 검정을 사용하는 일반적인 시험을 통해 추가로 측정될 수 있다.
부록 1 및 2에 제공한 바와 같이 핵 수용체 LBD가 하나 이상의 결정형 중에 상기한 수용체 또는 그의 일부의 구조 좌표를 결정화시키므로, 핵 수용체의 상기 다른 결정형의 구조를 밝히는 것이 특히 유용하다. 이는 또한 충분한 상동성을 가지는 돌연변이체 또는 공복합체의 구조를 밝히는데 이용될 수 있다.
DES-ERα LBD-GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드 복합체에 대한 부록 1 및 OHT-ERα LBD 복합체에 대한 부록 2가 브룩하벤 국립 라이브러리 단백질 정보 은행(Brookhaven National Laboratory Protein Data Bank)에 기탁되었고, 기탁 번호(Brookhaven Protein Data Bank Accession Numbers 2erd 및 2ert)를 부여 받았다. 상기 방법은 미지의 결정에 대한 정밀한 구조를 예컨대, ab initio와 같은 정보를 측정하기 위해 시도하는 것 보다 더 신속하고 효과적으로 제공할 수 있다.
본 발명의 결정으로부터 수집된 원자 좌표 자료를 축적시킬 수 있다. 바람직한 구체예에서, 장치 해독 데이터 저장 매체 형태로 제공될 수 있다. 상기 매체는 리간드 결합 도메인 또는 그의 일부의 구성 및/또는 조작을 위한 정보를 포함할 수 있다. 예를 들어, 장치 해독성 매체는 hERα Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525, 및 Met528, 바람직하게는 Met343, Met421 His524, Leu525, 및 Met528, 또는 상기 부위를 포함하는 분자 또는 분자 복합체의 상동체와 대응하는 아미노산의 구조 좌표를 포함한다. 상기 상동체는 아미노산의 골격 원자로부터 1.5Å이하의 제곱평균루트 편차를 가지는 LBD를 포함한다. 하나의 바람직한 분자 및 복합체는 LBD와 결합된 화합물을 나타낸다.
장치 해독성 데이터 저장 매체는 상호작용성 약제의 설계 및 분자 치환 연구에 이용될 수 있다. 예를 들어, 데이터 저장 재료는 제 2 세트의 장치 해독성 데이터와 결합될 수 있는 제 1 세트의 장치 해독성 데이터로 엔코딩될 수 있다. 분자 치환의 경우에, 제 1 세트의 데이터는 관심 있는 핵 수용체 또는 그의 일부의 구조 좌표의 일부 이상의 푸리에르(Furier) 전환을 포함할 수 있으며, 제 2 세트의 데이터는 관심있는 분자 또는 분자 복합체의 X-선 회절 패턴을 포함한다. 제 1 및 제 2 세트의 데이터를 이용하기 위한 지침과 함께 프로그래밍된 장치를 사용하여 제 2 세트의 데이터와 대응하는 일부 또는 전부의 구조 좌표가 측정될 수 있다.
본원에 기술된 결정 및 분석을 위한 단백질은 공지 및 본원에 기술된 발현 및 정제 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 높은 수준의 핵 수용체 LBD의 발현이, 적절한 발현 숙주 예를 들어, E. coli에서 얻어질 수 있다. 예를 들어, E. coli에서의 LBD의 발현은 ERα LBD, 및 GR 및 PR을 포함하는 다른 핵 수용체를 포함한다. 이들 핵 수용체가, ER의 발현을 제외하고는 일반적으로 세균에서 발현되는 것이 보다 더 어려우므로, 효모 및 다른 진핵세포성 발현 시스템이 열 쇼크 단백질과 결합하는 핵 수용체와 함께 사용될 수 있다. 대표적인 핵 수용체 또는 이들의 리간드 결합 도메인이 클로닝되고 서열화되었다: 인간 ER(참고문헌: Seielstad, et al., Molecular Endocrinology 9(6):647-658(1995), 본원에 참고로서 통합됨), 인간 GR, 인간 PR. 이들 수용체 각각에 대한 LBD가 동정되었다.
보조활성제 단백질은 당업계의 공지의 방법 특히, 이미 클로닝 및/또는 발현된 보조활성제 단백질의 p160 패밀리의 일원 예를 들어, SRC-1, AIB1, RAC3, p/CIP, 및 GRIP1 및 이의 상동체 TIF2 및 NcoA-2를 사용하여 발현될 수 있다. 보조활성제 단백질의 바람직한 발현 방법은 전사작용 활성을 가지는 단편을 GRIP1 발현에 대한 문헌(Hong, et al., Mol. Cell. Biol. 17:2735-44(1997) and Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(10):4948-52(1996))상의 "Song and Field" 방법(또한, "효모 2-하이브리드"로 언급됨)을 사용하여 발현시키는 것이다.
상기 단백질은 성숙한 또는 전장(full-legth) 서열의 단편으로서 단독으로 발현되거나, 이형(heterogous) 서열과 융합함으로서 발현될 수 있다. 예를 들어, ERα는 DBD 또는 아미노 말단 도메인의 어떠한 부분이 없이도 발현될 수 있다. LBD와 인접하는 아미노산과 함께 추가의 구조적 정보가 필요한 경우, DBD 또는 아미노 말단의 일부가 포함될 수 있다. 일반적으로, 결정에 대해 사용된 ERα LBD는 320 아미노산 길이 미만이다. 바람직하게는, 상기 ERα LBD는 220 아미노산 이상의 길이이며 가장 바람직하게는 250 아미노산 길이 이상이다. 예를 들어, 결정화를 위해 사용된 LBD는 ERα의 297 내지 554 아미노산 스패닝을 포함할 수 있다.
통상적으로, 상기 LBDs는 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 질량 분석계(MS), 및 소수성 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 측정될 수 있다. 상기 결정화를 위해 정제된 LBD는 97.5% 이상의 순도, 바람직하게는 99.05 이상의 순도, 및 보다 더 바람직하게는 00.5% 이상의 순도여야 한다.
초기에, 리간드 결합되지 않은 수용체의 정제는 공지 방법 예를 들어, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HPLC), 및 헤파린 친화성 크로마토그래피에 의해 수득될 수 있다. 핵 수용체, 특히 에스트로젠 수용체의 개선된 결정을 위한 보다 더 높은 순도를 달성하기 위해, 상기 수용체는 수용체를 전하에 따라 분리하는 컬럼 예를 들어, 이온교환 또는 소수성 상호작용 컬럼을 사용하여 분리하고, 다음 용출된 수용체를 리간드 특히 작용제와 결합시키는 컬럼을 사용하여 리간드-시프트 정제시킬 수 있다. 상기 리간드는 수용체의 표면전하내에 하전을 유도하여 리간드 결합된 수용체가 리간드가 결합되지 않은 수용체와 다른 위치에서 융출되도록한다. 일반적으로 포화 농도의 리간드가 사용되고, 단백질은 리간드를 컬럼에 통과시키기 전에 예비 인큐베이팅된다. 본원에 기술된 구조적 연구는 결정화를 위한 매우 높은 순도의 핵 수용체를 수득하기 위한, 상기 방법의 일반적인 적용가능성을 지시한다.
정제는 또한 예를 들어, 단백질의 말단 예를 들어, N 말단에 위치하도록 조작된 히스티딘 아미노산을 지닌 정제 핸들 또는 "태그"를 사용하고, 후속하여 니켈 또는 코발트 컬럼을 사용함에 의해 완성될 수 있다(참고문헌: Janknect, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8972-8976(1991)). 일반적으로 정제된 LBD 예를 들어, ERα LBD는 단백질의 통합성을 보존하는 온도하의, 리간드 포화농도에서 평형상태로 존재한다. 상기 수용체가 2-20℃ 범위에서 보다 더 안정적일지라도, 리간드 평형은 2 내지 37℃에서 확립된다. 결정의 안정성과 질을 향상시키기 위해, 조절된 온도제어가 바람직하다. 일반적으로, 4-25℃의 온도가 이용되며, 상기 온도 범위 이상에서 결정화를 시험하는 것이 종종 바람직하다. 다음, 상기 결정은 x-선 회절 패턴을 얻기 위해 표준 방법에 따라 기체 확산되고, x-선으로 포격(bombard)된다. 단독의 리간드 결합 도메인 또는 보조활성제 결합부위와 결합하는 펩티드와 콘주게이션된 리간드 결합 도메인과 결합하는 리간드와 함께 공결정화시키기 위해, 관심있는 핵 수용체의 결합부위와 결합하는 서열을 함유하는 다양한 농도의 리간드 및 펩티드가 미세 결정화 시험, 및 추가의 결정화를 위해 선택된 적절한 화합물중에 사용될 수 있다. 리간드 및 펩티드가 다양한 방법에 의해 리간드 결합 도메인 및 관심있는 핵 수용체의 보조활성제 결합부위와의 결합에 대해 검정될 수 있다. ERα LBD를 사용한 결정화 시험을 위해, 행잉 드롭 증기 확산 방법이 바람직하다. pH, 용매, 용질 성분 및 농도, 및 온도는 예를 들어, 실시예에 기재한 바와 같이 조절될 수 있다. 행잉 드롭 방법에서, x-선 회절 분석을 위한 적절한 결정을 얻기 위해, 복합체의 미세결정과 함께 제조된 드롭의 시딩이 사용될 수 있다. 구조적 정보의 수집이 본원에서 측정된 ERα LBD의 구조를 이용한 분자 치환에 의해 측정될 수 있다. 상기 구조는 공지의 표준 방법에 따라 정제될 수 있다.
본 발명은 많은 용도 및 장점을 제공한다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법 및 장점은 핵 수용체 활성을 조절하는 펩티드, 펩티도미메틱스, 또는 작은 천연 또는 합성 유기 분자의 동정에 유용하다. 상기 화합물은 핵 수용체 관련 질환의 치료에 유용하다. 본 발명의 방법 및 조성물은 천연 및 합성 리간드의 구조/기능을 특성화하는데 유용하다.
하기, 실시예에 대한 기초적 이해를 수득된 결과 및/또는 도달된 결론과 함께 제공한다.
상기한 바와 같이, 많은 보조활성제가 핵 수용체 LBDs와 서열 LXXLL(서열번호: 1)을 통해 결합된 보조활성제를 인식하며, 여기서 L은 루이신이고 X는 임의의 아미노산(상기 NR 박스)이다. 상기 DES-hERαLBDS-GRIP1 펩티드 복합체 서열의 구조는 LXXLL 모티프(서열번호: 1)가 수용체 표면의 고도의 상보성인 소수성 그루브에 의해 인식되는 짧은 양극성 α헬릭스의 중심을 형성함을 제시했다. 다른 돌연변이 및 구조의 연구에서의 결론과 일치하여(상기 B rozozowski, et al., 및 Feng, et al.), 이 헬릭스 3, 4, 5, 및 12로부터의 잔기, 및 헬릭스 3 및 4사이의 회전(turn)에 의해 형성된 상기 펩티드 결합 그루브가 전사활성에 관여하는 ERα, 즉 보조활성제 결합부위의 표면으로 간주된다. 또한, TRβ 및 GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드 사이의 복합체의 연구, 및 TRβ 및 GR과 결합된 GRIP1의 연구(상기, Darimont, et al.), 및 PPARγ/SRC-1 펩티드 복합체의 일반적 특성의 연구(상기, Nolte, et al.)는 본원에 기술된 ERα/GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드 복합체에 대한 연구와 유사하며, 이는 NR 박스 인식 기전이 핵 수용체 패밀리에 걸쳐 보존됨을 암시한다.
그의 측쇄가 보조활성제 헬릭스(도 3a)와 상호작용하는 11개의 AF-2 잔기중, 단지 4개(Lys 362, Leu 379, Gln 375, 및 Gln 542)가 핵 수용체 패밀리에 걸쳐 고도로 보존성이다(상기 Wurtz et al.). 상기 Lys 362 및 Leu 379의 측쇄는 GRIP1의 결합이 없는 경우에도 묻히게되며, 전사활성예 관여하는 표면의 구조의 인테그랄 부분을 형성하는 것으로 보인다. 이와 반대로, Gln 375 및 Gln 542 측쇄는 대체로 보조활성제 부재하에 노출된 용매이며, 보조활성제 헬릭스와 비극성 접촉 및 단지 수용체 매개의 상호작용 양자 모두를 형성한다. 상기 두개의 캡핑 상호작용 잔기는 보조활성제의 주쇄 콘포메이션을 안정시키위해서 뿐만아니라 분자 캘리퍼(caliper)로서 작용하기 위해서 보조활성제 결합부위 그루브의 반대점에 위치된다; Lys 362와 Glu542사이의 15Å 간격은 짧은 2회전 보조활성제 α헬릭스, ~11Å의 축길이를 구분하는데 적합하였다(도 3c). 유사한 수용체 매개 캡핑 상호작용이 또한 TRβLBD와 NR 박스 Ⅱ 펩티드 사이의 복합체에서 관찰되었다(상기 Darimont, et al.). 상기 두 잔기중 어느 한쪽의 돌연변이는 ERα 뿐만아니라 TRβ에 의한 보조활성제 결합을 심하게 손상시킨다(참고문헌:상기 Apriletti, et al. 및 상기 Feng, et al. 및 상기 Henttu, et al.). 그러므로, 헬릭스 캡핑 상호작용의 형성은 핵 수용체에 의한 보조활성제 인식의 일반적인 특징일 수 있다.
6개의 소수성 AF-2 잔기들(Ile 358, Leu 372, Val 376, Leu 379, Leu 539, 및 Met 543)의 측쇄는 보조활성제 헬릭스의 소수성 측면을 가진 수용체에 의해서 생성된 반데르발스 결합의 고도의 협동적 네트워크의 대부분을 형성한다(도 3a 및 도 3c). Ile358, Val376, 및 Leu539에서의 돌연변이는 GRIP1 결합을 폐기시킨다 (참고문헌:상기 Feng, et al.). 통상, 비록 상기 잔기가 Lys 362 또는 Glu542 보다 더 핵 수용체에 걸쳐 불량하게 보존되지만, 그들의 소수성 특성은 Leu 372를 제외하고 보존된다. 다른 NR LBDs가 동일한 전체 폴드를 채택하므로(Moras, et al,. Curr. Opin. CELL Biol. 10:384-91(1998)), 이는 다른 핵 수용체 보조활성제 결합부위 표면의 소수성 부분이 뚜렷하게 조직화 되었음을 의미한다. 이러한 가설을 지지하여, 결정화에 사용된 상기 NR 박스 Ⅱ 펩티드는 GRIP1의 매우 다른 효율을 가진 ERα, TRβ, 및 글루코코르티코이드 수용체(GR)에 대한 결합을 저해하였다(상기 Ding, et al.).
NR 박스 헬릭스의 소수성 측면은, 3개의 모티프 루이신 및 상기 모티프에 선행하는 이소루이신(Ile 689)의 측쇄에 의해 형성된다. 수용체 결합중에 보존된 루이신의 기능적 중요성이 많은 시험관내 및 체내 연구를 통해 증명되었다. 이와 반대로, 수용체 결합내에 상기 모티프에 선행하는 잔기의 역할에 대한 특성화는 저조하였다. 생화학적 및 구조적 데이터 양자 모두 주요 수용체 결합체의 결정소로서 로서 Ile 689를 결부시킨다. 상기 결정에서, 단지 모티프 루이신과 Ile 689의 측쇄만이 비결정학적 대칭성 관련 펩티드 양자 모두내의 LBD와 광범위하게 결합한다. 알라닌에 대한 Ile 689의 돌연변이는 경쟁적 검정(데이터를 나타내지 않음)에서 GRIP1과 ERα의 결합을 저해시키는 펩티드의 능력을 ~30배까지 감소시킨다. Ile 689의 측쇄는 다소 화학적으로 구분되는 환경에 위치한다; 상기 잔기는 Asp 538 측쇄, Leu 539의 측쇄, 및 Glu 542의 γ-카르복실레이트의 지방성 부분과 반데르 발스 결합을 형성한다(도 1a 및 3a). Ile 689의 소수성 측쇄와 Glu 542의 음으로 하전된 부분의 근접은 카르복실레이트 측쇄의 정전기 전위를 증가시키고, 보조활성제 헬릭스의 N-말단과 상호작용을 안정화시킨다. 수용체 인식에서의 명백하게 결정적인 역할에도 불구하고, 공지의 NR 박스에 바로 선행하는 잔기의 동일성의 보존은 불량하였다. 이러한 서열의 변화성은 ERα과의 패킹 상호작용 뿐만아니라 Glu 542의 화학적인 환경 및 매우 중요한 배향 양자 모두에 효과가 영향을 미친다. 이는 수용체에 대한 친화성의 다양성으로 번갈아 번역될 것이다. 실제로, 각각 LXXLL 모티프(SEQ ID NO:1)를 선행하는 다른 잔기를 각각 포함하는 GRIP1로부터의 3개의 NR 박스는 ERα에 대한 다른 친화성을 가진다(상기 Ding, et al.; Vogel, et al. EMBO J. 17:507-19(1998)).
GRIP1의 인간 상동체인 TIF2의 NR 박스는 수용체 결합 친화성의 개별적인 차이에도 불구하고 부분적으로 기능적으로 중복됨이 밝혀졌다. TIF2의 NR 박스 3개 모두는 ERα와의 상호작용을 완전히 제거하기 위하여 돌연변이되어야 한다(상기 Ding, et al.; Vogel, et al. EMBO J. 17:507-19(1998)). 본원의 데이터는 단일 NR 박스 펩티드가 단일 ERαLBD와 견고한 복합체를 형성하기에 충분함을 제시한다. 그러나, p160 보조활성제가 다중 NR 박스를 차지한다. 다중 NR 박스의 존재에 대한 가능한 설명은 그들이 광범위한 특이성을 가진 보조활성제를 제공한다는 것이다. 수용체 결합이 다중 반데르 발스 상호작용의 복잡한 형성에 의존하지만, 많은 핵 수용체는 다른 보조활성제 결합 부위 표면을 가진 것처럼 보인다. LXXLL 모티프(SEQ ID NO:1)에 바로 선행하는 위치의 다른 아미노산이 이들 구분되는 표면에 대한 소정의 적응성을 허용하나; 모든 핵 수용체와 결합하는 효용성을 가질 수 있는 NR 박스는 없을 수 있다. 따라서, 다중 NR 박스는 많은 표적을 인식하데 필요한 다양한 경계면을 보조활성제에 제공할 수 있다.
ERα 전사 활성은 OHT 및 RAL 같은 길항제에 의해 블로킹된다. OHT 및 RAL 리간드 결합된 ERαLBDs 구조의 가장 놀라운 특징은 헬릭스 12가 보조활성제 인식 그루브의 정전 영역과 결합된다는 것이다(도 3b 및 상기 Brzozowski, et al.). 이들 2개의 구조와 보조활성제/LBD 복합체의 구조의 비교는 작용제 복합체내에서, NR 박스류의 서열(LXXML 대 LXXLL)(SEQ ID NO:2 대 SEQ ID NO:1)을 지닌 헬릭스 12의 영역이 보조활성제 헬릭스의 분자내 의사물질로서 작용함을 나타낸다(도 5 및 상기 Brzozowski, et al.).
다른 제안(상기 Brzozowski, et al. 및 상기 Darmont, et al.)과 일치하여, 상기 헬릭스 12의 배치가 전사활성에 관여하는 표면의 구조 및 기능에 2가지 경로로 직접적으로 영향을 미친다. 첫째, 헬릭스 12 잔기가 보조활성제 결합 부위 표면의 인테그랄 부분을 형성하기 때문에, 상기 표면은 헬릭스 12가 길항제 결합된 콘포메이션인 경우에 불완전하다. 특히, Leu 539, Glu 542, 및 Met 543은 보조활성제 인식에 대하여 부정확하게 배향된다. 둘째, 상기 표면의 정전 영역으로부터의 잔기가 헬릭스 12와 결합되고, 보조활성제와의 상호작용이 방해된다(도 3a 및 3b).
ERαLBD의 헬릭스 12의 LXXLL 모티프(SEQ ID NO:1)에 대한 서열 유사성은 핵 수용체중에서 유니크한 것으로 보인다. 비록 일반적으로는 소수성이지만, 다른 핵 수용체내의 헬릭스 12의 상기 영역중의 잔기의 동일성은, ERα에서의 경우와 같이NR 박스의 서열과 밀접하게 유사하지는 않다(상기 Wurtz, et al.). 그러나, 차선의 인식 서열을 지닌 분자내 저해제가 높은 국소 농도로 주어질 경우에 보조활성제 결합에 대해 경쟁할 수 있다. 그러나, 차선(suboptimal)의 인식 서열을 지닌 내분자 저해제가 매우 높은 국소 농도로 주어진 경우에, 조활성제 결합에 대해 경쟁할 수 있다.
ERα에 대한 OHT의 결합은 보조활성제의 결합을 저해하는 헬릭스 12 콘포메이션을 촉진시킨다. OHT는 어떤 헬릭스 12 잔기(도 4b)와도 직접적으로 상호작용 하지 않는다. 또한, OHT 복합체에서 헬릭스 12와 상호작용하는 보조활성제 결합 부위 그루브의 영역내의 LBD의 구조는, DES 및 E2복합체(도 3a, 3b, 및 5)경우와 동일하다.
수 많은 연구들이 수용체 길항작용에서 OHT 측쇄의 중요성을 증명하였다(상기 Jordan, et al. 및 Robertson, et al., J. Med. Chem. 25:167-71(1982)). OHT및 DES 복합체 구조의 비교는 OHT 측쇄의 결합 모드가 헬릭스 12의 작용제 유도 콘포메이션을 배제함을 제시한다. OHT 측쇄는 헬릭스 3 내지 11(도 2b, 6b, 및 6c) 사이의 리간드 결합 포켓의 밖으로 돌출한다. 그 결과, 작용제 결합 콘포메이션에서와 같이, 리간드 결합 포켓에 걸친 헬릭스 12의 배치는 소수성 공동내의 OHT 측쇄의 양으로 하전된 미메틸아미노기를 함입시키고, 측쇄의 디메틸아미노기 영역과 Leu540의 측쇄 사이에 입체적 상충을 유발시킨다.
작용면에서, OHT는 단순히“측쇄를 가진 작용제"가 아니다. OHT 결합은 DES나 E2결합에 의해서 안정화된 것과 뚜렷이 구분되는, LBD의 콘포메이션을 촉진시킨다. 상기 다른 콘포메이션은 헬릭스 12의 배치에 다른 제한을 부과한다.
DES 및 E2복합체에서 헬릭스 3, 8, 및 11은, 이들이 OHT 복합체에 있는 것 보다 1 내지 2회전 더 길다(상기 Brzozowski, et al). 헬릭스 11은 DES와 E2복합체내의 Cys 530에서 종결하고, OHT 복합체내의 Tyr 526에서 종결한다. 헬릭스 12는 OHT 복합체내의 Leu 536에서 시작한다. 길항제 복합체에서, Leu 536이 비극성 결합의 협조적인 네트워크를 형성하고, 헬릭스 12(도 1b)의 N-말단을 안정화시키는 Glu 380 및 Tyr 537과 수소결합을 형성하는 것은 필수적인 것으로 보인다. 따라서, 헬릭스 12가 작용제의 존재하에서 보조활성제 결합부위의 정전 영역과 결합하는 경우, 루프 연결 헬릭스 11 및 12는 다섯 개의 잔기에 걸쳐 ~17Å가지 스패닝되어야 할 것이다. 비록 이론상으로 가능하여도, 이러한 콘포메이션은 매우 긴축성이며 존재하기 어렵다. 대조적으로 OHT 복합체내의 긴 루프 연결 헬릭스 11 및 12는 헬릭스 12가 보조활성제 결합 그루브의 정전 영역가지 연장하는 것을 허용한다.
DES 및 E2복합체에서, 헬릭스 12 및 루프 연결 헬릭스 11 및 12가 헬릭스 3 및 11에 대하여 패킹하는 반면에, OHT 복합체에서는 패킹하지 않는다(도 2a 및 2b 및 상기 Brzozowski, et al). 최근에 묘사된 E2-LBD 복합체의 구조는 DES 및 E2복합체에서의 보다 더 긴 헬릭스가 작용제-결합 콘포메이션내네 헬릭스 12가 향성하는 상호작용에 의존하지 않음을 는다는 것을 나타낸다(상기 Tanenbaum, et al). 상기 구조에서, 결정 패킹 합성체는 헬릭스 12가 대칭-관련성 분자와 결합하게 한다. 헬릭스 12가 상기 구조에서 리간드 결합 포켓에 걸쳐 위치하지 않음은 명백하다. 그럼에도 불구하고, 헬릭스 3, 8 및 11은 이들이 OHT 복합체에 있는 경우에서 보다 더 길다(도 6a). 그러므로, 작용제 복합체의 긴 헬릭스는 리간드 결합 포켓에 걸친 헬릭스 12의 배치에 독립적으로 발생하고, 대신에 작용제 결합의 직접적 결과이다.
작용제 복합체 및 OHT 복합체 사이의 2차 구조의 차이는 다른 리간드에 의해 유도된 패킹 상호작용의 구분되는 배열로부터 발생한다. DES 또는 E2주위에서 생성된 헬릭스 3, 7, 8, 및 11로부터의 많은 소수성 잔기사이의 반데르 발스 결합과β헤어핀의 협조적인 네트워크가 작용제 복합체에서 보다 더 긴 헬릭스를 안정화시키는 것으로 보인다(도 4a 및 도6d). OHT B 고리의 배치는 이를 둘러싼 리간드 결합 포켓 잔기중 다수가 DES나 E2구조에서 그들이 채택한 것과 현저히 상이한 콘포메이션을 채택하게 한다. 결과적으로, DES 및 E2구조에 존재하는 잔기사이의 패킹 상호작용의 대부분은 OHT 구조내에서 없어지거나 변경된다(도 6d). 상기 구조적인 변형은 잔기 339 내지 341, 421 내지 423, 및 527 내지 530(작용제 구조에서 각각 헬릭스 3, 8 및 11의 부분을 형성하는)의 주쇄가 OHT 구조내에 연장된 콘포메이션을 채택하게 한다(도 6a-d).
따라서, OHT의 결합은 헬릭스 12의 배치의 길항작용에 기여하는 각각 2개의 뚜렷한 효과를 가진다(도 7). 헬릭스 12는 OHT 측쇄에 의해 리간드 결합 포켓에 걸쳐 위치하는 것이 방해된다. 또한, OHT 주위의 리간드 결합 포켓 잔기의 선택적 패킹 배열은 헬릭스 12가 보조활성제 결합부위 및 의사물질 결합 보조활성제의 정전 영역에 이르도록 허용하는 LBD의 콘포메이션을 안정화시킨다.
상기 기전은 OHT에 특이적인 것으로 보이지는 않는다. OHT의 경우와 같이 RAL의 측쇄는 헬릭스 12의 작용제 결합 콘포메이션을 입체적으로 방해한다(상기 Brzozowski, et al). 또한, 헬릭스 11은 RAL 복합체중의 Met 528에서 종결되는 것으로 보인다. 이는 RAL 결합에 의한 His 542 부근의 결합 포켓내의 비틀림으로부터 기인할 수 있다(상기 Brzozowski, et al).
상기 결과는 본 발명의 다양한 측면을 예시하기 위한 하기 제공되는 실시예에 의해 됫받침된다. 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
실험 방법
단백질 발현 및 정제
인간 ERα-LBD 297-554fmf hERα의 554(Yale University의 Paul Sigler에 의해서 제공됨)를 통한 잔기 297에 융합시킨 Met-Asp-Pro 서열을 함유하는 변형된 pET-23d-ERG 벡터로 형질변환시킨 BL21(DE3)pLysS 세포에서 상기한 바와 같이 (Seielstad, et al., Mol. Endocrinol. 9:647-658(1995)) 과발현시켰다. 정제한 세균용해물을 우레아에 3 M, NaCL에 0.7 M씩 조절한 다음, 에스트라디올-세파로즈10㎖ 컬럼에 적용시켰다(Greene, et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA 77:5115- 5119(1980); Landel, et al., Mol. Endocrinol.8: 1407-1419(1994);Landel, et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 63:59-73(1997)).
용매-접근성 시스테인을 카르복시메틸화시키기 위해, 상기 결합된 hERαLBD를 pH 8.1, 10mM 트리스, 250mM NaSCN에서 5mM 요오드아세트산으로 처리했다(Hegy, et al., Steroids 61:367-373(1996)). 단백질을 pH8.2, 50mM 트리스, 1 mM EDTA, 1 mM DTT 및 250 mM NaSCN의 30-100ml중에 3×10-5M 리간드(DES 또는 OHT)를 사용하여 용출시켰다. hERαLBD의 수율은 통상 100%에 가까웠다(Seielstad, et al., Biochemistry 34: 12605-12615(1995)). 친화성-정제시킨 물질을 한외여과하여 농축하고, pH 8.1의 20 mM 트리스, 1 mM EDTA, 4 mM DTT로 교체시켰다. 상기 단백질을 Resource Q 칼럼(pharmacia)과 결합시킨 다음, pH 8.1의 20 mM 트리스, 1 mM DTT내에서 25-350mM NaCl의 선상 구배하에 용출시켰다. hERαLBD 리간드 복합체는 150-200mM NaCl에서 용출시켰다. 분획을 한외여과시켜 농축하고 SDS-PAGE, PAGE, 및 전기분무 이온화 질량분석계로 분석했다.
GST-풀다운 분석
글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)과 hERα의 아미노산 282-595 사이의 융합은 pSG5ERα-LBD(Lopez et al.)로부터 pGEX-3X(pharmacia)까지 EcoRI 단편을 서브클로닝하여 제조했다. Ile 358-〉Arg, Lys 362-〉Ala, 및 Leu 539-〉Arg 돌연변이를 제조자 지침에 따라 퀵 체인지 키트(Stratagne)를 사용하여 GST-LBD 구성체내로 도입시켰다. Val 376-〉Arg, 및 Glu 54-〉Lys 돌연변이를 pSG5-ER-HEGO의 Bsm1/HinⅢ 단편 을 상기 돌연변이가 이미 도입된 곳으로 서브클로닝(Tora, et al., EMBO J, 8:1981-6(1989)) 시킴에 의해, GST-LBD 구성내에 생성시켰다. 모든 구성체를 자동화된 서열화(시카고대학 암 연구 센터 DNA Sequencing Facility)에 의해 확인했디.
야생형 및 돌연변이 GST-LBDs를 BL21(DE3) 세포중에 발현시켰다. 총 리간드 결합활성을 제어된 다공성 유리 비드 분석(Greene, et al., Mol. Endocrinol.2: 714- 726 (1988))으로 결정되고 단백질 수준을 hERα(H222)에 대한 모노클로날 항체와 함께 웨스턴 브롯팅하여 모니터링했다. GST-LBDs를 함유한 정제된 추출물을 단일 완충액(50 mM 트리스,pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% NP-40 및 프로테아제 제해제 칵테일), 또는 DES 또는 OHT 1μM을 가한 완충액중 4℃하에서 1시간 동안 인큐베이팅시켰다. GST-LBD의 30pmol을 함유하는 추출 샘플을 10μl 글루타치온-세파로스-4B 비드(팔마시아)와 4℃하에서 1시간 동안 인큐베이팅시켰다. 비드를 20mM HEPES, pH7.4, 400mM NaCl, 0.05% NP-40를 사용하여 5회 세척시켰다.35S-표지한 GRIP1을 TNT Coupled Reticulocyte Lysate System(Promega)을 제조자 지침에 따라 사용하고, 주형으로서 pSG5-GRIP1(남 캘리포니아 대학의 Michal Stallcup에 의해서 제시된)를 사용하여 시험관내 전사와 번역시켜 합성했다. 고정화시킨 GST-LBDs를 트리스-완충 염수(TBS) 300μl에 희석시킨 미정제의 전사 반응 혼합물의 할당량 2.5㎕와 2.5시간 동안 인큐베이팅시켰다. 0.05% NP-40를 함유한 TBS중에 5회 세척시킨 후, 단백질을 샘플 완충액에서 10분 동안 비드를 보일링시켜용출시켰다. 결합35S-GRIP1를 SDS-PAGE 따른 플루오로그래피로 정량했다.
결정화 및 데이터 수집
DES-hERα LBD-GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드 복합체의 결정을 헹잉 드롭 증기 확산으로 수득했다. 결정화 이전에, DES-hERα LBD(잔기 297-554) 복합체를 GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드(서열번호: 4)의 2-4배 몰과량과 함께 7-16시간 동안 인큐베이팅시켰다. 상기 용액의 샘플 2μL를 25-27%(w/v)PEG 4000, 90mM 트리스(pH 8.75- 9.0) 및 180mM Na 아세테이트로 구성시킨 동일 부피의 저장 완충액과 혼합시키고, 저장 완충액 800μL를 포함하는 웰에 현탁시켰다. 19-21℃에서 4-7일 경과후에, 막대형 결정을 수득했다. 보조활성제 복합체 결정이 셀 규격 a=54.09, b=82.22, c=58.04, 및 β=111.34를 지닌 스페이스그룹 P21에 놓여있다. DES-LBD 및 보조활성제 펩티드의 각각 두 분자는 비대칭 유니트를 형성했다. A 200㎛×40㎛×40㎛ 결정을 25%(w/v) PEG 4000, 10%(w/v) 에틸렌글리콜, 100mM 트리스(pH 8.5), 200mM Na 아세테이트, 및 10㎛ 펩티드를 포함하는 크리요용매(cryosolvent) 용액으로 옮기고, 레이온 루프내 -170℃하의 질소환경에서 동결시켰다. 상기 결정으로부터의 데이터를 Stanford Synchrotron Rsdiation Laboratory(SSRL)에서 300mm MAR 영상 플레이트를 1.08Å의 파장길이와 빔라인(beamline) 7-1에서 사용하여 170℃에서 측정했다.
OHT에 대한 hERα LBD 복합체의 결정을 헹잉 드롭 증기 확산으로 수득했다. 3.9 mg/mL 단백질 리간드 복합체를 포함하는 용액, 및 9%(w/v) PEG 8000, 6%(w/v) 에틸렌 글리콜, 50mM HEPES(pH 6.7)과 200mM NaCl을 포함하는 저장 용액의 동일 부피 할당량(2μL)을 저장 용액 800μL에 대해 혼합 및 현탁시켰다. 육각 플레이트류 결정을 21-23℃에서 4-7일 경과 후 수득했다. 결정의 크기와 질은 모두 마이크로시딩 기술을 통해 개선시켰다. 상기 결정은 셀 변수 a=b=58.24Å 및 c=277.47Å을 가진 스페이스 그룹 P6522에 속한다. 상기 비대칭 유닛은 단일 LBD 단량체로 구성되며; 이량체 축은 결정학상의 2 폴드를 따라 놓인다. 단일 결정(400㎛×250㎛×40㎛)를 10%(w/v) PEG 8000, 25%(w/v) 에틸렌글리콜 50mM HEPES(pH 7.0), 및 200mM NaCl로 구성된 냉각 보호 용액중에 간단히 인큐베이팅시킨 후, 레이온 루프내에 현탁시킨 액상 N2중에 동결시켰다. 회절 데이터는 SSRL에서 345mm MAR 이미지 플레이트를 빔라인 9-1 및 0.98Å의 파장으로 사용하여 -170℃에서 측정했다.
양자의 데이터 세트의 이미지 모두를 DENZO로 가공하고 디펄트 값 -3 컷오프를 사용하여 SCALEPACK(Otwinowski, et al, Methods Enzymol. 276:307-326(1997))으로 스케일링시켰다.
구조 결정 및 정제
DES-LBD-GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드 복합체의 구조결정을 위한 초기의 노력은 낮은 간격(3.1Å) 데이터 세트(데이터를 제시하지 않음)를 사용하였다. 자기 회전 검색은 비결정학상의 2분 염색체(dyad)의 존재를 지시하는 POLARRFN("CCP4 suite:단백질 결정학을 위한 프로그램", Acta Crystallogr. D 50:760-763(1994))를 사용하여 수행했다. 비대칭의 2개의 LBDs를 검색 프로브로서 인간 RARγLBD(상기 Renaud, et al)의 일부 폴리알라닌 모델을 사용하는 AMoRe(CCP4, 1994)에서 분자 재배치에 의해서 위치시켰다. 모델이 상기 지점에 주어진 경우에, 모델은 부정확하고(상기 모델과 Cα위치에 근거한 마지막 모델간의 r.m.s.d. 17Å), 불완전하였으며(비대칭의 유니트내의 총 스캐터링된 물질의 단지 ∼45%), 적극적 밀도 수정 지침을 수행시켰다. MOLOC내의 모델과 함께 산재된 DM(CCp4, 1994) 2 폴드 NCS 평균화를 반복 수행시키고(Muller, et al., Bull. Soc. Chim. Belg. 97:655-667 (1988)), LBD 단독의 모델을 신속하에 구축하기 위해 REFMAC(Murshudov, et al., Acta Crystallor. D 53:240-225(1997))중의 모델 정제를 사용했다. 이 과정을 위해, MAMA(Kleywert, et al., "Halloween... mask and bones. In form First Map to Final Model", Bailey, et al., eds, Warington, England, SERC Daresbury Laboratory, 1994)를 모든 마스크 조작에 사용하였고, PHASES(Furey, et al., PA33 Am. Cryst. Assoc. Mtg. Abstr. 18:73(1990)) 및 CCP4 슈트(CCP4)를 구조인자의 생성 및 중량 계산에 사용했다.
그러나, 비록 DES-LBD-GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드 복합체 모델이 비대칭 유니트중의 스캐터링 물질의 ~90%이지만, 정제가 심각한 모델 바이어스(bias)에 의해 방해된다. 다음, 상기 OHT 복합체 데이터 세트를 수집했다. 검색 프로브로서 예비 DES-LBD 모델의 단량체를 사용하여, AMoRe내의 분자 재배치를 P6122 및 P6522 양자 모두 중의 상기 결정형내의 LBD 위치를 검색하는데 사용했다. P6122내의 번역 검색은 정확한 결과(R=55.3%, CC=38.2%)를 산출했다. 모델 바이어스를 감소시키기 위해, DMMULTI(CCP4, 1994)를 사용하여 DES 복합체 세포로부터 OHT 복합체 세포내로의 평균화된 밀도를 산출했다. 상기 모델을 REFMAC에서 최초 정제시키고, 후속하여 X-PLOR(Bruger, X-PlLOR Version 3.843, New Havenm Connecticut: Yale University, 1996)에서 최대 유사성 표적을 사용하여 어닐링, 배치 및 B-인자 정제 지침을 시뮬레이션시켰다(Adams et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5018-23(1997)). 비등방성 스캐일링 및 벌크 용매 정정을 수행하고, B-인자를 등방적으로 정제했다. Rfree세트(데이터 세트중 8%의 무작위 샘플링)를 제외하고, 41 내지 1.9Å(σ 컷오프 부재) 사이의 모든 데이터를 포함시켰다. 상기 최종 모델은 잔기 306-551, 리간드 및 79 워터스(waters)를 구성한다. PROCHEK에 따르면(CCP4), 모델중의 모든 잔기의 91.6%가 Ramachandran 플롯의 중심영역내에 존재했으며, 허락되지 않은 영역에는 어떠한 잔기도 없었다.
DES-LBD-GRIP NR 박스 Ⅱ 펩티드 복합체의 고도의 간격 데이터 세트를, OHT-LBD 모델의 Rfree가 ~31%인 경우에 이용할 수 있었다. DES 복합체 결정의 비대칭 유니트내의 두 개의 단량체 모두를 검색 모델로서 AMoRe 및 완전히 정제된 OHT-LBD 모델(헬릭스 12, 및 헬릭스 11과 12 사이의 루프가 제거된)을 사용하여 재배치시켰다. 모델중 결실 부분을 구축하고, 모델의 나머지 부분을 MOLOC 및 DM 중에 생성시킨 2 폴드 평균화 지도(maps)를 사용하여 보정했다. 먼저, 견고한 NCS 속박을 사용하는 REFMAC를 사용하여 정제를 수행했다. 다음 단계에서, 상기 모델을 X-PlLOR중에 시뮬레이션시킨 어닐링, 배치 및 B-인자 정제 지침, 및 최대 유사성 표적을 사용하여 NCS 속박 없이 정제시켰다. 모든 B-인자를 비등방성 및 등방성으로 정제시키고, 벌크 용매 보정을 수행시켰다. 상기 Rfree세트는 모든 데이터의 65의 무작위 샘플링에 함유했다. 정제중에, 27 내지 2.03Å(σ 컷오프 없음)의 모든 데이터를 사용했다. 최종 모델은 단량체 A의 잔기 305-549, 단량체 B의 잔기 305-461 및 470-554, 펩티드 A의 잔기 687-697, 펩티드 B의 잔기 686-696, 2개의 리간드 분자, 147 워터스, 2개의 카르복실기 및 염소 이온으로 구성시켰다. PROCHEK에 따르면, 모델내의 모든 잔기의 93.7%가 Ramachandran 플롯의 중심 영역에 존재하고, 허용되지 않은 영역에는 어떠한 것도 없었다.
도 1a는 2.03Å 간격으로 계산되고 1.0σ에서 작성된 2Fo-Fc 전자 밀도 맵을 제공하며, GRIP1 NR 박스 Ⅱ와 LBD의 상호작용을 도시한다. 상기 GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드(서열번호: 4)를 맵 계산전에 제거했다. 펩티드로부터의 ILe 689 및 이것이 상호작용하는 수용체 잔기 3개중 2개(Glu 542 및 Leu 539)를 표지시켰다. Asp 538을 명확성을 위해 삭제했다. Glu 542의 γ-카르복실레이트와 펩티드의 잔기 689 및 690의 아미드와의 수소결합을 점선의 오렌지 결합으로 도시했다. 도 1b는 1.90Å 간격으로 계산되고 1.0σ에서 작성된 2Fo-Fc 전자 밀도 맵을 제공하며, 헬릭스 12의 N 말단 영역을 도시한다. 상기 점선의 오렌지 결합은 His377, γ-카르복실레이트의 이미다졸 고리와 Tyr 537의 아미드와의 물-매개 수소결합 네트워크를 도시한다. 상기 표지한 3개의 잔기(Glu 380, Leu 536, 및 Tyr 537)은 반데르 발스 결합 및/또는 수소 결합을 통해 다른 것과 결합한다. 흥미롭게도, 이들 3개의 잔기의 각각의 돌연변이가 리간드 결합되지 않은 ERα LBD의 전사활성을 매우 증가시켰다(Eng, et al., Mol. Cell. Biol. 17:4644-4653(1997): Lazennec, et al., Mol. Endrcrinol. 11:1375-86(1997)); White, et al., EMBO J. 16:1427-35(1997))
실시예2
구조측정
마우스 p160 보조활성제인 GRIP1은 작용제(상기 Ding,et al.)와 결합된 ERαLBD와 함께 체내 및 시험관내에서 상호작용하지만 길항체와 결합된 LBD (Norris,et al., J.Biol.Chem. 273:6679-88(1998))는 그렇지 않다. GRIP1과 상기 인간 상동체 TIF2의 돌연변이 연구는 GRIP1으로부터의 NR 박스 3개 중 NR 박스 Ⅱ(잔기 690- 694)가 ERαLBD(상기 Ding, et al., 및 상기 Voegel.et al.)를 가장 견고히 결합시킴을 제안한다.
비교 검정은 GRIP1(상기 Ding, et al.)의 잔기 686-698와 대응하는 표준 고체상합성법에 의해 합성된 13개 잔기 GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드, NH2-KHHILHRLLQDSS- CO2H(서열번호: 4)가 작용제 결합 ERαLBD(IC50〈0.4μM;Kushner. 비간행) 및 다른 작용제 결합 NR LBDs(상기 Ding, et al.및 상기 Darimont, et al.)와 특이적으로 결합함을 지적한다.
전기영동의 이동 변화 검정을, GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드(서열번호: 4)가 작용제 DES의 존재하에 ERαLBD와 결합하지만, 길항제 OHT의 존재하에서는 결합하지 않음을 입증하는데 사용했다. DES 또는 OHT 중의 어느 하나와 결합된 정제 hERα-LBD의 8마이크로그램 샘플을 GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드(서열번호: 4)의 부재하에 즉, 완충액 단독으로 배양시키거나, 2배 또는 10배 몰과량의 GRIP1 NR 박스Ⅱ 펩티드의 존재하에 배양시켰다. 결합반응을 20mM Tris, pH8.1, 1mM DTT, 및 200mM NaCl을 함유시킨 완충액 10㎕중 45분간 빙상에서 수행시킨 후, 6% PAGE를 수행시켰다. 겔을 GELCODE 블루 염색 시약으로 염색시켰다(Pierce)
NR 박스 Ⅱ 펩티드의 존재하에, DES-LBD 복합체의 이동은 지연되었다. 펩티드의 부가는 OHT-LBD 복합체의 이동성에 어떠한 영향도 주지 않았다. 따라서, 상기 GRIP1의 펩티드 단편은 전장의 단백질의 리간드 의존성 수용체 결합 활성 특성을 가진다. 상기 관찰은 GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드가 GRIP1과 ERαLBD사이의 상호작용의 연구에 있어 효과적인 모델임을 제안한다.
GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드와 ERαLBD의 상호작용을 구조적으로 특성화시키기 위해, 재조합 인간 ERαLBD(잔기 297-554)를 DES 및 상기 GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드와 결합시켜 결정시켰다. 또한, 그에 의해 길항제가 보조활성제/ERα 상호작용을 블로킹하는 기전을 측정하기 위해, OHT와 결합된 ERαLBD를 결정화시켰다. 상기결정으로부터 X-ray 회절데이타를 측정하고, 구조를 분자 재배치(인간레티온산 수용체γ(RAAγ)LBD의 coordinates의 수정된 버전사용)와 적극적 밀도 조정의 조합에 의해 측정했다.
DES-ERα LBD-GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드 복합체의 상기 구조를, 도1a 및 표2에 제시한 바와 같이, 2.03Å 간격에 대한 데이터를 사용하여, 19.9%의 결정학상의 R-factor(Rfree=25.0%)로 정제시켰다. OHT-ERα LBD 복합체의 구조를 도 1b 및 표2에 제시한 바와 같이, 1.9Å 간격에 대한 데이터를 사용하여 23.0%(Rfree=26.2%)의 결정학상 R-factor로 정제시켰다.
표 2
결정학적 통계의 요약
리간드
데이터 수집 DES OHT
스페이스 그룹 P21 P6522
간격 2.03 1.90
관측값 104189 269253
고유값 30265 23064
완전성(%) 98.4 99.1
Rsym(%)a 7.8 7.0
평균 I/σI 9.8 16.1
미세화
수소 이외의 원자의 갯수 4180 2070
Rcryst(%)b/Rfree(%) 19.9/25.0 23.0/26.1
결합 r.m.s. 편차 (Å) 0.006 0.006
각도 r.m.s. 편차 (˚) 1.05 1.05
평균 B 인자 (Å2) 34.0 40.4
aRsym= ∑i│Ii-〈Ii〉│∑Ii(여기서, 〈Ii〉는 대칭 당량에 대한 평균 세기임)bRcryst= ∑│FO-FC│/∑│FO│
실시예 3
DES-LBD-GRIP1 NR 박스Ⅱ펩티드 복합체의 전체구조물
DES-LBD-GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드 복합체 결정의 비대칭 유니트는 E2및 RAL 양자 모두와 결합한 LBDs의 동일한 비결정학성 이량체를 함유했다(상기 Brozozowski, et al과 상기 Tanenbaum, et al). 헬릭스 2 및 3, 및 헬릭스 9 및 10 사이의 유연성 루프외에, 상기 이량체의 두 개의 LBDS는 비슷한 구조물(Cα위치에 기초한 r.m.s.d.0.47Å)을 채택한다. 각각의 DES와 복합된 LBD의 구조는 E2와 결합된 LBD의 구조와 매우 유사하였다; 각 단량체는 11 내지 12 헬릭스의 3개층과 단일 베타 헤어핀으로 구성된 쐐기형 분자이다. 각각의 LBD에서 헬릭스 12의 소수성면은 리간드 결합 포켓으로 덮힌 헬릭스 3, 5/6, 및 11에 대해 팩킹되어있다. 하나의 GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드가 헬릭스 3, 4, 5, 및 12의 잔기 3과 4사이의 회전(도 2a 와 3a)으로 구성된 소수성 단편에서 각각의 LBD와 결합한다. 비대칭 유니크내의 양 펩티드에 대한 밀도는 연속적이고 분명치 못하다(도 1a). 펩티드 A로 지명된 GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드로부터의 잔기 687, 697과 펩티드 B로 지명된 GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드로부터의 잔기 686과 696을 모델링시켰다; 남아있는 잔기는 불규칙했다. 각각의 펩티드가 결정내의 다른 환경중에 놓여질 경우에, 잔기 Ile 689 내지 Gln 695의 각 펩티드는 2회전 엠피페틱 α헬릭스(도 2a 및 3a)를 형성한다. 통상 2차 구조의 상기영역 플랭킹하는 동안, 펩티드는 비슷하지 않은 무작위 코일 형태를 채택한다.
DES-ERα-GRIP1NR 박스 Ⅱ 펩티드 복합체와 OHR-ERαLBD 복합체의 전체 구성을 도 2, 도 2a에 제시했다. 보조활성제 펩티드와 LBD는 리본 모양으로 나타냈다. 펩티드는 금색이고 헬릭스 12(잔기 538-546)는 자홍색으로 나타냈다. 헬릭스 3, 4와 5(각각 H3, H4, 및 H5로 표시)는 청색으로 나타냈다. 녹색으로 나타낸 DES는 공간충전을 제시한다. 도 2b에서, LBD를 리본으로 나타냈다. 도 2a에서와 같이,헬릭스 12(잔기 536-544)는 자홍색, 헬릭스 3, 4, 및 5를 청색으로 나타냈다. 적색으로 나타낸 OHT는 공간충전을 제시한다.
실시예 4
NR 박스Ⅱ 펩티드-LBD 경계면
ERαLBD 대한 GRIP1 NR 박스Ⅱ 펩티드 결합은 각 분자로부터 주로 소수성 표면 지역의 1000Å2을 함입시켰다. 상기 GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드 결합 부위는 헬릭스 3으로부터의 잔기 Leu354, Val358, Ala361과 Lys362; 헬릭스 3 및 4 사이의 회전으로부터의 Leu372; 헬릭스 5로부터의 Gln375, Val376, Leu379, 및 Glu380; 및 헬릭스 12로부터의 Asp538, Leu539, Glu542, 및 Met543으로 구성된 얕은 그루브이다(도3 a). 상기 그루브의 저면과 측면은 완전히 비극성이지만, 상기 그루브의 말단부는 하전된다(도 3c).
LBD는 일차적으로 Ile689의 측쇄 및 3개의 LXXLL 모티프(서열번호: 1)인 루이신(Leu690, Leu693, 및 Leu694)에 의해 형성된 GRIP1 NR 박스 Ⅱ펩티드 α헬릭스의 소수성면에서 상호작용한다. Leu690의 측쇄는 그루브내에 깊이 합임되고, Ile358, Val376. Leu379, Glu380, 및 Met543(도 3a와 3c)의 측쇄와 함께 반 데르 발스 결합을 형성한다. Leu694의 측쇄는 그루브내에 유사하게 고립되고 Ile358, Lys362, Leu372, Gln375, Val376과 Leu379(도 3a와 3c)의 측쇄와 함께 반 데르 발스 결합을 형성한다. 이와 반대로, Ile689 및 제 2의 GRIP1 NR 박스 루이신, Leu693의 양 측쇄들 모두 그루브의 림상에 놓인다(도 3a와 3c). Ile689의 측쇄는 Asp538, Leu539, Glu542의 측쇄에 의해 형성된 얕은 디프레션에 놓여진다. Leu693의 측쇄는 Ile358과 Leu359의 측쇄와 비극성 결합을 형성한다.
펩티드 헬릭스의 친수성 측면을 형성하는 하전된 극성의 측쇄는 수용체로부터 돌출되고, 용매와 강하게 상호작용하거나 대칭결합을 형성한다(도1a). 펩티드 B의 Lys688을 제외하고, 비대칭 유니트내의 펩티드의 헬리칼 영역 외부의 극성 및 하전된 잔기의 측쇄는 LBD 단량체와 결합한 수소결합을 형서하지도 않고, 염 가교를 만들지도 않는다. 펩티드 B의 Lys688의 ε-아미노기는 단량체 B의 Glu380의 측쇄 카르복실레이트와 결합한다. 상기 상호작용은 결정 합성체인 것으로 보인다; 펩티드 B의 N-말단의 3개 잔기의 주쇄 원자가 단량체 B로부터 치환되고 대칭-관련성 LBD와 광범위하게 상호작용한다.
펩티드 헬릭스의 소수성 측면과 상호작용하는 것에 부가하여, 상기 LBD는 펩티드 헬릭스의 양 말단과 캡핑 상호작용을 형성함에 의해 NR 박스 펩티드의 주쇄를 안정화시킨다. Glu542 및 Lys362는 펩티드 결합부분의 반대쪽 말단에 위치한다(도 3a). Glu542 및 Lys362의 측쇄는 각각의 펩티드 헬릭스의 N 말단 및 C 말단 회전에서 주쇄 및 측쇄와 함께 반 데르 발스 결합을 형성한다. 상기 상호작용은 Gly542의 γ-카복실레이트의 안정화 전하 및 Lys362의 ε-아미노기를 GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드 헬릭스 말단 부근에 배치시킨다(도 3c). Glu542의 측쇄 카복실레이트(γ-카복실레이트)는 펩티드 헬릭스(펩티드A의 잔기 688과 689;펩티드 B의 잔기 689와 690)의 N-말단 회전의 잔기 아미드와 수소결합한다(도 1a). 유사하게, Lys362의 ε-아미노기는 펩티드 헬릭스(펩티드 A의 잔가693;펩티드B의 잔기 693과 694)의 C-말단 회전의 잔기의 카르보닐과 수소결합한다(도 5).
결정중에 관찰되는 GRIP1 NR 박스 Ⅱ 펩티드/LBD 경계면의 중요도를 시험하기 위하여, 위치 지정의 일련의 돌연변이를 ERαLBD내로 도입시켰다. 상기 돌연변이를 구조적 일체성 및 결합 그루브(Ile358-〉Arg,Val376-〉Arg와 Leu539-〉Arg)의 저면의 비극성을 동시에 교란시키거나 캡핑 상호작용(Lys362-〉Ala와 Glu542-〉Lys)의 형성을 방지시키기 위해 설계했다. 야생형 및 돌연변이 LBD에 대한 글루타티온-S-전이효소(GST)의 융합을 리간드의 부재, 또는 DES 또는 OHT의 존재하의35S-표지된 GRIP1에 대한 결합력을 검정했다.35S-표지한 GRIP1을 고정화시킨 GST, 고정화시킨 야생형 GST-hERαLBD, 또는 리간드의 부재, 또는 DES 또는 OHT의 존재하의 고정화시킨 돌연변이 GST-LBD중의 어느 하나와 인큐베이팅시켰다. 상기 결합된 GRIP1을 SDS-PAGE 후에 정량했다. I358R, 잔기 358에서 Ile-〉Arg 치환을 함유한 돌연변이LBD; K362A, 잔기 362에서 Lys-〉Ala 치환을 함유한 돌연변이 LBD; V376R, 잔기 376에서 Val-〉Arg 치환을 함유한 돌연변이 LBD; L539R, 잔기 539에서 Leu-〉Arg 치환을 함유한 돌연변이 LBD; E542K, 잔기 542에서 Glu-〉Lys 치환을 함유한 돌연변이 LBD.
리간드의 부재 또는 OHT의 존재하에, 야생형 단백질과 모든 돌연변이 LBD 대한 융합은 GRIP1과의 검출성 결합을 제시하지 못했다. Ile358-〉Arg, Val376-〉Arg및 Leu539-〉Arg 돌연변이는 결정내에 관찰되는 팩킹 상호작용의 중요함을 확정하는 작용제의 존재하에 보조활성제와 상호작용이 불가능하다. N- 말단 또는 C-말단의 캡핑 상호작용중 어느 하나의 분열은 또한 작용제의 존재하에 GRIP1 결합을 포함했다. 단지 야생형 GST-LBD만이 DES의 존재하에 보조활성제를 인식할 수 있었다.
실시예 5
작용제 인식
다른 형상 및 커다란 분자 부피에도 불구하고, DES(273Å3)가 E2(252Å3)를 인식하는 동일 결합 포켓중에 수용되었다. 이의 수용체 복합체에서, DES는 헬릭스 3, 6, 7, 8, 11, 및 12 뿐만아니라 S1/S2 헤어핀(도2a 및 4a)으로부터의 잔기로 구성된 강력한 소수성 공동중 LBD의 좁은 절반안에 싸여졌다. ERα와 DES의 상호작용은 E2의 경우와 유사했다. DES 페놀성 고리중 하나는 E2A 고리와 같이 헬릭스 3 및 6에 인접한 동일한 위치에 놓였다. E2의 방향족 고리와 같이, DES A 고리(도 4a)는 Glu353의 γ-카르복실레이트, Arg394의 구아니디니움 및 구조적으로 보존된 물 분자에 대한 페놀릭 하이드록실 형성 수소 결합을 지닌 Phe404, Ala350, Leu387 및 Leu391의 측쇄에 의해서 연결된다. DES의 A' 고리(도 4a)는 E2C 및 D 고리의 로케이션과 인접한 헬릭스 7, 8, 및 11 부근에서 결합한다. 상기 고리는 E2의 D 고리처럼 Gly521 및 Leu525 뿐만아니라, Met343, Leu346 및 Met421와 반 데르 발스 결합을 형성한다(도 4a). 심지어 비록 D 고리 하이드록실로부터 1.7Å에 위치하여도, DES A' 고리 페놀릭 하이드록실은 His524의 이미다졸 고리에 대한 수소결합이 여전히 가능하다(도 4a).
DES는 또한 LBD와 결합을 형성하나, E2는 그렇지 않다. E2의 B 고리의 α 측면과 C 고리의 β 측면에 인접한 비어있는 공동이 존재한다(상기 Brzozowski, et al., Tanenbaum, et al.). 페놀성 고리의 평면으로부터 수직으로 돌출된 DES의 에틸기가 상기 공간에 합치된다. Ala350, Leu384, Phe404, 및 LeU428의 측쇄(도 4a)와의 추가의 비극성 결합의 결과는 수용체에 대한 DES의 높은 친화성을 설명한다 (Kuiper, et al., Endocrinology 138:863-70(1991)). Met421 및 Met528(양자 모두 단지 E2와 결합함)을 제외하고, ER은 양쪽 작용제와 관찰된 수소결합 및 반 데르 발스 결합 모두를 형성하기 위해서 동일 잔기를 사용할 수 있다(도 4a, 상기 Brzozowski, et al., 및 상기 Tanenbaum, et al.). 상기 뛰어난 적응성은 아마도 결합 포켓(양쪽 복합체에서 ∼500Å3)의 상대적으로 큰 분자 부피 및 뚜렷한 구조적 유연성(plasticity)의 결과이다. 특히, 결합 포켓의 DES A' 고리/스테로이드 D 고리의 말단에서, Met343, Met421, His524와 Met528는 각각의 리간드(자료에 나오지 않음)에 반응하여 다른 팩킹 형태를 채택한다. 상기 유연성은 수용체가 D 고리에서 구조적으로 E2와 다른 에스트론 및 에스트리올 같은 내재성 에스트로겐을 인식할 수 있도록 하기 위해 필요하다.
실시예 6
OHT-LBD 복합체의 구조
OHT 결합은 DES 결합에 의해 유도된 것과 2차 구조 및 3차 구조가 다른 유 LBD 콘포메이션을 유도시켰다. DES 복합체에서, 잔기 339 내지 341, 421 내지 423, 및 527 내지 530의 주쇄는 각각 헬릭스 3, 8 및 11의 부분을 형성시켰다. 이와 반대로, 상기 영역은 OHT 복합체에서 연장된 콘포메이션을 채택했다(도 2a 및 6a). 또한, 헬릭스 12의 조성 및 배향은 상기 두개 구조에서 상이했다. OHT 복합체중의 헬릭스 12는 잔기 536 내지 544를 구성하는 반면에, DES 복합체중의 헬릭스 12는 잔기 538 내지 546를 구성한다. 특히, DES 복합체에서 처럼 리간드 결합 포켓을 커버링하기 보다는 는, OHT복합체에서 헬릭스 12는 헬릭스 3,4 및 5와 회전 결합 헬릭스 3과 4(도 2a, 2b 및 3b)로 부터의 잔기에 의해서 형성된 보조활성제 결합 그루브의 부분을 차지한다. 상기 양자택일의 헬릭스 12의 형태는 RAL 복합체에서 관찰된 것과 유사한 것처럼 보인다.(상기 Brozozoski, et al.)
실시예7
헬릭스 12-LBD 공유영역
헬릭스 12의 배향을 제외하고, 펩티드 결합 그루브의 구조는 DES 및 OHT 복합체(도 3a 및 3b)에서 거의 동일했다. 헬릭스 12의 상기 그루브 외부의 구역은 NR 박스 결합부위의 "정전 영역"으로서 본원에서 언급된다. OHT 복합체에서 헬릭스 12 및 DES 복합체에서 NR 박스 펩티드 헬릭스는 현저하게 유사한 방식으로 보조활성제 인식 그루브의 정전 영역과 상호작용을 한다.
헬릭스 12는 NR 박스와 비슷한(LXXLL 대신 LLEML)(서열번호: 1 대신 서열번호: 3) 잔기 (잔기 540에서 544)의 스트레치를 가진 그루브의 정전 영역과의 NR 박스 펩티드의 소수성 상호작용을 모방했다. Leu 540 및 Met 543의 측쇄는 펩티드 복합체(도 5)에서 첫 번째 및 두 번째 모티프 루이신(Leu 690 및 Leu 693)의 측쇄처럼 대체로 동일 위치에 놓여있다. Leu 540가 그루브에 삽입되고 Leu 354, Val 376, 및 Glu 380(도 3b 및 3d)와 반 데르 발스 결합을 형성했다. Met 543은 그루브의 가장자리를 따라 놓이고, Leu 354, Val 355, 및 Ile 358(도 3b 및 3d)의 측쇄와 반 데르 발스 결합을 형성했다. Leu 544의 측쇄 위치는 세 번째 NR 박스 루이신인 Leu694(도 5)의 위치와 거의 정확히 겹쳤다. 그루브의 깊은 곳에서, Leu 544 측쇄가 Ile358, Lys362, Leu372, Gln 375, Val 376, 및 Leu 379(도 3b 및 3d)의 측쇄와 반 데르 발스 결합을 형성했다.
OHT 복합체에서 헬릭스 12는 N- 및 C- 말단 캡핑 상호작용에 의해, 또한 안정화??다. Lys 362는 헬릭스 펩티드(도 3a 및 3b)의 동등한 회전과 상호작용하는 것과 같이 헬릭스 12의 C-말단 회전과 상호작용했다. Lys 362 측쇄는 잔기 543 및 544(도 5)의 카르보닐에 대한 ε-아미노기 수소 결합을 가진 헬릭스 12의 C-말단 회전에 대해 패킹했다. N-말단 회전 보조활성제 헬릭스에서 주어진 캡핑 상호작용은 헬릭스 12 잔기(Glu 542)에 의해 형성되고, 길항제 복합체에서 헬릭스 12의 N-말단 회전은 다른 잔기인 Glu380(도 3b 및 3d)와 상호작용하도록 했다. 상기 Glu 380 γ-카르복실레이트는 Tyr 537과 반 데르 발스 결합을 형성하고 일련의 물-매개 수소결합(도 1b)을 통해 Tyr 537의 아미드와 상호작용한다.
상기 "NR 박스류" 상호결합의 형성에 부가하여, 헬릭스 12 역시 보조활성제 인식 그루브의 LBD 외부의 구역과 반 데르 발스 결합을 형성한다. Leu536의 측쇄는 Glu 380 및 Trp 383과 반 데르 발스 결합을 형성하고, Tyr 537의 측쇄는 His 373, Val 376, 및 Glu380(도 lb, 3b 및 3d)와 반 데르 발스 결합을 형성한다. 상기 결합의 결과 OHT 복합체중의 헬릭스 12가 DES 복합체중의 NR 박스 펩티드 보다 더 많은 용매 근접성 표면 영역(∼1200Å)을 함입시킨다.
실시예 8
OHT 인식
OHT는 DES, E2및 RAL을 인식하는 동일 포켓내에 결합되었다. 결합 포켓 안의 OHT의 배향은 상기 리간드의 두 개의 구조적인 특징, 페놀성 A 고리와 거대한 측쇄(도 4b 및 6c)의 배치에 의해 지시되는 것처럼 보인다. OHT의 A 고리는 DES의 A 고리 처럼 구조적으로 보존된 물과 Glu 353 및 Arg 394(도 4b)의 측쇄에 대한 페놀릭 하이드록실 수소결합을 가진 헬릭스 3 및 6 근처의 대체로 동일한 위치에 결합한다. RAL의 거대한 측쇄처럼, OHT의 측쇄는 헬릭스 3과 11(도 2b 및 4b)사이의 결합 포켓을 배출시켰다. 상기 OHT C 고리(도 4b)는 Met 343, Leu 346, Thr 347, Ala 350, Trp 383, Leu 384, Leu 387, 및 Leu 525의 측쇄와 반 데르 발스 결합을 형성했다. 측쇄의 유동성 있는 디메틸아미노에틸 영역에서의 배치는 Thr 347, Ala 350 및 Trp 383과의 반 데르 발스 결합에 의해서 안정화되었고, 측쇄의 디메틸아미노기와 Asp 351의 β-카르복실레이트 사이에 3.8Å 간격으로 놓인 염 가교에 의해 안정화되었다. OHT의 견고한 트리페닐에틸렌 프레임워크의 콘텍스트에서 A 고리와 측쇄의 위치는 OHT의 에틸렌기가 DES의 에틸렌기(도 4a, 4b 및 6d)의 위치에 대해 거의 직교의 배향에 놓이는 것을 필요로 한다. 그 결과, OHT의 B 고리는 DES의 A'고리(도 6b 및 6c) 보다 더 깊게 결합 포켓으로 합입된다.
OHT B 고리 상기 위치는 결합 포켓의 DES A' 고리/E2D 고리 말단 DES 및 E2의 다른 구조적 특징에 적응되도록 하는 동일한 기전에 의애 수용될 수 없음이 명백하다. 대신에, DES의 A' 고리와 대부분 상호작용하는, B 고리(Met 343, Leu 346, Met421, Ile424, Gly %@!, His 524 및 Leu 525)와 결합한 잔기는 DES 구조(도 6d)에서 그들이 채택한 것과 다른 콘포메이션을 채택한다. 실제로, B 고리의 로케이션은 실질적으로 하나의 잔기 Met 421의 측쇄가 DES 구조(도 6b 및 6c)에서 채택했던 것과 동일한 콘포메이션을 채택하는 것을 막는다. 상기 B 고리-유도된 측쇄 콘포메이션의 결과로서, DES 복합체에 존재하는 많은 잔기사이의 반 데르 발스 결합이 OHT 복합체에서는 존재하지 않았다. 예를 들어, Met 421은 작용제 복합체에서 헬릭스 11로부터의 His 524 및 헬릭스 3으로부터의 Met 343에 대해 패킹하는 반면에, Met는 OHT B 고리 로케이션에 의해 길항제 복합체(도 6d)내에서 상기 잔기 중 어느 하나와 상호결합하는 것을 막는다.
B 고리의 배치의 구조적 효과는 B 고리와 결합하는 잔기에 제한되지 않는다;상기 잔기의 형태는 결합 포켓에 걸친 다른 잔기가 교대로 선택적 콘포메이션을 채책택하도록 한다. 예를 들어, OHT 복합체내의 Met 421에 의해 채택된 콘포메이션은 Phe 404 및 Phe 425 측쇄가 DES 복합체(도 6b 및 6c)에서 차지했던 위치를 차지하는 것을 막는다. 그 결과, DES 또는 E2(도 6c)의 A 고리와 결합을 형성하지 않았다. 실제로, Phe 404는 OHT의 에틸기(도 6c 및 6d)와 결합한다. B 고리와 직접적으로 결합하고 이에 의해 간접적으로 영향을 받은 두 잔기의 측쇄의 선택적 콘포메이션은 결합 포켓에 걸친 주쇄가 또한 다른 콘포메이션을 채택하도록 한다(도 6d).
ERα의 리간드 결합 도메인내의 주요 잔기의 동정 및 특성화와 이들 정보의 다른 핵 수용체에 대한 확장은, 이들 잔기가 데이터에서 확인된 모든 핵 수용체에 대해 공통됨을 보여주었다. 이와같이, 본원에서 제시한 실시예는 ERα 리간드 결합 도메인의 구조와 기능에서 수득된 정보가 핵 수용체 패밀리의 모든 일원을 위해, 핵 수용체에 대한 화합물의 결합을 조절하는 화합물의 설계 및 선택에 적용될 수 있음을 입증하였다.
상기 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 본원에 참고로서 통합된다.
상기한 본 발명은, 당업자에 의해 첨부된 청구범위의 본질과 범위를 벗어나지 않으면서 많은 변경과 수정이 가능함은 물론이다.
발명의 개요
본 발명은 리간드 결합 도메인(LBD)의 추가의 동정 및 조작에 관한 것으로서, 이는 LBD와 결합하고 핵 수용체, 특히 에스트로젠 수용체의 활성을 조절하는 화합물의 설계를 가능하게 한다. 상기 화합물은 핵 활성을 조절하는 작용제 및 길항제를 포함하고, 수용체-, 세포-, 및/또는 조직 특이성일 수 있다. 특히, 상기 화합물은 보조활성제-보조활성제 반응 부위 상호작용에 영향을 주어 핵 수용체 활성을 조절한다.
본 발명은 또한 LBD와 결합된 작용제 및 보조활성제 결합부위와 결합된 펩티드를 지닌 핵 수용체의 단백질 공결정(cocrystal), 및 이의 제조 방법을 포함한다. 유사하게, 본 발명은 또한 LBD와 결합된 길항제를 지닌 핵 수용체의 단백질 공결정 및 이의 제조 방법을 포함한다. 상기 공결정은 특이적 아미노산 및 LBD를 형성하는 그의 원자, 및 그의 부위와 결합하는 분자와 상호작용하는 보조활성제 결합부위의 정보에 대한 원자 모델링을 얻기 위한 방법을 제공한다. 상기 공결정은 또한 리간드:핵 수용체, 및 보조활성제:핵 수용체 상호작용, 및 이와 결합된 리간드의 구조에 대한 모델링 정보를 제공한다.
본 발명은 핵 수용체의 원자 모델을 사용하여 핵 수용체에 대한 리간드 결합을 조절하는 분자의 동정 및 설계를 위한 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 핵 수용체 LBD 또는 그의 단백질을 포함하는 원자 구조 모델을 사용하는 핵 수용체 LBD 내에 특이적으로 들어맞는 시험 화합물의 모델링, 검정 예를 들어, 생물학적 검정으로 시험 화합물의 스크리닝, 시험 화합물과 핵 수용체 LBD와의 결합에 의한 특성화, 및 수용체에 대한 리간드 결합을 조절하는 시험 화합물의 동정을 포함한다.
본 발명은 또한 핵 수용체의 LBDs 내의 주요 잔기를 동정하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 상기 방법은 리간드 및/또는 보조활성제의 결합을 조절하는 잔기를 동정하기 위해 관심있는 핵 수용체의 표면을 조사하는 것을 포함한다. 상기 잔기는 본원에 기술된 인간 ERα의 LBD 내의 주요 잔기에 대한 상동성 검색에 의해 동정될 수 있다. 핵 수용체의 LBD, 및/또는 그의 단백질의 입체 모델을 사용한 오버래잉 및 수퍼포지셔닝이 또한 본 목적을 위해 사용될 수 있다. 또한, 배열 및/또는 모델링이 세포의 콘텍스트 내의 부위의 성질을 특성화하기 위해 LBD 표면상의 변이 배치에 대한 가이드로서 사용될 수 있다.
또한, 핵 수용체의 활성을 조절하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 체내이거나 시험관내일 수 있다. 상기 방법은 시험관내 또는 체내에서 리간드 결합 도메인과 결합하고 작용제 또는 길항제로서 활성이 있는 화합물을 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 화합물은 관심있는 세포내에서 발견된 리간드 보다 더 큰 친화성으로 부위와 결합하는 것이다.
본 발명은 핵 수용체와 결합하는 리간드의 작용제 또는 길항제를 동정하기 위한 방법을 추가로 포함한다. 상기 방법은 핵 수용체 결합 도메인 또는 그의 단백질을 포함하는 원자 좌표를 컴퓨터화된 모델링 시스템에 제공하는 단계; 리간드 결합 도메인과 공간적으로 들어맞는 화합물을 모델링하는 단계; 핵 수용체 활성에 대한 검정 예를 들어, 생물학적 검정으로 리간드 결합 도메인을 통해 핵 수용체의 활성을 증가시키거나 감소시키는 화합물을 동정하는 단계를 포함한다.
또한, 리간드 결합 도메인 또는 그의 부분에 대한 정보와 함께 장치 해독성 데이터 저장 매체가 제공된다. 상기 매체는 장치 해독성 데이터로 엔코딩된 데이터 저장 물질을 포함하고, 데이터를 이용하기 위한 지침과 함께 프로그래밍된 장치를 사용하는 경우에, 상기 데이터는 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 대한 분자 또는 분자 복합체의 입체 그래픽 재현을 보여줄 수 있다.
또한, 다른 핵 수용체와 비교하여 한가지 유형의 핵 수용체 화합물의 활성을 선택적으로 조절하는 화합물을 동정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 관심있는 핵 수용체 결합 도메인내로 공간적으로 및 우선적으로 들어맞는 시험 화합물을 핵 수용체 LBD의 원자 구조 모델을 사용하여 모델링하는 단계, 부위의 콘텍스트내의 LBD 유니크의 하나 이상의 잔기와 상호작용하는 화합물을 선택하는 단계, 및 다른 핵 수용체에 대해 LBD와 선택적으로 결합하는 화합물을 검정 예를 들어, 생물학적으로 검정하여 동정하는 단계를 포함한다. 수용체 선택성 리간드중에 포함된 상기 유니크 특징은 다른 핵 수용체 또는 동일한 유형의 수용체의 아이소폼(isoform)에 의해 동정될 수 있다.
본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 동정된 펩티드, 펩티도미메틱, 및 다른 화합물 예를 들어, 작은 유기 분자, 특히 핵 수용체 관련 질환, 특히 스테로이드 수용체 관련 질환, 및 보다 더 구체적으로는 에스트로젠 수용체 관련 질환의 치료에 유용한 신규의 유도 화합물의 선택 및 특성화에 이용될 수 있다.

Claims (71)

  1. 에스트로젠 수용체 α 리간드 결합 도메인 또는 이의 일부의 원자 구조 모
    델을 사용하여 관심있는 핵 수용체 리간드 결합 도메인내로 공간적으로 합치되는 시험 화합물을 모델링하는 단계;
    시험 화합물과 리간드 결합 도메인의 결합을 특징으로 하는 검정으로 시험 화합물을 스크리닝 하는 단계; 및
    핵 수용체 활성을 조절하는 시험 화합물을 동정하는 단계를 포함하여, 핵 수용체 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법으로서,
    원자 구조 모델이 인간 에스트로젠 수용체 α Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525 및 Met528의 잔기에 상응하는 아미노산 잔기의 원자 좌표를 포함하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 아미노산 잔기가 잔기 Met343, Met421, His 524, Leu525, 및 Met528에 상응함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 시험 화합물이 작용제이고, 핵 수용체 활성이 보조활성제 결합부위에 대한 보조활성제의 결합에 의해 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 시험 화합물이 길항제이고, 핵 수용체 활성이 헬릭스 12의 풀림에 의해 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 시험 화합물이 길항제이고, 핵 수용체 활성이 보조활성제 결합의 블로킹에 의해 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 스크리닝이 시험관내 스크리닝임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 스크리닝이 고처리량 스크리닝임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 시험 화합물이 화합물의 라이브러리로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 시험 화합물이 작은 유기 분자, 펩티드, 또는 펩티도미메틱임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 모델링 단계 이전에, 에스트로젠 수용체 α 리간드 결합 도메인 또는 이의 일부의 원자 좌표를 컴퓨터화된 모델링 시스템에 제공하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 핵 수용체가 에스트로젠 수용체, 티로이드 수용체, 레티노이드 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 프로제스틴 수용체, 미네랄로코르티코이드 수용체, 안드로젠 수용체, 퍼록시좀 수용체, 및 비타민 D 수용체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 핵 수용체가 에스트로젠 수용체임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 에스트로젠 수용체가 에스트로젠 수용체 α임을 특징으로 하는 방법.
  14. 에스트로젠 수용체 α 리간드 결합 도메인 또는 이의 일부의 원자 구조 모델을 사용하여 관심있는 핵 수용체 리간드 결합 도메인내로 공간적으로 합치되는 시험 화합물을 모델링하는 단계;
    시험 화합물과 결합 도메인의 결합을 특징으로 하는 검정으로 시험 화합물을 스크리닝 하는 단계; 및
    리간드가 핵 수용체에 결합하는 것을 조절하는 시험 화합물을 동정하는 단계를 포함하여, 리간드가 핵 수용체에 결합하는 것을 조절하는 화합물을 확인하는 방법으로서,
    원자 구조 모델이 인간 에스트로젠 수용체 α Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525 및 Met528의 잔기에 상응하는 아미노산 잔기의 원자 좌표를 포함하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 아미노산 잔기가 잔기 Met343, Met421, His 524, Leu525 및 Met528에 상응함을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 핵 수용체가 에스트로젠 수용체, 티로이드 수용체, 레티노이드 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 프로제스틴 수용체, 미네랄로코르티코이드 수용체, 안드로젠 수용체, 퍼록시좀 수용체, 및 비타민 D 수용체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 핵 수용체가 에스트로젠 수용체임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 에스트로젠 수용체가 에스트로젠 수용체 α임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 14항에 있어서, 스크리닝이 시험관내 스크리닝임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 스크리닝이 고처리량 스크리닝임을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 14항에 있어서, 시험 화합물이 화합물의 라이브러리로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 14항에 있어서, 시험 화합물이 리간드 결합의 작용제 또는 길항제임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 14항에 있어서, 시험 화합물이 작은 유기 분자, 펩티드, 또는 펩티도미메틱임을 특징으로 하는 방법.
  24. 에스트로젠 수용체 α 리간드 결합 도메인 또는 이의 일부의 원자 좌표를 컴퓨터화된 모델링 시스템에 제공하는 단계;
    리간드 결합 도메인내로 공간적으로 합치되는 화합물을 모델링하는 단계; 및
    핵 수용체 활성에 대한 검정으로, 핵 수용체의 리간드 결합 도메인과 결합하여 핵 수용체의 활성을 증가시키거나 감소시키는 화합물을 동정하는 단계(여기서, 리간드 결합의 작용제 및 길항제가 동정됨)를 포함하며,
    원자 좌표가 인간 에스트로젠 수용체 α Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525 및 Met528인, 핵 수용체에 대한 리간드 결합의 작용제 또는 길항제를 동정하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 아미노산 잔기가 잔기 Met343, Met421, His 524, Leu525 및 Met528에 상응함을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 핵 수용체가 에스트로젠 수용체, 티로이드 수용체, 레티노이드 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 프로제스틴 수용체, 미네랄로코르티코이드 수용체, 안드로젠 수용체, 퍼록시좀 수용체, 및 비타민 D 수용체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 핵 수용체가 에스트로젠 수용체임을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 에스트로젠 수용체가 에스트로젠 수용체 α임을 특징으로 하는 방법.
  29. 핵 수용체 활성의 조절이 필요한 동물에게, 충분량의 관심있는 핵 수용체의 리간드 결합 도메인내로 공간적 및 우선적으로 합치되는 화합물을 투여함으로써 포유동물에서 핵 수용체 활성을 조절하는 방법으로서, 화합물이 인간 에스트로젠 수용체 α Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525 및 Met528의 잔기에 상응하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시키도록 설계된 화합물인 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 잔기 Met343, Met421, His 524, Leu525 및 Met528에 상응함을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 29에 있어서, 핵 수용체가 에스트로젠 수용체, 티로이드 수용체, 레티노이드 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 프로제스틴 수용체, 미네랄로코르티코이드 수용체, 안드로젠 수용체, 퍼록시좀 수용체, 및 비타민 D 수용체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 핵 수용체가 에스트로젠 수용체임을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 에스트로젠 수용체가 에스트로젠 수용체 α임을 특징으로 하는 방법.
  34. 장치 해독성 데이터로 엔코딩된 데이터 저장 물질을 포함하는 장치 해독성 데이터 저장 매체로서, 데이터 저장 물질이 데이터의 사용 명령이 프로그래밍된 장치를 사용하는 경우에 인간 에스트로젠 수용체 α Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525 및 Met528에 상응하는 아미노산의 구조 좌표를 포함하는 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 결합된 화합물의 분자 복합체 또는 이것의 동족체의 3차원 그래픽을 디스플레이시킬 수 있는 매체.
  35. 제 34항에 있어서, 아미노산 잔기가 잔기 Met343, Met421, His 524, Leu525 및 Met528에 상응함을 특징으로 하는 매체.
  36. 제 34에 있어서, 핵 수용체가 에스트로젠 수용체, 티로이드 수용체, 레티노이드 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 프로제스틴 수용체, 미네랄로코르티코이드 수용체, 안드로젠 수용체, 퍼록시좀 수용체, 및 비타민 D 수용체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 매체.
  37. 제 36항에 있어서, 핵 수용체가 에스트로젠 수용체임을 특징으로 하는 매체.
  38. 제 37항에 있어서, 에스트로젠 수용체가 에스트로젠 수용체 α임을 특징으로 하는 매체.
  39. 제 34항에 있어서, 분자 복합체가 부록 1 및 부록 2에 나타난 구조 좌표의 세트로 정의되거나, 1.5Å이하의 아미노산의 골격 원자로부터의 제곱평균평방근 편차를 가지는 분자 복합체의 동족체로 정의됨을 특징으로 하는 매체.
  40. 제 1 세트 및 제 2 세트의 데이터의 이용을 위한 명령으로 프로그래밍된 장치를 사용하여, 제 2 세트의 장치 해독성 데이터와 결합된 경우에, 제 2 세트의 장치 해독성 데이터에 상응하는 구조 좌표의 일부 이상을 측정할 수 있는, 제 1 세트의 장치 해독성 데이터로 엔코딩된 데이터 저장 물질을 포함하는 장치 해독성 데이터 저장 매체로서,
    제 1 세트의 데이터가 부록 1 또는 부록 2에 기재된 좌표로 구성된 군으로부터 선택된 일부 이상의 구조 좌표의 푸리에 변환을 포함하고; 제 2 세트의 데이터가 분자 또는 분자 복합체의 X-선 회절 패턴을 포함하는 매체.
  41. 제 40항에 있어서, 핵 수용체가 에스트로젠 수용체, 티로이드 수용체, 레티노이드 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 프로제스틴 수용체, 미네랄로코르티코이드 수용체, 안드로젠 수용체, 퍼록시좀 수용체, 및 비타민 D 수용체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 매체.
  42. 제 41항에 있어서, 핵 수용체가 에스트로젠 수용체임을 특징으로 하는 매체.
  43. 제 42항에 있어서, 에스트로젠 수용체가 에스트로젠 수용체 α임을 특징으로 하는 매체.
  44. 리간드 결합 도메인에 결합된 작용제 및 핵 수용체의 보조활성제 결합부위에 결합된 분자를 포함하는, 2.03Å 이상의 간격으로 회절하는 핵 수용체 공결정.
  45. 제 44항에 있어서, 핵 수용체가 에스트로젠 수용체 α임을 특징으로 하는 공결정.
  46. 제 45항에 있어서, 인간 에스트로젠 수용체 α임을 특징으로 하는 공결정.
  47. 제 46항에 있어서, 분자가 펩티드임을 특징으로 하는 공결정.
  48. 제 47항에 있어서, 펩티드가 NR 박스 아미노산 서열 또는 그의 유도체를 포함함을 특징으로 하는 공결정.
  49. 핵 수용체의 리간드 결합 도메인에 결합된 길항제를 포함하는, 1.9Å 이상의 간격으로 회절하는 핵 수용체 공결정.
  50. 제 49항에 있어서, 핵 수용체가 에스트로젠 수용체 α임을 특징으로 하는 공결정.
  51. 제 50항에 있어서, 인간 에스트로젠 수용체 α임을 특징으로 하는 공결정.
  52. 인간 수용체 에스트로젠 α Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525, 및 Met528, 바람직하게는 Met343, Met421 His524, Leu525 및 Met528의 잔기에 상응하는 핵 수용체 LBD의 하나 이상의 아미노산 잔기가 리간드의 하나 이상의 제 1 화학 성분과 상호작용하는 핵 수용체 리간드를 설계하는 컴퓨터화된 방법으로서,
    상호작용하는 아미노산과 제 1 화학성분 사이의 상호작용과 비교하여, 상호작용하는 아미노산과 제 2 화학성분 사이의 상호작용을 증가시키거나 감소시키는 구조를 지닌 제 2 화학성분을 생성시키기 위해, 제 1 화학 성분의 하나 이상의 화학적 변형을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  53. 제 52항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 잔기 Met343, Met421, His 524, Leu525 및 Met528에 상응함을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 52항에 있어서, 제 1 화학성분의 화학적 변형 후에, 상호작용하는 아미노산과 리간드 사이의 상호작용의 변화를 측정하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 52항에 있어서, 화학적 변형이, 상호작용하는 아미노산과 제 1 화학성분과비교하여, 상호작용하는 아미노산과 제 2 화학성분 사이의 수소결합 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용, 또는 양극성 상호작용을 증강시킴을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 52항에 있어서, 화학적 변형이, 상호작용하는 아미노산과 제 1 화학성분과비교하여, 상호작용하는 아미노산과 제 2 화학성분 사이의 수소결합 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용, 또는 양극성 상호작용을 감소시킴을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 52에 있어서, 핵 수용체가 에스트로젠 수용체, 티로이드 수용체, 레티노이드 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 프로제스틴 수용체, 미네랄로코르티코이드 수용체, 안드로젠 수용체, 퍼록시좀 수용체, 및 비타민 D 수용체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 57항에 있어서, 핵 수용체가 에스트로젠 수용체임을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 52항에 있어서, 에스트로젠 수용체가 에스트로젠 수용체 α임을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 59항에 있어서 리간드가 작용제임을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 60항에 있어서, 리간드가 17β-에스트라디올, 디에틸스틸베스트롤, 모제스트롤, 메소헥세스트롤, 코우메스트롤, △9-THC, o.p-DDT, 지아랄레논, 및 케폰으로 구성된 군으로부터 선백됨을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 61항에 있어서, 리간드가 17β-에스트라디올이고, 제 1 화학성분이 C6α, C7α, C12α, C15α, 및 C17α로 구성된 군으로부터 선택된 위치에 배치된 A' 고리의 유리 탄소임을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 59항에 있어서, 리간드가 길항제임을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 63항에 있어서, 리간드가 ICI 164,384 및 EM800으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 59항에 있어서, 리간드가 선택성 에스트로젠 수용체 조절제임을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 65항에 있어서, 리간드가 타목시펜, 랄록시펜, 및 GW5638로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  67. 관심있는 핵 수용체의 리간드 결합 도메인과 공간적 및 우선적으로 합치되는 충분한 양의 리간드를 이를 필요로하는 포유동물에 투여함에 의해 핵 수용체 활성을 조절하는 방법으로서,
    리간드가 컴퓨터화된 방법에 의해 설계되며, 인간 에스트로겐 수용체 α Met343, Leu346, Ala350, Glu353, Leu384, Leu387, Leu391, Arg394, Phe404, Met421, Leu428, Gly521, His524, Leu525, 및 Met528, 바람직하게는 Met343, Met421 His524, Leu525 및 Met528에 상응하는 하나 이상의 핵 수용체 리간드 결합 도메인의 아미노산 잔기가 리간드의 제 1 화학 성분과 상호작용하고,
    상호작용하는 아미노산과 제 1 화학 성분의 상호작용과 비교하여, 상호작용하는 아미노산과 제 2 화학 성분 사이의 상호작용을 증가시키거나 감소시키는 구조를 지닌 제 2 화학 성분을 생성시키기 위해, 제 1 화학 성분의 하나 이상의 변형을 선택하는 것을 포함하는 방법.
  68. 제 67항에 있어서, 아미노산 잔기가 잔기 Met343, Met421, His 524, Leu525 및 Met528에 상응함을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 67항에 있어서, 리간드가 길항제임을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 67항에 있어서, 리간드가 작용제임을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 70항에 있어서, 컴퓨터화된 방법으로 설계된 보조활성제 의사물질을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법으로서,
    인간 에스트로겐 수용체 α 헬릭스 3 잔기 Leu354, Val355, Met357, Ile358, Ala361 및 Lys 362, 헬릭스 4 잔기 Phe367, 헬릭스 5 잔기 Gln375 Val376, Leu379 및 Glu380, 헬릭스 6 잔기 Trp383, 및 헬릭스 12 잔기 Asp538, Leu539, Glu542, Met543 및 Leu544에 상응하는 핵 수용체 보조활성제 결합 부위의 하나 이상의 아미노산 잔기가 보조활성제 의사물질의 하나 이상의 제 1 화학 성분과 상호작용하며, 상호작용하는 아미노산과 제 1 화학 성분 사이의 상호작용과 비교하여, 상호작용하는 아미노산과 제 2 화학 성분 사이의 상호작용을 증가시키거나 감소시키는 구조를 지닌 제 2 화학 성분을 생성시키기 위해, 제 1 화학 성분의 하나 이상의 화학적 변형을 선택하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
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