KR20010041989A - 변화된 ｐＨ 프로필을 가지는 할로퍼옥시다제 - Google Patents

변화된 ｐＨ 프로필을 가지는 할로퍼옥시다제 Download PDF

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KR20010041989A
KR20010041989A KR1020007010316A KR20007010316A KR20010041989A KR 20010041989 A KR20010041989 A KR 20010041989A KR 1020007010316 A KR1020007010316 A KR 1020007010316A KR 20007010316 A KR20007010316 A KR 20007010316A KR 20010041989 A KR20010041989 A KR 20010041989A
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haloperoxidase
pro
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KR1020007010316A
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스벤드슨알란
요르겐슨루이즈
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피아 스타르
노보자임스 에이/에스
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
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    • C09D5/00—Coating compositions, e.g. paints, varnishes or lacquers, characterised by their physical nature or the effects produced; Filling pastes
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    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
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Abstract

모 바나듐-함유 할로퍼옥시다제의 변이체로서, 이 변이체는 할로퍼옥시다제 활성 및 변화된 pH 최적치를 가지고 다음 위치의 최소한 하나에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다: R490A, L, I, Q, M, E, D; A399G; F397N, Y, E, Q; P395A, S; R360A, L, I, Q, M, E, D; K353Q, M; S402A, T, V, S; D292L; A501S; W350F, Y; V495A, T, V, S; K394A, L, I, Q, M, E, D; 상기에서 모 할로퍼옥시다제는 SEQ ID No. 1에 주어진 아미노산 서열을 가지거나, 또는 모 할로퍼옥시다제는 SEQ ID No. 1에 최소한 80% 상동성인 아미노산 서열을 가진다.

Description

변화된 ｐＨ 프로필을 가지는 할로퍼옥시다제{HALOPEROXIDASES WITH ALTERED pH PROFILES}
〈110〉 NOVO NORDISK A/S
〈120〉 HALOPEROXIDASES WITH ALTERED pH PROFILES
〈130〉 2
〈150〉 DK 0374/98
〈151〉 1998-03-18
〈160〉 9
〈170〉 KopatentIn 1.71
〈210〉 1
〈211〉 609
〈212〉 PRT
〈213〉 Curvularia inaequalis
〈400〉 1
Met Gly Ser Val Thr Pro Ile Pro Leu Pro Lys Ile Asp Glu Pro Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Asn Thr Asn Tyr Ile Leu Phe Trp Asn His Val Gly Leu Glu
20 25 30
Leu Asn Arg Val Thr His Thr Val Gly Gly Pro Leu Thr Gly Pro Pro
35 40 45
Leu Ser Ala Arg Ala Leu Gly Met Leu His Leu Ala Ile His Asp Ala
50 55 60
Tyr Phe Ser Ile Cys Pro Pro Thr Asp Phe Thr Thr Phe Leu Ser Pro
65 70 75 80
Asp Thr Glu Asn Ala Ala Tyr Arg Leu Pro Ser Pro Asn Gly Ala Asn
85 90 95
Asp Ala Arg Gln Ala Val Ala Gly Ala Ala Leu Lys Met Leu Ser Ser
100 105 110
Leu Tyr Met Lys Pro Val Glu Gln Pro Asn Pro Asn Pro Gly Ala Asn
115 120 125
Ile Ser Asp Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly Leu Val Leu Asp Arg Ser
130 135 140
Val Leu Glu Ala Pro Gly Gly Val Asp Arg Glu Ser Ala Ser Phe Met
145 150 155 160
Phe Gly Glu Asp Val Ala Asp Val Phe Phe Ala Leu Leu Asn Asp Pro
165 170 175
Arg Gly Ala Ser Gln Glu Gly Tyr His Pro Thr Pro Gly Arg Tyr Lys
180 185 190
Phe Asp Asp Glu Pro Thr His Pro Val Val Leu Ile Pro Val Asp Pro
195 200 205
Asn Asn Pro Asn Gly Pro Lys Met Pro Phe Arg Gln Tyr His Ala Pro
210 215 220
Phe Tyr Gly Lys Thr Thr Lys Arg Phe Ala Thr Gln Ser Glu His Phe
225 230 235 240
Leu Ala Asp Pro Pro Gly Leu Arg Ser Asn Ala Asp Glu Thr Ala Glu
245 250 255
Tyr Asp Asp Ala Val Arg Val Ala Ile Ala Met Gly Gly Ala Gln Ala
260 265 270
Leu Asn Ser Thr Lys Arg Ser Pro Trp Gln Thr Ala Gln Gly Leu Tyr
275 280 285
Trp Ala Tyr Asp Gly Ser Asn Leu Ile Gly Thr Pro Pro Arg Phe Tyr
290 295 300
Asn Gln Ile Val Arg Arg Ile Ala Val Thr Tyr Lys Lys Glu Glu Asp
305 310 315 320
Leu Ala Asn Ser Glu Val Asn Asn Ala Asp Phe Ala Arg Leu Phe Ala
325 330 335
Leu Val Asp Val Ala Cys Thr Asp Ala Gly Ile Phe Ser Trp Lys Glu
340 345 350
Lys Trp Glu Phe Glu Phe Trp Arg Pro Leu Ser Gly Val Arg Asp Asp
355 360 365
Gly Arg Pro Asp His Gly Asp Pro Phe Trp Leu Thr Leu Gly Ala Pro
370 375 380
Ala Thr Asn Thr Asn Asp Ile Pro Phe Lys Pro Pro Phe Pro Ala Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Gly His Ala Thr Phe Gly Gly Ala Val Phe Gln Met Val Arg
405 410 415
Arg Tyr Tyr Asn Gly Arg Val Gly Thr Trp Lys Asp Asp Glu Pro Asp
420 425 430
Asn Ile Ala Ile Asp Met Met Ile Ser Glu Glu Leu Asn Gly Val Asn
435 440 445
Arg Asp Leu Arg Gln Pro Tyr Asp Pro Thr Ala Pro Ile Glu Asp Gln
450 455 460
Pro Gly Ile Val Arg Thr Arg Ile Val Arg His Phe Asp Ser Ala Trp
465 470 475 480
Glu Leu Met Phe Glu Asn Ala Ile Ser Arg Ile Phe Leu Gly Val His
485 490 495
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Thr Lys Asp Val Tyr Ala Val Asp Asn Asn Gly Ala Thr Val Phe Gln
515 520 525
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530 535 540
Glu Gly Leu Phe Pro Ile Gly Gly Val Pro Leu Gly Ile Glu Ile Ala
545 550 555 560
Asp Glu Ile Phe Asn Asn Gly Leu Lys Pro Thr Pro Pro Glu Ile Gln
565 570 575
Pro Met Pro Gln Glu Thr Pro Val Gln Lys Pro Val Gly Gln Gln Pro
580 585 590
Val Lys Gly Met Trp Glu Glu Glu Gln Ala Pro Val Val Lys Glu Ala
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Pro
〈210〉 2
〈211〉 600
〈212〉 PRT
〈213〉 Curvularia sp.
〈400〉 2
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〈210〉 3
〈211〉 26
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: Primer
〈400〉 3
cgcggatcct ctatatacac aactgg 26
〈210〉 4
〈211〉 27
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: Primer
〈400〉 4
gaagatctcg agttaattaa tcactgg 27
〈210〉 5
〈211〉 30
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: Primer
〈400〉 5
gaatgacttg gttgacgcgt caccagtcac 30
〈210〉 6
〈211〉 31
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: Primer
〈400〉 6
ggtctgtatt gggcctacct tgggtcaaac c 31
〈210〉 7
〈211〉 31
〈212〉 DNA
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〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: Primer
〈400〉 7
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〈211〉 25
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: Primer
〈400〉 8
cgccatttct gagatcttcc tgggc 25
〈210〉 9
〈211〉 36
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: Primer
〈400〉 9
gcatcttcct cggcagccac tggcgattcg atgccg 36
할로퍼옥시다제는 과산화수소의 존재 하에서 할로겐화물(X=Cl-, Br-, 또는 I-)을
H2O2+ X-+ H+→ H2O + HOX
에 따라 상응하는 하이포할러스 산(HOX)으로 산화시킬수 있는 효소의 분류를 형성한다.
만약 사용하기 좋은 친핵성 수용체가 존재한다면, 반응은 여러가지의 할로겐화 반응 생성물을 형성할수 있으므로 HOX 쪽으로 일어날 것이다.
염화 퍼옥시다제(EC 1.11.1.10)는 H2O2를 소모하면서 염소, 브롬 및 요오드 이온을 산화시킬수 있는 효소이다.
브롬 퍼옥시다제는 H2O2를 소모하면서 브롬 및 요오드 이온을 산화시킬수 있는 효소이다.
요오드 퍼옥시다제(EC 1.11.1.8)는 H2O2를 소모하면서 요오드 이온을 산화시킬수 있는 효소이다.
바나듐 할로퍼옥시다제는 다른 할로퍼옥시다제가 헴퍼옥시다제인 것과는 달리, 이들 효소의 보호기가 바나네이트(바나듐 Ⅴ)와 유사한 구조적 특징을 가진다는 점에서 다른 할로퍼옥시다제와 상이하다.
할로퍼옥시다제는 여러가지 유기체로부터 단리되어 왔다: 포유류, 해양 동물, 식물, 조류, 이끼, 진균 및 박테리아(Biochimica et Biophysica Acta 1161, 1993, pp. 249-256 참조). 다른 효소도 포함될수는 있지만, 사실상 할로퍼옥시다제는 할로겐화 화합물의 형성을 책임지는 효소라고 일반적으로 승인된다.
진균 Curvularia inaequalis로부터 바나듐-함유 염화퍼옥시다제에 대한 아미노산 서열(SEQ No.1)이 공개되어 있다(SWISS-PROT:P49053 참조).
진균 Curvularia verruculosa로부터 바나듐-함유 염화퍼옥시다제에 대한 아미노산 서열(SEQ No.2)이 공개되어 있다(WO 97/04102 참조).
진균 Curvularia inaequalis로부터 바나듐-함유 염화퍼옥시다제의 X-선 구조가 공개되어 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 93(1), 1996, 392-396; and pdb1vnc.ent).
할로퍼옥시다제는 넓은 범위의 잠재적인 산업적 용도 때문에 현재 관심의 대상이다. 예를 들어, 할로퍼옥시다제는 항-미생물제로서 사용하도록 제안되어 왔다.
본 발명은 야생형과 비교하여 변화된 pH 최적치를 가지는 할로퍼옥시다제 변이체에 관한 것이다.
(발명의 간단한 설명)
본 발명은 모 할로퍼옥시다제와 비교하여 변화된 pH 최적치를 가지는 바나듐-함유 할로퍼옥시다제 변이체에 관한 것이며, 특히 본 발명은 다음을 다루고 있다:
모 바나듐-함유 할로퍼옥시다제의 변이체로서, 이 변이체는 할로퍼옥시다제 활성 및 변화된 pH 최적치를 가지며, 다음의 위치 중 최소한 하나에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다.
상기에서 모 할로퍼옥시다제는 SEQ ID No. 1의 아미노산 서열을 가지거나 또는 모 할로퍼옥시다제는 SEQ ID No. 1에 최소한 80% 상동성인 아미노산 서열을 가진다.
(발명의 상세한 설명)
상동성 바나듐-함유 할로퍼옥시다제
상이한 진균에 의해 생성된 다수의 바나듐-함유 할로퍼옥시다제는 아미노산 수준에 있어서 상동성이다.
Curvularia inaequalis 및 Curvularia verruculosa 할로퍼옥시다제의 정렬이 수행되었다. 정렬은 C. inaequalis의 3D 구조 파일로부터 얻은 할로퍼옥시다제 아미노산 서열을 사용한다(Brookhaven databank file pdb1vnc.ent).
디폴트 파라미터(패널티: gap 중량=3.0, 길이 중량=0.1; WISCONSIN PACKAGE Version 8.1-UNIX, August 1995, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)를 가지는 GAP 프로그램을 사용하는 UWGCG 프로그램으로부터 얻은 상동 퍼센트를 사용한 경우, 다음의 상동성이 밝혀졌다.
SEQ ID No. 1의 아미노산 서열을 포함하는 Curvularia inaequalis 바나듐-함유 할로퍼옥시다제: 100%
SEQ ID No. 2의 아미노산 서열을 포함하는 Curvularia verruculosa 바나듐-함유 할로퍼옥시다제: 96%
본 발명과 관련하여, "로부터 유도된"은 당해 유기체의 스트레인에 의해 생성된 또는 생성가능한 바나듐-함유 할로퍼옥시다제를 나타낼 뿐만 아니라, 그러한 스트레인으로부터 단리된 DNA 서열에 의해 코드화되고 상기 DNA 서열을 함유하는 숙주 유기체에서 생성되는 바나듐-함유 할로퍼옥시다제를 나타낸다. 마지막으로, 이 용어는 합성 및/또는 cDNA 기원의 DNA 서열에 의해 코드화되고, 당해 바나듐-함유 할로퍼옥시다제의 확인된 특성을 가지는 바나듐-함유 할로퍼옥시다제를 나타낸다.
변화된 pH 최적치를 가지는 변이체
바나듐-함유 할로퍼옥시다제의 바람직한 pH 최적치는 관심의 용도에 따른다. 예를 들어, 만약 바나듐-함유 할로퍼옥시다제가 데님 표백용으로 사용된다면, 바람직한 pH 최적치는 pH 5-8 근처일 것이고, 반면 바나듐-함유 할로퍼옥시다제가 세탁의 목적으로 사용된다면, 바람직한 pH 최적치는 pH 8-10 근처가 될것이다.
상기 변이체는 돌연변이의 결과, 즉, 하나 이상의 아미노산 잔기가 모 바나듐-함유 할로퍼옥시다제로부터 제거, 대체 또는 첨가된 결과라는 점에서 모 바나듐-함유 할로퍼옥시다제의 pH 최적치를 변화시키는 것이 가능하다. 활성 자리 잔기의 이웃에 전하 변화를 도입함에 의해, 관심의 잔기의 pKa가 당해 할로퍼옥시다제의 변화된 활성 프로필을 조절하기 위해 변화될수 있다.
His(할로퍼옥시다제의 활성 자리) 가까이에 더 음으로 하전된 잔기를 도입함에 의해, 그것의 pKa는 상승되고 따라서 이전 보다 더 높은 pH에서 촉매로 작용하게 될 것이라고 일반적으로 믿어진다. His 가까이에 더 양으로 하전된 잔기를 도입함에 의해, 활성 자리 His는 그것의 pKa를 이전보다 더 낮은 pKa로 변화시키고 따라서 이전 보다 더 낮은 pH에서 촉매로 작용하게 될것이다.
pKa의 증가는 또한 활성 자리(His)의 용매 접근용이성을 감소시킴으로서 얻어질수 있다.
그러나, 본 발명에 따라, 잔기가 His 496 및 His 404 주위의 10Å 내에 존재하는 것이 가장 중요하다고 밝혀졌다. 이들 잔기는: 46-48, 193, 257, 259-265, 267-269, 285-294, 297-304, 307, 242, 245-346, 349-350, 353, 358-363, 365, 378, 380-384, 393-412, 441, 443, 482-502, 507, 551-557 이다. 이 영역 내의 변화는 pH 의존성 활성을 변화시키거나 또는 효소의 pH-최적치를 변화시킨다고 밝혀졌다. 이 방법에 있어서, 잔기는, 예를 들어 Curvularia inaequalis 할로퍼옥시다제로 돌연변이 될수있다. 유사한 구조를 가지기 위해 가정된 상동성 구조가 모형조립 될수 있으며(실시예 1 참조), 관심의 영역이 같은 방법으로 밝혀졌다.
돌연변이의 바람직한 위치는 다음과 같다.
상기에서 모 할로퍼옥시다제는 SEQ ID No. 1의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID No. 1과 최소한 80% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 모 할로퍼옥시다제의 상동성 위치, 또는 SEQ ID No. 1과 최소한 85% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 모 할로퍼옥시다제의 상동성 위치, 또는 SEQ ID No. 1과 최소한 90% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 모 할로퍼옥시다제의 상동성 위치, 또는 SEQ ID No. 1과 최소한 95% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 모 할로퍼옥시다제의 상동성 위치, 또는 SEQ ID No. 1과 최소한 96% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 모 할로퍼옥시다제의 상동성 위치, 또는 SEQ ID No. 1과 최소한 97% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 모 할로퍼옥시다제의 상동성 위치, 또는 SEQ ID No. 1과 최소한 98% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 모 할로퍼옥시다제의 상동성 위치, 또는 SEQ ID No. 1과 최소한 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 모 할로퍼옥시다제의 상동성 위치를 가진다.
특히 다음의 돌연변이가 바람직하다:
상기에서 모 할로퍼옥시다제는 SEQ ID No. 2의 아미노산 서열을 가진다.
바람직한 구체예에서 두개 이상의 아미노산 잔기가 다음과 같이 치환될수 있다.
상기에서 모 할로퍼옥시다제는 SEQ ID No. 1의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID No. 1과 최소한 80% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 모 할로퍼옥시다제의 상동성 위치, 또는 SEQ ID No. 1과 최소한 85% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 모 할로퍼옥시다제의 상동성 위치, 또는 SEQ ID No. 1과 최소한 90% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 모 할로퍼옥시다제의 상동성 위치, 또는 SEQ ID No. 1과 최소한 95% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 모 할로퍼옥시다제의 상동성 위치, 또는 SEQ ID No. 1과 최소한 96% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 모 할로퍼옥시다제의 상동성 위치, 또는 SEQ ID No. 1과 최소한 97% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 모 할로퍼옥시다제의 상동성 위치, 또는 SEQ ID No. 1과 최소한 98% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 모 할로퍼옥시다제의 상동성 위치, 또는 SEQ ID No. 1과 최소한 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 모 할로퍼옥시다제의 상동성 위치를 가진다.
바람직한 구체예에서 두개 이상의 아미노산 잔기가 다음과 같이 치환될수 있다.
상기에서 모 할로퍼옥시다제는 SEQ ID No. 2의 아미노산 서열을 가진다.
바나듐-함유 할로퍼옥시다제 변이체의 제조 방법
유전자에 돌연변이를 도입하기 위한 몇가지 방법이 당해 기술분야에 알려져 있다. 할로퍼옥시다제-코드화 DNA 서열의 클로닝에 대한 간단한 논의 후에, 할로퍼옥시다제-코드화 서열 내의 특정한 자리에 돌연변이를 발생시키기 위한 방법이 논의될 것이다.
바나듐-함유 할로퍼옥시다제를 코드화하는 DNA 서열의 클로닝
모 바나듐-함유 할로퍼옥시다제를 코드화하는 DNA 서열이 당해 기술분야에 잘 알려진 여러가지 방법을 사용하여, 어떤 세포 또는 당해 할로퍼옥시다제를 생성하는 미생물로부터 단리될수 있다. 처음에, 게놈성 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리가 연구되는 할로퍼옥시다제를 생성하는 유기체로부터 염색체의 DNA 또는 메신저 RNA를 사용하여 구성되어야 한다. 다음에, 만약 할로퍼옥시다제의 아미노산 서열이 알려져 있다면, 상동성, 표지 올리고뉴클레오티드 프로브가 합성될수 있고, 당해 유기체로부터 제조된 게놈성 라이브러리로부터 할로퍼옥시다제-코드화 클론을 확인하기 위해 사용될수 있다.
또는 달리, 알려진 할로퍼옥시다제 유전자에 상동성 서열을 함유하는 표지 올리고뉴클레오티드 프로브가 낮은 스트린전시의 혼성화 및 세척 조건을 사용하여, 할로퍼옥시다제-코드화 클론을 확인하기 위한 프로브로서 사용될수 있다.
할로퍼옥시다제-코드화 클론의 확인 방법은, 플라스미드와 같은 발현 벡터에 cDNA를 삽입하는 단계, 결과의 cDNA 라이브러리로 할로퍼옥시다제-네가티브 진균을 형질전환하는 단계, 그리고 다음으로 형질전환된 진균을 할로퍼옥시다제에 대한 기질을 포함하는 아가에 플레이팅하는 단계를 포함하며, 이로써 확인되는 할로퍼옥시제를 발현하는 클론을 허가한다.
또는 달리, 효소를 코드화하는 DNA 서열이 수립된 표준 방법, 예를 들어 포스포로아미디트(phosphoroamidite) 법에 의해 합성적으로 제조될수 있다. 포스포로아미디트법에서, 올리고뉴클레오티드는 예들 들어 자동 DNA 합성기에서 합성되고, 정제, 어닐, 결찰되고 적절한 벡터로 클론된다.
마지막으로, DNA 서열은 표준 기술에 따라, 합성, 게놈성 또는 cDNA 기원의 단편을 결찰함에 의해 제조된(적절한 바에 따라, 전체 DNA 서열의 여러 부분에 상응하는 단편), 게놈성 및 합성 기원의 혼합, 합성 및 cDNA 기원의 혼합 또는 게놈성 및 cDNA 기원의 혼합일수 있다. DNA 서열은 또한 특정한 프라이머를 사용하는 폴리머라제 사슬 반응(PCR)에 의해 제조될수 있다.
특정 부위 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)
이전에 할로퍼옥시다제-코드화 DNA 서열이 단리되었고, 돌연변이에 바람직한 부위가 확인되었다. 돌연변이는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 도입될수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 바람직한 돌연변이 부위를 방어하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다; 돌연변이 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드가 합성되는 동안 삽입된다. 특정한 방법에 있어서, 할로퍼옥시다제-코드화 서열을 연결하는, DNA의 단일-나선 gap이 할로퍼옥시다제 유전자를 가지는 벡터에서 만들어진다. 다음에 바람직한 돌연변이를 가지는 합성 뉴클레오티드가 단일-나선 DNA의 상동성 부분에 어닐된다. 다음에 잔여 gap이 T7 DNA 폴리머라제로 채워지고 이 구조물은 T4 리가제를 사용하여 결찰된다(모리나가법-Biochemistry, 2, 1984, pp. 626-639 참조). 미국 4,760,025는 카세트의 작은 변성을 수행함에 의해 다중 돌연변이를 코드화하는 올리고뉴클레오티드의 도입을 개시하고 있다. 그러나, 여러가지 길이의, 다수의 올리고뉴클레오티드가 도입될수 있기 때문에, 더 여러가지의 돌연변이가 모리가나법에 의해 동시에 도입될수 있다.
할로퍼옥시다제-코드화 DNA 서열에 돌연변이를 도입하는 다른 방법은 PCR 반응의 프라이머 중의 하나로서 화학적으로 합성된 DNA 나선을 사용함에 의해 도입된 바람직한 돌연변이를 함유하는 PCR 단편의 3-단계 발생이다. PCR-발생 단편으로부터, 돌연변이를 가지는 DNA 단편이 제한 엔도뉴클리아제로 분열시킴에 의해 단리되고 발현 플라스미드에 재삽입될수 있다.
무작위 돌연변이유발(random mutagenesis)
모 할로포옥시다제를 코드화하는 DNA 서열의 무작위 돌연변이유발이 당해 기술분야에 알려진 어떤 방법을 사용함으로서 쉽게 수행될수 있다.
예를 들어, 무작위 돌연변이유발은 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이유발제의 사용에 의해, 적합한 올리고뉴클레오티드의 사용에 의해, 또는 PCR-발생 돌연변이유발에 DNA 서열을 종속시킴에 의해 수행될수 있다. 나아가, 무작위 돌연변이유발은 이들 돌연변이유발제의 어떤 조합을 사용함에 의해서도 수행될수 있다.
돌연변이유발제는, 예를 들어 전이, 변위, 전위, 스크램블링, 제거 및/또는 삽입을 유발하는 어떤 것일수 있다.
본 목적에 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이유발제의 예는 자외선(UV) 복사, 히드록시아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), O-메틸 히드록시아민, 아질산, 에틸 메탄 술포네이트(EMS), 나트륨 바이술포네이트, 포름산, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
그러한 시약이 사용된 경우, 돌연변이유발은 전형적으로 돌연변이가 일어나기 위한 적합한 조건 하에서, 정선한 돌연변이유발제의 존재 하에서 돌연변이되는 모 효소를 코드화하는 DNA 서열을 인큐베이팅하고, 바람직한 성질을 가지는 돌연변이된 DNA를 선택함에 의해 수행된다.
돌연변이유발이 올리고뉴클레오티드의 사용에 의해 수행되는 경우, 올리고뉴클레오티드는 변화되는 위치에서 올리고뉴클레오티드가 합성되는 동안 세 개의 비-모 뉴클레오티드로 도프(dope)되거나 스파이크(spike)될수 있다. 도핑 또는 스파이킹이 행해질수 있으며 따라서 원하지 않은 아미노산의 코돈을 피할수 있다. 도프된 또는 스파이크된 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 PCR, LCR 또는 어떤 DNA 폴리머라제 및 리가제를 사용하는, 어떤 공개된 기술에 의해 할로퍼옥시다제 효소를 코드화하는 DNA로 재조합될수 있다.
PCR-발생 돌연변이가 사용되는 경우, 모 할로퍼옥시다제 효소를 코드화하는 화학적으로 처리되거나 또는 처리되지 않은 유전자가 뉴클레오티드의 오결합을 증가시키는 조건 하에서 PCR된다(Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol. 1, 1989, pp. 11-15).
대장균, S. cereviseae 또는 어떤 다른 미생물 유기체의 돌연변이유발유전자 스트레인이 예를 들어 모 효소를 함유하는 플라스미드를 돌연변이유발유전자 스트레인에 형질전환시키고, 플라스미드로 돌연변이유발유전자 스트레인을 성장시키고, 그리고 돌연변이유발유전자 스트레인으로부터 돌연변이된 플라스미드를 단리하는 것에 의한, 할로퍼옥시다제 효소를 코드화하는 DNA의 무작위 돌연변이유발에 사용될수 있다. 돌연변이된 플라스미드는 연속하여 발현 유기체로 형질전환 될수 있다.
돌연변이되는 DNA 서열은 모 할로퍼옥시다제 효소를 발현하는 유기체로부터 제조된 게놈성 또는 cDNA 라이브러리에 쉽게 존재할수 있다. 또는 달리, DNA 서열은 플라스미드 또는 박테리오파아지와 같은 적합한 벡터에 존재할수 있으며, 이는 돌연변이유발제로 인큐베이트되거나 또는 다른 방법으로 돌연변이유발제에 노출될수 있다. 돌연변이되는 DNA는 또한 상기 세포의 게놈에 통합됨에 의해 또는 세포에 숨겨진 벡터에 존재함에 의해 숙수 세포에 존재할수 있다. 마지막으로, 돌연변이되는 DNA는 단리된 형태일수 있다. 무작위 돌연변이유발이 되기 쉬운 DNA 서열은 바람직하게는 cDNA 또는 게놈성 DNA 서열이다.
어떤 경우에 있어서, 수행되는 발현 단계 또는 스크리닝 단계 전에 돌연변이된 DNA 서열을 알맞게 증폭하는 것이 편리할수 있다. 그러한 증폭은 당해 기술분야에 알려진 방법에 따라 수행될것이며, 현재 바람직한 방법은 모 효소의 DNA 또는 아미노산 서열을 기초로하여 제조된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR-발생 증폭이다.
돌연변이유발제로 인큐베이션되거나 또는 돌연변이유발제에 노출된 후에, 돌연변이된 DNA는 발현이 일어나는 것을 허가하는 조건 하에서, DNA 서열을 가지는 적합한 숙주 세포를 배양함에 의해 발현된다. 이 목적에 사용되는 숙주 세포는 선택적으로 벡터에 존재하는, 돌연변이된 DNA 서열로 형질전환된 것, 또는 돌연변이 유발 처리 동안 모 효소를 코드화하는 DNA 서열을 가지는 것일수 있다. 적합한 숙주 세포의 예는 Aspergillus niger 또는 Aspergillus oryzae와 같은 진균 숙주이다.
돌연변이된 DNA 서열은 돌연변이된 DNA 서열의 발현을 허가하는 기능을 코드화하는 DNA 서열을 더 포함할수 있다.
국부적 무작위 돌연변이유발(localized random mutagenesis)
무작위 돌연변이유발은 본 모 할로퍼옥시다제의 부분에 국부적으로 제한될수 있다. 이것은, 예를 들어 효소의 어떤 영역이 효소의 주어진 성질을 위해 특히 중요하다고 확인된 경우, 그리고 변형이 개선된 성질을 가지는 변이체를 가져오는 것이 기대되는 경우에 유리할수 있다. 그러한 영역은 보통 모 효소의 삼차 구조가 밝혀지고 효소의 기능에 관계되는 경우에 확인될수 있다.
국부적 무작위 돌연변이유발은 상기 설명된 바와 같은 PCR-발생 돌연변이유발 기술 또는 당해 기술분야에 알려진 어떤 다른 적합한 기술을 사용함으로서 쉽게 수행된다.
또는 달리, 변형되는 DNA 서열의 부분을 코드화하는 DNA 서열이, 예를 들어 적합한 벡터에 삽입됨에 의해 단리될수 있으며, 상기 부분은 상기 논의된 돌연변이유발 방법 중 어떤것을 사용함에 의해 연속하여 돌연변이유발될수 있다.
본 발명의 상기 언급된 방법의 스크리닝 단계에 관하여, 이것은 다음의 이론에 근거한 aa 필터 검정을 사용함으로서 쉽게 수행될수 있다:
관심의 돌연변이된 할로퍼옥시다제 효소를 발현할수 있는 미생물이 적합한 배지에서 인큐베이트되고, 분비되는 효소에 적합한 조건 하에서, 배지는 일차 단백질-결합 필터 및 낮은 단백질 결합 능력을 나타내는 이차 필터의 상부를 포함하는 이중 필터에 제공된다. 미생물은 이차 필터에 위치하게 된다. 인큐베이션 후에, 미생물로부터 분비된 효소를 포함하는 일차 필터가 미생물을 포함하는 이차 필터로부터 분리된다. 일차 필터는 바람직한 효소성 활성을 위해 스크리닝되고, 이차 필터에 존재하는 상응하는 미생물 콜로니가 확인된다.
효소성 활성을 결합하는데 사용되는 필터는 어떤 단백질 결합 필터, 예를 들어 나일론 또는 니트로셀룰로스이다. 발현 유기체의 콜로니를 가지는 상부 필터는 결합 단백질에 대해 낮은 친화성을 가지거나 또는 친화성을 가지지 않는 어떤 필터, 예를 들어 셀룰로스 아세테이트 또는 DuraporeTM일수 있다. 필터는 스크리닝에 사용되는 어떤 조건으로 전처리되거나 효소성 활성을 검출하는 동안 처리될수 있다.
효소성 활성은 염료, 형광, 침전, pH 지시약, IR-흡광도 또는 효소성 활성을 검출하기 위한 어떤 다른 알려진 기술에 의해 검출될수 있다.
검출된 화합물은 어떤 고착제, 예를 들어 아가로스, 아가, 젤라틴, 폴리아크릴아미드, 녹말, 여과지, 천; 또는 고착제의 어떤 조합에 의해 고착될수 있다.
할로퍼옥시다제 변이체의 발현
본 발명에 따라, 상기 언급된 방법에 의해, 또는 당해 기술분야에 알려진 어떤 다른 방법에 의해 생성된 변이체를 코드화하는 DNA 서열이 전형적으로 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 신호, 및 선택적으로 리프레서 유전자 또는 여러가지 활성 유전자를 코드화하는 조절 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용하여, 효소 형태로 발현될수 있다.
본 발명의 할로퍼옥시다제 변이체를 코드화하는 DNA 서열을 가지는 재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 방법이 쉽게 수행될수 있는 어떤 벡터일수 있으며, 벡터의 선택은 주로 그것이 도입되는 숙주 세포에 의존한다. 따라서, 벡터는 자발적으로 복제하는 벡터, 즉 염색체외 실체, 염색체의 복제, 예를 들어 플라스미드, 박테리오파아지 또는 염색체외 요소에 독립적인 복제, 소염색체 또는 인공 염색체로서 나타나는 벡터일수 있다. 또는 달리, 숙주 세포에 도입되는 경우, 벡터는 숙주 세포 게놈에 통합되고 그것이 통합되는 염색체와 함께 복제된것일수 있다.
벡터에 있어서, DNA 서열은 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되어야 한다. 프로모터는 정선한 숙주 세포에 전사적 활성을 나타내는 어떤 DNA 서열일수 있으며, 숙주 세포에 상동성 또는 이종성 단백질을 코드화하는 유전자로부터 유도될수 있다. 본 발명의 할로퍼옥시다제 변이체를 코드화하는 DNA 서열의 전사를 지시하기 위한 적합한 프로모터의 예는, 특히 진균 숙주로서, A. oryzae TAKA 아밀라제, Rhizomucor miehei 아스파르트성 프로테이나제, A. niger 중성 α-아밀라제, A. niger 산 안정 α-아밀라제, A. niger 글루코아밀라제, Rhizomucor miehei 리파제, A. oryzae 알카리성 프로테아제, A. oryzae 트리오제 포스페이트 이소머라제 또는 A. nidulans 아세트아미다제로부터 유도된 것들이다.
본 발명의 발현 벡터는 또한 적합한 전사 터미네이터 및, 진핵세포로서, 본 발명의 할로퍼옥시다제 변이체를 코드화하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 폴리아데닐레이션 서열을 포함할수 있다. 터미네이션 및 폴리아데닐레이션 서열은 프로모터와 같은 공급원으로부터 적합하게 유도될수 있다.
벡터는 벡터가 당해 숙주 세포에 복제되도록 하는 DNA 서열을 더 포함할수 있다. 그러한 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 및 pIJ702의 복제 공급원이다.
벡터는 또한 선택가능한 마아커, 예를 들어, 암피실린, 카나마이신, 클로르암페니콜 또는 테트라시클린 내성과 같은 항생제 내성을 부여하는 것과 같이, 숙주 세포의 결함을 보완하는 생성물인 유전자를 포함할수 있다. 나아가, 벡터는 히그로마이신 내성을 일으키는 마아커인 amdS, argB, niaD 및 sC와 같은 Aspergillus 선택 마아커를 포함하거나, 또는 선택이 예를 들어 WO 91/17243에 설명된 바와 같은 공동-형질전환에 의해 수행될수 있다.
할로퍼옥시다제 변이체, 프로모터, 터미네이터 및 다른 요소들을 각각 코드화하는 본 발명의 DNA 구조물을 결찰하기 위해 그리고 그것들을 복제에 필수적인 정보를 함유하는 적합한 벡터에 삽입하기 위해 사용된 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있다(예를 들어 Sambrook et al. (1989) 참조).
상기 설명된 바와 같은 본 발명의 DNA 구조물 또는 발현 벡터를 포함하는 본 발명의 세포는 본 발명의 할로퍼옥시다제 변이체의 재조합 생성 숙주 세포로서 바람직하게 사용된다. 세포는 숙주 염색체의 DNA 구조물(하나 이상의 카피)을 결찰함에 의해 쉽게, 변이체를 코드화하는 본 발명의 DNA 구조물로 형질전환될수 있다. 이러한 통합은 일반적으로 DNA 서열이 세포를 더 안정하게 유지하기 때문에 바람직하게 고려된다. 숙주 염색체에 DNA 구조물의 통합은 종래의 방법, 예를 들어 상동성 또는 이종성 재조합 방법에 따라 수행될수 있다. 또는 달리, 세포는 상이한 종류의 숙주 세포와 연결된 상기 설명된 바와 같은 발현 벡터로 형질전환될수 있다.
본 발명의 세포는 포유류 또는 곤충과 같은 고등 유기체의 세포일수도 있지만, 바람직하게는 미생물 세포, 예를 들어 진균 세포이다.
바람직하게는, 사상 진균은 Axpergillus, 예를 들어 Aspergillus oryzae 또는 Aspergillus niger 종에 속할수 있다. 진균 세포는 원형질체 변형성 및 원형질체의 형질전환에 이어서 알려진 방법에 의한 세포 벽의 재발생을 포함하는 과정에 의해 형질전환될수 있다. Aspergillus 숙주 세포의 형질 전환에 적합한 방법은 EP 238 023에 개시되어 있다.
더 이상의 측면으로, 본 발명은 변이체의 생성에 도움이 되는 조건하에서, 상기 설명된 바와 같이 숙주 세포를 배양하고, 세포 및/또는 배양 배지로부터 변이체를 회수하는 것을 포함하는 방법인, 본 발명의 할로퍼옥시다제 변이체의 생성 방법에 관한 것이다.
세포를 배양하는데 사용되는 배지는 당해 숙주 세포가 성장하고 본 발명의 할로퍼옥시다제 변이체의 발현을 얻기에 적합한 어떤 종래의 배지이다. 적합한 배지는 상업 공급원으로부터 입수가능하거나 공개된 방법에 따라 제조될수 있다(예를 들어, catalogues of American Type Culture Collection에 설명된 바와 같이)
숙주 세포로부터 분비된 할로퍼옥시다제 변이체는 원심 분리 또는 여과에 의해 배지로부터 세포를 분리하고, 암모늄 술페이트와 같은 염에 의해 배지의 프로테이나세우스 성분을 침전시키는 것을 포함하는 잘 알려진 방법에 의해 배양 배지로부터 쉽게 회수될수 있으며, 이어서 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피 방법이 사용된다.
산업 용도
본 발명의 할로퍼옥시다제는 세제 또는 클리닝 조성물에 유용한 다른 효소 종류, 바람직하게는 프로테아제, 아밀라제, 큐티나제, 퍼옥시다제, 옥시다제, 락카제, 셀룰라제, 크실라나제 및 리파제로 구성된 군으로부터 선택되는 최소한 하나의 더 이상의 효소를 포함하는 세제 또는 클리닝 조성물에 혼합될수 있다. 특히 본 발명의 할로퍼옥시다제는 표백용 및 위생용 목적으로 사용될수 있다.
식품, 야채, 로숀과 같은 화장품, 크림, 젤, 연고, 비누, 샴푸, 컨디셔너, 제한제, 방취제, 양치질약, 콘텍트렌즈 제품, 효소 제조물, 또는 식품 재료의 보존에 사용되는 경우, 본 발명의 할로퍼옥시다제는 미생물 세포를 죽이거나 미생물 세포의 성장을 억제하는데 효과적인 양으로, 예를 들어 보존할수 없는 식품, 야채, 화장품, 콘텍트렌즈 제품, 식품 재료 또는 항염제품에 혼합될수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에 사용되는 할로퍼옥시다제는 예를 들어 좌창, 눈 또는 입의 감염, 피부 감염의 치료; 제한제 또는 방취제; 발 목욕 염, 콘텍트렌즈, 경질 표면, 치아(구강 관리), 상처, 타박상 등의 클리닝 및 살균의 살균제로서 유용할수 있다.
일반적으로, 본 발명의 할로퍼옥시다제는 클리닝, 살균 또는 어떤 경질 표면에서의 미생물 성장을 억제하는데 유용하도록 보완되었다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물과 접촉될수 있는 표면의 예는 예를 들어 착유장, 화학약품 또는 제약품 처리 공장, 하수도 시스템, 종이 펄프 처리 공장, 용수 처리 공장, 및 냉각 타워에 사용되는 처리 장치의 표면이다. 본 발명의 할로퍼옥시다제는 클리닝, 살균 또는 당해 표면에서의 미생물 성장을 억제하는데 효과적인 양으로 사용되어야 한다.
나아가, 바람직하게는, 본 발명의 할로퍼옥시다제는 어떤 종류의 처리 장치의 클리닝을 위한 클리닝-인-플레이스(C.I.P) 시스템에 사용되도록 보완되었다.
본 발명의 할로퍼옥시다제는 표면 및 식품 처리 공장과 병원, 요양원, 식당, 특히 패스트 푸드 식당, 조제 식품 판매점 등과 같이 식품을 제조하거나 제공하는 어떤 지역의 요리 기구를 클리닝하는데 추가로 사용될수 있다. 그것은 또한 식품 제품의 항균제로서 사용되며, 특히 치즈, 과일 및 야채와 샐러드 바의 식품 표면 의 항균제로서 유용하다.
그것은 또한 물을 기제로하는 페인트의 보존제 또는 살균제로서 사용된다.
페인트의 보존/저장
당해 기술분야에 있어서, 캔의 페인트 제품의 보존은 페인트에 비-효소성 유기 바이오시드를 첨가함으로서 수행되어 왔다. 본 발명과 관련하여, 페인트는 물, 유기 용매 및/또는 오일과 같은 액체 용액에 용해되거나 분산된 고체 착색 물질을 포함하는 물질로서 해석되며, 표면에 스프레드되는 경우, 이는 얇게 착색된, 장식 성 및/또는 보호성 코팅을 남기기 위해 건조된다. 전형적으로 5-클로르-2-메틸-4-티아졸리-3-온과 같은 이소티아졸리온이 페인트의 미생물 성장을 억제/방지 하기위해 약 0.05-0.5% 범위의 용량으로 바이오시드로서 페인트에 첨가되어 왔다. 그러나 본 발명의 방법은 이러한 분야에 적용하기에 적합하지만, 이러한 독성 바이오시드를 환경적으로 양립할수 있는 효소로 대체함으로서 독성 유기 바이오시드의 사용에 의해 나타나는 생물학적 위험의 문제가 해결된다. 따라서 본 발명은 페인트를 본 발명에 따르는 할로퍼옥시다제 변이체와 접촉시키는 것을 포함하는 페인트의 보존 방법을 제공한다. 나아가, 본 발명은 본 발명에 따르는 할로퍼옥시다제를 포함하는 페인트 조성물을 제공한다.
페인트는 바람직하게는 물을 기제로한 페인트, 즉 페인트의 고체가 수성 용액에 분산된 페인트이다. 페인트는 0-20% 유기 용매, 바람직하게는 0-10%, 예를 들어, 0-5%의 유기용매를 함유할수 있다.
효소는 L 페인트 당 0.0001-100mg/L 활성 효소 단백질의 양으로, 바람직하게는 0.001-10 mg/L, 예를 들어 0.01-1mg/L 활성 효소 단백질의 양으로 첨가된다.
과산화수소 공급원
본 발명에 따라, 할로퍼옥시다제와의 반응에 필요한 과산화수소는 많은 상이한 방법으로 얻어질수 있다: 그것은 과산화수소 또는 예를 들어 퍼카보네이트 또는 퍼보레이트와 같은 과산화수소 선구물질, 또는 퍼옥시카르복실산 또는 그것들의 염일수 있거나, 또는, 예를 들어 옥시다제 및 그것의 기질과 같은 과산화수소를 발생시키는 효소 시스템일수 있다. 유용한 옥시다제는 예를 들어 글루코스 옥시다제, 글리세롤 옥시다제 또는 아미노산 옥시다제일수 있다. 아미노산 옥시다제의 예는 WO 94/25574에 주어져있다.
생물학적으로 적당한 조건 하에서, 이러한 공급원은 비교적 낮은 농도의 과산화수소를 초래하므로, 효소적으로 발생되는 과산화수소를 사용하는 것이 바람직하다. 낮은 농도의 과산화수소는 할로퍼옥시다제-촉매 반응 속도의 증가를 초래한다.
본 발명에 따라, 할로퍼옥시다제와의 반응에 필요한 과산화수소 공급원은 0.01-1000mM 범위, 바람직하게는 0.1-500mM 범위의 과산화수소 농도에 상응하는 농도로 가해진다.
할로겐화물 공급원
본 발명에 따라, 할로퍼옥시다제와의 반응에 필요한 할로겐화물 공급원이 많은 상이한 방법에 의해, 예를 들어 할로겐화 염의 첨가에 의해 달성될수 있다: 그것은 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화나트륨, 브롬화칼륨, 요오드화나트륨, 또는 요오드와 칼륨일수 있다.
할로겐화물 공급원의 농도는 전형적으로 0.01-1000mM, 바람직하게는 0.1-500mM 범위에 상응할 것이다.
조성물
할로퍼옥시다제, 과산화수소 공급원, 할로겐화물 공급원을 포함하는 조성물은 고체 또는 액체, 특히 비-살포 과립, 또는 안정화된 액체의 형태로서 제조될수 있다.
고체로 제조되는 경우, 모든 조성물은 예를 들어, 분말, 과립 또는 겔화된 생성물로서 함께 혼합된다.
건조 형태 조성물 이외의 것이 사용는 경우 및 그러한 경우에서도, 다른 성분들로부터 분리된 과산화수소를 가지는 두 부분 제조 시스템을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 습윤제, 증점제, 완충제, 안정제, 향수, 착색제, 충전제 등과 같은 보조제를 더 포함할수 있다.
유용한 습윤제는 계면활성제, 즉 비이온성, 음이온성, 양쪽성 이온 또는 쯔위터이온성 계면활성제이다.
본 발명의 조성물은 농축 제품 또는 바로 사용할수 있는 제품일수 있다.
할로퍼옥시다제 활성
본 발명에 따라, 할로퍼옥시다제 활성은 WO 97/04102, p. 13 1. 7-19에 설명된 바와 같이 측정될수 있다.
본 발명은 청구항에 따르는 본 발명의 범위를 어떤 방법으로도 제한하지 않는 다음의 실시예들로 더 설명된다.
실시예 1
Curvularia verruculosa 할로퍼옥시다제 3D-구조의 상동체 빌딩
다른 서열, 예를 들어 Curvularia verruculosa에 Curvularia ineaqualis(CI)의 서열 상동체를 사용하여, CI-모양 3D-구조를 밝혔다.
Curvularia ineaqualis와 비교하여, 구조를 밝히기 위해 사용된 Curvularia verruculosa는 다수의 잔기가 상이하다. 모델은 Molecular Simulations Inc.로부터 INSIGHT 및 HOMOLOGY 프로그램을 사용하여 조립했다. 프로그램은 구조적으로 보존되는 영역(SCR)으로서 프로그램에 정의된 상동성 위치에서, Curvularia ineaqualis의 아미노산을 Curvularia verruculosa로부터의 아미노산으로 치환한다. 사이의 잔기를 GENERATE를 가지는 LOOP 옵션을 사용하여 조립했다. 이들 단계를 사용하여, 미정제 모델을 공간 상호작용 형태로 얻었다.
구조를 HOMOLOGY 패키지에 설명된 방법을 사용하여 정제했다.
실시예 2
할로퍼옥시다제 변이체의 구조
Curvularia verruculosa 할로퍼옥시다제 효소 상업용 키트의 변이체의 구조를 위하여, Chameleon 이중 나선, 특정 부위 돌연변이유발 키트를 제조자의 지시에 따라 사용했다.
당해 할로퍼옥시다제 효소를 코드화하는 유전자는 플라스미드 pElo29에 위치한다. 제조자의 지시에 따라, pElo29의 Ampicillin 유전자의 ScaI 부위를 프라이머 117996(SEQ ID No: 3)을 사용하여 Mlul 부위로 변화시켰다. 동시에 바람직한 돌연변이를 바람직한 돌연변이를 포함하는 적절한 프라이머의 첨가에 의해 할로퍼옥시다제 유전자에 도입했다.
플라스미드 pElo29의 구조
플라스미드 pElo29를 다음 단편으로부터 조립했다:
a) 벡터 pCiP(WO 93/34618에 설명된)로부터의 4.1 kb 단편을 BamHⅠ 및 BglⅡ를 가지도록 자른다.
b) 주형으로서 플라스미드 pAJ014-1(WO 97/04102)를 사용하여 Pwo 폴리머라제를 가지는 PCR에 의해 증폭된 Curvularia verruculosa 할로퍼옥시다제 유전자, 및 BamHⅠ 및 BglⅡ를 도입한 프라이머 프라이머 146063 및 146062(SEQ ID NO: 4 및 5)를 각각 할로퍼옥시다제 유전자의 5' 및 3'로 위치 지정한다.
다음에 단편 a 및 b를 결찰하고, 전체 할로퍼옥시다제 유전자를 바람직하지 않은 돌연변이가 PCR 증폭 동안 도입되지 않도록 서열화한다.
특정 부위 돌연변이유발
상기 설명된 바와 같은 특정 부위 돌연변이유발을 할로퍼옥시다제 효소의 변이체를 코드화하는 플라스미드 은닉 유전자를 구성하는데 사용했다. 다음의 프라이머가 사용되었다:
프라이머 147293(SEQ ID No: 6)를 D289L을 도입하기 위해 사용했다.
프라이머 147295(SEQ ID No: 7)를 D289E을 도입하기 위해 사용했다.
프라이머 139078(SEQ ID No: 8)를 R487E을 도입하기 위해 사용했다.
프라이머 139085(SEQ ID No: 9)를 V492S을 도입하기 위해 사용했다.
각 경우에 있어서, 돌연변이는 전체 유전자 서열화에 의해 증명된다. 결과의 플라스미드를 각각 pElo30, pElo31, pElo34 및 pElo37로 명명했다.
JaL228에 pElo30, pElo31, pElo34 및 pElo37의 형질전환
Aspergillus oryzae JaL 228(WO 97/27221)은 알칼리성 프로테아제 및 중성 메탈로프로테아제 Ⅰ에서 검출된 Aspergillus oryzae IFO 4177이다. 이 스트레인을 공동형질변화체로서 amdS 유전자를 가지는 플라스미드 pToC90(WO 91/17243)을 사용하여 pElo30, pElo31, pElo34 및 pElo37로 형질전환했다. 형질전환체의 선택을 특허 EP 0 531 372 B1에 설명된 바와 같은 아세트아미드를 사용하여 수행했다. 형질전환체는 두번 재단리된 포자였다. 각 형질전환체의 두번째 재단리로부터의 포자를 소규모 발효(진동 플라스크 및 마이크로타이터디쉬)으로 할로퍼옥시다제 생성에 대해 시험했다.
Aspergillus oryzae의 Curvularia verruculosa 할로퍼옥시다제 변이체의 발효
상기로부터의 단리를 리터 당 수크로스 12g, 50% 이스트 추출물 20g, MgSO4*7H2O 2g, DH2PO4 2g, K2SO4 3g, 시트르산 4g, 플루로닉 1㎖, V2O5 182mg, 및 미량 금속 용액☆0.5㎖로 이루어진 탱크 배지에서 발효하고, 80% 말토스 용액 250g, 50% 이스트 추출물 20g, 시트르산 5g, 플루로닉 5㎖, V2O5 182mg, 및 리터 당 미량 금속 용액 0.5㎖로 이루어진 배지로 발효하는 동안 공급했다. 발효 육즙을 34℃, pH 6.0 이상에서 5 일 발효 후 수득했다.
☆미랑 금속 용액: 리터 당 ZnSO4*7H2O 14.3g, CuSO4*5H2O 2.5g, NiCl2*6H2O 0.5g, FeSO4*7H2O 13.8g, MnSO4*H2O 8.5g, 및 시트르산 3.0g.
서열 목록
SEQ ID NO 3: 프라이머 117996; 변화된 뉴클레오티드를 밑줄로 표시했다. ScaI 부위의 제거 및 pElo29의 MluⅠ부위의 도입을 가져온다.
SEQ ID NO 4: 프라이머 146063; Curvularea verruculosa 할로퍼옥시다제 유전자의 증폭을 위한 PCR 프라이머. 밑줄친 뉴클레오티드는 BamHⅠ 부위를 도입한다.
SEQ ID NO 5: 프라이머 146062; Curvularea verruculosa 할로퍼옥시다제 유전자의 증폭을 위한 PCR 프라이머. 밑줄친 뉴클레오티드는 BamHⅡ 부위를 도입한다.
SEQ ID NO 6: 프라이머 147293; 밑줄친 뉴클레오티드는 당해 할로퍼옥시다제 효소에 D289L 돌연변이를 도입한다.
SEQ ID NO 7: 프라이머 147295; 밑줄친 뉴클레오티드는 당해 할로퍼옥시다제 효소에 D289E 돌연변이를 도입한다.
SEQ ID NO 8: 프라이머 139078; 밑줄친 뉴클레오티드는 당해 할로퍼옥시다제 효소에 R487E 돌연변이를 도입한다.
SEQ ID NO 9: 프라이머 139085; 밑줄친 뉴클레오티드는 당해 할로퍼옥시다제 효소에 V492S 돌연변이를 도입한다.
실시예 3
여러가지 할로퍼옥시다제 변이체의 pH-곡선
할로퍼옥시다제 변이체(Curvularia verruculosa로부터 유도된)를 실시예 2에 설명된 바와 같이 만들었다.
실험:
pH-프로필 측정을 위한 페놀 레드 검정:
96 웰 마이크로타이터 플레이트에서:
60mM Britton-Robinson, pH 4-8.5 완충액 중의 0.008% 페놀 레드 100㎕. 이 용액에 0.5M KBr 40㎕ 및 1mM ortho-바나데이트를 함유하는 희석 요소 용액 50㎕를 가했다. 반응을 0.3% 과산화수소 10㎕을 첨가함으로서 시작했고, 동력학을 595nm에서 5분에 걸쳐 측정했다.
결과:
활성이 각 효소에 대한 최고 값에 비례하여 얻어졌다:
표로부터 야생형이 pH 7.0에서 pH 최적치를; 변이체 D289E 및 R487E 및 V492S가 6.0에서 pH 최적치를; 그리고 변이체 D289L이 pH 7.5에서 pH 최적치를 가짐을 알수있다
실시예 4
정제된 할로퍼옥시다제 변이체(V492S)의 pH-곡선
상기 설명된 할로퍼옥시다제 변이체(V492S) 및 Curvularia verruculosa 야생형을 정제하고 시카고 스카이 블루로 시험했다.
할로퍼옥시다제의 정제:
할로퍼옥시다제 활성을 함유하는 발효 육즙을 필트론(10 kDa 컷어프)으로 농축하기 전에 GF/F(Whatmann) 및 0.22 μm(GS, Millipore)로 여과했다. pH를 pH 7.5로 조절하고 샘플을 50mM 트리스-HCl, pH 7.5로 평형화한 Q-세파로스 칼럼(파마시아)에 로딩했다. 할로퍼옥시다제를 50 mM 트리스-HCl, pH 7.5 중에서 NaCl의 0-1M 선형 구배로 용출했다. 단편을 함유하는 할로퍼옥시다제를 아미콘 셀(YM10 멤브레인)로 농축하고 50mM 트리스-HCl, pH 8.5으로 평형화한 모노Q-칼럼(파마시아)에 로딩하고, 50 mM 트리스-HCl 중에서 NaCl의 0-1M의 선형 구배로 용출했다. 단편을 함유하는 할로퍼옥시다제를 모으고, 50mM 나트륨 아세테이트, 0.1M NaCl, pH 5.5로 평형화된 Superdex75 칼럼 16/60(파마시아)에서 더 정제했다.
실험:
96 웰 마이크로타이터 플레이트:
60mM Britton-Robinson, pH 4-8 100㎕ + 효소 용액 50㎕ + 0.4M NaCl 25㎕ + OD610=5로 물에 희석된 시카고 스카이 블루 25㎕. 반응을 2mM 과산화수소 10㎕을 첨가함으로서 시작했다. 활성이 595nm에서 흡광도의 선형 감소로서 얻어졌다.
결론:
V492S는 wt 효소와 비교하여 낮은 pH 범위에서 증가된 활성을 명백하게 나타낸다.

Claims (22)

  1. 모 바나듐-함유 할로퍼옥시다제의 변이체로서, 변이체가 할로퍼옥시다제 활성 및 변화된 pH 최적치를 가지고 다음의 위치 중 최소한 하나에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하며, 모 할로퍼옥시다제는 SEQ ID No. 1의 아미노산 서열을 가지거나, 또는 모 할로퍼옥시다제는 SEQ ID No. 1에 최소한 80% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 모 바나듐-함유 할로퍼옥시다제의 변이체.
  2. 제 1 항에 있어서, 변이체가 다음의 위치 중 최소한 하나에서 돌연변이를 포함하며, 모 할로퍼옥시다제는 SEQ ID No. 2의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 모 바나듐-함유 할로퍼옥시다제의 변이체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 모 할로퍼옥시다제가 Curvularia로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 변이체.
  4. 제 1 항에 있어서, 모 할로퍼옥시다제가 Curvularia inaequalis로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 변이체.
  5. 제 2 항에 있어서, 모 할로퍼옥시다제가 Curvularia verruculosa로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 변이체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따르는 할로퍼옥시다제 변이체를 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 구조물.
  7. 제 6 항에 따르는 DNA 구조물을 가지는 재조합 발현 벡터.
  8. 제 6 항에 따르는 DNA 구조물 또는 제 7 항에 따르는 벡터로 형질전환된 세포.
  9. 제 8 항에 있어서, 미생물인 것을 특징으로 하는 세포.
  10. 제 9 항에 있어서, 박테리아 또는 진균인 것을 특징으로 하는 세포.
  11. 제 10 항에 있어서, Aspergillus niger 또는 Aspergillus oryzae 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  12. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항을 따르는 할로퍼옥시다제 변이체의 표백용 용도.
  13. 제 12 항에 있어서, 얼룩 표백용인 것을 특징으로 하는 용도.
  14. 제 12 항에 있어서, 면직물 표백용인 것을 특징으로 하는 용도.
  15. 제 12 항에 있어서, 염료 표백용인 것을 특징으로 하는 용도.
  16. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따르는 할로퍼옥시다제 변이체의 미생물 제여용 용도.
  17. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따르는 할로퍼옥시다제 변이체의 경질 표면 클리닝용 용도.
  18. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따르는 할로퍼옥시다제 변이체를 비-살포 과립, 안정화된 액체 또는 보호된 효소의 형태로 포함하는 것을 특징으로 하는 세제 첨가제.
  19. 제 18 항에 있어서, 프로테아제, 리파제, 아밀라제, 및/또는 셀룰라제와 같은 하나 이상의 다른 효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세제 첨가제.
  20. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따르는 할로퍼옥시다제 변이체 및 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 세제 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 프로테아제, 리파제, 아밀라제 및/또는 셀룰라제와 같은 하나 이상의 다른 효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세제 조성물.
  22. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따르는 할로퍼옥시다제 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 페인트.
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