KR20010036568A - Transgenic animals and production thereof by the testis-mediated gene transfer - Google Patents

Abstract

PURPOSE: Provided is a method for producing the transformed animals by inserting the transgene into a testicle, thereby the insertion and expression of the transgene can be faithfully reproduced. CONSTITUTION: The method for producing the transformed animals comprises the steps of: preparing the desired transgene construct consisting of the human growth hormone(hGH) gene, the hGH receptor gene, and the rat mOB gene; preparing the liposome/DNA complex by mixing the desired transgene construct with a liposome solution; inserting the liposome/DNA complex into the testicle of a Korean male sheep; harvesting the sperm of the Korean sheep inserted by the liposome/DNA complex; fertilizing a sexual excited Korean female sheep with the harvested sperm; and producing the transformed Korean sheep.

Description

정소실질을 이용한 형질전환동물 및 그 제조 방법{Transgenic animals and production thereof by the testis-mediated gene transfer}Transgenic animals and production method by testicular parenchyma and method for producing same

본 발명은 형질전환동물의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 정소실질에 리포좀/외인성 유전자 DNA 복합체를 도입하여 정자에 형질전환을 일으키고 상기 형질전환된 정자를 채취하고, 난자에 수정시켜 형질전환 동물을 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a transgenic animal. More specifically, the present invention relates to a method for producing a transgenic animal by introducing a liposome / exogenous gene DNA complex into the testis parenchyma, causing transformation of sperm, harvesting the transformed sperm, and fertilizing the egg.

형질전환동물 생산을 위한 방법의 하나로 정자를 매개로 한 유전자 전이법의 이용 가능성이 다수의 연구자에 의하여 보고 되었다(Lavitrano, M., et al.: Cell 57, 717-723(1989); Lavitrano, M., et al.: Transplant Proc. 29, 3508-3509 (1997); Bachiller, D., et al.: Mol. Reprod. Develop.,30, 194-200(1991); Sato, M., et al.:Anim. Biotech., 5, 19-31(1994)). 이러한 방법은 외래 유전자 도입을 위한 ″정자벡터(sperm vector)″로써 잘 알려져 있지만 재현성에는 많은 문제점이 제기되었다(Brinster, R. L., et al.: Cell, 59, 239-241(1989)). 한편, 바칠라 등(Bachiller, D., et al.: Mol. Reprod. Develop.,30, 194-200(1991))은 지질인 리포좀(liposome)과 외래유전자 복합체를 정소상체 미부에서 회수한 정자와 체외에서 공배양할 경우 비록 외래 유전자가 정자두부에는 결합이 가능하나 이들 정자를 이용하여 형질전환 개체생산에는 성공하지 못하였다고 보고하였다. 그러나, 오가와 등(Ogawa, S., et al.: J. Reprod. Develop., 41, 379-382(1995))은 목적하는 외래 유전자를 리포좀과 시험관내에서 배양하여 리포좀/DNA 복합체 형태로 정소실질내에 직접 주입하는 것이 형질전환효율이 높았으며, 생쥐 정소실질내에 4일 간격으로 이러한 방법으로 리포좀/DNA 복합체(MT promoter/β-galactosidase gene)를 3회 주입한 후 성성숙에 도달한 정상적인 암컷과 교배시켜 자성생식기로부터 회수한 배반포에서는 대부분(50-70%)이 β-갈락토시다제(β-galactosidase) 염색반응이 나타났다고 보고하였다. 그러나, 자성생식기로부터 회수한 배반포에 대하여 서던 블로팅 및 도트 블로팅(dot blotting)을 실시하지 않아 발현된 외래 유전자가 삽입된 유전자에 기인한 발현인지 또는 에피토픽(epitopic) 발현에 의한 것인지는 규명하지 못하였다.The availability of sperm-mediated gene transfer as one of the methods for the production of transgenic animals has been reported by many researchers (Lavitrano, M., et al .: Cell 57, 717-723 (1989); Lavitrano, M., et al .: Transplant Proc. 29, 3508-3509 (1997); Bachiller, D., et al .: Mol. Reprod. Develop., 30, 194-200 (1991); Sato, M., et al .: Anim. Biotech., 5, 19-31 (1994)). This method is well known as a "sperm vector" for the introduction of foreign genes, but many problems have been raised in reproducibility (Brinster, R. L., et al .: Cell, 59, 239-241 (1989)). On the other hand, Bachiller et al. (Bachiller, D., et al .: Mol. Reprod. Develop., 30, 194-200 (1991)) have reported that liposomes and foreign gene complexes, which are lipids, have been recovered from the tail of the testis. Although co-cultivation in vitro and in vitro, although foreign genes can bind to sperm heads, they have not been successful in producing transgenic individuals using these sperm. However, Ogawa et al. (Ogawa, S., et al .: J. Reprod. Develop., 41, 379-382 (1995)) testified in liposome / DNA complexes by incubating the desired foreign genes in vitro with liposomes. Injecting directly into the parenchyma had high transfection efficiency, and after injection of the liposome / DNA complex (MT promoter / β-galactosidase gene) three times at 4 days intervals into the mouse testis parenchyma, Most of the blastocysts harvested from the female genitalia (50-70%) reported β-galactosidase staining. However, whether blastocysts recovered from the female genitalia are not subjected to Southern blotting and dot blotting, and the expressed foreign genes are expressed by inserted genes or by epitopic expression. I couldn't.

본 발명자들은 외인성 유전자를 리포좀-DNA 복합체 형태로써 정소실질내에 직접 주입하는 방식으로 형질전환 동물을 제조할 수 있었다. 본 발명에 의한 형질전환동물 제조 방법은 형질전환동물 생산을 위한 벡터로써 정자를 이용한 점에서는 기존의 방법과 거의 유사하나 공지의 방법처럼 시험관내에서 정자와 외래 유전자를 융합시킨후 체내에서 수정란에 도입시키는 방식이 아니라, 외래 유전자를 정소실질내 주입함으로써 정자를 통한 유전자 전이 방식으로 원하는 유전자가 도입된 형질전환 동물을 제조한다는 점에서 차이가 있다.We were able to prepare transgenic animals by injecting exogenous genes directly into the testicular parenchyma in the form of liposome-DNA complexes. The method for producing a transgenic animal according to the present invention is similar to the conventional method in that sperm is used as a vector for producing a transgenic animal, but is introduced into a fertilized egg in the body after fusion of a sperm and a foreign gene in vitro as in a known method. The difference is that the transgenic animals are introduced into the testicular parenchyma, rather than by the method of making them into a transgenic animal in which the desired gene is introduced by the gene transfer method through sperm.

따라서, 본 발명의 목적은 정소실질내 유전자 도입법을 통한 형질전환동물 제조 방법을 제공하는 것이다.Therefore, an object of the present invention is to provide a method for producing a transgenic animal through the introduction of gene in the testis parenchyma.

이하, 본 발명의 구성 및 작용효과를 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the configuration and effect of the present invention will be described in detail.

도 1은 흰쥐 및 생쥐의 정소실질내에 주입할 유전자 구성체를 나타내는 그림이고,1 is a diagram showing the gene construct to be injected into the testis parenchyma of rats and mice,

도 2는 산자에서의 hGHR 검출결과를 나타내는 그림으로, (a)는 F1 세대에서의 hGHR 유전자에 대한 서던 블로트 분석결과, (b)는 F3 세대 8마리중의 hGHR 유전자에 대한 서던 블로트 분석결과, (c)는 형질전환 흰쥐 산자(F3 세대, 3-10 레인) 및 비형질전환 흰쥐 산자(F3 세대, 11-12 레인)에서의 hGHR 노던 분석결과, 레인 1은 마커, 레인 2는 블랭크를 나타내는 그림이고,2 is a diagram showing the results of detection of hGHR in the living quarters, (a) Southern blot analysis of the hGHR gene in the F1 generation, (b) Southern blot analysis of the hGHR gene in eight F3 generations Results (c) shows hGHR Northern analysis of transgenic rats (F3 generation, lanes 3-10) and non-transgenic rats (F3 generation, lanes 11-12). Lane 1 is a marker and lane 2 is blank. Is a picture showing

도 3은 서던 블로트 분석에 의한 F0 세대에서의 mOB 유전자의 검출결과를 나타내는 그림이고,3 is a diagram showing the detection result of the mOB gene in the F0 generation by Southern blot analysis,

도 4는 산자에서의 hGH 유전자의 검출결과를 나타낸 그림이고,4 is a diagram showing the detection result of the hGH gene in the litter,

도 5은 한국 재래산양에 도입한 mWAP 프로모터 및 사람 성장호르몬(hGH)가 재조합된 외인성 DNA 구성체를 나타내는 그림이고,5 is a diagram showing an exogenous DNA construct in which mWAP promoter and human growth hormone (hGH) introduced into Korean native goats are recombined.

도 6는 리포좀/외인성 DNA 복합체가 정소실질에 도입된 한국 재래산양으로부터 분리한 정자의 PCR/서던 분석결과를 나타내는 그림이고,Figure 6 is a diagram showing the results of PCR / Southern analysis of sperm isolated from Korean native goats liposome / exogenous DNA complex introduced into the testis parenchyma,

도 7은 리포좀/외인성 DNA 복합체를 정소실질에 도입한 결과 유전자 전이가 일어난 정자를 채취하여 발정유도된 한국 재래산양에 수정시킨 결과로 탄생한 산자(3주령)의 PCR 분석결과를 나타낸 그림이다.Figure 7 shows the results of PCR analysis of the litter (3 weeks old) born as a result of introducing liposomes / exogenous DNA complexes into the testis parenchyma and extracting sperm from which gene transfer has occurred and fertilizing them in estrus-induced Korean native goats.

본 발명자들은 외래 유전자를 피로좀 벡터를 이용하여 포유동물의 정소실질내에 주입하여 형질전환 동물을 제조하였다. 본 발명의 구성은 도입하고자 하는 목적 유전자(DNA) 구성체를 제조하는 단계; 상기 제조한 유전자 DNA 구성체를 리포좀에 포괄하여 리포좀/외인성 DNA 복합체를 제조하는 단계; 상기 리포좀/외인성 DNA 복합체를 포유동물 정소실질내에 도입하는 단계; 상기 리포좀/외인성 DNA 복합체가 도입된 포유동물로부터 일정기간이 지난 후에 정자를 채취하는 단계; 상기 채취된 정자를 발정하거나 발정유기된 포유동물에 수정시키는 단계; 상기 수정에 의해 임신된 포유동물로부터 산자를 생산하는 단계들로 이루어진다.The present inventors prepared a transgenic animal by injecting a foreign gene into the testis parenchyma of a mammal using a pyrosome vector. The composition of the present invention comprises the steps of preparing a target gene (DNA) construct to be introduced; Preparing the liposome / exogenous DNA complex by enclosing the prepared gene DNA construct into liposomes; Introducing the liposome / exogenous DNA complex into mammalian testicular parenchyma; Collecting sperm after a certain period of time from the mammal into which the liposome / exogenous DNA complex is introduced; Estrus or fertilizing the collected sperm in an estrous organic mammal; Producing fertility from mammals pregnant by the fertilization.

본 발명의 한 구체예에 있어서, 본 발명자들은 사람 성장호르몬(hGH), hGH 수용체 및 마우스 렙틴(mOB)으로 형질전환된 생쥐를 제조하였다.In one embodiment of the invention, we produced mice transformed with human growth hormone (hGH), hGH receptor and mouse leptin (mOB).

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 본 발명자들은 사람 성장호르몬 유전자 (hGH)이 도입된 형질전환 한국 재래산양을 제조하였다. 상기 hGH에 mWAP 프로모터를 재조합한 도입 유전자 구성체를 발현벡터에 삽입하여 대장균에서 클로닝하고 분리 정제한 후 리포좀/DNA 복합체를 한쪽 정소를 거세한 2두의 재래산양의 정소실질 및 정소상체 미부에 각각 150μl씩 주입하였다. 이들 개체에 유전자를 도입한 후 5, 10, 20, 40, 60 및 80일째에 정액을 채취하여 PCR 및 서던 블로팅을 실시한 결과 약 659bp의 단편을 확인할 수 있었다. 상기 채취한 정액에서 외래 유전자가 가장 강력하게 검출된 것은 유전자 도입후 40일째의 정액이었다. 상기 결과로부터 본 발명자들은 형질전환 재래산양을 제조하기 위하여 유전자 도입후 30-50일, 바람직하게는 40일째의 정자를 인공수정에 공시하였다.In another embodiment of the present invention, the present inventors produced transgenic Korean native goats into which the human growth hormone gene (hGH) was introduced. Insert the gene construct recombinant the mWAP promoter in the hGH into the expression vector was cloned and purified in Escherichia coli, and then the liposome / DNA complex was 150 μl each in two testes of testis parenchyma and epididymal tail of two native goats, each of which was castrated. Injected. Semen was collected at 5, 10, 20, 40, 60 and 80 days after introducing the gene into these individuals, and PCR and Southern blotting were performed. As a result, a fragment of about 659 bp was confirmed. The most strongly detected foreign gene was semen at 40 days after transduction. From the above results, the present inventors have disclosed sperm 30-50 days, preferably 40 days after the introduction of the sperm in artificial insemination to produce a transgenic native goat.

본 발명자들은 재래산양의 발정을 유기하기 위하여 PGF_2α3mg(0.2mg/kg/BW)을 근육투여하였으며, 그 결과 1차 투여후 총 24두중 16두(66.6%)가 발정을 나타내었으며 발정이 유기되지 않은 개체는 1차 투여로부터 8일 후 동량의 PGF2α를 재투여함으로써 7두의 재래산양에서 발정이 유도되어 전체 평균 약 96% 발정유기율을 보였다. 이들 산양에 리포좀/외인성 유전자 DNA를 정소실질에 도입한 후 40일째 채취한 정액을 이용하여 인공수정에 공시한 결과 총 4두가 임신하여 7마리(암컷 3, 수컷 5)를 분만하였다.The present inventors intramuscularly administered 3 mg (0.2 mg / kg / BW) of PGF _2α to induce estrus of native goats. As a result, 16 out of 24 heads (66.6%) exhibited estrus after the first administration. The unestablished individuals were reestablished with the same amount of PGF2α after 8 days from the first administration, and estrus were induced in 7 conventional goats with an average of about 96%. After the introduction of liposome / exogenous gene DNA into the testis parenchyma on the goats, the semen collected on day 40 was used for artificial insemination. As a result, four heads were pregnant and seven (3 females and 5 males) were delivered.

형질전환동물의 검정을 위하여 생후 3주령 산자의 경정액으로부터 혈액을 채취하여, 이들 혈액으로부터 고분자 DNA를 분리한 후, PCR을 실시한 결과 2두(암컷 및 수컷)의 자양에서 약 659bp의 유전자가 검출되었으며, 상기와 같은 결과는 서던 블로팅에서도 동일하였다.For assaying transgenic animals, blood was collected from the saline solution of three-week-old babies, polymer DNA was isolated from these blood, and PCR was performed to detect approximately 659 bp of genes in two (female and male) nutrients. And the same result was the same in Southern blotting.

본 발명에서 형질전환동물을 제조하기 위하여 도입되는 유전자는 발명의 목적에 따라 원하는 어떠한 유전자 유전자도, 예컨대 인터페론 유전자, 인슐린 유전자, EPO 유전자 등도 적절한 프로모터와 함께 본 발명의 기술적 요지 및 범위내에서 이용 가능하며, 이로부터 원하는 형질의 형질전환동물을 제조할 수 있다.Genes introduced for the production of transgenic animals in the present invention can be any gene gene desired according to the purpose of the invention, such as interferon gene, insulin gene, EPO gene, etc. can be used within the technical scope and scope of the present invention with a suitable promoter From this, a transgenic animal of desired character can be prepared.

상기의 유전자 조작 등과 관련된 실험방법은 문헌(Sambrook, J. et al.: Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York., 1989; Ausubel, F. et al.: Short Protocols in Molecular Biology. 3rd. John ＆ Wiley Sons, Inc., 1995)에 기술된 공지 방법을 따랐다.Experimental methods related to such genetic manipulations are described in Sambrook, J. et al .: Molecular Cloning.A laboratory Manual.2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory.Cold Spring Harbor.New York., 1989; Ausubel, F. et. al .: Short Protocols in Molecular Biology.3rd.John & Wiley Sons, Inc., 1995).

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 에시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and do not limit the scope of the present invention.

실시예 1 : 형질전환 흰쥐의 제조Example 1 Preparation of Transgenic Rats

실험예 1 : 외래 유전자 구성체(transgene construct)의 제조Experimental Example 1 Preparation of a Foreign Gene Construct

도 1과 같은 정소실질내에 도입할 유전자 구성체(인간 성장호르몬(hGH), hGH 수용체(hGHR) 및 생쥐 렙틴(mOB) 유전자를 각각 유장 산성 단백질(WAP) 프로모터, 메탈로티오네인-I(MT) 프로모터 및 생쥐 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터와 융합시켜 제조) 제작하였다.Gene constructs (human growth hormone (hGH), hGH receptor (hGHR), and mouse leptin (mOB) genes to be introduced into the testis parenchyma as shown in FIG. 1, respectively, are whey acidic protein (WAP) promoter and metallothionein-I (MT)). Promoter and mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter.

(1) hGHR : 클론테크(Clonetech Lab., Inc., CA, USA, Lot:46018)로부터 사람 간 폴리(A)+ RNA를 구입하여 이중 5μl를 몰로니 뮤린 류케미아 바이러스(MMLV)역전사효소로 역전사하고 사람 간 cDNA 라이브러리를 제조하는데 사용하였다. hGHR cDNA를 스크링하기위한 합성 cDNA 프로브는 RT-PCR을 통해 사람 간 폴리(A)+ RNA를 주형으로 사용하여 제조하였다. 포워드 프라이머는 5'-GATCAGAGGCGAAGCTCGGA-3'(-30 부터 -11 부위, 20 bp)이고 리버스 프라이머는 5'-TGGGGGCAGAATCAGCATTT-3'(943 부터 924 부위, 20bp) 이었다. PCR은 퍼킨-엘머 세투스 DNA 써멀 싸이클러 (Perkin-Elmer Cetus Instrument)을 사용하여 94℃ 1분, 65℃ 1분 및 72℃ 1.5분, 마지막 신장은 72℃ 10분에서 수행하였다. 전기영동시 약 950bp에서 밴드를 형성하는 각 PCR 산물를 수득하였다. 라이브러리의 대략 2.5X10⁶플라크를 플레이팅하고 나일론 필터(Hybond-N+, Amersham)에 전이시켰다. 스크리닝한 결과 양성반응을 보이는 6개의 클론을 수득하고, 이들 클론에 삽입된 cDNA를 BamHI로 절단된 pUC18에 시퀀싱을 위하여 서브클로닝하였다. 시퀀싱은 오토-리드 시퀀싱 키트 및 A.L.F. DNA 시퀀서(Pharmacia Biotech)를 사용하여 다이데옥시 방법으로 수행하였다. 모든 제한효소자리가 겹치도록 두 가닥에 대해 다 서열을 결정하였다. DNASIS-MAC V2.0 컴퓨터 소프트웨어(Hitachi)를 사용하여 서열분석을 실시하였다. hGHR cDNA를 포함하는 2.1 kbp NheI-XhoI 절편을 MT-I 프로모터를 포함한 pTB ㅠㅡㄹ라스미드(ATCC 77386)에 삽입하였다. 정소실질내에 주입하기 위하여 MT/hGHR 융합 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드의 5.0 kbp NotI-BamHI 절편을 제조하였다(도 1(a)). 상기 구성체의 NheI-EcoRI 및 Xho-I 절편은 서던 및 노던 블로팅 분석을 위하여 사용되었다.(1) hGHR: Human human poly (A) + RNA was purchased from Clonetech Lab., Inc., CA, USA, Lot: 46018. Reverse transcription was used to prepare the human liver cDNA library. Synthetic cDNA probes for screening hGHR cDNA were prepared using human liver poly (A) + RNA as a template via RT-PCR. The forward primer was 5'-GATCAGAGGCGAAGCTCGGA-3 '(-30 to -11 sites, 20 bp) and the reverse primer was 5'-TGGGGGCAGAATCAGCATTT-3' (943 to 924 sites, 20 bp). PCR was performed at 94 ° C. for 1 minute, 65 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1.5 minutes, and the last elongation at 72 ° C. for 10 minutes using a Perkin-Elmer Cetus Instrument. Electrophoresis yielded each PCR product forming a band at about 950 bp. Approximately 2.5 × 10 ⁶ plaques of the library were plated and transferred to nylon filters (Hybond-N +, Amersham). Screening yielded six clones that showed positive reaction, and the cDNA inserted into these clones was subcloned for sequencing on pUC18 digested with BamHI. Sequencing was performed by the dideoxy method using an auto-read sequencing kit and an ALF DNA sequencer (Pharmacia Biotech). Sequences were determined for both strands so that all restriction sites overlap. Sequencing was performed using DNASIS-MAC V2.0 computer software (Hitachi). A 2.1 kbp NheI-XhoI fragment containing hGHR cDNA was inserted into pTB O. lasmid (ATCC 77386) containing the MT-I promoter. A 5.0 kbp NotI-BamHI fragment of a recombinant plasmid containing the MT / hGHR fusion gene was prepared for injection into testicular parenchyma (FIG. 1 (a)). NheI-EcoRI and Xho-I fragments of the constructs were used for Southern and Northern blotting analysis.

(2) mOB : 생쥐 간 지방조직으로부터 추출한 폴리(A)+ RNA를 사용하여 RT-PCR에 의해 생쥐 ob 유전자를 제조하였다. 포워드 프라이머는 5'-GAGGAAAATGTGCTGGAGA-3'(111부터 130 부위, 20bp)이고 리버스 프라이머는 5'-TGGTGGCCTTTGAAACTTCA-3'(636 부터 617 부위, 20bp)이었다. 535bp의 PCR 산물 서열을 결정하고 MMTV 프로모터를 포함하는 SKCMGS 벡터에 삽입하였다. MMTV-mOB 융합 유전자를 포함하는 상기 구성체의 약 3.2kbp SacII-NheI 절편을 정소실질내에 주입하는데 사용하였다(도 1(b)).(2) mOB: Mouse ob gene was prepared by RT-PCR using poly (A) + RNA extracted from mouse liver adipose tissue. The forward primer was 5'-GAGGAAAATGTGCTGGAGA-3 '(111 to 130 sites, 20 bp) and the reverse primer was 5'-TGGTGGCCTTTGAAACTTCA-3' (636 to 617 sites, 20 bp). The PCR product sequence of 535 bp was determined and inserted into the SKCMGS vector containing the MMTV promoter. About 3.2 kbp SacII-NheI fragments of the construct containing the MMTV-mOB fusion gene were used to inject into the testis parenchyma (FIG. 1 (b)).

(3) hGH : 7.2kb 게놈 생쥐 유장 산성 단백질(mWAP)를 포함하는 ㅔWAPE7.2neo로부터 KpnI 및 EcoRI으로 절단하여 4.6kb의 구조 유전자 서열을 제거하였다. 그 다음, KpnI 부위는 벡터 서열을 포함하는 EcoRI/BamHI 벡터 절편 및 mWAP의 5' 플랭킹 영역을 이끄는 BamHI 링커를 첨가하여 BamHI 부위로 전환시켰다. hGH 유전자의 암호화 영역을 pMT의 BamHI 부위에 삽입하고 pBR327/5'WAP 플라스미드의 BamHI 부위에 삽입하였으며 이로부터 mWAP의 단백질 암호화 영역을 제거하였다[도 1(c)]. 도 1(c) 구성체의 PvuII/PvuII 절편은 프로브로 사용하였다.(3) hGH: 7.2 kb Genomic Mouse Whey acidic protein (mWAP) containing ㅔ WAPE7.2neo containing the cleavage of KpnI and EcoRI to remove the structural gene sequence of 4.6kb. The KpnI site was then converted to a BamHI site by addition of an EcoRI / BamHI vector segment containing the vector sequence and a BamHI linker leading to the 5 'flanking region of the mWAP. The coding region of the hGH gene was inserted into the BamHI site of pMT and into the BamHI site of the pBR327 / 5'WAP plasmid from which the protein coding region of mWAP was removed (FIG. 1 (c)). PvuII / PvuII fragments of the construct of FIG. 1 (c) were used as probes.

실험예 2 : 정소실질내 도입될 리포좀/DNA 복합체의 제조Experimental Example 2 Preparation of Liposomal / DNA Complex to be Introduced into Testicular Parenchyma

상기 과정에 의해 제조한 MT/hGHR 또는 MMTV/mOB(각 25μg) 유전자 DNA 구성체가 포함된 인산완충 용액(PBS) 5μl를 양이온성(cationic) 리포좀 용액 (LIPOFECTIN Reagent, GIBCO-BRL; 200μl)에 혼합하고 상온에서 1시간 방치하여 리포좀/DNA 복합체를 형성하였다.5 μl of a phosphate buffer solution (PBS) containing MT / hGHR or MMTV / mOB (25 μg each) gene DNA construct prepared by the above process is mixed with a cationic liposome solution (LIPOFECTIN Reagent, GIBCO-BRL; 200 μl) And left at room temperature for 1 hour to form a liposome / DNA complex.

실험예 3 : 리포좀/DNA 복합체의 정소실질내 주입Experimental Example 3 Intravitreal Injection of Liposomal / DNA Complex

상시 리포좀/DNA 복합체를 에테르 마취하에서 스크로툼(scrotum)을 통해 12주령의 수컷 흰쥐(rat)의 두 정소실질(testis)에 각각 100μl씩 주입하였다. 주입은 30G 바늘을 가진 멸균된 해밀톤 마이크로시린지(Hamilton microsyringe)를 사용하였다. WAP/hGH 유전자를 5μl의 PBS에 5μl에 용해시킨 후 리포좀 용액 20μl와 혼합하여 리포좀/DNA 복합체를 제조한 후 상기 리포좀/DNA 복합체를 에테르 마취하에서 스크로툼를 통해 8주령의 생쥐(mouse)의 두 정소실질에 각 10μl씩 주입하였다. 상기 주입 후 4일(흰쥐) 또는 3일(생쥐) 후에 각 수컷을 같은 종의 발정유도된 암컷과 교미시켰다.Normal liposome / DNA complexes were injected 100 μl each into two testis of 12 week old male rats through scrotum under ether anesthesia. Injection was performed using sterile Hamilton microsyringe with 30G needles. After dissolving the WAP / hGH gene in 5 μl of 5 μl PBS and mixing with 20 μl of liposome solution to prepare liposome / DNA complex, the liposome / DNA complex was subjected to strotum under ether anesthesia for two 8-week-old mice. 10 μl each was injected into the testis parenchyma. Four days after the injection (male) or three days (mouse) each male was mated with a estrus induced female of the same species.

실험예 4 : 산자의 형질전환여부 확인Experimental Example 4: Confirmation of transformation of living

산자의 형질전환 여부를 확인하기 위하여 도 1의 나타낸 프로브를 사용하여 서번 블로팅 분석을 수행하였다. 4-5주령 산자의 꼬리로부터 DNA를 추출하였다. MT/hGHR 분석을 위하여, 추출한 DNA를 EcoRI 또는 HindIII로 절단하였다. MMTV/mOB 및 WAP/hGH 유전자를 검출하기 위하여 DNA를 각각 SalI/BamHI 및 EcoRI으로 절단하였다. 하이브리다이제이션은 [α-³²P]dCTP로 라벨링한 프로브(1∼2X10⁶cpm/ml)로 하이브리다이제이션 믹스(5X SSC, 100mg/ml의 연어 정자(salmon sperm) DNA, 2.5X 덴하르트 시약(Denhardt's reagent), 5mM EDTA, 0.1% SDS, 10% 덱스트란 설페이트)에서 42℃, 하룻밤 수행하고 0.2X SSC/0.1% SDS로 세척 후 필터를 X-선 필름에 노출시켰다.In order to confirm the transformation of the litter, sequential blotting analysis was performed using the probe shown in FIG. 1. DNA was extracted from the tails of 4-5 week-old litters. For MT / hGHR analysis, the extracted DNA was digested with EcoRI or HindIII. DNA was digested with SalI / BamHI and EcoRI, respectively, to detect MMTV / mOB and WAP / hGH genes. Hybridization is a probe labeled with [α- ³² P] dCTP (1-2 × 10 ⁶ cpm / ml) and hybridization mix (5X SSC, 100 mg / ml of salmon sperm DNA, 2.5 × Denhardt's reagent). (Denhardt's reagent), 5 mM EDTA, 0.1% SDS, 10% dextran sulfate) and overnight at 42 ° C. and washed with 0.2 × SSC / 0.1% SDS to expose the filter to X-ray film.

노던 블로팅 분석을 통해 흰쥐에서의 hGHR 또는 mOB 유전자 및 생쥐에서의 hGH 유전자를 확인하였다. 전 RNA는 구아니딘 이소티오시아네이트에서 조직을 균질화(homogenization)시킨 후 염화세슘에서 원심분리함으로써 준비하였다. 상기 과정에 의해 준비한 50μl의 RNA를 65℃에서 변성시키고 1% 아가로스 MOPS-포름알데히드 젤에서 전기영동한 후 니트로셀룰로스 필터에 이동시켰다. 하이브리다이제이션 방법은 상기 설명한 바와 같다.Northern blotting analysis confirmed the hGHR or mOB gene in rats and the hGH gene in mice. Whole RNA was prepared by homogenizing the tissue in guanidine isothiocyanate and then centrifuging in cesium chloride. 50 μl of RNA prepared by the above procedure was denatured at 65 ° C., electrophoresed on a 1% agarose MOPS-formaldehyde gel and then transferred to a nitrocellulose filter. The hybridization method is as described above.

교미 4일전에 MT/hGHR 유전자 융합 구성체가 주입된 수컷과 교미한 암컷 흰쥐로부터 17마리의 산자를 얻었다. 분만 후 4주 후에 산자의 꼬리로부터 DNA를 추출하여 서던 블로팅 분석을 수행하였다. 17마리 산자중 3마리(F0; 3 females)에서 MT/hGHR 유전자에 특이적인 프로브와 하이브리다이제이션하는 것으로 나타났다. 11주령이 되었을 때 형질전환된 암컷 생쥐중의 한마리를 정상적인 수컷과 교미시켰다. 교미한 상기 암컷은 7 마리를 분만하였으며, 이중 2마리(F1: 1 male, 1 female)가 서던 블로팅을 통한 MT/hGHR 유전자 분석에 양성반응을 나타내었다. 상기 결과를 도 2(a)에 나타내었다. F1 세대의 형질전환 수컷을 4마리의 정상적인 암컷과 교미시켰다. 상기 암컷들은 전부 61마리의 산자를 생산하였는데 그중 21마리(F2)가 MT/hGHR 유전자를 함유한 것으로 나타났다. 양성의 서던 블로팅 분석 결과를 보인 F3 세대의 3마리 흰쥐(도 2(b))를 사용하여, 근육, 신장, 심장, 뇌, 간에서의 hGHR mRNA 발현 여부를 노던 블로팅 분석하였다(도 2(c)).Seventeen females were obtained from male and female rats mated with MT / hGHR gene fusion construct 4 days before mating. Four weeks after delivery, DNA was extracted from the tails of the litter and Southern blotting analysis was performed. Three of the 17 litters (F0; 3 females) were shown to hybridize with probes specific for the MT / hGHR gene. At 11 weeks of age, one of the transformed female mice was mated with a normal male. The mating females gave birth to 7 mice, of which 2 (F1: 1 male, 1 female) were positive for MT / hGHR gene analysis through Southern blotting. The results are shown in FIG. 2 (a). Transformed males of the F1 generation were mated with four normal females. The females produced 61 live births, 21 of which (F2) were found to contain the MT / hGHR gene. Three rats of the F3 generation (FIG. 2 (b)) showing positive Southern blotting analysis were used for Northern blotting analysis of hGHR mRNA expression in muscle, kidney, heart, brain and liver (FIG. 2). (c)).

MMTV/mOB 융합 유전자 구성체를 정소실질내에 도입한 3마리의 수컷 흰쥐와 암컷 흰쥐를 교배하여 각각 10, 14, 및 12마리의 산자를 생산하였다. 서번분석결과는 36마리의 산자중에 2마리의 게놈이 MMTV-mOB 유전자 구성체를 함유하는 것으로 나타났다. 상기 결과를 도 3에 나타내었다.Three male and female rats incorporating the MMTV / mOB fusion gene construct into the testis parenchyma were crossed to produce 10, 14, and 12 litters, respectively. The sequencing analysis revealed that out of 36 live births, two genomes contained the MMTV-mOB gene construct. The results are shown in FIG. 3.

WAP-hGH 유전자 구성체가 도입된 2 마리의 다른 수컷과 교미한 두 마리의 암컷은 각각 15 및 16 마리의 산자를 생산하였다. 서던 분석결과 이중 3 마리가 전이 유전자를 가지는 것으로 나타났다(도 4(a)). 포유동물 유선에서 hGH 유전자의 발현은 노던 분석을 수행한 결과 전이 유전자의 발현을 확인하였으며 그 결과를 도 4(b)에 나타내었다.Two females mating with two other males into which the WAP-hGH gene construct was introduced produced 15 and 16 live litters, respectively. Southern analysis revealed that three of them had a transfer gene (Fig. 4 (a)). The expression of hGH gene in mammalian mammary gland was confirmed by the expression of the transfer gene as a result of Northern analysis and the results are shown in Figure 4 (b).

실시예 2 : 형질전환 한국 재래산양의 제조Example 2 Preparation of Transgenic Korean Native Goats

실험예 1 : 외래 유전자 구성체의 제조Experimental Example 1 Preparation of Foreign Gene Construct

본 발명에 사용된 유전자는 사람 유래의 성장호르몬(hGH)이며, 프로모터는 유선조직에서 특이적으로 발현되어지는 생쥐 유래의 유청단백질(whey acidic protein) 프로모터와 hGH 게놈 DNA를 연결하고 3' 부분에 SV40 폴리A+를 재조합하여 정소실질내에 도입할 유전자 구성체를 제조하였다(도 1). 도 1에 나타난 바와 같이, 4.6 kbp의 mWAP/hGH 구성체는 양말단에 EcoRI 절단부위를 가지며 hGH 게놈 DNA 및 이를 조절하는 유청단백질 프로모터를 포함하고 있다. 상기 구성체를 플라스미드 pUC18에 결합(ligation)시킨후, 재조합 발현벡터를 대장균에 형질전환시키고 대량 배양하였다. 상기 배양된 대장균으로부터 재조합 플라스미드를 분리하고 각 플라스미드를 EcoRI 제한효소로 절단하였다. 1%TAE 젤에서 전기영동을 실시하고, 진클리어 키트(Geneclear kit, Bio 101, USA)를 사용하여 정소실질내에 도입할 유전자 구성체를 정제하였다.The gene used in the present invention is a human-derived growth hormone (hGH), and the promoter connects the mouse-derived whey acidic protein promoter and hGH genomic DNA, which is specifically expressed in mammary tissue, to the 3 'region. The SV40 polyA + was recombinant to prepare a gene construct for introduction into the testis parenchyma (FIG. 1). As shown in FIG. 1, the 4.6 kbp mWAP / hGH construct has an EcoRI cleavage site at the sock end and includes hGH genomic DNA and a whey protein promoter regulating it. After ligation of the construct to plasmid pUC18, the recombinant expression vector was transformed into Escherichia coli and mass cultured. Recombinant plasmids were isolated from the cultured Escherichia coli and each plasmid was digested with EcoRI restriction enzyme. Electrophoresis was performed on 1% TAE gel and the gene construct to be introduced into the testis parenchyma was purified using Geneclear kit (Geneclear kit, Bio 101, USA).

실험예 2 : 리포좀/DNA 복합체의 준비Experimental Example 2 Preparation of Liposome / DNA Complex

정소실질내의 정자에 외래 유전자를 삽입 또는 도입시키기 위하여 리포좀(Lipofectin Reagent, GIBOCO-BRL)을 사용하였다. 형질전환 재래산양을 제조하기 위하여 mWAP/hGH 유전자(125μg)를 125μl PBS(Ca²⁺free)에 융해한 후 리포좀-DNA 복합체 형태로 하기 위하여 양이온 리포좀 용액 200μl와 서서히 혼합하여 실온(약 25℃)에서 1시간동안 배양하였다.Liposomes (Lipofectin Reagent, GIBOCO-BRL) were used to insert or introduce foreign genes into sperm in the testicle parenchyma. To prepare a transgenic goat, mWAP / hGH gene (125 μg) was melted in 125 μl PBS (Ca ²⁺ free) and then slowly mixed with 200 μl of cationic liposome solution to form liposome-DNA complex to room temperature (about 25 ° C.). Incubated for 1 hour at.

실험예 3 : 정소질내 유전자 도입Experimental Example 3 Introduction of Genes in the Vertebrate

상기 실시예2에 의해 제조된 리포좀-DNA 복합체를 20개월령된 한쪽 정소를 제거한 한국 재래산양의 정소실질내에 직접 300μl 주입한후 5, 10, 20, 40, 60 및 80일 0경과후에 오전 9시에서 10시 사이에 인공질법으로 정액을 채취하였다. 정액 채취후 일반적인 검사과정을 거친 후 미리 준비된 1차 희석액과 혼합하였다. 상기 1차 희석액의 조성분 및 첨가량은 다음과 같다 : 구연산 나트륨 1.920mg, 인산 나트륨(diabasic) 80mg, 글리신 170mg, 포도당 83mg, 과당 170mg, 트리스 500mg, EDTA 25mg, 탄산나트륨(sodium bicarbonate) 166mg, BSA 3mg/ml, 스트렙토마이신-페니실린-G 10,000IU/100ml, 난황 20%(v/v). 상기 혼합액을 냉장고에서 2-3시간동안 4℃까지 냉각시킨후 최종 희석비율의 1/2이 되도록 1차 희석액과 혼합후 정액량에 따라 3℃에서 4회에 걸쳐 글리세롤이 첨가된 2차 희석액을 첨가하였다. 2시간동안 글리세롤 평형을 실시한 후 0.5ml 스트로우에 봉입하여 -79℃ 딥프리저(deep freezer)에 보관하였다. 융해는 37℃ 워터배쓰(water bath)에서 2분간 급속융해방법으로 실시하였다. 희석비율은 0.5ml 스트로우당 평균 80X10⁶개로, 글리세롤 최종농도는 7%였으며 인위적 발정이 유기된 재래산양의 인공수정시까지 동결보존하였다.The liposome-DNA complex prepared in Example 2 was injected directly into the testis parenchyma of the Korean native goat, which had been removed from one of 20-month-old testes, at 9 am after 0, 5, 10, 20, 40, 60 and 80 days. Semen was collected by artificial method between 10 and 10 o'clock. After semen collection, the test procedure was carried out and then mixed with the prepared first diluent. The composition and amount of the first dilution solution are as follows: sodium citrate 1.920 mg, sodium phosphate (diabasic) 80 mg, glycine 170 mg, glucose 83 mg, fructose 170 mg, Tris 500 mg, EDTA 25 mg, sodium bicarbonate 166 mg, BSA 3 mg / ml, streptomycin-penicillin-G 10,000 IU / 100 ml, egg yolk 20% (v / v). After cooling the mixture to 4 ° C. for 2-3 hours in a refrigerator, the mixture was mixed with the primary dilution so that it becomes 1/2 of the final dilution ratio, and the secondary dilution solution containing glycerol was added four times at 3 ° C. according to the amount of semen. Added. After glycerol equilibration for 2 hours, it was enclosed in a 0.5ml straw and stored in a -79 ° C deep freezer. Melting was carried out by rapid melting for 2 minutes in a 37 ℃ water bath (water bath). The dilution ratio averaged 80 × 10 ⁶ per 0.5 ml straw, and the final concentration of glycerol was 7%. Cryopreservation was achieved until artificial fertilization of conventional goats with artificial estrus.

실험예 4 : 정자의 mWAP/hGH 유전자 검출Experimental Example 4 Detection of Sperm mWAP / hGH Gene

동결보존된 정액의 정자로부터 게놈 DNA 추출은 문헌(Sambrook, J., E. F. Fritsh and T. Maniatis, Molecular cloning. A laboratory manual and edition, New York, Cold Spring Harbor laboratory press, 1989)에 기재된 방법을 사용하였다. 먼저, 정액은 라이시스 버퍼(50mM Tris-HCL, pH 8.0, 100mM EDTA, 35μl proteinase(30mg/ml), 0.1% SDS)에 부유시킨후 45℃ 배양기에서 12시간 이상 배양하였고, DNA 회수는 핑거프린팅(finger printing) 방법에 따라 수행하였다. 추출된 DNA의 농도는 스펙트로포토메터(U-2000, HITACH)에서 측정하였다. PCR은 타종의 hGH와 상동성이 낮은 부분의 하기 프라이머 1 및 2를 사용하여 수행하였다.Genomic DNA extraction from the sperm of cryopreserved semen is performed using methods described in Sambrook, J., EF Fritsh and T. Maniatis, Molecular cloning.A laboratory manual and edition, New York, Cold Spring Harbor laboratory press, 1989. It was. First, the semen was suspended in lysis buffer (50 mM Tris-HCL, pH 8.0, 100 mM EDTA, 35 μl proteinase (30 mg / ml), 0.1% SDS), and then cultured in a 45 ° C. incubator for at least 12 hours. It was performed according to the (finger printing) method. The concentration of the extracted DNA was measured on a spectrophotometer (U-2000, HITACH). PCR was carried out using the following primers 1 and 2 with low homology with other hGH species.

프라이머 1(forward, 1047-1067 nt, 20 bp)Primer 1 (forward, 1047-1067 nt, 20 bp)

5'-CTCAGAGTCTTTCCGACAC-3'5'-CTCAGAGTCTTTCCGACAC-3 '

프라이머 2(reverse, 1687-1706 nt, 20 bp)Primer 2 (reverse, 1687-1706 nt, 20 bp)

5'-TCTTGAGTAGTGCGTCATCG-3'5'-TCTTGAGTAGTGCGTCATCG-3 '

PCR은 50ng의 게놈 DNA를 주형으로 하고 100μM dNTP, 12.5mM MgCl₂, 10XPCR 버퍼, 10μM hGH 포워드(forward) 및 리버스(reverse) 프라이머, 5unit의 Taq DNA 폴리머라제(TaKaRa, Japan)을 함유하고 있는 10mM Tris-HCL 버퍼와 총 100μl로서, 94℃ 1분 , 61℃ 1분, 72℃ 1분으로 총 36 싸이클을 DNA 써모싸이클러(DNA Thermocycler, Perkin-Elmer Cetus)에서 실시하였다. 그리고 마지막 신장(final extension)은 72℃에서 10분간 실시하였다. 서던 블로팅은 공지의 방법에 따라 수행하였다.PCR was based on 50ng of genomic DNA as a template, 10mM containing 100μM dNTP, 12.5mM MgCl ₂ , 10XPCR buffer, 10μM hGH forward and reverse primer, and 5 units of Taq DNA polymerase (TaKaRa, Japan) A total of 36 cycles were performed in a DNA thermocycler (DNA Thermocycler, Perkin-Elmer Cetus) with 100 μl of Tris-HCL buffer and 94 ° C., 1 minute, 61 ° C., 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute. The final extension was performed at 72 ° C. for 10 minutes. Southern blotting was performed according to known methods.

상기 과정에 의한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2의 a에서 A, B, C 및 D 레인은 각각 PCR 산물을 나타낸다. E 및 F 레인은 각각 DNA 크기 마커 및 mWAP/hGH 플라스미드 DNA로부터 증폭된 대조구(positive control)를 나타낸다. 화살표는 약 659bp의 hGH 절편을 나타낸다. 도 2의 b는 한국 재래산양의 정자에 도입된 mWAP/hGH 융합 유전자의 PCR/서던 분석 결과를 나타낸다. 상기 과정 수행결과 유전자 도입 후 채취한 정액에서 외래 유전자는 80일 이상 존재하였으며, 가장 높은 전이율은 40일째 얻어졌다. 상기 결과는 외래유전자가 성공적으로 도입되었음을 보여주는 것이다.The results by the above process are shown in FIG. 2. In Figure 2a, A, B, C and D lanes each represent a PCR product. E and F lanes represent positive controls amplified from DNA size markers and mWAP / hGH plasmid DNA, respectively. Arrows indicate hGH segments of about 659 bp. Figure 2b shows the results of PCR / Southern analysis of the mWAP / hGH fusion gene introduced into the sperm of Korean native goats. As a result of the above process, foreign genes were present in semen collected after gene introduction for 80 days or more, and the highest metastasis rate was obtained at 40 days. The results show that the foreign gene was successfully introduced.

실험예 5 : 발정유기 및 인공수정Experimental Example 5 estrous organic and artificial insemination

한국 재래산양의 발정유기는 약 15개월령된 24두의 암컷 산양에 두당 PGF_2α(prostagladin F_2α, Upjohn Co., USA) 3mg(0.2mg/kg/BW)을 근육주사후 36시간째부터 1일 4시간 간격으로 발정유도를 관찰하였으며, 1차 투여에서 발정이 유기되지 않은 개체는 1차 투여후 8일째에 동량의 PGF_2α를 2차 투여함으로써 인위적인 발정을 유기하였다. 발정이 유기된 23두는 동결정액으로 인공수정을 실시하였다.The estrous period of Korean native goats was 3 mg (0.2mg / kg / BW) of PGF _2α (prostagladin F _2α , Upjohn Co., USA) per head in 24 female goats of about 15 months of age. Estrous induction was observed at 4 hour intervals, and the individual who did not induce estrus at the first administration induced artificial estrus by second administration of the same amount of PGF _2α on the 8th day after the first administration. 23 estrous estrus were artificially inseminated with copper crystal solution.

실험예 6 : 형질전환동물의 검정Experimental Example 6 Assay of Transgenic Animal

총 23두의 인공수정 결과 태어난 7두의 자양으로부터 도입된 유전자의 발현유무를 검토하기 위하여 생후 3주령 산자의 경정맥으로부터 혈액을 채취하여, 이들 혈액으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 혈액으로부터 추출한 DNA는 EcoRI 제한효소로서 37℃에서 하룻밤 절단시킨 후 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25:24:1)로서 추출하여 0.8% TAE 아가로스 젤에서 50V 전압에서 60분간 로딩하였다. 로딩이 끝난 젤은 알칼리 용액(1.5M NaCl 및 0.5N NaOH) 및 중성배지(1M Tris(pH 7.4), 1.5M NaCl)에서 각각 45분 및 30분간 변성시킨 후 나일론막(Hybond+N, USA)에 전이하였다. 전이가 끝난 필터는 0.2XSSC(0.1% SDS)로 50℃에서 10분간 2회 세정한후 하이브리다이제이션하였다. 프로브는 도 1에 보는 바와 같이 재래산양의 성장호르몬과 상동성이 비교적 낮은 부분을 [α-³²P]dCTP로 라벨링한 프로브(1∼2X10⁶cpm/ml)와 하이브리다이제이션 용액(6X SSC, 0.5% SDS, 열변성한 100μg/ml의 연어 정자(salmon sperm) 및 50X 덴하르트 용액(Denhardt's solution)과 함께 42℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 하이브리다이제이션이 끝난 필터의 세정은 0.5X SSC 버퍼와 50℃에서 30분 및 10분 2회 실시하였고, 마지막으로 50℃의 0.1X SSC 버퍼에서 2-3분간 실시한 후 -70℃에서 48시간 동안 X-선 필름(Kodak, Japan)에 노광시켜 검토하였다.In order to examine the expression of the genes introduced from the seven chicks born after the artificial insemination of a total of 23 heads, blood was collected from the jugular vein of 3 weeks old babies and genomic DNA was extracted from the blood. DNA extracted from blood was digested overnight at 37 ° C. with EcoRI restriction enzyme and then extracted as phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) and loaded for 60 min at 50 V on 0.8% TAE agarose gel. After loading, the gel was denatured in alkaline solution (1.5M NaCl and 0.5N NaOH) and neutral medium (1M Tris (pH 7.4), 1.5M NaCl) for 45 minutes and 30 minutes respectively and then nylon membrane (Hybond + N, USA) Transitioned to. After the transition, the filter was washed twice with 0.2XSSC (0.1% SDS) at 50 ° C. for 10 minutes and hybridized. As shown in FIG. 1, a probe labeled with [α- ³² P] dCTP having a relatively low homology with a growth hormone of a native goat (1-2 × 10 ⁶ cpm / ml) and a hybridization solution (6X SSC, Incubate overnight with 0.5% SDS, thermodenatured 100 μg / ml salmon sperm and 50 × Denhardt's solution at 42 ° C. Washing of the hybridized filter was performed with 0.5 × SSC buffer and 50 ° C. The test was carried out twice for 30 minutes and 10 minutes at < RTI ID = 0.0 > C, < / RTI >

자양으로부터 분리한 게놈 DNA의 PCR 및 서던 분석결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 2두의 자양이 형질전환되었음을 알 수 있다.The results of PCR and Southern analysis of genomic DNA isolated from nutrients are shown in FIG. 3. As shown in Figure 3, it can be seen that the two nourishment has been transformed.

본 발명은 포유동물의 정소실질에 리포좀/외인성 유전자 DNA 복합체를 도입하여 생산된 형질전환 정자를 채취하고, 난자에 수정시켜 형질전환 동물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 의해 목적하는 유전형질을 가진 형질전환동물 제조가 가능하여 본 발명은 생명공학, 의약 및 농축산 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.The present invention relates to a method for producing a transgenic animal by harvesting transformed sperm produced by introducing a liposome / exogenous gene DNA complex into the testis parenchyma of a mammal, and fertilizing the egg. It is possible to produce a transgenic animal having a genetic trait, the present invention is a very useful invention in the biotechnology, pharmaceutical and livestock industry.

Claims (1)

형질전환동물의 제조 방법에 있어서,In the method for producing a transgenic animal, (a)도입하고자 하는 목적 유전자(DNA) 구성체를 제조하는 단계;(a) preparing a target gene (DNA) construct to be introduced; (b)상기 제조한 유전자 DNA 구성체를 리포좀에 포괄하여 리포좀/외인성 DNA 복합체를 제조하는 단계;(b) encapsulating the prepared gene DNA construct into liposomes to produce a liposome / exogenous DNA complex; (c)상기 리포좀/외인성 DNA 복합체를 한국 재래산양의 정소실질내에 도입하는 단계;(c) introducing the liposome / exogenous DNA complex into the testis parenchyma of Korean native goats; (d)상기 리포좀/외인성 DNA 복합체가 도입된 한국 재래산양으로부터 정자를 채취하는 단계;(d) collecting sperm from Korean native goats into which the liposome / exogenous DNA complex is introduced; (e)상기 채취된 정자를 발정하거나 발정유기된 한국 재래산양에 수정시키는 단계;(e) fertilizing the collected sperm or fertilizing an estrous organic native goat; (f)상기 수정에 의해 임신된 한국 재래산양으로부터 산자를 생산하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 형질전환 한국 재래산양의 제조 방법(f) a method for producing a transgenic Korean native goat comprising the step of producing a litter from the Korean native goat pregnant by the fertilization