KR20010030622A - 다중 표적 하이브리드형성 핵산과 그들의 제조, 구성,제제, 키트 및 응용 - Google Patents

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Abstract

2 이상의 RNA 표적에 결합된 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 개시되어 있다.

Description

다중 표적 하이브리드형성 핵산과 그들의 제조, 구성, 제제, 키트 및 응용 {Multiple Target Hybridizing Nucleic Acids, Their Preparation, Compositions, Formulation, Kits and Applications}
다양한 병과 통증에 관련된 호흡기 질병은 일반집단에서 매우 통상적이며, 아프리카계 미국인들과 같은 일정 소수집단에서는 더욱 그러하다. 몇몇 경우에, 그러한 질병은 폐의 상태를 악화시키는 염증을 수반한다. 예를 들면, 천식(arthma)은 산업국가에서 가장 통상저인 병중에 하나이다. 미국에서 천식은 전체 의료비의 1%에 해당한다. 지난 10년에 걸쳐 천식 환자수와 사망자수가 엄청나게 증가한 것이 기록되어졌고, 천식은 다음 10년에도 심각한 직업 폐 질환이 될 것으로 보인다. 산업국가에서 천식 사망자수의 증가는 이 병의 치료약인 베타 아고니스트에 대한 높은 신뢰에 기인하지만, 천식의 본질적인 원인은 거의 알려지지 않았다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인간질환의 유용한 병리학적 작용제로, 상당한 이론적인 관심을 받아 왔다. 그러나, 인간 질환의 실용화 모델로 한 실제적인 적용은 다소 힘들었었다. 그들을 효과적으로 응용하기에 한가지 어려움은 작용장소로 수송하기위한 적당한 투여경로를 찾는 것이 어려웠다. 뇌의 특이 영역으로 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 직접 투여하는 많은 생체 내 실험이 수행되었다. 그러나, 이들 적용은 침범 특성(invasive nature)으로 임상학적 유용성이 어쩔 수 없이 제한되었었다.
질환-함유(disease-involved) 조직을 표적하는데 적잖은 본질적인 문제로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 전신투여(systemic administration)는 상당한 문제점을 또한 나타내었다. 이에 반해, 폐는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 직접 투여하기 위한 우수한 표적이 되고, 비침범적이고 조직-특이적인 경로를 가지고 있다. 폐로의 안티센스 작용제의 수송은 비교적 많이 연구되지 않았다.
폐에서 아데노신은 기관지 천식을 포함하는 다양한 질환에서 중요한 매개체이다. 천식 환자는 에어러졸화된 아데노신에 대해 현저한 기관지협착(brochoconstriction)반응을 나타냈고, 일반환자는 그렇지 않은 연구 결과로 아데노신의 가능한 역할이 제안되었다. 인간 천식의 연구를 위한 천식 토끼 동물모델인, 작은 먼지 알레르기성 토끼 모델(dust mite allergic rabbit model)은, 유사하게 에어러졸화된 아데노신에 대해 현저한 기관지협착 반응을 나타냈고, 반면 비천식(non-asthma) 토끼에서는 어떤 반응도 나타나지 않았다. 이 동물 모델로 한 더 최신의 연구에서 아데노신-유도 기관지협착 및 천식성 기관지 과반응은 우선적으로 아데노신 수용체의 자극을 통해 매개한다는 것을 제안하였다. 먼저 진단되지 않은 과반응 기도를 가진 환자의 다른 질환 및 통증에 대해 치료적으로 투여되었을 때, 아데노신은 죽음을 포함한 좋지 않은 영향을 또한 나타내는 것으로 보인다.
일반적으로 제한을 가지고 있어도, 소량의 약물(medicament)들은 호흡기 질환 및 통증의 치료에 이용되어 왔다. 천식 치료의 중요한 약인 디오필린은 천식 토끼에서 아데노신-매개 기관지협착을 제거하는 것으로 기록된 아데노신 수용체의 안타고니스트으로 알려져 있다. 선택적인 아데노신 A1 수용체 안타고니스트인, 8-사이클로 펜틸-1.3-디프로파일잰타인(DPCPX)는 알레르기 토끼에서 아데노신-매개 기관지수축과 기관지 과반응을 저해할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 현재 이용가능한 아데노신 수용체 A1-특이 안타고니스트들의 치료적으로, 예방적으로 적용하기에는 안타고니스트들의 독성때문에 제한되고 있다. 예를 들면, 디오필린은 천식의 치료에 폭넓게 사용되고 있지만, 좁은 치료적 투여범위로 비번하고, 상당한 독성을 나타내고 있다. 지난 10년간 많은 연구가 진척되었음에도, 어떠한 아데노신 수용체 특이 안타고니스티는 이들 작용제의 일반적인 독성으로 이내 임상의 이용되지 못하고 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인간질병의 병리학적 작용제로서 사용하기 위해 상당한 이론적인 관심을 받고 있다. 그러나, 많은 량으로 투여를 하여야 하기 때문에, 인간 병의 실질적인 모델에서 이들 작용제의 실제적인고 효과적인 적용을 거의 찾을 수 없다. 일들 분자의 병리학적인 적용에서 다른 중대한 관심은 투여 경로이다. 생체내의 많은 적용은 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 뇌의 한정된 부분으로 직접 투여한 것이 고작이다. 그러나, 그러한 적용은 침투적인 특성으로 임상의 유용성이 한계지어진다.
병리학적 작용제로 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 전신 투여는, 병을 함유한 조직의 표적화에 어려움때문에, 중요한 문제점이 되어왔다. 즉, 정맥주사나 입으로 투약하여 치료량을 얻기에는, 순환계에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 충분히 희석되는 어려움이 있다. 입으로 투약했을 경우, 생체이용도는 거의 5%도 되지 않을 만큼 적다.
본 발명자를 포함한 많은 사람들은 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 임상에서 사용하였고, 본 발명자는 이미 폐에 이들 작용제를 직접투여함으로써 다양한 병과 통증을 성공적으로 치료하였다. 많은 경우에, 다른 사람들은 DNA분자를 원하는 표적으로 위치시키는데 많은 어려움을 가지고 있다. 그러므로, 병과 통증의 위치 뿐 만이 아니라, 일반적인 병과 통증을 치료하는데, 투약경로는 매우 중요하다.
따라서, 안티센스 치료법을 이행하기 위한 효과적인 방법, 더욱 상세하게는 복잡한 상태에 있는 병과 통증의 치료가 고도로 효과적이도록 하는 방법이 필요하다. 후자의 예로서, 복잡한 경로들과 많은 내생물질들이 홀로, 혹은 서로의 조합하여, 환자들에게서 병리학적인 통증을 유발한다.
본 발명은 아데노신 함량이 작거나 없는 다중 표적 안티센스 올리고뉴클레오타이드(MTA oligos)에 관한 것이다. 본 작용제(agent)는 폐 질환 을 포함하는 염증(inflammation), 기관지 장해(impaired airway), 및 부차적으로 환자의 폐를 상해하는 질환에 관련된 질환 및 통증의 예방과 치료에 효과적이다. 본 작용제는 특이 유전자, 유전자의 측면 영역(genomic flaking regions), 개시코돈, 인트론-액손의 경계(intron-exon borders), 및 그와 같은 것에, 또는 일정 단백질, 특히 다양한 관련 경로에 작용하는 다중 매개체들을 가진 질환에 관련된 단백질을 인코딩하는 RNA의 코딩 영역 및 비코딩 영역을 표적한다. 예로는 알레르기, 천식, 호흡장해, 통증, 낭모성 섬유증과 예로서 결장암, 백혈병(leukemias)과 같은 암, 및 그와 같은 것이 있다. 본 작용제는 다른 치료법과 병행하여 예방적, 치료적으로 쉽게 투여될 수 있고, 또는 상당하고 음성적인 부작용을 가진 치료법을 대신하여 이용될 수 있다.
[발명의 요약]
본 발명은, 두 개 이상의 mRNA들과 하이드리드를 형성하는 안티센TM 올리고뉴클레오타이드 또는, 다중 표적 안티센스 올리고들(MAT 올리고들)에 관한 것이다. 예를들면, 표적 유전자들, 유전자 인접 영역들, 개시 코돈, 인트론-액손 보더들(boarder) 등 및, mRNA의 코딩 영역과 5' 캡 또는 말단, 예를들면 폴리-A 분획과 같은 3' 말단을 포함하는 전체 서열의 RNA들, 그리고, 하나 이상의 질환이나 질병들 또는 이들의 조합과 관련있는 단백질들을 코딩하는 RNA들에 대응하는 안티센스 올리고들과 같은 것이 있다. 예를들면, mRNA는 전사인자들, 자극 및 활성인자들, 인터루킨들, 인터루킨 수용체들, 케모킨들, 케모킨 수용체들, 내재적으로 생산된 특이적 및 비-특이적 효소들, 면역글로블린들, 항체 수용체들, 면역글로불린들, 항체 수용체들, 중추신경계와 말초신경계와 비신경계의 수용체들, 중추신경계와 말초신경계와 비신경계의 펩티드 전달물질들, 흡착 분자들, 디펜신들, 성장인자들, 혈관작용성 펩티드들 및 수용체들, 그리고 결합 단백질들과 같은 펩티드(들)을 코딩할 수 있거나, 또는 종양유전자에 대응하는 mRNA을 코딩할 수 있다. 본 발명의 작용제는 약 15% 이하의 아데노신(A)를 함유하며, 많은 경우 아데노신을 전혀 함유하지 않는다. 또한, 본 발명의 작용제는 조성물의 형태로 나타날 수 있으며, 캡슐과 카트리지, 다양한 제제, 수송장치와 사용지침서와 함께 제공되는 키트의 형식으로 존재할 수 있다. 본 발명의 안티센스-올리고들은, 일반적인 염기와 같이 아데노신-유사 결합치환체로 치환함으로서 감소된 아데노신 함량을 갖을 수 있다. 또한, 키트는 다른 치료제들과 조성물을 위한 구성요소를 가질 수 있다. 또한, 작용제는 벡터에 작동가능하게 연결되거나 형질감염된 숙주세포의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 작용제, 조성물 및 제제는, 표적 유전자, 유전자 인접 영역들 또는 단백질들 중 적어도 하나에 대응하는 mRNA가 존재하는 것과 관련된 질환과 질병의 치료에 적용될 수 있으며, 적어도 하나의 표적 mRNA의 생산 및 유용성을 감소시키거나 분해를 증가시키는데 효과적인, 본 발명의 MTA 올리고의 양으로 환자에게 투여한다. 바람직한 실시예에 있어서, 작용제는 적어도 두 개의 표적 mRNA의 생산성과 이용성을 줄이거나, 분해성을 증가시키기 위한 효과적인 량으로 투여 할 수 있다. 본 발명의 전형적인 질환 및 질병은, 환자의 폐에 음성적인 영향을 미치는 폐 질환, 질병 및 통증을 포함하는, 호흡기 장애 및 염증과 관련된 것이다. 본 발명의 작용제를 가지고 예방과 치료적으로 처치될 수 있는 질환과 질병의 예로는, 폐혈관 수축, 염증, 알레르기성 비염, 급성 천식, 알레르기, 천식, 호흡기 장애, 호흡 곤란 증후군, 고통, 낭포성 섬유증, 폐 히퍼텐신, 폐혈관 수축, 기종, 만성폐색성폐질환(COPD), 백혈병, 림프종, 유방암과 전립선 암을 포함한 폐로 전이된, 혹은 전이되고 있는 모든 종류의 암뿐만이 아니라, 예로서 결장암, 유방암, 폐암, 췌장암, 감세포성 암, 신장암, 흑색종, 간 전이, 등과 같은 암종이 있다. 본 작용제(들)은 또한 방사선치료, 화학요법, 항체 치료, 프로토치료, 암과 다른 외과의 다른 치료법을 포함하는 다른 치료전후 또는 치료동안에 투여해도 좋다. 또한, 예방과 치료를 위해 효과적으로 투여될 수 있는 본 작용제는 다른 치료와 병행하거나, 다른 치료없이 그 자체로 질병치료를 하거나, 상당하고 음성적인 효과를 지닌 다른 치료방법에도 적합하다.
본 발명의 조성물은, 입, 동내, 비강내, 항문내, 질내, 경피, 피내, 협내, 혈과내, 피하, 근육내, 종양내로 투입하는 것을 포함하며, 일반적으로 동맥내, 혈관내, 흡입에 의해, 두개골내, 포막, 기관내, 예로서 간과 다른 기관을 포함하여, 측로를 통한 투입을 포함하고, 사람과 포유동물과 같은 척추동물을 포함한 다른 동물의 이식, 안구내 투여를 통해 투입할 수 있다. 본 발명의 치료법은 예방적, 치료적일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 작용제를 환자의 호흡기에 직접 투여하여, 표적된 질환 및 질병의 폐에서의 효과를 감소시키거나 저해하기 위한 효과적인 량으로 상기 작용제가 폐에까지 직접 도달할 수 있다.
본 발명의 작용제는, 유전자들, 유전자 인접 영역들, 인드론-액손 보더들, 등 또는, 비코딩 RNA들을 포함하는 전체 서열의 RNA들 및 하나 이상의 질환 및 질병과 관련된 것으로 알려진 단백질을 코딩하는 RNA과 같은 두개 이상의 표적들은 선택하는 단계; 유전자들 및 게놈성 인접 영역들에 해당하는 RNA들과 표적 단백질을 코딩하는 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA를 얻는 단계; 두 번째 RNA에 최소한 약 60%, 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90%, 심지어는 거의 100%의 동종성 있는 첫번째 RNA의 분획을 선택하는 단계; 그리고 하나 이상의 RNA 분획(segment)에 대한 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계로부터 제공될 수 있다. 표적 RNA들은 전구체, 스플라이싱된 mRNA 및, 5'-말단과 3'-말단 및 코딩 영역을 함유하는 또다른 RNA 분자, 코딩- 및 비코딩-서열들과 나란하게 포개지는 분획들을 포함한다. 본 발명의 바람직한 형태에서는, 두 개 이상의 표적들이 같은 분자안에 위치할 수 있다. 예를 들면, 다수의 서브유닛을 가진 단백질을 코딩하는 mRNA의 경우, MTA 올리고들은 다른 단백질 서브유닛들을 코딩하고 있는 RNA 분획에서 찾을 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 따라 생성될 수 있는 MTA 올리고들이 제공되어 있다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은, 본 발명자 자신 또는 다른 사람들이 이전에 발견한 것 즉, 이 전에는 안티-센스 올리고뉴클레오타이드가 다수의 관련 경로를 가진 질환 또는 질병을 치료하는데 있어서 치료적학적으로 사용될 수 있다는 발견을 향상시키고자하는 발명자의 희망으로부터 나왔다. 본 발명자는 질환과 질병과 관련된 특이성이 있는 표적에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이들을 설계함으로서 하나의 특이적인 경로의 효과들을 경감하거나 증강시키는데 있어서의 발명자의 이전 성공을 향상시킬 수 있다는 것을 본 발명을 통해 추론되었다. 따라서, 본 발명자는 다수의 표적에 직접 연관된 새롭고 불명확한 전략을 시도하기 시작했다. 그러는동안, 본 발명자는 수많은 장애, 특히, 표적을 얻는 것 뿐만아니라 특정 질환과 관련된 게놈성 DNA, RNA들, 또는 단백질, 원하는 서열을 위치시키는데 필요한 광범위한 검색과 선택들을 극복하였다. 그리고 난 후, 본 발명자는 몇 개의 특정 질환들 또는 질병들에 적용함으로써 본 발명을 입증하였으며, 다양하고 바람직한 실시예들을 제공하였고, 다중 표적 안티센스 올리고뉴클레오타이드(MTO 올리고) 서열들을 특별하게 제작하였다.
본 발명의 다중 표적 안티센스(MTA)올리고뉴클FP오타이드들은 하나이상의 표적 mRNA의 발현을 경감시키거나, 하나이상의 경로의 활성을 증강시키거나 경감시킬 수 있는 능력을 가진다. 실시예의 방법들을 통해, 본 발명의 방법은, 표적 mRNA안에 있는 약 7, 약 10, 약 12, 약15, 약 18, 약 21 내지 약 28, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 60, 또는 그 이상의 모노뉴클레오타이드에 대한 가능성있는 모든 데스아데노신(desA) 안티센스 서열을 처음으로 확인하고 실체화할 수 있었다. 이것은, 아데노신에 상보적인 뉴클레오타이드인 티미딘이 적거나 없는 표적 서열들 안에서 7개이상의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 분획을 검색함으로서 얻어졌다. 이 전형적인 검색을 통해 10개 내지 30개의 desT 분획들(즉, 자연적으로 티미딘이 부족한 것) 또는 T 함량이 낮은 분획들(예를들면, 약 15% T까지)이 결과로 나왔다. 이로부터, 다양한 길이의 안티-센스 올리고뉴클레오타이드들이, 예를들면, 약 1800 뉴클레오타이드 길이와 같은 평균길이의 전형적인 표적 mRNA에 대해 설계될 수 있다. 그런 후에, 특정 표적에 대해 얻어진 desA 안티센스 서열 각각에 대해 엄격하게 상보하는 센스 서열이 추론될 수 있다. 따라서, 추론된 센스 서열은 바람직한 제 2차 표적의 서열을 찾는데 사용될 수 있다. 또한, 하나이상의 서열 데이타 베이스, 예를들면, GENBANK 등은, 또다른 대안의 제 2차 표적을 찾을 수 있다. 따라서, 표적화는 몇가지 방법으로 수행될 수 있으며 그 중 하나는 한가지 이상의 질환에 관련된 특정 표적들들을 선택하는 것이다. 또한, 일차 표적은 처음에 선택될 수 있고, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 바람직하게는 desA 올리고뉴클레오타이드가 찾아질 수 있으며, 그리고 나서, 제2차, 제3차 또는 그 이상의 표적을 찾을 수 있다. 전형적인 검색, 바람직한 이차 표적의 목록 또는 데이타 베이스의 목록에 있어서, 관심있는 동종성의 제2차 표적들의 예들이 확인된다. 즉, 본 발명의 기술들은 제1차, 제2차 및 그 이상의 서열들간의 자연적인 상동성들있는 예들을 찾을 수 있도록 하였다. MTA들을 얻은 표적 거대분자들과 관련있는 특정 질환들 또는 질병들을 치료하는데 상기 발견물들을 사용할 수 있다.
본 발명의 기술은, 폐 기도 병변들이 관여하는 질병들과 관련된 mRNA들을 표적화하는 안티센스 올리고들의 제작에 사용되며, 의도된 목적을 위해, 활성과 유효성을 유지하는 동안 아데노신이 파괴되어 방출되어 야기되는 바람직하지 못한 부작용들이 발생하는 것을 감소하기 위해 상기 올리고들을 변형시키는데에도 사용된다. 이러한 방식으로, 본 발명자는 특정 유전자를 선택하여, 이에 대응하는 mRNA에 선택적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드(들)을 설계하고,필요에 따라, 일반적인 염기 또는 아데노신 A1, A2b, A3수용체들을 활성화시키지 못하도록 하는 아데노신 유사체로 치환함으로서 아데노신의 함량을 줄인다. 이 분야의 우선적인 경험에 기초하여, 본 발명자는, "하향조절하는" 특정 유전자들에 부가하여, 티미딘(T)이 없거나 그 함량이 낮거나, 또는 설계된 올리고뉴클레오타이드(들)에 있는 하나이상의 아데노신(들)이, 티미딘에 결합하나 아데노신 슈용체들을 활성화시키는 능력이 결핍되거나, 그렇지않다면 폐에서의 아데노신 효과를 수축시킬 수 있는, 소위 일반적인 염기들로 불리는 다른 뉴클레오타이드 염기들로 치환된, RNA 분획을 선택함으로써 투여된 작용제(들)의 효과를 증가시킬수 있다는 것을 밝혔다. 아데노신(A)이 티미딘에 상보하는 뉴클레오타이드 염기임을 생각하면, T가 상기 RNA에 나타날 때, 안티센스 올리고는 같은 위치에서 A를 가질 것이다. 비록 상보성있는 서열들이 본 발명의 4개의 코너안에 포함되더라도, 일관성있게, 본원에서 모든 RNA와 올리고뉴클레오타이드는, 왼쪽에서 오른쪽으로 읽혀졌을 때 5'에서 3'방향으로 된 한 가닥의 스트랜드로 나타낸다. 더욱이, 모든 뉴클레오타이드 염기들 및 아미노산들은 IUPAC-IUB 생화학 명명법회(biochemical Nomenclature Comminssion)의 규정에 따라, 또는 (아미노성에 대해) 알려진 3글자 코드를 이용하여 나타내었다.
본 발명의 방법은, 원인이 무엇이든지 간에 환자에 있어서 감소된 기도의 기능과 관련있는 병을 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 안티센스 작용제의 아데노신 함량은 생체내에서 작용제의 분해로 방출되는 것을 막기위해 A의 함량을 줄였다. 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 기도질환의 예들로는 낭모성 성유증, 천식, 풀모너리 히퍼텐신, 혈관수축, COPD, 장기 프론치티스, 호흡기 스트레스성 증후군, 폐암, 폐 전이암, 및 염증반응을 포함한 다른 기도 질환을 포함한다.
다른 것들 중에서, 아데노신 A1, A2a, A2b, A3수용체들, CCR3 (케모카인 수용체들), 브래디키닌 2B, CAM(혈액세포 흡착 분자), 호산구 수용체에 대한 안티센스 올리고들은 그들 유전자의 발현을 하향조절하는데 효과적이다. 이들중 몇몇은 증상을 완화시키거나, 또는 호흡기 질병 및/또는 염증, 예로서, 아데노신 A1, A2a, A2b, 및/또는 A3수용체와 CRR3, 브래디키닌 2B, VCAM(혈관 세포 흡착 분자), 및 호산구 수용체의 "하향조절"에 의해 줄일 수 있다. 광범위한 계(system)의 전이 없이 폐에 도달할 수 있도록, 이러한 작용제들은, 예를들면, 흡입기 또는 다른 수단을 사용하여 호흡계 안으로 직접 투여되는 것이 바람직하다. 이것은, 선행기술 또는 다른 일반적인 경로를 통해서 투여하는 것과 비교해 볼 때, 본 발명의 작용제를 실질적으로 작은 량으로 투여하는 것을 가능하게 하고, 결과적으로, 체내에서 작용제의 광범위한 분포로 인해 야기되는 바람직하지 못한 부작용을 줄일 수 있게 한다. 본 발명의 작용제는 조직에서 발현되는 수용체 단백질의 양을 줄이는 것으로 알려져 왔다. 그러므로, 예를들면, 수용체와 같은 표적들에만 상호작용하는 본 발명의 작용제는, 다른 약이 상호작용하는 표적 단백질의 수를 줄일 수 있다. 이러한 방식으로 본 발명의 작용제(들)은 낮은 독성과 함께 극도의 고효율성을 제공한다.
상기 검토된 아데노신 수용체는 본 발명자의 기술의 잘 작용하는 더할나위 없는 예들이다. 실제로, 단백질의 발현을 줄이거나 하향조절하기 위해 본 발명과 유사한 방식으로 많은 수의 유전자를 표적화하였다. 실시예의 방법으로, 만일 표적 질환 또는 질병이 호흡장애 또는 호흡감소, 기관지협착, 만성 기관지염, 폐 기관지협착 및/또는 저혈압, 만성폐색성폐질환(CODP), 알레르기, 천식, 낭모성 섬유증, 호흡기곤란 증후군, 직접 또는 전이되어 폐에 좋지 않은 영향을 주는 암과 관련된 것인 경우, 본 발명의 방법은 특히 아래 표 1에 나열된 표적을 포함하는 가능성 있는 표적 mRNA의 목록에 적용될 수 있다.
표 1 : 폐질환 또는 통증(천식/염증) 표적
NfκB 전사인자인터루킨-5 수용체 (IL-5R)인터루킨-3 수용체 (IL-3R)인터루킨-1β 수용체 (IL-1βR)트립타아제(Tryptase)β2-아드레날린성 수용체 키나제엔도세린 수용체 B브래디키닌(bradykinin) B2수용체(B2B)인터루킨-1 (IL-1)인터루킨-9 (IL-9)인터루킨-11 (IL-11)유도성 일산화질소 신타아제세포내 흡착 분자 1 (ICAM-1; intracellular Adhesion Molecule 1)란테츠(Rantes)시클로옥시게나아제-2(COX-2)단구 활성 인자(monocyte Acting factor)호중구 엘라스타제무스카리닉 아세틸콜린 수용체종양 괴사 인자 α(Tumor necrosis factor)포스포디에스터라아제 IV서브스턴스 P 수용체치마제(chymase)인터루킨-2 (IL-2)인터루킨-12 (IL-12)인터루킨-6 (IL-6)인터루킨-8 (IL-8)인터루킨-7 수용체(IL-7R)인터루킨-14 수용체(IL-14R)CCR-2 CC 케모카인 수용체CCR-4 CC 케모카인 수용체 인터루킨-8 수용체 (IL-8R)인터루킨-4 수용체 (IL-4R)인터루킨-1β 수용체 (IL-1βR)에오탁신(Eotaxin)주요 기본 수용체(Major Basic Receptor)엔도세린 수용체 A (endotherial receptor A)프리프로엔도세린 (preproendothelin)IgE (고친화 수용체)인터루킨-1 수용체 (IL-1R)인터루킨-9 수용체 (IL-9R)인터루킨-11 수용체 (IL-11R)시클로옥시게나아제 (COX; Cyclooxygenase)혈관 세포 흡착 분자(VCAM; vascular celluar adhersion molecule)내피성 백혈구 흡착 분자(ELAM-1; endothelial Leukocyte Adhesion Molecule)GM-CSF, 엔도세린-1(Endothelin-1)호중구 케모타틱(chemitactic) 인자디펜신 1, 2, 3혈소판 활성 인자(Platelet Activating factor)5-리폭시게나아제서브스턴스 P히스타민 수용체CCR-1 CC 케모카인 수용체인터루킨-4 (IL-4)인터루킨-5 (IL-5)인터루킨-7 (IL-7)인터루킨-12 수용체(IL-12)인터루킨-1 (IL-1)인터루킨-14 (IL-14)CCR-3 CC 케모카인(chemokine) 수용체CCR-5 CC 케모카인 수용체
표 1: 폐 질환 또는 통증(천식/염증) 표적(계속)
프로스타노이드 수용체호중구 흡착 수용체인터루킨-15 (IL-15)인터루킨-11 (IL-11)NFAT 전사인자MIP-1αMCP-3사이클로필린 (A, B 등)기본 섬유아세포(fibroblast) 성장 인자CSBP/p38 MAP 키나제PDG2인터루킨-10(IL-10)FK506-결합 단백질파이브로넥틴cMad CAM-1PECAM-1C3biE-셀렉틴CD-34p150,95퓨코실 트랜스퍼라아제CD-18/CD11aICAM2 및 ICAM3CCR3 (에오탁신 수용체)LTB-4단백질 키나제 C타치키닌넨(tachykinninen) 수용체 (tach R)인터루킨-2 수용체 (IL-2R)STAT 6NF-인터루킨-6 (NF-IL-6)인터루킨-3(IL-3)인터루킨-13(IL-13)인터루킨-14(IL-14)인터루킨-16(IL-16)메둘라신 (Medullasin) GATA-3 전사 인자MAP 키나제인터루킨-15 수용체(IL-15R)인터루킨-11 수용체 (IL-11R)STAT 4MCP-2MCP-4포스포리파아제 A2메탈로프로테인아제트립신 수용체인터루킨-3(IL-3)시클로스포린 A-결합 단백질α4β1 셀렉틴(selectin)α4β7 셀렉틴LFA-1(CD11a/CD18)LFA-1 셀렉틴PSGL-1P-셀렉틴L-셀렉틴Mac-1(CD11b/CD18)VLA-4CD11b/CD18C5aCCR1, CCR2, CCR4, CCR5AP-1 전사인자시스테이닐 루코트리엔 수용체IκB 키나제 1 및 2(예를 들면, 서브스턴스 P, NK-1＆ NK-3 수용체)c-mas인터루킨-10 수용체(IL-10R)인터루킨-2 수용체(IL-2R)인터루킨-12 수용체(IL-12R)인터루킨-6 수용체(IL-6R)인터루킨-13 수용체(IL-13R)인터루킨-16 수용체(IL-16R)
표 1: 폐 질환 또는 통증(천식/염증) 표적(계속)
아데노신 A1수용체 (A1R)아데노신 A2b수용체 (A2bR)β 트립타아제아데노신 A2a수용체 (A2aR)Fc-엡실론 수용체 CD23 항원IgE 수용체 Fc 엡실론 수용체 (IgERFcξR)히스티딘 디카르복실라아제프로스타글란딘 D 신타아제호산구 유도 뉴로톡신내피성 일산화 질소 신타아제호중구 옥시다아제 인자대식세포 염증성 단백질-1-알파/란테츠 수용체엔도세린 수용체 ET-B 트립타아제-I아데노신 A3수용체 (A3R)IgE 수용체 β 서브유닛 (IgE Rβ)IgE 수용체 α 서브유닛 (IgE Rα)서브스턴스 P 수용체트립타아제-1호산구 양이온성 단백질호산구 퍼옥시다아제내피성 단구 활성 인자카뎁신(cathepsin) G인터루킨-8 수용체 α 서브유닛(IL-8 R α)서브스턴스 P엔도세린 ETA 수용체
G와 C로 이루어진 군으로부터 선택된 최소한 4개의 계속적인 핵산을 가진 표적 핵산의 단편들을 선택하는 단계 및 선택된 단편을 포함하고 약 15%까지의 G와 C 핵산 함량을 갖는 4 내지 60개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 일차 뉴클레오타이드를 얻는 단계로부터, 본 발명의 올리고들을 얻을 수 있다. 그 다음 단계는, 선택된 단편에 대한 안티센스인 서열을 포함하는 4 내지 60개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 이차 올리고뉴클레오타이드를 얻는 것이다. 상기 이차 올리고뉴클레오타이드는 15%까지의 아데노신 함량을 갖고 있다. 또한, 이러한 방법은, 선택된 단편이 적어도 하나의 티미딘 염기를 포함할 때, 안티센스 단편의 해당 뉴클레오타이드에있는 아데노신 염기를, 티미딘 염기에 결합하나 길항제 활성을 가지고 아데노신 A1, A2b, A3수용체들에서 약 0.3의 아데노신 염기 아고니스트 활성을 갖는 헤테로 방향족 염기들, 및 아데노신 A2a수용체에서는 어떤 활성을 가지지 않거나, 아고니스트 활성을 가진 헤테로 방향족 염기들로 이루어진 군으로부터 선택된 일반적인 염기로 치환하는 단계를 포함한다. 헤테로 방향족 염기 유사체는 O, 알로, NH2, SH, SO, SO2, SO3, COOH 및 분지되고 융합된 1차 및 2차 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로아릴, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알콕시, 알케놋시, 아실, 사이클로아실, 아릴아실, 알키놀시, 사이클로알코시, 아로일, 아릴티오, 아릴설폭실, 아키닐알릴, 아릴아킬, 아릴알케닐, 아릴아키닐, 알릴사이클로아킬로 치환될 수 있고, O, 할로, NH2, 1차, 2차, 3차 아민, SH, SO, SO2, SO3, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴로 더 치환될 수 있는, 피리미딘들 및 퓨린들 모두로부터 선택될 수 있다. 피리미딘들 및 퓨린들은 이 기술에서 알려진 모든 위치에서 치환되어질수 있으나, 1,2,3,4,7, 및/또는 8의 위치에서 치환되는 것이 바람직하다. 더욱이, 화학식 1을 갖는, 티오필린, 카페인, 디필린, 에토필린, 아세필린 파이퍼라진, 바미필린, 엔프로필린 및 크산틴와 같은 피리미딘들 및 퓨린들이 바람직하다.
여기서, R1, R2는 독립적으로 H, 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, R3는 H, 아릴, 디사이클로알킬, 디사이클로알케닐, 디사이클로알키닐, 사이클로알킬, 사이클로아케닐, 사이클로알키닐, O-사이클로알킬, O-사이클로알케닐, O-사이클로아키닐, NH2-알킬아미노-케톡시알킬로시-아릴, 모노 및 디아킬아미노아킬-N-아킬아미노-SO2아릴이다.
바람직한 T 함량을 가진 분획들이가 없었을 때, 또는 원하는 분획이 T 함량을 포함하는 경우, 본 발명자는, 표적 RNA에 있는 티미딘들(T)에 대응하는 안티센스 올리고드의 아데노신 함량을 감소시켜, 올리고뉴클레오타이드 서열로부터 약 15% 이하 또는 완전히 제거된 A가 되도록하였고, 이러한 방법으로, 그들의 분해산물들이 페 조직 주위안으로 아데노신이 자유롭게 다니게 되어, 환자의 병을 악화시키거나 투여된 작용제의 유용한 효과를 감소시키지 못하도록 하였다.
실시예의 방법에 의해, NfκB 전사인자가 1차 표적으로 선택될 수 있고, 데스티미딘(desT) 분획들이 찾아질 수 있다. 수많은 desT가 찾아졌을 때, 안티센스 분획이 추론될 수 있고, 아마도 약 20이상의 desA 안티센스 서열을 얻을 수 있다. 이러한 안티센스 서열들은, 가능한 경우, 1차 표적의 mRNA에서 찾아진 모든 desA 안티센스 서열을 나타내고, 상기 표 1 또는 하기 표2에서 보여진 것과 같은 2차 표적의 바람직한 목록안에서 또는 GENBAND와 같은 서열 데이터 염기안에서 동종성있는 서열들의 탐색을 시작하는데 사용될 수 있다. NFκ 전사인자에 대해 찾아진 약 20개의 천연 desA 안티센스 서열의 각각에 대해, 전형적으로 약 10 내지 30개의 동종성 서열들이, 상기 표1에서 보여진 군의 다른 요소들 사이에서 찾아질 수 있다(2차, 3차, 그와 같은 표적). 몇 개의 예에서는, 탐색을 통해, 2차표적(1차 표적과 다른 표적 mRNA으로부터 나온 서열 사이에서의 동종성)뿐만이 아니라, 3차 표적(예를들면, 3개의 다른 표적 mRNA로부터 나온 서열과 1차 표적 사이의 동종성)과, 1차 표적에 대한 동종성을 제공한다. 그러나, 후자의 경우는 극히 드물다. 이것이 발생할 경우, 찾아진 안티센스 올리고들은 100% 동종성이 있다고 말할 수 있다. 그러나, 찾아진 서열들은 2차, 3차, 또는 4차 서열들 안에는 전혀 동종성이 없는 뉴클레오타이드들 몇 개를 포함하고 있다. 많은 경우에서, 이런 불일치는 충분히 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 덜 활성화되게하거나 표적에 대해 전혀 활성이 없도록 할 수 있다. 몇몇 경우에, 하나의 비동종성 뉴클레오타이드의 존재가로도 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 활성을 저하시키기에 충분하다. 소위 "동종성이 있는" 서열이 불일치하였을 때, 40%까지, 바람직하게는 최대 약 30%, 더욱 바람직하게는 최대 20%, 더 바람직하게는 최대 10% 불일치 서열이 용인될 수 있다. 몇몇 경우에, 더 높은 %의 불일치가 용인되고,
비-동종성 뉴클레오타이드가, 자연적인 DNA에 존재하는 4개의 염기(A, G, T, 및 C)중 2개이상과 유사 또는 동일한 친화성(affinity)를 가지고 염기쌍을 이룰 수 있는 "일반적"인 염기로 "고쳐지거나" 대치될 수 있기 때문에, 올리고들은 여전히 활성이 있다. 상기 "고치는 단계"는 부가적으로 신규한 서열을 생성한다. 상기 서열은 자연에서 찾아진 것과는 다르고, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가, 바람직하게는 동일하게 잘, 제 1차 표적, 제 2차 표적, 제 3차 표적, 등과 결합하도록 한다.
NfκB 전사인자가 표적으로 선택되었을 때, 그것의 mRNA 또는 DNA는 낮은 티미딘(T) 또는 데스티미딘(desT) 단편들을 위해 검색된다. 상보가닥으로 desA 안티센스를 차례로 생산할 mRNA 또는 DNA의 desT 분획만 선택된다. 수 많은 RNA desT 분획이 찾아졌을 때, 안티센스 분획의 서열이 추론된다. 전형적으로, 약 10 내지 30 및 심지어 더 많은 수의 desA 안티센스 서열이 얻어질 수 있다. 이러한 안티센스 서열은, 상기 표1 또는 하기 표2에서 보여진 것과 같이, 표적의 mRNA의 desT 분획에 대응하는 일부 또는 모든 desA 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이것이 발생했을 때, 찾아진 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 100% A가 없다고 말할 수 있다. 원래의 desA 각각에 대해, 표적유전자, 예로서 NFκB 전사인자에 대응하는 약 10 내지 30개의 서열들의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열은 적은 함량의 티미딘(RNA)을 가진 표적유전자 또는 RNA안에서 찾아질 수 있다. 본 발명에 따라, 선택된 단편 서열들은 또한 2차 또는 3차 또는 4차 서열안에 적은 수의 티미딘(RNA)를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 많은 아데노신 함량은 안티센스 올리고뉴클FP오타이드가 덜 활성화되거나 심지어 표적에 비활성화 되도록 할 수 있다. 본 발명에 따라, 이러한 소위 '전체적으로 desA가 없는' 서열은 15%보다 적은 아데노신 함량을 가지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10%보다 더 적게 가지고, 더 바람직하게는 5%보다 작게, 심지어는 2%보다도 작게 가지는 것이 바람직하다. 몇몇 경우에 더 높은 아데노신 함량이 용인되며, 올리고뉴클레오타이드는 여전히 활성화되고, 특히 이때, 아데노신 뉴클레오타이드는 자연에 존재하는 4개의 뉴클레오타이드(A, G, T, 및 C)의 두 개 이상에 유사한 또는 동일한 친화성(affiniy)를 가지고 염기쌍을 이룰 수 있는 '일반적인' 염기를 가지고 고쳐지거나 치환될 수 있다. 일반적인 염기는 티미딘과 하이브리드화하는 능력을 가지고, 바람직하게는 실질적으로 아데노신 수용체와 결하는 능력을 줄이거나, 부족한 어떠한 화합물, 더 일반적으로 아데노신 유사체로서 이 특허에서 정의되어진다. 또한, 아데노신 A1, A2b, 및/또는 A3수용체, 가장 바람직하게는 A1수용체와 같은 아데노신 수용체를 활성화시키지 못하게하는 아데노신 유사체가 사용되어질 수 있다. 일반적인 염기의 한 예는 α-디오시리보퓨라노솔-(5-니트로인돌)이고, 전문가들은 다른 예들을 선택하는 방법을 알고 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 바람직하게는 동일하게 표적 RNA와 결합하게 하는 이 교정화단계는 더 새로운 서열을 만들어낸다. 일반적인 염기의 예로는 2-디옥시리보실-(5-니트로인돌)이 있다. 일반적인 염기들의 다른 예로는 3-니트로피롤-2'-디옥시뉴클리오사이드, 5-니트로-인돌, 2-디옥시리보실-(5-니트로인돌), 2-디옥시리보퓨라놀실-(5-니트로인돌), 2'-디옥시이노신, 2'-디옥시네불라린, 6H,8H-3,4-디하이드로피리미도 [4,5c] 옥사킨-7-원 및 2-아미노-6-메속시아미노퓨린이 있다. 상기에 더하여, 줄어든 하이브리다이즈 능력을 가지지만 또 다른 염기로 치환될 수 있는 일반적인 염기는 3-니트로피롤 2'디옥시뉴클리오사이드, 2-디옥시리보퓨라노실-(5-니트로인돌), 2'디옥시이노신 및 2'디옥시네불라린등을 포함한다(Glen Research, Sterling, VA). 더 특이적으로, 특히 불일치 리페어는 구아닌(G)또는 아데닌(A)과 염기쌍을 이루는 "P" 뉴클리오사이드인 6H,8H-3,4-디하이드로피리미도[4,5c][1,2] 악사킨-7-원(one), 및 시스티딘 또는 티미딘과 염기쌍을 이루는 "K" 뉴클리오사이드인 2-아미노-메속시아미노퓨린을 사용하여 만들 수 있다.또한 이 기술분야에서 알려진 다른 것들도 적당하다. 예로서, Loakers, D. and Brown, D.M., Nucl. Acids Res. 22: 4039-4043(1994); Ohtsuka, E. et al., J. Biol. Chem. 260(5):2605-2608(1985); Lin, P.K.T. and Brown, D. M., Nucleic Acids Res. 20(19): 5149-5152(1992); Nichols, R. et al., Nature 369(6480): 492-493 (1994); Rahman, M.S. and Humayun, N.Z., Mutation Research 377(2): 263-268(1997); Amosova, O., et al., Nucleic Acids Res. 25(10): 1930-1934(1997); Loakes D. ＆ Brown, D.M., Nucleic Acids Res. 22(20): 4039-4043 (1994)를 보면, 일반적인 염기와 그들의 제법과 핵산 결합에서의 사용에 관련된 전체의 분야들이 이 참고문헌 안에 나와있다.
완전히 desT 서열이 자연적으로 표적에서 찾아지지 않을 때, 약 1에서 3의 일반적인 염기 치환이 100% "desA" 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 되도록 하기 위해, 그것들은 전형적으로 선택된다. 그러므로 본 방법은 A 함량이 적거나 또는 없는 다른 표적에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 하나 이상의 뉴클레오타이드, 예로서 약 1에서 3, 또는 그 이상이 "일반적인" 염기로 치환되어 교정되어진 안티센스뉴클레오타이드를 공급한다. 일반적인 염기는 이 기술에서 알려졌고, 여기서 나열될 필요는 없다. 기술자는 어떤 염기가 일반적인 염기로서 될 수 있고, A의 치환체로 될 수 있는지 알 것이다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드 연구제작의 본 접근은 낭모성 섬유증, 만성폐색성 폐질환, 만성 기관지염, 폐기관지 히퍼텐신을 포함하는 여러 염증 질환 및 폐로 전이된 유방암, 콜론 암, 호흡기 디스트레스 증후군, 프로스테이트 암, 췌장암, 신장암, 림포마, 멜라노마, 간세포성 카시노마 등의 암을 포함하는 암등을 포함하는 여러 다른 질병과 통증에 또한 이용될 수 있다.
본 명세서에서, 천식 또는 다른 호흡기 및 염증성 질환 또는 병의 "치료" 또는 "치료함"의 용어는 그러한 치료법을 받는 환자가 호흡기 또는 염증성 폐질환 또는 다른 폐 통증을 나타내는 것이 줄어드는 치료법에 관한 것이다. 용어 "다운 레귤레이트"는 표적된 세포내 단백질의 생산, 분비 또는 이용성에서의 감소 (즉, 농도의 감소)를 유도하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 척추동물, 그 부류중 인간 및 비인간 유인원을 포함하는 포유동물, 야생 및 가축 동물, 수중 및 육상 동물, 애완견, 및 예로서 고양이, 개, 말, 코끼, 및 고래를 포함한 동물원 동물에 일차적으로 관심을 가지고, 가장 바람직하게는 인간환자이다. 본 기술의 특별하게 알맞은 적용중 하나는 수의학에 관한 것이고, 야생 동물, 수중동물, 가축동물, 동물원 동물, 및 그와 같은 것은 모든 종류의 작고 큰 동물들을 포함한다. 표적된 유전자와 단백질은 포유동물의 것이 바람직하고, 표적된 서열은 치료할 환자의 것과 같은 종류인 것이 바람직하다. 많은 예들이 있을 지라도, 다른 종의 표적 RNA 또는 유전자가 투여체의 서열과 특히 45%이상의 동종성을 나타내는, 더욱 바람직하게는 85%이상의 동종성을 나타내는, 가장 바람직하게는 95%이상의 동종성을 나타내도 또한 적당하다. 작용제의 바람직한 부류는 desA이다. 또 다른 바람직한 부류는 완전히 desA가 아닌 올리고뉴클레오타이드도 포함하고, 하나 이상의 아데노신 염기는 일반 염기로 치환된다.
일반적으로 "안티센스"라는 용어는 작은, 합성체 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이고, 본 특허에서는 표적 메신저 RNA (mRNA)의 저해에 의해 유전자 발현을 저해하도록 적용된다(참조, Milligan, J. F. et al., J. Med. Chem. 36(14), 1923-1937(1993)에서 여기에 관련된 일부분을 참조하였다.). 아데노신 A1, A2a, A2d, 또는 A3수용체, CCR3 (또한 이오탁신 수용체로서 알려진 화합물 수용체 320), VCAM (혈관 세포 흡착 분자), 유노필(eonophil) 수용체, 브리디키닌 2B 수용체, 및 상기 표1에서 나열된 다른 많은 것들과 같은 표적 유전자의 유전자 발현을 본 작용제는 저해한다. 본 기술에서 알려진 것과 같이, 일반적으로 이것은 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 표적된 메신저 RNA (mRNA)의 코딩(센스) 서열과 하이브리드형성에 의해 얻어진다. 본 발명의 작용제가 세포 외에서 투여하는 것은, 표적 유전자에 의해 코딩된 mRNA 및 단백질의 수위를 감소시키고, 및/또는 투여된 세포의 성장 특성 또는 모양의 변화 원인이 된다(참조, Milligan et al. (1993); helene, C. and Toulme, J. Biochim. Biophys. Acta 1049, 99-125 (1990); Cohen, J.S. D., Ed., Oligodeoxynucleotide as anti-sense Inhibition of Gene Expression; CRC Press: Boca RAton, FL (1987)에서 여기에 관련된 일부분을 참조하였다.). 여기에서 사용된 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 (1)적당한 하이브리드 형성 환경에서 표적된 단백질을 코딩하는 mRNA의 분획과 하이브리드를 형성하는, 및 (2)하이브리드 형성으로 표적된 단백질의 유전자 발현량을 줄이게 하는, 합성 뉴클fp오타이드의 짧은 서열이다.
용어 "des-아데노신"(desA) 및 "des-티미딘" (desT)은 실제적으로 아데노신(desA) 또는 티미딘(desT)가 없는 올리고뉴클레오타이드를 말한다. 몇몇 경우에, desT 서열은 자연적으로 형성되고, 다른 경우에는 원치 않은 뉴클레오타이드(A)를 활성을 지니지 않은 다른 것으로 치환하여 만들어진다. 본 기술에서 알려진 바와 같이, 본 명세서의 치환은 일반적으로 A를 일반적인 염기로 치환하는 것에 의해 이루어진다.
표적 단백질의 mRNA는 단백질을 발현하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열로부터 유도될 수 있다. 예로서, 인간 유전자의 아데노신 A1수용체의 서열 및 쥐와 인간의 아데노신 A3수용체의 서열은 알려져 있다(참조, US Pat. No. 5,320,962; Zhou, F., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci.(USA) 89 : 7432(1992); Jacobson, M.A., et al., U.K. Pat. Appl. No. 9304582.1). 아데노신 A2b수용체 유전자의 서열이 알려져 있다(참조, Salvatore, C. A., Luneau, C. J., Johnson, R. G. and Jacobson, M., Genomics (1995), 에서 여기에 관련된 일부분을 참조하였다.). 많은 예시 표적 유전자의 서열이 또한 알려져 있다(참조, GenBank, NIH). 그러한 유전자의 서열이 아직 이용가능하지 않은 유전자의 서열은 본 기술에서 알려진 기술을 적용하여 펴적 분획을 분리하여 얻어낼 수 있다. 일단 유전자, 그것의 RNA, 및/또는 단백질의 서열이 알려졌을 때, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 본 발명에 따라 만들어질 수 있고, 표준 기술에 따라 표적 단백질의 발현을 줄일 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 호흡장해, 폐 염증반응, 기도 폐색, 기관지염, 및 그와 같은 질환 또는 통증에 관련된 단백질을 코딩하는 mRNA 분자의 부분 또는 분획과 특이적으로 결합하는 서열을 가진다. 이러한 결합의 효과로 대응하는 mRNA의 전이를 줄이거나 심지어 막을 수 있고, 환자의 폐에서 표적 단백질의 이용가능한 량이 줄어든다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 포스포다이에스터 잔기는 변형되거나 치환된다. 생체 내에서 올리고뉴클레오타이드의 안정성을 증가시키는 메틸포스포네이트, 포스포트리에스터, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 포스포라미데이트의 예에서처럼 변형된 또는 치환된 포스포다이에스터의 올리고뉴클레오타이드의 유사체 화학물질은 특히 바람직하다. 자연적으로 있는 올리고뉴클레오타이드의 포스포다이에스터 연결은 세포내에세 뉴클레아제에 의해 분해되기 쉽다. 이와 반대로, 여기에서 제안된 많은 잔기들중 대부분은 뉴클레아제 분해에 대해 높은 저항성을 가지고 있다. (참조, 상기Milligan et al., and Cohen, J. S. D.). 본 발명의 바람직한 다른 실시예에서, 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에서의 포스포다이에스터 연결을 뉴클레아제-저항 연결로 치환하기 위해"3'-말단 캡"을 올리고뉴클레오타이드에 더함으로서, 분해를 막을 수 있다 (참조, Tidd, D. M. and Warenius, H. M., Be. J. Cancer 60:343-350(1989); Shaw, J.P. et al., Nucleic Acids Res. 19: 747-750(1991),에서 여기에 관련된 일부분을 참조하였다.). 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 및 메딜포스포네이트 연결은 모두 이러한 방식으로 본 발명의 목적으로 충분히 기능할 수 있다. 포스포다이에스터 기골(backbone)을 확장 변형시키면, 형성된 작용제는 더 안정화되고, 많은 예에서 RNA의 친화성 및 세포 투과성이 더 놓아진다(참조, 상기 Milligan, et al.). 따라서, 변형 치환될수 있는 잔기의 수는 요구, 표적, 및 투여경로에 따라 다양하게 변할 수 있으며, 1에서부터 모든 잔기까지, 또는 그 사이 어떤 수라도 될 수 있다. 완전한 포스포다이에스터 기골을 새로운 연결로 바꾸는 많은 다른 방법들이 알려져 있다 (참조, 상기 Millikan et al.). 기골 유사체 잔기는 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스터, 티오포름아세탈, 포스포로디티오에이트, 포스포라미데이트, 포름아세탈, 보라노포스페이트, 3'-티오포름아세탈, 5'-티오에테르, 카보네이트, 5'-N-카바메이트, 설페이트, 설포네이트, 설파메이트, 설폰아마이드, 설폰, 설파이트, 2'-0 메틸, 설폭사이드, 설파이드, 하이드록시아마이??, 메틸렌(메틸이미노) (MMI), 및 메틸렌네오시(메틸이미노) (MOMI) 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. 자동적으로 올리고뉴클레오타이드가 합성되어도, 포스포로티오에티트 및 메틸포스포네이트-변형 올리고뉴클레오타이드가 그들의 이용성으로 특히 바람직하다 (참조, 상기 Milikan et al.). 적당하게, 본 발명의 작용제는 조제학적으로 용인되는 염, 및 안티 센스올리고뉴클리오타드와 그의 염의 혼합물의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 작용제는 한 표적 mRNA의 발현을 격감시키는 능력을 가지고, 및/또는 한 경로의 활성을 유도하거나 격감시키는 능력을 가졌다. 실시예의 방법으로, 표적 mRNA 또는 유전자로 티미딘(T) 또는 아데닌(A)가 낮은 디옥시뉴클레오타이드의 분획이 각각 약 7이상의 모노뉴클레오타이드인, 바람직하게는 약 60까지의 모노뉴클레오타이드인, 더욱 바람직하게는 약 10에서 36까지의 모노뉴클레오타이드인, 가장 바람직하게는 약 12에서 약 21 모노뉴클레오타이드인 모든 가능한 디옥시리보뉴클레오타이드를 확인하여 본 방법에서 사용될 수 있다. 이것은 티미딘이 낮거나 없는(RNA), 아데노신에 상보하는 뉴클레오타이드, 또는 아데노신이 낮은(유전자) 7이상의 뉴클레오타이드 길이를 가진 표적 서열내의 모노뉴클레오타이드를 검색하여 달성할 수 있다. 대부분의 경우에, 이런 검색에서 전형적으로 자연적으로 약 40%보다 적은 함량을 가진 또는 부족한 약 10에서 30의 서열, 및 펴균 약 1800 뉴클레오타이드 길이의 전형적인 표적 mRNA의 다야한 길이의 안티센스올리고 뉴클레오타이드의 결과가 나타났다. 높은 함량의 T 또는 A를 가진 것은 각각 하나이상의 A를 일반적인 염기로 치환하여 교정하였다.
본 발명의 작용제는 특별한 표적 및 수송방법에 따라 또한 다른 길이가 될 수 있지만, 본 발명의 작용제는 한계는 없으나 약 7에서 약 60뉴클레오타이드의 길이, 바람직하게는 약 12 내지 약 45의 길이, 더욱 바람직하게는 약 30 까지의 길이, 가장바람직하게는 약 21까지의 길이를 포함하는 적당한 길이가 될 수 있다. 본 발명의 작용제는 어떠한 및 모든 표적 RNA 분획을 가르킬 수 있다. 작용제의 하나의 바람직한 부류는 인트론 및 액손 사이의 접합부을 가르키는 것을 포함하는 mRNA 영역인 것을 포함한다. 작용제가 인트론/액손 간격을 가르킬 때, 그것의 접합부에 완전히 놓여지거나 충분히 접합부에 가까워, 예로서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 3' 또는 5' 말단에 약 2에서 10, 바람직하게는 3에서 5의 인트론/액손 접합부의 뉴클fp오타이드안에 위치되어서, 전구 mRNA가 성숙 mRNA로 가는 과정 동안 사이에 놓인 액손이 스플라이싱되어 없어지는 것을 저해한다. 또한, 개시코돈 및 코딩 영역의 5' 및 3' 말단 부근을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 바람직하다.
따라서, 이 다중-표적 안티센스(MTA) 올리고뉴클레오타이드의 접근은 낭모성 섬유증, 만성폐색성폐질환, 장기 기관지염 등의 다른 염증반응을 포함하는 다양한 질병과 통증에 적용된다. 이 기술이 효과적으로 적용되는 다른 특이적 질환과 통증에는 폐 히퍼텐신 및 암등이 있다.
하기 표2는 다중-표적 안티센스 (MTA) 올리고뉴클레오타이드가 효과적으로 적용될 수 있는 많은 표적을 나타낸다. 다른 것도 또한 표적 될 수 있다.
표 2 : 암 표적
형질변환 온코진(transforming Oncogene) 치료 표적
rassrcmycbcl-2 티미딜레이트 신데타아제(synthetase)티미딜레이트 신데타아제디하이드로폴레이트(digydrofolate)환원효소티미딘 키나제디옥시시티딘 키나제리보뉴클레오타이드 환원효소
암 치료의 표적의 부류는 다른 형태의 암, 또는 일반적으로 맬리그넌스와 관련되어 알려진 것 중에 조절인자 혹은 RNA 및/또는 단백질의 생산을 포함한 것에 관련된 유전자이다. 다음에만 국한되지 않지만, ras, src, myc 및 bcl-2등의 형질전환 종양유전자가 그 예이다. 다른 표적은 절대적이지는 않지만, 다른 표적은 암의 화학치료 작용제가 우선적으로 디미딜레이트 신데타아제, 디하이드로폴레이트 환원효소, 티미딘 키나제, 디이옥시스티딘 키나제, 리보뉴클레오타이드 환원효소와 같은 다양한 효소를 가르킬 수 있는 것들이다. 화학요법 및 방사선치료등과 같은 치료법은 일반 살아있는 세포를 황폐화시키는 것을 막기는 하지만, 종래의 암 치료는 선택적으로 암세포를 죽이는 해결되지 않는 문제에 직면하고 있어, 본 기술은 매우 중요하다. 본 기술은 다중 경로를 동시에 격감시키거나 유도하는 능력을 지니고 있다. 이 접근은 일반세포에서 동시에 발현되지 않는 일차, 이차 및 가능하다면 3차 표적을 포함한 다중 경로의 혼합 선택을 허락하기 때문에 상당한 이익을 지닌다. 따라서, 본 발명의 작용제는, 예로서, 환자에게 투여하여 모든 세 종류의 표적을 모두 발현한 종양세포에서만 독성을 증가시키게 하고, 일반 세포에서는 하나 혹은 둘의 표적만을 발현하여 상당히 덜 영향을 받거나 또는 심지어 대부분 살아남게 된다.
표적 유전자, 유전자 인접 영역, 시작 우너점, 인트론-액손 보더, 및 그와 같은에 상보하는 RNA를 포함하는 부류, 또는 mNRA 코딩 영역, 비코딩 RNA 분획, 5'-말단 및 3'-말단, 예로서 폴리-A 분획 및 코딩 및 비코딩 영역 사이의 가까운 부분(juxta-section)을 표적하는 올리고등을 포함하는 전구 RNA의 완전한 서열, 및 하나 이상의 질환 또는 질병 또는 이들의 혼합과 관련된 것으로 알려진 단백질은 코딩하는 RNA로부터 선택된 두 개이상의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 작용제를 본 발명에서 제공한다.
본 발명에 따라 투여된 작용제는 투여될 종이 원래종에 관련된 표적 유전자 및/또는 안티센스로 설계되는 것이 바람직하다. 인간에게 처리했을 때, 본 작용제는 인간 유전자 또는 RNA의 안티센스로 설계하는 것이 바람직하다. 본 발명의 작용제는 자연적으로 형성된 DNA 및/또는 RNA 서열인 올리고뉴클레오타이드, 그것 중 표적된 서열보다 일(1) 염기의 길이가 작고 바람직하게는 7 뉴클리오다이드 길이를 가진 단편, 약 0.02%, 바람직하게는 약 0.01%, 더욱 바람직하게는 약 1%, 더욱 바람직하게는 약 4%까지 아데노신 뉴클레오타이드를 가지고, 위로는 약 30%까지, 더욱 바람직하게는 15%까지, 더욱 바람직하게는 10%까지 및 가장 바람직하게는 5%의 아데노신 뉴클레오타이드를 가진 또는 아데노신이 부족한 올리고, 및 한 개이상의 아데노신 뉴클레오타이드가 소위 일반적인 염기로 바뀌어 티미딘과 염기쌍을 이루지만 시제적으로 아데노신 수용체 활성을 유도하는 올리고를 포함한다. 여기에 국한 된 것은 아니지만, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에대한 인간의 서열 및 단편의 예는 바람직하게 7, 10, 15, 18에서 21, 24, 27, 30, n-1을 포함하는 전체 유전자 또는 서열을 코딩하는 서열, 액손, 및 인트론-액손 접합부의 단편 및 더짧은 단편의 분획이다.(여기서, n은 서열의 총 뉴클레오타이드 수이다.) 예로서, 이들 단편들은 더 긴 올리고의 어떤 부분으로부터, 중간, 5'-말단, 3'-말단, 또는 원래 서열의 어떤 다른 곳의 시작으로부터 선택되어진다. 단편은 낮은 아데노신 뉴클레오타이드 함량을 가지는 것이 중요하고, 이들 단편들은 30%보다 작게, 더욱 바람직하게는 15%보다 작게, 더욱 바람직하게는 10%보다 작게, 더욱 바람직하게는 5%보다 작게, 가장 바람직하게는 선택적으로 또는 본 발명에 따라 일반적인 염기로 바꾸는 것에 의해 아데노신의 함량을 없게 한다. 본 발명의 작용제는 서열에 하나 이상의 아데노신이 있어 예시에서처럼, 일반적인 염기(B)에 의해 바꾼 가장 바람직한 서열 부류 및 단편을 포함한다. 유사하게, 아데노신을 B로 치환하여 설계된 단편을 포함하고, 상기의 그러한 서열, 단편 또는 분획에 포함되 더짧은 B-포함 단편의 더짧은 단편을 또한 모두 포함한다.서열과 단편의 제한된 나열은 하기에서 나타내었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열 단편의 일부 예들은 각각의 유전자의 개시코돈을 표적하고, 몇몇 경우에 아덴노신은 "B"로서 나타낸 일반염기 아데노신 유사체로 치환하여, 아데노신 A1 및/또는 A3 수용체와의 결합 능력을 부족하게 했다. 하기 많은 예들은 개시코돈을 포함하는 하나의 그러한 서열 및 많은 단편을 나타내었고, 여기서 뉴클레오타이드의 수 n은 약 7, 약 10, 약 12, 약 15, 약 18, 약 21 이고 위로는 약 28, 약 35, 약 40, 약 50, 약 60인 것이 바람직하다.
한 실시예에서, 본발명의 MTA 올리고가 표적하는 mRNA중 적어도 하나는 전사인자, 촉진 및 활성 인자, 세포내 및 세포외 수용체 및 일반적인 펩티드 트랜스미터, 인터루킨, 인터루킨 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 내분비 특이 및 비특이 효소, 면역글로불린, 항체 수용체, 중추신경계(CNS) 과 말초신경 및 비신경계 수용체, CNS 및 말초신경 및 비신경계 펩티드 트랜스미터, 흡착 분자, 디펜신, 성장 인자, 바소액티브 펩티드 및 수용체, 및 결합 단백질, 그와 같은 단백질을 코딩하고; 또는 mRNA는 종양유전자 및 다양한 질환 및 질병과 관련된 다른 유전자에 대응한다. 표적 단백질의 예로는 특히, 에오탁신, 주요 기본 단백질, 프리프로엔도딜린, 유시노필 캐타이언닉 단백질, P-셀렉틴, STAT 4, MIP-1α, MCP-2, MCP-3, STAT 6, c-mas, NF-IL-6, 사이클로필린, PDG2, 사이클로스포린 A-결합 단백질, FK5-결합 단백질, 파이블로넥틴, LFA-1(CD11a/CD18), PECAM-1, C3bi, PSGL-1, CD-34, 서븐턴스 P, p150, 95, Mac-1(CD11b/18), VLA-4, CD-18/CD11a, CD11b/CD18, C5a, CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, 및 LTB-4이다. 그러나, 다른 것들도 또한 적당한 예가 될 수 있다.
또 다른 실시예에서, MTA 올리고가 표적하는 mRNA중 적어도 하나는 특히 교감신경 자극 수용체, 부교감신경 수용체, GABA 수용체, 아데노신 수용체, 브래디키닌 수용체, 인슐린 수용체, 글루카곤 수용체, 프로스타글란딘 수용체, 티로이드 수용체, 안드로겐 수용체, 아나볼릭 수용체, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 응고 캐스캐이드에 관련한 수용체, 아데노하이포피시얼 수용체, 아데노하이포피시얼 펩티드 트랜스미터, 및 히스타민 수용체(HisR)와 같은 세포내 및 세포외 수용체와 펩티드 전달물질을 코딩한다. 그러나 다른 것들도 또한 있을 수 있다. 코딩된 교감신경 자극 수용체 및 부교감신경 자극 수용체는 아세틸콜린에스터라제 수용체(AcChaseR), 아세틸콜린 수용체(AChR), 아트로핀 수용체, 무스카리닉 수용체, 에피네프린 수용체 (EpiR), 도파민 수용체(DOPAR), 및 노르에피네프린 수용체(NEpiR)등을 포함한다. 더 많은 인코딩 수용체의 예는 아데노신 A1수용체, 아데노신 A2b수용체, 아데노신 A3수용체, 엔도델린 수용체 A, 엔도델린 수용체 B, IgE 고친화 수용체, 무스카리닉 아세틸콜린 수용체, 서브스턴스 P 수용체, 히스타민 수용체, CCR-1 CC 켐모카인 수용체, CCR-3 CC 켐모카인 수용체 (에오탁신 수용체), 인터루킨-1β 수용체 (IL-1βR), 인터루킨-1 수용체 (IL-1R), 인터루킨-1β 수용체 (IL-1βR), 인터루킨-3 수용체(IL-3R), CCR-4 CC 켐모카이 수용체, 시스테인닐 루코트리엔 수용체, 프로스테노이드 수용체, GATA-3 전사인자 수용체, 인터루킨-1 수용체(IL-1R), 인터루킨-4 수용체(IL-4R), 인터루킨-5 수용체 (IL-5R), 인터루킨-8 수용체(IL-8R), 인터루킨-9 수용체 (IL-9R), 인터루킨-11 수용체(IL-11R), 브래디키닌 B2 수용체, 교감신경 자극 수용체, 부교감신경자극 수용체, GABA 수용체, 아데노신 수용체, 브래디키는 수용체, 인슐린 수용체, 글루카곤 수용체, 프로스타글란딘 수용체, 티로이드 수용체, 안드로겐 수용체, 아나볼릭 수용체, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 응고 캐스캐이드에 관련한 수용체, 아데노하이포피시얼 수용체, 아데노하이포피시얼 펩티드 트랜스미터, 및 히스타민 수용체(HisR)이 있다. 여기에 나열되지 않은 다른 것들도 또한 있을 수 있다.
본 발명에서 MTA올리고의 발전을 위해 인코딩된 효소는 신데타아제, 카이네이즈, 옥시데이즈, 포스파타아제, 리덕타아제, 폴리사카라이드, 트리글라이세라이드, 및 단백질 하이드로라아제, 에스터라아제, 에라스타아제, 및 폴리사카라이드, 트리글라이세라이드, 리피드, 및 단백질 신세이즈 등을 포함한다. 표적 효소의 예는 트립타아제, 유도 니트릭 옥사이드 신세이즈, 사이클로옥시지나아제(Cox), 맵 카이나아제, 유신필 퍼록시다아제, β2-아드레너직 수용체 카이네이즈, 루코트리엔 c-4 신세이즈, 5-리포옥시네이즈, 포스포디에스터라아제 IV, 메탈로프로테이네이즈, 트립타아제, CSBP/p35 맵 카이네이즈, 뉴트로필 엘라스타제, 포스포리파아제 A2, 사이클로옥시나아제 2 (Cox-2), 퓨코실 트랜스퍼라아제, 치마아제, 프론테인 카아나아제 C, 티미틸레이트 신데타아제, 디하이드로폴레이트 리덕타아제, 티미딘 카이나아제, 디옥시시티딘 카이나아제, 및 리보뉴클리오타이즈 리덕타아제 등이 있다. 그러나, 병 또는 통증에 관련된 효소는 본 발명의 표적으로 적당하다.
본 발명의 출원에 대한 알맞은 인코딩 인자들은, 특히, NfκB 전사인자, 그래뉼로사이트 마크로파지 콜러니 자극 인자(CM-CSF), AP-1 전사인자, GATA-3 전사인자, 모노사이트 활성인자, 뉴트로필 컴모타틱 인자, 그래뉼로사이트/마크로파지 콜러니-형성-인자(G-CSF), NFAT 전사인자, 혈소판 활성 인자, 종양 네크로시스 인자 α(TNFα), 및 기본 파이프로블라스트 성장인자 (BFGF)등이 있다. 심지어 상세하게 언급되지는 않았지만 본 발명에 다른 인자가 있을 수 있다. 본 발명에서 사용한 알맞은 흡착 분자는 세포내 흡착 분자 1 (ICAM-1), 2(ICAM-2), 및 3(ICAM-3), 혈관 세포 흡착 분자(VCAM), 언도테리얼 루코사이트 흡착 분자-1(ELAM-1), 뉴트로필 흡착 수용체, 및 CAM-1, 및 그와 같은 것이 있다. 다른 알려진 및 알려지지 않은 인지 (이 시점에서)는 또한 본 명세서에서 또한 표적될 수 있다. 사이토카인, 림포카인 및 켐모카인 중에서 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-11(IL-11), CCR-5 CC 켐모카인, 및 란테츠(Rantes)가 바람직하다. 그러나, 치료되어야 할 특이 질환 또는 질병, 또는 염증과 같은 일반적인(generic)의 활성에 대해 포함되어진 것으로 알려진 다른 것들도 표적으로 될 수 있다. 본 발명의 사용에 대한 디펜신의 예로 디펜신 1, 디펜신 2, 및 디펜신 3, 셀렉틴으로 α4β1 셀렉틴, α4β7 셀렉틴, LFA-셀렉틴, E-셀렉틴, P-셀렉틴, L-셀렉틴이 있다. 모든 것을 포함하지는 않지만, 온코진의 예로는 ras, src, myc, 및 bcl-2r kdlT다. 그러나 본 발명의 사용에 다른 것들도 적당하다.
본 발명에 따라 투여될 작용제는 투여될 종과 같은 종에 관련된 표적 유전자 및/또는 mRNA에 대한 안티센스로 설계되는 것이 바람직하다. 인간에게 처리했을 때, 본 작용제는 인간 유전자 또는 RNA에 대한 안티센스로 설계되는 것이 바람직하다. 본 발명의 작용제는 자연적으로 형성된 DNA 및/또는 RNA 서열인 올리고뉴클레오타이드, 그것 중 표적된 서열보다 일(1) 염기의 길이가 작고 바람직하게는 7 뉴클리오다이드 길이를 가진 단편, 약 0.02%, 바람직하게는 약 0.01%, 더욱 바람직하게는 약 1%, 더욱 바람직하게는 약 4%까지 아데노신 뉴클레오타이드를 가지고, 위로는 약 30%까지, 더욱 바람직하게는 15%까지, 더욱 바람직하게는 10%까지 및 가장 바람직하게는 5%의 아데노신 뉴클레오타이드를 가진 또는 아데노신이 부족한 올리고, 및 한 개이상의 아데노신 뉴클레오타이드가 소위 일반적인 염기로 바뀌어 티미딘과 염기쌍을 이루지만 시제적으로 아데노신 수용체 활성을 유도하는 올리고를 포함한다. 여기에 국한 된 것은 아니지만, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에대한 인간의 서열 및 단편의 예는 바람직하게 7, 10, 15, 18에서 21, 24, 27, 30, n-1을 포함하는 전체 유전자 또는 서열을 코딩하는 서열, 액손, 및 인드론-액손 접합부의 프래그 먼트 및 더짧은 단편의 분획이다.(여기서, n은 서열의 총 뉴클레오타이드 수이다.) 예로서, 이들 단편은 더 긴 올리고의 어떤 부분으로 부터, 중간, 5'-말단, 3'-말단, 또는 원래 서열의 어떤 다른 곳의 시작으로부터 선택되어진다. 단편은 낮은 아데노신 뉴클레오타이드 함량을 가지는 것이 중요하고, 이들 단편은 30%보다 작게, 더욱 바람직하게는 15%보다 작게, 더욱 바람직하게는 10%보다 작게, 더욱 바람직하게는 5%보다 작게, 가장 바람직하게는 선택적으로 또는 본 발명에 따라 일반적인 염기로 바꾸는 것에 의해 아데노신의 함량을 없게 한다. 본 발명의 작용제는 서열에 하나 이상의 아데노신이 있어 예시에서처럼, 일반적인 염기(B)에 의해 바꾼 가장 바람직한 서열 부류 및 단편을 포함한다. 유사하게, 아데노신을 B로 치환하여 설계된 단편을 포함하고, 상기의 그러한 서열, 플그먼트 또는 분획에 포함되 더 짧은 B-포함 단편의 더짧은 단편을 또한 모두 포함한다.서열과 단편의 제한된 나열은 하기에서 나타내었다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열 단편의 일부 예들은 각각의 유전자의 개시코돈을 표적하고, 몇몇 경우에 아덴노신은 "B"로서 나타낸 일반염기 아데노신유사체로 치환하여, 아데노신 A1 및/또는 A3 수용체와의 결합 능력을 부족하게 했다. 하기 많은 예들은 개시코돈을 포함하는 하나의 그러한 서열 및 많은 단편을 나타내었고, 여기서 뉴클레오타이드의 수 n은 약 7, 약 10, 약 12, 약 15, 약 18, 약 21 이고 위로는 약 28, 약 35, 약 40, 약 50, 약 60인 것이 바람직하다.
인간 수용체-관련 안티센스 폴리뉴클레오타이드
인간 효소-관련 안티센스 폴리뉴클레오타이드
인간 인자 관련 안티센스 올리고뉴클레오타이드
인간 아데노신 A1수용체 안티센스 올리고 뉴클레오타이드 단편들
인간 아데노신 A2a 수용체 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 아데노신 A2b 수용체 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 아데노신 A3 수용체 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 IgE 수용체 β안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 Fc-ζ 수용체 CD23 항원 (IgE 수용체)
안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 IgE 수용체 α안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 IgE 수용체(Fc 엡솔론 R) 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 히스티딘 디카르복실라아제 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 베타 트립타아제 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 트립타아제-Ⅰ 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 프로스타글라딘-D 신타아제 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 시클로옥시게네이즈-2 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 호산구 양이온성 단백질 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 호산구 유도 뉴우로톡신 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 호산구 퍼옥시다아제 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 세포내 아데노신 분자-1(ICAM-1)
안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 혈관 세포아데노신 분자-1(VCAM-1) 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 내피성 백혈구 흡착 분자
(ELAM-1)안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 P 셀렉틴 단편들
인간 내피성 단구 활성 인자 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 IL3*안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 IL3 수용체 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 IL-4 수용체 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 IL-4 수용체 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 IL5*수용체 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 IL-5 수용체 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 IL-6 수용체 단편들
인간 IL-6 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 단구-유도 호중구 케모타틱 인자 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 호중구 엘라스타제(메둘라신) 인자 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 호중구 옥시다아제 인자 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 카뎁신 G 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 디펜신 1 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 디펜신 3 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 대식세포 염증성 단백질-1 알파/란텐츠 수용체 인자 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
란텐츠 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 무스카리닉 아세틸콜린 수용체 HM1*안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 무스카리닉 아세틸콜린 수용체 HM3*안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 피브로넥틴*안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 인터류킨-8*안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 IL-8 수용체 알파 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 GM-CSF 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 종양 괴사 인자 α안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 류코드리엔 C4 신타아제 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 엔도세린-1 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
엔도세린 수용체 ET-B 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
엔도세린 ETA 수용체 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
서브스턴스 P 안티센스 올리고뉴클레오타이드 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
서브스턴스 P 수용체 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
치마제 안티센스 올리고뉴클레오타이드 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
내피성 일산화질소 신타아제 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
유도성 일산화질소 신타아제 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
NF-kB 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 주요 기본 단백질 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
인간 호산구 주요 기본 단백질 단편들
BP-1 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
C/EBPβ 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
여기에서, B는 아데노신이나, 아데노신을 바꾼 것 및 일반적인 염기이며, 아데노신 A2a수용체 아고니스트, 아데노신 A2b길항제, 아데노신 A3수용체 길항제, 또는 아데노신 A1수용체 길항제인 것이 더욱 바람직하다.
브래드키닌 수용체 안티센스 올리고뉴클레오타이드 단편들
바람직한 실시예에서, 이웃 모노뉴클fp오타이드 사이의 연결이 포스포다이에스터 연결이다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드(들)의 적어도 하나의 모노뉴클레오타이드 포스포다이에스터 잔기는 메틸포스포네이트, 포스포트리에스터, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보라노포스페이트, 포름아세탈, 티오포름아세탈, 디오에테르, 카보네이트, 카바메이트, 설페이트, 설포네이트, 설파메이트, 설폰아마이드, 설폰, 설파이트, 설폭사이드, 설파이드, 하이드록실아민, 2'-O-메틸, 멩틸렌(메틸이미노), 메틸렌옥시 (메틸이미도), 포스포라미데이트 잔기, 및 그의 결합으로 된 것으로 치환된다. 하나 이상의 다른 잔기로 치환된 하나 이상의 포스포다이에스터 잔기를 가진 MTA 올리고는, 이들 잔가가 포스포다이에스터 잔기보다 더 가수분해에 저항적이어서, 더 오래 지속되는 것이다. 몇몇 경우에는 약 10%, 약 30%, 약 50%, 약 75%, 및 심지어는 모든 포스포다이에스터 잔기(100%)가 전부 치환되어 질 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 다중 표적 안티센스 오릴고뉴클레오타이드(MTA 올리고)는 약 7 모노뉴클레오타이드, 몇몇 경우에는 60 및 그 이상의 모노뉴클레오타이드까지를 포함하고, 바람직하게는 약 10 내지 약 36, 더욱 바람직하게는 약 12내지 약 21 모노뉴클레오타이드를 포함한다. 그러나, 표적 고분자의 길이에 따라, 다른 길이가 또한 적당할 수 있다. 본 발명의 MTA 올리고의 예는 하기 표 3에서 나타나있고, 96개의 서열을 포함한다. (SEQ ID NOS: 2317 내지 2411).
[표 3a] MTA 올리고들, 표적화된 위치 및 표적
[표 3b] MTA 올리고들, 표적화된 위치 및 표적
[표 3c] MTA 올리고들, 표적화된 위치 및 표적
[표 3d] MTA 올리고들, 표적화된 위치 및 표적
MTA 올리고 표 3 은 하기 표 4에서 나열된 2개 이상의 표적들과 같이 사용되어지기에 적합하다.
표 4: 표 3의 MTA 올리고의 표적
화합물 표적
EPI 2010 아데노신 A1수용체
EPI 2045 아데노신 A3수용체
EPI 2873, EPI 2193 NFκB
EPI 1873 인터루킨-1
EPI 1857 인터루킨-5
EPI 2945 인터루킨-4
EPI 2977 인터루킨-8
EPI 2031 5-리폭시게나아제
EPI 1898 루코트리엔 C-4 신타아제
EPI 1856 에오탁신
EPI 1131 ICAM
EPI 1085 VCAM
EPI 2085 TNFα
EPI 1908 PAF
EPI 1925 IL-4 수용체
EPI 2643 β2아드레날린성 수용체 키나제
EPI 2934 트립타아제
EPI 2033 주요 기본 단백질
EPI 2795 호산구 퍼옥시다아제
NfκB : 핵 인자 κB (nucleat factor κB)ICAM : 세포내 흡착 분자 (intracellular adhesion molecule)VCAM : 혈관 세포 흡착 인자 (vascular cell adhesion molecule)TNF : 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor)PAF : 혈소판 활성인자 (platelet activating factor)
폐에서 쓰여지는 대부분의 바람직한 실시예에서, 이 MTA 올리고의 발명은 데스아데노신 올리고뉴클레오타이드(desadenosine oligonucleotide)에서 자연적인 데스싸이미딘 서열(desthymidine sequence)에서의 안티센스와 발명과 일치하는 하나 이상의 전반적인 염기서열의 치환에 의한 것을 포함한다. 염기서열의 치환 방법이나 특정 염기서열의 올리고 뉴클레오타이드 합성방법, 전반적인 염기들중 어떤 염기를 차용할 것인가에 대해서는 아트(art)에 알려졌으며 아티즌(artisan)에서 알려져 있으므로 여기서 더 이상 언급할 필요 없다. 발명의 작용제(agent)에 대한 좀더 자세한 실시예와 MTA 올리고는 작용제(agent)나 활동적으로 살아있는 세포에 의해 수용되어지는 분자에 연결된다. 이같은 방법으로 발명 작용제의 흡수는 아트에서 알려진 바와 같이 강화된다. 작용제들의 예나 이 발명에서의 MTA 올리고의 사용에 적합한 분자들은 트랜스페린(transferrin), 아시알로글라이코프로틴(asialoglycoprotein), 그리고 스텝타비딘(steptavidin)이다. 다른 것들도 물론 적당하다.
여기서의 작용제들은 타겟 mRNA의 발현을 억제하는 충분한 효과를 가진 것들을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense nucleotide) 조제학적 구성에 의한 것이며, mRNA의 전이을 억제하기 위해서 세포막을 통과하거나 세포에서의 타겟 mRNA와 특별히 결합하는 것을 통과시키는 것 또한 이 발명의 또다른 면이다. 그런 구성들은 적당한 조제학적 운반자, 예를들어 sterile pyrogen-free saline solution, 같은 것에 의해 제공된다. 발명의 작용제는 약학적으로 수용성 운반자에 의해 운반되어질수 있는 리포좀과 같이 세포막을 통과할 수 있는 하이드로포빅 운반자와 합성되어질 수 있다. 그 올리고뉴클레오타이드들은 비활성화된 라이보자임과 같은 mRNA와 함께 ??어지기도 한다. 그러한 올리고뉴클레오타이드들은 특정한 수용체, 효소들 및/또는 단백질들, 및/또는 요소들의 작용을억제시키는 역할의 필요에 의해 운영되어질 수도 있다. 약학적 합성은 세포에의해 수용되어진다고 알려져있는 분자들에 부착된 안티센스 올리고 뉴클레오타이드들을 포함하는 화학적 분자들 또한 포함한다. 이같은 올리고뉴클레오타이드 합성체들은 올리고뉴클레오타이드의 세포내 농도를 증가시키기 위한 세포 수용기작들을 이용한다. 이같은 방법에서 사용되어지는 분자들의 예로 여러 가지 것들중 트랜스페린, 아시알로글라이코프로틴(asialoglycoprotein)과 스트랩타비딘(streptavidin)과 같은 것들을 포함하는 거대분자들이 있다. 안티센스 합성체는 리포좀이나 마이크로크리스탈과 같은 지질의 소포들을 가지고 있는 약학적 합성체에 속한다. 이런 입자들은 유니라멜라나 복수라멜라와 같은 구조에 적합하다. 하나의 바람직한 embodiment, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 소포안에 포함된다. 예를들어 N-[1-(2,3 - dioleoyloxi)propyl]-N, N, N-trimethylammoniumethylsulfate 나 "DOTAP"같이 양극(+)으로 분극된 지질들은 특히 그런 입자들이나 소포들에 매우 바람직하다. 또한 다른 것들 역시 적합하다. 이러한 지질 입자들에 대한 준비는 잘 알려져있다. ( 참조, US Patent Nos. 4880635 to Janoff et al., 4906477 to Kurono et al., 4911928 to Wallach, 4917951 to Wallach, 4920016 to Allen et al., 4921757 to Wheatley et al., 이것들에 대한 모든 관계된 부분은 여기 참조문으로 그것들 전체를 편입했음.)
이 발명의 조합은 작용제를 폐로 운반하는 어떠한 방법에 의해서도 조정될 수 있다. 현재의 작용제는 다른 어떠한 적당한 방법들에 의해 환자의 폐로 조정될 수 있으나 호흡하기에 알맞은 형태로서의 호흡기 조직을 통한 것이 바람직하며 더욱 바람직한 적은 입자를 호흡하거나 흡입제를 포함하는 에어로졸의 형태이다. 흡입제는 기체, 액체 혹은 고체의 형태이며 그것들은 필요에따라 건강에 도움이 되는 첨가물이나 조제 요소들을 포함한다. 여기 발명의 입자들은 충분히 작아서 호흡을 통하거나 입 그리고 후두, 복수, 폐의 알베올리(alveoli)를 통과하기에 바람직한 크기의 입자들이다. 입자들의 호흡을 위한 대체적 직경은 약 0.5에서 10 마이크론 정도이다. 그러나 다른 크기도 가능하다. 호흡제에 포함되어 있는 비교적 직경이 커서 호흡기로 흡수할 수 없는 크기의 입자들은 목에 쌓이게 되어 삼켜지게 된다. 따라서, 폐로 흡수할 수 없는 크기의 입자들의 양을 최소화시키는 것이 바람직하다. 코에서의 입자들의 유기를 위해 10-500마이크로미터정도의 입자 크기가 바람직하다.
호흡용 제제로서의 생산을 위해 약학적 액체 조성의 작용제로 예를 들어 적당한 운반체와 결합된 안티센스 올리고가 들어간 에어로졸과 같은 멸균 파이로겐(pyrogen)-결핍 수(water)나 또는 다른 알려진 적당한 약학적 운반체가 있다. 본 기술에 알려진 다른 성분들뿐만 아니라 다른 약학적 합성물들도 포함된다. 발명에서의 축소화된 작용제와 같은 호흡할수 있는 건조된 입자들을 포함하는 고체 미립자의 성분은 건조된 안티센스 함성물을 막자사발과 막자로 분쇄하여 준비한 후 커다란 덩어리의 입자의 분쇄를 위해 400mesh screen과 같은 합성막을 통과시킨다. 안티센스 합성물을 포함하는 고체 입자의 구성은 에어로졸이나 안개(mist)의 형성을 유도하는 역할을 하는 것으로 알려진 다른 작용제와 분산제 또한 역시 포함할 수 있다. 적당한 분산제는 락토즈(lactose)이며 이것을 안티센스 합성물과 약 1:1의 질량비 정도의 적당한 비율로 섞는다. 다른 비율역시 사용되며 다른 약학적 합성물과 입자형성제 또한 포함한다. 작용제(agent)를 포함하는 액체 입자의 에어로졸은 스프레이(insufflator or nebulizer)같은 방법에 의해 생성될 수도 있다. (참조 US Patent No. 4501729. ) 스프레이들은 수용액이나 작용제의 서스펜션을 에어로졸의 안개형태로 바꾸어주는 상업적 장치나 대체적으로 예를 들어 좁은 벤츄리 관이나 초음파 교반기에 의한 공기나 산소압축가스의 가속방법도 사용가능하다. 스프레이(insufflator or nebulizer)를 사용하기 위한 작용제, 이 발명을 포함하는 적당한 합성은 염분과 같은 것들을 첨가하여 몸 성분과 등장액으로 만드는 것이 바람직하며 수용성 알콜 용액이나 전형적인 물의 액체 운반체를 20% 질량비 미만으로 0.01에서 40% 정도의 양이 바람직하다. 다른 운반체 역시 가능하다. 다른 추가적인 첨가물들은 예를 들어 메틸 하이드록시벤존에이트(methylhydroxybenzoate), 안티옥시던트(antioxydant), 향료(flavoring agents), 기화유제(volatile oils), 멸균되지 않았을 때의 보존제들이나 계면활성제와 버퍼제, 외 다른 것과 같이 멸균되지 않은 상태일경우의 보존제를 포함한다.
여기에 제시된 약학적 합성물들은 위에서 제시된 뉴클레오산 아티센스 올리고뉴클레오타이드와 한가지 이상의 계면활성제를 포함한다. 이 발명에서의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 수용을 강화시키는 적당한 계면활성제나 계면활성 요소들로 계면활성 단백질 A, B, C, D E 와 2-포화(di-saturated) 포스패티딜콜린, 다이 팰미토일포스패티딜콜린(dipalmitoylphophatidylcholine), 포스패티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스패티딜글라이세롤(phosphatidylglycerol), 포스패티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스패티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 라이소포스패티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 팰미토일-라이소포스패티딜콜린(palmitoyl-lysophosphatidylcholine), 포스패티딜세린(phosphatidylserine), 포스패티딕 산(phosphatidic acid), 유비퀴논들(ubiquinones), 디하이드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone), 돌리콜스(dolichols), 설패티딕 산(sulfatidic acid), 글라이세롤-3-포스패이트(glycerol-3-phosphate), 다이하이드록시아세톤 포스패이트(dihydroxyacetone phosphate), 그라이세롤(glycerol), 글라이세로-3-포스포콜린(glycero-3-phosphocholine), 다이하이드록시아세톤(dihydroxyacetone), 팰미테이트(palmitate), 사이티딘 다이포스패이드(CPD) (cytidine diphosphate diacylglycerol), CDP 콜린(choline), 콜린(choline), 콜린 포스패이트(choline phosphate); 또한 오메가-3-패티 산(omega-3-fatty acids), 폴리에닉 산(polyenic acid), 레시딘(lecithin), 팔미티딕 산(palmitidic acid), 에틸렌이나 프로필렌 산화물들의 복합체들의 비이온 블록과 같이 계면활성제 요소를 운반하는 자연적 운반체인 자연적 인공적 라멜라 몸체, 폴리프로필렌(polypropylene), 모노머릭과 폴리머릭(monomeric, polymeric) 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene), 덱스트락(dextran)이나 알카노일 작용기(alkanoyl side chains)의 폴리, Brij 35, 트리톤 X-100 과 합성된 계면활성제 ALEC, Exosurf, Survan 과 Atovaquone, 그외의 것들이 있다. 이러한 계면활성제들은 하나 혹은 여러 개의 계면활성 요소들의 부분과 3'이나 5' 말단부와 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 결합으로 사용될수 있다. 이 발명의 구성은 안티센스 뉴클레오타이드와 계며노할성 복합체를 폐로 운반하는 다른 어떠한 방법으로도 쓰여질수 있다. 안티센스 합성물은 안티센스를 포함하는 흡입제의 에어로졸 형태로 흡입되는 방법처럼 적당한 방법에 의해서 환자의 폐에서 배포되었다. 이 흡입제들은 액체나 고체 그리고 다른 조제나 진단 성분과 다른 특정 형태의 성분을 포함한다. 다른 작용제의 사용예는 아세타미노펜(acetaminophen), 아닐러딘(anilerdine), 아스피린(아스피린) 버프리노핀(buprenorphine), 부타비탈(butabital), 부톱파놀(butorpphanol), 콜린 살리실레이트(choline salicylate), 코딘(codeine) 디조사인(dezocine), 디클로퍼낵(declofenac), 디프루니살(diflunisal), 디하이드로코딘(dihydrocodeine), 엘카토니민(elcatoninin), 엑토도락(etodolac), 페노프로펜(fenoprofen), 하이드록코돈(hydrocodone), 하이드로모폰(hydromorphone), 아이부프로펜(ibuprofen), 케토프로펜(ketoprofen), 케도로락(ketorolac), 레보파놀(levorphanol), 마그네시엄 살리실레이트(magnesium salicylate), 메크로페나메이트(meclofenamate), 메페나믹 산(mefenami acid), 메페리딘(meperidine), 메타돈(methadone), 메토트리머프레이진(methotrimeprazine), 몰핀(morphine), 낼부핀(nalbuphine), 나프록신(naproxen), 아편(opium), 옥시코돈(oxycodone), 옥시몰폰(oxymorphone) 펜타조신(pentazocine), 페노바비탈(phenobarbital), 프로폭시펜(propoxyphene), 살사레이트(salsalate), 소디엄 사리실레이트(sodium salicylate), 트라마돌(tramadol) 과 나코틱(narcotic) 진통제를 위에 열거된 것들에 첨가한다. (참조 Mosby's Physician's GenRx ) 항 우울제들도 알프라졸람(alprazolam), 브로마지팜(bromazepam), 부스피론(buspirone), 클로디아지폭사이드(chlordiazepoxide), 클로머자논(chlormezanone), 클로라지페이트(clorazepate), 다이아지팜(diazepam) 할라지팜(halazepam), 하이드록시진(hydroxyzine), 케타스졸람(ketaszolam), 로라즈팜(lorazepam), 몰프로바메이트(meprobamate), 옥사지팜(oxazepam)과 프레지팜(prazepam)외 다른것들을 포함하는 것도 유용하다. 항 우울제들은 클로다이아지폭사이드(chlordiazepoxide), 아미트립티라인(amitriptyline), 로락핀 매프로틸린(loxapine maprotiline) 과 퍼피나진(perphenazine)등과 같이 정신적 우울에 관계한다. 논 류마틱 아스피린(non-rheumatic aspirin), 콜린 살리실레이트(choline salicylate), 다이클로페낙(diclofenac), 케토프로펜(ketoprofen), 다이플루니살(diflunisal), 에토돌락(etodolac), 페노프로렌(penoprofen), 플록타페닌(floctafenine), 프루비프로펜(flurbiporfen), 아이부프로펜(ibuprofen), 인도메타신(indomethacin), 마그네시엄 살리실레이트(magnesium salicylate), 메클로페나메이트(meclofenamate), 메페나믹 산(mefenamic acid), 나부메톤(nabumetone), 나프록신(naproxen), 옥사프로진(oxaprozin), 페닐부타존(phenylbutazone), 피록시캄(piroxicam), 살사레이트(salsalate), 소디엄 살리실레이트(sodium salicylate), 설린댁(sulindac), 테노시캠(tenoxicam), 티아프로페닉 산(tiaprofenic acid), 톨머틴(tolmetin), 디클로페낙(diclofenac), 프루비프로펜(flurbiprofen), 인도메타신 (indomethacin), 케토롤락(ketorolac), 리멕소론(rimexolone) (대개 수술 후 사용함)과 같은 항 소염제, 베클로메탁손(beclomethaxone), 부데소니드(budesonide), 덱사메타손(dexamethasone), 프루니솔리드(flunisolide), 트리암시놀론(trisamcinolone)과 같은 비 감염적 코의 적용을 위한 항 소염제들이다. 소포리픽(soporifics, 수면촉진제)이나 알프라콜람(alprazolam), 브로마지팜(bromazepam), 디아지팜(diazepam), 디펜하이드락민(diphenhydramine), 독실라민(doxylamine), 에스타졸람(estazolam), 플루라지팜(flurazepam), 할라지팜(halazepam), 케타졸람(ketazolam), 로가지팜(lorazepam), 니트라지팜(nitrazepam), 프라지팜(prazepam), 퀘지팜(quazepam), 테마지팜(temazepam), 트리아졸람(triazolam), 졸피뎀(zolpidem)과 소피클론(sopiclone)등과 같은 불면증 치료에 사용되는 것들로 사용되어 질수 있다. 디펜하이드라민(diphenhydramine), 하이드록시진(hydroxyzine), 메토트리머프라진(methotrimeprazine), 프로메타진(promethazine), 프로포폴(propofol), 메라토닌(melatonin), 트리머프라진(trimeprazine)과 같은 진정제를 포함한다. 안정제와 작용제들은 아미트립티라인(amitriptyline) HCl; 클로디아지폭사이드(chlordiazepoxide), 아모바비탈(amobarbital); 세코바비탈(secobarbital), 아프로바비탈(aprobarbital), 부타바비탈(butabarbital), 에치오바이놀(ethchiorvynol), 글루테티미드(glutethimide), L-트립토판(tryptophan). 메포바비탈(mephobabital), 메토헥시탈(methohexital) Na, 미다졸람(methazolam) HCl, 옥사지팜(oxazepam), 펜토바비탈(pentobarbital) Na, 페노바비탈(phenobarbital), 세코바비탈(secobarbital) Na, 티아미랄(thiamylal) Na과 같이 다른 환경에서 간질병이나 떨림 치료에 사용된다. 머리 외상의 치료에 이용되는 엔아돌린(enadoline) HCl, 사이토 프로텍티브(cytoprotective) 작용제, 그리고 에고타민(ergotamine), 벨라도나 알카로이드(belladonna alkaloid) 그리고 페노바비탈(phenobarbital), 과 같은 폐경기 증상치료제, 클로니딘(clonidine), 합성된 에스트로겐(estrogen), 그리고 메드록시프로게스테론(medroxyprogesterone), 에스트라디올(estradiol), 에스트라디올 사이피내이트(estradiol cypinate), 에스트라디올 발러레이트(estradiol valerate), 에스트로겐(estrogens), 합성된 에스트로겐들과 에스터리피드 에스트론(esterifeid estrone), 에스트로피패이트(estropipate), 그리고 에티닐 에스트라디올(ethinyl estradiol)과 같은 폐경기 운동신경 증상의 치료에 이용된다. 월경긴장증상의 치료 작용제(PMS)의 예로 프로게스테론(progesterone), 프로제스틴(progestin), 고나도트로픽(gonadotrophic) 관련 호르몬, 구강 피임기, 다나졸(danazol), 루프로라이드 아세테이트(luprolide acetate), 비타민 B6들이 있다. 정신치료에 이용되는 작용제의 예로는 트리사이클릭(tricyclic) 항 우울제, 아미트립타일린(amitriptyline) HCl(elavil), 아미트립타일린(amitriptyline) HCl, 퍼페나진(perphenazine, 그리고 독세핀(doxepin) HCl들이 있다. 안정제, 항 우울제 그리고 항 걱정 작용제들로 디아지팜(valium), 로라지팜(ativan), 알프라지팜(xanax), SSRI's(선택적 세로토닌 수용 억제제), 플루옥세틴 HCl(prozac), 세탈린 HCl(zoloft), 파락세틴 HCl(paxil), 플루복사민 말레이트(luvox), 벤라팍신 HCl(effexor), 세로토닌, 세로토닌 가담제(fenfluramine), 그리고 다른 전반적인 조제약들(OTC)들이 있다.
이 발명의 조성은 호흡기로 흡수할만한 크기의 입자들을 포함하도록 투약되어질수 있다. 눈이나 입 그리고 후두를 통해 흡기되고 기관지와 폐의 알베올리를 통과할 정도로 충분히 작은 크기이다.보통, 대략 0.5부터 10 마이크론 정도의 크기이다. 에어로조레 포함된 흡기될수 없는 입자들은 목에 쌓이게 되어 삼켜지기 때문에 그 양은 최소화되어야 한다. 코의 관리를 위해 입자의 크기는 10-500 마이크로미터가 비강의 유지를 위해 바람직하다. 발명작용제를 포함하는 에어로졸이나 고체입자의 안개는 다른 어떠한 기구에 의해 고체 입자로 에어로졸과 안개(mist)로도 만들 수 있다. 에어로졸과 안개 생성기는 고체 입자 약제의 형성에 적당하다. 이러한 기계들은 호흡할 만한 입자를 위에서 설명한 바와 같이 생성하며 동물이나 인간에 적당한 양의 약제 정량의 측정을 미리 결정하는 것또한 포함한다. 예시적인 고체 입자의 에어로졸 형성기 타입은 분무기(insufflator)이다. 코 호흡을 통하여 취입기에 의해 정밀히 분쇄된 분말의 형태로 포함되어 운영하기 적당하게 형성된다. 이 분무기에서 여기에 있는 처방을 효과적으로 수행하도록 하는 정량의 작용제 가루가 캡슐에 들어가게 된다. 이러한 것들은 일반적으로 젤라틴이나 플라스틱으로 만들어지고 잘라지거나 열려지도록하여 가루가 사용법에 의해 작동되는 흡입기를 통하여 공기의 흡수에 의해 전달되게 된다. 분무기에 적용되는 가루는 순수한 작용제이거나 작용제와 섞인 가루, 예를 들어 락토오즈(lactose)와 적당히 희석된 가루, 그리고 선택적인 계면활성제나 다른 작용제로 이루어지게 된다. 이러한 작용제는 질량비 0.01부터 100까지를 포함하게 된다. 두 번째 타입의 예시적 에어로졸의 형성은 흡입입자에 의해 정량된 것을 포함한다. 정량된 흡입제는 에어로졸 분무기에 의해 일정기압이 유지된 액체화된 입자와 활성된 요소들의 용액이나 서스펜션을 포함한다. 이러한 기계의 사용은 활성화된 성분을 함유하는 정제된 스프레이 입자의 생성을 위해 대략 10에서 150마이크로리터 정도의 정량된 부피의 운반은 물론 다른 적당한 부피에 대한 적용이 사용된다. 적당한 추진제들은 예를 들어 다이클로로다이플로로메탄, 트리클로로프로롤메탄, 다이클로테트라프로로에단 혼합물들과 같은 클로로플루로카본 합성물들이다. 하나이상의 추가적인 혼합용액으로 예를 들어 에탄올, 계면활성제, 올릭산 이나 솔비탄 트리올리트, 항산화제 그리고 적당한 향신료들이 있다. 고체나 혹은 액체 입자로 된 에어로졸은 대략 1분에 10-150 리터정도의 속도로 에어로졸 생성기에 의해 만들어지며 대부분 바람직하게 1분에 60리터 정도로 생성된다. 상당량의 약제를 함유하는 에어로졸을 보다 빠른 방법으로 만들 수 있다.
이미 지적했듯이, 본 발명의 작용제는 발명의 작용제는 물론 운반제를 포함한다. 운반제는 바람직하게 생물적으로 수용 가능하여야 하고 약학적이나 능률적으로 기체, 액체 , 고체나 그 혼합형태의 의도에 따라 다른 운반경로에 적당한 운반제 이어야 한다. 그 구성은 다른 질병이나 환경, 향신료, 항산화제, 색깔제제, 충전제, 휘발성 오일, 버퍼제, 확산제, 계면활성제, RNA 불활성제, 추진제, 보존제나 다른 알려진 치료적 혼합물질들과 같은 다른 치료 물질들에 수용되어진다. mRNA 불활성제의 하나의 작용제 예는 라이보자임과 같은 효소이다. 그 혼합은 대게 0.01-99.99 질량비로 바람직한 것으로 약 1-40 질량비, 더욱 바람직한 5-20 질량비 구성의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 그러나 다른 성분들, 그리고 다른 작용제의 양은 이 발명의 한정에 적절해야 한다. 발명의 작용제는 또한 다양하게 다른 방법으로 운용되거나 다양한 운반에 의한 방법으로 계산된 합성물들을 공급한다. 피부로 흡수되는 합성 또한 다른 적당한 피부, 입, 코, 질, 항문, 눈, 귀, 다른 신체의 혈, 일관적인 공급으로, 두개골내, 인트라세컬, 혈관내, 흡입에 의해, 폐포내, 기관내, 이식에 의해, 크림, 젤 등등 본 기술에 알려진 바와같이 신중한 고려를 통한 운반제와 운반작용제의 합성물들이다. 하나의 특정한 형태에서, 작용제는 서스펜드되거나 혹은 용액에 녹는다. 다른 운반제는 지질 입자와 리포좀이나 마이크로 크리스탈과 같은 소포체처럼 소수성의 운반제를 포함한다. 모든 이러한 쓰여지는 성분이나 합성물들의 준비는 본 기술에 알려진 바와 같으며 더 이상 언급할 필요는 없다. 운반제 형성의 특히 바람직한 것에서, 운반제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 리포좀을 포함한다. 리피드 운반제는 N-(1-[2,3-디올레올시로시 프로필)-N,N,N-티리메틸-암모늄 메틸셀페이트 및 본 기술에서 표적 세포로 DNA의 운반에 적당하게 사용하기 이용될 수 있는 다른 알려진 것을 포함한다. 본 실시예에서, 형태는 애어솔과 같은 호흡에 적한합 형태를 포함한다. 작용제, 및 본 발명의 형태는 본 기술에서 알려진 바와 같이 먹기 쉽게 하기 위한, 본 발명의 형태는 벌크와 유닛의 형태, 및 임플랜트, 용액 또는 혼탁액, 캡슐 또는 카트리지의 형태로 만들어진다.
또한 카트는 수송 장치 및 분리된 용기, 작용제, 구성 또는 본 발명의 형태, 및 선택적인 다른 작용제, 및 키트 함유물 사용 지침서를 포함하여 제공된다. 하나의 바람직한 실시예에서, 수송장치는 하나 또는 다중의 개량된(metered) 형태 투여량을 수송하기 위한 분무기를 포함한다. 하나의 계량된 량의 분무기는 본 출원에서의 충분한 작용제로 무균으로 미리 장착된 일회용 키트로서 공급한다. 분무기는 취입기, 및 먹기 쉬운 캡슐 또는 카트리지의 구성으로 공급된다. 다른 실시예에서, 수송장치는 압력을 가하는 흡입기, 및 작용제가 혼탁액 또는 용액의 형태인 것을 포함한다. 키트는 용기내에 또한 다른 치료화합물을 포함하는 부류로부터 선택된 작용제, 앤티옥시던트, 향 및 색깔이 있는 작용제, 필터, 휘발성 기름, 완충제, 분산제, 계면활성제, 작용제를 내입수송하는 세포, RNA 불활성화제, 앤티옥시던트, 향료제, 추진제 및 보건제와 다른 형태로 적당히 더해질 수 있는 것??르 구성하는 부류로부터의 선택된 작용제를 선택적으로 포함할 수 있다. 작용제의 용매 또는 함유물이 더해졌을 때, 유기 용매 및 한가지 이상 조용매(cosolvent)이 혼합된 유기용매 및 수용매(aquous solvent)는 본 기술에서 알려진 바와 같이 이용될 수 있다.
본 발명의 작용제는 수송 목적을 위한, 또는 작용제의 복세수를 많이 제조하기 위한 벡터와 결합되어 제공될 수 있다. 본 기술에서 알려진 바와 같이, 작용제는 효과적으로 벡터에 연결될 수 있다. 작용제는 또한 MTA 올리고의 증가 및 저장의 목적으로 숙수 세포에 투입할 수 있다.
본 발명의 작용제는 그 자체에 의해, 또는 적어도 하나의 표적 유전자의, 유전자 프랭킹 영역, 개시코돈, 인트론-액손 보더, 및 그와 같은 것에, 또는 비코딩 RNA 분획, 및 코딩 및 비코딩 영역의 인접영역(juxta-section)과 폴리-A 분획과 같은 5'-말단과 같은 3'-말단, 및 단백질 인코딩 영역을 포함하는 완전한 전구RNA에 관련된 질환 또는 통증의 치료를 위해 구성의 형태 또는 다양한 방법에 의해, 상당량의 안티센스 올리고 뉴크리오타이드를 질환 또는 통증에 영향받는 환자에게 투여하여 적어도 하나의 환자 표적 mRNA의 생산성 및 이용성을 줄이고, 분괴를 증가시키는 것에 의해 이용될 수 있다. 전형적으로, 작용제는 적어도 두 개의 표적 mRNA의 생산성과 이용성을 줄거나, 또는 분해를 증가시키는데에 효과적이게 투여된다. 선택적으로, 작용제는 환자의 VP에 직접 투여될 수 있고, 호흡하기 쉬운 에어졸이 바람직하다. 전문가는 본 특허의 내용에 따라 치료된 환자들의 무게에 따른 작용제의 투여량을 어떻게 측량할 수 있는지 알고 있고, 다중 표적 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 세포 내에서의 농도가 약 0.05에서 약 10μM가 되는 효과량으로 작용제를 투여하는 것이 바람직하고, 다중 표적 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 세포 내에서의 농도가 약 5μM까지인 것이 더욱 바람직하다.
본 특허에 따른 치료업은 수많은 질병과 통증의 치료에 적당하고, 그것은 출원은 표적 분자와 그것의 서열의 이용성에만 한정된다. 본 기술이 특히 잘 적용될 될 수 있는 한가지의 형태는 폐질환 및 통증이다. 이러한 형태의 출원에 대해, 적어도 하나의 표적 mRNA는 아데노신 A1수용체, 아데노신 A2b수용체, 아데노신 A3수용체, 및 브래디키닌 B2 수용체와 같은 단백질을 인콘딩한다. 그러나, 다른 표적에도 또한 적용될 수 있다. 어떤 적용에서, 질환 또는 통증은 환자의 기도의 폐색성에 관련되어 있고, 더욱 상세하게는 천식등에 관련되어 있다. 상기에 적용될 수 있는 많은 다른 것들을 언급하였으나, 바람직한 표적 단백질의 하나는 NfκB 전사인자를 포함한다. 또 다른 바람직한 적용에서, 질환과 통증은 염증반응에 관련한다. 이러한 형태의 적용에서, 적어도 하나의 표적 mRNA는 인터루킨, 켐모카인, 란테(Rantes) 및 그들의 수용체를 포함하는 부류로부터 선택된 단백질을 인코딩하는 것이 바람직하다. 또 다른 적용은 알레르기에 관련한 질환 또는 통증의 치료이다. 본 적용에서, mRNA는 항체 및 항체 수용체를 포함하는 부류로부터 선택된 표적을 인코딩하는 것이 바람직하다. 맬리그넌시 또는 암에 관련한 병 또는 통증에 대한 본 기술의 적용에서, mRNA는 온코진, 면약글로블린, 및 항체 수용체를 구성하는 부류로부터 선택된 표적을 인코딩하는 것이 바람직하다.
표적 기관 또는 조직에 따라, 본 발명의 작용제는 피부 또는 전신(systemic) 경로, 더욱 상세하게는 입내로, 공동(cavitarily)내로, 항문내로, 코내로, 질내로, 피부를 통해, 볼(bucal)내로, 혈관내로, 피하로, 근육내로, 종양내로, 그랜드(gland)로, 이식에 의해, 피부내로, 및 많은 다양한 투여경로의 예에서의 많은 방법중에 하나의 방법으로 수송한다.
또한, 형식은 이식, 느린 방출, 피부를 통한 방출, 떠받쳐진 방출 및 하나 이상의 고분자로 덮어 선택된 표적에 도달되기 전에 작용제가 파괴되는 것을 막을 수 있다. 본 작용제에 의해 치료될 수 있는 환자는 인간과 다른 일반적인 동물, 특히 척중동물, 이들중에 표유동물, 더욱 상세하게는, 인간, 및 크고 작은, 야생 및 가축, 수생 및 농장 동물이고, 바람직하게는 인간과 가축 및 농장 동물이다. 본 발명의 한 측면에서, 최소한 하나의 표적의 mRNA 및 환자의 것은 같은 종의 것이고, 바람직하게는 그것들은 인간의 것이다. 그러나, 실시에서, 불일치 뉴클레오타이드는 교체되었으므로, 불일치 종은 또한 사용되어질 수 있다.
본 발명의 다중 표적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 폭넓은 량으로 투여될 수 있다. 1회 투여마다약 0.0005에서 약 150mg/kg체중의 량이 바람직하고, 작용제는 하루에 7번의 분량으로 주사기 처리법으로 투여될 수 있으며, 계속적인 투여로 특이 분자의 수위를 유시시킬 수 있다.약 0.01에서 약 75mg/kg체중의 량이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 약 1에서 50mg/kg체중으로 투여한다. 본 방법은 예방적 또는 치료적인 방법으로 투여된다.
본 발명의 작용제는, 유전자, 유전자 프랭킹 영역, 적어도 하나의 병 또는 통증에 연관되어진 것으로 알려진 mRNA 및 단백질을 구성하는 부류로부터 선택된 두 개이상의 표적을 선택하는 것에 의해; 유전자에, 유전자 프랭킹 영역, 개시코돈, 인트론-액손 보더 및 그와 같은 것에, 또는 비코딩 RNA 분획, 폴리-A 분획 와 코딩 및 비코딩 영역 사이의 인접부분(juxta-section)을 표적하는 올리고와 같은 5'-말단 및 3'-말단, 및 표적 단백질을 인코딩하는 RNA 분획을 포함하는 RNA의 완전한 서열에 대응하는 RNA를 구성하는 부류로부터 선택된 RNA를 얻는 것에 의해; 제 2차 RNA의 분획에 최소한 약 60%의 동종성을 지닌 일차 RNA 분획을 선택하는 것에 의해; 및 하나 이상의 RNA 시그먼트에 대한 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드르 합성하는 것에 의해 만들어질 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 방법은 최소한 하나를 일반적인 염기로 치환하는 것과, 몇몇 경우에서는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 비-유사한 뉴클레오타이드 모두를 치환하는 것을 모두 포함하며, 다른 실시예에서, 본 방법은 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 적어도 하나의 CpG의 시토신을 메틸레이티드 스토신으로 치환하는 것을 포함한다. 본 기술은 본기술에서 알려진 메틸레이션을 포함하나, 여기서는 언급하지 않겠다.
MTA의 특이 길이는 표적의 길이 및 약간의 티미딘을 포함하는 그것의 분획에 의해 결정되지만, 안티센스 올리고 뉴클레오타이드는 7 뉴클레오타이드의 길이 이상, 및 약 60 뉴클레오타이드 길이 이하인 것이 바람직하다. 특이적 기골(backbone) 화학은 여기서 언급한 내용 및 본 기술의 상당한 지식을 기초로 전문가에 의해 선택되어질 수 있다. 뉴클레오타이드 가교 잔기의 선택을 방해하는 한가지 인자는 요구되는 뉴클레아제 저항의 정도와 다른 인자는 한가지 또는 다른 투여방법의 특이성이다. 다른 인자는 작용제의 치료후에 나타날 수 있는 부작용을 최소화 또는 완전히 없애는 위치에 대한 요구이다.
다음의 실시예는 본 발명을 설명하나, 여기에만 국한 된 것이 아니다. 본 실시예에서, μM은 마이크로 몰을, ml은 밀리리터, ㎛은 마이크로미터, mm은 밀리미터, cm은 센티미터, ℃는 섭씨온도, ㎍은 마이크로그람, ㎎은 밀리그람, g은 그람, kg은 킬로그람, m은 몰, h는 시간을 의미한다.
[실시예 1: 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 설계와 합성]
A1및 A3아데노신 수용체에 대한 앤드센스 올리고뉴클레오타이드의 설계하는데에는 표적 A1수용체 mRNA 및 표적 A3수용체 mRNA의 복잡한 2차구조의 해석을 필요로 한다. 이러한 구조를 형성시킨 후, mRNA에 대한 기능적 활성 또는 안정성을 주는 것으로 해석될 수 있으며, 및 최적으로 개시코돈과 겹쳐질 수 있는 mRNA의 표적영역들에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 설계한다. 다른 표적화 위치가 쉽게 이용될 수 있다. 안티센스 효과의 특이성에 대해 나타난 바와 같이, 전체적으로 표적 mRNA에 상보하지 않으나 w/w 기준하에 동일한 뉴클레오타이드 조성을 포함하는 또 다른 뉴클레오타이드가 안티센스 실험에 대조군으로 포함된다.
아데노신 A1수용체의 mRNA 이차구조는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 설계하기위해, 상기에 나타낸 것처럼 분석되어지고, 사용되어졌다. 합성된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 HAdA1AS를 명명하고, 서열 5'-CAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG-3' (SEQ ID NO:1)을 가진다.
대조군으로, 불일치 포스포로티오에이트 안티센스 뉴클레오타이드는 HAdA1MM1으로 명명하고, 서열 5'-GTA GCA GGC GGG GAT GGG GGC-3' (SEQ ID NO:2)을 가진다.
각각의 올리고뉴클레오타이드는 동일한 염기함량과 일반적인 서열 구조를 가진다. GENBANK(릴리스 85.0) 및 EMBL(릴리스 40.0)에서의 유사성의 검색은 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 인간과 토끼 의 아데노신 A1수용체에서 특이적인 것 및, 불일치 대조군은 임의의 알려진 유전자의 서열과 하이브리드형성하기 위한 물질이 될 수 없다는 것을 나타내었다. 아데노신 A3수용체 mRNA의 이차구조는 상기 두 개의 포스포티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 설계하는 바와 같이, 유사하게 분석되고 사용되어질 수 있다. 합성된 첫 번째 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (HAdA3AS1)는 서열 5'-GTT GTT GGG CAT GGG CAT CTT GCC-3' (SEQ ID NO:3)을 가진다.
대조군으로, 불일치 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드(HAdA3MM1)은 합성되고 서열 5'-GTA CTT GCG GAT CTA GGC-3' (SEQ ID NO:4)을 가진다.
또한, 두 번째 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (HAdA3AS2)가 설계되고 합성되고, 서열 5'- GTG GGC CTA GCT CTC GCC-3' (SEQ ID NO:5)을 가진다.
그것의 대조군 올리고뉴클레오타이드 (HAdA3MM2)는 서열 5' GTC GGG GTA CCT GTC GGC-3' (SEQ ID NO:6)을 가진다.
포스포티오에이트 올리고뉴클레오타이드들은 응용 생물 시스템 모델 369 합성기(Applied Biosystem Model 396 Olgonucleotide Sunthesizer)에서 합성되었으며, NENSORB 크로마토그래피 (Dupont, MD)를 사용하여 정제했다.
[실시예 2: 생체내 아데노신 A1수용체 안티센스 올리고의 검사]
상기 기재된 인간 A1수용체에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드(SEQ ID NO:1)는 폐 선종 세포 HTB-54를 이용하는 시험관내 모델에서 효험을 검사하였다. HTB-54 폐 선종 세포가 일반 노던 블럿팅(Northern blotting) 실험 및 실험실에서 설계되어 합성된 수용체 프로브를 사용하여 A1아데노신 수용체의 발현시킨다는 것이 입증되었다. HTB-54 인간 폐 선종 세포(106/100mm 조직배양 디쉬)에 5.0μM HAdA1AS 또는 HAdA1MM1과 함께 24시간동안 배양하였고, 배양 12시간 후에 새로운 배지와 올리고뉴클레오타이드를 바꾸어주었다. 24시간동안 올리고뉴클레오타이드와 함께 배양한 후에, 세포는 일반 실험과정을 통해 세포를 채취하고 RNA를 뽑아내었다. 안티센스에 의해 표적화된 mRNA 영역에 대응하는 21-mer 프로브 ( 즉, 포스포로티오에이트가 아닌 안티센스와 같은 서열임)은 합성되어, HAdA1AS-처리, GAdA1MM1-처리 및 비처리된 HTB-54 세포로부터 준비된 RNA를 노던 블럿용 프로브로 사용되었다. 이들 블랏을 통해 HAdA1AS는 효과적으로 인간 아데노신 수용체 mRNA의 량을 약 50%이상 줄어들이나, HAdA1MM1에서는 그렇지 않은 것을 분명하게 보여주었다. 이런 결과는 HAdA1AS는 천식과 관련된 아데노신 A1수용체의 세포내 mRNA을 격감시키므로, 항천식 약으로 유용한 재료가 될 수 있다.
[실시예 3: 아데노신 A1 수용체 안티센스 올리고의 생체내 효험]
개시코돈과 겹치면서, 아데노신 A1유전자 안의 토끼와 인간의 DNA 서열사이의 우연적 유사성으로 인해, 인간 아데노신 A1수용체에 대한 용도로 처음으로 설계된 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 토끼모델에서 사용이 가능하다. 약 10% 카올린과 혼합된 312 항원 unit/ml 하우스 더스트마이트(House dust mite; D.farinae) 추출물(Berkeley Biologicals, Berkeley, CA)을 생후 24시간 안에 복막 내로 면역시킨다. 첫 한달은 일주일에 한번, 다음 두달 동안은 2주일에 한번씩 면역시킨다. 3-4달의 나이에서, 8번 면역시킨 토끼는 케타민 하이드로클로라이드 (44mg/kg) 및 아세프로마킨 메리에이트(0.4mg/kg)의 혼한물을 근육 내로 투여하여 마취시키고 이완시킨다. 작고 푹신하게 주형된 동물 상자(Mallinkrodt, Inc., Glen Falls, NY)의 편안한 위치에 만 듯이 눕히고, 4.0mm 호흡 관에서 배양했다. 라텍스 밸룬이 부착된 외경 2.4mm의 폴리에틸렌 도뇨관은 식도로 넣고, 이 실험에 관한 입구에서 같은 거리 (약 16cm)로 유지한다. 도뇨관은 가열된 플레이쉬 뉴모타초그래프(크기 00; DOM Medical, Richmond, VA)에 부착되고, 플로우는 고울드 캐리어 엠플리파이어 (Model 11-4113; Gould Electronic ,cleveland, OH)에서 유도된 발리딘 부분압력 유도기(model DP-45161927; Validyne Engineering Corp., Northridge, CA)를 사용하여 측정하였다. 식도의 종선형 플라스크는 부분 압력유도기의 한 측면에 부착되고, 식도관의 흐름은 기관지의 압력을 기록하도록 부분압력 유도기의 반대측에 연결된다. 흐름은 계속적으로 주기적인 부피를 구성하고, 총 폐저항(lung resistance, RL) 및 다이나믹 컴플리언스(Cdyn)의 측정은 자동호흡분석기(Model 6; Buxco, Shron, CT)를 사용하여 각각 같은부피(isovolumetric) 및 흐름영점에서 계산하였다. 동물들은 임의로 선택되었고 첫째날 PC50의 전처리 값이 에어러졸화된 아데노신에 대해 얻어졌다. 안티센스(HAdA1AS) 또는 불일치 대조군(HAdA1MM) 올리고뉴클레오타이드는 무균의 생리 식염수에서 1.0ml 당 5000μg(5mg)의 농도로 용해되었다. 계속해서 매일 두 번씩 기관내 튜브를 통해 이틀동안 에어러졸화된 안티센스 또는 불일치 올리고뉴클레오타이드(약 1ml의 부피에 5000μg)를 동물에게 투여하었다. 식염수, 아데노신, 또는 안티센스 또는 불일치 올리고뉴클레오타이드의 에어러졸은 초음파 분무기(DeVilbiss, So -merset, PA)에 의해 비말(droplet)만들어지고, 형성된 비말의 80%는 5μm보다도 작다. 실험의 첫 번째 방법(arm)로, 임의로 선택된 것으로 알레르기성 토끼 4마리에 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하고, 4개의 대조군에는 불일치 올리고뉴클레오타이드를 투여했다. 셋째날 아침에, PC50값(기준선 값으로부터, 50%의 기관지 기도에서 다이나믹 컴플리언스를 줄이는데 요구되는 에어러졸 아데노신의 mg/ml 농도)이 얻어졌으며, 올리고뉴클레오타이드에 노출되기 전의 동물들에서 얻어진 PC50의 값과 비교되었다. 1주일 기간을 경과 후, 동물들은 먼저 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리후 불일치 대조 올리고뉴클레오타이드로 투여된 토끼들과 서로 교차한다. 처리방법 및 측정은 이 실험의 첫 번째 방법에 사용된 것과 동일하다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드으로 처리된 8마리의 동물중 6마리에서, 아데노신-매개 기관지협착증이 아데노신의 용해성, 20mg/ml의 한계로 얻어질수 없다는 것이 주목되어져야 한다. 계산의 목적으로, 이들 동물에 대한 PC50의 값은 20ml/mg로 고정한다. 그러므로 언급된 값은 안티센스의 효과성에 대한 최소값을 나타낸다. 실제의 효과적인 값은 더 높다. 이 실험의 결과는 하기 표 3에서 나타내었다.
표 3: 천식 토끼에서 PC50값에 대한 아데노신 수용체 A1안티센스 올리고의 효과
불일치 대조군 A1 수용체 안티센스 올리고
올리고뉴클레오타이드처리전 올리고뉴클레오타이드처리후 올리고뉴클레오타이드처리전 올리고뉴클레오타이드처리후
3.56±1.02 5.16 ± 1.03 2.36 ± 0.68 〉19.5 ± 0.34**
본 결과는 평균 (m=8) ± SEM 으로 나타내었다.유의성은 분산의 반복-측정 분석 (ANOVA; repaeted-measures analysis of variance) 및 튜키 보호 테스트(Tukey's protected test)로 계산되었다.**모든 다른 군과 유의적 차이가 있음을 의미, p〈0.01
상기 두 개의 실험 방법에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리받은 동물들은, 50%까지의 폐의 다이나믹 컴플리언스를 줄이기위해 요구되는 에어러졸화된 아데노신의 투여량이 크기순서로 증가되는 것을 보여주었다. 불일치 대조군 올리고뉴클레오타이드는 PC50의 값에 어떤 영향도 미치지 않는 것이 관찰되었다. 흡입된 안티센스 또는 대조군 올리고뉴클레오타이드가 어떠한 동물에서도 독성이 나타나지 않았다.
이러한 결과를 통해, 폐질환에 있어서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 기초로한 치료제의 표적으로 특히 폐가 가능성이 있다는 것을 보여준다. 더욱이, 그것들은, 인간천식과 매우 유사한 모델 체계에 있어서, 아데노신 A1수용체의 하향조절(downregulation)은 주로 천식기도에서 아데노신-매개 기관지협착증을 제거할 수 있는 것으로 보인다. 이러한 과민반응을 관련된 조직이 에어러졸화된 올리고뉴클레오타이드와의 접촉점 가까이에 있고, 상기 모델이 중요한 인간 질환과 유사하게 자극시키므로, 인간 천식의 알레르기 토끼 모델에서 기관지 과민반응은 안티센스에 의한 중재에 대한 아주 좋은 결과이다.
[실시예 4: A1-아데노신 수용체 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 특이성]
상기 실시예 3의 교차실험의 결론으로, 모든 토끼로부터 나온 기도 평활근에서 아데노신 A1수용체의 숫자가 정량적으로 분석되었다. 또한, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 특이성에 대한 대조군으로서, 영향받지 않는 아데노신 A2수용체를 정량화하였다. 각각의 토끼로부터 얻은 기도 평활근 조직을 해부하고, 세포막 분획(fraction)을 Kleinstein et al.의 방법 (Kleinstein, J. and Glossmann, H., Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 305 : 191 -200(1978), 상기 문헌중 관련된 부분은 본원에서 참고문헌으로 전부 통합되어 있다.)에서 약간 변형을 가하여 준비하였다. 준비된 천연 세포막은 검사전까지 70℃에서 저장하였다. 단백질의 함량은 브래드포드의 방법(M. Bradford, Anal. Biochem. 72, 240-254 (1976), 상기문헌 중 관련 부분은 본원에서 참고문헌으로 전부 통합되어 있다.)으로 측정하였다. 냉동한 세포막을 상온에서 녹이고, 0.2U/ml 아데노신 탈아민효소를 넣고, 37℃에서 30분간 배양시켜 내재하고 있는 아데노신을 제거한다. [3H] DPCPX (A1 수용체-특이적임) 또는 [3H]CGS-21680(A1 수용체-특이적임)의 결합은 상기 설명된 Ali et. ac. 방법(Ali, S. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 268, Am J. Physiol 266, L271-277 (1994), 상기문헌 중 관련 부분은 본원에서 참고 문헌으로 전부 통합되어있다.)으로 측정하였다. 상기문헌중 A1-특이성이 있는 길항제(antagonist) DPCPX의 특이성 있는 결합에 대한 분석을 하였을 때, 교차실험에서 아데노신 A1 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 동물은 대조군과 비교하여 A1 수용체의 수자상 75%를 줄였다. A2수용체-특이성이 있는 길항제 2-[p-(2-카르복시에틸)-페네틸아미노]-5'-(N-에틸카르복사미도) 아데노신 (CGS-21680)의 특이반응성 잇는 결합에 대한 분석을 하였을 때, 아데노신 A2수용체 숫자에 있어서의 변화는 없었다. 이것을 하기 표 4에서 나타내었다.
표 4: 아데노신 A1수용세 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 작용 특이성
불일치 대조군 올리고뉴클레오타이드 A1안티센스 올리고뉴클레오타이드
A1-특이 결합 1105 ± 48** 293± 18
A2-특이 결합 302 ± 22 442± 171
본 결과는 평균 (m=8) ± SEM. 으로 나타내었다유의성은 분산의 반복-측정 분석 (ANOVA; repaeted-measures analysis of variance) 및 튜키의 보호 t 테스트(Tukey's protected test)로 계산되었다.**불일치 대조군과의 유의적 차이가 있음을 의미, p〈0.01
상기 결과는 기도 질환을 치료하는데 있어서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효과성을 보여준다. 상기 설명된 안티센스 올리고는 아데노신-매개 기관지협착의 원인이 되는 수용체 체계를 제거하기 때문에, 수용체 체계로부터 아데노신을 제거하는 것이 꼭 필요하지는 않다. 그러나, 유사한 효과를 얻기위해 요구되는 투여량을 줄이기위해 이들 올리고뉴클레오타이드로부터 아데노신을 제거하는 것이 바람직하다. 염증에 관련된 단백질의 mRNA을 표적하는 다른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 앞에 설명되어있다. 분해는 동안 아데노신의 방출을 막기위해, 아데노신을 뉴클레오타이드로부터 제거하였다.
[실시예 5 : 다른 표적 핵산들에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드]
이러한 작업은, 본 발명이 광범위하게 핵산 표적들에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드들("올리고들")에 폭넓게 적용될 수 있다는 것을 보여주기 위해 수행되었다. 다음 실험연구가 수행됨으로서, 본원 발명에 의해 제시된 대로 설계된 안티센스 올리고 및 어떤 모든 아데노신 수용체 mRNA를 표적하는 올리고의 사용이 폭넓게 적용될 수 있다는 것을 본 발명은 보여주었다. 이러한 목적으로, 다양한 안티센스 올리고들이 아데노신 A1, A2b, A3수용체 mRNA의 예시된 아데노신 수용체 mRNA에 대해 준비되었다. 안티센스 올리고 I은 상기 (SEQ. ID NO:1)로 개시되었다. 부가된 다섯 개의 안티센스 포스포로티오에이트 올리고들은 상기에 제시한 바와 같이 설계되고 합성되었다.
또한 아데노신 A1 수용체를 하지만, 올리고 I과는 다른 영역을 표적하는 1-올리고 II (SEQ. ID NO:7)
아데노신 A2b수용체를 표적하는 2-올리고 V (SEQ. ID NO : 10)
아데노신 A3수용체의 다른 부위를 표적하는 3- 올리고 III(SEQ. ID NO:8) 및 IV(SEQ. ID NO: 9)
4- 올리고 I-PD (SEQ. ID NO : 1681) (올리고 I과 같은 서열의 포스포다이에스터 올리고)
이러한 안티센스 올리고들은 상기 설명된 바와 같이, 선택된 종에서의 치료를 위해서 설계되었고, 다른 종의 표적 mRNA의 단편이 유사한 서열을 포함하지 않는 한, 일반적으로 그 종에 특이적이다. 모든 안티센스 올리고들은 하기와 같이 준비되었고, 상기 본원에서 설명한 바와 같이, 천식과 같은 질병의 경우와 같은 호흡장애 및 폐기도 장해를 가진 기관지협착, 염증, 및 알르레기에 대한 토끼 모델에서 안티센스 올리고들을 가지고 생체내 시험을 하였다.
[실시예 6: 다른 안티센스 올리고의 설계 및 서열]
6개의 올리고 및 그들의 작용이 토끼 모델에서 연구되었으며, 이런 연구의 결과는 하기에 기록되었고 검토되었다. 이러한 올리고들 중 5개는 상기 실시예 1 내지 4에서 언급된 올리고 I (SEQ ID NO : 1)에 대한 데이타를 보충하기 위한 연구로 선택되었다. 시험된 올리고들은 아데노신 A1 수용체 mRNA의 다른 영역을 표적하는 안티센스 올리고 I (SEQ ID NO : 1) 및 II(SEQ ID NO : 7), 아데노신 A2b수용체 mRNA를 표적하는 올리고 V(SEQ ID NO : 8), 아데노신 A3 수용체 mRNA의 다른 두 영역을 표적하는 올리고 III 및 IV (SEQ ID NO : 9 및 10)들과 동일하다. 여섯 번째 올리고(올리고 I-PD)는 올리고 I (SEQ ID NO : 1)가 포스포다이에스터화된 버젼이다. 이러한 안티센스 올리고들의 제작과 합성은 실시예 1에 따라 수행된었다.
(I) 안티센스 올리고 I
실시예 1 내지 4에서 언급된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 I은, 인간 A1 아데노신 수용체 mRNA(EPI 2010)에 표적된다. 안티센스 올리고 I은 21개의 뉴클레오타이드이고, 개시코돈과 겹쳐지고 서열 5'-GAT GCA GGG CGG CAT GGC GGG-3' (:SEQ. ID No 1)을 가진다.
앞에서 검토되고, 상기 Nyce, J.W. ＆ Metzger, W.J., Nature, 385:721(1977)(상기문헌 중 관련 부분은 본원에서 참고 문헌으로 전부 통합되어있다.)에서 보여진 바와 같이, 올리고 I은 상기에서 알레르기성 토끼의 아데노신-유도성 기관지협착을 없애는 것과, 앨러젠(allergen)-유도성 기도장해 및 기관지 과민반응(BHR)을 감소시키는 것으로 보여졌다.
(II) 안티센스 올리고 II
포스포로티오에이트 안티센스 올리고(SEQ. ID NO:7)은 개시코돈(시작점)에 대하여 +936 내지 +956에 있는 토끼 아데노신 A1 수용체 mRNA를 표적하기 위해 본 발명에 따라 설계되었다. 안티센스 올리고 II는 21개의 뉴클레오타이드이고, 서열 5'-CTC GTC GCC GTC GCC GGC GGG-3'(SEQ. ID NO:7)을 가진다.
(III) 안티센스 올리고 III
상기 실시예 1에서 제시된 것과 다른 포스포로티오에이트 안티센스 올리고(SEQ. ID NO:8)는 개시코돈(시작점)에 대하여 안티센스 A3수용체 +3 내지 +22에 있는 mRNA 영역을 표적하기 위해 본 발명에 따라 설계되었다. 안티센스 올리고 III는 20개의 뉴클레오타이드이고, 서열 5'-GGG TGG TGC TAT TGT CGG GC-3' (SEQ. ID NO:8)을 가진다.
(IV) 안티센스 올리고 IV
또 다른 포스포로티오에이트 안티센스 올리고(SEQ. ID NO:9)은 개시코돈(시작점)에 대하여, +386 내지 +401에 있는 아데노신 A3 수용체 mRNA를 표적하도록 본 발명에 따라 설계되었다. 안티센스 올리고 IV는 15개의 뉴클레오타이드이고, 서열 5'-GGC CCA GGG CCA GCC-3'(SEQ. ID NO:9)을 가진다.
(V) 안티센스 올리고 V
포스포로티오에이트 안티센스 올리고(SEQ. ID NO:10)는 개시코돈(시작점)에 대하여, -21∼-1에 있는 아데노신 A2b수용체 mRNA를 표적하도록 본 발명에 따라 설계되었다. 안티센스 올리고 V는 21개의 뉴클레오타이드이고, 서열 5'-GGC CGG GCC AGC CGG GCC CGG-3' (SEQ. ID NO:10)을 가진다.
(VI) A1 불일치 올리고
다음과 같은 서열을 가진 두 개의 다른 불일치 올리고뉴클레오타이드들은 상기 실시예 5에 기재된 안티센스 올리고 I(SEQ. ID NO:1)에 대한 대조군으로서 사용되었다:
A1MM2 5'-GTA GGT GGC GGG CAA GGC GGG-3' (SEQ. ID NO:1682);
A1MM3 5'-GAT GGA GGC GGG CAT GGC GGG-3'(SEQ. ID NO:1683)
안티센스 올리고 I 및 두 개의 불일치 안티센스 올리고들은 동일한 염기 함량과 일반적인 서열 구조를 가졌다. GENBANK (릴리스 85.0) 및 EMBL(릴리스 40.0)에서 유사성 검색을 한 결과, 안티센스 올리고 I은 인간 및 토끼의 아데노신 A1수용체 유전자에 특이적이고, 불일치 대조군은 알려진 다른 인간 또는 동물의 유전자 서열과 하이브리드하지 않는다는 것을 보여주었다.
(VII) 안티센스 올리고 A1-PD(올리고 VI)
올리고 I과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가진 포스포다이에스터 안티센스 올리고 (Oligo VI; SEQ. ID NO:1681)를 상기 본원에서 개시된 바와 같이 설계하였다. 안티센스 올리고 I-PD는 21개의 뉴클레오타이드이고, 개시코돈과 겹치며, 서열 5'-GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG-3'(SEQ. ID NO:1681)을 가진다.
(VIII) 대조군
상기 (II), (III) 및 (IV)에 있는 안티센스 올리고들과 같은 방법에 따라 5.0ml 에어러졸화된 무균 식염수 5.0ml을 각각의 토끼에 투여하였다.
[실시예 7: 안티센스 올리고의 합성]
상기 (a)에 기재된 서열을 갖고 있는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고들은 응용 생활성 모델 (Apllied Biosystem Model 396 Oligonucleotide Synthesizer)에서 합성하고, NENSORB 크로마토그래피 (DuPont, DE)를 사용하여 정제하였다. TETD (테트라에틸티우람 다이설피드)가 가황산제로 합성동안 사용되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 II(SEQ. ID NO:7), 안티센스 올리고뉴클레오타이드 III(SEQ. ID NO:8), 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 IV(SEQ. ID NO:9) 각각을 상기와 같은 방식으로 합성하고, 정제하였다.
[실시예 8: 알레르기성 쥐의 준비]
새로 태어난 뉴질랜드 화이트 파스퇴렐라-겹핍성 토끼를 태어난지 24시간 안에, 앞서 기재된 10% 카오린(Metzger, W.J., in Late Phase Allergic Reactions, Dorsch, W., Ed., CRC Handbook, pp.347-362, CRC Press, Boca Raton(1990);상기문헌 중 관련 부분은 본원에서 참고 문헌으로 전부 통합되어있다.)과 혼합한 312항원 units/ml 하우스 더스트 마이트 (House dust mite)(D. farinae) 추출물(Berkeley Biologicals, Berkeley, CA) 0.5ml로 복막내에 면역시켰다(Metzger, W.J., in Late Phase Allergic Reactions, Sorsch, W., Ed., CRC Handbook, pp.347-362, CRC Press, Boca RAton(1990); Ali,S.,Metzger, W.J. and Mustafa, S. J., Am. J. Resp. Crit. Care Med. 149: 908(1994), 상기문헌 중 관련 부분은 본원에서 참고 문헌으로 전부 통합되어있다.). 첫 한달 동안 1주일에 한번씩, 다음 4달이 될 때까지는 2주에 한번씩 면역을 반복시켰다. 바람직하게도 이러한 토끼는 앨러젠-특이성 IgE 항체를 생산하며, 전형적으로 초기 및 후기 천식 반응 모두에서 앨러젠 노출에 반응하고, 기관지 과민반응(BHR)이 보였다. 매달 앨러젠(상기와 같은 312 unit 더스트 마이트 앨러젠)을 복막 내에 투여함으로서 앨러젠-특이성 IgE 항체 및 BHR을 연속적으로 자극하여 유지시킬수 있다. Alo et al.에 의해 설명된 것처럼, 4개월의 나이에 에어러졸을 투여하여 면역된 토끼를 만들어낸다. (Ali., S., Metzger W. J. and Mustafa, S. J., Am. J. Resp. Crit. Care Med. 149 (1994), 상기문헌 중 관련 부분은 본원에서 참고 문헌으로 전부 통합되어있다.).
투여량-반응 연구
[실시예 9: 실험 장치]
아데노신(0-20mg/ml) 또는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 두 개의 불일치 올리고뉴클레오타이드(5mg/ml)중 하나에 대한 에어러졸을 초음파 분무기(Model 646, DeVilbiss, Somerset, PA)를 사용하여 각각 분리하여 제조였고, 상기 초음파 분무기는 에어러졸 비말(droplet)을 생산하며 이중 80%는 5μm보다도 작았다. 동일한 부피의 에어러졸을 내호흡기관을 통해 폐에 직접적으로 투여하였다. 동물을 임으로 선택하고, 에어러졸화된 아데노신을 투여하였다. 첫째날, 아데노신에 반응한 전처리 값이 컴플리언스 50% 손실(PC50아데노신)을 야기하는 아데노신의 투여량으로 계산된다. 그리고나서, 동물들은 에어러졸화된 안티센스 또는 불일치 안티센스 올리고중에 하나를, 기관 내의 관(5mg/ml)을 통해 이틀동안 하루에 두 번씩 2분동안, 동물에 투여하였다(총 투여량, 20mg). 후처리 PC50값을 삼일째 아침에 기록하였다(후처리 투여). 이러한 연구의 결과는 하기 실시예 21에서 언급하였다.
[실시예 10: 교차실험]
안티센스 올리고 I (SEQ ID NO:1) 및 이에 대응하는 불일치 대조군 올리고뉴클레오타이드 A1MM2을 사용하는 몇몇 실험에서, 2주 경과 후, 동물들을 교차시켰다. 즉, 전에 불일치 대조군 A1MM2로 투여된 것은 안티센스 올리고 I을 받도록 하고 전에 안티센스 올리고 I으로 처리된 것은 불일치된 대조군 A1MM2 올리고를 받도록하였다. 각 부류당 동물의 수는 다음과 같다. 기술적인 어려움으로 인해 실험의 두 번째 분지(arm)에서 한 마리가 죽었기 때문에, 불일치 A1MM2 (대조군 1)는 n=7이었고, 불일치 A1MM3에 대해서는 n=4 (대조군 2) 및 A1AS 안티센스 올리고 I는 n=8이었다. A1MM3 올리고-처리된 동물들은 분리하여 분석하고, 교차실험 부분은 그렇지 않았다. 교차 후 사용된 처리방법 및 측정은 실험의 첫 번째 분지에서 사용되어진 것과 동일하였다.
안티센스 올리고 I(SEQ. ID NO:1)로 처리된 8 마리의 동물들중 6마리에서, 어떠한 PC50의 값이 아데노신의 용해성의 한계인 20mg/ml까지의 아데노신 투여량에서 얻어지지 않았다. 따라서, 이러한 동물들에 대한 PC50의 값은 계산 목적상 20mg/ml인 것으로 가정하였다. 그러므로, 주어진 값은 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효과성에 대한 최소값을 나타낸다. 상기 기재된 방법에 따라, 안티센스 올리고 I(SEQ ID NO:1) 또는 A1MM2 올리고 0.5 또는 0.005mg(총 2.0 또는 0.2mg)을 다른 군(group)의 알레르기성 토끼(각 군당 n=4)에 투여하였다. 이 연구의 결과는 하기 실시예 22에서 언급하였다.
[실시예 11: 안티센스 올리고의 처방]
각각의 안티센스 올리고를 분리하여 수용액에 각각 용해시키고, 상기 (e)에서 안티센스 올리고 I(SEQ. ID NO:1)에 대해 설명된 바와 같이, 상기 기관 내의 관을 통해 분무기를 사용하여 네 개의 5mg 분량(총 20mg의 량)으로 투여시켰다. 하기 실시예 19 및 표 1에 기재된 바와 같이, 안티센스 올리고 I 및 그의 불일치 대조 3에 대한 결과를 통해, 불일치 대조군은 식염수와 동일하다는 것이 확인되었다. 이러한 발견 때문에, 안티센스 올리고 II, III, IV (SEQ. ID NO: 7, 8, 9)를 사용한 폐의 기능연구에 대조군으로 식염수가 사용되었다.
[실시예 12: 아데노신 A1 수용체에 대한 올리고 I의 특이성 (수용체 결합 연구)]
상기에서와 같이 48시간에 거쳐 4번 나누어진 투여량으로 20mg 올리고 I(SEQ ID NO:1)을 투여해 왔던 토끼로 부터의 기도 평활근 조직을 일차, 이차 및 3차 기관지로 절개하였다. Ali et al.(Ali., S., et al., Am. J. Resp. Crit. Care Med. 149: 908 (1994), 세포막 부분의 중비와 관련된 섹션은 본원에 참고문헌으로 전체적으로 통합되어 있다.)의 방법에 따라 세포막 부분을 준비하였다. 단백질 함량은 브래드포드(Bradford) 방법을 사용하여 측정하였고, 세포막은 0.2U/ml의 아데노신 탈아민효소와 함께 37℃에서 30분 동안 배양하여, 내재하고 있는 아데노신을 제거하였다. Bradford, M.M. Anal. Biochem. 72, 240-254(1976),. [3H]DPCPX, [3H]NPC17731, 또는 [3H]CGS-21680의 결합은 Jarvis et al.에 의해 설명된 것처럼 측정되었다. (Jarvis et al. See, Jarvis, M.F., et al, Pharmaco. Exptl. Ther. 251, 888-893 (1989), 상기 문헌중 관련 부분은 본원에서 참고문헌으로 전부 통합되어 있다.) 이 연구의 결과는 표 8 및 하기 실시예 20에서 나타내었다.
[실시예 13: 폐기능 측정 (컴플리언스 CDYN및 저항)]
4개월 되고, 면역된 동물을 케타아민 HCl(35mg/kg) 및 아세프로마친 맬리에이트(1.5mg/kg)의 혼합물 1.5ml로 근육내로 투입하여 마취시키고 이완시켰다. 마취유도 후, 알레르기성 토끼를 푹신하게 주형된 동물 상자에 반듯이 편안하게 눕혔다. 건조화되는 것을 막기 위해 눈에 연고를 바르고, 눈을 감겼다. 그런 다음, Zavala 및 Rhodes에 의해 설명되어진 바와 같이, 4.0mm 중간 고-저 커프된 머피(cuffed Murphy) 1 기관내 튜브으로 삽관하였다.(Mallinckrodt, Glen Fall, NY) (See, Zavala and Rhodes, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 144: 509-512 (1973), 상기문헌 중 관련부분은 본원에서 참고문헌으로 전부 통합되었다.) 얇은 벽의 라텍스 밸룬을 가진 OD 2.4mm의 폴리에틸렌 도뇨관 (Becton Dickinson, Clay Adams, Parsippany, NJ)을 식도로 통과시키고, 실험하는 동안 입로부터 같은 거리(약 16cm)에서 유지시켰다. 기관 내의 관은 가열된 프레이쉬 뉴모타취(pneumotach) (크기 00; DEM Medical, Richmond, VA)에 부착되고, 고울드 캐리어(Gould carrier) 증폭기(Model 11-4113, Gould Electronics, Cleveland, OH)로 구동된 발리딘(Validyne) 부분 압력 유도기(Model DP-45-16-1927, Validyne Engineering, Northridge, CA)을 사용하여 흐름(v)을 측정하였다. 식도 밸룬(balloon)은 발리딘 부분 압력 유도기의 한 측면에 연결시키고, 다른 측면은 폐압력(Ptp)을 얻기 위해 기관 내 관의 출구에 부착시켰다. 흐름(flow)은 계속적으로 주기적인 부피를 생산하도록 통합시켰으며, 같은 부피 및 흐름영점에서 총 폐저항(Rt) 및 다이나믹 컴플리언스(Cdyn)를 측정하였다. 8개 채널의 고울드 2000W 하이 고주파수 리코더에서 흐름, 부피 및 압력을 기록하였고, 총 부피 및 영점흐름에서의 Ptp 차이를 사용하여 Cdyn을계산하였으며, Ptp 및 중간주기의 폐 부피에서 Ptp와 V의 비로서 Rt을 계산하였다. Giles et al.에 의해 이전에 설명된 바와 같이, 북스코 자동 폐 역학 호흡 분석기(Model 6, Buxco Electronics, Shron, CT; automated pulmonary mechinics respiratory analyzer)를 이용하여 자동적으로 상기계산들을 하였다.(Giles et al., Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 194: 213-232 (1971), 상기 문헌 중 관련 부분은 본원에서 참고문헌으로 전부 통합되어 있다.) 알레르기성 토끼에 올리고 II를 투여하여 얻어진 결과는 하기 실시예 26에서 나타나 있으며 검토되고 있다.
[실시예 14: 기관지 과민반응의 측정 (BHR)]
각각의 알레르기성 토끼에 에어러졸화된 히스타민을 투여하여 기준점(baseline) 과민반응성을 측정하였다. 식염수 또는 히스타민의 에어러졸을 만들었다. 각 투여량이 적용될 때, 30초동안 그리고 나서 2분 동안 Devilbiss 분무기(devilbiss, Somerset, PA)를 사용하여 히스타민 에어러졸을 만들었다. 초음파 분무기는 에어러졸 미말을 만드는데, 이 중 80%가 직경이 5마이크론보다 작았다. 농도(0.156에서 80mg/ml까지)를 증가시키면서 히스타민 에어러졸을 투여하고, 각각의 투여 후 폐기능을 측정하였다. 그리고나서, 기준점으로부터 Cdyn50% (PC30 Histamine)을 줄이는데 요구되는 히스타민의 농도(mg/ml)(PC50히스타민)을 계산하여 B4R을 결정하였다.
[실시예 15: 안티센스 올리고 I의 심장혈관상 효과]
CardiomaxTM을 사용하여 심장의 박출량 및 다른 심장혈관의 매개변수의 측정은 부피의 알려진 차가운 식염수를 혈관 투입한 후 심장에서 나가는 혈액 온도의 변화를 모니터하는 피부열의 희석 원리가 환용된다. 오른쪽 경정맥의 배관을 통해 우심방으로 차가운 식염수를 빠르게 투입하였고, 혼합된 투입물질과 대동맥궁의 혈액의 온도에 있어서 대응하는 변화가, 경동맥의 배관을 통해 온도-감지 소형 프로브에 의해 기록되었다. 상기 (d)에서 언급된 바와 같이 에어러졸의 올리고 I(EPI 2010; SEQ. ID NO:1)를 가지고 알레르기성 토끼를 처리하고, 12시간 후, 동물들을 80% 케타민과 20% 자이라킨 0.3mg/kg으로 마취시켰다. Nyce ＆ Metzger(1997), spura(상기문헌의 적절한 개시사항은 본원에서 참고문헌으로 전체적으로 통합되어 있다.)에서 명확히 보여준바와 같이, 이 시점은 SEQ. ID NO:1의 효험을 나타내는 이전 데이타와 일치한다. 그리고나서, 각각의 쥐에 열전쌍(thermocouple)을 좌경동맥으로 집어넣고, 6.5cm 전진시키고, 비단 봉합사로 단단히 조였다. 오른쪽 경정맥을 배관하고, 폴리에틸렌 튜브의 길이만큼 집어넣고 단단히 조였다.
그리고나서 20℃에서 무균 식염수를 투입하여, CardiomaxTMII(Columbus Instrument, Ohio)에서 열희석 곡선을 얻어 열전쌍 프로브의 정확한 위치를 결정하였다. 열전쌍의 정확한 위치를 확인한 다음, 대퇴골 동맥 및 정맥을 격리시켰다. 대퇴골 정맥은 약을 투여하기 위한 문맥으로 사용하고, 대퇴골 동맥은 혈압과 맥박 측정을 위해 사용하였다. 일단 일정한 기준점(baseline) 심장혈관 매개변수가 성립되면, 혈압, 맥박, 심장 박출량, 총 말초저항 및 심장 신축성을 CardiomaxTM으로 측정하였다.
[실시예 16: 올리고 I (SEQ. ID NO:1)의 활성기간]
상기 (f)에 언급된 바와 같이, 기관내 튜브를 통해 분무기를 사용하여, 기준점을 찾기위해 컴플리언스가 50% (PC50 adenosine)로 감소 될 때까지, 0.156mg/ml로 시작하여 초기 증가하는 로그 투여량을 8 마리의 알레르기성 토끼에 투여하였다. 그리고나서 상기 기재된 바와 같이, 토끼 중 6마리에 (SEQ. ID NO:1)의 5mg 에어러졸화된 량을 4번 투여하였다. 두 마리의 토끼에는 대조군으로 동일량의 식염수 용액을 투여했다. 마지막 투여하고 18시간 후, PC50 adenosine의 값을 다시 시험하였다. 이 시점 이후, 10일까지 매일 모든 동물에 대하여 계속 측정하였다. 이 연구의 결과는 하기 실시예 25에서 검토되었다.
[실시예 17: 안티센스 올리고 V에 의한 아데노신 A2b수용체 수의 감소]
상기 흡착 챔버(chamber)를 사용하여 이틀에 세 번씩, Sprague Dawley 쥐에 호흡가능한 안티센스 올리고 V(SEQ ID NO:10) 2.0mg을 투여하였다. 마직막 투여하고, 12시간 후, 폐의 선세포 조직을 절개하고, Nyce ＆ Metzger (1997)에 기재된 바와 같이, [311]-NECA를 사용하여 아데노신 A2b수용체 결합에 대한 분석을 하였다. 대조군은 동일량의 식염수를 투여하였다. 스튜던트의 짝지워진 t 시험을 사용한 결과들은 p〈0.05의 중요성을 갖고 있으며, 하기 실시예 28에서 검토하였다.
[실시예 18: 올리고 I와 이에 대응하는 포스포다이에스터 올리고 VI(SEQ. ID NO:1681)의 비교]
올리고 I(SEQ. ID NO:1)는 아데노신의 효과들을 감소시키고 20mg 아데노신/5.0ml(아데노신 용해성의 한계)까지의 아데노신 얄에 대한 자극 감응도를 제거시켰다. 포스포다이에스터 형의 올리고 뉴클레오타이드의 서열인 올리고 VI(SEQ. ID NO:1681)은 같은 방식으로 시험되었을 때, 완전히 비효과적이었다. 상기 화합물 모두는 단지 올리고 I (SEQ. ID NO:1)에 있어서 포스포로티오에이트 잔기의 존재 여부만 다르고 동일한 서열을 가지며, 상기 및 Nyce ＆ Metzger(1997)에 기재된 바와 같이, 에어러졸화 되어 분무되었다. 스튜던트의 짝지워진 t 검사시 p〈0.001에서 상당히 달랐으며, 결과는 하기 실시예 29에서 검토되었다.
안티센스 올리고 I(SEQ. ID NO:1)에 대해 얻어진 결과
[실시예 19: 선행 작업의 결과]
아데노신 A1수용체에 대해 특이적인 안티센스 올리고 I(SEQ. ID NO:1)의 뉴클레오타이드 서열 및 다른 데이타들은 앞서 제공하였다. 또한, 수용체 숫자 및 활성을 하향조절(downregulation)하는데 있어서 올리고 I의 효율성을 보여주는 실험 데이터도 앞서 제공하였다. 안티센스 올리고 I의 특징과 활성에 대한 더 상세한 정보는 Nyce, J. W. and Metzger, W. J., Nature 385:721 (1997)에 제공되어져있다. (한편, 다음 결과와 관련있는 부분은 본원의 참고문헌으로 전체적으로 통합되어 있다.) 한편, Nyce ＆ Metzger(1997)의 출판물은 다음과 같은 안티센스 올리고 (SEQ. ID NO:1) 특성을 나타내는 데이터로 제공하였다:
(1) 하기 표 5에서 보여진 바와 같이, 안티센스 올리고 I은 투여량에 따라 알레르기성 토끼의 기관지 평활근에서 아데노신 A1 수용체의 수를 감소시킨다.
(2) 안티센스 올리고 I은 아데노신-유도성 기관지 협착 및 앨러젠-유도성 기관지 협착을 완화시킨다.
(3) 올리고 I은, 기관지 과민반응성을 평가하기 위한 표준측정 PC50히스타민에 의해 측정된 바와 같이, 기관지 과민반응을 완화시킨다. 표 5에서 보여진 바와 같이, 이 결과는 안티센스 올리고 I 의 항염증 활성을 보여준다.
(4) 예상한 바와 같이, 안티센스 올리고 I이 아데노신 A1수용체를 표적하도록 설계되었기 때문에, 안티센스 올리고 I은 전체적으로 아데노신 A1수용체에 특이적이고, 어떠한 투여량으로도, 매우 가까이 연계된 아데노신 A2수용체 또는 관련된 브래디키닌 B2수용체에 대해 어떠한 영향도 미치지 않는다. 이것은 표 5에 나타나 있다.
(5) 올리고 I의 상기 효과와 대비하여, 불일치 대조군 분자 MM2 및 MM3 (SEQ. ID NO:1682 및 SEQ. ID NO:1683)는 안티센스 올리고 I(SEQ. ID NO:1)와 동일한 염기구성 및 분자량을 가지지만, 각각 약 6 및 2의 불일치로 인해 상기 안티센스 올리고 I과는 다르다. 여전히 남아있는 동일한 염기 조성을 계속 유지시킬 수 있는 최소한의 불일치는 표적화된 수용체(A1, A2, 또는 B2)에 어떠한 효과도 전혀 나타내지 못했다.
아데노신 A1수용체를 표적하는, 올리고 I과 같은 안티센스 올리고 뉴클레오타이드의 용도에 대한 선행기술은 전혀 없으므로, 상기 결과는 예상할 t 없는 결과들이다. 본 특허에서 보여지는 결과들은, 의도적으로, 기관지협착, 염증, 알레르기 등과 같은 폐 기도와 관련된 질환 또는 질병을 치료하기 위해 청구된 작용제 및 방법의 유효성을 보여줄 수 있다.
[실시예 20 : 올리고 I은 효과적으로 아데노신 공격(challinge)에 대한 반응을 줄인다.]
수용체 결합 실험은 상기 실시예 12에서 기재되어 있고, 하기 표 5에 나타난 결과는 A1아데노신 수용체 및 B2브래디키닌 수용체의 안티센스- 및 불일치-처리된 알레르기성 토끼의 기도 평활근으로부터 분리된 세포막에서 아데노신 A1-선택적 배위자 [3H]DPCPX 및 브래디키닌 B2-선택적 배위자 [3H]NPC 17731의 결합특성을 보여준다.
표 5 : 세 개의 안티센스 올리고의 결합 특성
처리 A1 수용체 B2수용체
Kd Bmax Kd Bmax
아데노신 A1 A 수용체
20 mg2 mg0.2 mgA1MM120 mg2 mgB2A(브래디키닌 수용체)20 mg2 mg0.2 mgB2MM (대조군)20 mg2 mg0.2 mg식염수 0.36±0.029 nM0.38±0.030 nM0.37±0.030 nM(대조군) 0.34±0.027 nM0.37±0.033 nM0.36±0.028 nM0.39±0.035 nM0.40±0.028 nM0.39±0.031 nM0.41±0.035 nM0.37±0.029 nM0.37±0.041 19±1.52 fmoles*32±2.56 fmoles*49±3.43 fmoles52.0±3.64 fmoles51.8±3.88 fmoles45.0±3.15 fmoles44.3±2.90 fmoles47.0±3.76 fmoles42.0±2.94 fmoles40.0±3.20 fmoles43.0±3.14 fmoles46.0±5.21 0.39±0.031 nM0.41±0.028 nM0.34±0.024 nM0.35±0.024 nM0.38±0.028 nM0.38±0.027 nM0.34±0.024 nM0.35±0.028 nM0.41±0.029 nM0.37±0.030 nM0.36±0.025 nM0.39±0.047 nM 14.8±0.99 fmoles15.5±1.08 fmoles15.0±1.06 fmoles14.0±1.0 fmoles14.6±1.02 fmoles8.7±0.62 fmoles*11.9±0.76fmoles**15.1±1.05 fmoles14.0±0.98 fmoles14.8±0.99 fmoles15.1±1.35 fmoles14.2±1.35 fmoles
148시간이상 4번에 걸쳐 동일량으로 투여된 전체 올리고. 처리와 분석은 방법에서 언급된 것처럼 수행되었다. 유의성은 분산의 반복-측정 분석 (ANOVA; repeated-measures analysis of variance), 및 튜키의 보고 t 테스트를 통해 계산되었다. 모든 군에서 n은 4-6* 불일치 대조군- 및 식염수-처리 군과의 유의적 차이, 신뢰도 p〈0.001;** 불일치 대조근- 및 식염수-처리 군과의 유의적차이, 신뢰도, p〈0.05
[실시예 21: 올리고 I의 투여량-반응의 작용]
안티센스 올리고 I (SEQ ID NO:1)은 하기 표6에서 보여진 바와 같이 시험되는 투여량 범위에 걸쳐 투여량에 의존하는 방식으로 동물에 아데노신을 투여한 효과를 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
표 6 : 안티센스 올리고 I의 투여량-반응 효과
총 투여량(mg) PC50아데노신(mg 아데노신)
안티센스 올리고 I 0.2 2.0 20A1MM2 올리고 (대조군) 0.2 2.0 20 8.32 ±7.214.0 ±7.219.5 ±0.342.51 ±0.463.13 ±0.713.25 ±0.34
상기 결과는 스튜던스 쌍 t 검정(student's paired t test)로 연구되었고, 통계학적 차이성은, p=0.05인 것으로 나타났다.
올리고 I (SEQ ID NO:1)인 안티-아데노신 A1 수용체 올리고는 특이적으로 A1수용체에 작용하나, 아데노신 A2수용체에는 작용하지 않는다. 상기 실시예 9 및 Nyce ＆ Metzger(1997), supra에 기재된 바와 같이 (분무기 또는 기관내 튜브을 통해 8 내지 12시간 간격으로 5mg의 량을 4번에 걸쳐 투여), 안티센스 올리고 I(SEQ ID NO:1) 또는 불일치 대조군 올리고 (SEQ ID NO:1682; A1MM2)로 처리한 것, 절개된 기관지 평활근 조직, 및 Nyce ＆ Metzger(1997)에 기록된 바와 같이 결정된 아데노신 A1및 아데노신 A2수용체의 숫자로부터 상기와 같은 결과가 나온 것이다.
[실시예 22: 표적 유전자 생산에 대한 올리고 I(SEQ ID NO:1)의 특이성]
올리고 I(SEQ ID NO:1)는 아데노신 A1수용체에 대해 특이적이나 불일치 대조군은 어떠한 활성이 없다. 도 1은 상기 실시예 10 및 Nyce ＆ Metzger (1997), supra에서 설명한 교차 실험으로부터 얻은 결과를 표시하고 있다. 두 개의 불일치 대조군(SEQ ID NO:1682 및 SEQ ID NO:1683)을 투여하면 PC50아데노신 값에 어떠한 영향을 미치지 않는다. 반대로, 안티센스 올리고 I(SEQ ID NO:1을를 투여하면 PC50아데노신 값이 7배 증가하는 것으로 나타났다. 이런 결과는, 식염수 대조군과 비교하여, 안티센스 올리고 I(SEQ ID NO:1)이 세포 외에서 투여된 아데노신에 대한 반응을 감소시키는 것(민감성을 완화시키는 것)을 명확히 보여주고 있다. 상기 표 2에서 제공된 결과들은, 안티센스 올리고 I의 효과가 투여량에 의존함을 확증시킨다.(참조, 표 1의 3열) 또한, 올리고 I은 아데노신 A1수용체에 특히 특이적이어서(참조, 상기 표의 3행), 매우 가깝게 연관된 A2수용체 또는 브래디키닌 B2수용체에서도 어떤 활성을 나타내지 않는다(참조, 상기 표 2의 8-10번째 줄). 나아가, 표 2에서 보여진 결과들에 의하면 안티센스 올리고 I (SEQ ID NO:1)가 투여량에 의존하는 방식으로 그리고 안티센스 올리고-의존성 방식으로 아데노신의 민감성을 감소시킨다. 두 개의 불일치 대조군 올리고뉴클레오타이드 (A1MM2 ; SEQ ID NO:1682 및 A1MM3 SEQ ID NO:1683) 모두는 PC50아데노신 값에 또는 아데노신 A1수용체의 수에 전혀 효과를 나타나지 않기 때문이다.
[실시예 23: 앨로젠-유도성 기관지협착 및 염증에 대한 효과]
올리고 I(SEQ ID NO:1)는 불일치 올리고와 비교해 볼 때, 토끼 모델에서 히스타민-유도성 작용을 상당히 감소시킨다고 나타났다. 안티센스 올리고 I(SEQ ID NO:1) 및 불일치 올리고(A1MM2, SEQ ID NO:1682 및 A1MM3 SEQ ID NO:1682)의 앨러젠-유도성 기도폐색증 및 기관지 과민반응에 대한 효과를 알레르기성 토끼에서 평가하였다. 앨러젠-유도 기도폐색증에 대한 안티센스 올리고 I(SEQ ID NO:1)의 효과가 평가되었다.
그래프로 나타낸 곡선 면적으로부터 계산된 것과 같이, 안티센스 올리고 I은 불일치 대조군과 비교하여 앨러젠-유도성 기도폐색증을 상당히 저해하였다.(55%, P〈0.05; 반복측정 ANOVA, 및 터키(Tukey)의 t 검정) 불일치 올리고 A1MM2(대조군)는 앨레젠-유도성 기도 폐색증에 대한 효과에 있어서 전혀 영향을 주지 않는다. 앨러젠-유도성 BHR에 대한 안티센스 올리고 I(SEQ ID NO:1)의 효과는 상기에서와 같이 결정되었다. PC50히스타민 값으로부터 계산된 것과 같이, 안티센스 올리고 I(SEQ ID NO:1)은, 불일치 대조군과 비교해 볼 때, 앨러젠-유도성 BHR을 상당히 저해시켰다.(61%, p〈0.05; 반복측정 ANOVA, 터키의 t 검정) A1MM 불일치 대조군은 앨러젠-유도성 BHR에 대한 효과가 전혀 없는 것으로 관찰되었다.
이런 결과를 통해 안티센스 올리고 I(SEQ ID NO:1)은 앨러젠-유도성 기관지협착증(집먼지)로부터 보호되는데 효과적이다. 이에 더하여, 안티센스 올리고 I(SEQ ID NO:1)에 대한 항염증 활성을 나타내는 히스타민 민감성에 대한 효과에 의해 보여진 바와 같이, 안티센스 올리고 I(SEQ ID NO:1)은 먼지-유도성 기관지 과민반응의 가능한 저해제가 될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
[실시예 24: 안티센스 올리고 I은 유독한 부작용이 없다.]
올리고 I(SEQ ID NO:1)는, 투여제에 독성을 있을 수 있는 부작용이 없는 것으로 나타났다. 올리고 I (SEQ ID NO:1)를 2.0 또는 20mg 투여하였을 때에는, 동맥혈압, 심박출량, 박동량, 맥박, 총 말단 저항 또는 심수축성(dPdT)에 어떤 변화도 없었다. 게다가, 심박출량(CO), 박동량(SV), 평균 동맥혈압(MAP), 맥박(HR), 총말단 저항(TRP), 및 수축성(dPdT)을 CardiomaxTM기구(Columbus Instrument, Ohio)를 이용하여 측정한 결과가 평가되었다.
이러한 결과는 올리고 I(SEQ ID NO:1)가 중요한 심혈관 매개변수에 어떤 해로운 효과를 나타내지 않는다는 것을 증명한다. 더욱 상세하게는, 이 올리고는 저혈압을 야기시키지 않는다. 다른 포스포로티오에이트 안티센스 올리고 뉴클레오타이드가 과거에는 일부 모델 시스템에서 저혈압을 유도하는 것으로 보여졌기 때문에, 이런 결과는 특히 중요하다. 더욱이, 아데노신 A1수용체는 심장안에서 동방결절 전도에 중요한 역할을 한다. 안티센스 올리고 I(SEQ ID NO:1)에 의해 아데노신 A1수용체를 격감시켜, 수용체의 하향조절에 대한 반응으로 해로운 폐 외의 활성을 초래할 것으로 예상될 수 있다. 그러나 이것은 그렇지 않다. 안티센스 올리고 I(SEQ ID NO:1)은 어떤 해로운 폐 내 효과를 야키시키지 않으며, 본 안티센스 올리고를 적은 량 투여하더라도 예상되지 못한, 또는 원하지 않은 부작용이 나타나지 않는다. 이것은 올리고 I(SEQ ID NO:1)이 직접적으로 폐에 투여되었을 때, 유독한 효과를 야기하는 상당량으로 않는다는 것을 증명한다. 이것은, 폐에서 방출되어 유독한, 심지어 생명을 위협하는 효과를 야기할 수 있는 디오필린과 같은 종래의 아데노신 수용체 길항제와 대조된다.
[실시예 25: 올리고 I의 장기 지속 효과]
아데노신 처리 전에 올리고 I(SEQ ID NO:1)을 투여하여 얻어진 PC50의 값 및 저항의 값에 의해 증명된 바와 같이, 올리고 I(SEQ ID NO:1)는 장기 지속의 효과를 나타내었다. 상기에서 설명된 바와 같이, 기관내 관을 통해 분무기로 각각 동일량의 5mg을 매번 투여하였을 때, 아데노신 안티센스 올리고I의 PC50의 값에 대하여, 효과의 지속성을 측정하였다. 작용제의 효과는 투여 후 첫째날에서 여??번째 날까지 상당하였다. 안티센스 올리고 I(SEQ ID NO:1)의 작용이 사라졌을 때, 동물들에 식염수(대조군)을 투여하고, 모든 동물에 대해 다시 PC50아데노신의 값을 측정하였다. 식염수-처리 동물들은 기준선 PC50아데노신 값(n=6)을 보여주었다.
상기에서 설명한 바와 같이, 안티센스 올리고 I(SEQ ID NO:1)을 20mg 투여한 6마리의 알레르기성 토끼에 대하여 기도저항을 측정하면서, 저항에 대한 효과의 지속성을 측정하고, 평균 계산된 효과 기간은 PC50아데노신(p〈0.05) 및 저항(p〈0.05) 모두에서 8.3일이었다. 이러한 결과는 안티센스 올리고 I(SEQ ID NO:1)는 아주 오랜 효과 기간을 가지고 있다는 것을 보여주며, 이것은 완전히 예상되지 못한 것이다.
[실시예 26: 안티센스 올리고 II]
아데노신 A1수용체 mRNA의 다른 영역에 표적된 안티센스 올리고 II는, 아데노신 A1-매개 효과에 대하여 활성이 매우 크다는 것이 밝혀졌다. 상기에기재된 바와 같이, 알레르기성 토끼들의 두 군에 안티센스 올리고 II 또는 식염수(대조군) 20mg을 투여하였을 때, 안티센스 올리고 II(SEQ ID NO:7)의 투여의 효과를 컴플리언스 및 저항값으로 측정하였다. 아데노신 또는 식염수를 투여한 후 상기 실시예 13에서 설명한 바와 같이 컴플리언스 및 저항값을 측정하였다.
본 발명의 안티센스 올리고의 효과를 통계적으로 의미있게, 쌍의 t-검정을 사용한 컴플리언스에 대해 p〈0.05, 저항에 대해 p〈0.01로 대조군과 차이를 나타냈다.
이런 결과는 아데노신 A1수용체를 표적한 안티센스 올리고 II(SEQ ID NO:7)이 아데노신 투여시 효과적으로 컴플리언스를 유지하고, 저항을 감소시킨다는 것을 보여주었다.
[실시예 27 : 안티센스 올리고 III 및 IV]
상기 기재된 바와 같이, 안티센스 올리고 III(SEQ ID NO:8) 및 안티센스 올리고 IV(SEQ ID NO:9)는 실제로 아데노신 A3 수용체에 특이적으로 표적하여, 안티센스 올리고 III(SEQ ID NO:8) 및 IV(SEQ ID NO:9)을 알레르기성 토끼에 20mg 분리투여 했을 때, 염증과 염증반응 세포의 수를 감소시키는 것으로 보여졌다. 기관지 세정액에 3시간동안 염증세포를 둔 후, 염증반응 세포수를 측정한 결과 세정마다 적어도 100의 생존가능한 세포가 있었다. 과립세포(granulocyte) 및 기관지 세액에서의 총 세포에 대한 안티센스 올리고 III(SEQ ID NO:8) 및 IV(SEQ ID NO:9)의 효과가 먼지 앨러젠에 노출시킨 후 평가되었다. 이 결과는, 안티센스 올리고 III(SEQ ID NO:8) 및 안티센스 올리고 IV(SEQ ID NO:9)가 먼지 앨러젠에 노출되어진 후의 천식 폐에서 항염증 작용제로 매우 유용하다는 것을 보여주었다. 본 기술에서 알려졌듯이, 안티센스 올리고 III(SEQ ID NO:8) 및 IV(SEQ ID NO:9)을 투여하였을 때, 천식의 일차적인 염증반응 세포인 과립세포, 더욱 상세하게는, 호산세포(eosinopil)에서 각각 약 40% 및 66%의 수가 감소하였다. 더욱이, 안티센스 올리고 IV(SEQ. ID NO:9) 및 III(SEQ. ID NO:8)은 또한 기관지 세정에서 각각 약 40% 및 80%의 총 세포의 수를 감소시켰다. 이것은 또한 본 발명의 앤티-아데노신 A3작용제에 의해 항염증 활성의 중요한 지표이다. 염증은 천식에서 기관지 과민반응 및 앨러젠-유도성 기관지협착의 근간을 이룬다고 알려졌다. 아데노신 A3수용체를 표적하는 안티센스 올리고 III(SEQ ID NO:8) 및 IV(SEQ ID NO:9)은 모두 종의 폐 수용체를 특이적으로 표적하기 위해 설계되어질 수 있는 항염증 작용제의 중요한 새로운 클래스의 대표적인 예가 될 수 있다.
[실시예 28: 안티센스 올리고 V]
아데노신 A2b아데노신 수용체 mRNA를 표적하는 안티센스 올리고 V(SEQ. ID NO:10)는, 아데노신 A2b-매개 작용을 감소시키고, 아데노신 A2b 수용체의 수를 절반보다 작게 줄이는데 매우 효과적이다.
[실시예 29: 포스포다이에스터-잔기로 치환된 올리고 I-DS(SEQ. ID NO:1681)의 기대치 않은 우수성]
상기에서 기재된 바와 같이, 올리고 I(SEQ. ID NO:1) 및 I-DS(SEQ. ID NO:1681)을 각각 분리하여 알레르기성 토끼에 투여하였고, 그런 다음 토끼에 아데노신을 투여하였다. 포스포다이에스터 올리고 I-DS(SEQ. ID NO:1681)은 통계적으로 아데노신의 효과를 감소시키는데 상당히 덜 효과적인 반면, 올리고 I(SEQ. ID NO:1)는 20mg의 PC50아데노신에 나타난 바와 같이, 고효율성을 가진다.
[실시예 30: 안티센스 올리고 VI]
본 작업을 위해, 아데노신 A1수용체를 표적하는 부가적인 안티센스 포스포로티오에이트 올리고(Oligo IV)를 설계하였다. 상기 특허출원에서 설명한 바와 같이, 안티센스 올리고는 선택된 종의 치료용으로 설계되었고, 선택된 다른 종의 아데노신 mRNA의 분획이 유사한 서열인 경우가 아니면, 일반적으로 그 종에 특이적이다. 이 안티센스 올리고는 하기와 같이 준비되고, 상기-동일 출원에서 기재된 바와 같이, 천식과 같은 병의 경우에서처럼 호흡곤란 및 폐기도 장해를 가진, 기관지협착증, 염증 및 폐 알르레기에 대해 토끼 모델로 생체 내에서 시험하였다. 추가된 올리고 및 그것의 토끼 모델상에서의 효과가 연구되고, 연구의 결과는 하기에 기록되어졌고, 검토되어졌다. 본 발명의 올리고(안티센스 올리고 VI)는, 상기-본 특허출원에 있는 아데노신 A1수용체 mRNA의 안티센스인 SEQ ID NO: I(올리고 I)의 결과를 보충하기 위해 본 연구에서 선택되어졌다. 상기 부가적인 올리고는 안티센스 올리고 VI과 동일하고, 올리고 I과 달리 아데노신 A1수용체 mRNA의 다른 영역을 표적한다. 이 안티센스의 올리고의 설계 및 합성은 상기-본 특허출원의 실시예 1에서 나타난 방법에 따라 수행되었다.
안티센스 올리고 VI는 개시코돈(시작점)에 대하여 +964 내지 +984 해당하는 토끼의 아데노신 A1수용체 mRNA의 코딩 영역을 표적하도록 설계된 포스포로티오에이트이다. 올리고 VI는 상기 본출원에 기재된 바와 같이, 연급된 것처럼 준비되고 20개의 뉴클레오타이드 길이를 가진다. 올리고 VI는 아데노신 A1수용체 유전자로 인도하고 서열 5'-CGC CGG CGG CTG CGG GCC GG-3' (SEQ. ID NO:_)을 가진다.
상기 (5)에서 기재된 서열을 갖는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고 VI는 응용 생물시스템 모델 올리고뉴클레오타이드 합성기에서 합성되어지고, NENSORB 크로마토그래피 (DuPont, DE)를 사용하여 정제하였다. TETD (테트라에틸티우람 다이셀페이트)는 합성동안 가황상제로서 사용하였다.
[실시예 31 : 알레르기 토끼의 제조]
새로 태어난 뉴질랜드 화이트 패스??라-결핍성 토끼는 태어난지 24시간 안에, 상기된 10%카오린(Metzger, W.J., in Late Phase Allergic Reactions, Dorsch, W., Ed., CRC Handbook, pp.347-362, CRC Press, Boca Raton(1990); 상기문헌 중 관련 부분은 본원에서 참고문헌으로 전부 통합되어 있다.)과 혼합된 312항원 units/ml 하우스 더스트 마이트 (D. farinae) 추출물(Berkeley Biologicals, Berkeley, CA)의 0.5ml로 복막 내 면역시킨다(Metzger, W.J., in Late Phase Allergic Reactions, Dorsch, W., Ed., CRC Handbook, pp.347-362, CRC Press, Boca RAton(1990); Ali,S.,Metzger, W.J. and Mustafa, S. J., Am. J. Resp. Crit. Care Med. 149: 908(1994), 상기문헌 중 관련 부분은 본원에서 참고문헌으로 전부 통합되어 있다.)
첫 한달 동안 1주일에 한번, 다음에 4달의 나이가 될 때까지는 이주에 한번씩 면역시켰다. 이들 토끼는 앨러젠-특이성 IgE 항체를 생산하는 것이 바람직하고, 초기 및 후기 천식 반응 모두에서 앨러젠 공격에 전형적으로 반응하고, 기관지 과민반응(BHR)이 보여준다. 매달 앨러젠(상기 312 unit 먼지 앨러젠)을 복막 내 투여함으로서, 앨러젠-특이성 IgE 항체 및 BHR을 연속적으로 자극하여 유지시킨다. 4개월의 나이에, 면역반응된 토끼가 Ali et al.(1994)에 의해 언급된 것처럼 에어러졸 투여용으로 준비되었다.
[실시예 32: 아데노신 에어러졸 제조]
아데노신 에어러졸(20 mg/ml)은 에어러졸 비말을 생산하는 초음파 분무기 (Model 646, DeVilbiss, Somerset, PA)에 의해 준비되었다. 상기 에어러졸 비말의 80%는 직경이 5μm보다 작다. 동일한 량의 에어러졸은 세 마리 토끼에 모두 기관내 튜브를 통해 폐로 직접 투여되었다.
그런 다음, 이 동물들은 에어러졸화된 아데노신을 투여받고, 첫째날 아데노신에 대한 반응성에 대한 전처리 값이 컴플라이언스의 50% 손실을 만드는 아데노신의 량(PC50 아데노신)으로 계산하였다. 그 다음 이틀 동안 하루에 두 번씩 2분 동안 (총량 20mg) 에어러졸화된 안티센스(5mg/1.0ml)를 기관내 튜브를 통해 이 동물에 투여했다. 후처리 PC50값이 셋째날 아침에 기록되었다(후처리 투여). 이들 연구의 결과는 하기 (9)에서 언급하였다.
[실시예 33: 안티센스 올리고 처방]
안티센스 올리고 각각을 개별적으로 수용액에 용해시키고, 상기 (e)에서 안티센스 올리고 I에 대해 설명된 바와 같이, 기관내 튜브을 통해 분무기를 사용하여 네 번에 걸쳐 5mg 분량으로 투여하였다.
[실시예 34: 올리고 VI는 올리고 I보다도 더 아데노신 투여에 대한 반응을 감소시킨다.]
아데노신 VI는, 상기 (7) 및 본 특허출원에서 설명된 바와 같이, 세 개의 알레르기성 토끼에서 시험하고 준비되었다. 올리고 VI는, 올리고 I과 다른 A1수용체의 코딩 영역의 부분을 표적한다. 이러한 표적 서열 모두는 가능성 있는 많은 코딩 영역 표적 서열로부터 임의적으로 선택되었다. 세 마리 토끼는, 상기 올리고 I과 같이 처리되었다. 간략히, 올리고 VI의 5mg을 하루에 두 번씩 8시간의 간격으로 이틀동안 토끼에 분무되었다. 그리고나서, PC50아데노신 연구를 전처리 PC50값에 비교하였다. 셋째날 아침에 수행하였으며 실험과정은 Nyce and Metzger (Nyce ＆ Metzger, Nature 385: 721-725(1997))에서 더욱 상세하게 기재되어 있다.
세 마리 토끼에서 얻어진 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
표 1: 에어러졸화된 아데노신 처리 전후의 PC50아데노신
처리 시간 PC50아데노신
처리전 처리후 3.0 ±2.1〉20.0*
*아데노신의 식염수에서의 불용해성에 의해 최대로 성취될 수 있는 량
올리고 VI로 처리된 세 마리 동물 모두, 상기 표 1에서 보여진 바와 같이, 작용제의 측정할 수 있는 수위까지 아데노신에 대한 민감성을 완전히 줄였다. 즉, 올리고 VI의 투여하여 세 마리 알레르기성 토끼에서의 아데노신-유도 기관지협착증을 완화시켰다. 따라서, 올리고 IV의 실제 효험성은 사용된 실험 시스템에서 측정될 수 있는 것보다 더 크다.
상기 올리고 I에서 나온 결과와 비교하여, 올리고 IV는 올리고 I만큼 또는 그 이상의 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
[실시예 34 : 결론]
실시예에서 기재될 바와 같은, 작업의 결과들은 상기-본 출원의 내용에 따라 설계된 모든 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 이들에 의해 표적된 수용체에 의해 매개되는 작용을 중화하거나 감소시키는데 매우 효과적이다는 것을 보여준다. 즉, 아데노신 A1수용체 mRNA를 표적하는 두 개의 안티센스 올리고, 아데노신 A2b수용체 mRNA를 표적하는 한 개의 안티센스 올리고, 및 A3수용체 mRNA를 표적하는 두 개의 안티센스 올리고는, 이들이 표적하는 특이성 수용체에 의해 매개되는 아데노신의 세포외 투입에 의한 효과를 완화시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 올리고의 활성은 표적에 특이적이며, 다른 표적을 실질적으로 저해시킬 수는 없다. 또한, 본 발명의 작용제의 투여는 부작용 또는 독성이 매우 낮거나 거의 존재하지 않는다는 것을 결과를 통해 보여준다. 이것은 기관지 협착 및/또는 염증반응의 치료에 매우 효과적이고 특이적인 작용제의 투여로 인해 100% 성공을 보여준다. 본 발명은 기도 질환에 연관된 단백질을 코딩하는 모든 유전자 및 대응 mRNA 에 같은 방식으로 폭넓게 적용될 수 있다. 포스포다이에스터 및 포스포다이에스터 결합을 포스포로티오에스터 결합으로 치환한 동일 올리고뉴클레오타이드형과 비교하면, 포스포다이에스터 안티센스 올리고보다 포스포티오에스터 올리고뉴클레오타이드가 예기치 않은 우월성을 가진다.
상기의 실시예는 본 발명을 설명하나, 여기에만 국한된 것이 아니다. 본 발명에 포함된 청구항의 동일한 범주에서, 본 발명은 다음 청구항에 의해 설명되어질 수 있다.

Claims (58)

  1. 표적 유전자들, 표적유전자들에 대응하는 RNA의 코딩 또는 비-코딩 영역, 유전자들의 개시코돈들, 게놈의 인접(flanking) 영역들, 인트론-엑손 경계들, 코딩 및 비코딩영역들 사이에 있는 5'-말단과 3'-말단과 인접(juxta)-구획, 및 하나이상의 질환(disease)이나 질병(condition)이나 이들의 조합(mixtures)과 관련된 단백질을 코딩하는 모든 RNA 단편들로 구성된 군으로 선택된 적어도 두 개의 mRNA에 대한 안티-센스인 올리고뉴클레오타이드을 포함하는 작용제(agent).
  2. 제 1항에 있어서, 하나의 mRNA는, 전사인자들, 자극 및 활성 인자들, 인터루킨들, 인터루킨 수용체들, 케모킨들(chemokines), 케모킨 수용체들, 내재적으로 생산된 특이적 및 비-특이적 효소들, 면역글로불린들, 항체 수용체들, 중추신경계(central nervous system: CNS)와 말초신경계와 비-신경계의 수용체들, CNS와 말초신경계와 비-신경계의 펩티드 전달물질, 유착 분자들, 디펜신들(defensines), 성장인자들, 혈관작용성 펩티드 및 수용체, 및 결합단백질 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하거나 종양유전자(oncogene)에 대응하는 것임을 특징으로 하는 작용제.
  3. 제2항에 있어서, 코딩된 수용체들 및 펩티드들은, 교감신경자극성 수용체들, 부교감신경계 수용체들, GABA 수용체들, 유착 수용체들, 아데노신 수용체들, 브래디키닌(bradykinin) 수용체들, 인슐린 수용체들, 글루카곤(glucagon) 수용체들, 프로스타글랜딘(prostaglandin) 수용체들, 티로이드 수용체들, 안드로겐 수용체들, 신진대사 수용체(anabolic receptor), 에스트로겐 수용체들, 프로제스테론 수용체들, 응고 카스캐이드(coagulation cascade)와 관련된 수용체들, 아데노하이포피실(adenohypophyseal) 수용체들, 아데노하이포피실 펩티드 전달물질들, 및 히스타민 수용체들(HisR)로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  4. 제 2항에 있어서, 코딩된 교감신경자극성 수용체들 및 부교감신경계 수용체들은, 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase) 수용체들(AcChaseR), 아세틸콜린 수용체들(AcChR), 아트로핀 수용체들, 무스카린 수용체들, 에피네프린 수용체들(EpiR), 도파민 수용체들(DOPAR), 타치친넨(tachychinnen) 수용체들 및 노르에피네프린 수용체들(NEpiR)로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  5. 제 2항에 있어서, 코딩된 효소들은, 중합효소, 키나제, 옥시다제, 포스파타제, 리덕타제, 폴리사카린, 트리글리세라이드 및 단백질 가수분해효소, 에스터라제, 엘라스타제, 및, 폴리사카라이드, 트리글리세라이드, 지질 및 단백질 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  6. 제5항에 있어서, 코딩된 효소들은, 트립타제(tryptase), 유도성 산화질소 중합효소, 사이클로옥시제나제(Cox), MAP 키나제, 호산구 과산화효소, β2-아드레날린 수용체 키나제, 류코트리엔(leukotriene) c-4 중합효소, 5-리포옥시게나제, 포스포디에스터라제 Ⅳ, 금속단백질분해효소(metalloprotenase), CSBP/p38 MAP 키나제, 뉴트로필 엘라스타제, 포스포리파제 A2, 사이클로옥시게나제 2(Cox-2), 푸코실 트란스퍼라제, ⅠκB 키나제 1 및 2, 치마제, 단백질 키나제 C, 티미틸레이트 중합효소, 트립타제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 트립타제, 티미딘 키나제, 디옥시시티딘 키나제, 및 리보뉴클레어타이드 리덕타제로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  7. 제 2항에 있어서, 코딩된 인자는, NfκB 전사인자, 과립구 대식세포 콜로니 자극성 인자(GM-CSP), AP-1 전사인자, 단핵세포 활성화 인자, 뉴트로필 케모택틱??(chemotactic) 인자, 과립구 콜로니-자극성-인자(G-CSF), NFAT 전사인자들, 혈소판 활성화 인자, 종양 괴사 인자α(TNFα), 기저 섬유아세포 성장인자(BFGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  8. 제 2항에 있어서, 코딩된 유착 단백질은, 세포내 유착 분자들 1(ICAM-1), 2(ICAM-2) 및 3(ICAM-3), 혈관세포 유착 분자(VACM), 내피 백혈구 유착 분자-1(ELAM-1), GATA 전사인자, 뉴트로필 유착 수용체, mad CAM-1로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  9. 제2항에 있어서, 코딩된 시토킨, 림포킨, 케모킨들은, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-1β(IL-1)인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-8(IL-8),인터루킨-9(IL-9), 인터루킨-11(IL-11), CCR-5 CC 케모킨 및 란테스(Rantes)로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  10. 제 2항에 있어서, 코딩된 수용체는, 아데노신 A1수용체, 아데노신 A2B 수용체, 아데노신 A3수용체, 엔도텔린 수용체 A, 엔도텔린 수용체 B, IgE 고-친화성 수용체, 무스카린 아세틸콜린 수용체들, 기질 P 수용체, 히스타민 수용체, CCR-1 CC 케모킨 수용체, 기질 P, NK-1 및 NK-3 수용체들, CCR-2CC 케모킨 수용체, CCR-3 CC 케모킨 수용체(Eotaxin Receptor), 인터루킨-1β 수용체(IL-1βR), 인터루킨-1 수용체(IL-1R), 인터루킨-1β 수용체(IL-1βR), 인터루킨-3(IL-3R), CCR-4CC 케모킨 수용체, 시스테인 류코트리엔 수용체들, 프로스타노이드 수용체들, 인터루킨-1 수용체(IL-1R), 인터루킨-4 수용체(IL-4R), 인터루킨-5 수용체(IL-5R), 인터루킨-8 수용체(IL-8R), 인터루킨-9 수용체(IL-9R), 인터루킨-11 수용체(IL-11R), 브라디키닌(bradykinin) B2 수용체, 교감신경자극 수용체들, 부교감신경계 수용체, GABA 수용체들, 아데노신 수용체들, 브라디키닌 수용체들, 인슐린 수용체들, 글루카곤 수용체들, 프로스타글라딘 수용체들, 티로이드 수용체들, 안드로겐 수용체들, 신진대사성 수용체들, 에스트로겐 수용체들, 프로게스트론 수용체들, 응집 캐스캐이드와 관련된 수용체들, 아데노하이포피실 수용체들, 및 히스타민 수용체들(HisR)로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  11. 제 2항에 있어서, 코딩된 단백질은 에오탁신(eotaxin), 주요 기저 단백질(major basic protein), 프리프로엔도텔린(preproendothelin), 호산구 양이온 단백질(eosinnophil cationic protein), P-셀렉틴, STAT 4, STAT 6, c-mas, NF-인터루킨-6(NF-IL-6), MIP-1α, MCP-2, MCP-3, MCP-4, 사이클로필린, PDG2, 사이크로스포린 A-결합 단백질, FK5-결합 단백질, 화이브로넥틴, LFA-1(CD11a/CK18), PECAM-1, C3bi, PSGL-1, CD-34, 기질 P, p150,95, Mac-1(CD11b/CD18), VLA-4, CD-18/CD11a, CD11b/CD 18, C5a, CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, 및 LTB-4로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  12. 제 2항에 있어서, 코딩된 디펜신은, 디펜신 1, 디펜신 2, 및 디펜신 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  13. 제 2항에 있어서, 코딩된 셀렉틴은, α4β1 셀렉틴, α4β7 셀렉틴, LFA-1 셀렉틴, E-셀렉틴, P-셀렉틴, 및 L-셀렉틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  14. 제 2항에 있어서, mRNA는, ras, src, myc, 및 bcl-2로 이루어진 군으로부터 선택된 종양유전자에 대응하는 것임을 특징으로 하는 작용제.
  15. 제 1항에 있어서, 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 중 적어도 하나의 모노뉴클레오타이드-연결하는 포스포다이에스터 잔기는, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스터, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 보라노포스페이트, 포름아세탈, 티오포름아세탈, 티오에테르, 카보네이트, 카바메이트, 설페이트, 설포네이트, 설파메이트, 설폰아마이드, 설폰, 설파이트, 설폭사이드, 설파이드, 하이드록실아민, 메틸렌(메티이미노), 메틸레네옥시(메틸리미노), 2'-O-메틸, 포스포라미데이트 잔기들, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기에 의해 치환된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  16. 제 15항에 있어서, 모든 포스포다이에스터 잔기들로 치환된 것을 특징으로 하는 작용제.
  17. 제 1항에 있어서, 안티-센스 올리고뉴클레오타이드는 약 7 내지 60개의 모노뉴클레오타이드로 구성된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  18. 제 1항에 있어서, 올리고는 적어도 약 15% A를 포함하는 것임을 특징으로 하는 작용제.
  19. 제 1항에 있어서, 올리고는 아데노신이 없는 것임을 특징으로 하는 작용제.
  20. 제 1항에 있어서, 안티-센스 올리고는, 서열번호 - 내지 -, 서열번호 - 내지 -, 및 서열번호 - 내지 -(단편번호 -내지-)로 구성된 올리고들로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  21. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 A는, 티미딘 염기에 결합하나 길항제 활성을 갖는 헤테로 방향족 염기들, 아데노신 A1, A2b및 A3수용체들에 작용제 활성을 갖는 약 0.3이하의 아데노신 염기, 및 아데노신 A2a수용체에 활성을 갖지 않거나 길항제 활성을 갖는 헤테로아로마 염기들로 이루어진 군으로부터 선택된 일반적인 염기로 치환되는 것임을 특징으로 하는 작용제.
  22. 제 21항에 있어서, 헤테로아로마 염기는 피리미딘들 및 퓨린들로 이루어진 군으로부터 선택된 것이되,
    O, 할로(halo), NH2, SH, SO, SO2, SO3, COOH, 및 분지되고 접합된 1차 및 2차 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알콕시, 알케녹시, 아실, 사이클로아실, 아릴아실, 알킨옥시, 사이클로알콕시, 아로일, 아릴티오, 아릴설폭실, 할로사이클로알킬, 알킬사이클로알킬, 알케닐사이클로알킬, 알키닐사이클로알킬, 할로아릴, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 아릴사이클로알킬에 의해 치환될 수 있으며,
    O, 할로, NH, 1차, 2차 및 3차 아민, SH, SO, SO2, SO3, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴에 의해 더 치환될 수 있는 것임을 특징으로 하는 작용제.
  23. 제 22항에 있어서, 피리미딘들 및 퓨린들은 위치 1, 2, 3, 4, 7 및 8에서 치환되는 것임을 특징으로하는 작용제
  24. 제 23항에 있어서, 피리미딘들 및 퓨린들은, 하기 화학식 -을 갖는, 티오필린(theophylline), 카페인, 다이필린(dyphylline), 에토필린(etophylline), 아세필린(acephylline), 피퍼라진(piperazine), 바미필린(bamifylline), 엔프로필린(enprofylline) 및 크산틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 작용제.
    [화학식 1]
    여기서, R1및 R2은 독립적으로 H, 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이고,
    R3은 H, 아릴, 다이사이클로알킬, 다이사이클로알케닐, 다이사이클로아키닐, 사이클로알킬, 사이클로아케닐, 사이클로알키닐, O-사이클로알킬, O-사이클로알케닐, O-사이클로알키닐, NH2-알킬아미노-케톡시알킬옥시-아릴, 및 모노 및 다이아킬아미노알킬-N-알킬아미노-SO2-아릴임.
  25. 제 24항에 있어서, 일반적인 염기는, 3-니트로피롤-2'-디옥시뉴클레오타이드, 5'-니트로-인돌, 2-디옥시리보실-(5-니트로인돌), 2-디옥시리보푸라노실-(5-니트로인돌), 2'-디옥시이노신, 2'-디옥시네불라린, 6H, 8H-3,4-다이하이드로피리미도[4,5-c]옥사진-7-1 또는 2-아미노-6-메톡시아미노푸린 으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  26. 제 1항에 있어서,메틸화된 시토신(mC)은, 올리고로 존재하는 경우 적어도 하나의 CpG 다이뉴클레오타이드로 치환된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  27. 제 1항에 있어서, 안티-센스 올리고뉴클레오타이드는, 세포에 내화되거나(internalized) 흡수된(up-taken) 작용제, 또는 진핵세포 또는 원핵세포 벡터에 작동가능하게 연결된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  28. 제 27항에 있어서, 세포에 내화되거나 흡수된 작용제은 트란스페린, 아지알로클라이코프로테인(asialoglycoprotein), 및 스트렙타비딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 작용제.
  29. 제 1항에 의한 작용제, 및 약학적으로 또는 수의학적으로 수용가능한 캐리어를 함유하는 조성물.
  30. 제 29항에 있어서, 캐리어는, 가스, 액체, 고체 캐리어로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제 29항에 있어서, 다른 치료학적 화합물들, 계면활성제들, 산화방지제들, 방향제 및 착색제들, 충전제들, 휘발성 오일들, 완충제들, 분산제들, RNA 불활성제들, 산화방지제들, 방향제들, 추진제들 및 방부제들로 이루어진 군으로부터 선택된 작용제을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제 29항에 있어서, 안티-센스 올리고뉴클레오타이드는, 약 99.99 w/w의 조성물에 대하여 약 0.01정도의 양으로 존재한느 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제 32항에 있어서, 핵산, 계면활성제 및 캐리어를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제 33항에 있어서, 계면활성제는, 계면활성제 단백질 A, 계면활성제 단백질 B, 계면활성제 단백질 C, 계면활성제 단백질 D 및 이들의 계면활성제 단백질과 활성 단편들, 비-다이팔미토일 불포화 포스파티딜콜린, 다이팔미토일포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜인시톨, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 인산, 유비퀴논들, 리소소스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜콜린, 팔미토일-리소포스파티딜콜린, 디하이드로에피안드로스테론, 돌리콜들, 황산, 글리세롤-3-포스페이트, 다이하이드록시아세톤 포스페이트, 글리세롤, 글리세롤-3-포스포콜린, 다이하이드록시아세톤, 팔미트산염, 시티딘 다이포스페이트 (CDP) 다이아실글리세롤, CDP 콜린, 콜린, 콜린 포스페이트, 계면활성제 성분들을 위한 인공 라멜라체 부형제들, 오메가-3 자방산들, 폴리에닉산, 폴리에노익산, 레시틴, 팔미트산, 비-이온 에틸ㄹ렌 및/또는 프로필렌 옥사이드 블럭 공중합체들, 폴리옥시프로필렌, 폴리옥시에틸렌, 덱스트란 및/또는 알카노일 측쇄들을 갖는 폴리(비닐 아민), Brij 35, 트리톤 X-100, ALEC, 엑소서프(Exosurf), 서번트(Survant) 및 아토바큐온(Atovaquone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 제 26항의 조성물을 포함하되, 캐리어는 소수성 캐리어인 것을 특징으로 하는 제재(formulation).
  36. 제 35항에 있어서, 캐리어는 지질 미립자들 또는 부형제인 것을 특징으로 하는 제재.
  37. 제 36항에 있어서, 부형제들은 리포솜들을 이루어져 있으며 미립자들은 마이크로 크리스탈들로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 제재.
  38. 제 35항에 있어서, 지질 부형제들은 N-(1-[2,3-다이올레옥실옥시]프로필)-N,N,N-트리메틸-암모늄 메틸설페이트로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 제재.
  39. 제 34항에 있어서, 호흡에 적합한 제제를 함유하는 것을 특징으로 하는 제재.
  40. 제 34항에 있어서, 에어로졸을 함유하는 것을 특징으로 하는 제재.
  41. 제 34항에 있어서, 단독 또는 복합 유니트 형식으로 있는 것을 특징으로 하는 제재.
  42. 제 34항에 있어서, 원액(bulk)상태로 있는 것을 특징으로 하는 제재.
  43. 제 26항의 조성물을 함유하는 캡슐 또는 약포(cartrige).
  44. 분리된 용기상태로 있는 전달 기구(delivery device), 제 26항의 조성물 및 용도에 대한 설명서를 포함하는 키트.
  45. 제 44항에 있어서, 전달 기구는, 1회 측정된 투여량의 제재를 전달하는 분무기(nebulizer)를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  46. 제 44항에 있어서, 분무기는 취분기(insufflator)로 이루어져 있으며, 조성물은 꿰뚫을 수 있거나 열 수 있는 캡슐 또는 약포로 제공되는 것을 특징으로 하는 키트.
  47. 제 44항에 있어서, 전달 기구는 압축된 흡입기(inhaler)로 이루어져 있으며, 조성물은 현탄액 또는 용액상의 작용제으로 이루져 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  48. 제 44항에 있어서, 다른 치료학적 화합물들, 계면활성제들, 산화방지제들, 방향제 및 착색제들, 충전제들, 휘발성 오일들, 완충제들, 분산제들, 세포에 내화되거나(internalized) 흡수된(up-taken) 작용제, RNA 불활성제들, 산화방지제들, 방향제들, 추진제들 및 방부제들로 이루어진 군으로부터 선택된 작용제이 분리된 용기로 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  49. 제 48항에 있어서, 계면활성제는, 계면활성제 단백질 A, 계면활성제 단백질 B, 계면활성제 단백질 C, 계면활성제 단백질 D 및 이들의 계면활성제 단백질과 활성 단편들, 비-다이팔미토일 불포화 포스파티딜콜린, 다이팔미토일포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜인시톨, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 인산, 유비퀴논들, 리소소스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜콜린, 팔미토일-리소포스파티딜콜린, 디하이드로에피안드로스테론, 돌리콜들, 황산, 글리세롤-3-포스페이트, 다이하이드록시아세톤 포스페이트, 글리세롤, 글리세롤-3-포스포콜린, 다이하이드록시아세톤, 팔미트산염, 시티딘 다이포스페이트 (CDP) 다이아실글리세롤, CDP 콜린, 콜린, 콜린 포스페이트, 계면활성제 성분들을 위한 인공 라멜라체 부형제들, 오메가-3 자방산들, 폴리에닉산, 폴리에노익산, 레시틴, 팔미트산, 비-이온 에틸렌 및/또는 프로필렌 옥사이드 블럭 공중합체들, 폴리옥시프로필렌, 폴리옥시에틸렌, 덱스트란 및/또는 알카노일 측쇄들을 갖는 폴리(비닐 아민), Brij 35, 트리톤 X-100, ALEC, 엑소서프(Exosurf), 서번트(Survant) 및 아토바큐온(Atovaquone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 키트.
  50. 제 44항에 있어서, 조성물은 캡슐 또는 약포 상태로 제공되는 것을 특징으로 하는 키트.
  51. 제 1항의 작용제을 포함하는 세포.
  52. 적어도 하나 이상의 표적 유전자(들), 게놈의 인접(flanking) 영역들, 또는 단백질들에 대응하는 mRNA와 관련된 질환 또는 질병을 치료하는 방법에 있어서,
    상기 질환 또는 질병에 걸린 피실험자에게 제 1항의 작용제을 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 작용제는, 피실험자에 의해 적어도 하나 이상의 표적 mRNA의 생산성 또는 유효성을 감소시키거나 분해를 증가시키는데 유효한 투여량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 52항에 있어서, 적어도 두개의 표적 mRNA들의 생산 또는 유효성을 감소시키거나 분해를 증가시키는데 유효한 투여양으로 상기 작용제을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 52항에 있어서, 상기 작용제을 피실험자의 폐에 직접 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 54항에 있어서, 상기 작용제을 호흡에 알맞은 에어로졸로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 52항에 있어서, 질환 또는 질병은 폐 질환 또는 질병이고, 적어도 하나의 표적 mRNA는,아데노신 A1수용체, 아데노신 A2B 수용체, 아데노신 A3수용체 및 브라디킨 B2 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 56항에 있어서, 질환 또는 질병은 피실험자의 기도(airways)의 장애와 관련된 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 57항에 있어서, 질환 또는 질병은 천식인 것을 특징으로 하는 방법.
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