KR20010024585A - Tumor-specific antigens, methods for their production and their use for immunization and diagnosis - Google Patents

Abstract

엑손-코딩되는 종양 항원의 인트론에 의해 적어도 부분적으로 코딩되고, (a) 엄격한 조건 하에서 엑손-코딩되는 종양 항원의 인트론 서열과 혼성화하는 핵산 단편이 프라이머로 사용되는, 종양 세포의 가용성 세포질 부분으로부터 단리되는 mRNA로부터의 역전사효소 PCR , (b) 상기 PCR 생성물의 단리, 숙주 세포 내에서 상기 PCR 생성물 또는 그의 단편의 발현, 및 종양-특이적 항원의 엑손 서열과도 혼성화하는 상기 PCR 생성물 또는 그의 단편에 의해 코딩되는 상기 종양-특이적 항원의 단리에 의해 수득되는, 종양-특이적 폴리펩티드 항원은 종양 질병과 관련되는 진단 및 치료적 용도에 유용하다.Isolation from the soluble cytoplasmic portion of tumor cells, at least partially encoded by introns of exon-encoded tumor antigens and (a) a nucleic acid fragment that hybridizes with the intron sequences of exon-encoded tumor antigens under stringent conditions is used as a primer Reverse transcriptase PCR from mRNA, (b) isolation of said PCR product, expression of said PCR product or fragment thereof in a host cell, and hybridization to said PCR product or fragment thereof that also hybridizes with exon sequences of tumor-specific antigens Tumor-specific polypeptide antigens, obtained by isolation of such tumor-specific antigens encoded by, are useful for diagnostic and therapeutic uses associated with tumor disease.

Description

종양-특이적 항원, 이들의 제조방법, 및 이들의 면역화 및 진단에서의 용도{TUMOR-SPECIFIC ANTIGENS, METHODS FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR USE FOR IMMUNIZATION AND DIAGNOSIS}TUMOR-SPECIFIC ANTIGENS, METHODS FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR USE FOR IMMUNIZATION AND DIAGNOSIS}

본 발명은 새로운 종양-특이적 항원, 이들의 제조방법, 및 이들의 면역화, 특히 세포독성이고 종양-특이적인 T-림프구의 활성화, 및 MHC 클래스 I-복합체 내에서 상기 종양-특이적 항원을 제시하는 종양세포용 특이적 진단을 위한 용도에 관한 것이다.The present invention provides novel tumor-specific antigens, methods for their preparation, and their immunization, in particular the activation of cytotoxic and tumor-specific T-lymphocytes, and presenting such tumor-specific antigens in MHC class I-complexes. It relates to the use for specific diagnosis for tumor cells.

면역계는 암에 대한 면역 감시 및 종양 퇴행에서 중요한 역할을 한다. 항-종양 면역 반응은 종양 세포 상에서 발현되는 종양 항원을 인식하는 B 및 T 세포를 통해 매개될 수 있다. 최근 몇년 동안 암환자로부터 유래된 종양-침윤 림프구 (tumor-infiltrating lymphocyte: TIL) 또는 말초혈 림프구로부터의 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte: CTL)의 발생은 인간의 종양 퇴행 과정에서 T 세포의 가치를 검토하도록 했다.The immune system plays an important role in immune surveillance against cancer and tumor regression. Anti-tumor immune responses can be mediated through B and T cells that recognize tumor antigens expressed on tumor cells. In recent years, the development of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) derived from cancer patients or cytotoxic T lymphocytes (CTLs) from peripheral blood lymphocytes has been associated with the value of T cells in the course of human tumor regression. To review.

인터루킨 2 (IL-2)와 함께 종양-침윤 림프구를 암 자가환자에 양자면역세포이입하면 인간에서 종양이 퇴행되도록 할 수 있고 (Rosenberg et al., New Engl. J. Med. 319 (1988) 1676-1680: Rosenberg et al., J. Natl. Cancer Inst. 86 (1994) 1159-1166), 이것은 T 세포가 생체내에서 종양거부에 중요한 역할을 한다는 것을 제안한다. 생체내에서 종양 퇴행을 매개할 수 있는 능력은 생체외에서 유전적 동계의 종양 세포와 함께 배양했을 때 특정한 용해 및 시토킨 방출을 매개하는 TIL의 능력과 연결되어 생각되었다 (Barth et al., J. Exp. Med. 173 (1991) 647-658).Adopting tumor-infiltrating lymphocytes with interleukin 2 (IL-2) in cancer autologous patients can lead to tumor regression in humans (Rosenberg et al., New Engl. J. Med. 319 (1988) 1676 -1680: Rosenberg et al., J. Natl. Cancer Inst. 86 (1994) 1159-1166), suggesting that T cells play an important role in tumor rejection in vivo. The ability to mediate tumor regression in vivo was thought to be linked to the ability of TILs to mediate specific lysis and cytokine release when incubated with genetic syngeneic tumor cells in vitro (Barth et al., J. Exp.Med. 173 (1991) 647-658).

T 세포-매개 항-종양 반응의 분자적 근거를 이해하기 위해, 종양 항원을 코딩하는 T 세포에 의해 인식되는 다양한 유전자들이 확인되었다 (Boon et al., Annu. Rev. Immunol. 12 (1994) 337-365): Houghton, J. Exp. Med. 180 (1994) 1-4: Tsomides and Eisen, Proc. Natl. Acad Sci. USA 91 (1994) 3487-3489: Pardoll, Nature 369 (1994) 357-358: Rosenberg, Cancer J. Sci. Am. 1 (1995) 90-100). 이러한 항원들을, 발현 양식을 기초로 하여, 여러 군으로 나눌 수 있다.To understand the molecular basis of T cell-mediated anti-tumor responses, various genes recognized by T cells encoding tumor antigens have been identified (Boon et al., Annu. Rev. Immunol. 12 (1994) 337 (365): Houghton, J. Exp. Med. 180 (1994) 1-4: Tsomides and Eisen, Proc. Natl. Acad Sci. USA 91 (1994) 3487-3489: Pardoll, Nature 369 (1994) 357-358: Rosenberg, Cancer J. Sci. Am. 1 (1995) 90-100). These antigens can be divided into several groups based on expression patterns.

종양 항원의 제 1 군에는 흑색종 및 고환 및 태반 이외의 정상 조직에 의한 것이 아닌 다양한 조직학적 유형의 다른 종양 사이에서 분배되는 항원 (예를 들어 MAGE, BAGE 및 GAGE)이 포함된다 (Van der Bruggen et al., Science 254 (1991) 1643-1647: Boel et al., Immunity 2 (1995) 167-175: Van der Eynde et al., J. Exp. Med. 182 (1995) 689-698). 다른 HLA-클래스 I 대립유전자에 의해 제한되는 CTL에 의해 인식되는 이러한 항원의 사용을 기초로 한 임상 시험이 흑색종 및 기타 종양성 질환에 걸린 환자에서 진행 중이다 (Marchand et al., Int. J. Cancer 63 (1995) 883-885: Rosenbeg, Immunology Today (1997) 175-182). 각각의 이러한 항원의 발현 빈도 및 HLA 클래스 I 대립유전자의 발현 빈도를 감안하여, 백인 흑색종 환자의 60 % 초과, 머리 및 목 암 환자의 40 % 및 방광암 환자의 28 %가 이러한 군의 하나 이상의 항원으로의 면역화에 적합하다. 치료된 환자에서 부작용은 검출되지 않았다. 실제로, MAGE, BAGE 및 GAGE 유전자 발현은, 항원제시에 필요한 고전적 MFC 클래스 I 분자가 발현되지 않아서 T 세포에 의해 표적화되지 않는 정원세포 및 정모세포 (II)와 같은 고환 세포에서 정상적으로 일어난다 (Hass et al., Am. J. Reprod. Immunol. Microbiol. 18 (1988) 47-57).The first group of tumor antigens includes melanoma and antigens (e.g., MAGE, BAGE and GAGE) that are distributed between different tumors of various histological types and not by normal tissues other than testes and placenta (Van der Bruggen et al., Science 254 (1991) 1643-1647: Boel et al., Immunity 2 (1995) 167-175: Van der Eynde et al., J. Exp. Med. 182 (1995) 689-698). Clinical trials based on the use of these antigens recognized by CTLs restricted by other HLA-class I alleles are ongoing in patients with melanoma and other tumorous diseases (Marchand et al., Int. J. Cancer 63 (1995) 883-885: Rosenbeg, Immunology Today (1997) 175-182). Given the frequency of expression of each such antigen and the frequency of expression of the HLA class I allele, more than 60% of white melanoma patients, 40% of head and neck cancer patients and 28% of bladder cancer patients have one or more antigens in this group. Suitable for immunization with No side effects were detected in the treated patients. Indeed, MAGE, BAGE and GAGE gene expression normally occurs in testicular cells such as spermatogonia and spermatogonia (II) that do not express the classical MFC class I molecules required for antigen presentation and thus are not targeted by T cells (Hass et al. , Am. J. Reprod. Immunol.Microbiol. 18 (1988) 47-57).

종양 항원의 제 2 군에는 멜라닌세포 계통의 정상 및 종양성 세포에서 발현되는 조직-특이적 항원이 포함된다. CTL은 티로시나제로부터의 에피토프를 인식한다 (Brichard et al., J. Exp. Med. 178 (1993) 489-49513). 흑색종 및 정상 배양 멜라닌세포 상의 멜란A^Mart1(Coulie et al., J.Exp. Med. 180 (1994) 35-42; Castelli et al., J. Exp. Med 181 (1995) 363-368; Kawakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1991) 3515-3519), gp100^Pme17(Bakker et al., J. Exp. Med 179 (1994) 1005-1009; Kawakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 6458-6462), gp75^TRP1(Wang et al., J. Exp. Med 181 (1995) 799-804) 및 TRP-2 (Wang et al., J. Exp. Med 184 (1996) 2207-2216)는 많은 흑색종 환자로부터 생체외에서 발전될 수 있다. 따라서, 흑색종 환자의 다수는 이러한 항원에 대해 T 세포 반응을 일으키려는 면역치료 시험에 잠재적으로 이로울 수 있다. 실제로, 분화 항원이 대부분의 모든 흑색종에서 발현되고, 이들의 대다수가 다양한 인종 군에서의 빈도가 놓은 HLA-A2 대립유전자에 의해 면역 대사인자에 제시된다. 그러나, 정상 조직(즉, 피부 멜라닌세포 및 착색된 망막세포)에 대한 교차반응성 반응의 진전으로 인한 이러한 치료의 잠재적인 부작 을 주의깊게 고려해야 한다.The second group of tumor antigens includes tissue-specific antigens expressed in normal and neoplastic cells of the melanocyte lineage. CTLs recognize epitopes from tyrosinase (Brichard et al., J. Exp. Med. 178 (1993) 489-49513). Melan A ^Mart1 on melanoma and normal culture melanocytes (Coulie et al., J. Exp. Med. 180 (1994) 35-42; Castelli et al., J. Exp. Med 181 (1995) 363-368; Kawakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1991) 3515-3519), gp100 ^Pme17 (Bakker et al., J. Exp. Med 179 (1994) 1005-1009; Kawakami et al., Proc. Natl.Acad.Sci. USA 91 (1994) 6458-6462), gp75 ^TRP1 (Wang et al., J. Exp. Med 181 (1995) 799-804) and TRP-2 (Wang et al., J. Exp Med 184 (1996) 2207-2216) can be developed ex vivo from many melanoma patients. Thus, many of the melanoma patients can potentially benefit immunotherapy trials that attempt to elicit T cell responses to these antigens. Indeed, differentiation antigens are expressed in most all melanoma, the majority of which are presented to immune metabolites by HLA-A2 alleles placed in frequency in various ethnic groups. However, carefully consider the potential side effects of this treatment due to the development of cross-reactive responses to normal tissues (ie dermal melanocytes and pigmented retinal cells).

종양 항원의 제 3 군에는 종양세포에 의해서만 발현되고 이들로부터 단리되는 종양향원이 포함된다. 이같은 항원은 다른 기원의 기타 정상 또는 종양성 조직에서는 발현되지 않고, 일반적으로 항원성 에피토프는 다르게는 편재하여 발현되는 단백질에서 일어나는 점돌연변이에 의해 생성된다. 이러한 군에 속하는 종양 항원은 마우스 시스템 (Boon et al., Annu. Rev. Immunol. 12 (1994) 337-365) 및 일부 인간 종양 (Wolfel et al., Science 269 (1995) 1281-1284: Coulie et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 92 (1995) 7976-7980; Robbins et al., J. Exp. Med 183 (1996) 1185-1192)에서 기재되어 있다. 이러한 항원에 대한 자연적인 내성의 결핍은 잠재적인 자가면역 반응을 피하면서 강한 면역 반응을 일으킬 수 있다. 그러나, 광범위한 돌연변이 다발점의 패널이 발견될 때까지, 이같은 항원의 임상 적용은 종양이 주어진 돌연변이를 지니는 개인 환자 또는 적어도 매우 소수의 개인의 치료로 제한되어야 한다 (Wolfel et al., Science 269 (1995) 1281-1284).The third group of tumor antigens includes oncogenes expressed only by and isolated from tumor cells. Such antigens are not expressed in other normal or tumorous tissues of other origin, and generally antigenic epitopes are produced by point mutations that occur in proteins that are otherwise ubiquitous expressed. Tumor antigens belonging to this group include the mouse system (Boon et al., Annu. Rev. Immunol. 12 (1994) 337-365) and some human tumors (Wolfel et al., Science 269 (1995) 1281-1284: Coulie et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 92 (1995) 7976-7980; Robbins et al., J. Exp. Med 183 (1996) 1185-1192). Lack of natural resistance to these antigens can cause a strong immune response while avoiding potential autoimmune responses. However, until a broad panel of mutations has been found, clinical application of such antigens should be limited to the treatment of individual patients or at least very few individuals with a given mutation (Wolfel et al., Science 269 (1995). 1281-1284).

종양 항원의 제 4 군은 대안적으로 처리된 전사물로부터 유래된다. Robins 등은 [J. Immunol. 159 (1997) 303-308]에서 제 4 인트론 부분에 해당되고 정상적인 gp100 당단백질에서는 발견되지 않는 추가적인 35 개의 아미노산을 코딩하는 gp100 전사물을 서술하였다. 그러나, 이 에피토프는 흑색종에서 낮은 수준으로만 발현된다. Robins 등은 [J. Immunol. 154 (1995) 5944-5950]에서 흑색종-특이적 HLA-A24 제한 종양-침윤 림프구에 의해 인식되는 항원을 코딩하는 유전자의 클로닝을 서술하였다. 이 항원은 인트론 또는 이것의 일부분에 의해 코딩되지 않는 전체 길이 클론의 단편이다.The fourth group of tumor antigens are derived from alternatively treated transcripts. Robins et al. [J. Immunol. 159 (1997) 303-308, describe a gp100 transcript that encodes an additional 35 amino acids corresponding to the fourth intron portion and not found in normal gp100 glycoproteins. However, this epitope is expressed only at low levels in melanoma. Robins et al. [J. Immunol. 154 (1995) 5944-5950, the cloning of genes encoding antigens recognized by melanoma-specific HLA-A24 restriction tumor-infiltrating lymphocytes. This antigen is a fragment of a full length clone that is not encoded by an intron or part thereof.

Fujii 등은 [J. Immunol. 153 (1994) 5516-5524]에서 인트론 4를 함유하는 mRNA에 의해 코딩되는, 가용성 형태의 종양파괴성이 아닌 HLA-G 항원을 서술하였다. 그러나, 가용성 HLA-G 단백질에 대한 특정한 기능은 현재 알려지지 않았다.Fujii et al. [J. Immunol. 153 (1994) 5516-5524 describe a soluble form of oncolytic HLA-G antigen, encoded by mRNA containing intron 4. However, the specific function for soluble HLA-G protein is currently unknown.

멜라닌세포 또는 다른 조직학적 기원의 기타 표적이 아니라, 자가 및 HLA-대등 대립유전자성 흑색종을 인식할 수 있는 CTL 클론 패널의 반응성 패턴을 기초로 하여, 종양 항원의 제 5 세트의 존재가 현재 제안되고 있다 (Anichini et al., J. Immunol. 156 (1996) 208-217).Based on the reactivity pattern of a panel of CTL clones capable of recognizing autologous and HLA-comparative allelic melanoma, but not melanocytes or other targets of other histological origin, the presence of a fifth set of tumor antigens is currently proposed. (Anichini et al., J. Immunol. 156 (1996) 208-217).

본 발명의 목표는 정상 세포에서는 발현되지 않고 정상 세포로부터 종양세포를 명확하게 구분할 수 있는 새로운 종양-특이적 항원을 제공하는 것이다.It is an aim of the present invention to provide new tumor-specific antigens which are not expressed in normal cells and are capable of clearly distinguishing tumor cells from normal cells.

발명의 개요Summary of the Invention

본 발명은 항원성 효과를 갖는 종양-특이적 폴리펩티드로, 종양 세포 상의 MHC 클래스 I 복합체에 의해 제시되는 폴리펩티드 (엑손-코딩되는 종양 항원)의 유전자로부터의 인트론 서열에 의해 부분적으로 코딩되고, 엄격한 조건 하에서 엑손-코딩되는 종양 항원의 인트론 서열과 혼성화하는 핵산 단편이 프라이머로 사용되는, 종양 세포의 가용성 세포질 부분으로부터 단리된 mRNA로부터의 역전사효소 PCR 에 의해 수득될 수 있고, PCR 생성물이 수득되면, PCR 생성물의 단리, 숙주세포에서의 발현 및 PCR 생성물에 의해 코딩되는 종양-특이적 항원의 단리에 의해 수득될 수 있는 폴리펩티드로 구성된다.The present invention is a tumor-specific polypeptide having an antigenic effect, partially encoded by intron sequences from genes of polypeptides (exon-coded tumor antigens) presented by MHC class I complexes on tumor cells, and subject to stringent conditions Nucleic acid fragments that hybridize with the intron sequences of tumor antigens that are exon-coded below can be obtained by reverse transcriptase PCR from mRNA isolated from the soluble cytoplasmic portion of tumor cells, where a PCR product is obtained. Consisting of polypeptides obtainable by isolation of the product, expression in host cells and isolation of tumor-specific antigens encoded by PCR products.

이러한 항원은 특정한 CTL 반응을 일으키기 위해 항원제시 세포 (APC)에 의해 단편으로 제시될 수 있다.Such antigens can be presented in fragments by antigen presenting cells (APCs) to elicit specific CTL responses.

본 발명의 또다른 목표는 항원성 효과를 갖는 이같은 종양-특이적 폴리펩티드의 확인 방법으로 하기를 수행하는 방법이다:Another aim of the present invention is a method of identifying such tumor-specific polypeptides having antigenic effect:

- 엄격한 조건 하에서 엑손-코딩되는 종양 항원의 인트론 서열과 혼성화하는 핵산 단편이 프라이머로 사용되는, 종양 세포의 mRNA로부터의 역전사효소 PCR:Reverse transcriptase PCR from mRNA of tumor cells, wherein nucleic acid fragments that hybridize with intron sequences of exon-encoded tumor antigens under stringent conditions are used as primers:

- PCR 생성물이 수득되면: PCR 생성물의 단리, 숙주 세포 내에서의 발현, 및 종양-특이적 항원의 엑손 서열과도 혼성화하는 PCR 생성물에 의해 코딩되는 종양-특이적 항원의 단리.Once the PCR product is obtained: isolation of the PCR product, expression in the host cell, and the isolation of the tumor-specific antigen encoded by the PCR product which also hybridizes with the exon sequence of the tumor-specific antigen.

단리 후에, 혼성화 생성물, 또는 이들의 단편을 발현 벡터 내로 삽입하고, 벡터를 적합한 숙주 세포 내로 옮겨서 이 숙주 세포 내에서 발현시킨다. 이어서, 생성된 재조잡 폴리펩티드를 단리한다.After isolation, the hybridization product, or fragment thereof, is inserted into an expression vector and the vector is transferred into a suitable host cell for expression in this host cell. The resulting reassorted polypeptide is then isolated.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 혼성화 생성물의 8 내지 12 코돈의 단편을 항원의 발현을 위해 사용한다.In a preferred embodiment of the invention, fragments of 8-12 codons of hybridization products are used for expression of the antigen.

따라서, 본 발명의 주제는 엑손-코딩되는 종양 항원의 인트론에 의해 부분적으로 코딩되고, 하기에 의해 수득되는 종양-특이적 폴리펩티드 항원이다:Accordingly, a subject of the invention is a tumor-specific polypeptide antigen, partially encoded by the intron of an exon-encoded tumor antigen, obtained by:

(a) 엄격한 조건 하에서 엑손-코딩되는 종양 항원의 인트론 서열과 혼성화하는 핵산 단편이 프라이머로 사용되는, 종양 세포의 가용성 세포질 부분으로부터 단리되는 mRNA로부터의 역전사효소 PCR,(a) reverse transcriptase PCR from mRNA isolated from the soluble cytoplasmic portion of tumor cells, wherein nucleic acid fragments that hybridize with intron sequences of exon-encoded tumor antigens under stringent conditions are used as primers,

(b) 상기 PCR 생성물의 단리, 숙주 세포 내에서 상기 PCR 생성물 또는 그의 단편의 발현, 및 종양-특이적 항원의 엑손 서열과도 혼성화하는 상기 PCR 생성물 또는 그의 단편에 의해 코딩되는 상기 종양-특이적 항원의 단리.(b) isolation of said PCR product, expression of said PCR product or fragment thereof in a host cell, and said tumor-specific encoded by said PCR product or fragment thereof which also hybridizes with exon sequences of tumor-specific antigens Isolation of the antigen.

본 발명의 또다른 주제는 상기 PCR 생성물의 8 내지 12 코돈의 단편이 발현을 위해 사용되는, 본 발명에 따른 종양-특이적 폴리펩티드이다.Another subject of the invention is a tumor-specific polypeptide according to the invention, wherein fragments of 8 to 12 codons of said PCR product are used for expression.

또한 본 발명의 또다른 주제는 엑손-코딩되는 종양 항원이 MAGE, BAGE 및 GAGE와 같은 CTL 인식 항원, 티로시나아제로부터의 CTL 인식 에피토프, 멜란A^Mart1, gp100^Pme17, gp75^TRP1및 TRP-2인, 본 발명에 따른 종양-특이적 폴리펩티드 항원이다.Another subject of the invention is also that the exon-encoded tumor antigens are CTL recognition antigens such as MAGE, BAGE and GAGE, CTL recognition epitopes from tyrosinase, Melan A ^Mart1 , gp100 ^Pme17 , gp75 ^TRP1 and TRP-2, Tumor-specific polypeptide antigens according to the invention.

또한 본 발명은 서열 번호 1에 의해 코딩되는 종양-특이적 폴리펩티드 항원에 관한 것이다.The invention also relates to a tumor-specific polypeptide antigen encoded by SEQ ID NO: 1.

본 발명의 추가적인 주제는 엑손-코딩되는 종양 항원의 인트론에 의해 코딩되는 종양-특이적 항원의 mRNA의 단리 방법으로, 하기의 것이 수행되는 방법이다:A further subject of the invention is a method of isolating mRNA of tumor-specific antigens encoded by introns of exon-encoded tumor antigens, wherein:

(a) 엄격한 조건 하에서 엑손-코딩되는 종양 항원의 인트론 서열과 혼성화하는 핵산 단편이 프라이머로 사용되는, 종양 세포의 가용성 세포질 부분으로부터 단리되는 mRNA로부터의 역전사효소 PCR,(a) reverse transcriptase PCR from mRNA isolated from the soluble cytoplasmic portion of tumor cells, wherein nucleic acid fragments that hybridize with intron sequences of exon-encoded tumor antigens under stringent conditions are used as primers,

(b) 상기 항원의 엑손 서열과도 혼성화하는 PCR 생성물의 단리.(b) Isolation of a PCR product that also hybridizes with the exon sequence of the antigen.

또한 본 발명은 종양-특이적 세포독성 T-세포의 증식을 측정하는 방법으로, 본 발명에 따른 종양-특이적 항원을 항원제시세포 및 세포독성 T-세포를 함유하는 환자의 체액 시료에 첨가하고, 바람직하게는 시토킨 방출의 측정을 통해 (TNF, IFNγ, GM-CSF와 같은 시토킨의 측정) 세포독성 T-세포의 증식을 측정하는 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention provides a method for measuring the proliferation of tumor-specific cytotoxic T-cells, wherein the tumor-specific antigen according to the present invention is added to a bodily fluid sample of a patient containing antigen-presenting cells and cytotoxic T-cells. , Preferably, by measuring cytokine release (measurement of cytokines such as TNF, IFNγ, GM-CSF) for measuring proliferation of cytotoxic T-cells.

본 발명의 또다른 주제는 본 발명에 따른 종양-특이적 항원을 코딩하는 핵산의 종양 질병 치료용 치료제의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.Another subject of the invention relates to the use of a nucleic acid encoding a tumor-specific antigen according to the invention for the preparation of a therapeutic agent for the treatment of tumor diseases.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 종양-특이적 항원의 생체내 또는 생체외에서 T 전구체 세포로부터의 세포독성 T 세포의 활성화를 위한 용도에 관한 것이다.The invention also relates to the use for the activation of cytotoxic T cells from T precursor cells in vivo or ex vivo of a tumor-specific antigen according to the invention.

본 발명의 추가적인 주제는 항원-특이적 폴리펩티드 항원의 제조방법으로, 종양-특이적 항원이 하기에 의해 수득되는 방법이다:A further subject of the invention is a method of preparing an antigen-specific polypeptide antigen, wherein the tumor-specific antigen is obtained by:

(a) 엄격한 조건 하에서 엑손-코딩되는 종양 항원의 인트론 서열과 혼성화하는 핵산 단편이 프라이머로 사용되는, 종양 세포의 가용성 세포질 부분으로부터 단리되는 mRNA로부터의 역전사효소 PCR,(a) reverse transcriptase PCR from mRNA isolated from the soluble cytoplasmic portion of tumor cells, wherein nucleic acid fragments that hybridize with intron sequences of exon-encoded tumor antigens under stringent conditions are used as primers,

(b) 상기 PCR 생성물의 단리, 숙주 세포 내에서 상기 PCR 생성물 또는 그의 단편의 발현, 및 상기 종양-특이적 항원의 엑손 서열과도 혼성화하는 상기 PCR 생성물 또는 그의 단편에 의해 코딩되는 상기 종양-특이적 항원의 단리.(b) isolation of said PCR product, expression of said PCR product or fragment thereof in a host cell, and said tumor-specific encoded by said PCR product or fragment thereof which also hybridizes with the exon sequence of said tumor-specific antigen Isolation of enemy antigens.

또한 본 발명의 또다른 주제는 엄격한 조건 하에서 엑손-코딩되는 종양 항원의 인트론 서열과 혼성화하고 mRNA로부터의 역전사효소 PCR용 프라이머쌍으로 사용될 수 있는 두 핵산의 조합물이다.Another subject of the invention is also a combination of two nucleic acids that hybridize with intron sequences of exon-encoded tumor antigens under stringent conditions and can be used as primer pairs for reverse transcriptase PCR from mRNA.

본 발명의 추가적인 주제는 서열 번호 3 내지 서열 번호 9에 의해 코딩되는 핵산이다.A further subject of the invention is the nucleic acid encoded by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 9.

본 발명에 따른 종양 항원은 멜라닌 세포와 같은 정상 세포의 표면에서는 발견되지 않는다. 그러나, 이것은 예를 들어 흑색종 세포의 80 %초과에서 발견되고 따라서 종양 세포에 특이적이다.Tumor antigens according to the invention are not found on the surface of normal cells such as melanocytes. However, it is found in more than 80% of melanoma cells, for example, and therefore is specific for tumor cells.

따라서, 이 펩티드는 환자의 종양 세포-특이적 면역화에 특히 적합하고, 흑색종 세포 및 정상 멜라닌세포의 진단성 분화에도 적합하다.Thus, this peptide is particularly suitable for tumor cell-specific immunization of patients and also for diagnostic differentiation of melanoma cells and normal melanocytes.

전이성 흑색종 환자의 말초혈 림프구로부터 유래된 세포독성 T 림프구 클론 (CTL 128)은 HLA A6801 제한된 방식으로 여러 동종 흑색종 및 자가 종양을 용해시킬 수 있었다. CTL 128 에 의해 인식되는 항원을 코딩하는 유전자는, 자가 흑색종 mRNA로부터 구축된 cDNA 라이브러리를 HLA A6801 대립유전자를 발현시키는 Cos-7 세포 내로 트랜스펙션시킴으로써 확인되었다. 놀랍게도 멜라닌세포와는 대조적으로 mRNA 성숙에서 스플라이싱 에러가 발생한다는 것이 발견되었다. 그 결과, 인트론 4의 일부분 및 인트론 2가 반복되는 엑손 1-4를 함유하는 (TRP-2-INT2) 부분적으로 스플라이싱된 형태의 멜라닌세포 분화 항원 (TRP)-2으로 구성되는 펩티드가 번역된다. TRP-2-INT2는, TRP-2의 동일한 리딩 프레임을 사용하여, 위치 400 내의 개시 코돈으로부터 18 개의 뉴클레오티드 하류 펩티드 코딩 부위인 인트론 2 내에 위치한 종결인자 부위 (n:1113)까지 미치는 아미노산 238 개의 추정 단백질을 코딩한다.Cytotoxic T lymphocyte clones (CTL 128) derived from peripheral blood lymphocytes from patients with metastatic melanoma were HLA A 6801 It was possible to dissolve several allogeneic melanoma and autologous tumors in a limited manner. The gene encoding the antigen recognized by CTL 128, HLA A cDNA library constructed from autologous melanoma mRNA This was confirmed by transfection into Cos-7 cells expressing the 6801 allele. It was surprisingly found that splicing errors occur in mRNA maturation in contrast to melanocytes. As a result, a peptide consisting of a part of intron 4 and (TRP-2-INT2) partially spliced form of melanocyte differentiation antigen (TRP) -2 containing exon 1-4 in which intron 2 is repeated is translated do. TRP-2-INT2, using the same reading frame of TRP-2, estimates 238 amino acids from the start codon at position 400 to the terminator site (n: 1113) located in 18 nucleotides downstream peptide coding site, intron 2 Code the protein.

분화 항원 TRP-2는 [R.F. Wang, J. Experimental Medicine 184 (1996) 2207-2216]에 서술되어 있다. TRP-2는 인간의 착색 멜라닌세포 및 흑색종에서 가장 높게 발현되는 당단백질 중의 하나이다 (Wang, J. Experimental Medicine 184 (1996) 2207-2216). 이것은 인간 염색체 13 상에 위치하고, 따라서 티로시나제-관련 유전자 훼밀리의 일원인 것으로 보이고, 티로시나제 및 gp75/TRP-1과 40 -45 %의 아미노산 서열이 동일하다 (Yokoyama et al., Biochim. Biophys. Acta. 1217 (1994), 317-321; Robbins et al., J. Immunol. 154 (1995), 5944-5950). TRP-2는 아미노산 519 개의 단백질을 코딩하고, 멜라닌 합성에 수반되는 도파크롬 호변이성화효소 (DOPAchrome tautomerase) 활성을 갖는 것으로 입증되었다 (Bouchard et al., Eur. J. Biochem. 219 (1994), 127-134).Differentiation antigen TRP-2 is described by R.F. Wang, J. Experimental Medicine 184 (1996) 2207-2216. TRP-2 is one of the highest expressed glycoproteins in human pigmented melanocytes and melanoma (Wang, J. Experimental Medicine 184 (1996) 2207-2216). It is located on human chromosome 13 and therefore appears to be a member of the tyrosinase-related gene family and is identical in tyrosinase and gp75 / TRP-1 with an amino acid sequence of 40-45% (Yokoyama et al., Biochim. Biophys. Acta. 1217 (1994), 317-321; Robbins et al., J. Immunol. 154 (1995), 5944-5950). TRP-2 encodes a protein of 519 amino acids and has been shown to have DOPAchrome tautomerase activity involved in melanin synthesis (Bouchard et al., Eur. J. Biochem. 219 (1994), 127 -134).

흑색종, 정상 피부 멜라닌세포 및 각막에서 발견되는 Wang 등에 의해 서술된 완전히 스플라이싱된 TRP-2 mRNA와는 대조적으로, TRP-INT-2 mRNA는 흑색종에서만 검출되었다. 이러한 결과는 CTL에 의해 인식되는 흑색종 항원이 종양에서는 일어나지만 정상세포에서는 일어나지 않는 스플라이싱에서의 차이에 의해 공지된 계통-관련 단백질로부터 유래될 수 있다는 것을 가리킨다. 이러한 메카니즘의 결과는 정확한 종양 특이적으로 간주될 수 있고 동일한 조직 유형의 종양에 의해서만 공유되고 동일한 계통의 정상 조직에는 없는 새로운 군의 항원이다. 따라서 이러한 새로운 군의 항원은 공지된 계통-관련 단백질로부터 정상세포에서는 일어나지 않는 종양-특이적이고 선택적인 스플라이싱에 의해 단백질로부터 유래되는 것을 특징으로 한다. 정상 멜라닌세포, 피부 시료 및 각막은 역전사효소 (RT) PCR 분석에서 음성인 것으로 증명되었다. 이러한 특징은 더욱 안전하고 더욱 효과적인 면역치료 시험의 발전을 가능하게 하는 항원을 정의한다.In contrast to the fully spliced TRP-2 mRNA described by melanoma, normal skin melanocytes and Wang found in the cornea, TRP-INT-2 mRNA was detected only in melanoma. These results indicate that melanoma antigens recognized by CTL can be derived from known lineage-related proteins by differences in splicing that occur in tumors but not in normal cells. The result of this mechanism is a new group of antigens that can be considered precise tumor specific and shared only by tumors of the same tissue type and not in normal tissues of the same lineage. Thus, this new group of antigens is characterized from tumor-specific and selective splicing that does not occur in normal cells from known lineage-related proteins. Normal melanocytes, skin samples and corneas proved negative in reverse transcriptase (RT) PCR analysis. This feature defines antigens that enable the development of safer and more effective immunotherapeutic trials.

따라서 본 발명은 종양 세포의 가용성 세포질 부분으로부터 단리된 mRNA로부터의 역전사효소 PCR에 의해 수득되는, 부분적으로 인트론-코딩되는 종양-특이적 항원에 관한 것이다. 이러한 항원들은 특정 T 림프구에 의해 인식되고, 이어서 이 림프구들이 MHC 클래스 I 복합체 내에서 본 발명에 따른 항원을 제시하는 종양 세포를 용해시킨다. 놀랍게도, 이같은 종양 세포의 세포질에 풍부한 본 발명의 항원을 코딩하는 mRNA가 특히 종양-특이적이라는 것이 발견되었다.The present invention therefore relates to partially intron-coded tumor-specific antigens obtained by reverse transcriptase PCR from mRNA isolated from the soluble cytoplasmic portion of tumor cells. These antigens are recognized by certain T lymphocytes, which then lyse the tumor cells presenting the antigens according to the invention in an MHC class I complex. Surprisingly, it has been found that mRNA encoding the antigens of the invention enriched in the cytoplasm of such tumor cells is particularly tumor-specific.

"인트론-코딩되는 종양-특이적 항원"은 엑손 서열뿐만 아니라 인트론 서열에 의해서도 부분적으로 (바람직하게는 약 30 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 50 % 이상, 가장 바람직하게는 80 % 이상) 코딩되고 MHC 클래스 I을 통해 제시되는 종양 항원을 명확하게 인식하는 종양 항원을 의미한다. 인트론의 발현은 계통 관련 단백질에서의 변화된 스플라이싱의 메카니즘과 관련된다. "부분적"은 바람직하게는 30 내지 50 % 또는 30 내지 80 % 인트론-코딩됨을 의미한다. 본 발명에 따른 항원이 선택적인 스플라이싱으로 인한 것이기 때문에, 엑손-코딩되는 및 인트론-코딩되는 상기 항원의 서열은 관련된 게놈성 서열에서 직접 연결된다."Intron-coded tumor-specific antigens" are partially encoded (preferably at least about 30%, more preferably at least about 50%, most preferably at least 80%) not only by the exon sequence but also the intron sequence By tumor antigen is clearly recognized the tumor antigen presented through MHC class I. Expression of introns is associated with a mechanism of altered splicing in lineage-related proteins. "Partial" means preferably 30 to 50% or 30 to 80% intron-coded. Since the antigens according to the invention are due to selective splicing, the sequences of the exon-coded and intron-coded antigens are linked directly in the relevant genomic sequences.

"엑손-코딩되는 종양 항원"은 도입부에서 서술된 항원, 예컨대 MAGE, BAGE 및 GAGE (Van der Bruggen et al., Science 254 (1991) 1643-1647: Boel et al., Immunity 2 (1995) 167-175: Van der Eynde et al., J. Exp. Med. 182 (1995) 689-698) 또는 예컨대 티로시나아제로부터의 CTL 인식 에피토프 (Brichard et al., J. Exp. Med. 178 (1993) 489-49513), 멜란A^Mart1(Coulie et al., J.Exp. Med. 180 (1994) 35-42; Castelli et al., J. Exp. Med 181 (1995) 363-368; Kawakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1991) 3515-3519), gp100^Pme17(Bakker et al., J. Exp. Med 179 (1994) 1005-1009; Kawakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 6458-6452), gp75^TRP1(Wang et al., J. Exp. Med 181 (1995) 799-804) 및 TRP-2 (Wang et al., J. Exp. Med 184 (1996) 2207-2216)을 의미한다.“Exon-encoded tumor antigens” include antigens described at the introduction, such as MAGE, BAGE and GAGE (Van der Bruggen et al., Science 254 (1991) 1643-1647: Boel et al., Immunity 2 (1995) 167- 175: Van der Eynde et al., J. Exp. Med. 182 (1995) 689-698) or CTL recognition epitope from eg tyrosinase (Brichard et al., J. Exp. Med. 178 (1993) 489 -49513), Melan A ^{Mart 1} (Coulie et al., J. Exp. Med. 180 (1994) 35-42; Castelli et al., J. Exp. Med 181 (1995) 363-368; Kawakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1991) 3515-3519), gp100 ^Pme17 (Bakker et al., J. Exp. Med 179 (1994) 1005-1009; Kawakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 6458-6452), gp75 ^TRP1 (Wang et al., J. Exp. Med 181 (1995) 799-804) and TRP-2 (Wang et al., J. Exp. Med 184 ( 1996) 2207-2216).

"본 발명에 따른 펩티드 또는 폴리펩티드"은 바람직하게는 8 내지 12 개의 아미노산, 가장 바람직하게는 10 개 이상의 아미노산으로 구성되고, 단백질의 크기를 이룰 있는 폴리펩티드를 의미한다. 또한 펩티드는 단백질, 예컨대 융합 (fusion) 단백질의 일부분일 수도 있다."Peptide or polypeptide according to the invention" means a polypeptide which preferably consists of 8 to 12 amino acids, most preferably at least 10 amino acids, and which is of protein size. The peptide may also be part of a protein, such as a fusion protein.

"항원성 효과를 갖는폴리펩티드"는 생체내 및 생체외에서 특정한 면역 반응을 끌어내는 폴리펩티드를 의미한다."Polypeptide with an antigenic effect" means a polypeptide that elicits specific immune responses in vivo and ex vivo.

"엄격한 조건 하에서의 혼성화"라는 용어는 두 개의 핵산 단편이 [Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E.coli" in Molecular cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Habor Press., New York, USA, 9.47-9.62 and 11.45-11.61]에 기재된 표준 혼성화 조건 하에서 서로 혼성화 할 수 있는 것을 의미한다.The term "hybridization under stringent conditions" has been described by Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Habor Press., New York, USA, 9.47-9.62 and 11.45-11.61] means that they can hybridize with each other under standard hybridization conditions.

더욱 구체적으로, 본 명세서에서 사용된 "엄격한 조건"은 50 ℃에서의 2.0 ×SSC의 세척이 뒤따르는 약 45 ℃에서의 6.0 ×SSC 내에서의 혼성화를 가리킨다. 엄격성의 선별을 위해, 세척 단계에서 염 농도는, 예를 들어, 낮은 엄격성을 위해서 50 ℃에서의 약 2.0 ×SSC부터 높은 엄격성을 위해 50 ℃에서의 약 0.2 ×SSC까지 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계에서의 온도는 약 22 ℃의 실온에서의 낮은 엄격성 조건으로부터 약 65 ℃에서의 높은 엄격성 조건까지 증가할 수 있다.More specifically, "strict conditions" as used herein refer to hybridization in 6.0 x SSC at about 45 ° C followed by a wash of 2.0 x SSC at 50 ° C. For the screening of stringency, the salt concentration in the washing step can be selected, for example, from about 2.0 × SSC at 50 ° C. for low stringency to about 0.2 × SSC at 50 ° C. for high stringency. In addition, the temperature in the washing step may increase from low stringency conditions at room temperature of about 22 ° C. to high stringency conditions at about 65 ° C.

원핵 또는 진핵 생물, 예컨대 원핵생물 숙주 세포 또는 진핵생물 숙주 세포에서의 발현을 위해, 당업자에게 익숙한 방법에 따라 핵산 서열을 적합한 발현 벡터 내로 혼입시킬 수 있다. 바람직하게는 이같은 발현 벡터는 조절성/유도성 프로모터를 함유한다. 이어서 발현을 위해 이러한 재조작 벡터를 적합한 숙주 세포, 예컨대 원핵생물 숙주 세포로서의 E.coli, 또는 진핵생물 숙주 세포로서의 사카로미세스 세레비시에, CHO 또는 COS 세포 내로 도입시키고, 형질전환 또는 형질도입된 숙주 세포를 비정형 유전자가 발현되도록 하는 조건 하에서 배양한다. 펩티드를 공지된 방법에 따라 숙주 세포로부터 또는 숙주 세포의 배양 상층액으로부터 단리할 수 있다. 이같은 방법은, 예를 들어 [Ausubel I., Frederick M., Current Protocols in Mol. Biol. (1992) John Wiley and Sons, New York]에 기재되어 있다.For expression in prokaryotic or eukaryotic organisms such as prokaryotic host cells or eukaryotic host cells, nucleic acid sequences may be incorporated into suitable expression vectors according to methods familiar to those skilled in the art. Preferably such expression vector contains a regulatory / inducible promoter. This reengineered vector is then introduced for expression into a suitable host cell, such as E. coli as a prokaryotic host cell, or Saccharomyces cerevisiae as a eukaryotic host cell, into a CHO or COS cell, and transformed or transduced. Host cells are cultured under conditions that allow atypical genes to be expressed. Peptides can be isolated from host cells or from culture supernatants of host cells according to known methods. Such methods are described, for example, in Ausubel I., Frederick M., Current Protocols in Mol. Biol. (1992) John Wiley and Sons, New York.

"숙주 세포"는 원핵 또는 진핵 세포, 바람직하게는 COS 또는 CHO 세포이다. 단백질의 작용에 관해 글리코실화가 그리 중요하지 않다고 입증된다면 원핵세포 내에서의 제조가 바람직할 것이다."Host cells" are prokaryotic or eukaryotic cells, preferably COS or CHO cells. Preparation in prokaryotic cells would be desirable if glycosylation proved to be less important with regard to the action of the protein.

특정한 세포독성 T 림프구 (CTL)에 의해 인식되는 종양-특이적 항원을 코딩하는 유전자는 자가 흑색종 mRNA로부터 구축된 cDNA 라이브러리를, 바람직하게는 환자의 적합한 HLA 대립유전자를 발현시키는, 진핵세포 내로 트랜스펙션시킴으로써 확인될 수 있다.Genes encoding tumor-specific antigens recognized by specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) transduce cDNA libraries constructed from autologous melanoma mRNA, preferably into eukaryotic cells, expressing the appropriate HLA allele of the patient. This can be confirmed by specification.

HLA 항원을 결정하기 위해, 환자의 종양 세포 또는 종양 조직으로부터 전체 RNA를 단리하고, HLA 항원을 명확하게 코딩하는 프라이머를 사용하여 역전사효소 PCR에 의해 cDNA를 수득하여, 진핵세포 발현 벡터, 예컨대 pcDNA3 (Invitrogen Corporation, Oxon, U.K) 내로 클론한다. 본 발명에 따른 인트론-코딩되는 종양-특이적 항원을 결정하기 위해, 종양 세포의 가용성 세포질 부분으로부터 단리된 mRNA로부터 폴리 A⁺RNA를 단리하고, 엑속-코딩되는 종양 항원, 예컨대 MAGE, BAGE 및 GAGE, 티로시나아제로부터의 CTL 인식 에피토프, 멜란A^Mart1, gp100^Pme17, gp75^TRP1및 TRP-2를 명확하게 코딩하는 프라이머를 사용하는 역전사효소 PCR에 의해 cDNA 라이브러리를 설립한다. cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 단편을 진핵생물 발현 벡터, 예컨대 pcDNA3.1 (Invitrogen Corporation, Oxon, U.K) 내로 클론한다. 발현벡터를 진핵 세포, 예를 들어 Cos-7 세포 (특정한 종양 항원 T 세포를 활성화시킬 수 있는 항원의 펩티드 단편을 제시할 수 있는 적절한 MHC 유전자를 발현시킴) 내로 코트랜스펙션시킨 후에, 종양-특이적 세포독성 T 림프구의 자극을 일으키는 클론들을 측정할 수 있다. 종양-특이적 세포독성 T 림프구에 대한 자극 효과는 [Traversari et al., Immunogenetics 35 (1992), 145-152]에 서술된 대로 CTL 자극 분석 (TNF-α, IFN-γ, GM-CSF의 측정)에 의해 측정될 수 있다.To determine HLA antigens, isolated whole RNA from patient's tumor cells or tumor tissues, and cDNA was obtained by reverse transcriptase PCR using primers that explicitly encode HLA antigens to eukaryotic expression vectors such as pcDNA3 ( Invitrogen Corporation, Oxon, UK). To determine intron-coded tumor-specific antigens according to the present invention, poly A ⁺ RNA is isolated from mRNA isolated from the soluble cytoplasmic portion of tumor cells and ex-coded tumor antigens such as MAGE, BAGE and GAGE ^CDNA libraries are established by reverse transcriptase PCR using primers that explicitly encode CTL recognition epitopes from tyrosinase, Melan A ^Mart1 , gp100 ^Pme17 , gp75 ^TRP1 and TRP-2. cDNA fragments from the cDNA library are cloned into eukaryotic expression vectors such as pcDNA3.1 (Invitrogen Corporation, Oxon, UK). Expression vectors were co-fected into eukaryotic cells, eg, Cos-7 cells (expressing the appropriate MHC gene, which can present peptide fragments of antigens capable of activating specific tumor antigen T cells). Clones causing stimulation of specific cytotoxic T lymphocytes can be determined. The stimulatory effects on tumor-specific cytotoxic T lymphocytes are measured in CTL stimulation assays (TNF-α, IFN-γ, GM-CSF as described in Traversari et al., Immunogenetics 35 (1992), 145-152). Can be measured by

이러한 방식으로, 각각의 종양 세포의 용해를 일으키는 이러한 세포독성 T 세포들을 명확하게 활성화시키는 세포 클론을 수득하는 것이 가능하다.In this way, it is possible to obtain cell clones that specifically activate these cytotoxic T cells causing the lysis of each tumor cell.

이러한 세포 클론들은 면역화/예방접종을 위해 단리되어 정제된 형태로 환자에게, 본 발명에 따른 항원성 폴리펩티드가 생체 내에서 프로세싱되므로 전체 길이 폴리펩티드로 직접 또는 짧아진 폴리펩티드 단편의 형태로 투여될 수 있는 폴리펩티드를 발현시킨다.Such cell clones are polypeptides that can be administered to patients in isolated and purified form for immunization / vaccination, either directly or as shortened polypeptide fragments, as the antigenic polypeptides according to the invention are processed in vivo. Express.

이를 위해, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 확인된 방법 (Sambrook et al., Molecular cloning (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 따라 이러한 세포 클론으로부터 단리하고, 제한절단으로 짧게 한다. 이러한 짧아진 단편을 진핵생물 발현 벡터 내로 클로닝한 후 진핵세포, 예컨대 COS-7 세포 (상기) 내로 트랜스펙션시키고, Traversari 등의 [Immunogenetics 35 (1992) 145-152]에 설명된 대로 CTL 자극 분석으로 세포독성 T 세포의 자극을 측정한다. 이러한 방식으로 코딩 핵산 서열을 세포독성 T 세포의 자극에 필수적인 펩티드 에피토프로 제한할 수 있다.To this end, nucleic acids encoding polypeptides according to the invention are isolated from these cell clones according to the identified methods (Sambrook et al., Molecular cloning (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) and shortened by restriction digestion. These shortened fragments were cloned into eukaryotic expression vectors and then transfected into eukaryotic cells, such as COS-7 cells (above), and analyzed for CTL stimulation as described in Traversari et al. [Immunogenetics 35 (1992) 145-152]. To measure the stimulation of cytotoxic T cells. In this way, the coding nucleic acid sequence can be limited to peptide epitopes essential for stimulation of cytotoxic T cells.

바람직한 구현예에서, 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 숙주세포 내에서 단백질의 프로세싱을 강화시킬 수 있는 핵산 서열과 커플링시킨다.In a preferred embodiment, the nucleic acid sequence encoding the protein is coupled with a nucleic acid sequence capable of enhancing the processing of the protein in a host cell.

동시에 단백질 수송, 단백질 분해 및 MHC 클래스 I 복합체로의 도입을 강화시키는 다수의 서열, 예컨대 유비퀴틴이 공지되어 있다 (Bachmair et al., Science 234 (1986) 179-186; Gonda et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 16700-16712; Bachmair et al., Cell 56 (1989) 1019-1032). 단백질의 더 빠른 분해 및 MHC 클래스 I 복합체로의 더욱 효과적인 도입은 본 발명에 따른 항원성 폴리펩티드를 함유하는 단백질을 유비퀴틴과 커플링시킴으로써 달성될 수 있다. 그 결과, 종양 세포 표면 상의 폴리펩티드의 제시가 특히 효과적이다. 이와 관련하여, 항원성 펩티드를 함유하는 단백질과 유비퀴틴 사이의 아미노산이 항원성 펩티드를 함유하는 단백질과 유비퀴틴의 커플링의 관점에서 특히 중요하다. 적합한 아미노산을 선택함으로써, 특정한 세포독성 T 세포에 의한 흑색종 세포의 인식에서 상당한 개선을 추가적으로 달성할 수 있다.At the same time a number of sequences are known, such as ubiquitin, which enhance protein transport, proteolysis and introduction into MHC class I complexes (Bachmair et al., Science 234 (1986) 179-186; Gonda et al., J. Biol) Chem. 264 (1989) 16700-16712; Bachmair et al., Cell 56 (1989) 1019-1032. Faster degradation of the protein and more effective introduction into the MHC class I complex can be achieved by coupling the protein containing the antigenic polypeptide according to the invention with ubiquitin. As a result, the presentation of polypeptides on tumor cell surfaces is particularly effective. In this regard, the amino acid between the protein containing the antigenic peptide and ubiquitin is particularly important in view of the coupling of the protein containing the antigenic peptide to ubiquitin. By selecting suitable amino acids, significant improvements in the recognition of melanoma cells by specific cytotoxic T cells can additionally be achieved.

바람직한 구현예로서, PCR 생성물의 8 내지 12 코돈의 단편을 사용한다.In a preferred embodiment, fragments of 8-12 codons of the PCR product are used.

또다른 바람직한 구현예에서, 특정한 T 림프구에 의해 인식된 후 이 림프구가 MHC 클래스 I 복합체 내에서 폴리펩티드 EVISCKLIKR 을 제시하는 흑색종 세포들을 용해시키고, 아미노산 서열이 서열번호 2에 나타난 DNA 서열에 의해 코딩되는,부분적으로 인트론-코딩되는 종양-특이적 항원 TRP-2-INT2 (이하 TRP-2-INT2 단편 또는 TRP-2-INT2 펩티드로 칭함)을 사용한다.In another preferred embodiment, the lymphocytes are recognized by a particular T lymphocyte and then lysed the melanoma cells presenting the polypeptide EVISCKLIKR within the MHC class I complex and the amino acid sequence is encoded by the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 2. Partially intron-coded tumor-specific antigen TRP-2-INT2 (hereinafter referred to as TRP-2-INT2 fragment or TRP-2-INT2 peptide) is used.

TRP-2-INT2-펩티드의 종양-특이적 항원의 코딩 서열을 수득하기 위해, TRP-2-INT2 항원 및 HLA-A6801 대립유전자를 코딩하는 cDNA를 [Istituto Nazionale Yumori (Milan, Itary)]에서 수술받은 환자의 수술표본으로부터 수득된 전이성 상해로부터 설립된 흑색종 세포계의 세포질로부터 단리했다. 양쪽 모두의 cDNA 를 COS-7 세포 내로 트랜스펙션시킨 후, 세포독성 T 림프구(CTL128)의 세포독성 효과를 자극할 수 있는 클론 (TRP-2-INT2, HLA-A6801)을 단리했다. DNA 서열을 분석하여, 인트론 2 및 인트론 4 의 일부분과 함께 엑손 1-4를 함유하는 엑손-코딩되는 TRP-2 항원의 cDNA 단편을 제시하였다. TRP-2-INT2 DNA를 당업자에게 익숙한 방법 또는 [Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E.coli" in Molecular cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Habor Press., New York, USA, 5.3-5.10]에 기술된 방법에 따라 제한 효소로 절단하거나, 단편-특이적 프라이머 (서열번호 6, 7, 8)을 사용하여 PCR 증폭하여 TRP-2-INT2 단편의 아(亞)단편을 수득하였다. COS-7 세포 내로의 트랜스펙션 후에, Raversari 등의 [Immunogenetics 35 (1992) 145-152]에 설명된 대로 CTL 자극 분석에 의해 CTL-자극 효과를 측정한다. DNA 서열 분석에 의해 코딩 핵산 서열을 결정하였다.To obtain coding sequences of tumor-specific antigens of TRP-2-INT2-peptides, TRP-2-INT2 antigen and HLA-A The cDNA encoding the 6801 allele was isolated from the cytoplasm of the melanoma cell line established from metastatic injury obtained from surgical specimens of patients undergoing surgery in Istituto Nazionale Yumori (Milan, Itary). Clones capable of stimulating the cytotoxic effects of cytotoxic T lymphocytes (CTL128) after transfecting both cDNAs into COS-7 cells (TRP-2-INT2, HLA-A 6801). DNA sequences were analyzed to present cDNA fragments of exon-encoded TRP-2 antigens containing exons 1-4 with portions of intron 2 and intron 4. TRP-2-INT2 DNA is known to those of skill in the art or by Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Habor Press., New York, USA, 5.3-5.10], cleavage with restriction enzymes or PCR amplification using fragment-specific primers (SEQ ID NOs: 6, 7, 8) to obtain subfractions of TRP-2-INT2 fragments. It was. After transfection into COS-7 cells, CTL-stimulatory effects are measured by CTL stimulation analysis as described in Raversari et al. [Immunogenetics 35 (1992) 145-152]. Coding nucleic acid sequences were determined by DNA sequence analysis.

본 발명의 또다른 주제는 MHC 클래스 I을 통해 본 발명의 따른 항원을 제시하는 종양세포의 용도이다.Another subject of the invention is the use of tumor cells to present the antigens of the invention via MHC class I.

본 발명의 또다른 주제는 환자의 체액, 바람직하게는 혈액 또는 조직 표본으로부터 본 발명에 따른 항원의 발현을 검출하는 방법이다. 이를 위해, 본 발명에 따른 항원을 코딩하는, 인트론-코딩되는 종양-특이적 cDNA를 본 발명에 따른 항원을 발현시키는 종양 세포를 진단하기 위한 치료 전후 및 치료중에 사용한다.Another subject of the invention is a method for detecting the expression of an antigen according to the invention from a body fluid of a patient, preferably a blood or tissue sample. To this end, intron-coded tumor-specific cDNAs encoding antigens according to the invention are used before and after treatment and for the treatment of the tumor cells expressing the antigens according to the invention.

종양이 실제로 본 발명에 따른 항원을 발현시키는 경우에만 치료가 수행될 수 있기 때문에, 치료 전에 본 발명에 따른 종양 항원이 환자의 종양 세포에서 발현되는지를 시험해본다. 치료 중에는 종양 세포 존재의 마커인 본 발명에 따른 종양의 발현이 감소할 수 있는지를 모니터링할 수 있고, 치료 후에는 본 발명에 따른 항원의 발현을 측정함으로써 최대로 가능한 정도로 종양 세포가 제거되었는지를 조절할 수 있다.Since the treatment can only be performed if the tumor actually expresses the antigen according to the invention, the tumor antigen according to the invention is tested prior to the treatment in the patient's tumor cells. During treatment, it is possible to monitor whether the expression of the tumor according to the invention, which is a marker of the presence of tumor cells, can be reduced, and after the treatment to control whether tumor cells have been removed to the maximum extent possible by measuring the expression of the antigens according to the invention. Can be.

바람직한 구현예에서, 종양-특이적 TRP-2-INT2 펩티드를 코딩하는 핵산을, 세포 표면 상에 TRP-2-INT2 펩티드를 제시하는 흑색종 세포의 진단을 위해 사용할 수 있다.In a preferred embodiment, nucleic acids encoding tumor-specific TRP-2-INT2 peptides can be used for the diagnosis of melanoma cells presenting TRP-2-INT2 peptides on the cell surface.

TRP-2-INT2 펩티드를 코딩하는 서열은 특히 흑색종에서 발현된다. 따라서, TRP-2-INT2 서열을 종양 세포를 확인하기 위한 표본으로 사용할 수 있다. PCR 또는 라벨링된 혼성화 시료에 의해 또는 당업계에 공지된 임의의 각종 핵산 탐침 기재 분석에 의해 확인할 수 있다.The sequence encoding the TRP-2-INT2 peptide is particularly expressed in melanoma. Thus, the TRP-2-INT2 sequence can be used as a sample for identifying tumor cells. It can be identified by PCR or labeled hybridization sample or by any of a variety of nucleic acid probe based assays known in the art.

TRP-2-INT2 발현의 측정은 특정한 라벨링된 TRP-2-INT2 탐침과의 혼성화 및 역전사 PCR (RT-PCR)에 의해 mRNA 수준에서 수행된다.Measurement of TRP-2-INT2 expression is performed at the mRNA level by hybridization with a specific labeled TRP-2-INT2 probe and reverse transcription PCR (RT-PCR).

특히 TRP-2-INT2 mRNA는 TRP-2 mRNA 와의 구별을 위해, 하기에 의해 측정될수 있다:In particular, TRP-2-INT2 mRNA can be measured by the following to distinguish it from TRP-2 mRNA:

1) cDNA로 전사;1) transcription with cDNA;

2) 인트론-특이적 프라이머의 사용;2) use of intron-specific primers;

3) 증폭된 cDNA 단편의 길이 비교 (증폭된 cDNA 엑손-인트론-엑손 단편과 cDNA 엑손-엑손의 길이를 측정);3) length comparison of amplified cDNA fragments (measuring the length of the amplified cDNA exon-intron-exon fragment and cDNA exon-exon);

4) 인트론-특이적 탐침과의 혼성화.4) Hybridization with intron-specific probes.

본 발명의 또다른 주제는 종양-특이적 세포독성 T 림프구의 증식을 측정하는 방법이다. 이 방법은 치료 전 및 치료 중에 본 발명에 다른 항원에 의해 활성화될 수 있는 세포독성 T 세포의 검출을 위해 사용된다. 치료 전에는, 본 발명에 따른 항원에 의해 활성화될 수 있는 세포독성 T 림프구를 이미 갖고 있는 환자를 선별하기 위해 사용될 수 있다.Another subject of the invention is a method of measuring the proliferation of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes. This method is used for the detection of cytotoxic T cells that can be activated by other antigens in the present invention before and during treatment. Prior to treatment, it can be used to screen patients who already have cytotoxic T lymphocytes that can be activated by the antigens according to the invention.

환자에 종양-특이적 활성화될 수 있는 T 세포가 있는지를 점검하기 위해, T 세포 및 항원제시 세포를 환자의 혈액으로부터 단리하고, 본 발명에 따른 항원을 탈체에서 항원제시 세포와 접촉시킨다 (펄스). 본 발명에 따른 항원에 의해 활성화될 수 있는 T 세포가 환자의 혈액 내에 존재한다면, 예를 들어, CTL 자극 분석에 의해 검출될 수 있는 특정한 세포독성 L 림프구의 증식이 있을 것이다. 이같은 활성화될 수 있는 T 세포를 본 발명에 따른 항원에 의해 자극한 후, 치료를 위해 사용할 수 있다. 이러한 진단 과정은 치료 전에 수행되어야 한다.To check whether a patient has tumor-specific activated T cells, T cells and antigen presenting cells are isolated from the patient's blood and the antigens according to the invention are contacted with antigen presenting cells in disassembly (pulses). . If T cells capable of being activated by the antigens according to the invention are present in the blood of a patient, there will be proliferation of certain cytotoxic L lymphocytes that can be detected, for example, by CTL stimulation assay. Such activatable T cells can be stimulated with the antigens according to the invention and then used for treatment. This diagnostic procedure should be performed before treatment.

치료 중의 또다른 진단 과정은, 종양-특이적 T 세포 활성화 유도를 정량적으로 측정하는 것을 가능하게 하면서, 세포독성 L 림프구의 대조구로 쓸모가 있다.Another diagnostic procedure during treatment is useful as a control of cytotoxic L lymphocytes, while enabling to quantitatively measure tumor-specific T cell activation induction.

세포독성 T 림프구의 증식은 예를 들어 CTL 자극 분석에 의해 측정될 수 있다. [Traversari et al., Immunogenetics 35 (1992) 145-152]에 기재된 대로 CTL에 의해 TNF의 생성을 자극할 수 있는 자극 세포계의 능력을 테스트한다. MTT 비색계 분석에서 WEHI-164.13 세포 (Espevic and Nissen-Meyer, J. Immunol. Methods 95 (1986) 99-105) 상에서의 세포독성 효과를 테스트함으로써 TNF 함량을 측정한다 (CTL 자극 분석).Proliferation of cytotoxic T lymphocytes can be measured, for example, by CTL stimulation assay. The ability of stimulating cell lines to stimulate the production of TNF by CTL as described in Traversari et al., Immunogenetics 35 (1992) 145-152 is tested. TNF content is determined by testing cytotoxic effects on WEHI-164.13 cells (Espevic and Nissen-Meyer, J. Immunol. Methods 95 (1986) 99-105) in an MTT colorimetric assay (CTL stimulation assay).

바람직한 구현예에서, TRP-2-INT2 펩티드를 TRP-2-INT2-특이적 세포독성 T 림프구 증식의 검출을 위해 사용한다.In a preferred embodiment, the TRP-2-INT2 peptide is used for the detection of TRP-2-INT2-specific cytotoxic T lymphocyte proliferation.

본 발명의 또다른 주제는 본 발명에 따른 인트론-특이적 항원을 코딩하는 핵산의 종양질환 치료용 치료제의 제조에서의 용도이다.Another subject of the invention is the use in the preparation of a therapeutic agent for the treatment of tumor diseases of nucleic acids encoding intron-specific antigens according to the invention.

이와 관련해, 본 발명에 따른 핵산을 유전자 치료를 위해 사용할 수 있다. 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터를 사용하여 핵산을 환자의 신체 내로 도입하여, 코딩서열이 명확하게 발현되어 본 발명에 따른 펩티드가 항원제시 세포에 결함함으로써 특정한 세포독성 T 세포 반응을 유도해야 한다. 이어서 유도된 면역 반응이 세포 표면 상에 본 발명에 따른 펩티드를 발현시키는 모든 종양 세포에 대해 향해져야 한다. 벡터 상에 코딩된 DNA 서열을 리포좀과 조합된 모든 누드 (nude) DNA 형태로, 또는 적합한 보조제와 함께 (당업계에 공지된 대로), 피하, 근육내 또는 종양내로 적용될 수 있다.In this regard, nucleic acids according to the invention can be used for gene therapy. Nucleic acid should be introduced into the patient's body using viral or non-viral vectors such that the coding sequence is clearly expressed so that the peptides according to the invention are defective in antigen presenting cells to induce specific cytotoxic T cell responses. The induced immune response must then be directed against all tumor cells expressing the peptides according to the invention on the cell surface. The DNA sequence encoded on the vector can be applied in the form of all nude DNA combined with liposomes, or with suitable adjuvants (as known in the art), subcutaneously, intramuscularly or intratumorally.

바람직한 구현예에서, TRP-2-INT2 펩티드를 유전자 치료를 위해 사용한다.In a preferred embodiment, the TRP-2-INT2 peptide is used for gene therapy.

또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 항원을 종양 환자의 면역화 및/또는 예방접종을 위해 사용할 수 있다. 면역화는 항원제시 세포를 통해 본 발명에 따른 항원을 제시함으로써 특정한 세포독성 T 세포를 활성화시키는 것을 기초로 한다. 면역화는 생체내 및 생체외 모두에서 수행될 수 있다.In another embodiment, the antigens according to the invention can be used for immunization and / or vaccination of tumor patients. Immunization is based on activating specific cytotoxic T cells by presenting the antigens according to the invention via antigen presenting cells. Immunization can be performed both in vivo and ex vivo.

이를 위해, 항원제시 세포 (대식세포, 수상돌기세포, 또는 B 세포) 및 T 림프구를 환자의 혈액으로부터 취하여 본 발명에 따른 펩티드와 탈체에서 접촉시킨다 (펄스). 본 발명에 따른 펩티드가 갖춰진 이러한 항원제시 세포로 특정한 세포독성 T 세포의 활성화를 일으키고, 이어서 환자의 혈액으로 되돌린다.To this end, antigen presenting cells (macrophages, dendritic cells, or B cells) and T lymphocytes are taken from the blood of the patient and contacted (pulsed) with the peptides according to the invention. Such antigen presenting cells equipped with a peptide according to the invention result in the activation of specific cytotoxic T cells and then return to the blood of the patient.

면역화는 환자에게 본 발명에 따른 폴리펩티드를 피하 투여하여, 특정한 세포독성 T 세포의 활성화를 환자 내에서 직접 달성함으로써 생체 내에서 수행될 수 있다. 항원제시 세포 상의 상응하는 HLA 분자에 본 발명에 따른 폴리펩티드가 결합하여 특정한 세포독성 T 림프구의 증식을 일으킨다.Immunization can be performed in vivo by subcutaneously administering a polypeptide according to the invention to a patient, thereby achieving the activation of specific cytotoxic T cells directly in the patient. The polypeptide according to the invention binds to the corresponding HLA molecule on the antigen presenting cell, resulting in the proliferation of certain cytotoxic T lymphocytes.

적용 동안 본 발명에 따른 펩티드의 면역원성의 효과는 하기의 수단에 의해 강화될 수 있다:The effect of immunogenicity of the peptides according to the invention during application can be enhanced by the following means:

1) 박테리아성 독소와의 커플링 (초항원);1) coupling with bacterial toxins (superantigens);

2) 프로이드 보조물과 혼합하여 투여;2) in combination with Freud's assistant;

3) 본 발명에 따른 펩티드를 리포좀과 혼합.3) mixing the peptides according to the invention with liposomes.

바람직한 구현예에서, TRP-2-INT2 펩티드를 흑색종 환자의 면역화 및 예방접종을 위해 사용한다.In a preferred embodiment, the TRP-2-INT2 peptide is used for immunization and vaccination of melanoma patients.

본 발명의 또다른 주제는 RT-PCR에 의해 본 발명에 따른 특정한 종양 항원의 발현을 검출하기 위한 프라이머이다. 이와 관려하여, 프라이머를 하기의 수단에 의해 선택할 수 있다:Another subject of the invention is a primer for detecting the expression of a specific tumor antigen according to the invention by RT-PCR. In this regard, primers can be selected by the following means:

1) 센스 및 안티센스 프라이머가 종양 항원의 두개의 다른 엑손 서열과 혼성화한다;1) sense and antisense primers hybridize with two different exon sequences of the tumor antigen;

2) 센스 프라이머는 종양 항원의 엑손 서열과 혼성화하고, 안티센스 프라이머 (올리고 dT 프라이머)는 종양 항원의 mRNA 서열의 폴리A 말단과 혼성화한다.2) The sense primer hybridizes with the exon sequence of the tumor antigen, and the antisense primer (oligo dT primer) hybridizes with the polyA terminus of the mRNA sequence of the tumor antigen.

바람직한 구현예에서, 특정한 프라이머를 아미노산 서열이 서열번호 2 (PRIT-3) 및 서열번호 4 (INT2-1260)에 나타난 DNA 서열에 의해 코딩되는 TRP-2-INT2 단편의 발현을 검출하기 위해 사용한다.In a preferred embodiment, specific primers are used to detect the expression of TRP-2-INT2 fragments whose amino acid sequences are encoded by the DNA sequences shown in SEQ ID NO: 2 (PRIT-3) and SEQ ID NO: 4 (INT2-1260). .

하기의 실시예, 참고문헌, 서열목록 및 도면은 본 발명의 다양한 면모 및 구현예를 더욱 설명하기 위해 제공되고, 범주를 제한하기 위한 것이 아니다.The following examples, references, sequence listings and drawings are provided to further illustrate various aspects and embodiments of the invention and are not intended to limit the scope thereof.

도 1: CTL 128은 HLA-A6801 제한된 방식 내으로 자가 흑색종 (Me 18732)을 인식하였다. 고정 E:T 비율의 대사인자를 첨가하기 전에 표적 세포를 지시된 안티-HLA mAb와 함께 실온에서 1 시간동안 항온배양하였다 (A: Me18732 + 아무것도 첨가하지 않음; B: Me18732; C: ME18732 + HLA-A2, -A69; D: ME18732 + HLA-A2, -A28; Me18732 + HLA-A-B, -C).Figure 1: CTL 128 is HLA-A 6801 Autologous melanoma (Me 18732) was recognized in a limited fashion. Target cells were incubated with the indicated anti-HLA mAb for 1 hour at room temperature prior to addition of a fixed E: T ratio of metabolites (A: Me18732 + nothing added; B: Me18732; C: ME18732 + HLA). -A2, -A69; D: ME18732 + HLA-A2, -A28; Me18732 + HLA-AB, -C).

도 2: CTL128에 의한 자가 흑색종 Me18732 및 HLA-A6801+ 흑색종 세포계의 인식. 1,500 CTL을 25,000 자극세포에 첨가하고, 상층액의 TNF 함량을 24 시간 후에 WEHI-164.13 세포 상에서 평가하였다 (흑색종: A: Me18732; B: Me20842; C: Me17697; D: Me25591/1; E: Me12657; E: Me17088; G: Me4023; H: LB-33; I: 폐암 Calu 3; K: 유방암 SKBR3; L: 난소암 SKOV3).Figure 2: Autologous melanoma Me18732 and HLA-A by CTL128 6801+ Recognition of Melanoma Cell Line. 1,500 CTL was added to 25,000 stimulation cells and the TNF content of the supernatant was assessed on WEHI-164.13 cells after 24 hours (melanoma: A: Me18732; B: Me20842; C: Me17697; D: Me25591 / 1; E: Me12657; E: Me17088; G: Me4023; H: LB-33; I: Lung cancer Calu 3; K: Breast cancer SKBR3; L: Ovarian cancer SKOV3).

도 3: cDNA 131 및 HLA-A6801 cDNA로 트랜스펙션된 Cos-7 세포에 의한 CTL 클론 128의 자극. Cos-7 세포를 HLA-A6801 및 풀 A255 또는 cDNA 131로 트랜스펙션시켰다. 풀 255 는 포화되도록 증폭되고 플라스미드가 추출되는 Me18732 cDNA 라이브러리의 100 cDNA 클론의 군이다. cDNA 131은 풀 A255로부터 서브클로닝된 단일 클론이다. TNF 민감성 세포계 WEHI-164.13을 사용하여, 트랜스펙션된 세포와 20 시간동안 함께 배양한 후에 CTL 128 에 의한 TNF의 생성을 측정하였다. 대조구로서, Cos-7 세포를 cDNA 131 또는 HLA-A6801 단독으로 트랜스펙션시켰다 (A: Me18732; B: COS; C: COS + A6801; D: COS + cDNA 131; E: COS + A6801 + cDNA 131).Figure 3: cDNA 131 and HLA-A Stimulation of CTL Clone 128 by Cos-7 Cells Transfected with 6801 cDNA. HLA-A Cos-7 Cells 6801 and pool A255 or cDNA 131. Pool 255 is a group of 100 cDNA clones of the Me18732 cDNA library from which amplified to saturation and plasmids extracted. cDNA 131 is a monoclonal subcloned from pool A255. The production of TNF by CTL 128 was measured after incubation with transfected cells for 20 hours using TNF sensitive cell line WEHI-164.13. As a control, Cos-7 cells were either cDNA 131 or HLA-A. 6801 alone transfected (A: Me18732; B: COS; C: COS + A 6801; D: COS + cDNA 131; E: COS + A 6801 + cDNA 131).

도 4: CTL 128에 의해 인식되는 항원을 코딩하는 cDNA 131. HLA-A6801 흑색종 세포계 LB33의 제네티신 내성 집단의 CTL 128에 의한 (A) 인식 및 (B) 용해 후, pcDNA3.1/cDNA 131 구축물로 트랜스펙션시킨다. 1,500 개의 반응 세포와 20,000 개의 자극 세포와의 공배양의 24 시간 후에, CTL 128에 의한 TNF 분비를 측정하였다. 다른 대사인자/표적 (E/T) 비에서의 CTL과의 공배양 4 시간 후에 CTL 128의 용해 활성을⁵¹Cr 라벨링된 표적 세포 상에서 측정하였다.Figure 4: cDNA 131 encoding the antigen recognized by CTL 128. HLA-A After (A) recognition and (B) lysis by the CTL 128 of the geneticin resistant population of 6801 melanoma cell line LB33, it is transfected with pcDNA3.1 / cDNA 131 construct. Twenty four hours after coculture of 1,500 reactive and 20,000 stimulating cells, TNF secretion by CTL 128 was measured. Lysis activity of CTL 128 was measured on ⁵¹ Cr labeled target cells after 4 hours of co-culture with CTL at different metabolic factor / target (E / T) ratios.

도 5: CTL 128에 의해 인식되는 항원성 펩티드를 코딩하는 서열의 확인. 패널 (A)의 윗부분에는 cDNA 131의 엑손/인트론 구조가 나타난다. 엑손 및 인트론을 각각 단색 및 빈 박스로 나타내고, 말단의 수평선은 pcDNA3.1 벡터를 나타내고, 서열의 숫자매김은 cDNA 131의 5′말단에 관한 것이다. cDNA 131 아래에 빈 박스로 나타나는, PCR 생성물 및 cDNA로부터 유래된 아단편을 발현 벡터 내에서 클론하고 HLA-A6801 cDNA와 함께 Cos-7 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 엑손 8 특이적 올리고뉴클레오티드 탐침으로 18732 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여, 스플라이싱된 전체 길이 형태의 TRP-2 cDNA를 수득하였다. CTL 128에 의한 TNF 방출을 WEHI164.13 세포 상에서 평가하였다 (B). PCR 단편 INT-2-166 및 INT-2-107에 존재하는 펩티드 코딩 서열을 지적하였다.5: Identification of the sequences encoding antigenic peptides recognized by CTL 128. The upper part of panel (A) shows the exon / intron structure of cDNA 131. Exons and introns are shown in solid and empty boxes, respectively, the horizontal lines at the ends represent pcDNA3.1 vectors, and the numbering of sequences relates to the 5 'end of cDNA 131. PCR products and sub fragments derived from cDNA, which appear as empty boxes under cDNA 131, were cloned in the expression vector and HLA-A Transfected into Cos-7 cells with 6801 cDNA. 18732 cDNA libraries were screened with exon 8 specific oligonucleotide probes to obtain spliced full-length form of TRP-2 cDNA. TNF release by CTL 128 was evaluated on WEHI164.13 cells (B). Peptide coding sequences present in PCR fragments INT-2-166 and INT-2-107 are indicated.

도 6: 합성 항원성 펩티드와 펄스된 HLA-A6801 세포의 CTL 128에 의한 용해.⁵¹Cr 라벨링된 HLA-A6801 EBV-LCL (LB-EBV)를 지시된 농도에서 좌측에 나타난 합성 펩티드의 존재 하에, 20:1의 E/T 비에서 CTL 128과 함께 항온배양하였다.⁵¹Cr-방출을 4 시간 후에 측정하였다. 음성 대조구로서, HLA-A1에 결합할 수 있는 MAGE-3 유래 펩티드 (M3A1)을 사용하였다.Figure 6: Pulsed HLA-A with synthetic antigenic peptides Lysis by CTL 128 of 6801 Cells. ⁵¹ Cr labeled HLA-A 6801 EBV-LCL (LB-EBV) was incubated with CTL 128 at an E / T ratio of 20: 1 in the presence of the synthetic peptide shown on the left at the indicated concentrations. ⁵¹ Cr-release was measured after 4 hours. As a negative control, a MAGE-3 derived peptide (M3A1) capable of binding HLA-A1 was used.

도 7: A3 형 슈퍼타입의 HLA 대립유전자에 의해 제시될 때 TRP-2-INT2_221-231펩티드의 CTL 128에 의한 인식. 다른 농도의 펩티드 TRP-2-INT2_221-231의 존재 하에, 20:1의 E/T 비에서 CTL128과 함께⁵¹Cr 라벨링된 EBV-LCL을 항온배양했다. 크로뮴 방출을 4 시간 후에 측정하였다. c: 펩티드가 없는 음성 대조구.Figure 7: Recognition by CTL 128 of TRP-2-INT2 _221-231 peptide when presented by HLA allele of type A3 _supertype . ⁵¹ Cr labeled EBV-LCL was incubated with CTL128 at an E / T ratio of 20: 1 in the presence of different concentrations of peptide TRP-2-INT2 _221-231 . Chromium release was measured after 4 hours. c: negative control without peptide.

서열 설명:Sequence description:

서열번호 1: CTL 128에 의해 인식되는 항원성 펩티드의 코딩 서열 (핵산).SEQ ID NO: 1: Coding sequence of an antigenic peptide recognized by CTL 128 (nucleic acid).

서열번호 2: CTL 128에 의해 인식되는 항원성 펩티드의 코딩 서열 (아미노산)SEQ ID NO: 2: Coding sequence of an antigenic peptide recognized by CTL 128 (amino acid)

서열번호 3: 스플라이싱되지 않은 인트론 TRP2-INT의 확인을 위해 사용되는 (PRIT-1) 센스 프라이머; TRP2-유전자의 5′UTR 내에 위치.SEQ ID NO: 3: (PRIT-1) sense primer, used for identification of unspliced intron TRP2-INT; Located within 5′UTR of TRP2-gene.

서열번호 4: (INT2-1260) 스플라이싱되지 않은 인트론 TRP2-INT의 확인을 위해 사용되는 안티센스 프라이머: TRP2-유전자의 5′UTR 및 인트론 2 내에 위치.SEQ ID NO: 4: (INT2-1260) Antisense Primer used for identification of unspliced intron TRP2-INT: located within 5′UTR and Intron 2 of the TRP2-gene.

서열번호 5: (KS-INT2) cDNA 131의 아단편의 제조 및 게놈 DNA로부터 TRP-2-INT의 클로닝을 위해 사용되는 안티센스 프라이머: TRP2-유전자의 엑손 2 내에 위치.SEQ ID NO: 5: (KS-INT2) Antisense primer used for preparation of the sub fragment of cDNA 131 and cloning of TRP-2-INT from genomic DNA: located in exon 2 of the TRP2-gene.

서열번호 6: (INT2-as1) cDNA 131의 아단편 INT2-107의 제조를 위해 사용되는 안티센스 프라이머; TRP2-유전자의 인트론 2 내에 위치.SEQ ID NO: 6: (INT2-as1) antisense primer used for the preparation of sub fragment INT2-107 of cDNA 131; Located in intron 2 of the TRP2-gene.

서열번호 7: (INT2-as1) cDNA 131의 아단편 INT2-166의 제조를 위해 사용되는 안티센스 프라이머; TRP2-유전자의 인트론 2 내에 위치.SEQ ID NO: 7: (INT2-as1) antisense primer used for the preparation of sub fragment INT2-166 of cDNA 131; Located in intron 2 of the TRP2-gene.

서열번호 8: (Sp6) cDNA 131의 아단편 INT2-434의 제조를 위해 사용되는 안티센스 프라이머; pCDNA1-플라스미드 내에 위치.SEQ ID NO: 8 (Sp6) antisense primer used for the preparation of sub fragment INT2-434 of cDNA 131; located in the pCDNA1-plasmid.

서열번호 9: (PR2) 게놈 DNA로부터 TRP-2-INT2의 클로닝을 위해 사용되는 안티센스 프라이머: 엑손 3 내제 위치.SEQ ID NO: 9 (PR2) Antisense primer used for cloning of TRP-2-INT2 from genomic DNA: exon 3 internal position.

서열번호 10: (PR3) TRP-2 DNA의 증폭을 위해 사용되는 센스 프라이머; 엑손 2 내에 위치.SEQ ID NO: 10 (PR3) Sense primer used for amplification of TRP-2 DNA; Located in Exxon 2.

서열번호 11: (TRP-2L) TRP-2 DNA의 증폭을 위해 사용되는 안티센스 프라이머; 엑손 8 내에 위치.SEQ ID NO: 11: (TRP-2L) antisense primer used for amplification of TRP-2 DNA; Located in Exxon 8.

서열번호 12: 항원성 펩티드의 코딩 영역을 포함하는 5′말단-1500 단편의 핵산 서열. pcDNa 3.1에 속하고, cDNA 131의 개시 앞인 최초 45bp를 생략한다.SEQ ID NO: 12 nucleic acid sequence of 5 ′ terminal-1500 fragment comprising coding region of antigenic peptide. The first 45bp belonging to pcDNa 3.1 and before the start of cDNA 131 is omitted.

실시예 1Example 1

CTL 128에 대한 제한 요소로서의 HLA-A6801 의 확인HLA-A as a limiting factor for CTL 128 Confirmation of 6801

전이성 상해 환자로부터 흑색종 세포계 Me18732를 설립하고, 혈청학적 방법에 의해 LA-A2 및 HLA-A28 로 분류한 후, 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 탐침 (SSOP) 서브타이핑에 의해 HLA-A0201 및 HLA-A68011로 분류하였다 (앞으로 HLA-A6801로 나타냄) (Oh et al., Genomics 29 (1995) 24-34). [Anichini et al., J.Immunol. 156 (1996) 208-217]에 설명된 대로 항-종양 CTL 클론을 수득하였다.Melanoma cell line Me18732 was established from patients with metastatic injury and classified by LA-A2 and HLA-A28 by serological methods and then HLA-A by sequence-specific oligonucleotide probe (SSOP) subtyping. 0201 and HLA-A Classified as 68011 (forward HLA-A 6801) (Oh et al., Genomics 29 (1995) 24-34). Anichini et al., J. Immunol. 156 (1996) 208-217, an anti-tumor CTL clone was obtained.

CTL 클론 128은, 이것의 세포용해 활성이 안티-HLA 클래스 I mAB W6/32에 의해서는 감소되지만 안티-HLA-A-B, -C mAb 4E에 의해서는 감소되지 않기 때문에, HLA-A 유전자좌와 관련하여 자가 흑색종을 인식한다 (도 1). 용해의 저해가 안티-HLA-A2, -A28 mAb CR1 1.351과만 관찰되고, 안티-HLA-A2, -A69 mAb BB7.2과는 관찰되지 않기 때문에 (도 1), HLA-A0201은 CTL 128 에 의해 인식되는 항원을 위한 제시 분자로서 배제될 수 있다. 따라서, CR1 1.351의 저해 활성은 A28 (A6801)이 CTL 128을 위한 HLA 제시분자라는 것을 가리킨다.CTL clone 128 is associated with the HLA-A locus because its lytic activity is reduced by anti-HLA class I mAB W6 / 32 but not by anti-HLA-AB, -C mAb 4E. Recognize autologous melanoma (FIG. 1). Since inhibition of lysis was observed only with anti-HLA-A2, -A28 mAb CR1 1.351, and not with anti-HLA-A2, -A69 mAb BB7.2 (Figure 1), HLA-A 0201 may be excluded as a presentation molecule for the antigen recognized by CTL 128. Thus, the inhibitory activity of CR1 1.351 was A28 (A 6801) is an HLA presenter for CTL 128.

세포계의 배양Cell culture

흑색종 세포계 M18732를 [Istituto Nazionale Tumori (Milan, Itary)]에서 수술받은 환자의 수술표본으로부터 수득된 전이성 상해로부터 설립하였다. 이 환자의 PBL을 혈청학적으로 HLA-A2, -A28, -B44, -B51, -C2, -C5로 분류하였다. 인간의 전이성 (Me17697, Me2559/1, Me12657, Me17088/1, Me4023) 및 일차적 (Me20843) 흑색종 세포계를 설립하고, 10 % FCS/RPMI 1640 내에서 배양하였다. 흑색종 라인 LB-33, LB-40 및 Cos-7 (ATCC: CRL 1651) 세포주를 10 % FCS/DMEM 내에서 유지시켰다. 암종 계 CALU3, SKBR3 및 SKOV3 [American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)로부터 구입]를 10 % FCS/RPMI 1640 내에서 계속 배양하였다. CIRA03301 트랜스펙탄트, 동형접합성 EBV-형질전환된 LCL, 세포계 SCHU를 HLA-A0301, B0702, -C7로 특징짓고, AMA-1은 HLA-A6802로, B5301, -C4 및 WT-100-bis는 HLA-A11, -B35, -C4로 특징지었다. EBV-LCL JHAF (HLA-A31011, -B51, -C8) 및 LB (HLA-A68011, B40011, -C2, -C3)를 ATCC로부터 수득하였다. EBV-LCL 을 10 % FCS/RPMI 1640 에서 유지시켰다.Melanoma cell line M18732 was established from metastatic injury obtained from surgical specimens of patients undergoing surgery in Istituto Nazionale Tumori (Milan, Itary). PBLs of this patient were serologically classified as HLA-A2, -A28, -B44, -B51, -C2, -C5. Human metastatic (Me17697, Me2559 / 1, Me12657, Me17088 / 1, Me4023) and primary (Me20843) melanoma cell lines were established and cultured in 10% FCS / RPMI 1640. Melanoma lines LB-33, LB-40 and Cos-7 (ATCC: CRL 1651) cell lines were maintained in 10% FCS / DMEM. Carcinoma CALU3, SKBR3 and SKOV3 (purchased from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)) were continued incubation in 10% FCS / RPMI 1640. CIRA 03301 transfectant, homozygous EBV-transformed LCL, cell line SCHU to HLA-A 0301, B 0702, characterized by -C7, AMA-1 is HLA-A 6802, B 5301, -C4 and WT-100-bis were characterized as HLA-A11, -B35, -C4. EBV-LCL JHAF (HLA-A 31011, -B51, -C8) and LB (HLA-A 68011, B 40011, -C2, -C3) were obtained from ATCC. EBV-LCL was maintained at 10% FCS / RPMI 1640.

CTL 128 항원 특이성의 평가Evaluation of CTL 128 Antigen Specificity

다른 종양 상에서 CTL 128에 의해 인식되는 항원의 발현 빈도를 평가하기 위해, HLA-A6801 흑색종 계를 CTL 자극 분석으로 테스트하였다. 8 개의 흑색종 세포 계 중 5 개가 CTL 128에 의해 TNF 방출을 유도하였다 (도 2). 대신에 다른 조직학적 기원의 세 개의 HLA-A6801 암종 계에서는 반응성이 관찰되지 않았다 (도 2). HLA-A6801 음성 흑색종, 멜라닌세포 및 다른 조직학적 유형의 종양 계는 CTL 128에 의한 시토킨 방출을 자극하지 못했다. 테스트되는 흑색종 세포 계에 대한 CTL 128에 의해 나타나는 반응성의 패턴은 RT-PCR에 의해 평가된 이러한 세포계 내에서 흑색종 항원의 발현과 연관되지 않았다. 이것을 공유된 흑색종 항원 (멜란-A/MART-1, 티로시나제, gp100, TRP-1, 2, MAGE-1, -2. -3. -4, -12, BAGE-1. -2. GAGE-1, -2, -3, -4, -5, -6))을 코딩하는 것으로 공지된 각각의 유전자와 함께, 플라스미드 pcDNA3/A6801과 코트랜스펙션되고, 환자 18732의 HLA-A6801 유전자를 함유하는 Cos-7 세포의 존재 하에 CTL 128에 의해 TNF가 방출되지 않는 것에 의해 확인하였다. 이러한 결과는 HLA-A6801 제한된 CTL 128이 다수의 흑색종에 의해 공유되는 새로운 항원을 인식한다는 가정과 일치한다.To assess the frequency of expression of antigens recognized by CTL 128 on other tumors, HLA-A The 6801 melanoma line was tested by CTL stimulation assay. Five of eight melanoma cell lines induced TNF release by CTL 128 (FIG. 2). Instead, three HLA-As of different histological origins No reactivity was observed in the 6801 carcinoma system (FIG. 2). HLA-A 6801 negative melanoma, melanocytes and other histological types of tumor systems did not stimulate cytokine release by CTL 128. The pattern of reactivity exhibited by CTL 128 against the melanoma cell line tested was not associated with the expression of melanoma antigens in this cell line assessed by RT-PCR. It has been shared with melanoma antigens (melan-A / MART-1, tyrosinase, gp100, TRP-1, 2, MAGE-1, -2. -3. -4, -12, BAGE-1. -2.GAGE- Plasmid pcDNA3 / A, with each gene known to encode 1, -2, -3, -4, -5, -6)) HLA-A in patients transfected with 6801 and patient 18732 TNF was not released by CTL 128 in the presence of Cos-7 cells containing the 6801 gene. These results are HLA-A 6801 Consistent with the assumption that limited CTL 128 recognizes new antigens shared by multiple melanoma.

4 주된 혼합 림프구 종양 배양물 (MLTC)의 제한적 희석에 의해 CTL 클론 128을 유도하고, 이전에 기술된 것과 유사한 조건에서 배양하였다 (Anichini et al., J. Immunol. 156 (1996) 208-217). 특정한 mAb와의 흘림세포계측법에 의해 평가된 대로, CTL 128은 CD³⁺, CD^4-, CD8⁺, TCR-⁺표현형을 발현시켰다.CTL clone 128 was induced by limited dilution of 4 week mixed lymphocyte tumor culture (MLTC) and cultured under similar conditions as previously described (Anichini et al., J. Immunol. 156 (1996) 208-217) . As assessed by flow cytometry with specific mAbs, CTL 128 expressed the CD ³⁺ , CD ^4- , CD8 ⁺ , TCR− ⁺ phenotypes.

세포용해 활성 분석Cytolytic Activity Assay

이전에 기술된 대로 (Anichini et al., J. Immunol. 156 (1996) 208-217), 크로뮴 방출 분석으로 CTL 128의 용해 활성을 테스트하였다. 결과는 하기와 같이 표현된다:As previously described (Anichini et al., J. Immunol. 156 (1996) 208-217), the lytic activity of CTL 128 was tested by chromium release assay. The result is expressed as follows:

식 중 자발적 방출은 표적 세포를 대사인자의 부재 하에 항온배양함으로써 평가되고, 최대 방출은 1 % NP-4O 세제 (BDH Boichemicals, Poole, U.K.)의 존재 하에 측정된다. 자가 흑색종에 대한 용해 저해는 보고된 대로 하기의 mAb로 수행되었다 (Anichini et al., J. Immunol. 156 (1996) 208-217): 안티-HLA-A, -B, -C W6/32 (Parham et al., J. Immunol. 123 (1979) 342-249-299), 안티-HLA-A2, -A69 BB7.2 (Parham and Brodsky, Hum. Immunol. 3 (1981) 277-299), 안티-HLA-A2, -A28 CR11.351 (Russo et al., Immunogenetics 18 (1983) 23-35), 및 안티-HLA-A-B, -C 4E (Yang et al., Immunogenetics 19 (1984) 217-231).Spontaneous release in the formula is assessed by incubating the target cells in the absence of metabolic factors, maximal release is measured in the presence of 1% NP-4O detergent (BDH Boichemicals, Poole, U.K.). Dissolution inhibition against autologous melanoma was performed with the following mAbs as reported (Anichini et al., J. Immunol. 156 (1996) 208-217): anti-HLA-A, -B, -C W6 / 32 (Parham et al., J. Immunol. 123 (1979) 342-249-299), anti-HLA-A2, -A69 BB7.2 (Parham and Brodsky, Hum. Immunol. 3 (1981) 277-299), Anti-HLA-A2, -A28 CR11.351 (Russo et al., Immunogenetics 18 (1983) 23-35), and anti-HLA-AB, -C 4E (Yang et al., Immunogenetics 19 (1984) 217- 231).

HLA-A6801 대립유전자의 서브클로닝HLA-A Subcloning of the 6801 Allele

RNAzol B (Cinna/Biotex, South Loop East. TX)를 사용하여 구아니딘-이소티오시아네이트 방법에 의해 Me18732 세포로부터 토탈(total) RNA를 제조하였다. 제조자의 지시에 따라 RNase 활성이 없는 쥐백혈병바이러스-유래 역전사효소 (MMLV VRT RNase-H-Superscript; GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) 및 올리고-dT 프라이머를 사용하여 2㎍의 토탈 RNA 상에서 단일가닥 cDNA를 합성하였다.Total RNA was prepared from Me18732 cells by the guanidine-isothiocyanate method using RNAzol B (Cinna / Biotex, South Loop East. TX). Single-stranded cDNA on 2 μg total RNA using MMase VL RNase-H-Superscript (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) and oligo-dT primers without RNase activity according to the manufacturer's instructions Synthesized.

300 ng의 토탈 RNA에 상응하는 cDNA를 1 U의 DynaZymeTM (Finnzymes OY, Espoo, Finland) 및 특정한 증폭과 HLA-A 대립유전자의 전체 길이 코딩 영역의 방향성 클로닝에 적합한 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. BamHI 및 HindIII 절단 후에, 1.1 Kb PCR 생성물을 진핵생물 발현 벡터 pcDNA3 (Invitrogen Corporation, Oxon, UK)의 BamHI/EcoRV 부위 내로 서브클로닝했다.Amplify cDNA corresponding to 300 ng total RNA by PCR using 1 U DynaZymeTM (Finnzymes OY, Espoo, Finland) and primer pairs suitable for specific amplification and directional cloning of the full-length coding region of the HLA-A allele It was. After BamHI and HindIII cleavage, the 1.1 Kb PCR product was subcloned into the BamHI / EcoRV site of the eukaryotic expression vector pcDNA3 (Invitrogen Corporation, Oxon, UK).

HLA-A68011 또는 A＊0201 (환자 18732의 HLA-A28 및 -A2 대립유전자)을 코딩하는 플라스미드 클론을 진단성 제한효소를 사용하여 확인하였다. 이어서 HLA-A＊68011 유전자를 서열확인하여 공개된 DNA 서열과의 유사성을 입증하였다. 이 플라스미드를 pcDNA3/HLA-A＊6801이라고 부른다.HLA-A Plasmid clones encoding 68011 or A * 0201 (HLA-A28 and -A2 alleles of patient 18732) were identified using diagnostic restriction enzymes. The HLA-A * 68011 gene was then sequenced to demonstrate similarity with published DNA sequences. This plasmid is called pcDNA3 / HLA-A * 6801.

실시예 2Example 2

CTL 128에 의해 인식되는 흑색종 항원을 코딩하는 cDNA의 클로닝Cloning of cDNA Encoding Melanoma Antigens Recognized by CTL 128

Me18732 세포로부터 추출된 폴리(A)⁺RNA를 갖는 적합한 발현 벡터 (pcDNA3.1) 내에 cDNA 라이브러리를 구축하였다. Fast Track mRNA 추출 키트 (Invitrgen)을 사용하여 Me18732 세포로부터 폴리(A)⁺RNA를 단리하였다. 5′말단에 NotI 부위를 함유하는 올리고-dT 프라이머를 사용하여 SuperSctipt Choice System 키트 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)으로 5 ㎍의 폴리(A)⁺RNA를 cDNA로 전환시키면서 라이브러리를 구축하였다. 이어서 cDNA를 BstXI 연결기(Invitrgen)로 결찰시키고, NotI로 절단하였다. 크기 분획 후에, cDNA를 비방향적으로 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrgen)의 BstXI/NotI 부위 내로 클로닝하였다. 재조작 플라스미드를 DH5-대장균 내로 일렉트로포레이션하고, 앰피실린 (100 mg/㎖)으로 선별하였다.CDNA libraries were constructed in a suitable expression vector (pcDNA3.1) with poly (A) ⁺ RNA extracted from Me18732 cells. Poly (A) ⁺ RNA was isolated from Me18732 cells using Fast Track mRNA Extraction Kit (Invitrgen). Libraries were constructed by converting 5 μg of poly (A) ⁺ RNA into cDNA with the SuperSctipt Choice System Kit (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) using oligo-dT primers containing the NotI site at the 5 ′ end. CDNA was then ligated with BstXI linker (Invitrgen) and cleaved with NotI. After the size fraction, cDNA was cloned non-directionally into the BstXI / NotI site of mammalian expression vector pcDNA3.1 (Invitrgen). The engineered plasmid was electroporated into DH5-E. Coli and selected with ampicillin (100 mg / ml).

라이브러리를 약 100 cDNA 클론의 1,300 풀로 나누었다. 각 풀의 박테리아를 포화될 때까지 증폭시키고, 플라스미드 DNA를 추출하여, DEAE-덱스트란-클로로퀸 방법 (Coulie et al., J.Exp. med. 180 (1994); Seed and Aruffo. Pro. Natl. Acad. Sci.USA 84 (1987) 3365-3369)에 의해 pcDNA3/A6801 (100ng)과 함께 1.2 ×10⁴Cos-7 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 동일한 기술을 사용하여, 다른 실험에서 Cos-7 세포를 100 ng의 pcDNA3/A6801 벡터 및 100 ng의 하기의 흑색종 항원 중 하나를 함유하는 pcD SR 플라스미드 또는 pcDNAI와 함께 코트랜스펙션시켰다: Melan A/MART-1, 티로시나아제, gp100, MAGE-1, -2, -3, -4, -12, BAGE-1, -2, GAGE-1, -2, -3-, -4, -5, -6, TRP-1. 전체 길이의 TRP-2 cDNA를 5′비번역 영역 (UTR) 내에 위치하고 엑손 8의 말단에 위치하는 특정한 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 증폭하고, pcDNA 내로 클로닝하고, 서열확인하여 공개된 cDNA 서열 (Yokohama et al., Bioch. Bioph.Acta 1271 (1994) 317-321)과의 유사성을 입증하였다. 트랜스펙션된 Cos-7 세포를 48 시간 후에 CTL 자극 분석으로 테스트하였다.The library was divided into 1,300 pools of approximately 100 cDNA clones. Bacteria in each pool were amplified until saturation and plasmid DNA was extracted and the DEAE-dextran-chloroquine method (Coulie et al., J. Exp. Med. 180 (1994); Seed and Aruffo. Pro. Natl. PcDNA3 / A by Acad.Sci. USA 84 (1987) 3365-3369) 6801 (100ng) was transfected into 1.2 × 10 ⁴ Cos-7 cells. Using the same technique, 100 ng pcDNA3 / A of Cos-7 cells in different experiments Coatfection was performed with pcD SR plasmid or pcDNAI containing 6801 vector and 100 ng of one of the following melanoma antigens: Melan A / MART-1, tyrosinase, gp100, MAGE-1, -2,- 3, -4, -12, BAGE-1, -2, GAGE-1, -2, -3-, -4, -5, -6, TRP-1. Full-length TRP-2 cDNA was amplified by RT-PCR using specific primers located in the 5 ′ untranslated region (UTR) and located at the end of exon 8, cloned into pcDNA, sequenced and published cDNA sequence (Yokohama et al., Bioch. Bioph. Acta 1271 (1994) 317-321) demonstrated similarity. Transfected Cos-7 cells were tested 48 hours later by CTL stimulation assay.

CTL 자극 분석CTL Stimulation Analysis

이전에 기술된대로, CTL 128에 의한 TNF의 형성을 일으킬 수 있는 능력에 대해 트랜스펙탄트 또는 자극 세포계를 테스트하였다 (Traversari et al., Immunogenetics 35 (1992) 145-152). 간단하게는, 25 U/㎖ r-hu-IL2 (Eurocetus, Amsterdam, The Netherlands) 및 10 % 풀된 인간 혈청 (PHS)와 함께 100 ℓ의 IMDM (BioWhittaker, Walkersville, MD) 내에, 표적 세포를 함유하는 마이크로웰에 1,500 CTL을 첨가하였다. 24 시간 후에, 상층액을 수집하고, MTT 비색계 분석으로 WEHI 세포, 예컨대 WEHI-164.13 상에서의 세포독성 효과를 테스트함으로써 (Espevik, T., and J. Nissen-Meyer, J. Immunol. Methods 95 (1986) 99-105) ,이것의 TNF 함량을 측정하였다. WEHI-164.13 세포를 10 % FCS/RPMI-1640 내에서 계속 배양하였다.As previously described, transfectant or stimulating cell lines were tested for their ability to cause the formation of TNF by CTL 128 (Traversari et al., Immunogenetics 35 (1992) 145-152). Briefly, in 100 L IMDM (BioWhittaker, Walkersville, MD) with 25 U / ml r-hu-IL2 (Eurocetus, Amsterdam, The Netherlands) and 10% pooled human serum (PHS) containing the target cells 1,500 CTL was added to the microwells. After 24 hours, supernatants were collected and tested for cytotoxic effects on WEHI cells, such as WEHI-164.13, by MTT colorimetric assay (Espevik, T., and J. Nissen-Meyer, J. Immunol. Methods 95 (1986). 99-105), and its TNF content was measured. WEHI-164.13 cells were continued incubation in 10% FCS / RPMI-1640.

이중 마이크로컬쳐를 트랜스펙션시키고, 이틀 후에 CTL 128에 의한 TNF 방출을 자극하는 이들의 능력을 스크리닝하였다. 1,300 풀 중 하나(poll A255) 의 DNA가 높은 수준의 TNF 형성을 유도하였고 (도 3), 이것을 제 2 트랜스펙션 실험에서 확인하였다. 양성 풀의 박테리아를 클론하고, 이들의 플라스미드 DNA를 이전의 HLA-A6801 구축물과 함께 코트랜스펙션시켰다. 159 클론 중 25 개가 CTL 128에 의한 TNF 방출을 자극하였다. 이들 중 하나, 즉 cDNA 131로 수득된 결과가 도 3에 나타난다.Dual microcultures were transfected and their ability to stimulate TNF release by CTL 128 after two days was screened. DNA from one of the 1,300 pools (poll A255) induced high levels of TNF formation (FIG. 3), which was confirmed in the second transfection experiment. Clone bacteria in positive pools, and their plasmid DNA was previously identified as HLA-A. Coatfection was performed with the 6801 construct. 25 of 159 clones stimulated TNF release by CTL 128. The results obtained with one of these, ie cDNA 131, are shown in FIG.

흑색종 세포계의 트랜스펙션Transfection of Melanoma Cell Lines

흑색종 세포계 LB-33을 인산칼슘 침전 기술에 의해 플라스미드 pcDNA3.1 (Invitrogen) 내에 클론된 cDNA 131로 트랜스펙션시키는데, 이것은 네오마이신 내성 유전자를 함유한다. G418-내성 트랜스펙션된 집단으로부터 클론성 서브라인을 단리했다. 동일한 방법을 사용하여, 10 % FCS/DMEM 내에 유지된 흑색종 세포계 LB-40, SK23-MEL 및 MZ2-MEL을 HLA-A6801 cDNA로 트랜스펙션시키고, G418 내에서 선별하였다. 안정한 트랜스펙턴트 내의 트래스펙션된 HLA-A6801 대립유전자의 발현을 특정한 mAb로의 흘림세포계측법으로 입증하였다.Melanoma cell line LB-33 is transfected with cDNA 131 cloned in plasmid pcDNA3.1 (Invitrogen) by calcium phosphate precipitation technique, which contains a neomycin resistance gene. Clonal sublines were isolated from G418-resistant transfected populations. Using the same method, melanoma cell lines LB-40, SK23-MEL and MZ2-MEL maintained in 10% FCS / DMEM were HLA-A Transfected with 6801 cDNA and selected in G418. HLA-A Transfected in Stable Transfectant Expression of the 6801 allele was demonstrated by flow cytometry to specific mAbs.

CTL 128 에 의해 인식되지 않는 (도 2) HLA-A6801⁺흑색종 세포계 LB-33은 cDNA 131과 코트랜스펙션되었을 때 TNF 방출을 유도할 수 있는 성질을 얻고 (도 4A), CTL 128에 의한 용해에 민감해지고 (도 4B), 이것은 항원의 인식이 종양세포에서 일어날 수 있고, Cos-7 세포에서 달성된 높은 인위적 발현 수준과 독립적이라는 것을 가리킨다.HLA-A not recognized by CTL 128 (Figure 2) 6801 ⁺ melanoma cell line LB-33 acquires the property of inducing TNF release when co-exacted with cDNA 131 (FIG. 4A) and is sensitive to lysis by CTL 128 (FIG. 4B), which is an antigen recognition This may occur in tumor cells and is independent of the high artificial expression level achieved in Cos-7 cells.

cDNA 131의 서열은 3548 bp 길이라는 것이 입증되었다. 유전자은행을 조사함으로써, 뉴클레오티드 (nt) 1-994 및 nt 3081-3347이, 최근 멜라닌세포 계통의 흑색종 항원으로 확인된 (Wang, R., et al., J. Exp. Med. 184 (1996) 2207-2216) TRP-2를 코딩하는 cDNA의 두 개의 비인접 영역과 동일하다는 것이 발견되었다 (Yokoyama, K., et al., Bioch. Bloph. Acta 1217H (1994) 317-321). 제 1 영역은 TRP-2의 5′-UTR, 엑손 1 및 엑손 2를 함유하는 반면, 제 2 영역은 엑손 3 및 엑손 4 를 함유한다. nt 995-3080 사이 및 nt 3347 하류의 서열은 데이타뱅크에 기록된 어느 서열과도 의미있는 상동성을 보이지 않았다. cDNA 131에는 존재하지만 TRP-2 cDNA에는 존재하지 않는 2 개의 영역은 인트론 서열을 지닌다. 엑손 부분 측면의 10 개의 아미노산 범위는 TRP-2 유전자의 엑손-인트론 접합점에서 기술된 서열과 완벽하게 꼭 들어맞았다 (Sturm, R., et al., Genomics 29 (1995) 24-34). 또한, 서열 995-3080 (2086 nt)의 길이는 공개된 게놈 지도로부터 추정되는, TRP-2의 인트론 2와 양립성이었다 (Sturm, R., et al., Genomics 29 (1995) 24-34). 따라서 nt 995-3080의 정체는 TRP-2의 인트론 2의 정체와 일치하였다. cDNA 131의 nt 3347 의 하류 서열은 TRP-2의 인트론 4의 것과 동일한 5′도너(donor) 스플라이스 부위 서열을 나타낸다 (Sturm, R., et al., Genomics 29 (1995) 24-34). 3 ′ 어셉터(acceptor) 스플라이스 부위 서열이 없고, 공개된 게놈 지도로부터 추정된 것보다 길이가 더 짧기 때문에, 이것은 nt 200 에서 절단된 TRP-2의 인트론 4의 서열이다. 따라서, cDNA 131은 인트론 4의 초기 부분 및 인트론 2의 반복과 함께 엑손 1-4를 함유하는 흑색종세포 분화 항원 TRP-2 의 부분적으로 스플라이싱된 형태로 구성된다.The sequence of cDNA 131 was demonstrated to be 3548 bp in length. By examining the gene banks, nucleotides (nt) 1-994 and nt 3081-3347 were recently identified as melanoma antigens of melanocyte lineages (Wang, R., et al., J. Exp. Med. 184 (1996). 2207-2216) and two non-adjacent regions of the cDNA encoding TRP-2 (Yokoyama, K., et al., Bioch. Bloph. Acta 1217H (1994) 317-321). The first region contains 5′-UTR, exon 1 and exon 2 of TRP-2, while the second region contains exon 3 and exon 4. Sequences between nt 995-3080 and downstream of nt 3347 showed no significant homology with any sequence recorded in the databank. Two regions present in cDNA 131 but not in TRP-2 cDNA have intron sequences. The 10 amino acid range on the side of the exon portion fits perfectly with the sequence described at the exon-intron junction of the TRP-2 gene (Sturm, R., et al., Genomics 29 (1995) 24-34). In addition, the length of SEQ ID NOs: 995-3080 (2086 nt) was compatible with intron 2 of TRP-2, as estimated from published genomic maps (Sturm, R., et al., Genomics 29 (1995) 24-34). Thus, the identity of nt 995-3080 was consistent with that of intron 2 of TRP-2. The downstream sequence of nt 3347 of cDNA 131 shows the same 5 'donor splice site sequence as that of Intron 4 of TRP-2 (Sturm, R., et al., Genomics 29 (1995) 24-34). Since there is no 3 ′ acceptor splice site sequence and is shorter in length than estimated from published genomic maps, this is the sequence of intron 4 of TRP-2 cleaved at nt 200. Thus, cDNA 131 consists of a partially spliced form of melanoma differentiation antigen TRP-2 containing exon 1-4 with an initial portion of intron 4 and an intron 2 repeat.

DNA 서열확인 및 상동성 조사DNA sequencing and homology investigation

합성 올리고뉴클레오티드로의 명확한 프라이밍에 의해 DNA 서열을 분석하였다. 염료-라벨링된 디데옥시뉴클레오티드 및 ABI Prismtm Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction 키트 (Perkin Elmer, Foster City, CA)을 사용하여 디데옥시-사슬 종결 방법에 의해 서열확인 반응을 수행하였다. 자동화된 DNA 서열확인기 (ABI Prism 377 DNA Sequencer: Perkin Elmer)로 플라스미드 클론 cDNA 131의 DNA 서열을 측정하였다. 프로그램 FASTA EMBI-Heidelberg를 사용하여 컴퓨터로 서열 상동성을 조사하였다.DNA sequences were analyzed by clear priming with synthetic oligonucleotides. Sequencing reactions were performed by the dideoxy-chain termination method using dye-labeled dideoxynucleotides and the ABI Prismtm Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer, Foster City, Calif.). DNA sequence of plasmid clone cDNA 131 was measured with an automated DNA sequencer (ABI Prism 377 DNA Sequencer: Perkin Elmer). Sequence homology was examined by computer using the program FASTA EMBI-Heidelberg.

CTL 128에 의해 인식되는 항원성 펩티드를 코딩하는 서열의 확인Identification of sequences encoding antigenic peptides recognized by CTL 128

CTL 128에 의해 인식되는 항원성 펩티드를 코딩하는 서열의 위치를 찾기 위해, cDNA 131을 HindIII로 절단하여, 각각 1500, 200 및 2000 bp의 세 개의 아단편 (도 5 에서 5′-말단-1500, 200 bp 및 3′-말단)을 수득하였다.To find the position of the sequence encoding the antigenic peptide recognized by CTL 128, cDNA 131 was cleaved with HindIII and three subsegments of 1500, 200 and 2000 bp, respectively (5′-terminal-1500 in FIG. 5, 200 bp and 3'-end) were obtained.

cDNA 아단편의 제조Preparation of cDNA Subsegments

플라스미드를 HinIII 및 BstUI로 절단하여 cDNA 131의 아단편 (5′-말단-1500, 5′-말단-8OO, 200 bp 및 3′-말단)을 수득하엿다. 아가로스 겔 상에서의 정제 후에, 단편을 pcDNAI 플라스미드 내로 클론하였다. PCR 증폭에 의해, 5′-말단-1500으로부터 더 작은 단편 INT-2-434, INT-2-166 및 INT-2-107을 만들었다. 센스 프라이머 KS-INT2(서열번호 5) 을 사용하여 모든 단편들을 증폭하였다. 이 프라이머는, TRP-2와 동일한 프래임에서, 적합한 Kozak 공통서열과 함께, ATG 개시 코돈 (밑줄)을 생성하였다. INT-2-434, -166 및 -107 각각을 증폭시키기 위해 사용되는 안티센스 프라이머는 pcDNAI 플라스미드 내에 위치하는 SP6 (서열번호 8), TRP-2의 인트론 2 에 위치하는 INT-as1 (서열번호 6) 및 INT2-as2 (서열번호 7)이다. 안티센스 프라이머 INT-as1 및 INT2-as2는 방향성 클로닝을 위해 XhoI 제한부위를 함유한다. 결찰을 촉진하기 위해, DynazymeTM-증폭된 단편의 5′-말단에서, DNA 중합효소의 최종 트랜스퍼라제 활성 때문에, 단일 3′A-돌출부가 존재한다는 잇점을 이용하였다. pcDNAI 플라스미드를 EcoRV로 절단한 후, [Marchuk, D., et al, Nucl. Acids Res. 19 (1991) 1154]에 의해 설명된 대로, 2mM dTTP의 존재 하에 DynazymeTM과 함께 항온배양함으로써 단일 티미딘을 각 단편의 3′말단에서 첨가하였다. T 벡터뿐만 아니라 PCR 생성물을 XhoI으로 절단하고, 아가로스 겔 상에서 정제하고, 결찰시켰다. 결찰 후에, 플라스미드를 DH-5 E. coli 내로 전기영동하고, 앰피실린 (50 ㎎/㎖)로 선별하였다. 클론을 단리하고, 플라스미드 DNA를 추출하여 HLA-A6801 유전자와 함께 Cos-7 세포 내로 트랜스펙션시켰다.Plasmids were cleaved with HinIII and BstUI to obtain sub fragments of cDNA 131 (5'-end-1500, 5'-end-8OO, 200 bp and 3'-end). After purification on agarose gels, the fragments were cloned into pcDNAI plasmids. By PCR amplification, smaller fragments INT-2-434, INT-2-166 and INT-2-107 were made from 5′-end-1500. All fragments were amplified using sense primer KS-INT2 (SEQ ID NO: 5). This primer, in the same frame as TRP-2, produced an ATG start codon (underlined) with a suitable Kozak consensus sequence. Antisense primers used to amplify INT-2-434, -166 and -107 respectively were SP6 (SEQ ID NO: 8) located in the pcDNAI plasmid, INT-as1 (SEQ ID NO: 6) located on Intron 2 of TRP-2. And INT2-as2 (SEQ ID NO: 7). Antisense primers INT-as1 and INT2-as2 contain XhoI restriction sites for directional cloning. To facilitate ligation, the advantage was that at the 5′-end of the Dynazyme ™ -amplified fragment, due to the final transferase activity of the DNA polymerase, there was a single 3′A-protrusion. The pcDNAI plasmid was digested with EcoRV and then Marchuk, D., et al, Nucl. Acids Res. 19 (1991) 1154, single thymidine was added at the 3 ′ end of each fragment by incubation with Dynazyme ™ in the presence of 2 mM dTTP. PCR products as well as T vectors were cleaved with XhoI, purified on agarose gels and ligated. After ligation, the plasmids were electrophoresed into DH-5 E. coli and selected with ampicillin (50 mg / ml). Isolate the clones, extract the plasmid DNA and HLA-A Transfected into Cos-7 cells with 6801 gene.

이 단계에서, 번역을 조절하는 개시 코돈의 5′말단 단편 내의 존재는 연구되지 않았다. 5′-말단-1500 단편(서열목록 12)으로 트랜스펙션된 Cos-7 세포의 존재 하에 CTL에 의해 방출되는 TNF의 수준을 cDNA 131에 의해 자극되는 것과 비교하였는데 (도 5), 이것은 항원성 펩티드가 이 영역 내에 위치한다는 것을 가리킨다. 엑손 1, 엑손 2 및 인트론 2의 최초 410 bp를 둘러싸는 이 아단편의 뉴클레오티드 서열이 서열번호 12에 나타나 있다. CTL 128은 완전히 스플라이싱된 TRP-2 cDNA 및 HLA-A6801로 코트랜스펙션된 Cos-7 세포에 의해서는 자극되지 않았다 (도 5). 이것은 CTL 128에 의해 인식되는 항원을 코딩하는 서열이 cDNA 내에 존재하는 TRP-2 유전자의 인트론성 부분에 전체적으로 또는 부분적으로 위치할 수 있다는 것을 보여준다. BstUI 부위에서의 5′-말단-1200 단편의 절단에서 유래되고 엑손 1 및 엑손 2의 반을 함유하는, 5′-말단-800 cDNA 단편으로 트랜스펙션된 Cos-7 세포의 인식의 결핍 (도 5)은 이러한 의견을 지지한다. 항원성 펩티드를 코딩하는 서열의 인트론성 위치는 인트론 2의 434 bp (INT-2-434)를 포함하는 PCR 증폭된 단편의 항원의 발현을 전달할 수 있는 능력에 의해 확인된다 (도 5). 이 영역의 이전의 엑손의 동일한 판독 프레임에서, HLA-A6801 펩티드 결합 모티프 (Rammensee, H.G., et al., Immunogenetics 41 (1995) 178-228)에 상응하는 고정 잔기를 함유하는 (위치 9 및 10) 데카펩티드 (EVISCKLIKR) (서열번호 2)를 코딩하는 서열의 존재가 관찰되었다.At this stage, the presence in the 5 ′ terminal fragment of the initiation codon that regulates translation has not been studied. The level of TNF released by CTL in the presence of Cos-7 cells transfected with 5′-end-1500 fragment (SEQ ID NO: 12) was compared to that stimulated by cDNA 131 (FIG. 5), which is antigenic. It indicates that the peptide is located in this region. The nucleotide sequence of this sub fragment surrounding the first 410 bp of exon 1, exon 2 and intron 2 is shown in SEQ ID NO: 12. CTL 128 is fully spliced TRP-2 cDNA and HLA-A It was not stimulated by Cos-7 cells transfected with 6801 (FIG. 5). This shows that the sequence encoding the antigen recognized by CTL 128 can be located in whole or in part in the intronic portion of the TRP-2 gene present in the cDNA. Lack of recognition of Cos-7 cells derived from cleavage of 5′-terminal-1200 fragments at the BstUI site and transfected with 5′-terminal-800 cDNA fragments containing half of exon 1 and exon 2 (FIG. 5 supports this opinion. The intronic position of the sequence encoding the antigenic peptide is confirmed by its ability to deliver the expression of the antigen of the PCR amplified fragment comprising 434 bp (INT-2-434) of Intron 2 (FIG. 5). In the same reading frame of the previous exon of this region, HLA-A Sequence encoding the decapeptide (EVISCKLIKR) (SEQ ID NO: 2) (positions 9 and 10) containing a fixed residue corresponding to the 6801 peptide binding motif (Rammensee, HG, et al., Immunogenetics 41 (1995) 178-228) The presence of was observed.

에피토프를 함유하는 영역을 더 정의하기 위해, PCR 단편을 적합한 Kozak 공통서열을 갖는 ATG를 생성시키는, 센스 프라이머 KS-INT2 (서열번호 5), 및 역 프라이머 INT2-as1 (서열번호 6) 또는 INT2-as2 (서열번호 7)를 사용하여 증폭시켰다. 첫번째 단편 (INT-2-166)은 두번째 단편 (INT-2-107)에서는 부분적으로 결실된 서열을 코딩하는 전체 추정 펩티드를 함유한다. 완전한 추정 서열을 함유하는, 단편 INT-2-166만이 CTL 128에 의한 TNF 방출을 자극할 수 있다 (도 5). 10-mer 및 9-mer 펩티드, 즉 EVISCKLIKR (서열번호 2) 및 EVISCKLIK (마지막 펩티드 (R)이 없어서 10-mer 펩티드 (서열번호 2)와 다른 9-mer 펩티드)를 합성하여, HLA-A6801 상동성 LCL 계 LB와 함께 항온배양하였다. 데카펩티드 EVISCKLIKR는 LB 세포를 자극하여 CTL 128에 의해 용해되게 할 수 있는 반면 (약 100 pM의 농도에서 최대 절반의 용해가 수득됨), 노나펩티드는 효율이 매우 낮았고 대조 펩티드는 음성이었다 (도 6).To further define the region containing the epitope, the sense fragment KS-INT2 (SEQ ID NO: 5), and the reverse primer INT2-as1 (SEQ ID NO: 6) or INT2-, which generate an ATG with PCR fragments suitable Kozak consensus Amplification using as2 (SEQ ID NO: 7). The first fragment (INT-2-166) contains the entire putative peptide encoding the partially deleted sequence in the second fragment (INT-2-107). Only fragment INT-2-166, containing the complete putative sequence, can stimulate TNF release by CTL 128 (FIG. 5). 10-mer and 9-mer peptides, namely EVISCKLIKR (SEQ ID NO: 2) and EVISCKLIK (the last peptide (R) lacking 10-mer peptide (SEQ ID NO: 2) and other 9-mer peptides) to synthesize HLA-A Incubated with 6801 homologous LCL based LB. The decapeptide EVISCKLIKR can stimulate LB cells to be lysed by CTL 128 (up to half lysis is obtained at a concentration of about 100 pM), while the nonapeptide was very low in efficiency and the control peptide was negative (FIG. 6). ).

CTL 128에 의해 인식되는 에피토프가 종양에서 일어나는 돌연변이에 의해 생성될 수 있는 것ㅇ르 배제하기 위해, 전체 인트론 2에 걸쳐있는 (cDNA 131 내의 nt 995-3080) 2142 bp 단편을 CTL 게놈 DNA 및 다른 흑색종, MZ2-mel으로부터 PCR에 의해 증폭시켰다.To rule out that epitopes recognized by CTL 128 could be produced by mutations occurring in tumors, 2142 bp fragments spanning the entire intron 2 (nt 995-3080 in cDNA 131) were replaced with CTL genomic DNA and other blacks. Species were amplified by PCR from MZ2-mel.

실시예 3Example 3

게놈 DNA로부터 TRP-2-INT2의 클로닝Cloning of TRP-2-INT2 from Genomic DNA

QIAamp 혈액 키트 (QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여, CTL 128 및 MZ2 흑색종 세포로부터 게놈 DNA를 정제하였다. 센스 프라이머로 엑손 2에 위치한 KS-INT2 (서열번호 5)를, 안티센스 프라이머로 엑손 3 에 위치한 PR2 (서열번호 9)를 사용하여 100 ng의 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 TRP-2 유전자의 인트론 2를 증폭시켰다. TRP-2-INT2 단편을 상기 설명된 대로 pcDNAI 벡터 내로 클론하고, 서열확인하고, HLA-A6801 유전자와 함께 Cos-7 세포 내로 트랜스펙션시켰다.Genomic DNA was purified from CTL 128 and MZ2 melanoma cells using the QIAamp blood kit (QIAGEN, Hilden, Germany). Intron 2 of the TRP-2 gene was purified by PCR from 100 ng of genomic DNA using KS-INT2 (SEQ ID NO: 5) located in exon 2 as the sense primer and PR2 (SEQ ID NO: 9) located in exon 3 as the antisense primer. Amplified. TRP-2-INT2 fragments were cloned into pcDNAI vectors, sequenced, and HLA-A as described above. Transfected into Cos-7 cells with 6801 gene.

PCR 생성물을 클론하고, 서열확인하고, Cos-7 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 모든 클론은 예상된 서열을 가졌고, 항원의 발현을 전할 수 있었다.PCR products were cloned, sequenced and transfected into Cos-7 cells. All clones had the expected sequence and were able to convey the expression of the antigen.

엑손 1 및 인트론 2에 위치한, 센스 프라이머 PRIT-1(서열번호 3) 및 안티센스 프라이머 INT2-1260 (서열번호 4)을 사용하여 RT-PCR 분석으로 인트론2를 보유하는 TRP 2 전사물로부터만의 977 bp 단편을 증폭시켰다.977 only from TRP 2 transcripts carrying intron 2 by RT-PCR analysis using sense primers PRIT-1 (SEQ ID NO: 3) and antisense primers INT2-1260 (SEQ ID NO: 4), located at exons 1 and intron 2 bp fragment was amplified.

실시예 4Example 4

TRP-2-INT2 및 TRP-2 발현을 위한 PCR 분석PCR analysis for TRP-2-INT2 and TRP-2 expression

배양세포계, 신선한 피부, 각막 및 종양 시료로부터, 구아니딘-이소티오시아네이트 방법에 의해 토탈 RNA를 제조하였다. 300 ng의 토탈 RNA에 상응하는 cDNA를 1 U의 DynazymeTM (Finnzymes) 및 1mM의 각 프라이머를 최종 부피 50 ㎖로 PCR을 사용하여 증폭시켰다. 반응 혼합물에 30 회 증폭 사이클을 적용했다. TRP-2 cDNA의 증폭을 위해, 엑손 2에 위치한 PR3 (서열번호 10) 및 엑손 8에 위치한 TRP-2L (서열번호 11)을 각각 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머로 사용하였다. PCR을 30 사이클 수행하였다 (94 ℃에서 1 분, 58 ℃에서 1 분 및 72 ℃에서 1 분). 스플라이싱되지 않은 인트론 2의 발현을 확인하기 위해, 각각 5′-UTR 및 인트론 2에 위치한, 센스 프라이머 PRIT-1 (서열번호 3) 및 안티센스 프라이머 INT2-1260 (서열번호 4)를 사용하였다. PCR을 30 사이클 수행하였다 (94 ℃에서 1 분, 55 ℃에서 1 분 및 72 ℃에서 1 분). TRP-2의 검출을 위해 원거리의 엑손 내에 프라이머를 국한시킴으로써, 및 TRP-2-INT2의 증폭을 위해서 엑손 1과 엑손 2 상의 10 kb 길이의 인트론 1 (Sturm, R., et al., Genomics 29 (1995) 24-34)의 존재에 의해, 오염된 게놈 DNA로부터의 증폭을 피한다. RNA 제조의 품질은 특정한 프라이머를 사용하는 액틴 cDNA의 PCR 증폭에 의해 점검하였다.Total RNA was prepared from the cultured cell line, fresh skin, cornea and tumor samples by the guanidine-isothiocyanate method. CDNA corresponding to 300 ng of total RNA was amplified with 1 U of DynazymeTM (Finnzymes) and 1 mM of each primer with PCR to a final volume of 50 ml. 30 amplification cycles were applied to the reaction mixture. For amplification of TRP-2 cDNA, PR3 (SEQ ID NO: 10) located at exon 2 and TRP-2L (SEQ ID NO: 11) located at exon 8 were used as sense primers and antisense primers, respectively. PCR was performed for 30 cycles (1 minute at 94 ° C., 1 minute at 58 ° C. and 1 minute at 72 ° C.). To confirm the expression of unspliced intron 2, sense primers PRIT-1 (SEQ ID NO: 3) and antisense primers INT2-1260 (SEQ ID NO: 4), located at 5'-UTR and Intron 2, respectively, were used. PCR was performed for 30 cycles (1 minute at 94 ° C., 1 minute at 55 ° C. and 1 minute at 72 ° C.). By confining primers in distant exons for detection of TRP-2, and 10 kb long intron 1 on exons 1 and exons 2 for amplification of TRP-2-INT2 (Sturm, R., et al., Genomics 29 (1995) 24-34) avoids amplification from contaminated genomic DNA. The quality of RNA preparation was checked by PCR amplification of actin cDNA using specific primers.

완전히 스플라이싱된 TRP-2 전령을 각각 엑손 2 및 8 에 위치한 센스 프라이머 PR3 (서열번호 10) 및 안티센스 프라이머 (서열번호 11)으로 검출하였다.Fully spliced TRP-2 messengers were detected with sense primers PR3 (SEQ ID NO: 10) and antisense primers (SEQ ID NO: 11) located at exons 2 and 8, respectively.

테스트된 종양 중에서, 흑색종만이 TRP-2 및 TRP-2-INT2 항원에 양성인 것으로 입증되었다 (표 1). TRP-2 부재 하 TRP-2-INT2의 발현은 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 TRP-2가 멜라닌세포 분화 항원이고 (Wang, et al., J. Exp. Med. 184 (1996) 2207-2216) 동일한 프로모터가 두 개의 항원이 생기는 공통된 전령이 합성되게 한다는 의견과 일치한다. 분석된 신선한 흑색종 시료의 69 %가 TRP-2를 발현시켰고, TRP-2⁺흑색종의 78 % 또한 TRP-2-INT2를 발현시켰다 (표 1). 이것은 흑색종 세포계에서도 관찰되었는데, 정상적인 형태의 TRP-2 및 인트론 2를 보유하는 것이 분석된 시료의 각각 84 % 및 68 %에서 발현되었다. TRP-2가 존재하는 것을 알려진 정상 조직을 TRP-2-INT2 발현에 대해 분석하였다. 세 개의 멜라닌 세포계, 4 개의 피부 시료 및 한 개의 각막이 RT-PCR 분석에서 음성이었다 (표 1). 4 개의 피부 시료를 동일한 환자로부터 유래된 비옵틱(bioptic) 일차 상해와 비교하여 분석하였더니, TRP-2 가 모든 시료에서 검출되는 반면, TRP-2-INT2는 종양시료 내에만 존재하였다.Of the tumors tested, only melanoma proved positive for TRP-2 and TRP-2-INT2 antigens (Table 1). Expression of TRP-2-INT2 in the absence of TRP-2 was not observed. These results are in agreement with the opinion that TRP-2 is a melanocyte differentiation antigen (Wang, et al., J. Exp. Med. 184 (1996) 2207-2216) and that the same promoter results in the synthesis of a common messenger with two antigens. do. 69% of fresh melanoma samples analyzed expressed TRP-2 and 78% of TRP-2 ⁺ melanoma also expressed TRP-2-INT2 (Table 1). This was also observed in the melanoma cell line, with normal forms of TRP-2 and intron 2 being expressed in 84% and 68% of the samples analyzed, respectively. Normal tissues known for the presence of TRP-2 were analyzed for TRP-2-INT2 expression. Three melanin cell lines, four skin samples and one cornea were negative in RT-PCR analysis (Table 1). Four skin samples were analyzed in comparison to a bioptic primary injury from the same patient, where TRP-2 was detected in all samples while TRP-2-INT2 was only present in the tumor sample.

종양 및 정상 조직 내에서 TRP-2-INT-2 및 TRP-2의 발현Expression of TRP-2-INT-2 and TRP-2 in Tumors and Normal Tissues 항원이 발현된 시료의 수/테스트된 시료의 수Number of samples with antigen expression / Number of samples tested TRP-2-INT-2TRP-2-INT-2 TRP-2TRP-2 흑색종 세포계Melanoma Cell Line 13/19 (68%0 13/19 (68% 0 16/19 (84%)16/19 (84%) 멜라닌세포계Melanocyte system 0/30/3 3/33/3 신선한 흑색종 시료Fresh Melanoma Sample 7/13 (54%) 7/13 (54%) 9/13 (69%)9/13 (69%) 피부skin 0/40/4 4/44/4 각막cornea 0/10/1 1/11/1 종양 (흑색종이 아닌 것)Tumors (not melanoma) 0/10/1 0/30/3

TRP-2-INT-2 발현이 TRP-2에 대해 양성인 시료에서만 검출되었다. TRP-2-INT-2 expression was detected only in samples positive for TRP-2.

흑색종 계에서 TRP-2-INT-2 mRNA의 발현과 CTL 128에 의한 TNF 방출을 자극하는 능력 사이에서 강한 상관관계가 발견되었다.A strong correlation was found between the expression of TRP-2-INT-2 mRNA in the melanoma system and its ability to stimulate TNF release by CTL 128.

HLA-A3-형 수퍼타입의 대립유전자에 의한 항원성 펩티드의 제시Presentation of antigenic peptides by alleles of the HLA-A3-type supertype

HLA-A6801은, A3, A11: A31 및 A3301과 함께, 유사한 펩티드-결합 특징을 갖는 A3 형 수퍼타입의 HLA-A 대립유전자에 속한다 (Sidney, J., et al., J. Immunol. 154 (1995) 247-259). 펩티드 EVISCKLIR (서열번호 2)가 A3 형 수퍼타입의 HLA-A6801 대립유전자에 의해 CTL 128에 제시될 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 이같은 대립유전자를 발현시키는 EBV LCL를, 펩티드로 펄싱 (pulsing)한 후에, CTL 128용 표적으로 사용하였다 (도 7).HLA-A 6801 is A3, A11: A31 and A Along with 3301, it belongs to the HLA-A allele of the A3 type supertype with similar peptide-binding characteristics (Sidney, J., et al., J. Immunol. 154 (1995) 247-259). Peptide EVISCKLIR (SEQ ID NO: 2) is HLA-A of type A3 supertype To investigate whether the 6801 allele could be presented in CTL 128, EBV LCLs expressing such alleles were used as targets for CTL 128 after pulsing with peptides (FIG. 7).

또한 분석에는 HLA-A6802 대립유전자, A2 형 수퍼타입에 속하는 HLA-A28의 서브타입도 포함된다. A3 형 수퍼타입 대립유전자 중에서, A3301만이 A6801과 동일한 효율로 TRP-2-INT_222-223펩티드를 제시할 수 있었다. 펩티드가 A6802에 의해 제시되었을 때, 더 높은 농도에서 낮은 수준의 인식이 관찰되었다.Also in the analysis is HLA-A Also included are the 6802 allele, a subtype of HLA-A28 belonging to the A2 type supertype. Among the A3 type supertype alleles, A 3301 only A TRP-2-INT _222-223 peptide could be presented with the same efficiency as 6801. Peptide A When presented by 6802, low levels of recognition were observed at higher concentrations.

실시예 5Example 5

항원성 펩티드 및 CTL 분석Antigenic Peptides and CTL Analysis

펩티드를 임시적 NH2-말단 보호를 위해 Fmoc를 사용하여 고체 상 상에서 합성하고, 질량 분광기에 의해 특징지웠다 (Primm, Milan, Italy). 모든 펩티드는 분석적 HPLC에 의해 ＞90 % 순수한 것으로 나타났다. 동결건조된 펩티드를 10 % DMSO 내의 10 mM 농도에서 용해시키고, -80 ℃에서 보관하였다. 펩티드를 20:1dml 대사물질/표적 비에서 CTL의 첨가 전에 다양한 농도의 펩티드와 함께 96 웰 마이크로플레이트 내에서 1 시간동안 실온에서⁵¹Cr 라벨링된 표적 세포를 항온배양하여, 테스트하였다. 4 시간 후에 용해를 측정하였다. 항원성 펩티드의 제시도 TNF-방출 분석에서 테스트하였다. 간단하게, 자극 세포를 1 시간동안 실온에서 고정된 농도의 펩티드와 함께 항온배양한 후, 철저하게 세척하고, CTL 128을 첨가하고, TNF 방출을 18-20 시간 후에 WEHI-164.13 세포 상에서 평가하였다.Peptides were synthesized on solid phase using Fmoc for temporary NH2-terminal protection and characterized by mass spectroscopy (Primm, Milan, Italy). All peptides were> 90% pure by analytical HPLC. Lyophilized peptide was dissolved at 10 mM concentration in 10% DMSO and stored at -80 ° C. Peptides were tested by incubating ⁵¹ Cr labeled target cells at room temperature for 1 hour in 96 well microplates with varying concentrations of peptides before addition of CTL at 20: 1dml metabolite / target ratio. Dissolution was measured after 4 hours. The presentation of antigenic peptides was also tested in the TNF-release assay. Briefly, stimulating cells were incubated with fixed concentrations of peptides at room temperature for 1 hour, then washed thoroughly, CTL 128 was added, and TNF release was assessed on WEHI-164.13 cells after 18-20 hours.

참고 문헌references

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Tsomides, T.J., and Eisen, H.N., Proc. Natl. Acad Scl. USA 91 (1994) 3487-3489Tsomides, T. J., and Eisen, H. N., Proc. Natl. Acad Scl. USA 91 (1994) 3487-3489

Van den Eynde, B., et al., J. Exp. Med. 182 (1995) 689-698Van den Eynde, B., et al., J. Exp. Med. 182 (1995) 689-698

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Wang, R., et al., J. Exp. Med. 184 (1996) 2207-2216Wang, R., et al., J. Exp. Med. 184 (1996) 2207-2216

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Yokoyama, K., et al., Bioch. Bloph. Acta 1217H (1994) 317-321Yokoyama, K., et al., Bioch. Bloph. Acta 1217H (1994) 317-321

서열 목록Sequence list

(1) 일반적 정보:(1) General Information:

(i) 출원인:(i) Applicant:

(A) 이름: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH(A) Name: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH

(B) 거리: Sandhofer Str. 116(B) Street: Sandhofer Str. 116

(C) 도시: Mannheim(C) City: Mannheim

(E) 국가: 독일(E) Country: Germany

(F) 우편번호 (ZIP): D-68305(F) ZIP code (ZIP): D-68305

(G) 전화번호: 08856/60-3446(G) Phone number: 08856 / 60-3446

(H) 팩스번호: 08856/60-3451(H) FAX: 08856 / 60-3451

(ii) 발명의 명칭: 종양-특이적 항원, 이들의 제조방법, 및 이들의 면역화 및 진단에서의 용도(ii) Title of the Invention: Tumor-specific antigens, methods for their preparation, and their use in immunization and diagnosis

(iii) 서열의 수: 12(iii) number of sequences: 12

(iv) 컴퓨터 판독 형태:(iv) computer readable form:

(A) 매체 유형: 플로피 디스크(A) Media type: floppy disk

(B) 컴퓨터: 호환성IBM PC(B) Computer: Compatibility IBM PC

(C) 운영체계: PC-DOS/MS-DOS(C) operating system: PC-DOS / MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.30B (EPO)(D) Software: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.30B (EPO)

(2) 서열번호 1에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO: 1

(i) 서열 특징:(i) Sequence Features:

(A) 길이: 30 염기쌍(A) Length: 30 base pairs

(B) 유형: 핵산(B) Type: nucleic acid

(C) 가닥: 단일(C) strand: single

(D) 토폴로지: 선형(D) topology: linear

(ii) 분자 유형: cDNA(ii) Molecular Type: cDNA

(ix) 특징:(ix) Features:

(A) 명칭/기호: CDS(A) Name / symbol: CDS

(B) 위치:1..30(B) Location: 1..30

(xi) 서열 내용: 서열번호 1:(xi) Sequence content: SEQ ID NO 1:

(2) 서열번호 2에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO:

(i) 서열 특징:(i) Sequence Features:

(A) 길이: 10 아미노산(A) Length: 10 amino acids

(B) 유형: 아미노산(B) Type: Amino Acid

(D) 토폴로지: 선형(D) topology: linear

(ii) 분자 유형: 단백질(ii) Molecular Type: Protein

(xi) 서열 내용: 서열번호 2:(xi) Sequence content: SEQ ID NO: 2:

(2) 서열번호 3에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO:

(i) 서열 특징:(i) Sequence Features:

(A) 길이: 17 염기쌍(A) Length: 17 base pairs

(B) 유형: 핵산(B) Type: nucleic acid

(C) 가닥: 단일(C) strand: single

(D) 토폴로지: 선형(D) topology: linear

(ii) 분자 유형: 기타 핵산(ii) Molecular Type: Other Nucleic Acids

(A) 기술: /desc = "프라이머"(A) Skill: / desc = "primer"

(xi) 서열 내용: 서열번호 3:(xi) Sequence content: SEQ ID NO: 3:

(2) 서열번호 4에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO:

(i) 서열 특징:(i) Sequence Features:

(A) 길이: 20 염기쌍(A) Length: 20 base pairs

(B) 유형: 핵산(B) Type: nucleic acid

(C) 가닥: 단일(C) strand: single

(D) 토폴로지: 선형(D) topology: linear

(ii) 분자 유형: 기타 핵산(ii) Molecular Type: Other Nucleic Acids

(A) 기술: /desc = "프라이머"(A) Skill: / desc = "primer"

(xi) 서열 내용: 서열번호 4:(xi) Sequence content: SEQ ID NO: 4:

(2) 서열번호 5에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO:

(i) 서열 특징:(i) Sequence Features:

(A) 길이: 27 염기쌍(A) Length: 27 base pairs

(B) 유형: 핵산(B) Type: nucleic acid

(C) 가닥: 단일(C) strand: single

(D) 토폴로지: 선형(D) topology: linear

(ii) 분자 유형: 기타 핵산(ii) Molecular Type: Other Nucleic Acids

(A) 기술: /desc = "프라이머"(A) Skill: / desc = "primer"

(xi) 서열 내용: 서열번호 5:(xi) Sequence content: SEQ ID NO: 5:

(2) 서열번호 6에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO:

(i) 서열 특징:(i) Sequence Features:

(A) 길이: 27 염기쌍(A) Length: 27 base pairs

(B) 유형: 핵산(B) Type: nucleic acid

(C) 가닥: 단일(C) strand: single

(D) 토폴로지: 선형(D) topology: linear

(ii) 분자 유형: 기타 핵산(ii) Molecular Type: Other Nucleic Acids

(A) 기술: /desc = "프라이머"(A) Skill: / desc = "primer"

(xi) 서열 내용: 서열번호 6:(xi) Sequence content: SEQ ID NO: 6:

(2) 서열번호 7에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO:

(i) 서열 특징:(i) Sequence Features:

(A) 길이: 25 염기쌍(A) Length: 25 base pairs

(B) 유형: 핵산(B) Type: nucleic acid

(C) 가닥: 단일(C) strand: single

(D) 토폴로지: 선형(D) topology: linear

(ii) 분자 유형: 기타 핵산(ii) Molecular Type: Other Nucleic Acids

(A) 기술: /desc = "프라이머"(A) Skill: / desc = "primer"

(xi) 서열 내용: 서열번호 7:(xi) Sequence content: SEQ ID NO: 7:

(2) 서열번호 8에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO:

(i) 서열 특징:(i) Sequence Features:

(A) 길이: 18 염기쌍(A) Length: 18 base pairs

(B) 유형: 핵산(B) Type: nucleic acid

(C) 가닥: 단일(C) strand: single

(D) 토폴로지: 선형(D) topology: linear

(ii) 분자 유형: 기타 핵산(ii) Molecular Type: Other Nucleic Acids

(A) 기술: /desc = "프라이머"(A) Skill: / desc = "primer"

(xi) 서열 내용: 서열번호 8:(xi) Sequence content: SEQ ID NO: 8:

(2) 서열번호 9에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO:

(i) 서열 특징:(i) Sequence Features:

(A) 길이: 20 염기쌍(A) Length: 20 base pairs

(B) 유형: 핵산(B) Type: nucleic acid

(C) 가닥: 단일(C) strand: single

(D) 토폴로지: 선형(D) topology: linear

(ii) 분자 유형: 기타 핵산(ii) Molecular Type: Other Nucleic Acids

(A) 기술: /desc = "프라이머"(A) Skill: / desc = "primer"

(xi) 서열 내용: 서열번호 9:(xi) Sequence content: SEQ ID NO: 9:

(2) 서열번호 10에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO: 10:

(i) 서열 특징:(i) Sequence Features:

(A) 길이: 20 염기쌍(A) Length: 20 base pairs

(B) 유형: 핵산(B) Type: nucleic acid

(C) 가닥: 단일(C) strand: single

(D) 토폴로지: 선형(D) topology: linear

(ii) 분자 유형: 기타 핵산(ii) Molecular Type: Other Nucleic Acids

(A) 기술: /desc = "프라이머"(A) Skill: / desc = "primer"

(xi) 서열 내용: 서열번호 10:(xi) SEQ ID NO: 10:

(2) 서열번호 11에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO:

(i) 서열 특징:(i) Sequence Features:

(A) 길이: 27 염기쌍(A) Length: 27 base pairs

(B) 유형: 핵산(B) Type: nucleic acid

(C) 가닥: 단일(C) strand: single

(D) 토폴로지: 선형(D) topology: linear

(ii) 분자 유형: 기타 핵산(ii) Molecular Type: Other Nucleic Acids

(A) 기술: /desc = "프라이머"(A) Skill: / desc = "primer"

(xi) 서열 내용: 서열번호 11:(xi) SEQ ID NO: 11:

(2) 서열번호 12에 대한 정보:(2) Information about SEQ ID NO: 12:

(i) 서열 특징:(i) Sequence Features:

(A) 길이: 1409 염기쌍(A) Length: 1409 base pairs

(B) 유형: 핵산(B) Type: nucleic acid

(C) 가닥: 단일(C) strand: single

(D) 토폴로지: 선형(D) topology: linear

(ii) 분자 유형: DNA (게놈)(ii) Molecular Type: DNA (Genome)

(ix) 특징:(ix) Features:

(A) 명칭/기호: 엑손(A) Name / symbol: exon

(B) 위치: 1..994(B) Location: 1..994

(ix) 특징:(ix) Features:

(A) 명칭/기호: 인트론(A) Name / Symbol: Intron

(B) 위치: 995..1409(B) Location: 995..1409

(ix) 특징:(ix) Features:

(A) 명칭/기호: 미스크_시그날(A) Name / Symbol: Misc_Signal

(B) 위치: 399..402(B) location: 399..402

(D) 기타 정보: /기능= "개시 코돈"(D) Other information: / function = "initiation codon"

(ix) 특징:(ix) Features:

(A) 명칭/기호: 미스크_시그날l(A) Name / Symbol: Misc_Signal

(B) 위치: 1111..1113(B) Location: 1111..1113

(D) 기타 정보: /기능= "제 1 종결 코돈"(D) Other information: / function = "first stop codon"

(ix) 특징:(ix) Features:

(A) 명칭/기호: 매트_펩티드(A) Name / symbol: mat_peptide

(B) 위치: 1063..1093(B) Location: 1063..1093

(xi) : 서열번호 12:(xi): SEQ ID NO: 12

＜110＞ ROCHE DIAGNOSTICS GMBH<110> ROCHE DIAGNOSTICS GMBH

＜120＞ TUMOR-SPECIFIC ANTIGENS, METHODS FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR U<120> TUMOR-SPECIFIC ANTIGENS, METHODS FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR U

SE FOR IMMUNIZATION AND DIAGNOSISSE FOR IMMUNIZATION AND DIAGNOSIS

＜130＞ 1<130> 1

＜150＞ EP 97119404.8<150> EP 97119404.8

＜151＞ 1997-11-06<151> 1997-11-06

＜160＞ 13<160> 13

＜170＞ KOPATIN 1.5<170> KOPATIN 1.5

＜210＞ 1<210> 1

＜211＞ 30<211> 30

＜212＞ DNA<212> DNA

＜213＞ Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

＜220＞<220>

＜223＞ coding sequence (nucleic acid) of the antigenic peptide<223> coding sequence (nucleic acid) of the antigenic peptide

＜220＞<220>

＜221＞ CDS<221> CDS

＜222＞ (1)..(30)<222> (1) .. (30)

＜400＞ 1<400> 1

gaa gta att tca tgc aag tta att aag aga 30gaa gta att tca tgc aag tta att aag aga 30

Glu Val Ile Ser Cys Lys Leu Ile Lys ArgGlu Val Ile Ser Cys Lys Leu Ile Lys Arg

1 5 101 5 10

＜210＞ 2<210> 2

＜211＞ 10<211> 10

＜212＞ PRT<212> PRT

＜213＞ Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

＜400＞ 2<400> 2

Glu Val Ile Ser Cys Lys Leu Ile Lys ArgGlu Val Ile Ser Cys Lys Leu Ile Lys Arg

1 5 101 5 10

＜210＞ 3<210> 3

＜211＞ 10<211> 10

＜212＞ PRT<212> PRT

＜213＞ Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

＜220＞<220>

＜223＞ coding sequence (amino acid) of antigenic peptide<223> coding sequence (amino acid) of antigenic peptide

＜400＞ 3<400> 3

Glu Val Ile Ser Cys Lys Leu Ile Lys ArgGlu Val Ile Ser Cys Lys Leu Ile Lys Arg

1 5 101 5 10

＜210＞ 4<210> 4

＜211＞ 17<211> 17

＜212＞ DNA<212> DNA

＜213＞ Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

＜220＞<220>

＜223＞ (PRIT-1) sense primer<223> (PRIT-1) sense primer

＜400＞ 4<400> 4

ggagaaaagt acgacag 17ggagaaaagt acgacag 17

＜210＞ 5<210> 5

＜211＞ 20<211> 20

＜212＞ DNA<212> DNA

＜213＞ Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

＜220＞<220>

＜223＞ (INT2-1260) anti-sense primer<223> (INT2-1260) anti-sense primer

＜400＞ 5<400> 5

acctcaccaa ctcacatctt 20acctcaccaa ctcacatctt 20

＜210＞ 6<210> 6

＜211＞ 27<211> 27

＜212＞ DNA<212> DNA

＜213＞ Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

＜220＞<220>

＜223＞ (KS-INT2) sense primer<223> (KS-INT2) sense primer

＜400＞ 6<400> 6

gccgccatgt attctgttag agataca 27gccgccatgt attctgttag agataca 27

＜210＞ 7<210> 7

＜211＞ 27<211> 27

＜212＞ DNA<212> DNA

＜213＞ Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

＜220＞<220>

＜223＞ (INT2-as1) anti-sense primer<223> (INT2-as1) anti-sense primer

＜400＞ 7<400> 7

atccgctcga gcatgaaatt acttccc 27atccgctcga gcatgaaatt acttccc 27

＜210＞ 8<210> 8

＜211＞ 25<211> 25

＜212＞ DNA<212> DNA

＜213＞ Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

＜220＞<220>

＜223＞ (INT2-as2) anti-sense primer<223> (INT2-as2) anti-sense primer

＜400＞ 8<400> 8

atccgctcga ggataattct acgac 25atccgctcga ggataattct acgac 25

＜210＞ 9<210> 9

＜211＞ 18<211> 18

＜212＞ DNA<212> DNA

＜213＞ Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

＜220＞<220>

＜223＞ (Sp6) anti-sense primer<223> (Sp6) anti-sense primer

＜400＞ 9<400> 9

atttaggtga cactatag 18atttaggtga cactatag 18

＜210＞ 10<210> 10

＜211＞ 20<211> 20

＜212＞ DNA<212> DNA

＜213＞ Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

＜220＞<220>

＜223＞ (PR2) anti-sense primer<223> (PR2) anti-sense primer

＜400＞ 10<400> 10

gagaaatcta tggccctgta 20gagaaatcta tggccctgta 20

＜210＞ 11<210> 11

＜211＞ 20<211> 20

＜212＞ DNA<212> DNA

＜213＞ Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

＜220＞<220>

＜223＞ (PR3) sense primer<223> (PR3) sense primer

＜400＞ 11<400> 11

ttcggcagaa catccattcc 20ttcggcagaa catccattcc 20

＜210＞ 12<210> 12

＜211＞ 27<211> 27

＜212＞ DNA<212> DNA

＜213＞ Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

＜220＞<220>

＜223＞ (TRP-2L) anti-sense primer<223> (TRP-2L) anti-sense primer

＜400＞ 12<400> 12

accctaggct tcttctgtgt atctctt 27accctaggct tcttctgtgt atctctt 27

＜210＞ 13<210> 13

＜211＞ 1409<211> 1409

＜212＞ DNA<212> DNA

＜213＞ Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

＜220＞<220>

＜223＞ nucleic acid sequence of the 5' end-1500 fragment<223> nucleic acid sequence of the 5 'end-1500 fragment

＜220＞<220>

＜221＞ exon<221> exon

＜222＞ (1)..(994)<222> (1) .. (994)

＜220＞<220>

＜221＞ intron<221> intron

＜222＞ (995)..(1409)<222> (995) .. (1409)

＜220＞<220>

＜221＞ misc_signal<221> misc_signal

＜222＞ (399)..(402)<222> (399) .. (402)

＜223＞ /function= "start codon"<223> / function = "start codon"

＜220＞<220>

＜221＞ misc_signal<221> misc_signal

＜222＞ (1111)..(1113)<222> (1111) .. (1113)

＜223＞ /function= "first stop codon"<223> / function = "first stop codon"

＜220＞<220>

＜221＞ mat_peptide<221> mat_peptide

＜222＞ (1063)..(1093)<222> (1063) .. (1093)

＜400＞ 13<400> 13

agctaaggag ggagggagag ggtttagaaa taccagcata ataagtagta tgactgggtg 60agctaaggag ggagggagag ggtttagaaa taccagcata ataagtagta tgactgggtg 60

ctctgtaaat taactcaatt agacaaagcc tgacttaacg ggggaagatg gtgagaagcg 120ctctgtaaat taactcaatt agacaaagcc tgacttaacg ggggaagatg gtgagaagcg 120

ctaccctcat taaatttggt tgttagaggc gcttctaagg aaattaagtc tgttagttgt 180ctaccctcat taaatttggt tgttagaggc gcttctaagg aaattaagtc tgttagttgt 180

ttgaatcaca taaaattgtg tgtgcacgtt catgtacaca tgtgcacaca tgtaacctct 240ttgaatcaca taaaattgtg tgtgcacgtt catgtacaca tgtgcacaca tgtaacctct 240

gtgattcttg tgggtatttt tttaagaaga aaggaataga aagcaaagaa aaataaaaaa 300gtgattcttg tgggtatttt tttaagaaga aaggaataga aagcaaagaa aaataaaaaa 300

tactgaaaag aaaagactga aagagtagaa gataaggaga aaagtacgac agagacaagg 360tactgaaaag aaaagactga aagagtagaa gataaggaga aaagtacgac agagacaagg 360

aaagtaagag agagagagag ctctcccaat tataaagcca tgagccccct ttggtggggg 420aaagtaagag agagagagag ctctcccaat tataaagcca tgagccccct ttggtggggg 420

tttctgctca gttgcttggg ctgcaaaatc ctgccaggag cccagggtca gttcccccga 480tttctgctca gttgcttggg ctgcaaaatc ctgccaggag cccagggtca gttcccccga 480

gtctgcatga cggtggacag cctagtgaac aaggagtgct gcccacgcct gggtgcagag 540gtctgcatga cggtggacag cctagtgaac aaggagtgct gcccacgcct gggtgcagag 540

tcggccaatg tctgtggctc tcagcaaggc cgggggcagt gcacagaggt gcgagccgac 600tcggccaatg tctgtggctc tcagcaaggc cgggggcagt gcacagaggt gcgagccgac 600

acaaggccct ggagtggtcc ctacatccta cgaaaccagg atgaccgtga gctgtggcca 660acaaggccct ggagtggtcc ctacatccta cgaaaccagg atgaccgtga gctgtggcca 660

agaaaattct tccaccggac ctgcaagtgc acaggaaact ttgccggcta taattgtgga 720agaaaattct tccaccggac ctgcaagtgc acaggaaact ttgccggcta taattgtgga 720

gactgcaagt ttggctggac cggtcccaac tgcgagcgga agaaaccacc agtgattcgg 780gactgcaagt ttggctggac cggtcccaac tgcgagcgga agaaaccacc agtgattcgg 780

cagaacatcc attccttgag tcctcaggaa agagagcagt tcttgggcgc cttagatctc 840cagaacatcc attccttgag tcctcaggaa agagagcagt tcttgggcgc cttagatctc 840

gcgaagaaga gagtacaccc cgactacgtg atcaccacac aacactggct gggcctgctt 900gcgaagaaga gagtacaccc cgactacgtg atcaccacac aacactggct gggcctgctt 900

gggcccaatg gaacccagcc gcagtttgcc aactgcagtg tttatgattt ttttgtgtgg 960gggcccaatg gaacccagcc gcagtttgcc aactgcagtg tttatgattt ttttgtgtgg 960

ctccattatt attctgttag agatacatta ttaggtgggt tttttccttg gctgaaggta 1020ctccattatt attctgttag agatacatta ttaggtgggt tttttccttg gctgaaggta 1020

tattattaca ggtttgtgat tgggttgagg gtatggcagt gggaagtaat ttcatgcaag 1080tattattaca ggtttgtgat tgggttgagg gtatggcagt gggaagtaat ttcatgcaag 1080

ttaattaaga gagcaaccac aaggcagcct taggtttatg aaagtcgtag aattatcaaa 1140ttaattaaga gagcaaccac aaggcagcct taggtttatg aaagtcgtag aattatcaaa 1140

taccgcctgg agttagaagg aagcagtttc ttcctgtgca ttggatgcag acactttaaa 1200taccgcctgg agttagaagg aagcagtttc ttcctgtgca ttggatgcag acactttaaa 1200

tgttctctcc tctaccgtat gttcttggtt caaagtgtaa acttttctct gtgaagctgt 1260tgttctctcc tctaccgtat gttcttggtt caaagtgtaa acttttctct gtgaagctgt 1260

taatcatcaa agatgtgagt tggtgaggtg gaggcgaatt ccttttgatt tcagaagaaa 1320taatcatcaa agatgtgagt tggtgaggtg gaggcgaatt ccttttgatt tcagaagaaa 1320

atatttgcga atctggccat ggaagccctc tctgaccttt tctccaaatt agaggaatta 1380atatttgcga atctggccat ggaagccctc tctgaccttt tctccaaatt agaggaatta 1380

actgaacatg tgctaaggca catgaagct 1409actgaacatg tgctaaggca catgaagct 1409

Claims (11)

엑손-코딩되는 종양 항원의 인트론에 의해 부분적으로 코딩되고, 하기에 의해 수득되는 종양-특이적 폴리펩티드 항원:Tumor-specific polypeptide antigens, partially encoded by introns of exon-coded tumor antigens, obtained by: (a) 엄격한 조건 하에서 엑손-코딩되는 종양 항원의 인트론 서열과 혼성화하는 핵산 단편이 프라이머로 사용되는, 종양 세포의 가용성 세포질 부분으로부터 단리되는 mRNA로부터의 역전사효소 PCR,(a) reverse transcriptase PCR from mRNA isolated from the soluble cytoplasmic portion of tumor cells, wherein nucleic acid fragments that hybridize with intron sequences of exon-encoded tumor antigens under stringent conditions are used as primers, (b) 상기 PCR 생성물의 단리, 숙주 세포 내에서 상기 PCR 생성물 또는 그의 단편의 발현, 및 종양-특이적 항원의 엑손 서열과도 혼성화하고 상기 PCR 생성물 또는 그의 단편에 의해 코딩되는 상기 종양-특이적 항원의 단리.(b) isolation of said PCR product, expression of said PCR product or fragment thereof in a host cell, and said tumor-specific hybridization with the exon sequence of a tumor-specific antigen and encoded by said PCR product or fragment thereof Isolation of the antigen. 제 1 항에 있어서, PCR 생성물의 8 내지 12 코돈의 단편이 발현을 위해 사용되는 종양-특이적 폴리펩티드 항원.The tumor-specific polypeptide antigen of claim 1, wherein fragments of 8 to 12 codons of the PCR product are used for expression. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 엑손-코딩되는 종양 항원이 MAGE, BAGE 및 GAGE, 티로시나아제로부터의 CTL 인식 에피토프, 멜란A^Mart1, gp100^Pme17, gp75^TRP1및 TRP-2인 종양-특이적 폴리펩티드 항원.3. A method according to claim 1 or 2 wherein the exon - a tumor antigen encoded MAGE, BAGE and GAGE, CTL recognizing epitopes, Gamelan A ^Mart1, gp100 ^Pme17, gp75 ^TRP1 and TRP-2 in tumors from the tyrosinase-specific Polypeptide antigens. 서열 번호 1에 의해 코딩되는 종양-특이적 폴리펩티드 항원.Tumor-specific polypeptide antigens encoded by SEQ ID NO: 1. 엑손-코딩되는 종양 항원의 인트론에 의해 부분적으로 코딩되는 종양-특이적 항원의 mRNA를 단리하기 위한 방법으로,A method for isolating mRNAs of tumor-specific antigens partially encoded by introns of exon-coded tumor antigens, (a) 엄격한 조건 하에서 엑손-코딩되는 종양 항원의 인트론 서열과 혼성화하는 핵산 단편이 프라이머로 사용되는, 종양 세포의 가용성 세포질 부분으로부터 단리되는 mRNA로부터의 역전사효소 PCR,(a) reverse transcriptase PCR from mRNA isolated from the soluble cytoplasmic portion of tumor cells, wherein nucleic acid fragments that hybridize with intron sequences of exon-encoded tumor antigens under stringent conditions are used as primers, (b) 상기 항원의 엑손 서열과도 혼성화하는 PCR 생성물의 단리를 수행하는 방법.(b) isolating a PCR product that also hybridizes with the exon sequence of said antigen. 종양-특이적 세포독성 T-세포 증식의 측정 방법으로, 제 1 항 내지 제 4 항에서 청구된 종양-특이적 항원을 항원제시세포 및 세포독성 T-세포를 함유하는 환자의 체액 시료에 첨가하고, 세포독성 T-세포의 증식을 측정하는 방법.In a method for measuring tumor-specific cytotoxic T-cell proliferation, the tumor-specific antigen claimed in claim 1 is added to a bodily fluid sample of a patient containing antigen presenting cells and cytotoxic T-cells. , Method for measuring proliferation of cytotoxic T-cells. 제 1 항 내지 제 4 항에서 청구된 종양-특이적 항원을 코딩하는 핵산의 종양 질병 치료용 치료제의 제조를 위한 용도.Use of a nucleic acid encoding a tumor-specific antigen as claimed in claim 1 for the preparation of a therapeutic agent for the treatment of tumor diseases. 제 1 항 내지 제 4 항에서 청구된 종양-특이적 항원의 생체내 또는 생체외에서 T 전구체 세포로부터 세포독성 T 세포의 활성화를 위한 용도.Use for the activation of cytotoxic T cells from T precursor cells in vivo or ex vivo of the tumor-specific antigens claimed in claim 1. 종양-특이적 폴리펩티드 항원의 제조방법으로, 종양-특이적 항원이 하기에 의해 수득되는 방법:A method for preparing a tumor-specific polypeptide antigen, wherein the tumor-specific antigen is obtained by: (a) 엄격한 조건 하에서 엑손-코딩되는 종양 항원의 인트론 서열과 혼성화하는 핵산 단편이 프라이머로 사용되는, 종양 세포의 가용성 세포질 부분으로부터 단리되는 mRNA로부터의 역전사효소 PCR,(a) reverse transcriptase PCR from mRNA isolated from the soluble cytoplasmic portion of tumor cells, wherein nucleic acid fragments that hybridize with intron sequences of exon-encoded tumor antigens under stringent conditions are used as primers, (b) 상기 PCR 생성물의 단리, 숙주 세포 내에서 상기 PCR 생성물 또는 그의 단편의 발현, 및 엄격한 조건 하에서 종양-특이적 항원의 엑손 서열과도 혼성화하고 상기 PCR 생성물 또는 그의 단편에 의해 코딩되는 상기 종양-특이적 항원의 단리.(b) isolation of said PCR product, expression of said PCR product or fragment thereof in a host cell, and said tumor hybridized with exon sequences of tumor-specific antigens under stringent conditions and encoded by said PCR product or fragment thereof Isolation of Specific Antigens. 엄격한 조건 하에서 엑손-코딩되는 종양 항원의 인트론 서열과 혼성화하고 mRNA로부터의 역전사효소 PCR용 프라이머쌍으로 사용될 수 있는 두 핵산의 조합물.A combination of two nucleic acids that hybridize with the intron sequence of an exon-encoded tumor antigen under stringent conditions and can be used as a primer pair for reverse transcriptase PCR from mRNA. 서열 번호 3 내지 서열 번호 9에 의해 코딩되는 핵산.The nucleic acid encoded by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 9.