KR20010022505A - Kinase activating dependent cyclin protein kinases, and their uses - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기의 공통 특징들을 가지는 단백질-카이나제의 계열에 관한 것이다: 이들은 일정한 패턴인 GxGx(Y/F)GxV를 결여하고; 비-싸이클린-의존 CAK 활성을 가지고 있다. 이 계열의 단백질-카이나제의 억제자는 살균제로서 사용될 수 있다.The present invention relates to a family of protein-kinases having the following common characteristics: they lack a constant pattern of GxGx (Y / F) GxV; Has non-cyclin-dependent CAK activity. Inhibitors of this class of protein-kinase can be used as fungicides.
Description
싸이클린-의존 단백질 카이나제(cycline-dependent protein kinases, 이하 'Cdk'로 약칭함)는 세포 주기의 G1/S 전이단계 및 G2/M 전이단계에서 모두 필수적인 진핵생물에 있어서의 세포분열 싸이클 조절자이다. 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 CDC28 및 쉬조사카로마이시스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)의 CDC2가 존재가 규명된 첫 번째 Cdks이다.Cycline-dependent protein kinases (abbreviated as `` Cdks '') are cell division cycle regulators in eukaryotes that are essential for both the G1 / S and G2 / M transitions of the cell cycle. to be. CDC28 from Saccharomyces cerevisiae and CDC2 from Schizosaccharomyces pombe are the first Cdks to be identified.
Cdks가 활성화되기 위해서는 싸이클린 한 분자의 부착과 "T 루프(T loop)"라 부르는 지역에 위치한 보존된 트레오닌 잔기상에 Cdk를 인산화시키는 것이 모두 필요하다.To activate Cdks, both the attachment of a cyclin molecule and the phosphorylation of Cdk on conserved threonine residues located in a region called the "T loop" is required.
이러한 인산화는 "Cdk-활성 카이나제(Cdk-activating kinase)"(CAK)라 부르는 카이나제에 의해 이루어지고, 척추동물에서 CAK는 Cdk7이라 부르는 카탈리틱 서브유니트(catalytic subunit), 싸이클린H라 부르는 싸이클린 형태의 서브유니트, 및 MAT-1 인자를 포함하는 헤테로트라이머(heterotrimer)의 형태로 존재한다는 것이 밝혀졌다(Solomon, Trends Biochem. Sci. 19, 496-500 (1994)). 또한 상기 Cdk7-싸이클린H 복합체는 RNA 중합효소Ⅱ에 의한 유전자의 기본 전사를 위해 필요한 TFⅡH 복합체의 성분이고, 상기 중합효소의 큰 서브유니트에 있는 카르복시-말단 도메인(CTD)의 반복되는 염기서열을 인산화하는 것과 연관되어 있다.This phosphorylation is made by a kinase called "Cdk-activating kinase" (CAK), and in vertebrates, CAK is a catalytic subunit called Cdk7, called Cyclin H. It has been found to exist in the form of a cyclin-type subunit, and in the form of a heterotrimer comprising a MAT-1 factor (Solomon, Trends Biochem. Sci. 19, 496-500 (1994)). In addition, the Cdk7-cyclin H complex is a component of the TFIIH complex required for basic transcription of a gene by RNA polymerase II, and phosphorylates a repeating sequence of the carboxy-terminal domain (CTD) in a large subunit of the polymerase. It is related to doing.
분열 효모인 쉬조사카로마이시스 폼베에서, Crk1이라 부르는 카탈리틱 서브유니트, 및 Mcs2라 부르는 조절싸이클린을 포함하는 Cdk7-싸이클린H와 유사한 복합체가 규명되었다. Crk1 유전자는 세포 생존에 필수적이라는 것이 밝혀졌고, Crk1-Mcs2 복합체가 CAK 활성 및 CTD-카이나제 활성과 관련이 있다는 것이 시험관내 실험(in vitro)에서 관찰되었다(Buck et al., EMBO J., 14(24), 6173-83 (1995); Damagnez et al., EMBO J., 14(24), 6164-72 (1995)).In cleavage yeast Schizolochicaromysis pombe, a complex similar to Cdk7-cycline H was identified, including a cationic subunit called Crk1 and a regulatory cycline called Mcs2. Crk1 gene was found to be essential for cell survival, and it was observed in vitro that the Crk1-Mcs2 complex was associated with CAK activity and CTD-kinase activity (Buck et al., EMBO J. , 14 (24), 6173-83 (1995); Damagnez et al., EMBO J., 14 (24), 6164-72 (1995).
출아 효모인 사카로마이시스 세레비지애에서는, 염기서열 수준에서 각각 카이나제 Cdk7 및 Crk1, 그리고 조절단백질인 싸이클린H 및 Mcs2와 관련된 카이나제(Kin28) 및 싸이클린(Ccl1)을 포함하는 복합체가 규명되었다. 상기 Kin28-Ccl1 복합체는 TFⅡH 복합체의 일부분을 형성하고, CTD-카이나제 활성을 가지고 있으나, CAK 활성과는 연관이 없다.In budding yeast Saccharomyces cerevisiae, complexes containing kinases Cdk7 and Crk1 and kinases (Kin28) and cyclins (Ccl1) related to the regulatory proteins Cyclin H and Mcs2, respectively, at the sequencing level were identified. It became. The Kin28-Ccl1 complex forms part of the TFIIH complex and has CTD-kinase activity, but is not associated with CAK activity.
최근에, 발명자들이 사카로마이시스 세레비지애에서 CAK 활성을 책임지는 카이나제를 규명하였다. 이 카이나제를 CIV1(시험관내 실험에서는 CAK)이라 불렀고, 이에 상응하는 유전자를 CIV1(Thuret et al., Cell, 86(4), 1996)이라 불렀다. 이러한 결과들은 다른 팀에 의해 확인되었다(Kaldis et al., Cell, 86(4), 553-564 (1996); Espinoza et al., Science, 273(5282), 1714-1717 (1996)). 사카로마이시스 세레비지애 CAK는 전체적으로 세린-트레오닌-카이나제 계열과 관계가 있고, 특별히 단백질 카이나제인 CDC2 및 CDC28과 관계가 있으며, 대부분의 단백질 카이나제에 존재하는 글라이신이 풍부한 보존된 모티브(motif)인 GxGx(Y/F)GxV가 존재하지 않고, Cdk 계열에서 보존되어 있는 2차구조의 성분들 사이에 위치한 5 내지 29개의 아미노산 삽입물이 존재한다는 점에서, 또한 그의 CAK 활성은 효소복합체로의 결합을 필요로 하지 않는다는 사실에 의해서 다른 생물에서 기존에 규명된 CAKs와는 다르다.Recently, the inventors have identified a kinase responsible for CAK activity in Saccharomyces cerevisiae. This kinase was called CIV1 (CAK in vitro) and the corresponding gene was called CIV1 (Thuret et al., Cell, 86 (4), 1996). These results were confirmed by other teams (Kaldis et al., Cell, 86 (4), 553-564 (1996); Espinoza et al., Science, 273 (5282), 1714-1717 (1996)). Saccharomyces cerevisiae CAK is generally associated with the serine-threonine-kinase family, particularly with the protein kinases CDC2 and CDC28, and is a glycine-rich conserved motif present in most protein kinases Also, its CAK activity is enzymatic complex in that there is no (motif) GxGx (Y / F) GxV, and there are 5 to 29 amino acid inserts located between components of the secondary structure that are conserved in the Cdk family. The fact that it does not require a bond to the furnace differs from previously identified CAKs in other organisms.
본 발명은 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에서의 새로운 싸이클린-의존 단백질 카이나제(cycline-dependent protein kinase)-활성 카이나제 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to novel cycline-dependent protein kinase-active kinases and their use in Candida albicans.
도 1은 CaCIV1의 아미노산 서열(1-문자코드)과 사카로마이시스 세레비지애 CAK(ScCIV1이라 부름)의 아미노산 서열, 및 사카로마이시스 세레비지애 카이나제 CDC28(ScCDC28이라 부름)의 아미노산 서열과의 비교를 나타낸다. ScCIV1 및 CaCIV1에서 보존된 잔기들은 진하게 표시되어 있다.1 shows the amino acid sequence of CaCIV1 (1-letter code) and the amino acid sequence of Saccharomyces cerevisiae CAK (called ScCIV1), and the amino acid sequence of Saccharomyces cerevisiae kinase CDC28 (called ScCDC28). Indicates a comparison. Conserved residues in ScCIV1 and CaCIV1 are shown in bold.
부호에 대한 설명:Explanation of the marks:
k = 대부분의 단백질 카이나제에서 보존된 잔기;k = residue conserved in most protein kinases;
= Cdk 계열에 종종 존재하는 잔기; = Residues often present in the Cdk family;
= Cdk 계열에 항상 존재하는 잔기; = Residues always present in the Cdk family;
+ = Cdk 계열과 ScCIV1에 존재하는 잔기;+ = Residues present in the Cdk family and ScCIV1;
2차구조: a = α나선; b = β쉬트.Secondary structure: a = α helix; b = β sheet.
CIV1의 CAK 활성이 세포분열 및 생존을 위해 필수적이기 때문에, 본 발명자들은 병원체 효모에서 CAK 활성을 보유한 단백질 카이나제를 암호하는 CIV1과 상동의 유전자가 존재하는지 여부에 대해 조사를 수행하였다. 과연, 이 경우에, 이러한 활성을 조절하는 수단, 특히 억제자(inhibitor)의 획득은 산업적 또는 치료적 관점에서, 주로 살균제의 생산을 위해서 대단히 흥미로운 것이다.Since the CAK activity of CIV1 is essential for cell division and survival, the inventors examined whether a gene homologous to CIV1 encoding protein kinase possessing CAK activity in pathogen yeast. Indeed, in this case, the acquisition of a means for regulating this activity, in particular an inhibitor, is of great interest for the production of fungicides, mainly from an industrial or therapeutic point of view.
이러한 목적의 관점에서, 본 발명자들이 사카로마이시스 세레비지애 CIV1 유전자의 다양한 부위에서 유도된 프로브(probe)를 사용하여 병원체 효모인 칸디다 알비칸스의 DNA 라이브러리(library)에 대한 스크리닝(screening)을 처음으로 수행하였다. 그러나, 사용된 어떠한 프로브도 칸디다 알비칸스 게놈에서 상동의 염기서열을 탐지하지 못하였다.In view of this purpose, the inventors first screened for the DNA library of the pathogen yeast Candida albicans using probes derived from various sites of the Saccharomyces cerevisiae CIV1 gene. Was performed. However, none of the probes used detected the homologous sequences in the Candida albicans genome.
그러나, 본 발명자들은 CIV1 유전자의 열-감수성 돌연변이체에서 사카로마이시스 세레비지애의 CAK 기능을 복구할 수 있는 하나 또는 그 이상의 유전자가 칸디다 알비칸스에 있는지 여부를 시험하는 것에 의해 칸디다 알비칸스가 사카로마이시스 세레비지애 CAK의 기능적인 유사체를 보유하는 것이 가능한지 여부를 조사했다. 발명자들은 돌연변이체에서 그 자신의 불완전한 CAK 기능을 보충할 수 있는 칸디다 알비칸스 유전자를 규명하는데 결국 성공했다.However, we have tested Candida albicans sac by testing whether there is one or more genes in Candida albicans that can restore CAK function of Saccharomyces cerevisiae in the heat-sensitive mutant of the CIV1 gene. We investigated whether it is possible to have functional analogues of the Romanissis cerevisiae CAK. The inventors eventually succeeded in identifying the Candida albicans gene, which can compensate for its own incomplete CAK function in mutants.
CaCIV1이라 부르는 이 유전자의 서열이 결정되었는데; 서열은 서열목록의 서열번호 1에 나타내었고; CaCIV1이라 부르는 유전자의 번역산물의 서열은 서열번호 2에 나타내었다.The sequence of this gene called CaCIV1 has been determined; The sequence is shown in SEQ ID NO: 1 in Sequence Listing; The sequence of the translation product of a gene called CaCIV1 is shown in SEQ ID NO: 2.
도 1은 CaCIV1의 아미노산 서열(1-문자코드)과 사카로마이시스 세레비지애 CAK(ScCIV1이라 부름)의 아미노산 서열, 및 사카로마이시스 세레비지애 카이나제 CDC28(ScCDC28이라 부름)의 아미노산 서열과의 비교를 나타낸다.1 shows the amino acid sequence of CaCIV1 (1-letter code) and the amino acid sequence of Saccharomyces cerevisiae CAK (called ScCIV1), and the amino acid sequence of Saccharomyces cerevisiae kinase CDC28 (called ScCDC28). Indicates a comparison.
CaCIV1은 전체 아미노산 서열의 레벨에서 사카로마이시스 세레비지애의 CAK, ScCIV1과 단지 28%의 동일성을 보인다.CaCIV1 shows only 28% identity with CAK, ScCIV1 of Saccharomyces cerevisiae at the level of the entire amino acid sequence.
그러나, ScCIV1과 CaCIV1 사이에 관찰된 유사성은, 하기 특징들을 가지는 단백질과 함께 분류되는 이하에서 CIV1이라 부르는 카이나제 계열을 정의하는 것을 가능하게 만든다.However, the similarity observed between ScCIV1 and CaCIV1 makes it possible to define a kinase family called CIV1 hereinafter, classified together with a protein having the following characteristics.
- 이들은 GxGx(Y/F)GxV 모티브가 결여되어 있다. 이 때 G는 글라이신을 표시하고, x는 임의의 아미노산을 표시하며, Y/F는 티로신 또는 페닐알라닌 중 어느 하나를 표시하고, V는 발린을 표시한다;They lack the GxGx (Y / F) GxV motif. G represents glycine, x represents any amino acid, Y / F represents either tyrosine or phenylalanine, and V represents valine;
- 이들은 비-싸이클린-의존 CAK 활성을 보유하고 있다.They possess non-cyclin-dependent CAK activity.
본 발명은 사카로마이시스 세레비지애 CAK ScCIV1을 제외한, 상기 정의된 바와 같이 CIV1 계열에 속하는 단백질 카이나제를 포함한다.The present invention includes protein kinases belonging to the CIV1 family as defined above, except Saccharomyces cerevisiae CAK ScCIV1.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 단백질 카이나제를 자낭균, 유리하게는 반자낭균, 및 바람직하게는 칸디다 알비칸스로부터 얻을 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, said protein kinase can be obtained from asymptococci, advantageously H. pylori, and preferably Candida albicans.
본 발명에 따르는 단백질 카이나제는 예를 들어 서열목록의 서열번호 2로 나타내어진다.Protein kinases according to the invention are represented, for example, by SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
또한 본 발명의 목적은 본 발명에 따르는 단백질 카이나제를 암호하는 핵산서열이다.Also an object of the present invention is a nucleic acid sequence encoding a protein kinase according to the present invention.
본 발명에 따르는 핵산서열은 예를 들어 서열목록의 서열번호 1로 이루어진다.Nucleic acid sequences according to the invention consists of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, for example.
또한 본 발명의 목적은 본 발명에 따르는 CAK에 특이적인 펩티드 서열을 암호하는 핵산서열에 상동이거나 상보적인 적어도 18 bp의 핵산단편들이다.It is also an object of the present invention at least 18 bp nucleic acid fragments homologous or complementary to the nucleic acid sequence encoding the peptide sequence specific for CAK according to the present invention.
이러한 단편들은 구체적으로 본 발명에 따르는 CAK를 암호하는 핵산서열을 칸디다 알비칸스를 이용하여 분리 및/또는 클론하기 위한 혼성화 프로브, 및/또는 증폭 프라이머(primer)로서 사용되어질 수 있다.Such fragments can be used specifically as hybridization probes, and / or amplification primers for isolating and / or cloning nucleic acid sequences encoding CAK according to the invention using Candida albicans.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 CAK CaCIV1, 및 사카로마이시스 세레비지애 CAK ScCIV1에 의해 정의된 단백질 카이나제 계열에서 보존된 펩티드 서열을 암호하는 핵산서열에 상동이거나 상보적인 적어도 15 bp, 바람직하게는 적어도 18 bp의 핵산단편들을 포함한다.The invention also provides at least 15 bp homologous or complementary to a nucleic acid sequence encoding a peptide sequence conserved in the protein kinase family defined by CAK CaCIV1 and Saccharomyces cerevisiae CAK ScCIV1 according to the invention. Comprises at least 18 bp of nucleic acid fragments.
이러한 단편들은 구체적으로 사카로마이시스 세레비지애 및 칸디다 알비칸스와는 다른 생물에서, CAK CaCIV1 및 ScCIV1과 관련된 카이나제를 암호하는 서열의 존재를 탐지하기 위한, 그리고 그에 따라 규명된 유전자를 분리 및/또는 클론하기 위한 혼성화 프로브, 및/또는 증폭 프라이머(primer)로서 사용되어질 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 방법에서 얻은 핵산서열, 및 이러한 서열에 의해 암호화되는 CAK CaCIV1과 ScCIV1 계열의 단백질 카이나제를 포함한다.These fragments are specifically used to detect the presence of sequences encoding kinases associated with CAK CaCIV1 and ScCIV1, and to thereby isolate and identify genes identified in organisms other than Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. And / or hybridization probes for cloning, and / or amplification primers. The present invention also includes nucleic acid sequences obtained in this method, and protein kinases of the CAK CaCIV1 and ScCIV1 family encoded by these sequences.
또한 본 발명의 목적은 본 발명에 따르는 적어도 하나의 핵산서열을 적당한 벡터로 삽입시킨 결과로 형성되는 임의의 재조합 벡터(vector), 및 특히 임의의 발현벡터이다. 본 기술분야에서 숙련된 사람은 본 발명에 따르는 핵산을 증폭 및/또는 발현시키기 위해 선택된 숙주세포에 따라 수많은 이용가능한 벡터중에서 적당한 벡터를 용이하게 선택할 수 있다.It is also an object of the present invention for any recombinant vector to be formed as a result of the insertion of at least one nucleic acid sequence according to the invention into a suitable vector, and in particular for any expression vector. One skilled in the art can readily select a suitable vector from a number of available vectors depending on the host cell selected for amplifying and / or expressing the nucleic acid according to the present invention.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 핵산서열로 형질전환된 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 이러한 형질전환된 세포들은 구체적으로 본 발명에 따르는 카이나제를 발현시키기 위해 사용될 수 있고, 예를 들어 사카로마이시스 세레비지애 CIV1에 대해 발명자들에 의해 전에 설명된 유사한 기술들을 사용하여(Thuret et al., 1996) 세포 배양물로부터 그것을 정제하기 위해서, 또는 대체하여 세포생존능력의 적당한 테스트에 의해 그것의 활성을 탐지하기 위해서 사용될 수 있다.The present invention also includes prokaryotic or eukaryotic cells transformed with nucleic acid sequences according to the present invention. Such transformed cells can be specifically used to express the kinase according to the invention, for example using similar techniques previously described by the inventors for Saccharomyces cerevisiae CIV1 (Thuret et. al., 1996) can be used to purify it from cell culture or, alternatively, to detect its activity by appropriate testing of cell viability.
본 발명자들에 의한 카이나제 ScCIV1 및 CaCIV1의 기능적 상동관계에 대한 입증은 이러한 카이나제 계열에 대한 수많은 적용을 예견하는 것을 가능하게 한다.The demonstration of functional homology of the kinase ScCIV1 and CaCIV1 by the inventors makes it possible to foresee numerous applications for this kinase family.
구체적으로, 이러한 카이나제 계열의 비-싸이클린-의존 CAK 활성은 세포분열과 생존에 필수적인 것으로 보이기 때문에, 이러한 활성을 억제하는 물질들은 살균제로서 사용될 수 있고, 의약으로서 또는 산업적으로 이용될 수 있다.Specifically, since these kinase family of non-cyclin-dependent CAK activities appear to be essential for cell division and survival, substances that inhibit these activities can be used as fungicides, as medicines or industrially.
예를 들면, 칸디다 알비칸스에 작용하는 물질과 같은 살균물질을 스크리닝하기 위해서 CaCIV1, 또는 CIV1 계열의 비-싸이클린-의존 CAK로 이루어지는 이의 기능적 상동체(homologues) 중 하나의 카이나제 활성이 살균성질을 확인하기 위하여 각각의 산물의 존재하에서 측정되고, 이러한 활성에 억제효과를 갖는 산물이 선택된다.For example, the kinase activity of one of its functional homologues, consisting of CaCIV1, or a non-cyclin-dependent CAK of the CIV1 family, for screening bactericidal agents such as those acting on Candida albicans, is bactericidal. Products are measured in the presence of each product to confirm that products with inhibitory effects on this activity are selected.
그러한 스크리닝은 시험되어지는 잠재적인 활성자(activator) 또는 억제자의 존재하에 CIV1 계열의 CAK의 카이나제 활성을 측정함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 카이나제 활성은 적당한 반응혼합물에서 펩티드 또는 예컨대 CDC28이나 Cdk2, 또는 단백질 MBP(myelin basic protein)와 같은 기질단백질의 인산화를 탐지하는 것에 의해 직접적으로, 또는 후자가 인산화에 의존할 때 기질단백질의 활성을 탐지 및/또는 측정하는 것에 의해 간접적으로 시험관내 방법으로(in vitro) 측정될 수 있다.Such screening can be performed by measuring the kinase activity of CAKs of the CIV1 family in the presence of potential activators or inhibitors to be tested. For example, kinase activity can be determined either directly by detecting the phosphorylation of a peptide or matrix protein such as CDC28 or Cdk2, or protein myelin basic protein (MBP) in a suitable reaction mixture, or when the latter is dependent on phosphorylation. It may be determined in vitro by indirectly by detecting and / or measuring the activity of the substrate protein.
카이나제 활성은 또한 생체내 방법으로(in vivo) 세포생존능력을 테스트하는 것에 의해 측정되어질 수 있으며; 예를 들면, CaCIV1의 카이나제 활성은 CaCIV1 유전자로 형질전환되어 CAK ScCIV1을 발현하지 않는 사카로마이시스 세레비지애의 돌연변이체의 세포에서 유리하게 측정될 수 있다.Kinase activity can also be measured by testing cell viability in vivo; For example, the kinase activity of CaCIV1 may be advantageously measured in cells of mutants of Saccharomyces cerevisiae that are transformed with CaCIV1 gene and do not express CAK ScCIV1.
또한 본 발명은 CIV1 계열의 비-싸이클린-의존 CAK의 억제특성에 대해서 상술된 바와 같이 선택된 산물을 살균제의 생산을 위하여 사용하는 상기 산물의 용도를 포함한다.The invention also encompasses the use of said product for the production of fungicides using the product selected as described above for the inhibitory properties of the CIV1 family of non-cycline-dependent CAKs.
본 발명은 하기에서 CaCIV1의 CAK 활성의 탐지, 및 상응하는 유전자의 클로닝을 설명하는 실시예에 의하여 더욱 분명하게 이해되어질 것이다.The invention will be more clearly understood by the following examples which illustrate the detection of CAK activity of CaCIV1 and the cloning of the corresponding genes.
사카로마이시스 세레비지애 균주, CMY975(유전형 CIV1-2 ura3 leu2 trp1 lys2 ade2 ade3)는 CIV1 유전자의 열-감수성 돌연변이를 가지고, 이 때문에 37℃가 아닌 24℃에서 성장한다.Saccharomyces cerevisiae strain, CMY975 (genotype CIV1-2 ura3 leu2 trp1 lys2 ade2 ade3), has a heat-sensitive mutation of the CIV1 gene and therefore grows at 24 ° C. rather than 37 ° C.
이 균주의 배양물은 벡터 YEp24(멀티카피-URA3)(Botstein et al., Gene 8, 17-24, (1979))의 BamHI 위치에 클론된 칸디다 알비칸스 Sau3A 게놈 단편들의 라이브러리를 가지고 리튬 아세테이트(lithium acetate) 방법(Schiestl and Gietz, Current Genetics, 16, 339-346, (1989))에 의해 형질전환되었다.Cultures of this strain had a library of Candida albicans Sau3A genomic fragments cloned at the BamHI site of vector YEp24 (Multicopy-URA3) (Botstein et al., Gene 8, 17-24, (1979)). lithium acetate) method (Schiestl and Gietz, Current Genetics, 16, 339-346, (1989)).
상기 CMY975 세포를 우라실이 없는 합성배지를 갖는 디쉬에 도말하고, 37℃에서 배양한다.The CMY975 cells are plated in dishes with synthetic medium without uracil and incubated at 37 ° C.
이러한 조건하에서 성장한 CMY975의 10개의 콜로니를 얻었다. 칸디다 알비칸스 삽입물을 갖는 플라스미드 YEp24를 상기 콜로니의 각각에서 회수하였고, 대장균(Escherichia coli)에서 증폭시켰다.Ten colonies of CMY975 were grown under these conditions. Plasmid YEp24 with Candida albicans insert was recovered in each of the colonies and amplified in Escherichia coli.
이러한 플라스미드 각각의 제한지도를 작성하였고, 제한지도는 모든 삽입물이 칸디다 알비칸스 게놈의 동일한 지역으로부터 나왔다는 사실을 관찰하는 것을 가능하게 한다. 이 지역의 시퀀싱(sequencing)은 339개 아미노산의 단백질 카이나제를 암호하는 동일한 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 특정하는 것을 가능하게 만들었고, 이것은 따로 얻어진 10개의 삽입물이 동일한 칸디다 알비칸스 유전자에 상응하는 것을 나타낸다. 이 유전자를 CaCIV1이라 명명하였다.Restriction maps of each of these plasmids were prepared, which makes it possible to observe the fact that all inserts are from the same region of the Candida albicans genome. Sequencing of this region made it possible to specify the same open reading frame, which encodes a protein kinase of 339 amino acids, so that 10 separate inserts correspond to the same Candida albicans gene. It shows. This gene was named CaCIV1.
CaCIV1의 서열은 서열목록의 서열번호 1의 서열로서 나타내어지고, CaCIV1의 서열은 서열목록의 서열번호 2의 서열로서 나타내어진다. 단백질 CaCIV1의 서열과 데이터베이스에서 이용가능한 서열과의 비교는 이 단백질이 사카로마이시스 세레비지애 ScCIV1의 CAK과 동일한 아미노산을 단지 28% 가지고 있다는 것과, 사카로마이시스 세레비지애의 Cdk인 ScCDC28 및 칸디다 알비칸스의 CaCDC28과 동일한 아미노산을 24% 가지고 있다는 것을 밝혀준다.The sequence of CaCIV1 is shown as the sequence of SEQ ID NO: 1 in Sequence Listing, and the sequence of CaCIV1 is shown as the sequence of SEQ ID NO: 2 in Sequence Listing. Comparison of the sequence of the protein CaCIV1 with the sequences available in the database shows that the protein has only 28% of the same amino acids as the CAK of Saccharomyces cerevisiae ScCIV1, and ScCDC28 and Candida albi, the Cdks of Saccharomyces cerevisiae It reveals that it has 24% of the same amino acids as CaCDC28 from Kans.
CaCIV1 유전자를 갖는 3kb의 BamHI-ClaI 게놈 단편이 동원체 플라스미드 TRP1 pRS414(Sikorski and Hieter, Genetics, 122, 19-27 (1989)) 속으로 서브클론되었다. 이 플라스미드는 ScCIV1 서열이 게놈에서 제거되고 복제 플라스미드상에 ScCIV1 유전자를 갖고 또한 선택가능한 유전자인 URA3(게놈 ura3 leu2 trp1 lys2 civ1 LEU2/pJG43(URA3-ScCIV1)을 갖는 균주 CMY116)를 갖는 사카로마이시스 세레비지애 돌연변이체를 형질전환하기 위해서 사용되었다. 플라스미드 pRS414-CaCIV1로 형질전환된 세포는 카운터셀렉션(counterselection)과 플라스미드 pJG43(URA3-ScCIV1)의 상실 후에도 생존할 수 있고, 이것은 CaCIV1 유전자가 필수적인 ScCIV1 유전자를 대신하여 기능할 수 있다는 것을 증명한다. 따라서, CaCIV1은 ScCIV1의 기능적인 상동체를 암호하고, CAK 활성을 회복시키기에 충분하다.A 3 kb BamHI-ClaI genomic fragment with CaCIV1 gene was subcloned into the plasmid TRP1 pRS414 (Sikorski and Hieter, Genetics, 122, 19-27 (1989)). This plasmid has a Saccharomyces sessile with the ScCIV1 sequence removed from the genome and the ScCIV1 gene on the replication plasmid and also the selectable gene URA3 (strain CMY116 with the genome ura3 leu2 trp1 lys2 civ1 LEU2 / pJG43 (URA3-ScCIV1)). It was used to transform Levisia mutants. Cells transformed with plasmid pRS414-CaCIV1 can survive after counterselection and loss of plasmid pJG43 (URA3-ScCIV1), demonstrating that the CaCIV1 gene can function in place of the necessary ScCIV1 gene. Thus, CaCIV1 encodes the functional homologue of ScCIV1 and is sufficient to restore CAK activity.
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