KR20010005701A - Motilin homologs - Google Patents
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Abstract
본 발명은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 그것의 펩티드 단편 그리고 모틸린에 대해 상동성을 갖는 신규한 cDNA 서열에의 그것의 사용에 관한 것이다. 이 신규한 폴리펩티드에 대한 mRNA의 조직 분포는 위, 소장 및 췌장에 대해 특이적이다. 본 발명은 아고니스트, 길항제, 항체, 신규한 모틸린 상동체를 코드화하는 cDNA를 발현하는 숙주 세포 및 신규한 분자를 사용하여 위운동을 증가시키는 방법을 더 포함한다.The present invention relates to polynucleotides, polypeptides and peptide fragments thereof and their use in novel cDNA sequences having homology to motilin. The tissue distribution of mRNA for this novel polypeptide is specific for the stomach, small intestine and pancreas. The invention further includes methods of increasing gastric motility using agonists, antagonists, antibodies, host cells expressing cDNA encoding the novel motiline homologues and novel molecules.
Description
영양 항상성을 유지하는데 중요한 많은 조절 펩티드들이 위장 환경에서 발견되고 있다. 이들 펩티드들은 소화계에서 합성되어 국소적으로 작용할 수 있지만, 또한 뇌에서도 확인될 수 있다. 또한, 그 역도 또한 발견된다. 즉, 펩티드들은 뇌에서 합성되지만, 위장관에서 세포를 조절하는 것으로 발견된다. 이런 현상은 "뇌-장관 축"으로 언급되어 왔으며, 포만감을 신호화하고, 체온을 조절하며 뇌와 장관 사이의 피드백을 필요로 하는 다른 생리적 과정들에 중요하다.Many regulatory peptides that are important for maintaining nutritional homeostasis are found in the gastrointestinal environment. These peptides can be synthesized in the digestive system and act locally, but can also be found in the brain. The reverse is also found. That is, peptides are synthesized in the brain but are found to regulate cells in the gastrointestinal tract. This phenomenon has been referred to as the "brain-intestinal axis" and is important for other physiological processes that signal satiety, regulate body temperature, and require feedback between the brain and intestines.
장관의 펩티드 호르몬으로는 가스트린, 콜레시스토키닌(CCK), 세크레틴, 위의 억제 펩티드(GIP), 혈관에 작용하는 장의 폴리펩티드(VIP), 모틸린, 소마토스타틴, 췌장 펩티드(PP), 물질 P 및 뉴로펩티드 Y(NPY)가 있으며, 이것들은 여러 가지의 상이한 작용 메카니즘을 사용한다. 예를 들어, 가스트린, 모틸린 및 CCK는 내분비 및 신경분비형 호르몬으로서 작용한다. 다른 호르몬들, 예컨대 가스트린과 GIP는 배타적으로 내분비 양상으로만 작용하는 것으로 여겨진다. 다른 작용 방식으로는 내분비, 신경분비 및 파라크린 작용의 조합(소마토스타틴); 배타적인 신경분비 작용(NPY); 및 신경분비와 파라크린 작용의 조합(VIP 및 물질 P)이 있다. 대부분의 장관 호르몬 작용은 멤브레인-결합 수용체들에 의해 매개되고 제 2의 메신저 시스템을 활성화한다. 장관 펩티드에 대해서는 문헌을 참조한다[Mulvihill et al., in Basic and Clinical Endocrinology, pp. 551-570, 4th edition Greenspan F. S. and Baxter, J. D. editors., Appleton & Lange: Norwalk, Connecticut, 1994].Intestinal peptide hormones include gastrin, cholecystokinin (CCK), secretin, gastric inhibitory peptide (GIP), intestinal polypeptide acting on blood vessels (VIP), motilin, somatostatin, pancreatic peptide (PP), substance P and neuropeptide Y (NPY), and they use a variety of different mechanisms of action. For example, gastrins, motilines and CCK act as endocrine and neuroendocrine hormones. Other hormones such as gastrin and GIP are believed to act exclusively in the endocrine modality. Other modes of action include a combination of endocrine, neuroendocrine and paracrine functions (somatostatin); Exclusive neurosecretory action (NPY); And a combination of neurosecretion and paracrine action (VIP and substance P). Most intestinal hormonal action is mediated by membrane-bound receptors and activates a second messenger system. For intestinal peptides see literature [Mulvihill et al., In Basic and Clinical Endocrinology, pp. 551-570, 4th edition Greenspan F. S. and Baxter, J. D. editors., Appleton & Lange: Norwalk, Connecticut, 1994].
많은 이들 장관 펩티드들은 활성화되기 위해서 많은 펩티드 절단을 필요로 하는 비활성 전구체 분자로서 합성된다. VIP, 가스트린, 세크레틴, 모틸린, 글루카곤 및 갈라닌을 포함하는 "글루카곤-세크레틴" 패밀리로서 알려져 있는 패밀리는 다중 절단 및 후-번역 변형에 의해 조절되는 펩티드들의 좋은 예이다.Many of these enteric peptides are synthesized as inactive precursor molecules that require many peptide cleavage to be activated. The family known as the "glucagon-secretin" family, including VIP, gastrin, secretin, motiline, glucagon and galanine, are good examples of peptides that are regulated by multiple cleavage and post-translational modifications.
모틸린은 포유동물 종의 장관 조직에서 발견되는 22 아미노산 펩티드이다[Domschke, W., Digestive Disease 22(5):454-461, 1977]. 돼지의 프레프로모틸린에 대한 DNA 및 아미노산 서열이 확인되어 있다(미국 특허 제 5,006,469 호). 모틸린은 펩신 분비를 자극함으로써 위의 분비 기능에 영향을 주는, 위 운동성을 증가시킬 수 있는 인자로서 확인되었으며 [Brown et al, Canadian J. of Physiol. Pharmacol. 49:399-405, 1971], 최근의 증거는 위 및 소장에서의 근전성 조절에 모틸린이 역할을 담당하고 있음을 시사한다. 모틸린의 순환계에서의 증가는 소화계내 근전성 복합체의 상 III 및 십이지장의 공복 수축과 상관관계가 있다[Chey et al., in Gut Hormones, (eds.) Bloom, S. R., pp. 355-358, Edinburgh, Churchill Livingstone, 1978; Lee et al., Am. J. Digestive Diseases, 23:789-795, 1978; 및 Itoh et al., Am. J. Digestive Diseases, 23:929-935, 1978]. 모틸린 및 모틸린의 유사체들은 위장의 평활근의 수축을 유발하는 것으로 증명되었지만, 다른 유형의 평활근 세포들은 수축시키지 못한다[Strunz et al., Gastroenterology 68:1485-1491, 1975].Motilin is a 22 amino acid peptide found in the intestinal tissue of mammalian species (Domschke, W., Digestive Disease 22 (5): 454-461, 1977). DNA and amino acid sequences have been identified for swine prepromotiline (US Pat. No. 5,006,469). Motiline has been identified as a factor that can increase gastric motility by stimulating pepsin secretion, affecting gastric secretory function [Brown et al, Canadian J. of Physiol. Pharmacol. 49: 399-405, 1971], recent evidence suggests that motilin plays a role in the regulation of myostatic in the stomach and small intestine. The increase in motiline in the circulatory system correlates with fasting contraction of phase III and duodenum of the EMG complex in the digestive system [Chey et al., In Gut Hormones, (eds.) Bloom, S. R., pp. 355-358, Edinburgh, Churchill Livingstone, 1978; Lee et al., Am. J. Digestive Diseases, 23: 789-795, 1978; And Itoh et al., Am. J. Digestive Diseases, 23: 929-935, 1978.]. Motiline and its analogs have been shown to cause contraction of gastrointestinal smooth muscle, but other types of smooth muscle cells fail to contract (Strunz et al., Gastroenterology 68: 1485-1491, 1975).
본 발명은 위장 시스템에서 전사되는 것으로 밝혀진, 모틸린에 대해 상동성을 가지고 있는 신규한 분비된 단백질에 관한 것이다. 이러한 신규한 펩티드의 발견은 신체가 어떻게 영양 항상성을 유지하는지에 대한 추가의 설명 및 그러한 과정들을 조절하기 위한 치료법의 개발, 뿐만 아니라 본원의 설명으로부터 명백하게 드러날 다른 용도에도 중요하다.The present invention relates to a novel secreted protein having homology to motilin, which has been found to be transcribed in the gastrointestinal system. The discovery of these novel peptides is important for further explanation of how the body maintains nutritional homeostasis and development of therapies to modulate such processes, as well as other uses that will be apparent from the description herein.
발명의 개요Summary of the Invention
본 발명은 한 측면으로, (a) SEQ ID NO: 1에 나타낸 뉴클레오티드 70 내지 뉴클레오티드 111의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자; (b) (a)의 대립성 변이체; (c) (a)와 (b)의 오르토로그(ortholog); 및 (d) (a), (b) 또는 (c)의 축퇴성 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다.In one aspect, the invention provides a kit comprising: (a) a polynucleotide molecule comprising the nucleotide sequence of nucleotides 70 to nucleotide 111 shown in SEQ ID NO: 1; (b) allelic variants of (a); (c) orthologs of (a) and (b); And (d) encoding a polypeptide selected from the group consisting of degenerate nucleotide sequences of (a), (b) or (c).
본 발명은 또 다른 측면으로, (a) SEQ ID NO: 2에 나타낸 잔기 24 내지 잔기 37의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 분자; (b) (a)의 대립성 변이체; 및 (c) (a) 또는 (b)의 오르토로그로 이루어지는 군으로부터 선택된 분리된 폴리펩티드를 제공한다.In another aspect, the invention provides an antibody comprising: (a) a polypeptide molecule comprising the amino acid sequence of residues 24 to 37 shown in SEQ ID NO: 2; (b) allelic variants of (a); And (c) an ortholog of (a) or (b).
또 다른 측면으로, 본 발명은 다음의 작동가능하게 연결된 구성요소: 전사 프로모터; (a) SEQ ID NO: 1에 나타낸 뉴클레오티드 70 내지 뉴클레오티드 111의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자; (b) (a)의 대립성 변이체; (c) (a) 또는 (b)의 오르토로그; 및 (d) (a), (b) 또는 (c)의 축퇴성 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 DNA 절편; 전사 터미네이터를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.In another aspect, the invention provides an operably linked component comprising: a transcriptional promoter; (a) a polynucleotide molecule comprising the nucleotide sequence of nucleotides 70 to nucleotide 111 shown in SEQ ID NO: 1; (b) allelic variants of (a); (c) the ortholog of (a) or (b); And (d) a DNA fragment selected from the group consisting of the degenerate nucleotide sequences of (a), (b) or (c); An expression vector comprising a transcription terminator is provided.
또 다른 측면으로, 본 발명은 다음의 작동가능하게 연결된 구성요소: 전사 프로모터; (a) SEQ ID NO: 1에 나타낸 뉴클레오티드 70 내지 뉴클레오티드 111의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자; (b) (a)의 대립성 변이체; (c) (a) 또는 (b)의 오르토로그; 및 (d) (a), (b) 또는 (c)의 축퇴성 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 DNA 절편; 전사 터미네이터를 포함하는 발현 벡터가 도입된 배양 세포를 제공하는데, 여기서 상기 세포는 DNA 절편에 의해 코드화된 폴리펩티드를 발현한다.In another aspect, the invention provides an operably linked component comprising: a transcriptional promoter; (a) a polynucleotide molecule comprising the nucleotide sequence of nucleotides 70 to nucleotide 111 shown in SEQ ID NO: 1; (b) allelic variants of (a); (c) the ortholog of (a) or (b); And (d) a DNA fragment selected from the group consisting of the degenerate nucleotide sequences of (a), (b) or (c); Provided is a cultured cell into which an expression vector comprising a transcription terminator is introduced, wherein said cell expresses a polypeptide encoded by a DNA fragment.
또 다른 측면으로, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 2에 나타낸 잔기 24 내지 잔기 37의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 분자; (b) (a)의 대립성 변이체; 및 (c) (a) 또는 (b)의 오르토로그로 이루어지는 군으로부터 선택된 정제된 폴리펩티드를 약학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.In another aspect, the invention provides an antibody comprising (a) a polypeptide molecule comprising the amino acid sequence of residues 24 to 37 shown in SEQ ID NO: 2; (b) allelic variants of (a); And (c) a purified polypeptide selected from the group consisting of the orthologs of (a) or (b) in combination with a pharmaceutically acceptable excipient.
또 다른 측면으로, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 2에 나타낸 잔기 24 내지 잔기 37의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 분자; (b) (a)의 대립성 변이체; 및 (c) (a) 또는 (b)의 오르토로그로 이루어지는 군으로부터 선택된 폴리펩티드의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.In another aspect, the invention provides an antibody comprising (a) a polypeptide molecule comprising the amino acid sequence of residues 24 to 37 shown in SEQ ID NO: 2; (b) allelic variants of (a); And (c) an antibody that binds to an epitope of a polypeptide selected from the group consisting of the orthologs of (a) or (b).
또 다른 측면으로, 본 발명은 다음의 작동가능하게 연결된 구성요소: 전사 프로모터; (a) SEQ ID NO: 1에 나타낸 뉴클레오티드 70 내지 뉴클레오티드 111의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자; (b) (a)의 대립성 변이체; (c) (a) 또는 (b)의 오르토로그; 및 (d) (a), (b) 또는 (c)의 축퇴성 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 DNA 절편; 전사 터미네이터를 포함하는 발현 벡터가 도입된 세포를 배양하고, 이로써 상기 세포가 DNA 절편에 의해 코드화된 폴리펩티드를 발현하도록 하고, 그 폴리펩티드를 회수하는 것으로 이루어지는 zsig33 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.In another aspect, the invention provides an operably linked component comprising: a transcriptional promoter; (a) a polynucleotide molecule comprising the nucleotide sequence of nucleotides 70 to nucleotide 111 shown in SEQ ID NO: 1; (b) allelic variants of (a); (c) the ortholog of (a) or (b); And (d) a DNA fragment selected from the group consisting of the degenerate nucleotide sequences of (a), (b) or (c); There is provided a method for producing a zsig33 polypeptide comprising culturing a cell into which an expression vector comprising a transcription terminator is introduced, thereby allowing the cell to express a polypeptide encoded by a DNA fragment and recovering the polypeptide.
또 다른 측면으로, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 2에 나타낸 잔기 24 내지 잔기 37의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 분자; (b) (a)의 대립성 변이체; 및 (c) (a) 또는 (b)의 오르토로그로 이루어지는 군으로부터 선택된 분리된 폴리펩티드를 약학적으로 허용되는 부형제에 포함하는 조성물을, 섭취된 물질의 운반시간 또는 위배출을 증가시키기에 충분한 양으로, 위운동의 자극이 필요한 포유동물에게 투여하는 것으로 이루어지는 위운동의 자극방법을 제공한다.In another aspect, the invention provides an antibody comprising (a) a polypeptide molecule comprising the amino acid sequence of residues 24 to 37 shown in SEQ ID NO: 2; (b) allelic variants of (a); And (c) a composition comprising an isolated polypeptide selected from the group consisting of orthologs of (a) or (b) in a pharmaceutically acceptable excipient, an amount sufficient to increase delivery time or gastric emptying of the ingested material; In another aspect, the present invention provides a method of stimulating gastric movement consisting of administering to a mammal in need thereof.
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본원에서 사용되는 특정 용어들을 규정하는 것이 도움이 될 것이다.Before describing the invention in detail, it will be helpful to define the specific terms used herein.
용어 "오르토로그"는 상이한 종으로부터 유도되는 폴리펩티드 또는 단백질의 기능성 대응물인 어떤 한 종으로부터 얻어지는 폴리펩티드 또는 단백질을 말한다. 오르토로그들중의 서열 차이는 새로운 종으로의 분화의 결과이다.The term “ortholog” refers to a polypeptide or protein obtained from any one species that is a functional counterpart of a polypeptide or protein derived from a different species. Sequence differences among the orthologs are the result of differentiation into new species.
"파라로그(paralog)"는 유기체에 의해 만들어진, 구별되지만 구조적으로 관련이 있는 단백질을 말한다. 파라로그는 유전자 복사중에 발생하는 것으로 여겨진다. 예를 들면, α-글로빈, β-글로빈, 및 미오글로빈들이 서로의 파라로그이다.A "paralog" refers to a distinct but structurally related protein made by an organism. Paralogs are thought to occur during gene copying. For example, α-globin, β-globin, and myoglobin are paralogs of each other.
용어 "대립성 변이체"는 동일한 염색체 유전자좌를 차지하고 있는 유전자의 둘 또는 그 이상의 대용 형태중 어느 하나를 말한다. 대립성 변이체는 돌연변이를 통하여 자연적으로 발생하며, 집단내에 있는 표현형 다형태를 유발할 수 있다. 유전자 돌연변이는 사일런트일 수 있거나(코드화된 폴리펩티드에 변화가 없음) 또는 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코드화할 수 있다. 용어 대립성 변이체는 또한 본원에서 유전자의 대립성 변이체에 의해 코드화된 단백질을 나타내기 위해 사용된다.The term “allelic variant” refers to any one of two or more surrogates of a gene that occupy the same chromosomal locus. Allelic variants occur naturally through mutations and can lead to phenotypic polymorphisms in a population. The gene mutation may be silent (no change in the encoded polypeptide) or may encode a polypeptide having an altered amino acid sequence. The term allelic variant is also used herein to refer to a protein encoded by an allelic variant of a gene.
용어 "발현 벡터"는 그것의 전사를 제공하는 추가의 절편들과 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 절편을 포함하고 있는 선형 또는 원형의 DNA 분자를 말한다. 그러한 추가의 절편으로는 프로모터와 터미네이터 서열이 있으며, 임의로 하나 또는 그 이상의 복제 기원, 하나 또는 그 이상의 선택가능한 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되며, 또는 두가지의 요소를 모두 함유할 수도 있다.The term “expression vector” refers to a linear or circular DNA molecule that contains a fragment encoding a polypeptide of interest that is operably linked with additional fragments that provide for its transcription. Such additional segments include promoter and terminator sequences, and may optionally include one or more origins of replication, one or more selectable markers, enhancers, polyadenylation signals, and the like. Expression vectors are generally derived from plasmid or viral DNA, or may contain both elements.
용어 "분리된"은 폴리뉴클레오티드 분자에 적용될 때, 폴리뉴클레오티드가 그것의 천연 유전적 환경으로부터 제거되고 그로써 다른 외래성 또는 원하지 않는 코딩 서열이 없으며, 유전학적으로 조작된 단백질 제조 시스템내에서 사용하기에 적당한 형태로 존재함을 나타낸다. 그러한 분리된 분자들은 그것들의 천연 환경으로부터 분리되고 cDNA 및 게놈성 클론을 포함하는 것들이다. 본 발명의 분리된 DNA 분자들은 그것들이 원래 결합되어 있던 다른 유전자들이 없지만, 프로모터와 터미네이터와 같은 자연 발생적 5' 및 3' 미번역 영역을 포함할 수는 있다. 결합된 영역의 확인은 당업자에게는 명백할 것이다[예컨대 Dynan and Tijan, Nature 316:774-778, 1985 참조]. 단백질에 적용되는 경우에는, 용어 "분리된"은 단백질이 그것의 천연 환경이외의 조건, 예컨대 혈액 및 동물의 조직과 별개의 조건에서 발견되는 것을 가리킨다. 분리된 단백질은 실질적으로 다른 단백질, 특히 동물 기원의 다른 단백질이 없는 것이 바람직한 형태이다. 단백질은 매우 정제된 형태로, 즉, 95% 이상의 순도로, 보다 바람직하게는 99% 이상의 순도로 제공되는 것이 바람직하다.The term “isolated”, when applied to a polynucleotide molecule, removes the polynucleotide from its natural genetic environment and thereby is free of other adventitious or unwanted coding sequences and is suitable for use in genetically engineered protein production systems. It exists in form. Such isolated molecules are those that are isolated from their natural environment and include cDNA and genomic clones. Isolated DNA molecules of the present invention may contain naturally occurring 5 'and 3' untranslated regions such as promoters and terminators, although there are no other genes to which they were originally bound. Identification of bound regions will be apparent to those skilled in the art (see, eg, Dynan and Tijan, Nature 316: 774-778, 1985). When applied to a protein, the term “isolated” refers to the protein being found in conditions other than its natural environment, such as conditions separate from blood and animal tissue. An isolated protein is a form that is substantially free of other proteins, particularly other proteins of animal origin. The protein is preferably provided in a highly purified form, ie at least 95% purity, more preferably at least 99% purity.
용어 "작동가능하게 연결된"은 DNA 샘플에 적용되는 경우, 절편들이 그것들의 의도된 목적에 일치하게 기능하도록, 예컨대 전사는 프로모터에서 개시되어 코딩 절편을 통하여 진행되어 터미네이터에 이르도록 배열되는 것을 의미한다.The term “operably linked”, when applied to a DNA sample, means that the fragments are arranged to function in accordance with their intended purpose, such that transcription is initiated at the promoter and arranged through the coding fragments to reach the terminator. .
용어 "폴리뉴클레오티드"는 5' 단부에서 3' 단부로 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 단일- 또는 이중-가닥 중합체를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하며, 천연 공급원으로부터 분리될 수 있고, 시험관내에서 합성될 수도 있으며, 또는 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수도 있다.The term "polynucleotide" refers to a single- or double-stranded polymer of deoxyribonucleotides or ribonucleotides that is read from the 5 'end to the 3' end. Polynucleotides include RNA and DNA and can be isolated from natural sources, synthesized in vitro, or prepared from a combination of natural and synthetic molecules.
용어 "폴리뉴클레오티드 분자의 보체"는 참조 서열에 비교하여 상보적인 염기 서열 및 역 배향을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 나타낸다. 예를 들면, 서열 5' ATGCACGGG 3'은 5' CCCGTGCAT 3'에 상보적이다.The term “complement of a polynucleotide molecule” refers to a polynucleotide molecule having complementary base sequences and reverse orientation compared to the reference sequence. For example, the sequence 5 'ATGCACGGG 3' is complementary to 5 'CCCGTGCAT 3'.
용어 "축퇴성 뉴클레오티드 서열"은 (폴리펩티드를 코드화하는 참조 폴리뉴클레오티드 분자와 비교하여) 하나 또는 그 이상의 축퇴성 코돈을 포함하는 뉴클레오티드의 서열을 나타낸다. 축퇴성 코돈은 뉴클레오티드의 상이한 트리플렛을 함유하지만, 동일한 아미노산 잔기를 코드화한다(즉, GAU 와 GAC 트리플렛은 각각 Asp를 코드화한다).The term “degenerate nucleotide sequence” refers to a sequence of nucleotides comprising one or more degenerate codons (as compared to a reference polynucleotide molecule encoding a polypeptide). Degenerate codons contain different triplets of nucleotides, but encode the same amino acid residues (ie, the GAU and GAC triplets each encode Asp).
용어 "프로모터"는 RNA 중합효소의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 함유하고 있는 유전자의 부분을 나타낸다. 프로모터 서열은 공통이지만, 언제나 유전자의 5' 비-코딩 영역에서 발견되는 것은 아니다.The term “promoter” refers to a portion of a gene containing a DNA sequence that provides for the binding of RNA polymerase and the initiation of transcription. Promoter sequences are common but are not always found in the 5 'non-coding region of a gene.
용어 "분비 신호 서열"은 보다 큰 폴리펩티드의 성분으로서 그것이 합성되는 세포의 분비 경로를 통하여 보다 큰 폴리펩티드를 지정하는 폴리펩티드 ("분비 펩티드")를 코드화하는 DNA 서열을 의미한다. 보다 큰 펩티드는 통상 분비 경로를 통하여 진행하는 중에 분비 펩티드를 제거하기 위하여 절단된다.The term "secretory signal sequence" refers to a DNA sequence that encodes a polypeptide ("secretory peptide") that designates a larger polypeptide through the secretory pathway of the cell from which it is synthesized as a component of a larger polypeptide. Larger peptides are typically cleaved to remove secreted peptides in progress through the secretory pathway.
용어 "수용체"는 생체활성 분자(즉 리간드)에 결합하여 리간드의 세포에 미치는 영향을 매개하는 세포-결합된 단백질을 나타낸다. 멤브레인-결합 수용체는 세포외재성 리간드-결합 도메인과 전형적으로 신호 변환에 포함되는 세포내재성 이펙터 도메인을 포함하는 다중-도메인 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 리간드의 수용체에 대한 결합은 그 결과로, 이펙터 도메인과 세포내에 있는 다른 분자(들) 사이의 상호작용을 유발하는 수용체의 형태적 변화를 초래한다. 이 상호작용은 계속해서 세포의 대사에서 변경을 유도한다. 수용체-리간드 상호작용과 관련이 있는 대사 사건으로는 유전자 전사, 포스포릴화, 탈포스포릴화, 사이클릭 AMP 생성의 증가, 세포 칼슘의 고정화, 막 지질의 고정화, 세포 고착, 이노시톨 지질의 가수분해 및 인지질의 가수분해가 있다. 대부분의 핵 수용체는 또한 아미노-말단, 교차활성화(transactivating) 도메인, DNA 결합 도메인 및 리간드 결합 도메인을 포함하는 다중-도메인 구조를 나타낸다. 일반적으로, 수용체는 막 결합될 수 있으며, 시토솔성일 수도 있고, 또는 핵성일 수도 있다; 단량체일 수도 있고(예컨대 갑상선 자극 호르몬 수용체, 베타-아드레날린성 수용체) 또는 다량체일 수도 있다(예컨대 PDGF 수용체, 성장 호르몬 수용체, IL-3 수용체, GM-CSF 수용체, G-CSF 수용체, 에리트로포이에틴 수용체 및 IL-6 수용체).The term “receptor” refers to a cell-bound protein that binds to a bioactive molecule (ie a ligand) and mediates its effect on the cells of the ligand. Membrane-bound receptors are characterized by having a multi-domain structure comprising an extracellular ligand-binding domain and an endogenous effector domain typically involved in signal transduction. Binding of the ligand to the receptor results in a morphological change of the receptor causing an interaction between the effector domain and other molecule (s) in the cell. This interaction continues to induce alterations in cell metabolism. Metabolic events associated with receptor-ligand interactions include gene transcription, phosphorylation, dephosphorylation, increased cyclic AMP production, immobilization of cellular calcium, immobilization of membrane lipids, cell fixation, and hydrolysis of inositol lipids. And hydrolysis of phospholipids. Most nuclear receptors also exhibit a multi-domain structure comprising amino-terminus, transactivating domains, DNA binding domains and ligand binding domains. In general, receptors may be membrane bound, cytosolic, or nuclear; It may be a monomer (eg thyroid stimulating hormone receptor, beta-adrenergic receptor) or a multimer (eg PDGF receptor, growth hormone receptor, IL-3 receptor, GM-CSF receptor, G-CSF receptor, erythropoietin receptor And IL-6 receptor).
용어 "보체/항보체 쌍"은 적절한 조건하에서 비-공유적으로 결합된 안정한 쌍을 형성하는 동일하지 않은 부분들을 말한다. 예를 들면, 비오틴과 아비딘 (또는 스트렙트아비딘)은 보체/항보체 쌍의 원형적인 (표본적인) 구성원이다. 다른 예시적인 보체/항보체 쌍으로는 수용체/리간드 쌍, 항체/항원 (또는 합텐 또는 에피토프) 쌍, 센스/안티센스 폴리뉴클레오티드 쌍 등이 있다. 계속해서 보체/항보체 쌍의 분해가 바람직한 경우에는, 보체/항보체 쌍은 109M-1미만의 결합 친화성을 가지는 것이 바람직하다.The term “complement / anticomplement pair” refers to unequal moieties that form a stable pair that is non-covalently bound under appropriate conditions. For example, biotin and avidin (or streptavidin) are circular (sample) members of the complement / anticomplement pair. Other exemplary complement / anticomplement pairs include receptor / ligand pairs, antibody / antigen (or hapten or epitope) pairs, sense / antisense polynucleotide pairs, and the like. If degradation of the complement / anticomplement pair is then desired, the complement / anticomplement pair preferably has a binding affinity of less than 10 9 M −1 .
여기에 인용된 모든 참고문헌은 전부 참고로 포함된다.All references cited herein are incorporated by reference in their entirety.
본 발명은 부분적으로 돼지의 모틸린과 가장 밀접한 상동성을 가지는, 모틸린과 상동성을 가지고 있는 신규한 분비된 폴리펩티드를 코드화하는 신규한 사람 DNA 서열의 발견을 토대로 한다(SEQ ID NO:3 과 4에 나타냄). 모틸린은 위장의 생리학을 조절하는 폴리펩티드 패밀리의 구성원이다. 모틸린이 속해 있는 위장 조절에 중요한 폴리펩티드의 패밀리에는 글루카곤, 가스트린, 갈라닌, 및 혈관작용성 장 펩티드(VIP)가 있다. 이들 폴리펩티드는 활성 형태로 처리되는 다중 단계를 필요로 하는 선구 형태로 합성된다. 특히 본 발명의 폴리펩티드와 관련있는 것은 모틸린, VIP 및 갈라닌으로, 이것들에 대한 처리는 신호 서열의 제거와, 이어서 활성 펩티드를 방출하기 위한 하나 또는 그 이상의 부속 펩티드들을 절단하는 것을 포함한다. 그 결과의 활성 펩티드는 일반적으로 작고(10 내지 30 아미노산) 추가의 후-번역 변형, 예컨대 아미드화, 술페이션 또는 글루탐산 잔기의 피롤리단 카르보닐산 변형을 필요로 할 수 있다.The present invention is based, in part, on the discovery of novel human DNA sequences encoding novel secreted polypeptides homologous to motiline, which is most closely homologous to pig motiline (SEQ ID NO: 3 and 4). Motilin is a member of the polypeptide family that regulates the physiology of the stomach. Families of polypeptides important for gastrointestinal regulation to which motilines belong include glucagon, gastrin, galanine, and vasoactive intestinal peptides (VIPs). These polypeptides are synthesized in precursor forms that require multiple steps to be processed in the active form. Of particular relevance to the polypeptides of the invention are motilins, VIPs and galanines, the treatment of which involves the removal of signal sequences followed by cleaving one or more accessory peptides to release the active peptide. The resulting active peptides are generally small (10-30 amino acids) and may require additional post-translational modifications such as amidation, sulphation or pyrrolidane carbonyl acid modification of glutamic acid residues.
이 신규한 DNA에 상응하는 mRNA의 조직 분포를 분석한 결과, 발현 수준은 위에서 가장 높았으며, 소장과 췌장에서도 나타났지만 발현 수준이 감소된 것으로 나타났다. EST는 또한 폐의 cDNA 라이브러리에도 존재한다. 폴리펩티드는 zsig33 으로 표시되었다.Analysis of the tissue distribution of mRNA corresponding to this novel DNA showed the highest levels of expression in the stomach and decreased expression levels in the small and pancreas. EST is also present in lung cDNA libraries. The polypeptide is designated zsig33.
본 발명의 신규한 zsig33 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 처음에는 추정되는 분비 신호를 가지고 있는 서열에 대한 EST 데이터베이스에 대해 의문을 가짐으로써 확인되었다. 그 결과 EST 서열이 발견되었고 모틸린 패밀리에 관련이 있을 것으로 예상되었다. EST 서열은 태아의 췌장 라이브러리로부터 유도되었다.The novel zsig33 polynucleotides and polypeptides of the present invention were initially identified by questioning the EST database for sequences with putative secretion signals. As a result, the EST sequence was discovered and expected to be related to the motilin family. EST sequences were derived from the fetal pancreatic library.
완전한 길이의 cDNA에 의해 코드화된 신규한 폴리펩티드는 117 아미노산이다. 예상되는 신호 서열은 23 아미노산 잔기이다(SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 1 내지 23). 활성 펩티드는 16 아미노산 잔기일 것으로 예상되었고(SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 24내지 41), SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 41(Ser) 다음의 C- 말단에서 절단되는 것으로 예상된다. 그러나, 많은 장관-뇌 펩티드들은 다수의 절단을 필요로 한다. 예를 들어, 프로가스트린 펩티드는 101 아미노산이며, N-말단에서 절단되어 그 결과 순차적으로 더 작은 펩티드(G34, G17 및 G14)가 된다[Sugano et al., J. Biol. Chem. 260:11724-11729, 1985]. 다수의 처리 단계를 필요로 하는 다른 펩티드로는 C-말단이 절단되어 글루카곤-유사 펩티드 1 및 글루카곤-유사 펩티드 2가 유발되는 글루카곤, 및 그 처리과정이 GMAP로 알려져 있는 C-말단 펩티드의 절단을 포함하는 갈라닌이 있다. 그러므로, SEQ ID NO: 2의 아미노산 37(Gln) 뒤를 절단한 것을 토대로 한 추가의 펩티드가 합성되었고, 그 결과 생물학적 활성을 나타내는 14 아미노산 펩티드(SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 24(Gly) 내지 아미노산 잔기 37(Gln))가 생성되었다.The new polypeptide encoded by full length cDNA is 117 amino acids. The expected signal sequence is 23 amino acid residues (amino acid residues 1-23 of SEQ ID NO: 2). The active peptide is expected to be 16 amino acid residues (amino acid residues 24 to 41 of SEQ ID NO: 2) and is expected to be cleaved at the C-terminus following amino acid residue 41 (Ser) of SEQ ID NO: 2. However, many entero-brain peptides require multiple cleavage. For example, the progastrin peptide is 101 amino acids and is cleaved at the N-terminus resulting in smaller peptides (G34, G17 and G14) sequentially [Sugano et al., J. Biol. Chem. 260: 11724-11729, 1985. Other peptides that require multiple treatment steps include cleavage of C-terminal cleavage resulting in glucagon-like peptide 1 and glucagon-like peptide 2, and cleavage of C-terminal peptide, whose treatment is known as GMAP. There is galanin included. Therefore, additional peptides based on cleavage after amino acid 37 (Gln) of SEQ ID NO: 2 were synthesized, resulting in 14 amino acid peptides (amino acid residues 24 (Gly) to amino acids of amino acid sequence SEQ ID NO: 2). Residue 37 (Gln)) was generated.
C-말단 펩티드(SEQ ID NO: 2의 아미노산 42 내지 117)도 또한 약간의 특수화된 활성을 가질 수 있다. 모틸린에 대한 활성 펩티드(SEQ ID NO: 4에 나타냄)의 처리결과 모틸린-결합 펩티드(MAP)로 알려져 있는, 아미노산 잔기 50(Ser) 내지 아미노산 잔기 119(Lys)의 70 아미노산의 C-말단 펩티드가 방출되었다. 아델만 등은 MAP가 소화, 식욕 및 영양 흡수의 조절에 역할을 담당할 것으로 가정하였다[Adelman et al., 미국 특허 제 5,006,409 호].C-terminal peptides (amino acids 42 to 117 of SEQ ID NO: 2) may also have some specialized activity. Treatment of an active peptide against motiline (shown in SEQ ID NO: 4) results in the C-terminal of 70 amino acids from amino acid residues 50 (Ser) to amino acid residue 119 (Lys), known as motiline-binding peptide (MAP). The peptide was released. Adelman et al. Assumed that MAP would play a role in the regulation of digestion, appetite and nutrient absorption (Adelman et al., US Pat. No. 5,006,409).
폴리펩티드 zsig33의 고도로 보존된 아미노산들은 새로운 패밀리 구성원을 확인하기 위한 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)은 다양한 조직 공급원으로부터 얻어지는 RNA로부터 보존된 모티프를 코드화하는 서열을 증폭시키기 위하여 사용될 수 있다. 두 개의 그러한 보존된 도메인이 본 발명으로부터의 서열을 사용하여 확인되었다. 첫 번째 도메인은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 31 내지 36 에서 발견되었고, 여기서 확인된 모티프는 Glu X Gln Arg X Gln(X는 모든 아미노산 잔기이다)(SEQ ID NO: 5에 나타냄)이었고, 두 번째 도메인은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 78 내지 84에서 발견되었고, 여기서 확인된 모티프는 Ala Pro X Asp X Gly Ile(X는 모든 아미노산 잔기이다)(SEQ ID NO: 6에 나타냄)이었다. 특히, 이들 서열로부터 디자인된 고도로 축퇴된 프라이머들이 본 목적에 유용하다.Highly conserved amino acids of polypeptide zsig33 can be used as a tool to identify new family members. For example, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) can be used to amplify sequences encoding motifs conserved from RNA obtained from various tissue sources. Two such conserved domains have been identified using sequences from the present invention. The first domain was found at amino acid residues 31 to 36 of SEQ ID NO: 2, where the identified motif was Glu X Gln Arg X Gln (X is all amino acid residues) (shown in SEQ ID NO: 5), two The first domain was found at amino acid residues 78 to 84 of SEQ ID NO: 2, wherein the identified motif was Ala Pro X Asp X Gly Ile (X is all amino acid residues) (shown in SEQ ID NO: 6). In particular, highly degenerate primers designed from these sequences are useful for this purpose.
당업자들은 유전자 코드의 축퇴성의 견지에서, 상당한 서열 변이가 U를 T 대신 치환하는 모든 RNA 서열을 포함하여 SEQ ID NO: 2를 코드화하는 이들 폴리뉴클레오티드 분자들 사이에서 가능함을 쉽게 인지할 것이다. 그로써, zsig33 폴리펩티드-코드화 폴리뉴클레오티드 및 그것들의 RNA 동등물은 본 발명에 의해 예상된다. 하기의 표 1은 축퇴성 뉴클레오티드 위치를 나타내기 위하여 사용된 한문자 코드를 나타낸다. "풀이(resolution)"는 코드 문자에 의해 표시된 뉴클레오티드이다. "보체"는 상보적인 뉴클레오티드(들)에 대한 코드를 가리킨다. 예를 들어, 코드 Y는 C 또는 T를 나타내고, 그것의 보체인 R은 A 또는 G를 나타내며, A는 T에 상보적이고, G는 C에 상보적이다.Those skilled in the art will readily recognize that, in view of the degeneracy of the genetic code, significant sequence variation is possible between these polynucleotide molecules encoding SEQ ID NO: 2, including all RNA sequences replacing U instead of T. As such, zsig33 polypeptide-encoding polynucleotides and their RNA equivalents are contemplated by the present invention. Table 1 below shows the one letter code used to indicate the degenerate nucleotide position. "Resolution" is a nucleotide indicated by a code letter. "Complement" refers to the code for complementary nucleotide (s). For example, the code Y represents C or T, its complement R represents A or G, A is complementary to T, and G is complementary to C.
주어진 아미노산에 대한 모든 가능한 코돈을 포함하는 축퇴성 코돈들은 하기 표 2에 나타낸다.Degenerate codons, including all possible codons for a given amino acid, are shown in Table 2 below.
당업자라면 각각의 아미노산을 코드화하는 모든 가능한 코돈을 나타내는 축퇴성 코돈을 결정하는데 약간의 불명확함이 도입된다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 세린에 대한 축퇴성 코돈(WSN)은 어떤 경우에는 아르기닌을 코드화할 수 있고(AGR), 아르기닌에 대한 축퇴성 코돈(MGN)은 어떤 경우에는 세린을 코드화할 수 있다(AGY). 유사한 관계가 페닐알라닌과 로이신을 코드화하는 코돈들 사이에서도 존재한다. 그로써, 축퇴성 서열에 의해 포함된 일부의 폴리뉴클레오티드는 변이 아미노산 서열을 코드화할 수 있지만, 당업자는 그러한 변이 서열을 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 참조함으로써 쉽게 확인할 수 있다. 변이 서열은 본원에서 설명되는 바와 같이 기능성에 대해 쉽게 시험될 수 있다.Those skilled in the art will appreciate that some ambiguity is introduced in determining the degenerate codons representing all possible codons encoding each amino acid. For example, degenerate codons for serine (WSN) can in some cases encode arginine (AGR) and degenerate codons for arginine (MGN) can encode serine in some cases (AGY). Similar relationships exist between codons encoding phenylalanine and leucine. As such, some polynucleotides comprised by degenerate sequences can encode variant amino acid sequences, but one of ordinary skill in the art can readily identify such variant sequences by referring to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Variant sequences can be easily tested for functionality as described herein.
본 발명의 바람직한 구체예내에서 분리된 폴리뉴클레오티드는 스트린전시 조건하에서 SEQ ID NO: 1의 유사한 크기의 영역, 또는 그것에 상보적인 서열에 하이브리드화할 것이다. 일반적으로, 스트린전시 조건은 규정된 이온 강도 및 pH 에서 특이한 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 더 낮게 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 정확하게 매치된 프로브에 하이브리드화하는 온도(규정된 이온 강도 및 pH에서)이다. 전형적인 스트린전시 조건은 염농도가 최소한 약 0.02M, pH 7 이고 온도가 최소한 약 60℃인 조건이다.Isolated polynucleotides within preferred embodiments of the invention will hybridize to regions of similar size of SEQ ID NO: 1, or to sequences complementary thereto, under stringency conditions. In general, stringency conditions are selected to be about 5 ° C. lower than the thermal melting point (T m ) for specific sequences at defined ionic strengths and pH. T m is the temperature (at defined ionic strength and pH) at which 50% of the target sequence hybridizes to the exactly matched probe. Typical stringency conditions are salt concentrations of at least about 0.02M, pH 7 and temperatures of at least about 60 ° C.
상술된 바와 같이, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA를 포함한다. DNA 및 RNA를 분리하는 방법은 당해 기술 분야에 공지이다. 일반적으로 DNA가 다른 조직으로부터 RNA를 사용하여 제조될 수 있거나 또는 게놈 DNA로서 분리될 수 있음에도 불구하고, RNA는 위로부터 분리되는 것이 바람직하다. 총 RNA는 구아니딘 HCl 추출과 이어지는 CsCl 구배에서의 원심분리를 사용하여 제조될 수 있다[Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979]. 폴리 (A)+RNA는 아비브와 레더의 방법을 사용하여 총 RNA로부터 제조된다[Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412, 1972]. 상보적인 DNA(cDNA)는 공지된 방법들을 사용하여 폴리 (A)+RNA로부터 제조된다. 그런 다음 zsig33 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드가 예컨대 하이브리드화 또는 PCR에 의해 확인되고 분리된다.As mentioned above, isolated polynucleotides of the present invention include DNA and RNA. Methods of separating DNA and RNA are known in the art. In general, although DNA may be prepared using RNA from other tissues or may be isolated as genomic DNA, RNA is preferably isolated from the stomach. Total RNA can be prepared using guanidine HCl extraction followed by centrifugation in a CsCl gradient (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52-94, 1979). Poly (A) + RNA is prepared from total RNA using the methods of Aviv and Leather [Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412, 1972. Complementary DNA (cDNA) is prepared from poly (A) + RNA using known methods. The polynucleotide encoding the zsig33 polypeptide is then identified and separated, such as by hybridization or PCR.
본 발명은 추가로 다른 종으로부터의 대응 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 제공한다(오르토로그). 특히 관심있는 것은 쥐과, 래트, 돼지, 양, 소과, 개과, 고양이과, 말 및 다른 영장류 단백질을 포함하여, 다른 포유동물 종으로부터 얻어지는 zsig33 폴리펩티드이다. 사람 단백질의 오르토로그는 본 발명에 의해 제공되는 정보 및 조성을 종래의 클로닝 기법과 조합하여 사용하여 클론될 수 있다. 예를 들어, cDNA는 단백질을 발현하는 조직 또는 세포 유형으로부터 얻어진 mRNA를 사용하여 클론될 수 있다. mRNA의 적당한 공급원은 노던 블롯을 본원에 개시된 서열로부터 디자인된 프로브로 프로빙함으로써 확인될 수 있다. 그런 다음 라이브러리가 세포주의 양성 조직의 mRNA로부터 제조된다. 그런 다음 zsig33 오르토로그-코드화 cDNA가 다양한 방법에 의해, 예컨대 완전 또는 부분적인 사람 cDNA를 사용하여 또는 개시된 서열을 토대로 한 하나 또는 그 이상의 축퇴성 프로브 세트를 사용하여 프로빙함에 의해 분리될 수 있다. cDNA는 또한 중합효소연쇄반응, 또는 PCR [Mullis, 미국 특허 제 4,683,202 호]을 사용하여, 본원에 개시된 서열로부터 디자인된 프라이머를 사용하여 클론될 수 있다. 추가의 방법내에서, cDNA 라이브러리는 숙주 세포를 형질전환시키기 위하여(세포 또는 바이러스 경유) 사용될 수 있고, 관심의 cDNA의 발현은 zsig33에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 유사한 기법이 또한 게놈 클론을 분리하는데 적용될 수 있다.The invention further provides corresponding polypeptides and polynucleotides from other species (orthologs). Of particular interest are zsig33 polypeptides obtained from other mammalian species, including murine, rat, pig, sheep, bovine, canine, feline, horse and other primate proteins. Orthologs of human proteins can be cloned using the information and composition provided by the present invention in combination with conventional cloning techniques. For example, cDNA can be cloned using mRNA obtained from a tissue or cell type that expresses a protein. Suitable sources of mRNA can be identified by probing the northern blot with a probe designed from the sequences disclosed herein. The library is then prepared from the mRNA of the positive tissue of the cell line. The zsig33 ortholog-encoded cDNA can then be separated by various methods, such as by probing using complete or partial human cDNA or using one or more degenerate probe sets based on the disclosed sequences. cDNA can also be cloned using primers designed from the sequences disclosed herein, using polymerase chain reaction, or PCR [Mullis, US Pat. No. 4,683,202]. Within further methods, cDNA libraries can be used to transform host cells (via cells or viruses), and expression of cDNA of interest can be detected using an antibody against zsig33. Similar techniques can also be applied to isolate genomic clones.
당업자들은 SEQ ID NO: 1에 표시된 서열, 및 그로써 코드화된 폴리펩티드가 사람 zsig33 유전자 및 폴리펩티드의 단일한 대립형질을 나타내고, 대립성 변이 및 대체 스플라이싱이 일어날 것으로 예상된다는 것을 인지할 것이다. 대립성 변이체는 표준 과정에 따라 상이한 개체로부터 얻어지는 cDNA 또는 게놈성 라이브러리를 프로브함으로써 클론될 수 있다. 사일런트 돌연변이를 함유하고 있는 것들과 그 돌연변이가 아미노산 서열 변화를 유발시킨 것들을 포함하여, SEQ ID NO: 1에 표시된 DNA 서열의 대립성 변이체는, 그 단백질이 SEQ ID NO: 2의 대립성 변이의 생성물인 한 본 발명의 범주에 포함된다.Those skilled in the art will appreciate that the sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the polypeptides encoded thereby, represent a single allele of the human zsig33 gene and polypeptide, and allelic variation and replacement splicing are expected. Allelic variants can be cloned by probes of cDNA or genomic libraries from different individuals according to standard procedures. Allelic variants of the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1, including those containing silent mutations and those in which the mutation caused amino acid sequence changes, are those products of which the protein is an allelic variation of SEQ ID NO: 2 It is included within the scope of the present invention.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 2의 폴리펩티드 및 그것들의 오르토로그에 실질적으로 상동하는 분리된 zsig33 폴리펩티드를 제공한다. 본원에서 용어 "실질적으로 상동하는"은 SEQ ID NO: 2에 표시된 서열 또는 그것의 오르토로그와 50%, 바람직하게는 60%, 보다 바람직하게는 최소한 80%의 서열 동일성을 가지고 있는 폴리펩티드를 나타내기 위하여 사용된다. 그러한 폴리펩티드들은 SEQ ID NO: 2 또는 그것의 오르토로그와 바람직하게는 최소한 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일할 것이다. % 서열 동일성은 종래 방법으로 측정된다[예컨대 Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603-616, 1986 및 Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992]. 간단히 설명하면, 두 개의 아미노산 서열이 하기의 표 3에 나타낸 바와 같이 10의 갭 오프닝 페널티, 1의 갭 연장 페널티, 및 하인코프와 하인코프의 "블로섬 62" 경과기록 매트릭스를 사용하여 배열 경과기록을 최적화하기 위하여 배열된다(아미노산들은 표준 한문자 코드로 나타낸다).The invention also provides an isolated zsig33 polypeptide that is substantially homologous to the polypeptides of SEQ ID NO: 2 and their orthologs. The term “substantially homologous” herein refers to a polypeptide having a sequence identity of 50%, preferably 60%, more preferably at least 80% with the sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or an ortholog thereof To be used. Such polypeptides will preferably be at least 90%, most preferably at least 95% identical to SEQ ID NO: 2 or an ortholog thereof. % Sequence identity is determined by conventional methods. See, eg, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-616, 1986 and Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992]. Briefly, two amino acid sequences were used to record sequence progression using a gap opening penalty of 10, a gap extension penalty of 1, and Heinkov and Heincorp's "bloom 62" history matrix, as shown in Table 3 below. Arranged for optimization (amino acids are represented by standard single letter codes).
그런 다음% 동일성이 다음과 같이 계산된다:Then% identity is calculated as:
폴리뉴클레오티드 분자의 서열 동일성은 상술된 바와 같은 비율을 사용하여 유사한 방법에 의해 측정된다.Sequence identity of the polynucleotide molecules is measured by a similar method using the proportions as described above.
실질적으로 상동하는 단백질 및 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 가지는 것을 특징으로 한다. 이들 변화는 바람직하게는 미미한 성질의 것이다, 즉 보존성 아미노산 치환(하기의 표 4 참조) 및 단백질 또는 폴리펩티드의 폴딩 또는 활성에 유의할만한 영향을 주지 않는 다른 치환; 작은 결실, 전형적으로 하나 내지 약 30 아미노산의 결실; 및 작은 아미노- 또는 카르복실-말단 연장, 예컨대 아미노-말단 메티오닌 잔기, 약 20 내지 25 잔기의 작은 링커 펩티드, 또는 정제를 용이하게 하는 작은 연장(친화성 태그), 예컨대 폴리히스티딘 트랙, 단백질 A [Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991], 글루타티온 S 트란스페라제 [Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988], 말토오스 결합 단백질[Kellerman and Ferenci, Methods Enzymol. 90:459-463, 1982; Guan et al., Gene 67:21-30, 1987], 티오레독신, 유비퀴틴, 셀룰로오스 결합 단백질, T7 중합효소, 또는 다른 항원성 에피토프 또는 결합 도메인이다[Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991 참조]. 친화성 태그를 코드화하는 DNA 들은 구매가능하다(예컨대 Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA).Substantially homologous proteins and polypeptides are characterized by having one or more amino acid substitutions, deletions or additions. These changes are preferably of insignificant nature, ie conservative amino acid substitutions (see Table 4 below) and other substitutions that do not significantly affect the folding or activity of the protein or polypeptide; Small deletions, typically one to about 30 amino acids; And small amino- or carboxyl-terminal extensions, such as amino-terminal methionine residues, small linker peptides of about 20 to 25 residues, or small extensions (affinity tags) that facilitate purification, such as polyhistidine tracks, protein A [ Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991, glutathione S transferase (Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988), maltose binding protein [Kellerman and Ferenci, Methods Enzymol. 90: 459-463, 1982; Guan et al., Gene 67: 21-30, 1987], thioredoxin, ubiquitin, cellulose binding protein, T7 polymerase, or other antigenic epitope or binding domain [Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991]. DNAs encoding affinity tags are commercially available (eg Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, Mass.).
20개의 표준 아미노산 외에, 비-표준 아미노산(예컨대 4-히드록시프롤린, 6-N-메틸라이신, 2-아미노이소부티르산, 이소발린 및 α-메틸 세린)도 zsig33의 아미노산 잔기대신 치환될 수 있다. 제한된 수의 비보존성 아미노산, 유전자 코드에 의해 코드화되지 않는 아미노산, 및 비천연 아미노산들이 zsig33 아미노산 잔기대신 치환될 수 있다. "비천연 아미노산"은 단백질 합성후에 변형되었고 및/또는 그것들의 측쇄(들)에서 표준 아미노산의 그것과 상이한 화학적 구조를 가지고 있다. 비천연 아미노산은 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 바람직하게는 구매가능하며, 예를 들면 피페콜산, 티아졸리딘 카르복실산, 데히드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 및 3,3-디메틸프롤린이 있다.In addition to the twenty standard amino acids, non-standard amino acids (such as 4-hydroxyproline, 6-N-methyllysine, 2-aminoisobutyric acid, isovalin and α-methylserine) may also be substituted for the amino acid residues of zsig33. A limited number of non-conservative amino acids, amino acids not encoded by the genetic code, and non-natural amino acids can be substituted instead of zsig33 amino acid residues. "Non-natural amino acids" have been modified after protein synthesis and / or have a chemical structure different from that of standard amino acids in their side chain (s). Non-natural amino acids may be chemically synthesized or are preferably commercially available, for example pipecolic acid, thiazolidine carboxylic acid, dehydroproline, 3- and 4-methylproline, and 3,3-dimethyl There is proline.
본 발명의 zsig33 폴리펩티드의 필수 아미노산은 부위특이적 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발과 같은 당해기술분야에 공지되어 있는 과정을 따라 확인될 수 있다[Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085, 1989]. 상기 후자의 기법에서는, 단일한 알라닌 돌연변이가 분자의 매 잔기마다 도입되며, 그 결과의 돌연변이 분자는 분자의 활성에 중요한 아미노산 잔기를 확인하기 위하여 생물학적 활성(예컨대 위장 세포 수축성의 자극, 영양 흡수의 조절 및/또는 소화 효소의 분비)에 대하여 시험된다[Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699-4708, 1996]. 리간드-수용체 상호작용의 부위는 또한 예컨대 핵자기 공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성 표지화와 같은 기법들에 의해 측정되는 바와 같이, 추정되는 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 조합하여 구조의 물리적 분석에 의해 측정될 수 있다[de Vos et al., Science 255:306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992]. 필수 아미노산의 동일성은 또한 장관-뇌 펩티드 호르몬의 글루카곤-세크레틴 패밀리의 관련된 구성원들과의 상동성의 분석으로부터 추론될 수 있다.Essential amino acids of the zsig33 polypeptide of the invention can be identified following procedures known in the art such as site specific mutagenesis or alanine-scanning mutagenesis [Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085, 1989]. . In this latter technique, a single alanine mutation is introduced at every residue of the molecule, and the resulting mutant molecule is biologically active (eg, stimulates gastrointestinal cell contractility, modulates nutritional uptake, to identify amino acid residues important for the activity of the molecule). And / or secretion of digestive enzymes) (Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996. Sites of ligand-receptor interactions can also be determined by physical analysis of the structure in combination with putative mutations of putative contact site amino acids, eg, as measured by techniques such as nuclear magnetic resonance, crystallography, electron diffraction or photoaffinity labeling. De Vos et al., Science 255: 306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Identity of essential amino acids can also be deduced from analysis of homology with related members of the glucagon-secretin family of intestinal-brain peptide hormones.
다중 아미노산 치환은 돌연변이유발 및 스크리닝의 공지된 방법, 예컨대 라이드하르-올슨과 사우어 또는 보위와 사우어에 의해 문헌에 발표된 것과 같은 방법을 사용하여 만들어지고 시험될 수 있다[Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241:53-57, 1988; Bowie and Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989]. 간단히 설명하면, 이들 저자들은 폴리펩티드의 둘 또는 그 이상의 위치를 동시에 무작위화하고, 기능적 폴리펩티드에 대해 선택한 후, 돌연변이된 폴리펩티드를 서열화하여 각 위치에서의 치환을 가능하게 하는 스펙트럼을 결정하는 방법을 발표하였다. 사용될 수 있는 다른 방법으로는 파지 디스플레이[예컨대 Lowman et al., Biochem. 30:10832-10837, 1991; Ladner et al., 미국 특허 제 5,223,409 호; Huse, WIPO 공보 WO 92/06204] 및 영역-특정 돌연변이유발 [Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988].Multi-amino acid substitutions can be made and tested using known methods of mutagenesis and screening, such as those published in the literature by Reidhar-Olson and Sauer or Bowie and Sauer. Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241: 53-57, 1988; Bowie and Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989]. In brief, these authors have presented a method for randomizing two or more positions of a polypeptide simultaneously, selecting for functional polypeptides, and then sequencing the mutated polypeptide to determine the spectra that allow substitution at each position. . Other methods that can be used include phage display (eg, Lowman et al., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner et al., US Pat. No. 5,223,409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204 and region-specific mutagenesis [Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988].
상기에서 언급된 바와 같은 돌연변이유발법은 숙주 세포에서 클론되고 돌연변이된 폴리펩티드의 활성을 검출하기 위한 큰 처리량의 자동화된 스크리닝 방법과 조합될 수 있다. 활성 폴리펩티드(예컨대 위장 세포 수축성의 자극, 영양 흡수의 조절 및/또는 소화 효소의 분비)를 코드화하는 돌연변이된 DNA 분자들은 현대적인 장비를 사용하여 숙주 세포로부터 회수되어 신속하게 서열화될 수 있다. 이들 방법으로 관심의 폴리펩티드의 개별적인 아미노산 잔기들의 중요성을 신속하게 측정하는 것이 가능해졌고, 미지의 구조의 폴리펩티드에도 적용할 수 있게 되었다.Mutagenesis as mentioned above can be combined with large throughput automated screening methods to detect the activity of cloned and mutated polypeptides in a host cell. Mutated DNA molecules encoding active polypeptides (such as stimulation of gastrointestinal cell contractility, regulation of nutrient uptake and / or secretion of digestive enzymes) can be recovered from the host cell using modern equipment and rapidly sequenced. These methods make it possible to quickly determine the importance of the individual amino acid residues of a polypeptide of interest and to apply it to a polypeptide of unknown structure.
상기에서 언급된 방법들을 사용하면, 당업자는 SEQ ID NO: 2의 잔기 24 에서 37 까지 또는 그것의 대립성 변이체에 실질적으로 상동하고 야생형 단백질의 성질을 보유하고 있는 다양한 폴리펩티드를 확인 및/또는 제조할 수 있다. 그러한 폴리펩티드들은 또한 일반적으로 논의된 바왁 같은 추가의 폴리펩티드 절편을 포함할 수 있다.Using the methods mentioned above, those skilled in the art will be able to identify and / or prepare a variety of polypeptides that are substantially homologous to residues 24 to 37 of SEQ ID NO: 2 or to allelic variants thereof and retain the properties of the wild type protein. Can be. Such polypeptides may also include additional polypeptide fragments, such as Wawak, as generally discussed.
본 발명의 폴리펩티드는 완전한 길이의 단백질 및 그것의 단편들을 포함하여, 종래의 기법에 따라 유전학적으로 처리된 숙주 세포에서 제조될 수 있다. 적당한 숙주 세포는 외인성 DNA로 형질전환되어 배양중에 성장할 수 있는 그런 세포 유형의 것들로, 예를 들면 박테리아, 진균 세포, 및 배양된 고등 진핵 세포를 들 수 있다. 진핵 세포, 특히 다핵세포 유기체의 배양된 세포가 바람직하다. 클론된 DNA 분자를 조작하고 외인성 DNA를 다양한 숙주 세포안에 도입시키는 기법들은 문헌에 기재되어 있다[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, and Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987].Polypeptides of the invention can be produced in host cells genetically treated according to conventional techniques, including full length proteins and fragments thereof. Suitable host cells are those of those cell types that can be transformed with exogenous DNA and grown in culture, including, for example, bacteria, fungal cells, and cultured higher eukaryotic cells. Preferred are eukaryotic cells, especially cultured cells of multinucleated organisms. Techniques for manipulating cloned DNA molecules and introducing exogenous DNA into various host cells are described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, and Ausubel et al., (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987].
일반적으로, 본 발명의 zsig33 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열은 발현 벡터내에서 그것의 발현에 필요한 다른 유전적 구성요소, 예컨대 전사 프로모터 및 터미네이터에 작동가능하게 연결된다. 당업자들이라면 특정 시스템내에서 선택가능한 마커들이 별도의 벡터상에 제공될 수 있고, 외인성 DNA의 복제가 숙주 세포 게놈안으로의 통합에 의해 제공될 수 있을 것으로 인지하겠지만, 벡터는 또한 통상적으로 하나 또는 그 이상의 선택가능한 마커와 하나 또는 그 이상의 복제 기원을 함유할 것이다. 프로모터, 터미네이터, 선택가능한 마커, 벡터 및 다른 구성요소의 선택은 당해 기술분야의 통상적인 수준 내에서의 기본적인 디자인의 문제이다. 많은 그러한 구성요소가 문헌에 설명되어 있고 상업적인 공급자들로부터 구매가능하다.In general, the DNA sequence encoding the zsig33 polypeptide of the invention is operably linked to other genetic components, such as transcriptional promoters and terminators, required for its expression in an expression vector. Those skilled in the art will recognize that selectable markers within a particular system may be provided on a separate vector, and that replication of exogenous DNA may be provided by integration into the host cell genome, but the vector is also typically one or more It will contain a selectable marker and one or more origins of replication. The selection of promoters, terminators, selectable markers, vectors and other components is a matter of basic design within conventional levels in the art. Many such components are described in the literature and are available from commercial suppliers.
zsig33 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로에 특정하기 위하여, 분비 신호 서열(또한 리더 서열, 프레프로 서열, 또는 프레 서열로도 알려져 있음)이 발현 벡터에 제공된다. 분비 신호 서열은 zsig33 폴리펩티드의 것일 수 있으며, 또는 다른 분비된 단백질(예컨대 t-PA)로부터 유도되거나 또는 새롭게 합성될 수도 있다. 분비 신호 서열은 비록 특정 신호 서열이 관심의 DNA 서열의 그밖의 곳에 위치할 수도 있지만, 통상적으로는 관심의 프로펩티드를 코드화하는 DNA 서열의 5' 에 위치한다[예컨대 Welch et al., 미국 특허 제 5,037,743 호; Holland et al., 미국 특허 제 5,143,830 호 참조].To specify a zsig33 polypeptide in the secretory pathway of a host cell, a secretory signal sequence (also known as a leader sequence, prepro sequence, or pre sequence) is provided in the expression vector. The secretory signal sequence may be of zsig33 polypeptide, or may be derived from other secreted proteins (eg t-PA) or newly synthesized. Secretory signal sequences are typically located 5 'of the DNA sequence encoding the propeptide of interest, although the particular signal sequence may be located elsewhere in the DNA sequence of interest (eg, Welch et al., US Pat. 5,037,743; Holland et al., US Pat. No. 5,143,830.
배양된 포유동물 세포는 또한 본 발명내에서 바람직한 숙주이다. 외인성 DNA를 포유동물 숙주 세포안에 도입시키기 위한 방법으로는 인산 칼슘-매개 형질전환 [Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973], 일렉트로포레이션 [Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982], DEAE-덱스트란 매개 형질전환 [Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987], 리포솜-매개 형질전환[Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993], 및 바이러스 벡터 [A. Miller and G. Rosman, Biotechniques 7:980-990, 1989; Q. Wang and M. Finer, Nature Med. 2:714-716, 1996]가 있다. 배양된 포유동물 세포에서의 재조합 폴리펩티드의 제조도 또한 공개되어 있다[예컨대 Levinson et al., 미국 특허 제 4,713,339 호; Hagen et al., 미국 특허 제 4,784,950 호; Palmiter et al., 미국 특허 제 4,579,821 호; 및 Ringold, 미국 특허 제 4,656,134 호]. 바람직한 배양된 포유동물 세포로는 COS-1(ATCC No. CRL 1650), COS-7(ATCC No. CRL 1651), BHK 570(ATCC No. CRL 10314), 293(ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) 및 차이니즈 햄스터 난소 세포주(예컨대 CHO-K1, ATCC No. CCL 61)가 있다. 추가의 적당한 세포주는 당해 기술분야에 공지이고 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(Rockville, Maryland, USA)과 같은 공개 기탁기관으로부터 활용가능하다. 일반적으로, 강력한 전사 프로모터, 예컨대 SV-40 또는 사이토메갈로바이러스로부터의 프로모터가 바람직하다(미국 특허 제 4,956,288 호 참조). 다른 적당한 프로모터로는 메탈로티오네인 유전자로부터 유도된 것들(미국 특허 제 4,579,821 호 및 4,601,978 호) 및 아데노바이러스 주요 후기 프로모터가 있다.Cultured mammalian cells are also preferred hosts within the present invention. Methods for introducing exogenous DNA into mammalian host cells include calcium phosphate-mediated transformation [Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973], electroporation [Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982], DEAE-dextran mediated transformation [Ausubel et al., Eds. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987], liposome-mediated transformation [Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993], and viral vectors [A. Miller and G. Rosman, Biotechniques 7: 980-990, 1989; Q. Wang and M. Finer, Nature Med. 2: 714-716, 1996. The preparation of recombinant polypeptides in cultured mammalian cells is also disclosed (see, eg, Levinson et al., US Pat. No. 4,713,339; Hagen et al., US Pat. No. 4,784,950; Palmiter et al., US Pat. No. 4,579,821; And Ringold, US Patent 4,656,134. Preferred cultured mammalian cells include COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et. al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) and Chinese hamster ovary cell lines (eg CHO-K1, ATCC No. CCL 61). Additional suitable cell lines are known in the art and are available from publicly deposited institutions such as the American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, USA). In general, strong transcriptional promoters, such as those from SV-40 or cytomegalovirus, are preferred (see US Pat. No. 4,956,288). Other suitable promoters include those derived from metallothionein genes (US Pat. Nos. 4,579,821 and 4,601,978) and adenovirus major late promoters.
그 안에 외래 DNA가 삽입되는 배양된 포유동물 숙주 세포를 선택하기 위하여 일반적으로 약물 선택이 사용된다. 그러한 세포들은 통상 "형질전환체"로 언급된다. 선택제제의 존재하에 배양되고 관심의 유전자를 그들의 자손으로 계대시킬 수 있는 세포들은 "안정한 형질전환체"로 언급된다. 바람직한 선택가능한 마커는 항생물질 네오마이신에 대한 내성을 코드화하는 유전자이다. 선택은 네오마이신-유형 약물, 예컨대 G-418 등의 존재하에 수행된다. 선택 시스템은 또한 관심의 유전자의 발현 수준을 증가시키기 위해서도 사용될 수 있으며, 이런 증가 과정은 "증폭" 으로 언급된다. 증폭은 형질전환체를 낮은 수준의 선택 제제의 존재하에 배양시킨 후, 도입된 유전자의 생성물을 고수준으로 생성하는 세포를 선택하기 위하여 선택 제제의 양을 증가시킴으로써 수행된다. 바람직한 증폭가능한 선택성 마커는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 디히드로폴레이트 산화환원효소이다. 다른 약물 내성 유전자들, 예컨대 하이그로마이신 내성, 다중-약물 내성, 퓨로마이신 아세틸트란스페라제가 또한 사용될 수 있다. 변경된 표현형을 도입시키는 또 다른 마커, 예컨대 녹색 형광 단백질, 또는 세포 표면 단백질, 예컨대 CD4, CD8, 제 I 부류의 MHC, 태반의 알칼리 포스파타제가 형질전환된 세포를 형질전환되지 않은 세포들로부터, FACS 분류법 또는 자기 비이드 분리 기법과 같은 수단에 의해 분류하기 위하여 사용될 수 있다.Drug selection is generally used to select cultured mammalian host cells into which foreign DNA is inserted. Such cells are commonly referred to as "transformants". Cells cultured in the presence of a selection agent and capable of passage of the gene of interest to their offspring are referred to as "stable transformants". Preferred selectable markers are genes encoding resistance to the antibiotic neomycin. The selection is carried out in the presence of neomycin-type drugs such as G-418 and the like. Selection systems can also be used to increase the expression level of the gene of interest, which process is referred to as "amplification." Amplification is performed by culturing the transformant in the presence of low levels of the selection agent and then increasing the amount of selection agent to select cells that produce high levels of the product of the introduced gene. Preferred amplifiable selectable markers are dihydrofolate oxidoreductases that confer resistance to methotrexate. Other drug resistance genes such as hygromycin resistance, multi-drug resistance, puromycin acetyltransferase may also be used. FACS sorting from cells that have not been transformed with another marker that introduces an altered phenotype, such as a green fluorescent protein, or a cell surface protein such as CD4, CD8, class I MHC, placental alkaline phosphatase Or for sorting by means such as magnetic bead separation techniques.
식물 세포, 곤충 세포 및 조류 세포를 포함한 다른 고등 진핵 세포들도 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 식물 세포에서 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)를 사용하는 것은 싱카 등에 의해 재검토되었다[Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987]. 곤충 세포의 형질전환 및 그 안에서의 외래 폴리펩티드의 생성은 문헌에 발표되어 있다[Guarino et al., 미국 특허 제 5,162,222 호 및 WIPO 공보 WO 94/06463 호]. 곤충 세포들은 통상 오토그라파 캘리포르니카 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV)로부터 유도된 재조합 바큘로바이러스로 감염될 수 있다. zsig33 폴리펩티드를 코드화하는 DNA는 하기의 두가지 방법중 하나에 의해 AcNPV 폴리헤드린 유전자 코드화 서열 대신에 바큘로바이러스 게놈안으로 삽입된다. 첫 번째 방법은 야생형 AcNPV 와 AcNPV 서열에 의해 플랭킹된 zsig33 을 함유하고 있는 전달 벡터 사이의 상동하는 DNA 재조합의 전통적인 방법이다. 적당한 곤충 세포, 예컨대 SF9 세포가 야생형 AcNPV로 감염되고 AcNPV 폴리헤드린 유전자 프로모터, 터미네이터, 및 플랭킹 서열에 작동가능하게 연결된 zsig33 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있는 전달 벡터로 형질전환된다[King, L.A. and Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; 및 Richardson, C.D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995]. 곤충 세포안에서의 자연적인 재조합 결과 폴리헤드린 프로모터에 의해 작동되는 zsig33 을 함유하는 재조합 바큘로바이러스가 생성될 것이다. 재조합 바이러스 스톡은 당해기술분야에 통상적으로 사용되는 방법에 의해 만들어진다.Other higher eukaryotic cells, including plant cells, insect cells, and algal cells, can also be used as hosts. The use of Agrobacterium rhizogenes as a vector for expressing genes in plant cells has been reviewed by Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987]. Transformation of insect cells and the generation of foreign polypeptides therein are disclosed in the literature (Guarino et al., US Pat. No. 5,162,222 and WIPO Publication WO 94/06463). Insect cells can usually be infected with recombinant baculovirus derived from Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). The DNA encoding the zsig33 polypeptide is inserted into the baculovirus genome in place of the AcNPV polyhedrin gene coding sequence by one of the following two methods. The first method is the traditional method of homologous DNA recombination between a wild type AcNPV and a transfer vector containing zsig33 flanked by an AcNPV sequence. Suitable insect cells, such as SF9 cells, are infected with a wild type AcNPV and transformed with a delivery vector comprising a zsig33 polynucleotide operably linked to the AcNPV polyhedrin gene promoter, terminator, and flanking sequences [King, L.A. and Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman &Hall; O'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; And Richardson, C.D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995]. Natural recombination in insect cells will result in recombinant baculovirus containing zsig33 which is driven by the polyhedrin promoter. Recombinant viral stock is made by methods commonly used in the art.
재조합 바큘로바이러스를 제조하는 두 번째 방법은 룩코우 등에 의해 설명된 트랜스포존-기초 시스템을 활용한다[Luckow, V.A., et al., J. Virol. 67:4566-4579, 1993]. 이 시스템은 Bac-to-Bac 키트로 시판된다(Life Technologies, Rockville, MD). 이 시스템은 "백미드(bacmid)"로 언급되는 큰 플라스미드로서 대장균안에 유지된 바큘로바이러스 게놈안으로 zsig33 폴리펩티드를 코드화하는 DNA를 이동시키기 위한 Tn7 트랜스포존을 함유하고 있는 전달 벡터인 pFastBaclTM(Life Technologies) 을 활용한다. pFastBaclTM전달 벡터는 zsig33의 경우에 관심의 유전자의 발현을 유도하기 위하여 AcNPV 폴리헤드린 프로모터를 활용한다. 그러나, pFastBaclTM은 상당한 정도로 변형될 수 있다. 폴리헤드린 프로모터는 제거되고 바큘로바이러스 감염에서 초기에 발현되는 바큘로바이러스 염기성 단백질 프로모터(또한 Pcor, p6.9 또는 MP 프로모터로도 알려져 있음)로 치환될 수 있으며, 분비된 단백질을 발현하는데 유익한 것으로 알려져 있다[Hill-Perkins, M.S. 및 Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Bonning, B.C. et al., J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994; 및 Chazenbalk, G.D. and Rapoport, B., J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995]. 그러한 전달 벡터 구성물에서, 짧은 또는 긴 버전의 염기성 단백질 프로모터가 사용될 수 있다. 더욱이, 천연 zsig33 분비 신호 서열을 곤충 단백질로부터 유도된 분비 신호 서열로 대체하는 전달 벡터가 구성될 수 있다. 예를 들어, 엑디스테로이드 글루코실트란스페라제(EGT), 꿀벌 멜리틴(Invitrogen, Carlsbad, CA), 또는 바큘로바이러스 gp67(PharMingen, San Diego, CA)로부터 얻어지는 분비 신호 서열이 천연 zsig33 분비 신호 서열을 대체하기 위한 구성물에서 사용될 수 있다. 또한, 전달 벡터는 발현된 zsig33 폴리펩티드의 C- 또는 N-말단에서 에피토프 태그, 예를 들면 Glu-Glu 에피토프 태그를 코드화하는 DNA와의 프레임내(in-frame) 융합을 포함할 수 있다[Graussenmeyer, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7952-7954, 1985]. 당해 기술분야에 공지된 기법을 사용하여, zsig33 을 함유하고 있는 전달 벡터가 대장균에 형질전환되고, 재조합 바큘로바이러스를 나타내는 차단된 lacZ 유전자를 함유하는 백미드에 대해 스크린된다. 재조합 바큘로바이러스 게놈을 함유하는 백미드 DNA는 통상적인 기법을 사용하여 분리되고, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포, 예컨대 Sf9 세포를 형질전환시키기 위하여 사용된다. zsig33 을 발현하는 재조합 바이러스는 계속해서 생성된다. 재조합 바이러스 스톡은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법들에 의해 만들어진다.The second method of producing recombinant baculovirus utilizes a transposon-based system described by Luxco et al. [Luckow, VA, et al., J. Virol. 67: 4566-4579, 1993. This system is commercially available as a Bac-to-Bac kit (Life Technologies, Rockville, MD). This system is pFastBacl ™ (Life Technologies), a transfer vector containing a Tn7 transposon for transferring DNA encoding the zsig33 polypeptide into the baculovirus genome maintained in E. coli as a large plasmid called "bacmid". To utilize. The pFastBacl ™ delivery vector utilizes the AcNPV polyhedrin promoter to induce the expression of the gene of interest in the case of zsig33. However, pFastBacl ™ can be modified to a significant extent. The polyhedrin promoter can be removed and replaced with a baculovirus basic protein promoter (also known as the Pcor, p6.9 or MP promoter) that is initially expressed in baculovirus infection and is beneficial for expressing secreted proteins. Known [Hill-Perkins, MS and Possee, RD, J. Gen. Virol. 71: 971-976, 1990; Bonning, BC et al., J. Gen. Virol. 75: 1551-1556, 1994; And Chazenbalk, GD and Rapoport, B., J. Biol. Chem. 270: 1543-1549, 1995. In such delivery vector constructs, short or long versions of the basic protein promoter can be used. Moreover, delivery vectors can be constructed that replace native zsig33 secretion signal sequences with secretory signal sequences derived from insect proteins. For example, the secretory signal sequence obtained from ecsteroid glucosyltransferase (EGT), bee melittin (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), Or baculovirus gp67 (PharMingen, San Diego, Calif.) Is a natural zsig33 secretion signal sequence. Can be used in constructs to replace In addition, the delivery vector may comprise in-frame fusion with DNA encoding an epitope tag, eg, a Glu-Glu epitope tag, at the C- or N-terminus of the expressed zsig33 polypeptide. Graussenmeyer, T et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952-7954, 1985. Using techniques known in the art, delivery vectors containing zsig33 are transformed into E. coli and screened for backmids containing blocked lacZ genes representing recombinant baculovirus. Backmid DNA containing the recombinant baculovirus genome is isolated using conventional techniques and used to transform Spodoptera frugiperda cells, such as Sf9 cells. Recombinant viruses expressing zsig33 continue to be produced. Recombinant virus stocks are made by methods commonly used in the art.
재조합 바이러스는 숙주 세포, 전형적으로 가을의 조밤나방류 유충인 스포돕테라 프루기페르다로부터 유도된 세포주를 감염시키기 위하여 사용된다[Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994]. 다른 적당한 세포주는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)로부터 유도된 High FiveoTM세포주(Invitrogen)이다(미국 특허 제 5,300,435 호 참조). 상업적으로 활용가능한 혈청-유리 배지가 세포를 성장시키고 유지시키기 위하여 사용된다. 적당한 배지는 Sf9 세포에 대해서는 Sf900 IITM(Life Technologies) 또는 ESF 921TM(발현 시스템)이고; T. ni 세포에 대해서는 Ex-cell0405TM(JRH Biosciences, Lenexa, KS) 또는 Express FiveOTM(Life Technologies)이다. 세포들은 대략 2 내지 5×105세포의 접종 밀도로부터 1 내지 2×106세포의 밀도로 성장되었고, 그 때에 재조합 바이러스 스톡이 0.1 내지 10의, 보다 전형적으로는 3에 가까운 감염 다중도(MOI)로 첨가된다. 재조합 바이러스-감염된 세포는 전형적으로 감염 후 12 내지 72시간에 재조합 zsig33 폴리펩티드를 생성하며, 그것을 변화하는 효율로 배지에 분비한다. 배양물은 통상 감염 후 48시간 후에 수확된다. 원심분리를 사용하여 배지로부터 세포가 분리된다(상층액). zsig33 폴리펩티드를 함유하고 있는 상층액은 통상 0.45 ㎛의 기공의 밀리포아 필터를 통하여 여과된다. 사용되는 과정의 일반적인 사항은 활용가능한 실험실 매뉴얼에 설명되어 있다[King, L.A. and Possee, R.D., 상기 동일; O'Reilly, D.R. et al., 상기 동일; Richardson, C.D., 상기 동일]. 계속해서 상층액으로부터 zsig33 폴리펩티드를 정제하는 것은 본원에서 설명되는 방법을 사용하여 이루어질 수 있다.Recombinant viruses are used to infect host cells, typically cell lines derived from the fall beetle larva larvae, Spodothera prugiferda [Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, DC, 1994]. Another suitable cell line is the High Fiveo ™ cell line (Invitrogen) derived from Trichoplusia ni (see US Pat. No. 5,300,435). Commercially available serum-free media is used to grow and maintain cells. Suitable medium is Sf900 II ™ (Life Technologies) or ESF 921 ™ (expression system) for Sf9 cells; For T. ni cells, it is Ex-cell0405 ™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) or Express FiveO ™ (Life Technologies). The cells were grown from an inoculation density of approximately 2-5 × 10 5 cells to a density of 1-2 × 10 6 cells, with recombinant virus stocks of 0.1-10, more typically near multiplicity of infection (MOI). ) Is added. Recombinant virus-infected cells typically produce recombinant zsig33 polypeptide 12-72 hours after infection and secrete it into the medium at varying efficiencies. Cultures are usually harvested 48 hours after infection. Cells are separated from the medium using centrifugation (supernatant). Supernatants containing zsig33 polypeptide are usually filtered through a 0.45 μm pore Millipore filter. General details of the procedures used are described in the available laboratory manuals [King, LA and Possee, RD, supra; O'Reilly, DR et al., Supra; Richardson, CD, same as above. Subsequently, the purification of the zsig33 polypeptide from the supernatant may be accomplished using the methods described herein.
효모 세포, 및 특히 사카로마이세스 속과 피치아 속의 세포를 포함한 진균류 세포가 또한 본 발명내에서, 예를 들면 zsig33 단편 또는 폴리펩티드 융합물을 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 외인성 DNA로 효모 세포를 형질전환시키고 그것으로부터 재조합 폴리펩티드를 제조하는 방법들은 예를 들면, 가와사키(Kawasaki)의 미국 특허 제 4,599,311 호; 가와사키 등의 미국 특허 제 4,931,373 호; 브레이크(Brake)의 미국 특허 제 4,870,008 호; 웰치(Welch) 등의 미국 특허 제 5,037,743 호; 및 머레이(Murray) 등의 미국 특허 제 4,845,075 호에 설명되어 있다. 형질전환된 세포들은 선택가능한 마커, 통상적으로는 약물 내성 또는 특정한 영양성분(예컨대 로이신)이 없을 때 성장하는 능력에 의해 측정된 표현형에 의해 선택된다. 효모에서 사용하기에 바람직한 벡터 시스템은 가와사키 등에 의해 발표된(미국 특허 제 4,931,373 호) POT1 벡터 시스템인데, 이것은 형질전환된 세포가 글루코오스-함유 배지에서의 성장에 의해 선택되는 것을 가능하게 한다. 효모에서 사용하기에 적당한 프로모터 및 터미네이터로는 당분해성 효소 유전자들로부터 유도된 것들[예컨대 가와사키의 미국 특허 제 4,599,311 호; 킹스만(Kingsman) 등의 미국 특허 제 4,615,974 호; 및 비터(Bitter)의 미국 특허 제 4,977,092 호] 및 알코올 탈수소효소 유전자들로부터 유도된 것들이 있다[미국 특허 제 4,990,446 호; 5,063,154 호; 5,139,936 호; 및 4,661,454 호 참조]. 다른 효모들, 예를 들면 한세뉼라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis), 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 귈러몬디(Pichia guillermondii), 피치아 메타놀리카(Pichia methnolica) 및 칸디다 말토사(Candida maltosa)에 대한 형질전환 시스템도 당해 기술분야에 공지이다[Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986 및 Cregg, 미국 특허 제 4,882,279 호]. 아스페르길루스 세포도 맥나이트 등의 방법을 따라 사용될 수 있다(McKnight et al., 미국 특허 제 4,935,349 호). 아크레모니움 크리소게눔(Acremonium chrysogenum)을 형질전환시키는 방법은 수미노(Sumino) 등에 의한 미국 특허 제 5,162,228 호에 설명되어 있다. 뉴로스포라(Neurospora)를 형질전환시키는 방법은 람보비츠(Lambowitz)의 미국 특허 제 4,486,533 호에 개시되어 있다.Yeast cells, and especially fungal cells, including cells of the genus Saccharomyces and Peachia, may also be used within the present invention, for example, to prepare zsig33 fragments or polypeptide fusions. Methods for transforming yeast cells with exogenous DNA and preparing recombinant polypeptides therefrom are described, for example, in US Pat. No. 4,599,311 to Kawasaki; U.S. Patent No. 4,931,373 to Kawasaki et al .; US Patent No. 4,870,008 to Brake; US Patent No. 5,037,743 to Welch et al .; And US Pat. No. 4,845,075 to Murray et al. Transformed cells are selected by a selectable marker, typically a phenotype measured by drug resistance or the ability to grow in the absence of a particular nutrient (such as leucine). A preferred vector system for use in yeast is the POT1 vector system published by Kawasaki et al. (US Pat. No. 4,931,373), which allows transformed cells to be selected by growth in glucose-containing medium. Suitable promoters and terminators for use in yeast include those derived from glycolytic enzyme genes (see, eg, US Pat. No. 4,599,311 to Kawasaki; U.S. Patent No. 4,615,974 to Kingsman et al .; And US Pat. No. 4,977,092 to Bitter and those derived from alcohol dehydrogenase genes (US Pat. No. 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936; And 4,661,454. Other yeasts such as Hansenula polymorpha, Shichizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis Transformation System for Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia guillermondii, Pichia methnolica and Candida maltosa Also known in the art [Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-3465, 1986 and Cregg, US Pat. No. 4,882,279. Aspergillus cells can also be used according to the method of McKnight et al. (McKnight et al., US Pat. No. 4,935,349). A method for transforming Acremonium chrysogenum is described in US Pat. No. 5,162,228 to Sumino et al. A method for transforming Neurospora is disclosed in US Pat. No. 4,486,533 to Lamborwitz.
형질전환된 또는 트랜스펙션된 숙주 세포들은 종래 과정에 따라 선택된 숙주 세포의 성장에 필요한 영양분 및 다른 성분들을 함유하고 있는 배양 배지에서 배양된다. 규정된 배지 및 복합 배지를 포함한 다양한 적당한 배지가 당해 기술분야에 공지이며, 일반적으로는 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민 및 미네랄을 포함한다. 배지에는 또한 성장 인자 또는 혈청과 같은 성분들이 필요에 따라 함유될 수 있다. 성장 배지는 예컨대 발현 벡터상에서 수행되거나 또는 숙주 세포안으로 함께 형질전환된 선택가능한 마커에 의해 상보되는 필수 영양분의 결핍 또는 약물 선택에 의해 첨가된 외래 DNA를 함유하고 있는 세포를 선택한다. 피치아 메타놀리카 세포는 적당한 탄소원, 질소원 및 미량의 영양성분 공급원을 포함하고 있는 배지중에서 약 25 내지 35 ℃의 온도에서 배양된다. 액체 배양물에는 종래의 수단, 예컨대 작은 플라스크의 진동 또는 발효기의 스파아징(sparging)에 의해 충분한 통기가 제공된다. 피치아 메타놀리카에 대한 바람직한 배양 배지는 YEPD(2% D-글루코오스, 2% BactoTM펩톤(Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% BactoTM효모 추출물(Difco Laboratories), 0.004% 아데닌 및 0.006%의 L-로이신)이다.Transformed or transfected host cells are cultured in a culture medium containing nutrients and other ingredients necessary for the growth of the selected host cell according to conventional procedures. Various suitable media are known in the art, including defined and complex media, and generally include carbon sources, nitrogen sources, essential amino acids, vitamins and minerals. The medium may also contain ingredients such as growth factors or serum as needed. The growth medium selects cells containing foreign DNA added by drug selection or lack of essential nutrients, for example, carried out on expression vectors or complemented by selectable markers transformed together into host cells. Peachia metanolica cells are cultured at a temperature of about 25-35 ° C. in a medium containing a suitable carbon source, nitrogen source and trace amounts of nutrient source. Liquid cultures are provided with sufficient aeration by conventional means, such as by vibrating small flasks or sparging the fermentor. Preferred culture media for Peachia metanolica include YEPD (2% D-glucose, 2% Bacto ™ peptone (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% Bacto ™ yeast extract (Difco Laboratories), 0.004% adenine and 0.006% L-leucine).
발현된 재조합 zsig33 폴리펩티드는 분획화 및/또는 종래의 정제 방법 및 배지를 사용하여 정제될 수 있다. 황산 암모늄 침전 및 산 또는 케이오트로프(chaotrope) 추출이 샘플의 분획화를 위해 사용될 수 있다. 예시적인 정제 단계로는 히드록시아파타이트, 크기 축출, FPLC 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 들 수 있다. 적당한 음이온 교환 배지로는 유도된 덱스트란, 아가로오스, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 특히 실리카 등이 있다. PEI, DEAE, QAE 및 Q 유도체가 바람직하며, DEAE 패스트-플로우 세파로오스(Pharmacia, Piscataway, NJ)가 특히 바람직하다. 예시적인 크로마토그래피 배지로는 페닐, 부틸, 또는 옥틸기로 유도화된 배지, 예를 들면 페닐-세파로오스 FF(Pharmacia), 토요퍼얼 부틸(Toyopearl butyl) 650(Toso Haas, Montgomeryville, PA), 옥틸-세파로오스(Pharmacia) 등; 또는 폴리아크릴계 수지, 예컨대 암버크롬(Amberchrom) CG 71(Toso Haas) 등이 있다. 적당한 고체 지지체로는 유리 비이드, 실리카-기초 수지, 셀룰로오스 수지, 아가로오스 비이드, 교차-결합된 아가로오스 비이드, 폴리스티렌 비이드, 교차결합된 폴리아크릴아미드 수지 등이 있으며, 이것들은 그것들이 사용되는 조건하에서 불용성이다. 이들 지지체는 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기, 히드록실기 및/또는 탄수화물 부분에 의한 단백질의 부착을 허용하는 반응성기로 변형될 수 있다. 커플링 화학의 실예로는 시아노겐 브로마이드 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 술프히드릴 활성화, 히드라지드 활성화, 및 카르보디이미드 커플링 화학을 위한 카르복실 및 아미노 유도체가 있다. 이들 및 다른 고체 배지는 당해 기술분야에서 공지이며 널리 사용되고 있고, 구매가능하다. 수용체 폴리펩티드를 지지체 배지에 결합시키는 방법은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 특정한 방법의 선택은 기본적인 디자인 문제이고 부분적으로는 선택된 지지체의 성질에 의해 결정된다[예컨대 Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988].The expressed recombinant zsig33 polypeptide can be purified using fractionation and / or conventional purification methods and media. Ammonium sulfate precipitation and acid or chaotrope extraction may be used for fractionation of the sample. Exemplary purification steps include hydroxyapatite, size extraction, FPLC, and reversed phase high performance liquid chromatography. Suitable anion exchange media include derived dextran, agarose, cellulose, polyacrylamide, especially silica and the like. PEI, DEAE, QAE and Q derivatives are preferred, DEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) is particularly preferred. Exemplary chromatography media include phenyl, butyl, or octyl group-induced media such as phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl- Sepharose (Pharmacia) and the like; Or polyacrylic resins such as Amberchrom CG 71 (Toso Haas). Suitable solid supports include glass beads, silica-based resins, cellulose resins, agarose beads, cross-linked agarose beads, polystyrene beads, cross-linked polyacrylamide resins, and the like. They are insoluble under the conditions in which they are used. These supports may be modified with reactive groups that allow the attachment of proteins by amino groups, carboxyl groups, sulfhydryl groups, hydroxyl groups and / or carbohydrate moieties. Examples of coupling chemistries include carboxyl and amino derivatives for cyanogen bromide activation, N-hydroxysuccinimide activation, epoxide activation, sulfhydryl activation, hydrazide activation, and carbodiimide coupling chemistry. . These and other solid media are known in the art, widely used, and commercially available. Methods of binding the receptor polypeptide to the support medium are well known in the art. The choice of a particular method is a fundamental design issue and partly determined by the nature of the chosen support (eg Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988).
본 발명의 폴리펩티드들은 작은 크기 및 낮은 pI의 사용에 의해 분리될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드는 낮은 pH 값에서 음이온 교환기에 결합할 수 있다. 다른 정제 방법으로는 렉틴 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 글리코실화된 단백질의 정제가 있다[Methods in Enzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp.529-539]. 또는 달리, 관심의 폴리펩티드의 융합물 및 친화성 태그(예컨대 폴리히스티딘, 말토오스-결합 단백질, 면역글로불린 도메인)가 정제를 용이하게 하기 위하여 구성될 수 있다.Polypeptides of the invention can be isolated by the use of small size and low pi. For example, the polypeptides of the present invention can bind anion exchangers at low pH values. Other purification methods include purification of glycosylated proteins by lectin affinity chromatography and ion exchange chromatography [Methods in Enzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529-539. Alternatively, a fusion and affinity tag (eg, polyhistidine, maltose-binding protein, immunoglobulin domain) of the polypeptide of interest can be configured to facilitate purification.
단백질 리폴딩(및 임의로 재산화) 과정이 유익하게 사용될 수 있다. 단백질은 바람직하게는 80% 이상의 순도, 보다 바람직하게는 95% 이상의 순도, 및 특히 바람직하게는 약학적으로 순수한 상태, 즉 오염 거대분자, 특히 다른 단백질 및 핵산의 견지에서 99.9% 이상의 순도로, 그리고 감염원성 및 발열성 병원체가 없도록 정제되는 것이 좋다. 바람직하게도, 정제된 단백질은 실질적으로 다른 단백질, 특히 동물 기원의 다른 단백질이 없다.Protein refolding (and optionally reoxidation) procedures can be advantageously used. The protein is preferably at least 80% pure, more preferably at least 95% pure, and particularly preferably in a pharmaceutically pure state, i.e. at least 99.9% pure in terms of contaminating macromolecules, in particular other proteins and nucleic acids, and Purified to be free of infectious and pyrogenic pathogens. Preferably, the purified protein is substantially free of other proteins, especially other proteins of animal origin.
zsig33 폴리펩티드 또는 그것의 단편들은 또한 화학적 합성을 통해 제조될 수 있다. zsig33 폴리펩티드는 단량체이거나 다량체일 수 있고; 글리코실화된 것이거나 그렇지 않을 수도 있으며; 페길레이트된 것이거나 그렇지 않을 수도 있고; 아미드화된 것이거나 또는 그렇지 않은 것일 수도 있으며; 술페이트된 것이거나 그렇지 않을 수도 있고; 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 예를 들면, zsig33 폴리펩티드는 또한 배타적인 고체상 합성법, 부분적인 고체상 방법, 단편 축합법 또는 고전적인 용액 합성법에 의해 합성될 수 있다. 폴리펩티드는 바람직하게는 고체상 펩티드 합성법, 예를 들면 문헌(Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963)에 기재되어 있는 바와 같은 방법에 의해 제조된다. 합성은 알파-아미노 말단에서 보호된 아미노산을 사용하여 수행된다. 가변성 측쇄를 가지고 있는 삼중기능성 아미노산은 또한 폴리펩티드의 조립중에 발생하는 원하지 않는 화학반응을 방해하기 위하여 적당한 기로 보호된다. 알파-아미노 보호기는 아미노-말단에서 후속적인 반응이 일어나도록 선택적으로 제거된다. 알파-아미노 보호기의 제거를 위한 조건은 측쇄의 보호기를 제거하지는 않는다.zsig33 polypeptide or fragments thereof may also be prepared via chemical synthesis. zsig33 polypeptide may be a monomer or a multimer; May or may not be glycosylated; May or may not be pegylated; May or may not be amidated; May or may not be sulfated; It may or may not include an initial methionine amino acid residue. For example, zsig33 polypeptides can also be synthesized by exclusive solid phase synthesis, partial solid phase methods, fragment condensation methods or classical solution synthesis methods. Polypeptides are preferably prepared by solid phase peptide synthesis, for example as described in Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963. Synthesis is performed using amino acids protected at the alpha-amino terminus. Trifunctional amino acids with variable side chains are also protected with suitable groups to prevent unwanted chemical reactions that occur during assembly of the polypeptide. Alpha-amino protecting groups are optionally removed such that subsequent reactions occur at the amino-terminus. Conditions for the removal of the alpha-amino protecting group do not remove the protecting group of the side chain.
알파-아미노 보호기는 단계식 폴리펩티드 합성 기술에 유용한 것으로 알려져 있다. 그러한 기로는 아실형 보호기(예컨대 포르밀, 트리플루오로아세틸, 아세틸), 아릴형 보호기(예컨대 비오티닐), 방향족 우레탄형 보호기(예컨대 벤질옥시카르보닐(Cbz), 치환된 벤질옥시카르보닐 및 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)), 지방족 우레탄형 보호기(예컨대 t-부틸옥시카르보닐(tBoc), 이소프로필옥시카르보닐, 시클로헥실옥시카르보닐) 및 알킬형 보호기(예컨대 벤질, 트리페닐메틸)가 있다. 바람직한 보호기는 tBoc 와 Fmoc이다.Alpha-amino protecting groups are known to be useful in staged polypeptide synthesis techniques. Such groups include acyl protecting groups (such as formyl, trifluoroacetyl, acetyl), aryl protecting groups (such as biotinyl), aromatic urethane protecting groups (such as benzyloxycarbonyl (Cbz), substituted benzyloxycarbonyl and 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), aliphatic urethane type protecting group (such as t-butyloxycarbonyl (tBoc), isopropyloxycarbonyl, cyclohexyloxycarbonyl) and alkyl type protecting group (such as benzyl Triphenylmethyl). Preferred protecting groups are tBoc and Fmoc.
선택된 측쇄 보호기는 커플링중에 무상으로 유지되어야 하며, 아미노-말단 보호기의 탈보호중에 또는 커플링이 진행되고 있는 상태중에 제거되어서는 안된다. 측쇄 보호기는 또한 최종 폴리펩티드를 변경시키지 않을 반응 조건을 사용하여 합성이 완료될 때 제거될 수 있어야 한다. tBoc 화학에서, 삼중기능성 아미노산에 대한 측쇄 보호기는 대부분이 벤질을 기초로 한 것이다. Fmoc 화학에서 측쇄 보호기는 대부분이 tert-부틸 또는 트리틸을 기초로 한 것이다.The selected side chain protecting group must remain free during coupling and must not be removed during deprotection of the amino-terminal protecting group or while the coupling is in progress. Side chain protecting groups should also be able to be removed when synthesis is complete using reaction conditions that will not alter the final polypeptide. In tBoc chemistry, the side chain protecting groups for trifunctional amino acids are mostly based on benzyl. Side chain protecting groups in Fmoc chemistry are mostly based on tert-butyl or trityl.
tBoc 화학에서, 바람직한 측쇄 보호기는 아르기닌에 대해서는 토실기이고, 아스파르트산에 대해서는 시클로헥실기이며, 시스테인에 대해서는 4-메틸벤질기( 및 아세트아미도메틸기)이고, 글루탐산, 세린 및 트레오닌에 대해서는 벤질기이며, 히스티딘에 대해서는 벤질옥시메틸기(및 디니트로페닐기)이고, 라이신에 대해서는 2-Cl-벤질옥시카르보닐기이며, 트립토판에 대해서는 포르밀기이고, 티로신에 대해서는 2-브로모벤질기이다. Fmoc 화학에서, 바람직한 측쇄 보호기는 아르기닌에 대해서는 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐(Pmc) 또는 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조퓨란-5-술포닐(Pbf)이고, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민 및 히스티딘에 대해서는 트리틸이며, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌 및 티로신에 대해서는 tert-부틸기이고, 라이신 및 트립토판에 대해서는 tBoc 기이다.In tBoc chemistry, preferred side chain protecting groups are tosyl groups for arginine, cyclohexyl groups for aspartic acid, 4-methylbenzyl groups (and acetamidomethyl groups) for cysteine, and benzyl groups for glutamic acid, serine and threonine Benzyloxymethyl group (and dinitrophenyl group) for histidine, 2-Cl-benzyloxycarbonyl group for lysine, formyl group for tryptophan, and 2-bromobenzyl group for tyrosine. In Fmoc chemistry, preferred side chain protecting groups are 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) or 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran for arginine -5-sulfonyl (Pbf), trityl for asparagine, cysteine, glutamine and histidine, tert-butyl group for aspartic acid, glutamic acid, serine, threonine and tyrosine and tBoc group for lysine and tryptophan.
포스포펩티드의 합성을 위해서는, 포스페이트기의 직접 또는 어셈블리-후 통합이 사용된다. 직접적인 통합 스트래티지에서, 세린, 트레오닌 또는 티로신상의 포스페이트기가 Fmoc 화학에서는 메틸, 벤질, 또는 tert-부틸기에 의해, tBoc 화학에서는 메틸, 벤질 또는 페닐기에 의해 보호될 수 있다. 포스페이트 보호가 없는 포스포티로신의 직접적인 통합이 또한 Fmoc 화학에서 사용될 수 있다. 어셈블리-후 통합 스트래티지에서는, 세린, 트레오닌 또는 티로신의 탈보호된 히드록실기가 디-tert-부틸-, 디벤질- 또는 디메틸-N,N'-디이소프로필포스포라미디트로 고체상위에 유도된 후, ter-부틸히드로퍼옥시드에 의해 산화된다.For the synthesis of phosphopeptides, direct or post-assembly integration of phosphate groups is used. In direct integrated strategy, the phosphate groups on serine, threonine or tyrosine can be protected by methyl, benzyl, or tert-butyl groups in Fmoc chemistry and by methyl, benzyl or phenyl groups in tBoc chemistry. Direct integration of phosphotyrosine without phosphate protection can also be used in Fmoc chemistry. In post-assembly integrated strategy, deprotected hydroxyl groups of serine, threonine or tyrosine are induced on the solid phase with di-tert-butyl-, dibenzyl- or dimethyl-N, N'-diisopropylphosphoramidite. And then oxidized by ter-butylhydroperoxide.
고체상 합성은 통상 카르복시-말단으로부터 알파-아미노 보호된(측쇄 보호된) 아미노산의 적당한 고체 지지체에의 커플링에 의해 수행된다. 클로로메틸, 클로로트리틸 또는 히드록시메틸 수지에 대한 부착이 완성될 때 에스테르 연결이 형성되고, 그 결과의 폴리펩티드는 C-말단에 자유 카르복실기를 가지게 될 것이다. 또는 달리, 벤즈히드릴아민 또는 p-메틸벤즈히드릴아민 수지와 같은 아미드 수지(tBoc 화학을 위해) 및 Rink 아미드 또는 PAL 수지가 사용되는 경우(Fmoc 화학에 대해), 아미드 결합이 형성되고, 그 결과의 폴리펩티드는 C-말단에 카르복시아미드 기를 가질 것이다. 이들 수지는 그것이 폴리스티렌- 또는 폴리아미드-기초 또는 폴리에틸렌글리콜-그라프트된 것이든지에 관계없이, 핸들 또는 링커의 유무, 부착된 첫 번째 아미노산의 유무에 관계없이 상업적으로 활용가능하고, 그것들의 제조에 대해서는 문헌에 설명되어 있다[Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2nd Edition), (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984) and Bayer & Rapp Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986); and Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989].Solid phase synthesis is usually performed by coupling the alpha-amino protected (side chain protected) amino acid from the carboxy-terminus to the appropriate solid support. When the attachment to the chloromethyl, chlorotrityl or hydroxymethyl resin is complete, an ester linkage is formed and the resulting polypeptide will have free carboxyl groups at the C-terminus. Alternatively, if an amide resin (for tBoc chemistry) such as benzhydrylamine or p-methylbenzhydrylamine resin and Rink amide or PAL resin are used (for Fmoc chemistry), an amide bond is formed and The resulting polypeptide will have a carboxyamide group at the C-terminus. These resins are commercially available, with or without handles or linkers, with or without the first amino acid attached, whether they are polystyrene- or polyamide-based or polyethylene glycol-grafted, Steewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2nd Edition), (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984) and Bayer & Rapp Chem. Pept. Prot. 3: 3 (1986); and Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989].
필요하다면 측쇄에서, 및 알파-아미노기에서 보호된 C-말단의 아미노산은 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIPCDI) 및 카르보닐디이미다졸(CDI) 을 포함한 다양한 활성화제를 사용하여 히드록시메틸 수지에 부착된다. 그것은 그것의 세슘 테트라메틸암모늄 염 형태로 직접 또는 트리에틸아민(TEA) 또는 디이소프로필에틸아민(DIEA)의 존재하에 클로로메틸 또는 클로로트리틸에 부착될 수 있다. 아미드 수지에 대한 첫 번째 아미노산 부착은 커플링 반응중의 아미드 결합 형성과 동일하다.The C-terminal amino acids protected at the side chain and at the alpha-amino group, if necessary, are dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIPCDI) and carbonyldiimidazole (CDI). Various activators are used to attach to the hydroxymethyl resin. It may be attached in the form of its cesium tetramethylammonium salt either directly or to chloromethyl or chlorotrityl in the presence of triethylamine (TEA) or diisopropylethylamine (DIEA). The first amino acid attachment to the amide resin is identical to the amide bond formation during the coupling reaction.
수지 지지체에 부착시킨 후, 보호 화학에 따라 다양한 시약(예를 들면, tBoc, Fmoc)을 사용하여 알파-아미노 보호기를 제거한다. Fmoc의 제거정도는 300-320nm에서 또는 전도성 셀에 의해 모니터링될 수 있다. 알파-아미노 보호기의 제거 후, 원하는 서열을 얻기 위해 나머지 보호 아미노산들을 단계적으로 커플링시킨다.After attachment to the resin support, various reagents (eg, tBoc, Fmoc) are used to remove the alpha-amino protecting groups, depending on the protective chemistry. The degree of removal of Fmoc can be monitored at 300-320 nm or by conductive cells. After removal of the alpha-amino protecting group, the remaining protecting amino acids are stepwise coupled to obtain the desired sequence.
다양한 활성화제를 커플링 반응에 사용할 수 있는데 그 예로는 DCC, DIPCDI, 2-클로로-1,3-디메틸이미듐 헥사플루오로포스페이트(CIP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP) 및 그것의 피롤리딘 유사체(PyBOP), 브로모-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBroP), O-(벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸-우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU) 및 그것의 테트라플루오로보레이트 유사체(TBTU) 또는 그것의 피롤리딘 유사체(HBPyU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸-우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU) 및 그것의 테트라플루오로보레이트 유사체(TATU) 또는 그것의 피롤리딘 유사체(HAPyU)를 들 수 있다. 커플링 반응에 사용되는 가장 일반적인 촉매 첨가제로는 4-메틸아미노피리딘(DMAP), 3-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아졸(HODhbt), N-히드록시벤조트리아졸(HOBt) 및 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt)을 들 수 있다. 각 보호 아미노산은 과잉량(>2.0당량)으로 사용되고, 커플링은 통상 N-메틸피롤리돈(NMP) 또는 DMF, CH2Cl2또는 이들의 혼합물 중에서 수행된다. 커플링 반응의 완료정도는 예를 들면 Kaiser et al., Anal. Biochem. 34:595, 1970에 기재된 바와 같은 닌히드린 반응에 의해 각 단계에서 모니터링될 수 있다.Various activators can be used in the coupling reaction, for example DCC, DIPCDI, 2-chloro-1,3-dimethylimide hexafluorophosphate (CIP), benzotriazol-1-yl-oxy-tris- ( Dimethylamino) -phosphonium hexafluorophosphate (BOP) and its pyrrolidine analogue (PyBOP), bromo-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate (PyBroP), O- (benzotriazole- 1-yl) -1,1,3,3-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HBTU) and its tetrafluoroborate analogue (TBTU) or its pyrrolidine analogue (HBPyU), O- ( 7-azabenzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HATU) and its tetrafluoroborate analogue (TATU) or pyrrolidine analogue thereof (HAPyU) is mentioned. The most common catalyst additives used in coupling reactions are 4-methylaminopyridine (DMAP), 3-hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazole (HODhbt), N-hydroxybenzotriazole (HOBt) and 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt). Each protective amino acid is used in excess (> 2.0 equiv) and the coupling is usually carried out in N-methylpyrrolidone (NMP) or DMF, CH 2 Cl 2 or mixtures thereof. The degree of completion of the coupling reaction is described, for example, by Kaiser et al., Anal. Biochem. The ninhydrin reaction as described in 34: 595, 1970 can be monitored at each step.
원하는 펩티드를 전부 어셈블한 후, 펩티드-수지를 적당한 스캐빈저를 갖는 시약에 의해 절단한다. Fmoc 펩티드는 통상 스캐빈저(예, H2O, 에탄디티올, 페놀 및 티오아니솔)를 갖는 TFA에 의해 절단 및 탈보호된다. tBoc 펩티드는 통상 액체 HF에 의해 -5℃ 내지 0℃에서 1-2시간 동안 절단 및 탈보호되는데, 이 액체 HF는 폴리펩티드를 수지로부터 절단하고 측쇄 보호기의 대부분을 제거한다. 통상, 절단 동안에 형성되는 양이온이 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 잔기를 알킬화 및 아실화하는 것을 방지하기 위해 아니솔, 디메틸술파이드 및 p-티오크레졸과 같은 스캐빈저를 액체 HF와 함께 사용한다. 트립토판의 포르밀기 및 히스티딘의 디니트로페닐기는 HF 절단에 앞서 DMF 중의 피페리딘 및 티오페닐에 의해 각각 제거될 필요가 있다. 시스테인의 아세트아미도메틸기는 아세트산수은(II)에 의해 그리고 선택적으로 시스테인을 시스틴으로 동시에 산화시키는 요오드, 트리플루오로아세트산탈륨(III) 또는 테트라플루오로붕산은에 의해 제거될 수 있다. tBoc 펩티드의 절단 및 탈보호에 사용되는 다른 강산으로는 트리플루오로메탄술폰산(TFMSA) 및 트리메틸실릴트리플루오로아세테이트(TMSOTf)를 들 수 있다.After all the desired peptides are assembled, the peptide-resin is cleaved by reagent with a suitable scavenger. Fmoc peptides are typically cleaved and deprotected by TFA with scavengers (eg, H 2 O, ethanedithiol, phenol and thioanisole). tBoc peptides are typically cleaved and deprotected with liquid HF at −5 ° C. to 0 ° C. for 1-2 hours, which cleaves the polypeptide from the resin and removes most of the side chain protecting groups. Typically, scavengers such as anisole, dimethylsulfide and p-thiocresol are used in combination with liquid HF to prevent cations formed during cleavage from alkylating and acylating amino acid residues present in the polypeptide. The formyl group of tryptophan and the dinitrophenyl group of histidine need to be removed, respectively, by piperidine and thiophenyl in DMF prior to HF cleavage. The acetamidomethyl group of cysteine can be removed by mercury (II) acetate and optionally by iodine, thallium trifluoroacetate (III) or silver tetrafluoroborate, which simultaneously oxidize cysteine to cystine. Other strong acids used for cleavage and deprotection of tBoc peptides include trifluoromethanesulfonic acid (TFMSA) and trimethylsilyltrifluoroacetate (TMSOTf).
본 발명의 분자의 활성은 위장관 세포 수축의 자극, 영양분 흡수의 조절 및/또는 소화효소의 분비를 측정하는 여러 가지 측정법을 사용하여 측정될 수 있다. 특히 중요한 것은 평활근 세포의 수축성의 변화, 예를 들면, 포유류의 십이지장 또는 다른 위장관의 평활근 조직 절편의 수축 반응의 변화이다(Depoortere et al., J. Gastrointestinal Motility 1:150-159, 1989, 여기에 참고문헌으로 포함됨). 예시적인 생체내 측정법에서는 초음파 마이크로미터를 사용하여 교차연결부들 사이의 그리고 판막 기저부의 면에 대해 세로방향으로의 크기 변화를 쉽게 측정한다(Hansen et al., Society of Thoracic Surgeons 60: S384-390, 1995).The activity of the molecules of the present invention can be measured using various assays that measure stimulation of gastrointestinal cell contraction, regulation of nutrient absorption and / or secretion of digestive enzymes. Of particular importance is the change in the contractile properties of smooth muscle cells, for example, the contractile response of smooth muscle tissue sections of the duodenum or other gastrointestinal tract of mammals (Depoortere et al., J. Gastrointestinal Motility 1: 150-159, 1989, here Incorporated by reference). Exemplary in vivo measurements use ultrasonic micrometers to readily measure longitudinal size changes between cross-connections and to the face of the valve base (Hansen et al., Society of Thoracic Surgeons 60: S384-390, 1995).
위운동은 일반적으로 임상 세팅에서 위배출에 요구되는 시간 및 위장관을 통과하는 후속 운반시간으로서 측정된다. 위배출 스캐닝은 당업자에게 잘 알려져 있고, 간단히 말하면, 바륨과 같은 경구 콘트라스트제 또는 방사성표지된 식사의 사용을 포함한다. 고체 및 액체를 독립적으로 측정할 수 있다. 시험 음식물 또는 액체를 동위원소(예,99mTc)로 방사성표지하고, 섭취 또는 투여 후, 위장관을 통과하는 운반시간 및 위배출을 감마 카메라를 사용하여 시각화함으로써 측정한다(Meyer et al., Am. J. Dig. Dis. 21:296, 1976; Collins et al., Gut 24:1117, 1983; Maughan et al., Diabet. Med. 13 9 Supp. 5:S6-10, 1996 및 Horowitz et al., Arch. Intern. Med. 145:1467-1472, 1985). 이들 연구는 약제의 효능을 정량화하기 위한 촉진제의 투여 전후에 수행될 수 있다.Gastric motion is generally measured as the time required for gastric emptying in a clinical setting and the subsequent delivery time through the gastrointestinal tract. Gastric excretion scanning is well known to those skilled in the art and, in short, involves the use of oral contrast agents such as barium or radiolabelled meals. Solids and liquids can be measured independently. Test foods or liquids are radiolabelled with isotopes (e.g., 99m Tc), and after ingestion or administration, transport time and gastric emptying through the gastrointestinal tract are measured by visualizing with a gamma camera (Meyer et al., Am. J. Dig. Dis. 21: 296, 1976; Collins et al., Gut 24: 1117, 1983; Maughan et al., Diabet. Med. 13 9 Supp. 5: S6-10, 1996 and Horowitz et al., Arch.Intern.Med. 145: 1467-1472, 1985). These studies can be performed before or after administration of an accelerator to quantify the efficacy of the medicament.
세포의 증식 또는 분화에 영향을 미치는 zsig33 폴리펩티드의 능력을 측정하는 측정법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 증식을 측정하는 측정법으로는 중성의 적색 염료에 대한 화학감작성과 같은 측정법을 들 수 있다(Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8:347-354, 1990, 여기에 참고문헌으로 포함됨), 방사성표지된 뉴클레오티드의 혼입(Cook et al., Analytical Biochem. 179:1-7, 1989, 여기에 참고문헌으로 포함됨), 증식세포의 DNA로의 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU)(Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82:169-179, 1985, 여기에 참고문헌으로 포함됨)의 혼입 및 테트라졸륨염의 사용(Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res. 48:589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5:69-84, 1995; 및 Scudiero et al., Cancer Res. 48:4827-4833, 1988, 모두 여기에 참고문헌으로 포함됨). 분화를 측정하는 측정법으로는 예를 들면 조직의 단계특이적 발현, 효소활성, 기능적 활성 또는 형태학적 변화와 관련된 세포표면 마커를 측정하는 것을 들 수 있다(Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989, 모두 여기에 참고문헌으로 포함됨).Assays to measure the ability of zsig33 polypeptides to affect proliferation or differentiation of cells are well known in the art. For example, measurements of proliferation include measurements such as chemistry for neutral red dyes (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8: 347-354, 1990, incorporated herein by reference). ), Incorporation of radiolabeled nucleotides (Cook et al., Analytical Biochem. 179: 1-7, 1989, incorporated herein by reference), 5-bromo-2'-deoxyuridine into DNA of proliferating cells (BrdU) (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82: 169-179, 1985, incorporated herein by reference) and the use of tetrazolium salts (Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res. 48: 589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5: 69-84, 1995; and Scudiero et al., Cancer Res. 48: 4827-4833, 1988 , All incorporated herein by reference). Assays to measure differentiation include, for example, measuring cell surface markers associated with phase specific expression, enzymatic activity, functional activity or morphological changes in tissues (Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991). Francis, Differentiation 57: 63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol.Bioprocesses, 161-171, 1989, all incorporated herein by reference).
측정법을 사용하여 화학주성, 부착, 이온통로 유입량의 변화, 제 2 메신저 레벨의 조절 및 신경전달물질의 방출을 포함하는 다른 세포반응을 측정할 수 있다. 이러한 측정법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다(예를 들면, "Basic & Clinical Endocrinology Ser., Vol. 3", Cytochemical Bioassays: Techniques & Applications, Chayen; Chayen, Bitensky, eds., Dekker, New York, 1983 참조).Assays can be used to measure other cellular responses, including chemotaxis, adhesion, changes in ion channel entry, control of second messenger levels, and release of neurotransmitters. Such assays are well known in the art (eg, "Basic & Clinical Endocrinology Ser., Vol. 3", Cytochemical Bioassays: Techniques & Applications, Chayen; Chayen, Bitensky, eds., Dekker, New York, 1983 Reference).
zsig33에 대해 관찰되는 조직 분포의 점에서, 아고니스트(천연 리간드/기질/보인자 등을 포함) 및 길항제는 시험관내 및 생체내 적용 둘 다에 있어서 큰 잠재력을 갖는다. zsig33 아고니스트로서 동정된 화합물은 생체내 또는 시험관내에서 위장관 세포 수축의 자극, 영양분 흡수의 조절 및/또는 소화효소의 분비를 촉진하는데 유용하다. 예를 들면, 아고니스트 화합물은 소정 세포배양배지의 성분으로서 유용하며 영양분의 흡수를 조절하고 따라서 위, 십이지장, 근위 공장(空腸), 동(洞) 및 기저부의 G 세포, 장크롬친화성 세포 및 상피 점막과 같은 위장관세포의 성장 및/또는 발육을 특이적으로 촉진하는데 유용하다.In terms of tissue distribution observed for zsig33, agonists (including natural ligands / substrates / carriers, etc.) and antagonists have great potential for both in vitro and in vivo applications. Compounds identified as zsig33 agonists are useful for stimulating gastrointestinal cell contraction, regulating nutrient absorption and / or promoting the secretion of digestive enzymes in vivo or in vitro. For example, agonist compounds are useful as components of certain cell culture media and regulate the uptake of nutrients and thus the G cells of the stomach, duodenum, proximal jejunum, sinus and base, enterochrome affinity cells and It is useful for specifically promoting growth and / or development of gastrointestinal tract cells such as epithelial mucosa.
장관-뇌 펩티드류는 신경학적 기능 및 CNS 기능과 관련되어 왔다. 예를 들면, 뇌 및 장관 양자내의 수용체를 갖는 펩티드인 NPY는 중추신경계에 투여될 때 식욕을 자극하는 것으로 밝혀졌다(Gehlert, Life Sciences 55(6):551-562, 1994). 모틸린의 면역반응성은 뇌, 특히 소뇌의 여러 부위에서 그리고 뇌하수체에서 동정되었다(Gasparini et al., Hum. Genetics 94(6):671-674, 1994). 모틸린은 소뇌내의 신경전달물질인 γ-아미노부티르산과 공존하는 것으로 발견되었다(Chan-Patay, Proc. Sym. 50th Anniv. Meet. Br. Pharmalog. Soc.:1-24, 1982). 생리학적 연구로, 모틸린은 섭식 행동(Rosenfield et al., Phys. Behav. 39(6):735-736, 1989), 방광 제어, 뇌하수체성장호르몬 방출에 영향을 미친다는 몇몇 증거가 제공되었다. CCK, 엔케팔린, VIP 및 세크레틴과 같은 다른 장관-뇌 펩티드는 소화계에 활성인 것 외에 혈압, 심박수, 행동 및 동통 조절에도 관여하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, zsig33 또는 그것의 일부 부분은 신경학적으로 어떤 관련이 있을 것으로 예상할 수 있다.Intestinal-brain peptides have been associated with neurological and CNS functions. For example, NPY, a peptide with receptors in both the brain and intestinal tract, has been shown to stimulate appetite when administered to the central nervous system (Gehlert, Life Sciences 55 (6): 551-562, 1994). The immunoreactivity of motilin has been identified in the brain, particularly in various parts of the cerebellum and in the pituitary gland (Gasparini et al., Hum. Genetics 94 (6): 671-674, 1994). Motiline was found to coexist with γ-aminobutyric acid, a neurotransmitter in the cerebellum (Chan-Patay, Proc. Sym. 50th Anniv.Meet.Br. Pharmalog. Soc.:1-24, 1982). In physiological studies, some evidence has been provided that motilin affects eating behavior (Rosenfield et al., Phys. Behav. 39 (6): 735-736, 1989), bladder control, and pituitary growth hormone release. Other intestinal-brain peptides such as CCK, enkephalin, VIP and secretin have been found to be involved in blood pressure, heart rate, behavior and pain control in addition to being active in the digestive system. Thus, one could expect zsig33 or some portion thereof to be neurologically related.
본 발명의 아미노산 또는 DNA 서열의 부위특이적 변화를 사용하면, 길항제, 아고니스트 또는 부분 아고니스트인 유사체를 제조할 수 있다(Macielay et al., Peptides: Chem. Struct. Biol. pp.659, 1996). 길항제는 설사 및 크론병과 같은 위장관운동과잉증과 관련된 임상 질병에 유용하다. 또한 길항제는 리간드-수용체 상호작용의 부위를 특성화하기 위한 연구용 약제로서 유용하다.Site-specific changes in the amino acid or DNA sequences of the present invention can be used to prepare analogs that are antagonists, agonists or partial agonists (Macielay et al., Peptides: Chem. Struct. Biol. Pp.659, 1996 ). Antagonists are useful for clinical diseases associated with gastrointestinal hyperplasia such as diarrhea and Crohn's disease. Antagonists are also useful as research agents for characterizing the site of ligand-receptor interaction.
zsig33 리간드 결합 폴리펩티드는 또한 리간드의 정제에 사용될 수 있다. 이 폴리펩티드는 아가로스, 가교 아가로스, 유리, 셀룰로오스계 수지, 실리카계 수지, 폴리스티렌, 가교 폴리아크릴아미드 또는 사용 조건하에서 안정한 유사 물질의 비드와 같은 고체 지지체상에 고정화된다. 폴리펩티드를 고체 지지체에 연결하는 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있고, 아민 화학, 시아노겐 브로마이드 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 술프히드릴 활성화 및 히드라지드 활성화를 포함한다. 얻어지는 배지를 일반적으로 컬럼의 형태로 구성하고, 리간드를 함유하는 유체를 이 컬럼에 1회 이상 통과시켜 리간드를 수용체 폴리펩티드에 결합시킨다. 이어서 리간드를 염농도, 카오트로픽제(chaotropic agent; 구아니딘 HCl) 또는 pH의 변화를 이용하여 용출시켜 리간드-수용체 결합을 분해시킨다.zsig33 ligand binding polypeptides can also be used for purification of ligands. The polypeptide is immobilized on a solid support such as agarose, crosslinked agarose, glass, cellulose based resin, silica based resin, polystyrene, crosslinked polyacrylamide or beads of similar material that is stable under the conditions of use. Methods of linking polypeptides to solid supports are well known in the art and include amine chemistry, cyanogen bromide activation, N-hydroxysuccinimide activation, epoxide activation, sulfhydryl activation and hydrazide activation. The resulting medium is generally configured in the form of a column and the ligand containing fluid is passed through the column one or more times to bind the ligand to the receptor polypeptide. The ligand is then eluted using a change in salt concentration, chaotropic agent (guanidine HCl) or pH to break down the ligand-receptor bond.
리간드 결합 수용체(또는 항체, 보체/항보체의 일원) 또는 그것의 결합단편를 사용하는 측정시스템, 및 시중에서 입수가능한 바이오센서 기구(BIAcoreTM, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 상기 수용체, 항체, 보체/항보체 쌍의 일원 또는 단편을 수용체 칩의 표면상에 고정화시킨다. 이러한 기구의 사용은 Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-40, 1991 및 Cunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993에 개시되어 있다. 수용체, 항체, 상기 일원 또는 단편을 아민 또는 술프히드릴 화학을 사용하여 덱스트란 섬유에 공유결합시키고 이 텍스트란 섬유를 유동 셀내의 금 필름에 부착시킨다. 시험 샘플을 셀에 통과시킨다. 리간드, 에피토프 또는 보체/항보체 쌍의 반대 일원이 샘플에 존재하면, 이것은 고정화된 수용체, 항체 또는 상기 일원에 각각 결합되어 배지의 굴절율을 변화시키는데, 이 변화는 금 필름의 표면 플라즈몬 공명이 변화하는 것으로서 검출된다. 이 시스템에 의하면 결합친화성을 계산할 수 있는 개폐율의 측정 및 결합 화학양론의 평가가 가능해진다.It may be advantageous to use a measurement system using a ligand binding receptor (or a member of an antibody, complement / anticomplement) or binding fragment thereof, and a commercially available biosensor instrument (BIAcore ™ , Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). . A member or fragment of the receptor, antibody, complement / anticomplement pair is immobilized on the surface of the receptor chip. The use of such instruments is described in Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-40, 1991 and Cunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993. The receptor, antibody, member or fragment is covalently attached to the dextran fiber using amine or sulfhydryl chemistry and the textan fiber is attached to the gold film in the flow cell. Pass the test sample through the cell. If the opposite member of a ligand, epitope or complement / anticomplement pair is present in the sample, it is bound to the immobilized receptor, antibody or member, respectively, to change the refractive index of the medium, which changes the surface plasmon resonance of the gold film. Is detected as. This system enables the measurement of the opening and closing rate and the binding stoichiometry to calculate the binding affinity.
리간드 결합 수용체 폴리펩티드는 또한 본 기술분야에 공지된 다른 측정시스템내에서도 사용될 수 있다. 그러한 시스템으로는 결합친화성을 측정하기 위한 Scatchard 분석법(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949 참조) 및 열량측정법(Cunningham et al., Science 253:545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245:821-25, 1991)을 들 수 있다.Ligand binding receptor polypeptides can also be used within other measurement systems known in the art. Such systems include Scatchard assays (see Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) and calorimetry (Cunningham et al., Science 253: 545-48, 1991) to determine binding affinity; Cunningham et al., Science 245: 821-25, 1991).
zsig33 폴리펩티드는 또한 zsig33 에피토프, 펩티드 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 폴리클로날 또는 모노클로날 항체의 제조방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다(예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; 및 Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982 참조. 이들은 여기에 참고문헌으로 포함됨). 당업자에게 자명한 바와 같이, 폴리클로날 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 토끼, 마우스 및 래트와 같은 각종 온혈동물로부터 발생될 수 있다.The zsig33 polypeptide may also be used to prepare antibodies that specifically bind to a zsig33 epitope, peptide or polypeptide. Methods of preparing polyclonal or monoclonal antibodies are well known in the art (eg, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; and Hurrell, See JGR, Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982. These are incorporated herein by reference). As will be apparent to those skilled in the art, polyclonal antibodies can be generated from a variety of warm blooded animals such as horses, cows, goats, sheep, dogs, chickens, rabbits, mice and rats.
zsig33 폴리펩티드의 면역원성은 알룸(수산화알루미늄) 또는 프로이트 착체와 같은 보조제 또는 불완전 보조제의 사용을 통해 증가될 수 있다. 또한 면역화에 유용한 폴리펩티드로는 zsig33 또는 그 일부와 면역글로불린 폴리펩티드 또는 말토스 결합 단백질의 융합체와 같은 융합 폴리펩티드를 들 수 있다. 폴리펩티드 면역원은 전체길이의 분자 또는 그 일부일 수 있다. 폴리펩티드 부분이 "헵탄과 유사"하면, 이러한 부분은 면역화를 위해 거대분자 담체(예를 들면, 키홀 림페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin; KHL), 소혈청알부민(BSA) 또는 파상풍 톡소이드에 유리하게 결합 또는 연결될 수 있다.Immunogenicity of the zsig33 polypeptide can be increased through the use of an adjuvant or incomplete adjuvant such as alum (aluminum hydroxide) or Freud complex. Polypeptides useful for immunization also include fusion polypeptides such as fusions of zsig33 or a portion thereof with an immunoglobulin polypeptide or maltose binding protein. Polypeptide immunogens may be full-length molecules or portions thereof. If the polypeptide moiety is “similar to heptane,” this moiety favors macromolecular carriers (eg, keyhole limpet hemocyanin (KHL), bovine serum albumin (BSA) or tetanus toxoid for immunization). It can be combined or connected.
여기서 사용되는 용어 "항체"는 폴리클로날 항체, 친화성 정제된 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 그리고 F(ab')2및 Fab 단백질분해성 단편과 같은 항원 결합 단편을 포함한다. 키메라 항체, Fv 단편, 단일사슬 항체 등과 같은 유전공학적으로 조작된 완전한 항체 또는 단편 뿐만 아니라, 항원 결합성 합성 펩티드 및 폴리펩티드도 또한 포함된다. 비사람의 항체는 비사람의 CDR을 사람의 프레임워크 및 일정 영역을 그래프팅하거나 또는 비사람의 다양한 도메인 전체를 혼입(선택적으로 노출된 잔기를 치환시켜 사람과 같은 표면으로 이들을 "클로킹"시키는데, 그 결과로 얻어지는 것은 "베니어드(veneered)" 항체이다)시킴으로써 사람화될 수 있다. 몇몇 경우, 사람화된 항체는 비사람 잔기를 사람의 각종 영역의 프레임워크 도메인내에 유지시켜 적당한 결합특성을 향상시킬 수 있다. 사람화 항체를 통해 생물학적 반감기가 증가될 수 있고, 사람에게 투여시 역면역반응이 일어날 가능성이 감소된다. 본 발명에 유용한 항체를 발생시키거나 또는 선택하는 대안적 방법으로는 림프구를 zsig33 단백질 또는 펩티드에 시험관내에서 노출시키는 것 및 파지 또는 유사 벡터내의 항체표시 라이브러리를 선택(예를 들면, 고정화되거나 또는 표지된 zsig33 단백질 또는 펩티드의 사용을 통해)하는 것을 들 수 있다.The term “antibody” as used herein includes polyclonal antibodies, affinity purified polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and antigen binding fragments such as F (ab ′) 2 and Fab proteolytic fragments. Also included are genetically engineered complete antibodies or fragments such as chimeric antibodies, Fv fragments, single chain antibodies and the like, as well as antigen binding synthetic peptides and polypeptides. A nonhuman antibody grafts a nonhuman CDR into a human framework and a region or incorporates all of the various domains of the nonhuman (optionally "substitutes" exposed residues to "cloak" them to a surface such as a human, The resultant can be humanized by " veneered " antibodies. In some cases, humanized antibodies can maintain non-human residues within the framework domains of various regions of humans to enhance proper binding properties. Humanized antibodies can increase biological half-life and reduce the likelihood of adverse immune reactions when administered to humans. Alternative methods of generating or selecting antibodies useful in the invention include exposing lymphocytes to zsig33 protein or peptide in vitro and selecting an antibody-labeled library in a phage or similar vector (eg, immobilized or labeled). Through the use of the zsig33 protein or peptide).
항체는 106M-1이상, 바람직하게는 107M-1이상, 보다 바람직하게는 108M-1이상, 가장 바람직하게는 109M-1이상의 결합친화성(Ka)으로 zsig33 폴리펩티드에 결합되는 경우 특이적으로 결합되는 것으로 정의된다. 항체의 결합친화성은 당업자에 의해(예를 들면 Scatchard 분석법에 의해) 쉽게 측정될 수 잇다.The antibody has a zsig33 polypeptide of binding affinity (K a ) of at least 10 6 M −1 , preferably at least 10 7 M −1 , more preferably at least 10 8 M −1 , most preferably at least 10 9 M −1. When bound to, it is defined as specifically bound. The binding affinity of the antibody can be readily determined by one skilled in the art (eg by Scatchard assay).
당업자에게 공지된 여러 가지 측정법을 사용하여 zsig33 단백질 또는 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 검출할 수 있다. 예시적인 측정법은 Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988에 상세히 기재되어 있다. 이러한 측정법의 대표적인 예로는 동시면역전기영동법, 방사선면역측정법, 방사선면역침강법, 효소결합항체법(ELISA), 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯 측정법, 저해 또는 경쟁 측정법, 그리고 샌드위치 측정법을 들 수 있다. 또한 항체는 야생형 대 돌연변이 zsig33 단백질 또는 펩티드로의 결합에 대해 스크리닝될 수 잇다.Various assays known to those of skill in the art can be used to detect antibodies that specifically bind to zsig33 protein or peptide. Exemplary assays are described in detail in Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Representative examples of such assays include co-immunoelectrophoresis, radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, enzyme-linked antibody (ELISA), dot blot or western blot assay, inhibition or competition assay, and sandwich assay. Antibodies can also be screened for binding to wild type versus mutant zsig33 protein or peptide.
zsig33에 대한 항체는 zsig33을 친화성 정제에 의해 분리하기 위해, zsig33 폴리펩티드의 순환레벨을 측정하는 진단측정법을 위해, 가용성 zsig33을 내재하는 병태 또는 질환의 마커로서 검출 또는 정량화하기 위해, FACS를 사용하는 분석법에, 발현 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 유전형 항체를 발생시키기 위해, 그리고 시험관내 및 생체내에서 zsig33 활성을 차단하는 길항제로서 또는 중성화 항체로서 zsig33을 발현시키는 세포에 태그를 붙이는데 사용될 수 있다. 적합당 직접 태그 또는 라벨로는 방사성핵종, 효소, 기질, 보인자, 저해제, 형광성 마커, 화학발광성 마커, 자성 입자 등을 들 수 있고, 간접 태그 또는 라벨은 바이오틴-아비딘 또는 다른 보체/항보체 쌍을 매개체로서 사용하는 것이 특징일 수 있다. 본 발명에서 항체는 또한 약제, 톡신, 방사성핵종 등에 직접 또는 간접적으로 콘쥬게이트될 수 있다.Antibodies to zsig33 use FACS to isolate zsig33 by affinity purification, for diagnostic assays to measure the circulating level of zsig33 polypeptide, and to detect or quantify it as a marker of a condition or disease inherent in soluble zsig33. The assay can be used to screen expression libraries, generate genotype antibodies, and tag cells expressing zsig33 as antagonists that block zsig33 activity in vitro and in vivo or as neutralizing antibodies. Suitable tags or labels per suitable include radionuclides, enzymes, substrates, carriers, inhibitors, fluorescent markers, chemiluminescent markers, magnetic particles, and the like, and indirect tags or labels may be biotin-avidin or other complement / anticomplement pairs. It may be characterized by using as a medium. Antibodies in the present invention can also be conjugated directly or indirectly to drugs, toxins, radionuclides and the like.
본 발명의 분자는 zsig33의 기능을 매개하는 수용체를 동정 및 분리하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 단백질 및 펩티드는 컬럼상에 그리고 컬럼위로 흐르는 멤브레인 제제상에 고정화될 수 있다(Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., eds., Academic Press, San Diego, CA, 1992, pp.195-202). 단백질 및 펩티드는 또한 방사성표지(Methods in Enzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, ed., Acad. Press, San Diego, 1990, 721-737) 또는 광친화성표지(Brunner et al., Ann. Rev. Biochem. 62:483-514, 1993 및 Fedan et al., Biochem. Pharmacol. 33:1167-1180, 1984)될 수 있고 특이적 세포표면 단백질을 동정할 수 있다.Molecules of the invention can be used to identify and isolate receptors that mediate the function of zsig33. For example, the proteins and peptides of the present invention can be immobilized on membranes and on membrane preparations flowing over columns (Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., Eds., Academic Press, San Diego, CA, 1992, pp. 195-202). Proteins and peptides may also be used as radiolabels (Methods in Enzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, ed., Acad. Press, San Diego, 1990, 721-737) or photoaffinity labels (Brunner). et al., Ann. Rev. Biochem. 62: 483-514, 1993 and Fedan et al., Biochem. Pharmacol. 33: 1167-1180, 1984) and specific cell surface proteins can be identified.
본 발명의 폴리펩티드, 핵산 및/또는 항체는 위장관 세포의 수축, 소화효소 및 산의 분비, 위장관운동, 소화효소의 동원과 관련된 질환; 염증, 특히 위장계에 영향을 미치는 염증; 역류성 질환의 치료; 및 영양분 흡수의 조절에 사용될 수 있다. 본 발명의 분자로 치료하는 것이 유리한 특정 상태로는 당뇨병성 위부전마비, 수술후 위부전마비, 미주신경절단술, 만성 특발성 장 가폐쇄증 및; 위식도 역류성 질환을 들 수 있으나 이것에 제한되지 않는다. 추가의 용도로는 방사선학적 연구를 위한 위배출, 담낭 수축 및 동절제술(antrectomy)을 수 있다.Polypeptides, nucleic acids and / or antibodies of the invention include diseases associated with contraction of gastrointestinal cells, secretion of digestive enzymes and acids, gastrointestinal motility, recruitment of digestive enzymes; Inflammation, especially inflammation affecting the gastrointestinal system; Treatment of reflux disease; And nutrient absorption. Specific conditions that benefit from treatment with the molecules of the invention include diabetic gastric palsy, postoperative gastric palsy, vagus nerve cutting, chronic idiopathic bowel obstruction, and; Gastroesophageal reflux disease, but is not limited to this. Further uses may include gastric emptying, gallbladder contractions, and antectomy for radiological studies.
본 발명의 분자의 운동성 및 신경학적 영향으로 인해, 본 발명의 분자는 비만 및 신경학적 피드백이 영양물의 흡수를 조절하는 다른 대사성 장애의 치료에 유용하게 된다. 본 발명의 분자는 포만, 글루코스 흡수 및 대사 그리고 신경병 관련 위장과 장애를 조절하는데 유용하다.Due to the motility and neurological effects of the molecules of the present invention, the molecules of the present invention are useful in the treatment of other metabolic disorders in which obesity and neurological feedback modulate the absorption of nutrients. Molecules of the present invention are useful for modulating satiety, glucose uptake and metabolism, and neuropathy-related stomach and disorders.
본 발명의 분자는 또한 글루코스를 함유하는 항저혈당 제제에 대한 첨가제로서 그리고 영양분의 신속한 작용이 요구되는 경구 약제를 위한 흡착증강제로서 유용하다. 또한, 본 발명의 분자는 글루코스에 의해 유발되는 인슐린 방출을 자극하는데 사용될 수 있다.The molecules of the present invention are also useful as additives for antihyperglycemic preparations containing glucose and as adsorbents for oral pharmaceuticals requiring rapid action of nutrients. In addition, the molecules of the present invention can be used to stimulate insulin release induced by glucose.
약학적 용도를 위해, 본 발명의 단백질은 종래 방법에 따라 비경구, 경비 흡인, 특히 정맥내 또는 피하 전달을 위해 조제될 수 있다. 정맥내 투여는 1 내지 수시간의 전형적인 기간에 걸친 일시주사 또는 주입에 의해 행해질 수 있다. 일반적으로, 약학적 제제는 zsig33 단백질을 염수, 완충염수, 물중의 5% 텍스트로오스 등과 같은 약학적으로 허용되는 비히클과 함께 포함한다. 제제는 한가지 이상의 부형제, 보존제, 가용화제, 완충제, 바이얼 포면에서 단백질이 손실되는 것을 방지하기 위한 알부민 등을 더 포함할 수 있다. 조제방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있고 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mark Publishing Co., Easton PA, 1990에 개시되어 있는데 이것은 여기에 참고문헌으로 포함되어 있다. 치료학적 투여량은 일반적으로 1일 환자 체중 kg당 0.1 내지 100μg, 바람직하게는 1일 0.5-20μg/kg이고, 정확한 투여량은 임상의학자가 치료할 질병의 성질 및 심각성, 환자의 특성 등을 고려하여 허용된 표준에 따라 결정한다. 투여량의 결정은 당업자의 수준내에 있는 것이다. 본 단백질은 1주 이하, 종종 1 내지 3일의 기간에 걸친 급성 치료를 위해 투여되거나 또는 수개월 또는 수년에 걸친 만성 치료에 사용될 수 있다. 예를 들면, zsig33의 치료학적 유효량은 위운동 및 영양물 흡수의 변화를 측정하는데 사용되는 파라미터에 있어서 임상학적으로 현저한 변화를 가져오기에 충분한 양이다. 이러한 측정을 하기 위한 특정 시험은 당업자에게 공지되어 있다.For pharmaceutical use, the proteins of the invention can be formulated for parenteral, nasal aspiration, in particular intravenous or subcutaneous delivery, according to conventional methods. Intravenous administration may be by bolus injection or infusion over a typical period of 1 to several hours. In general, pharmaceutical preparations include zsig33 protein with pharmaceutically acceptable vehicles such as saline, buffered saline, 5% textose in water, and the like. The formulation may further comprise one or more excipients, preservatives, solubilizers, buffers, albumin, etc. to prevent loss of protein in the vial surface. Formulation methods are well known in the art and are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mark Publishing Co., Easton PA, 1990, which is incorporated herein by reference. Therapeutic dosages are generally from 0.1 to 100 μg per kg of patient's body weight per day, preferably 0.5-20 μg / kg per day, and the exact dosage is determined by taking into account the nature and severity of the disease to be treated by the clinician and the characteristics of the patient Determined according to accepted standards. Determination of dosage is within the level of ordinary skill in the art. The protein may be administered for acute treatment over a period of up to one week, often one to three days, or may be used for chronic treatment over months or years. For example, a therapeutically effective amount of zsig33 is an amount sufficient to produce a clinically significant change in the parameters used to measure changes in gastric motility and nutrient uptake. Certain tests for making these measurements are known to those skilled in the art.
실시예 1Example 1
분비서열을 함유하는 cDNA에 대해 cDNA 데이터베이스를 스캐닝한 결과, 발현된 서열의 태그(expressed sequence tag; EST)는 모틸린에 대해 상동성을 가짐이 밝혀졌다. cDNA는 사람 태아의 췌장 cDNA 라이브러리로부터 얻은 것이다.Scanning the cDNA database for cDNA containing secretion sequences revealed that the expressed sequence tag (EST) had homology to motilin. cDNA was obtained from the pancreatic cDNA library of human fetus.
EST가 유래된 cDNA의 서열을 분석하여 EST 서열을 확인하였다. 이 cDNA는 플라스미드를 함유하였고, 클로닝 부위를 사용하여 절제하였다. 분석 결과, 이 cDNA는 zsig33을 코드화하는 DNA의 코딩영역 전체를 포함하였다.The EST sequence was confirmed by analyzing the sequence of cDNA from which EST was derived. This cDNA contained a plasmid and was excised using a cloning site. As a result, the cDNA contained the entire coding region of the DNA encoding zsig33.
실시예 2Example 2
노던은 Clontech(Palo Alto, CA)제 Human Multiple Tissue Blots 및 Human RNA Master 도트 블롯을 사용하여 수행하였다. 프로브는 약 40bp의 올리고뉴클레오티드 ZC12,494(SEQ ID NO: 7)이었다. 이 프로브를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 포워드 완충액(Life Technologies, Inc.)을 사용하여 말단표지화하였다. 프로브를 NUCTRAP 푸시 컬럼(Stratagene, La Jolla, CA)을 사용하여 정제하였다. EXPRESSHYB(Clontech) 용액을 하이브리드화에 사용하고 그리고 노던 블롯용 하이브리드화 용액으로서 사용하였다. 하이브리드화는 42℃에서 일어났고, 블롯은 2×SSC 및 0.05% SDS로 실온에서 세척하고 이어서 1×SSC 및 0.1% SDS로 71℃에서 세척하였다. 약 600bp의 전사체가 위에서는 강한 신호로서 관찰되었고, 췌장 및 소장에서는 약한 신호가 보였다.Northern was performed using Human Multiple Tissue Blots and Human RNA Master dot blot by Clontech (Palo Alto, Calif.). The probe was about 40 bp oligonucleotide ZC12,494 (SEQ ID NO: 7). This probe was endlabeled using T4 polynucleotide kinase (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) and T4 polynucleotide kinase forward buffer (Life Technologies, Inc.). Probes were purified using NUCTRAP push columns (Stratagene, La Jolla, Calif.). EXPRESSHYB (Clontech) solution was used for hybridization and as a hybridization solution for northern blots. Hybridization took place at 42 ° C. and blots were washed at room temperature with 2 × SSC and 0.05% SDS followed by 71 × C with 1 × SSC and 0.1% SDS. About 600 bp of the transcript was observed as a strong signal in the stomach and weak in the pancreas and small intestine.
실시예 3Example 3
약 12주 된 2마리의 수컷 Sprague-Dawley 래트(Harlan, Indianapolis, IN)를 우레탄으로 마취시키고 이 래트들의 위를 복부를 조금 절개하여 노출시켰다. 2개의 2.4mm의 형질도입 결정(Sonometrics, Ontario, Canada)을, 순환적 수축을 2개의 결정 사이의 간격의 변화로서 모니터링할 수 있도록 위의 동(洞) 부분에 위치시켰다. 결정은 VETBOND TISSUE ADHESIVE(3M, St. Paul, MN)에 의해 부착되었다.Two male Sprague-Dawley rats (Harlan, Indianapolis, Ind.), About 12 weeks old, were anesthetized with urethane and their stomachs were slightly incised to expose the stomach. Two 2.4 mm transduction crystals (Sonometrics, Ontario, Canada) were placed in the upper part of the stomach so that cyclic contraction could be monitored as a change in the spacing between the two crystals. Crystals were attached by VETBOND TISSUE ADHESIVE (3M, St. Paul, MN).
10μl의 1μM 아세틸콜린을 2개의 결정 사이에 있는 위에 국부적으로 도포하한 바, 2개의 결정 사이의 간격이 급속하게 그러나 일시적으로 증가되었다. 10μl의 1M 노르에피네프린(NE)은 2개이 결정 사이의 간격을 감소시켰다. NE에 의해 유발된 증폭은 아세틸콜린에 의해 유발된 간격 증가의 약 50%이었다. 양 반응은 모두 일시적인 것이었다.10 μl of 1 μM acetylcholine was applied locally over the two crystals, and the spacing between the two crystals increased rapidly but temporarily. 10 μl of 1M norepinephrine (NE) reduced the spacing between the two crystals. The amplification induced by NE was about 50% of the interval increase induced by acetylcholine. Both reactions were temporary.
결정들 사이에 국부적으로 도포된 음성 콘트롤인 10μl의 인산 완충액(PBS)은 영향을 미치지 않았다.10 μl of phosphate buffer (PBS), a negative control applied locally between the crystals, had no effect.
14 아미노산의 zsig33 펩티드(SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 24(Gly) 내지 아미노산 잔기 37(Gln)로부터 얻어짐)를 PBS에 용해시키고 10μl를 최종농도가 1μg, 10μg 또는 100μg이 되도록 국부적으로 도포하였다. 1μg의 zsig33은 결정 간격을 지속적 및 주기적으로 증가 및 감소시켰다. 이러한 효과는 투여량 의존성인 것으로 나타났는데, 농도 10μg 및 100μg의 것을 시험하였을 때 속도 및 증폭 둘 다에 있어서 향상된 반응을 보였다.A 14 amino acid zsig33 peptide (obtained from amino acid residues 24 (Gly) to amino acid residues 37 (Gln) of SEQ ID NO: 2) was dissolved in PBS and 10 μl was applied locally to a final concentration of 1 μg, 10 μg or 100 μg. . 1 μg of zsig33 increased and decreased the crystal spacing continuously and periodically. This effect appeared to be dose dependent and showed an improved response in both rate and amplification when tested at concentrations of 10 μg and 100 μg.
실시예 4Example 4
약 6주 된 8마리의 암컷 ob/ob 마우스(Jackson Labs, Bar Harbor, ME)를 1일 4시간의 식이 스케쥴에 2주 동안 적응시켰다. 이 식이 스케쥴을 2주 수행한 후, 이들의 식사기간 직후(식후)에 마우스에게 100μl의 멸균된 0.1% BSA 중의 100μg의 14 아미노산 아미노 zsig33 펩티드(SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 24(Gly) 내지 아미노산 잔기 37(Gln)로부터 얻어짐)를 경구 섭식에 의해 투여하였다. 30분후, 마우스에게 0.5ml 부피의 25% 글루코스를 경구투여하였다. 안와후 출혈을 일으켜 혈청 글루코스 레벨을 측정하였다. 혈액을 zsig33 투여전, 글루코스의 경구 투여전 및 글루코스 투여후 1, 2, 4 및 20시간에 뽑았다.Eight female ob / ob mice (Jackson Labs, Bar Harbor, ME), approximately six weeks old, were acclimated for two weeks on a dietary schedule of four hours per day. After 2 weeks of this dietary schedule, immediately after their diet (postprandial) mice were treated with 100 μg of 14 amino acid amino zsig33 peptide (SEQ ID NO: amino acid residue 24 (Gly)) to 100 μl of sterile 0.1% BSA. Amino acid residue 37 (obtained from Gln) was administered by oral feeding. After 30 minutes, mice were dosed orally with 0.5 ml volume of 25% glucose. Post-orbital bleeding occurred to measure serum glucose levels. Blood was drawn before zsig33 administration, before oral administration of glucose, and at 1, 2, 4 and 20 hours after glucose administration.
zsig33 펩티드를 글루코스를 경구 투여하기 30분전에 100μg 경구 투여한 경우에는, 식후 글루코스 흡수에 향상을 보였다.When the oral administration of 100 μg of the zsig33 peptide 30 minutes before oral administration of glucose showed an improvement in postprandial glucose uptake.
실시예 5Example 5
SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 24(Gly) 내지 아미노산 잔기 37(Gln)에 대응하는 펩티드인 zsig33-1을 모델 431A 펩티드 합성장치(Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA)를 사용하여 고체상 펩티드 합성에 의해 합성하였다. Fmoc-글루타민 수지(0.63mmol/g; Advanced Chemtech, Louisville, KY)를 초기 지지체 수지로서 사용하였다. 1mmol의 아미노산 카트리지(Anaspec, Inc. San Jose, CA)를 합성에 사용하였다. 2(1-벤조트리아졸-1-일-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 2m N,N-디이소프로필에틸아민, N-메틸피롤리돈, 디클로로메탄(모두 Applied Biosystems/Perkin Elmer제) 및 피페리딘(Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO)의 혼합물을 합성 시약으로서 사용하였다.Zsig33-1, a peptide corresponding to amino acid residues 24 (Gly) to amino acid residue 37 (Gln) of SEQ ID NO: 2, was subjected to solid phase peptide using a model 431A peptide synthesizer (Applied Biosystems / Perkin Elmer, Foster City, CA). Synthesized by synthesis. Fmoc-glutamine resin (0.63 mmol / g; Advanced Chemtech, Louisville, KY) was used as the initial support resin. A 1 mmolol amino acid cartridge (Anaspec, Inc. San Jose, Calif.) Was used for the synthesis. 2 (1-benzotriazol-1-yl-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 2m N, N-diiso A mixture of propylethylamine, N-methylpyrrolidone, dichloromethane (all from Applied Biosystems / Perkin Elmer) and piperidine (Aldrich Chemical Co., St. Louis, Mo.) was used as a synthetic reagent.
펩티드 컴패니언 소프트웨어(Peptides International, Louisville, KY)를 사용하여 zsig33-1 펩티드 합성에 대한 아글리게이션 포텐셜 및 난이도 레벨을 예측하였다. 합성은 싱글 커플링 프로그램을 사용하여 제작자의 지시에 따라 수행하였다.Peptide companion software (Peptides International, Louisville, KY) was used to predict aggregation levels and difficulty levels for zsig33-1 peptide synthesis. Synthesis was performed according to the manufacturer's instructions using a single coupling program.
표준 TFA 절단법에 따라 펩티드를 고체상으로부터 절단하였다(펩티드 절단 매뉴얼, Applied Biosystems/Perkin Elmer에 따라). 펩티드의 정제는 C18, 100μm 반제조용 컬럼(Vydac, Hesperial, CA)을 사용하여 RP-HPLC에 의해 행하였다. 컬럼으로부터 용출된 분획을 채취하여 일렉트로스프레이 질량분광법에 의해 정확한 질량 및 순도에 대해 분석하였다. 용출된 물질의 푸울 2개를 채취하였다. 이 질량분광분석의 결과로 두 푸울은 1600달톤의 질량을 갖는 정제된 형태의 zsig33을 함유하였음을 알 수 있었다. 이것은 예상된 질량이었고, 그래서 이 푸울들을 합하여 동결건조시켰다.Peptides were cleaved from the solid phase according to standard TFA cleavage (according to the Peptide Cleavage Manual, Applied Biosystems / Perkin Elmer). Purification of the peptide was performed by RP-HPLC using a C18, 100 μm semi-preparation column (Vydac, Hesperial, Calif.). Fractions eluted from the column were taken and analyzed for correct mass and purity by electrospray mass spectrometry. Two pools of eluted material were taken. As a result of this mass spectrometry, it was found that the two pools contained a purified form of zsig33 with a mass of 1600 Daltons. This was the expected mass, so the pools were combined and lyophilized.
실시예 6Example 6
zsig33을, 시중에서 입수가능한 "GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL)을 사용하여 염색체 3에 대해 매핑하였다. GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel은 각각 93개의 방사선 하이브리드 클론으로부터의 DNA 및 2개의 콘트롤 DNA(HFL 공여체 및 A23 수용체)로부터의 DNA를 함유하였다. 공개적으로 이용가능한 WWW 서버(http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl)로, GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel에 의해 구성된 사람 게놈의 Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research의 방사선 하이브리드 맵("WICGR" 방사선 하이브리드 맵)에 대한 매핑이 가능하다.zsig33 was mapped to chromosome 3 using the commercially available "GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). The GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel contained DNA from 93 radiation hybrid clones and DNA from two control DNAs (HFL donor and A23 receptor), respectively. The publicly available WWW server (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl), the Whitehead Institute / MIT Center for the Human Genome, composed by the GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel A mapping to Genome Research's radiation hybrid map ("WICGR" radiation hybrid map) is possible.
zsig33을 "GeneBridge 4 RH Panel"에 의해 매핑하기 위해서는, 20μl의 반응물을 96웰의 마이크로타이터 플레이트(Stratagene, La Jolla, CA)에서 만들고 "RoboCycler Gradient 96" 서멀 사이클러(Stratagene)에 사용하였다. 95개의 PCR 반응물은 각각 2μl의 10×KlenTag PCR 반응용 완충액(CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1.6μl의 dNTP 혼합물(각각 2.5mM, Perkin-Elmer, Foster City, CA), 1μl의 센스 프라이머, ZC13,166(SEQ ID NO: 8), 1μl의 안티센스 프라이머, ZC13,167(SEQ ID NO: 9), 2μl의 "RediLoad"(Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0.4μl의 50×Advantage KlenTaq 중합효소 혼합물(Clontech Laboratories, Inc.), 개개의 하이브리드 클론 또는 콘트롤로부터의 25ng의 DNA 및 총 부피가 20μl가 되게 하기 위한 ddH2O로 구성되었다. 반응물에 동일한 양의 광유를 바르고 밀봉하였다. PCR 사이클러 조건은 다음과 같았다. 즉, 초기 1 사이클: 95℃에서 5분 변성, 35 사이클: 95℃에서 1분 변성, 64℃에서 1분 어닐링 및 72℃에서 1.5분 연장, 이어서 최종 1 사이클: 72℃에서 7분 연장. 반응물들을 3% NuSieve GTG 아가로스겔(FMC Bioproducts, Rockland, ME)상에서 전기영동에 의해 분리하였다.To map zsig33 by the "GeneBridge 4 RH Panel", 20 μl of the reaction was made in a 96-well microtiter plate (Stratagene, La Jolla, Calif.) and used in a "RoboCycler Gradient 96" thermal cycler (Stratagene). 95 PCR reactions each contain 2 μl of 10 × KlenTag PCR reaction buffer (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, Calif.), 1.6 μl of dNTP mixture (2.5 mM each, Perkin-Elmer, Foster City, CA), 1 μl Sense primer, ZC13,166 (SEQ ID NO: 8), 1 μl antisense primer, ZC13,167 (SEQ ID NO: 9), 2 μl of "RediLoad" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0.4 μl 50 × Advantage KlenTaq polymerase mixture (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng of DNA from individual hybrid clones or controls and ddH 2 O to bring the total volume to 20 μl. An equal amount of mineral oil was applied to the reaction and sealed. PCR cycle conditions were as follows. Ie initial 1 cycle: 5 min denaturation at 95 ° C., 35 cycles: 1 min denaturation at 95 ° C., 1 min annealing at 64 ° C. and 1.5 min extension at 72 ° C., then last 1 cycle: 7 min extension at 72 ° C. The reactions were separated by electrophoresis on 3% NuSieve GTG agarose gel (FMC Bioproducts, Rockland, ME).
그 결과로, zsig33이 WICGR 염색체 3 방사선 하이브리드 맵상에서 프레임워크 마커 AFMA216ZG1로부터의 10.43 cR_3000을 매핑함이 증명되었다. 근위 및 원위의 프레임워크 마커는 각각 AFMA216ZG1 및 D3S1263이었다. 주위 마커를 사용하여 zsig33을 통합된 LDB 염색체 3 맵상의 3p26.1 영역에 위치시켰다(The Genetic Location Database, University of Southhampton, WWW server: http://cedar.genetics. soton.ac.uk/public_html/).As a result, it was demonstrated that zsig33 maps 10.43 cR_3000 from framework marker AFMA216ZG1 on the WICGR chromosome 3 radiation hybrid map. Proximal and distal framework markers were AFMA216ZG1 and D3S1263, respectively. Surround markers were used to position zsig33 in the 3p26.1 region on the integrated LDB chromosome 3 map (The Genetic Location Database, University of Southhampton, WWW server: http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/ ).
실시예 7Example 7
국부적으로 도포된 zsig33 펩티드(SEQ ID NO: 2의 아미노산 24 내지 37)가, 절식시킨 수컷 Sprague-Dawley 래트(Harlan, Indianapolis, IN)의 위를 통한 페놀 레드의 통과에 미치는 영향을 평가하였다. 래트(6마리, 8주 됨)를 우레탄(0.5ml/100g의 25% 용액)으로 마취시키기 24시간전에 절식시켰다. 마취시킨 후, 동물들에게 1ml의 페놀 레드 용액(2% 메틸셀룰로오스 용액중 50mg/ml)을 경구투여하였다.The effect of locally applied zsig33 peptide (amino acids 24-37 of SEQ ID NO: 2) on the passage of phenol red through the stomach of fasted male Sprague-Dawley rats (Harlan, Indianapolis, IN) was evaluated. Rats (6 rats, 8 weeks old) were fasted 24 hours before anesthesia with urethane (0.5 ml / 100 g 25% solution). After anesthesia, animals were orally administered 1 ml of phenol red solution (50 mg / ml in 2% methylcellulose solution).
각 동물의 위를 복부를 조금 절개하여 노출시키고 1μg의 zsig33 펩티드 또는 스크램블된 서열 펩티드의 14 아미노산 콘트롤을 섭식후 5분에 위에 국부적으로 도포하였다. 섭식 30분후 배출된 위내용물의 광학밀도를 측정함으로써 위에 잔류하는 페놀 레드의 양을 측정하였다.The stomach of each animal was exposed by a small incision in the abdomen and a localized amino acid control of 1 μg of zsig33 peptide or scrambled sequence peptide was applied locally to the stomach 5 minutes after feeding. The amount of phenol red remaining in the stomach was measured by measuring the optical density of the gastric contents discharged 30 minutes after feeding.
zsig33 펩티드는 스크램블된 펩티드와 비교하여 위에 잔류하는 페놀 레드의 양을 약 25% 만큼 감소시켰는데, 이것에 의해 zsig33 펩티드는 이들 래트에서 위배출을 향상시킴을 알 수 있다.The zsig33 peptide reduced the amount of phenol red remaining in the stomach by about 25% compared to the scrambled peptide, indicating that the zsig33 peptide enhances gastric emptying in these rats.
실시예 8Example 8
8주 된 16마리의 암컷 ob/ob 마우스(Jackson Labs, Bar Harbor, ME)에게 1일 4시간의 식이 스케쥴에 2주 동안 적응시켰다. 매일 오전 7:30에서 11:30까지 임의로 먹이를 주었다. 이러한 식이 스케쥴을 2주 시행한 후, 마우스를 2개의 8마리의 군으로 나누었다. 한 군에는, 음식물을 주기 직전과 4시간의 섭식기간이 끝났을 때 100μl의 멸균된 0.1% BSQA 중의 zsig33-1(14 아미노산 펩티드) 및 다른 비히클(14 아미노산 스크램블된 서열 펩티드)을 마우스당 1.0μg씩 경구 섭식에 의해 투여하였다. 마우스에게 14일 동안 매일 2회 투여하였고, 이 시간 동안 음식물 흡수량 및 체중을 매일 측정하였다. 14일째에 zsig33-1 펩티드를 2차로 경구 섭식시킨 후 바로, 마우스에세 0.5ml 부피의 25% 글루코스를 경구 투여하였다. zsig33-1 펩티드 또는 비히클을 투여하기 직전(t=30분) 및 글루코스를 투여한지 0, 1, 2 및 4시간후에 안와후 출혈을 일으켜 혈청 글루코스 레벨을 측정하였다.Sixteen week old female ob / ob mice (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) were acclimated for two weeks on a dietary schedule of four hours per day. The animals were randomly fed daily from 7:30 am to 11:30 am. After two weeks of this dietary schedule, mice were divided into two 8 groups. In one group, 1.0 μg per mouse of zsig33-1 (14 amino acid peptide) and other vehicle (14 amino acid scrambled sequence peptide) in 100 μl of sterile 0.1% BSQA immediately before feeding and at the end of the 4 hour feeding period. Administration was by oral feeding. Mice were administered twice daily for 14 days, during which time food uptake and body weight were measured. Immediately after the second oral ingestion of the zsig33-1 peptide on day 14, mice were dosed orally with 25% glucose in a volume of 0.5 ml. Serum glucose levels were measured by post-orbital bleeding immediately prior to administration of the zsig33-1 peptide or vehicle (t = 30 minutes) and 0, 1, 2 and 4 hours after the administration of glucose.
그 결과로, zsig33-1 펩티드를 마우스당 1μg씩 경구 투여한 경우, 1일 체중 또는 음식물 흡수량, 또는 14일째에 측정된 글루코스 제거율에 영향을 미치지 않음을 알았다.As a result, it was found that the oral administration of zsig33-1 peptide by 1 μg per mouse did not affect the daily weight or food absorption or glucose removal rate measured on day 14.
실시예 9Example 9
A. 장 조직의 노던 블롯A. Northern Blot of the Intestinal Tissue
노던 블롯을 다음 공급원으로부터의 mRNA를 사용하여 제조하였다.Northern blots were prepared using mRNA from the following sources.
1. Human Colorectal Andenocarcinoma 세포주 SW480으로부터의 RNA(Clontech, Palo Alto, CA)1. RNA from Human Colorectal Andenocarcinoma cell line SW480 (Clontech, Palo Alto, CA)
2. 사람의 소장 조직으로부터의 RNA(Clontech)2. RNA from human small intestine tissue (Clontech)
3. 사람의 위 조직으로부터의 RNA(Clontech)3. RNA from human stomach tissue (Clontech)
4. 사람의 장 평활근 세포주(Hism; ATCC No. CRL-1692; 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD)4. Human intestinal smooth muscle cell line (Hism; ATCC No. CRL-1692; American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD)
5. 정상인의 콜론 세포주(FMC; ATCC No. CRL-1831; 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션)5. Colon Cell Line of Normal Person (FMC; ATCC No. CRL-1831; American Type Culture Collection)
6. 사람의 정상 태아의 소장 세포주(FHs74 Int.; ATCC No. CCL241; 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션).6. Small intestine cell line of human normal fetus (FHs74 Int .; ATCC No. CCL241; American Type Culture Collection).
전체 RNA를 산구아니딘법에 의해 Hism, FHC 및 FHs74 Int.로부터 분리하였다(Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162:156-159, 1989). 전체 RNA를 폴리A+RNA를 체류시키는 컬럼을 통해 용출시켜 폴리A+RNA를 선택하였다(Aviv et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 69:1408-1412, 1972). 각 샘플로부터의 2μg의 폴리A+RNA를 2.2M 포름알데히드 및 인산완충액중의 1.5% 아가로스겔에서 분리해내었다. RNA를 20×SSC 중의 Nytran 멤브레인(Schleicher and Schuell, Keene, NH)으로 하룻밤 동안 옮겼다. 블롯을 UV Stratalinker 2400(Stratagene, La Jolla, CA)에서 0.12Joule로 처리하였다. 이어서 블롯을 80℃에서 1시간 동안 베이킹하였다.Total RNA was isolated from Hism, FHC and FHs74 Int. By sanguanidine method (Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162: 156-159, 1989). Eluting total RNA through a column that retention of the poly A + RNA was selected from poly A + RNA (Aviv et al, Proc Nat Acad Sci 69:..... 1408-1412, 1972). 2 μg of polyA + RNA from each sample was isolated on 1.5 M agarose gel in 2.2 M formaldehyde and phosphate buffer. RNA was transferred overnight to a Nytran membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH) in 20 × SSC. Blots were treated with 0.12 Joules in UV Stratalinker 2400 (Stratagene, La Jolla, Calif.). The blot was then baked at 80 ° C. for 1 hour.
PCR에 의해 증폭된 전체길이의 cDNA(SEQ ID NO: 1에 나타냄)를 사용하고, 약 50ng의 zsig33 DNA 및 42.5μl의 물을 Radiprime 펠릿 키트(Amersham, Arlington Heights, IL)를 제작자의 지시에 따라 사용하여32P dCTP로 방사성표지하였다. 블롯을 EXPRESSHYB(Clontech) 중에서 55℃에서 하룻밤 하이브리드화하였다. 블롯을 실온에서 2×SSC 및 0.1% SDS로, 이어서 65℃에서 2×SSC 및 0.1% SDS로, 그리고 최종적으로 65℃에서 0.1×SSC 및 0.1% SDS로 세척하였다. 그 결과로, zsig33이 위의 RNA에는 하이브리드화되었으나 다른 조직 유래의 RNA에는 하이브리드화되지 않았음이 증명되었다.Using a full-length cDNA amplified by PCR (shown in SEQ ID NO: 1), a Radiprime pellet kit (Amersham, Arlington Heights, IL) was prepared using approximately 50 ng of zsig33 DNA and 42.5 μl of water according to the manufacturer's instructions. Radiolabeled with 32 P dCTP. Blots were hybridized overnight at 55 ° C. in EXPRESSHYB (Clontech). The blot was washed with 2 × SSC and 0.1% SDS at room temperature, then with 2 × SSC and 0.1% SDS at 65 ° C. and finally with 0.1 × SSC and 0.1% SDS at 65 ° C. As a result, it was demonstrated that zsig33 hybridized to the above RNA but not to RNA from other tissues.
B. 종양의 노던 블롯B. Northern Blot of Tumors
Northern TerritoryTM-사람의 종양 패널 블롯 II(Human Tumor Panel Blot II; Invitrogen, San Diego, CA) 및 Northern TerritoryTM-사람의 위종양 패널 블롯(Human Stomach Tumor Panel Blot; Invitrogen)을 zsig33 RNA의 발현에 대해 분석하였다.Northern Territory TM -Human Tumor Panel Blot II (Invitrogen, San Diego, CA) and Northern Territory TM -Human Stomach Tumor Panel Blot (Invitrogen) for expression of zsig33 RNA Was analyzed.
사람의 종양 패널 블롯은 레인당 20μg의 전체 RNA를 함유하였고 1% 변성용 포름알데히드겔상에 흘려보냈다. 이 블롯은 식도 종양, 정상 식도, 직장 종양 및 정상 직장으로부터의 RAN를 함유하였다. 사람의 위종양 패널 블롯은 4명의 독립된 공여자의 정상 조직으로부터 분리된 전체 RNA를 함유하였다. 20μg의 RNA를 각 샘플의 레인에 사용하였고 레인들은 각 공여자로부터의 정상 및 종양 세트가 교대되었다.Human tumor panel blots contained 20 μg of total RNA per lane and flowed onto a 1% denaturing formaldehyde gel. This blot contained RAN from esophageal tumor, normal esophagus, rectal tumor and normal rectum. Human gastric tumor panel blots contained total RNA isolated from normal tissues of four independent donors. 20 μg of RNA was used for the lanes of each sample and the lanes were alternating normal and tumor sets from each donor.
약 40bp의 올리고뉴클레오티드 ZC12,494(SEQ ID NO: 7)인 프로브를 제조하엿다. 이 프로브를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 포워드 완충액(Life Technologies, Inc.)을 사용하여 말단 표지화하였다. 프로브를 NUCTRAP 푸시 컬럼(Stratagene, La Jolla, CA)을 사용하여 정제하였다. 종양 블롯 및 위 블롯을 둘 다 동일한 방법으로 처리하였다. EXPRESSHYB(Clontech) 용액을 사전하이브리드화에 그리고 노던 블롯용 하이브리드화 용액으로서 사용하였다. 하이브리드화는 42℃에서 일어났고, 블롯은 60℃에서 0.1×SSC 및 0.01% SDS로, 이어서 70℃에서 0.1×SSC 및 0.1% SDS로 세척하였다. 그 결과로 zsig33은 사람의 종양 패널과 사람의 장 종양 패널 둘 다에 있어서 위의 정상 조직에서 배타적으로 발현된다는 것을 명백히 알 수 있다.A probe with an oligonucleotide ZC12,494 (SEQ ID NO: 7) of about 40 bp was prepared. This probe was end labeled using T4 polynucleotide kinase (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) and T4 polynucleotide kinase forward buffer (Life Technologies, Inc.). Probes were purified using NUCTRAP push columns (Stratagene, La Jolla, Calif.). Both tumor blots and stomach blots were treated in the same manner. EXPRESSHYB (Clontech) solution was used for prehybridization and as a hybridization solution for northern blots. Hybridization took place at 42 ° C. and blots were washed with 0.1 × SSC and 0.01% SDS at 60 ° C. followed by 0.1 × SSC and 0.1% SDS at 70 ° C. As a result, it can be clearly seen that zsig33 is exclusively expressed in normal tissue of the stomach in both human tumor panels and human intestinal tumor panels.
본 명세서에 본 발명의 특정 구체예를 예시를 위해 기재하였으나, 상기로부터 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 수정이 행해질 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구의 범위에 의해 한정되는 것을 제외하고는 한정되지 않는다.While specific embodiments of the invention have been described herein for purposes of illustration, it will be appreciated from the above that various modifications may be made without departing from the spirit and scope of the invention. Accordingly, the invention is not limited except as by the appended claims.
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