KR20010005544A

KR20010005544A - Ｖｎｔｒ 대립 유전자의 추출 및 이용방법

Info

Publication number: KR20010005544A
Application number: KR1019997008604A
Authority: KR
Inventors: 그레그 펄쓰
Original assignee: 그레그 펄쓰
Priority date: 1997-03-21
Filing date: 1998-03-20
Publication date: 2001-01-15
Also published as: GB9922203D0; GB2338553A; HUP0000668A2; GB2338553B; US20020058250A1; AU6737698A; IL131610A0; CN1257551A; JP2001517086A; CA2283651A1; NO994441D0; AU725963B2; HUP0000668A3; IS5188A; NO994441L

Abstract

본 발명은 VNTR 대립유전자의 추출 및 다중 개체로부터 얻는 복잡한 게놈의 동시적 비교에 의해 다중 위치에서 유전되는 형질에 대한 다형태성 표시제의 동시적 삭제를 위한 신규한 방법이다. 상기 생성물은 형질에 대하여 정보성이 있는 대립유전자의 전체 발현 (TRAIT)으로 나타낸다. 상기 대립유전자들은 유전적 표시제로서 직접적으로 사용될 수 있거나, 서열 변이를 일으키는 정확한 위치화를 축진시키기 위한 매개물로서 사용될 수 있다.

Description

ＶＮＴＲ 대립 유전자의 추출 및 이용방법{Extraction and utilisation of VNTR alleles}

용어풀이 및 약어풀이

어뎁터 (adapter): 뉴클레오티드 (nucleotide) 서열, 일반적으로 어닐된 (annealed) 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하며, DNA 단편에 연결되어 상기 단편의 특정 증폭 (amplification) 및 조작 (manipulation)을 가능하게 함.

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism): 증폭된 단편 길이 다형태성.

대립 유전자 (allele): 특정 한 위치에서 몇몇 가능한 선택적인 서열 변형 중 하나.

증폭자 (amplimer): 상기 어뎁터 프라이머 (primer) 및 '내부 프라이머'를 이용한 증폭에 의해 생성된 생성물 또는 생성물들의 덩어리.

DNA: 데옥시리보핵산 (deoxyribonucleic acid)

DNA 지문 (DNA fingerprint): 특정 DNA 시료로부터 얻은 한 셋트의 DNA 단편의 디스플레이 (display).

GMS (Genomic Mis-match Scanning): 게놈상의 불-일치 스캐닝.

개체 (individual): 조사를 위한 특정 종의 개체.

이종이중사슬 (heteroduplex): 다른 개체, 개체 세트 또는 개체군으로부터 분리된 두개의 대립 유전자의 이중사슬,

이종접합 (heterozygous): 동일한 위치에서 이배체 세포 (dipoid cell) 내의 쌍을 이룬 염색체 (chromosomes) 각각이 동일한 개체, 개체 세트 또는 개체군으로부터 분리된 대립유전자의 다른 동종이중사슬인 대립 유전자.

동종접합 (homozygous): 동일한 위치에서 이배체 세포의 쌍을 이룬 염색체가 동일한 대립 유전자.

위치 (locus): 염색체 상의 특정 위치.

불-일치 (mis-match): 반대 염기와 안정한 수소 결합을 형성하지 않는 이중사슬 내의 하나 또는 그 이상의 염기들.

NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification): 핵산 서열에 기초한 증폭.

PCR (Polymerase Chain Reaction): 폴리머라아제 사슬 반응.

RAPD (Random-Amplified DNA markers): 무작위-증폭된 DNA 표시제.

RDA (Representation Difference Analysis): 발현차 분석.

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): 제한 단편 길이 다형태성.

형질 (trait): 물리적, 화학적 또는 생물학적으로 자발적으로 나타나는 뛰어난 특징 또는 형질.

TRAIT (Total Representation of Alleles that are Informative for a Trait): 형질에 대한 정보를 주는 대립유전자의 전체 발현.

VNTR (Variable Number Tandem Repeat): 변수 직렬 반복, 또는 단순한 서열 반복단위 (미니위성 (minisatellites) 및 마이크로위성 (microsatellites)을 포함하는, 짧은 비-반복적인 서열에 의해 계속되거나 방해될 수 있는 둘 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 모든 반복을 포함함).

DNA는 네개의 모노뉴클레오티드 유니트 (unit)의 반복으로 구성된 이중 가닥의 선형 폴리머 (polymer)이다. 상기 유니트들이 배열되는 서열 (sequence)은 소위 게놈 (genome)이라는 유전자 코드 (genetic code)를 발생시킨다. 비록 한 종 내의 모든 개체의 게놈이 필수적으로 동종일지라도, 개체성을 부여하는 미묘한 변형이 존재한다. 하나 이상의 서열 변형이 존재할 수 있는 게놈의 위치는 다형태성 (polymorphism)이라 일컬으며, 상기 서열의 각 변종 (variant)은 상기 대립유전자를 발현시킨다. 생식자(gamete)-형성 배종 세포 (germinal cell) 내의 다형태성은 종족 번식에 유전될 것이다. 한 개체의 유일 코드 ('지문')의 게놈 내의 다형태성의 결합을 연구함으로써 사용될 수 있고, 상기 개체의 조상이 결정될 수 있다. 또한, 다형태성은 연결될 수 있으며, 특정한 유전적 형질 또는 유전성 질병으로의 공-분리가 다른 개체 내에서 상기 형질 또는 질병의 유전적 스크리닝 (screening)을 위한 표시제로서 사용될 수 있다.

복합체 게놈 내의 우성 또는 열성의 유전 형질의 연구는 그의 경제적, 의학적 및 사회적 의미로 상당한 관심이 되어 왔다. 복합체 게놈 내의 핵산 서열들의 비교 및 그 서열의 서브세트 (subset)에 대해 독특한 차이의 분리를 가능하게 하는 방법의 성립은 상기 분야의 연구에 기본적인 조건이다.

핵산 서열의 비교 및 개체 내의 서열 간의 차이를 분리하기 위해 동물 및 식물에서 많은 방법이 사용되었다. 상기 방법들은 제한 단편 길이 다형태성 (FRLP), 무작위-증폭된 다형태성 DNA 표시제 (RAPD), 증폭된 단편 길이 다형태성 (AFLP), 발현차 분석법 (RDA), 게놈 불-일치 스캐닝 (GMS), 및 변수 직렬 반복법을 포함한다. 한 게놈 내의 전체 DNA 서열 변형의 서브세트를 검정함으로써 상기 방법들은 다형태성을 검출한다. FRLP, AFLP 및 RDA에 의해 검출되는 다형태성은 제한 단편 크기 변형을 반영하는 젤-전기영동법 (gel-electrophoresis)에 의한 지문 사다리 (fingerprint ladder)의 생성에 의존한다. RAPD 다형태성은 프라이머 결합 위치의 서열 변화 및 프라이머 결합 위치 사이의 길이차로부터 발생한다. GMS 다형태성은 두 개의 관련된 개체로부터 분리된 제한 단편을 포함하는 이종교잡 분자 내의 서열 변형으로부터 발생한다. 연결 분석법 (linkage analysis)은 특정 형질을 갖는 한 대립유전자의 공-분리 (co-segregation) 및 변수 직렬 반복 (VNTR)의 길이 변형의 검출을 포함한다.

RFLP

RFLP 분석법은 젤 전기영동법에 의해 결과적으로 형성된 단편의 분리 및 제한 엔도뉴클레아제 (restriction endonuclease)에 의한 핵산 서열의 절단 (cleavage)에 의존한다. 상기 단편들은 막 상으로 점적 (blotted)되고, 단편 길이 변형의 검출을 가능하게 하는 표지화된 표지체 (labelled probe)에 교잡된다. 상기 기술은 단일한 격리된 위치 또는 유전자 단편의 연구에 사용될 수 있으나, 여기서 조사는 부적절한 분리된 서열에 제한되지 않는다. 또 다른 제한은 생성된 다형태성의 단지 작은 수만이 정보를 줄 수 있으며, DNA 출발 물질을 위한 높은 요구사항이 있으며, 상기 방법은 많은 노력이 필요하다.

RAPD

RAPD는 통상적으로 특히, 식물 종을 위해, 게놈의 지문 및 다양성 연구에서 PCR-기초 다형태성 표시제로 사용된다. 상기 기술은 5'에서 3' 방향으로 게놈 DNA 서열 사이의 충분한 상동성 및 임의의 프라이머의 상동성이 있는 게놈의 영역의 증폭을 발생시키는 하나의 '임의의 프라이머'의 사용을 포함한다. 상기 증폭된 생성물은 젤 전기영동법에 의해 분리된다. 상기 방법의 미묘한 변형은 임의의 프라임화된-PCR (arbitrary primed-PCR, AP-PCR) 및 DNA 증폭 지문화 (DNA amplification fingerprinting, DAF)을 포함한다. 그러나, 차이 분석을 위한 PCR에 의한 DNA의 증폭 및 임의적인 프라이밍의 원리는 모두 같다. RFLP와 비교되는 장점은 상기 방법들은 더 빠르고, DNA에 대하여 더 낮은 조건을 가지며, 서열을 미리 알 필요가 없다는 것이다. RFLP와의 공통점에 있어서의 한계는 각각의 분석이 두 개의 개체의 게놈을 단지 비교만 할 수 있다는 것이다. 비록 몇몇 위치가 상기 방법에 의해 동시에 제거될 수 있을지라도, 다형태성의 검출은 젤-전기영동법에 의한 띠 모양의 변화의 관찰을 필요로 하며, 다른 대립유전자형의 유사한 전기영동상의 이동성 (mobility)의 중첩 오차가 생긴다. 많은 띠들이 해석하기에 모호하며 어렵고, 반복 실험에서의 일률적인 결과를 얻기가 어렵다. 다수의 PCR 기술에서의 공통점으로, 상기 결과들은 반응 조건, 시약 오염, 및 불연속 띠형성 (banding) 모양의 형성에 있어서, 미묘한 변화에 의해 오차로 판명된다. 신빙성에 있어서의 이러한 결함은 개체의 '타이핑 (typing)'에서의 상기 기술의 유용성에 한계를 부여한다.

AFLP

AFLP 분석 (EP, A, 0534858; Zabeau M et al.)은 DNA의 제한 엔도뉴클레아제 소화 및 생성된 제한 단편의 어뎁터와의 연결을 포함한다. 상기 어뎁터 서열과 상보적인 프라이머를 이용하여, 상기 제한 단편들은 PCR에 의해 증폭되며, 생성물은 젤-전기영동에 의해 분리되며, 띠 모양에 있어서의 차이가 다형태성을 나타낸다. 마이크로위성-AFLP (WO 96/22388; Kuiper M et al.)는 상기 기술의 변형이며, 여기서, 적어도 하나가 단일 서열 반복단위인, 둘 또는 그 이상의 제한 효소가 어뎁터와 연결되는 단편으로 DNA를 절단하는데 사용된다. 상기 단편들은 상기 어뎁터 서열과 상보적인 프라이머를 이용하여 증폭된다. RAPD와 공통으로, 몇몇 위치들은 상기 방법에 의해 동시에 제거될 수 있으나, 다형태성의 검출은 젤-전기영동에 의한 띠 패턴의 변화의 관찰을 필요로 하며, 다른 대립유전자의 유사한 전기영동상의 이동성의 중첩 오차를 생기게 한다. AFLP 지문 상의 띠를 기록하는 능력은 몇몇은 매우 모호하며 해석하기 어려운 많은 수의 띠의 생성에 의해 손상된다. 또한, 상기 기술은 상기 요약한, 모든 PCR 기초 기술에 공통으로 나타나는 오차로 판명되며, 다중 복합체 게놈을 동시에 분석할 수 없기 때문에 어렵다. 이는 진정한 다형태성을 반영하지 않는, 주형 DNA의 불완전한 제한 즉, 띠의 생성에 의해 복잡화된다. 그러므로, AFLP 및 RAPD 분석들은 많은 동일한 제한을 공유한다. 부가적인 문제는 상기 게놈에 걸쳐 골고루 분산된 것 보다는 AFLP는 동원체 (centromere) 주위로 회합되는 것으로 기록된다는 점이다. 결과적으로, 상기 방법은 동원체로부터 떨어진 거리에 위치한다면 특정 서열 차를 이용하여 공-분리하는 다형태성을 생성시킬 수 없다. 상기 문제는 연결 분석법과 같은 기술과 비교하여 다형태성 검출의 감소된 속도로 나타난다. 또한, 분석을 받는 게놈의 복잡성을 증가와 함께 AFLP에 의해 생성된 실험 데이타의 복잡성이 강조된다. 결과적으로, 비록 AFLP 분석에 의해 몇몇 식물 종의 게놈을 조사하는 것은 가능할지라도, 상대적으로 복잡한 더 고등한 진핵 종의 게놈은 상기 기술의 유용한 능력을 초월할 수 있다.

RDA

DNA의 제한 엔도뉴클레아제 소화, 어뎁터와 상기 단편들의 연결 및 RDA는 PCR에 의한 증폭을 포함한다. 비교 게놈 사이의 차이는 감하는 교잡 (subtractive hybridization) 및 속도론적 풍부성의 연속적인 라운드 (round)에 의해 선택되며, 차이의 영역은 우세하게 된다. 상기 기술은 가상 생성물의 생성 및 반응 오염을 통한 오차성 결과를 낳는다. 또한, RDA의 기본 조건은 밀접하게 관련된 개체의 과에 유용성이 있으며, 상기 개체들중 일부는 특정 형질을 나타낸다. RDA가 밀접하게 관련된 또는 매우 가까운 게놈과는 다른 점에서 수행되는 곳에서, 다양한 차이가 간결하고 유용한 분석법에 대해 매우 중요하다.

GMS

GMS는 두 개의 관련된 개체의 동정-바이-디센트 (identity-by-descent)의 영역을 지도화하기 위한 기술이다. 전체 게놈은 DNA에 대한 큰 요구를 갖는 단일 교잡화로 비교되는데, 이는 상기 게놈 시료들이 증폭되기 때문이다. 전술한 지도 정보의 요구와 무관하게, 통상적인 표시제 또는 겔 전기영동법은 장점이 있다. 그러나, 상기 방법은 단지 두 개의 관련된 개체의 게놈 상에서의 사용에만 제한된다.

상기 두 게놈의 제한 단편들이 교잡되며, 이들 중 하나는 메틸화되어 이종교잡 (heterohybrid) 분자가 완전히 메틸화된 분자 및 메틸화되지 않은 분자들만 각각 절단하는 Dpn 1 및 Mbo 1에 의한 소화에 대한 저항을 통하여 구별될 수 있다. 불-일치가 적은 동종 가닥을 포함하는 이종교잡이 선택되며, 지도화된 클론 (clone)의 배열을 증명하는데 사용된다. 비록 상기 기술에 사용된 상기 불-일치 단백질이 상기 시스템의 제한을 초월하여 검출되지 않는 더 실질적인 불-일치를 포함하는 점 변이 (point mutation) 다형태성을 해결할 수 있다. 그러므로, RFLP, AFLP, RAPD 및 RDA를 유지하면서, GMS는 낮은 정보성을 갖는 이중의 다형태성을 해결하려는 경향이 있다.

상기 모든 기술들에서, 다형태성을 검출하기 위해 프라이머 결합자리에서 또는 그 사이에서 또는 엔도뉴클레아제 제한 자리 사이에서 뉴클레오티드 서열의 차이가 있어야 한다. 이점이 상기 절차들의 주요한 제한점으로 강조되는데, 이는 많은 경우에 있어서, 유전적 형질을 발생시키기 변이는 프라이머 결합 또는 제한 효소 소화에 있어서의 변화에 의해 검출가능한 서열 차이를 형성하지 않을 것이기 때문이다. 결과적으로, 특정 형질과 관련한 다형태성은 상기 기술들을 이용하여 확인되지 않을 것이다. GMS는 상기 제한 자리서 흔히 일어나는 다형태성을 검출하며, 다른 방법의 한계를 일부 공유한다. 그러나, VNTR 다형태성과 반대로, 상기 모든 기술들에 의해 검출되는 대부분의 다형태성은 정보성이 없다.

연결 분석법 (Linkage analysis)

연결 분석법은 상기 형질이 존재하는 과에서 특정 형질과 다형태성 VNTR의 유전형질의 전체적인 비교를 포함하는 간접적인 분자상의 유전적 방법이다. 미니위성 및 마이크로위성을 포함하는 많은 타입의 VNTR이 있으며, 이들 모두의 특징은 단순 서열의 원소들의 반복이라는 것이다. 이들은 길이상 변형과 함께 대립유전자를 발생시키며, 각 원소가 반복되는 시간 수의 변화에 의해 다형화된다. 몇몇 선택적인 대립유전자가 프라이머 결합 또는 제한 효소 소화의 변화에 기초된 다형태성과 대조적으로, 어떤 한 위치에 존재할 수 있기 때문에, VNTR 다형태성 대립유전자는 매우 정보성이 있는 경향이 있다. 결과적으로, 특정 VNTR 대립유전자와 한 형질의 공-분리가 나타나는 곳에서, 상기 대립유전자는 상기 형질에 대한 표시제로서 사용될 수 있거나, 상기 형질의 분자상 유전적 기본의 확인을 촉진시키는 수단으로써 사용될 수 있다. 마이크로위성은 모든 진핵 게놈에 걸쳐 도처에 기여한다. 결론적으로, 마이크로위성을 이용한 연결 분석법은 유전적 스크리닝 방법의 가장 높은 다형태성 검출 속도와 관련한다. 사실상, 전체적인 마이크로위성 분석법은 통상의 암의 특정 타입을 인지하는데 많은 발전에 이미 기여하였다. 그러므로, 연결 분석법은 그 결과가 매우 재연성이 있는 차이 분석법의 다른 관련된 방법과 비교하여 장점이 있다. 그러나, 연결 분석법은 매우 시간 소비적이며, 많은 노동을 요구하고, 비싸다. 또한, 많은 분석법들이 수행되기 때문에, DNA에 대한 전체 조건이 각각 매우 크다. 이는 만일 상기 게놈의 물리적인 지도가 상기 게놈에 걸쳐 평등하게 기여하는 정보성 마이크로위성의 선택에 사용불가능하다면 특히 절실하다. 연결의 주장은 상기 실험적 데이타의 분석을 위한 강력한 컴퓨터 소프트웨어 및 정교한 통계 프로그램의 적용을 필요로 한다. 상기 기술은 복합유전성 (multigenic) 형질에 요구되는 상기 통계 분석법이 특히 복잡하기 때문에 단일유전성 (monogenic) 결함에 더 적합하다. 불행하게도, 다인자성 형질은 단일유전성 결함보다 훨씬 더 유행하고 있으며, 연결 분석법을 대부분의 유전성 형질의 조사에 장애가 되는 기술로 만든다.

복합체 게놈 내의 질병과 다형태성 공-분리를 위한 이상적인 방법의 특성은 다음을 포함한다:

(ⅰ) 몇몇 개체의 복합체 게놈으로부터 다형태성을 적합도와 함께 및 동시에 분리되는 능력,

(ⅱ) 다원유전성 형질의 분석을 가능하게 하며, 동시에 몇몇 다형태성을 분리하는 능력,

(ⅲ) 점 변이로부터 발생하는 것과 같은 미묘한 차이를 포함하며, 모든 진핵 종 내의 서열 차이로 공-분리하는 다형태성의 높은 검출 속도,

(ⅳ) 특정 형질을 연구하기 위해 밀접하게 관련된 개체의 상과에 대한 무조건성,

(ⅴ) 게놈상 서열의 선행 지식 또는 상기 게놈의 물리적 지도화에 대한 무조건성,

(ⅵ) 분석을 통한 핵산 시료들의 양을 나누기 위한 필요조건,

(ⅶ) 비싸고, 가장 특이한 실험 장비 또는 컴퓨터 소프트웨어가 필요없는 사용의 단순성,

(ⅷ) 동물 및 식물계에 걸쳐 광범위한 적용을 위한 잠재성,

(ⅸ) 정밀성, 정확성 및 적합성을 갖는 강한 성능.

현재 유용한 상기 기술 중 어느 것도 대부분의 상기 이상적인 특성을 만족시키지 않는다. 이들 모두는 다음을 포함하는 몇몇 제한 중 적어도 하나에 의해 손상된다: 고가; 속도 결함; 많은 양의 DNA에 대한 조건; 낮은 다형태성 검출 속도; 점 변이와 같은 작은 서열 변형을 검출할 수 없는 능력; 가공물 및 가상의 결과의 높은 발생률과 함께 적합도의 결함; 몇몇 복합체 게놈을 동시에 분석할 수 없는 능력; 다중 위치에서 다형태성을 동시에 해결할 수 없는 능력; 분석을 위해 밀접하게 관련된 게놈에 대한 고유한 필요성; 이미 알려진 서열의 필요성; 및 비싼 장치 및 컴퓨터 소프트웨어의 필요성과 함께 분석의 복잡성. 또한, 밀접하게 관련된 개체들의 상과에 의존하는 상기 기술들은 계통에서 어긋나는 곳에서 더욱 손상되어서, 부계 테스팅 (paternity testing)은 분석을 받는 각 과의 개체의 통합을 달성하기 위한 필수적인 지배적 조사일 수 있다.

본 발명은 모든 유기체 내의 유전성 형질의 연구의 목표인 복합체 게놈 (genome) 내의 다형태성 변형의 검출에 관한 것이다. 다원유전성 형질은 단일유전자인 과체중 개체와는 거리가 있기 때문에, 다수의 개체의 복합체 게놈 내의 몇몇 정보성 다형태성의 개념으로 분리를 가능하게 하는 방법은 유전성 형질의 조사를 위한 매우 강력한 도구를 제공한다.

본 발명은 다음 단계를 먼저 사용하는 다른 모든 기술과는 근본적으로 다르다:

(ⅰ) DNA로부터 빠르고 쉽게 VNTR를 제조할 수 있는 단계:

(ⅱ) 서로 연결되며, 형질에 대한 정보를 주는 다형태성을 만드는 단계:

(ⅲ) 상기 게놈 내에서 발생하는 것과 같이, 상기 다형태성 대립유전자를 재생하고 보존하는 단계:

(ⅳ) 미스 프라이밍 (mis priming), 반응 오염 및 가상 생성물의 생성을 포함하며, 다른 폴리머라제 사슬 반응에 기초한 기술의 특징인 문제를 부정하는 단계:

(ⅴ) 밀접하게-관련된 개체의 과(family)를 제한하는 조하의 요구를 부정하는 단계:

(ⅵ) 다원유전성 형질을 분석하는 단계:

(ⅶ) DNA 출발 물질을 위한 관대한 조건을 갖는 단계.

그러므로, 본 발명은 유리하거나 불리한 단일유전성 또는 다원유전성 유전적 형질로 다형태성 공-분리를 위해 빠르고 정확하게 단순 또는 복합체 게놈을 스크린 (screen)하기 위한 생의한 분야의 요원의 능력의 주요한 향상을 나타낸다. 이는 사회적 또는 경제적으로 중요한 유전성 질병 또는 형질로 공-분리하는 다형태성 표시제의 생성에 의해, 의학, 수의학, 법과학, 농학, 동물 경작 및 생물학의 발전에 큰 잠재성이 있다. 본 발명은 또한 모든 관련 유기체에 대한 변이 분석을 촉진하는 작용을 할 것이다.

본 발명은 플랭킹 서열 (flanking sequence)을 갖는 각각의 대립유전자를 보존하면서, 게놈상 또는 합성 DNA로부터 VNTR을 대량으로 제조하는 신규한 방법이다. 상기 대립유전자는 젤 전기영동법에 의해 '지문'을 제조하는데 사용될 수 있거나, 이들은 유전적 형질로 공-분리하는 다형태성 표시제의 분리를 위한 방법 또는 개체의 인자형을 형성하는 방법에서 출발 물질로서 사용될 수 있다. 후자는 특정 형질을 나타내는 모든 개체들에 공통인 한 그룹의 대립유전자의 생성하는 불-일치 식별법에 의해 달성될 수 있다. 또한, 용액 또는 배열에 고정된 형으로, 상기 형질이 존재하지 않는 개체의 대립유전자와 상기 선택된 대립유전자의 불-일치 식별법은 특정 형질에 정보성이 있으며, 모두 연결된 대립유전자를 갖는 VNTR의 정제를 가능하게 한다. 그러므로, 최종 생성물은 형질에 대해 정보성이 있는 대립유전자의 전체 발현 (Total Representation of Alleles Informative for a Trait (TRAIT))으로 나타낸다.

한 목적으로 본 발명은 다음 단계를 포함하며, 특정 종의 하나 또는 그이상의 원소의 게놈상 DNA의 플랭킹 영역 및 VNTR 대립유전자의 혼합물을 제조하는 방법을 제공한다:

a) 특정 종의 게놈상 DNA를 단편으로 나누는 단계;

b) 각 3'-말단이 효소 사슬 연장을 방지하기 위해, 각 단편의 각 말단에 어뎁터를 연결하여 차단된 어뎁터-끝처리된 단편의 혼합물을 제조하는 단계;

c) 어뎁터-말단화된 단편의 혼합물의 일부를 어뎁터 프라이머 및 VNTR 프라이머와 함께 주형으로 사용하여 5'-플랭킹 VNTR 증폭자를 제조하는 단계;

d) 어뎁터-말단화된 단편의 혼합물을 어뎁터 프라이머 및 VNTR 안티센스 (antisense) 프라이머와 함께 주형으로 사용하여 3'-플랭킹 VNTR 증폭자를 제조하는 단계;

e) 및 특정 종의 하나 또는 그 이상의 원소의 게놈상 DNA를 5'플랭킹 VNTR 증폭자의 혼합물과 함께 주형으로 사용하고, 3'-플랭킹 VNTR 증폭자를 프라이머로 사용하여 VNTR 대립유전자 및 이들의 플랭킹 영역으로 이루어진 원하는 혼합물을 제조하는 단계.

상기 특정 종은 식물 및 동물계로부터 얻은 진핵 종일 수 있다. 비록 이들이 아주 동일한 방법으로 반복적인 서열을 나타내지 않을지라도, 원핵 종도 또한 고려에 넣는다. 한 종의 개체 원소는 예를 들면 마이크로유기체 (micro-organism) 또는 포유류와 같은 동물일 수 있다.

또 다른 목적으로, 본 발명은 특정 종의 하나 또는 그 이상의 원소의 게놈상 DNA의 일부를 제공하며, 상기 일부분은 선택된 VNTR 서열 및 이들의 플랭킹 영역의 대립유전자의 대표적인 혼합물로 필수적으로 이루어진다.

용어 "대립유전자의 대표적인 혼합물"은 모든 가능한 대립유전자, 또는 상기 가능한 대립유전자의 대부분, 선택된 VNTR 서열이 존재하는 것을 필수적으로 의미하는 것은 아니다. 특정 대립유전자가 존재하든 그렇지 않든, 예를 들면, 상기 정의된 방법에 의해 생성된 혼합물은 단계 a)에서 사용된 제한 효소의 성질 및 다른 인자에 의존할 수 있다.

본 발명은 또한 특정 종의 게놈상 DNA의 일부를 제공하며, 상기 일부분은 선택한 VNTR 서열의 3'-플랭킹 영역의 대표적인 혼합물로 필수적으로 이루어지며, 상기 혼합물의 각 원소는 3'-말단에서 어뎁터를 운반한다.

본 발명은 또한 특정 종의 게놈상 DNA의 일부를 제공하며, 상기 일부분은 선택한 VNTR 서열의 5'-플랭킹 영역의 대표적인 혼합물로 필수적으로 이루어지며, 상기 혼합물의 각 원소는 5'-말단에서 어뎁터를 운반한다.

또한, 본 발명은 예를 들면, 선택 VNTR 서열 및 이들의 플랭킹 영역, 또는 선택적으로, AFLP, 마이크로위성-AFLP, GMS 또는 RAPD와 같은 약간 다른 방법으로 생성된 혼합물의 다형태성 대립유전자 혼합물을 취급하는 방법을 제공하며, 상기 혼합물은 특정 형질을 나타내는 대표 물질이며, 상기 방법은 상기 혼합물의 가닥을 분리 후 재-어닐링하는 단계, 특정 불-일치를 분리하고 제거하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 상기 방법은 예를 들면, 선택한 VNTR 서열 및 이들의 플랭킹 영역, 또는 AFLP와 같이 약간 다른 방법으로 생성된 혼합물, 마이크로위성-AFLP, GMS 또는 RAPD의 해당 다형태성 대립유전자 혼합물과 상기 혼합물을 교잡하는 부가적인 단계를 포함하며, 상기 물질들은 특정 형질에 특징이 있는 다형태성 대립유전자의 혼합물을 제공하기 위해 불-일치를 선택하며, 특정 형질을 나타내지 않는 대표 물질이다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 방법을 수행하기 위한 방법 및 시약을 포함하는 키트 (kit)를 제공한다.

본 발명의 두드러진 점은 다음과 같이 나타내어 질 수 있다:

(ⅰ) 선택된 어뎁터와 모두 연결되며, PCR, NASBA 또는 다른 방법에 의한 생성물의 강화를 사용하여, 선택한 프라이머와 동일한 서열을 포함하는 게놈상 DNA 제한 단편의 이중 포지티브 선택 (double positive selection)에 의해 게놈의 복잡성의 감소;

(ⅱ) 상기 대립유전자를 보존하고, 그러므로 각 위치의 정보를 보존하면서, 주형 내에 상기 클랭킹 서열을 갖는 VNTR의 재생을 가능하게 하는 방법으로, 상기 선택된 강화 단편의 게놈상 주형으로의 삽입;

(ⅲ) 오 프라이밍 (miss priming), 반응 오염 및 반응 조건의 보호한 변형을 통해 발생하는 증폭의 특정한 가상의 생성물을 제거하기 위해 상기 제조된 VNTR 대립유전자의 불-일치 식별;

(ⅳ) 상기 그룹의 개체에서 우세한 대립 유전자 또는 특정 형질을 나타내는 개체 모두에 공통인 합성된 VNTR 대립유전자만의 선택. 이는 상기 개체들 사이에 다른 위치에서 대립유전자의 이종이중사슬을 함유하는 불-일치를 발생시키는 가닥 분해 및 교잡에 의해 성취된다. 상기 복합체는 불-일치 식별법에 의해 거부(rejectiot) 될 수 있다. 상기 강화된 대립유전자들은 상기 형질을 나타내는 개체에 공통이거나, 상기 그룹이 다형태성 대립유전자를 이용하는 다른 DNA 기초 연구에서 출발 물질로서 사용하기에 충분히 순수하다는 점에서 지배적이다;

(ⅴ) 상기 형질이 존재하지 않는 개체에서도 또한 공통인 상기 그룹에서 지배적이거나, 특정 형질을 나타내는 모든 기체에 공통인 대립유전자의 거부. 이는 상기 형질이 또 다른 불-일치 식별법에 의해 동반, 존재하지 않는 개체의 VNTR 대립유전자를 갖는 그룹에서 지배적이거나, 또는 특이한 특정 형질을 나타내는 개체에서 공통인 VNTR 대립유전자의 가닥 분해 및 교잡화에 의해 성취될 수 있다. 상기 경우에 있어서, 유전적 형질을 나타내는 기체로부터 분리된 이종이중사슬 및 동종이중사슬을 포함하는 불-일치가 선택된다. 이는 특이한 특정 형질로 공-분리하는 정보성 대립유전자를 갖는 다형태성 VNTR을 발현시킨다. 특정 형질을 나타내는 개체의 DNA로부터 얻은 상기 VNTR의 증폭은 DNA 표시제로서 사용될 수 있는 정보성 대립유전자를 생성한다.

본 발명은 직접 존재하지 않거나 낮은 수준에서 존재하는 한 그룹의 개체에 공통인 유전 원소를 선택하는 방법을 제공한다. 이러한 주제 하의 분명한 변형은 한 그룹의 개체 내에는 없으나, 상기 절자의 과정 동안, 불-일치의 존재 또는 부재하의 대립유전자 이중사슬의 올바른 선택에 의해 바로 존재하는 유전 원소의 선택이다.

단순화를 위해, 상기 방법은 세 개의 분리법을 고려할 수 있다: VNTR 대립유전자의 제조; 불-일치 식별법; 및 형질에 대한 정보성이 있는 대립유전자의 선택. 상기 내용은 본 발명의 설명을 촉진시키기 위해 많은 도와 함께 예시된다.

VNTR 대립유전자의 제조

상기 방법은 한 개체의 게놈상 DNA 또는 몇몇 개체의 그룹화된 DNA로부터 대량으로 플랭킹 서열을 갖는 VNTR 대립유전자를 적합하게 제조하는 방법을 기술하고 있다. 초기 단계는 상기 게놈상 DNA를 물리적, 화학적 또는 효소적으로 단편화하는 단계를 포함하며, 상기 단계의 목적은 증폭가능한 길이의 VNTR을 포함하는 게놈상 단편을 얻는 것이다. 하나 또는 그 이상의 제한 효소의 사용은 게놈상 시료의 균일한 단편화를 발생시키며, 바람직한 기술을 구성한다. 빈번히 절단하는 제한 효소의 적절한 선택으로, 한 게놈 또는 게놈 군 내의 선택된 타입의 모든 VNTR을 대량으로 생산할 수 있으며, 이는 모든 단편들이 효과적인 증폭화를 위해 충분히 작기 때문이다. 상기 단편화를 위한 게놈상 DNA에 영향을 미치는 개체들의 표현형 (phenotype)은 중요하지 않음을 주의해야 한다. 사실상, 상기 방법으로 제한된 게놈들은 특이한 특정 형질의 조사를 위해 이들의 표현헝에 의해 선택되는 특정 개체 또는 개체군으로부터 분리될 필요가 없다.

상기 제한 단편은 상기 단편이 증폭되거나 조작될 수 있는 어뎁터에 연결된다. 상기 어뎁터 내에 포함된 더 긴 올리고뉴클레오티드의 서열이 선택되어서, 게놈상 DNA를 포함하는 증폭 반응에 상기 프라이머로서 부가될 때 특정 생성물을 생성할 수 없다. 말단들은 물리적, 화학적 또는 효소적으로 모든 유용한 3'-말단에 도입되어 DNA 폴리머라제의 영향 하에 이들의 확장을 막을 수 있다. 이들은 다음을 포함하는 몇몇 방법 중 하나로 도입될 수 있다: (A) 연결 이전에 상기 말단의 부가; (B) 연결 다음에 상기 말단의 부가; (C) 연결 동안 상기 말단의 부가. 상기 목적에 적합한 유용한 말단의 스펙트럼 (spectrum)은 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dideoxynucleotide triphosphates)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

(A) 연결 이전에 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트와 모든 3'-말단의 말단화가 이루어지는 방법은 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 (Terminal deoxynucleotidyl transferase)를 포함하는 DNA 폴리머라제의 작용을 통해, 선택된 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서 이루어진다.

연결 후, 각 가닥 위에 상기 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 말단이 축적되는 절적한 5'-리세스 (recess)를 함유하는 어뎁터가 뒤따른다.

(B) 연결 다음에 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트와 모든 3'-말단의 말단화가 이루어지는 방법은 선택한 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 폴리머라제의 작용을 통해 이루어진다.

(C) 연결된 3'-말단이 상기 연결 과정 동안 말단화를 수행할 수 있는 방법은 합성 동안 더 짧은 올리고뉴클레오티드 상에 적절한 3' 말단 및 5' 포스페이트의 도입이 이루어져서, 상기 올리고뉴클레오티드는 T4 DNA 리가제 (ligase)와 같은 효소의 영향 하에서 상기 게놈상 단편과 공유 결합을 형성하게 될 것이다. 또한, 적절한 말단으로는 디데옥시뉴클레오티드 포스페이트를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, DNA 폴리머라제의 영향 하에서 상기 3'-말단의 확장을 저지할 디데옥시뉴클레오티드 유사체 및 다른 다양한 변형이 가능하다.

상기 설명 중 방법 (A)가 가장 신빙성이 있는 것으로 발견되었는데, 이는 어뎁터에 연결하는 모든 게놈상 단편이 적절한 말단을 갖는 것으로 보증되기 때문이다. 또한, 이는 상호-단편 연결 (inter-fragment ligation)이 불가능함을 보장한다. 방법 (C)는 또한, 각각 연결된 3' 끝이 말단을 가짐을 보장한다. 그러나, 방법 (A)의 경우와는 달리, 상호-단편 연결이 일어날 수 있다.

몇몇 단편들은 한 DNA 가닥이 틈이 난 위치를 함유하기 쉬우므로, 상기 위치로부터 중합반응을 저지하기 위해, 이들 내에 적절한 말단을 삽입시키는 것이 바람직하다. 이는 말단화되고 연결된 게놈상 단편을 모든 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 폴리머라제와 함께 인큐베이션 (incubation)하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 방법으로 수행될 수 있다.

상기 어뎁터 내에 함유되는 더 긴 올리고뉴클레오티드는 중합가능한 모든 위치에서 말단의 부가에 의해 차단되고, 적절하게 연결된 게놈상 단편을 함유하는 증폭화 반응에서 어뎁터 프라이머로서 사용될 수 있다. 그러나, 또 다른 뉴클레오티드 서열로부터 '상호' 프라이밍을 없애면, DNA의 증폭은 불가능하다. 그러나, 만일 또 다른 뉴클레오티드 서열이 어뎁터의 한계에 성공적으로 어닐 (anneal)하고 중합반응을 달성한다면, 어뎁터 프라이머 결합 위치가 생성된다. 상기 어뎁터 프라이머의 결합은 상기 어닐된 뉴클레오티드 서열의 한계에 DNA의 중합반응을 가능하게 한다. 만일 상기 뉴클레오티드 서열이 프라이머를 발현시키거나, 또는 프라이머 결합 위치를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 발현시킨다면, 상기 어뎁터 프라이머 및 상기 '상호 프라이머'의 도입은 상기 어딜된 뉴클레오티드 서열과 유사한 DNA를 함유하며 상기 어뎁터에 성공적으로 연결되는 단편으로부터만 얻은 생성물의 특정한 지수적 증폭화를 가능하게 한다.

만일 선택한 VNTR과 유사한 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 상기 상호 프라이머로서 사용된다면, 상기 어뎁터에 성공적으로 연결되며, 상기 타겟화된 (targeted) VNTR을 함유하는 단편만이 증폭할 수 있을 것이다. 이는 상기 선택된 VNTR 프라이머와 유사한 VNTR 서열 및 선택한 제한 효소에 대한 제한 자리에 의해 제한된 게놈상 서열을 포함하는, 각 VNTR을 플랭킹 (flanking) 하는 '증폭자'를 발생시킨다.

다양한 범위의 종에서 다수의 다른 타입의 VNTR 서열이 확인되었다. 이들은 디뉴클레오티드 반복단위, 트리뉴클레오티드 반복단위 및 테트라뉴클레오티드 반복단위를 포함한다. 상기 (AC)n 디뉴클레오티드 반복단위는 대부분의 종에서 발생하는 가장 공통의 VNTR을 구성하기 때문에, 상기 VNTR을 위한 증폭자를 생성하는 적절한 서열의 프라이머가 선택될 수 있다. 이는 (AC)n 프라이머의 도입이 상기 VNTR의 한 플랭크 (flank)를 발현시키는 증폭자를 발생시키며, (GT)n 프라이머의 도입은 상기 VNTR의 다른 플랭크를 발현시키는 증폭자를 발생시킬 것으로 보인다. 그러나, 긴 반복 길이를 갖는 VNTR은 더 많은 프라이머 결합 자리에 의한 더 짧은 VNTR과 비교하여 증폭자 풀 (pool)에서 과 발현된다. 유사하게, 더 긴 대립유전자는 더 많은 프라이머 결합 자리에 기인한 동일한 VNTR의 더 짧은 대립유전자와 비교하여 과 발현될 것이다. 이러한 문제는 상기 플랭킹 서열의 출발과 함께 배열되지 않는다면, 상기 어닐된 프라이머의 중합을 저지하는 상기 VNTR 프라이머 상의 변성 3' 말단의 도입에 의해 부정된다. 그러므로, 모든 VNTR 및 모든 대립유전자의 증폭은 이들의 반복 길이에 의해 한쪽으로 치우치게 되지 않을 것이다. (AC)n 디뉴클레오티드 반복단위의 경우, 하기 프라이머들이 사용될 수 있다:

(AC)nB, 여기서 B = C + G + T

(CA)nD, 여기서 D = A + G + T

(GT)nH, 여기서 H = A + C + T

(TG)nV, 여기서 V = A + C + G

선택적으로, 다른 VNTR 서열의 증폭자는 변성 3' 말단을 함유하는 적절한 타겟-특이적 프라이머의 도입에 의해 상기 방법으로 제조될 수 있다. 사살상, 특정 타겟-특이적 뉴클레오티드 결합 자리를 함유하거나 플랭킹하는 게놈상 서열을 구성하는 증폭자도 동일한 방법으로 제조될 수 있다.

(AC)n 디뉴클레오티드 반복단위의 경우에 있어서, 상기 (AC)nB 및 (CA)nD 변성 올리고뉴클레오티드에 의해 프라임화된 반응으로부터 얻은 증폭자는 풀 (pool)화될 수 있다. 분명한 대체방법은 상기 (AC)nB 및 (CA)nD 변성 올리고뉴클레오티드모두로 증폭반응을 프라임화함으로써 증폭자 풀을 생성하는 것이다. 그러나, 이는 독립적으로 반응을 수행하는 것 보다 덜 효과적인 것처럼 보인다. 유사하게, 상기 (GT)nH 및 (TG)nV 프라임화된 반응은 풀화될 수 있거나, 또는 상기 변성 프라이머를 모두 함유한 반응이 수행될 수 있다. 결과적으로, 두 개의 증폭자 풀이 제조될 수 있으며, 각각은 각 VNTR의 단 하나의 플랭크로부터 얻은 서열을 발현시킨다.

전체 대립유전자 길이는 존재하지 않으면서, 모든 VNTR의 두 개의 플랭킹 서열중 단지 하나만이 각 증폭자 풀에서 생성되기 때문에, 상기 증폭화반응의 생성물은 정보성이 없다. 그러나, 상기 전체 길이 대립유전자는 이들의 플랭킹 서열과 함께, 상기 어닐된 서열의 계속적인 중합반응 및 상기 게놈상 DNA에 대한 상기 증폭자의 교잡반응에 의해 게놈상 DNA로부터 대량으로 적합하게 재생될 수 있다. 이와 같은 이유로, 특이한 특정 형잴을 나타내는 개체의 상기 전체 길이 '영향받은' VNTR 대립유전자는 상기 개체의 게놈상 DNA에 대한 증폭자의 교잡반응에 의해 얻어질 수 있다. 유사하게, 형질이 존재하지 않는 개체에 대한 역 반응은 이들이 상기 개체의 게놈상에서 발생할 때, 전체 길이 '와일드 타입 (wild type)' VNTR 대립유전자 및 플랭킹 서열을 생성시킬 것이다. 결과적으로, '와일드 타입' DNA로부터 얻은 대립유전자 및 '영향받은' DNA로부터 얻은 대립유전자를 함유하는 두 개의 VNTR 풀이 생성될 수 있다. 중합반응 동안 가닥 손실을 발생시키는 '스튜터 밴드 (stutter band)'의 생성 가능성을 최소화시키기 위해 상기 분야에 매우 진행적인 DNA 폴리머라제가 바람직하다.

교잡반응 동안 증폭자 가닥의 비-특이적 연합을 통하여 발생하는 '크로스-토크 (cross-talk)'에 의한 가상의 생성물의 생성 가능성을 제한하기 위하여, 상기 증폭자로부터 얻은 VNTR 반복 서열을 제거하는 것이 바람직하며, 이는 이들 반복 서열들이 상기 대부분의 크로스-토크의 원인이 되기 때문이다. 이는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 방법으로 초기화될 수 있다; (A) 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제 (exonuclease) 활성을 갖는 효소에 의한 소화 단계; (B) 5' 내지 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 소화 단계; (C) 유라실 (uracil)을 함유하는 프라이머로 생성된 증폭자 풀의 유라실 DNA 글리코실라제 (Uracil DNA glycosylase)에 의한 소화 단계; (D) RNA 프라이머로 생성된 증폭자 풀의 RNase에 의한 소화 단계.

(A) 상기 어뎁터 프라이머의 5' 말단이 모든 네 개의 뉴클레오티드를 가짐을 가정하면, 반대 가닥은 유사하게 주어질 것이다. 이와 같은 이유로, T4 DNA 폴리머라제와 같은 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 함께, 12℃에서 단지 두 개의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서의 인큐베이션은 상기 어뎁터 프라이머와 상보적인 3' 가닥의 의미있는 길이감소를 초래하지 않을 것이다. 그러나, 상기 VNTR 프라이머와 상보적인 3' 가닥은 만일 상기 반응이 부족한 디데옥시뉴클레오티드의 존재하에서 발생한다면 T4 DNA 폴리머라제에 의해 제거될 것이다. 상기 효소에 의한 엑소뉴클레아제 소화는 상기 반응 혼합물에 존재하는 첫번째 데옥시뉴클레오티드가 만날때 중단할 것이다. 생성되는 5' 돌출부 (overhang)는 모든 반복 서열이 제거되도록, 엑소뉴클레아제 Ⅶ (Exonuclease Ⅶ)를 포함하나 이에 한정되지 않는 단일 가닥 특정 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제 (endonuclease)로 소화될 수 있다. 다음 예는 (AC)n 및 (GT)n 프라임화된 증폭자의 시나리오 (scenario)를 도시하고 있다:

만일 트리뉴클레오티드 VNTR이 타겟화된다면, 단지 하나의 데옥시뉴클레오티드의 존재하에서 T4 DNA 폴리머라제에 의한 적절한 소화가 요구될 것이다. 테트라뉴클레오티드 반복단위에 대하여, 상기 방법은 부적절하며, 또 다른 방법이 적용되어야 한다.

(B) 상기 반복 서열은 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제와 같은 5' 내지 3' 엑소뉴클레아제로 소화될 수 있다. 포스포로티오에이트 결합 (phosphorothioate bond)은 상기 효소의 활성을 지연시킨다. 네 개의 연속적인 결합이 억제하는데 고려된다. 그러므로, 만일 상기 어뎁터 프라이머가 5' 말단에서 적어도 네 개의 포스포로티오에이트 결합과 함께 합성되고, 포스포로티오에이트 결합과 완전하게 합성되지 않는다면, 이는 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제의 5' 내지 3' 엑소뉴클레아제 활성에 저항을 가질 것이다. 만일 상기 VNTR 프라이머가 이들의 3' 말단에서 네 개의 포스포로티오에이트 결합으로 합성된다면, T7 유전자 6 엑소뉴클레아제의 작용은 네 개의 뉴클레오티드의 반복 서열을 남기고 상기 VNTR 프라이머를 소화할 것이다. 상기 상보적인 서열은 모든 반복 서열이 각 가닥 내의 네 개의 뉴클레오티드로부터 떨어진 증폭자로부터 제거되도록 엑소뉴클레아제 I을 포함하나, 이에 한정되지 않는 단일 가득 특이적 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제에 의해 소화될 것이다. 상기 짧은 길이의 반복 서열은 교잡반응 동안 가닥 말단의 비-특이적 상호작용에 의한 가상의 생성물의 생성을 초래하기 어렵다.

(C) 예를 들면 (GU)nH 및 (UG)nV와 같은 VNTR 프라이머를 함유하는 유라실의 합성은 유라실 DNA 글리코실라제의 작용에 의해 적절한 증폭자 풀 내에서 사익 프라이머들을 파괴시킨다. Si 뉴클레아제를 포함하나 이에 한정되지 않는 단일 가득 특이적 엔도뉴클레아제로 소화된 증폭자의 인큐베이션은 단일 가닥화된 공간을 함유하는 VNTR 프라이머의 부가적인 소화를 초래하며, 결과적으로, 모든 반복 서열이 제거되도록 상기 상보적인 서열의 제거를 초래한다.

(D) 역전사효소 (reverse transcriptase)와 함께 DNA 폴리머라제를 이용하여, VNTR 서열에 기초한 RNA 프라이머를 갖는 증폭자 풀을 제조하는 것은 RNAse의 작용에 의해 상기 VNTR 프라이머의 파괴를 가능하게 한다. 상기 상보적 서열은 단일 가닥 특이적 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제에 의해 제거될 수 있다.

몇몇 방법에서는 상기 소화된 증폭자들은 이들이 그 조형 내에서 발생할 때, 상기 VNTR 대립유전자를 대량으로 적합하게 생성하기 위해 하나 또는 그 이상의 개체의 게놈상 DNA와 교잡될 수 있다. 이는 (A) 단편화되거나 될 수 없는 게놈상 DNA와 함께 또는 각각 연속해서 상기 증폭자 풀의 교잡 및 중합반응; (B) 물리적, 화학적 또는 효소적으로 단편화된 후, 말단화되고, 상기 증폭자 풀을 제조하는데 사용되거나 사용되지 않은 어뎁터에 연결된 게놈상 DNA에 각 VNTR의 단지 하나의 플랭크를 구성하는 증폭자의 교잡반응 및 증폭반응. 각 경우에 있어서, 많은 교잡반응 촉진자 (accelerator) 중 하나를 부가하면 교잡반응 속도가 증가된다. 특히, 교잡반응의 엄격한 조건 하에서, 상기 촉진자의 사용이 바람직하다. 교잡반응이 촉진되는 방법은 많지만, 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드 (cetyl trimethylammonium bromide, CTAB)와 같은 페놀 축출 (phenol exclusion), 양이온 세제 (detergent) 및 텍스트란 설페이트 (dextran sulphate)와 같은 부피 축출제 (volume excluding agent)의 삽입을 포함한다. 만일 CTAB가 선택된 교잡반응 촉진자라면, 상기 교잡반응 혼합물 내의 염 (salt)의 농도는 그의 침전물을 막기 위해 낮아야 한다는 것을 주의해야 한다.

(A) 다음 예는 DNA 폴리머라제에 의한 상기 게놈상 주형 내의 VNTR 대립유전자의 재생을 가능하게 하는 게놈상 DNA에 하나의 증폭자 풀을 교잡하는 것이다:

제 2 증폭자 풀의 교잡반응은 상기 어뎁터 프라이머를 이용하여 대량으로 모든 VNTR 대립유전자의 증폭을 가능하게 한다:

(B) 다음 예는 단편화되고, 말단화되며 증폭자 풀에 존재하는 것과 같거나 다른 어뎁터와 연결된 게놈상 DNA와 하나의 증폭자 풀을 교잡하는 것이다:

상기 증폭자로부터 반복 서열의 제거는 비-특이적 가닥 연합을 통한 가상 생성물의 생성 가능성을 제한하면서 게놈상 DNA와 양쪽의 증폭자 풀의 동시 교잡을 가능하게 한다. 가상 생성물의 생성은 감소된 또 다른 인자이다. 그러나, 만일 영향받은 개체 및 와일드 타입 개체의 수가 제한된다면, 일치된 자매세포 쌍, 즉, 한 원소는 영향받은 개체이고, 다른 한 원소는 와알드 타입 개체인 쌍의 선택은 특정 형질에 대하여 댜른 풀화된 게놈의 대립유전자 빈도를 조정하기 위해 특정 거리를 둘 것이다.

불-일치 식별법

만일 상기 영향받은 개체 및 와일드 타입 개체로부터 생성된 VNTR 대립유전자가 변성되고, 각 반응에서 재-어닐된다면, 불-일치가 존재하거나 존재하지 않는 이중사슬 DNA 분자가 생성될 것이다. 상기 VNTR-특이적 플랭킹 서열 및 교잡반응의 엄격한 조건에 기인하여, 동일한 VNTR인 대립유전자만이 재-어닐할 것이다. 그러므로, 불-일치를 갖는 이중사슬은 동일하지 않은 크기인 동일한 VNTR의 대립유전자를 포함하거나, 이들은 증폭화의 가상 생성물을 포함한다. 재-어닐하는 유사한 크기의 대립유전자는 완전한 이중사슬을 형성할 것이다.

불-일치를 함유하는 분자들은 DNA 내의 구조상 비정규성 (conformational irregularity)을 검출할 수 있는 효소 또는 단일 가닥화된 DNA 상에 작용하는 효소로 소화될 수 있다. 적합한 효소로는 S1 뉴클레아제 및 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 두 개의 효소 중에서, T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ는 상기 분야에서 가장 신빙성 있고 효율적인 효소인 것으로 드러났으며, 교잡반응으로부터 CTAB의 과-운반 (carry-over)을 경험하면서 DNA 폴리머라제 완충액의 범위에서 효과적으로 소화하는 것을 발견하였다.

절단은 연속적인 증폭 과정 동안 비-특이적으로 상호작용하여 결과적으로 가상의 생성물을 형성하는 말단을 생성하는 반복 서열 내에서 발생하기 쉽다. 상기 문제를 극복하기 위해, 상기 반복 서열은 상기 절단된 이중사슬로부터 소화될 수 있다. 이는 (A) α-티오포스페이트 (thiophosphate) 기 또는 3' 오버행 (overhang)을 포함하나 이에 한정되지 않는 보호 말단과 함께 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ 소화 이전에 모든 DNA 가닥을 보호하면서, 단일 가닥 특이적인 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제와 함께, 엑소뉴클레아제 Ⅲ를 포함하나, 이에 한정되지 않는 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제의 작용에 의해; (B) 상기 어뎁터 프라이머에 삽입된 포스포로티오에이트 결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 보호기와 함께 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ 소화 이전에 모든 DNA 가닥을 보호하면서, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제와 함께 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제를 포함하나 이에 한정되지 않는 5' 내지 3' 엑소뉴클레아제의 작용에 의해 다양한 방법으로 성취될 수 있다.

상기 어뎁터 프라이머 내의 포스포로티오에이트 결합의 삽입에 의해, 상기 어뎁터 프라이머를 포함하는 모든 분자의 5' 말단은 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제의 5' 내지 3' 엑소뉴클레아제 활성도에 저항할 것이다. 그러나, T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ에 의해 생성된 5' 말단은 상기 효소에 민감할 것이다.

몇몇 분자들은 단일 가닥화된 틈 (nick)만을 필요로 하는 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ에 의한 완전한 절단을 피할 수 있다. 그러나, 만일 상기 효소가 단일 가닥 특이적 엑소뉴클레아제인 개념으로 사용된다면, 단지 틈이 있는 가닥만이 소화될지라도, 상기 틈은 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제에 의한 소화에 민감하다. 바꾸어 말하면, S1 뉴클레아제를 포함하나 이에 한정되지 않는 단일 가닥 특이적 엔도뉴클레아제는 양 가닥이 파괴되도록 단일 가닥화된 틈을 수용하는 분자 내에 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제의 작용에 의해 노출된 상보적인 단일 가닥을 절단할 것이다. 결과적으로, T7 유전자 6 엑소뉴클레아제와 함께 S1 뉴클레아제와 같은 효소는 하나 또는 양쪽 가닥이 절단되는 것과 무관한 모든 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ 소화된 분자의 완전한 소화를 초래할 것이다.

S1 뉴클레아제는 상기 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 완충액에 의해 생성된 알칼린 조건하에서 단일 가닥화된 DNA의 효과적인 소화를 가능하게 하면서, 상기 작용에 성공적인 것으로 판명되었다. 그러나, DNA의 몇몇 비-특이적 소화가 상기 효소와 함께 발생한다. T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ의 작용에 의한 단일 가닥화된 틈을 수용하는 상기 분자들이 적은 것처럼 보이기 때문에, 상기 방법으로 작용하기 덜 쉬운 단일 가닥 특이적 엑소뉴클레아제를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 효소들 중에서 엑소뉴클레아제 I 및 엑소뉴클레아제 Ⅶ가 포함된다. 불-일치가 결함된 분자들은 소화의 상기 양식에 저항할 것이며, 증폭화에 의해 보강될 것이다. 상기 증폭화 반응 동안 가닥 손실 및 폴리머라제 오차로 발생하는 '스튜터 밴드'의 생성을 최소화하기 위해, 증폭화의 사이클 (cycle) 수는 생성물의 적절한 수율을 제공하는 것 보다 초과해선 안된다.

T7 유전자 6 엑소뉴클레아제에 부가하여, 엑소뉴클레아제 Ⅲ가 DNA 분자 내의 틈에서 작용할 수 있다. 상기 어뎁터 프라이머 내의 포스포로티오에이트 결합의 부재하에서, 상기 효소는 틈이 난 분자 내에 소화의 완결시 긴 3' 오버행을 생성한다. 그러므로, 상기 오버행을 제거하는 단일 가닥 특이적 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제의 삽입은 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ가 불-일치 함유 이중사슬 내에서 하나 또는 양 가닥을 파괴하는 것과 무관하게 절단된 분자의 제거를 가능하게 한다. 그러나, 불-일치 절단에 앞서 모든 DNA 분자의 3' 말단의 보호단계를 포함하는 부가적인 단계에 대한 조건을 충족시키기 위해, T7 유전자 6 엑소뉴클레아제가 바람직한데, 이는 상기 효소의 사용에 요구되는 5' 말단의 보호가 상기 어뎁터 프라이머 내로의 포스포로티오에이트 결합의 삽입에 의해 쉽게 성취되기 때문이다.

절단된 분자가 제거될 수 있는 또 다른 방법은 또 다른 시약에 대한 햅텐의 친화도에 의해 상기 절단된 분자의 물리적인 분리 다음에 오는 절단 자리에서 바이오틴-16-dUTP (biotin-16-dUTP)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 햅텐 (hapten)의 부가에 의한 것이다. 이는 이들이 DNA 폴리머라제의 존재하에서 불활성이 되도록 불-일치 절단 방법 이전에 모든 분자의 3' 말단의 말단화에 의해 성취될 수 있다. 적절한 말단은 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 (Terminal deoxynucleotidyl transferase)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 DNA 폴리머라제에 의해 삽입될 수 있는 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제와 같은 DNA 폴리머라제의 존재하에서 바이오틴-16-dUTP와 함께 상기 절단된 분자의 계속적인 인큐베이션은 말단화된 3' 말단이 결핍된 분자만 바이오틴화 (biotinylation)시킨다. 그 후, 스트렙타비딘 (streptavidin)과의 결합을 통한 상기 바이오틴화된 분자의 분리가 수반된다.

유사한 방법으로, T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ에 의해 절단된 분자들은 3' 오버행을 갖기 때문에, 상기 분자들은 단일 가닥화된 DNA에 대한 친화성을 갖는 단일 가닥 결합 단백질 또는 시약에 의한 포획 (capture)을 통하여 제거될 수 있다. T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ에 의해 절단된 상기 오버행은 본 발명의 방법에 의해 절단된 분자의 효솨적인 선택을 위해 너무 작게 되기 쉽다. 이들은 DNA 풀리머라제의 존재하에서 불활성으로 만드는 적절한 말단과 함께 불-일치 절단 이전에 상기 DNA 분자의 말단화된 모든 3' 말단을 갖는, 하나 또는 그 이상의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 DNA 폴리머라제와 함께 인큐베이션함으로써 특이적으로 확장될 수 있다.

DNA 분자의 물리적 분리는 문제가 되며, 효소적 수단에 의한 분리와 비교하여 상대적으로 효과적이지 않다. 또한, 단일 가닥호된 틈을 갖는 분자의 제거는 성공적이지 못하게 된다. 이러한 이유로, DNA 종의 효소적인 차별화 방법이 바람직하다.

변성의 몇몇 반복, 교잡화 및 불-일치 절단은 모든 증폭화의 가상 생성물을 성공적으로 제거한다. 또한, 이는 각 VNTR의 가장 공통의 대립유전자만이 남겨지도록 모든 VNTR의 동형접합성을 감소시키거나, 많은 대립유전자가 동일한 빈도로 존재하는 상기 VNTR을 제거하려는 경향이 있다. 변성 온도에서 어닐링 온도로의 빠른 전이는 동일한 크기의 대립유전자의 바람직한 어닐링을 방해할 필요가 있다. 이는 만일 상기 변성 온도로부터 어닐링 온도까지의 전이를 오래끈다면 발생할 수 있다. 교잡반응의 효율을 증가시키기 위해 교잡반응 촉진자가 삽입될 수 있다. 상기 '와일드 타입' VNTR 대립유전자 뿐만 아니라 '영향받은' 대립유전자에 대하여 동등하게 수행되는 상기 공정은 균형을 이룬 대립유전자 생성 빈도 및 동종접합성을 동일하게 감소시키려는 경향이 있다. 그러나, 많은 VNTR에 대하여, 상기 불-일치 절단 방법의 끝 단계에서 상기 영향받은 그룹 및 와일드 타입 그룹에서의 대립유전자 빈도는 매우 다를 것이다. 특정 형질이 상기 VNTR이 유도되는 두 개의 개체 군을 구별하는 유일한 특징이라고 가정하면, 상기 와일드 타입 그룹과 비교하여 상기 영향받은 그룹에서 과발현되는 대립유전자는 상기 형질로 공-분리해야 한다. 상기 형질의 표시제들이 존재하며, 선택되어야 한다.

VNTR의 대립유전자 빈도에 대한 반복된 불-일치 절단의 영향은 소화 효율, 폴리머라제 오류에 대한 영향 및 교잡반응의 2차 속도를 부시하고 기본 시나리오로 예시될 수 있다. 다음과 같은 세 개의 대립유전자가 존재하는 VNTR을 고려해보자:

출발 시나리오

대립유전자	A	B	C
대립유전자 빈도	2/4	1/4	1/4
비율	2	1	1

만일 상기 대립유전자들이 변성되고, 재-어닐된다면, 오일치의 존재 또는 부재하에서 이중사슬 분자가 발생된다. 완전한 이중사슬을 형성하는 각 대립유전자의 비율은 그의 대립유전자 빈도에 의존할 것이다. 모든 불-일치 함유 분자들은 이론적으로 T4 엔도뉴클레아제 VII에 의한 소화에 민감하며, 제거된다. 결과적으로, 불-일치 절단의 제 1 라운드 (round) 후에, 잔존하는 각 대립유전자의 양 및 비율은 다음과 같다:

대립유전자	A	B	C
잔존량	4/16	1/16	1/16
전체 잔존량	6/16
비율	4	1	1
대립유전자 빈도	4/8	1/6	1/6

불-일치 절단의 제 2 라운드 후에 상기 대립유전자 빈도는 다음과 같이 변한다:

대립유전자	A	B	C
잔존량	16/36	1/36	1/36
전체 잔존량	18/36
비율	16	1	1
대립유전자 빈도	16/18	1/18	1/18

제 3 라운드 후에, 이론적인 대립유전자 빈도는 다음과 같다:

대립유전자	A	B	C
잔존량	256/324	1/324	1/324
전체 잔존량	258/324
비율	256	1	1
대립유전자 빈도	256/258	1/258	1/258

그러므로, 두 라운드 후에 하나의 대립유전자가 매우 우세하게 된다. 부가적인 라운드 후에, 상기 대립유전자는 사실상 독립적으로 존재한다. 불-일치 절단 전에 단지 하나의 대립유전자가 있었든 VNTR에 비교하여, 잔존하는 상기 VNTR의 전체 양의 비율은 다음과 같다:

동일한 방법으로, 특정 VNTR의 가장 공통의 대립유전자가 불-일치 절단의 충분한 라운드 후 우세할 것이다. 네 개의 라운드는 동종접합에 가깝게 상기 VNTR을 감소시키기에 충분하나. 효소 소화 효율, 폴리머라제 오차의 생성 및 교잡반응 속도 등은 이에 영향을 미칠 인자이다. 영향받은 VNTR 및 와일드 타입 VNTR의 대립유전자 빈도의 불일치는 만일 상기 불균형이 충분히 크다면 각 그룹에서 다른 대립유전자의 증가를 초래할 것이다. 상기 대립유전자들은 특정 형질에 대하여 정보성이 있으나, 만일 이들이 상기 형질과 일반적으로 무관하게 양적으로 우세하다면, 상기 영향받은 그룹 및 와일드 타입 그룹 모두에서 동일한 다른 증가된 대립유전자로부터 선택되어야 한다.

다른 시나리오 하에서 불-일치 구별법의 다른 예는 첨부와 같다.

형질에 대한 정보성이 있는 대립유전자의 선택

상기 특정 형질에 관한 대립유전자의 선택은 많은 방법으로 수행될 수 있다. 상기 불-일치 절단 방법의 연속적인 라운드에서 생존한 각 VNTR의 대립유전자 크기의 불일치는 개체의 각 군으로부터 얻은 상기 대립유전자를 차이가 검출될 수 있도록 공지의 길이 및 공간상 분리법으로 분리된 VNTR 대립유전자의 배열에 교잡시킴으로써 확인될 수 있다. 사실상, 상기 불-일치 절단 방법이 필요 없이 상기 두 개의 그룹 내의 대립유전자 빈도에 관한 정보를 만드는 유사한 방법으로 배열에 정량적으로 교잡반응할 수 있다.

덜 공들인 방법은 대립유전자 빈도의 차이를 확인하기 위해 한 그룹 내의 대립유전자를 다른 그룹 내의 대립유전자에서 빼는 방법을 포함한다. 그러나, 상기 방법은 한 그룹 내에 한 대립유전자가 존재하나ㅏ, 다른 그룹 내에는 대립유전자가 존재하지 않는 VNTR 뿐만 아니라, 상기 시나리오 모두가 특정 형질로 연결 불균형화 (linkage disequilibium)를 제시하기 때문에 각 그룹 내에 존재하는 상기 대립유전자들이 서로 다른 VNTR을 확인해야 한다. 이는 물리적, 화학적 또는 효소적으로 수행될 수 있다. 만일 효소에 기초한 선택이 선택된다면, 효소 소화가 완전히 수행될 수 있도록 하는 포스포로티오에이트 결합이 부족한 어뎁터 프라이머와 함께 상기 불-일치 절단 방법에 의해 증가되는 대립유전자를 증폭하는 것이 바람직하다.

효소 기본 선택의 적절한 방법은 적어도 네 개의 뉴클레오티드 또는 α-티오포스페이트 (α-thiophosphate) 연결의 3' 오버행 (overhang)을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 한 개체군의 생존하는 대립유전자에 대한 보호성 말단의 첨가 및 엑소뉴클레아제 Ⅲ를 이용한 다른 그룹에서 상기 생존하는 그룹의 과량의 제거를 포함한다. 대부분의 상황 하에서, 상기 형질이 결핍된 상기 개체군으로부터 생존할 수 없는 상기 영향받은 개체군으로부터 생존하는 특정 대립유전자의 확인이 요구된다. 이를 위해, 상기 보호성 말단의 첨가는 영향받은 개체로부터 제거된 상기 VNTR에만 첨가되어야 한다. (A) 어뎁터의 연결 또는 (B) DNA 폴리머라제에 의한 뉴클레오티드의 비-주형 (non-template) 첨가를 포함하나, 이에 한정되지 않는 많은 방법으로 3' 오버행이 제조될 수 있다. 이들 중, 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제와 같은 효소를 이용하여 성취되는 방법 (B)가 더 효과적인 것을 알았다. 상기 효소는 단일한 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서 인큐베이션시 몇백의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 제조할 수 있다. α-티오포스페이트 연결은 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 포함하나 이에 한정되지 않는 DNA 폴리머라제를 이용하여 보호성 데옥시뉴클레오티드 연결의 첨가에 의해 삽입될 수 있다. 적절한 유사체로는 α-티오데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함한다. 상기 유사체들은 DNA 분자의 연속적인 소화 또는 조작을 방해하기 때문에, 보호성을 부여하기 위해 3' 오버행의 첨가가 바람직하다. 엑소뉴클레아제 Ⅲ의 활성에 보호성을 부여하는 또 다른 덜 바람직한 방법은 이중사슬 DNA 내에 5' 리세스를 제조할 수 있는 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제를 포함하나 이에 한정되지 않는 5' 내지 3' 활성을 갖는 엑소뉴클레아제의 작용에 의한 것이다. 상기 DNA 분자를 증폭하는데 사용되는 상기 어뎁터 프라이머 내에 포스포로티오에이트 결합의 적절한 삽입은 엑소뉴클레아제 Ⅲ에 대한 내성을 부여하는데 필요한 것 이상의 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제에 의한 소화를 억제시킨다. 유사하게, 5' 리세스는 유라실 DNA 글리코실라제와 같은 효소를 이용하여 소화될 수 있는 상기 어뎁터 프라이머 내에 유라실 함유 5' 말단의 삽입에 의해 제조될 수 있다.

결과적으로 형성된 분자들은 생성되는 상기 3' 오버행 때문에 엑소뉴클레아제 Ⅲ 소화에 대하여 내성을 갖는다. 과량의 생존하는 와일드 타입 대립유전자와의 교잡반응은 상기 와일드 타입 그룹 내에 생존하는 적절한 VNTR의 대립유전자를 제공하는 모든 영향받은 대립유전자의 이종이중사슬 형성을 가능하게 한다.

만일 상기 영향받은 그룹의 대립유전자로부터 감하는 와일드 타입 대립유전자가 없다면, 각 말단에서 3' 오버행을 갖는 동종이중사슬 분자가 생성될 것이다 (분자 1). 만일 VNTR의 생존 대립유전자가 상기 두 그룹 사이에서 다르다면, 불-일치를 함유하는 이종이중사슬 분자가 생성될 것이다 (분자 2). 상기 두 그룹 내에 동일한 크기의 생존 대립유전자는 불-일치를 포함하지 않는 이종이중사슬 분자를 생성할 것이다 (분자 3). 상기 교잡반응으로부터 방생할 다른 종의 DNA는 불-일치 (분자 4) 및 교잡할 수 없는 단일 가닥 분자를 포함하거나 포함하지 않는 와일드 타입 대립유전자의 동종이중사슬을 포함한다. T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ를 포함하나, 이에 한정되지 않는, DNA 내의 구조상 비정규성 또는 단일 가닥화된 DNA에 작용하는 효소에 의한 상기와 같은 다른 타입의 분자의 소화는 절단 위치에서 3' 오버행의 생성과 함께, 불-일치를 함유하는 상기 이중사슬의 절단을 초래한다.

엑소뉴클레아제 Ⅲ에 의한 계속적인 소화는 각 말단에 3' 오버행이 없는 이중사슬의 단편 또는 모든 단일 가닥화된 이중사슬을 형성하게 한다.

엑소뉴클레아제 Ⅲ에 의한 민감한 분자의 소화는 완결시까지 진행하려는 경향이 있기 때문에, 단일 가닥 특이적 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 이용한 부가적인 소화는 모든 단일 가닥 DNA 종을 제거하며, 생존하는 분자 상에서 상기 3' 오버행을 제거한다. 그러므로, 타겟 분자만이 소화에 생존한다. 엑소뉴클레아제 Ⅰ은 상기 작업에 적절하나, 종종 단일 뉴클레오티드 3' 오버행이 남아서, 만일 상기 타겟 분자가 회복되는 방법으로 무딘 말단의 복제가 선택된다면 제거해야 한다.

순수 동중이중사슬에 대하여, 상기 정보성 대립유전자는 상기 동종이중사슬 내에 존재하며, 복제 (cloning) 및 시퀀싱 (sequencing)에 의해 확인될 수 있다. 엑소뉴클레아제 Ⅲ 및 엑소뉴클레아제 Ⅰ에 의한 소화에 살아남은 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ 절단 단편에 대하여, 전 길이 VNTR은 전술된 방법과 유사한 방법으로 증폭화반응 다음에, 단편화되고, 말단화된 어뎁터-연결된 게놈상 DNA에 상기 단편의 교잡반응에 의해 얻어질 수 있다. 상기 정보성 대립유전자는 플랭킹 서열로부터 고안된 VNTR-특이적 프라이머를 이용하여 상기 VNTR에 대하여 특정 형질을 나타내는 개체를 유전자형화 (genotyping)함으로써 확인될 수 있다.

상기 삭제 방법이 다른 다양한 방법으로 생성되는 VNTR 외에 다른 대립유전자에 동등하게 적합함은 분명하다. 이와 같은 이유로, DNA 풀의 조성의 차이를 확인하는 상기 방법이 한 풀에는 존재하고, 다른 풀에는 동일한 형태로 존재하지 않는 다른 종의 DNA뿐만 아니라 다형태성 서열의 다른 타입의 선택에 더 광범위하게 적용될 수 있다.

상기 방법은 단일유전자의 유전성 형질 뿐만 아니라 다원유전성의 조사를 위한 적합도에 있어서 유일하다. 이는 현재 연구 분야와 관련한 어려움, 시간 및 비용을 상당히 감소시키면서, 유전성 형질의 연구에 상당한 영향을 미칠 수 있다.

바람직한 실시예

(ⅰ) 조사시 상기 조사에 필수적인 개체는 아니지만, 하나의 제한 효소와 함께 상기 종의 한 개체의 게놈상 DNA의 단편화.

(ⅱ) 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제에 의한 모든 3' 말단의 말단화.

(ⅲ) 단일-가닥 틈의 말단화 다음에, T4 DNA 리가제 (ligase)의 존재하에서 인큐베이션에 의해 어뎁터에 상기 말단화된 단편의 연결.

(ⅳ) 상기 ddNTP로부터 상기 연결된 생성물의 정제 및 다음을 포함하는 반응에서 증폭화:

a) 어뎁터 프라이머 및 (AC)nB 프라이머, 여기서 B=G+T+C;

b) 어뎁터 프라이머 및 (CA)nD 프라이머, 여기서 D=G+A+T;

c) 어뎁터 프라이머 및 (GT)nH 프라이머, 여기서 H=A+T+C;

d) 어뎁터 프라이머 및 (TG)nV 프라이머, 여기서 V=G+A+C.

상기 증폭화 생성물은 상기 선택된 어뎁터에 성공적으로 연결하며, 상기 선택된 프라이머와 동종체를 갖는 VNTR을 함유하는 게놈상 단편으로부터 발생한다.

(ⅴ) dATP 및 dCTP의 존재하에서 T4 DNA 폴리머라제에 의한 상기 (AC)nB 및 (CA)nD 프라임화된 생성물의 소화 후, 모든 VNTR 서열 및 과량의 VNTR 프라이머를 제거하기 위해 엑소뉴클레아제 Ⅶ에 의한 소화.

(ⅵ) dGTP 및 dTTP의 존재하에서 T4 DNA 폴리머라제에 의한 상기 (GT)nH 및 (TG)nV 프라임화된 생성물의 소화 후, 모든 VNTR 서열 및 과량의 VNTR 프라이머를 제거하기 위해 엑소뉴클레아제 Ⅶ에 의한 소화. 최적 범위의 분자량의 생성물을 얻기 위해 크기 선별이 수행될 수 있다.

(ⅶ) 특이한 특정 형질을 나타내는 개체로부터 유도된 충분한 양의 게놈상 DNA와 함께 (GT)nH 및 (TG)nV 결합 프라임화된 과량의 생성물 또는 (AC)nB 및 (CA)nD 프라임화된 과량의 생성물 중 하나의 교잡반응.

(ⅷ) 모든 어닐된 3' 말단의 가닥을 확장시키기 위해 Taq DNA 폴리머라제 (Taq DNA polymerase)와 함께 상기 교잡된 생성물의 인큐베이션.

(ⅸ) 어뎁터 프라이머의 첨가 및 Taq DNA 폴리머라제의 존재하에서 열적 사이클링 (thermal cycling)에 의해 상기 '게놈상 주형'으로부터 VNTR 대립유전자의 생성.

(ⅹ) 상기 생성된 VNTR 대립유전자의 정제 후, 엄격한 조건하에서 가닥 분해 및 재어닐링.

(xi) 증폭화반응의 가상 생성물에 VNTR 대립유전자의 교잡반응 또는 조사시 특이한 특정 형질을 나타내는 개체 사이에 다른 VNTR 대립유전자의 교잡반응으로부터 발생하는 불-일치 함유 이중사슬 분자의 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ를 이용한 소화.

(xii) 절단된 분자로부터 VNTR 서열을 제거하건, 이들을 완전히 삭제하기 위해 S1 뉴클레아제와 함께 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제에 의한 부가적인 소화.

(xiii) Taq DNA 폴리머라제의 존재하에서 열적 사이클링에 의한 상기 생존하는 DNA 분자의 증폭화.

(xiv) 상기 생존하는 DNA 분자의 교잡반응, 소화 및 증폭화의 반복. 이는 특이한 특정 형질을 나타내는 모든 개체에 공통인 VNTR 대립유전자 또는 증폭화의 특정 가상 생성물을 제거하고, 상기 그룹 내에 지배적인 대립유전자 내에서 상기 반응을 강화시킨다.

(xv) dNTP의 존재하에서 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제와 함께 인큐베이션에 의한 특정한 형질을 나타내는 개체군의 상기 선택된 대립유전자에 3' 오버행의 첨가.

(xvi) (i)에서 (xiv)까지 전체 또는 부분적으로 유사한 방법으로 게놈상 DNA로부터 생성된 형질이 없는 개체의 과량의 상기 VNTR 대립유전자에 3' 오버행을 포함하는 특정한 형질을 나타내는 개체군의 상기 선택된 대립유전자의 교잡반응.

(xvii) T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ에 의한 불-일치 함유 이중사슬 분자의 소화.

(xviii) 3' 오버행에 의한 보호가 결핍한 이중사슬 분자 내에 가닥을 삭제하기 위해 엑소뉴클레아제 Ⅲ에 의한 부가적인 소화.

(xix) 상기 엑소뉴클레아제 Ⅲ의 제거 또는 불활성화 후, 단일 가닥화된 DNA를 제거하는 엑소뉴클레아제 Ⅰ에 의한 부가적인 소화. 이는 특정 형질에 연결된 VNTR과는 다른 모든 분자의 제거를 초래한다. 순수 VNTR에 대하여, 상기 정보성 대립유전자가 존재한다. 엑소뉴클레아제 Ⅲ 및 엑소뉴클레아제 Ⅰ에 의한 소화에 생존하는 절단된 VNTR에 대하여, 전체적인 VNTR 서열은 단편화되고, 말단화된 어뎁터-연결된 게놈상 DNA와의 교잡반응 및 VNTR 특이적 프라이머가 상기 형질과 연결된 정보성 대립유전자를 관련시키기 위해 영향받은 개체의 유전자형화를 가능하게 하는 상기 플랭킹 서열로부터 고안될 수 있도록 Taq DNA 폴리머라제에 의한 가닥 확장 (strand extension) 후 얻어질 수 있다.

제 2 실시예

(ⅰ) VNTR 대립유전자는 어뎁터 프라이머 및 VNTR 프라이머를 이용한 단편화되고 연결된 게놈상 DNA의 증폭화, 및 특정 형질을 나타내는 개체의 게놈상 '주형' DNA에 상기 생성된 생성물의 교잡반응 및 상기 주형 DNA로부터 관련 VNTR 대립유전자의 생성의 공정과는 다른 수단에 의해 생성된다. 이는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다:

a) 각각의 반응에서 각 VNTR의 플랭킹 영역에 특이적인 프라이머를 이용한 게놈상 또는 합성 DNA로부터 VNTR의 증폭;

b) 부착된 VNTR 특이적 프라이머를 이용하여 다중 VNTR을 대량으로 증폭시키는 다중 시스템 (multiplex system)을 이용한 게놈상 또는 합성 DNA로부터 VNTR의 증폭;

c) 어뎁터가 상기 소화된 DNA에 연결되고, 상기 VNTR 대립유전자의 증폭에 사용될 수 있도록 상기 VNTR 서열 내 또는 주변에서 절단하는 엔도뉴클레아제를 이용하여 게놈상 또는 합성 DNA로부터 VNTR의 증폭;

d) 상기 형질이 없는 개체와 함께 삭제 공정에 의해 특정 형질을 나타내는 개체로부터 VNTR 풀의 생성.

(ⅱ) 상기 생성된 VNTR 대립유전자의 정제 후, 엄격한 조건 하에서 가닥 분해 및 재어닐링.

(ⅲ) 증폭반응의 가상 생성물에 VNTR 대립유전자의 교잡반응 또는 조사시 특이한 특정 형질을 나타내는 상기 개체 사이에 다른 VNTR 대립유전자의 교잡반응으로부터 발생하는 불-일치 함유 이중사슬의 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ를 이용한 소화.

(ⅳ) 상기 소화된 이중사슬 DNA 분자 및 단일 가닥 DNA 종이 제거되도록 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 및 S1 뉴클레아제의 존재하에서 상기 교잡된 대립유전자의 인큐베이션.

(ⅴ) 소화에 내성이 있는 불-일치가 없는 이중사슬의 증폭화에 의한 증가.

(ⅵ) 불-일치가 없는 분자의 교잡, 소화 및 선택의 반복. 이는 상기 특이한 특정 형질을 나타내는 모든 개체에 공통인 VNTR 대립유전자 내의 반응을 강화시키며, 증폭화의 가상 생성물을 제거한다.

(ⅶ) 특정 형질을 나타내는 모든 개체에 공통인 상기 선택된 대립유전자와, (ⅰ) 내지 (ⅵ)과 함께, 전체 또는 부분적으로, 동일한 방법으로 게놈상 DNA로부터 발생하는 상기 형질이 없는 개체의 VNTR 대립유전자의 교잡반응.

(ⅷ) 불-일치 함유 이중사슬의 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ를 이용한 소화 후, 엑소뉴클레아제 Ⅲ 및 엑소뉴클레아제 Ⅰ과 함께 연속적인 인큐베이션.

(ⅸ) 5' 오버행이 결핍된 상기 생존한 분자의 혼합물로부터 선택. 상기 전체적인 VNTR 또는 VNTR 단편들은 상기 특이한 특정 형질에 연결된다. 상기 특정 형질에 대하여, 상기 전체적인 VNTR의 정보성 있는 대립유전자는 시퀀싱에 의해 얻어질 수 있다. 상기 VNTR 단편에 대하여, 단편화되고, 말단화되며, 어뎁터-연결된 게놈상 DNA의 교잡반응 후, Taq DNA 폴리머라제를 포함한 인큐베이션에 의해 전 길이 서열이 생성될 수 있다. 상기 정보성 대립유전자는 플랭킹 서열로부터 고안된 VNTR-특이적 프라이머를 이용하여 특정 형질을 나타내는 개체를 유전자형화하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 얻어질 수 있다.

당업자라면 용액 또는 어레이 (array) 상태에서 불-일치가 없는 이중사슬과 불-일치 함유 이중사슬을 구분하는 몇가지 방법이 있음을 알 것이다. 상술된 방법은 단지 상기 방법 중 하나를 나타낸 것이다.

당업자는 본 발명이 예를 들면, (CA)n 및 (GT)n과 같은 디뉴클레오티드 반복단위, 예를 들면 (AAT)n, (AGC)n, (AGG)n, (CAC)n, (CCG)n 및 (CTT)n과 같은 트리뉴클레오티드 반복단위 및 예를 들면 (CCTA)n, (CTGT)n, (CTTT)n, (TAGG)n, (TCTA)n 및 (TTCC)n과 같은 테트라뉴클레오티드 반복단위를 포함하나 이에 한정되지 않는 VNTR의 특정 타입을 동등하게 잘 적용된 것임을 알 것이다. 또한, 본 발명은 반복성 모티브 (motif)의 (AT), (CC), (CT) 및 (GA) 함유 트랙트 (tract)를 포함하나 이에 한정되지 않는 단순 유기체 마이크로위성에 적용될 수 있다.

당업자는 VNTR과는 다른 다형태성 대립유전자가 특정 형질을 나타내는 모든 개체에 공통이며, 증폭화의 가상 생성물이 없는 대립유전자를 제조하는데 본 발명을 이용하여 사용될 수 있음을 알 것이다. 상기 다형태성 대립유전자는 모든 가능한 대립유전자 또는 이들의 서브셋트 (subset)의 고정된 어레이에 교잡되거나, 상기 형질이 없는 개체로부터 유도된 대립유전자의 풀에 교잡될 수 있다. 불-일치 식별법에 의해, 상기 연결되고, 형질에 대해 정보성이 있는 대립유전자들이 확인될 수 있다.

당업자는 알려지지 않은 표현형 및 인자형을 갖는 한 개체 또는 그 이상의 개체의 게놈으로부터 얻은 대립유전자가 불-일치 식별법에 의한 증폭화의 가상 생성물을 제거하면서 충실하게 증폭되며, 대립유전자의 고정된 어레이에 또는 상기 개체에 대한 인자형 또는 표현형을 고안하기 위해, 용액 상태에서 대립유전자의 풀에 교잡될 수 있음을 알 것이다.

당업자는 불-일치 식별법이 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ와 다른 효소 또는 시약을 이용하여 수행될 수 있음을 알 것이다. 상기 대체물로는 S1 뉴클레아제, 뭉빈 (Mung Bean) 뉴클레아제, 변이 검출 단백질 (예를 들면 Mut S), 오스뮴 테트록사이드 (osmium tetroxide) 및 하이드록실아민 (hydroxylamine)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

당업자는 증폭된 다형태성 서열이 스스로 가치가 있으며, 유전성 형질을 갖는 VNTR의 공-분리를 결정하는 것과는 다른 방법으로 사용될 수 있음을 알 것이며, 상기 방법은 유전자형화 (genotyping), 지도화 (mapping), 위치성 복제 (positional cloning), 형질 위치의 정량화, 조상 및 진화 연구, 개체군 연구, 계통 발생학 (phylogenetics), 및 VNTR 및 이들을 분리하는 서열의 인 비보 (in vivo)뿐만 아니라 인 비트로 (in vitro) 연구를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

당업자는 만일 VNTR이 신체성 변이와 관련하지 않는다면 비-유전성인 신체성 변이를 확인하는데 본 발명이 사용될 수 있음을 알 것이다.

당업자는 상기 말단화되고 어뎁터-연결된 게놈상 단편들이 이들이 교잡되는 공지 또는 비공지의 특정 뉴클레오티드 서열과 동종 서열을 갖는 게놈의 영역을 재생하고 증폭하는데 사용될 수 있음을 알 것이다.

당업자는 본 발명이 증폭화의 가상 생성물이 제거되도록 PCR 생성물로부터 얻은 컨센서스 (consensus) 서열을 정제하는 수단을 나타냄을 알 것이다.

당업자는 본 발명이 하나 또는 그 이상의 타입의 DNA 분자의 특정 풀로부터 얻은 컨센서스 서열을 정제하는 수단을 나타냄을 알 것이다.

본 발명은 게놈상 단편들이 유도되는 위치에서 다형태성 변화를 반영하지 않는 게놈상 단편들이 생성되기 때문에 모든 종래 기술과는 근본적으로 다르다. 또한, 상기 단편들은 특정 조사방법으로 개체로부터 생성될 필요가 없으나, 적절한 종의 특정 개체로부터 얻어질 수 있다. 그러나, 조사 및 불-일치 식별법 처리된 개체의 게놈상 '주형' DNA에 상기 단편들을 교잡하는 것은 사실상, 다른 PCR-기초 방법의 특성이 있는 가상 생성물의 생성 문제를 극복하면서, 상기 게놈상 주형 내의 대립유전자의 증폭을 가능하게 한다. 만일 상기 게놈상 단편들이 한 개체로부터 유도된다면, 각 VNTR을 플랭킹하는 서열 내의 다형태성 변화 문제는 이들이 조사시 모든 개체에 대하여 동일하기 때문에 부정된다. 본 발명은 그의 플랭킹 서열을 갖는 각 VNTR 대립유전자를 보존하기 때문에, 상기 대립유전자들은 매우 정보성이 있다. 이러한 관점에서 본 발명이 유일한 방법이다. 또한, VNTR을 제조하는 상기 신규한 방법은 빠르고, 저렴하며, 서열에 대한 사전 지식을 필요로 하지 않고, 정밀한 장치도 필요로 하지 않으며, VNTR의 분리에 대하여 현재 필요로 하는 시간 및 돈의 높은 소비를 방지하는 면에서 아주 중요하다. 결과적으로, 어떤 것도 분리되지 않는 종 내의 VNTR의 이용성에 의존하는 기술의 적용은 이전에 실행할 수 없었던 것을 가능하게 한다. 모든 종으로부터 많은 VNTR을 빠르고, 효율적이며, 싸고, 신뢰성있게 제조하는 능력은 생의학 분야의 종사자들에 대한 본 발명의 상당한 기여이다.

요약하면, 본 발명은 DNA의 제한 엔도뉴클레아제 소화, 상기 단편의 어뎁터와의 연결 및, 선택한 VNTR과 동종 서열을 갖는 프라이머의 삽입으로, 선택한 엔도뉴클레아제 제한 효소 자리에 의해 플랭크화된 상기 단편 및 VNTR을 증폭하는 단계를 포함하는 VNTR을 생성하는 신규한 방법에 관한 것이다. 상기 단편들은 각 VNTR의 상기 대립유전자를 대표하지 않으며, 조사시 특정한 개체로부터 제조될 필요가 없다. 조사시 상기 개체의 게놈상 DNA와 상기 단편들의 교잡반응은 이들이 게놈에서 발생할 때, 플랭킹 서열을 갖는 순수 VNTR 대립유전자를 재생시킨다. 이는 그 자체로 DNA 지문 및 연결 분석법을 포함하나 이에 한정되지 않는, VNTR의 유용성에 의존하는 목적을 위해 모든 종에서 VNTR을 빠르고, 효율적이며, 싸고 신뢰성있게 제조하는 생의학 분야 종자사의 능력에 있어서 주된 단계를 구성한다. 불-일치 식별법의 도입은 반응 오염 및 반응 조건에서의 모호한 변화에 의한 가상 생성물의 생성 및 미스-프라이밍 (mis-priming) 문제를 극복하며, 상기 문제는 모든 PCR-기초 기술의 단점이며, 조사시 특정 형질을 나타내는 모든 개체에 공통이 아닌 대립유전자를 삭제시킨다. 불-일치 식별법의 제 2 라운드는 상기 형질을 나타내지 않는 개체의 게놈 내에 존재하는 비-정보성 대립유전자를 제거한다. 상기 방법은 형질에 대하여 정보성이 있는 대립유전자의 전체 발현 (Total Representation of Alleles that are Informative for a Trait (TRAIT))으로 나타내어진다. 그러므로, 본 발명은 AFLP, GMS, RDA 및 RAPD의 분석 속도 및 연결 분석법의 높은 다형태성 검출 속도를 포함하나, 밀접하게 관련된 개체로부터 얻은 DNA 및 부계 테스팅 (paternity testing)에 대한 요구를 부정하면서, 이정 방법보다 상당한 장점을 갖는다. 또한, 본 발명은 미스-프라이밍 및 반응 오염 및 반응 조건에서의 미묘한 변화를 통한 가상 생성물의 생성을 포함하는, PCR 기초 기술의 특징인 근본적인 문제를 극복한다. 또한, 값비싼 장치 또는 정교한 통계 컴퓨터 소프트웨어가 필요없다. 상기 분석법은 특정 형질을 나타내는 개체에서 높은 빈도로 또는 독점적으로 존재하나, 상기 형질이 결핍된 개체 내에서는 낮은 빈도로 존재하거나 없는, 연결되며, 정보성이 있는 대립유전자를 생성할 것이다. 이러한 관점에서, 본 발명은 다른 모든 방법에 대한 우위성에 있어서 독보적이다.

본 발명은 다양한 개체로부터 얻은 단순 또는 복잡한 게놈의 동시 비교에 의해 다중 위치에서 다형태성의 동시 검출을 가능하게 하며, 이전에 사용되었던 다른 모든 기술과 근본적으로 다르다. 본 발명은 유전성 형질을 이용한 다형태성 공-분리에 대한 복잡한 게놈을 스크리닝 (screening)하는 단계에 부가하여, 특정 종의 게놈으로부터 VNTR을 빠르고, 효율적이며, 저렴하고, 신뢰성있게 제조하는, 생의학 분야의 종사자의 능력에 있어서, 주된 장점을 갖는다. 그러므로, 상기 방법의 적용은 모든 유기체 내의 유전성 질병 또는 유리한 단일유전적 또는 다원유전적 형질에 대한 유전적 스크리닝의 표시제의 개발을 촉진시킨다.

본 발명이 적용되는 방법의 예

하기 실시예는 본 발명이 적용될 수 있는 다른 방법에 대한 제한 또는 본 발명의 목적에 대한 제한을 추론하지 않고 본 발명이 적용될 수 있는 방법의 예를 나타낸다.

실험 데이타

실시예 1

(CA)₁₃및 (GU)₁₃프라이머를 이용한 증폭자의 제조

2㎍ DNA를 다음과 같은 전체 부피 100㎕ 내에 3㎕의 Rsa I으로 완전히 소화시켰다:

8.5㎕ 게놈상 DNA (3㎍ DNA와 동등량)

10㎕ 10× 반응 완충액

3㎕ Rsa I (10u/㎕; Promega)

78.5㎕ dH₂O

100㎕

상기 반응을 하룻밤 동안 37℃에서 인큐베이션시킨 후, 70℃에서 20분간 인큐베이션시켜 열적으로 불활성화시켰다. 마이크로농축법 (microconcentration) (Microcon-100; Amicon)에 의해 상기 완충액으로부터 상기 DNA를 분리하였다. 10㎕ 부피가 회수되었다.

어뎁터를 구성하는 48mer 올리고뉴클레오티드 2nmole과 12mer 올리고뉴클레오티드 2nmole을 결합시켰다:

15.9㎕ 48mer (2nmole과 동등량)

13.7㎕ 12mer (2nmole과 동등량)

10㎕ 10× 리가제 완충액 (NEB)

48.4㎕ dH₂O

88㎕

상기 혼합물을 50℃까지 가열한 후, 10℃로 1시간에 걸쳐 냉각시켰다.

88㎕의 어닐된 어뎁터에 소화된 DNA 10㎕를 첨가시키고, 상기 게놈상 단편에 상기 어뎁터를 연결시켰다:

88㎕ 어닐된 어뎁터/리가제 완충액 (ATP 포함)

10㎕ DNA

2㎕ T4 DNA 리가제 (400 NEBu/㎕)

100㎕

상기 반응을 16℃에서 하룻밤동안 인큐베이션시킨 후, 70℃에서 20분간 인큐베이션하여 가열 불활성화시켰다.

마이크로농출법 (Microcon-100; Amicon)에 의해 상기 완충액 및 비-연결된 어뎁터로부터 상기 어뎁터-연결된 DNA 단편을 분리시켰다. 12㎕ 부피의 DNA가 회수되었다.

계속적인 조작으로 상기 어뎁터 및 비-연결된 DNA의 3' 확장을 방지하기 위하여 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서 Taq DNA 폴리머라제와 함께 상기 어뎁터-연결된 DNA 단편을 인큐베이션시켰다:

12㎕ 마이크로농출된 DNA

3㎕ 10× NH₄반응 완충액

1㎕ 50mM MgCl₂

1㎕ 10mM ddATP

1㎕ 10mM ddCTP

1㎕ 10mM ddGTP

1㎕ 10mM ddTTP

1㎕ Taq DNA 폴리머라제 (5u/㎕; Bioline)

9㎕ dH₂O

30㎕

상기 반응을 72℃에서 2시간동안 인큐베이션시켰다.

페놀/클로로포름 (phenol/chloroform) 추출법 및 마이크로농출법에 의해 말단화된 3' 말단을 갖는 상기 어뎁터-연결된 DNA를 정제하였다. 회수된 부피를 40㎕로 만들고, DNA 농도를 젤 전기영동법에 의해 측정하였다. 75ng/㎕의 농도가 측정되었다.

다음 분리 반응을 통하여 (CA) 프라임화된 증폭자와 (GU) 프라임화된 증폭자를 제조하였다:

10㎕ 10× NH₄반응 완충액

8㎕ 50mM MgCl₂

1.5㎕ 10mM dNTP

1㎕ 말단화된 3' 말단을 갖는 어뎁터-연결된 DNA

4㎕ (CA) 또는 (GU) 프라이머 (25pmol/㎕)

73.5㎕ dH₂O

98㎕

상기 반응을 미네랄 오일 (mineral oil)과 함께 방치시키고, 95℃에서 2분간 가열하며, 상기 가열 동안 1㎕ Taq DNA 폴리머라제 (5u/㎕; Bioline) 및 2㎕ 어뎁터 프라이머 (50pmol/㎕)를 첨가하였다.

가열 사이클링을 다음과 같이 수행하였다: 전체 20 사이클 동안 95℃에서 30초, 72℃에서 45초 후, 72℃에서 5분.

잔존하는 (CA) 프라이머를 제거하기 위해, 상기 100㎕의 (CA) 프라임화된 생성물에 5㎕의 엑소뉴클레아제 I (10u/㎕)를 첨가하였다. 상기 반응을 37℃에서 30분간 인큐베이션시켰다.

상기 PCR 생성물로 삽입된 모든 유라실 (uracil)을 소화시키기 위해 상기 100㎕의 (GU) 프라임화된 생성물에 10㎕의 유라실 DNA 글리코실라제 (1u/㎕; NEB)를 첨가하였다. 상기 반응을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 1㎕ 10mM dNTP를 첨가한 후, 상기 소화된 (GU) 서열을 보충하는 불쑥 불거져 나온 (CA) 가닥을 제거하기 위하여 2㎕ T4 DNA 폴리머라제 (5u/㎕; Epicentre laboratories)를 첨가하였다. 상기 반응을 37℃에서 5분간 인큐베이션시켰다. 증폭자의 양 풀을 페놀/클로로포름으로 추출하였고, 마이크로농축 (Microcon-100; Amicon)시켰다. 각 풀에 대하여, 회수된 부피는 500㎕이었고, DNA의 농도를 결정하기 위하여 이중 5㎕를 분광분석법으로 분석하였다.

동일한 양의 (CA) 및 (GU) 프라임화된 증폭자를 가열 사이클링 이전에 한 개체의 게놈상 '주형' DNA에 교잡시켰다. 증폭자 대 게놈상 '주형' DNA의 최적 비율을 측정하기 위해, 다양한 양의 '주형' DNA를 이용하여 증폭자의 양을 동일하게 유지하면서 다음과 같은 몇몇 반응을 수행하였다:

'주형' DNA (ng)	0	0.1	1	10	100	1000
결합된 증폭자 (ng)	1	1	1	1	1	1
5M NaCl (㎕)	0.22	0.22	0.22	0.22	0.22	0.22
dH₂O (㎕)	전체 부피를 5.55㎕로 맞춤

각 반응을 미네랄 오일과 함께 방치시키고, 98℃에서 5분간 인큐베이션시키고, 그 후, 상기 온도를 4시간에 걸쳐 78℃로 단계적으로 낮추었다.

각 교잡반응에 다음을 첨가하였다:

5㎕ 10× NH₄반응 완충액

4㎕ 50mM MgCl₂

0.75㎕ 10mM dNTPs

0.5㎕ 어뎁터 프라이머 (50pmol/㎕)

34.2㎕ dH₂O

각 반응을 마이크로원심분리기 내에서 짧게 회전시켰다. 이들을 72℃에서 2분간 가열시키고, 0.5㎕의 Taq DNA 폴리머라제 (5u/㎕; Bioline)를 첨가하였다. 상기 반응을 72℃에서 추가 10분간 인큐베이션시키고, 그 후, 상기 온도를 2분간 95℃로 올렸다. 다음과 같이 가열 사이클링을 수행하였다: 전체 10 사이클 동안 95℃에서 2분간 후, 72℃에서 1분간.

각 반응에 대하여, 40㎕의 반응 혼합물에 10 사이클 동안 증폭된 생성물 10㎕를 첨가하고, 추가 22 사이클롱안 동일한 조건하에서 증폭시켰다. 증폭반응의 말단 생성물 5㎕를 아가로우스 젤 (agarose gel) 상에 전개시켰다. 100ng 게놈상 '주형' DNA를 함유하는 반응은 게놈상 '주형' DNA:증폭자가 100:1의 질량비와 동일하게, 대부분의 증폭반응 생성물을 생성함을 발견하였다.

본 발명은 증폭화 생성물을 복제함으로써 유효하게 되었다. 성공적으로 옮겨진 E.coli의 두 개의 콜로니 (colony)가 배양되었으며, 이로부터 플라스미드 (plasmid)가 후반에 수거되었다. 상기 플라스미드는 서열화되었고, 다중 복제 자리에서 VNTR 서열을 함유하는 것으로 밝혀졌다.

또 다른 실험 데이타

다음 실험을 위하여, 개속의 (canine) 게놈상 DNA 또는 개속의 게놈상 DNA로부터 증폭된 복제된 VNTR 대립유전자가 사용되었다. 상기 복제된 대립유전자를 pUC18 MCS의 Sma 1 자리로 연결하고, 이중 한 면에 플라스미드 삽입물의 계속적인 증폭을 위해 플라스미드 특이적 프라이머를 고안하였다:

별다른 언급이 없는 한, 모든 시약은 Amersham Pharmacia Biotech 또는 그의 계열사로부터 얻었다.

올리고뉴클레오티드는 프랑스의 Genset Corp.으로부터 구입하였다. 괄호에 나타난 서열의 11의 반복단위 다음에 하나의 변성 염기로 구성된 VNTR 프라이머 (AC)11B, (CA)11D, (GT)11H 및 (TG)11V에서 B=C+G+T, D=A+G+T, H=A+C+T 및 V=A+C+G이었다.

실시예 2

(a) 어뎁터 연결반응 전 말단화 및 (b) 말단화 전 어뎁터 연결반응을 이용한 어뎁터-연결되고, 디데옥시뉴클레오티드 말단화된 게놈상 단편의 제조.

(a) 5㎍ 개의 게놈상 DNA를 Hae Ⅲ로 단편화시키고, 상기 소화를 37℃에서 12시간에 걸쳐 진행시켰다:

4.4㎕ 1.135㎍/㎕ 게놈상 DNA

10㎕ 10× 제한 완충액

2㎕ 10u/㎕ Hae Ⅲ

84㎕ dH₂O

100㎕

소화는 에티듐 브로마이드 (ethidium bromide)로 염색된 1% 아가로우스 젤 상에 반응 등분액의 전기영동법에 의해 확인되었다.

DNA를 추출 (GFX 정제 칼럼 (column)하고, 50㎕ 5mM Tris pH8.5로 희석하고, 이중 30㎕를 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제와 함께 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다:

30㎕ DNA

30㎕ 5× 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 완충액

4.5㎕ 10mM ddGTP

10㎕ 9u/㎕ 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제

75.5㎕ dH₂O

150㎕

원심분리의 에피소드 (episode) 사이에 dH₂O를 연속적으로 부가하면서, 마이크로농축법 (Microcon-30;Amicon)에 의해 저 분자량의 용질로부터 DNA를 분리하였다. 35㎕의 부피가 회수되었다.

상기 어뎁터는 두 개의 올리고뉴클레오티드, 즉, 24mer (GsCsAsGsGAGACATCGAAGGTATGAAC, 여기서 's'는 포스포로티오에이트 결합) 및 12mer (TTCATACCTTCG)를 어닐링함으로써 제조되었다:

7.6㎕ 197pmol/㎕ 24mer

9.2㎕ 162pmol/㎕ 12mer

1.87㎕ 10× T4 DNA 리가제 완충액

18.7㎕

상기 혼합물을 55℃로 가열하고, 한 시간에 걸쳐 10℃로 냉각하였다.

상기 어뎁터를 상기 말단화된 게놈상 단편에 연결하였다:

35㎕ DNA

18.7㎕ 어뎁터

4.3㎕ 10× T4 DNA 리가제 완충액

1.5㎕ 10u/㎕ T4 DNA 리가제

2.5㎕ dH₂O

62㎕

상기 반응을 16℃에서 하룻밤동안 인큐베이션시킨 후, 70℃에서 20분간 가열 불활성화시켰다.

원심분리의 에피소드 사이에 연속적으로 dH₂O를 첨가하면서, 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)에 의해 저 분자량의 용질로부터 DNA를 분리하였다. 54㎕의 부피가 회수되었다.

단일 가닥 잘린 틈 자리로부터 프라이밍을 통한 가상 생성물의 생성을 억제하기 위하여, 써모 시쿼나제 (Thermo Sequenase)와 함께 인큐베이션하여 이들을 말단화시켰다:

54㎕ DNA

4.4㎕ 써모 시쿼나제 완충액

1.4㎕ 10mM ddATP

1.4㎕ 10mM ddCTP

1.4㎕ 10mM ddGTP

1.4㎕ 10mM ddTTP

0.5㎕ 32u/㎕ 써모 시쿼나제

5.5㎕ dH₂O

70㎕

상기 혼합물을 미네랄 오일과 함께 방치하고, 74℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다.

DNA를 추출 (GFX 정제 칼럼)하고, 50㎕ 5mM Tris pH 8.5로 희석하였다.

(b) 5㎍의 개의 게놈상 DNA를 Mbo I으로 단편화시키고, 상기 소화를 37℃에서 유지하여 완결시켰다:

4.4㎕ 1.135㎍/㎕ 게놈상 DNA

10㎕ 10× 제한 완충액

2.5㎕ 10u/㎕ Mbo I

83㎕ dH₂O

100㎕

소화는 에티듐 브로마이드로 염색된 1% 아가로우스 젤 상에 상기 반응 용액의 전기영동에 의해 확인하였다.

70℃에서 20분간 인큐베이션 한 후, 원심분리의 에피소드 사이에 연속적으로 dH₂O를 첨가하면서, 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)에 의해 저 분자량의 용질로부터 DNA를 분리하였다. 32㎕의 부피가 회수되었고, 이들 중 반은 어뎁터에 연결되었다:

상기 어뎁터는 두 개의 올리고뉴클레오티드, 즉, 24mer (GsCsAsGsGAGACATCGAAGGTATGAAC, 여기서 's'는 포스포로티오에이트 결합) 및 16mer (GATCGTTCATACCTTC)를 어닐링함으로써 제조되었다:

6.3㎕ 197pmol/㎕ 24mer

8.5㎕ 147pmol/㎕ 16mer

1.65㎕ 10× T4 DNA 리가제 완충액

16.5㎕

상기 어뎁터를 상기 게놈상 단편에 연결하였다:

16㎕ DNA

16.5㎕ 어뎁터

2.4㎕ 10× T4 DNA 리가제 완충액

2㎕ 10u/㎕ T4 DNA 리가제

3.1㎕ dH₂O

40㎕

원심분리의 에피소드 사이에 연속적으로 dH₂O를 첨가하면서, 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)에 의해 저 분자량의 용질로부터 DNA를 분리하였다. 40㎕의 부피가 회수되었다.

상기 어뎁터-연결된 단편은 써모 시쿼나제를 이용하여 말단화되었다:

40㎕ DNA

4.4㎕ 써모 시쿼나제 완충액

1.4㎕ 10mM ddGTP

0.5㎕ 32u/㎕ 써모 시쿼나제

24㎕ dH₂O

70㎕

상기 혼합물을 미네랄 오일과 함께 방치하고, 74℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 단일 가닥 잘린 틈 자리로부터 프라이밍을 통한 가상 생성물의 생성을 억제하기 위하여, 써모 시쿼나제와 잔존하는 ddNTP를 첨가하여 더욱 인큐베이션하여 이들을 말단화시켰다:

1.4㎕ 10mM ddATP

1.4㎕ 10mM ddCTP

1.4㎕ 10mM ddTTP

0.3㎕ 써모 시쿼나제 완충액

4.8㎕

상기 혼합물을 74℃에서 추가 한 시간 동안 인큐베이션시켰다.

상기 게놈상 단편의 어뎁터 연결 및 말단화 방법 (a) 및 (b)는 다음을 포함하는 반응에서 '상호' 프라이머의 존재 또는 부재하에서 결과적으로 형성된 단편의 증폭화와 비교되었다:

5㎕	5㎕	5㎕	10× Taq PCR 완충액
5㎕	5㎕	5㎕	10× dNTP
1㎕	1㎕	1㎕	25pmol/㎕ 24mer
1㎕	1㎕	0㎕	50pmol/㎕ (AC)11B
50ng	0ng	50ng	GFX 추출된 DNA
50㎕로 맞춤	dH₂O

각 반응을 미네랄 오일과 함께 방치하고, 95℃에서 2분간 가열하였다.

0.5㎕의 5u/㎕ Taq DNA 폴리머라제를 각 반응에 첨가하고, 이를 95℃에서 30초간, 65℃에서 30초간, 72℃에서 1분간 25번 반복으로 증폭한 후, 72℃에서 5분간 최종 확장하였다.

7.5㎕의 각 반응물을 에티듐 브로마이드로 염색된 1.5% 아가로우스 젤 상에서 전기영동시켰다. DNA가 결핍된 음성 조절 반응물 (negative control reactions)은 어떠한 생성물도 생성시키지 않은 반면, 모든 성분을 함유한 반응물은 다양한 분자량의 혼합 생성물을 생성하였다. 반대로, DNA를 함유하나 상호 프라이머를 함유하지 않은 반응물은 생성물을 생성할 수 없었다. 상기 결과들은 어뎁터가 게놈상 단편에 성공적으로 연결되었으며, DNA 폴리머라제의 존재하에서 확장할 수 있는 모든 3' 말단이 말단화되었음을 확인시켜준다. 바람직한 방법은 연결반응 이전에 말단화시키는 것인데, 이는 (i) 성공적으로 연결하는 모든 단편들이 말단화되었음을 보증하기 때문이며, (ii) 상호-단편 연결의 기회가 멀어졌기 때문이다.

말단화되고, 어뎁터-연결된 게놈상 단편으로부터 5' 및 3' 플랭킹 서열의 증폭화.

다음을 포함하는 각 VNTR 프라이머에 대하여 증폭화 반응이 수행되었다:

5㎕	5㎕	10× Taq PCR 완충액
5㎕	5㎕	10× dNTP
2㎕	2㎕	25pmol/㎕ 24mer
2㎕	2㎕	25pmol/㎕ (AC)11B 또는 (CA)11D 또는 (GT)11H 또는 (TG)11V
2㎕	0㎕	단편화되고, 말단화되며, 어뎁터-연결된 게놈 (약 50ng/㎕)
34㎕	36㎕	dH₂O
50㎕	50㎕	전체

또한, VNTR 프라이머를 제외한 모든 성분을 함유하는 병행 반응을 준비하였다.

모든 반응을 미네랄 오일과 함께 방치하고, 95℃에서 2분간 가열하였다. 각 튜브 (tube)에 0.5㎕의 5u/㎕ Taq DNA 폴리머라제를 첨가하고, 95℃에서 30초, 65℃에서 45초, 72℃에서 45초를 18번 반복한 후, 72℃에서 2분간 최종 확장하는 가열 사이클링에 의해 증폭화를 수행하였다.

5㎕의 각 반응물을 에티듐 브로마이드로 염색한 1.5% 아가로우스 젤 상에 분자량 표시제와 함께 점적하였다. 모든 성분을 함유한 반응물은 약 100 내지 500bp (염기쌍) 범위의 혼합 생성물을 생성하였으며, 분자량의 집중도 및 분포를 각 반응에서 비교하였다. DNA가 결핍된 반응물 및 VNTR 프라이머가 결핍된 반응물에 해당하는 줄 (line)들은 어떠한 증폭화 생성물도 함유하지 않았다.

실시예 3

T4 DNA 폴리머라제에 의해 VNTR 프라임화된 PCR 생성물로부터 얻은 반복 서열의 소화 효율이 조사되었다.

복제된 VNTR 대립유전자를 Taq DNA 폴리머라제에 의해 증폭시키고, 원심분리의 에피소드 사이에 dH₂O를 연속적으로 첨가하면서 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)에 의해 저 분자량 용질로부터 분리하였다. 40㎕의 부피가 회수되었고, 이의 농도는 아가로우스 젤 전기영동법에 의해 130ng/㎕, 약 1.3pmol/㎕로 밝혀졌다.

T4 DNA 폴리머라제의 1.5u/㎕ 희석액을 dH₂O로 제조하였다. T4 DNA 폴리머라제의 농도를 12℃에서 다음과 같이 변화시키면서, 상기 증폭된 DNA를 0.3pmol/㎕의 농도에서 소화시켰다:

1.5㎕ 10× T4 DNA 폴리머라제 완충액

0.75㎕ 10mM dATP

0.75㎕ 10mM dCTP

3.5㎕ DNA

0, 0.5, 1, 2 또는 4㎕ 1.5u/㎕ T4 DNA 폴리머라제

15㎕까지 dH₂O

dNTP가 결핍된 병행 반응을 준비하였다. 상기 반응을 12℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 70℃에서 20분간 가열 불활성화시켰다.

7.5㎕의 각 반응물을 에티듐 브로마이드가 염색된 2.5% 아가로우스 젤 상에서 전기영동시켰다. dNTP의 부재하에서 모든 DNA를 0.05u/㎕를 초과하는 효소 농도로 소화시켰다. 대조적으로, T4 DNA 폴리머라제의 특정 농도에서 dNTP의 존재하에서 DNA의 식별가능한 손실은 없다.

T7 유전자 6 엑소뉴클레아제에 의해 VNTR 프라임화된 PCR 생성물로부터 얻은 반복 서열의 소화 효율을 조사하였다.

복제된 VNTR 대립유전자를 [α-33P]dATP의 존재하에서 Taq DNA 폴리머라제에 의해 플라스미드 특이적 센스 (sense) 프라이머 및 (GT)11H 프라이머와 함께 증폭하였다. 연속적인 네 개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하거나 포함하지 않는 프라이머에 대하여 병행 반응을 수행하였다. 상기 프라이머에 있어서, 포스포로티오에이트 결합을 함유한 쌍이 플라스미드 특이적 프라이머의 5' 말단 및 (GT)11H 프라이머의 3' 말단에 위치하였다.

원심분리의 에피소드 사이에 dH₂O를 연속적으로 첨가하면서 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)에 의해 저 분자량 용질로부터 상기 증폭화된 DNA를 분리하였다. 동일 양의 증폭화 반응물을 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제로 37℃에서 15 및 30분간 소화시켰으며, DNA의 농도는 약 0.1pmol/㎕이었다:

3.6㎕ DNA

2㎕ 5× T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 완충액

1㎕ 10u/㎕ T7 유전자 6 엑소뉴클레아제

3.4㎕ dH₂O

10㎕

효소의 부재하에서 37℃에서 15분간 조절 반응물을 인큐베이션하였다.

5㎕ 포름아마이드 점적 염료 (formamide leading dye)의 부가와 함께 95℃에서 2분간 모든 반응을 변성시켰다. 10㎕의 각 시료들을 8% 폴리아크릴아마이드 변성 젤 (polyacrylamide denaturing gel) 상에 전기영동시켰다. 상기 젤을 고정시키고 건조시킨 후, 방사선 사진 필름 (Biomax MR; Kodak)을 상기 젤에 노출시켰다.

15분간의 인큐베이션 후, 포스포로티오에이트 차단이 부족한 DNA는 완전히 소화되었음을 발견하였다. 대조적으로, 포스포로티오에이트 결합이 존재하면 상기 DNA가 보존되며, 비록 DNA의 몇몇 비-특이적 손실이 관찰될지라도, 각 분자 내의 한 가닥이 상기 효소의 소화에 의해 짧아진다.

T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ 및 S1 뉴클레아제 에 의한 소화의 효율 및 특이성이 비교되었다.

4 뉴클레오티드 정도로 반복 길이가 다른 동일한 VNTR의 복제된 VNTR 대립유전자를 [α-33P]dATP의 존재하에서 각각 증폭하였다. 더 짧은 대립유전자로부터 유도된 생성물을 두 튜브에 동일하게 나누었다. 한 튜브에 동일한 양의 더 긴 대립유전자를 첨가하고, 98℃에서 2분간 변성 및 100mM NaCl 및 200μM CTAB 내에서 75℃에서 150분간의 어닐링에 의해 상기 혼합물을 교잡시켰다.

원심분리의 에피소드 사이에 dH₂O를 연속적으로 첨가하면서 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)에 의해 다른 저 분자량 용질로부터 DNA의 교잡된 풀 및 교잡되지 않은 풀을 분리하였다.

T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ를 공급된 희석 완충액으로 250u/㎕까지 희석하였다. S1 뉴클레아제 희석액을 dH₂O로 제조하였다. 동일한 양의 교잡된 DNA 또는 교잡되지 않은 DNA를 Taq DNA 폴리머라제 완충액 내의 50u/㎕ T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ 또는 공급된 완충액 내의 다양한 농도의 S1 뉴클레아제로 소화시켰다. 상기 반응물에 최종 농도가 0.01u/㎕, 0.03u/㎕, 0.1u/㎕ 및 0.3u/㎕가 되도록 S1 뉴클레아제를 첨가하였다. 각 경우에 있어서, 효소가 결핍된 조절 반응물을 제조하였다. 상기 반응을 37℃에서 30분간 수행하였다.

소화의 완결시, EDTA의 첨가 및 가열 불활성화에 의해 상기 반응을 중단하였다. 상기 반응물 부피의 반과 동일한 양의 포름아마이드 점적 염료를 첨가하였고, 각 반응물을 95℃에서 5분간 인큐베이션하여 변성시켰다. 12㎕의 각 시료를 8% 폴리아크릴아마이드 변성 젤 상에 전기영동시켰다. 고정되고 건조된 젤에 방사선사진 필름 (Biomax MR; Kodak)을 노출시켰다.

T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ는 절단시 반복 서열 내의 불-일치의 위치와 일치하는 특정 모양의 절단된 생성물을 생산하는, 동일한 VNTR의 거의 동일한 양의 다른 두 대립유전자의 교잡으로부터 유도된 모든 DNA의 약 반을 절단하는 것으로 밝혀졌다. 교잡되지 않았으며, 결과적으로 불-일치가 없는 이중 가닥 DNA를 포함하는 한 대립유전자로부터 유도된 DNA는 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ에 의해 영향받지 않았다. 대조적으로, T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ와 함께 관찰되는 상기 특정 패턴의 절단된 생성물은 특정 반응 조건하에서 S1 뉴클레아제와 연합하여서는 관찰되지 않았다. 이와 같은 이유로, T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ는 상기 적용에 상기 두 효소 중 더 좋은 것으로 사료된다.

1× Taq PCR 완충액, 1× Pfu 완충액 (Stratagene) 및 1× T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 완충액 내에서 30분 및 1시간의 소화반응 동안 다양한 농도의 효소를 이용하여 상기 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ 반응의 반복은 상기 효소가 반응 조건의 범위에 걸쳐 예상가능하고 재생가능하게 소화시키며, 이는 최대 200u/㎕ 농도에서 검출가능한 DNA의 명백한 비-특이적 소화는 아니다. 상기 효소는 크기 범위에서의 불-일치를 함유하는 교잡된 분자를 절단하는 것으로 관찰되었다.

한 반복 서열 내의 불-일치로부터 발생한 특정 패턴의 절단된 생성물이 많은 양의 DNA가 폴리아크릴아마이드 젤 상에 첨적될 때에만 S1 뉴클레아제와 함께 관찰되었다. 이는 네 개의 뉴클레오티드 불-일치와 함께 관찰되었다. S1 뉴클레아제가 두 개의 뉴클레오티드 불-일치를 해결하는 능력은 매우 열악한 것으로 밝혀졌다.

T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ에 의한 이중사슬 DNA를 함유하는 불-일치의 절단 효율에 대한 효소 농도의 영향을 조사하였다.

2 뉴클레오티드 만큼 대립유전자 길이에서 차이가 있는 두 개의 복제된 VNTR 대립유전자를 프라이머 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (polynucleotide kinase)를 이용하여 [γ-33P]로 라벨된 하나의 프라이머를 포함한 플라스미드 특이적 프라이머를 이용하여 각각 분리하였다. 원심분리 에피소드 사이에 dH₂O를 연속적으로 첨가하면서, 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)에 의해 각각의 증폭된 대립유전자를 저 분자량 용질로부터 분리하였다.

더 작은 대립유전자의 증폭으로부터 유도된 DNA의 반은 저장하였다. 나머지 반에 거의 동일양의 더 큰 대립유전자의 증폭된 DNA를 첨가하였다. 상기 혼합물을 98℃에서 2분간 변성시킨 후, 100mM NaCl 및 200μM CTAB의 존재하에서 75℃에서 2시간 동안 어닐시켰으며, 상기 온도 사이에서 전이가 빠르게 일어났다. 마이크로원심분리에 의한 저 분자량 용질로부터 상기 어닐된 DNA의 분리를 반복하였다.

T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ의 연속 희석액을 상기 공급된 희석 완충액으로 제조하였다. 비-변성된 더 작은 대립유전자 및 변성되고 어닐된 상기 대립유전자 혼합물을 최종 농도가 0u/㎕, 50u/㎕, 100u/㎕ 및 150u/㎕ 농도의 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ를 함유한 Taq DNA 폴리머라제 완충액으로 각각 소화시켰다:

6㎕ DNA

1㎕ 10×Taq PCR 완충액

3㎕ T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ

10㎕

37℃에서 30분간 인큐베이션을 수행하였고, 그 후, 상기 반응을 5㎕의 포름아마이드 점적 염료를 첨가하여 95℃에서 2분간 가열하였다. 10㎕ 부피를 8% 폴리아크릴아마이드 변성 젤 상에서 전기영동시킨 후, 상기 젤을 고정시키고, 건조시키며, 방사선 사신 필름 (Biomax MR; Kodak)에 노출시켰다.

상기 비-변성된 더 작은 대립유전자의 소화는 거의 검출되지 않았다. 증폭화의 최종 사이클 동안 스튜터 띠의 어닐링 또는 폴리머라제 오류 위치에서 소화의 결과로 발생하는 어떠한 흔적도 관찰되지 않았다. 상기 어닐된 대립유전자에 해당하는 선에서, T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ의 존재하에서 특정한 형태의 소화가 발생하는 것으로 관찰되었다. 비록 100u/㎕에서의 소화량이 50u/㎕보다 약간 더 큰 것처럼 보일지라도, 각 효소 농도에서의 소화 정도는 거의 균일한 것을 발견하였다.

Pfu 완충액 (Stratagene) 및 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 완충액 내의 다양한 농도의 T4 엔도뉴클레아제를 이용하여 유사한 실험을 수행하였다. 상기 양 반응 완충액 내에서 불-일치 함유 DNA의 효율적인 소화가 발생하며, 50u/㎕와 100u/㎕ 사이의 T4 엔도뉴클레아제의 농도에서 상기 소화 정도는 최대이었다. 불-일치가 없는 이중사슬 DNA는 상기 조건하에서 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ에 내성을 가졌다.

T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 완충액 내의 S1 뉴크레아제 소화의 효율성 및 특이성을 검사하였다.

T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 이용하여 [γ-33P]로 라벨된 하나의 프라이머를 포함하는 플라스미드 특이적 프라이머를 이용하여 복제된 VNTR 대립유전자를 증폭하였다. 원심분리의 에피소드 사이에 dH₂O를 연속적으로 첨가하여 마이크로원심분리법 (Microcon-30; Amicon)에 의해 저 분자량 용질로부터 증폭된 DNA를 분리하였다. 회수된 DNA의 부피를 다음과 같이 나누었다: 30㎕는 이중 가닥 DNA로 남겨 놓고, 나머지 30㎕ DNA는 98℃에서 2분간 변성시킨 후, 얼음물에서 스냅 냉각 (snap cooling)시켜 단일 가닥으로 만들었다.

dH₂O로 S1 뉴클레아제의 희석액을 제조하였다. 동일한 양의 이중 가닥 DNA 또는 단일 가닥 DNA를 0u/㎕, 0.1u/㎕, 0.3u/㎕, 1u/㎕ 및 3u/㎕의 최종 농도에서 S1 뉴클레아제의 존재하에서 37℃, 5분간 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 내에서 소화시켰다. 소화의 완결시, 상기 반응을 최종 농도 25mM까지 500mM EDTA pH8의 첨가로 중단시켰다.

포름아마이드 점적 염료를 첨가하고, 95℃에서 3분간 가열시켜 상기 반응을 변성시킨 후, 등분액을 8% 폴리아크릴아마이드 변성 젤 상에서 전기영동시켰다. 상기 젤을 고정시키고, 건조시키며, 방사선 사진 (Biomax MR; Kodak)에 노출시켰다.

T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 내의 1u/㎕ S1 뉴클레아제의 농도는 단일 가닥 DNA의 최적 소화를 형성하며, 상기 농도에서 이중 가닥 DNA의 드러난 손실은 없다.

S1 뉴클레아제와 함께 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 소화의 조사.

T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 및 S1 뉴클레아제의 조사를 위해, 5' 말단에 네 개의 포스포로티오에이트 결합을 갖는 플라스미드 특이적 센스 프라이머와 3' 말단에서 네 개의 포스포로티오에이트 결합을 함유한 (AC)11B 프라이머 또는 상기 결합이 없는 (AC)11B 프라이머를 이용하여 복제된 VNTR 대립유전자로부터 DNA를 증폭하였다. 원심분리의 에피소드 사이에서 dH₂O를 연속적으로 첨가하면서 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)을 이용하여 저 분자량 용질로부터 상기 증폭된 생성물을 분리하였다. 각 경우에서 회수된 부피는 40㎕로 측정되었다. 포스포로티오이에트 결합의 존재 또는 부재하에서 각각 상기 VNTR 프라이머에 의해 프라임화된 상기 반응물을 약 1.3pmol/㎕ 및 0.35pmol/㎕를 함유하는 것을 발견하였다.

T7 유전자 6 엑소뉴클레아제를 dH₂O 내 10u/㎕로 희석하였다.

S1 뉴클레아제를 dH₂O 내 10u/㎕로 희석하였다.

약 0.1pmol/㎕의 농도에서 각각의 증폭된 생성물을 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제에 의해 소화시켰다. 또한, 포스포로티오에이트 (PT) 결합을 함유한 (AC)11B 프라이머를 이용하여 생성된 상기 DNA를 S1 뉴클레아제와 함께 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제에 의해 소화시켰다;

PT 결합의 부재	PT 결합의 존재	PT 결합의 존재
4㎕	4㎕	4㎕	5×T7 유전자 6 완충액
5.7㎕	1.6㎕	1.6㎕	DNA
0, 2, 4, 8㎕	0, 2, 4, 8㎕	0, 2, 4, 8㎕	10u/㎕ T7 유전자 6 엑소뉴클레아제
0㎕	0㎕	2㎕	10u/㎕ S1 뉴클레아제
20㎕까지	20㎕까지	20㎕까지	dH2O

각 반응을 37℃에서 10분간 인큐베이션시킨 후, 각 튜브에 1㎕ 500mM EDTA pH8을 첨가하고, 70℃에서 20분간 인큐베이션하였다.

각 소화물의 10㎕를 에티듐 브로마이드로 염색된 2.5% 아가로우스 젤 상에서 전기영동시켰다. 효소가 없는 반응물에 해당하는 선들은 예상된 분자량의 개개의 띠를 포함하였다. 포스포로티오에이트 차단이 없는 (AC)11B 프라이머에 의해 프라임된 DNA에 대하여 1u/㎕ 농도의 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제에서 단일 가닥 DNA에 해당하는 더 낮은 분자량의 띠가 관찰되었다. 사실상, 이를 초과하는 농도에서, 모든 DNA는 단일 가닥이었다. 대조적으로, 각 말단에서 포스포로티오에이트 결합에 의해 보호된 DNA는 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제의 특정 농도에서 분자량을 의미있게 변화시키지 않았으나, DNA의 양의 감소는 농도의 증가와 함께 분명했다. 유사하게, 각 말단에서 보호된 DNA는 S1 뉴클레아제와 함께 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제의 소화에 대하여 내성이 있었다. 약 0.1pmol/㎕ DNA를 함유하는 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 완충액 내의 1u/㎕ S1 뉴클레아제와 함께 1u/㎕ T7 유전자 6 엑소뉴클레아제의 농도가 가장 좋은 결과를 초래하는 것으로 나타났다.

불-일치 식별법은 제2 VNTR의 단일 대립유전자와 함께 동일한 VNTR의 세 개의 대립유전자를 함유하는 모델 시스템을 이용하여 조사되었다.

동일한 VNTR의 세 개의 대립유전자, (AC)10, (AC)11 및 (AC)18을 각각 2:1:1의 비율로 함유한 VNTR 대립유전자의 혼합물을 제조하였다. 또한, (AC)11 및 (AC)18 대립유전자와 동일한 양의, 제2 VNTR의 (CA)16 대립유전자를 상기 혼합물에 첨가하였다. Pfu DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 이용하여, [γ-33P]로 라벨된 각각의 플라스미드 특이적 프라이머 60pmol을 함유하는 100㎕의 반응 부피에서 상기 혼합물 1ng을 PCR로 증폭하였다. 95℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 45초 후, 72℃에서 5분간 초종 확장하는 가열 사이클링을 17번 반복수행하였다.

원심분리의 에피소드 사이에 dH₂O를 첨가하면서, 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)에 의해 저 분자량 용질로부터 상기 증폭된 DNA를 분리하였다. 상기 회수된 DNA를 98℃에서 2분간 변성시킨 후, 100mM NaCl 및 200μM CTAB 내에서 75℃에서 2시간 동안 어닐링시켰으며, 상기 온도 사이의 전이는 빨랐다.

원심분리의 에피소드 사이에 dH₂O를 첨가하면서 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)에 의해 저 분자량의 용지리로부터 상기 교잡된 DNA를 분리하였고, 전체 부피 36㎕ 내에 50u/㎕의 효소를 함유하는 Taq DNA 폴리머라제 완충액 내의 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ으로 소화시켰다. 상기 소화는 37℃에서 1시간 동안 진행하였고, 그 후, 상기 반응을 75℃에서 15분간 인큐베이션시켰다.

원심분리의 에피소드 사이에 dH₂O를 첨가하면서 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)에 의해 저 분자량 용질로부터 상기 소화된 DNA를 분리하였다. T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 완충액 내에 1u/㎕ T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 및 1u/㎕ S1 뉴클레아제 를 함유하는 50㎕ 반응물 내에서 37℃에서 10분간 부가적인 소화를 수행하엿다. 2㎕ 500mM EDTA pH8을 첨가하고, 75℃에서 10분간 가열하여, 상기 반응을 중단시켰다.

마이크로농축법은 원심분리 에피소드 사이에서 dH₂O를 첨가하여 수행하였다 (Microcon-30; Amicon). 48㎕의 부피가 회수되었으며, 이중 4㎕를 전술한 바와 같이 PCR로 증폭하였다. 이는 불-일치 식별법의 제2 라운드에 의해 수행되었다.

상기 불-일치 식별법의 각 라운드 전 및 후에 증폭된 DNA의 등분액을 8% 폴리아크릴아마이드 변성 젤 상에서 전기영동시켰다. 또한, 각 생성물의 분자량의 비교를 위해, 분리되어 증폭된 각 대립유전자의 PCR 생성물을 상기 젤 상에 점적하였다.

Pfu는 각 증폭화 반응에서 다양한 스튜터 띠를 생성함을 발견하였다. 불-일치 식별법 이전에 상기 혼합물 내의 (AC)10 대립유전자의 양은 모든 다른 대립유전자의 양의 약 두배이었다. 상기 다른 대립유전자들은 대략적으로 동일한 양으로 존재하였다. 불-일치 식별법의 제1 라운드 후, 상기 (AC)10 대립유전자의 분명한 증가가 관찰되었다. 이는 (AC)10 대립유전자에 해당하는 매우 강한 띠를 발생시키는 불-일치 식별법의 제2 라운드에 의해 향상되었고, (AC)11 및 (AC)18 대립유전자의 감소를 나타내었다. 비록 제2 VNTR의 (CA)15 대립유전자에 해당하는 띠가 불-일치 식별법의 제2 라운드 후에 존재할지라도, 이는 증가된 (AC)10 대립유전자의 띠만큼 밝지 않다. 이는 상기 혼합물 내의 각 VNTR의 전체 DNA 내의 불균형 및 결과적인 2차 반응차수를 따르는 교잡반응의 상대적인 비효율성을 반영하는 것으로 사료되었다. 상기 실험은 불-일치 식별법이 가장 높은 빈도를 갖는 동일한 VNTR의 대립유전자의 혼합물 내에 대립유전자를 증가시킴을 증거한다.

실시예 4

하기 방법은 몇몇 개의 풀화된 게놈을 이용하여 조사되었다.

유전적 형질에 의해 영향받는 개체 및 영향받지 않는 개체로부터 얻은 DNA 시료의 부재하에서, 본 방법은 열성 형질의 존재하에서 기대되는 VNTR 연결 불균형 (linkage disequilibrium)의 시나리오와 유사하게 고안된 모델 시스템 상에서 유효하게 되었다.

전체 43마리의 개는 VNTR 특이적 프라이머를 이용하여 상기 개에서 미리 분리된 VNTR으로 각각 유전자형화되었다. 상기 VNTR 프라이머 쌍은 (CACTTGGGACTTTGGATTGGTCA) 센스 프라이머 및 (GTCTTTGTTTCCATTCTTGCTTGC) 안티센스 프라이머를 포함하였다.

PCR에 의한 증폭화 반응은 4pmol의 각 VNTR 특이적 프라이머 및 20ng의 게놈상 DNA를 함유하는 10㎕ 부피로 수행되었다. 각 경우에 있어서, 상기 VNTR 특이적 센스 프라이머를 라벨화하고, 하기의 증폭화 반응 마스터 혼합물 (master mix)에 첨가하였다:

1.5㎕ 10×T4 폴리뉴클레오티드 키나제 완충액

2.4㎕ 50pmol/㎕ VNTR 특이적 센스 프라이머

4.5㎕ [γ-33P]ATP

1㎕ 30u/㎕ T4 폴리뉴클레오티드 키나제 희석액 3분의 1

5.6㎕ dHH₂O

15㎕

상기 반응을 37℃에서 1시간, 후 90℃에서 5분간 인큐베이션시켰다.

상기 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 반응물을 PCR 마스터 혼합물에 첨가하였다:

15㎕ T4 폴리뉴클레오티드 키나제 반응물

45㎕ 10×Taq DNA 폴리머라제 완충액

45㎕ 10×dNTP

2.4㎕ 50pmol/㎕ VNTR 특이적 안티센스 프라이머

4.5㎕ 5u/㎕ Taq DNA 폴리머라제

293㎕ dH₂O

405㎕

각각의 개에 대하여, 20ng/㎕ 게놈상 DNA 1㎕를 PCR 마스터 혼합물 9㎕에 첨가하고, 미네랄 오일과 함께 방치하였다. 각 반응물을 95℃에서 예열된 가열 사이클러 (cycler) 상에 놓고, 2분간 인큐베이션하였다. 가열 사이클링은 그 후, 95℃에서 30초간 28번 반복하여 변성하였고, 65℃에서 30초간 어닐링하고, 72℃에서 30초간 확장한 후, 72℃에서 5분간 최종 확장하였다.

8% 폴리아크릴아마이드 변성 젤 상에서 60W에서의 전기영동법 이전에, 90℃에서 3분간 변성시킨 각 반응물에 가열 사이클링 완결시, 5㎕의 포름아마이드 점적 염료를 첨가하였다. 상기 젤을 10% 메탄올/10% 빙초산 내에 고정시키고 건조시켰다. 방사선 사진 필름 (BioMax MR; Kodak)을 상기 젤에 하룻밤동안 노출시켰다.

영향받은	대립유전자 빈도
(AC)n	100%
(AC)n+1	0%
(AC)n+2	0%
(AC)n+3	0%
(AC)n+4	0%
(AC)n+5	0%
(AC)n+6	0%
(AC)n+7	0%
와일드 타입	대립유전자 빈도
(AC)n	15%
(AC)n+1	0%
(AC)n+2	0%
(AC)n+3	0%
(AC)n+4	35%
(AC)n+5	20%
(AC)n+6	0%
(AC)n+7	30%

한 개의 게놈상 DNA로부터 증폭자를 제조하였다. 100㎕ 부피로, 5㎍의 게놈상 DNA를 20 유니트 (unit) Hae III로 소화시켰으며, 상기 소화는 37℃에서 12시간에 걸쳐 완결되었다:

4.4㎕ 1.135㎍/㎕ 게놈상 DNA

10㎕ 10×제한 완충액

2㎕ 10u/㎕ Hae III

84㎕ dH₂O

100㎕

에티듐 브로마이드로 염색된 1% 아가로우스 젤 상에서 상기 반응물을 전기영동시켜 소화를 확인하였다.

DNA를 추출하고 (GFX 정제 칼럼), 50㎕ 5mM Tris pH8.5로 용출하였으며, 이중 30㎕ 내에 함유된 약 3㎍은 37℃에서 3시간 동안 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제로 인큐베이션하였다:

30㎕ DNA

30㎕ 5×터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 완충액

4.5㎕ 10mM ddGTP

10㎕ 9u/㎕ 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제

75.5㎕ dH₂O

150㎕

원심분리 에피소드 사이에 dH₂O를 연속적으로 첨가하면서 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)으로 저 분자량의 용질로부터 DNA를 분리하였다. 35㎕의 부피가 회수되었다.

두 개의 올리고뉴클레오티드, 24mer (GsCsAsGsGAGACATCGAAGGTATGAAC, 여기서 's'는 포스포로티오에이트 결합을 나타냄) 및 12mer (TTCATACCTTCG)를 어닐링시켜 어뎁터를 제조하였다:

7.6㎕ 197pmol/㎕ 24mer

9.2㎕ 162pmol/㎕ 12mer

1.87㎕ 10×T4 DNA 리가제 완충액

18.7㎕

상기 혼합물을 55℃로 가열하고, 10℃로 한 시간에 걸쳐 냉각시켰다.

상기 어뎁터를 말단화된 게놈상 단편에 연결시켰다:

35㎕ DNA

18.7㎕ 어뎁터

4.3㎕ 10×T4 DNA 리가제 완충액

1.5㎕ 10u/㎕ T4 DNA 리가제

2.5㎕ dH₂O

62㎕

상기 반응물을 16℃에서 하룻밤동안 인큐베이션시킨 후, 70℃에서 20분간 불활성화시켰다.

원심분리 에피소드 사이에 dH₂O를 연속적으로 첨가하면서 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)으로 저 분자량 용질로부터 DNA를 분리하였다. 54㎕의 부피가 회수되었다.

단일 가닥 틈의 위치로부터 프라이밍을 통한 가상 생성물의 생성을 저지하기 위해, 써모 시쿼나제와 함께 인큐베이션하여 말단화되었다:

54㎕ DNA

4.4㎕ 써모 시쿼나제 완충액

1.4㎕ 10mM ddATP

1.4㎕ 10mM ddCTP

1.4㎕ 10mM ddGTP

1.4㎕ 10mM ddTTP

0.5㎕ 32u/㎕ 써모 시쿼나제

5.5㎕ dH₂O

70㎕

상기 혼합물을 미네랄 오일과 함께 방치시키고, 74℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다.

DNA를 추출하고 (GFX 정제 칼럼), 50㎕ 5mM Tris pH 8.5로 용출하였다.

VNTR 프라이머 및 상기 어뎁터 프라이머로서 상기 어뎁터 내에 함유된 24mer 올리고뉴클레오티드를 이용하여 상기 DNA로부터 증폭자를 제조하였다:

5㎕ 10×Taq DNA 폴리머라제 완충액

5㎕ 10×dNTP

2㎕ 25pmol/㎕ 어뎁터 프라이머

2㎕ 25pmol/㎕ VNTR 프라이머 [(AC)11B, (CA)11D, (GT)11H 또는 (TG)11V]

2㎕ 말단화되고, 어뎁터-연결된 DNA 단편 (약 50ng/㎕)

34㎕ dH₂O

50㎕

VNTR 프라이머를 포함하나 게놈상 DNA가 없는 유사한 반응물을 제조하였다. 또한, 게놈상 DNA를 포함하나 VNTR 프라이머가 없는 하나의 반응을 수행하였다. 모든 반응은 미네랄 오일과 함께 방치시키고, 95℃에서 2분간 인큐베이션시켰다. 각 반응물에 5u/㎕ Taq DNA 폴리머라제 0.5㎕를 참가하였다. 95℃에서 30초, 65℃에서 45초, 72℃에서 45초를 18번 반복하고, 72℃에서 5분간 최종 확장하는 가열 사이클링으로 증폭화반응을 수행하였다.

증폭화 완결시, 5㎕의 각 반응물을 에티듐 브로마이드로 염색된 1.5% 아가로우스 젤 상에 분자량 표시제와 함께 전기영동시켰다. 주형 DNA 및 VNTR 프라이머를 함유한 반응을 나타내는 선에서 증폭된 생성물의 존재는 어뎁터 서열에 대한 게놈상 단편의 연결이 일어났음을 증거한다. 각 경우에 있어서, 상기 선들의 모양은 유사하며, 약 100염기쌍 내지 500염기쌍의 분자량 범위에 걸쳐 분포된 증폭화 생성물 덩어리가 있다. 모든 다른 선들은 증폭화 생성물이 없다. 주형 DNA를 포함하나 VNTR 프라이머가 없는 반응이 생성물을 만들지 않는다는 사실은 Taq DNA 폴리머라제의 존재하에서 사슬 확장이 저지되도록 모든 3' 말단이 성공적으로 말단화되었음을 확실시하였다.

(AC)11B 및 (CA)11D로 프라임된 반응물이 결합되었다. 또한, (GT)11H 및 (TG)11V로 프라임된 반응물이 결합되었다. 원심분리 에피소드 사이에 dH₂O를 첨가하면서 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)으로 저 분자량 용질로부터 두 증폭자 풀 모두를 분리하였다. 회수된 DNA의 아가로우스 젤 전기영동법에 의한 정량화는 각 라인이 약 35ng/㎕ 증폭자 DNA를 함유함을 제시한다.

T4 DNA 폴리머라제 및 엑소뉴클레아제 Ⅶ를 이용하여 상기 풀화된 (AC)11B 및 (CA)11D 프라임화된 생성물로부터 반복 서열을 제거하였다:

14㎕ 35ng/㎕ (AC)11B/(CA)11D 프라임화된 증폭자 DNA

2㎕ 10×T4 DNA 폴리머라제 완충액

1㎕ 10mM dATP

1㎕ 10mM dCTP

2㎕ 4u/㎕ T4 DNA 폴리머라제의 4분의 1 희석액

20㎕

상기 반응을 12℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 70℃에서 20분간 인큐베이션하였다.

상기 반응물에 10u/㎕ 엑소뉴클레아제 Ⅶ 1㎕를 첨가하고 37℃에서 30분간 인큐베이션한 후, 70℃에서 20분간 인큐베이션하였다.

상기 지정된 영향받은 풀 및 와일드 타입 풀은 선택된 개의 게놈상 DNA의 동일 양을 결합시켜 제조되었고, 분광광도법으로 정량하였다. 페놀/클로로포름 추출하고, 원심분리 에피소드 사이에 dH₂O를 첨가하면서 마이크로농축하였다 (Microcon; Amicon).

게놈상 DNA의 각 풀을 Hae III로 소화하고, 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 이용하여 말단화하고, 상술한 방법과 유사한 방법으로 상기 어뎁터에 연결하였다. 모든 3' 말단의 완전한 말단화는 상기 어뎁터 프라이머와 함께 PCR로 확인하였다. 상기 DNA 풀들은 아가로우스 젤 전기영동법으로 정량화하였으며, 이들은 대략 동일한 농도를 함유하는 것으로 나타났다.

최소 부피로, T4 DNA 폴리머라제 및 엑소뉴클레아제 Ⅶ로 소화된, 2.5㎕의 35ng/㎕ (AC)/(CA) 프라임화된 증폭자 풀은 단편화되고, 말단화되며, 상기 어뎁터에 연결된 약 300ng의 '영향받은' 게놈상 DNA와 0.6M NaCl 내에서 교잡되었다. 이는 98℃에서 3분간 미네랄 오일 하에서 상기 혼합물을 변성시킨 후, 80℃에서 70℃로 10 시간에 걸쳐 온도를 단계적으로 감소시키며, 추가 10시간 동안 최종 온도를 유지시킴으로써 달성되었다. 상기 와일드 타입 풀을 유사한 방법으로 병행교잡시켰다.

각 교잡반응에 다음을 첨가하였다:

20㎕ 10×Taq DNA 폴리머라제 완충액

20㎕ 10×dNTP

160㎕ dH₂O

200㎕

각 경우에 있어서, 상기 교잡된 DNA를 함유한 전체 부피를 두 반응 튜브에 나누었다. 미네랄 오일 하에서 각 부피를 75℃로 가열하였다. 5u/㎕ Taq DNA 폴리머라제 1㎕를 각 튜브에 첨가한 후, 72㎕에서 10분간 인큐베이션하였다. 각 반응물을 95℃에서 3분간 변성하고, 25pmol/㎕ 어뎁터 프라이머 4㎕를 첨가하였다. 상기 교잡된 DNA의 증폭화반응은 95℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 90초간 30번 반복하고, 72℃에서 5분간 최종 확장하는 가열 사이클링으로 수행되었다.

영향받은 DNA를 함유한 반응물을 풀화시키고, 와일드 타입 DNA를 함유한 반응물도 풀화시키며, 10u/㎕ 엑소뉴클레아제 I 8㎕를 각 200㎕ 부피의 증폭된 DNA에 첨가하였다. 반응물을 37℃에서 15분간 인큐베이션하였다.

각 반응물에 대하여, 원심분리 에피소드 사이에 dH₂O를 첨가하면서 저 분자량 용질로부터 (Microcon-30l Amicon) DNA를 분리하였다. 각 경우에 있어서, 10㎕의 부피가 회수되었다. 각 시료 내에 함유된 대립유전자를 변성시킨 후, 98℃에서 5분간 미네랄 오일 하에서 인큐베이션시킨 후, 75℃까지 온도를 빠르게 감소시켰다. 75℃에서, 2M NaCl 및 10mM CTAB를 최종 농도가 각각 50mM 및 500μM이 되도록 첨가하였다. 상기 교잡 반응물을 75℃에서 추가 16시간 동안 인큐베이션하였다.

각 교잡 반응물에 5mM Tris pH8.5 150㎕를 첨가하였다. 그 후, 상기 희석된 교잡반응물을 원심분리 에피소드 사이에 dH₂O를 첨가하면서 저 분자량 용질 (Microcon-30; Amicon)으로부터 분리하였다. 이들은 약 10pmol DNA를 함유하는 것으로 판단되었다. Taq DNA 폴리머라제 완충액 내에서 50u/㎕의 농도에서 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ에 의한 소화를 부피 100㎕에서 수행하였다. 상기 소화는 65℃에서 15분간 인큐베이션하기 전에 37℃에서 30분간 진행하였다.

원심분리 에피소드 사이에 dH₂O를 첨가하면서 저 분자량 용질 (Microcon-30; Amicon)로부터 각 소화물을 분리하였다. 각 경우에 있어서 회수된 부피를 세 개의 튜브에 나누고, 각각을 1×Taq DNA 폴리머라제 완충액 내의 0.5u/㎕ 엑소뉴클레아제 I, 1u/㎕ T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 후, 70℃에서 10분간 가열 불활성화 후, 1×T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 완충액 내 0.5u/㎕ 엑소뉴클레아제 I, 또는 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 완충액 내 1u/㎕ S1 뉴클레아제와 함께 1u/㎕ T7 유전자 6 엑소뉴클레아제로 소화하였다. 각 반응물 내의 DNA의 농도는 30㎕ 부피 내에 약 0.1pmol/㎕를 함유하였다. 70℃에서 10분간 가열 불활성화 이전에 37℃에서 15분간 엑소뉴클레아제 I 반응을 수행하였다. S1 뉴클레아제의 존재 또는 부재하에서 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제를 함유한 반응을 37℃에서 10분간 수행하였다. 소화의 각 반응의 완결시, DNA를 추출하고 (GFX 정제 칼럼), 50㎕ dH₂O로 용출하였다.

각각의 추출된 DNA 시료의 3분의 1을 Taq DNA 폴리머라제를 이용한 PCR로 증폭하였다:

37.5㎕ 소화된 DNA

15㎕ 10×Taq DNA 폴리머라제 완충액

15㎕ 10×dNTP

6㎕ 25pmol/㎕ 어뎁터 프라이머

76.5㎕ dH₂O

150㎕

상기 반응물을 75㎕ 등분액으로 나누고, 미네랄 오일과 함께 방치시키고, 95℃에서 2분간 인큐베이션 후, 0.75㎕의 5u/㎕ Taq DNA 폴리머라제를 첨가하였다. 95℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 90초를 25번 반복한 후, 72℃에서 5분간 최종 확장하는 가열 사이클링으로 증폭화를 수행하였다.

150㎕의 각 증폭화된 DNA에 6㎕ 10u/㎕ 엑소뉴클레아제 I을 첨가하였다. 상기 반응물을 37℃에서 15분간 인큐베이션하였다.

각 경우에 있어서, 원심분리 에피소드 사이에 dH₂O를 첨가하면서 저 분자량 용질 (Microcon-30; Amicon)으로부터 DNA를 분리하였다. 50mM NaCl 및 500μM CTAB 내에서 교잡반응 후, 소화의 각 반응을 반복한 후, 상기와 같이, Taq DNA 폴리머라제와 함께 PCR에 의해 생성된 DNA를 증폭하였다.

상기 증폭된 각 시료의 등분액을 에티듐 브로마이드로 염색된 1.5% 아가로우스 젤 상에서 저 분자량 표시제와 함께 전기영동하였다. T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ 후, 엑소뉴클레아제 I에 의해 소화된 DNA에 해당하는 선 내의 증폭된 생성물은 웰(well)로 향하는 덩어리화된 고 분자량으로 이루어졌다. 대조적으로, T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 후 엑소뉴클레아제 I 또는 S1 뉴클레아제와 동시에 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제로 소화된 증폭된 생성물에 해당하는 선들은 약 200 염기쌍 내지 750 염기쌍의 분자량 범위를 갖는 물질을 함유하였다. 각 경우에 있어서의 분자량 분포는 유사하였다. 웰로 향하는 덩어리화는 관찰되지 않았으며, 이는 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제의 부재하에서 관찰되었던 증폭화반응의 가상 생성물이 상기 효소의 존재에 의해 제거되었음을 제시한다. 이와 같은 이유로, T7 유전자 6 엑소뉴클레아제는 다른 방법으로 교차-교잡반응하고, 가상 DNA 분자를 생성하는 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ 절단된 분자로부터 얻은 반복 서열의 제거를 위한 불-일치 식별법 반응의 필수 성분으로 사료되었다.

불-일치 식별법의 제2 라운드로부터 발생한 증폭화된 DNA의 각각의 150㎕ 부피에 10u/㎕ 엑소뉴클레아제 I 6㎕를 첨가하고, 상기 반응물을 37℃에서 15분간 소화하였다.

각 경우에 있어서, 원심분리 에피소드 사이에 dH₂O를 첨가하면서 저 분자량 용질 (Microcon-30; Amicon)로부터 DNA를 분리하였다.

상기 '영향받은' 개에 해당하는 각 반응에 대하여, 약 25ng의 DNA를 함유하는 50㎕ 부피로 상기 VNTR 특이적 프라이머를 이용하여 Taq DNA 폴리머라제를 이용하여 PCR로 증폭화를 수행하였다. 28 반복의 가열 사이클링에 의한 증폭화반응을 수행한 후, 5㎕ 등분액과 분자량 표시제를 에티듐 브로마이드로 염색된 2% 아가로우스 젤 상에 점적하였다.

T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ 및 엑소뉴클레아제 I에 의한 소화에 해당하는 선에 대하여, 예상된 분자량의 생성물은 매우 희미했다. 또한, 상기 웰 부근에 많은 양의 가상 생성물이 관찰되었다. 모든 다른 선들에 대하여, 고분자량의 물질은 관찰되지 않았다. 또한, 상기 증폭된 생성물은 약 130염기쌍의 예상된 분자량의 개별 띠로서 분명하게 관찰되었다.

T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ 및 엑소뉴클레아제 I에 의한 소화에 해당하는 증폭화 생성물을 버렸다. T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 이용하여 [γ-33P]ATP로 라벨된 하나의 프라이머를 포함하는 VNTR 특이적 프라이머를 이용하여 잔존하는 반응물을 추가 증폭화하였다. 35 반복의 가열 사이클링 동안, 각 프라이머를 10pmol 함유한 20㎕ 부피로 Taq DNA 폴리머라제를 이용하여 PCR에 의해 증폭화 반응을 수행하였다. 또한, 풀화된 '영향받은' DNA 및 풀화된 '와일드 타입' DNA 40ng을 함유하면서 동일한 방법으로 반응을 수행하였다. 10㎕의 포름아마이드 점적 염료를 각 시료에 첨가한 후, 증폭된 생성물을 90℃에서 3분간 변성하였다. 각 혼합물의 6㎕ 등분액을 8% 폴리아크릴아마이드 변성 젤 상에서 전기영동시켰다. 상기 젤을 고정하고, 건조하며, 방사선 사진 필름에 노출하였다.

불-일치 식별법의 제2 라운드 다음에 영향받은 DNA로부터 증폭된 DNA에서 생성물이 나타남을 관찰하였다. 이는 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 후, 엑소뉴클레아제 I에 의한 소화에 해당하는 선과 S1 뉴클레아제와 동시에 T7 유전자 6 엑소뉴클레아제에 의한 소화에 해당하는 선 모두에서 관찰되었다. 각 경우에 있어서, 생성물은 불-일치 절단되지 않은 상기 풀화된 영향받은 DNA의 증폭화로부터 얻은 것과 유사하였다. 불-일치 식별법의 제2 라운드 후 증폭된 와일드 타입 DNA의 경우에 있어서, 생성물은 식별할 수 없었다.

상기 실험은 VNTR이 몇몇 개체의 풀화된 게놈으로부터 신뢰성있게 재생되며, 각 경우에 있어서 대립유전자가 보존되고, 불-일치 식별법은 증폭화의 가상 생성물을 제거하고 가장 높은 빈도의 VNTR 대립유전자를 증가시키는 작용을 함을 증거한다. 비록 상기 와일드 타입 DNA로부터 유도된 DNA에서 생성물이 관찰되지 않았을지라도, 상기 폴리아크릴아마이드 젤 상에 DNA를 더 많이 점적하면 생성물이 관찰될 수 있다. 이와 같은 이유로, 상기 정보성 대립유전자의 최종 선택이 달성될 수 있도록 모든 DNA 풀 내의 대립유전자들을 거의 동형접합에 가깝게 감소시키는데 상기 불-일치 식별법의 부가적인 반복이 필수적이다.

실시예 5

어뎁터 연결에 의해 유도된 3' 오버행을 갖는 DNA의 엑소뉴클레아제 III에 대한 내성의 증명.

복제된 VNTR 대립유전자를 Taq DNA 폴리머라제로 증폭하였다. 원심분리 에피소드 사이에 dH₂O를 연속적으로 첨가하면서 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)으로 저 분자량 용질로부터 증폭된 DNA를 분리하였다.

회수된 부피는 44㎕로 측정되었으며, 이의 농도는 아가로우스 젤 전기영동법에 의해 약 1.6pmol/㎕인, 160ng/㎕로 결정되었다.

T4 DNA 폴리머라제 소화로 증폭된 DNA를 뭉뚝하게 하였다:

42㎕ DNA

3.25㎕ 10mM dATP

3.25㎕ 10mM dCTP

3.25㎕ 10mM dGTP

3.25㎕ 10mM dTTP

13㎕ 10×T4 DNA 폴리머라제 완충액

3.25㎕ 4u/㎕ T4 DNA 폴리머라제

59㎕ dH₂O

130㎕

상기 반응을 12℃에서 30분간 인큐베이션한 후, 70℃에서 20분간 가열 불활성화하였다. 원심분리 에피소드 사이에 dH₂O를 연속적으로 첨가하면서 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)으로 저 분자량 용질로부터 DNA를 분리하였다. 30㎕의 부피가 회수되었다.

1600pmol의 21mer 올리고뉴클레오티드 (CTCGCAAGGATGGGATGCTCG)를 제공된 희석 완충액으로 10u/㎕로 희석된 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 인산화(phosphorylation)하였다:

3.19㎕ 21mer 올리고뉴클레오티드

1.5㎕ 10×T4 DNA 리가제 완충액

1㎕ 10u/㎕ T4 DNA 폴리뉴클레오티드 키나제

9.3㎕ dH₂O

15㎕

상기 반응을 37℃에서 30분간 인큐베이션한 후, 90℃에서 10분간 가열 불활성화하였다. 상기 키나제 반응물에 1600pmol의 12mer 올리고뉴클레오티드 (CATCCTTGCGAG)를 첨가하였다. 55℃에서 가열한 후, 1시간에 걸쳐 10℃까지 상기 혼합물을 냉각함으로써 어뎁터를 형성하기 위한 상기 올리고머들의 어닐링을 수행하였다.

T4 DNA 폴리머라제에 의해 끝이 뭉뚝하게 된 DNA의 반은 저장하였다. 상기 어닐링된 어뎁터에 상기 어뎁터가 50배 과량으로 되도록 나머지 15㎕의 뭉뚝한 끝의 DNA를 첨가하였다:

15㎕ 뭉뚝한 끝의 DNA

16.2㎕ 어닐링된 어뎁터

1.9㎕ 10×T4 DNA 리가제 완충액

1㎕ 10u/㎕ T4 DNA 리가제

34㎕

상기 연결 반응물을 16℃에서 하룻밤동안 인큐베이션하였다. 상기 연결반응을 70℃에서 20분간 가열 불활성화하고, 원심분리 에피소드 사이에 dH₂O를 연속적으로 첨가하면서 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)으로 저 분자량 용질로부터 DNA를 분리하였다.

회수된 부피는 36㎕로 측정되었다.

상기 연결된 DNA 및 15㎕의 저장된 비-연결된 DNA에 dH₃O를 첨가하여 약 0.75pmol/㎕로 제조하였다. 0.2pmol/㎕로 추정되는 DNA의 최종 농도에서 엑소뉴클레아제 III로 각각을 소화시켰다:

10.7㎕ DNA

4㎕ 10×엑소뉴클레아제 III 완충액

1㎕ 200u/㎕ 엑소뉴클레아제 III

24.3㎕ dH₂O

40㎕

상기 반응물을 37℃에서 5분간 인큐베이션한 후, 70℃에서 20분간 가열 불활성화시켰다.

약 2pmol의 각 소화물을 에티듐 브로마이드로 염색된 2% 아가로우스 젤에 점적하였다. 상기 아가로우스 젤 상에 아무것도 관찰되지 않도록 엑소뉴클레아제 III에 의해 모든 비-연결된 DNA를 완전히 소화시켰다. 반대로, 비록 약간의 소화가 일어났을지라도, 상기 연결된 DNA의 대부분은 소화에 대한 내성이 있는 것으로 관찰되었다. 소화된 것은 상기 인산화된 어뎁터에 연결될 수 없는 것으로 추정된다. 상기 실험은 어뎁터의 연결이 DNA 분자가 엑소뉴클레아제 III 소화에 대하여 내성이 있을 수 있으며, 어뎁터가 없는 상기 분자들은 상기 효소에 의해 완전히 소화되는 한 방법임을 증거한다.

엑소뉴클레아제 III를 이용한 DNA의 제2 풀에 교잡되는 DNA 풀 내의 독특한 서열의 선택.

반복 길이가 네 개의 뉴클레오티드 정도 차이가 있는 두 개의 복제된 VNTR 대립유전자를 Taq DNA 폴리머라제를 이용한 PCR로 증폭하였다. 원심분리 에피소드 사이에 dH₂O를 연속적으로 첨가하면서 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)으로 저 분자량 용질로부터 증폭된 DNA를 분리하였고, 결과적인 DNA의 농도는 아가루오스 젤 전기영동법으로 결정하였다.

터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제와 함께 인큐베이션하여, 더 작은 대립유전자의 증폭된 생성물의 일부에 3' 오버행을 첨가하였다:

12.5㎕ 120ng/㎕ DNA (약 1.2pmol/㎕)

15㎕ 5×터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제

1.125㎕ 10mM dATP

3.3㎕ 9u/㎕ 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제

43㎕ dH₂O

75㎕

상기 반응을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, DNA를 추출하였다 (GFX 정제 칼럼). 상기 혼합물을 98℃에서 3분간 변성하고, 0.2M NaCl 및 100μM CTAB의 존재하에서 75℃에서 2시간 동안 어닐링하였다.

각 교잡반응에 다음을 첨가하였다:

10㎕ 10×Taq DNA 폴리머라제 완충액

10㎕ 500u/㎕ T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ

80㎕ dH₂O

100㎕

상기 반응을 37℃에서 45분간 인큐베이션한 후, 70℃에서 15분간 불활성화시켰다.

원심분리 에피소드 사이에 dH₂O를 연속적으로 첨가하면서 마이크로농축법 (Microcon-30; Amicon)으로 저 분자량 용질로부터 DNA를 분리하였다. 각 경우에 있어서, 약 40㎕의 부피가 회수되었고, 5u/㎕ 엑소뉴클레아제 III를 함유한 반응 혼합물 내에 희석되었다:

40㎕ DNA

15㎕ 10×엑소뉴클레아제 III 완충액

3.75㎕ 200u/㎕ 엑소뉴클레아제 III

91㎕ dH₂O

150㎕

상기 반응을 37℃에서 5분간 인큐베이션한 후, 마이크로농축하였다 (Microcon-30; Amicon). 회수된 전체 부피를 에티듐 브로마이드로 염색된 1.5% 아가로우스 젤 상에서 전기영동하였다. 또한, 분자량 표시제, 3' 오버행이 없는 400ng의 작은 대립유전자, 및 오버행을 포함한 400ng의 더 작은 대립유전자를 상기 젤에 점적하였다.

상기 더 작은 증폭된 대립유전자의 크기는 상기 분자량 표시제와 비교하여 약 150염기쌍인 것으로 확인되었다. 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제와 함께 인큐베이션한 후, 상기 증폭된 대립유전자의 분명한 크기가 증가하였다. 이중 가닥 DNA의 400염기쌍과 750염기쌍에 해당하는 크기 범위에 걸쳐 분포된 생성물 덩어리가 관찰되었으나, 대부분의 DNA는 상기 범위 중간에 분명하지 않은 띠로 제한된다. 소화된 다른 크기의 교잡된 대립유전자를 포함하는 선에서, 이중 가닥 DNA의 약 300염기쌍에 해당하는 띠가 생성물 덩어리의 뒤쪽에 관찰되었다. 상기 띠는 DNA 이중사슬을 함유한 불-일치의 효소적 절단의 결과인 것으로 사료된 반면, 상기 배경 덩어리는 3' 오버행의 보호가 없는 분자의 엑소뉴클레아제 III 소화로부터 발생된 단일 가닥 DNA인 것으로 사료되었다. 동일한 크기의 교잡된 대립유전자를 함유한 선에서, 두 개의 분명하지 않은 띠들이 생성물의 배경 덩어리에 대하여 관찰되었다. 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제와 인큐베이션한 후의 더 작은 대립유전자와 유사한 가장 선명한 띠가 나타났으며, 이는 엑소뉴클레아제 III에 의해 소화된 이종이중사슬 분자로부터 얻은 잔존하는 단일 가닥 DNA를 나타내는 것으로 사료되었다. 더 희미한 띠는 폴리머라제 오류를 포함한 분자의 효소적 절단의 결과로 판단되었다. 전술한 바와 같이, 상기 배경 덩어리는 엑소뉴클레아제 III에 의한 소화로부터 발생된 3' 오버행이 없는 분자의 단일 가닥 DNA에 기인한 것으로 사료되었다. 상기 실험은 다른 반복 길이의 대립유전자를 갖는 이종이중사슬내에 도입되는 3' 오버행을 갖는 대립유전자가 상기 이종이중사슬의 단편이 선택될 수 있도록 T4 엔도뉴클레아제 Ⅶ 및 엑소뉴클레아제 III에 의해 소화됨을 제시한다.

첨부

드문 열성 형질을 유형화하는 시나리오를 참조하라. 영향받은 개체군은 동일한 대립유전자에 대하여 동종이다. 와일드 타입 군에서, 상기 대립유전자는 비교적 낮은 빈도를 갖는다.

결과적으로, 과량의 와일드 타입 DNA가 불-일치 식별법에 생존하는 상기 영향받은 DNA에 교잡될지라도, 상기 영향받은 그룹 내에 존재하는 대립유전자는 회수되기가 매우 쉽다.

한 대립유전자가 상기 와일드 타입 그룹보다 더 큰 빈도에서 영향받은 개체군 내에 존재하는 또 다른 시나리오를 참조하라.

결과적으로, 비록 과량의 와일드 타입 DNA가 불-일치 식별법에서 생존하는 상기 영향받은 DNA에 교잡될지라도, 상기 영향받은 그룹 내에 존재하는 대립유전자 E가 회수되기 매우 쉽다.

참고문헌

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Claims

a) 특정 종의 게놈상 DNA를 단편으로 나누는 단계,

b) 효소적 사슬 확장을 저지시키기 위해, 각 단편의 각 말단을 어뎁터에 연결하여, 각각의 3' 말단이 차단된 어뎁터-말단화 단편의 혼합물을 제조하는 단계,

c) 어뎁터 프라이머 및 VNTR 프라이머와 함께 주형으로서 어뎁터-말단화 단편의 혼합물 부분을 이용하여 5'-플랭킹 VNTR 증폭자 혼합물을 제조하는 단계,

d) 어뎁터 프라이머 및 VNTR 안티센스 프라이머와 함께 주형으로서 어뎁터-말단화 단편의 혼합물 부분을 이용하여 3'-플랭킹 VNTR 증폭자 혼합물을 제조하는 단계,

e) 프라이머로서 5'-플랭킹 VNTR 증폭자 혼합물 및/또는 3'-플랭킹 VNTR 증폭자 혼합물과 함께 주형으로서 특정 종의 하나 또는 그 이상의 구성원의 게놈상 DNA를 이용하여 VNTR 대립유전자 및 이들의 플랭킹 영역의 원하는 혼합물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 특정 종의 하나 또는 그 이상의 구성원의 게놈상 DNA의 VNTR 대립유전자 및 이들의 플랭킹 영역의 혼합물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 b)단계는 효소적 사슬 확장을 저지시키기 위해 각 단편의 각 3'-말단을 말단화시키고, 각 단편의 각 5'-말단을 어뎁터에 연결하여, 어뎁터 말단화된 단편의 혼합물을 제조함으로써 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 c)단계에서 상기 VNTR 반복 서열은 5'-플랭킹 VNTR 증폭자로부터 제거되며, d)단계에서 상기 VNTR 반복 서열은 3'-플랭킹 VNTR 증폭자로부터 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 c) 및/또는 d) 단계에서, 사용된 상기 어뎁터 또는 프라이머는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 e)단계는 프라이머로서, 연속적으로 또는 동시에 5'-플랭킹 VNTR 증폭자 혼합물 및 3'-플랭킹 VNTR 증폭자 혼합물을 모두 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 e)단계에서 특정 형질을 나타내는 특정 종의 하나 또는 그 이상의 구성원의 게놈상 DNA가 사용되며, VNTR 대립유전자 및 이들의 클랭킹 서열의 결과적으로 형성된 혼합물은 상기 특정 형질을 나타내는 것으로 대표되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 f)단계에서, 상기 VNTR 대립유전자 및 이들의 플랭킹 영역의 혼합물의 계통이 분리된 후, 재-어닐링되고, 특정 불-일치가 분리되며, 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 f)단계는 하나의 VNTR 대립유전자 및 이의 플랭킹 영역을 회수하기 위해 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 형질을 나타내는 것으로 대표되는 적어도 하나의 VNTR 대립유전자 및 이의 플랭킹 서열은 상기 특정 형질을 나타내지 않는 것으로 대표되는 VNTR 대립유전자 및 이들의 플랭킹 서열의 혼합물과 교잡되며, 상기 특정 형질을 특징으로 하는 적어도 하나의 VNTR 대립유전자 또는 단편을 제공하기 위해 적어도 하나의 일치 및/또는 적어도 하나의 불-일치가 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 특정 형질을 나타내는 것으로 대표되는 적어도 하나의 VNTR 대립유전자 및 이의 플랭킹 서열은 3'-중첩 말단과 함께 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
선택된 VNTR 서열의 대립유전자 및 이들의 플랭킹 영역의 대표적 혼합물로 필수적으로 이루어진 것을 특징으로 하는 특정 종의 하나 또는 그 이상의 구성원의 게놈상 DNA 부분.
제11항에 있어서, 상기 대립유전자 혼합물은 특정 형질을 나타내는 것으로 대표됨을 특징으로 하는 게놈상 DNA 부분.
제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 혼합물의 각 구성원은 3'-말단 및 5'-말단의 각각에 어뎁터를 포함하는 것을 특징으로 하는 게놈상 DNA 부분.
특정 형질을 나타내는 것을 특징으로 하는 하나의 VNTR 대립유전자 및 이의 플랭킹 영역 및 3'-말단 및 5'-말단의 각각에서의 어뎁터로 필수적으로 이루어진 것을 특징으로 하는 특정 종의 하나 또는 그 이상의 구성원의 게놈상 DNA 부분.
선택된 VNTR 서열의 3'-플랭킹 영역의 대표적 혼합물로 필수적으로 이루어지며, 상기 혼합물의 각 구성원은 3'-말단에 하나의 어뎁터를 수반하는 것을 특징으로 하는 특정 종의 게놈상 DNA 부분.
선택된 VNTR 서열의 5'-플랭킹 영역의 대표적 혼합물로 필수적으로 이루어지며, 상기 혼합물의 각 구성원은 5'-말단에 어뎁터를 수반하는 것을 특징으로 하는 특정 종의 게놈상 DNA 부분.
특정 형질을 나타내는 것으로 대표되는 다형태성 대립유전자 혼합물의 가닥을 분리한 후 재-어닐링하는 단계, 및 특정 불-일치를 분리하고 제거하는 단계를 포함하는 다형태성 대립유전자 혼합물을 처리하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 다형태성 대립유전자 혼합물은 선택된 VNTR 서열의 대립유전자 및 이들의 플랭킹 영역의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 방법은 하나의 VNTR 대립유전자 및 이의 플랭킹 영역을 회수하기 위해 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 형질을 나타내는 것으로 대표되는 적어도 하나의 VNTR 대립유전자 및 이의 플랭킹 서열은 상기 특정 형질을 나타내지 않는 것으로 대표되는 VNTR 대립유전자 및 이들의 혼합물과 교잡되며, 상기 특정 형질에 특성이 있는 적어도 하나의 VNTR 대립유전자 또는 이의 단편을 제공하기 위해 적어도 하나의 일치 및/또는 적어도 하나의 불-일치가 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 특정 형질을 나타내는 것으로 대표되는 적어도 하나의 VNTR 대립유전자 및 이의 플랭킹 서열이 3'-중첩 말단과 함께 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
a) 특정 종의 하나 또는 그 이상의 구성원의 게놈상 DNA를 단편으로 나누는 단계,

b) 효소적 사슬 확장을 저지하기 위해, 각 단편의 각 말단에 어뎁터를 연결하여 각 3'-말단이 차단된 어뎁터-말단화된 단편의 혼합물을 제조하는 단계,

c) 어뎁터 프라이머 및 VNTR 프라이머와 함께 주형으로서 상기 어뎁터-말단화된 단편의 혼합물 부분을 이용하여 5'-플랭킹 VNTR 증폭자 혼합물을 제조하는 단계, 및/또는

d) 어뎁터 프라이머 및 VNTR 안티센스 프라이머와 함께 주형으로서 상기 어뎁터-말단화된 단편의 혼합물 부분을 이용하여 3'-플랭킹 VNTR 증폭자 혼합물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭자 혼합물의 제조방법.
교잡반응 조건하에서, 특정 형질을 나타내는 것으로 대표되는 적어도 하나의 다형태성 대립유전자 및 이의 플랭킹 서열, 및 상기 특정 형질을 나타내지 않는 것으로 대표되는 다형태성 대립유전자 및 이들의 플랭킹 서열의 혼합물과 함께 인큐베이션하는 단계; 및 상기 특정 형질에 연결되는 적어도 하나의 대립유전자 또는 이의 단편을 제공하기 위해, 적어도 하나의 일치 및/또는 적어도 하나의 불-일치를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 특정 형질에 연결된 대립유전자를 동정하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 대립유전자는 VNTR 대립유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 특정 형질을 나타내는 것으로 대표되는 적어도 하나의 대립유전자 및 이의 플랭킹 서열은 3'-중첩 말단과 함께 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에서 청구된 바와 같은 게놈상 DNA 부분을 진단 검정법에 사용하는 방법.
제1항 내지 제10항 또는 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VNTR 대립유전자 및 이의 플랭킹 영역, 또는 상기 VNTR 대립유전자 및 이들의 플랭킹 서열의 혼합물은 교잡반응 조건하에서 고정된 VNTR 대립유전자 및/또는 이들의 플랭킹 영역의 배열에 적용됨으로써 분석되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제10항, 제17항 내지 제25항 또는 제27항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 방법 및 시약을 포함하는 키트.