KR20010003853A - Vaccine compositions using antigens encapsulated within alginate microspheres for oral administration and preparation process thereof - Google Patents

Vaccine compositions using antigens encapsulated within alginate microspheres for oral administration and preparation process thereof Download PDF

Info

Publication number
KR20010003853A
KR20010003853A KR1019990024336A KR19990024336A KR20010003853A KR 20010003853 A KR20010003853 A KR 20010003853A KR 1019990024336 A KR1019990024336 A KR 1019990024336A KR 19990024336 A KR19990024336 A KR 19990024336A KR 20010003853 A KR20010003853 A KR 20010003853A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antigen
protein
vaccine
microspheres
alginate
Prior art date
Application number
KR1019990024336A
Other languages
Korean (ko)
Inventor
정서영
권익찬
박주애
Original Assignee
박호군
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 박호군, 한국과학기술연구원 filed Critical 박호군
Priority to KR1019990024336A priority Critical patent/KR20010003853A/en
Priority to KR1020017001096A priority patent/KR20020005563A/en
Priority to PCT/KR1999/000466 priority patent/WO2001000233A1/en
Priority to AU55295/99A priority patent/AU5529599A/en
Publication of KR20010003853A publication Critical patent/KR20010003853A/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A41—WEARING APPAREL
    • A41B—SHIRTS; UNDERWEAR; BABY LINEN; HANDKERCHIEFS
    • A41B11/00—Hosiery; Panti-hose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A41—WEARING APPAREL
    • A41B—SHIRTS; UNDERWEAR; BABY LINEN; HANDKERCHIEFS
    • A41B11/00—Hosiery; Panti-hose
    • A41B11/004—Hosiery with separated toe sections
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A41—WEARING APPAREL
    • A41B—SHIRTS; UNDERWEAR; BABY LINEN; HANDKERCHIEFS
    • A41B2400/00—Functions or special features of shirts, underwear, baby linen or handkerchiefs not provided for in other groups of this subclass
    • A41B2400/32—Therapeutic use
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A41—WEARING APPAREL
    • A41B—SHIRTS; UNDERWEAR; BABY LINEN; HANDKERCHIEFS
    • A41B2400/00—Functions or special features of shirts, underwear, baby linen or handkerchiefs not provided for in other groups of this subclass
    • A41B2400/60—Moisture handling or wicking function

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

PURPOSE: An arginate-microsphere used for oral vaccine is provided, which delivers antigens effectively through a pathway by Peyer's patch and a by-pathway of lymphatic gland with its small size; shows higher immunity property; improves level of serum and mucous membrane when administrated with cholera toxin or cholera toxin B unit; so can be used as an effective oral vaccine. CONSTITUTION: A process for the preparation of arginate-microsphere used for oral vaccine comprises: adding a solution containing antigen protein(or antigen protein and immuno-adjuvant) to arginate solution; adding n-octanol solution containing an emulsifier to the antigen protein(or antigen protein and immuno-adjuvant)-arginate mixed solution, and homogenizing; adding calcium chloride-contained n-octanol using a sprayer while stirring the emulsion slowly; adding calcium chloride solution to saturate the emulsion, and gelating microspheres; dehydrating the microspheres by adding dehydration solvent; filtering the microspheres, washing with alcohol, and drying in vacuum state.

Description

경구용 백신으로 사용할 수 있는 알긴산염 마이크로스피어 및 그 제조방법{Vaccine compositions using antigens encapsulated within alginate microspheres for oral administration and preparation process thereof}Vaccine compositions using antigens encapsulated within alginate microspheres for oral administration and preparation process

본 발명은 항원 단백질을 확산-조절 계면 겔화 기법(diffusion-controlled interfacial gellation technique)에 의해 생분해성 알긴산염 마이크로스피어에 포합시킴으로써 얻어지는 5 μm 이하의 직경을 갖는 알긴산염 마이크로스피어, 그 제조방법 및 상기 알긴산염 마이크로스피어로 구성되는 경구용 백신에 관한 것이다.The present invention relates to an alginate microsphere having a diameter of 5 μm or less obtained by incorporating an antigenic protein into a biodegradable alginate microsphere by a diffusion-controlled interfacial gellation technique, a method for preparing the alginate, and the alginic acid. It relates to an oral vaccine consisting of salt microspheres.

인체 감염에 있어서, 주된 감염 경로는 점막 표면(mucosal surface)이다(Cundell, 1995). 따라서 점막 표면에서의 면역은 병원균에 대한 잠재적 백신의 중요한 경로가 되며, 이러한 전략은 전신 면역체계(systemic immunity)가 결여된 유아나 노인에게 특히 유용하다.In human infection, the main route of infection is the mucosal surface (Cundell, 1995). Immunity at the mucosal surface is therefore an important route for potential vaccines against pathogens, and this strategy is particularly useful for infants and the elderly who lack systemic immunity.

점막성 면역 시스템(mucosal immune system)은 병원균에 특이적인 분비형 면역글로불린 A(IgA) 항체를 생산함으로써 호흡기내로의 병원균의 침입에 대항할 수 있게 한다. 국소(local) 분비형 IgA는 점막조직에서의 병원균의 증식 (colonization)을 억제하며, 또한 전신 항체(systemic antibodies)보다 효과적으로 병원균이 전신에 퍼지는 것을 막는다(Service, 1994).The mucosal immune system allows the production of secretory immunoglobulin A (IgA) antibodies specific for the pathogen, thereby countering the invasion of the pathogen into the respiratory tract. Local secretion type IgA inhibits the colonization of pathogens in mucosal tissues and also prevents the spread of pathogens throughout the system more effectively than systemic antibodies (Service, 1994).

점막조직과 분비샘은 생체내 T 세포, B 세포 및 플라즈마 세포가 가장 많이 존재하는 곳이며, 인체 면역글로불린의 60 % 이상을 차지하는 분비형 IgA 가 이러한 조직으로부터 생산된다. 점막조직에서의 면역반응은 특수한 임파조직(lymphoid tissue)의 집합체에 의해 자극되는 것으로 알려져 있으며, 이러한 임파조직의 집합체로는 위장관에 존재하는 임파조직(gut-associated lymphoid tissue, 이하 GALT라 한다.)과 기관지에 존재하는 임파조직(bronchus-associated lymphoid tissue, 이하 BALT라 한다.)이 있다. BALT와 GALT의 독특한 특성은 하나의 점막표면에서 일어난 면역정보를 인체의 다른 점막조직으로 전달할 수 있다는 것이다. 또한 적절하게 조절된다면, GALT와 BALT는 다양한 병원균과 독소에 대해 점막성 면역반응은 물론 전신성 면역반응에도 관여할 수 있음이 알려져 있다(Shalaby, 1995).Mucosal tissue and secretory glands are the most abundant T cells, B cells and plasma cells in vivo, and secreted IgA, which accounts for more than 60% of human immunoglobulins, is produced from these tissues. Immune responses in mucosal tissues are known to be stimulated by specific aggregates of lymphoid tissues, and such aggregates of lymphoid tissues are called gut-associated lymphoid tissues (GALT). And bronchus-associated lymphoid tissue (BALT). A unique feature of BALT and GALT is the ability to transfer immune information from one mucosal surface to other mucosal tissues in the body. It is also known that, if properly controlled, GALT and BALT may be involved in systemic immune as well as mucosal immune responses to various pathogens and toxins (Shalaby, 1995).

이와 같은 중요성에도 불구하고, 점막성 경로를 이용한 면역 및 방어는 종래에는 간과되어 왔다. 백신을 주사에 의해 투여하는 경우에는 점막성 면역을 거의 유발하지 못하는데, 이는 전신성 면역과 점막성 면역이 기능적으로 분리되어 있기 때문으로 여겨진다. 이상과 같은 문제점을 해결하기 위해 적당한 전달 시스템을 사용하여 점막성 백신을 개발하는 것이 시급하게 요구되어 왔다.Despite this importance, immunity and defense using mucosal pathways have been overlooked in the past. Vaccine administration rarely induces mucosal immunity, which is believed to be due to the functional separation of systemic and mucosal immunity. In order to solve the above problems, it has been urgently required to develop a mucosal vaccine using a suitable delivery system.

점막성 면역의 특징은 표피의 분비세포 바로 밑에 존재하는 플라즈마 세포로부터 이합체(dimeric) 형태의 IgA가 외부로 대량 분비된다는 점이다. 이러한 분비형 IgA의 작용은 세균의 항원이 점막 표면에 붙는 것을 방해하여 세균의 증식을 억제하고 그 제거를 촉진함에 주로 기인하며(Abraham, 1994), 그밖에도 분해효소(lysozyme)나 보체계(complements)가 존재할 경우 세균의 가수분해를 유발하는 것으로도 알려져 있다. 이러한 IgA의 생산은 상부 호흡기 또는 위장관에 존재하는 특이화된 점막성 임파조직인 GALT와 BALT에서 시작된다. 위장관에 존재하는 GALT는 페이어 패치(Peyer's patches)와 부속기관 그리고 독립적인 임파절(lymphoid nidules)로 구성되며, 호흡기에 존재하는 BALT는 구개(palatine)와 인두편도(pharyngeal tosils)에 존재하는 폴리클(follicles)로 구성되어 있는데, 양 조직의 기능에는 약간의 차이가 있다.A feature of mucosal immunity is that large amounts of dimeric form of IgA are secreted from the plasma cells just below the secretory cells of the epidermis. The action of these secreted IgAs is mainly due to the inhibition of bacterial antigens on mucosal surfaces, inhibiting the growth of bacteria and promoting their elimination (Abraham, 1994), as well as lysozymes and complements. It is also known to cause the hydrolysis of bacteria when present. Production of this IgA begins in GALT and BALT, specialized mucosal lymphoid tissues present in the upper respiratory or gastrointestinal tract. GALT in the gastrointestinal tract consists of Peyer's patches, appendages, and independent lymph nodes (lymphoid nidules). BALT in the respiratory tract consists of palatine and pharyngeal tosils. It consists of follicles, with slight differences in the function of both tissues.

페이어 패치의 돔 영역(dome region)에는 M 세포(microfold cell), B 세포 및 T 세포가 존재한다. M 세포는 상피세포(epithelium)로서 항원을 포착하여 임파조직 아래로 이동시킨다. B 세포와 T 세포는 페이어 페치의 돔 아래에 위치하는 폴리클의 중심에 존재하며, 상기 항원에 의해 활성화된다. 이들 세포는 원심성 림프(efferent lymphatics)를 경유하여 페이어 페치에서 나와 흉관(thoracic tract)을 통해 전신 순환계로 들어가게 되며 작용부위에 이르면 그곳에 머물면서 면역반응을 일으킨다(도 1). 특히, B 세포는 장간막의 임파절(lymph node)에서 그 수가 증가하고 IgA 플라즈마 세포로 성숙하여, 분비형 IgA를 생산한다. 이러한 세포의 분포 시스템(cellular distribution system)은 일반적인 인체의 점막성 면역 시스템을 구성하며, 경구 백신 투여에 의한 면역이 특정 분비형 IgA를 유도하고 이것이 먼 위치에서도 분비되어 체액 또는 점막 조직으로부터 IgA 분비세포가 검출된다는 사실이 이를 입증한다(Czerkinsdy et al., 1991).In the dome region of the phase patch, there are M cells (microfold cells), B cells and T cells. M cells are epithelium and capture antigen and move it down the lymphoid tissue. B cells and T cells are present in the center of the polycle, which is located below the dome of the fetch, and are activated by the antigen. These cells exit the phase fetch via efferent lymphatics and enter the systemic circulatory system through the thoracic tract, where they stay and cause an immune response (Figure 1). In particular, B cells increase in number at the lymph nodes of the mesentery and mature into IgA plasma cells, producing secretory IgA. This cellular distribution system constitutes the general human mucosal immune system, and immunization by oral vaccine administration induces specific secretory IgA, which is secreted at a remote location, thus secreting IgA cells from body fluids or mucosal tissues. The fact that is detected proves this (Czerkinsdy et al., 1991).

이에 점막 경로를 통한 효과적인 면역반응을 일으키기 위해 새로운 전략들이 시도되어 왔다.New strategies have been tried to elicit effective immune responses through mucosal pathways.

우선, 콜레라 독소(cholera toxin, 이하 CT라 한다.), 대장균 장독소(Escherichia coli heat-labile enterotoxin), 뮤라밀디펩타이드 (muramyldipeptide) 또는 포볼 에스터(phorbol ester)와 같은 강력한 면역 보조제를 백신 제형내에 첨가하는 방법이 있다. 이들 점막성 보조제들은 면역세포의 신호전달체계를 변화시키거나 미세환경에서의 면역반응을 자극함으로써 작용한다. 이 중에서도 CT가 가장 강력한 점막성 면역의 보조제로 알려져 있는데, CT는 다양한 세포로부터 항원의 제시(presentation), B 세포의 분화, IgA의 분비, 기타 T 세포의 증식과 림포카인 생산에 영향을 미친다(Holmgren 등, 1993). 그 구체적인 기작에 대해서는 아직까지 명확히 밝혀진 것은 아니지만 CT의 B 단위체가 GM-1 강글리오사이드에 결합하는 성질과 A 단위체가 ADP-리보실화하는 능력에 관련된 것으로 알려져 있다.First, a strong immune adjuvant such as cholera toxin (hereinafter referred to as CT), Escherichia coli heat-labile enterotoxin, muramyldipeptide or phorbol ester is added to the vaccine formulation. There is a way. These mucosal auxiliaries work by altering the signaling system of immune cells or by stimulating immune responses in the microenvironment. Among them, CT is known as the most powerful adjuvant of mucosal immunity, which affects the presentation of antigen from different cells, the differentiation of B cells, the secretion of IgA, the proliferation of other T cells and lymphokine production. (Holmgren et al., 1993). The specific mechanism is not yet clear, but it is known that the B unit of CT is related to the binding property of GM-1 ganglioside and the ability of the A unit to ADP-ribosylate.

점막성 면역을 위한 또다른 전략은 항원의 물리적 형태를 바꾸는 것이다. 예를 들면, 콜로이드 미립자를 이용한 마이크로캡슐화 방법에 의한 항원이 포합된 마이크로 또는 나노미터 리포좀, 마이크로에멀션, 마이크로스피어 및 나노스피어 등이 있다.Another strategy for mucosal immunity is to change the physical form of the antigen. For example, micro or nanometer liposomes containing the antigen by microencapsulation method using colloidal fine particles, microemulsions, microspheres and nanospheres.

약물, 효소, 톡신(toxin), 박테리아(bacteria) 및 바이러스(virus) 등의 화학적, 생물학적 물질을 고분자 기질 내에 봉입하는 기술을 마이크로캡슐화(microencapsulation)라 한다. 약제학적인 측면에서 마이크로캡슐화는 약물이 수분, 열 또는 산화에 의해 불활성되거나 휘발되는 것을 방지하며, 생체적합성을 증가시키는 등의 장점을 갖는다. 특히, 항원을 마이크로캡슐 내에 봉입 시에 체내의 낮은 pH 및 위장관내의 효소에 의한 가수분해로 인해 항원이 변성되는 것을 막을 수 있을 뿐만 아니라 모계 항체로부터 보호할 수 있는 장점이 있어, 위장관 내로의 항원 전달을 위해 생분해성·생체적합성 마이크로스피어가 사용되어왔다(Muir et al,. 1994).Microencapsulation is a technique for encapsulating chemical and biological substances such as drugs, enzymes, toxins, bacteria and viruses in a polymer matrix. In the pharmaceutical aspect, microencapsulation has advantages such as preventing the drug from being inactivated or volatilized by moisture, heat or oxidation, increasing biocompatibility, and the like. In particular, when the antigen is encapsulated in the microcapsules, the antigen is not only prevented from being denatured due to low pH in the body and hydrolyzed by enzymes in the gastrointestinal tract, but also protected from maternal antibodies. Biodegradable and biocompatible microspheres have been used for this purpose (Muir et al, 1994).

그러나, 마이크로스피어를 제조하는 대부분의 방법은 유기용매를 사용해야하거나 높은 온도에서 가열하는 과정을 포함하므로, 이러한 가혹한 조건하에서는 항원이 변성되는 문제점이 있다. 예를들어, 고분자로 젤라틴(gelatin), 폴리(D,L-락트산)(poly(D,L-lactic acid)), 폴리(글리콜산)(poly(glycolic acid)) 또는 알부민(albumine)을 이용하여 마이크로스피어를 생산하는 경우, 고분자를 용해시키거나 교차결합(cross-link)시키기 위해서 130 ℃정도의 높은 열을 필요로 하며, 고분자 화합물을 용해하거나 교차결합시키기 위해 포름알데하이드(formaldehyde), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 및 헥사플루오로아세톤 세스퀴하이드레이트(hexafluoroacetone sesquihydrate)와 같은 유기 용매를 사용하는 문제가 있었다(Jepson et al., 1993, Maloy et al., 1994).However, most methods for preparing microspheres require the use of organic solvents or include heating at high temperatures, and thus, there is a problem in that antigens are denatured under such severe conditions. For example, gelatin, poly (D, L-lactic acid), poly (glycolic acid) or albumin may be used as a polymer. In order to produce microspheres, a high temperature of about 130 ° C. is required to dissolve or cross-link the polymer, and formaldehyde and glutarase to dissolve or cross-link the polymer compound. There have been problems using organic solvents such as aldehyde (glutaraldehyde), methylene chloride and hexafluoroacetone sesquihydrate (Jepson et al., 1993, Maloy et al., 1994).

그러나 다른 마이크로스피어와 달리 알긴산염(alginate)을 기질로 한 마이크로스피어는 실온 상태, 수용액 중에서 쉽게 제조될 수 있기 때문에 항원을 마이크로캡슐화하는 데에 매우 유용하다 할 수 있다.However, unlike other microspheres, microspheres based on alginate are very useful for microencapsulating antigens because they can be easily prepared in room temperature and in aqueous solution.

알긴산염은 1,4-연결된-β-D-만누론산(mannuronic acid)과 α-L-글루쿠론산 (glucuronic acid)의 음이온성 공중합체로서 식품 첨가제, 정제 붕해제 및 겔화제(gelation agent)로 사용되어 왔으며, 또한 독성이 없고 생체내에서 분해되어 생체적합성이 뛰어나므로 세포를 고정화하거나, 약물 또는 항원의 전달 시스템으로서 광범위하게 적용되어 왔다(K.Park, 1993).Alginate is an anionic copolymer of 1,4-linked-β-D-mannuronic acid and α-L-glucuronic acid, which is a food additive, tablet disintegrant, and gelling agent. It has been used as a non-toxic substance, and has been widely applied as a system for immobilizing cells or as a delivery system for drugs or antigens because it is non-toxic and degraded in vivo and has excellent biocompatibility (K. Park, 1993).

알긴산염의 가장 큰 특징 중의 하나는 Ca2+과 같은 2가 양이온의 존재하에서 겔을 형성한다는 것이다. 이러한 겔 형성은 주로 이온과 동종공중합체 블록 사이의 결합점에서 주로 일어나며, 칼슘-알긴산염 겔은 이온 결합에 의한 가교 형성으로 단단한 하이드로겔을 만들 수 있다. 알긴산염 겔은 수용액에서 제조될 수 있고, 생체내에서 팽윤하여 점차적으로 붕해되기 때문에 마이크로스피어의 고분자 기질로서 가장 널리 사용되는 물질이며, 이러한 목적에 잘 부합되는 물리화학적 성질을 갖고 있다. 그러나, 비록 알긴산염 마이크로스피어가 약물의 수송체로서 널리 이용되어 왔다 할지라도, 약물 방출 속도를 결정하기 위한 최적의 물리, 화학적 조건들이 정립되어 있지 않으며, 현재까지의 기술로는 직경이 10 μm 이하인 안정적인 마이크로스피어를 제조하는데 어려움이 있었다.One of the greatest features of alginates is that they form gels in the presence of divalent cations such as Ca 2+ . This gel formation occurs mainly at the point of attachment between the ions and the homopolymer block, and the calcium-alginate gel can form a rigid hydrogel by crosslinking by ionic bonding. Alginate gel can be prepared in an aqueous solution, and is the most widely used material as a polymer substrate of microspheres because it swells in vivo and gradually disintegrates, and has physicochemical properties well suited for this purpose. However, although alginate microspheres have been widely used as drug transporters, optimal physical and chemical conditions for determining drug release rates have not been established, and to date techniques up to 10 μm in diameter have not been established. There was a difficulty in producing a stable microsphere.

마이크로스피어가 소장에서 흡수되기 위해서는 마이크로스피어의 직경이 10 μm 이하이어야 한다. GALT 내에서 마크로스피어의 동태 연구(kinetic study)를 한 결과, 마이크로스피어의 직경이 5 μm 이하일 때는 원심성 림프(efferent lymphatics)를 통해 전달되는 반면, 직경이 5 μm 이상일 때는 페이어 패치(Peyer's patches)내에 머무르게 되는 것이 밝혀졌다. 이와 같은 사실로부터, 작은 크기의 알긴산염 마이크로스피어가 페이어 패치(Payer's patch)에 의한 경로 및 임파관을 통한 부수경로를 통해 항원을 효과적으로 전달하기 위한 적당한 수송체임을 알 수 있다.In order for the microspheres to be absorbed in the small intestine, the microspheres must be less than 10 μm in diameter. Kinetic studies of macrospheres in GALT show that microspheres are delivered through efferent lymphatics when the diameter is less than 5 μm, while Peyer's patches are larger than 5 μm. It turned out to stay within. From this fact, it can be seen that the small size alginate microspheres are suitable transporters for the efficient delivery of antigens via pathways by the Payer's patches and secondary pathways through the lymphatic vessels.

기존의 방법에 있어서, 작은 크기의 알긴산염 마이크로스피어는 유제화된 기제(fluidized bed)와 회전 팬(rotating pans)을 사용함으로써 제조되어왔다. 그러나, 칼슘 이온을 포함하는 수용액 내에 알긴산염을 적가하여 생성되는 겔은 평균 직경이 크고, 입자 크기의 분포도 넓었다. 그러므로, 페이어 패치내로 항원을 전달하기 위해서는 바람직한 크기의 범위를 갖는 마이크로스피어를 생산하는 새로운 제조방법이 요구되어 왔다.In existing methods, small alginate microspheres have been prepared by using emulsified beds and rotating pans. However, the gel produced by dropwise addition of alginate in an aqueous solution containing calcium ions had a large average diameter and a wide particle size distribution. Therefore, there has been a need for a new method of producing microspheres having a desired size range for delivery of antigens into a layer patch.

스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)는 수막염(meningitis), 중이염(otitis media), 균혈증(bacteremia) 및 폐렴(pneumonia) 등을 일으키는 주된 호흡점막 병원체이다. 균체 외막의 다당류(capsular polysaccharides)에 대한 특수한 항체는 성인에게 폐렴에 대항하는 방어적 면역 반응을 일으킬 수 있다(Macleod, 1945). 그러나, 면역성이 낮은 유아(2세 미만)와 노인의 경우, 다당류 백신은 효과적으로 폐렴구균-특이적 보호 항체 반응을 일으킬 수 없으며(Anderson, 1997, Peters, 1994), 어린이는 동일한 피막 혈청형(serotype) 균주에 의해 재감염될 수 있다. 이러한 단백질 다당류 결합체 또는 단독의 폐렴구균성 단백질은 유아와 어린이에 있어서, 폐렴성 감염에 대한 방어성 면역을 유발하는 대안으로서 고려되어 왔다(Yamamoto, 1997).Streptococcus pneumoniae is a major respiratory mucosal pathogen that causes meningitis, otitis media, bacteremia and pneumonia. Special antibodies against capsular polysaccharides in the cell membrane can produce protective immune responses against pneumonia in adults (Macleod, 1945). However, in low-immunity infants (under 2 years) and the elderly, polysaccharide vaccines cannot effectively produce pneumococcal-specific protective antibody responses (Anderson, 1997, Peters, 1994), and children have the same serotype. ) May be reinfected by strains. Such protein polysaccharide conjugates or pneumococcal proteins alone have been considered as alternatives to induce protective immunity against pneumococcal infections in infants and children (Yamamoto, 1997).

단백질이 갖는 면역성은 새로운 백신 전략의 목표로 대두되고 있다. 강력한 백신 후보로서 인식되고 있는 폐렴구균성 단백질은 뉴몰리신(pneumolysin), 뉴라미니다제(neuraminidase), 오토리신(autolysin), 폐렴구균성 표면 접착단백질 A(PsaA) 및 폐렴구균성 표면 단백질 A(PspA)를 포함한다(McDaniel, 1996). 이러한 단백질들은 많은 혈청형에 대하여 좀 더 광범위한 보호작용(protection)을 제공할 수 있으며, T 세포 의존적 면역 반응을 일으킬 수 있고 기억 반응(memory response)를 제공하기 때문에, 좀 더 효과적인 백신이 될 수 있다.Protein immunity is emerging as a target for new vaccine strategies. Pneumococcal proteins recognized as potent vaccine candidates include pneumolysin, neuraminidase, autolysin, pneumococcal surface adhesion protein A (PsaA) and pneumococcal surface protein A (PspA) (McDaniel, 1996). These proteins can provide more extensive protection against many serotypes and can be more effective vaccines because they can give rise to T cell-dependent immune responses and provide memory responses. .

알려진 폐렴 구균성 단백질 중, 뉴몰리신과 폐렴구균성 표면 단백질 A(PsaA)만이 백신 후보로서 광범위하게 검사되어왔다. 이 두 단백질은 생쥐들에게 부분적인 보호작용(protection)을 일으키는 것으로 알려져 유력한 백신 후보로 제시되었다(AlonsoDevelasco, 1995).Of the known pneumococcal proteins, only pneumolysin and pneumococcal surface protein A (PsaA) have been extensively tested as vaccine candidates. These two proteins have been shown to be potent vaccine candidates known to cause partial protection in mice (AlonsoDevelasco, 1995).

이에 본 발명자들은 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 접착기능에 관여하는 폐렴구균 단백질 중의 하나인 37-kDa의 PsaA 단백질을 항원으로 하고, 이를 확산-조절 계면 겔화 기법(diffusion-controlled interfacial technique)에 의해 생분해성 알긴산 미립구내에 포합시킨 경구용 백신 조성물을 제조함으로써, 알긴산염에 포합되지 않은 PsaA에 비해 높은 면역원성을 나타내며 특히 직경이 5μm 이하로 작아 페이어 페치에 의한 경로 및 임파관에 의한 부수경로를 통하여 항원을 효과적으로 전달할 수 있는 백신을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors made the antigen of 37-kDa PsaA protein, one of pneumococcal proteins involved in the adhesion function of Streptococcus pneumoniae, as an antigen, and biodegradation by a diffusion-controlled interfacial technique. By preparing an oral vaccine composition incorporated into sex alginic acid microspheres, it exhibits higher immunogenicity than PsaA which is not incorporated into alginate, and is particularly small, less than 5 μm in diameter, through antigen-facing pathways by phage fetch and lymphatic channels. The present invention has been completed by developing a vaccine capable of effectively delivering the vaccine.

본 발명의 목적은 경구용 백신으로 사용할 수 있는 알긴산염 마이크로스피어 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide an alginate microsphere that can be used as an oral vaccine and a method for preparing the same.

도 1은 점막에 존재하는 임파 시스템내의 임파구(lymphocyte) 순환을 나타낸 것이고,Figure 1 shows the lymphocyte circulation in the lymphatic system present in the mucosa,

도 2a는 알긴산염 모노머인 β-D-만누론산(β-D-mannuronic acid) 과 α-L-글루론산(α-L-guluronic acid) 을 나타낸 것이고,Figure 2a shows the alginate monomer β-D-mannuronic acid (β-D-mannuronic acid) and α-L-guluronic acid (α-L-guluronic acid),

도 2b는 α-L-글루론산과 이온의 킬레이션 및 2가 양성이온 Ca2+의 결합에 의한 겔 형성시의 예상되는 구조 모델을 나타낸 것이고,Figure 2b shows the expected structural model during gel formation by chelation of ions with α-L-gluronic acid and binding of divalent zwitterions Ca 2+ ,

도 3은 알긴산염 마이크로스피어를 제조하기 위한 제조방법을 나타낸 것이고,Figure 3 shows a manufacturing method for preparing alginate microspheres,

도 4는 플라스미드 pCYB4-PsaA의 구조를 나타낸 것이며,4 shows the structure of plasmid pCYB4-PsaA,

도 5는 7개의 클론에 의한 재조합 단백질의 발현을 웨스턴 블럿팅(western blotting)으로 확인한 결과를 나타낸 것이고,5 shows the results of Western blotting confirming the expression of the recombinant protein by the seven clones,

도 6은 PsaA 유전자의 염기서열을 나타낸 것이고,Figure 6 shows the nucleotide sequence of the PsaA gene,

도 7은 형질전환된 XL1-Blue의 온도에 따른 성장곡선을 나타낸 것이고,Figure 7 shows the growth curve according to the temperature of the transformed XL 1 -Blue,

도 8은 온도에 따른 세포 분해물의 펠렛과 부유물의 밴드 양상을 웨스턴 블럿팅으로 분석한 결과를 나타낸 것이고,FIG. 8 shows the results of Western blotting analysis of band patterns of pellets and suspended solids according to temperature.

도 9a는 정제된 PsaA 단백질(35 kDa)을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이고,9a shows the result of SDS-PAGE analysis of purified PsaA protein (35 kDa),

도 9b는 정제된 PsaA 단백질(35 kDa)을 웨스턴 블럿팅으로 분석한 결과를 나타낸 것이고,Figure 9b shows the results of Western blotting analysis of purified PsaA protein (35 kDa),

도 10은 알긴산 염 마이크로스피어로부터 PsaA의 시험관내 방출 프로화일(profile)을 나타낸 것이고,FIG. 10 shows an in vitro release profile of PsaA from alginic acid microspheres. FIG.

도 11은 재조합 PsaA 단백질을 피하로 투여하였을 때의 항체 반응을 나타낸 것이고,Figure 11 shows the antibody response when the recombinant PsaA protein is administered subcutaneously,

도 12는 샌드위치 엘리자(sandwich ELISA)에 의해 결정된 항체의 수량화를 위한 표준곡선을 나타낸 것이며,Figure 12 shows the standard curve for the quantification of the antibody determined by sandwich ELISA,

도 13은 PsaA 항원 단백질을 마이크로캡슐화 한 제형[encapsulated PsaA, 이하 E (PsaA)라 한다]과 마이크로캡슐화 하지 않은 제형[naked PsaA, 이하 N(PsaA)라 한다]을 마우스에 경구 면역화시 유도되는 항체 반응을 나타낸 것이다.FIG. 13 shows antibodies induced upon oral immunization of mice with formulations microencapsulated PsaA antigen protein [encapsulated PsaA (hereinafter referred to as E (PsaA)]) and non-encapsulated formulations (naked PsaA, referred to as N (PsaA)] in mice. The reaction is shown.

E 40 : E (PsaA)[+CT or +CTB]E 40: E (PsaA) [+ CT or + CTB]

N 40 : N (PsaA)[+CT or +CTB]N 40: N (PsaA) [+ CT or + CTB]

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 항원 단백질을 확산-조절 계면 겔화 기법(diffusion-controlled interfacial gellation technique)으로 생분해성 알긴산염 마이크로스피어에 포합시킴으로써 얻어지는 5 μm 이하의 직경을 갖는 알긴산염 마이크로스피어, 그 제조방법 및 상기 알긴산염 마이크로스피어로 구성되는 경구용 백신을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an alginate microsphere having a diameter of 5 μm or less obtained by incorporating an antigenic protein into a biodegradable alginate microsphere by a diffusion-controlled interfacial gellation technique. It provides a preparation method and oral vaccine consisting of the alginate microspheres.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 단백질 항원은 바이러스성 항원, 세균성 항원, 자가면역성 항원, 알레르기 유발성 항원을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하며, 폐렴구균 항원, 헤모필루스 파라인플루엔자(Hemophilus parainfluenza) 항원, 디프테리아 항원, 백일해 항원, 파상풍 항원, 독성 대장균 항원, 이질 항원, 콜레라 항원, 임균 항원, 인플루엔자 바이러스 항원, B형 간염 항원, 홍역 바이러스 항원, 마진 항원, 풍진 항원을 포함하는 그룹 중에서 선택되어질 수 있다. 바람직하게는 뉴몰리신(pneumolysin), 뉴라미니다제(pneuraminidase), 오토리신 (autolysin), 폐렴구균성 표면 접착 A(Psa A) 또는 폐렴구균성 표면 단백질 A(Psp A)를 포함하는 스트렙토코커스 뉴모니애(Spreptococcus pneumoniae)의 단백질 중에서 선택될 수 있다.The protein antigen of the present invention is preferably at least one selected from the group consisting of viral antigens, bacterial antigens, autoimmune antigens, allergens, pneumococcal antigens, Haemophilus parainfluenza antigens, diphtheria antigens, It can be selected from the group comprising pertussis antigen, tetanus antigen, toxic E. coli antigen, heterologous antigen, cholera antigen, gonococcal antigen, influenza virus antigen, hepatitis B antigen, measles virus antigen, margin antigen, rubella antigen. Preferably Streptococcus comprising pneumolysin, neuraminidase, autolysin, pneumococcal surface adhesion A (Psa A) or pneumococcal surface protein A (Psp A) It may be selected from the proteins of Spreptococcus pneumoniae.

특히 폐렴구균성 표면 접착 A (Psa A) 항원을 포함하는 스트렙토코커스 뉴모니애의 단백질을 사용하는 것이 바람직한데, 상기 Psa A 단백질 항원은 스트렙토코커스 뉴모니애(S.pneumoniae)의 염색체 DNA로부터 Psa A 유전자를 증폭하고 이를 pCYB4 벡터에 클로닝한 다음, 상기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환하고 이를 배양함으로써 생산·정제하여 얻어질 수 있다.In particular, it is preferable to use a protein of Streptococcus pneumoniae comprising a pneumococcal surface adhesion A (Psa A) antigen, wherein the Psa A protein antigen is derived from Psa from the chromosomal DNA of S. pneumoniae. It can be obtained by amplifying the A gene and cloning it into a pCYB4 vector, then transforming E. coli with the recombinant vector and culturing it to produce and purify it.

상기 항원을 포함하는 알긴산염 마이크로스피어를 제조함에 있어, 알긴산염은 1,4-β-D-만누론산(mannuronic acid)과 α-L-글루론산(guluronic acid)의 공중합체로, 상기 알긴산염은 실온 상태 및 수용액 상에서 용이하게 제조할 수 있어 항원을 마이크로캡슐화하는데 매우 유용할 뿐 아니라, 독성이 없고 생체적합성이 뛰어난 장점이 있다.In preparing alginate microspheres comprising the antigen, alginate is a copolymer of 1,4-β-D-mannuronic acid and α-L-guluronic acid, wherein the alginate Silver can be easily prepared at room temperature and in aqueous solution, which is very useful for microencapsulating antigen, and has the advantage of no toxicity and excellent biocompatibility.

또한 상기 백신은 추가적으로 콜레라 독소(cholera toxin), 콜레라 독소 B 단위체(cholera toxin B subunit), 대장균 장독소(Escherichia coli heat-labile enterotoxin), 뮤라밀디펩타이드(muramyldipeptide), 또는 포볼 에스터(phorbol ester)와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 이러한 면역보조제들은 마이크로스피어의 내상 또는 외상에 혼합 시 강한 점막성 면역반응을 유발하여 본 발명의 경구용 백신의 면역원성을 높일 수 있다.In addition, the vaccine additionally contains cholera toxin, cholera toxin B subunit, Escherichia coli heat-labile enterotoxin, muramyldipeptide, or phorbol ester. The same adjuvant may be included. These adjuvants can induce a strong mucosal immune response when mixed with the inner or outer trauma of the microsphere can increase the immunogenicity of the oral vaccine of the present invention.

마이크로스피어가 소장에서 흡수되어 효과적으로 항원을 전달하기 위해서는 그 크기가 5 ㎛ 이하인 것이 바람직하며, 크기가 작을수록 투여부위에서의 독성 및 자극을 감소시키고 발암성을 줄일 수 있다.In order for the microspheres to be absorbed in the small intestine and to effectively deliver the antigen, the size of the microspheres is preferably 5 μm or less.

따라서 본 발명에서는 마이크로스피어의 크기를 줄이기 위해 종래 두 수성층 사이의 계면에서 겔화를 유도하던 방법과는 달리 새로이 "유중 수형 에멀젼 방법(water-in-oil emulsion technique)"에 의해 더 작고 균일한 입자를 제조하는 방법을 제공한다.Therefore, in the present invention, unlike the conventional method of inducing gelation at the interface between two aqueous layers in order to reduce the size of the microsphere, smaller and more uniform particles are newly produced by the "water-in-oil emulsion technique". It provides a method of manufacturing.

상기 유중 수형 에멀젼 방법에 따른 알긴산염 마이크로스피어의 제조방법은,Method for preparing alginate microspheres according to the water-in-oil emulsion method,

1. 항원 단백질 또는 항원단백질과 면역보조제를 포함하는 용액을 알긴산염 용액에 첨가하는 단계;1. adding an antigen protein or a solution comprising an antigenic protein and an adjuvant to an alginate solution;

2. 단계 1의 항원단백질 또는 항원단백질과 면역보조제-알긴산염 혼합용액에 유화제를 포함하는 n-옥탄올 용액을 첨가하며 균질화 하는 단계;2. adding and homogenizing n-octanol solution containing an emulsifier to the antigenic protein or the antigenic protein and the adjuvant-alginate mixed solution of step 1;

3. 단계 2의 유제를 천천히 교반하면서 염화칼슘이 첨가된 n-옥탄올을 분무기로 첨가하는 단계;3. adding calcium chloride-added n-octanol with a nebulizer while slowly stirring the emulsion of step 2;

4. 단계 3의 유제를 포화시키기 위해 염화칼슘 용액을 첨가하고, 마이크로스피어를 겔화하는 단계;4. Add calcium chloride solution to saturate the emulsion of step 3 and gel the microspheres;

5. 탈수용매를 첨가하여 마이크로스피어를 탈수하는 단계;5. dehydrating the microspheres by adding a dehydrating solvent;

6. 마이크로스피어를 막 필터로 여과하고 알콜로 세척한 후, 진공상태에서 건조하는 단계로 구성된다.6. The microspheres are filtered through a membrane filter, washed with alcohol and then dried in vacuo.

상기 제조방법에서, 단계 1의 항원 단백질, 알긴산염은 상기 서술한 것과 동일하다.In the above production method, the antigenic protein and alginate of step 1 are the same as those described above.

알긴산염 용액은 알긴산염의 농도가 1-5 중량%인 것이 바람직하며, 알긴산염 수용액과 전체 유기 용매의 부피비는 1:1 내지 1:10 정도가 바람직한데 이러한 부피비에 따라 마이크로스피어의 크기 및 겔화정도에 차이가 생긴다.The alginate solution preferably has an alginate concentration of 1-5% by weight, and the volume ratio of the alginate aqueous solution and the total organic solvent is preferably 1: 1 to 1:10. The microsphere size and degree of gelation depend on the volume ratio. Makes a difference.

단계 2의 유화제로는 1-10 중량 %의 수소화된 캐스터 오일(Hydrogenated caster oil, 이하 HCO라 함.)-10, HCO-60, Span-80 등이 사용될 수 있으며, HCO-60이 바람직하다.As the emulsifier of step 2, 1-10% by weight of hydrogenated caster oil (hereinafter referred to as HCO) -10, HCO-60, Span-80, etc. may be used, and HCO-60 is preferable.

또한, 단계 3의 염화칼슘이 첨가된 n-옥탄올은 염화칼슘의 농도가 0.5-2 중량 %인 것이 바람직하며, 단계 4의 염화칼슘 용액은 염화칼슘의 농도가 5-10 중량 %인 것이 바람직하다.In addition, the n-octanol to which calcium chloride is added in step 3 preferably has a calcium chloride concentration of 0.5-2 wt%, and the calcium chloride solution in step 4 preferably has a calcium chloride concentration of 5-10 wt%.

단계 5의 탈수용매로는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세톤 등으로부터 선택되는 것이 바람직하다.The dehydrating solvent of step 5 is preferably selected from methanol, ethanol, isopropanol or acetone.

단계 6의 막 필터는 0.10-0.44 μm의 소공을 갖는 폴리테트라 플루오로에틸렌(PEFE) 막 필터인 것이 바람직하다.The membrane filter of step 6 is preferably a polytetra fluoroethylene (PEFE) membrane filter with pores of 0.10-0.44 μm.

마이크로스피어의 크기에 있어서, 유화제의 영향이 매우 크다. 수소화된 캐스터 오일(hydrogenated caster oil) 시리즈의 폴리옥시에틸렌 단위가 증가함에따라 유화제의 극성이 증가하게 됨으로써, 마이크로스피어의 크기가 감소한다.In the size of the microsphere, the influence of the emulsifier is very large. As the polyoxyethylene units of the hydrogenated caster oil series increase, the polarity of the emulsifier increases, thereby reducing the size of the microspheres.

이외에도 많은 인자들이 입자의 크기 분포에 영향을 미친다.Many other factors also affect the size distribution of particles.

수용액 내의 알긴산염의 초기 농도는 이러한 인자들 중의 하나이다. 바람직한 알긴산염의 농도는 5 %(W/V)이다. 5 % 이상의 농도에서는, 알긴산염 용액의 높은 점도 때문에 작고, 균일한 마이크로스피어를 제조하기가 어려우며, 5 % 이하의 농도에서는 뭉쳐진 마이크로스피어가 얻어진다.The initial concentration of alginate in aqueous solution is one of these factors. Preferred concentrations of alginate are 5% (W / V). At concentrations above 5%, it is difficult to produce small, uniform microspheres due to the high viscosity of the alginate solution, and at concentrations below 5% agglomerated microspheres are obtained.

유기 용매의 선택은 입자의 크기와 분포도를 결정하는 또 다른 중요한 요인이다. '분산 중합 연구'(dispersion polymerization study)에 의하면, 입자 크기는 용매의 극성이 증가함에 따라 감소한다(Lok and Ober, 1985, Paine, 1990). 본 발명에서는 바람직한 실시예로서 CaCl2가 용해되어 있는 n-옥탄올을 유기용매로 사용한다. 이 용액은 확산-조절 계면 겔화를 위해 알긴산염을 포함하는 수용액 내에 천천히 확산된다.The choice of organic solvent is another important factor in determining the size and distribution of the particles. According to the dispersion polymerization study, particle size decreases with increasing polarity of the solvent (Lok and Ober, 1985, Paine, 1990). In the present invention, n-octanol in which CaCl 2 is dissolved is used as an organic solvent. This solution diffuses slowly in an aqueous solution containing alginate for diffusion-controlled interfacial gelling.

교반 속도 또한 바람직한 직경을 가진 유제 입자를 형성함에 있어서 중요한 인자이다. 본 발명에서 바람직한 실시예로서 유화(emulsification)는 1시간 동안 8,000 rpm으로 수행되었다. 교반 속도가 5,000 rpm 이하이면, 직경이 10 μm 이상인 불균질한 마이크로스피어를 얻는반면, 교반 속도가 10,000 rpm 이상이면 뭉쳐진 입자의 제제를 낮을 수율로 얻는다. 가능한 교반속도는 약 5,000 rpm 내지 10,000 rpm이며 바람직하게는 7,000∼8,000 rpm 이다. 또한, 경화된 마이크로스피어가 입자로서 분리되기 위해서는 겔화가 될 때까지 낮은 속도로 지속적으로 교반하는 것이 필요하다.Stirring speed is also an important factor in forming emulsion particles having the desired diameter. As a preferred embodiment in the present invention, emulsification was performed at 8,000 rpm for 1 hour. If the stirring speed is 5,000 rpm or less, heterogeneous microspheres having a diameter of 10 μm or more are obtained, while the preparation of the agglomerated particles is obtained in low yield if the stirring speed is 10,000 rpm or more. Possible stirring speeds are about 5,000 rpm to 10,000 rpm and preferably 7,000 to 8,000 rpm. In addition, in order for the cured microspheres to separate as particles, it is necessary to continuously stir at a low rate until gelation occurs.

입자 크기는 또한, n-옥탄올내의 CaCl2의 농도와 이 CaCl2용액을 매질내에 첨가하는 속도에 의존적이다. CaCl2용액을 유제에 첨가시에, 주사기로 적가하는 것 보다는 분사(spraying)함으로써 마이크로스피어의 크기를 감소시킬 수 있다.The particle size also depends on the concentration of CaCl 2 in n-octanol and the rate at which this CaCl 2 solution is added to the medium. When the CaCl 2 solution is added to the emulsion, the size of the microspheres can be reduced by spraying rather than dropping into a syringe.

본 발명의 구체적인 실시예로 생체외 방출 시험에 사용된 마이크로스피어는 5 %(w/v) HCO-60을 포함하는 n-옥탄올 용액 내에 유화된 5 %(w/v) 알긴산염 용액에 의해 제조된 다음, 1 % 염화칼슘을 포함하는 n-옥탄올로 겔화되었다.In a specific embodiment of the present invention, the microspheres used in the in vitro release test were prepared by a 5% (w / v) alginate solution emulsified in an n-octanol solution containing 5% (w / v) HCO-60. Prepared and then gelled with n-octanol containing 1% calcium chloride.

항원이 충진된 마이크로스피어의 표면 형태와 크기는 주사 전자현미경(scanning electron microscopy)에 의해 관찰되는데, 본 발명의 마이크로스피어는 특별한 굴곡이 없는 매끄러운 표면을 가지며, 0.5 내지 5 μm 범위의 직경을 갖는다.The surface morphology and size of the antigen-filled microspheres are observed by scanning electron microscopy, which has a smooth surface without special bending and has a diameter in the range of 0.5-5 μm.

본 발명의 알긴산염 마이크로스피어는 임상투여 시에 경구투여가 가능하며, 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캅셀제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.The alginate microspheres of the present invention can be administered orally during clinical administration and can be used in the form of general pharmaceutical formulations. Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, etc. Or lactose, gelatin, etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc may also be used.

본 발명의 알긴산염 마이크로스피어를 경구 백신으로 사용시, 항원 단백질의 유효량은 20 ∼400 ㎍/dose이고, 바람직하기로는 40 ∼ 100 ㎍/dose이다.When the alginate microsphere of the present invention is used as an oral vaccine, the effective amount of the antigenic protein is 20 to 400 µg / dose, preferably 40 to 100 µg / dose.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.The following examples are intended to illustrate the invention and are not intended to limit the scope of the invention.

＜실시예 1＞ S.뉴모니애의 염색체로부터 PsaA 유전자의 클로닝<Example 1> Cloning of PsaA Gene from S. pneumoniae chromosome

(1-1) 스트렙토코커스 뉴모니애로부터 게놈 DNA의 분리(1-1) Isolation of Genomic DNA from Streptococcus pneumoniae

스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)를 BHI와 10 % FBS(fetal bovine serum) 배지에서 37 ℃, 혐기성 조건하에서 하루동안 배양하였다. 이를 13,000 rpm에서 2분간 원심분리하여 배양된 S.뉴모니애(1.5 ml)를 얻었다. 이 펠렛을 227 μl의 라이소자임(10 mg/ml)을 포함하는 TE(Tris-EDTA) 완충액 340 μl에 현탁하고, 실온에서 30분간 배양하였다. 10 % SDS 30 μl와 프로테아제 K(protease K)(20 mg/ml) 3 μl를 첨가한 후, 혼합물을 37 ℃에서 1시간 동안 배양하고, 5 M NaCl 100 μl와 CTAB/NaCl(10 % hexadecyltrimethylammonium bromide in 0.7 M NaCl)용액 80 μl를 첨가하여 65 ℃에서 10분간 배양하였다. 동량의 클로로포름/이소아밀 알코올로 DNA를 추출하고, 마니아티스의 방법(Maniatis, 1989)으로 침전시켜 S. 뉴모니애의 게놈 DNA를 얻었다.Streptococcus pneumoniae was incubated in BHI and 10% fetal bovine serum (FBS) medium at 37 ° C. under anaerobic conditions for one day. This was centrifuged at 13,000 rpm for 2 minutes to obtain cultured S. pneumoniae (1.5 ml). This pellet was suspended in 340 μl of TE (Tris-EDTA) buffer containing 227 μl of lysozyme (10 mg / ml) and incubated at room temperature for 30 minutes. After addition of 30 μl of 10% SDS and 3 μl of protease K (20 mg / ml), the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour, and 100 μl of 5 M NaCl and CTAB / NaCl (10% hexadecyltrimethylammonium bromide in 0.7 M NaCl) solution was added to incubate for 10 minutes at 65 ℃. DNA was extracted with the same amount of chloroform / isoamyl alcohol and precipitated by Maniatis' method (Maniatis, 1989) to obtain genomic DNA of S. pneumoniae.

(1-2) pCYB4 벡터의 제조(1-2) Preparation of pCYB4 Vector

pCYB4(6.8kb)는 IPTG-유도성 Ptac 프로모터(promotor)와 다중 클로닝 위치(multiple cloning site)를 포함한다. 상기 벡터는 목표 단백질의 C-말단과 인테인(inteine)의 N-말단이 융합하도록 디자인되었다. 키틴 결합 도메인(chitin binding domain)을 코딩하는 DNA는 친화성 정제를 위한 인테인의 C-말단에 존재하며, NcoI 및 SmaI 제한 효소 위치는 다중 클로닝 위치에 존재한다. 재조합 플라스미드를 전기천공법에 의해 대장균 XL1-Blue 내로 형질전환하였고, 플라스미드 DNA는 마니아티스 방법에 따라 제조되었다.pCYB4 (6.8 kb) contains an IPTG-induced Ptac promoter and multiple cloning sites. The vector was designed to fuse the C-terminus of the target protein with the N-terminus of inteine. The DNA encoding the chitin binding domain is present at the C-terminus of the intein for affinity purification and the NcoI and SmaI restriction enzyme sites are at multiple cloning sites. Recombinant plasmids were transformed into E. coli XL 1 -Blue by electroporation and plasmid DNA was prepared according to the Maniatis method.

(1-3) PsaA 유전자의 클로닝(1-3) Cloning of PsaA Gene

Psa A을 코딩하는 유전자의 DNA 염기서열은 DNA 데이터베이스로부터 얻어졌다(도 6). 유전자 Psa A는 S.뉴모니애의 37-kDa 단백질을 코딩하는데, 보고된 2.4 kbp 단편은 3개의 전사해독틀(open reading frames, ORP)을 가지고 있다. 전사해독틀 1, 3은 PsaA의 양쪽에 있으며, 933bp PsaA로 표시되는 해독틀 2는 Mr 34, 541과 pI 5.93의 단백질을 코딩한다. 성숙한 PsaA 단백질은 친수성이지만, 20개의 아미노산으로 이루어진 소수성 선도 서열(leader sequence)을 갖는다. PsaA 유전자는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되고, 아가로오즈 겔 전기영동에 의해 분석되었다. 877bp PCR 산물은 퀴아젠 용출 키트(Quagen elution Kit.)을 이용하여 겔로부터 정제하였다.The DNA sequence of the gene encoding Psa A was obtained from a DNA database (FIG. 6). The gene Psa A encodes the 37-kDa protein of S. pneumoniae. The reported 2.4 kbp fragment has three open reading frames (ORPs). Transcription reading frames 1 and 3 are on both sides of PsaA, and reading frame 2, denoted 933 bp PsaA, encodes the proteins of Mr 34, 541 and pi 5.93. Mature PsaA proteins are hydrophilic but have a hydrophobic leader sequence of 20 amino acids. PsaA gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and analyzed by agarose gel electrophoresis. The 877 bp PCR product was purified from the gel using the Qagen Elution Kit.

총 1330bp 유전자에서 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭된 부분은 232부터 1112의 위치이다. 신호 펩타이드와 정지 코돈은 각각의 말단에서 제거되었다. 반응 혼합물(50 μl)은 Taq 폴리머라제(polymerase) 2 유닛(unit), 서열 1의 순방향 시발체 400 nmol, 서열 2의 역방향 시발체 400 nmol, 주형으로 1 μg의 게놈 DNA 및 200 μM의 dNTP을 포함한다. 중합효소 연쇄 반응에 대한 시발체는 Oligos ETC. Inc.(Willsonile, USA)의 방법에 의해 합성되었다.The amplified portion of the total 1330 bp gene by the polymerase chain reaction is located at 232-1112. Signal peptides and stop codons were removed at each end. The reaction mixture (50 μl) comprises 2 units of Taq polymerase, 400 nmol of the forward primer of SEQ ID NO: 1, 400 nmol of the reverse primer of SEQ ID NO: 2, 1 μg of genomic DNA as template, and 200 μM of dNTP. . The primers for the polymerase chain reaction are Oligos ETC. It was synthesized by the method of Inc. (Willsonile, USA).

증폭을 위한 가열 순환시간은 94 ℃에서 3분간 1 싸이클; 94 ℃에서 15초간, 55 ℃에서 15초간, 72 ℃에서 1분간 32 싸이클; 72 ℃에서 5분간 마지막 연장반응을 수행하였다. 중합효소 연쇄반응 후, 반응 혼합물을 전기영동하고 아가로오스 겔로부터 용출(QIA quick Gel Extraction Kit)하였다. 얻어진 DNA 펠렛을 증류수에 용해하고, Taq 폴리머라제 반응에 의해 형성된 폴리 아데닌 서열(dA 꼬리)을 제거하기 위해, 상기 DNA 를 2배 부피의 클레노우(Klenow) 효소 완충액(2 unit/1 μl)에서 45 ℃, 15분간 배양하고, 여기에 총 반응액 부피의 1/10에 해당하는 0.125 nM dNTP를 37 ℃, 30분 동안 첨가하였다. 반응물에 TE-포화 페놀과 크로로포름:이소아밀알코올(24:1 부피비)을 순차적으로 처리하고, 에탄올로 DNA를 침전 시킨 후에, 용출된 DNA를 증류수에 용해하였다.Heating cycle time for amplification was 1 cycle at 94 ° C. for 3 minutes; 32 cycles of 15 seconds at 94 DEG C, 15 seconds at 55 DEG C, and 1 minute at 72 DEG C; The last extension reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes. After the polymerase chain reaction, the reaction mixture was electrophoresed and eluted from agarose gel (QIA quick Gel Extraction Kit). In order to dissolve the obtained DNA pellet in distilled water and remove the poly adenine sequence (dA tail) formed by Taq polymerase reaction, the DNA was taken in a double volume of Klenow enzyme buffer (2 unit / 1 μl). Incubated at 45 ° C. for 15 minutes, and 0.125 nM dNTP corresponding to 1/10 of the total reaction solution volume was added thereto at 37 ° C. for 30 minutes. The reaction was sequentially treated with TE-saturated phenol and chloroform: isoamyl alcohol (24: 1 by volume), after precipitating DNA with ethanol, the eluted DNA was dissolved in distilled water.

증폭된 삽입 DNA와 pCYB4 벡터는 처음에는 25 ℃에서 SmaI에 의해, 둘째로 37 ℃에서 NcoI에 의해 절단되었다. 절단된 DNA를 전기영동하고, 퀴아 퀵 겔 추출 키트(QIA quick Gel Extraction Kit)로 용출한 후, TE-포화 페놀과 크로로포름:이소아밀알코올(24:1 부피비)을 순차적으로 처리하고, 에탄올로 DNA를 침전시켰다. 정제된 DNA를 증류수에 재용해하였다.The amplified insert DNA and pCYB4 vector were first cleaved by SmaI at 25 ° C and second by NcoI at 37 ° C. The digested DNA was electrophoresed, eluted with QIA quick Gel Extraction Kit, and then sequentially treated with TE-saturated phenol and chloroform: isoamyl alcohol (24: 1 by volume), followed by ethanol DNA was precipitated. Purified DNA was redissolved in distilled water.

벡터와 삽입 DNA를 완전히 혼합하고, 45 ℃에서 15분간 배양하여 DNA를 용해시킨 다음, 얼음 위에서 5-10분간 저장하였다. 리가제 완충액을 혼합물에 섞은 다음, 여기에 T4 리가제(ligase)와 1mM ATP를 첨가하였다. 접합반응은 4 ℃에서 하루동안 수행되었다(도 4).The vector and the inserted DNA were thoroughly mixed, incubated at 45 ° C. for 15 minutes to dissolve the DNA, and stored for 5-10 minutes on ice. Ligase buffer was mixed into the mixture, followed by addition of T4 ligase and 1 mM ATP. The conjugation reaction was performed at 4 ° C. for one day (FIG. 4).

(1-4) 형질전환(1-4) Transformation

대장균 XL1-Blue를 테트라사이클린(tetracycline, 50 ug/ml)이 첨가된 SOB(2 % Bacto tryptone, 0.5 % Bacto yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2및 10mM MgSO4)배지 10 ml에 접종하고 하루동안 배양하였다. 배양세포 1μl(1.6 x 109)를 100 ml의 새로운 SOB/TC에 옮기고, 37 ℃에서 진탕배양하였다. OD600이 0.5에 도달하였을 때, 배양액을 20-30분간 얼음에 놓아둔 다음, 원심분리하여(Sovall SS-34 rotor:3,000 rpm, 15 min, 4 ℃) 세포를 얻었다. 상등액을 제거한 후, 펠렛을 10 ml의 차가운 RF1[100 mM RbCl, 50 mM MnCl2, 30 mM potassium acetate, 10 mM CaCl2및 15 %(w/v) 글리세롤(pH 5.8)]용액에 현탁시키고, 15분간 얼음 위에 놓아두었다. 이를 상기와 같이 원심분리하고, 펠렛을 10 ml의 차가운 RF2[10 mM MOPS, 10 mM RbCl2, 75 mM CaCl2및 15 %(w/v) 글리세롤(pH 6.8)]용액에 현탁시켰다. 세포 현탁액을 튜브당 100 μl씩 분주하고, 상기 (1-3)으로부터 얻은 라이게이션 혼합물 4 μl를 각각 혼합하였다. 이 DNA-세포 혼합물을 얼음 위에서 1시간 동안 냉각시키고, 42 ℃에서 2분 30초동안 배양하고, 다시 얼음 위에서 2분간 냉각시켰다. 여기에 새로운 LB(500 μl)배지를 첨가하여 정치상태로 1시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 이 혼합물 중 100-200 μl를 암피실린(100 μg/ml)를 포함하는 LB 아가 플레이트 위에 도말하여, 37 ℃에서 배양하였다.Escherichia coli XL 1- Blue was supplemented with SOB (2% Bacto tryptone, 0.5% Bacto yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl 2 and 10 mM MgSO 4 ) supplemented with tetracycline (50 ug / ml). Inoculated in 10 ml and incubated for one day. 1 μl (1.6 × 10 9 ) of culture cells were transferred to 100 ml of fresh SOB / TC and shaken at 37 ° C. When the OD 600 reached 0.5, the culture was placed on ice for 20-30 minutes and then centrifuged (Sovall SS-34 rotor: 3,000 rpm, 15 min, 4 ° C.) to obtain cells. After removing the supernatant, the pellet was suspended in 10 ml of cold RF1 [100 mM RbCl, 50 mM MnCl 2 , 30 mM potassium acetate, 10 mM CaCl 2 and 15% (w / v) glycerol (pH 5.8)] solution, It was left on ice for 15 minutes. It was centrifuged as above and the pellet suspended in 10 ml of cold RF2 [10 mM MOPS, 10 mM RbCl 2 , 75 mM CaCl 2 and 15% (w / v) glycerol (pH 6.8)] solution. The cell suspension was dispensed at 100 μl per tube and 4 μl of the ligation mixture obtained from (1-3) above were mixed respectively. The DNA-cell mixture was cooled on ice for 1 hour, incubated at 42 ° C. for 2 minutes 30 seconds, and then again on ice for 2 minutes. Fresh LB (500 μl) medium was added thereto and incubated at 37 ° C. for 1 hour while standing. 100-200 μl of this mixture was plated on LB agar plates containing ampicillin (100 μg / ml) and incubated at 37 ° C.

(1-5) 형질전환체의 스크리닝(1-5) Screening of transformants

pCYB4-PsaA 플라스미드를 포함하고 있는 콜로니를 선별하기 위해, 각각의 콜로니로부터 플라스미드를 정제하고 제한효소로 처리하였다. 대조군으로는 pCYB 플라스미드만을 포함하고 있는 대장균 XL1-Blue 형질전환체를 사용하였다. 우선, 총 178개의 콜로니로부터 32개의 콜로니를 선택하고, 이 중 몇개의 콜로니를 임의적으로 선택하여, 암피실린을 포함하는 LB 배지에 접종하였다. 각각의 플라스미드는 상기 (1-2)의 방법에 따라 배양액으로부터 정제되었다. 정제된 플라스미드는 pCYB4 벡터와 PsaA 삽입 단편을 만들기 위해 37 ℃에서 제한효소 KpnI와 NcoI로 이중처리하였다.To select colonies containing the pCYB4-PsaA plasmid, plasmids were purified from each colony and treated with restriction enzymes. As a control, Escherichia coli XL 1 -Blue transformant containing only pCYB plasmid was used. First, 32 colonies were selected from a total of 178 colonies, and some of them were randomly selected and inoculated in LB medium containing ampicillin. Each plasmid was purified from the culture according to the method of (1-2) above. Purified plasmids were double-treated with restriction enzymes KpnI and NcoI at 37 ° C to make pCYB4 vector and PsaA insert fragment.

클론이 실제적으로 PsaA-인테인/CBD 융합 단백질로 발현할 수 있는지를 알아보기 위해서 예비 발현 시험을 수행하였다. pCYB4-PsaA를 갖는 각 클론을 암피실린 100 μg/ml를 포함하는 5 ml LB배지에 접종하고 하루동안 배양하였다. 하루동안 배양한 배양액(50 μl)을 암피실린을 포함하는 새로운 LB배지 5 ml에 옮기고, 37 ℃에서 3시간 동안 진탕배양하였다. 500 μM IPTG 첨가하거나 첨가하지 않음으로써 37 ℃에서 2시간 동안 더 배양을 유도한 다음, 각각의 배양액을 원심분리하고 현탁하였다. 세포 펠렛을 초음파분쇄한 다음, 세포 분해물을 웨스턴 블럿팅(western blotting) 및 SDS-PAGE로 분석하였다(도 5).Preliminary expression tests were performed to see if the clones could actually express the PsaA-intein / CBD fusion protein. Each clone with pCYB4-PsaA was inoculated in 5 ml LB medium containing 100 μg / ml of ampicillin and incubated for one day. Cultures (50 μl) incubated for one day were transferred to 5 ml of fresh LB medium containing ampicillin and shaken at 37 ° C. for 3 hours. Incubation was further induced at 37 ° C. for 2 hours with or without 500 μM IPTG, followed by centrifugation and suspension of each culture. Cell pellets were sonicated and then cell lysates were analyzed by western blotting and SDS-PAGE (FIG. 5).

SDS-PAGA와 웨스팅 블럿팅은 마니아티스 등(Maniatis et al., 1989)의 방법으로 수행하였다. 구체적으로 샘플들을 3분간 열수조에서 가열하고, 10 % 폴리아크릴아마이드 겔로 분리하였다. 겔은 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant Blue) R250으로 염색하고, 겔 건조 키트(gel drying kit)(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 건조하였다. 웨스팅 블럿팅을 위해 단백질을 겔로부터 폴리비닐리딘플루오라이드(PVDF) 막으로 옮기고, 항-PsaA 토끼 혈청을 PBS로 100배 희석하여 1차 항원으로 사용하였다. 또한, 퍼록시다제와 결합된 항-토끼 염소 항체(Organon Teknika Corp, NC, USA)를 PBS로 10,000배 희석하여 2차 항원으로 사용하였다. 이후 발색반응을 위해 세척된 막을 4-클로로-1-나프톨(4-chloro-1-naphtol) 용액에서 배양하였다. 그 결과 4개의 클론에서 90kD 또는 35kD의 단백질을 발현하였다.SDS-PAGA and Westing blotting were performed by Maniatis et al. (1989). Specifically, the samples were heated in a hot water bath for 3 minutes and separated by a 10% polyacrylamide gel. Gels were stained with Coomassie brilliant Blue R250 and dried using a gel drying kit (Promega, Madison, Wis., USA). Proteins were transferred from gels to polyvinyridine fluoride (PVDF) membranes for westing blotting, and anti-PsaA rabbit serum was diluted 100-fold with PBS to serve as the primary antigen. In addition, anti-rabbit goat antibodies (Organon Teknika Corp, NC, USA) bound to peroxidase were diluted 10,000-fold with PBS and used as secondary antigens. Then, the washed membrane for the color reaction was incubated in 4-chloro-1-naphtol (4-chloro-1-naphtol) solution. As a result, four clones expressed 90 kD or 35 kD protein.

(1-6) DNA 염기서열 결정(1-6) DNA sequence determination

클로닝된 PsaA 유전자 염기서열은 DNA 염기서열 결정에 의해 확정되었다. 총 877 염기의 처음 절반은 Ptac 프로모터 시발체의 연장반응에 의하여, 나머지 절반은 인테인 역방향 시발체의 연장에 의해 결정되었다. 염기서열 결정은 자동 형광 서열분석기(automatic fluorescence sequencer)(Applied Biosystems, Model 373)(Sanger et al., 1977)를 사용한 생거 등의 방법(dideoxy chain termination method)에 의해 수행되었다. '순방향' 반응 혼합물(20 μl)은 5 pmol의 서열 3의 Ptac 프로모터 시발체(New England Biolabs에 의해 합성됨), 1 μg의 주형 플라스미드 및 더모 시퀀사제 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 프리-믹스 키트(Thermo SequenaseTMdye terminator cycle sequencing pre-mix kit, Amersham Life Science) 8 μl를 포함한다. '역방향" 반응 혼합물(20 μl)은 Ptac 프로모터 시발체 대신 서열 4의 인테인 역방향 시발체(New England Biolabs에 의해 합성됨)를 사용하는 것을 제외하고는 '순방향' 조성물과 동일한 조성물을 사용하였다. 중합효소 연쇄반응(PCR)의 조건은 96 ℃에서 30초간, 45 ℃에서 15초간, 60 ℃에서 4분간 30회 반복하였다. 중합효소 연쇄반응 후에, 혼합물을 3 M 의 암모늄 아세테이트 (ammonium acetate) 2 μl와 95 % 에탄올 50 μl를 포함하는 튜브로 옮긴 다음, -70 ℃에서 10분간 냉각 후 원심분리하였다. 펠렛을 70 % 에탄올로 세척하고 스피드백(SpeedVac)으로 건조한 다음, DNA를 4 μl의 로딩 완충액(탈이온화된 포름아마이드 : 50 mM EDTA의 비율이 5 : 1, pH 8.0)에 재용해시켰다. 이를 70 ℃에서 5분간 가열하고 얼음 위에 즉시 담그었다. DNA를 TBE 완충용액(90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA)에 녹인 6 M 우레아를 포함하는 6 % 아크릴아마이드 겔에 재용해하였다. DNA 염기서열 결정(도 6) 및 재조합 단백질의 발현에 의해 양성으로 확정되는 재조합 크론은 암피실린 100 μg/ml를 포함하는 5 ml LB 내에서 성장되었다. 배양액의 OD600가 0.5-0.6에 도달했을 때, 배양액 800 μl에 글리세롤 200 μl를 혼합하고, 혼합물을 -70 ℃에서 저장하였다.The cloned PsaA gene sequence was confirmed by DNA sequencing. The first half of the total 877 bases was determined by extension of the Ptac promoter primer and the other half by extension of the intein reverse primer. Sequencing was performed by a dieoxy chain termination method using an automatic fluorescence sequencer (Applied Biosystems, Model 373) (Sanger et al., 1977). The 'forward' reaction mixture (20 μl) contained 5 pmol of the Ptac promoter primer of SEQ ID NO: 3 (synthesized by New England Biolabs), 1 μg of template plasmid and die terminator cycle sequencing pre-mix kit (Thermo Sequenase TM) dye terminator cycle sequencing pre-mix kit (Amersham Life Science). The 'reverse' reaction mixture (20 μl) used the same composition as the 'forward' composition, except that the intein reverse primer of SEQ ID NO: 4 (synthesized by New England Biolabs) was used instead of the Ptac promoter primer. The conditions of the chain reaction (PCR) were repeated 30 times at 96 ° C. for 30 seconds, at 45 ° C. for 15 seconds, and for 4 minutes at 60 ° C. After the polymerase chain reaction, the mixture was mixed with 2 μl of 3 M ammonium acetate. Transfer to a tube containing 50 μl of 95% ethanol and then centrifuge after cooling for 10 minutes at −70 ° C. Pellets were washed with 70% ethanol and dried with SpeedVac and DNA was then loaded with 4 μl of loading buffer ( Deionized formamide: 50 mM EDTA ratio was re-dissolved in a ratio of 5: 1, pH 8.0.Then it was heated for 5 minutes at 70 ° C. and immediately immersed on ice DNA was added to TBE buffer (90 mM Tris-borate, 6 M urea in 2 mM EDTA) Re-dissolved in a containing 6% acrylamide gel Recombinant cron, positively confirmed by DNA sequencing (FIG. 6) and expression of recombinant protein, was grown in 5 ml LB containing 100 μg / ml of ampicillin. When the OD 600 of the culture reached 0.5-0.6, 200 μl of glycerol was mixed with 800 μl of the culture and the mixture was stored at -70 ° C.

＜실시예 2＞ 재조합 PsaA 단백질의 발현 및 정제<Example 2> Expression and Purification of Recombinant PsaA Protein

(2-1) 재조합 PsaA 단백질의 발현(2-1) Expression of Recombinant PsaA Protein

(1-5)에서 선별된 형질전환체를 10 ml의 암피실린을 포함하는 LB 배지에 접종하고, 37 ℃에서 하루동안 배양하였다. 배양된 세포를 암피실린을 포함하는 새로운 LB 배지 1 리터에 접종하여 37 ℃에서 600 rpm으로 3시간동안 진탕배양하였다. 대장균을 37℃로 배양하면, PsaA-인테인/CBD 융합단백질은 내포체(inclusion bodies)의 형태로 발현되므로, IPTG로 발현을 유도할 때는 배양온도를 보다 낮추어 30, 25, 또는 20℃로 하였다. 이러한 온도에 따른 성장곡선을 도 7에 나타내었다. OD580이 0.5-0.6에 도달하였을 때, 0.5 mM IPTG로 발현을 유도하고, OD580이 2.0-2.1에 도달할 때까지 18시간 동안 20 ℃에서 배양하였다. 8,000 rpm에서 4 ℃, 30분간 원심분리(Sovall SLA-1500 rotor)하여 세포 펠렛을 얻은 다음 다음 실험 때까지 -70 ℃에서 저장하였다. 각각의 펠렛과 상등액은 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿팅으로 분석하였다(도 8).The transformants selected in (1-5) were inoculated in LB medium containing 10 ml of ampicillin and incubated at 37 ° C. for one day. The cultured cells were inoculated in 1 liter of fresh LB medium containing ampicillin and shaken for 3 hours at 37 ° C. at 600 rpm. When E. coli was cultured at 37 ° C, the PsaA-intein / CBD fusion protein was expressed in the form of inclusion bodies, so when inducing expression by IPTG, the culture temperature was lowered to 30, 25, or 20 ° C. . The growth curve according to the temperature is shown in FIG. 7. When OD 580 reached 0.5-0.6, expression was induced with 0.5 mM IPTG and incubated at 20 ° C. for 18 hours until OD 580 reached 2.0-2.1. Cell pellets were obtained by centrifugation (Sovall SLA-1500 rotor) at 8,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C. and then stored at −70 ° C. until the next experiment. Each pellet and supernatant were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting (FIG. 8).

(2-2) 재조합 PsaA 단백질의 정제(2-2) Purification of Recombinant PsaA Protein

펠렛을 25 ml의 차가운 컬럼 완충액(Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 0.1 mM EDTA 및 0.1 % triton X-100) 내에 현탁하였다. 세포는 1.5 ml의 라이소자임(lysozyme)(10 mg/ml)을 첨가하고 초음파 분쇄하였다. 그 분해물을 14,000 rpm에서 4 ℃, 30분간 원심분리(Sovall SLA-1500 rotor)하고, 완충액으로 미리 평형화된 키틴 친화 컬럼위에 상등액을 로딩하였다. 키틴 비드(chitin beads)는 약 2 mg 단백질/ml에 결합하는 능력을 가지고 있다. 재조합 PsaA 단백질의 정제는 1단계 단백질 정제 매뉴얼('IMPACTTMI : One step Protein Purification System Manual')에 따라 수행되었다. 4 ℃에서 완충액으로 미리 평형화된 키틴 친화 컬럼위에 샘플을 3회 재로딩한 다음, 컬럼을 컬럼 완충액(키틴 비드 슬러리의 30 배)으로 세척하고, 3배의 절단 완충액(Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 0.1 mM EDTA 및 30 mM DTT)을 통과시켰다. 변형된 인테인은 티올의 존재하에 낮은 온도에서 N-말단위치가 자가절단되므로 융합단백질로부터 인테인을 분리하기 위해, DTT가 컬럼을 따라 퍼지면 흐름을 멈추고 그대로 밀봉하여 4 ℃에서 하루밤 동안 방치하였다. 다음날, 컬럼에 3배의 컬럼 완충액을 흐르게 하여 PsaA 단백질을 용리(熔離)하였다. 상기와 같은 정제과정을 통해 PsaA 단백질은 용출액에 포함되어 얻어지고, 인테인/CBD 단백질은 칼럼에 남아있게 된다. 분리된 PsaA 단백질의 크기를 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿팅으로 조사한 결과, 약 35kD에 달하는 단백질임이 밝혀졌으며, 이러한 사실은 자연형의 PsaA 단백질과 일치하는 것이다(도 9a, 9b).The pellet was suspended in 25 ml cold column buffer (Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 0.1 mM EDTA and 0.1% triton X-100). Cells were sonicated with 1.5 ml of lysozyme (10 mg / ml). The digest was centrifuged (Sovall SLA-1500 rotor) for 30 minutes at 4 ° C. at 14,000 rpm and the supernatant was loaded onto a chitin affinity column previously equilibrated with buffer. Chitin beads have the ability to bind about 2 mg protein / ml. Purification of the recombinant PsaA protein was performed according to the One Step Protein Purification System Manual (IMPACT ™ I). Reload the sample three times on a chitin affinity column previously equilibrated with buffer at 4 ° C., then wash the column with column buffer (30 times of the chitin bead slurry), and triple cut buffer (Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 0.1 mM EDTA and 30 mM DTT). In order to separate the intein from the fusion protein, the modified intein was self-cleaved at low temperature in the presence of thiol, so as to separate the intein from the fusion protein, the flow was stopped when the DTT spreaded along the column, sealed and left overnight at 4 ° C. The next day, PsaA protein was eluted by running threefold column buffer over the column. Through the above purification process, the PsaA protein is obtained by being included in the eluate, and the intein / CBD protein remains in the column. The size of the isolated PsaA protein was examined by SDS-PAGE and Western blotting, and found to be about 35 kD protein, which is consistent with the native PsaA protein (FIGS. 9A and 9B).

정제된 PsaA 단백질을 아미콘 센트리프렙(Amicon Centriprep, molecule weight cut off : 10,000)에 의해 1.5 mg/ml으로 농축하였다. 이 농축액을 PBS 또는 증류수에서 투석함으로써 DTT 제거한 다음, 직접 사용하거나 캡슐화하여 항원으로서 각각 사용하였다. 항원은 사용할 때까지 -20 ℃에서 저장하였다. 단백질 성분은 브래드포드 분석 키트에 의해 결정되었으며, PsaA의 정제수율은 세균 배양 리터당 10 mg이었다.Purified PsaA protein was concentrated to 1.5 mg / ml by Amicon Centriprep (molecule weight cut off: 10,000). This concentrate was removed by DTT by dialysis in PBS or distilled water and then used directly or encapsulated and used as antigen, respectively. Antigen was stored at -20 ° C until use. Protein components were determined by the Bradford Assay Kit and the purification yield of PsaA was 10 mg per liter of bacterial culture.

＜실시예 3＞ 마이크로캡슐화(microencapsulation)<Example 3> microencapsulation

(3-1) 알긴산염 마이크로스피어의 제조(3-1) Preparation of Alginate Microspheres

마이크로스피어는 변형된 유중 수형 유화 기법(w/o emulsion technique, 도 2a, 2b, 3)에 의해 제조되었다. 유화제로서 HCO-60[5 %(w/v)]을 포함하는 n-옥탄올 용액(30 ml)에 알긴산염 용액[5ml, 5.0 %(w/v)]을 적가하였다. 유중 수형 유제(w/o emulsion)는 100 ml 용량의 방해판이 장착된 피렉스 비커(baffled pyrex beaker, 750 mm in diameter x 900 mm in height)에서, 8,000 rpm으로 1시간 동안 호모게나이져(homogenizer, Ultra-turrax disperser, IKA Werke, Staufen, Germany)에 의해 균질화됨으로써 제조되었다. 마그네틱 교반기로 천천히 교반하면서, 유제에 1 %(w/v) 염화칼슘을 포함하는 n-옥탄올을 분무기(air sprayer, Fuso Seiki Co., Ltd., Tokyo, Japan)로 첨가하였다. 혼합물을 포화시키기 위해 8 %(w/v) 염화칼슘 5 ml를 첨가하여 혼합한 후, 마이크로스피어를 10분간 경화하였다. 다음 이소프로필 알코올 6 ml를 천천히 첨가하여 마이크로스피어를 탈수하였다. 마지막으로, 마이크로스피어를 0.44 μm의 소공을 갖는 폴리테트라플루오로에틸렌(PEFE) 막 필터(Alltech Associates, Inc., IL)로 여과하고, 필터 위에 모아진 마이크로스피어를 20 ml의 이소프로필 알코올로 세척하여 18 시간동안 진공상태에서 건조하였다. 마이크로스피어의 크기 및 표면 형태는 주사 전자 현미경(scanning electron microscope, S-2460N, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하여 조사하였다. 그 결과 본 발명의 마이크로스피어는 특별한 굴곡이 없는 매끄러운 표면을 가지며, 0.5 내지 5 μm 범위의 직경을 갖고 있음을 알 수 있었다.Microspheres were prepared by a modified water-in-oil emulsion technique (w / o emulsion technique, FIGS. 2A, 2B, 3). To the n-octanol solution (30 ml) containing HCO-60 [5% (w / v)] as emulsifier was added dropwise an alginate solution [5 ml, 5.0% (w / v)]. Water-in-oil emulsions (w / o emulsion) are homogenizers for 1 hour at 8,000 rpm in a Pyrex beaker (baffled pyrex beaker, 750 mm in diameter x 900 mm in height) equipped with a 100 ml capacity baffle. Ultra-turrax disperser, IKA Werke, Staufen, Germany). While slowly stirring with a magnetic stirrer, n-octanol containing 1% (w / v) calcium chloride in the emulsion was added by an air sprayer (Fuso Seiki Co., Ltd., Tokyo, Japan). After mixing by adding 5 ml of 8% (w / v) calcium chloride to saturate the mixture, the microspheres were cured for 10 minutes. Microspheres were then dehydrated by the slow addition of 6 ml of isopropyl alcohol. Finally, the microspheres were filtered with a polytetrafluoroethylene (PEFE) membrane filter (Alltech Associates, Inc., IL) having a pore size of 0.44 μm, and the microspheres collected on the filter were washed with 20 ml of isopropyl alcohol. Drying in vacuo for 18 hours. The size and surface morphology of the microspheres were investigated using a scanning electron microscope (S-2460N, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan). As a result, it was found that the microspheres of the present invention had a smooth surface without special bending and had a diameter in the range of 0.5 to 5 μm.

(3-2) 항원을 포함하는 알긴산염 마이크로스피어의 제조(3-2) Preparation of Alginate Microspheres Containing Antigens

항원을 5 % 알긴산염 수용액 5 ml에 첨가하여 상기 (3-1)의 방법에 따라 마이크로스피어를 제조하였다. 유제는 8,000 rpm으로 1시간 동안 호모게나이져로 균질화하여 제조하였고, HCO-60을 계면 활성제로 사용하였으며, 1 % 염화칼슘 용액은 겔화제로 사용되었다. 진공상태에서 건조된 마이크로스피어는 바이알(bial) 내에 밀봉하여 4 ℃에서 보관하였다. 항원의 충진율은 단백질 함량 분석법에 의해 측정하였다. 마이크로스피어 내에 충진된 항원의 양은 마이크로스피어를 pH 7.8인 0.1 M 시트르산염 완충액 내에서 3시간 동안 교반하여 완전히 녹임으로써 결정하였다. 이 용액을 PBS에서 투석하고, 전체 단백질 양을 브래드포드 분석(bradford assay)에 의해 결정하였다. 그 결과 PsaA 단백질의 캡슐화에 있어 평균 충진율(캡슐화된 단백질/용액 내 총 단백질)은 24%(BSA 단백질에 대해서는 42%)였다. 마이크로스피어 내에 충진된 PsaA 단백질 비율(충진된 단백질의 질량/마이크로스피어 질량)은 0.4%(w/w)였으며, BSA 단백질의 경우에는 0.8%였다. PsaA 단백질에 대한 낮은 캡슐화 충진율은 용액 내의 낮은 단백질 농도 및 PsaA 단백질의 크기가 작은 것에 기인하는 것이다.The microspheres were prepared according to the method of (3-1) by adding the antigen to 5 ml of an aqueous 5% alginate solution. The emulsion was prepared by homogenizing with a homogenizer for 1 hour at 8,000 rpm, using HCO-60 as a surfactant, and a 1% calcium chloride solution was used as a gelling agent. The microspheres dried in vacuo were sealed in vials and stored at 4 ° C. The filling rate of antigen was determined by protein content analysis. The amount of antigen filled in the microspheres was determined by dissolving the microspheres completely by stirring for 3 hours in 0.1 M citrate buffer, pH 7.8. This solution was dialyzed in PBS and the total protein amount was determined by bradford assay. As a result, the average fill rate (encapsulated protein / total solution in solution) for PsaA protein encapsulation was 24% (42% for BSA protein). The PsaA protein ratio (mass / microsphere mass of filled protein) filled in the microspheres was 0.4% (w / w) and 0.8% for BSA protein. The low encapsulation fill rate for PsaA protein is due to the low protein concentration in solution and the small size of PsaA protein.

＜실시예 4＞ 시험관내 항원 방출 연구Example 4 In Vitro Antigen Release Study

마이크로스피어로부터 Psa A의 방출 속도를 다음과 같은 방법으로 결정하였다. 마이크로스피어(10 mg)를 PBS(1 ml)를 포함하는 밀봉된 바이알에 넣고 37 ℃에서 진탕하였다. 1,000 g에서 15분간 원심분리를 반복하여 상등액을 제거하고, 브래드포드 분석에 의해 단백질 양을 결정하였다. 분획(aliquots)내의 단백질 양은 마이크로스피어 샘플 내의 전체 단백질 양과 관련이 있으며, 단백질 방출의 축적 퍼센트는 시간의 함수로 결정된다.The release rate of Psa A from the microspheres was determined in the following manner. Microspheres (10 mg) were placed in sealed vials containing PBS (1 ml) and shaken at 37 ° C. The supernatant was removed by repeating centrifugation at 1,000 g for 15 minutes and the protein amount was determined by Bradford assay. The amount of protein in the aliquots is related to the total amount of protein in the microsphere sample, and the percent accumulation of protein release is determined as a function of time.

PBS 내에서 알긴산 마이크로스피어로부터 PsaA의 시험관내 방출 결과를 도 10에 나타내었다.In vitro release results of PsaA from alginic acid microspheres in PBS are shown in FIG. 10.

PsaA 단백질은 초기에 급속한 방출을 나타낸 이후 18시간동안 일정하게 방출되었다. 약 50 % 가량의 항원은 초기 단계에 급속히 방출되지만, 나머지 50%의 항원은 알긴산염 마이크로스피어로부터 일정한 형태로 지연방출되었다.PsaA protein was released constantly for 18 hours after initial rapid release. About 50% of the antigen was released rapidly at an early stage, while the remaining 50% of the antigen was delayed in some form from the alginate microspheres.

＜실시예 5＞ 면역원성 분석(immunological assay)<Example 5> Immunological assay

(5-1) PsaA의 면역원성(immunogenicity) 확인 시험(5-1) Immunogenicity test of PsaA

6 내지 8주령의 Balb/c 생쥐 암컷을 대한 실험 동물 연구 센터(DAEHAN Laboratory Animal Research Center Co.)로부터 얻었으며, 실험과정을 통해 임의로 조합된 사료와 특정항원이 존재하지 않는 표준 환경에서 유지되었다. 전신 면역 유발을 위하여, PBS(200 μl)와 완전 프로인트 보조제(boosting은 불완전 프로인트 보조제로 수행하였다)에 용해한 PsaA 항원 유제를 피하에 주사하였다. 면역화를 위한 PsaA 함량에 기초한 용량은 40 μg/마우스이다. 첫 번째 면역화한 후 2주 간격으로 제 2, 3회 면역화를 실시하였다.Balb / c mouse females, 6-8 weeks old, were obtained from the DAEHAN Laboratory Animal Research Center Co. and maintained in a standard environment free of randomly combined feeds and specific antigens throughout the experiment. For systemic immunization, PsaA antigen emulsions dissolved in PBS (200 μl) and complete Freund's adjuvant (boosting performed with incomplete Freund's adjuvant) were injected subcutaneously. The dose based on PsaA content for immunization is 40 μg / mouse. The second and third immunizations were performed at two week intervals after the first immunization.

3번째 면역화하고 2주 후에 안와정맥동에서 채혈하고 장 세척액, 폐 세척액을 채취하기 위하여 사혈시켰다.Two weeks after the third immunization, blood was collected from the orbital sinus and blood was collected for intestinal lavage and lung lavage.

채혈된 혈액은 4 ℃에서 18시간 동안의 원심분리함으로써 혈청을 분리하였다. 장 세척 샘플(gut wash samples)은 엘슨(Elson, 1984) 등의 방법에 의해 모아졌다. 즉, 1 ml의 세척액[25 mM NaCl, 40 mM Na2SO4, 10 mM KCl, 20 mM NaHCO3, 50 mM EDTA, 0.1 mg/ml 소이빈 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor) 및 162 mg/ml 폴리-에틸렌 글리콜(평균 분자량 3,350)]을 분리된 소장에 주사하고, 10분 후 소장관을 짜서 나온 액을 원심분리 튜브에 모았다. 이를 와동혼합(votex) 및 원심분리(1,000 ×g, 10 min)하여 상등액을 100 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF, Sigma Co.) 0.01 부피를 포함한 원심분리 튜브에 옮겼다. 이 샘플을 13,000 ×g에서 15분간 원심분리하고, 상등액을 회수하여 100 mM PMSF의 0.01 부피와 혼합하였다. 장에서 얻어진 투명한 액을 얼음 위에 놓고, 여기에 글로블린을 함유하지 않은(globulin-free) 3.5 % BSA 용액 0.05 부피를 첨가한 후, 사용할 때까지 -70 ℃로 동결한 상태로 보관하였다. 기관지에 캐뉼러를 삽입하여 샘플을 채취하고, 차가운 PBS 0.7 ml로 기관지포상을 세척을 하였다. 약 0.5 ml의 폐 세척액(lung lavage)을 각 마우스로부터 회수하고 잔유물(debris)을 제거하기 위하여 3,000 ×g로 4 ℃에서 5분간 원심분리한 후, -20 ℃에서 저장하였다. 기관지포상 세척액의 혈액 오염은 O.D.575에서 헤모글로빈(hemoglobin)을 검출함으로써 평가되었다. PBS에서 연속적으로 희석된 생쥐의 혈액을 표준물질로서 사용하였으며, 평균 혈액 오염도는 4±0.7 %였다. 각 채취한 혈청, 장 세척액, 기관지포상 세척액 및 폐 세척액의 항 PsaA-항체 생성량을 (5-2)의 방법으로 측정하였다.The collected blood was separated from the serum by centrifugation at 4 ° C. for 18 hours. Gut wash samples were collected by the method of Elson (Elsen, 1984). 1 ml of wash [25 mM NaCl, 40 mM Na 2 SO 4 , 10 mM KCl, 20 mM NaHCO 3 , 50 mM EDTA, 0.1 mg / ml soybean trypsin inhibitor and 162 mg / ml poly -Ethylene glycol (average molecular weight 3,350)] was injected into the separated small intestine, and after 10 minutes, the solution obtained by squeezing the small intestine was collected in a centrifuge tube. This was vortexed and centrifuged (1,000 × g, 10 min) to transfer the supernatant to a centrifuge tube containing 0.01 volume of 100 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF, Sigma Co.). The sample was centrifuged at 13,000 xg for 15 minutes and the supernatant was collected and mixed with 0.01 volume of 100 mM PMSF. The clear solution obtained in the intestine was placed on ice, to which 0.05 volumes of a globulin-free 3.5% BSA solution was added, and stored frozen at -70 ° C until use. A sample was taken by inserting a cannula into the bronchus, and the bronchial blisters were washed with 0.7 ml of cold PBS. About 0.5 ml of lung lavage was recovered from each mouse and centrifuged at 3,000 × g for 5 minutes at 4 ° C. to remove debris and then stored at −20 ° C. Blood contamination of bronchoalveolar lavage fluid was assessed by detecting hemoglobin at OD 575 . Blood from mice serially diluted in PBS was used as standard and mean blood contamination was 4 ± 0.7%. The amount of anti-PsaA-antibody produced in each of the collected serum, intestinal lavage fluid, bronchial lavage fluid and lung lavage fluid was measured by the method of (5-2).

재조합 PsaA 단백질의 면역원성을 확인하기 위하여 행한 면역화 실험의 결과 생성된 항PsaA-항체를 도 11에 나타내었다. 세번째 면역 후 2주째에 PsaA에 대한 IgG와 IgA의 농도가 일반적으로 증가하였으나, 증가정도는 측정 부위에 따라 다르게 나타났다. 즉, 소장에서의 IgG 반응은 혈장에서 유래된 IgG가 세포주위로 확산된 것이거나 상피세포에서 국소적으로 생성된 것에 기인하는 것이다. 피하 주사에 의한 IgA 반응은 일반적으로 IgG 반응보다 낮게 나타났다. 전신성 면역 반응은 점막성 면역반응과 비교하여 유아의 경우에는 더 늦게, 노인의 경우에는 더 짧게 나타나므로 재조합 PsaA의 항원성을 이들 피하주사를 통한 면역화로 확인할 수 있었다.The anti-PsaA-antibody generated as a result of the immunization experiment conducted to confirm the immunogenicity of the recombinant PsaA protein is shown in FIG. 11. At 2 weeks after the third immunization, the concentrations of IgG and IgA for PsaA were generally increased, but the extent of increase was different depending on the site of measurement. In other words, the IgG response in the small intestine is due to the spread of plasma-derived IgG around the cell or locally produced in epithelial cells. The IgA response by subcutaneous injection was generally lower than the IgG response. The systemic immune response was later in infants and shorter in older adults compared to mucosal immune responses, and the antigenicity of recombinant PsaA was confirmed by these subcutaneous injections.

(5-2) 엘리자(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)분석(5-2) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) analysis

항-PsaA 항체의 검출을 위하여, 샘플들을 엘리자로 2번씩 분석하였다. 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(Corning, Cambrige, MA, USA)를 중탄산염 코팅 완충액(40 mM Na2CO3, 60 mM NaHCO3, pH 9.6) 존재하에 3.2 μg/ml PsaA로 코팅하였다. 4 ℃에서 하루밤 동안 흡착한 후, 플레이트 내 성분을 0.05% 트윈20(PBST)을 포함하는 PBS로 2회 세척하였다. 웰은 5 % 탈지우유 용액으로 채워지고, 블로킹을 위해서 37 ℃에서 2시간 동안 배양되었다. 내용물을 제거한 뒤 웰을 PBST로 2회 세척하였다. 혈청 표본을 50회 희석하고, 2배로 희석된 장 세척 및 기관지포상 세척 샘플을 1차 항체로 사용하였다. 2,000배 희석된 고추냉이(HRP)-결합 항-마우스 염소 면역글로불린(Organon Teknika Corp., Durham, NC, USA)을 2차 항체로 사용하였다. 모든 사용된 면역 글로불린(immunoglobulines)은 1 % 탈지우유를 포함하는 PBS에 희석되고 37 ℃에서 30분간 배양되었으며, 각각의 단계 후에 웰은 PBST로 6회 세척되었다. 모든 시약은 100 μl 표준 부피로 사용되었다. OPD(1 mg/ml)를 포함하는 안정한 퍼옥시다제(peroxidase) 기질 완충액(PIERCE Chemical Co., Rockford, IL, USA)은 발색반응을 위해 사용되었다. 2.0 N 황산 100 μl를 첨가하여 반응을 중단시키고, 492 nm에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 OD를 측정하였다.For detection of anti-PsaA antibodies, samples were analyzed twice with Eliza. Polystyrene microtiter plates (Corning, Cambrige, Mass., USA) were coated with 3.2 μg / ml PsaA in the presence of bicarbonate coating buffer (40 mM Na 2 CO 3 , 60 mM NaHCO 3 , pH 9.6). After adsorption overnight at 4 ° C., the components in the plate were washed twice with PBS containing 0.05% Tween20 (PBST). The wells were filled with 5% skim milk solution and incubated at 37 ° C. for 2 hours for blocking. The wells were washed twice with PBST after the contents had been removed. Serum samples were diluted 50 times and two-fold diluted intestinal and bronchial lavage samples were used as primary antibodies. Wasabi (HRP) -binding anti-mouse goat immunoglobulin (Organon Teknika Corp., Durham, NC, USA) diluted 2,000-fold was used as the secondary antibody. All used immunoglobulins were diluted in PBS containing 1% skim milk and incubated for 30 minutes at 37 ° C., after each step the wells were washed six times with PBST. All reagents were used in 100 μl standard volume. Stable peroxidase substrate buffer containing OPD (1 mg / ml) (PIERCE Chemical Co., Rockford, IL, USA) was used for the color reaction. The reaction was stopped by adding 100 μl of 2.0 N sulfuric acid and the OD was measured using a microplate reader at 492 nm.

항체의 양은 검체내의 항체의 농도의 비례평균(geometric mean)로서 표현하였다. 항체의 농도 결정을 위하여 샌드위치 엘리자(sandwich ELISA)를 사용하여 표준곡선을 구하였다. 마이크로타이터 플레이트는 4 μg의 항-마우스 염소 면역글로불린 동위체(IgM, IgG, IgA;Organon Teknika Corp., Durham, NC, USA)를 포함하는 50 μl의 중탄산 완충액으로 4 ℃에서 하루동안 코팅하였다. 5 % 탈지우유로 블로킹한 후, 표준물질인 동위체(isotopes)의 알려진 농도로 마우스 면역 글로불린(Organon Teknika Corp.)을 정제하였다.The amount of antibody was expressed as the geometric mean of the concentration of the antibody in the sample. A standard curve was determined using a sandwich ELISA to determine the concentration of the antibody. Microtiter plates were coated for 1 day at 4 ° C. with 50 μl of bicarbonate buffer containing 4 μg of anti-mouse goat immunoglobulin isotope (IgM, IgG, IgA; Organon Teknika Corp., Durham, NC, USA). After blocking with 5% skim milk, mouse immunoglobulins (Organon Teknika Corp.) were purified to known concentrations of isotopes, a standard.

OD(optical density)는 20-120 ng/ml의 범위에서 IgM 항체의 농도에 비례하였고, 쥐의 IgG 항체에 대해서는 10-110 ng/ml, 쥐의 IgA 항체에 대해서는 10-100 ng/ml의 범위에서의 농도에 비례하였다(도 12).Optical density (OD) was proportional to the concentration of IgM antibody in the range of 20-120 ng / ml, 10-110 ng / ml for murine IgG antibody and 10-100 ng / ml for murine IgA antibody It was proportional to the concentration at (Fig. 12).

(5-3) 경구용 제형의 PsaA 단백질에 대한 전신적 및 국소적 항체반응(5-3) Systemic and Local Antibody Responses to PsaA Proteins in Oral Formulations

PsaA 항원 단백질을 마이크로캡슐화 한 제형인 E (PsaA)과 마이크로캡슐화 하지 않은 제형인 N (PsaA)를 40 ug씩 경구로 면역화하기 직전에 3 % Na2CO3을 포함하는 PBS에 현탁하였다. 이 항원용액(500 μl/dose)을 끝이 뭉툭한 바늘(blunt-tipped feeding needle)을 사용하여 생쥐들의 위 내에 투여하였다.E (PsaA), a microencapsulated formulation of PsaA antigen protein, and N (PsaA), a non-microencapsulated formulation, were suspended in PBS containing 3% Na 2 CO 3 immediately before oral immunization. This antigen solution (500 μl / dose) was administered to the stomach of mice using a blunt-tipped feeding needle.

생쥐들에게 2주 간격으로 3회 경구면역화한 후에, 2주 후 상기 (5-1)에서와 동일한 방법으로 채취한 혈청, 장 세척액, 폐 세척액으로부터 PsaA에 대한 항체 반응을 상기 (5-2)의 방법으로 분석하였다. E(PsaA)와 N(PsaA)로 면역화된 생쥐들의 면역 반응성의 비교 결과를 도 13에 나타내었다. E(PsaA)는 주로 혈청, 기관지 포상 부위 및 소장에 서 IgG와 IgA의 반응을 유도하였으며, p 값은 0.05미만으로 나타났다. 이로부터, E(PsaA)이 항원의 생체내에서의 분해를 방지하여 전신성(systemic) 및 점막성(mucosal) 항체 반응을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.After oral immunization three times at 2 week intervals in mice, the antibody response to PsaA from serum, intestinal lavage, and lung lavage obtained in the same manner as in (5-1) after 2 weeks was described in (5-2). The method was analyzed. A comparison of the immune responsiveness of mice immunized with E (PsaA) and N (PsaA) is shown in FIG. 13. E (PsaA) induced the reaction of IgG and IgA mainly in serum, bronchial acinar area and small intestine, and p value was less than 0.05. From this, it was confirmed that E (PsaA) can increase the systemic and mucosal antibody response by preventing degradation of the antigen in vivo.

(5-4) 콜레라 독소에 의한 면역반응 유도 시험(5-4) Induction test of immune response by cholera toxin

콜레라 독소(CT)가 PsaA에 대한 전신성 및 점막성 면역 반응을 증가시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, CT와 PsaA를 같이 투여하였다. 콜레라 톡신(CT) 또는 콜레라 톡신 B 단위체(CTB)를 같이 투여하는 경우에는 독소를 각각 5 μg/마우스 또는 10 μg/마우스로 접종하였으며, 첫 번째 면역화 후 2주 간격으로 2회와 3회 면역화를 시행하였다. 그 결과, p 값이 0.05 미만으로 나타나, PsaA와 CT를 같이 복용할 경우 전신성 및 점막성 면역 반응을 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 13). 즉, 마이크로캡슐화된 항원과 함께 점막 면역보조제인 CT를 동시에 경구복용할 경우, CT에 대한 특이적인 혈청항원반응을 유도할 수 있을 뿐 아니라, 점막 부위에 항원-특이적 항체반응을 생성하기 위한 효과적인 방법(regimen)임을 증명하였다. 그러나 콜레라 톡신 B 단위체(CTB)는 항원과 같이 복용시 면역 보조제로의작용이 있는 것으로 보고되었으나(Bergquist C, 1195), 본 실시예에서는 PsaA에 대한 면역 반응을 증가시키지 못한 것으로 나타났다.To determine whether cholera toxin (CT) can increase systemic and mucosal immune responses to PsaA, CT and PsaA were administered together. When cholera toxin (CT) or cholera toxin B unit (CTB) was administered together, the toxin was inoculated at 5 μg / mouse or 10 μg / mouse, respectively, and two and three immunizations were performed two weeks apart after the first immunization. Was implemented. As a result, the p value was shown to be less than 0.05, it was confirmed that the systemic and mucosal immune response can be increased by taking PsaA and CT together (Fig. 13). In other words, oral administration of CT, a mucosal adjuvant, together with microencapsulated antigen not only induces specific serum antigen responses to CT, but also is effective for generating antigen-specific antibody responses to mucosal sites. It proved to be a regimen. However, cholera toxin B monomer (CTB) has been reported to act as an adjuvant when taken together with antigen (Bergquist C, 1195), but this example did not increase the immune response to PsaA.

본 발명의 마이크로스피어는 알긴산염을 고분자 기질로하여 위의 산성 환경 및 장관 내의 단백질 분해효소에 대한 저항성이 있어서 단백질 항원의 경구용 수송체로 사용할 수 있다는 이점을 갖는다.The microspheres of the present invention have the advantage that they can be used as oral transporters of protein antigens because they are resistant to proteolytic enzymes in the acidic environment and intestinal tract with alginate as a polymer substrate.

또한, 본 발명의 마이크로스피어는 5 μm이하의 직경을 가지므로 포합된 항원을 페이어패치(Payer's patch)에 의한 경로 및 임파관에 의한 부수경로를 통하여 전신적 또는 국소적 면역기관까지 효과적으로 전달할 수 있으며, 알긴산염에 포함되지 않은 PsaA에 비해 더 높은 항체를 생성할 뿐만 아니라 점막 면역 보강제인 콜레라 독소(cholera toxin) 또는 콜레라 독소 B 단위체와 함께 투여시 혈청 및 점막 항체의 수준을 향상시킬 수 있다.In addition, since the microsphere of the present invention has a diameter of 5 μm or less, the conjugated antigen can be effectively delivered to the systemic or local immune organs through the pathway by the Payer's patch and the secondary pathway by the lymphatic vessel. Not only does it produce higher antibodies compared to PsaA, which is not included in alginate, but it can also improve serum and mucosal antibody levels when administered with cholera toxin or cholera toxin B monomer, which is a mucosal adjuvant.

Claims (21)

단백질 항원을 포함하며 알긴산염 마이크로스피어 형태로 제조되는 것을 특징으로 하는 경구투여용 백신.An oral vaccine comprising a protein antigen and prepared in the form of alginate microspheres. 제 1항에 있어서, 단백질 항원은 바이러스의 외막 단백질 항원, 세균의 표면 단백질 항원, 세균의 균체내 또는 균체외 톡신 항원, 자가면역 유발 단백질 항원, 알레르기 유발 단백질 항원을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 경구투여용 백신.The method of claim 1, wherein the protein antigen is at least one selected from the group consisting of outer membrane protein antigens of viruses, bacterial surface protein antigens, bacterial intracellular or extracellular toxin toxins, autoimmune-inducing protein antigens, allergen-producing protein antigens Oral vaccine, characterized in that. 제 1항에 있어서, 단백질 항원은 폐렴구균 항원, 헤모필루스 파라인플루엔자(Hemophilus parainfluenza) 항원, 디프테리아 항원, 백일해 항원, 파상풍 항원, 독성 대장균 항원, 이질 항원, 콜레라 항원, 임균 항원, 인플루엔자 바이러스 항원, B형 간염 항원, 홍역 바이러스 항원, 마진 항원, 풍진 항원을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 경구투여용 백신.The method of claim 1, wherein the protein antigen is pneumococcal antigen, Hemophilus parainfluenza antigen, diphtheria antigen, pertussis antigen, tetanus antigen, toxic E. coli antigen, heterologous antigen, cholera antigen, gonococcal antigen, influenza virus antigen, type B The vaccine for oral administration, characterized in that at least one selected from the group consisting of hepatitis antigen, measles virus antigen, margin antigen, rubella antigen. 제 1항에 있어서, 단백질 항원은 뉴몰리신(pneumolysin), 뉴라미니다제(pneuraminidase), 오토리신(autolysin), 폐렴구균성 표면 접착 A(Psa A) 또는 폐렴구균성 표면 단백질 A(Psp A)를 포함하는 스트렙토코커스 뉴모니애(Spreptococcus pneumoniae)의 단백질 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 경구용 백신.The method of claim 1, wherein the protein antigen is pneumolysin, neuraminidase, autolysin, pneumococcal surface adhesion A (Psa A) or pneumococcal surface protein A (Psp A) Oral vaccine, characterized in that at least one selected from the proteins of Streptococcus pneumoniae. 제 1항에 있어서, 백신은 추가적으로 콜레라 독소(cholera toxin), 콜레라 독소 B 단위체(cholera toxin B subunit), 대장균 장독소(Escherichia coli Heat labile enterotoxin), 뮤라밀디펩타이드(muramyldipeptide), 또는 포볼 에스터(phorbol ester)와 같은 면역보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 경구투여용 백신.The vaccine of claim 1, wherein the vaccine further comprises cholera toxin, cholera toxin B subunit, Escherichia coli Heat labile enterotoxin, muramyldipeptide, or phorbol ester. oral administration vaccine comprising an adjuvant such as ester). 제 5항에 있어서, 백신은 면역 보조제를 경구투여용 마이크로스피어의 내부에 또는 마이크로스피어 외상에 첨가하는 것을 특징으로 하는 경구투여용 백신.6. The vaccine for oral administration according to claim 5, wherein the vaccine is added to the inside of the oral microsphere for oral administration or to the microsphere trauma. 제 1항에 있어서, 알긴산염 마이크로스피어는 직경이 0.1 내지 5㎛인 것을 특징으로 하는 경구투여용 백신.2. The vaccine for oral administration according to claim 1, wherein the alginate microspheres have a diameter of 0.1 to 5 mu m. 제 1항에 있어서, 백신은 점막성 면역반응을 일으키는 것을 특징으로 하는 경구투여용 백신.The vaccine for oral administration according to claim 1, wherein the vaccine generates a mucosal immune response. 1. 항원 단백질 또는 항원 단백질과 면역보조제를 포함하는 용액을 알긴산염 용액에 첨가하는 단계;1. adding an antigenic protein or a solution comprising an antigenic protein and an adjuvant to an alginate solution; 2. 단계 1의 항원 단백질 또는 항원 단백질과 면역 보조제-알긴산염 혼합용액에 유화제를 포함하는 n-옥탄올 용액을 첨가하여 균질화하는 단계;2. homogenizing by adding n-octanol solution containing an emulsifier to the antigenic protein or the antigenic protein-immune adjuvant-alginate mixture solution of step 1; 3. 단계 2의 유제를 천천히 교반하면서 염화칼슘이 첨가된 n-옥탄올을 분무기로 첨가하는 단계;3. adding calcium chloride-added n-octanol with a nebulizer while slowly stirring the emulsion of step 2; 4. 단계 3의 유제를 포화시키기 위해 염화칼슘 용액을 첨가하고, 마이크로스피어를 겔화하는 단계;4. Add calcium chloride solution to saturate the emulsion of step 3 and gel the microspheres; 5. 탈수용매를 첨가하여 마이크로스피어를 탈수하는 단계;5. dehydrating the microspheres by adding a dehydrating solvent; 6. 마이크로스피어를 막 필터로 여과하고 알콜로 세척한 후, 진공상태에서 건조하는 단계로 구성되는 제 1항의 경구용 백신의 제조방법.6. The method for preparing the oral vaccine of claim 1, which comprises filtering the microspheres with a membrane filter, washing with alcohol, and then drying in a vacuum. 제 9항에 있어서, 단계 1의 항원 단백질은 바이러스의 외막 단백질 항원, 세균의 표면 단백질 항원, 세균의 균체내 또는 균체외 톡신 항원, 자가면역 유발 단백질 항원, 알레르기 유발 단백질 항원을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제 1항의 경구투여용 백신의 제조방법.10. The method of claim 9, wherein the antigenic protein of step 1 is selected from the group consisting of outer membrane protein antigen of virus, bacterial surface protein antigen, bacterial intracellular or extracellular toxin toxin, autoimmune induced protein antigen, allergenic protein antigen. Method of producing a vaccine for oral administration according to claim 1, which is at least one. 제 9항에 있어서, 단계 1의 항원 단백질은 폐렴구균 항원, 헤모필루스 파라인플루엔자(Hemophilus parainfluenza) 항원, 디프테리아 항원, 백일해 항원, 파상풍 항원, 독성 대장균 항원, 이질 항원, 콜레라 항원, 임균 항원, 인플루엔자 바이러스 항원, B형 간염 항원, 홍역 바이러스 항원, 마진 항원, 풍진 항원을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제 1항의 경구투여용 백신의 제조방법.The antigenic protein of claim 1, wherein the antigenic protein of step 1 is a pneumococcal antigen, Hemophilus parainfluenza antigen, diphtheria antigen, pertussis antigen, tetanus antigen, toxic Escherichia coli antigen, heterologous antigen, cholera antigen, gonococcal antigen, influenza virus antigen The hepatitis B antigen, measles virus antigens, margin antigens, rubella antigens, characterized in that at least one selected from the group comprising a method for producing an oral vaccine of claim 1. 제 9항에 있어서, 단계 1의 항원 단백질은 뉴몰리신(pneumolysin), 뉴라미니다제(pneuraminidase), 오토리신(autolysin), 폐렴구균성 표면 접착 A(Psa A) 또는 폐렴구균성 표면 단백질 A(Psp A)를 포함하는 스트렙토코커스 뉴모니애(Spreptococcus pneumoniae)의 단백질 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제 1항의 경구용 백신의 제조방법.The method of claim 9, wherein the antigenic protein of step 1 is pneumolysin, neuraminidase, autolysin, pneumococcal surface adhesion A (Psa A) or pneumococcal surface protein A Method for producing the oral vaccine of claim 1, characterized in that at least one selected from the proteins of Streptococcus pneumoniae comprising (Psp A). 제 9항에 있어서, 백신은 추가적으로 콜레라 독소(cholera toxin), 콜레라 독소 B 단위체(cholera toxin B subunit), 대장균 장독소(Escherichia coli Heat labile enterotoxin), 뮤라밀디펩타이드(muramyldipeptide), 또는 포볼 에스터(phorbol ester)와 같은 면역보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1항의 경구투여용 백신의 제조방법.10. The vaccine of claim 9, wherein the vaccine further comprises cholera toxin, cholera toxin B subunit, Escherichia coli Heat labile enterotoxin, muramyldipeptide, or phorbol ester. A method for preparing the vaccine for oral administration according to claim 1, comprising an immunoadjuvant such as ester). 제 13항에 있어서, 백신은 면역 보조제를 경구투여용 마이크로스피어의 내부, 또는 마이크로스피어 외상에 첨가하는 것을 특징으로 하는 제 1항의 경구투여용 백신의 제조방법.The method of claim 13, wherein the vaccine is added to the inside of the microspheres for oral administration, or to the microspheres external to the vaccine. 제 9항에 있어서, 단계 1의 알긴산염 용액은 알긴산염의 농도가 1-5 중량%인 것을 특징으로 하는 제 1항의 경구용 백신의 제조방법.10. The method according to claim 9, wherein the alginate solution of step 1 has an alginate concentration of 1-5% by weight. 제 9항에 있어서, 단계 2의 유화제는 1-10 중량 %의 HCO-10, HCO-60, Span-80인 것을 특징으로 하는 제 1항의 경구용 백신의 제조방법.10. The method of claim 9, wherein the emulsifier of step 2 is 1-10% by weight of HCO-10, HCO-60, Span-80. 제 9항에 있어서, 단계 3의 염화칼슘이 첨가된 n-옥탄올은 염화칼슘의 농도가 0.5-2 중량 %인 것을 특징으로 하는 제 1항의 경구용 백신의 제조방법.10. The method according to claim 9, wherein the n-octanol to which calcium chloride is added in step 3 has a calcium chloride concentration of 0.5-2% by weight. 제 9항에 있어서, 단계 4의 염화칼슘 용액은 염화칼슘의 농도가 5-10 중량%인 것을 특징으로 하는 제 1항의 경구용 백신의 제조방법.10. The method according to claim 9, wherein the calcium chloride solution of step 4 has a calcium chloride concentration of 5-10% by weight. 제 9항에 있어서, 단계 5의 탈수용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세톤 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제 1항의 경구용 백신의 제조방법.10. The method of claim 9, wherein the dehydrating solvent of step 5 is selected from methanol, ethanol, isopropanol or acetone. 제 9항에 있어서, 단계 6의 막 필터는 0.10-0.44 μm의 소공을 갖는 폴리테트라플루오로에틸렌(PEFE) 막 필터인 것을 특징으로 하는 제 1항의 경구용 백신의 제조방법.10. The method of claim 9, wherein the membrane filter of step 6 is a polytetrafluoroethylene (PEFE) membrane filter having a pore of 0.10-0.44 μm. 제 9항에 있어서, 마이크로스피어는 직경이 0.1 내지 5㎛인 것을 특징으로 하는 제 1항의 경구용 백신의 제조방법.10. The method according to claim 9, wherein the microspheres have a diameter of 0.1 to 5 mu m.
KR1019990024336A 1999-06-25 1999-06-25 Vaccine compositions using antigens encapsulated within alginate microspheres for oral administration and preparation process thereof KR20010003853A (en)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019990024336A KR20010003853A (en) 1999-06-25 1999-06-25 Vaccine compositions using antigens encapsulated within alginate microspheres for oral administration and preparation process thereof
KR1020017001096A KR20020005563A (en) 1999-06-25 1999-08-19 Vaccine compositions using antigens encapsulated within alginate microspheres for oral administration and preparation process thereof
PCT/KR1999/000466 WO2001000233A1 (en) 1999-06-25 1999-08-19 Vaccine compositions using antigens encapsulated within alginate microspheres for oral administration and preparation process thereof
AU55295/99A AU5529599A (en) 1999-06-25 1999-08-19 Vaccine compositions using antigens encapsulated within alginate microspheres for oral administration and preparation process thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019990024336A KR20010003853A (en) 1999-06-25 1999-06-25 Vaccine compositions using antigens encapsulated within alginate microspheres for oral administration and preparation process thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20010003853A true KR20010003853A (en) 2001-01-15

Family

ID=19595443

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019990024336A KR20010003853A (en) 1999-06-25 1999-06-25 Vaccine compositions using antigens encapsulated within alginate microspheres for oral administration and preparation process thereof
KR1020017001096A KR20020005563A (en) 1999-06-25 1999-08-19 Vaccine compositions using antigens encapsulated within alginate microspheres for oral administration and preparation process thereof

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020017001096A KR20020005563A (en) 1999-06-25 1999-08-19 Vaccine compositions using antigens encapsulated within alginate microspheres for oral administration and preparation process thereof

Country Status (3)

Country Link
KR (2) KR20010003853A (en)
AU (1) AU5529599A (en)
WO (1) WO2001000233A1 (en)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002003398A (en) * 2000-04-17 2002-01-09 Ltt Institute Co Ltd Sustained-release preparation, method for preparing the same, and vaccine therefrom
DE60112073T2 (en) 2000-05-12 2006-04-20 Pharmacia & Upjohn Co. Llc, Kalamazoo VACCINATE COMPOSITION AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF AND METHOD FOR THE VACCINATION OF SWIVELED ANIMALS
KR100406503B1 (en) * 2001-09-25 2003-11-19 한국과학기술연구원 Composition, liquid formulation, and powder formulation for enhancing solubility of PsaA, manufacturing method thereof and vaccine
US7476733B2 (en) * 2005-03-25 2009-01-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Development of a real-time PCR assay for detection of pneumococcal DNA and diagnosis of pneumococccal disease
EP2673050B1 (en) 2011-02-10 2016-03-30 Alfa Biogene International B.V. Plant hsp70 for use in the treatment of food allergy
CN105759036A (en) * 2016-04-11 2016-07-13 新疆农业大学 Detection method and detection kit used for detecting immune antibody of micro-encapsulation escherichia coli oral vaccine
CN107320777A (en) * 2017-07-12 2017-11-07 上海白衣缘生物工程有限公司 A kind of dura mater biological sticking patch and preparation method thereof
KR102196572B1 (en) * 2019-10-10 2020-12-29 대한민국 Composition for Fish Vaccine Containing Alginate Capsule and Preparing Method Thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5900238A (en) * 1995-07-27 1999-05-04 Immunex Corporation Vaccine delivery system
DE19644343A1 (en) * 1996-10-25 1998-04-30 Privates Inst Bioserv Gmbh Taste-neutral microcapsules, process for their preparation and their use
DK0873752T3 (en) * 1997-04-23 2004-05-10 Pfizer Aqueous solvent-based vaccine encapsulation of a bovine herpesvirus type-1 subunit

Also Published As

Publication number Publication date
AU5529599A (en) 2001-01-31
KR20020005563A (en) 2002-01-17
WO2001000233A1 (en) 2001-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6019982A (en) Mutant enterotoxin effective as a non-toxic oral adjuvant
US6562352B1 (en) Vaccine compositions for mucosal delivery
KR100353496B1 (en) Hydrogel Microencapsulated Vaccine
KR100188836B1 (en) Hydroxyapatite-antigen conjugates and methods for generating a poly-ig immune response
Kim et al. Oral immunization with Helicobacter pylori‐loaded poly (d, l‐lactide‐co‐glycolide) nanoparticles
JP5344558B2 (en) Mucosal vaccine using cationic nanogel
KR101100237B1 (en) Oral recombinant helicobacter pylori vaccine and preparing method thereof
EP1395648B1 (en) Methods for binding acma-type protein anchor fusions to cell-wall material of micro-organisms
FR2732605A1 (en) COMPOSITION FOR INDUCING MUCOSAL IMMUNE RESPONSE
AU771205B2 (en) Novel, non-antigenic, mucosal adjuvant formulation which modulates the effects of substances, including vaccine antigens, in contact with mucosal body surfaces
TW200416042A (en) Improvements in or relating to vaccines
US20050260225A1 (en) Intranasal recombinant Salmonella vaccine encoding heterologous polysaccharide antigens
AU2002314626A1 (en) Methods for binding AcmA-type protein anchor fusions to cell-wall material of micro-organisms
Gan et al. Fight bacteria with bacteria: Bacterial membrane vesicles as vaccines and delivery nanocarriers against bacterial infections
KR20010003853A (en) Vaccine compositions using antigens encapsulated within alginate microspheres for oral administration and preparation process thereof
US9310381B2 (en) Engineered type IV pilin of Clostridium difficile
Shahbazi et al. Design and fabrication of a vaccine candidate based on rOmpA from Klebsiella pneumoniae encapsulated in silk fibroin-sodium alginate nanoparticles against pneumonia infection
Riedmann et al. Effectiveness of engineering the nontypeable Haemophilus influenzae antigen Omp26 as an S-layer fusion in bacterial ghosts as a mucosal vaccine delivery
KR102458982B1 (en) Adjuvants
RU2818278C2 (en) Pneumococcal surface proteins
US20030161889A1 (en) Vaccines against diseases caused by enteropathogenic organisms using antigens encapsulated within biodegradable-biocompatible microspheres
TW201138814A (en) Conjugates of polysaccharide and E. coli heat-labile toxin, their use and preparation method
WO2020203731A1 (en) Pneumococcal surface proteins
JP4944335B2 (en) Pharmaceutical composition for administration to the mucosal surface
Lintermans et al. Identification of the F17 gene cluster and development of adhesion blockers and vaccine components

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination