KR20000015939A

KR20000015939A - Monitoring hybridization during pcr

Info

Publication number: KR20000015939A
Application number: KR1019980709495A
Authority: KR
Inventors: 칼 티. 위터; 커크 엠. 리리; 랜디 피. 라스센
Original assignee: 프레드한 아룬디프 에스; 유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션
Priority date: 1996-06-04
Filing date: 1997-06-04
Publication date: 2000-03-15
Also published as: KR100479789B1

Abstract

PURPOSE: A method for monitoring hybridization during polymerase chain reaction (PCR) are provided to decrease the total time required for PCR and analysis, and to improve the quality of PCR. CONSTITUTION: The method comprises amplifying the target sequence of a sample by PCR with rapid thermal cycling in the presence of two nucleic acid probes capable of hybridizing in the proximity of the target sequence where the probes is double stranded-specific DNA dyes, one of the probes is labeled with an acceptor of a fluorescence resonance energy transfer pair and the other is labeled with a donor; activating the sample with the light of wavelength absorbed by the donor; detecting the light generated by the fluorescence resonance energy transfer pair; and monitoring the fluorescence generated by the fluorescence resonance energy transfer pair versus temperature to obtain a melting curve and annealing curve. The structure and position of the DNA melting curve is a function of GC/AT ratio, length and sequence, thereby the amplified DNA can be quantified, its purity can be determined and only the desired produce can be separated.

Description

ＰＣＲ하는 동안에 하이브리드반응의 모니터 방법How to Monitor Hybrid Reactions During PCR

폴리메라제 사슬 연쇄 반응(PCR)은 분자 생물학에서 가장 기초적인 것으로 임상 실험실에서 제일먼저 실행하는 분자 기술이다. 이와 같이 PCR의 유용성 및 대중성에도 불구하고, 현재 PCR의 이해가 상당히 진보되지 않은 상태이다. 성공적으로 증폭을 시키기 위한 적절한 조건에 대해서는 시행착오과정으로 확립할 수 있고, 최적의 조건은 실험에 의해 이루어진다. 당업자라도 이 공정의 이해 또는 예상 가설의 이해하지 않고도 강력한 기술을 이용할 수 있다.Polymerase chain reaction (PCR) is the most basic in molecular biology and is the first molecular technique to be implemented in clinical laboratories. As such, despite the usefulness and popularity of PCR, the current understanding of PCR has not advanced significantly. Appropriate conditions for successful amplification can be established by trial and error, and optimal conditions are achieved by experiment. One skilled in the art can use powerful techniques without understanding this process or understanding the hypothesis.

PCR은 샘플의 온도 과정에 의해 이루어지는 것인데, DNA를 변성시키고(분리); 특정 프라이머에 부착시키고(어닐링); 복제(연장)가 일어나도록 한다. PCR의 한 과정은 통상 2 내지 8분이 소요되는데, 30회 변환 과정의 증폭을 위해서는 1 내지 4시간이 요구된다. 대부분의 PCR 기구에서 샘플 온도 반응은 변성 및 어닐링에 요구되는 시간과 비교를 할 때 매우 느리다. PCR에서 물리적인 반응(변성 및 어닐링)과 효소적인 반응(연장)은 매우 신속하게 일어난다. PCR 증폭 시간은 1시간에서 15분 이내로 줄일 수 있다. 참고문헌 미국 출원 08/537,612(1995년 10월 2일자 출원)에서는 신속한 과정 시스템에 대해 상술하고 있다. 신속한 변환 과정 기술은 모세관 튜브와 같은 샘플을 포함하는 용기의 용적에 비해 표면적이 큰 용기에서 샘플의 신속한 온도 반응 및 온도 상동성에 의해 가능하다. 추가 정보는 C.T. Witter, G.B. Reed, K.M. Ririe, Rapid cycle DNA amplification in K.B. Mullis. F. Ferre R.A. Gibbs. The polymerase chain reaction. Birkhauser. Boston. 174-181(1994). 개선된 온도 상동성으로 PCR에서의 온도 및 시간에 대한 요구가 더 명확하고 더 이해를 하기 쉽도록 한다. 또한 개선된 온도 상동성으로 증폭하는 동안에 PCR을 모니터하는데 이용되는 임의 분석학적 기술의 정확성을 증가시킨다.PCR is achieved by the temperature process of a sample, which denatures (isolated) DNA; Attached to a specific primer (annealed); Allow replication to take place. One procedure of PCR usually takes 2 to 8 minutes, and 1 to 4 hours are required for amplification of 30 conversion procedures. In most PCR instruments the sample temperature response is very slow compared to the time required for denaturation and annealing. In PCR, physical reactions (denaturation and annealing) and enzymatic reactions (extension) occur very quickly. PCR amplification time can be reduced from 1 hour to 15 minutes. Reference US application 08 / 537,612, filed Oct. 2, 1995, describes a rapid process system. Rapid conversion process technology is possible due to the rapid temperature response and temperature homology of the sample in a container having a large surface area relative to the volume of the container containing the sample, such as a capillary tube. For further information, see C.T. Witter, G.B. Reed, K.M. Ririe, Rapid cycle DNA amplification in K.B. Mullis. F. Ferre R.A. Gibbs. The polymerase chain reaction. Birkhauser. Boston. 174-181 (1994). Improved temperature homology makes the requirements for temperature and time in the PCR clearer and easier to understand. It also increases the accuracy of any analytical technique used to monitor PCR during amplification with improved temperature homology.

형광측정은 감응성이 있고, 분자생물학에서 많은 부분에 이용을 할 수 있는 다용도 기술이다. 수년간 에티디움 브롬화물을 이용하여 겔 전기영동에 의해 분리된 핵산의 크기별 분포를 볼 수 있었다. 겔은 통상 UV 광에 투명하고, 이중 쇄의 핵산이 붉은 형광으로 관찰된다. 특히, 에티디움 브롬화물은 흔히 증폭이 완료된 후에 PCR 산물을 분석하는데 이용된다. 또한, EPA 0 640 828 A1(Higuchi & Watson)에서는 증폭하는 동안에 에티디움 브롬화물을 이용하여 각 변환 과정에서의 형광을 측정하여 이중 쇄 DNA의 양을 모니터 한다. 형광 강도는 온도에 역반응으로 상승되고 감소되는데, 어닐링/연장 온도(50℃)에서는 최대가 되고, 변성 온도(94℃)에서는 최저가 된다. 최대 형광을 각 변환 과정에서 얻어 이로써 DNA의 양을 측정한다. Higuchi & Watson 출원에서는 형광을 이용하여 하이브리드 반응을 모니터 하는 것에 대해서는 언급이 없고, 하이브리드 반응 범위를 따르는 상이한 온도 범위에서 형광을 얻는 것에 대해서도 언급이 없다. 또한, Higuchi & Watson은 PCR 생성물의 확인 또는 정량화를 위해 온도에 따른 PCR 산물의 하이브리드 반응을 이용한다고 제시하지 못하였다.Fluorescence is a versatile technique that is sensitive and can be used in many areas of molecular biology. For several years, the distribution of nucleic acids separated by gel electrophoresis using ethidium bromide can be seen. Gels are usually transparent to UV light and double stranded nucleic acids are observed with red fluorescence. In particular, ethidium bromide is often used to analyze PCR products after amplification is complete. EPA 0 640 828 A1 (Higuchi & Watson) also monitors the amount of double-stranded DNA by measuring the fluorescence in each conversion process using ethidium bromide during amplification. The fluorescence intensity rises and decreases in reverse reaction with temperature, being maximum at the annealing / extension temperature (50 ° C.) and lowest at the modification temperature (94 ° C.). Maximum fluorescence is obtained during each conversion, thereby measuring the amount of DNA. The Higuchi & Watson application does not mention the use of fluorescence to monitor hybrid reactions, nor does it mention obtaining fluorescence at different temperature ranges along the hybrid reaction range. Higuchi & Watson also did not suggest using a hybrid reaction of PCR products with temperature for identification or quantification of PCR products.

그러나, Higuchi & Watson 출원에서는 미국 특허 5,210,015(Gelfand)에서 상술된 것과 같이 특정 DNA 폴리메라제의 5'-엑소뉴클레아제 활성에 의해 하이브리드하였을 때, 형광을 발생시키는 이중-라벨된 프로브 시스템을 포함하는 다른 형광단(fluorophore)을 이용한다고 명시하고 있다. 이들 프로브에서 관찰되는 형광은 두 개의 형광단사이에 프로브의 가수분해에 따라 달라진다. PCR 생성물의 양은 각 변환 과정에서의 형광을 측정하여 결정을 한다. 이들 프로브의 하이브리드 반응은 가수분해가 필수적인 것으로 보이나, 하이브리드 반응이 아닌 프로브의 가수분해로 인하여 주로 형광 시그날이 발생되는데, 이때 양쪽 단부에 형광 염료를 가지는 올리고뉴클레오티드는 PCR 생성물의 감지 및 핵산의 하이브리드을 감지하는데 유용한 수냉(quenched) 프로브 시스템을 제공한다(K.J. Livak et al., 4PCR Meth. Appl. 357-362(1995)). PCR 생성물에 서열의 변화를 확인하는데 온도에 따른 형광을 가지는 프로브 하이브리드 반응을 준수한다는 내용은 없었다.However, the Higuchi & Watson application includes a double-labeled probe system that generates fluorescence when hybridized by the 5'-exonuclease activity of certain DNA polymerases as detailed in US Pat. No. 5,210,015 to Gelfand. To use another fluorophore. The fluorescence observed in these probes depends on the hydrolysis of the probe between the two fluorophores. The amount of PCR product is determined by measuring the fluorescence in each conversion process. Although the hybridization of these probes seems to be necessary for hydrolysis, the fluorescence signal is generated mainly due to the hydrolysis of the probe, not the hybrid reaction, wherein oligonucleotides having fluorescent dyes at both ends detect PCR products and hybridization of nucleic acids. To a quenched probe system useful for use (KJ Livak et al., 4 PCR Meth. Appl. 357-362 (1995)). There was no indication that the PCR product conformed to probe hybrid reactions with fluorescence over temperature to confirm the change of sequence.

확인용으로 상보 쇄 핵산의 특정한 하이브리드 반응이 많은 상이한 포맷으로 개발되었다. 예를 들면, 제한 효소로 절단한 후에, 게놈 DNA를 크기별로 분류를 하고 서던 블랏팅을 이용하여 프로브에 하이브리드시킨다. 또 다른 예를 들면, 한 개 염기 돌연변이는 대립형질-특이적인 올리고뉴클레오티드와 "점 블랏"에 의해 감지할 수 있다. 일반적으로, 한 개 온도에서 필수적인 구별을 위해서는 하이브리드 반응을 수분 내지 수 시간 동안 실시한다. 또는, 형광 기술을 이용하여 온도를 변화시키면서 하이브리드 반응의 정도를 동적으로 모니터 한다. 예를 들면, 형광 용융 곡선을 이용하여 하이브리드 반응을 모니터한다(L.E. Morrison & L.M. Stols, 용액에서 DNA 하이브리드 반응의 역학적인 측정 및 감응성이 있는 형광을 이용한 열역학적인 측정, 32 Biochemistry 3095-3104, 1993). 온도 스캔 비율은 형광 측정 큐벳의 높은 열 부피로 인하여 통상 시간당 10℃ 또는 그 이하로 한다.Certain hybrid reactions of complementary stranded nucleic acids have been developed in many different formats for identification. For example, after digestion with restriction enzymes, genomic DNA is sorted by size and hybridized to the probe using Southern blotting. In another example, one base mutation can be detected by an "point blot" with an allele-specific oligonucleotide. In general, the hybrid reaction is carried out for a few minutes to several hours for the necessary distinction at one temperature. Alternatively, the degree of hybrid reaction can be dynamically monitored while changing temperature using fluorescence techniques. For example, fluorescence melting curves are used to monitor hybrid reactions (LE Morrison & LM Stols, dynamic measurement of DNA hybrid reactions in solution and thermodynamic measurements using sensitive fluorescence, 32 Biochemistry 3095-3104, 1993). . The temperature scan rate is usually 10 ° C. or less per hour due to the high thermal volume of the fluorescence measuring cuvette.

현재의 하이브리드반응을 모니터하는 방법은 상당한 시간을 요한다. 하이브리드 반응이 몇 시간이 아닌 수초 내에 이루어진다면, 비록 빠른 PCR 변환 과정동안에라도 PCR 증폭하는 동안에 하이브리드 반응을 모니터할 수 있다. PCR 동안에 하이브리드 반응을 모니터 하는 것은 많은 부분에서 이용을 할 수 있는데(이후에 상세히 설명을 함), 예를 들면, 생성물의 확인 및 정량, 서열의 변화 감지, 형광 피이드백에 의해 온도 변환 과정의 자동 제어 등을 포함한다.The method of monitoring current hybrid reactions takes considerable time. If the hybrid reaction occurs in seconds rather than hours, the hybrid reaction can be monitored during PCR amplification, even during rapid PCR conversion. Monitoring hybrid reactions during PCR can be used in many areas (discussed in detail later), for example to identify and quantify products, detect changes in sequences, and automate the temperature conversion process by fluorescence feedback. Control and the like.

전술한 것과 같이, 선행기술은 온도 변환 과정을 매우 느리게 경험적으로 실행을 하였다. 하이브리드 반응을 이용하여 PCR 생성물의 분석이 필요하면, 추가 시간을 소요하는 단계가 있어야 한다. 따라서, PCR 동안에 하이브리드 반응을 모니터 하는 방법과 반응이 일어나는 동안에 즉, 샘플의 조작 없이 온도 변환 과정동안에 또는 직후에 반응을 분석하는 방법을 본 기술분야에 제공을 하는 것은 당 분야에 상당한 진보를 한 것이다. PCR 동안에 하이브리드 반응을 모니터함으로써, PCR 작업을 할 수 있는 기초 원리를 따르고, 이를 이용하여 증폭하는 동안에 반응을 분석하고 최적화할 수 있다.As mentioned above, the prior art empirically performed the temperature conversion process very slowly. If analysis of the PCR product using a hybrid reaction is required, there must be an additional time step. Thus, it is a significant advance in the art to provide the art with methods for monitoring hybrid reactions during PCR and for analyzing the reactions during reactions, i.e. during or immediately after temperature conversion without manipulation of the sample. . By monitoring hybrid reactions during PCR, you can follow the basic principles of PCR work and use them to analyze and optimize your reactions during amplification.

발명의 요약Summary of the Invention

본 발명의 목적은 PCR 동안에 하이브리드 반응 생성물을 모니터 하는 이중쇄-특이적인 DNA 염료를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide double chain-specific DNA dyes that monitor hybrid reaction products during PCR.

본 발명의 목적은 형광 용융 곡선을 이용하여 PCR-증폭된 생성물을 확인하는 시스템을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a system for identifying PCR-amplified products using fluorescence melting curves.

본 발명의 목적은 이중-쇄 특이적인 DNA 염료로 PCR 정량화의 감응성을 개선하는 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for improving the sensitivity of PCR quantification with double-chain specific DNA dyes.

본 발명의 또 다른 목적은 이중 쇄-특이적인 DNA 염료로 감지된 비-특이적인 증폭을 교정하기 위해 용융 곡선에 의한 PCR에 의해 증폭된 특정 생성물의 양을 결정하는 방법을 제공한다.Another object of the present invention is to provide a method for determining the amount of a specific product amplified by PCR by a melting curve to correct for non-specific amplification detected with double chain-specific DNA dyes.

본 발명의 또 다른 목적은 이중 쇄-특이적인 염료와 상이한 PCR 생성물 관련 양을 결정하는 방법을 제공한다.Another object of the present invention is to provide a method for determining the amount of PCR product relative to a double chain-specific dye.

본 발명의 또 다른 목적은 이중-쇄 특이적인 DNA 염료 존재89하에, 생성물의 재-어닐링 역학으로 생성물을 정량화하는 방법을 제공한다.Another object of the present invention is to provide a method for quantifying a product by re-annealing the product in the presence of a double-chain specific DNA dye.

본 발명의 또 다른 목적은 프라이머/프로브 하이브리드 반응을 모니터하기 위해 신규의 공명 에너지 전달 쌍을 제공하는 것이다.It is yet another object of the present invention to provide novel resonance energy transfer pairs for monitoring primer / probe hybrid reactions.

본 발명의 또 다른 목적은 공명 에너지 전달 쌍을 이용하여 생성물에 프로브를 다시 어닐링시켜 생성물을 정량화하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for quantifying a product by reannealing the probe to the product using a resonance energy transfer pair.

본 발명의 또 다른 목적은 PCR 증폭하는 동안 각 변환 과정에서 프로브의 하이브리드으로 인한 형광에 따라 시작 주형 복제 수를 결정하는 방법을 제공한다.Another object of the present invention is to provide a method for determining the starting template replication number according to fluorescence due to hybridization of probes during each conversion process during PCR amplification.

본 발명의 또 다른 목적은 PCR 프라이머의 내부에 하이브리드되는 두 개의 라벨된 프로브간에 공명 에너지 전달에 의해 PCR 생성물의 상동 감지에 대한 시스템을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a system for the detection of homology of PCR products by resonance energy transfer between two labeled probes that hybridize inside a PCR primer.

본 발명의 또 다른 목적은 PCR 프라이머의 내부에 하이브리드되는 한 개의 라벨된 프로브와 한 개의 라벨된 프라이머간에 공명 에너지 전달에 의해 PCR 생성물의 상동 감지에 대한 시스템을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a system for the detection of homology of PCR products by resonance energy transfer between one labeled probe and one labeled primer hybridized inside the PCR primer.

본 발명의 또 다른 목적은 공명 에너지 전달 및 프로브 용융 곡선에 의해 PCR 프라이머의 내부에 서열 변화를 감지하는 시스템을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a system for detecting sequence changes inside PCR primers by resonance energy transfer and probe melting curves.

본 발명의 또 다른 목적은 프로브 용융 곡선에 의해 상이한 PCR 생성물의 관련 양을 정량화하는 시스템을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a system for quantifying the relevant amounts of different PCR products by probe melting curves.

본 발명의 또 다른 목적은 변환 과정 수에 대해 형광을 나타낸 곡선으로 시작 주형 복제 수를 결정하는 방법을 제공하는 것이다.It is yet another object of the present invention to provide a method for determining the starting template copy number from a curve fluorescence with respect to the number of conversion processes.

본 발명의 또 다른 목적은 PCR을 신속하게 실행을 하고, 지속적으로 반응을 모니터하고, 반응이 진행되는 동안에 반응 변수를 조절하는 방법 및 시스템을 제공하는 것이다.It is yet another object of the present invention to provide a method and system for rapidly performing PCR, continuously monitoring the reaction, and adjusting the response variable during the reaction.

본 발명의 또 다른 목적은 합성 핵산 유사체 또는 유도체, 가령, 펩티드 핵산(PNA) 등을 핵산 프라이머에 대체하는 것을 제공하는데 단, 이 대체물은 형광 화합물로 라벨되어야 한다.Another object of the present invention is to provide for the replacement of synthetic nucleic acid analogs or derivatives, such as peptide nucleic acids (PNAs), with nucleic acid primers, provided that the replacements are labeled with fluorescent compounds.

이와 같은 목적과 본 발명의 장점은 상세한 설명 및 청구범위에서 이해를 할 수 있을 것이다.Such objects and advantages of the invention will be understood from the description and the claims.

본 발명은 특히, 선행기술에 비해 PCR 증폭 및 분석에 요구되는 전체 시간을 감소시키면서 동시에 증폭 조건을 최적화하여 반응의 질을 상당히 증가시킬 수 있다.In particular, the present invention can significantly increase the quality of the reaction by simultaneously optimizing the amplification conditions while reducing the overall time required for PCR amplification and analysis as compared to the prior art.

본 발명은 DNA 증폭에 대한 지속적인 형광 모니터를 하는 방법 및 이용 방법을 제공한다. 필요한 기구는 여러 가지 형광 기술에 의해 지속적으로 DNA 증폭을 모니터하기 위해 신속한 온도 변환 과정을 제공하는 구조를 가진 광학 요소들을 복합시킨다. 한 가지 구체예로써, 형광은 한 가지 샘플 또는 모든 샘플이 동시에 신속한 열 처리 과정을 거칠 수 있는 회전하는 컨베이어에 있는 다수의 샘플로부터 지속적으로 얻을 수 있다. 또한, 연합된 기구에 대한 정보는 전술한 미국 출원에서 찾을 수 있다.The present invention provides a method and method of using a continuous fluorescence monitor for DNA amplification. The necessary instruments combine optical elements with structures that provide a rapid temperature conversion process to continuously monitor DNA amplification by various fluorescence techniques. In one embodiment, the fluorescence can be obtained continuously from multiple samples in a rotating conveyor where one or all samples can undergo a rapid heat treatment process simultaneously. In addition, information on the associated organization can be found in the above-mentioned US application.

본 발명의 한 특징에 따르면, DNA 증폭하는 동안에 형광은 1) 이중 쇄-특이적인 염료 SYBR Green 1; 2) 하이브리드 반응 프로브가 있는 Cy5^TM또는 Cy5.5^TM으로 형광물질의 공명 에너지 전달에 의해 모니터할 수 있다. 한 번의 변환 과정에서 수득되는 형광 데어터를 이용하면 시작 주형 복제 수를 정량화할 수 있다.According to one feature of the invention, the fluorescence during DNA amplification is 1) double chain-specific dye SYBR Green 1; 2) Cy5 ^™ or Cy5.5 ^™ with hybrid reaction probes can be monitored by the resonance energy transfer of the phosphor. The fluorescence data obtained in one conversion process can be used to quantify the number of starting template replicas.

또한, 한 번의 변환 과정에서 형광을 측정하는 것과는 대조적으로, 본 발명의 구체예에서는 각 변환 과정을 통하여 지속적으로 온도, 시간, 형광을 모니터 하여, 3차원 쇄를 만들 수 있다. 이와 같은 3-차원 쇄는 시간에 대한 온도 비율, 시간에 대한 형광, 온도에 대한 형광 곡선도 정리할 수 있다. 하이브리드 반응 프로브에서 온도에 대한 형광 곡선을 이용하면 생성물에 있는 서열 변화를 감지할 수 있다. 이와 같은 서열 변화는 돌연변이 또는 다형성에서는 자연적인 것이나 PCR을 정량화하는 만들어지는 또 다른 주형에서는 인공적인 것이다.In addition, in contrast to measuring fluorescence in one conversion process, embodiments of the present invention can continuously monitor temperature, time, and fluorescence through each conversion process to create a three-dimensional chain. Such a three-dimensional chain can also arrange the temperature ratio over time, the fluorescence over time, and the fluorescence curve over temperature. Fluorescence curves for temperature in hybrid reaction probes can be used to detect sequence changes in the product. Such sequence changes are natural in mutations or polymorphisms, but artificial in another template made to quantify PCR.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 이중 쇄-특이적인 DNA에 특이적인 염료를 이용하여 형광을 모니터하여, PCR 동안에 생성물 용융 곡선을 얻을 수 있다. 생성물의 분해 온도동안에 열 사이클러(cycler)를 가열할 때, 온도에 대한 형광을 플롯 하면 PCR 생성물의 용융 곡선을 얻을 수 있다. 이와 같은 DNA 용융 곡선의 모양 및 위치는 GC/AT 비율, 길이, 서열에 대한 함수로써, 이를 이용하면 용융 온도에서 2℃이하로 분리되는 증폭 생성물을 구별할 수 있다. 프라이머 이량체를 포함하는 원하지 않는 생성물가운데에서 원하는 생성물을 분리해낼 수 있다. 용융 곡선을 분석하면 정량적인 PCR 범위를 연장시키고, 다수의 증폭에서 상이한 생성물을 분리해낼 수 있다. 이중 쇄 염료를 이용하여, 각 변환 과정 내에 생성물의 변성, 다시 어닐링, 연장 등을 할 수 있다. 형광을 지속적으로 모니터 하면, 용융 곡선을 얻을 수 있고, 온도 변환 과정동안에 생성물의 어닐링 곡선을 얻을 수 있다.According to another feature of the invention, fluorescence can be monitored using dyes specific for double chain-specific DNA to obtain product melting curves during PCR. When heating the thermal cycler during the decomposition temperature of the product, plotting the fluorescence versus temperature yields a melting curve of the PCR product. The shape and position of such DNA melting curves are a function of the GC / AT ratio, length, and sequence, which can be used to distinguish amplification products separated below 2 ° C. at the melting temperature. The desired product can be isolated in the middle of unwanted products including primer dimers. Analyzing the melt curve can extend the quantitative PCR range and isolate different products in multiple amplifications. Double chain dyes can be used to denaturate, anneal, extend, etc. the product within each conversion process. By continuously monitoring the fluorescence, a melting curve can be obtained and an annealing curve of the product during the temperature conversion process.

본 발명은 30분 이내에, 적절하게는 15분 이내에, 가장 적절하게는 10분 이내에 형광을 모니터 함으로써 증폭 및 분석을 복합한 신속한 과정의 PCR을 위한 시약 및 방법을 제공한다.The present invention provides reagents and methods for rapid process PCR combining amplification and analysis by monitoring fluorescence within 30 minutes, suitably within 15 minutes, and most preferably within 10 minutes.

생물학적 시료에서 표적 DNA 서열을 분석하는 방법은 다음과 같다;Methods for analyzing target DNA sequences in biological samples are as follows;

- 표적 서열의 인접 부분에 하이브리드할 수 있는 두 개의 핵산 프로브 존재 하에, 폴리메라제 연쇄 반응법에 의해 표적 서열을 증폭시키고, 이때 두 개의 프로브중 한 개는 수용 형광단으로 라벨링하고, 나머지 프로브는 형광 에너지 전달 쌍의 제공 형광단으로 라벨링하여 표적 서열과 두 개의 프로브가 하이브리드하는 동안에 제공 형광단과 수용 형광단은 서로 25개 뉴클레오티드안에 있고, 폴리메라제 연쇄 반응은 생물학적 시료에 표적이 되는 핵산 서열에 대한 프라이머와 열에 안정한 폴리메라제를 첨가하고, 변성 온도와 연장 온도사이에서 시료에 열처리를 변환하는 것으로 구성되고;In the presence of two nucleic acid probes capable of hybridizing to adjacent portions of the target sequence, the target sequence is amplified by polymerase chain reaction, where one of the two probes is labeled with a recipient fluorophore and the other probe is While the target sequence and the two probes hybridize by labeling the donor fluorophore of the fluorescent energy transfer pair, the donor fluorophore and the accepting fluorophore are within 25 nucleotides of each other, and the polymerase chain reaction is performed on the nucleic acid sequence targeted to the biological sample. Adding a primer and a heat stable polymerase, and converting the heat treatment to the sample between denaturation temperature and extension temperature;

- 제공 형광단에 의해 흡수되는 파장에서 빛으로 생물학적 시료를 여기시키고, 형광단 에너지 전달 쌍으로부터 발생되는 빛을 감지하는 것으로 구성된다.Excitation of the biological sample with light at a wavelength absorbed by the donor fluorophore and sensing of light generated from the fluorophore energy transfer pair.

생물학적 시료의 표적 DNA 서열을 분석하는 방법은 다음과 같다;Methods for analyzing target DNA sequences of biological samples are as follows;

- 제공 형광단에 의해 흡수되는 파장에서 빛으로 생물학적 시료를 여기시키고, 형광단 에너지 전달 쌍으로부터 발생되는 빛을 감지하고; 그리고Exciting the biological sample with light at a wavelength absorbed by the providing fluorophore and sensing light generated from the fluorophore energy transfer pair; And

- 형광 에너지 전달 쌍으로부터 온도에 따른 형광을 모니터하는 것으로 구성된다.Monitoring fluorescence with temperature from the fluorescence energy transfer pair.

생물학적 시료에서 표적 핵산의 폴리메라제 연쇄 반응 증폭의 실제 시간을 모니터하는 방법은 다음과 같다;Methods of monitoring the actual time of amplification of the polymerase chain reaction of a target nucleic acid in a biological sample are as follows;

a) 두 가지 핵산 프라이머와 핵산 프로브 효과량을 생물학적 시료에 첨가하고, 이때 프라이머중 하나와 프로브는 수용 형광단과 제공 형광단으로 구성된 형광 에너지 전달 쌍의 한 개 구성원으로 각각 라벨링하고, 이때 라벨된 프로브는 라벨된 프라이머의 15개 뉴클레오티드내에 표적 핵산 서열의 증폭된 복제본에 하이브리드하고;a) Add two nucleic acid primers and an effective amount of nucleic acid probe to the biological sample, wherein one of the primers and the probe are labeled with one member of a fluorescence energy transfer pair consisting of a receiving fluorophore and a providing fluorophore, respectively, wherein the labeled probe Hybridizes to an amplified copy of the target nucleic acid sequence within 15 nucleotides of the labeled primer;

b) 폴리메라제 연쇄 반응법에 의해 표적 핵산 서열을 증폭시키고;b) amplifying the target nucleic acid sequence by polymerase chain reaction;

c) 제공 형광단이 흡수하는 선택된 파장의 빛을 생물학적 시료에 조사하고; 그리고c) irradiating the biological sample with light of a selected wavelength absorbed by the providing fluorophore; And

d) 시료의 형광 방출을 감지하는 것으로 구성된다.d) sensing the fluorescence emission of the sample.

생물학적 시료의 표적이 되는 핵산 서열을 증폭시키는 개선된 방법은 다음과 같다;Improved methods of amplifying a nucleic acid sequence targeted by a biological sample are as follows;

a) 핵산에 결합을 하는 형광물질 전제의 효과량을 생물학적 시료에 첨가하고;a) adding to the biological sample an effective amount of a fluorescent substance whole which binds to the nucleic acid;

b) 폴리메라제 연쇄 반응을 이용하여 표적 핵산을 증폭시키는데, 이는 시작 결정된 온도와 시간 변수를 이용하여, 생물학적 시료에 열처리 변환 과정을 거치게 하고, 그 다음b) Amplifying the target nucleic acid using a polymerase chain reaction, which causes the biological sample to undergo a heat treatment conversion process, using the temperature and time variables determined at the beginning.

(i) 폴리메라제 연쇄 반응동안에 형광물질 전체가 흡수하는 선택된 파장의 빛을 생물학적 시료에 비추고;(i) illuminating a biological sample with light of a selected wavelength absorbed by the entirety of the phosphor during the polymerase chain reaction;

(ii) 샘플에서 방출되는 형광을 모니터하여, 폴리메라제 연쇄 반응의 시간 변수와 적절한 온도를 결정하고;(ii) monitoring the fluorescence emitted from the sample to determine the time variable and appropriate temperature of the polymerase chain reaction;

(iii) 형광에 따른 초기 온도와 시간 변수를 조정하는 것으로 구성된다.(iii) adjusting the initial temperature and time variables according to fluorescence.

한 구체예에서, 형광물질 전체는 이중 쇄에 특이적인 핵산 결합 염료로 구성되고, 또 다른 구체예에서는 형광물질 전체는 표적이 되는 핵산 서열에 하이브리드할 수 있는 형광 라벨된 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성된다.In one embodiment, the entirety of the fluorescent material consists of nucleic acid binding dyes specific for the double chain, and in yet another embodiment the entirety of the fluorescent material consists of fluorescently labeled oligonucleotide probes capable of hybridizing to the target nucleic acid sequence.

생물학적 시료의 표적이 되는 핵산 서열을 감지하는 방법은 다음과 같다;Methods for detecting nucleic acid sequences targeted by biological samples are as follows;

a) 표적 핵산 서열에 하이브리드되는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프로브 효과량을 생물학적 시료에 첨가를 하고, 프로브중 하나는 수용 형광단으로 라벨링하고, 다른 프로브는 형광 에너지 전달 쌍의 제공 형광단으로 라벨링하고, 제공 형광단의 방출 스펙트럼과 수용 형광단의 흡수 스펙트럼의 겹치는 정도는 25%이하이고, 수용 형광단은 100,000M^-1㎝^-1의 흡광계수를 가지고, 두 개의 프로브가 하이브리드할 때, 제공 형광단과 수용 형광단은 서로 25개 뉴클레오티드범위내에 있고;a) add an effective amount of a pair of oligonucleotide probes hybridized to a target nucleic acid sequence to a biological sample, one of the probes labeled with a receiving fluorophore, the other probe a labeled fluorophore of a fluorescent energy transfer pair, The overlapping degree of the emission spectrum of the providing fluorophore and the absorption spectrum of the receiving fluorophore is 25% or less, and the receiving fluorophore has an extinction coefficient of 100,000 M ⁻¹ cm ⁻¹ , when the two probes hybridize, Receptive fluorophores are within 25 nucleotides of each other;

b) 제공 형광단이 흡수하는 선택된 파장의 빛을 생물학적 시료에 조사하고;b) irradiating the biological sample with light of a selected wavelength absorbed by the providing fluorophore;

c) 생물학적 시료로부터 발생되는 형광을 측정하는 것으로 구성된다.c) measuring fluorescence generated from biological samples.

공명 에너지 전달 쌍을 예로 들면 제공자로는 플로레신, 수용자로는 Cy5 또는 Cy5.5로 구성된다.Resonant energy transfer pairs, for example, consist of floresin as donor and Cy5 or Cy5.5 as acceptor.

생물학적 시료에서 표적이 되는 핵산 서열의 폴리메라제 연쇄 반응을 모니터하는 방법은 다음과 같다;The method of monitoring the polymerase chain reaction of a target nucleic acid sequence in a biological sample is as follows;

- 표적 서열의 인접 부분에 하이브리드할 수 있는 두 개의 핵산 프로브 존재 하에, 폴리메라제 연쇄 반응 법에 의해 표적 서열을 증폭시키고, 이때 두 개의 프로브중 한 개는 수용 형광단으로 라벨링하고, 나머지 프로브는 형광 에너지 전달 쌍의 제공 형광단으로 라벨링하여 표적 서열과 두 개의 프로브가 하이브리드하는 동안에 제공 형광단과 수용 형광단은 서로 25개 뉴클레오티드안에 있고, 폴리메라제 연쇄 반응은 생물학적 시료에 표적이 되는 핵산 서열에 대한 프라이머와 열에 안정한 폴리메라제를 첨가하고, 변성 온도와 연장 온도사이에서 시료에 열처리를 변환하는 것으로 구성되고;In the presence of two nucleic acid probes capable of hybridizing to adjacent portions of the target sequence, the target sequence is amplified by polymerase chain reaction, where one of the two probes is labeled with a recipient fluorophore and the other probe is While the target sequence and the two probes hybridize by labeling the donor fluorophore of the fluorescent energy transfer pair, the donor fluorophore and the accepting fluorophore are within 25 nucleotides of each other, and the polymerase chain reaction is performed on the nucleic acid sequence targeted to the biological sample. Adding a primer and a heat stable polymerase, and converting the heat treatment to the sample between denaturation temperature and extension temperature;

- 형광 에너지 전달 쌍에서 나오는 온도에 따른 형광을 모니터 하는 것으로 구성된다.It consists of monitoring the fluorescence according to the temperature from the fluorescence energy transfer pair.

생물학적 시료에서 표적 핵산의 폴리메라제 연쇄 반응 증폭의 실제 시간을 모니터 하는 방법은 다음과 같다;Methods for monitoring the actual time of amplification of the polymerase chain reaction of a target nucleic acid in a biological sample are as follows;

- SYBR^TMGreen I 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 표적 서열을 증폭시키고, 폴리메라제 연쇄 반응은 생물학적 시료에 표적이 되는 핵산 서열에 대한 프라이머와 열에 안정한 폴리메라제를 첨가하고, 변성 온도와 연장 온도사이에서 시료에 열처리를 변환하는 것으로 구성되고;Amplifying the target sequence by polymerase chain reaction in the presence of SYBR ^™ Green I, the polymerase chain reaction adding primers and heat stable polymerase to the target nucleic acid sequence to the biological sample, Converting the heat treatment to the sample between extension temperatures;

- SYBR^TMGreen I가 흡수하는 파장에서 빛으로 생물학적 시료를 여기시키고, 형광단 에너지 전달 쌍으로부터 발생되는 빛을 감지하고; 그리고Exciting the biological sample with light at a wavelength absorbed by SYBR ^™ Green I and sensing light generated from the fluorophore energy transfer pair; And

- SYBR^TMGreen I으로부터 나오는 온도에 따른 형광을 모니터하는 것으로 구성된다. 적절하게는 모니터 단계는 증폭된 표적 서열의 용융 프로파일을 결정하는 것으로 구성된다.It consists of monitoring fluorescence over temperature from SYBR ^™ Green I. Suitably the monitoring step consists in determining the melting profile of the amplified target sequence.

- 두 개의 핵산 프라이머와 핵산 프로브 효과량을 생물학적 시료에 첨가하고, 이때 두 개의 프라이머중 한 개와 프로브는 각각 수용 형광단과 제공 형광단으로 구성된 형광 에너지 전달 쌍의 한 개 구성원으로 각각 라벨링하고, 이때 라벨된 프로브는 라벨된 프라이머의 15개 뉴클레오티드내에 표적 핵산 서열의 증폭된 복제본에 하이브리드하고;Two nucleic acid primers and an effective amount of nucleic acid probe are added to the biological sample, wherein one of the two primers and the probe are each labeled with one member of a fluorescence energy transfer pair consisting of a receiving fluorophore and a providing fluorophore, respectively The probes hybridize to an amplified copy of the target nucleic acid sequence within 15 nucleotides of the labeled primer;

c) 제공 형광단이 흡수하는 선택된 파장의 빛을 생물학적 시료에 조사하고, 시료의 형광 방출을 감지하는 것으로 구성된다. 또 다른 한 구체예에서, 방법에는 시료의 온도에 따른 형광을 모니터하는데, 적절하게는 증폭된 표적 서열의 융융 프로파일을 결정함으로써 모니터하는 단계로 구성된다.c) irradiating the biological sample with light of a selected wavelength absorbed by the providing fluorophore and sensing the fluorescence emission of the sample. In another embodiment, the method comprises monitoring fluorescence over the temperature of the sample, suitably by determining the melting profile of the amplified target sequence.

제 2 핵산 서열과 비교를 할 때, 제 1 핵산에서 선택된 위치에 차이를 감지하는 방법은 다음과 같다;When comparing with the second nucleic acid sequence, a method for detecting a difference in a selected position in the first nucleic acid is as follows;

a) 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 증폭이 되도록 형태를 갖춘 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 제 1 핵산의 선택된 단편 및 이에 상응하는 제 2 핵산 서열을 제공하는데, 이때 선택된 단편 및 이에 상응하는 단편은 각각 선택된 위치로 구성되어, 증폭된 생성물에는 선택된 위치의 복사체를 포함하고;a) a pair of oligonucleotide primers shaped to be amplified by a polymerase chain reaction, selected fragments of a first nucleic acid and corresponding second nucleic acid sequences, wherein the selected fragments and corresponding fragments are each Consisting of the selected position, the amplified product comprises a copy of the selected position;

b) 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하는데, 프로브중 한 개는 수용 형광단으로 라벨링되고, 다른 프로브는 형광 공명 에너지 전달 쌍중 제공 형광단으로 라벨링하여, 증폭된 생성물에 두 개의 프로브가 하이브리드될 때, 제공자와 수용자는 공명 에너지 전달 관계에 있고, 이때 프로브중 한 개는 증폭된 생성물에 하이브리드하도록 되어 프로브중 한 개는 선택된 위치로 연장되고, 제 1 핵산 서열에 다른 점이 있는 경우, 용융 프로파일을 나타내고, 이는 제 2 핵산 서열의 용융 프로파일과 구별이 되며;b) providing a pair of oligonucleotide probes, one of which is labeled with a receiving fluorophore and the other probe is labeled with a donor fluorophore in a fluorescence resonance energy transfer pair, such that when the two probes hybridize to the amplified product , The donor and the recipient are in a resonance energy transfer relationship, where one of the probes is allowed to hybridize to the amplified product so that one of the probes extends to the selected position and exhibits a melting profile if there is a difference in the first nucleic acid sequence. It is distinguished from the melting profile of the second nucleic acid sequence;

c) 효과량의 프로브 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 제 1 핵산의 선택된 부분과 이에 상응하는 제 2 핵산 부분을 증폭시켜, 선택된 부분 및 이에 상응하는 부분을 증폭시키고, 이 부분은 공명 에너지 전달 관계에 있는 형광 공명 에너지 전달 쌍에 하이브리드되는 두 개의 프로브를 가지고;c) amplifying the selected portion of the first nucleic acid and the corresponding second nucleic acid portion by polymerase chain reaction in the presence of an effective amount of probe, thereby amplifying the selected portion and the corresponding portion, which portion resonates energy transfer. Having two probes hybridized to a fluorescence resonance energy transfer pair in relationship;

d) 증폭된 단편 및 이에 상응하는 단편 그리고 이에 하이브리드될 프로브에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 형광 공명 에너지 전달 쌍에 의해 형광을 유도하고;d) irradiating amplified fragments and corresponding fragments and probes to be hybridized with light of a selected wavelength to induce fluorescence by fluorescence resonance energy transfer pairs;

e) 온도에 따른 형광 방출을 측정하여, 증폭된 제 1 핵산의 선택된 부분에서 용융되는 프로브중 하나의 제 1 용융 프로파일과 제 1 핵산의 부분에 상응하는 제 2 핵산의 증폭된 부분에서 용융되는 프로브중 하나의 제 2 용융 프로파일을 결정하고; 그리고e) measuring the fluorescence emission over temperature, so that the probe melts in the amplified portion of the second nucleic acid corresponding to the portion of the first nucleic acid and the first melting profile of one of the probes melted in the selected portion of the amplified first nucleic acid Determine a second melt profile of one; And

f) 제 1 용융 프로파일과 제 2 용융 프로파일을 비교하여, 차이가 있는 경우에는 시료 핵산에 차이가 있다는 것을 나타낸다.f) The first melt profile is compared with the second melt profile, and if there is a difference, it indicates that there is a difference in the sample nucleic acid.

제 2 핵산에 비교하여 제 1 핵산에 선택된 위치에 차이를 감지하는 방법은 다음과 같다;The method for detecting a difference in a position selected for a first nucleic acid as compared to a second nucleic acid is as follows;

b) 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하는데, 프라이머중 하나와 프로브는 각각 제공 형광단과 수용 형광단으로 구성된 형광 에너지 전달 쌍의 한 개 요소로 라벨링하고, 라벨된 프로브와 라벨된 프라이머는 증폭된 생성물에 하이브리드되어, 제공자와 수용자는 공명 에너지 전달 관계에 있고, 이때 프로브는 증폭된 생성물에 하이브리드하도록 되어, 프로브는 선택된 위치로 연장되고, 제 1 핵산 서열에 다른 점이 있는 경우, 용융 프로파일을 나타내고, 이는 제 2 핵산 서열의 용융 프로파일과 구별이 되며;b) providing an oligonucleotide probe, wherein one of the primers and the probe are labeled with one element of a fluorescence energy transfer pair consisting of the donor fluorophore and the accepting fluorophore, respectively, and the labeled probe and the labeled primer are hybridized to the amplified product , The donor and the acceptor are in a resonance energy transfer relationship, where the probe is allowed to hybridize to the amplified product such that the probe extends to the selected position and exhibits a melting profile if there is a difference in the first nucleic acid sequence, which is the second nucleic acid. Distinct from the melting profile of the sequence;

c) 효과량의 프라이머와 프로브 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 제 1 핵산의 선택된 부분과 이에 상응하는 제 2 핵산 부분을 증폭시켜, 선택된 부분 및 이에 상응하는 부분을 증폭시키고, 이 부분은 공명 에너지 전달 관계에 있는 형광 공명 에너지 전달 쌍에 하이브리드되는 라벨된 프라이머와 프로브를 가지고;c) amplifying the selected portion of the first nucleic acid and the corresponding second nucleic acid portion by polymerase chain reaction in the presence of an effective amount of primer and probe, thereby amplifying the selected portion and the corresponding portion, the portion being resonance With labeled primers and probes hybridized to fluorescence resonance energy transfer pairs in an energy transfer relationship;

d) 증폭된 단편 및 이에 상응하는 단편 그리고 이에 하이브리드될 프로브 및 라벨된 프라이머에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 형광 공명 에너지 전달 쌍에 의해 형광을 유도하고;d) irradiating amplified fragments and their corresponding fragments and probes and labeled primers to be hybridized thereto with light of a selected wavelength to induce fluorescence by fluorescence resonance energy transfer pairs;

개체의 게놈에서 선택된 위치에 이형접합성을 감지하는 방법은 다음과 같은데 이때, 게놈은 돌연변이 대립형질과 이에 상응하는 기준 대립형질로 구성되고, 각각은 선택된 위치로 구성된다;Methods for detecting heterozygosity at selected locations in an individual's genome include the following: wherein the genome consists of the mutant allele and the corresponding reference allele, each consisting of the selected location;

a) 개체로부터 시료 게놈 DNA를 얻고;a) obtaining sample genomic DNA from an individual;

b) 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 증폭이 되도록 형태를 갖춘 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 돌연변이 대립형질유전자의 제 1 선택된 단편 및 이에 상응하는 기준 대립형질 유전자의 제 2 단편을 제공하는데, 이때 선택된 단편 및 이에 상응하는 단편은 각각 선택된 위치로 구성되어;b) a pair of oligonucleotide primers shaped to be amplified by a polymerase chain reaction, a first selected fragment of a mutant allele and a corresponding second fragment of a reference allele, wherein the selected fragment And corresponding fragments each consist of a selected position;

c) 올리고뉴클레오티드 프로브 한 쌍을 제공하는데, 프로브중 하나는 수용 형광단으로 라벨링하고, 나머지 프로브는 형광 에너지 전달 쌍의 제공 형광단으로 라벨링하여, 증폭된 제 1 단편과 제2 단편에 두 개의 프로브를 하이브리드하면, 프로브중 하나는 선택된 위치로 연장되고, 제 1 핵산 서열에 다른 점이 있는 경우, 용융 프로파일을 나타내고, 이는 제 2 핵산 서열의 용융 프로파일과 구별이 되며;c) providing a pair of oligonucleotide probes, one of which is labeled with a receiving fluorophore and the other probe is labeled with a donor fluorophore of a fluorescent energy transfer pair, thus providing two probes in the amplified first and second fragments. Hybridizing, one of the probes extends to the selected position and, if there is a difference in the first nucleic acid sequence, exhibits a melting profile, which is distinct from the melting profile of the second nucleic acid sequence;

d) 효과량의 프로브 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 샘플 게놈 DNA의 제 1 선택된 부분과 이에 상응하는 제 2 부분을 증폭시켜, 선택된 부분 및 이에 상응하는 부분을 증폭시키고, 이 부분은 공명 에너지 전달 관계에 있는 형광 공명 에너지 전달 쌍에 하이브리드되는 라벨된 두 개의 프로브를 가지고;d) amplifying the first selected portion and corresponding second portion of the sample genomic DNA by polymerase chain reaction in the presence of an effective amount of probe, thereby amplifying the selected portion and the corresponding portion, the portion being resonance energy Have two labeled probes hybridized to a fluorescence resonance energy transfer pair in a transfer relationship;

e) 증폭된 제 1 단편 및 이에 상응하는 제 2 단편 그리고 이에 하이브리드될 프로브에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 형광 공명 에너지 전달 쌍에 의해 형광을 유도하고;e) irradiating the amplified first fragment and its corresponding second fragment and the probe to be hybridized with light of a selected wavelength to induce fluorescence by a fluorescence resonance energy transfer pair;

f) 온도에 따른 형광 방출을 측정하여, 증폭된 제 1 선택된 부분에서 용융되는 프로브중 하나의 제 1 용융 프로파일과 제 1 부분에 상응하는 제 2 증폭된 부분에서 용융되는 프로브중 하나의 제 2 용융 프로파일을 결정하고; 그리고f) measuring the fluorescence emission with temperature, such that the first melt profile of one of the probes melted in the amplified first selected portion and the second melt of one of the probes melted in the second amplified portion corresponding to the first portion Determine a profile; And

g) 제 1 용융 프로파일과 제 2 용융 프로파일을 비교하여, 차이가 있는 경우에는 시료 게놈 DNA에 이형접합성을 나타내는 것을 나타낸다.g) The first melt profile is compared with the second melt profile, and when there is a difference, it shows that the sample genomic DNA is heterozygous.

c) 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하는데, 프라이머중 하나와 프로브는 각각 제공 형광단과 수용 형광단으로 구성된 형광 에너지 전달 쌍중의 한 구성요소로 라벨링하고, 라벨된 프로브와 라벨된 프라이머는 증폭된 제 1 단편과 제2 단편에 두 개의 프로브를 하이브리드하면, 프로브중 하나는 선택된 위치로 연장되고, 제 1 핵산 서열에 다른 점이 있는 경우, 용융 프로파일을 나타내고, 이는 제 2 핵산 서열의 용융 프로파일과 구별이 되며;c) providing an oligonucleotide probe, wherein one of the primers and the probe are labeled with one component of a fluorescence energy transfer pair consisting of a donor fluorophore and a receiving fluorophore, respectively, wherein the labeled probe and the labeled primers are labeled with the amplified first fragment and Hybridizing two probes to a second fragment, one of the probes extends to the selected position and, if there is a difference in the first nucleic acid sequence, exhibits a melting profile, which is distinct from the melting profile of the second nucleic acid sequence;

d) 효과량의 프로브와 프라이머 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 샘플 게놈 DNA의 제 1 선택된 부분과 이에 상응하는 제 2 부분을 증폭시켜, 선택된 부분 및 이에 상응하는 부분을 증폭시키고, 이 부분은 공명 에너지 전달 관계에 있는 형광 공명 에너지 전달 쌍에 하이브리드되는 라벨된 프라이머와 프로브를 가지고;d) amplifying the first selected portion and corresponding second portion of the sample genomic DNA by polymerase chain reaction in the presence of an effective amount of probe and primer to amplify the selected portion and the corresponding portion, the portion being With labeled primers and probes hybridized to fluorescence resonance energy transfer pairs in a resonance energy transfer relationship;

e) 증폭된 제 1 단편 및 이에 상응하는 제 2 단편 그리고 이에 하이브리드될 라벨된 프라이머와 프로브에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 형광 공명 에너지 전달 쌍에 의해 형광을 유도하고;e) irradiating light of a selected wavelength to the amplified first and corresponding second fragments and labeled primers and probes to be hybridized thereto to induce fluorescence by fluorescence resonance energy transfer pairs;

f) 온도에 따른 형광 방출을 측정하여, 증폭된 제 1 선택된 부분에서 용융되는 프로브의 제 1 용융 프로파일과 제 1 부분에 상응하는 제 2 증폭된 부분에서 용융되는 프로브의 제 2 용융 프로파일을 결정하고; 그리고f) measuring the fluorescence emission over temperature to determine a first melt profile of the probe that melts in the amplified first selected portion and a second melt profile of the probe that melts in the second amplified portion corresponding to the first portion and ; And

폴리메라제 연쇄 반응 혼합물에서 폴리메라제 연쇄 반응의 완료를 결정하는 방법은 다음과 같은데, 이때 혼합물은 (1) 핵산, 핵산 또는 폴리메라제 연쇄 반응으로 증폭된 핵산으로 두 개의 별개 상보쇄로 구성되고; (2) 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 핵산의 선택된 부분을 증폭시켜, 증폭된 생성물을 만들 수 있도록 된 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머; (3) 폴리메라제 연쇄 반응을 촉매하는 DNA 폴리메라제로 구성되고;A method for determining the completion of a polymerase chain reaction in a polymerase chain reaction mixture is as follows, wherein the mixture consists of two distinct complementary chains: (1) nucleic acid, nucleic acid or nucleic acid amplified by the polymerase chain reaction. Become; (2) two oligonucleotide primers that are capable of amplifying selected portions of nucleic acids by polymerase chain reaction to produce amplified products; (3) consisting of a DNA polymerase that catalyzes the polymerase chain reaction;

(a) 혼합물에 (1)와 (2)를 첨가하는데, 이때 (1)은 형광 공명 에너지 전달 쌍의 공명 에너지 전달 제공자 또는 공명 에너지 전달 수용자로 라벨된 올리고뉴클레오티드 프로브 효과량이 되고, 이때 프로브는 선택된 온도와 1가 이온 강도 하에 증폭된 생성물에 하이브리드할 수 있도록 되어 있고; (2)는 제공자 또는 수용자로 라벨된 기준 올리고뉴클레오티드 효과량이 되며, 이때 조건은 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드간에 하나는 제공자로 라벨링되고, 다른 하나는 수용자로 라벨링하는 것이고, 이때 기준 올리고뉴클레오티드는 선택된 온도와 1가 이온강도하에 증폭된 생성물에 하이브리드할 수 있도록 되어 있어, 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드 모두가 증폭된 생성물에 하이브리드될 때. 제공자와 수용자는 공명 에너지 전달 관계에 있으며;(a) Add (1) and (2) to the mixture, where (1) is an effective amount of oligonucleotide probe labeled with a resonance energy transfer provider or resonance energy transfer acceptor of the fluorescence resonance energy transfer pair, wherein the probe is selected To hybridize to amplified products under temperature and monovalent ionic strength; (2) is the reference oligonucleotide effective amount labeled with the donor or acceptor, wherein the condition is that between the probe and the reference oligonucleotide one is labeled with the donor and the other is labeled with the acceptor, wherein the reference oligonucleotide is determined by the selected temperature and When hybridized to amplified products under monovalent ionic strength, both probes and reference oligonucleotides are hybridized to amplified products. The donor and the recipient are in a resonance energy transfer relationship;

(b) 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 핵산의 선택된 단편이 증폭시켜, 증폭된 생성물을 얻는데 이때, 생성물은 공명 에너지 전달 관계에 있는 형광 공명 에너지 전달 쌍에 하이브리드된 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드를 가지고;(b) amplifying selected fragments of nucleic acid by polymerase chain reaction to obtain an amplified product, the product having a probe and a reference oligonucleotide hybridized to a fluorescence resonance energy transfer pair in a resonance energy transfer relationship;

(c) 하이브리드된 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드를 가지는 증폭된 생성물에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 형광공명 에너지 전달 쌍에 의해 형광을 유도하고, 발생되는 형광을 모니터하고, 반응이 종료되었음을 나타내는 형광 발생이 평탄역상에 도달하였을 때 변환과정을 결정하는 것으로 구성된다.(c) irradiating the amplified product having the hybridized probe and the reference oligonucleotide with light of a selected wavelength, inducing fluorescence by a fluorescence resonance energy transfer pair, monitoring the generated fluorescence, and generating fluorescence indicating that the reaction is completed. It consists of determining the conversion process when this plateau is reached.

(a) 혼합물에 핵산-결합 형광 염료 효과량을 첨가하고;(a) adding an effective amount of nucleic acid-binding fluorescent dye to the mixture;

(b) 혼합물에서 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 핵산의 선택된 단편을 증폭시키고, 이때 핵산에 결합하는 형광 염료를 첨가하면, 증폭된 생성물에 핵산 결합 형광 염료가 결합하게 되고; 그리고(b) amplifying selected fragments of nucleic acids by polymerase chain reaction in the mixture, wherein adding a fluorescent dye that binds the nucleic acid binds the nucleic acid binding fluorescent dye to the amplified product; And

(c) 핵산에 결합하는 형광 염료가 결합된 증폭된 생성물에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 형광공명 에너지 전달 쌍에 의해 형광을 유도하고, 발생되는 형광을 모니터하고, 반응이 종료되었음을 나타내는 형광 발생이 평탄역상에 도달하였을 때 변환과정을 결정하는 것으로 구성된다. 바람직하게는 핵산-결합 형광 염료는 SYBR^TMGreen-1, 에티디움 브롬화물, 피코 그린, 아크리딘 오렌지, 티아졸 오렌지, YO-PRO-1, 크로모마이신 A3에서 선택하는데, 가장 적절한 것이 SYBR^TMGreen-1이다.(c) irradiating light of a selected wavelength to the amplified product bound to the fluorescent dye binding to the nucleic acid, inducing fluorescence by a fluorescence resonance energy transfer pair, monitoring the generated fluorescence, and generating fluorescence indicating that the reaction is completed. It consists of determining the conversion process when this plateau is reached. Preferably the nucleic acid-binding fluorescent dye is selected from SYBR ^™ Green-1, Ethidium bromide, Pico Green, Acridine Orange, Thiazole Orange, YO-PRO-1, Chromycin A3, most suitable is SYBR ^TM Green-1.

이중 쇄-특이적인 형광 염료로 구성된 폴리메라제 연쇄 반응 혼합물의 어닐링, 연장, 변성 상으로 구성된 폴리메라제 연쇄 반응의 온도 변환과정 변수를 조절하는 방법은 다음과 같은데, 이때 변수는 어닐링 상의 기간, 변성 상의 기간, 변환과정 횟수로 구성된다;Annealing, extending and denaturing the polymerase chain reaction mixture of the double chain-specific fluorescent dyes may be performed to control the temperature conversion process parameters of the polymerase chain reaction consisting of the following phases. Consists of the period of metamorphosis and the number of transformations;

(a) 선택된 파장의 빛을 반응물에 조사하여, 형광 염료에 의해 형광을 유도하고. 변환되는 어닐링, 연장, 변성 상동안에 지속적으로 형광을 모니터하고;(a) irradiating the reactants with light of a selected wavelength to induce fluorescence with fluorescent dyes. Fluorescence is continuously monitored during the annealing, extension, denaturation phase being converted;

(b) (i) 연장상 동안에 형광이 증가되는 것이 종료되는 기간 또는(b) the period during which (i) the increase in fluorescence during the extended phase ends; or

(ii) 변성 상동안에 형광이 기저선까지 감소되는 기간 또는(ii) the period during which the fluorescence is reduced to baseline during the denatured phase, or

(iii) 연장 상동안에 미리 선택된 수준에 형광이 도달하기 위한 변환과정의 횟수 등을 결정하고;(iii) determine the number of times of conversion, etc. for fluorescence to reach a preselected level during the extended phase;

(c) 연장 상동안에 형광의 증가가 중지되는 시간에 따른 연장 상의 길이, 변성 상동안에 형광이 기저선까지 감소되는 시간에 따른 변성 상의 길이 또는 연장 상동안에 미리 선택한 수준에 형광이 도달하는데 필요한 변환과정의 횟수에 따른 변환과정의 수를 조절하는 것으로 구성된다.(c) the length of the extension phase over time when the increase in fluorescence ceases during the extension phase, the length of the denatured phase over time during which the fluorescence is reduced to the baseline during the denatured phase, or the conversion process required for fluorescence to reach a preselected level during the extension phase. It consists of adjusting the number of conversion process according to the number of times.

선택된 폴리메라제 연쇄 반응 혼합물에서 증폭된 생성물의 농도를 결정하는 방법은 다음과 같다;The method for determining the concentration of amplified product in the selected polymerase chain reaction mixture is as follows;

(a) 선택된 온도와 반응 조건에서 농도를 알고 있는 증폭된 생성물의 하이브리드 속도를 모니터하여 증폭된 생성물에 대한 이차 속도 상수를 결정하고;(a) monitoring the hybrid rate of the amplified product of known concentration at the selected temperature and reaction conditions to determine a secondary rate constant for the amplified product;

(b) 농도를 모르는 증폭된 생성물에 대한 어닐링 속도를 결정하고; 그리고(b) determine an annealing rate for the amplified product of unknown concentration; And

(c) 어닐링 속도와 이차 속도 상수로부터 증폭된 생성물의 농도를 계산하는 것으로 구성된다. 바람직하게는, 어닐링 속도는 여러 과정의 증폭을 한 후에 결정한다. 한 구체예에서 이차 속도 상수를 결정하는 방법은 다음과 같다;(c) calculating the concentration of amplified product from the annealing rate and the secondary rate constant. Preferably, the annealing rate is determined after several steps of amplification. In one embodiment the method of determining the secondary rate constant is as follows;

- 농도를 알고 있는 증폭된 생성물과 효과량의 이중-쇄 특이적인 형광 염료로 구성된 제 1 폴리메라제 연쇄 반응 혼합물의 온도를 증폭된 생성물의 변성 온도 이상으로 상승시켜 증폭된 생성물을 변성시키고;Denaturing the amplified product by raising the temperature of the first polymerase chain reaction mixture consisting of the amplified product of known concentration and an effective amount of a double-chain specific fluorescent dye above the denaturation temperature of the amplified product;

- 농도를 알고 있는 증폭된 생성물과 효과량의 이중-쇄 특이적인 형광 염료로 구성된 제 1 폴리메라제 연쇄 반응 혼합물의 온도를 증폭된 생성물의 변성 온도 이하로 신속하게 낮추고, 시간에 대한 함수로써 제 1 폴리메라제 연쇄 반응 혼합물의 형광을 지속적으로 모니터하고;Rapidly lowering the temperature of the first polymerase chain reaction mixture consisting of the amplified product of known concentration and an effective amount of a double-chain specific fluorescent dye to below the denaturation temperature of the amplified product, as a function of time; Continuously monitoring the fluorescence of the 1 polymerase chain reaction mixture;

- 최대 형광, 최소 형광, 최소 형광 시에 시간 등을 결정하기 위해 시간에 대해 형광을 플롯팅하고, 하기 수학식 1을 이용하여 농도를 알고 있는 증폭된 생성물에 대한 이차 속도 상수를 결정한다.Plot fluorescence over time to determine the maximum fluorescence, minimum fluorescence, time at minimum fluorescence, etc. and determine the secondary rate constant for the amplified product of known concentration using Equation 1 below.

이때, F는 형광이고, F_max는 최대 형광을 나타내고, F_min은 최소 형광을 나타내고, k는 이차 속도 상수이고, t_o는 F_min일 때 시간을 나타내고, [DNA]는 농도를 알고 있는 증폭된 생성물을 나타낸다.Where F is fluorescence, F _max is maximum fluorescence, F _min is minimum fluorescence, k is secondary rate constant, t _o is time at F _min , and [DNA] is amplification with known concentration. To the resulting product.

경쟁성 정량적인 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 선택된 핵산의 농도를 결정하는 방법은 다음과 같다;Methods of determining the concentration of a selected nucleic acid by competitive quantitative polymerase chain reaction are as follows;

(a) (i) 폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 주형의 단편과 경쟁을 하는 주형의 이에 상응하는 단편을 증폭시켜 이의 증폭된 생성물을 얻도록 된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 각 효과량;(a) (i) an effective amount of each pair of oligonucleotide primers to amplify the corresponding fragment of the template competing with the fragment of the selected template in the polymerase chain reaction to obtain an amplified product thereof;

(ii) 형광 공명 에너지 전달 쌍의 공명 에너지 전달 제공자 또는 공명 에너지 전달 수용자로 라벨된 올리고뉴클레오티드 프로브 효과량, 이때 프로브는 증폭된 생성물에 하이브리드되어, 경쟁이 되는 주형의 증폭된 생성물로부터 용융되는 프로브의 용융온도와는 구별이되는 용융온도에서 선택된 주형의 증폭된 생성물로부터 프로브가 용융되고;(ii) an effective amount of oligonucleotide probe labeled with a resonance energy transfer provider or resonance energy transfer acceptor of a fluorescence resonance energy transfer pair, wherein the probe is hybridized to the amplified product and melted from the amplified product of the competing template. The probe is melted from the amplified product of the selected mold at a melting temperature that is distinct from the melting temperature;

(iii) 제공자 또는 수용자로 라벨된 기준 올리고뉴클레오티드 효과량, 단 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드간에 하나는 제공자로 라벨되고, 다른 하나는 수용자로 라벨되며, 기준 올리고뉴클레오티드는 증폭된 생성물에 하이브리드하도록 되어, 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드가 모두 증폭된 생성물에 하이브리드될 때, 제공자와 수용자는 공명 에너지 전달 관계에 있고; 이와 같이 구성된 혼합물에서 농도를 모르는 선택된 주형과 농도를 알고 있는 경쟁이 되는 주형을 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 증폭시켜 이의 증폭된 생성물을 만들고;(iii) an effective amount of a reference oligonucleotide labeled with a donor or acceptor, provided that one between the probe and the reference oligonucleotide is labeled with the donor, the other is labeled with the acceptor, and the reference oligonucleotide is hybridized to the amplified product When both and the reference oligonucleotide hybridize to the amplified product, the donor and the acceptor are in resonance energy transfer relationship; In the mixture thus constructed, amplifying a template of unknown concentration and a competitive template of known concentration is amplified by polymerase chain reaction to produce an amplified product thereof;

(b) 반응 혼합물에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 형광 공명 에너지 전달 쌍에 의해 형광을 유도하고, 온도에 대한 함수로써 형광 방출을 결정하고, 반응 혼합물의 온도는 선택된 주형의 증폭된 생성물로부터 용융되는 프로브의 제 1 용융 곡선과 경쟁을 한 주형으로 부터 용융된 제 2 용융 곡선으로 변화되고;(b) irradiating the reaction mixture with light of a selected wavelength, inducing fluorescence by a fluorescence resonance energy transfer pair, determining fluorescence emission as a function of temperature, and the temperature of the reaction mixture melted from the amplified product of the selected template Changing from a mold in competition with the first melting curve of the probe to the second melting curve;

(c) 제 1과 제 2 용융 곡선을 제 1과 제 2 용융 피크로 변환시켜, 이와 같은 용융 피크로부터 선택된 주형과 경쟁을 하는 주형의 상대적인 양을 결정하고; 그리고(c) converting the first and second melt curves into first and second melt peaks to determine a relative amount of mold that competes with a mold selected from such melt peaks; And

(d) 경쟁이 되는 주형의 양, 선택된 주형과 경쟁 주형간의 상대적인 양을 근거로 하여 선택된 주형의 농도를 계산하는 것으로 구성된다.(d) calculating the concentration of the selected template on the basis of the amount of competition template and the relative amount between the selected template and the competition template.

형광 공명 에너지 전달 쌍은 형광물질과 Cy5 또는 Cy5.5로 구성된다.The fluorescence resonance energy transfer pair consists of the phosphor and Cy5 or Cy5.5.

폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 핵산의 농도를 결정하는 방법은 다음과 같다;The method of determining the concentration of the selected nucleic acid in the polymerase chain reaction is as follows;

(a) (i) 폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 주형의 제 1 단편을 증폭시켜 이의 증폭된 제 1 생성물을 얻도록 된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 제 1 프라이머 각 효과량;(a) (i) each effective amount of a pair of oligonucleotide first primers to amplify a first fragment of a selected template in a polymerase chain reaction to obtain an amplified first product thereof;

(ii) 폴리메라제 연쇄 반응에서 기준 주형의 제 2 선택된 단편을 증폭시켜 이의 증폭된 제 2 생성물을 얻도록 된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 제 2 프라이머 효과량;(ii) an effective amount of the pair of oligonucleotide second primers to amplify the second selected fragment of the reference template in the polymerase chain reaction to obtain an amplified second product thereof;

(iii) 핵산-결합하는 형광 염료 효과량;으로 구성된 혼합물에서 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 농도를 모르는 선택된 주형과 농도를 알고 있는 기준 주형을 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 각각 증폭시켜 각각의 증폭된 생성물을 만들고;(iii) amplifying the selected template of unknown concentration by the polymerase chain reaction and the reference template of known concentration by the polymerase chain reaction in the mixture consisting of nucleic acid-binding fluorescent dye effective amounts. Making a product;

(b) 반응 혼합물에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 핵산-결합하는 형광 염료에 의해 형광을 유도하고, 온도에 대한 함수로써 형광 방출을 지속적으로 모니터하고, 증폭된 생성물로부터 용융 곡선을 만드는데, 이때 제 1 생성물과 제 2 생성물은 다른 온도에서 용융되고;(b) irradiating the reaction mixture with light of a selected wavelength to induce fluorescence by nucleic acid-binding fluorescent dyes, to continuously monitor fluorescence emission as a function of temperature, and to create a melting curve from the amplified product, wherein The first product and the second product are melted at different temperatures;

(c) 용융 곡선을 용융 피크로 변환시켜, 이와 같은 용융 피크로부터 선택된 주형과 기준 주형의 상대적인 양을 결정하고; 그리고(c) converting the melting curve to a melting peak to determine a relative amount of mold selected from this melting peak and the reference mold; And

(d) 기준 주형의 양, 기준 주형과 선택된 주형간의 상대적인 양을 근거로 하여 선택된 주형의 농도를 계산하는 것으로 구성된다.(d) calculating the concentration of the selected template based on the quantity of the reference template and the relative amount between the reference template and the selected template.

양성 기준 주형을 포함하는 폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 핵산의 농도를 결정하는 방법은 다음과 같다;The method of determining the concentration of a selected nucleic acid in a polymerase chain reaction containing a positive reference template is as follows;

(ii) 폴리메라제 연쇄 반응에서 양성 기준 주형의 제 2 선택된 단편을 증폭시켜 이의 증폭된 제 2 생성물을 얻도록 된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 제 2 프라이머 효과량;(ii) an effective amount of a pair of oligonucleotide second primers to amplify the second selected fragment of the positive reference template in a polymerase chain reaction to obtain an amplified second product thereof;

(iii) 핵산-결합하는 형광 염료 효과량;으로 구성된 반응 혼합물을 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 선택된 주형과 양성 기준 주형을 각각 증폭시키는 조건하에 두고;(iii) a reaction mixture consisting of nucleic acid-binding fluorescent dye effective amounts; under conditions that respectively amplify the template selected by the polymerase chain reaction and the positive reference template;

(b) 반응 혼합물에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 핵산-결합하는 형광 염료에 의해 형광을 유도하고, 온도에 대한 함수로써 방출되는 형광을 지속적으로 모니터하고, 선택된 주형이 증폭된 경우에는 증폭된 제 1 생성물의 제 1 용융 피크를 만들고, 양성 기준 주형이 증폭된 경우에는 증폭된 제 2 생성물의 제 2 용융 피크를 만들고;(b) irradiating the reaction mixture with light of a selected wavelength, inducing fluorescence by nucleic acid-binding fluorescent dyes, continuously monitoring fluorescence emitted as a function of temperature, and amplifying if the selected template is amplified Make a first melt peak of the first product, and if the positive reference template is amplified, make a second melt peak of the amplified second product;

이때, 제 2 용융 곡선을 얻는다는 것은 폴리메라제 연쇄 반응이 작용했다는 것을 나타내고, 제 1 용융 곡선을 얻는다는 것은 선택된 제 1 단편이 증폭되었엄을 알리는 것이도, 제 1 용융 곡선이 없다는 것은 선택된 제 1 단편이 증폭되지 않았음을 나타내는 것으로 구성된다.At this time, obtaining the second melt curve indicates that the polymerase chain reaction has been performed, and obtaining the first melt curve indicates that the selected first fragment is amplified, but that there is no first melt curve is selected. Consisting of indicating that the first fragment was not amplified.

개체에서 V Leiden 돌연변이를 감지하는 방법은 다음과 같은데, 이때 V Leiden 돌연변이는 야생형과 비교를 하였을 때, 인자 V Leiden 돌연변이 위치에서 한 개의 염기가 변화된 것으로 구성된다;Methods for detecting V Leiden mutations in an individual include the following, where the V Leiden mutation consists of a change in one base at the position of the factor V Leiden mutation when compared to the wild type;

(a) 개체로부터 시료 게놈 DNA를 얻고;(a) obtaining sample genomic DNA from an individual;

(b) 기준으로 삼을 야생형 게놈 DNA를 얻고;(b) obtaining wild type genomic DNA for reference;

(c) 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 시료 게놈 DNA의 선택된 단편과 야생형 게놈 DNA의 단편을 증폭시키도록 된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공하고, 이때 선택된 단편은 인자 V Leiden 돌연변이 위치로 구성되어, 증폭된 생성물에는 인자 V Leiden 돌연변이 위치의 복사체를 포함하게 되고;(c) providing a pair of oligonucleotide primers adapted to amplify selected fragments of sample genomic DNA and fragments of wild-type genomic DNA by polymerase chain reaction, wherein the selected fragments consist of factor V Leiden mutation sites, The amplified product will contain a copy of the factor V Leiden mutation site;

(d) 형광 공명 에너지 전달 쌍의 공명 에너지 전달 제공자 또는 공명 에너지 전달 수용자로 라벨된 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하는데, 이때 프로브는 증폭된 생성물에 하이브리드되어, 시료 게놈 DNA에 V Leiden 돌연변이가 있는 경우에 용융 곡선을 나타내는데, 이때 용융 곡선은 야생형 게놈 DNA의 용융 프로파일과는 구별이 되는 것이고;(d) providing an oligonucleotide probe labeled with a resonance energy transfer provider or resonance energy transfer acceptor of a fluorescence resonance energy transfer pair, wherein the probe hybridizes to the amplified product and melts when there is a V Leiden mutation in the sample genomic DNA. Curves, wherein the melting curve is distinct from the melting profile of wild-type genomic DNA;

(e) 공명 에너지 전달 제공자 또는 공명 에너지 전달 수용자로 라벨된 전달 올리고뉴클레오티드를 제공하는데, 단 조건은 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드간에 하나는 공명 에너지 전달 제공자로 라벨이 되고, 다른 하나는 공명 에너지 전달 수용자로 라벨이 되며; 전달 올리고뉴클레오티드는 증폭된 생성물에 하이브리드하도록 되어, 공명 에너지 전달 제공자와 공명 에너지 전달 수용자는 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드가 증폭된 생성물에 하이브리드될 때, 공명 에너지 전달 관계에 있고;(e) providing a delivery oligonucleotide labeled as a resonance energy transfer provider or a resonance energy transfer acceptor, provided that one condition is labeled as a resonance energy transfer provider between the probe and the transfer oligonucleotide and the other as a resonance energy transfer acceptor. Label; The delivery oligonucleotide is adapted to hybridize to the amplified product such that the resonance energy transfer provider and the resonance energy transfer acceptor are in a resonance energy transfer relationship when the probe and delivery oligonucleotide hybridize to the amplified product;

(f) 올리고뉴클레오티드 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드 효과량 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 시료 게놈 DNA의 선택된 단편과 야생형 게놈 DNA를 증폭시켜, 선택된 단편을 증폭시키는데 여기에는 공명 에너지 전달 관계에 있는 형광 공명 에너지 전달 쌍이 하이브리드된 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드를 부분적으로 가지고;(f) amplifying selected fragments of the sample genomic DNA and wild-type genomic DNA by polymerase chain reaction in the presence of an oligonucleotide probe and an effective amount of the delivered oligonucleotide, thereby amplifying the selected fragments, including fluorescence resonance in resonance energy transfer relation. The energy transfer pair partially has a hybridized probe and a transfer oligonucleotide;

(g) 폴리메라제 연쇄 반응의 증폭 과정동안에 온도에 대한 함수로써 형광을 측정하여 시료 게놈 DNA의 증폭된 단편으로부터 용융되는 프로브의 용융 프로파일과 야생형 게놈 DNA의 증폭된 단편으로부터 용융되는 프로브의 용융 프로파일을 만들고;(g) Melt profile of probes melted from amplified fragments of sample genomic DNA and probe profiles melted from amplified fragments of wild-type genomic DNA by measuring fluorescence as a function of temperature during the amplification process of the polymerase chain reaction. Create;

(h) 야생형 게놈 DNA의 용융 프로파일에 대해 시료 게놈 DNA의 용융 프로파일을 비교하여, 차이가 있는 경우에는 시료 게놈 DNA에 인자 V Leiden 돌연변이가 존재함을 나타내는 것이다.(h) The melting profile of the sample genomic DNA is compared to the melting profile of the wild-type genomic DNA to indicate the presence of factor V Leiden mutations in the sample genomic DNA, if any.

핵산 하이브리드 반응을 분석하는 방법은 다음과 같다;Methods for analyzing nucleic acid hybrid reactions are as follows;

(a) 분석을 할 핵산 시료와 핵산에 결합하는 형광물질로 구성된 혼합물을 제공하고; 그리고(a) providing a mixture of a nucleic acid sample to be analyzed and a fluorescent substance binding to the nucleic acid; And

(b) 초당 ≥0.1℃ 이상의 속도로 온도를 변화시키면서 형광을 모니터 하는 것으로 구성된다.(b) monitoring fluorescence while varying the temperature at a rate of ≥0.1 ° C per second or more.

양을 모르는 핵산을 포함하는 시료에서 시작 복사체의 수를 정량화하는 방법은 다음과 같다;The method for quantifying the number of starting copies in a sample containing an unknown nucleic acid is as follows;

(a) 표준과 핵산 결합 형광물질로 구성된 혼합물에서 농도를 알고 있는 적어도 한가지 표준을 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 증폭시키고;(a) amplifying by polymerase chain reaction at least one standard of known concentration in a mixture consisting of a standard and a nucleic acid binding fluorescent substance;

(b) 변환 과정 횟수에 대한 함수로써 형광을 측정하여, 일련의 데이터 점을 얻고;(b) measuring fluorescence as a function of the number of conversion processes to obtain a series of data points;

(c) 초기 핵산 농도와 과정 횟수에 대한 함수로써 형광을 설명하는 주어진 식에 데이터 점을 적용시키고;(c) applying data points to a given equation describing fluorescence as a function of initial nucleic acid concentration and number of processes;

(d) 시료와 핵산 결합 형광물질로 구성된 혼합물에 양을 모르는 핵산을 포함하는 시료를 증폭시키고, 이의 형광을 모니터하고; 그리고(d) amplifying the sample comprising the nucleic acid of unknown amount in a mixture of the sample and the nucleic acid binding fluorescent substance, and monitoring its fluorescence; And

(e) (c)단계에서 결정된 반응식으로부터 초기 핵산 농도를 결정하는 것으로 구성된다.(e) determining the initial nucleic acid concentration from the scheme determined in step (c).

형광 공명 에너지 전달 쌍에 대해 상술하고 있는데, 이때 쌍은 방출 스펙트럼을 가지는 제공자 형광단과 흡수 스펙트럼을 가지는 수용자 형광단으로 구성되고, 100,000M^-1㎝^-1의 흡광계수를 가지고, 이때 제공자 형광단의 방출 스펙트럼과 수용자 형광단의 흡수 스펙트럼의 겹치는 정도는 25%이하이다. 한 구체예로 여기에서 설명되는 형광 공명 에너지 전달 쌍에서 제공자 형광단은 플로레신이고, 수용자 형광단은 Cy5 또는 Cy5.5이다.The fluorescence resonance energy transfer pair has been described in detail, wherein the pair consists of a donor fluorophore having an emission spectrum and an acceptor fluorophore having an absorption spectrum, and has an absorption coefficient of 100,000 M ⁻¹ cm ⁻¹ , wherein The overlap between the emission spectrum and the absorption spectrum of the receptor fluorophore is less than 25%. In one embodiment the donor fluorophore is floresin and the acceptor fluorophore is Cy5 or Cy5.5 in the fluorescence resonance energy transfer pair described herein.

생물학적 시료에서 표적 핵산 서열을 분석하는 방법은 다음과 같다;Methods for analyzing target nucleic acid sequences in biological samples are as follows;

- 핵산 결합 형광물질 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 표적 서열을 증폭시키고, 폴리메라제 연쇄 반응은 생물학적 시료에 표적이 되는 핵산 서열에 대한 프라이머와 열에 안정한 폴리메라제를 첨가하고, 변성 온도와 연장 온도사이에서 시료에 열처리를 반복하는 것으로 구성되고;Amplifying the target sequence by polymerase chain reaction in the presence of a nucleic acid binding fluorescent substance, the polymerase chain reaction adds primers and heat stable polymerases to the target nucleic acid sequence to the biological sample, Consisting of repeating the heat treatment on the sample between extended temperatures;

- 핵산 결합 형광 물질이 흡수하는 파장에서 빛으로 생물학적 시료를 여기시키고;Exciting the biological sample with light at a wavelength absorbed by the nucleic acid binding fluorescent substance;

- 시료의 온도가 변화될 때, 핵산 결합 형광물질로부터 온도에 따른 형광 방출을 모니터하는 것으로 구성된다. 적절하게는 핵산 결합 형광물질은 SYBR^TMGreen I와 같은 이중 쇄 핵산 결합 형광물질로 구성된다. 온도에 따른 형광 방출로 증폭된 생성물을 확인할 수 있는데, 적절하게는 용융 곡선을 분석하는 것이다. 두 개 또는 그 이상의 증폭된 생성물의 상대적인 양은 용융 곡선을 분석하여 결정한다. 예를 들면, 용융 곡선 아래에 있는 면적은 다중 가우스 함수 합의 비-선형 최소 자승 회귀분석으로 알 수 있다.When the temperature of the sample changes, it consists in monitoring the fluorescence emission with temperature from the nucleic acid binding fluorescent substance. Suitably the nucleic acid binding fluorescent substance consists of a double stranded nucleic acid binding fluorescent substance such as SYBR ^™ Green I. The product amplified by fluorescence emission over temperature can be identified, suitably by analyzing the melting curve. The relative amount of two or more amplified products is determined by analyzing the melt curve. For example, the area under the melting curve can be seen by non-linear least-squares regression of the sum of multiple Gaussian functions.

관련 출원Related Applications

1997년 3월 17일자로 출원된 미국 출원 08/818,267은 Factor V Leiden 돌연변이를 감지하는 방법에 대한 것으로 이는 1996년 6월 4일자 출원된 08/658,993(발명의 명칭; PCR 과정을 모니터 하는 방법 및 시스템)의 연속출원이고, 이는 1995년 10월 2일자 출원된 미국 출원 08/537,612(발명의 명칭; 생물학적 시료의 신속한 열 처리 과정을 하는 방법)의 연속출원이고, 이는 1994년 1월 10일자 출원된 미국 출원 08/179,969(발명의 명칭; 신속한 열 처리 과정 장치; 현재 미국 특허 등록 5,455,175)의 연속출원이고, 이는 1992년 1월 2일자 출원된 미국 출원 07/815,966(발명의 명칭; 신속한 열 처리 장치; 현재 포기됨)의 연속출원이고, 이는 1990년 6월 4일자 출원된 미국 출원 08/534,029(발명의 명칭; 자동화된 PCR 장치)의 연속출원이며, 이는 전부 참고문헌으로 첨부한 바 있다. 1997년 6월 4일자 RO/US에 출원한 PCT 출원 PCT/US97.....(발명의 명칭; 생물학적 공정을 실행하고 모니터 하는 방법 및 시스템 [출원인; University of Utah Research Foundarion][발명자; Carl T. Wittwer, Kirk M. Ririe, Randy P. Rasmussen, David R. Hillyard] 또한 참고문헌으로 첨부를 한다.US application 08 / 818,267, filed March 17, 1997, relates to a method for detecting Factor V Leiden mutations, filed 08 / 658,993 filed June 4, 1996; System), which is a serial application of U.S. Application 08 / 537,612 filed on Oct. 2, 1995 (name of the invention; a method for rapid thermal processing of biological samples), filed Jan. 10, 1994 US application 08 / 179,969 (name of the invention; rapid heat treatment process apparatus; now US patent registration 5,455,175), which is a serial application of US application 07 / 815,966 (name of the invention; rapid heat treatment, filed January 2, 1992) Serial application of US Appl. 08 / 534,029 (name of the invention; automated PCR apparatus), filed June 4, 1990, which is hereby incorporated by reference in its entirety. PCT application PCT / US97 ..... filed on June 4, 1997, RO / US; Name of Invention; Methods and Systems for Implementing and Monitoring Biological Processes [Applicant; University of Utah Research Foundarion] [Inventor; Carl T. Wittwer, Kirk M. Ririe, Randy P. Rasmussen, and David R. Hillyard] are also incorporated by reference.

본 발명은 폴리메라제 사슬 연쇄 반응과 연합한 하이브리드 반응의 결과를 형광 시그날로 관찰하는 것에 관계한다. 좀 더 구체적으로는, 본 발명은 PCR 하는 동안에 또는 PCR 직후에 형광물질로 하이브리드 반응을 관찰하는 것에 연관이 되는데, 이는 생성물의 확인, 서열 변화 감지 및 정량적인 것에 대한 정보를 이용한다.The present invention relates to observing the result of a hybrid reaction in association with a polymerase chain chain reaction with a fluorescence signal. More specifically, the present invention relates to observing hybrid reactions with fluorophore during or immediately after PCR, which utilizes information about product identification, sequence change detection and quantitative.

도 1a, b는 평형 PCR 전형(A)와 역학적인 PCR 전형(B)를 나타내는 그래프이다.1A and B are graphs showing an equilibrium PCR typical (A) and a dynamic PCR typical (B).

도 2는 형광 하이브리드를 모니터하는 시간에 대한 이용한 온도를 설명하는 것이다.2 illustrates the temperature used versus time for monitoring the fluorescence hybrid.

도 3은 PCR에서 신속한 온도 변환 과정의 시간에 대한 온도를 나타내는 것이다.Figure 3 shows the temperature over time of the rapid temperature conversion process in PCR.

도 4는 30회 과정후에 네 가지 상이한 온도/시간 프로파일(A-D)와 이로써 생성된 증폭 생성물의 결과를 나타낸 것이다.4 shows the results of four different temperature / time profiles (A-D) and the resulting amplification products after 30 cycles.

도 5a, b, c는 PCR의 형광 모니터를 하는 세 가지 상이한 방법에 대한 형광 발생 메카니즘을 설명하고 있는데; (A) 이중 쇄 DNA 염료; (B) 가수분해 프로브; (C) 하이브리드 반응 프로브.5a, b, c illustrate fluorescence generating mechanisms for three different methods of fluorescence monitoring of PCR; (A) double chain DNA dyes; (B) hydrolysis probes; (C) hybrid reaction probe.

도 6은 Cy5^TM의 1가 N-하이드록시숙시니미드 에스테르의 화학적 구조를 나타낸다.6 shows the chemical structure of the monovalent N-hydroxysuccinimide ester of Cy5 ^™ .

도 7은 Cy5.5^TM의 1가 N-하이드록시숙시니미드 에스테르의 화학적 구조를 나타낸다.7 shows the chemical structure of the monovalent N-hydroxysuccinimide ester of Cy5.5 ^™ .

도 8은 플로레신(직선)의 방출 스펙트럼과 Cy5(점선)의 여기 스펙트럼을 나타낸다.8 shows the emission spectrum of floresin (straight line) and the excitation spectrum of Cy5 (dashed line).

도 9는 PCR 동안에 각 변환 과정에서 플로레신와 Cy5-라벨된 인접 하이브리드 반응 프로브간에 발생하는 공명 에너지 전달을 나타낸다.9 shows the resonance energy transfer that occurs between floresin and Cy5-labeled adjacent hybrid reaction probes during each conversion process during PCR.

도 10은 PCR 동안에 발생한 공명 에너지 전달 시그날에서 플로레신 프로브에 대한 Cy5의 비율을 다양하게 하였을 때 그 효과를 나타낸다.10 shows the effect of varying the ratio of Cy5 to floresin probe in the resonance energy transfer signal generated during PCR.

도 11은 PCR 동안에 발생한 공명 에너지 전달 시그날에서 주어진 프로브 비율에서 대한 프로브 농도를 다양하게 하였을 때 그 효과를 나타낸다.FIG. 11 shows the effect of varying probe concentrations at a given probe ratio in the resonance energy transfer signal generated during PCR.

도 12는 PCR 동안에 발생한 공명 에너지 전달 시그날에서 라벨된 올리고뉴클레오티드간에 공간의 효과를 나타낸다.12 shows the effect of space between labeled oligonucleotides in the resonance energy transfer signal that occurred during PCR.

도 13은 온도 과정에서 Taq DNA 폴리메라제(exo^-; 직선); Taq DNA 폴리메라제의 Stoffel 단편(exo^-; 점선)로 30회 변환 과정후에 바로 형광 에너지 전달에 의한 인접 프로브 하이브리드 반응에 대한 시간별 과정 및 인접 하이브리드 반응 프로브로 PCR 하는 동안에 형광 발생에서 폴리메라제 형태 등을 나타내었고; 온도는 굵은 선으로 나타내었다.13 shows Taq DNA polymerase (exo ⁻ ; straight line) at temperature; Taq DNA polymerase of the Stoffel fragment (exo ^-; dotted line) in a 30 times transformation right time course for the adjacent probe hybridization by fluorescence energy transfer and adjacent fluorescent occur during PCR as a hybridization probe after polymerase form And the like; The temperature is shown by the thick line.

도 14는 Taq DNA 폴리메라제(exo^-; 직선); Taq DNA 폴리메라제 Stoffel 단편(exo^-; 긴 점선); KlenTaq DNA 폴리메라제(exo^-; 짧은 점선)로 증폭을 하는데 변환 횟수에 대해 형광 발생 비율을 플롯하였는데; 상측 패널은 60℃에서 20초간 유지시킨 94℃ 내지 60℃사이의 변환과정이고; 중간 패널은 60℃에서 120초간 유지시킨 94℃ 내지 60℃사이의 변환과정이고; 아래 패널은 65℃에서 75℃로 서서히 온도를 올리면선 94℃ 내지 60℃사이의 변환과정을 나타낸다.14 shows Taq DNA polymerase (exo ⁻ ; straight line); Taq DNA polymerase Stoffel fragment (exo ^- long dashed line); Amplification with KlenTaq DNA polymerase (exo ^- short dashed line) was used to plot the rate of fluorescence generation relative to the number of transformations; The upper panel is a conversion process between 94 ° C. and 60 ° C. held at 60 ° C. for 20 seconds; The middle panel is a conversion process between 94 ° C. and 60 ° C. held at 60 ° C. for 120 seconds; The lower panel shows the transition between 94 ° C and 60 ° C as the temperature is slowly raised from 65 ° C to 75 ° C.

도 15는 SYBR^TMGreen I으로 모니터하였을 때 상이한 시작 주형 복사 반응 수에 대해 형광을 플롯하였는데; 이때 시작 주형 복사체의 수는 다음과 같이 정의한다;0,(△); 1,(■); 10,(―); 10²,(-) ;10³,(+) ;10⁴,(●) ;10⁵,(◇) ;10⁶,(×); 10⁷,(▲); 10⁸,(□); 10⁹,(◆).FIG. 15 plots fluorescence for different starting template radiation reaction numbers when monitored with SYBR ^™ Green I; The number of starting template copies is then defined as: 0, (Δ); 1, (■); 10, (−); 10 ² , (-); 10 ³ , (+); 10 ⁴ , (●); 10 ⁵ , (◇); 10 ⁶ , (×); 10 ⁷ , (▲); 10 ⁸ , (□); 10 ⁹ , (◆).

도 16은 이중 라벨된 가수분해 프로브로 모니터하였을 때 상이한 시작 주형 복사 반응 수에 대해 형광을 플롯하였는데; 이때 시작 주형 복사체의 수는 다음과 같이 정의한다; 0,(-); 1,(▲); 10,(○); 10²,(*); 10³,(●); 10⁴,(□); 10⁵,(+); 10⁶,(■); 10⁷,(◇); 10⁸,(×); 10⁹,(◆).FIG. 16 plots fluorescence for different starting template radiation reaction numbers when monitored with double labeled hydrolysis probes; The number of starting template copies is then defined as follows; 0,(-); 1, (▲); 10, (○); 10 ² , (*); 10 ³ , (●); 10 ⁴ , (□); 10 ⁵ , (+); 10 ⁶ , (■); 10 ⁷ , (◇); 10 ⁸ , (×); 10 ⁹ , (◆).

도 17은 인접 하이브리드 반응 프로브로 모니터하였을 때 상이한 시작 주형 복사 반응 수에 대해 형광을 플롯하였는데; 이때 시작 주형 복사체의 수는 다음과 같이 정의한다;0,(-); 1,(▲); 10,(○); 10²,(*); 10³,(●); 10⁴,(□); 10⁵,(+); 10⁶,(■); 10⁷,(◇); 10⁸,(×); 10⁹,(◆).FIG. 17 plots fluorescence for different starting template radiation reaction numbers when monitored with adjacent hybrid reaction probes; The number of starting template copies is then defined as: 0, (-); 1, (▲); 10, (○); 10 ² , (*); 10 ³ , (●); 10 ⁴ , (□); 10 ⁵ , (+); 10 ⁶ , (■); 10 ⁷ , (◇); 10 ⁸ , (×); 10 ⁹ , (◆).

도 18은 공명 에너지 전달에 의해 모니터하였을 때, 구별이 되는 두 개의 하이브리드 반응 프로브 디자인에 대해 변환 과정의 횟수에 대한 형광 비율을 나타낸 것인데; (◇)는 플로레신과 Cy5로 각각 라벨한 두 개의 하이브리드 반응 프로브이고; (◆)는 플로레신으로 라벨한 프로브와 Cy5로 라벨한 프라이머를 나타낸다.FIG. 18 shows the fluorescence ratio for the number of conversions for two distinct hybrid reaction probe designs when monitored by resonance energy transfer; (◇) are two hybrid reaction probes labeled with floresin and Cy5, respectively; (◆) represents a probe labeled with floresin and a primer labeled with Cy5.

도 19a, b, c는 PCR 동안에 세 가지 형광을 모니터하는 기술을 비교한 것으로써; 여기에서는 (A) 이중 쇄-특이적인 DNA 염료 SYBR Green I; (B) 이중 라벨된 플로레신/로다민 가수분해 프로브; (C) Cy5-라벨된 프라이머와 플로레신-라벨된 하이브리드 반응 프로브; 도 19d는 도 19a-c에서 나타낸 세 가지 모니터 기술에 대한 변수 계수를 나타낸다.Figures 19a, b, c compare the techniques of monitoring three fluorescence during PCR; (A) double chain-specific DNA dye SYBR Green I; (B) double labeled floresin / rhodamine hydrolysis probe; (C) Cy5-labeled primers and floresin-labeled hybrid reaction probes; FIG. 19D shows the parameter coefficients for the three monitor techniques shown in FIGS. 19A-C.

도 20은 SYBR Green I으로 모니터하였을 때 표준 증폭의 변환 과정 횟수에 대한 형광을 전형적인 로그상태로 나타내었다.FIG. 20 shows the typical fluorescence of the number of conversion cycles of standard amplification when monitored with SYBR Green I. FIG.

도 21은 도 20의 데이터중 20-27회에 맞춘 지수 곡선을 나타낸다.FIG. 21 shows exponential curves matched 20-27 times in the data of FIG. 20.

도 22는 증폭 데이터로부터 시작 복사체의 수를 결정하게 위해 미지의 것에 맞춘 지수 곡선이다.22 is an exponential curve fitted to the unknown to determine the number of starting copies from amplified data.

도 23은 인접 하이브리드 프로브로 각 변환 과정을 모니터하였을 때 다섯 가지 표준에 대한 변환 과정의 횟수에 대해 전형적인 형광을 나타내는데 이때 시작 복사체의 수는 다음과 같다; 103,(●); 104,(◇); 105,(▲); 106,(□); 107,(◆).FIG. 23 shows typical fluorescence for the number of conversions for five standards when monitoring each conversion with adjacent hybrid probes, where the number of starting copies is as follows; 103, (●); 104, (◇); 105, (▲); 106, (□); 107, (◆).

도 24는 도 23의 표준 데이터에 맞춘 그래프이다.24 is a graph according to the standard data of FIG. 23.

도 25는 가수분해 프로브로 각 변환 과정을 모니터하였을 때 다섯 가지 표준에 대한 변환 과정의 횟수에 대해 전형적인 형광을 나타내는데 이때 시작 복사체의 수는 다음과 같다; 1.5,(●); 15,(◇); 150,(▲); 1500,(□); 15,000,(◆).FIG. 25 shows typical fluorescence for the number of conversions for five standards when monitoring each conversion with a hydrolysis probe, where the number of starting copies is as follows; 1.5, (●); 15, (◇); 150, (▲); 1500, (□); 15,000, (◆).

도 26는 도 25의 표준 데이터에 맞춘 그래프이다.FIG. 26 is a graph adapted to the standard data of FIG. 25.

도 27은 SYBR Green I으로 모니터하였을 때, 세 가지 표준 증폭에서 변환 횟수에 대한 일반적인 형광을 로그로 나타내었는데 이때: (■);(●);(▲)이다.FIG. 27 shows the logarithm of the typical fluorescence for the number of conversions in three standard amplifications when monitored with SYBR Green I: (■); (●); (▲).

도 28은 도 27의 표준 데이터에 맞춘 다른 그래프를 나타낸다.FIG. 28 shows another graph according to the standard data of FIG. 27.

도 29a, b에서 (A)는 시간에 대한 형광을 나타낸 것이고; (B)는 시간에 대한 온도를 나타낸 것으로 이는 온도와 형광사이에 역 관계가 있음을 설명하는 것이다.(A) in Figures 29a, b shows fluorescence over time; (B) shows the temperature versus time, which explains the inverse relationship between temperature and fluorescence.

도 30은 SYBR Green I 존재하에 헤파타이티스 B 게놈의 180개 염기 쌍 단편을 증폭시키는데 시간별 온도, 시간별 형광, 온도별 형광에 대한 2D 플롯과 3D 플롯을 나타낸 것이다.FIG. 30 shows 2D plots and 3D plots for hourly temperature, hourly fluorescence, and temperature fluorescence to amplify 180 base pair fragments of the Hepatitis B genome in the presence of SYBR Green I. FIG.

도 31은 SYBR Green I 존재 하에 사람 베타-글로빈 유전자의 536개 염기 쌍 단편을 증폭시키는데 온도별 형광을 나타낸 것이다.FIG. 31 shows temperature-specific fluorescence to amplify 536 base pair fragments of the human beta-globin gene in the presence of SYBR Green I. FIG.

도 32a, b에서, (A)에서는 가수분해 프로브에 대해 온도에 따른 형광 비율의 선형 변화를 나타낸 것이고; (B)에서는 하이브리드 반응 프로브에 대해서 온도에 대한 과격한 변화를 나타낸 것이다.32A and 32B, (A) shows the linear change in fluorescence ratio with temperature for the hydrolysis probe; (B) shows a radical change in temperature with respect to the hybrid reaction probe.

도 33은 인접 하이브리드 반응 프로브 존재하에 exo^-폴리메라제로 증폭시킨 온도에 따른 형광 비율을 나타낸 것이다.FIG. 33 shows the fluorescence ratio with temperature amplified with exo ^- polymerase in the presence of adjacent hybrid reaction probes.

도 34는 인접 하이브리드 반응 프로브 존재 하에 exo^-폴리메라제로 증폭시킨 온도에 따른 형광 비율을 나타낸 것이다.FIG. 34 shows the fluorescence ratio with temperature amplified with exo ^- polymerase in the presence of adjacent hybrid reaction probes.

도 35는 인접 하이브리드 반응 프로브 존재 하에 exo^-폴리메라제로 증폭하는 동안에 온도, 시간, 형광에 대한 3차원으로 플롯한 것을 나타낸 것이다.FIG. 35 shows three-dimensional plots of temperature, time and fluorescence during amplification with exo ^- polymerase in the presence of adjacent hybrid reaction probes.

도 36은 인접 하이브리드 반응 프로브 존재 하에 exo^-폴리메라제로 증폭하는 동안에 온도, 시간, 형광에 대한 3차원으로 플롯한 것을 나타낸 것이다.FIG. 36 shows three-dimensional plots of temperature, time and fluorescence during amplification with exo ^- polymerase in the presence of adjacent hybrid reaction probes.

도 37은 헤파타이티스 B 바이러스(●;50% GC, 180bp); 베타-글로빈(▲;53.2% GC, 536bp); 전립선 특이적인 항원(X;60.3% GC, 292bp)의 PCR 증폭된 생성물의 용융 곡선을 나타낸다.37 shows Hepatitis B virus (•; 50% GC, 180 bp); Beta-globin (▲; 53.2% GC, 536 bp); Melt curves of PCR amplified products of prostate specific antigen (X; 60.3% GC, 292 bp).

도 38은 0.1℃ 내지 5.0℃의 가열 속도에서 헤파타이티스 B 바이러스의 PCR-증폭된 생성물의 용융 곡선을 나타낸다.FIG. 38 shows the melting curves of PCR-amplified products of Hepatitis B virus at heating rates between 0.1 ° C. and 5.0 ° C. FIG.

도 39는 다양한 SYBR^TMGreen I 농도에서 헤파타이티스 B 바이러스의 PCR-증폭된 생성물의 용융 곡선을 나타낸다.FIG. 39 shows melting curves of PCR-amplified products of Hepatitis B virus at various SYBR ^™ Green I concentrations.

도 40a, b에서 (A)에서는 각기 다른 상황에서 증폭된 베타-글로빈 단편 생성물의 용융 곡선을 나타낸 것이고; (B)는 생성물의 전기영동상으로 분리된 밴드를 나타내는 것으로써; 각 조건은 다음과 같다; (a)는 주형의 첨가가 없고; (b)는 엄격성이 낮은 조건하에서 첨가된 주형의 수가 10⁶복사체이고; (c)는 매우 엄격한 조건하에서 첨가된 주형의 수가 10⁶복사체이다.(A) in FIGS. 40A and B show melting curves of beta-globin fragment products amplified in different situations; (B) represents the band separated by the electrophoretic phase of the product; Each condition is as follows; (a) no addition of the template; (b) indicates that the number of templates added under conditions of low stringency is 10 ⁶ copies; (c) shows 10 ⁶ copies added under very stringent conditions.

도 41a, b에서 헤파타이티스 바이러스 단편(HBV), β-글로빈 및 이의 혼합물의 용융 곡선(A)와 용융 피크(B)를 나타낸다.41A and B show melting curves (A) and melting peaks (B) of hepatitis virus fragment (HBV), β-globin and mixtures thereof.

도 42a-d에서 (A)는 다양한 양의 β-글로빈 주형으로부터 PCR 증폭된 생성물에 대한 변환 과정 횟수에 대한 상대적인 형광을 나타낸 것이고; (B)는 다양한 생성물의 용융 피크를 나타낸 것이고; (C)는 다양한 생성물의 전기영동 밴드를 나타낸 것이고; (D)는 (A)데이터의 교정된 형광을 나타낸 것이다.(A) in FIGS. 42A-D shows the relative fluorescence of the number of conversion processes for PCR amplified products from various amounts of β-globin templates; (B) shows melting peaks of various products; (C) shows electrophoretic bands of various products; (D) shows the corrected fluorescence of (A) data.

도 43a, b에서 포낭성 섬유증 유전자와 c-erbB-2 온코진 혼합물의 PCR 증폭된 생성물의 용융 곡선(A)과 이의 용융 피크(B)를 나타낸다.The melting curves (A) and melting peaks (B) of the PCR amplified products of the cystic fibrosis gene and c-erbB-2 oncozin mixture are shown in FIGS. 43A and 43B.

도 44에서는 포낭성 섬유증 유전자(CFTR)와 c-erbB-2 (neu)의 다양한 변환 과정 횟수에서 용융 피크를 나타낸다.44 shows melting peaks at various conversion processes of cystic fibrosis gene (CFTR) and c-erbB-2 (neu).

도 45에서는 CFTR과 neu PCR 생성물의 통합시킨 용융 피크의 그래프를 나타낸 것이다.45 shows a graph of the integrated melt peaks of CFTR and neu PCR products.

도 46a, b은 인자 V Leiden 돌연변이에 이형접합성(직선)인 사람, 인자 V Leiden 돌연변이에 동형접합성(점선)인 사람, 동형 접합성 야생형(긴 점선), DNA 없는 기준(일점 쇄선)에 대한 PCR 생성물의 용융 곡선(A)과 용융 피크(B)를 나타낸다.46a, b are PCR products for humans heterozygous (straight) to factor V Leiden mutation, humans homozygous (dashed line) to factor V Leiden mutation, homozygous wild type (long dashed line), reference without DNA (dotted dashed line) Melting curve (A) and melting peak (B) are shown.

도 47은 인자 V Leiden 돌연변이에 동형접합성(직선)인 시료, 인자 V Leiden 돌연변이에 이형접합성(점선)인 시료, 동형 접합성 야생형 시료(일점 쇄선)의 PCR 생성물의 40회 동안에 지속적으로 모니터한 온도에 대한 형광 비율을 나타낸 것이다.FIG. 47 shows continuously monitored temperatures for 40 times of PCR products of homozygous (straight) to factor V Leiden mutants, heterozygous (dashed) to factor V Leiden mutants, and homozygous wild type samples (single dashed line). Fluorescence ratio is shown.

도 48은 메틸렌테트라하이드로폴레이트 유전자에 동형접합성 돌연변이(직선), 동형 접합성 야생형(긴 점선), 이형접합성 야생형(점선), DNA 없는 기준(일점 쇄선)에 대한 용융 피크를 나타낸다.FIG. 48 shows the melting peaks for homozygous mutations (straight lines), homozygous wildtypes (long dashed lines), heterozygous wildtypes (dashed lines), and DNA free reference (single dashed line) to methylenetetrahydrofolate gene.

도 49는 다양한 시작 주형의 양에서 증폭된 β-글로빈 PCR 생성물의 재 어닐링 곡선을 나타낸 것이다.FIG. 49 shows re-annealing curves of β-globin PCR products amplified in the amounts of various starting templates.

도 50은 시작 주형 농도를 결정하기 위해 이차 속도 상수를 결정하는 것을 보여준다.50 shows determining the second order rate constant to determine the starting mold concentration.

도 51은 형광 자료로부터 열 처리 과정을 조절하는 블록 다이아그램을 나타낸다.51 shows a block diagram for controlling the heat treatment process from fluorescence data.

도 52a, b에서 (A)는 20회 후에 시간에 대한 온도 곡선을 나타낸 것이고; (B)는 25회 후에 시간에 대한 형광을 나타내었는데 이때 형광 데어터로부터 열 처리 과정이 조절된다.(A) in FIG. 52A, B shows the temperature curve with time after 20 times; (B) showed fluorescence over time after 25 times, in which the heat treatment process was controlled from the fluorescence data.

PCR 동안에 하이브리드 반응을 모니터 하는 본 발명을 설명하기 전에, 본 발명은 여기에서 상술하고 있는 특정 형태, 공정 단계, 재료에 국한시키는 것이 아니고, 형태, 공정 단계 및 재료는 다소 다양하게 변할 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다. 또한 여기에서 기술하고 있는 기술적인 용어는 본 구체예를 설명하기 위함이고, 이에 제한을 두고자 함은 아니고, 본 발명의 범위는 청구범위 및 이의 등가범위에 국한됨을 인지해야 할 것이다.Prior to describing the present invention for monitoring a hybrid reaction during PCR, the present invention is not limited to the specific forms, process steps, and materials described herein, but recognizes that the form, process steps, and materials may vary somewhat. You will have to. It is also to be understood that the technical terms herein are for the purpose of describing particular embodiments only, and are not intended to be limiting. The scope of the present invention is limited to the claims and their equivalents.

명세서 및 특허청구범위에서 이용된 것과 같이, "a", "an", "the"와 같은 단수 및 부정관사에는 다른 언급이 없는 한 복수 개념을 포함한다.As used in the specification and claims, the singular and indefinite articles such as "a", "an", and "the" include plural concepts unless otherwise stated.

본 발명을 설명함에 있어, 다음의 용어는 하기의 정의에 따라 이용된 것이다.In describing the present invention, the following terms are used according to the following definitions.

여기에서 사용하는 바와 같이, "핵산", "DNA" 및 이와 유사한 용어에는 핵산 유사체, 예를 들면 포스포디에스테르 골격이외의 구조를 가지는 유사체도 포함한다. 예를 들면, 소위 당분야에 공지된 골격에 포스포디에스테르 결합대신에 펩티드 결합을 가지는 "펩티드 핵산"도 본 발명의 범위에 속한다.As used herein, "nucleic acid", "DNA" and similar terms also include nucleic acid analogs, such as those having structures other than phosphodiester backbones. For example, so-called "peptide nucleic acids" having peptide bonds instead of phosphodiester bonds in the backbone known in the art are also within the scope of the present invention.

여기에서 사용하는 바와 같이, "지속적인 모니터" 또는 이와 유사한 용어는 PCR 과정동안에 여러 차례 모니터 하는 것을 말하는데, 적절하게는 온도 전이 동안에 그리고 가장 적절하게는 각 온도 전이에서 적어도 한 개의 데이터 점을 포함하는 것이다.As used herein, "continuous monitor" or similar term refers to multiple monitoring during the PCR process, preferably including at least one data point during the temperature transition and most suitably at each temperature transition. .

여기에서 사용하는 바와 같이,"cycle-by-cycle"란 각 과정에서 한 번 PCR 반응을 모니터 하는 것을 말하는데 적절하게는 PCR의 어닐링 상 동안에 모니터 하는 것을 말한다.As used herein, "cycle-by-cycle" refers to monitoring the PCR reaction once in each process, suitably during the annealing phase of the PCR.

여기에서 사용하는 바와 같이, "형광 공명 에너지 전달 관계" 및 이와 유사한 용어는 제공 형광단으로 라벨된 올리고뉴클레오티드와 수용 형광단으로 라벨된 또 다른 올리고뉴클레오티드를 표적 핵산에 인접 하이브리드 반응하여, 제공 형광단이 공명 에너지를 수용 형광단에 전달하여, 수용 형광단이 측정 가능한 형광을 방출하는 것을 말한다. 제공 형광단과 수용 형광단이 상당 거리 떨어져 있으면, 제공 형광단이 수용 형광단에 공명 에너지를 전달할 수 없고 따라서 수용 형광단이 측정할 수 있을 정도의 형광을 만들지 않고, 따라서, 제공 형광단과 수용 형광단은 공명 에너지 전달 관계에 있지 않는 것이다. 바람직하게는, 두 개의 라벨된 올리고뉴클레오티드가 모두 프로브이고, PCR 프라이머 기능을 하지 않으면(프로브-프로브), 제공 형광단과 수용 형광단은 0-25개 뉴클레오티드내에 있고, 적절하게는 0-5개 뉴클레오티드내에 있고, 가장 적절하게는 0-2개 뉴클레오티드에 있다. 특히 적절한 공간 거리는 1개 뉴클레오티드이다. 라벨된 올리고뉴클레오티드중 한 개가 PCR 프라이머(프로브-프라이머) 기능을 하는 경우에, 제공 형광단과 수용 형광단은 적절하게는 0-15개 뉴클레오티드범위에 있고, 더욱 바람직하게는 약 4-6개 뉴클레오티드 범위에 있다.As used herein, “fluorescent resonance energy transfer relationship” and similar terms refer to a donor fluorophore by hybrid reaction between an oligonucleotide labeled as a donor fluorophore and another oligonucleotide labeled as a accepting fluorophore adjacent to a target nucleic acid. This resonance energy is transmitted to a receiving fluorophore, and the receiving fluorophore emits measurable fluorescence. If the donor fluorophore is significantly separated from the accepting fluorophore, the donor fluorophore cannot deliver resonance energy to the acceptor fluorophore and thus does not produce fluorescence as measurable as the accepting fluorophore, and therefore, the donor fluorophore and acceptor fluorophore Is not in the resonance energy transfer relationship. Preferably, if both labeled oligonucleotides are probes and do not function as a PCR primer (probe-probe), the provided fluorophore and the accepting fluorophore are within 0-25 nucleotides, suitably 0-5 nucleotides. In the most suitable 0-2 nucleotides. Especially suitable spatial distance is 1 nucleotide. When one of the labeled oligonucleotides functions as a PCR primer (probe-primer), the donor fluorophore and the accepting fluorophore are suitably in the range of 0-15 nucleotides, more preferably in the range of about 4-6 nucleotides. Is in.

여기에서 사용하는 바와 같이, "효과량"이란 선택된 효과를 내는데 충분한 양을 말한다. 예를 들면, PCR 프라이머 효과량은 PCR에 의해 핵산 단편이 증폭되기에 충분한 양을 말하는데, 단 DNA 폴리메라제, 완충액, 주형 및 PCR을 실행하는데 필수적인 당 분야에 공지된 온도 조건을 포함하는 다른 조건이 제공된다는 전제하를 두고 있다.As used herein, "effective amount" refers to an amount sufficient to produce a selected effect. For example, an effective amount of a PCR primer refers to an amount sufficient to amplify a nucleic acid fragment by PCR, provided that DNA polymerase, buffer, template, and other conditions including temperature conditions known in the art are essential for carrying out PCR. It is assumed that this is provided.

PCR은 주형의 변성 및 프라이머 어닐링를 요구한다. 이와 같은 하이브리드 반응 전이는 온도에 따라 달라진다. 증폭을 시키는 PCR 온도 과정은 고온에서 축적된 생성물을 변성시키고, 더 낮은 온도에서는 생성물에 프라이머를 어닐링시킨다. 생성물의 변성과 프라이머 어닐링의 전이 온도는 주로 GC 함량과 이 길이에 따라 달라진다. 프로브가 PCR 생성물의 내부에 하이브리드하도록 만든 경우에 프라이머의 용융 온도 또한 GC 함량, 길이, 표적에 상보성 정도에 따라 달라진다. PCR에 적합성이 있는 형광 프로브는 증폭하는 동안에 하이브리드 반응을 모니터할 수 있다.PCR requires denaturation of the template and primer annealing. Such hybrid reaction transitions vary with temperature. The PCR temperature procedure for amplification denatures the accumulated product at high temperatures and anneals the primer at lower temperatures. The denaturation of the product and the transition temperature of the primer annealing mainly depend on the GC content and this length. If the probe is made to hybridize inside the PCR product, the melting temperature of the primer also depends on the GC content, length, and degree of complementarity to the target. Fluorescent probes compatible with PCR can monitor the hybrid reaction during amplification.

본 발명에 따르면, 신속한 과정(1996년 6월 4일자 출원된 미국 특허 출원 No. 08/658,993, 1996년 6월 4일자 "PCR 공정을 모니터하는 시스템 및 이 방법"; 1995년 10월 2일자 출원된 미국 출원 08/537,612 "생물학적 시료를 신속하게 열 처리하는 방법에 상세하게 설명됨)과 연관하여 적절히 이용하였을 때, PCR의 역학적인 전형이 적절하다. 세 가지 시간대(도 1a)에서 세 가지 다른 온도에서 발생하는 세 가지 반응(변성, 어닐링, 연장)으로 PCR을 생각하는 대신에, PCR의 역학적인 전형이 더 유용하다(도 1b). 역학적인 전형으로 시간에 대한 온도 곡선은 겹치는 반응간에 지속적인 전이로 구성된다. 변성 및 어닐링이 너무 빨라서 특정 온도에서 유지 시간이 불필요하다는 것이다. 연장은 다양한 속도에서 광역의 온도범위에서 일어난다. 완전히 분석을 하려면 모든 온도에서 모든 관련 속도 상수에 대한 지식을 알아야 한다. 모든 반응의 속도 상수을 알고 있다면, "PCR의 물리화학적인 설명"을 할 수 있을 것이다. 이와 같은 속도를 결정하는데에는 정확한 시료의 온도 조절을 요구하고, 이는 온도 변환 과정동안에 반응을 모니터 하여 상당히 간단하게 할 수 있다.According to the present invention, a rapid process (US Patent Application No. 08 / 658,993, filed June 4, 1996, "System and Method for Monitoring PCR Processes", filed June 4, 1996; filed October 2, 1995) When used properly in conjunction with US application 08 / 537,612 "explained in detail in a method for rapid thermal treatment of biological samples", the epidemiologic typical of PCR is appropriate. Three different time zones (FIG. 1A) Instead of thinking of PCR as the three reactions that occur at temperature (denaturation, annealing, and extension), the epidemiologic typical of PCR is more useful (Figure 1b). The denaturation and annealing are so fast that no holding time is required at a particular temperature, and the extension occurs over a wide range of temperatures at varying speeds. Knowing the knowledge of all relevant rate constants, if you know the rate constants of all reactions, you can give a "physical chemical description of the PCR." Determining these rates requires accurate sample temperature control, This can be done quite simply by monitoring the reaction during the temperature conversion process.

도 2에서는 형광 하이브리드 반응을 모니터하기 위한 시간에 대한 유용한 온도를 설명하고 있다. 변성으로 서서히 온도를 증가시키는 동안에 생성물의 용융 곡선을 얻을 수 있다. 변성 후에 일정한 온돌 매우 천천히 온도를 낮추면, 선택적으로 생성물, 프로브 또는 프라이머 어닐링이 이어진다. 프로브의 Tm 근처의 온도를 서서히 증가시키면 프로브의 용융 곡선을 얻을 수 있다. 도 2에서 나타낸 구체예는 바로 실제 시간을 나타내는 온도 과정 동안에 모든 분석을 제공한다. 온도 과정동안에 프라이머, 프로브 또는 생성물의 하이브리드를 지속적으로 모니터하기 위해 증폭 용액의 일부분에 형광 프로브를 포함한다.2 illustrates the useful temperature versus time for monitoring the fluorescence hybrid reaction. Melt curves of the product can be obtained while denaturation gradually increases the temperature. After denaturation, constant ondol lowering the temperature very slowly, optionally followed by product, probe or primer annealing. Slowly increasing the temperature near the Tm of the probe yields the probe's melting curve. The embodiment shown in FIG. 2 provides all the analyzes during the temperature course which represents the actual time. A fluorescent probe is included in a portion of the amplification solution to continuously monitor the hybrid of the primer, probe or product during the temperature process.

여기에 포함하는 형광 하이브리드 반응 기술은 신속한 과정에 근거를 두고 있는데, 이의 장점은 신속하고 특이성이 있다는 것이다.The fluorescent hybrid reaction technology included here is based on a rapid process, the advantage of which is that it is fast and specific.

도 3에서는 신속한 PCR 과정동안에 시료의 온도 프로파일을 나타낸 것이다. 이 도면에서 변성 및 어닐링에서 온도가 "스파이크"(그래프상의 삐죽한 끝모양)로 나타나는데, 이는 PCR 동안에 통상적인 온도 변환과정의 넓고 평탄하게 나타나는 것과는 반대되는 것(예를 들면, 도 1a)이다. 도 4에서 보면, 신속한 온도 과정은 통상적인 온도 과정과는 대조적인데, 이때 30회 증폭 과정이 15분 이내에 종료되고, 생성된 PCR 생성물에는 많은 소수의 부산물을 포함한다. 따라서, 신속한 과정에서 증폭에 요구되는 시간을 약 10배정도로 줄일 수 있고, 특이성은 개선시킬 수 있다.Figure 3 shows the temperature profile of the sample during the rapid PCR process. In this figure the temperature in denaturation and annealing is shown as "spikes" (the jagged edges on the graph), as opposed to the broad and flat appearance of a typical temperature conversion process during PCR (eg, Figure 1A). 4, the rapid temperature process is in contrast to the conventional temperature process, in which the 30 amplification processes are completed within 15 minutes, and the resulting PCR product contains a large number of by-products. Therefore, the time required for amplification in a rapid process can be reduced by about 10 times, and the specificity can be improved.

실시예 1Example 1

도 4에서는 30회 과정 후에 네 가지 상이한 온도/시간 프로파일(A-D)과 이의 증폭 생성물의 결과를 나타낸다. 도 4에서 프로파일 A와 B는 선행기술의 마이크로퓨즈 튜브를 이용하여 기존의 히팅 블록(heating block)에서 수득한 것이다. 도 4에서 볼 수 있는 것과 같이, 온도간에 전이가 느리고, 프로파일 A와 B에는 비-특이적인 밴드가 많이 나타난다. 프로파일 B에서는 각 온도에서 각 시료가 유지되는 시간을 제한하여 비-특이적인 밴드의 일부를 제거됨을 알 수 있는데(프로파일 A와 대조), 이는 시간이 짧을수록 더 바람직한 결과를 얻는다는 것을 나타낸다.4 shows the results of four different temperature / time profiles (A-D) and their amplification products after 30 cycles. Profiles A and B in FIG. 4 are obtained from existing heating blocks using prior art microfuse tubes. As can be seen in Figure 4, the transition between temperatures is slow, and many non-specific bands appear in profiles A and B. Profile B shows that some of the non-specific bands are removed by limiting the time each sample is held at each temperature (as opposed to Profile A), indicating that shorter time results in more desirable results.

프로파일 C와 D는 신속한 온도 싸이클러(cycler)를 이용하여 얻은 것이다. 도 4에서 볼 수 있는 것과 같이, 증폭은 특이적이고, 60초 연장 시간(C)에서도 수득율이 최고로 나타나고, 10초 연장 시간(D)에서도 전체적으로 만족할만한 결과가 나타났다.Profiles C and D were obtained using a rapid temperature cycler. As can be seen in Figure 4, the amplification is specific, yields are best at 60 sec extension time (C), and overall satisfactory results are also obtained at 10 sec extension time (D).

사람의 게놈 DNA에서 얻은 β-글로빈 536bp 단편을 증폭시키기 위한 최적의 시간 및 온도를 또한 결정한다. 변성(93℃)과 어닐링(55℃)을 1초 이내에 실행하는 경우에 증폭 수득율과 생성물의 특이성이 최적으로 나타났다. 변성시간 또는 어닐링 시간을 더 길게 하였을 경우에는 장점이 없었다. 77℃에서 연장 시간을 늘릴 경우에 수득율이 증가되었으나, 10-20초보다 더 길에 연장시간을 변화하였을 경우에는 거의 차이가 없었다. 이와 같이 기대이상의 결과에서 DNA를 증폭시키는데 이용된 기존의 장치로는 반응의 물리적 그리고 효소적인 요구사항을 최적화 시키는데 필수적인 조건을 최대화할 수 없다는 것을 알 수 있다.The optimal time and temperature for amplifying the β-globin 536 bp fragment obtained from human genomic DNA are also determined. When denaturation (93 ° C.) and annealing (55 ° C.) were performed within 1 second, the yield of amplification and the specificity of the product were optimal. There was no advantage for longer denaturation time or annealing time. The yield increased with increasing the extension time at 77 ° C., but there was little difference when the extension time was changed longer than 10-20 seconds. These unexpected results suggest that existing devices used to amplify DNA do not maximize the conditions necessary to optimize the physical and enzymatic requirements of the reaction.

추가 정보는 C.T. Wittwer et al., Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis delta F(508) Locus, 39 Clinical Chemistry 804 (1993) and C.T. Wittwer et al., Rapid DNA Amplification, THE POLYMERASE CHAIN REACTION 174(1994)에서 얻을 수 있을 것이고, 이들은 참고문헌으로 첨부한다. 형광을 얻는데 이용된 기구와 신속한 온도변환을 위한 장치는 미국 출원 No. 08/537,612에서 알 수 있다.For further information, see C.T. Wittwer et al., Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis delta F (508) Locus, 39 Clinical Chemistry 804 (1993) and C.T. Wittwer et al., Rapid DNA Amplification, THE POLYMERASE CHAIN REACTION 174 (1994), which are hereby incorporated by reference. The apparatus used to obtain fluorescence and the device for rapid temperature conversion are described in US application No. 08 / 537,612.

초기에 언급한 것과 같이, 폴리메라제 연쇄 반응은 신속하게 실행하여야 한다. 신속한 열 전달을 실행하는데 추가하여, 본 발명에 따른 DNA 증폭을 형광으로 지속적으로 모니터하기 위해서는 광학적으로 깨끗한 모세관 튜브를 이용해야 한다.As mentioned earlier, the polymerase chain reaction should be run quickly. In addition to performing rapid heat transfer, optically clear capillary tubes must be used to continuously monitor DNA amplification according to the invention with fluorescence.

형광 프로브를 이용하면, DNA 증폭을 감지할 수 있다. 유용한 프로브로는 이중 쇄-DNA 특이적인 염료 및 서열-특이적인 프로브를 포함한다. DNA 증폭에 관한 세 가지 다른 형광 기술을 도 5에 비교하였다. 도 5a에서는 형광은 이중-쇄 특이적인 DNA 염료로 감지하였을 때, PCR 생성물의 하이브리드반응에 따라 달라진다는 것을 알 수 있다. 도 5b에서는 5'-엑소뉴클레아제 퀸칭 프로브의 가수분해에 따라 달라지는데 이는 전술한 바 있다. 도 5c에서는 두 개의 인접한 프로브에 있는 형광단간에 공명 에너지 전달에 기초한 하이브리드 반응 과정의 다이아그램을 나타낸 것이다. 도 5a의 방법은 서열 특이적인 것은 아니고, 생성물 특이성은 본 발명의 특징 중에 하나인 용융 곡선으로 결정할 수 있다. 도 5b와 5c는 모두 서열 특이적이다. 그러나, 하이브리드 반응 방법은 본 발명의 또 다른 특징인 용융 곡선으로 분석할 수 있다.Fluorescence probes can be used to detect DNA amplification. Useful probes include double chain-DNA specific dyes and sequence-specific probes. Three different fluorescence techniques for DNA amplification were compared in FIG. 5. In Figure 5a it can be seen that the fluorescence depends on the hybridization of the PCR product when detected with a double-chain specific DNA dye. In FIG. 5B it depends on the hydrolysis of the 5′-exonuclease quenching probe, as described above. 5C shows a diagram of a hybrid reaction process based on the resonance energy transfer between fluorophores in two adjacent probes. The method of FIG. 5A is not sequence specific and product specificity can be determined by a melting curve, which is one of the features of the present invention. 5B and 5C are both sequence specific. However, hybrid reaction methods can be analyzed by melt curves, another feature of the present invention.

도 5b에서 나타낸 것과 같이 프로브의 가수분해와 연관된 반응 및 도 5c의 하이브리드 프로브와 연관된 반응에서 형광을 모니터할 때, 제공 형광단과 수용 형광단 모두에서 방출되는 형광을 측정하는 것이 유익하다. 실제, 가수분해 프로브에서 방출되는 형광의 대부분은 제공 형광단에서 나오는 것이고, 하이브리드 프로브에서 방출되는 형광의 대부분은 수용 형광단에서 나오는 것이다.When monitoring fluorescence in the reaction associated with hydrolysis of the probe as shown in FIG. 5B and in the reaction associated with the hybrid probe of FIG. 5C, it is beneficial to measure the fluorescence emitted from both the providing fluorophore and the receiving fluorophore. In fact, most of the fluorescence emitted from the hydrolysis probes is from the donor fluorophore, and most of the fluorescence emitted from the hybrid probes is from the accepting fluorophore.

이중 쇄-특이적인 DNA 염료 선택; 당업자는 형광 기술에 에티디움 브롬화물을 친숙하게 사용하였을 것이다. 증폭하는 동안에 이중-쇄 특이적인 플로레신 염료가 존재하는 경우에, 이중 쇄의 생성물이 많이 만들어질수록 일반적으로 플로레신는 증가된다(R. Higuchi et al., Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences, 10 Bio/Technology 413-417(1992)). 삽입물질인 YO-PRO-1을 이용하여 헤파타이티스 C RNA의 형광 PCR 검사를 한 것은 본 기술분야에 공지의 것이다(T. Ishiguro et al.,에 의해 형광 삽입체 존재 하에 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 헤파타이티스 C 바이러스 RNA의 상동성 정량 검사를 한 것이다, 229 Anal. Biochem. 207-213 (1995)). 당업자에서 공지된 SYBR^TMGreen I(Molecular Probes of Eugene, Oregon,에서 구할 수 있음)은 이중-쇄-특이적인 염료로 적절하다. 이와 같은 염료의 분자 구조는 상업상 비밀이나, 제조업자는 겔에서 DNA를 감지하는데에는 더 감응성이 있는 이중-쇄 특이적인 염료로써 이를 권하고 있다. 그러나, SYBR^TMGreen I은 열에 불안정하고 따라서, 통상적인 방법 즉, 반응 혼합물의 온도를 연장 시간동안에는 용융 온도에서 유지해야하는 상황 등의 PCR 반응에서 형광을 모니터하는데에는 유용하지 못하다. 이와 같은 열에 불안정한 성질로 인하여, 연장 시간동안에 용융 온도를 유지하지 않을 경우에 SYBR^TMGreen I을 이용하여 PCR 반응을 모니터할 수 있다는 것을 발견한 것은 예상하지 못한 것으로 예를 들면, 전술한 역한 전형에 따라 신속한 변환 과정으로 PCR을 실행하는 경우를 말한다.Double chain-specific DNA dye selection; One skilled in the art would have familiarly used ethidium bromide in fluorescence techniques. In the presence of double-chain specific fluorescein dyes during amplification, the more the double-chain product is made, the more generally the leucine is increased (R. Higuchi et al., Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences, 10 Bio / Technology 413-417 (1992). Fluorescence PCR testing of Hepatitis C RNA using the insert YO-PRO-1 is known in the art (polymerase chain reaction in the presence of fluorescent inserts by T. Ishiguro et al., Homology quantification of Hepatitis C virus RNA by 229 Anal. Biochem. 207-213 (1995)). SYBR ^™ Green I (available from Molecular Probes of Eugene, Oregon,) known to those skilled in the art is suitable as a double-chain-specific dye. The molecular structure of such dyes is a trade secret, but manufacturers recommend this as a double-chain specific dye that is more sensitive to DNA detection in gels. However, SYBR ^™ Green I is thermally unstable and therefore not useful for monitoring fluorescence in conventional methods, ie in situations where the temperature of the reaction mixture must be maintained at the melting temperature for extended periods of time. Due to this thermally unstable nature, it has been unexpected to find that PCR reactions can be monitored using SYBR ^™ Green I if the melting temperature is not maintained for extended periods of time. In this case, the PCR is performed in a rapid conversion process.

실시예 2Example 2

상이한 이중-쇄 특이적인 DNA 염료를 이용하여, 10,000 주형 복사체로부터 사람 β-글로빈 유전자의 PCO3/PCO4 프라이머쌍에서 110개 염기 쌍 단편이 증폭되는 것을 모니터 함으로써 비교를 한다. 당 분야에 공지인 표준 포스포아미데이트 화학물질 즉, Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus(Piscataway, New Jersey)를 이용하여 프라이머를 합성한다. 사람의 β-글로빈 프라이머 PC03/PC04(110 염기쌍)에 대해서는 C.T. Wittwer et al., "온풍으로 모세관에서 자동화된 폴리메라제 연쇄 반응" 17 Nucl. Acids. Res. 4353-4357 (1989),에서 상술하고 있고 이는 참고문헌으로 첨부한다. DNA 증폭은 실시예에서 다른 언급이 없는 한, 다음의 조건하에서 실행한다; 50mM Tris, pH 8.5(25℃), 3mM MgCl₂, 500㎍/㎖ 소 혈청 알부민, 50μM의 각 프라이머, 0.2mM 데옥시뉴클레오시드 3인산염, 시료 5㎕당 Taq 폴리메라제. 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전시켜(D.M. Wallace, "핵산의 소규모 및 대규모 페놀 추출 및 에탄올 침전법" 152 Methods in Enzymology 33-48 (1987), Centricon 30 마이크로농축기(Amicon, Danvers, Massachusetts)를 통하여 반복적으로 세척하여 프라이머를 제거하여, 생성물을 정제하고, 정제된 증폭 생성물은 DNA 주형으로 이용한다. 260㎚에서 흡수도를 측정하여 주형의 농도를 결정한다. 주형의 A(260):A(280) 비율은 7이상이다.Comparisons are made by monitoring the amplification of 110 base pair fragments in PCO3 / PCO4 primer pairs of the human β-globin gene from 10,000 template copies using different double-chain specific DNA dyes. Primers are synthesized using standard phosphoramidate chemicals known in the art, ie, Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, New Jersey). For human β-globin primer PC03 / PC04 (110 base pairs), CT Wittwer et al., “Automated Polymerase Chain Reaction in Capillaries with Warm Air” 17 Nucl. Acids. Res. 4353-4357 (1989), which is hereby incorporated by reference. DNA amplification is carried out under the following conditions, unless otherwise stated in the Examples; 50 mM Tris, pH 8.5 (25 ° C.), 3 mM MgCl ₂ , 500 μg / ml bovine serum albumin, 50 μM of each primer, 0.2 mM deoxynucleoside triphosphate, Taq polymerase per 5 μl of sample. Phenol / Chloroform Extraction and Ethanol Precipitation (DM Wallace, “Small and Large Scale Phenol Extraction and Ethanol Precipitation of Nucleic Acids,” 152 Methods in Enzymology 33-48 (1987), repeated through Centricon 30 microconcentrators (Amicon, Danvers, Massachusetts) The primers were purified by removing the primers, and the purified amplification products were used as DNA templates The absorbance was measured at 260 nm to determine the concentration of the template A (260): A (280) ratio of the template. Is 7 or more.

SYBR^TMGreen I(Molecular Probes, Eugene, Oregon)을 1:10,000 희석비로 이용하고, 에티디움 브롬화물은 5㎕/㎖이고, 아크리딘 오렌지는 3㎕/㎖이다. 이와 같은 농도는 각 염료를 이용한 증폭동안데 관찰되는 형광 시그날을 최대화하기 위해 최적 농도로 결장한 것이다. xenon arc로부터 450㎚-490㎚ 인터페이스 필터를 통하여 여기시키고, 단 에티디움 브롬화물은 520-550㎚에서 여기시킨다. SYBR^TMGreen I의 경우에, 520-550에서 방출을 모니터한다. 580-620㎚를 통하여 에티디움 브롬화물 형광을 관찰한다. 아크리딘 오렌지 시그날은 그린(520-550㎚)에 대한 적색(>610㎚) 형광의 비율로 얻는다. 증폭시키기 전에 시료의 형광은 60℃에서 35회(최대 94℃, 60℃에서 20초)후의 형광과 비교를 한다. 형광은 SYBR^TMGreen I의 경우에 5.3배 증가되었고, 에티디움 브롬화물의 경우에는 1.7배 증가되었다. 별도의 실험으로, SYBR^TMGreen I에서 나오는 형광은 70℃에서 30분 이상 안정하다. 또한 가시광선으로도 여기할 수 있어 편리하고, 에티디움 브롬화물보다 돌연변이 유발 물질이 더 적은 것이다. 모든 경우에서 배경 형광은 주로 프라이머로 인한 것이다.SYBR ^™ Green I (Molecular Probes, Eugene, Oregon) is used at a dilution of 1: 10,000, ethidium bromide is 5 μl / ml and acridine orange is 3 μl / ml. Such concentrations are missing at the optimal concentrations to maximize the fluorescence signal observed during amplification with each dye. Excited from the xenon arc through a 450 nm-490 nm interface filter, except that the ethidium bromide is excited at 520-550 nm. For SYBR ^™ Green I, emission is monitored at 520-550. Observe ethidium bromide fluorescence through 580-620 nm. Acridine orange signals are obtained at a ratio of red (> 610 nm) fluorescence to green (520-550 nm). Prior to amplification, the fluorescence of the sample is compared with the fluorescence after 35 cycles at 60 ° C. (maximum 94 ° C., 20 sec. Fluorescence was increased 5.3 times for SYBR ^™ Green I and 1.7 times for ethidium bromide. In a separate experiment, the fluorescence from SYBR ^™ Green I is stable for at least 30 minutes at 70 ° C. It is also convenient to be excited by visible light and has fewer mutagens than ethidium bromide. In all cases the background fluorescence is mainly due to the primer.

SYBR^TMGreen I은 PCR을 형광으로 모니터하는 경우에 바람직한 이중-쇄 특이적인 염료인데, 그 이유는 감응성이 뛰어나고, 이중 쇄와 일중쇄 핵산간에 분별력이 훨씬 크기 때문이다. SYBR^TMGreen I은 임의 증폭에 이용할 수 있고, 비용도 저렴하다. 또한, 생성물 특이성은 용융 곡선을 분석하여 얻을 수 있다.SYBR ^™ Green I is a preferred double-chain specific dye when PCR is monitored by fluorescence because of its high sensitivity and much greater discrimination between double and single chain nucleic acids. SYBR ^™ Green I is available for random amplification and is inexpensive. Product specificity can also be obtained by analyzing the melting curve.

하이브리드 프로브용 공명 에너지 전달 염료의 선택; 두 개의 형광단이 물리적으로 근접하고, 한 개의 형광단에서 나오는 방출 스펙트럼이 다른 형광단의 여기 스펙트럼과 겹친다면, 형광 공명 에너지 전달은 2개의 형광단사이에서 발생할 수 있다. 최근의 많은 문헌에서 형광 공명 에너지 전달에 대한 서두 이론을 볼 수 있다. 공명 에너지 전달 속도는 다음과 같은 수학식으로 나타낼 수 있다;Selection of resonance energy transfer dyes for hybrid probes; If two fluorophores are physically in close proximity and the emission spectrum from one fluorophore overlaps the excitation spectrum of the other fluorophore, fluorescence resonance energy transfer can occur between the two fluorophores. In recent literature, an introductory theory of fluorescence resonance energy transfer can be found. The resonance energy transfer rate can be expressed by the following equation;

공명 에너지 전달 속도=(8.785E-5)(t^-1)(k^-2)(n^-4)(q_D)(R^-6)(J_DA)Resonance Energy Transfer Rate = (8.785E-5) (t ^-1 ) (k ^-2 ) (n ^-4 ) (q _D ) (R ^-6 ) (J _DA )

이때,At this time,

t = 수용체가 없을 때 제공체의 여기된 상태의 수명t = lifetime of the excited state of the donor in the absence of the receptor

k²= 제공자와 수용자간에 정위 인자k ² = stereotactic factor between provider and receiver

n = 중재 매체에 가시광의 굴절 지수n = refractive index of visible light in the media

q_D= 수용체가 없을 때 제공체의 양자 효과q _D = quantum effect of donor in absence of receptor

R = 제공체와 수용체간의 거리(Å)R = distance between donor and acceptor

J_DA= 모든 겹치는 파장에서 W에 대해 적분(F_D)(e_A)(W⁴)J _DA = Integral (F _D ) (e _A ) (W ⁴ ) for W at all overlapping wavelengths

이때, F_D= 제공체의 피크 정상화된 형광 스펙트럼Where F _D = peak normalized fluorescence spectrum of the donor

e_A= 수용체(M^-1㎝^-1)의 몰 흡수 계수e _A = molar absorption coefficient of the receptor (M ^-1 cm ^-1 )

W = 파장(㎚)W = wavelength (nm)

임의 주어진 제공체와 수용체의 경우에, 공명 에너지 전달이 50%되는 거리를 계산할 수 있고, 이를 R₀로 정의한다. 공명 에너지 전달 속도는 제공체와 수용체간의 거리의 6번째 멱에 따라 달라지기 때문에, 공명 에너지 전달은 R₀로부터 R이 변화됨에 따라 신속하게 변화된다. 2R₀에서, 매우 적은 공명 에너지 전달이 이루어지고, 0.5R₀에서는 전달 효울이 거의 완전하다(단, 다른 우세한 여기를 제거하는 형태(즉 상쇄에 의한 제거)가 없는 조건). 많은 상이한 제공체와 수용체 쌍에 대한 R₀값을 측정하는데 이는 22 내지 72Å사이에서 다양하다.For any given donor and receptor, the distance at which the resonance energy transfer is 50% can be calculated, which is defined as R ₀ . Since the resonance energy transfer rate depends on the sixth time of the distance between the donor and the acceptor, the resonance energy transfer changes rapidly as R changes from R ₀ . At 2R ₀ , very little resonance energy transfer is achieved, and at 0.5R ₀ the transfer effect is almost complete, provided that there is no form of eliminating other predominant excitations (ie elimination by offset). R ₀ values for many different donor and receptor pairs are measured, which vary between 22-72 Hz.

이중 나선 DNA의 경우에, 약 34Å의 거리로 10개 염기가 떨어져 있다. 제공체와 수용체 형광단으로 DNA 염기를 라벨링함으로써, 공명 에너지 전달을 이용하면, 분광광도의 규정에따라 DNA의 이중 나선의 형태를 관찰하고, 4가지 방식의 DNA 결합 구조를 분석할 수 있다. 공명 에너지 전달을 이용하면, 하이브리드 반응을 모니터할 수 있다. 라벨된 올리고뉴클레오티드를 라벨된 주형 쇄에 하이브리드하는 경우에, R은 R₀이상에서부터 R₀이하로 되고, 공명 에너지 전달이 급격히 증가된다. 또는, 공명 에너지 전달에서 유사한 변화를 주기 위해, 2개의 라벨된 프로브를 동일한 주형 쇄에 하이브리드시킬 수 있다.In the case of double-stranded DNA, 10 bases are separated by a distance of about 34 μs. By labeling DNA bases with donors and receptor fluorophores, using resonance energy transfer, one can observe the form of double helixes of DNA in accordance with the definition of spectrophotometry and analyze the DNA binding structure in four ways. Using resonance energy transfer, the hybrid reaction can be monitored. In the case of a hybrid with the oligonucleotide label labeled nucleotide template strand, R is from ₀ or more to less than R R _0, yi resonance energy transfer is increasing rapidly. Alternatively, two labeled probes can be hybridized to the same template chain to give a similar change in resonance energy transfer.

하이브리드 반응을 모니터하는데 실제 공명 에너지 전달을 이용하는 것은 요구되는 감응성 및 얼마나 많은 시간이 이용되는지에 따라 달라진다. 1nM 라벨된 프로브오 경쟁적인 하이브리드 반응을 이용하면, PCR-증폭된 DNA는 40℃에서 15분후에 감지된다. 각 증폭과정에서 PCR 생성물을 편리하게 정량화할 수 있다. 또한, 프로브의 하이브리드 정도는 온도 과정내에서 모니터할 수 있다(B. Young & M. Anderson, Quantitative analysis of solution hybridization, In: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach 47-71, (B. Hames, S. Higgins eds., 1985)). 프로브의 농도가 표적의 농도보다 훨씬 큰 경우에, 하이브리드 반응 속도는 프로브 농도에 역비례한다. 예를 들면, 프로브 농도를 배로 늘리면, 하이브리드 반응 시간은 절단으로 감소된다. PCR 동안에 cycle-by-cycle 모니터를 하고자하는데 필수적인 요건이 프로브의 농도가 높아야 하는 것으로 그 이유는 하이브리드 반응 부위가 폴리메라제 연장에 의해 차단되기 전에 일어나기 때문이다.The use of real resonance energy transfer to monitor hybrid reactions depends on the sensitivity required and how much time is used. Using competitive hybrid reactions with 1 nM labeled probes, PCR-amplified DNA is detected after 15 minutes at 40 ° C. PCR products can be conveniently quantified during each amplification process. In addition, the degree of hybridization of the probe can be monitored within the temperature process (B. Young & M. Anderson, Quantitative analysis of solution hybridization, In: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach 47-71, (B. Hames, S. Higgins eds., 1985). If the concentration of the probe is much greater than the concentration of the target, the hybrid reaction rate is inversely proportional to the probe concentration. For example, doubling the probe concentration reduces hybrid reaction time with cleavage. An essential requirement for cycle-by-cycle monitoring during PCR is that the concentration of the probe must be high because the hybrid reaction site occurs before it is blocked by polymerase extension.

PCR 동안에 하이브리드 반응을 모니터하는데 요구되는 높은 프로브 농도는 독특한 특징을 가지는 공명 에너지 전달 쌍을 요구한다. 빛에 의한 제공자(D)와 수용자(A)의 여기를 고려해야 한다. 직접적으로 여기된 형광단(D)와(A)의 수는 여기 파장에서 각 형광단의 여기 계수에 비례하거나 또는 다음과 같이 표현을 할 수 있다.The high probe concentrations required to monitor hybrid reactions during PCR require resonance energy transfer pairs with unique characteristics. Consideration of excitation of the donor (D) and the receiver (A) by light. The number of directly excited fluorophores (D) and (A) may be proportional to the excitation coefficient of each fluorophore at the excitation wavelength, or may be expressed as follows.

직접 여기된 D 분자의 수 = (K)(e_D)Number of directly excited D molecules = (K) (e _D )

직접 여기된 A 분자의 수 = (K)(e_A)Number of directly excited A molecules = (K) (e _A )

이때, K는 비례 상수이다.K is a proportional constant.

형광, 공명 에너지 전달 및 열 퀸칭으로 요약된 다른 공정에 의해 제공자의 탈-여기(de-excitation)가 일어날 수 있다. p_F=공명 에너지 전달 확률이고, p_TD= 제공자의 열 퀸칭 확률인 경우에, 제공자의 형광 확률은 다음과 같이 나타낼 수 있다 ; 1-p_F-p_TD De-excitation of the donor can occur by other processes summarized by fluorescence, resonance energy transfer and thermal quenching. If p _F = resonance energy transfer probability and p _TD = donor's thermal quenching probability, the donor's fluorescence probability can be expressed as follows; 1-p _F -p _TD

그리고, 형광 제공 분자의 수는 다음과 같이 나타낸다; (K)(e_D)(1-p_F-p_TD)And the number of fluorescence providing molecules is represented as follows; (K) (e _D ) (1-p _F -p _TD )

제공자 방출 윈도우(예를 들면, 밴드패스 필터 윈도우)에서 제공자 방출을 감지하는 확률이 p_DD라면, 관찰된 제공체 방출의 수는 다음과 같이 나타낼 수 있다; (p_DD)(K)(e_D)(1-p_F-p_TD)If the probability of detecting provider emission in a provider emission window (eg, bandpass filter window) is p _DD , the number of observed provider emissions can be expressed as follows; (p _DD ) (K) (e _D ) (1-p _F -p _TD )

여기된 수용체 형광단의 수는 이와 같은 직접 여기된 것과 공명 에너지 전달에 의해 여기된 것의 합이다; (K)(e_A)+(K)(e_D)(p_F)The number of excited receptor fluorophores is the sum of these directly excited and excited by resonance energy transfer; (K) (e _A ) + (K) (e _D ) (p _F )

p_IA= 수용체의 열 퀸칭 확률이라면, 수용체 형광 확률은 다음과 같다; 1-p_IA If p _IA = thermal quenching probability of the receptor, then the receptor fluorescence probability is as follows; 1-p _IA

그리고, 형광 수용체 분자의 수는 다음과 같이 나타낼 수 있다; [(K)(e_A)+(K)(e_D)(p_F)][1-(p_TA)]And the number of fluorescent receptor molecules can be expressed as follows; [(K) (e _A ) + (K) (e _D ) (p _F )] [1- (p _TA )]

수용체 방출 윈도우에서 수용체 방출을 감지하는 확률을 p_AA라 한다면, 관찰된 수용체 방출의 수는 다음과 같다; (p_AA)[(K)(e_A)+(K)(e_D)(p_F)][1-(p_TA)]If the probability of detecting receptor release in the receptor release window is p _AA , the number of observed receptor releases is as follows; (p _AA ) [(K) (e _A ) + (K) (e _D ) (p _F )] [1- (p _TA )]

마지막으로, 수용체 방출 윈도우에서 제공체 방출 확률이 p_DA라면, 수용체 방출 윈도우에서 관측된 방출(D와 A 모두)의 수는 다음과 같다;Finally, if the probability of donor release in the receptor release window is p _DA , the number of releases (both D and A) observed in the receptor release window is as follows;

(p_AA)[(K)(e_A)+(K)(e_D)(p_F)][1-(p_TA)]+(p_DA)(K)(e_D)(1-p_F-p_TD)(p _AA ) [(K) (e _A ) + (K) (e _D ) (p _F )] [1- (p _TA )] + (p _DA ) (K) (e _D ) (1-p _F -p _TD )

형광이 상대적인 것이고, K는 모든 경우에 존재하기 때문에, 만약 K를 빼고, 다시 정리한다면, 제공체 윈도우에서 관측된 강도는 [(제공체 여기)-(에너지 전달)]에 비례를 할 것이고;Since fluorescence is relative and K is present in all cases, if K is subtracted and rearranged, the intensity observed in the donor window will be proportional to [(provider excitation)-(energy transfer)];

1) (e_D)(p_DD)(1-p_TD)-(e_D)(p_DD)(p_F)1) (e _D ) (p _DD ) (1-p _TD )-(e _D ) (p _DD ) (p _F )

그리고, 수용체 윈도우에서 관찰된 강도는 (수용체 여기) + (에너지 전달) - (수용체 윈도우에서 제공체 방출)에 비례한다;And, the intensity observed at the receptor window is proportional to (receptor excitation) + (energy transfer)-(provider release at the receptor window);

2) (e_A)(p_AA)(1-p_TA)+(e_D)(p_DD)(p_F)(1-p_TA)+(e_D)(p_DA)(1-p_TD-p_F)2) (e _A ) (p _AA ) (1-p _TA ) + (e _D ) (p _DD ) (p _F ) (1-p _TA ) + (e _D ) (p _DA ) (1-p _TD- p _F )

공명 에너지 전달이 증가할 때, 제공체 시그날은 감소되고, 수용체 시그날은 증가된다. 시그날 변화율은 각 윈도우에 배경 빛 강도에 따라 달라진다. 프로브의 농도가 높으면, 이와 같은 배경의 빛 강도가 높다. PCR 동안에, 모니터할 필요가 있는 표적(생성물)의 농도를 다양하게 하면, 표적 농도에 제공체 농도를 맞추는 것이 불가능하다. 과량의 제공체 분자는 제공체와 수용체 윈도우 모두에서 배경의 빛 강도에 기여하게 되고 부분적으로는 에너지 전달 현상을 차단한다. 수용체 윈도우의 배경 빛은 수용체 윈도우에 있는 제공체 방출에서도 나오고, 수용체의 직접적인 여기에 의해서도 나온다. 이와 같은 배경은 e_A와 p_DA를 낮게 하면 최소화할 수 있다.As the resonance energy transfer increases, the donor signal decreases and the receptor signal increases. The rate of signal change depends on the background light intensity in each window. If the concentration of the probe is high, the light intensity of such a background is high. During PCR, varying the concentration of target (product) that needs to be monitored makes it impossible to match the donor concentration to the target concentration. Excess donor molecules contribute to the background light intensity in both the donor and acceptor windows and partially block energy transfer. The background light of the receptor window comes from the release of the donor in the receptor window and also from the direct excitation of the receptor. This background can be minimized by lowering e _A and p _DA .

핵산을 감지하는데 흔히 이용되는 플로레신/로다민 플로레신 에너지 전달 쌍은 높은 배경 형광을 가진다. 직접적인 수용체 여기(e_A, ca. 10% e_MAX)와 수용체 방출을 감지하는데 이용되는 파장에서 제공체의 여기(p_DA, ca. 20% peak emission)는 높다. 이와 같은 쌍을 이용하면, 프로브의 농도가 표적 농도에 근접하고, 하이브리드 반응을 완료할 수 있도록 충분한 시간이 있는 경우에 하이브리드 반응을 모니터할 수 있다. 상당히 높은 프로브 농도를 요구하고, PCR에서 주형의 농도가 지속적으로 변화되기 때문에 지속적으로 PCR을 모니터하는데 한쌍의 형광단을 이용하는 것이 유익한 것은 아니다.Floresin / rhodamine floresin energy transfer pairs commonly used to detect nucleic acids have high background fluorescence. The donor excitation (p _DA , ca. 20% peak emission) is high at the wavelengths used to detect direct receptor excitation (e _A , ca. 10% e _MAX ) and receptor emission. Using this pair, the hybrid reaction can be monitored when the concentration of the probe is close to the target concentration and there is enough time to complete the hybrid reaction. It is not beneficial to use a pair of fluorophores to monitor the PCR continuously because it requires a fairly high probe concentration and the concentration of the template in the PCR is constantly changing.

하이브리드 반응에 의한 PCR 동안에 생성물 농도를 모니터하는 것은 과거에는 불가능하였는데, 그 이유는 수용 가능한 공명 에너지 전달 쌍을 발견하지 못했기 때문이다. 하이브리드 반응에 직접적인 "비-경쟁성" 감지에 공명 에너지 전달을 이용하려는 시도는 거의 없었다. 예를 들면, 미국 특허 5,565,322에서는 "수용체에의해 재방출시에 관찰되는 에너지 전달 효과는 상대적으로 낮다고 언급하고 있다". 수초 내에 상당한 하이브리드 반응을 일으키는데 충분한 프로브 농도에서, 배경 형광은 너무 높다.Monitoring product concentrations during PCR by hybrid reactions was not possible in the past because no acceptable resonance energy transfer pairs were found. There have been few attempts to use resonance energy transfer for "non-competitive" sensing directly in hybrid reactions. For example, US Pat. No. 5,565,322 states that the energy transfer effect observed upon re-release by the receptor is relatively low. At probe concentrations sufficient to cause significant hybrid reactions within seconds, the background fluorescence is too high.

플로레신는 가장 흔히 이용되는 형광단이다. 이의 여기 계수와 양자 계수는 높기 때문에, 이는 현미경, 면역검사, 유동 세포측정 등에 광범위하게 이용된다. 통상적으로 이용되는 공명 에너지 전달 쌍의 제공체는 로다민이다. Cy5는 흔한 적색-방출 형광단으로 매우 높은 여기 계수를 가진다. Cy5의 N-하이드록시숙시니미드 에스테르의 구조는 도 6에 나타내었고, 이와 연관된 염료 Cy5.5의 구조는 도 7에 나타내었다. 이들 염료는 유동 세포측정과 자동 형광 서열화기(이는 Amersham, Pittsburg, PA에서 구할 수 있음)에 흔히 이용되는 인도디카르보시아닌 염료이다. 플로레신과 Cy5는 올리고뉴클레오티드에 직접, 자동적으로 결합하는 아미데이트로 이용할 수 있다. 그러나, Cy5가 플로레신과 함께 공명 에너지 전달 쌍으로 이용되었다는 보고는 없었다. 직관적으로, 플로레신 방출과 Cy5 흡수는 공명 에너지 전달을 위해 충분히 겹쳐지지 않을 것이라고 생각할 수 있다. 도 8에는 올리고뉴클레오티드에 부착된 Cy5의 흡수 스펙트럼과 플로레신의 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다. 곡선아래 면적으로 표준화시켰을 때, 스펙트럼이 겹치는 부분은 19%이다. 기구에서 광학성문을 선택하면 스펙트럼의 적외선 부분/자외선 부분에서 작업하는 것이 유익하다. 조사(照射)를 위해서는 레어져 다이오드를 이용할 수 있고, 포토다이오드는 우수한 감응성을 가지도, 대부분의 물질은 관련 스펙트럼 부분에서 최소한의 자가 형광을 가진다.Floresin is the most commonly used fluorophore. Because of their high excitation and quantum coefficients, they are widely used in microscopy, immunoassay, flow cytometry and the like. A commonly used provider of resonance energy transfer pairs is rhodamine. Cy5 is a common red-emitting fluorophore with a very high excitation coefficient. The structure of the N-hydroxysuccinimide ester of Cy 5 is shown in FIG. 6, and the structure of the associated dye Cy5.5 is shown in FIG. 7. These dyes are indodicarbocyanine dyes commonly used in flow cytometry and automated fluorescence sequencing (available from Amersham, Pittsburg, PA). Floresin and Cy5 can be used as amidates that bind directly and automatically to oligonucleotides. However, there was no report that Cy5 was used as a resonance energy transfer pair with floresin. Intuitively, it is conceivable that fluorescein release and Cy5 absorption will not overlap enough for resonance energy transfer. 8 shows an absorption spectrum of Cy5 and an emission spectrum of floresin attached to an oligonucleotide. When normalized to the area under the curve, 19% of the spectrum overlaps. Choosing an optical gate on the instrument is advantageous for working in the infrared / ultraviolet portion of the spectrum. Laser diodes can be used for irradiation, and although photodiodes have good sensitivity, most materials have minimal autofluorescence in the relevant spectral portion.

스펙트럼의 겹침이 적어도, 플로레신과 Cy5 또는 Cy5.5는 PCR 동안에 하이브리드 반응을 모니터하기 위한 우수한 공명 에너지 전달 쌍이라는 것을 발견하였다.The overlap of the spectra was found to be, at least, Floresin and Cy5 or Cy5.5 as a good resonance energy transfer pair for monitoring hybrid reactions during PCR.

실시예 3Example 3

실시예 2의 과정에 따라, 사람의 게놈 DNA 50ng으로부터 110bp β-글로빈 단편을 증폭시키는데, 반응은 10㎕ 반응물에서 다음의 내부 프로브 각0.2μM, CAAACAGACACCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA-플로레신(서열 3), Cy5-GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA G-p(서열 18)과 0.8 U KlenTaql 폴리메라제(Taq 폴리메라제의 5'-엑소뉴클레아제가 결핍된 변이체; 미국 특허 5,436,149)을 이용한다. 프로브는 동일 쇄에서 프라이머의 내부에 하이브리드되고, 임의 중간에 끼어드는 염기없이 바로 인접한다.Following the procedure of Example 2, amplifying a 110 bp β-globin fragment from 50 ng of human genomic DNA, the reaction was carried out in a 10 μl reaction with the following internal probes each 0.2 μM, CAAACAGACACCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA-Floresine (SEQ ID NO: 3), Cy5- GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA Gp (SEQ ID NO: 18) and 0.8 U KlenTaql polymerase (variants lacking the 5′-exonuclease of Taq polymerase; US Pat. No. 5,436,149). The probes hybridize inside the primers in the same chain and are immediately adjacent without any intervening base.

프로브와 프라이머는 Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus(Piscataway, New Jersey)를 이용하여 당 분야에 공지된 것과 같은 표준 포스포로다민 화학방법에의해 합성된다. 최종 트리틸-ON이 있는 플로레신-라벨된 CPG 카세트(Glen Research. Sterling, VA)에서 3'-플로레신-라벨된 프로브를 합성하여 C18 역상 HPLC 정제를 지원한다. 나중에 용출되는 피크를 모아서, PolyPack(Glen Research)에서 트리틸(trityl) 기를 제거한다. 플로레신-라벨된 올리고는 50% 아세토니트릴로 용출하고, 다시 C18 역상 HPLC에 의해 정제한다. 3'단부(Glen Research)에 화학적인 포스포릴화반응 물질로 5'-Cy5-라벨된 프로브를 합성하고, 트리틸-OFF 합성동안에 5'단부에 Cy5 아미데이트(Pharmacia)를 첨가한다. 실패한 서열은 C18 역상HPLC에 의해 제거한다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 염료와 올리고의 흡수도를 이용하여 프로브의 순도를 점검한다.Probes and primers are synthesized by standard phosphorodamin chemistry methods such as those known in the art using Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, New Jersey). 3'-Floresin-labeled probes were synthesized in a Floresin-labeled CPG cassette (Glen Research. Sterling, VA) with final trityl-ON to support C18 reversed phase HPLC purification. The eluting peaks are collected later to remove the trityl group from PolyPack (Glen Research). Floresin-labeled oligo is eluted with 50% acetonitrile and purified again by C18 reversed phase HPLC. 5'-Cy5-labeled probes are synthesized with chemical phosphorylation at the 3'end (Glen Research) and Cy5 amidate (Pharmacia) is added at the 5'end during trityl-OFF synthesis. The failed sequence is removed by C18 reversed phase HPLC. Check the purity of the probe using polyacrylamide gel electrophoresis and absorbance of dyes and oligos.

4 x 250 ㎜ Hypersil ODS 컬럼(Hewlett Packard)에서 0.1M 트리에탄올아민 아세테이트 이동상 및 1㎖/min에서 아세토니트릴 농도차를 이용하여 HPLC를 실행한다. 용출물은 흡수도(A₂₆₀)와 형광(플로레신의 경우 490㎚에서 여기, 520㎚에서 방출, Cy5의 경우에 650㎚에서 여기, 670㎚에서 방출)에 대해 모니터한다. 트리틸화된 그리고 플로레신-라벨된 올리고뉴클레오티드는 10-20% 아세토니트릴 농도차를 두고 용출을 하고, Cy5-라벨된 올리고뉴클레오티드는 10-40% 아세토니트릴 농도차를 이용하여 용출시킨다.HPLC is performed on a 4 x 250 mm Hypersil ODS column (Hewlett Packard) with 0.1 M triethanolamine acetate mobile phase and acetonitrile concentration difference at 1 ml / min. Eluate is monitored for absorbance (A ₂₆₀ ) and fluorescence (excitation at 490 nm for excitation, emission at 520 nm, excitation at 650 nm for Cy5, emission at 670 nm). Tritylated and floresin-labeled oligonucleotides are eluted with 10-20% acetonitrile concentration differences, and Cy5-labeled oligonucleotides are eluted with 10-40% acetonitrile concentration differences.

온도 과정은 가는 형광 신속한 온도 싸이클러에서 94℃에서 0초(프로그램된 근접 속도는 초당 20℃), 60℃에서 20초(근접 속도는 초당 20℃), 75℃에서 0초(근접 속도는 초당 1℃)이다. 온도 변환과정동안에, 각 과정에 어닐링/연장 단편의 단부에서 플로레신과 Cy5 형광을 얻을 수 있다. 증폭 26회 변환 과정을 시작할 즘에 플로레신 형광은 감소되고, Cy5 형광은 증가되는 공명 에너지 전달을 관찰할 수 있다(도 9). 일반적으로, 플로레신 형광에 대한 Cy5의 형광 비율을 관찰하는 것이 바람직하다.The temperature course is 0 seconds at 94 ° C (programmed proximity rate is 20 ° C per second), 60 seconds at 20 ° C (20 ° C per second), and 75 seconds at 0 ° C (closer rate is 2 seconds) in a thin fluorescence rapid temperature cycler. 1 ° C.). During the temperature conversion process, fluorescein and Cy5 fluorescence can be obtained at the end of the annealing / extension fragment in each process. At the beginning of the 26 amplification conversion process, fluorescein fluorescence was reduced and Cy5 fluorescence was observed to increase resonance energy transfer (FIG. 9). In general, it is desirable to observe the fluorescence ratio of Cy5 to floresin fluorescence.

플로레신/Cy5 쌍을 이용하면 기대이상의 좋은 결과를 얻는 것에 대해 적어도 부분적으로는 이론적으로 설명을 할 수 있다. 겹치는 정수, J_DA는 스펙트럼의 겹침과 수용체의 여기 계수(Cy5는 650㎚에서 여기 계수가 250,000M^-1㎝^-1을 가진다)에 따라 달라지고, 파장의 제 4 멱(power)에 따라 달라진다. 이들 인자들 모두 비록 스펙트럼의 겹쳐짐이 낮지만, Cy5의 높은 J_DA를 선호한다. 최근에는, 피코에리틴(phycoerythrin)과 Cy7이 비록 스펙트럼의 겹쳐짐이 적지만, 면역형광을 위한 효과적인 순차 프로브가 될 수 있다는 것이다. 후자의 예로는, 하이브리드 반응 프로브에 라벨로써 플로레신과 Cy5.5의 용도를 설명한다. 형광 공명 에너지 전달을 이용하면 상호작용을 하는 염료가 매우 낮은 스펙트럼 겹침을 가지더라도 핵산 하이브리드 반응을 모니터할 수 있다. 하이브리드 반응을 모니터하기 위한 공명 에너지 전달 쌍으로 플로레신과 Cy5, Cy5.5 및 다른 적외선 또는 자외선 방출 염료를 이용한다는 것에 대해서 기존 기술에서는 알지 못하였다. 플로레신은 먼 적외선 및 자외선 염료를 여기시키는데 이용되는 600㎚, 700㎚ 및 이를 넘는 선까지 벗어나는 긴 방출 "꼬리"를 가진다. 에너지 전달 속도는 부분에 따라 달라지는데, 단 형광단간에 제6멱 거리에 의해 영향을 받을 수도 있다. 공명 에너지 전달 염료가 근접하도록 프로브를 만들면, 전달 속도는 크다. 플로레신/Cy5, 플로레신/Cy5.5 및 이와 유사한 쌍을 이용하면, 충돌하여 퀸칭되는 것에 비해 공명 에너지 전달이 우세하고, 형광단이 간섭 염기없이 인접하는 프로브에 부착되어 있는 경우와 같은 상기 실시예에서와 같이 형광단이 인접한 경우에, 다른 형태의 에너지는 손실된다.Using fluorescein / Cy5 pairs can at least partly explain the theoretically good results. The overlapping integer, J _DA, depends on the overlap of the spectrum and the excitation coefficient of the acceptor (Cy5 has an excitation coefficient of 250,000 M ⁻¹ cm ⁻¹ at 650 nm), and depends on the fourth power of the wavelength. All of these factors favor the high J _DA of Cy5, although the spectral overlap is low. In recent years, phycoerythrin and Cy7 can be effective sequential probes for immunofluorescence, although the spectrum overlaps little. The latter example illustrates the use of floresin and Cy5.5 as labels in hybrid reaction probes. Fluorescence resonance energy transfer can be used to monitor nucleic acid hybrid reactions even though the interacting dyes have very low spectral overlap. The use of floresin and Cy5, Cy5.5 and other infrared or ultraviolet emitting dyes as resonance energy transfer pairs for monitoring hybrid reactions is unknown in the prior art. Floresin has a long emission “tail” beyond the 600 nm, 700 nm and beyond lines used to excite far infrared and ultraviolet dyes. The rate of energy transfer varies from part to part, but may be affected by the sixth-second distance between fluorophores. If the probe is made so that the resonance energy transfer dye is in close proximity, the transfer rate is high. The use of floresin / Cy5, floresin / Cy5.5 and similar pairs gives the same resonant energy transfer as compared to impingement and quenching, and the above practices such as when fluorophores are attached to adjacent probes without interference bases. When the fluorophores are adjacent, as in the example, other forms of energy are lost.

공명 에너지 전달이 최대인 경우와 최소인 경우에 제공체와 수용체 인도우에서 빛의 강도의 비율이 변화되는 것을 관찰함으로써 하이브리드 반응 프로브가 공명 에너지 전달 쌍으로 유용한지에 대해 판단할 수 있다. 최소 및 최대 전달을 수득하는 한 가지 방법은 동일한 올리고뉴클레오티드에 두 가지 형광단을 부착시키고, 포스포디에스테라제로 처리하기 전과 처리 후에 형광 비율을 측정한다.Observation of the change in the ratio of light intensity in the donor and receptor guided cows at the maximum and minimum resonance energy transfer can be used to determine whether a hybrid reaction probe is useful as a resonance energy transfer pair. One method of obtaining minimum and maximum delivery is to attach two fluorophores to the same oligonucleotide and measure the fluorescence ratio before and after treatment with phosphodiesterase.

실시예 4Example 4

표준 포스포아미데이트 화학에 의해 이중-라벨된 플로레신/Cy5 프로브 Cy5-CTGCCG-F-TACT GCCCTGTGGG GCAAGGp(서열 19)를 합성하는데, 이때 p는 말단 3'-포스페이트(화학적 포스포릴화 시약, Glen Research)를 나타내고, F는 아미다이트(amidite)로써 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 골격과 함께 유도된 플로레신 잔기로 고유 3-탄소 중간뉴클레오티드 포스포디에스테르 거리를 유지시키고(Clon Tech, Palo Alto, CA); Cy5는 아미다이트(Pharmacia)로 첨가된다. 0.1M 트리스, pH 8.0에서 Cy5에 대한 플로레신 형광의 비율은 포스포디에스테라제(Sigma, St. Louis, MO)로 소모성 가수분해전후에서 얻을 수 있다. 형광 비율에서 변화는 가수분해후에 220배가 되었다. Perkin Elmer(Foster City, CA)로부터 이중-라벨된 플로레신/로다민 프로브, F-ATGCCCT*CCC CCATGCCATC CTGCGTp(서열 20)을 구입하였는데, 이때 F는 플로레신이고, * 는 아미노-링커에 의해 변형된 T 잔기에 부착되는 로다민이다. 포스포디에스테라제로 가수분해 후에 형광 비율의 변화(플로레신에 대한 로다민 비율)는 22배가 된다.Synthesizes double-labeled floresin / Cy5 probe Cy5-CTGCCG-F-TACT GCCCTGTGGG GCAAGGp (SEQ ID NO: 19) by standard phosphoramidate chemistry, wherein p is the terminal 3'-phosphate (chemical phosphorylation reagent, Glen F is a floresin moiety derived with a 2-aminobutyl-1,3-propanediol backbone as an amidite to maintain intrinsic 3-carbon intermediate nucleotide phosphodiester distances (Clon Tech). , Palo Alto, CA); Cy5 is added to Amidatite (Pharmacia). The ratio of floresin fluorescence to Cy5 at 0.1 M Tris, pH 8.0 can be obtained before and after wasting hydrolysis with phosphodiesterase (Sigma, St. Louis, MO). The change in fluorescence ratio was 220 times after hydrolysis. A double-labeled floresin / rhodamine probe, F-ATGCCCT * CCC CCATGCCATC CTGCGTp (SEQ ID NO: 20) was purchased from Perkin Elmer (Foster City, CA), where F is floresin and * is modified by amino-linker Rhodamine attached to the T residue. After hydrolysis with phosphodiesterase, the change in fluorescence ratio (rhodamine to floresin ratio) is 22-fold.

플로레신/Cy5 쌍의 시그날은 플로레신/로다민 쌍의 시그날보다는 10배 강하다.The signal of the floresin / Cy5 pair is 10 times stronger than the signal of the floresin / rhodamine pair.

실시예 5Example 5

PCR 동안에 플로레신과 Cy5-라벨된 인접 하이브리드 프로브의 비율, 농도 및 거리의 영향에 대해 연구하였다. 실시예 3의 β-글로빈 위치와 프로브 쌍의 증폭을 이용하고 플로레신에 대한 Cy5의 형광 비율에서 최대 변화를 관찰하였다. Cy5에 대한 플로레신-라벨된 프로브의 비율이 2:1(도 10)인 경우에 최대 시그날이 발생하였다. 2:1 비율에서, 형광 프로브의 농도가 0.2μM이고 Cy-5-라벨된 프로브의 농도가 0.4μM에서 가장 좋은 시그날이 발생하였다(도 11). PCR 동안에 인접한 하이브리드 프로브간에 끼어드는 가장 적절한 염기의 수를 결장한다. 길이는 동일하나 이들의 하이브리드 위치가 약간씩 이동하는 몇 가지 프로브를 실시예 3의 과정에 따라 합성을 하고, 이들을 β-글로빈 표적에 하이브리드시켰을 때, 0,1,2,3,4,6개 염기가 프로브간에 남아 있었다. 한 개의 염기가 끼어 있을 때 PCR 동안에 최대 시그날이 발생하였다(도 12). 15개 또는 25개 염기정도의 거리에서도 일부 공명 에너지 전달이 감지되었지만, 0-5개 염기사이에서 전달이 더 잘 된다.The effects of the ratio, concentration and distance of floresin and Cy5-labeled adjacent hybrid probes during the PCR were studied. The amplification of the β-globin position and probe pair of Example 3 was used and the maximum change in the fluorescence ratio of Cy5 to floresin was observed. The maximum signal occurred when the ratio of floresin-labeled probe to Cy5 was 2: 1 (FIG. 10). At a 2: 1 ratio, the best signal occurred at a concentration of 0.2 μΜ of fluorescent probes and 0.4 μΜ of Cy-5-labeled probes (FIG. 11). The most appropriate number of bases to interpose between adjacent hybrid probes during PCR are colonized. Several probes having the same length but slightly shifting their hybrid positions were synthesized according to the procedure of Example 3, and when they were hybridized to the β-globin target, 0,1,2,3,4,6 Base remained between probes. Maximum signal occurred during PCR when one base was sandwiched (FIG. 12). Some resonance energy transfer was detected at distances of 15 or 25 bases, but better between 0-5 bases.

Heller et al.,(미국 특허 4,996,143)에서는 형광단간에 뉴클레오티드의 수가 4에서 0 단위로 감소될 때 에너지 전달 효과가 감소되었다는 것을 발견하였다고 기록하고 있다. 대조적으로 플로레신/Cy5 쌍을 이용하였을 경우에 최대 에너지 전달은 0-2개의 사이에 끼인 뉴클레오티드에서 나타났다는 것이다.Heller et al. (US Pat. No. 4,996,143) found that the energy transfer effect was reduced when the number of nucleotides between fluorophores decreased from 4 to 0 units. In contrast, when using floresin / Cy5 pairs, the maximum energy transfer was seen between 0-2 nucleotides.

하이브리드 반응 프로브 방법 ; 표적에 인접하게 하이브리드되는 2개의 프로브를 합성하고, 각 프로브는 공명 에너지 전달 쌍의 한 개 형광단으로 라벨을 하는 경우에 하이브리드 반응이 일어나면, 공명 에너지 전달이 증가된다(도 5c). 플로레신/로다민 쌍이 핵산을 감지하는데 가장 흔히 이용되는 것이다.Hybrid reaction probe method; Synthesizing two probes that hybridize adjacent to the target, and if each probe is labeled with one fluorophore of a resonance energy transfer pair, if a hybrid reaction occurs, the resonance energy transfer is increased (FIG. 5C). Floresin / rhodamine pairs are the most commonly used to detect nucleic acids.

본 발명의 한 특징은 PCR 생성물을 감지하기 위한 서열-특이적인 상동성 하이브리드 방법을 제공하는 것이다. 어떻게 이를 얻는지에 대해서는 명백하지는 않다. 증폭하는 동안에 하이브리드 프로브를 이용한다는 것은 비-논리적이다. 프로브 하이브리드반응과 폴리메라제 연장과정 모두가 발생하는 것은 아닌 것으로 보인다. 서열 특이적인 형광을 얻기위해서는 프로브를 하이브리드해야 하지만, 폴리메라제가 프라이머 연장을 완료하고 지수적으로 DNA를 증폭시키기 위해서는 프로브를 하이브리드할 필요는 없다.One feature of the present invention is to provide a sequence-specific homologous hybrid method for sensing PCR products. It is not clear how to achieve this. Using a hybrid probe during amplification is non-logical. Not all probe hybridization and polymerase extension occur. Probes must be hybridized to obtain sequence specific fluorescence, but the polymerase does not need to hybridize the probe to complete primer extension and exponentially amplify DNA.

이 문제의 한 가지 해결 방법은 이중-라벨된 한 개 프로브를 이용하고, 연장하는 동안에 프로브를 절단하기 위해서 통상 열에 안정한 DNA 폴리메라제의 5'-엑소뉴클레아제 활성을 이용하여 2 형광단을 분리한다. 이 경우에, 형광 시그날은 인접 하이브리드반응에 의해 형광단의 접근이 아닌(도 5c) 프로브 가수분해시에 공명 에너지 전달 쌍의 분리로 인한 것(도 5b)이다. 그러나, 이중-라벨된 프로브는 수작업으로 적어도 한 개의 형광단을 올리고에 추가하고 통상 상당한 정제과정을 요하기 때문에 만들기가 어렵다. 프로브가 비싸기 때문에, 두 개의 이중-라벨된 프로브는 표적의 경쟁적인 정량화 또는 돌연변이 감지에 필수적이다. 또한, 관찰되는 형광은 임의 주어진 과정에서 존재하는 생성물의 양에 의존하는 것이 아니라 가수분해되는 누적된 프로브의 양에 따라 달라진다. 이는 PCR 평탄부분에 도달한 후에도 형광이 지속적으로 증가되게 되는 것이다. 마지막으로 가장 중요한 것은, 프로브 가수분해는 폴리메라제 연장동안에 항상 일어나는 것이 아닌데 이는 잘 이해되지 않는 것이다. 예를 들면, 실시예 4의 이중-라벨된 플로레신/Cy5 프로브는 프라이머에 인접하여 있을 때, PCR 동안에 가수분해가 거의 안되는 것으로 나타난다. 또한, 말단 라벨을 포함하는 몇 가지 이중-라벨된 플로레신/Cy5를 만들고 이들 모두는 증폭하는 동안에 가수분해가 잘 안되고 시그날 발생도 약한 것으로 나타났다.One solution to this problem is to use two single-labeled probes and two fluorophores using the 5'-exonuclease activity of the DNA polymerase, usually thermally stable, to cleave the probe during prolongation. Separate. In this case, the fluorescence signal is due to the separation of the resonance energy transfer pairs during probe hydrolysis, rather than the approach of the fluorophore by adjacent hybrid reactions (FIG. 5C). However, double-labeled probes are difficult to make because they manually add at least one fluorophore to the oligo and usually require significant purification. Because probes are expensive, two double-labeled probes are essential for competitive quantitation or mutation detection of a target. In addition, the fluorescence observed does not depend on the amount of product present in any given process, but on the amount of accumulated probe that is hydrolyzed. This is to continue to increase the fluorescence even after reaching the PCR flat portion. Last but not least, probe hydrolysis does not always occur during polymerase extension, which is not well understood. For example, the double-labeled floresin / Cy5 probe of Example 4 appears to have little hydrolysis during PCR when adjacent to the primer. In addition, several double-labeled floresin / Cy5 containing terminal labels were made, all of which were found to be poorly hydrolyzed and signal-prone during amplification.

인접 하이브리드 프로브와 PCR 생성물의 상동성 감지로 5'-엑소뉴클레아제 시스템의 많은 문제를 해결할 수 있다. 인접 하이브리드 프로브를 합성하는 것은 상대적으로 간단한데, 그 이유는 플로레신과 Cy5 모두의 아미다이트가 자동 합성동안에 직접 결합을 시킬 수 있고, 한 개 프로브에 이중 라벨링이 요구되지 않기 때문이다. 가수분해가 아닌 하이브리드로 인한 형광 때문에, 프로브 형광의 온도 의존성을 이용하여 돌연변이 감지 및 정량화를 할 수 있다. 그러나, PCR 생성물의 상동 감지를 위한 인접 하이브리드 프로브를 이용하는 것에 대해 기존에 언급된 바는 없었다. 놀라운 것은 프로브에 의해 차단된 지역을 통한 폴리메라제 연장에 의해 시그날 발생 및 증폭을 위한 하이브리드 반응이 일어날 수 있다는 것이다.Detection of homology between adjacent hybrid probes and PCR products can solve many of the problems of the 5'-exonuclease system. Synthesizing adjacent hybrid probes is relatively simple because the amidite of both floresin and Cy5 can bind directly during autosynthesis, and no double labeling is required for one probe. Because of the fluorescence from the hybrid rather than hydrolysis, the temperature dependence of the probe fluorescence can be used to detect and quantify mutations. However, there has not been previously been mentioned using adjacent hybrid probes for homologous detection of PCR products. Surprisingly, hybridization for signal generation and amplification can occur by polymerase extension through the region blocked by the probe.

실시예 6Example 6

실시예 3에서 설명한 것과 같이, 인접 플로레신-과 Cy5-라벨된 프로브를 이용하여 게놈 DNA로부터 110bp β-글로빈 단편을 증폭시켰다. 10㎕ 반응에 0.4 U (Taq) 또는 0.8 U(Stoffel 단편, Perkin Elmer, or KlenTaq1) 효소를 이용하였다. 다른 언급이 없는 한, 온도 변환 과정은 94℃에서 0초(프로그램된 근접 속도는 초당 20℃), 60℃에서 20초(근접 속도는 초당 20℃), 75℃에서 0초(근접 속도는 초당 1℃)이다. 도 13에서는 30회 온도 변환 과정 동안에 주형이 증폭된 직후에, 2개의 인접 하이브리드 프로브에 의해 발생되는 형광을 나타내었다. 94℃에서 간단하게 변성시킨 후에, 온도를 60℃로 낮추면 형광은 약 20초간 증가된다. 5' 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 고유 Taq 폴리메라제를 이용하는 것 보다 엑소뉴클레아제 결손된 폴리메라제(Stoffel 단편)를 이용하는 경우에 시그날의 크기가 더 크다. 약 20초 후에, 폴리메라제를 대체시키거나 또는 프로브가 가수분해되면 형광은 감소된다. 폴리메라제가 5'-엑소뉴클레아제 활성을 가지고 있을 때(Taq DNA 폴리메라제), 이 활성이 부족한 것(Stoffel 단편)보다는 형광 감소가 상대적으로 약간 더 빠르다.As described in Example 3, 110 bp β-globin fragments were amplified from genomic DNA using adjacent floresin- and Cy5-labeled probes. 0.4 U (Taq) or 0.8 U (Stoffel fragment, Perkin Elmer, or KlenTaq1) enzyme was used for 10 μl reaction. Unless otherwise noted, the temperature conversion process is 0 seconds at 94 ° C (programmed proximity rate is 20 ° C per second), 60 seconds at 20 ° C (20 ° C per second), and 75 seconds at 0 ° C (closer rate is 1 ° C.). FIG. 13 shows the fluorescence generated by two adjacent hybrid probes immediately after template amplification during 30 temperature conversion processes. After simple denaturation at 94 ° C, the fluorescence is increased for about 20 seconds by lowering the temperature to 60 ° C. The signal is larger when using exonuclease-depleted polymerases (Stoffel fragments) than using native Taq polymerases containing 5 'exonuclease activity. After about 20 seconds, the fluorescence is reduced when the polymerase is replaced or the probe is hydrolyzed. When the polymerase has 5'-exonuclease activity (Taq DNA polymerase), the fluorescence reduction is relatively faster than that lacking this activity (Stoffel fragment).

도 14(상측 패널)에서 볼 수 있는 것과 같이, 온도 변환 과정은 60℃에서 20초간 유지시키면서, 94℃와 60℃사이에서 일어난다. 형광이 최대인 20초 종료즘에 형광을 얻을 수 있다. Taq(exo^-)를 이용하면 양호한 증폭을 할 수 있으나, Stoffel 단편(exo⁺)을 이용하면 양호한 증폭을 얻을 수 없는데, 이는 형광 발생 및 아가로즈 겔(겔은 나타내지 않음)로 증명된다. 그러나, 60℃에서 유지하는 시간을 20초에서 120초로 증가시키면(도 14의 중간 패널), exo^-폴리메라제 증폭이 잘 된다. exo- 폴리메라제로 프로브 대체하는 속도를 늦출 경우, exo^-폴리메라제를 이용하는 경우보다 효과적인 증폭을 하는데 60℃에서 유지되는 시간이 더 길어진다. 온도를 60℃에서 75℃로 서서히 증가시키면, exo^-폴리메라제가 요구하는 시간을 감소시킬 수 있다(도 14의 아래 패널). 프로브에 도달하면, 폴리메라제는 중지시킨다. 그러나, 프로브 용융 온도에서는 프로브는 주형에서 용융되어 나오고, 폴리메라제는 방해를 하지 않기 때문에 쇄의 중합반응을 완성시킨다. 프로브가 용융된 후에 온도를 너무 빨리 올리지 않는 한 중합반응은 완성된다. 도 14(아래 패널)에서는 한 개의 exo^-폴리메라제(Taq)와 두 개의 exo^-폴리메라제(Stoffel 단편과 KlenTaql)를 나타낸다.As can be seen in FIG. 14 (top panel), the temperature conversion process takes place between 94 ° C. and 60 ° C. while maintaining at 60 ° C. for 20 seconds. Fluorescence can be obtained at the end of 20 seconds when the fluorescence is maximum. Good amplification can be achieved with Taq (exo ⁻ ), but good amplification cannot be obtained with Stoffel fragment (exo ⁺ ), which is evidenced by fluorescence generation and agarose gel (gel not shown). However, increasing the holding time at 60 ° C. from 20 seconds to 120 seconds (middle panel of FIG. 14) results in good exo ^- polymerase amplification. Slowing down the rate of probe replacement with exo ^- polymerases results in longer retention times at 60 ° C. for effective amplification than with exo ^- polymerases. Slowly increasing the temperature from 60 ° C. to 75 ° C. may reduce the time required for the exo ^- polymerase (bottom panel of FIG. 14). Upon reaching the probe, the polymerase is stopped. However, at the probe melting temperature, the probe melts out of the mold and the polymerase does not interfere, thus completing the chain polymerization. The polymerization is complete unless the temperature is raised too quickly after the probe has melted. 14 (bottom panel) shows one exo ^- polymerase (Taq) and two exo ^- polymerases (Stoffel fragment and KlenTaql).

엑소뉴클레아제 활성이 있는 경우에, 프로브의 일부는 각 온도 변환 과정에서 가수분해되는데 이는 방대한 증폭시의 형광이 감소되는 것으로 알 수 있다. 이는 도 13과 14(중간패널 및 아래 패널)에서 알 수 있는데, exo^-폴리메라제로는 일어나지 않는다. 형광은 방대한 증폭시에도 안정적이기 때문에 KlenTaq1과 같으 exo^-폴리메라제가 적절하다.In the case of exonuclease activity, some of the probes are hydrolyzed at each temperature conversion process, indicating that the fluorescence upon extensive amplification is reduced. This can be seen in Figures 13 and 14 (middle panel and lower panel), which do not occur with exo ^- polymerase. Since fluorescence is stable even during massive amplification, exo ^- polymerases are suitable, such as KlenTaq1.

PCR을 모니터하기 위해 인접 하이브리드 프로브 이용의 성공 여부는 몇 가지 인자에 달려있다. 인접 하이브리드 프로브간에 사이 염기가 0 내지 2인 경우에 공명 에너지 전달이 최대가 된다. 프로브 하이브리드 지역을 통하여 프라이머가 연장하기 전에 프로브에 하이브리드되는 쇄 단편을 증가시키기 위해서는 프로브의 용융 온도가 프라이머의 용융 온도보다 높아야 한다(바람직하게는 >5℃).The success of using adjacent hybrid probes to monitor PCR depends on several factors. Resonant energy transfer is maximized when the base is between 0 and 2 between adjacent hybrid probes. In order to increase the chain fragment hybridizing to the probe before the primer extends through the probe hybrid region, the probe's melting temperature must be higher than the primer's melting temperature (preferably> 5 ° C).

Cycle-by-Cycle 형광 ; DNA 증폭을 분석하는 통상적인 종점인 겔 전기영동은 생성물의 크기를 확인하고, 순도를 측정한다. 그러나, 증폭은 처음에는 확률적이고, 그 다음은 지수적으로 증가되고, 최종적으로는 정체되기 때문에, 종점 분석으로 정량화하는데에는 한계가 있다. 본 발명의 한 특징에는 하이브리드 프로브와 함께 시작 주형 복사체의 수를 정량화하는 cycle-by-cycle 모니터법을 포함한다. 당업자가 아는 바와 같이, DNA가 증폭하는 동안에 여러 시료의 변환과정당 1회 모니터하는 것이 가장 정확한 정량화 방법이다. Cycle-by-cycle 모니터 방법은 각 변환과정의 연장 상 또는 어닐링/연장 복합상 동안에 형광을 포착하고, 형광과 생성물의 농도에 대한 관계를 정립하는 것이다.Cycle-by-Cycle Fluorescence; Gel electrophoresis, a common endpoint for analyzing DNA amplification, confirms product size and measures purity. However, because amplification is probabilistic at first, then exponentially increased and finally stagnant, there is a limit to quantification by endpoint analysis. One feature of the present invention includes a cycle-by-cycle monitoring method that quantifies the number of starting template copies with a hybrid probe. As will be appreciated by those skilled in the art, the most accurate quantification method is to monitor once per conversion of several samples during DNA amplification. Cycle-by-cycle monitoring methods capture fluorescence during the extended phase or annealing / extended composite phase of each conversion process and establish a relationship between fluorescence and product concentration.

실시예 7Example 7

세 가지 다른 기술을 이용하여 Cycle-by-cycle 모니터 방법을 실행한다. (i) 이중 쇄-특이적인 염료 SYBR^TMGreen I; (ii) 이중-라벨된 가수분해 프로브의 엑소뉴클레아제 절단 후에 로다민에 의한 형광 퀸칭의 감소 및 (iii) 인접 하이브리드 프로브에 의한 플로레신에서 Cy5로의 공명 에너지 전달에 의해 형광을 모니터 한다. 증폭 시약 및 조건은 실시예 2에서 상술하였다. 사람의 β-글로빈 프라이머 RS42/KM29(536개 염기쌍) 및 PC03/PC04(110개 염기쌍)에 대해서는 Wittwer et al., "뜨거운 공기를 이용한 모세관에서의 자동 폴리메라제 연쇄 반응" 17 Nucl. Acids. Res. 4353-4357 (1989))에 상술하고 있고, 여기에 참고문헌으로 첨부되었다. β-글로빈의 온도 변환 과정은 최고 95℃, 최저 61℃, 72℃에서 15초, 온도간의 평균 변화는 초당 5.2℃이다. β-글로빈 프라이머와 플로레신/로다민 이중 프로브는 Perkin Elmer(no. N808-0230)에서 구입할 수 있다. β-악틴의 온도 변환 과정은 최고 94℃, 60℃에서 15초, 온도간의 평균 변화는 초당 6.2℃이다. 실시예 3에서 설명을 한 것과 같이 한 개 라벨된 프로브, 5'-CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA-플로레신-3'(서열 3)과 5'-Cy5-AAGTCTGCCG TTACTGCCCT GTGGGGCAAGp(서열 4)를 합성하였다. 이들 인접 프로브는 동일 DNA 쇄에 있는 PC03/PC04 β-글로빈 프라이머쌍의 내부에 하이브리드하고, 한 개 염기쌍에 의해 분리되어 있다. 온도 변환 과정은 최고 94℃, 59℃에서 20초, 온도간의 평균 변화는 초당 7.0℃이다. 하이브리드 프로브(β-악틴 및 β-글로빈)는 각 0.2μM을 이용하였다.Three different techniques are used to implement the cycle-by-cycle monitoring method. (i) double chain-specific dye SYBR ^™ Green I; Fluorescence is monitored by (ii) reduction of fluorescence quenching by rhodamine after exonuclease cleavage of the double-labeled hydrolysis probe and (iii) resonance energy transfer from floresin to Cy5 by adjacent hybrid probes. Amplification reagents and conditions were described above in Example 2. For human β-globin primers RS42 / KM29 (536 base pairs) and PC03 / PC04 (110 base pairs), Wittwer et al., “Automatic Polymerase Chain Reaction in Capillaries with Hot Air” 17 Nucl. Acids. Res. 4353-4357 (1989), which is hereby incorporated by reference. The temperature conversion process of β-globin is 15 seconds at a maximum of 95 ° C., a minimum of 61 ° C., and 72 ° C., and the average change between temperatures is 5.2 ° C. per second. β-globin primers and floresin / rhodamine double probes are available from Perkin Elmer (no. N808-0230). The temperature conversion of β-actin is up to 94 ° C, 60 ° C for 15 seconds, and the average change between temperatures is 6.2 ° C per second. One labeled probe, 5'-CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA-Floresine-3 '(SEQ ID NO: 3) and 5'-Cy5-AAGTCTGCCG TTACTGCCCT GTGGGGCAAGp (SEQ ID NO: 4), as described in Example 3, were synthesized. These adjacent probes hybridize inside the PC03 / PC04 β-globin primer pair in the same DNA chain and are separated by one base pair. The temperature conversion process is up to 94 ° C, 59 ° C for 20 seconds and the average change between temperatures is 7.0 ° C per second. Hybrid probes (β-actin and β-globin) each used 0.2 μM.

여러 시료를 SYBR^TMGreen I으로 각 온도 변환 과정에서 모니터할 경우, 시작 주형은 농도 10⁷-10⁸범위에서 구별할 수 있다(도 15). 이중-쇄 특이적인 염료로 SYBR^TMGreen I을 이용한 β-글로빈 유전자의 536bp 단편을 증폭시킨다. 각 시료에서 얻은 최대 형광 비율로 데어터를 표준화시키면, 10개 복사체로부터 100개의 시작 복사체가 명백하게 분리된다. 그러나, 1개와 10개 복사체간에 차이는 거의 없기 때문에, 시료당 0과 1개 평균 복사체간에는 차이가 없다.When several samples were monitored with SYBR ^™ Green I during each temperature conversion, the starting template could be distinguished in the concentration range 10 ⁷ -10 ⁸ (FIG. 15). A double-chain specific dye amplifies a 536 bp fragment of β-globin gene using SYBR ^™ Green I. Normalizing the data to the maximum fluorescence ratio obtained in each sample clearly separates 100 starting copies from 10 copies. However, since there is little difference between 1 and 10 copies, there is no difference between 0 and 1 average copies per sample.

대조적으로, 서열-특이적인 프로브는 유사한 역학 범위를 가지지만, 음성 기준으로부터 한 개의 시작 주형 복사체도 구별할 수 있는 것으로 보인다. 5'-엑소뉴클레아제 프로브(β-악틴 단편, 도 16)로 시그날 발생은 DNA 합성에 따라 달라지고 뿐만 아니라 이중-라벨된 프로브의 형광단간에 하이브리드와 가수분해를 요구한다. 이와 같은 가수분해는 퀸칭을 감소시키고, 플로센신에 대한 로다민의 형광 비율을 증가시킨다. 이중 쇄 염료로부터 발생되는 형광은 과도한 변환과정에서는 변화가 없지만(도 15), 엑소뉴클레아제 프로브로부터 발생되는 시그날은 각 변환과정에서 지속적으로 증가된다(도 16). 최종 생성물이 합성되지 않더라도 프로브 하이브리드와 가수분해는 계속 일어난다. 주형 복사체의 수가 10³이하로 감소되면, 시그날 강도는 감소되나, 음성 기준 시그날이 안정적이기 때문에, 복사체수가 작아도 정량화할 수 있다.In contrast, sequence-specific probes have a similar dynamic range, but seem to be able to distinguish even one starting template copy from the negative criteria. Signal generation with 5′-exonuclease probes (β-actin fragments, FIG. 16) depends on DNA synthesis as well as requires hybridization and hydrolysis between fluorophores of double-labeled probes. Such hydrolysis reduces quenching and increases the fluorescence ratio of rhodamine to florsensin. The fluorescence generated from the double chain dye remains unchanged during excessive conversion (FIG. 15), but the signal generated from the exonuclease probe is continuously increased during each conversion (FIG. 16). Probe hybrids and hydrolysis continue to occur even if the final product is not synthesized. When the number of template copies is reduced to 10 ³ or less, the signal intensity is reduced, but since the negative reference signal is stable, it can be quantified even if the number of copies is small.

도 17에서는 인접 하이브리드 프로브를 이용하여 증폭을 모니터하고, 이는 Cy5에 대한 플로레신 형광 비율로 나타내었다. 형광 비율에 변화는 대개 공명 에너지 전달로 인한 Cy5 형광이 증가되기 때문이다(도 9). 이중-라벨된 가수분해 프로브와는 대조적으로, 폴리메라제에 엑소뉴클레아제 활성이 포함된 경우에, 하이브리드 프로브의 형광 시그날은 복사체 수가 많은 경우에 감소된다.In FIG. 17, amplification was monitored using adjacent hybrid probes, expressed as the ratio of fluoresce fluorescence for Cy5. The change in fluorescence ratio is usually due to an increase in Cy5 fluorescence due to resonance energy transfer (FIG. 9). In contrast to double-labeled hydrolysis probes, when the polymerase contains exonuclease activity, the fluorescent signal of the hybrid probe is reduced when the number of copies is large.

PCR 동안에 하이브리드의 공명 에너지 전달을 위한 두 가지 다른 방법을 이용하여 본 발명의 실행가능성을 설명할 것이다. 첫 번째 방법은 두 개의 인접 하이브리드 프로브를 이용하는데, 한 개는 3'에 플로레신이 라벨되어 있고, 다른 하나는 5'에 Cy5가 라벨되어 있다. PCR 동안에 생성물이 축적될 때, 각 변환과정동안에 프로브는 서로의 다음에 하이브리드된다. 라벨된 프라이머는 증폭되는 동안에 PCR 생성물에 결합되고, 단지 한 개의 하이브리드반응만 있으면 된다.Two different methods for the resonance energy transfer of a hybrid during PCR will be used to illustrate the feasibility of the present invention. The first method uses two adjacent hybrid probes, one labeled 3 'with floresin and the other labeled 5' with Cy5. As products accumulate during PCR, the probes hybridize next to each other during each conversion. The labeled primers bind to the PCR product during amplification and only need one hybrid reaction.

실시예 8Example 8

Cy5-라벨된 프라이머와 플로레신-라벨된 하이브리드 프로브간에 공명 에너지 전달에 의해 PCR의 Cycle-by-cycle 모니터를 한다. 이는 인접 Cy5/플로레신 하이브리드 프로브를 이용한 모니터 결과와 비교를 하였다. Cy5-라벨된 프라이머는 CAACTTCATC CACGT^*TCACC(서열 21)이고, 이때 T^*는 Cy5가 부착된 변형된 T 염기이고, 이에 상응하는 프로브는 GTCTGCCGTT ACTGCCCTGT GGGGCAA-플로레신(서열 22)이다. 인접 하이브리드 프로브는 CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT CC-플로레신(서열 23)와 Cy5-GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAAp(서열 24)이다. 실시예 3에 따라 하이브리드 프로브를 합성하는데 각 0.2μM을 이용하였다. 두 단계로 Cy5-라벨된 프라이머를 합성하였다. 자동 합성을 이용하여 원하는 T 위치에 아미노-변형물질 C6dT(Glen Research)을 결합시킨다. 그 다음, Cy5 1가 N-하이드록시숙시니미드 에스테르(도 6)를 제조업자(Amersham)의 지시에 따라 손으로 아미노 링커에 결합시킨다. 실시예 3에서 설명하는 것과 같이, HPLC 정제를 한다.Cycle-by-cycle monitoring of PCR is performed by resonance energy transfer between Cy5-labeled primers and floresin-labeled hybrid probes. This was compared with the monitoring results using the adjacent Cy5 / Floresin hybrid probe. The Cy5-labeled primer is CAACTTCATC CACGT ^* TCACC (SEQ ID NO: 21), where T ^* is a modified T base with Cy5 attached, and the corresponding probe is GTCTGCCGTT ACTGCCCTGT GGGGCAA-Floresin (SEQ ID NO: 22). Adjacent hybrid probes are CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT CC-Floresine (SEQ ID NO: 23) and Cy5-GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAAp (SEQ ID NO: 24). Each 0.2 μM was used to synthesize a hybrid probe according to Example 3. Cy5-labeled primers were synthesized in two steps. Automated synthesis is used to bind the amino-modifier C6dT (Glen Research) to the desired T position. Cy5 monovalent N-hydroxysuccinimide ester (FIG. 6) is then bound to the amino linker by hand according to the manufacturer's instructions (Amersham). As described in Example 3, HPLC purification is performed.

PCO4를 이용하는 대신에 Cy5-라벨된 프라이머(0.5μM)를 이용하여, 실시예 3에서 설명하는 것과 같이 사람의 게놈 DNA에서 110개 염기쌍의 β-글로빈 단편을 증폭시키는데, 단 실시예 3과 다른 점은 10㎕에 이용된 효소는 0.4U Taq 폴리메라제를 이용한 것이다. 또한 인접 하이브리드 프로브로도 동일한 β-글로빈 단편의 증폭을 모니터할 수 있다. 온도 변환 과정은 94℃에서 0초, 60℃에서 20초간 실행한다. 어닐링/연장부의 종료시에 각 변환 과정에서 1회 형광을 모니터한다. 두 가지 방법에서, Cy5로 형광 에너지의 전달이 하이브리드반응과 함께 증가되고, 이를 Cy5 형광에 대해 플로레신 형광 비율로 나타내었다(도 18).Instead of using PCO4, Cy5-labeled primers (0.5 μM) were used to amplify 110 base pairs of β-globin fragments in human genomic DNA, as described in Example 3, with the exception of Example 3. The enzyme used in 10 μl of silver was 0.4 U Taq polymerase. Adjacent hybrid probes can also be used to monitor amplification of the same β-globin fragment. The temperature conversion process is performed at 94 ° C. for 0 seconds and at 60 ° C. for 20 seconds. At the end of the annealing / extension the fluorescence is monitored once in each conversion process. In both methods, the transfer of fluorescence energy to Cy5 was increased with hybridization, which was expressed as the ratio of fluoresce fluorescence to Cy5 fluorescence (FIG. 18).

추가 실험으로, Cy5-라벨과 플로레신 라벨을 분리하는 염기의 수를 다양하게 하였다. 시그날은 형광단간의 거리가 15개 염기까지는 감지할 수는 있으나, 최상의 형광 공명 에너지 전달은 형광단간에 거리가 약 4-6개 염기에서 관찰되었다.In further experiments, the number of bases separating Cy5-labels and floresin labels was varied. The signal can detect up to 15 bases in distance between fluorophores, but the best fluorescence resonance energy transfer was observed at about 4-6 bases between fluorophores.

가수분해 프로브와는 대조적으로, 하이브리드 프로브에서 나오는 형광 시그날은 누적되는 것이 아니고, 각 어닐링 상동안에 새로 발생하였다. 하이브리드 반응은 가상 1차 공정이기 때문에, 형광은 생성물의 농도를 바로 나타내는 척도가 된다. 프로브의 농도가 생성물의 것보다 휠씬 높기 때문에, 프로브에 하이브리드되는 생성물의 분취는 생성물의 농도와는 무관하다. 이와 같은 특징은 라벨된 프라이머와 함께 1회 하이브리드 반응을 이용하여도 정량화를 위한 생성물의 누적을 잘 모니터할 수 있다. cycle-by-cycle 모니터 방법동안에 상이한 형광 기술의 고유 변수는 정량화에 중요하다.In contrast to the hydrolysis probes, the fluorescence signals from the hybrid probes did not accumulate and were newly generated during each annealing phase. Since the hybrid reaction is a virtual primary process, fluorescence is a measure of the concentration of the product immediately. Since the concentration of the probe is much higher than that of the product, the aliquot of the product hybridized to the probe is independent of the concentration of the product. This feature allows one to monitor the accumulation of product for quantification even with one hybrid reaction with labeled primers. During the cycle-by-cycle monitoring method, inherent parameters of different fluorescence techniques are important for quantification.

실시예 9Example 9

세 가지 각각 다른 형광 모니터 방법을 이용하여 실시예 2에 따른 DNA 증폭을 실행하였다. KM29와 PCO4 프라이머로 부터 사람의 β-글로빈 단편 205개 염기쌍을 증폭시키는데 SYBR^TMGreen I을 1:10,000 희석하여 이용하였다. 가수분해 프로브와 조건은 실시예 7에서 명시하고 있다. 하이브리드 프로브인 TCTGCCGTTA CTGCCCTGTG GGGCAAG-플로레신(서열 5)를 KM29와 함께 이용하고, Cy5-라벨된 프라이머 CAACTTCATCCACGTT^*CACC(서열 6) 이때,T^*는 Cy5-라벨된 T 염기로 실시예 8에서와 같이 합성을 할 수 있다. 모든 증폭은 15,000 주형 복사체(사람 게놈 DNA/10㎕ 50ng)로 10개 복제단위(replicate)에서 실행한다. 온도 변환 과정은 31초로 길다(최대 94℃, 60℃에서 20초간, 온도간 평균 변화율은 초당 6.2℃). 어닐링/연장 상의 15 내지 20초사이에 각 시료에서 형광을 수득할 수 있다.DNA amplification according to Example 2 was performed using three different fluorescence monitoring methods. SYBR ^™ Green I was used at a dilution of 1: 10,000 to amplify 205 base pairs of human β-globin fragments from KM29 and PCO4 primers. Hydrolysis probes and conditions are specified in Example 7. Using the hybrid probe TCTGCCGTTA CTGCCCTGTG GGGCAAG-Floresin (SEQ ID NO: 5) with KM29, Cy5-labeled primer CAACTTCATCCACGTT ^* CACC (SEQ ID NO: 6), where T ^* is Cy5-labeled T base as in Example 8 Synthesis is possible. All amplifications are performed in 10 replicates with 15,000 template copies (50 ng of human genomic DNA / 10 μL). The temperature conversion process is as long as 31 seconds (up to 94 ° C, 60 ° C for 20 seconds, and the average rate of change between temperatures is 6.2 ° C per second). Fluorescence can be obtained in each sample between 15 and 20 seconds on the annealing / extension.

도 19에서는 PCR에서 형광을 모니터하는 세 가지 기술을 비교할 수 있다. 형광 프로브는 dsDNA dye SYBR^TMGreen I(도 19a), 이중 라벨된 플로레신/로다민 가수분해 프로브(도 19b), Cy5-라벨된 프라이머와 함께 플로레신-라벨된 하이브리드 프로브이다. 모든 프로브는 약 20회 변환과정에서 발생하는 형광을 감지하는데 동일한 감응성을 가진다. 연장된 증폭과 함께, 가수분해 프로브의 경우 시그날은 계속증되고, SYBR^TMGreen I의 경우에는 비등하고, 하이브리드 프로브의 경우에는 약간 감소된다. 도 19d에서는 세 가지 형광 모니터 기술의 정확성을 비교하였다. 각 점에 대한 평균 +/- 표준 편차를 플롯팅하였다. 각 데이터는 기저선 위의 형광(변환과정 11-15의 평균)의 변수 계수(표준 편차/평균)으로 플롯팅된다.In Figure 19, three techniques for monitoring fluorescence in PCR can be compared. Fluorescent probes are floresin-labeled hybrid probes with dsDNA dye SYBR ^™ Green I (FIG. 19A), double labeled floresin / rhodamine hydrolysis probe (FIG. 19B), Cy5-labeled primers. All probes have the same sensitivity to detect fluorescence that occurs in about 20 conversions. With prolonged amplification, the signal continues to increase for hydrolysis probes, boils for SYBR ^™ Green I, and decreases slightly for hybrid probes. In FIG. 19D, the accuracy of the three fluorescence monitor techniques was compared. The mean +/- standard deviation for each point was plotted. Each data is plotted as a variable coefficient (standard deviation / mean) of fluorescence on the baseline (average of conversions 11-15).

가수분해 프로브의 형광 비율에서 변화가 하이브리드 프로브에서 수득한 것보다 클지라도(도 19b, 19c), 가수분해 프로브에서 얻은 형광의 변수 계수가 더 크다(도 19d). 즉,비록 절대적인 시그날 수준은 더 낮더라도, 하이브리드 프로브 방법으로 인한 형광이 가수분해 프로브를 이용하는 것보다 더욱 정확하다. 이는 사용이 더 많은 이중-라벨된 가수분해 프로브보다도 하이브리드 프로브의 예상치못한 장점이 된다.Although the change in fluorescence ratio of the hydrolysis probe is larger than that obtained with the hybrid probe (FIGS. 19B, 19C), the parameter coefficient of the fluorescence obtained with the hydrolysis probe is larger (FIG. 19D). That is, although the absolute signal level is lower, the fluorescence due to the hybrid probe method is more accurate than using the hydrolysis probe. This is an unexpected advantage of hybrid probes over more double-labeled hydrolysis probes.

시작 주형 복사체 수의 정량화 방법 ; 정량적인 PCR은 생의학적 연구 및 임상 실험에서 매우 중요한 기술이 되었다. 정량화 과정은 흔히 복사체 수를 알 고 있는 표적 서열을 포함하는 시료의 표준 곡선으로 실행하는 것을 포함한다. 모르는 시료의 복사체 수는 알고 있는 값들 사이에 외삽법을 통하여 결정을 할 수 있다. 존재하는 DNA의 양에 비례하는 시그날을 제공하는 형광, 방사능활성 또는 임의 다른 방법을 이용한 cycle-by-cycle 완전한 증폭 곡선을 모니터하였을 때, 많은 데이터 점을 분석하는데 이용을 하고, 표준 또는 모르는 것을 나타내는 값을 선택하는 것은 분명하지는 않다. 선행 기술에서는 시그날의 "한계치"를 선택하고, 그 다음 표준 또는 미지의 시료가 한계치에 교차할 때 변환과정의 수를 대표값으로 이용한다(Higuchi & Watson, EPA 0 640 828 A1). 이와 같은 과정은 증폭 곡선에서 이용할 수 있는 소량의 데이터를 이용한다. 또한, 한계치 값이 매우 주관적이고, 이는 정확한 또는 부정확한 편향이 될 수 있다. 증폭 곡선에 있는 데이터에 비-선형 곡선 적용 기술을 이용하여 객관적으로 더 많은 데어터를 이용할 수 있다. 적절하게는 기초 공정의 인자를 모델화하여 증폭 곡선의 모양을 설명할 수 있는 식을 찾을 수 있다.Quantification method of starting template copy number; Quantitative PCR has become a very important technique in biomedical research and clinical trials. Quantification procedures often involve running a standard curve of a sample containing a target sequence of known copy number. Unknown copy number can be determined by extrapolation between known values. When monitoring cycle-by-cycle complete amplification curves using fluorescence, radioactivity, or any other method that provides a signal proportional to the amount of DNA present, it is used to analyze many data points, indicating standard or unknown. Choosing a value is not clear. Prior art selects the “limit” of a signal and then uses the number of conversions as a representative value when the standard or unknown sample crosses the limit (Higuchi & Watson, EPA 0 640 828 A1). This process uses a small amount of data available in the amplification curve. In addition, the threshold value is very subjective, which can be accurate or incorrect bias. More data can be used objectively by using a non-linear curve application technique on the data in the amplification curve. Appropriate models of the underlying process can be modeled to find an equation that explains the shape of the amplification curve.

많은 여러 가지 식을 이용하여 증폭 동안에 생성되는 데이터를 적용할 수 있다. 일반적으로 DNA 증폭은 로그 선형 부분을 가지고, 이 부분에서의 데이터는 DNA 증폭에서 기대되는 것과 같은 지수적인 증가를 나타내는 식에 적용시킬 수 있을 것이다. DNA 증폭의 로그-선형 부분은 다음의 식으로 표현할 수 있다.Many different equations can be used to apply the data generated during amplification. In general, DNA amplification has a logarithmic linear portion, and the data in this region can be applied to equations that represent an exponential increase as expected in DNA amplification. The log-linear portion of DNA amplification can be expressed by the following equation.

y=A^*[DNA]^*(1+E)ⁿ y = A ^* [DNA] ^* (1 + E) ⁿ

이때, A는 시그날 유닛을 DNA 유닛으로 전환하는 스케일링 인자이고; [DNA]는 반응에서 DNA의 출발 농도이고; E는 반응의 효과이고; n은 변환과정의 수이다.Wherein A is a scaling factor that converts a signal unit into a DNA unit; [DNA] is the starting concentration of DNA in the reaction; E is the effect of the reaction; n is the number of conversion processes.

정량화 과정은 다음과 같다; (1) 변수 A와 E를 만들기 위해 이 식에 공지의 표준을 적용시키고; (2) 표준으로부터 얻은 A와 E 값을 이용하여 식에 모르는 시료를 적용시키고, [DNA]를 플로팅시킨다. 이 기술은 더 많은 데이터를 이용하고, 데이터의 일부분, 선형 부분 즉, 정보성이 큰 부분을 이용한다. 도 20, 21, 22에서는 이와 같은 방법의 예를 나타내었다. 표준 곡선과 "미지"의 사람 게놈 DNA 표준을 이용하여, 정제된 PCR 생성물 10-배 희석물을 증폭시킨다. 도 20에서는 사용자 또는 소프트웨어를 이용하여 로그-선형 부분을 용이하게 확인할 수 있다는 것을 보여준다. 도 21에서는 수학식 3을 104 복사체 표준에 적용시키는 것을 보여준다. 도 22에서는 A와 E에 대한 몇 가지 표준으로부터의 평균 치를 이용하고, 이를 [DNA]에 적용시킨다. 게놈 DNA의 한 개 복사체 유전자에 대한 이론치(15,000복사체)에 매우 근접한 값 16,700을 얻는다.The quantification process is as follows; (1) applying a known standard to this equation to make variables A and E; (2) Apply an unknown sample using the A and E values obtained from the standard, and plot the [DNA]. This technique uses more data and uses a portion of the data, a linear portion, that is, an informational portion. 20, 21, and 22 show an example of such a method. Standard curves and “unknown” human genomic DNA standards are used to amplify purified PCR product 10-fold dilutions. 20 shows that the log-linear portion can be easily identified using a user or software. Figure 21 shows the application of Equation 3 to the 104 copy standard. In Figure 22, the mean values from several standards for A and E are used and applied to [DNA]. The value 16,700 is very close to the theory (15,000 copies) of one copy gene of genomic DNA.

증폭 곡선에 있는 모든 데이터를 이용하는 것에는 배경 수준과 평탄역 값을 포함한다. 복사체 수가 많을 경우에는 평탄역은 정보를 제공하지 못하는 것이고, 복사체 수가 적을 경우에는 시작 복사체 수에 비례할 수 있다. 배경 수준은 시그날이 상당히 증가하는 것을 나타내는 제 1 점을 결정하는데 유용하다. 이때, DNA 증폭 곡선의 모양에 관계하는 모든 인자를 아는 것은 아니기 때문에 한 가지 방식으로 곡선의 모양을 설명한다. 도 23에서는 DNA 주형 농도의 5차 크기 범위를 감지하기 위해 형광 하이브리드 프로브를 이용한 증폭 곡선을 나타낸다. 각 곡선은 다음의 식에 적용시킨다.Using all the data in the amplification curve includes the background level and the plateau value. If the number of copies is large, the flat area does not provide information. If the number of copies is small, it may be proportional to the number of starting copies. The background level is useful for determining the first point that indicates a significant increase in the signal. At this time, since not all factors related to the shape of the DNA amplification curve are known, the shape of the curve is explained in one way. FIG. 23 shows an amplification curve using a fluorescent hybrid probe to detect the fifth size range of DNA template concentration. Each curve is applied to the following equation.

y=((as^*x+ab)-(ds^*x+db))/(1-(x/c)＾b)+(ds^*x+db)y = ((as ^* x + ab)-(ds ^* x + db)) / (1- (x / c) ＾ b) + (ds ^* x + db)

이때, "as"는 기울기선의 배경을 나타내고; "ab"는 배경선의 y 절편을 나타내고; "ds"는 정체선의 기울기를 나타내고; "db"는 기울기선의 y 절편을 나타내고; "c"는 반응의 배경으로부터 평탄부까지의 절반 정도에 있을 때, 복사체의 수를 나타내고(A₅₀); "b"는 증폭의 로그-선형 부분의 기울기를 나타낸다.At this time, "as" represents the background of the inclination line; "ab" represents the y intercept of the background line; "ds" represents the slope of the congestion line; "db" represents the y intercept of the slope line; "c" represents the number of copies when at half the distance from the background of the reaction to the flat part (A ₅₀ ); "b" indicates the slope of the log-linear portion of the amplification.

이 식이 이와 같은 증폭 데이터에 매우 적합하고, 도 24에서는 A₅₀값이 7차 크기를 지나 시작 복사체 수 로그와 연관이 있다는 것을 나타낸다. 도 25에서는 5차 크기 범위에서 DNA 주형을 감지하기 위한 가수분해 프로브를 이용한 증폭으로부터 얻은 데이터를 동일한 식에 적용시킨 것을 나타낸다. 이 식은 이와 같은 증폭데이터에 매우 적합하고, 도 26에서는 A₅₀값이 시작 복사체 수 로그와 상관관계가 있다는 것을 나타낸다. 이는 식이 하이브리드 프로브 증폭 곡선의 가파른 평탄부와 가수분해 프로브 곡선의 지속적으로 증가하는 "평탄부" 모두에 잘 적용이 되기 때문에 전체 곡선 적용 방식의 유연성을 설명한다.This equation is well suited for such amplification data, and in FIG. 24 indicates that the A ₅₀ value correlates with the starting copy number log beyond the 7th magnitude. FIG. 25 shows that the data obtained from amplification using a hydrolysis probe for detecting DNA templates in the 5th size range was applied to the same equation. This equation is well suited for such amplification data, and in FIG. 26 indicates that the A ₅₀ value correlates with the starting copy number log. This explains the flexibility of the overall curve application method because it applies well to both the steep flats of the dietary hybrid probe amplification curve and the constantly increasing "flats" of the hydrolysis probe curve.

전체 곡선 적용이 이 식에만 국한되는 것은 아니다. 도 27에서는 다음의 수학식 5에 적용되는 세 가지 농도의 증폭을 나타낸다;Application of the entire curve is not limited to this equation. 27 illustrates amplification of three concentrations applied to Equation 5 below;

y=(((as^*x+ab)-(dmax^*x/dd+x))/(1+(x/c)＾b))+(dmax^*x/dd+x)y = (((as ^* x + ab)-(dmax ^* x / dd + x)) / (1+ (x / c) ＾ b)) + (dmax ^* x / dd + x)

이때, 식은 처음 6개 변수 식과 유사하나, 단 평탄부는 직선보다는 쌍곡선으로 정위된다. 도 28에서는 이 식의 A₅₀가 시작 복사체의 수와 상관관계가 있다는 것을 나타낸다.In this case, the equation is similar to the first six variable equations, except that the flat portion is hyperbolic rather than a straight line. 28 shows that A ₅₀ of this equation correlates with the number of starting copies.

A₅₀을 이 실시예에서 이용하는데, 특정 기술이 증폭 곡선의 아래 또는 위에서 더욱 확고하다면, 배경과 평탄부간에 수준을 선택할 수 있다. 예를 들면, 시작 복사체 수와 A₅₀,A₄₀,A₃₀,A₂₀,A₁₀사이에 최상의 상관관계를 평가하기 위해 일련의 증폭 표준 곡선을 평가한다. 알고 있는 시작 복사체 수와 가장 연관관계가 있는 증폭 수준을 결장한다. 이는 다른 감지 시스템과는 약간 다를 것이다. 도 19에서는 다양한 감지 시스템의 변수 계수를 나타낸다. 최상의 예측인 증폭 수준은 가장 낮은 변수 계수를 가진 수준일 것이다.A ₅₀ is used in this example, and if a particular technique is more robust below or above the amplification curve, one can choose the level between the background and the flat. For example, a series of amplification standard curves are evaluated to assess the best correlation between the starting copy number and A ₅₀ , A ₄₀ , A ₃₀ , A ₂₀ , A ₁₀ . The amplification level most relevant to the known starting copy number is absent. This will be slightly different from other sensing systems. 19 shows variable coefficients of various sensing systems. The best predictive level of amplification will be the level with the lowest variable coefficient.

DNA 증폭 반응 자체를 잘 이해를 하고 있기 때문에, 물리적인 공정을 반영하는 변수를 가지는 다른 식을 이용할 수 있다. DNA 증폭 곡선의 평탄부는 다른 반응에서 다른 원인을 가진다. 이는 나중의 변환과정에서 프라이머가 생성물과 재시 어닐링하는데 경쟁을 할 수 없기 때문이다. 이와 같은 효과는 반응(다시 어닐링하는 속도는 생성물의 농도 제곱에 비례함)에서 생성물의 농도 제곱에 따라 변화되는 변수로 포착을 할 수 있다. 평탄부의 또 다른 원인은 프라이머의 고갈이다. 프라이머 제한 반응은 특징적인 모양을 가지는데, 이는 인지할 수 있을 정도의 매우 가파른 평탄부를 가진다. 프라이머 제한 반응 적용에는 이와 같은 가파른 상단을 한정하는 변수를 포함한다. 효소 제한 반응은 이에 따라 적용할 수 있는 매우 둥근 평탄부를 가진다. 중량을 재는 인자를 고안할 수 있는데, 이는 주어진 시스템에서 공지의 변수 계수를 반영하여, 무거울수록 더 신뢰성이 있는 데이터 점을 가진다. 증폭 프로파일에 더 많은 점을 적용시켜, 시작 복사체 수를 더 정확한, 더 확고한 평가치를 얻을 수 있다. 이와 같은 하나이상의 적용 변수들을 이용하면 모르는 시료에서 시작 복사체의 수를 평가할 수 있다.Since we understand the DNA amplification reaction itself, we can use other equations with variables that reflect the physical process. The flat part of the DNA amplification curve has different causes in different reactions. This is because the primers cannot compete for reannealing the product during later conversion. This effect can be captured by a variable that changes with the square of the concentration of the product in the reaction (the rate of annealing again is proportional to the square of the concentration of the product). Another cause of the flat is depletion of the primer. Primer restriction reactions have a characteristic shape, which has a noticeably very steep flat. Primer restriction reaction applications include variables that define such steep tops. Enzyme restriction reactions have very round flats that can be applied accordingly. Weighing factors can be devised, which reflect the known variable coefficients in a given system, so that the heavier the data, the more reliable the data points. By applying more points to the amplification profile, a more accurate, more robust estimate of the starting copy number can be obtained. One or more of these application variables can be used to assess the number of starting copies in unknown samples.

PCR을 지속적으로 형광 모니터하는 방법 ; 본 발명의 각 PCR 온도 변환 과정안에 여러 회 모니터하는 지속적인 모니터방법의 특징을 논의하기로 한다. PCR 동안에 형광을 모니터하는 것은 일정 온도에서 각 과정에 1회 이루어지나, 본 발명은 PCR 과정을 통하여 지속적인 모니터의 장점을 제공한다. 도 29a와 29b에서는 SYB^TMGreen I의 온도와 형광에 대한 역관계를 설명하고 있다. 이는 온도 과정동안에 혼동 효과로써 통상 일정한 연장 온도에서 과정당 1회 형광을 고려하면 이를 제거할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 온도 변환동안에 형광을 모니터하는 것이 매우 유익한 것이다. 본 발명이전에는 각 변화과정내에서 형광을 지속적으로 모니터를 하지 않았다(이는 각 과정에 1회 모니터하는 것에 반대되는 것이다). 본 발명에 따르면, 시간, 온도, 형광등은 매 초, 매 200msec, 100msec 또는 더 큰 빈도에서 얻을 수 있다. 이와 같은 데이터는 기존에 이용한 방식으로는 얻을 수 없었던 생성물 변성, 다시 어닐링, 연장 및 프로브 어닐링 및 신속한 변화과정 동안에 용융 등의 상세한 정보가 된다.To continuously monitor PCR; The characteristics of the continuous monitoring method of monitoring multiple times in each PCR temperature conversion process of the present invention will be discussed. Monitoring fluorescence during PCR is done once for each process at a constant temperature, but the present invention provides the advantage of continuous monitoring throughout the PCR process. 29A and 29B illustrate an inverse relationship between temperature and fluorescence of SYB ^™ Green I. This is a confusing effect during the temperature process, which can be eliminated by considering fluorescence once per process, usually at a constant extension temperature. However, according to the invention, it is very advantageous to monitor the fluorescence during temperature conversion. Prior to the present invention, fluorescence was not continuously monitored within each change process (as opposed to one-time monitoring of each process). According to the present invention, time, temperature, fluorescent lamps can be obtained every second, every 200 msec, 100 msec or greater. Such data provides detailed information such as product denaturation, re-annealing, extension and probe annealing, and melting during rapid change, which would not have been possible with conventional methods.

실시예 10Example 10

프라이머 5'-CGTGGTGGACTTCTCTCAAT-3'(서열 1)과With primer 5'-CGTGGTGGACTTCTCTCAAT-3 '(SEQ ID NO: 1)

5'-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3'(서열 2)(Genbank sequence HVHEPB)을 이용하여, 정제된 PCR 생성물 10⁶복사체로부터 헤파타이트스 B 표면 항원 유전자의 180염기쌍을 증폭시켰다. 실시예 2의 증폭 조건을 준수하는데, 단 반응에는 1:20,000희석된 SYBR^TMGreen I과 2mM MgCl₂를 포함하는 것이 다른 점이다. 각 온도 변환과정은 다음과 같다; 27초간(최고 92℃, 최저 59℃, 70℃에서 5초간, 온도간의 평균 변화율은 초당 3.0℃)이다. 매 200msec마다 시간, 온도, 형광 2채널을 얻고, 이를 지속적으로 플롯팅하는데; 반복과정 수에 대한 형광, 온도에 대한 형광 그래프에 플롯한다. 도 30에서는 10 내지 34회 과정을 통한 온도, 시간, 형광을 3차원으로 나타낸 것이다. 이와 같은 3차운 곡선은 도 30의 2차 그래프인 시간에 대한 온도 그래프, 시간에 대한 형광 그래프 및 온도에 대한 형광 그래프로부터 투영하여 만든 것이다. 도 30의 시간에 대한 온도 그래프는 각 과정에서 반복하고, 이는 도 3에서 제공한 동일한 정보를 필수적으로 제공한다. 형광이 온도에 대해 역으로 변화되기 때문에, 도 30에 나타낸 초기 과정에서의 시간에 대한 형광 곡선은 시간에 대한 온도 그래프(도 29)에 눈금을 매긴 거울 상이된다. 생성물이 누적되면, 이중 쇄 생성물에서 모든 온도에서 형광이 증가되었다. 그러나, 변성 온도에서 단일 쇄 DNA가 있기 때문에, 형광이 기저수준으로 되돌아간다. 도 30에 나타낸 이중 쇄 염료의 온도에 대한 형광은 시간축에서 제거하고 DNA 증폭하는 동안에 thom이 상태에 따라 온도가 달라진다는 것을 나타낸다.180 base pairs of the hepatite B surface antigen gene were amplified from purified PCR product 10 ⁶ copies using 5'-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3 '(SEQ ID NO: 2) (Genbank sequence HVHEPB). The amplification conditions of Example 2 were followed, except that the reaction included 1: 20,000 diluted SYBR ^™ Green I and 2 mM MgCl ₂ . Each temperature conversion process is as follows; For 27 seconds (up to 92 ° C, minimum 59 ° C, and 70 ° C for 5 seconds, the average rate of change between temperatures is 3.0 ° C per second). Every 200 msec time, temperature, two fluorescence channels are obtained and continuously plotted; Plot fluorescence versus number of replicates and fluorescence plot against temperature. In FIG. 30, temperature, time, and fluorescence through 10 to 34 cycles are shown in three dimensions. Such a cubic curve is created by projecting from a temperature graph with respect to time, a fluorescence graph with respect to time, and a fluorescence graph with respect to temperature, which is the second graph of FIG. 30. The temperature graph over time in FIG. 30 is repeated in each process, which essentially provides the same information provided in FIG. 3. Since the fluorescence changes inversely with respect to temperature, the fluorescence curve over time in the initial process shown in FIG. 30 becomes a mirror image that is scaled in the temperature graph over time (Figure 29). As the product accumulated, the fluorescence increased at all temperatures in the double chain product. However, since there is single stranded DNA at denaturation temperature, fluorescence returns to baseline. Fluorescence of the temperature of the double chain dye shown in FIG. 30 indicates that the temperature varies depending on the state of the thom during removal from the time base and DNA amplification.

실시예 11Example 11

5㎕ 용적에 25ng 게놈 DNA와 SYBR^TMGreen I 1:10,000 희석물로부터 사람 β-글로빈 유전자의 536 염기쌍 단편을 증폭시켰다. 각 온도 변환과정은 다음과 같다; 28초간(최고 95℃, 최저 61℃, 72℃에서 15초간, 온도간의 평균 변화율은 초당 5.2℃)이다. 다른 조건은 도 30에서 설명한 것과 동일하다. 변환과정 15-40를 하였다. 도 31에 나타낸 것과 같은 온도에 대한 형광를 플롯팅하면 PCR 동안에 생성물의 쇄 상태에 따라 온도가 달라진다는 것을 알 수 있다. 초기 과정은 거의 동일한 것으로 낮은 온도에서는 형광이 비-선형으로 증가되었다. 증폭이 진행되면, 온도과정이 어닐링과 변성 온도간에 루프를 만드는 것처럼 보인다. 시료를 가열하면, 형광은 변성이 일어날 때까지 높다. 시료를 냉각하면, 형광은 증가되어 생성물이 다시 어닐링되었다는 것을 나타낸다. 온도가 연장하는 동안에 일정하면, 형광이 증가하는 것이 추가 DNA 합성과 상관관계가 있다.536 base pair fragments of the human β-globin gene were amplified from 25 ng genomic DNA and SYBR ^™ Green I 1: 10,000 dilution in 5 μl volume. Each temperature conversion process is as follows; 28 seconds (maximum 95 ° C, minimum 61 ° C, 72 ° C for 15 seconds, average change rate between temperatures is 5.2 ° C per second). Other conditions are the same as described in FIG. The conversion process was 15-40. Plot fluorescence for a temperature such as that shown in Figure 31, it can be seen that the temperature varies depending on the chain state of the product during PCR. The initial process was about the same and at low temperatures the fluorescence increased non-linearly. As amplification proceeds, the temperature process appears to create a loop between the annealing and denaturing temperatures. When the sample is heated, the fluorescence is high until denaturation occurs. Upon cooling the sample, the fluorescence was increased to indicate that the product was annealed again. If the temperature is constant during prolongation, increasing fluorescence correlates with further DNA synthesis.

본 명세서로부터 이해를 할 수 있겠지만, 변환과정내에 지속적인 모니터를 하면 선행기술에서 제공하지 못한 DNA 증폭 메카니즘에 식견을 제공한다. 본 발명을 이용하면, 거의 이해할 수 없었던 DNA 증폭에 대해 많은 면을 이해할 수 있다. 예를 들면, 신속한 변환가정 증폭은 생성물을 1초이내에서 변성시키는 것을 요구하면 반면, 기존기술에서는 변성하는데 10초에서 1분이 소요되었다. 본 발명에 따른 이중 쇄 염료로 실제 시간 형광을 모니터하여 생성물의 용융을 관찰하면(도 30, 31) 변성시간이 짧은 것이 휠씬 효과적이라는 것을 알 수 있다. 또 다른 예를 보면, "평탄역 효과"의 많은 원인에 대해 제시하였으나, 다른 방안들간을 구별하는데 이용될 수 있는 데이터는 거의 없다. 선행 기술의 느린 온도 사이클러로 생성물을 다시 어닐링하는 것은 다소 비용이 많이 들고 이는 바람직하지 못한 효과가 더 크다. 생성물의 재어닐링이 "평탄역 효과"의 주요원인인 것으로 보인다.As can be appreciated from this specification, continuous monitoring within the conversion process provides insight into DNA amplification mechanisms not provided in the prior art. By using the present invention, many aspects of DNA amplification that are hardly understood can be understood. For example, rapid conversion home amplification requires denaturation of the product within 1 second, whereas in the prior art it took 10 seconds to 1 minute to denature. When the real time fluorescence was monitored with the double-chain dye according to the present invention to observe the melting of the product (Figs. 30 and 31), it can be seen that the shorter modification time is more effective. In another example, many sources of "flat effect" have been suggested, but little data can be used to distinguish between the different approaches. Reannealing the product with the slow temperature cycler of the prior art is rather expensive and this is more undesirable. Reannealing of the product appears to be the main cause of the "flat effect".

인제는 서열 특이적인 프로브의 지속적인 모니터에 대해 생각을 해보아야 한다. 설명을 통하여 인지를 하겠지만, 변환과정내에 지속적인 모니터하여 프로브 형광의 성질을 확인할 수 있다.Indications should be considered for the continuous monitoring of sequence specific probes. As will be appreciated from the description, the nature of the probe fluorescence can be monitored by continuous monitoring during the conversion process.

실시예 12Example 12

실시예 7에서와 같이, 이중-라벨된 가수분해 프로브(β-악틴)과 인접 하이브리드 프로브(β-글로빈)으로 매 200msec마다 증폭을 지속적으로 모니터한다. 도 32a에서 볼 수 있는 것과 같이, 반응의 변환과정 20-45을 가수분해 프로브로 모니터하였다. 가수분해 프로브는 온도에 따른 형광 비율이 선형으로 변화되는 것으로 나타났고, 프로브 더 많이 가수분해되면 형광이 나란히 증가되었다. 대조적으로 하이브리드 프로브의 형광 비율은 온도에 따라 상당히 과격하게 변화된다(도 32b, 변환과정 20-40). 어닐링/연장 상동안에, 프로브는 단일 쇄 생성물에 하이브리드되고, 형광 비율(Cy5/플로레신)이 증가되었다. 생성물의 변성 온도를 가열시키는 동안에, 프로브는 70℃정도에서 분리되고, 형광 비율은 배경 수준으로 감소된다.As in Example 7, amplification is continuously monitored every 200 msec with a double-labeled hydrolysis probe (β-actin) and an adjacent hybrid probe (β-globin). As can be seen in Figure 32a, the conversion of reactions 20-45 was monitored with a hydrolysis probe. Hydrolysis probes showed a linear change in fluorescence ratio with temperature, and as the probes were more hydrolyzed, the fluorescence increased side by side. In contrast, the fluorescence ratio of the hybrid probe varies considerably with temperature (FIG. 32B, conversion 20-40). During the annealing / extension phase, the probe hybridized to a single chain product and the fluorescence ratio (Cy5 / floresin) was increased. While heating the denaturation temperature of the product, the probe is separated at about 70 ° C. and the fluorescence ratio is reduced to the background level.

실시예 13Example 13

10㎕ 용적에서 게놈 DNA 50ng으로부터 β-글로빈 단편 110bp를 증폭시켰다. 실시예 3의 증폭 조건 및 인접 하이브리드 프로브와 0.4U Taq 폴리메라제 또는 0.8U KlenTaq1으로 실시하였다. 매 100msec마다 형광을 모니터하였따. KlenTaq1(도 33)과 Taq(도 34)를 이용한 온도에 따른 형광을 나타낸 그래프에서는 70℃ 정도에서 프로브의 용융을 설명한다. KlenTaq1을 이용한 경우에 최대 시그날은 Taq을 이용한 경우의 시그날보다 큰데 그 이유는 Taq의 엑소뉴클레아제 활성으로 인한 것이다. Taq를 이용한 나중의 과정에서는 고유 프로브의 농도가 감소함에 따라 각 변환과정의 형광이 증가하기 시작하였다. 도 35(KlenTaq1)와 도 36(Taq)에서는 온도, 시간, 형광의 3차원 플롯을 나타내었다.Β-globin fragment 110 bp was amplified from 50 ng of genomic DNA in 10 μl volume. The amplification conditions of Example 3 and adjacent hybrid probes were run with 0.4 U Taq polymerase or 0.8 U KlenTaq1. Fluorescence was monitored every 100 msec. In the graph showing fluorescence with temperature using KlenTaq1 (FIG. 33) and Taq (FIG. 34), melting of the probe at about 70 ° C. will be described. The maximum signal with KlenTaq1 is greater than the signal with Taq because of Taq's exonuclease activity. In the later process using Taq, the fluorescence of each conversion process began to increase as the concentration of the intrinsic probe decreased. 35 (KlenTaq1) and 36 (Taq) show three-dimensional plots of temperature, time, and fluorescence.

본 발명의 (1) 각 온도변환과정내에서 지속적으로 형광을 모니터하는 것과 (2) 온도 및 시간에 따른 하이브리드을 분석하는 것을 복합하면 다른 것으로는 얻을 수 없는 장점을 제공한다. 도 2에서는 과정을 통한 지속적인 모니터방법에 의해서 기존에는 얻을 수 없었던 정보를 얻는다는 것을 나타낸다. 변환과정의 생성물 용융동안에 지속적으로 형광을 모니터하는 것으로 해당 과정동안에 존재하는 DNA의 순도, 확인, 정량 등에 대한 정보를 얻을 수 있다.The combination of (1) continuous monitoring of fluorescence in each temperature conversion process of the present invention and (2) analysis of hybrids with temperature and time provide advantages that cannot be obtained by other means. Figure 2 shows that by the continuous monitoring method through the process to obtain information that could not be obtained previously. By continuously monitoring the fluorescence during the product melting of the conversion process, information on the purity, identification and quantification of DNA present during the process can be obtained.

PCR 반응이 연장 온도로부터 변성 온도로 가열할 때, 시료에 있는 임의 DNA는 단일 쇄로 용융된다. 이와 같은 변성은 SYBR^TMGreen I의 형광이 떨어질 때 관찰된다. 작은 PCR 생성물의 경우에 좁은 온도범위에서 용융 전이가 일어나고, 용융 온도 범위의 중간 점을 Tm이라 한다. 겔 전기영동에의한 크기 분류와 비슷하게, 용융 피크 분석은 DNA의 기초 특징을 측정할 수 있고, 이를 이용하여 증폭된 생성물을 확인할 수 있다. 겔 전기영동과는 달리, 용융 곡선 분석은 길이는 동일하나 GC/AT 비율이 다른 생성물을 구별할 수 있다. 또한, 길이 및 GC 함령이 동일하나 GC 분포가 상이한(가령, 동일하게 분포되어있는 것과 단부에 GC가 몰려있는 것) 두 가지 생성물은 용융 곡선이 상당히 다르다.When the PCR reaction is heated from extension temperature to denaturation temperature, any DNA in the sample is melted into a single chain. This degeneration is observed when the fluorescence of SYBR ^™ Green I drops. In the case of small PCR products, melt transitions occur in a narrow temperature range and the midpoint of the melting temperature range is called Tm. Similar to size classification by gel electrophoresis, melt peak analysis can determine the basic characteristics of DNA and can be used to identify amplified products. Unlike gel electrophoresis, melt curve analysis can distinguish products of the same length but different GC / AT ratios. In addition, the two products having the same length and GC command but different GC distributions (eg, having the same distribution and having GC at the end) have significantly different melt curves.

PCR 생성물이 용융되는 온도는 상당한 범위까지 다양하다. 당 분야에 공지의 실험식을 이용하여, DNA의 용융 온도(Tm)에서 GC의 영향을 예측하는데, GC 0%인 이중나선은 100% GC 이중나선의 용융 온도보다 41℃ 낮은 온도에서 용융된다. 동일한 GC 함량을 가지는 경우에는 40개 염기쌍 프라이머 이량체가 1000bp 생성물보다 12℃ 아래에서 용융된다. 따라서, PCR 생성물의 Tm 범위는 적어도 50℃정도가 된다. 이와 같이 상당히 넓은 범위로 인하여 대부분의 PCR 생성물은 용융 곡선으로 구별할 수 있다. 따라서, 용융 곡선 분석과 함께 PCR의 형광을 모니터한 것을 복합하면, PCR 생성물의 증폭, 감지 및 구별을 동시에 할 수 있다.The temperature at which the PCR product melts varies to a significant extent. Using an empirical formula known in the art, the effect of GC on the melting temperature (Tm) of DNA is predicted, where the double helix of 0% GC melts at a temperature of 41 ° C. below the melting temperature of 100% GC double helix. For the same GC content, 40 base pair primer dimers are melted at 12 ° C. below the 1000 bp product. Thus, the Tm range of the PCR product is at least about 50 ° C. This wide range allows most PCR products to be distinguished by melting curves. Therefore, by combining the monitoring of the fluorescence of the PCR with the melting curve analysis, it is possible to simultaneously amplify, detect, and distinguish the PCR product.

실시예 14Example 14

SYBR^TMGreen I에 대한 광학과 24-시료 열 변환 사이클러가 있는 소량 형광계에서 세 가지 다른 PCR 생성물의 DNA 용융 곡선을 얻는다(LightCycler LC24, Idaho Technology, Idaho Falls, Idaho). 헤파타이티스 B 표면 항원 유전자의 180개 염기쌍을 증폭시키는데 이용된 프라이머는 5'-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3'(서열 1)와 5'-AGAAGATGAGGCATAGCAGC-3'(서열 2)이다. 292bp의 전립선 특이적인 항원(PSA) 유전자 증폭을 위한 프라이머는 5'-CTGTCCGTGA CGTGGATT-3'(서열 7)과 5'-AAGTCCTCCG AGTATAGC-3'(서열 8)이다. 실시예 7에서와 같이 536bp 염기쌍의 사람 β-글로빈 유전자 증폭시켰다. 증폭된 생성물은 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전, Centricon 30 소형 원심분리기(Amicon of Danvers, Massachusetts)를 통하여 반복세척하여 정제한다 주형의 농도는 260㎚에서 흡수도를 특정하고, 이는 A(260)/A(280) 비율이 1.7이상이 된다.DNA melting curves of three different PCR products were obtained on a small fluorimeter with optics for SYBR ^™ Green I and a 24-sample heat conversion cycler (LightCycler LC24, Idaho Technology, Idaho Falls, Idaho). Primers used to amplify 180 base pairs of the Hepatitis B surface antigen gene are 5'-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5'-AGAAGATGAGGCATAGCAGC-3' (SEQ ID NO: 2). Primers for amplifying the prostate specific antigen (PSA) gene at 292 bp are 5'-CTGTCCGTGA CGTGGATT-3 '(SEQ ID NO: 7) and 5'-AAGTCCTCCG AGTATAGC-3' (SEQ ID NO: 8). Human β-globin gene amplification of 536 bp base pairs as in Example 7. The amplified product is purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, repeated washing through Centricon 30 small centrifuge (Amicon of Danvers, Massachusetts). The concentration of the template specifies the absorbance at 260 nm, which is A (260) / A (280) ratio becomes 1.7 or more.

50mM Tris, pH 8.5, 2mM MgCl₂, 250㎍/㎖ 소 혈청 알부민에 포함된 정제된 DNA 50ng과 5㎕ 용적을 혼성 유리/플라스틱 반응 용기의 개방된 플라스틱 저장기에 피펫팅하고, 저속으로 원심분리하여, 모세 유리관의 팁부분에 시료를 위치시키고, 플라스틱 마개로 봉한다. 초당 0.1 내지 10.0도의 변화율로 95℃까지 선형 온도 전이 하는 동안 0.25 내지 2.0초간에 시그날을 통합하여, 용융 곡선을 위한 형광 데이터를 얻는다. 형광을 지속적으로 얻고, 이는 LabView 프로그램 환경(National Instrument, Austin, TX)에서 온도에 대한 형광플롯으로 나타낸다. 도 37에서는 세 가지 정제된 PCR 생성물의 용융 곡선을 나타낸다.50 ng of purified DNA and 5 μl of the purified DNA contained in 50 mM Tris, pH 8.5, 2 mM MgCl ₂ , 250 μg / ml bovine serum albumin were pipetted into an open plastic reservoir in a hybrid glass / plastic reaction vessel and centrifuged at low speed. The sample is placed on the tip of the capillary glass tube and sealed with a plastic cap. Integrate the signal between 0.25 and 2.0 seconds during linear temperature transition to 95 ° C. at a rate of change of 0.1 to 10.0 degrees per second to obtain fluorescence data for the melting curve. Fluorescence is obtained continuously, which is represented as a fluorescence plot of temperature in the LabView program environment (National Instrument, Austin, TX). 37 shows the melting curves of three purified PCR products.

도 37에서 세 가지 생성물의 Tm은 단지 6도 범위에 있고, 곡선중 두 개는 2도정도에 의해 분리되어 있다. Tm에서 길이에 걸쳐 GC 비율이 중요하다는 것은 길이가 536bp인 β-글로빈 단편보다 길이가 더 짧은 292bp PSA 생성물이 더 높은 온도에서 용융된다는 것으로 설명될 수 있다. 평형을 얻기 위해 분당 0.5℃ 비율로 용융 곡선을 얻을 수 있다. 또한, 가열 속도를 감소시키면 용융 곡선이 더 낮은 온도쪽으로 전이되고, 더 가파르게된다(도 38, 헤파타이티스 B 단편). 그러나, 도 37의 용융 곡선은 초당 0.2℃의 가열 속도(분당 12℃)로 하였을 때에도 얻을 수 있고, Tm이 2℃ 또는 그 이하정도로 다른 생성물을 구별할 수 있다.In Figure 37 the Tm of the three products is only in the 6 degree range, and two of the curves are separated by about 2 degrees. The importance of the GC ratio over the length at Tm can be explained by the fact that the 292 bp PSA product, which is shorter in length than the 536 bp β-globin fragment, melts at higher temperatures. Melt curves can be obtained at a rate of 0.5 ° C. per minute to achieve equilibrium. In addition, decreasing the heating rate causes the melting curve to shift towards lower temperatures and become steeper (FIG. 38, Hepatitis B fragment). However, the melting curve of FIG. 37 can be obtained even at a heating rate of 0.2 ° C. per second (12 ° C. per minute), and Tm can distinguish other products at about 2 ° C. or less.

PCR 생성물의 표면 Tm은 이중 쇄-특이적인 DNA 염료 농고에도 영향을 받는다(도 39, 헤파타이티스 B 단편). 염료의 농도가 높을수록 DNA 이중쇄의 안정성이 증가되고, 관찰되는 Tm도 증가된다.The surface Tm of the PCR product is also affected by double chain-specific DNA dye thickeners (FIG. 39, Hepatitis B fragment). Higher concentrations of dye increase the stability of the DNA double strand and increase the Tm observed.

SYBR^TMGreen I을 이용한 용융 곡선을 모니터하기 위한 적절한 조건은 가열 속도가 초당 0.1-0.5℃이고, SYBR Green I이 1:7,000 내지 1:30,000 희석비를 이용하는 것이다. 이와 같은 조건으로 2℃ 정도 Tm이 다른 생성물을 용이하게 분별할 수 있다.Suitable conditions for monitoring melt curves with SYBR ^™ Green I are heating rates of 0.1-0.5 ° C. per second and SYBR Green I using 1: 7,000 to 1: 30,000 dilution ratios. Under these conditions, products with different Tm about 2 ° C can be easily separated.

좀더 정확한 온도 조절 및 용융 피크 분석용 소프트웨어를 이용하면, Tm에서 감지할 수 있는 차이를 몇 분수로도 감소시킬 수 있다. 그러나, 모든 생성물을 Tm에 의해 구별할 수 있는 것은 아니고, 두 개 이상의 생성물이 같이 이동하여 전기영동 결과를 잘못 해석할 수도 있기 때문에, 예측 범위 내에 용융되는 생성물의 일부는 원하는 생성물이 아닐 수 있다. 그러나, 예측 범위에 용융된 DNA가 없는 경우에는 예측 생성물이 존재하지 않는다고 결론을 내릴 수 있다.With more accurate temperature control and melting peak analysis software, the detectable difference in Tm can be reduced by a few fractions. However, not all products can be distinguished by Tm, and because two or more products may move together to misinterpret the electrophoretic results, some of the products that melt within the predicted range may not be the desired products. However, it can be concluded that there is no predicted product in the absence of molten DNA in the predicted range.

용융 곡선 분석으로 이용할 수 있는 생성물을 구별하는 또 다른 형태는 긴 PCR 생성물에서 볼 수 있는 특이적인 도메인 용융 패턴이다. 통상 짧은 생성물(300bp이하)은 한 개의 전이에서 용융되지만, 긴 생성물은 복합적이고, 독특한 모양의 용융 곡선을 생성물의 증폭을 위한 핑거프린트로 이용한다.Another form of distinguishing the products available for melt curve analysis is the specific domain melting pattern found in long PCR products. Typically short products (up to 300 bp) melt in one transition, while long products use a complex, uniquely shaped melting curve as a fingerprint for amplification of the product.

용융 곡선 분석을 이용하여 프라이머 이량체와 같은 비-특이적인 생성물로부터 원하는 생성물을 분별할 수 있다. 프라이머 이량체는 광역의 저온에서 용융되어; 특정 PCR 증폭 생성물의 가파른 용융 곡선과는 상당히 다르다. 저온 어닐링에서 많은 과정을 거쳐 발생된 이형성이 큰 생성물은 순수 PCR 생성물의 것과 비교를 하면 낮고 넓은 용융 곡선을 가진다.Melt curve analysis can be used to fractionate desired products from non-specific products such as primer dimers. Primer dimers are melted at low temperatures in a wide area; It is quite different from the steep melting curve of certain PCR amplification products. Highly heterogeneous products generated through many processes in low temperature annealing have low and broad melting curves compared to those of pure PCR products.

실시예 15Example 15

536 β-글로빈 단편은 실시예 7에서 기술된 것에 따라, 1:30,000 희석된 SYBR^TMGreen I으로 증폭을 하는데, 단 조건을 변화시킨다. 반응 A(도 40)에서, 주형을 첨가하지 않고, 반응은 94℃에서 0초, 60℃에서 0초, 72℃에서 10초간 30회를 하여 작은 비-특이적인 증폭 생성물을 만든다. 반응 B에서는 낮은 엄격성(94℃에서 0초, 50℃에서 0초, 72℃에서 10초)에서 정제된 주형 10⁶시작 복사체를 증폭시키면 겔 전기영동에서 넓은 범위의 증폭 생성물이 나타나고, 넓은 온도 범위에서 용융된다. 반응 C에서, 정제된 주형 10⁶시작 복사체를 94℃에서 0초, 60℃에서 0초, 72℃에서 10초간을 30회 반복 실시하면, 한 개의 옅은 밴드가 나타나고, 급한 전이에서 용융된다. 온도 전이율은 초당 0.2℃이다. λ파아지 DNA(M)을 HindIII 처리한 것을 표식으로 이용한다.The 536 β-globin fragments are amplified with SYBR ^™ Green I diluted 1: 30,000, as described in Example 7, with varying conditions. In Reaction A (FIG. 40), without adding a template, the reaction was performed 30 times for 0 seconds at 94 ° C., 0 seconds at 60 ° C., and 10 seconds at 72 ° C. to produce a small non-specific amplification product. In reaction B, amplification of the purified template 10 ⁶ starting copy at low stringency (0 sec at 94 ° C., 0 sec at 50 ° C., 10 sec at 72 ° C.) results in a wide range of amplification products in gel electrophoresis and a wide temperature. Melt in the range. In Reaction C, when the purified template 10 ⁶ starting copy was repeated 30 times for 0 seconds at 94 ° C, 0 seconds at 60 ° C, and 10 seconds at 72 ° C, one light band appeared and melted in a rapid transition. The temperature transfer rate is 0.2 ° C. per second. HindIII treatment of lambda phage DNA (M) is used as a marker.

도 40에서는 용융 곡선이 어떻게 PCR 반응의 특이성을 정확하게 반영하는지를 나타낸다. 가파른, 높은 온도의 용융 곡선 C는 겔에서 한 개 밴드에 상응한다. 낮은 온도의 넓은 용융 곡선 A는 주형 기준이 없는 분석시에 나오는 것으로 프라이머 이량체만을 나타낸다. C에서 생성물의 과증폭으로 인하여 용융 곡선 B에 중간에 포함되나, 특정 생성물에서는 분명하게 구별할 수 잇는 것이다.40 shows how the melting curve accurately reflects the specificity of the PCR reaction. The steep, high temperature melting curve C corresponds to one band in the gel. The wide melting curve A at low temperature results in an assay without template criteria and only shows primer dimers. Due to the overamplification of the product in C, it is included in the melting curve B in the middle, but is clearly distinguishable in certain products.

도 37에서 볼 수 있는 용융 곡선은 온도(T)에 대한 형광(F)을 유도하여 정량화한 것이다. 이와 같은 유도는 -dF/dT vs T로 나타낼 수 있고 이는 용융 곡선을 용융 피크로 변환할 수 있다.The melting curve shown in FIG. 37 is quantified by inducing fluorescence (F) against temperature (T). This derivation can be expressed as -dF / dT vs T, which can translate the melting curve into a melting peak.

실시예 16Example 16

실시예 14의 정제된 헤파타이티스 B와 β-글로빈 유전자 단편을 개별적으로 용융시키고, 초당 0.2℃로 온도전이를 시키고 다른 조건은 실시예 14의 것(도 41)과 동일하다. 용융 곡선(상단)으로부터 Tm을 다소 객관적으로 결정은 용융 피크(아래)로부터 읽을 수 있다. 용융 피크아래 면적은 곡선 아래 면적을 적분하여 정량할 수 있다. -dF/dT vs T 플롯으로부터 우선 기저 형광을 얻을 수 있고 이는 곡선 아래 면적에 따라 기저치 크기가 변화된다는 것을 알 수 있다. 그 다음 평균, 표준편차, 피크의 높이 등을 적용 변수로 하여 가우스 함수의 비-선형 최소 자승 회귀분석으로 피크를 적용시킬 수 있다. 피크 면적으로 각 가우스 아래 면적을 얻는다. 모든 계산은 LabView 프로그램 환경(National Instruments, Austin, TX)을 이용하여 실행한다. 도 41에서는 용융 곡선을 용융 피크로 변환시키는 예를 나타낸 것이다. 이들 계산을 위한 코드는 별첨 A에 나타내었다.The purified hepatitis B and β-globin gene fragments of Example 14 were melted separately, temperature transitioned to 0.2 ° C. per second, and other conditions were the same as those of Example 14 (FIG. 41). A somewhat objective determination of Tm from the melting curve (top) can be read from the melting peak (bottom). The area under the melting peak can be quantified by integrating the area under the curve. From the -dF / dT vs T plot, the baseline fluorescence can be obtained first, which shows that the baseline magnitude changes with the area under the curve. The peaks can then be applied by non-linear least-squares regression analysis of the Gaussian function using the mean, standard deviation, and height of the peak as application variables. The area under each gauss is obtained with the peak area. All calculations are performed using the LabView program environment (National Instruments, Austin, TX). 41 shows an example of converting a melting curve to a melting peak. The codes for these calculations are shown in Appendix A.

프라이머 이량체와 다른 반응물로부터 특정 생성물을 구별하는 능력으로 시작 복제수가 적은 정량방법에서 이중 쇄 특이적인 DNA 염료 이용이 개선되었다. 상대적으로 많은 시작 주형 복사물의 수는 에티디움 브롬화물을 이용하면 정량화할 수 있다(Higuchi & Watson, supra). 그러나, 시작 복사물의 수가 적을 경우에, 프라이머 이량체와 다른 증폭 생성물의 배경 증폭이 특이적인 증폭 시그날을 간섭한다. 본 발명의 비-특이적인 인공생성물로부터 특정 생성물을 구별하는 능력을 이용하여, 이중 쇄-특이적인 DNA 염료를 이용하면 시작 복사체의 수가 적은 것도 정량화할 수 있다. 이는 이들 염료를 이용하는 것이 간단하기 때문에 장점이 된다. 임의 증폭에서 이중 쇄-특이적인 DNA 염료를 이용할 수 있는데, 전통적인 형광 라벨된 올리고뉴클레오티드가 필요하지 않게 된다. 이중 쇄 특이적인 DNA 염료를 이용하면 매우 적은 복사체 수를 정량화하는데 매우 우수한 증폭 특이성을 요구하는데, 이는 본 발명에 의해 제공되는 것과 같이, 비-특이적인 증으로부터 원하는 생성물을 구별한다는 것을 말한다.The ability to distinguish specific products from primer dimers and other reactants improved the use of double chain specific DNA dyes in quantitative methods with low starting replication. The relatively large number of starting template copies can be quantified using ethidium bromide (Higuchi & Watson, supra). However, when the number of starting copies is small, background amplification of primer dimers and other amplification products interferes with specific amplification signals. Using the ability to distinguish particular products from non-specific artificial products of the invention, the use of double chain-specific DNA dyes can also quantify the small number of starting copies. This is an advantage because it is simple to use these dyes. Double chain-specific DNA dyes can be used in any amplification, eliminating the need for traditional fluorescently labeled oligonucleotides. The use of double chain specific DNA dyes requires very good amplification specificity to quantify very low copy numbers, which means that it distinguishes the desired product from non-specific symptoms, as provided by the present invention.

실시예 17Example 17

생성물의 순도를 결정하는 본 발명의 방법을 이용하여 이중 쇄 특이적인 DNA 염료의 형광을 변환과정당 1회 모니터하는 것을 근거로 하는 PCR 정량화를 개선시킨다. 일련의 반응을 위한 생성물의 폴리메라제 연장을 정제된 β-글로빈 주형의 초기 농도를 다양하게 한 후에(도 42a), 각 반복과정에서 1회 형광을 얻는다. 실시예 7에서 설명한 것과 같이 β-글로빈 주형 및 증폭 조건을 제공한다. 배경 형광 이상으로 로그-선형 증가는 시작 주형 농도에 따라 반복 변환 과정 회수에서 시작된다. 반응당 10⁶내지 10²복사체 범위의 5개 반응의 플롯은 약 4개 과정으로 분리된다. 반응당 평균 10²복사체를 가지는 시료에서는 반응 효과가 감소되었고, 시작 복사체의 수가 100개 이하인 반응은 이용할 수 없는 형광 프로파일을 제공한다. 10개와 1(평균) 복사체를 포함하는 반응의 형광 프로파일은 역순서로 발생하고, 음성 기준은 약 30회 후에 증폭을 나타낸다. 이는 프라이머 이량체의 증폭 및 이중 쇄 특이적인 DNA 특이적인 염료의 일회 cycle-by-cycle 형광 모니터에 의해 원하는 생성물로부터 다른 비-특이적인 증폭 생성물을 구별할 수 없기 때문이다.The method of the present invention to determine the purity of the product is used to improve PCR quantification based on monitoring the fluorescence of the double chain specific DNA dye once per conversion. After extending the polymerase extension of the product for a series of reactions to vary the initial concentration of the purified β-globin template (FIG. 42A), one fluorescence is obtained in each iteration. Β-globin template and amplification conditions are provided as described in Example 7. The log-linear increase above background fluorescence begins at the number of iterative conversion processes depending on the starting template concentration. Plots of five reactions ranging from 10 ⁶ to 10 ² copies per reaction are separated in about four steps. In samples with an average of 10 ² copies per reaction, the effect of the reaction was reduced, and reactions with 100 or fewer starting copies provided no fluorescence profile. The fluorescence profile of the reaction involving 10 and 1 (average) copies occurred in reverse order and the negative reference shows amplification after about 30 times. This is because the amplification of the primer dimer and the single cycle-by-cycle fluorescence monitor of the double chain specific DNA specific dyes cannot distinguish other non-specific amplification products from the desired products.

각 시료에 대해 용융 피크를 얻고(도 42 b), 이는 전기영동 결과와 연관이 있다는 것을 알았다(도 42c). 0개 및 1개 평균 시작 주형 복사체를 포함하는 반응은 예상되는 536bp 위치에 구별할 수 있는 전기영동 밴드를 만들지 못하였다. 10개와 100개 시작 주형 복사체를 가지는 반응은 약한 전기영동 밴드를 나타낸다. 이는 용융 피크 분석과 잘 일치하고, 0개 복사체와 1개 시작 복사체를 포함하는 반응의 원하는 생성물의 범위(90-92℃)에서는 DNA 용융이 없고, 이 온도에서의 작은 피크는 10개와 100개 복사체 범위가 된다. 10³-10⁶시작 복사체를 포함하는 반응의 강한 전기영동 밴드는 예측되는 90-92℃ 범위에서 큰 용융 피크와 연관이 있다.A melting peak was obtained for each sample (FIG. 42 b), which was found to correlate with the electrophoresis results (FIG. 42 c). Reactions involving zero and one average starting template copy did not produce distinguishable electrophoretic bands at the expected 536 bp position. Reactions with 10 and 100 starting template copies exhibit weak electrophoretic bands. This is in good agreement with the melt peak analysis and there is no DNA melting in the range of the desired product (90-92 ° C.) of the reaction involving 0 copies and 1 starting copy, with small peaks at this temperature being 10 and 100 copies. Range. Strong electrophoretic bands of reactions involving 10 ³ -10 ⁶ starting radiators are associated with large melting peaks in the expected 90-92 ° C. range.

용융 피크 적분을 통하여, 전체 생성물에 대한 원하는 생성물의 비율은 10⁵복사체의 경우 0.28에서 시작 복사체의 수가 0인 경우 0.0002까지 이다. 도 41a에서 각 형광 값에 적절한 비율을 곱하면 정확한 플롯을 얻을 수 있다(도 42d에서 "보정된 형광"이라고 명함). 이 과정은 정량화의 효과적인 범위를 시작 주형 복사체의 수가 10개 내지 1개로 연장시켰다.Through the melt peak integration, the ratio of the desired product to the total product is from 0.28 for 10 ⁵ copies to 0.0002 when the number of starting copies is zero. The correct plot can be obtained by multiplying each fluorescence value in an appropriate ratio in FIG. 41A (named "corrected fluorescence" in FIG. 42D). This process extended the effective range of quantification from 10 to 1 starting template copy.

용융 피크로 비-특이적인 생성물(도 40)으로부터 특정 생성물을 구별할 수 있고, 두 개의 정제된 PCR 생성물을 함께 혼합한 것도 구별할 수 있어(도 41), 한 개의 반응 튜브에서 함께 증폭된 두 개의 특이적인 생성물을 구별하는데 유용하다. 본 발명에 따른 PCR 반응을 지속적으로 모니터함으로써 얻은 용융 곡선은 다중 PCR에 유용하다.Melt peaks can distinguish specific products from non-specific products (FIG. 40), and also mix two purified PCR products together (FIG. 41), so that two amplified together in one reaction tube Useful for distinguishing dog specific products. Melt curves obtained by continuously monitoring the PCR reaction according to the present invention are useful for multiplex PCR.

실시예 18Example 18

실시예에서, 게놈 DNA로부터 두 개의 유전자 단편을 동시에 증폭시켜, SYBR^TMGreen I 형광으로 모니터하였다. 각 증폭 과정동안에 상이한 증폭 생성물이 용융 온도에서 변성되는데, 생성물의 길이, GC 비율 및 당분야에 공지된 다른 인자들에따라 달라진다. 각 생성물이 용융되는 온도는 이중 쇄-특이적인 염료, SYBR^TMGreen I으로 모니터한다. 포낭성 섬유증 유전자로부터 81개 염기쌍 단편은 서열 14와 서열 15의 프라이머를 이용하여 증폭하고, 서열 16과 서열 17에서 설명한 프라이머를 이용하여 c-erB-2(HER2/neu) 온코진의 98개 염기쌍을 함께 증폭시켰다.In the examples, two gene fragments were simultaneously amplified from genomic DNA and monitored by SYBR ^™ Green I fluorescence. During each amplification process different amplification products denature at the melting temperature, depending on the length of the product, the GC ratio and other factors known in the art. The temperature at which each product melts is monitored by a double chain-specific dye, SYBR ^™ Green I. 81 base-pair fragments from the cystic fibrosis gene were amplified using the primers of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, and 98 base pairs of c-erB-2 (HER2 / neu) oncozin using the primers described in SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17. Amplified together.

증폭 반응은 다음과 같이 실행한다; 총 10㎕에서 50mM Tris-HCl, pH 8.3, 3mM MgCl₂, 500㎍/㎖ 소 혈청 알부민, 200μM 각 dNTP, 0.5μM 담낭성 섬유증 프라이머, 0.3μM HER2/neu 프라이머, 1:30,000 희석된 SYBR^TMGreen I, 1U AmpliTaq Gold DNA 폴리메라제(Perkin Elmer, Foster City, CA), 50ng 사람 게놈 DNA을 포함한다.The amplification reaction is carried out as follows; 50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 3 mM MgCl ₂ , 500 µg / ml bovine serum albumin, 200 µM each dNTP, 0.5 µM gallbladder fibrosis primer, 0.3 µM HER2 / neu primer, 1: 30,000 diluted SYBR ^TM Green I, 1U AmpliTaq Gold DNA polymerase (Perkin Elmer, Foster City, Calif.), 50 ng human genomic DNA.

95℃에서 30분간 폴리메라제를 활성화시킨 후에, 시료는 94℃에서 0초(기울기는 20), 55℃에서 0초(기울기는 20), 70℃에서 10초(기울기는 20)를 35회 반복한다. 시료는 70℃로 냉각시키고, 형광은 0.2℃/sec로 94℃까지 지속적으로 얻는다. 용융 곡선(도 43)에서는 78℃(CFTR)와 88℃(neu)에서 두 개의 뚜렷한 생성물이 나타난다는 것을 나타낸다. 두 개의 생성물은 Tm이 약 10℃ 정도 차이가 있고 이는 쉽게 구별을 할 수 있다.After activating the polymerase at 95 ° C. for 30 minutes, the sample was subjected to 35 cycles of 0 seconds at 94 ° C. (20 tilts), 0 seconds at 55 ° C. (20 tilts) and 10 seconds at 70 ° C. (20 tilts). Repeat. Samples are cooled to 70 ° C. and fluorescence is continuously obtained to 94 ° C. at 0.2 ° C./sec. The melting curve (FIG. 43) shows that two distinct products appear at 78 ° C. (CFTR) and 88 ° C. (neu). The two products differ in Tm by about 10 ° C. and can be easily distinguished.

증폭하는 동안에 내부 제어가 필요한 경우에는 다중 증폭이 유용하다. 예를 들면, 구분점의 양단에 프라이머를 위치시켜 PCR에 의해 많은 전치를 감지할 수 있다. 증폭이 일어나지 않는다면, DNA가 고유의 것이고 방해물질이 없는 한 전치가 없다는 것을 나타낸다. 동일한 반응 혼합물에 있는 양성 조절 위치를 증폭함으로써 이와 같은 가능성을 배제할 수 있다. 증폭과 감지를 동시에 내부 조절을 하여 증폭을 최상으로 조절할 수 있다.Multiple amplification is useful when internal control is required during amplification. For example, many translocations can be detected by PCR by placing primers across the breakpoint. If no amplification occurs, it indicates that the DNA is inherent and there is no transposition unless there is an interference. This possibility can be ruled out by amplifying the positive regulatory sites in the same reaction mixture. Amplification can be optimally controlled by internal control of both amplification and detection.

실시예 19Example 19

본 실시예에서는 실시예 18의 과정을 따르는데 단 30분간 95℃에서 폴리메라제를 활성화시킨 후에, 시료는 94℃에서 0초(기울기는 20), 55℃에서 0초(기울기는 20), 70℃에서 10초(기울기는 20)를 20회 반복한 후에, 94℃에서 0초(기울기는 1), 55℃에서 0초(기울기는 20), 70℃에서 20초(기울기는 20)를 15회 반복한다. 26-31회 과정동안에 70℃에서 94℃로 초당 1℃씩 변환하는 동안에 지속적으로 형광을 얻는다. 용융 곡선은 용융 피크로 전환하고, 이를 나타낸다(도 44). CFTR 단편의 증폭 효과는 neu 단편의 증폭보다는 큰 것으로 보인다. 증폭 효과는 실시예 16에서와 같은 용융 피크 데이터를 적분하여 결정한다.In this example, following the procedure of Example 18, after activating the polymerase at 95 ° C. for only 30 minutes, the sample is 0 seconds at 94 ° C. (20 tilt), 0 seconds at 55 ° C. (20 tilt), After 20 repetitions of 10 seconds at 70 ° C. (20 tilt), 0 seconds at 94 ° C. (1 tilt), 0 seconds at 55 ° C. (20 tilt) and 20 seconds at 70 ° C. (20 tilt) Repeat 15 times. Fluorescence is continuously obtained during the conversion from 70 ° C to 94 ° C in 1 ° C per second for 26-31 cycles. Melting curves convert to melting peaks and show this (FIG. 44). The amplification effect of the CFTR fragment appears to be greater than that of the neu fragment. The amplification effect is determined by integrating the melt peak data as in Example 16.

기준을 참고로 하는 이와 같은 종류의 정량적인 데이터는 많이 응용을 할 수 있다. 예를 들면, HER2/neu와 같은 특정 온코진을 많은 종양에서 in vivo로 증폭할 수 있다. 즉, 게놈 DNA에 유전자가 복제되는데 어떤 경우에는 여러층으로 복제된다. 온코진과 기준 주형의 증폭으로 관련 복사체의 수를 정량적으로 측정할 수 있다. 추가 실시예에서, HIV 또는 헤파타이티스 C에 감염된 환자에 있는 바이러스의 양은 예후 및 치료에 중요하다. 기준 주형을 이용하고, 증폭하는 동안에 기준과 천연 주형 모두의 증폭 효과를 모니터하여, 시작 주형 복사체 수를 정확하게 정량화할 수 있다.This kind of quantitative data, referenced to standards, can have many applications. For example, certain oncogenes such as HER2 / neu can be amplified in vivo in many tumors. That is, genes are replicated in genomic DNA, and in some cases, in multiple layers. Oncogene and amplification of the reference template can quantitatively determine the number of copies involved. In further embodiments, the amount of virus in a patient infected with HIV or hepatitis C is important for prognosis and treatment. By using the reference template and monitoring the amplification effects of both the reference and the natural template during amplification, the starting template copy number can be accurately quantified.

상대적인 정량화를 위한 용융 곡선을 이용하는 본 발명의 특징을 설명할 것이다. 본 발명에 따르면, 용융 곡선의 추가 용도는 PCR을 정량화하는 것이다. 도 42에서는 용융 피크의 아래 면적과 특이적인 생성물간의 상관관계를 나타낸다. 구 가지 생성물이 유사한 효과를 가지고 증폭된다면(또는 상이한 효과를 알고, 이를 보상할 수 있다면), 두 가지 PCR 생성물의 상대적인 정량화가 가능하다. 용융 피크 면적을 적분하여(실시예 16을 참고) 두 가지 생성물의 상대적인 양을 정량하는 것이 본 발명의 한 특징이다.Features of the invention using the melting curve for relative quantification will be described. According to the invention, a further use of the melting curve is to quantify PCR. 42 shows the correlation between the area under the melting peak and the specific product. If nine products are amplified with similar effects (or know different effects and can compensate), relative quantification of the two PCR products is possible. It is a feature of the present invention to quantify the relative amounts of the two products by integrating the melt peak area (see Example 16).

실시예 20Example 20

실시예 18의 담낭성 섬유증과 HER-2-neu 유전자 단편을 증폭하고, 실시예 2에서와 같이 정제하고 이를 175㎍/㎖로 적정하였다. 시료는 다양한 비율(총 8㎕)로 혼합하고, 완충액(1㎕)과 SYBR^TMGreen I(1㎕)에 혼합한다. 최종 농도는 50mM Tris, pH 8.3, 3mM MgCl₂, 250㎍/㎖ 소 혈청 알부민, 1:30,000 희석된 SYBR^TMGreen I이 된다. 초당 0.2℃에서 용융 곡선을 얻고, 배경 형광를 제거하고, 실시예 16에서 상술한 것과 같이 피크를 적분하였다. 그 결과는 도 45에 나타내었다. 두 가지 생성물의 용융 피크 아래 상대적인 면적과 상대적인 양간에는 뛰어난 상관관계가 있다.The gallbladder fibrosis and HER-2-neu gene fragment of Example 18 were amplified, purified as in Example 2, and titrated to 175 μg / ml. Samples are mixed at various ratios (8 μl total) and mixed in buffer (1 μl) and SYBR ^™ Green I (1 μl). The final concentration is 50 mM Tris, pH 8.3, 3 mM MgCl ₂ , 250 μg / ml bovine serum albumin, 1: 30,000 diluted SYBR ^™ Green I. Melt curves were obtained at 0.2 ° C. per second, background fluorescence was removed, and the peaks were integrated as described in Example 16. The result is shown in FIG. There is a good correlation between the relative area under the melting peaks of the two products and the relative amounts.

많은 정량적인 PCR 응용에서 두 가지 PCR 생성물의 상대적인 정량은 상당히 중요하다. 두 개 이상의 생성물의 다중 증폭 및 용융 피크아래 면적을 적분하는 것은 이 분야에 매우 유용하다. 가정 유전자의 mRNA의 양에 대해 mRNA를 정량화한다.In many quantitative PCR applications the relative quantification of the two PCR products is of considerable importance. Integrating the area under multiple amplification and melting peaks of two or more products is very useful in this field. MRNA is quantified for the amount of mRNA of the home gene.

상대적인 정량화의 또 다른 중요한 용도는 경쟁적인 PCR 정량화에 있다. 일반적으로 동일한 프라임 부위를 가지나 원래 표적이 되는 서열의 길이와는 다른 경쟁물질을 합성한다. 양을 알고 있는 경쟁물질을 양을 모르는 시료에 타고, 상대적인 정량화를 실행한다. 길이보다는 Tm이 표적 서열과는 다른 경쟁물질을 만든다. 이들의 용융 피크아래 면적을 비교함으로써 생성물의 상대적인 양을 정량화한다. 생성물중 한 가지의 양을 알고 있기 때문에, 원래 표적이 되는 물질의 양을 얻을 수 있다. 용융 피크 방법을 이용하면, 현재 각각의 양을 모르는 시료에 대해 다수의 튜브를 사용하고, 반응 동안에 다양한 반복 과정에서 튜브를 당겨 반응의 로그-선형 부분을 찾는 등의 현재 이용하는 방법보다 휠씬 쉽게 할 수 있다. 두 가지 생성물의 상대적인 양을 결정해야한다. 통상 이는 방사능동위원소로 dNTPs중 하나에 라벨링하여 아가로즈 겔 전기영동후에 각 밴드에 결합된 라벨의 양을 파악하여 이루어진다. 비교를 위해, 본 발명은 반응을 지속적으로 모니터 하여, 증폭의 로그-선형 부분을 쉽게 확인할 수 있게 한다. 용융 피크를 적분하여 상대적인 정량화를 신속하게 할 수 있다. 하루 종일 걸리는 공정을 한 시간으로 줄일 수 있다.Another important use of relative quantification is in competitive PCR quantification. Generally, a competitor is synthesized that has the same prime site but differs in length from the sequence originally targeted. Relative quantification is carried out on a non-quantitative sample of a known competitor. Tm rather than length makes the competitor different from the target sequence. The relative amounts of the products are quantified by comparing the areas under their melting peaks. Since the quantity of one of the products is known, the quantity of the substance originally targeted can be obtained. The melt peak method makes it much easier than current methods, such as using multiple tubes for each current unknown sample and pulling the tubes through various iterations during the reaction to find the log-linear portion of the reaction. have. The relative amounts of the two products must be determined. Typically this is done by labeling one of the dNTPs with radioisotopes to determine the amount of label bound to each band after agarose gel electrophoresis. For comparison, the present invention continuously monitors the reaction, making it easy to identify the log-linear portion of the amplification. The melt peaks can be integrated to speed up relative quantification. The whole day can be reduced to one hour.

전술한 내용으로부터, DNA 증폭하는 동안에 형광을 모니터하는 것은 상당히 분석학적으로 뛰어난 기술이라는 것을 알 수 있을 것이다. 서열-특이적인 감지와 정량화를 원하는 경우에는, 이중 쇄 특이적인 DNA 염료를 이용하는 대신에 공명 에너지 전달 프로브를 이용한다. 한 개의 염기가 잘못 짝을 이룬 경우(mismatch가 있을 때), 하이브리드 프로브의 Tm은 4-8℃ 이동된다. 하이브리드 프로브가 돌연변이 부위에 있는 경우에 프로브 용융 온도의 변이로써 한 개의 염기 돌연변이를 감지할 수 있다.From the foregoing, it will be appreciated that monitoring fluorescence during DNA amplification is a highly analytically superior technique. If sequence-specific detection and quantification is desired, resonance energy transfer probes are used instead of double chain specific DNA dyes. If one base is mismatched (when there is a mismatch), the Tm of the hybrid probe is shifted 4-8 ° C. One base mutation can be detected by variation in probe melting temperature when the hybrid probe is at the mutation site.

실시예 21Example 21

인자 V Leiden 돌연변이는 아미노산 잔기 506(R506Q)에서 아르기닌 잔기가 글루타민 잔기로 치환된(G →A) 한 개의 염기가 변화된 돌연변이다(R.M. Bertina et al., Mutation in Blood Coagulation Factor V Associated with Resistance to Activated Protein C, 369 Nature 64-67 (1994) and J. Voorberg et al., Association of Idiopathic Venous Thromboembolism with a Single Point-Mutaion at Arg⁵⁰⁶of Factor V, 343 Lancet 1535-36(1994)). 여기에서 사용된 바와 같이, "인자 V Leiden 돌연변이"란 야생형의 구아닌 염기가 인자 V Leiden 돌연변이에서는 아데닌 염기로 치환된 인자 V 유전자에 뉴클레오티드 위치를 말한다. 서열 9에서는 야생형 인자 V Leiden 유전자를 나타내고, 서열 10에서는 각 경우에서 31위치에 관련 뉴클레오티드를 가진 인자 V Leiden 유전자의 상응하는 위치를 나타낸다. 인자 V 유전자의 완전한 뉴클레오티드 서열은 R.J. Jenny et al., Complete cDNA and Derived Amino Acid Sequence of Human Factor V, 84 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 4846-50 (1987)에 설명을 하고 있고, 서열은 Genbank locus HUMF10에서 구할 수 있다. 돌연변이 인자 V 단백질에서 아미노산 변화는 이와 같은 응혈 인자가 분해에 저항성을 가지도록 하여 응혈 및 혈전증이 증가되는 경향을 가진다. 유전적인 혈전기우병(전우병)의 가장 흔한 원인이기 때문에, 이와 같은 돌연변이는 임상 분자유전학 실험실에서 실행되는 통상적인 실험실 테스트의 표적이 된다.The factor V Leiden mutation is a mutation in which one base is changed from amino acid residue 506 (R506Q) to an arginine residue substituted with a glutamine residue (G → A) (RM Bertina et al., Mutation in Blood Coagulation Factor V Associated with Resistance to Activated Protein C, 369 Nature 64-67 (1994) and J. Voorberg et al., Association of Idiopathic Venous Thromboembolism with a Single Point-Mutaion at Arg ⁵⁰⁶ of Factor V, 343 Lancet 1535-36 (1994). As used herein, “factor V Leiden mutation” refers to the nucleotide position in the factor V gene where the wild type guanine base is substituted with the adenine base in the factor V Leiden mutation. SEQ ID NO: 9 shows the wild type Factor V Leiden gene, and SEQ ID NO: 10 shows the corresponding position of the Factor V Leiden gene with the relevant nucleotide at position 31 in each case. The complete nucleotide sequence of the Factor V gene is described in RJ Jenny et al., Complete cDNA and Derived Amino Acid Sequence of Human Factor V, 84 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 4846-50 (1987), and the sequence is available from Genbank locus HUMF10. Amino acid changes in the mutant factor V protein tend to increase coagulation and thrombosis by making these coagulation factors resistant to degradation. As the most common cause of hereditary thrombosis, such mutations are the target of routine laboratory tests conducted in clinical molecular genetics laboratories.

인자 V Leiden 돌연변이용 분석을 위한 표준 방법은 PCR에 의해 유전자 다편을 증폭시키고, 증폭된 생성물을 야생형 서열은 절단하지만 돌연변이 서열은 절단하지 않는 엔도뉴클레아제로 처리하고, 겔 전기영동에 의해 절단된 야생형과 절단안된 돌연변이 생성물을 분리한다(R.M. Bertina et al., supra.). 이는 한정된 돌연변이를 분석하는데 당분야에 공지의 방법이다. 이와 같은 테스트는 통상적으로 약 4시간이 소요되는데, 구체적으로는 PCR 증폭(2시간), 효소 절단(1시간) 및 전기영동(1시간)으로 이루어진다. 증폭후의 단계는 시료 튜브를 개방하고, 효소를 첨가하고, 절단된 시료를 전기영동 장치로 옮기는 것으로 구성된다. 증폭 후 처리 과정은 최종 생성물의 오염 위험을 증가시키고, 시료에 잘못 라벨링을 하는 등의 수작업에 상당한 주의를 요한다. 점 돌연변이를 증폭시키고 동시에 분석하는 방법에서는 이와 같은 문제점을 배제한다.Standard methods for assays for factor V Leiden mutations amplify gene fragments by PCR and the amplified product is treated with an endonuclease that cleaves the wild-type sequence but does not cleave the mutant sequence, and is cleaved by gel electrophoresis. And uncleaved mutant products are isolated (RM Bertina et al., Supra.). This is a method known in the art for analyzing defined mutations. Such testing typically takes about 4 hours, specifically PCR amplification (2 hours), enzyme digestion (1 hour) and electrophoresis (1 hour). The step after amplification consists of opening the sample tube, adding enzyme and transferring the cut sample to an electrophoresis device. Post-amplification processing increases the risk of contamination of the final product and requires considerable attention, including manual labeling of the sample. The method of amplifying and simultaneously analyzing point mutations eliminates this problem.

동일한 기구에서 30분 이내에 인자 V Leiden 돌연변이를 완전하게 증폭시키고 분석하는 방법은 돌연변이 위치를 포함하는 사람 게놈 DNA의 일부분을 비대칭적으로 증폭시키고, 증폭된 DNA의 용융 곡선을 얻고 이를 분석하는 것으로 구성된다. 공지의 방법에 따라 가령, J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed., 1989)에 따라 게놈 DNA를 준비한다. 적절하게는 상기 설명한 것과 같이 형광 하이브리드 프로브를 이용하는 공명 에너지 전달 방법에 의해 용융 곡선을 얻는다. 이와 같은 검사는 상동접합성 야생형, 상동접합성 돌연변이 및 이형접합성 유전자형간에 쉽게 구별할 수 있도록 한다. 적절한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 플로레신으로 3'에 라벨을 하고, 공명 에너지 전달을 위해 Cy5-라벨된 프라이머의 부근에 증폭된 DNA에 하이브리드하도록 만든다. 이 방법은 임의 다른 정의된 돌연변이에 적용시킬 수 있다.Completely amplifying and analyzing Factor V Leiden mutations within 30 minutes in the same instrument consists of asymmetrically amplifying a portion of human genomic DNA comprising the mutation site, obtaining a melting curve of the amplified DNA, and analyzing it . Genomic DNA is prepared according to known methods, for example according to J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., 1989). Suitably, the melting curve is obtained by a resonance energy transfer method using a fluorescent hybrid probe as described above. Such testing makes it easy to distinguish between homozygous wild type, homozygous mutations and heterozygous genotypes. In a suitable embodiment, the oligonucleotide is labeled 3 'with floresin and allowed to hybridize to DNA amplified in the vicinity of the Cy5-labeled primer for resonance energy transfer. This method can be applied to any other defined mutation.

프로브 올리고뉴클레오티드는 그 길이가 약 15-40 뉴클레오티드 잔기가 적절하다. 프로브는 약 10개 뉴클레오티드 잔기는 최소한 포함해야 한다. 그러나, 이와 같은 짧은 뉴클레오티드는 특이성이 낮고, 용융 온도가 낮고, 배경이 증가한다는 단점을 가진다. 40개 잔기이상의 올리고뉴클레오티드를 이용할 수도 있지만, 이는 필요이상으로 가격이 비싸다. 따라서, 프로브 올리고뉴클레오티드의 크기에 제한을 두는 것은 기능성에 중점을 둔 것이기 때문이다. 프로브 올리고뉴클레오티드는 돌연변이를 잴 수는 있지만, 돌연변이는 프로브의 5' 또는 3' 말단 뉴클레오티드 잔기에 상응하지 않는 것이 바람직하다. 본 발명은 용융 곡선에 근거를 두기 때문에, 말단에 염기쌍의 부족이 내부 위치에 부족한 것보다는 용융 곡선에 영향이 적다는 것을 알고 있어, 돌연변이이 내부 위치에 발생하도록 프로브를 고안한다.Probe oligonucleotides are preferably about 15-40 nucleotide residues in length. The probe should contain at least about 10 nucleotide residues. However, such short nucleotides have the disadvantage of low specificity, low melting temperature and increased background. More than 40 residues of oligonucleotides may be used, but this is more expensive than necessary. Therefore, the limitation on the size of the probe oligonucleotide is because the emphasis is on functionality. While probe oligonucleotides may be mutated, it is preferred that the mutations do not correspond to the 5 'or 3' terminal nucleotide residues of the probe. Since the present invention is based on the melting curve, it is known that the lack of base pairs at the ends affects the melting curve less than the lack of internal positions, and the probe is designed to cause mutations to occur at the internal positions.

선택된 돌연변이 위치를 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 길이는 적절하게는 약 15 내지 30개 잔기가 된다. 적절한 범위보다 짧은 프라이머를 이용할 수는 있지만, 원하는 정도의 특이성을 가지지는 못한다. 유사하게, 적절한 범위를 넘는 프라이머도 이용할 수는 있지만, 필요이상으로 가격이 비싸다. 따라서, PCR 프라이머의 크기에 제한을 두는 것은 기능성에 중점을 두었기 때문이다.Oligonucleotide primers for amplifying selected mutation sites are suitably about 15 to 30 residues in length. Primers shorter than the appropriate range can be used but do not have the desired degree of specificity. Similarly, primers beyond the appropriate range can be used, but are more expensive than necessary. Therefore, limiting the size of the PCR primer is because the emphasis on functionality.

공명 에너지 전달 쌍간에 거리는 본 발명의 적절한 기능을 위해 중요하다. 공명 에너지 전달 쌍간에 최적의 거리는 약 5개 뉴클레오티드 정도가 된다. 거리는 약 10-15개 뉴클레오티드 까지 기능을 할 수는 있지만, 약 2 내지 8개 뉴클레오티드 정도의 거리가 바람직하다. 인접 뉴클레오티드에 공명 에너지 전달 쌍을 가지는 것이 반드시 유익한 것은 아닌데, 그 이유는 DNA 이중 나선에서의 위치가 공명 에너지 전달 쌍간의 거리에 영향을 주기 때문이다.The distance between the resonance energy transfer pairs is important for the proper functioning of the present invention. The optimal distance between the resonance energy transfer pairs is about 5 nucleotides. The distance may function up to about 10-15 nucleotides, but a distance of about 2 to 8 nucleotides is preferred. Having resonance energy transfer pairs in adjacent nucleotides is not necessarily beneficial because the position in the DNA double helix affects the distance between the resonance energy transfer pairs.

본 실시예에서, PCR 증폭은 다음과 같은 구성으로 된 10㎕ 반응 혼합물에서 실시한다; 50mM Tris, pH 8.3, 3mM MgCl₂, 500㎍/㎖ 소 혈청 알부민, 200μM 각 dNTP, 0.5μM Cy5-라벨된 프라이머(서열 11), 0.2μM 라벨안된 반대 프라이머(서열 12), 0.1μM 플로레신-라벨된 프로브(서열 13), 0.4 U Taq 폴리메라제, 50ng 사람 게놈 DNA. 네 가지 다른 DNA 시료를 테스트 하였다; 인자 V Leiden 돌연변이에 상동접합자인 개체의 사람 게놈 DNA; 이형접합자인 개체의 사람 게놈 DNA; 야생형 인자 V 대립유전자에 상동접합자인 개체의 사람 게놈 DNA; DNA가 없는 음성 기준. Cy5-라벨된 프라이머, 플로레신-라벨된 프로브, 돌연변이 위치(*로 표시)위 방향은 다음과 같다;In this example, PCR amplification is carried out in a 10 μl reaction mixture with the following configuration; 50 mM Tris, pH 8.3, 3 mM MgCl ₂ , 500 μg / ml bovine serum albumin, 200 μM each dNTP, 0.5 μM Cy5-labeled primer (SEQ ID NO: 11), 0.2 μM unlabeled counter primer (SEQ ID NO: 12), 0.1 μM Floresin- Labeled probe (SEQ ID NO: 13), 0.4 U Taq polymerase, 50 ng human genomic DNA. Four different DNA samples were tested; Human genomic DNA of an individual homologous to the factor V Leiden mutation; Human genomic DNA of individuals who are heterozygous; Human genomic DNA of an individual homologous to the wild type factor V allele; Negative standard without DNA. Cy5-labeled primers, floresin-labeled probes, mutation sites (marked with *) The directions are as follows;

라벨 안된 반대 프라이머의 서열은 TGTTATCACACTGGTGCTAA(서열 12)이고, 증폭된 생성물은 길이가 186bp이다. 실시예 8에서와 같이 Cy5-라벨된 프라이머를 얻는다. 온도 변환 과정은 다음과 같다; 94℃에서 0초(기울기=20), 50℃에서 10초 (기울기=20), 72℃에서 0초(기울기=1)를 50회 한다. 비록 50℃와 94℃ 범위에서 초당 1℃ 변환속도로 각 변환과정 동안을 모니터하면 분명하게 유전자형을 확인은 할 수 있지만(도 47), 느린 온도 변환 속도(초당 0.2℃-도 46)로 증폭 종료 즘에 최상의 용융 곡선을 얻는다. 온도와 온도에 대한 마이너스 형광 변화(-dF/dT vs T)를 플롯하면 용융 곡선을 가장 쉽게 볼 수 있다. 이와 같은 방식으로 원래의 형광 데이터로부터 모든 가능한 유전자형을 쉽게 확인할 수 있다.The sequence of the unlabeled counter primer is TGTTATCACACTGGTGCTAA (SEQ ID NO: 12) and the amplified product is 186 bp in length. Obtain a Cy5-labeled primer as in Example 8. The temperature conversion process is as follows; 50 seconds at 94 ° C for 0 seconds (tilt = 20), 50 ° C for 10 seconds (tilt = 20) and 72 ° C for 0 seconds (tilt = 1). Although monitoring genotypes during each conversion process in the 50 ° C and 94 ° C ranges at 1 ° C per second conversion rate is clearly visible (Figure 47), the amplification ends at a slower temperature conversion rate (0.2 ° C-46 per second). Best melt curves are obtained. Plotting the temperature and the negative fluorescence change over temperature (-dF / dT vs T) provides the easiest view of the melting curve. In this way all possible genotypes can be easily identified from the original fluorescence data.

Cy5 라벨에 근접하게 프라이머 3'-단부가 있을수록, 공명 에너지 전달 시그날이 커진다. 그러나, 3'-단부에는 반드시 폴리메라제 연장을 위한 자유 3'-하이드록실 기를 가지고 있어야 하고, 3'-단부 너무 가까이에(또는 3' 또는 두 번째 염기에) Cy5가 있으면, 폴리메라제의 부착을 방해하여, 폴리메라제에 의한 연장을 방해하게 된다. 3'-플로레신 프로브는 가능한 한 프라이머에 근접하게 하이브리드를 해야하고(1-3개 염기 점도가 겹쳐지는 것은 허용할 수 있다), 돌연변이 부위 프로브의 중앙 부근에 있어야 한다. 하이브리드된 형광단간에 5개 염기가 있고, 23-mer 프로브의 염기 8에 돌연변이가 있으면 용융 곡선은 돌연변이와 야생형 서열간에 8℃의 용융 곡선 이동이 있다(도 46).The closer the primer 3'-end to the Cy5 label, the greater the resonance energy transfer signal. However, if the 3'-end must have a free 3'-hydroxyl group for polymerase extension and there is Cy5 too close to the 3'-end (or at 3 'or the second base), the polymerase Interferes with adhesion, which impedes extension by the polymerase. The 3'-floresin probe should hybridize as close to the primer as possible (allowing 1-3 base viscosities to overlap) and should be near the center of the mutation site probe. If there are 5 bases between the hybridized fluorophores and there is a mutation in base 8 of the 23-mer probe, the melting curve has a melting curve shift of 8 ° C. between the mutation and the wild type sequence (FIG. 46).

한 개의 라벨된 프로브와 한 개의 라벨된 프라이머를 이용하는 대신에 2개 라벨된 프로브를 이용하여 프로브 용융에 의한 돌연변이를 감지할 수 있다. 본 구체예에서, 한 개 프로브는 Cy5로 5'라벨을 하고, 다른 프로브는 플로레신으로 3'라벨을 한다. 이들 두 개 형광 프로브는 아미다이트로부터 바로 합성을 할 수 있고, 프라이머/프로브 시스템에 있는 경우에는 손으로 작업하는 단계가 필요없다. 돌연변이 위치를 플로세신-라벨된 프로브의 중앙 근처에 위치하도록 플로레신-라벨된 프로브를 만든다. 돌연변이 위치에 걸치는 플로레신-라벨된 프로브보다 Cy-5 라벨된 프로브가 높은 온도(5℃ 이상)에서 용융 되도록, Cy5-라벨된 프로브 길이를 조절한다. 플로레신으로 인한 배경이 Cy5로 인한 배경보다 다소 문제가 있기 때문에, Cy5-라벨된 프로브의 농도는 플로레신-라벨된 프로브의 농도보다는 약 2-5배 높게하는 것이 바람직하다. 두 개의 프로브는 게놈 DNA의 동일한 쇄에 하이브리드해야 하고, 공명 에너지 전달 쌍은 약 0개 내지 5개 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어야 한다. 또는, 돌연변이 위치에 걸치는 프로브에 Cy5로 라벨을 할 수 있고, 다른 프로브에 플로레신으로 라벨을 할 수 있다.Instead of using one labeled probe and one labeled primer, two labeled probes can be used to detect mutations by probe melting. In this embodiment, one probe is labeled 5 ′ with Cy5 and the other probe is labeled 3 ′ with floresin. These two fluorescent probes can be synthesized directly from amidite and do not require manual steps when in a primer / probe system. The floresin-labeled probe is made to position the mutation near the center of the florcecin-labeled probe. The Cy5-labeled probe length is adjusted such that the Cy-5 labeled probe melts at a higher temperature (5 ° C. or higher) than the floresin-labeled probe across the mutation site. Since the background due to floresin is somewhat more problematic than the background due to Cy5, the concentration of the Cy5-labeled probe is preferably about 2-5 times higher than the concentration of the floresin-labeled probe. The two probes must hybridize to the same chain of genomic DNA and the resonance energy transfer pair should be separated by about 0-5 nucleotide residues. Alternatively, a probe spanning the mutation site can be labeled with Cy5 and another probe can be labeled with floresin.

인자 V Leiden 돌연변이를 감지하기 위해 여기에 상술하고 있는 특정 프로브와 프라이머는 단순히 설명을 하기 위함이고, 당업자는 실험없이도 여기에서 제시하는 원리와 안내에 따라 돌연변이를 감지하기 위한 다른 프로브와 프라이머를 고안할 수 있을 것이다. 또한 본 발명은 게놈 DNA에 있는 단일 염기에 돌연변이를 감지하는 거세 대해 설명을 하고 있지만, cDNA에 있는 돌연변이를 감지하는데에도 동일한 원리를 적용시킬 수 있다는 것을 인지할 것이다. DNA를 준비하는 것은 상당한 공정 단계와 시간을 요한다는 것은 공지된 바이고, 따라서 시간 및 비용이 절감되기 때문에 게놈 DNA를 이용하는 것이 바람직하다. 또한 동일한 기술을 이용하여 돌연변이 또는 다형성이 있을 때, 용융 온도가 변화되도록 하이브리드 프로브를 만들면, 삽입 또는 결손을 감지할 수 있다. 본 발명을 이용하여, 야생형에 대해 돌연변이에 하이브리드될 때 용융 온도가 변화되도록 프로브를 만들면 임의 공지의 돌연변이를 감지할 수 있다.The specific probes and primers detailed herein for detecting factor V Leiden mutations are merely illustrative and those skilled in the art will devise other probes and primers for detecting mutations according to the principles and guidance presented herein without experiment. Could be. The invention also describes castration for detecting mutations in a single base in genomic DNA, but it will be appreciated that the same principles can be applied to detecting mutations in cDNA. The use of genomic DNA is preferred because it is known that the preparation of DNA requires significant process steps and time, thus saving time and money. The same technique can also be used to detect insertions or deletions by making hybrid probes with varying melting temperatures in the presence of mutations or polymorphisms. Using the present invention, any known mutation can be detected by making the probe such that the melting temperature changes when hybridized to the mutation for the wild type.

절술한 실시예에서 플로레신 및 Cy5를 공명 에너지 전달 라벨로 이용하였지만, Cy5.5와 같은 다른 수용체들도 플로레신과 함께 이용을 할 수 있다.In the examples described above, fluorescein and Cy5 were used as resonance energy transfer labels, but other receptors, such as Cy5.5, can also be used with fluorescein.

실시예 22Example 22

실시예 21의 인자 V 위치를 증폭시키는데 단, 프라이머는 Cy5 대신에 Cy5.5로 라벨을 한다. Cy5.5 방출은 683㎚ 롱 패스 이색 필터와 683-703㎚ 밴드패스 건섭 필터를 통하여 Cy5.5 방출을 관찰한다. 약 30회때에는 Cy5.5에 대한 플로레신의 비율이 배경이상으로 증가되고, 비대칭 증폭 50외때에는 비율이 거의 두 배가 된다. 야생형 DNA로 증폭시켰을 때, 프로브의 Tm은 용융 피크로 판단하였을 때, 65-66℃이다.Amplify the factor V position of Example 21, except that the primers are labeled Cy5.5 instead of Cy5. Cy5.5 emission was observed for Cy5.5 emission through a 683 nm long pass dichroic filter and a 683-703 nm band pass interference filter. At about 30 times, the ratio of floresin to Cy5.5 is increased beyond the background, and outside of asymmetric amplification 50, the ratio is almost doubled. When amplified with wild-type DNA, the Tm of the probe is 65-66 ° C., judged by melting peak.

단일 염기 돌연변이를 감지하는 또 다른 실시예에 대해 설명을 한다.Another example of detecting a single base mutation is described.

실시예 23Example 23

메틸렌테트라하이드로폴레이트 환원효소(MTHER) 유전자(C₆₇₇T)에서 알라닌이 발린 잔기로 변환되어 열에 불안정한 효소가 되는 흔한 점 돌연변이이다. 이와 같은 돌연변이는 MTHFR 활성을 감소시키며 호호시스테인 혈장 수준을 상승시켜, 본 기술분야에 공지된 바와 같이 초기 맥관 질환 및 혈전증 등의 위험인자에 복합되어 있다. 프라이머중 하나는 Cy5로 라벨된 Cy5-(TGAAGGAGAAGGTGTCT^*GCGGGA)(서열 25)이고, 이때 T^*는 Cy5에연결된 변형된 T 잔기(정제 및 헙성에 대한 실시예 9를 촘고)이다. 프로브 서열은 플로레신이 라벨된 플로레신-CCTCGGCTAAATAGTAGTGCGTCGA(서열 26)이고, 다른 프라이머는 AGGACGGTGCGGTGAGAGTG(서열 27)이다. MTHER 유전자의 198bp 단편은 다음과 같은 조건에서 증폭된다; 50mM Tris, pH 8.3, 2mM MgCl₂, 500㎍/㎖ 소 혈청 알부민, 0.2mM 각 dNTP, 0.5μM Cy5-라벨된 프라이머, 0.1μM 반대 프라이머, 0.1μM 플로레신-라벨된 프로브, 10㎕당 0.4 U Taq DNA 폴리메라제 10㎕에 50ng 사람 게놈 DNA. 각 온도 변환과정은 30초 동안인데 이는 94℃에서 변성하고, 60℃에서 어닐링/연장 복합단계로 구성된다. 단계간의 온도 전이율은 초당 20℃이다. 60회 후에, 다음과 같이 용융 곡선을 얻을 수 있다; 초당 0.5℃로 50-60℃, 초당 0.1℃로 65-75℃, 초당 0.5℃로 75-94℃로 가열을 한다. 기저치를 빼고, 용융 피크로 전환한 후에, 모든 가능한 유전자형을 쉽게 구별할 수 있다(도 48).It is a common point mutation in which alanine is converted to valine residues in the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHER) gene (C ₆₇₇ T) to become thermally labile enzymes. Such mutations reduce MTHFR activity and elevate hohocysteine plasma levels, which are complexed to risk factors such as early vessel disease and thrombosis, as known in the art. One of the primers is Cy5- (TGAAGGAGAAGGTGTCT ^* GCGGGA) (SEQ ID NO: 25) labeled Cy5, where T ^* is a modified T residue linked to Cy5 (see Example 9 for purification and characterization). The probe sequence is floresin-labeled floresin-CCTCGGCTAAATAGTAGTGCGTCGA (SEQ ID NO: 26) and the other primer is AGGACGGTGCGGTGAGAGTG (SEQ ID NO: 27). 198 bp fragment of the MTHER gene is amplified under the following conditions; 50 mM Tris, pH 8.3, 2 mM MgCl ₂ , 500 μg / ml bovine serum albumin, 0.2 mM each dNTP, 0.5 μM Cy5-labeled primer, 0.1 μM counter primer, 0.1 μM Floresin-labeled probe, 0.4 U per 10 μL 50 ng human genomic DNA in 10 μl of Taq DNA polymerase. Each temperature conversion process is for 30 seconds, which is denatured at 94 ° C and consists of an annealing / extension step at 60 ° C. The rate of temperature transfer between steps is 20 ° C. per second. After 60 times, the melting curve can be obtained as follows; Heat 50-60 ° C. at 0.5 ° C. per second, 65-75 ° C. at 0.1 ° C. per second, and 75-94 ° C. at 0.5 ° C. per second. After subtracting the baseline and switching to the melting peak, all possible genotypes can be easily distinguished (FIG. 48).

하이브리드 프로브의 분별력을 이용하면 다중 또는 복합 PCR에 상당한 장점을 제공한다. 예를 들면, 한 개의 내부 염기 변화를 가지도록 인공 주형을 만들고, 실시예 21과 23에서와 같이 염기 변화를 커버할 수 있도록 하이브리드 프로브를 만든다. 실시예 16에서와 같이 용융 피크를 얻고 이를 적분하여, 경쟁물과 천연 주형의 상대적인 증폭을 결정한다. 또는, 상이한 온도에서 상이한 표적이 연속적으로 용융되는 다중 감지 프로브를 이용하는 경우에, 동일한 분석으로 상대적인 양을 얻을 수 있다. 일반적으로, 이중-쇄-특이적인 DNA 염료에 대해 기존의 임의 정량화 기술을 이용하여 하이브리드 프로브와 함계 특정 서열를 만든다.The discrimination power of hybrid probes offers significant advantages for multiple or multiplex PCR. For example, artificial templates are made to have one internal base change, and hybrid probes are made to cover base changes as in Examples 21 and 23. Melt peaks are obtained and integrated as in Example 16 to determine the relative amplification of the competition and natural template. Alternatively, when using multiple sense probes in which different targets are continuously melted at different temperatures, relative amounts can be obtained with the same analysis. In general, specific sequences are made with hybrid probes using existing random quantification techniques for double-chain-specific DNA dyes.

생성물의 재-어닐링 역학을 이용하여 생성물의 절대 농도를 측정 ; 본 발명을 이용하여 생성물의 농도를 유익하게 결정할 수 있다. 이중 쇄 DNA 형성을 지속적으로 모니터하여, 재-어닐링 역학으로 임의 증폭 과정에서 DNA를 정량화할 수 있다. 시료의 온도를 변성 온도로부터 갑자기 떨어지게 하고, 프라이머 어닐링을 방지할 수 있는 충분한 온도의 낮은 온도에서 유지시킨다(도 2). 생성물 재-어닐링의 속도는 2차 반응 속도이다(B. Young & M. Anderson, Quantitative analysis of solution hybridization, In: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach 47-71 (B. Hames & S. Higgins, eds., (1985)). 임의 주어진 PCR 생성물 및 온도에서, 2차속도 상수를 측정할 수 있다. 일단 속도 상수를 알면, 실험을 통한 재-어닐링 데이터로부터 임의 농도를 모르는 DNA의 농도를 알 수 있다. 냉각은 순간적인 것이 아니고, 일정 온도에 도달하기 전에 일부 재-어닐링이 발생할 수도 있다. 신속하게 냉각하면속도 상수 및 DNA 농도 결정에 이용할 수 있는 데이터의 양을 최대로 할 수 있다. 이 기술에는 순수 정제된 PCR 생성물을 요구하나, 이는 본 발명을 이용한 온도 변환 과정동안에 수득한 용융 곡선에 의해 이를 확실하게 할 수 있다.Determining the absolute concentration of the product using the re-annealing kinetics of the product; The present invention can be used to advantageously determine the concentration of the product. Double chain DNA formation can be continuously monitored to quantify DNA during any amplification process with re-anneal kinetics. The temperature of the sample is suddenly dropped from the denaturing temperature and kept at a low temperature of sufficient temperature to prevent primer annealing (FIG. 2). The rate of product re-annealing is the secondary reaction rate (B. Young & M. Anderson, Quantitative analysis of solution hybridization, In: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach 47-71 (B. Hames & S. Higgins, eds. , (1985)) At any given PCR product and temperature, the second order rate constant can be determined Once the rate constant is known, the concentration of the unknown DNA can be determined from the experimental re-anneal data. Cooling is not instantaneous, and some re-annealing may occur before a certain temperature is reached, allowing rapid cooling to maximize the amount of data available for determining rate constants and DNA concentrations. Purified PCR products are required, but this can be assured by the melt curves obtained during the temperature conversion process using the present invention.

본 발명의 정량화 방법은 시료간에 임의적인 시그날 강도의 변화에 무관하다는 장점이 있다.The quantification method of the present invention has the advantage that it is independent of any change in signal intensity between samples.

실시예 24Example 24

사람 게놈 DNA(실시예 7)과 정제된 DNA(실시예 2)로부터 β-글로빈 536bp 단편을 증폭시켰다. 상이한 양의 정제된 DNA를 5㎕ 50mM Tris, pH 8.3, 3mM MgCl₂에 있는 1:30,000 희석된 SYBR^TMGreen I에 혼합시킨다. 시료는 94℃에서 변성시키고, 신속하게 85℃로 냉각시킨다. 520-550㎚에서의 형광을 85℃에서 모니터한다. 농도가 다른 여러 가지 DNA를 테스트하는 경우에, 재-어닐링 곡선의 모양은 DNA 농도에 따른 특징을 가진다(도 49). 임의 주어진 PCR 생성물 및 온도에서 2차 반응 속도 상수를 결정한다. 도 50에서는 85℃에서 5㎕에 있는 536bp 단편 100ng에 대한 2차 재-어닐링 속도 상수를 결정하는 것을 나타낸다. 곡선은 도 50에 나타낸 2차 반응 식을 이용하여, 플로오팅 변수로 F_max, F_min, t₀, k와 함께 비-선형 최소 자승 회귀분석으로 만든다. 이와 같은 곡선을 만드는 분석 프로그램은 당 분야에 공지되어 있다(the user defined curve fit of Delta Graph. DeltaPoint, Inc, Monteray, CA). 일단 속도 상수를 알면, 실험에 의한 재-어닐링 데이터로부터 농도를 모르는 DNA의 농도를 결정할 수 있다.Β-globin 536 bp fragment was amplified from human genomic DNA (Example 7) and purified DNA (Example 2). Different amounts of purified DNA are mixed in 1: 30,000 diluted SYBR ^™ Green I in 5 μl 50 mM Tris, pH 8.3, 3 mM MgCl ₂ . The sample is denatured at 94 ° C. and quickly cooled to 85 ° C. Fluorescence at 520-550 nm is monitored at 85 ° C. In the case of testing different DNA at different concentrations, the shape of the re-annealing curve is characterized by the DNA concentration (FIG. 49). Secondary reaction rate constants are determined at any given PCR product and temperature. 50 shows determination of the secondary re-annealing rate constant for 100 ng of 536 bp fragment in 5 μl at 85 ° C. FIG. The curves are made by non-linear least-squares regression with the floating variables F _max , F _min , t ₀ , k using the second order equation shown in FIG. 50. Analytical programs for creating such curves are known in the art (the user defined curve fit of Delta Graph. DeltaPoint, Inc, Monteray, CA). Once the rate constant is known, the concentration of unknown DNA can be determined from experimental re-anneal data.

정의된 속도 상수(k)로, 모르는 시료에 DNA 농도를 결정한다. 실제 시간에서 온도변환 과정동안에 비-선형 최소 자승 회귀분석을 이용하여 모르는 시료의 시간에 대한 형광 곡선을 만든다(예를 들면, in the LabView programming environment, National Instruments, Austin, TX에서 설명하는 비-선형 Levenberg-Marquardt 방법). 곡선을 만드는데, F_max, F_min, t₀와 [DNA]는 플로오팅 변수이고, k는 상수이다.The defined rate constant (k) determines the DNA concentration in unknown samples. Non-linear least-squares regression analysis is used to generate fluorescence curves for unknown sample times during the temperature conversion process from real time (see, for example, the non-linearity described in the LabView programming environment, National Instruments, Austin, TX). Levenberg-Marquardt method). Create a curve, where F _max , F _min , t ₀ and [DNA] are the plotting variables, and k is a constant.

일부 형광 염료가 농도에 따른 방식으로 재-어닐링에 영향을 주기 때문에, 생성물의 재-어닐링의 2차 반응 속도 가설은 농도가 다른 표준 DNA에서 속도 상수를 결정하여 점검할 수 있다. 관계를 정의하고, 필요에 따라 또 다른 적용 식을 결합시킬 수 있다.Since some fluorescent dyes affect re-annealing in a concentration-dependent manner, the secondary reaction rate hypothesis of re-annealing of the product can be checked by determining rate constants at standard DNA with different concentrations. You can define relationships and combine other formulas as needed.

본 발명의 범위내에는 또는 생성물의 농도를 결정하는데 프로브 어닐링 속도를 이용한다. 형광 공명 에너지 전달 속도는 프라이머 어닐링 온도보다는 높은 프로브 어닐링 온도로 온도를 떨어뜨린 후에 이어진다(도 2). 프라이머로 라벨한 것과 한 개는 프로브로 라벨된 증폭의 경우에, 어닐링 속도(및 형광 발생 속도)는 2차 함수이다. 두 가지 라벨된 프로브를 이용하는 경우에, 형광 발생 속도는 3차 함수이다. 이들 두 가지 배열은 도 18에 나타내었다. 프로브의 농도가 생성물의 농도 보다 클 때, 가능성을 설명하는데에는 모의 1차 식 및 모의 2차 식을 이용하는 것이 적합하다. 이와 같은 다른 조건에 맞는 적절한 속도 식은 당 분야에 공지되어 있다(Young, B. and Anderson, M., supra). 본 발명의 목적을 위해, 선행 기술에서 제시하는 적절한 반응 속도 식은 필요에 따라서는 실험적으로 테스트하고, 교정하는 것이 바람직하다.Within the scope of the present invention or probe annealing rates are used to determine the concentration of the product. The fluorescence resonance energy transfer rate follows after dropping the temperature to a probe annealing temperature higher than the primer annealing temperature (FIG. 2). In the case of amplification labeled with a primer and one labeled with a probe, the annealing rate (and fluorescence generation rate) is a quadratic function. When using two labeled probes, the rate of fluorescence generation is a cubic function. These two arrangements are shown in FIG. 18. When the concentration of the probe is greater than the concentration of the product, it is suitable to use a simulated first-order equation and a simulated second-order equation to explain the possibilities. Suitable rate equations for these other conditions are known in the art (Young, B. and Anderson, M., supra). For the purposes of the present invention, it is preferred that the appropriate reaction rate equations presented in the prior art are experimentally tested and corrected as necessary.

프로브 어닐링 속도를 이용하여 생성물 농도를 결정할 때, 가능한 간섭 효과에는 생성물 재-어닐링(분지 이동으로 프라이머 치환) 및 프라이머 어닐링 및 프로브를 통한 연장을 포함한다. 프로브의 Tm이 프라이머의 Tm보다 높은 경우에 이를 최소화할 수 있고, 프라이머 어닐링을 최소화하기 위해 프로브 어닐링 온도를 선택한다. 도 13에서는 연장이 일어나더라도, 형광은 약 20초간 증가된다는 것을 나타낸다. 이 기간동안에, 형광은 생성물 농도에 따라 증가된다.When determining product concentration using probe annealing rates, possible interference effects include product re-annealing (primer substitution by branch transfer) and primer annealing and extension through the probe. If the Tm of the probe is higher than the Tm of the primer, it can be minimized and the probe annealing temperature is chosen to minimize primer annealing. 13 shows that even if extension occurs, the fluorescence is increased for about 20 seconds. During this period, fluorescence increases with product concentration.

프로브 어닐링 속도를 이용하여 생성물 재어닐링에 의한 생성물의 농도를 결정하는 전술한 방법과 유사하게 생성물의 농도를 결정한다. 그 방법을 요약하면 다음과 같다; (1) 시스템에 적합한 적절한 반응 식을 선택하고; (2) 속도 상수를 결정하기 위해 공지의 DNA를 이용하여 실시하고; (3) 다른 농도에서 유도한 상이한 속도 상수를 비교하여 속도 반응식의 유효성을 점검하고; (4) 속도 상수를 이용하여 이들의 프로브 어닐링 데이터를 이용하여 농도를 모르는 DNA 농도를 결정한다.The probe annealing rate is used to determine the concentration of the product, similar to the method described above for determining the concentration of the product by product reannealing. The method is summarized as follows; (1) selecting a suitable reaction formula for the system; (2) using known DNA to determine rate constants; (3) checking the validity of the rate equation by comparing different rate constants derived at different concentrations; (4) Determine the DNA concentration whose concentration is unknown using these probe annealing data using rate constants.

온도 변환 과정을 제어하기 위한 형광 피이드백 방법 ; 종점 cycle-by-cycle 분석과는 대조적으로, 본 발명은 각 온도 변한 과정을 통하여 형광을 모니터할 수 있다. 지속적으로 형광을 모니터하여 온도 변환과정 변수를 조절할 수 있다. 본 발명은 실제 시간 조절 및 증폭을 최적하시키기 위해 형광 피이드백을 이용한다. 이중-쇄-특이적인 DNA 염료 또는 형광 라벨된 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 PCR 시료에 지속적으로 형광을 모니터하는 방법을 이용하여, 개별 증폭 과정동안에 하이브리드와 용융을 모니터한다. 이와 같은 정보는 온도 사이클러 기구내에 온도 제어 알고리즘에 이용하여 열 변환 과정 조건을 개선하고, 요건에 맞게 만든다. 증폭시키기 전에 모든 변환과정 변수를 프로그램하여 통상적인 PCR을 실행한다. 지속적으로 모니터하면서, 증폭하는 동안에 어닐링, 연장, 변성 등을 지속적으로 관찰한 것에 근거하여 온도 변환과정의 요구사항을 결정한다. 온도과정을 제어하기 위한 하이브리드 정보를 이용하는 장점은 다음과 같다;Fluorescence feedback method for controlling the temperature conversion process; In contrast to endpoint cycle-by-cycle analysis, the present invention can monitor fluorescence through each temperature varying process. Continuously monitor fluorescence to adjust temperature conversion process parameters. The present invention utilizes fluorescent feedback to optimize the actual time adjustment and amplification. Hybrid and melting are monitored during the individual amplification process using a method of continuously monitoring fluorescence on PCR samples containing double-chain-specific DNA dyes or fluorescently labeled oligonucleotide probes. This information can be used in temperature control algorithms in temperature control algorithms to improve thermal conversion process conditions and to meet requirements. Prior to amplification, all transformation parameters are programmed to run conventional PCR. With continuous monitoring, the requirements of the temperature conversion process are determined based on continuous observation of annealing, extension and denaturation during amplification. The advantages of using hybrid information to control the temperature process are as follows;

1. 각 온도변환과정동안에 PCR 생성물을 완전하게 변성시킬 수 있는데,1. The PCR product can be completely denatured during each temperature conversion process.

이때, a) 상당히 높은 변성 온도에 노출을 최소화시켜, 증폭 생성물 및 폴리메라제에 열에 의한 손상을 피하게 한다. 변성 온도에 노출되는 시간을 제한하는 것은 긴 생성물을 증폭하는데에는 특히 유용하다.A) Minimize exposure to significantly higher denaturation temperatures to avoid thermal damage to the amplification product and polymerase. Limiting the time of exposure to denaturing temperatures is particularly useful for amplifying long products.

b) 변성 온도를 최소화시켜 반응 특이성을 증가시킨다. 이는 원하는 증폭 생성물보다 높은 Tm을 가진 생성물에 반하는 선택이다.b) minimizing denaturation temperature to increase reaction specificity. This is a selection against products with higher Tm than the desired amplification product.

2. 각 온도변환과정에 프라이머 어닐링에 적절한 시간을 확인하여 증폭 효과를 최대화시키는데,2. Maximize the amplification effect by checking the appropriate time for primer annealing during each temperature conversion process.

이때, a) 프라이머 어닐링의 특정 효과에 도달하는데 필요한 것보다 더 긴 시간을 허용하지 않음으로써 증폭에 필요한 시간을 최소로 하고;Where: a) the time required for amplification is minimized by not allowing a longer time than necessary to reach a particular effect of primer annealing;

b) 어닐링 온도에서 시간을 최소화시켜 반응 특이성을 강화시킨다.b) Minimize time at the annealing temperature to enhance reaction specificity.

3. 각 온도 변환 과정동안에 생성물의 연장에 필요한 시간을 확인하여 증폭 효과를 최대로 하는데3. Check the time required to extend the product during each temperature conversion process to maximize the amplification effect.

이때, a) 생성물 연장을 완료하는데 필요한 시간을 초과하는 것을 허용하지 않아 증폭에 필요한 시간의 양을 최소화시키고;Where: a) disallowing to exceed the time required to complete product extension to minimize the amount of time required for amplification;

b) 원하는 증폭 생성물보다 더 긴 생성물에 대비하여 선택을 함으로써 반응 특이성을 강화시킨다. 이와 같은 것들은 생성물의 연장을 완성하기 위해 할당된 시간보다 더 많은 시간을 요구한다.b) Enhance reaction specificity by making selections for products longer than the desired amplification product. These require more time than the allotted time to complete the extension of the product.

4. 초기 열 변환 과정은 수득된 형광 또는 현재 증폭 효율에 따라 변화된다. 예를 들면, 과-증폭 및 비특이적인 반응 상성물은 효과를 특정 수준으로 감소시켰을 때, 열 처리 과정을 종료시켜 최소화할 수 있다. 또 다른 예로써, 온도 과정을 변형시켜 형광이 감지되기 시작할 때 용융 곡선을 얻기위한 느린 온도 램프를 개시한다. 이는 시간을 절감시키는데 그 이유는 초기 변환과정에서는 느린 램프를 이용할 필요가 없기 때문이다. 본 발명의 실행에서 다른 바람직한 변화를 알 수 있을 것이다.4. The initial heat conversion process changes depending on the fluorescence obtained or the current amplification efficiency. For example, over-amplified and nonspecific reaction supernatants can be minimized by ending the heat treatment process when the effect is reduced to a certain level. As another example, a slow temperature ramp is disclosed to obtain a melting curve when the temperature process is modified to begin to sense fluorescence. This saves time because there is no need to use a slow ramp during the initial conversion process. Other desirable changes will be appreciated in the practice of the invention.

형광 데이터로부터 나오는 반응 변수를 평가하여 제어할 수 있다. 고유 형광 데이터는 시간에 따른 형광의 변화(변성, 어닐링, 연장의 온도 특이적인 속도), 온도에 따른 형광의 변화(생성물 또는 프로브의 Tm) 또는 증폭정도의 변화(증폭 스득율 및 효과)등으로 얻을 수 있다. 이들 속도, Tm 및 제 1 유도체 및 제2 유도체를 이용하면 최적 반응 변수를 얻을 수 있는데, 여기에는 변성 온도, 시간, 프라이머 어닐링 온도 및 시간, 프로브 어닐링 온도 및 시간, 효소 연장 온도 및 시간, 변환과정의 횟수 등을 포함한다.Response variables from fluorescence data can be evaluated and controlled. The intrinsic fluorescence data can include changes in fluorescence over time (denaturation, annealing, temperature-specific rates of extension), changes in fluorescence over temperature (Tm of the product or probe), or changes in amplification (amplification gain and effect). You can get it. These rates, Tm and the first and second derivatives can be used to obtain optimal reaction parameters, including denaturation temperature, time, primer annealing temperature and time, probe annealing temperature and time, enzyme extension temperature and time, conversion process. The number of times and the like.

이중-쇄-특이적인 DNA 염료를 이용하여 변성 및 연장을 제어하고, 특정 증폭 수준 또는 효과에서 열 변화과정의 변화를 시작한다. 공명 에너지 전달 염료를 이용하여 어닐링을 제어할 수 있다.Double-chain-specific DNA dyes are used to control denaturation and extension and initiate changes in the process of thermal change at specific amplification levels or effects. Resonance energy transfer dyes can be used to control the annealing.

실시예 25Example 25

시판되는 형광 모니터용 열 변환과정기(LC24 LightCycler, Idaho Technology Inc., Idaho Fails, Idaho)를 변형시켜, 소프트웨어에 온도/시간 세트포인트가 프로그램되어 있지 않도록 하고, 형광 값을 얻도록 프로그램하여, 열 변환과정 제어용으로 이들 값을 이용한다.A commercially available thermal conversion process for fluorescent monitors (LC24 LightCycler, Idaho Technology Inc., Idaho Fails, Idaho) can be modified to ensure that the temperature / time setpoint is not programmed in the software, and programmed to obtain fluorescence values. Use these values to control the conversion process.

Functional Block Diagram(도 51)에서 설명하는 것과 같이, Run-Time Program은 시리얼과 LightCycler가 있는 DAQ-board interfaces와 통신한다. 이로써 온도 또는 형광에 높은 수준으로 접근할 수 있고, 어느 것이든 온도 제어를 위한 Board-level Software를 이용한다. 그러나, 본 발명의 구체예에서는 온도 데이터만을 Controller Hardware level에서 디지탈 형식으로 변환시킨다.As illustrated in the Functional Block Diagram (FIG. 51), the Run-Time Program communicates with DAQ-board interfaces with serial and LightCycler. This provides a high level of access to temperature or fluorescence, using either board-level software for temperature control. However, in the embodiment of the present invention, only the temperature data is converted into the digital format at the controller hardware level.

생성물 용융 조절Product Melt Control

원하는 PCR 생성물에서 용융 피크를 얻고, 기저 형광은 생성물이 완전하게 용융된 온도에서 반응 칵테일을 포함하는 시료에서 얻는다.Melt peaks are obtained in the desired PCR product, and base fluorescence is obtained from the sample containing the reaction cocktail at the temperature at which the product is completely melted.

그 다음 각 반응의 온도변환과정은 표적으로 이와 같은 형광 값을 이용한다. 시간-정체를 피하기 위해, 생성물 변성에 접근하는 것은 두 단계로 이루어지는데 그 이유는 분석을 위한 멀리 떨어진 컴퓨터에 형광 값을 보내고 이 값이 는데 필요한 시간이 정체되는 것이다. 각 생성물의 용융 단계에서, 형광이 중간 값에 도달할 때까지 온도가 증가되고, 가열력은 감소되어, 약 초당 3℃의 온도 램프 속도는 컴퓨터 시간에 형광을 분석하고, 생성물 변성이 일어난 열 사이클러에 시그날을 보낸다.The temperature conversion process of each reaction then uses these fluorescence values as targets. To avoid time-stamp, accessing product denaturation is a two step approach: sending the fluorescence value to a remote computer for analysis and stagnating the time needed to reach this value. In the melting phase of each product, the temperature is increased until the fluorescence reaches a median value, and the heating power is reduced, so that a temperature ramp rate of about 3 ° C. per second analyzes the fluorescence at computer time and between the heat at which product denaturation takes place. Send a signal to the clerk.

생성된 온도/시간 플롯에서는 증폭 생성물의 농도가 증가될 때 변환과정 20회 후에 용융 온도가 증가되는 특징을 나타낸다. 생성물 Tm은 생성물 농도에 대한 함수이다.The resulting temperature / time plot is characterized by an increase in melting temperature after 20 conversions when the concentration of amplification product is increased. Product Tm is a function of product concentration.

생성물 어닐링/연장Product Annealing / Extension

어닐링/연장 온도서 연장동안에, 형광을 모니터하고, 이 정보를 이용하여, 적절한 그러나 생성물의 연장에 허용되는 시간을 초과하지는 않는 시간을 확인한다. 10초 간격으로 형광을 모니터하는데, 설정할 수 있는 비율(일반적으로 1.00-1.05)이상으로 형광이 증가되면, 어닐링/연장 단계를 지속한다. 그렇지않으면, 그 다음 생성물 용융 단계를 개시한다. 간격을 10초로하면, 어닐링/연장 복합온도에서 최소 20초를 제공한다.During the annealing / extension temperature extension, the fluorescence is monitored and this information is used to identify a time that is appropriate but does not exceed the time allowed for extension of the product. The fluorescence is monitored at 10 second intervals, and if the fluorescence increases above a set rate (typically 1.00-1.05), the annealing / extension step is continued. If not, then the product melting step is started. A 10 second interval provides at least 20 seconds at the annealing / extension temperature.

생성 형광/시간 플롯(도 52)에서는 증폭 생성물이 증가될 때 어닐링/연장 복합 온도에서 잔류 시간이 증가되는 특징을 가진다. 프라이머 농도와 폴리메라제 를 제한하기 때문에, 각 반복과정에서 생성물의 연장을 완료하기 위해서는 더 많은 시간을 필요로 한다.The resulting fluorescence / time plot (FIG. 52) is characterized by an increase in residence time at the annealing / extension complex temperature as the amplification product is increased. Due to the limitation of primer concentration and polymerase, more time is required to complete the extension of the product in each iteration.

증폭 평탄부Amplification

각 어닐링/연장 단계 종류시에, 형광 값을 얻고 이를 보관한다. 이 값이 최저 과정의 종료시의 형광 값의 1.2배로 증가되고 사용자의 설정가능한 비율(일반적으로 1.00-1.02)이하로 증가되는 것이 갑자기 멈추면, 열 변환과정은 종료된다. 도는, 용융 곡선 수득 단계는 생성물의 Tm을 통하여 초당 0.1-0.2℃의 느린 온도 램프로 들어가, 시료의 형광을 지속적으로 모니터하여 개시한다.At each type of annealing / extension step, fluorescence values are obtained and stored. If this value suddenly stops increasing to 1.2 times the fluorescence value at the end of the minimum process and below the user's settable rate (typically 1.00-1.02), the thermal conversion process ends. Alternatively, the melting curve obtaining step is initiated by entering a slow temperature ramp of 0.1-0.2 ° C. per second through the Tm of the product and continuously monitoring the fluorescence of the sample.

생성 형광/시간 플롯(도 52)에서는 32회 증폭 과정 후에, cycle-by-cycle 형광 증가 비율이 1.00이하가 되고 반응이 종료된다는 것을 나타낸다.The resulting fluorescence / time plot (FIG. 52) shows that after 32 amplification cycles, the rate of cycle-by-cycle fluorescence increase is less than 1.00 and the reaction ends.

본 발명의 한 구체예에서, 증폭 평탄부 감지를 이용하면, 각 시료의 최적 온도 변환과정에서 실시한 다중 시료에 있는 각 시료의 고-해상도 용융 곡선을 얻을 수 있다. 시료가 이의 증폭 평탄부에 도달하였을 때, 해당 시료에 대한 용융-곡선을 얻고, 그 다음 또 다른 반응이 그의 증폭 평탄부에 도달할 때까지, 규칙적인 온도 과정을 다시 시작한다.In one embodiment of the present invention, using amplification flats sensing, high-resolution melting curves of each sample in multiple samples performed during optimal temperature conversion of each sample can be obtained. When the sample reaches its amplification flat, a melt-curve for that sample is obtained, and then the regular temperature process is restarted until another reaction reaches its amplification flat.

본 발명은 실제 시간 모니터와 연장과는 별개의 어닐링을조절할 수 있다. 프라이머중 한 개는 Cy5가 3'단부에 라벨되어 있고, 연장은 일어나지 않는다. 그러나, 라벨된 프라이머(1-10%)를 라벨안된 프라이머(90-99%)와 혼합한다면, 증폭 효과는 약간 감소하나 이중-쇄 특이적인 염료에서 Cy5로의 형광 에너지 전달로 어닐링이 관찰될 수 있다. 최저 Tm(본 기술분야에 공지된 가장 인접한 이웃 열역학에 의해 결정함)을 가지는 프라이머는 Cy5로 라벨하고, SYBR^TMGreen I은 이중-쇄-특이적인 염료로 포함될 수 있다. 또는 프라이머 어닐링은 등가의 상보적인 올리고뉴클레오티드로 간접적으로 모니터할 수 있다. 최저 용융 프라이머로써 같은 길이와 Tm의 올리고뉴클레오티드는 증폭된 서열에 상보성이 없도록 한다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 Cy5로 5'라벨된 것이고 이의 상보적인 것은 플로레신 또는 다른 공명 에너지 전달 쌍의 것으로 3'라벨된다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드의 하이브리드 다음에 공명 에너지 전달이 이어진다. 한 개 프로브의 농도는 Tm가 가장 낮은 프라이머의 것과 같도록 하고, 다른 프로브의 농도는 더 낮게 하여, 생성물에 프라이머가 어닐링되는 모의-1차-반응에 근접하는 모의-1차-역학을 얻는다. 어닐링의 효과를 모니터하고, 이를 이용하여 어닐링 온도 및 시간을 이 방법들중 한 가지 방법으로 조절한다.The present invention can adjust annealing separate from the actual time monitor and extension. One of the primers has Cy5 labeled at the 3 ′ end and no extension occurs. However, if the labeled primers (1-10%) are mixed with the unlabeled primers (90-99%), the amplification effect is slightly reduced but annealing can be observed due to the fluorescence energy transfer from the double-chain specific dye to Cy5. . Primers with the lowest Tm (determined by the nearest neighboring thermodynamics known in the art) can be labeled Cy5 and SYBR ^™ Green I can be included as a double-chain-specific dye. Alternatively, primer annealing can be monitored indirectly with equivalent complementary oligonucleotides. As the lowest melting primer, oligonucleotides of the same length and Tm are not complementary to the amplified sequence. Such oligonucleotides are 5 'labeled with Cy5 and their complement is 3' labeled with floresin or other resonance energy transfer pairs. This hybrid of oligonucleotides is followed by resonance energy transfer. The concentration of one probe is equal to that of the lowest primer and the concentration of the other probe is lower, resulting in simulated-first-mechanics that approximate the simulated-first-reaction in which the primers are annealed to the product. The effect of the annealing is monitored and used to adjust the annealing temperature and time in one of these methods.

또한 형광 피이드백 제어로 전체적으로 온도 및 시간 세트포인트를 대체하는 것도 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들면, 세 가지 시료를 피이드백 능력이 있는 형광 온도 사이클러에 넣는다. 시료는 다음과 같다;It is also within the scope of the present invention to replace temperature and time setpoints entirely with fluorescence feedback control. For example, three samples are placed in a fluorescence temperature cycler with feedback capability. Samples are as follows;

1. 증폭된 생성물과 SYBR^TMGreen I을 포함하는 비-반응 시료;1. a non-reactive sample comprising amplified product and SYBR ^™ Green I;

2. 전술한 최저 Tm 프라이머와 농도가 동일한 Tm을 가지는 상보적으로 형광이 라벨된 프라이머를 포함하는 비-반응 시료;2. a non-reactive sample comprising a complementary fluorescently labeled primer having a Tm at the same concentration as the lowest Tm primer described above;

3. 증폭될 시료와 SYBR^TMGreen I.3. Sample to be Amplified and SYBR ^TM Green I.

각 증폭과정으로, 온도를 증가시켰을 때, 시료 1을 모니터하여 생성물의 변성을 확인한다. 용융 곡선은 실제 시간으로 결정하고 시료가 변성되었을 때, 어닐링 단계로 전이가 시작된다. 프라이머 어닐링은 시료 2에 있는 두 개의 상보적인 프라이머의 하이브리드를 통하여 간접적으로 모니터한다. 프라이머중 한 개은 플로레신으로 3'라벨을 하고, 다른 하나는 Cy5 또는 유사한 염료를 이용하여 5'에 라벨을 한다. 시료 2에서 670㎚/540㎚에서 형광 비율이 증가되면 프라이머 하이브리드를 나타낼 때까지 온도를 감소시킨다. 이들이 하이브리드될 때 형광단간에 공명 에너지 전달로 인하여 이 비율이 증가된다. 실시예 25에서 설명을 한 것과 같이 실제 시료의 형광을 모니터하면, 생성물의 연장이 이어진다.With each amplification process, sample 1 is monitored to confirm product denaturation as the temperature is increased. The melting curve is determined in real time and when the sample is denatured the transition to the annealing step begins. Primer annealing is indirectly monitored through a hybrid of two complementary primers in Sample 2. One of the primers is labeled 3 'with floresin and the other labeled 5' with Cy5 or a similar dye. In Sample 2, if the fluorescence ratio is increased at 670 nm / 540 nm, the temperature is decreased until the primer hybrid is shown. When they hybridize, this ratio is increased due to the transfer of resonance energy between fluorophores. Monitoring the fluorescence of the actual sample, as described in Example 25, leads to extension of the product.

요약 : 전술한 논의로 부터, 하이브리드를 모니터하기 위해 DNA 증폭하는 동안에 지속적으로 형광을 모니터하는 것은 상당한 분석 기술이 된다. 여기에서 설명을 하는 방법을 이용하고, 존재하는 초기 주형 복사체의 수에 따라서, 생성물 확인 및 정량화는 온도 과정이 시작된 후에 5 내지 20분이내에서 얻을 수 있다. 본 발명은 본 기술 분야에서 이용할 수 없는 몇 가지 장점을 가진다. 예를 들면, 본 발명은 생성물의 순도를 모니터하는데 단색 형광 방법을 이용하고, 다중 PCR 또는 경쟁 PCR에서의 관련 정량화, 재-어닐링 역학에 의한 절대적인 생성물의 정량화 및 반복과정 수에 대한 형광을 플롯하여 시작 주형의 정량화를 개선하는 등을 제공한다. 본 발명 또한 서열 변화 감지를 위한 이중 색, 서열 특이적인 방법, 다중 PCR 또는 경쟁 PCR에 의한 관련 정량화, 프로브 어닐링 역학에 의한 생성물의 정량화 및 반복과정 수에 대한 형광으로 시작 주형의 정량화 등을 제공한다.Summary: From the foregoing discussion, continuous monitoring of fluorescence during DNA amplification to monitor hybrids is a significant analytical technique. Using the method described herein and depending on the number of initial template copies present, product identification and quantification can be obtained within 5 to 20 minutes after the temperature process commences. The present invention has several advantages that are not available in the art. For example, the present invention uses a monochromatic fluorescence method to monitor the purity of a product, and plots the fluorescence for absolute product quantification and number of iterations by relevant quantification in multiplex or competition PCR, re-annealing kinetics. Improve the quantification of the starting template, and the like. The present invention also provides a dual color for sequence change detection, sequence specific methods, relevant quantification by multiple PCR or competition PCR, quantification of product by probe annealing kinetics and quantification of starting template with fluorescence for number of iterations, and the like. .

다음의 표는 지속적으로 PCR을 모니터하는데 유용한 이중-쇄 특이적인 DNA 염료, 가수분해 프로브, 하이브리드 프로브를 비교한 것이다. 이중-쇄 특이적인 DNA 염료의 형광은 DNA의 쇄 상태에 따라 달라진다. 이중-라벨된 가수분해 프로브는 퀸칭되고, 프로브가 하이브리드되면, 고유 제공체 형광이 증가된다. 하이브리드에 2개의 형광단이 서로 근접할 때 하이브리드 프로브는 증가된 공명 에너지 전달에 따라 달라진다.The following table compares double-chain specific DNA dyes, hydrolysis probes, and hybrid probes useful for continuously monitoring PCR. The fluorescence of double-chain specific DNA dyes depends on the chain state of the DNA. Double-labeled hydrolysis probes are quenched and when the probes hybridize, native donor fluorescence is increased. Hybrid probes rely on increased resonance energy transfer when two fluorophores are in close proximity to each other in the hybrid.

PCR을 지속적으로 모니터하기 위한 형광 프로브 요약Fluorescent Probe Summary for Continuous Monitoring of PCR 형광 프로브Fluorescent probes dsDNA 염료dsDNA dye 가수분해Hydrolysis 하이브리드hybrid 메카니즘Mechanism 쇄 상태Chain status 퀸칭Quinching 전달relay 프로브 합성Probe synthesis 불필요Unnecessary 어려움difficulty 간단simple 특이성Specificity 생성물 TmProduct Tm 서열order 서열order 용융 분석Melt analysis YesYes NoNo YesYes 다중 칼러 분석Multi color analysis NoNo YesYes YesYes

본 발명에 따르면, 시간, 온도 및 형광은 매 초다마 1-10회 얻을 수 있고, 온도 과정동안에 생성물 또는 프로브 하이브리드의 상세한 특징을 관찰한다. 이중-쇄-특이적인 DNA 염료로, 온도에 대한 생성물의 하이브리드를 이용하여, 용융 곡선에 의해 생성물을 확인한다. 또한, Tm이 다른 두 개 이상의 생성물의 다중 증폭에 의해 상대적인 생성물 정량화를 할 수 있다. 또한, 두 개이상의 생성물이 상이한 Tm를 가지면 공통 프라이머에 서열 내부에 변화를 주어 경쟁적인 PCR을 실행한다. 변성된 생성물을 신속하게 냉각하고, 재-어닐링 역학을 관찰하여 생성물을 절대적으로 정량화할 수 있다. 생성물 용융 곡선을 분석하여 반복 과정 수에 대한 형광을 플롯한 것으로 시작 주형의 감응성이 증가되어, 비특이적인 증폭과 곡선 피팅 알로리즘을 조절할 수 있다. 마지막으로, 변성 조건, 연장 시간, 생성물 수득율을 조절하기 위한 즉각적인 피이드백은 이중-쇄 특이적인 DNA 염료와 생성물의 쇄 상태를 모니터하여 수득할 수 있다.According to the present invention, time, temperature and fluorescence can be obtained 1-10 times every second and observe the detailed characteristics of the product or probe hybrid during the temperature process. With double-chain-specific DNA dyes, the product is identified by melting curve, using a hybrid of product to temperature. Relative product quantification can also be achieved by multiplexing amplification of two or more products with different Tm. In addition, if two or more products have different Tm, the common primer is changed inside the sequence to perform competitive PCR. The denatured product can be cooled quickly and the re-annealing kinetics can be observed to absolutely quantify the product. Analyzing the product melt curves and plotting the fluorescence for the number of replicates increases the sensitivity of the starting template, which can control nonspecific amplification and curve fitting algorithms. Finally, immediate feedback for controlling denaturation conditions, extension time, product yield can be obtained by monitoring the chain status of the double-chain specific DNA dyes and products.

온도 변환과정 동안에 형광으로 프로브 하이브리드를 모니터하는 능력이 강력한 도구가 될 수 있다. 본 발명은 PCR 동안에 서열-특이적인 감지 및 정량화를 위한 프로브 하이브리드(가수분해가 아님)에 따른 이중-색 형광 방법을 제공한다. 하이브리드 프로브의 어닐링 역학 및 용융은 형과단간에 엑소뉴클레아제 가수분해에 의존하는 프로브로는 이용할 수 없는 정보를 제공한다. 서열-특이적인 프로브 하이브리드를 지속적으로 모니터하는 것은 공명 에너지 전달에 의한 온도 변화에 따른다. 프로브 용융은 생성물의 서열 및 이에 상보적인 서열에 의해 결정된 특징적인 온도에서 발생된다. 본 발명은 두 가지 과정으로 설명을 하는데; (1) 두 가지 인접 하이브리드 프로브; (2) 라벨된 프라이머에 결합되는 단일 쇄 PCR 프로브에 하이브리드되는 한 개 라벨된 프로브. 서열-특이적인 프로브의 용융 온도는 PCR 동안에 생성물을 확인하고 구별한다. 단일 염기 돌연변이를 포함하는 DNA 다형성 또는 돌연변이를 프로브 Tm 이동에 의해 감지된다. 또한, 상이한 온도에서 각 생성물로부터 용융된 한 개 이상의 프로브와 적어도 다른 두 개의 상이한 생성물의 다중 증폭에 의해 상대적인 생성물의 증폭을 얻는다. 또한, 프라이머의 내부 서열을 변경하여 경쟁적인 PCR을 실행하는데, 한 개 이상의 프로브는 상이한 Tm에서 경쟁물질 및 고유 주형에 하이브리드된다. 또는, 상이한 형광단 가령, Cy5 또는 Cy5.5와 같은 것으로 라벨된 프로브의 여러 가지 색을 분석하여 상대적인 또는 경쟁적인 PCR을 실행한다. 생성물의 절대 농도는 프로브 어닐링 역학 분석에 의해 결정한다. 곡선을 만드는 알로리즘으로 변환 과정 수에 대한 형광을 플롯하여 시작 주형 복사체의 수를 결정한다.The ability to monitor probe hybrids with fluorescence during temperature conversion can be a powerful tool. The present invention provides a bi-color fluorescence method according to a probe hybrid (not hydrolysis) for sequence-specific detection and quantification during PCR. Annealing kinetics and melting of hybrid probes provide information not available with probes that rely on exonuclease hydrolysis between molds and stages. Continuous monitoring of sequence-specific probe hybrids is subject to temperature changes due to resonance energy transfer. Probe melting occurs at a characteristic temperature determined by the sequence of the product and the sequence complementary thereto. The invention is described in two processes; (1) two adjacent hybrid probes; (2) One labeled probe hybridized to a single chain PCR probe bound to the labeled primer. The melting temperature of sequence-specific probes identifies and distinguishes products during PCR. DNA polymorphisms or mutations comprising single base mutations are detected by probe Tm shift. Furthermore, relative amplification of the product is obtained by multiplexing the at least one probe and at least two different products melted from each product at different temperatures. In addition, competitive PCR is performed by altering the internal sequence of the primers, where one or more probes hybridize to the competitor and the native template at different Tm. Alternatively, different colors of probes labeled with different fluorophores such as Cy5 or Cy5.5 are analyzed to run relative or competitive PCR. The absolute concentration of the product is determined by probe annealing kinetics analysis. Plot the fluorescence against the number of conversion processes with an algorithm that creates a curve to determine the number of starting template copies.

한 개의 PCR 반응에서 여러 가지 반응을 원하는 경우에, 다중 생성물을 구별하기 위해 구별할 수 있는 방출 스펙트럼을 가지는 상이한 형광 라벨을 이용하여 실행한다. 이용할 수 있는 형광단 수를 제한하고 이용할 수 있는 이들 형광단의 방출 스펙트럼을 겹치면 분석이 복잡해진다. 용융 곡선과 생성물 또는 프로브 하이브리드 분석은 다중 PCR 생성물을 구별하는 또 다른 방법이 된다. 온도 변형과정동안에 하이브리드후에, 다중 생성물을 구별하기 위한 프로브의 수 또는 스펙트럼 색을 최소화한다. 본 발명은 본 발명의 특정 성질을 벗어나지 않고도 다른 특이적인 형으로 구체화할 수 있다. 여기에서 상술하는 구체예는 설명을 위함이고, 이에 제한하지 않는다. 따라서, 본 발명은 전술한 설명보다는 다음의 청구범위에 국한시킨다. 청구항에 있는 위미 및 이의 범위는 이들의 영역에 포함된다.If several reactions are desired in one PCR reaction, it is carried out using different fluorescent labels with distinguishable emission spectra to distinguish multiple products. Limiting the number of fluorophores available and overlapping the emission spectra of these fluorophores available complicates the analysis. Melt curves and product or probe hybrid assays are another way to distinguish multiple PCR products. After hybridization during the temperature transformation process, the number of probes or spectral colors to distinguish multiple products is minimized. The invention may be embodied in other specific forms without departing from the specific nature of the invention. Specific embodiments described herein are for the purpose of description, and not limitation. Accordingly, the invention is limited to the following claims rather than the foregoing description. The terminology and scope of the claims are within their scope.

용융 곡선 및 다른 분석을 위한 프로그램 코드는 다음 페이지에 이어진다.The program code for melt curves and other analysis is on the next page.

서열표 리스트Sequence Listing

(1)일반정보(1) General Information

(i)출원인; 위터, 칼 티(i) the applicant; Wyter, Cal Tee

리리 커크 엠Liri Kirk M

라스센, 랜디 피Rassen, Randy P

(ii) 발명의 명칭; PCR동안에 하이브리드 모니터하는 방법(ii) the name of the invention; How to monitor hybrid during PCR

(iii) 서열의 수; 27(iii) number of sequences; 27

(iv) 통신 주소(iv) communication address

(A) 주소: 토르프, 노스 & 웨스턴 일일피(A) Address: Torp, North & Western Daily

(B) 거리 : 사우스 700 이스트 9035, 슈이트 200(B) Street: South 700 East 9035, Suite 200

(C) 도시 : 샌디(C) City: Sandy

(D) 주 : 유타(D) State: Utah

(E) 나라 : USA(E) Country: USA

(F) 우편코드 : 84070(F) ZIP Code: 84070

(v) 컴퓨터 판독 형태(v) computer-readable form

(A)매체형태; 디스켓, 3.5인치, 1.44Mb 용량(A) medium form; Diskette, 3.5 in, 1.44 Mb Capacity

(B)컴퓨터; 도시바 T2150CDS(B) a computer; Toshiba T2150CDS

(C)작동시스템; 윈도우 95(C) the operating system; Windows 95

(D)소프트웨어; 워드 퍼펙트 7.0(D) software; Word Perfect 7.0

(vi) 현재 출원 데이터(vi) current application data

(A) 출원번호;(A) application number;

(B) 출원일자;(B) filing date;

(C) 분류(C) classification

(vii) 우선권 출원 데이터(vii) priority application data;

(A) 출원번호; US08/658,993(A) application number; US08 / 658,993

(B) 출원일자; 1996년 6월 4일(B) filing date; June 4, 1996

(vii) 우선권 출원 데이터(vii) priority application data;

(A) 출원번호; US08/818,267(A) application number; US08 / 818,267

(B) 출원일자; 1997년 5월 17일(B) filing date; May 17, 1997

(viii) 대리인 정보(viii) agent information

(A) 이름; 알란 제이. 하워드(A) name; Alan J. Howard

(B) 등록번호; 36,553(B) registration number; 36,553

(C) 서류 번호; 8618.CIP7(C) the document number; 8618.CIP7

(ix) 통신 정보(ix) communication information

(A) 전화번호; (801) 566-6633(A) a telephone number; (801) 566-6633

(B) 팩스번호; (801) 566-0750(B) a fax number; (801) 566-0750

(2)서열 1에 대한 정보(2) Information about sequence 1

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 20bp(A) length; 20 bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 1(xi) SEQ ID NO 1

CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT 20CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT 20

(2)서열 2에 대한 정보(2) Information about sequence 2

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 20bp(A) length; 20 bp

(B)형태; 핵산(B) form; Nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상;선형(D) phase; linear

(xi)서열 2(xi) SEQ ID NO: 2

AGAAGATGAG GCATAGCAGC 20AGAAGATGAG GCATAGCAGC 20

(2)서열 3에 대한 정보(2) Information about sequence 3

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 35bp(A) length; 35 bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 3(xi) SEQ ID NO 3

CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA 35CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA 35

(2)서열 4에 대한 정보(2) Information about sequence 4

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 30bp(A) length; 30 bp

(B)형태; 핵산(B) form; Nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 4(xi) SEQ ID NO: 4

AAGTCTGCCG TTACTGCCCT GTGGGGCAAG 30AAGTCTGCCG TTACTGCCCT GTGGGGCAAG 30

(2)서열 5에 대한 정보(2) Information about sequence 5

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 27bp(A) length; 27 bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 5(xi) SEQ ID NO: 5

TCTGCCGTTA CTGCCCTGTG GGGCAAG 27TCTGCCGTTA CTGCCCTGTG GGGCAAG 27

(2)서열 6에 대한 정보(2) Information about sequence 6

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 20bp(A) length; 20 bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 6(xi) SEQ ID NO: 6

CAACTTCATC CACGTNCACC 20CAACTTCATC CACGTNCACC 20

(2)서열 7에 대한 정보(2) Information about sequence 7

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 18bp(A) length; 18bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 7(xi) SEQ ID NO: 7

CTGTCCGTGA CGTGGATT 18CTGTCCGTGA CGTGGATT 18

(2)서열 8에 대한 정보(2) Information about sequence 8

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 18bp(A) length; 18bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 8(xi) SEQ ID NO: 8

AAGTCCTCCG AGTATAGC 18AAGTCCTCCG AGTATAGC 18

(2)서열 9에 대한 정보(2) Information about sequence 9

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 46bp(A) length; 46bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 9(xi) SEQ ID NO: 9

TAATCTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC GAGGAATACA GGTATT 46TAATCTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC GAGGAATACA GGTATT 46

(2)서열 10에 대한 정보(2) Information about sequence 10

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 46bp(A) length; 46bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 10(xi) SEQ ID NO: 10

TAATCTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AAGGAATACA GGTATT 46TAATCTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AAGGAATACA GGTATT 46

(2)서열 11에 대한 정보(2) Information about sequence 11

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 20bp(A) length; 20 bp

(B)형태; 핵산(B) form; Nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 11(xi) SEQ ID NO: 11

TAATCTGTAA GAGCAGATCC 20TAATCTGTAA GAGCAGATCC 20

(2)서열 12에 대한 정보(2) Information about sequence 12

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 20bp(A) length; 20 bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 12(xi) SEQ ID NO: 12

TGTTATCACA CTGGTGCTAA 20TGTTATCACA CTGGTGCTAA 20

(2)서열 13에 대한 정보(2) Information about sequence 13

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 23bp(A) length; 23bp

(B)형태; 핵산(B) form; Nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 13(xi) SEQ ID NO: 13

AATACCTGTA TTCCTCGCCT GTC 23AATACCTGTA TTCCTCGCCT GTC 23

(2)서열 14에 대한 정보(2) Information about sequence 14

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 20bp(A) length; 20 bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 14(xi) SEQ ID NO: 14

ATGCCTGGCA CCATTAAAGA 20ATGCCTGGCA CCATTAAAGA 20

(2)서열 15에 대한 정보(2) Information about sequence 15

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 20bp(A) length; 20 bp

(B)형태; 핵산(B) form; Nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 15(xi) SEQ ID NO: 15

GCATGCTTTG ATGACGCTTC 20GCATGCTTTG ATGACGCTTC 20

(2)서열 16에 대한 정보(2) Information about sequence 16

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 20bp(A) length; 20 bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 16(xi) SEQ ID NO: 16

CGGATCTTCT GCTGCCGTCG 20CGGATCTTCT GCTGCCGTCG 20

(2)서열 17에 대한 정보(2) Information about sequence 17

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 20bp(A) length; 20 bp

(B)형태; 핵산(B) form; Nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 17(xi) SEQ ID NO: 17

CCTCTGACGT CCATCATCTC 20CCTCTGACGT CCATCATCTC 20

(2)서열 18에 대한 정보(2) Information about sequence 18

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 31bp(A) length; 31bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 18(xi) SEQ ID NO: 18

GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA G 31GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA G 31

(2)서열 19에 대한 정보(2) Information about sequence 19

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 26bp(A) length; 26bp

(B)형태; 핵산(B) form; Nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 19(xi) SEQ ID NO: 19

CTGCCGTACT GCCCTGTGGG GCAAGG 26CTGCCGTACT GCCCTGTGGG GCAAGG 26

(2)서열 20에 대한 정보(2) Information about sequence 20

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 26bp(A) length; 26bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 20(xi) SEQ ID NO: 20

ATGCCCTCCC CCATGCCATC CTGCGT 26ATGCCCTCCC CCATGCCATC CTGCGT 26

(2)서열 21에 대한 정보(2) Information about sequence 21

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 20bp(A) length; 20 bp

(B)형태; 핵산(B) form; Nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 21(xi) SEQ ID NO: 21

CAACTTCATC CACGTTCACC 20CAACTTCATC CACGTTCACC 20

(2)서열 22에 대한 정보(2) Information about sequence 22

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 27bp(A) length; 27 bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 22(xi) SEQ ID NO: 22

GTCTGCCGTT ACTGCCCTGT GGGGCAA 27GTCTGCCGTT ACTGCCCTGT GGGGCAA 27

(2)서열 23에 대한 정보(2) Information about sequence 23

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 32bp(A) length; 32 bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 23(xi) SEQ ID NO: 23

CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT CC 32CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT CC 32

(2)서열 24에 대한 정보(2) Information about sequence 24

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 30bp(A) length; 30 bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 24(xi) SEQ ID NO: 24

GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA 30GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA 30

(2)서열 25에 대한 정보(2) Information about sequence 25

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 23bp(A) length; 23bp

(B)형태; 핵산(B) form; Nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 25(xi) SEQ ID NO: 25

TGAAGGAGAA GGTGTCTGCG GGA 23TGAAGGAGAA GGTGTCTGCG GGA 23

(2)서열 26에 대한 정보(2) Information about sequence 26

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 25bp(A) length; 25 bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 26(xi) SEQ ID NO: 26

CCTCGGCTAA ATAGTAGTGC GTCGA 25CCTCGGCTAA ATAGTAGTGC GTCGA 25

(2)서열 27에 대한 정보(2) Information about sequence 27

(i)서열특징(i) Sequence features

(A)길이; 20bp(A) length; 20 bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 27(xi) SEQ ID NO: 27

AGGACGGTGC GGTGAGAGTG 20AGGACGGTGC GGTGAGAGTG 20

Claims

생물학적 시료에서 표적 DNA 서열을 분석하는 방법에 있어서,A method of analyzing a target DNA sequence in a biological sample,

- 표적 서열의 인접 부분에 하이브리드할 수 있는 두 개의 핵산 프로브 존재 하에, 폴리메라제 연쇄 반응법에 의해 표적 서열을 증폭시키고, 이때 두 개의 프로브중 한 개는 수용 형광단으로 라벨링하고, 나머지 프로브는 형광 에너지 전달 쌍의 제공 형광단으로 라벨링하여 표적 서열과 두 개의 프로브가 하이브리드하는 동안에 제공 형광단과 수용 형광단은 서로 25개 뉴클레오티드안에 있고, 폴리메라제 연쇄 반응은 생물학적 시료에 표적이 되는 핵산 서열에 대한 프라이머와 열에 안정한 폴리메라제를 첨가하고, 변성 온도와 연장 온도사이에서 시료에 열 처리 변환하는 것으로 구성되고;In the presence of two nucleic acid probes capable of hybridizing to adjacent portions of the target sequence, the target sequence is amplified by polymerase chain reaction, where one of the two probes is labeled with a recipient fluorophore and the other probe is While the target sequence and the two probes hybridize by labeling the donor fluorophore of the fluorescent energy transfer pair, the donor fluorophore and the accepting fluorophore are within 25 nucleotides of each other, and the polymerase chain reaction is performed on the nucleic acid sequence targeted to the biological sample. Adding a primer and a heat stable polymerase to the sample, and heat-treating the sample between the denaturation temperature and the extension temperature;

- 제공 형광단에 의해 흡수되는 파장에서 빛으로 생물학적 시료를 여기시키고, 형광단 에너지 전달 쌍으로부터 발생되는 빛을 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.-Exciting the biological sample with light at a wavelength absorbed by the providing fluorophore, and sensing light generated from the fluorophore energy transfer pair.

생물학적 시료의 표적 DNA 서열을 분석하는 방법에 있어서,In a method of analyzing a target DNA sequence of a biological sample,

- 형광 에너지 전달 쌍으로부터 온도에 따른 형광을 모니터하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.-Monitoring the fluorescence with temperature from the fluorescence energy transfer pair.

제 1 항 또는 2 항에 있어서, 제공체와 수용체 형광단는 약 0-5개 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.3. The method of claim 1 or 2, wherein the donor and receptor fluorophores are separated by about 0-5 nucleotides.

제 3 항에 있어서, 제공체와 수용체 형광단는 약 0-2개 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.4. The method of claim 3, wherein the donor and receptor fluorophores are separated by about 0-2 nucleotides.

제 4 항에 있어서, 제공체와 수용체 형광단는 1개 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.5. The method of claim 4 wherein the donor and receptor fluorophores are separated by one nucleotide.

생물학적 시료에서 표적 핵산의 폴리메라제 연쇄 반응 증폭의 실제 시간을 모니터하는 방법에 있어서,A method of monitoring the actual time of amplification of a polymerase chain reaction of a target nucleic acid in a biological sample,

d) 시료의 형광 방출을 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.d) detecting the fluorescence emission of the sample.

제 6 항에 있어서, 시료에서 온도에따른 형광을 모니터하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.7. The method of claim 6, further comprising the step of monitoring fluorescence over temperature in the sample.

제 6 항에 있어서, 제공체 및 수용체 형광단은 서로 약 4-6개 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.7. The method of claim 6, wherein the donor and receptor fluorophores are separated by about 4-6 nucleotides of each other.

생물학적 시료의 표적이 되는 핵산 서열을 증폭시키는 개선된 방법에 있어서,In an improved method of amplifying a nucleic acid sequence targeted by a biological sample,

(iii) 감지된 형광에 따른 폴리메라제 연쇄 반응동안에 초기 온도와 시간 변수를 조정하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.(iii) adjusting the initial temperature and time variables during the polymerase chain reaction according to the detected fluorescence.

제 9 항에 있어서, 형광체는 이중 쇄 특이적인 핵산 결합 염료로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.10. The method of claim 9, wherein the phosphor consists of a double chain specific nucleic acid binding dye.

제 9 항에 있어서, 형광체는 표적이 되는 핵산에 하이브리드할 수 있는 형광 라벨된 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.10. The method of claim 9, wherein the phosphor consists of a fluorescently labeled oligonucleotide probe capable of hybridizing to the target nucleic acid.

제 9 항에 있어서, 형광체는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성되는데, 프로브중 하나는 형광 에너지 전달 쌍의 수용체 형광단으로 라벨되고, 다른 프로브는 형광 에너지 전달 쌍으로 라벨된 것을 특징으로 하는 방법.10. The method of claim 9, wherein the phosphor consists of a pair of oligonucleotide probes, one of which is labeled with a receptor fluorophore of a fluorescent energy transfer pair, and the other probe is labeled with a fluorescent energy transfer pair.

제 12 항에 있어서, 제공 형광단의 방출 스펙트럼과 수용 형광단의 흡수 스펙트럼의 겹치는 정도는 25%이하이고, 수용 형광단은 100,000M^-1㎝^-1의 흡광계수를 가지고, 두 개의 프로브가 하이브리드할 때, 제공 형광단과 수용 형광단은 서로 25개 뉴클레오티드범위내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 12, wherein the overlap between the emission spectrum of the provided fluorophore and the absorption spectrum of the receiving fluorophore is 25% or less, and the receiving fluorophore has an extinction coefficient of 100,000 M ⁻¹ cm ⁻¹ , and the two probes are hybrid Wherein the providing fluorophore and the receiving fluorophore are within 25 nucleotides of each other.

제 13 항에 있어서, 공명 에너지 전달 쌍은 제공체로 플로레신을, 수용체로 Cy5 또는 Cy5.5로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 13, wherein the resonance energy transfer pair consists of floresin as the donor and Cy5 or Cy5.5 as the acceptor.

생물학적 시료의 표적이 되는 핵산 서열을 감지하는 방법에 있어서,A method for detecting a nucleic acid sequence that is a target of a biological sample,

c) 생물학적 시료로부터 발생되는 형광을 측정하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.c) measuring fluorescence generated from the biological sample.

제 15 항에 있어서, 공명 에너지 전달 쌍의 제공자로는 플로레신으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.16. The method of claim 15, wherein the provider of the resonance energy transfer pair consists of floresin.

제 15 항에 있어서, 공명 에너지 전달 쌍의 수용자로는 Cy5 또는 Cy5.5로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 15, wherein the acceptor of the resonance energy transfer pair consists of Cy5 or Cy5.5.

제 15 항에 있어서, 제공체와 수용체 형광단은 표적이 되는 핵산 서열에 두 개의 프로브가 하이브리드할 때 서로 0-15개 뉴클레오티드범위내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.16. The method of claim 15, wherein the donor and receptor fluorophores are in the range of 0-15 nucleotides of each other when two probes hybridize to a target nucleic acid sequence.

제 18 항에 있어서, 제공체와 수용체 형광단은 서로 약 0-2개 뉴클레오티드범위내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 18, wherein the donor and receptor fluorophores are in the range of about 0-2 nucleotides of each other.

제 19 항에 있어서, 제공체와 수용체 형광단은 서로 1개 뉴클레오티드범위내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.20. The method of claim 19, wherein the donor and receptor fluorophores are within one nucleotide range of each other.

형광 에너지 전달 쌍은 플로레신으로 라벨된 제 1 프로브와 Cy5 또는 Cy5.5로 라벨된 제 2 프로브로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.The fluorescence energy transfer pair consists of a first probe labeled Floresin and a second probe labeled Cy5 or Cy5.5.

생물학적 시료에서 표적이 되는 핵산 서열의 폴리메라제 연쇄 반응을 모니터하는 방법에 있어서A method for monitoring polymerase chain reaction of a target nucleic acid sequence in a biological sample

- 형광 에너지 전달 쌍에서 나오는 온도에 따른 형광을 모니터 하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.Monitoring the fluorescence according to the temperature exiting the fluorescence energy transfer pair.

제 22 항에 있어서, 공명 에너지 전달 쌍은 제공체로는 플로레신이, 수용체로는 Cy5 또는 Cy5.5로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 22, wherein the resonance energy transfer pair consists of floresin as a donor and Cy5 or Cy5.5 as a receptor.

제 22 항에 있어서, 제공체와 수용체 형광단은 서로 약 0-5개 뉴클레오티드범위내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 22, wherein the donor and receptor fluorophores are in the range of about 0-5 nucleotides of each other.

제 22 항에 있어서, 제공체와 수용체 형광단은 서로 약 0-2개 뉴클레오티드범위내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 22, wherein the donor and receptor fluorophores are in the range of about 0-2 nucleotides of each other.

제 25 항에 있어서, 제공체와 수용체 형광단은 서로 1개 뉴클레오티드범위내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 25, wherein the donor and the receptor fluorophore are within one nucleotide range of each other.

제 22 항에 있어서, 모니터 단계는 표적이 되는 서열에서 융용되는 프라이머의 용융 프로파일을 결정하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 22, wherein the monitoring step consists in determining the melting profile of the primer melted in the target sequence.

생물학적 시료에서 표적 핵산의 폴리메라제 연쇄 반응 증폭의 실제 시간을 모니터 하는 방법에 있어서,A method of monitoring the actual time of amplification of a polymerase chain reaction of a target nucleic acid in a biological sample,

- SYBR^TMGreen I으로부터 나오는 온도에 따른 형광을 모니터하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.-Monitoring the fluorescence with temperature from SYBR ^™ Green I.

제 28 항에 있어서, 모니터 단계는 증폭된 표적 서열의 용융 프로파일을 결정하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.29. The method of claim 28, wherein the monitoring step consists in determining the melting profile of the amplified target sequence.

c) 제공 형광단이 흡수하는 선택된 파장의 빛을 생물학적 시료에 조사하고, 시료의 형광 방출을 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.c) irradiating the biological sample with light of a selected wavelength absorbed by the providing fluorophore and sensing the fluorescence emission of the sample.

제 30 항에 있어서, 시료의 온도에 따른 형광을 모니터하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.31. The method of claim 30, further comprising the step of monitoring fluorescence according to the temperature of the sample.

제 31 항에 있어서, 모니터 단계는 증폭된 표적 서열의 용융 프로파일을 결정하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.32. The method of claim 31, wherein the monitoring step consists in determining the melting profile of the amplified target sequence.

제 30 항에 있어서, 공명 에너지 전달 쌍은 제공체로는 플로레신이, 수용체로는 Cy5 또는 Cy5.5로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.31. The method of claim 30, wherein the resonance energy transfer pair consists of floresin as a donor and Cy5 or Cy5.5 as a receptor.

제 30 항에 있어서, 제공체와 수용체 형광단은 서로 약 4-6개 뉴클레오티드범위내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.31. The method of claim 30, wherein the donor and receptor fluorophores are in the range of about 4-6 nucleotides of each other.

제 2 핵산 서열과 비교를 할 때, 제 1 핵산에서 선택된 위치에 차이를 감지하는 방법에 있어서,A method for detecting a difference in a selected position in a first nucleic acid when compared with a second nucleic acid sequence,

f) 제 1 용융 프로파일과 제 2 용융 프로파일을 비교하여, 차이가 있는 경우에는 시료 핵산에 차이가 있다는 것을 나타내는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.f) comparing the first melt profile with the second melt profile to indicate that there is a difference in the sample nucleic acid, if any.

제 33 항에 있어서, 공명 에너지 전달 쌍은 제공체로는 플로레신이, 수용체로는 Cy5 또는 Cy5.5에서 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.34. The method of claim 33, wherein the resonance energy transfer pair is selected from floresin as the donor and Cy5 or Cy5.5 as the receptor.

제 35 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 프로브에 결합되고, 두 개의 프로브 모두가 선택된 단편의 증폭물 또는 이에 상응하는 단편의 증폭물에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 25개이하의 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.The donor and receptor of claim 35, wherein the donor and receptor are bound to a probe, and when both probes hybridize to an amplification of a selected fragment or an amplification of a corresponding fragment, the donor and receptor are less than about 25 nucleotides. Separated by residues.

제 37 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 프로브에 결합되고, 두 개의 프로브 모두가 선택된 단편의 증폭물 또는 이에 상응하는 단편의 증폭물에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 0-5개 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.The donor and receptor of claim 37, wherein the donor and receptor are bound to the probe, and when both probes hybridize to the amplification of the selected fragment or to the amplification of the corresponding fragment, the donor and receptor are about 0-5 nucleotides. Separated by residues.

제 38 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 프로브에 결합되고, 두 개의 프로브 모두가 선택된 단편의 증폭물 또는 이에 상응하는 단편의 증폭물에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 0-2개 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.The donor and receptor of claim 38, wherein the donor and receptor are bound to the probe, and when both probes hybridize to the amplification of the selected fragment or to the amplification of the corresponding fragment, the donor and receptor are about 0-2 nucleotides. Separated by residues.

제 39 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 프로브에 결합되고, 두 개의 프로브 모두가 선택된 단편의 증폭물 또는 이에 상응하는 단편의 증폭물에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 1개 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.The donor and receptor of claim 39, wherein the donor and receptor are bound to the probe, and when both probes hybridize to an amplification of the selected fragment or an amplification of the corresponding fragment, the donor and the receptor are at about 1 nucleotide residue. Separated by the method.

제 2 핵산에 비교하여 제 1 핵산에 선택된 위치에 차이를 감지하는 방법에 있어서;A method for detecting a difference in a selected position in a first nucleic acid compared to a second nucleic acid;

제 41 항에 있어서, 공명 에너지 전달 쌍은 제공체로는 플로레신이, 수용체로는 Cy5 또는 Cy5.5에서 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.42. The method of claim 41, wherein the resonance energy transfer pair is selected from floresin as the donor and Cy5 or Cy5.5 as the receptor.

제 41 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 프로브에 결합되고, 두 개의 프로브 모두가 선택된 단편의 증폭물 또는 이에 상응하는 단편의 증폭물에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 15개이하의 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.42. The donor and receptor of claim 41, wherein the donor and receptor are bound to the probe, and when both probes hybridize to the amplification of the selected fragment or to the amplification of the corresponding fragment, the donor and receptor are less than about 15 nucleotides. Separated by residues.

제 43 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 프로브에 결합되고, 두 개의 프로브 모두가 선택된 단편의 증폭물 또는 이에 상응하는 단편의 증폭물에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 4-6개 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.The donor and receptor of claim 43, wherein the donor and receptor are bound to a probe, and when both probes hybridize to an amplification of a selected fragment or an amplification of a corresponding fragment, the donor and receptor are about 4-6 nucleotides. Separated by residues.

개체의 게놈에서 선택된 위치에 이형접합성을 감지하는 방법에 있어서, 이때, 게놈은 돌연변이 대립형질과 이에 상응하는 기준 대립형질로 구성되고, 각각은 선택된 위치로 구성되고;A method for detecting heterozygosity at a selected location in a genome of an individual, wherein the genome consists of a mutant allele and a corresponding reference allele, each consisting of a selected location;

g) 제 1 용융 프로파일과 제 2 용융 프로파일을 비교하여, 차이가 있는 경우에는 시료 게놈 DNA에 이형접합성을 나타내는 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.g) comparing the first melt profile with the second melt profile to indicate heterozygosity in the sample genomic DNA, if any.

제 45 항에 있어서, 공명 에너지 전달 쌍은 제공체로는 플로레신이, 수용체로는 Cy5 또는 Cy5.5인 것을 특징으로 하는 방법.46. The method of claim 45, wherein the resonance energy transfer pair is floresin as a donor and Cy5 or Cy5.5 as a receptor.

제 45 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 프로브에 결합되고, 두 개의 프로브 모두가 선택된 제 1 증폭단편 또는 제 2 증폭단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 25개 이하 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.46. The donor and receptor of claim 45, wherein the donor and receptor are coupled to the probe, and when both probes hybridize to the selected first or second amplified fragment, the donor and receptor are separated by up to about 25 nucleotide residues. Characterized in that the method.

제 47 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 프로브에 결합되고, 두 개의 프로브 모두가 선택된 제 1 증폭단편 또는 제 2 증폭단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 0-5개 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.48. The method of claim 47, wherein the donor and the receptor are bound to the probe, and when both probes hybridize to the selected first or second amplified fragment, the donor and the receptor are joined by about 0-5 nucleotide residues. Characterized in that it is separate.

제 48 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 프로브에 결합되고, 두 개의 프로브 모두가 선택된 제 1 증폭단편 또는 제 2 증폭단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 0-2개 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.49. The donor and receptor of claim 48, wherein the donor and receptor are coupled to the probe, and when both probes hybridize to the selected first or second amplified fragment, the donor and receptor are selected by about 0-2 nucleotide residues. Characterized in that it is separate.

제 49 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 프로브에 결합되고, 두 개의 프로브 모두가 선택된 제 1 증폭단편 또는 제 2 증폭단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 1개 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.50. The method of claim 49, wherein the donor and receptor are coupled to the probe, and when both probes hybridize to the selected first or second amplified fragment, the donor and the receptor are separated by one nucleotide residue. Characterized in that the method.

개체의 게놈에서 선택된 위치에 이형접합성을 감지하는 방법에 있어서 이때, 게놈은 돌연변이 대립형질과 이에 상응하는 기준 대립형질로 구성되고, 각각은 선택된 위치로 구성되고;A method for detecting heterozygosity at a selected location in a genome of an individual, wherein the genome consists of the mutant allele and the corresponding reference allele, each consisting of the selected location;

g) 제 1 용융 프로파일과 제 2 용융 프로파일을 비교하여, 차이가 있는 경우에는 시료 게놈 DNA에 이형접합성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.g) comparing the first melt profile with the second melt profile and, if there is a difference, exhibits heterozygosity in the sample genomic DNA.

제 51 항에 있어서, 공명 에너지 전달 쌍은 제공체로는 플로레신이, 수용체로는 Cy5 또는 Cy5.5인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 51, wherein the resonance energy transfer pair is floresin as a donor and Cy5 or Cy5.5 as a receptor.

제 51 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 라벨된 프라이머와 프로브에 결합되고, 라벨된 프라이머와 프로브가 선택된 제 1 증폭단편 또는 제 2 증폭단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 15개 이하 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.53. The method of claim 51, wherein the donor and the receptor are bound to the labeled primers and probes, and when the labeled primers and probes hybridize to the selected first or second amplified fragments, the donors and receptors are about 15 or less. Separated by nucleotide residues.

제 53 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 라벨된 프라이머와 프로브에 결합되고, 라벨된 프라이머와 프로브가 선택된 제 1 증폭단편 또는 제 2 증폭단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 4-6개 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.54. The method of claim 53, wherein the donor and the receptor bind to labeled primers and probes, and when the labeled primers and probe hybridize to the selected first or second amplified fragment, the donor and receptor are about 4-6. And is separated by dog nucleotide residues.

폴리메라제 연쇄 반응 혼합물에서 폴리메라제 연쇄 반응의 완료를 결정하는 방법에 있어서, 이때 혼합물은 (1) 핵산, 핵산 또는 폴리메라제 연쇄 반응으로 증폭된 핵산으로 두 개의 별개 상보쇄로 구성되고; (2) 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 핵산의 선택된 부분을 증폭시켜, 증폭된 생성물을 만들 수 있도록 된 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머; (3) 폴리메라제 연쇄 반응을 촉매하는 DNA 폴리메라제로 구성되고;A method for determining completion of a polymerase chain reaction in a polymerase chain reaction mixture, wherein the mixture consists of (1) two distinct complementary chains of nucleic acid, nucleic acid or nucleic acid amplified by a polymerase chain reaction; (2) two oligonucleotide primers that are capable of amplifying selected portions of nucleic acids by polymerase chain reaction to produce amplified products; (3) consisting of a DNA polymerase that catalyzes the polymerase chain reaction;

(c) 하이브리드된 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드를 가지는 증폭된 생성물에 선택된 파장의 빛을 조사하여, 형광공명 에너지 전달 쌍에 의해 형광을 유도하고, 발생되는 형광을 모니터하고, 반응이 종료되었음을 나타내는 형광 발생이 평탄역상에 도달하였을 때 변환과정을 결정하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.(c) irradiating the amplified product having the hybridized probe and the reference oligonucleotide with light of a selected wavelength, inducing fluorescence by a fluorescence resonance energy transfer pair, monitoring the generated fluorescence, and generating fluorescence indicating that the reaction is completed. And determining the conversion process when this plateau is reached.

제 55 항에 있어서, 공명 에너지 전달 쌍은 제공체로는 플로레신이, 수용체로는 Cy5 또는 Cy5.5인 것을 특징으로 하는 방법.56. The method of claim 55, wherein the resonance energy transfer pair is floresin as a donor and Cy5 or Cy5.5 as a receptor.

제 9 항에 있어서, 폴리메라제 연쇄 반응의 총 열 변환과정의 수는 시료로부터 방출되는 형광을 모니터하고, 반응의 종료를 나타내는 형광 방출이 평탄부에 도달할 때, 과정 수를 측정하고, 평탄부에 도달하였을 때 반응을 종료시키는 것으로 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 9, wherein the total number of thermal conversion processes of the polymerase chain reaction monitors the fluorescence emitted from the sample, and when the fluorescence emission representing the end of the reaction reaches the flat portion, the number of processes is measured, Determining to terminate the reaction when the part is reached.

제 57 항에 있어서, 핵산-결합 형광 염료는 SYBR^TMGreen-1, 에티디움 브롬화물, 피코 그린, 아크리딘 오렌지, 티아졸 오렌지, YO-PRO-1, 크로모마이신 A3에서 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.The nucleic acid-binding fluorescent dye according to claim 57, wherein the nucleic acid-binding fluorescent dye is selected from SYBR ^™ Green-1, Ethidium bromide, Pico Green, Acridine Orange, Thiazole Orange, YO-PRO-1, Chromycin A3. How to.

제 9 항에 있어서, 폴리메라제 연쇄 반응의 온도변환 과정의 변수를 조절하는 추가 단계를 포함하는데, 이때 생물학적 시료의 열 변환 과정은 어닐링, 연장 및 변성의 반복 단계로 구서오디고, 핵산에 결합하는 형광은 이중 쇄-특이적인 형광 염료로 구성되고, 변환과정 변수는 어닐링 상의 기간, 변성 상의 기간, 변환과정 횟수로 구성되고,10. The method of claim 9, further comprising the step of adjusting the parameters of the temperature conversion process of the polymerase chain reaction, wherein the thermal conversion process of the biological sample is repeated with annealing, extension, and denaturation and binds to the nucleic acid. The fluorescence consists of a double chain-specific fluorescent dye, the conversion process variable consists of the period of the annealing phase, the period of denaturation phase, the number of conversion process,

(a) 형광 염료로부터 형광을 유도하기 위해 선택된 파장의 빛을 반응물에 조사하여, 형광 염료에 의해 형광을 유도하고. 반복되는 어닐링, 연장, 변성상동안에 지속적으로 형광을 모니터하고;(a) irradiating the reactants with light of a selected wavelength to induce fluorescence from the fluorescent dye to induce fluorescence with the fluorescent dye. Fluorescence is continuously monitored during repeated annealing, extension, denaturation phases;

(c) 연장 상동안에 형광의 증가가 중지되는 시간에 따른 연장 상의 길이, 변성 상동안에 형광이 기저선까지 감소되는 시간에 따른 변성 상의 길이 또는 연장 상동안에 미리 선택한 수준에 형광이 도달하는데 필요한 변환과정의 횟수에 따른 변환과정의 수를 조절하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.(c) the length of the extension phase over time when the increase in fluorescence ceases during the extension phase, the length of the denatured phase over time during which the fluorescence is reduced to the baseline during the denatured phase, or the conversion process required for fluorescence to reach a preselected level during the extension phase. Controlling the number of conversions according to the number of times.

제 59 항에 있어서, 핵산-결합 형광 염료는 SYBR^TMGreen-1, 에티디움 브롬화물, 피코 그린, 아크리딘 오렌지, 티아졸 오렌지, YO-PRO-1, 크로모마이신 A3에서 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.60. The method of claim 59, wherein the nucleic acid-binding fluorescent dye is selected from SYBR ^™ Green-1, ethidium bromide, pico green, acridine orange, thiazole orange, YO-PRO-1, chromomycin A3. How to.

선택된 폴리메라제 연쇄 반응 혼합물에서 증폭된 생성물의 농도를 결정하는 방법에 있어서;A method for determining the concentration of amplified product in a selected polymerase chain reaction mixture;

(c) 어닐링 속도와 이차 속도 상수로부터 증폭된 생성물의 농도를 계산하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.(c) calculating the concentration of amplified product from the annealing rate and the secondary rate constant.

제 61 항에 있어서, 어닐링 속도는 다중 증폭 과정후에 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.64. The method of claim 61, wherein the annealing rate is determined after the multiple amplification process.

증폭된 생성물의 농도를 결정하기 위해 증폭된 생성물의 이차 속도 상수를 결정하는 방법에 있어서,In the method of determining the second rate constant of the amplified product to determine the concentration of the amplified product,

- 최대 형광, 최소 형광, 최소 형광 시에 시간 등을 결정하기 위해 시간에 대해 형광을 플롯팅하고, 하기 수학식을 이용하여 농도를 알고 있는 증폭된 생성물에 대한 이차 속도 상수를 결정하고;Plot fluorescence over time to determine time at maximum fluorescence, minimum fluorescence, minimum fluorescence, etc., and determine the secondary rate constant for the amplified product of known concentration using the following equation;

이때, F는 형광이고, F_max는 최대 형광을 나타내고, F_min은 최소 형광을 나타내고, k는 이차 속도 상수이고, t_o는 F_min일 때 시간을 나타내고, [DNA]는 농도를 알고 있는 증폭된 생성물을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.Where F is fluorescence, F _max is maximum fluorescence, F _min is minimum fluorescence, k is secondary rate constant, t _o is time at F _min , and [DNA] is amplification with known concentration. Characterized in that it represents a processed product.

제 63 항에 있어서, 핵산-결합 형광 염료는 SYBR^TMGreen-1, 에티디움 브롬화물, 피코 그린, 아크리딘 오렌지, 티아졸 오렌지, YO-PRO-1, 크로모마이신 A3에서 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.64. The nucleic acid-binding fluorescent dye according to claim 63, wherein the nucleic acid-binding fluorescent dye is selected from SYBR ^™ Green-1, ethidium bromide, pico green, acridine orange, thiazole orange, YO-PRO-1, chromomycin A3. How to.

경쟁성 정량적인 폴리메라제 연쇄 반응에 의해 선택된 핵산의 농도를 결정하는 방법에 있어서,A method for determining the concentration of a selected nucleic acid by competitive quantitative polymerase chain reaction,

(d) 경쟁이 되는 주형의 양, 선택된 주형과 경쟁 주형간의 상대적인 양을 근거로 하여 선택된 주형의 농도를 계산하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.(d) calculating the concentration of the selected template based on the amount of the competing template and the relative amount between the selected template and the competing template.

제 65 항에 있어서, 기준 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍 중에 하나인 것을 특징으로 하는 방법.66. The method of claim 65, wherein the reference oligonucleotide is one of oligonucleotide primer pairs.

제 66 항에 있어서, 공명 에너지 전달 쌍은 제공체로는 플로레신이, 수용체로는 Cy5 또는 Cy5.5로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.67. The method of claim 66, wherein the resonance energy transfer pair consists of floresin as a donor and Cy5 or Cy5.5 as a receptor.

제 66 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드에 결합되고, 프로브와 올리고뉴클레오티드가 증폭단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 25개이하의 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.67. The method of claim 66, wherein the donor and the receptor are linked to the probe and the reference oligonucleotide, and when the probe and oligonucleotide hybridize to the amplification fragment, the donor and the receptor are separated by less than about 25 nucleotide residues. How to feature.

제 68 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드에 결합되고, 프로브와 올리고뉴클레오티드가 증폭단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 0-5개의 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.69. The method of claim 68, wherein the donor and the receptor are linked to the probe and the reference oligonucleotide, and when the probe and oligonucleotide hybridize to the amplification fragment, the donor and the receptor are separated by about 0-5 nucleotide residues. How to feature.

제 69 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드에 결합되고, 프로브와 올리고뉴클레오티드가 증폭단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 0-2개 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.70. The method of claim 69, wherein the donor and the receptor are linked to the probe and the reference oligonucleotide, and when the probe and oligonucleotide hybridize to the amplification fragment, the donor and the receptor are separated by about 0-2 nucleotide residues. How to feature.

제 70 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드에 결합되고, 프로브와 올리고뉴클레오티드가 증폭단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 1개의 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.71. The method of claim 70, wherein the donor and the receptor are linked to the probe and the reference oligonucleotide, and when the probe and oligonucleotide hybridize to the amplification fragment, the donor and the receptor are separated by about 1 nucleotide residue. How to.

제 65 항에 있어서, 기준 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 프라이머중의 하나가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.66. The method of claim 65, wherein the reference oligonucleotide is not one of the oligonucleotide primers.

제 72 항에 있어서, 공명 에너지 전달 쌍은 제공체로는 플로레신이, 수용체로는 Cy5 또는 Cy5.5로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.73. The method of claim 72, wherein the resonance energy transfer pair consists of floresin as a donor and Cy5 or Cy5.5 as a receptor.

제 73 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 프로브와 기준 올리고뉴클레오티드에 결합되고, 프로브와 올리고뉴클레오티드가 증폭단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 15개이하의 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.74. The method of claim 73, wherein the donor and the receptor are linked to the probe and the reference oligonucleotide, and when the probe and oligonucleotide hybridize to the amplification fragment, the donor and the receptor are separated by up to about 15 nucleotide residues. How to feature.

제 73 항에 있어서, 제공체 및 수용체는 프로브에 결합되고, 두 개의 프로브 모두가 선택된 단편의 증폭물 또는 이에 상응하는 단편의 증폭물에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 4-6개이하의 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.74. The method of claim 73, wherein the donor and the receptor are coupled to the probe, and when both probes hybridize to the amplification of the selected fragment or to the amplification of the corresponding fragment, the donor and the receptor are about 4-6 or less. And is separated by nucleotide residues of.

형광 공명 에너지 전달 쌍은 플로레신과 Cy5로 구성된 것을 특징으로 하는 형광 공명 에너지 전달 쌍.The fluorescence resonance energy transfer pair is a fluorescence resonance energy transfer pair, characterized in that consisting of Floresin and Cy5.

형광 공명 에너지 전달 쌍은 플로레신과 Cy5.5로 구성된 것을 특징으로 하는 형광 공명 에너지 전달 쌍.The fluorescence resonance energy transfer pair is a fluorescence resonance energy transfer pair, characterized in that consisting of Floresin and Cy5.5.

폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 핵산의 농도를 결정하는 방법에 있어서;A method for determining the concentration of a selected nucleic acid in a polymerase chain reaction;

(d) 기준 주형의 양, 기준 주형과 선택된 주형간의 상대적인 양을 근거로 하여 선택된 주형의 농도를 계산하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.(d) calculating the concentration of the selected template based on the amount of the reference template and the relative amount between the reference template and the selected template.

제 78 항에 있어서, 핵산-결합 형광 염료는 SYBR^TMGreen-1, 에티디움 브롬화물, 피코 그린, 아크리딘 오렌지, 티아졸 오렌지, YO-PRO-1, 크로모마이신 A3에서 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.79. The nucleic acid-binding fluorescent dye of claim 78 is selected from SYBR ^™ Green-1, ethidium bromide, pico green, acridine orange, thiazole orange, YO-PRO-1, chromomycin A3. How to.

양성 기준 주형을 포함하는 폴리메라제 연쇄 반응에서 선택된 핵산의 농도를 결정하는 방법에 있어서;A method for determining the concentration of a selected nucleic acid in a polymerase chain reaction comprising a positive reference template;

이때, 제 2 용융 곡선을 얻는다는 것은 폴리메라제 연쇄 반응이 작용했다는 것을 나타내고, 제 1 용융 곡선을 얻는다는 것은 선택된 제 1 단편이 증폭되었엄을 알리는 것이도, 제 1 용융 곡선이 없다는 것은 선택된 제 1 단편이 증폭되지 않았음을 나타내는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.At this time, obtaining the second melt curve indicates that the polymerase chain reaction has been performed, and obtaining the first melt curve indicates that the selected first fragment is amplified, but that there is no first melt curve is selected. And characterized in that the first fragment is not amplified.

제 80 항에 있어서, 핵산-결합 형광 염료는 SYBR^TMGreen-1, 에티디움 브롬화물, 피코 그린, 아크리딘 오렌지, 티아졸 오렌지, YO-PRO-1, 크로모마이신 A3에서 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.81. The method of claim 80, wherein the nucleic acid-binding fluorescent dye is selected from SYBR ^™ Green-1, Ethidium bromide, Pico Green, Acridine Orange, Thiazole Orange, YO-PRO-1, Chromycin A3 How to.

개체에서 V Leiden 돌연변이를 감지하는 방법에 있어서, 이때 V Leiden 돌연변이는 야생형과 비교를 하였을 때, 인자 V Leiden 돌연변이 위치에서 한 개의 염기가 변화된 것으로 구성되고;A method of detecting a V Leiden mutation in an individual, wherein the V Leiden mutation consists of a change in one base at the factor V Leiden mutation site when compared to the wild type;

(h) 야생형 게놈 DNA의 용융 프로파일에 대해 시료 게놈 DNA의 용융 프로파일을 비교하여, 차이가 있는 경우에는 시료 게놈 DNA에 인자 V Leiden 돌연변이가 존재함을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.(h) comparing the melting profile of the sample genomic DNA to the melting profile of the wild-type genomic DNA to indicate that there is a factor V Leiden mutation in the sample genomic DNA, if any.

제 82 항에 있어서, 전달 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍중에 하나인 것을 특징으로 하는 방법.83. The method of claim 82, wherein the delivery oligonucleotide is one of oligonucleotide primer pairs.

제 83 항에 있어서, 공명 에너지 전달 쌍은 플로레신과 Cy5 또는 Cy5.5로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.84. The method of claim 83, wherein the resonance energy transfer pair consists of floresin and Cy5 or Cy5.5.

제 84 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열 11과 서열 23인 것을 특징으로 하는 방법.85. The method of claim 84, wherein the oligonucleotide primers are SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 23.

제 85 항에 있어서, 서열 11은 Cy5 또는 Cy5.5로 라벨하는 것을 특징으로 하는 방법.86. The method of claim 85, wherein SEQ ID NO: 11 is labeled Cy5 or Cy5.5.

제 85 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열 13인 것을 특징으로 하는 방법.86. The method of claim 85, wherein the oligonucleotide probe is SEQ ID NO: 13.

제 85 항에 있어서, 서열 13은 플로레신으로 라벨을 하는 것을 특징으로 하는 방법.86. The method of claim 85, wherein SEQ ID NO: 13 is labeled with floresin.

제 82 항에 있어서, 공명 에너지 전달 제공체 및 수용체는 핵산 잔기에 결합되고, 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드가 증폭된 단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 15개이하의 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.83. The method of claim 82, wherein the resonant energy transfer donor and receptor are coupled to a nucleic acid residue, and when the probe and transfer oligonucleotide hybridize to an amplified fragment, the donor and receptor are separated by up to about 15 nucleotide residues. How to characterized.

제 89 항에 있어서, 공명 에너지 전달 제공체 및 수용체는 핵산 잔기에 결합되고, 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드가 증폭된 단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 4-6개이하의 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.90. The method of claim 89, wherein the resonant energy transfer donor and receptor are coupled to a nucleic acid residue, and when the probe and transfer oligonucleotide hybridize to the amplified fragment, the donor and receptor are joined by up to about 4-6 nucleotide residues. Characterized in that it is separate.

제 82 항에 있어서, 전달 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍중에 하나가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.83. The method of claim 82, wherein the delivery oligonucleotide is not one of the oligonucleotide primer pairs.

제 91 항에 있어서, 공명 에너지 전달 쌍은 플로레신과 Cy5 또는 Cy5.5로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.92. The method of claim 91, wherein the resonance energy transfer pair consists of floresin and Cy5 or Cy5.5.

제 92 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열 11과 서열 12인 것을 특징으로 하는 방법.93. The method of claim 92, wherein the oligonucleotide primers are SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12.

제 93 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 서열 13인 것을 특징으로 하는 방법.94. The method of claim 93, wherein the oligonucleotide is SEQ ID NO: 13.

제 94 항에 있어서, 서열 13은 플로레신으로 라벨된 것을 특징으로 하는 방법.95. The method of claim 94, wherein SEQ ID NO: 13 is labeled with floresin.

제 95 항에 있어서, 전달 올리고뉴클레오티드는 Cy5 또는 Cy5.5로 라벨하는 것을 특징으로 하는 방법.97. The method of claim 95, wherein the delivery oligonucleotide is labeled Cy5 or Cy5.5.

제 96 항에 있어서, 공명 에너지 전달 제공체 및 수용체는 핵산 잔기에 결합되고, 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드가 증폭된 단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 25개이하의 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.97. The method of claim 96, wherein the resonant energy transfer provider and receptor are bound to a nucleic acid residue, and when the probe and delivery oligonucleotide hybridize to an amplified fragment, the donor and receptor are separated by up to about 25 nucleotide residues. How to characterized.

제 97 항에 있어서, 공명 에너지 전달 제공체 및 수용체는 핵산 잔기에 결합되고, 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드가 증폭된 단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 0-5개이하의 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.98. The method of claim 97, wherein the resonant energy transfer donor and receptor are coupled to a nucleic acid residue, and when the probe and transfer oligonucleotide hybridize to an amplified fragment, the donor and receptor are joined by about 0-5 or less nucleotide residues. Characterized in that it is separate.

제 98 항에 있어서, 공명 에너지 전달 제공체 및 수용체는 핵산 잔기에 결합되고, 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드가 증폭된 단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 0-2개이하의 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.99. The method of claim 98, wherein the resonant energy transfer donor and receptor are coupled to the nucleic acid residue and when the probe and transfer oligonucleotide hybridize to the amplified fragment, the donor and receptor are joined by about 0-2 or less nucleotide residues. Characterized in that it is separate.

제 89 항에 있어서, 공명 에너지 전달 제공체 및 수용체는 핵산 잔기에 결합되고, 프로브와 전달 올리고뉴클레오티드가 증폭된 단편에 하이브리드할 때, 제공체와 수용체는 약 1개의 뉴클레오티드 잔기에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.90. The method of claim 89, wherein the resonant energy transfer provider and receptor are bound to nucleic acid residues, and when the probe and transfer oligonucleotide hybridize to an amplified fragment, the donor and receptor are separated by about 1 nucleotide residue. How to feature.

제 82 항에 있어서, 용융 프로파일에 차이가 있는 것은 열 처리 변환 과정에 적어도 2℃ 차이가 있는 것을 특징으로 하는 방법.83. The method of claim 82, wherein the difference in melt profile is at least 2 ° C. difference in the heat treatment conversion process.

서열 11의 핵산 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드.An oligonucleotide having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11.

서열 12의 핵산 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드.Oligonucleotide having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 12.

서열 13의 핵산 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드.An oligonucleotide having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13.

핵산 하이브리드 반응을 분석하는 방법에 있어서;A method of analyzing a nucleic acid hybrid reaction;

(b) 초당 ≥0.1℃ 이상의 속도로 온도를 변화시키면서 형광을 모니터 하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.(b) monitoring the fluorescence while varying the temperature at a rate of ≧ 0.1 ° C. or more per second.

제 105 항에 있어서, 핵산 결합 형광은 SYBR^TMGreen I인 것을 특징으로 하는 방법.107. The method of claim 105, wherein the nucleic acid binding fluorescence is SYBR ^™ Green I.

제 105 항에 있어서, 핵산 결합 형광은 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성되는데, 이때 프로브중 하나는 형광 공명 에너지 전달 쌍의 제공체로 라벨이 되고, 다른 하나는 수용체로 라벨되는 것을 특징으로 하는 방법.107. The method of claim 105, wherein the nucleic acid binding fluorescence consists of a pair of oligonucleotide probes, wherein one of the probes is labeled with a provider of a fluorescence resonance energy transfer pair and the other is labeled with a receptor.

제 107 항에 있어서, 프로브중 하나는 폴리메라제 연쇄 반응 증폭을 위한 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법.107. The method of claim 107, wherein one of the probes is a primer for amplifying the polymerase chain reaction.

양을 모르는 핵산을 포함하는 시료에서 시작 복사체의 수를 정량화하는 방법에 있어서;A method of quantifying the number of starting copies in a sample comprising an unknown nucleic acid;

(e) (c)단계에서 결정된 반응식으로부터 초기 핵산 농도를 결정하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.(e) determining the initial nucleic acid concentration from the scheme determined in step (c).

제 109 항에 있어서, 프로브중 하나는 증폭용 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법.109. The method of claim 109, wherein one of the probes is a primer for amplification.

형광 공명 에너지 전달 쌍에 있어서, 이때 쌍은 방출 스펙트럼을 가지는 제공자 형광단과 흡수 스펙트럼을 가지는 수용자 형광단으로 구성되고, 100,000M^-1㎝^-1의 흡광계수를 가지고, 이때 제공자 형광단의 방출 스펙트럼과 수용자 형광단의 흡수 스펙트럼의 겹치는 정도는 25%이하인 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 형광 공명 에너지 전달 쌍.For a fluorescence resonance energy transfer pair, the pair consists of a donor fluorophore having an emission spectrum and an acceptor fluorophore having an absorption spectrum, having an extinction coefficient of 100,000 M ⁻¹ cm ⁻¹ , wherein The fluorescence resonance energy transfer pair, characterized in that the overlap of the absorption spectrum of the receptor fluorophore is composed of 25% or less.

제 111 항에 있어서, 형광 공명 에너지 전달 쌍에서 제공자 형광단은 플로레신이고, 수용자 형광단은 Cy5 또는 Cy5.5 인 것을 특징으로 하는 형광 공명 에너지 전달 쌍.112. The fluorescence resonance energy transfer pair of claim 111, wherein the donor fluorophore in the fluorescence resonance energy transfer pair is floresin and the acceptor fluorophore is Cy5 or Cy5.5.

생물학적 시료에서 표적 DNA 서열을 분석하는 방법에 있어서;A method of analyzing a target DNA sequence in a biological sample;

- 시료의 온도가 변화될 때, 핵산 결합 형광물질로부터 온도에 따른 형광 방출을 모니터하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.-Monitoring the fluorescence emission with temperature from the nucleic acid binding fluorescent substance when the temperature of the sample changes.

제 113 항에 있어서, 핵산 결합 형광물질은 이중-쇄 핵산 결합 형광 염료인 것을 특징으로 하는 방법.115. The method of claim 113, wherein the nucleic acid binding fluorescent substance is a double-chain nucleic acid binding fluorescent dye.

제 114 항에 있어서, SYBR^TMGreen I와 같은 이중 쇄 핵산 결합 형광물질로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.117. The method of claim 114, wherein the method consists of a double stranded nucleic acid binding fluorescent substance, such as SYBR ^™ Green I.

제 115 항에 있어서, 온도에 따른 형광 변화는 이용하여 증폭된 생성물을 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.118. The method of claim 115, wherein the fluorescence change with temperature is used to identify the amplified product.

제 116 항에 있어서, 증폭된 생성물은 용융 곡선의 분석으로 확인되는 것을 특징으로 하는 방법.118. The method of claim 116, wherein the amplified product is identified by analysis of the melting curve.

제 117 항에 있어서, 두 개 이상의 증폭된 생성물의 상대적인 양은 용융 곡선을 분석하여 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.118. The method of claim 117, wherein the relative amounts of the two or more amplified products are determined by analyzing the melt curve.

제 117 항에 있어서, 용융 곡선 아래 면적은 다중 가우스함수의 비-선형 최소 자승 회귀분석의 합으로 알 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.118. The method of claim 117, wherein the area under the melting curve is determined by the sum of non-linear least-squares regression of multiple Gaussian functions.

생물학적 시료에서 표적 핵산 서열을 분석하는 방법에 있어서,A method of analyzing a target nucleic acid sequence in a biological sample,

- 시료의 온도가 변화될 때, 핵산 결합 형광물질로부터 온도에 따른 형광 방출을 모니터하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법Monitoring the fluorescence emission with temperature from the nucleic acid binding fluorescent substance when the temperature of the sample changes.

제 120 항에 있어서, 핵산 결합 형광물질은 이중-쇄 핵산 결합 형광 염료인 것을 특징으로 하는 방법.121. The method of claim 120, wherein the nucleic acid binding fluorescent substance is a double-chain nucleic acid binding fluorescent dye.

제 121 항에 있어서, SYBR^TMGreen I와 같은 이중 쇄 핵산 결합 형광물질로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.126. The method of claim 121, wherein the method consists of a double stranded nucleic acid binding fluorescent substance, such as SYBR ^™ Green I.

제 122 항에 있어서, 온도에 따른 형광 변화는 이용하여 증폭된 생성물을 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.123. The method of claim 122, wherein the fluorescence change with temperature is used to identify the amplified product.

제 123 항에 있어서, 증폭된 생성물은 용융 곡선의 분석으로 확인되는 것을 특징으로 하는 방법.126. The method of claim 123, wherein the amplified product is identified by analysis of a melting curve.

제 124 항에 있어서, 두 개 이상의 증폭된 생성물의 상대적인 양은 용융 곡선을 분석하여 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.124. The method of claim 124, wherein the relative amounts of the two or more amplified products are determined by analyzing the melt curve.

제 124 항에 있어서, 용융 곡선 아래 면적은 다중 가우스함수의 비-선형 최소 자승 회귀분석의 합으로 알 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.124. The method of claim 124, wherein the area under the melting curve is determined by the sum of non-linear least-squares regression of multiple Gaussian functions.