KR20000010981A - Anti-human mp52 monoclonal antibody - Google Patents

Abstract

PURPOSE: A mouse anti-human MP52 monoclonal antibody is provided to be combined to a dimeric human MP52 while not combined to a monomeric human MP52. CONSTITUTION: A mouse anti-human MP52 monoclonal antibody which binds to dimeric human MP52 but not to monomeric human MP52. This mouse monoclonal antibody comprising IgG and having a high specificity can be obtained by sensitizing mice with human MP52 (CHO-MP52) produced in CHO cells and human MP52 (rhMP52) produced in Escherichia coli. This antibody is useful in, for example, purifying or assaying human MP52 produced by genetic engineering techniques.

Description

사람 ＭＰ52에 대한 모노클로날 항체Monoclonal antibodies against human MP52

사람 MP52는 TGF-β 유전자 슈퍼 패밀리에 속하는 뼈 형성 관련 인자로서 1994년에 cDNA가 처음 단리되었다 (Biochem. Biophy. Res. Comm. Vol. 204, No. 2, 1994). 사람 MP52는 N말단에 알라닌이 있는 120의 아미노산 잔기로 이루어지는 단백질로 생각되며, 그 아미노산 서열은 WO 93/16099, WO 95/04819에 기재되어 있다. MP52가 다른 뼈 형성 인자와 마찬가지로 뼈 형성과 관련되어 있다는 것은 여러 동물 실험에서 확실해졌다. 그러나, 뼈 형성시에 직접적으로 무엇에 의해 MP52가 유도되고, 어떠한 메카니즘으로 뼈 형성을 이룰 수 있는가는 아직 불명확한 것이 많고, 그에 대한 보고도 적다.Human MP52 was first isolated in 1994 as a bone formation related factor belonging to the TGF-β gene superfamily (Biochem. Biophy. Res. Comm. Vol. 204, No. 2, 1994). Human MP52 is thought to be a protein consisting of 120 amino acid residues with alanine at the N-terminal, the amino acid sequences of which are described in WO 93/16099, WO 95/04819. It has been evident in several animal experiments that MP52, like other bone formation factors, is involved in bone formation. However, it is still unclear what causes MP52 to be induced directly at the time of bone formation and the mechanism by which bone formation can be achieved, and there are few reports.

또, 마우스 MP52는 사람의 MP52와 비교할 때 N 말단측의 아미노산이 한군데만이 다르고, 종을 넘어 강하게 보존된 유전자로부터 유래하기 때문에, 예를 들어, 마우스에서 사람 MP52에 대한 항체를 얻는 것은 용이하지 않다. 마우스 모노클로날 항체를 얻는 것은 이미 WO 93/16099에 기재되어 있다.In addition, since mouse MP52 has only one amino acid at the N-terminal side when compared to human MP52, and is derived from a strongly conserved gene across species, it is not easy to obtain an antibody against human MP52 in, for example, a mouse. not. Obtaining mouse monoclonal antibodies is already described in WO 93/16099.

<발명의 개시><Start of invention>

본 발명의 목표는, 다이머형의 사람 MP52에는 결합하지만 모노머형 사람 MP52에는 결합하지 않는 사람 MP52에 대한 마우스 모노클로날 항체를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a mouse monoclonal antibody against human MP52 that binds to dimeric human MP52 but not to monomeric human MP52.

사람 MP52를 유전공학적으로 제조하는 것이 시도되고 있다. 사람 MP52를 코딩하는 cDNA를 삽입한 숙주 세포를 배양하여 생산된 사람 MP52를 정제하는 경우, 사람 MP52와 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 사용하여 정제하는 것은 유효한 방법이다. 즉, 사람 MP52에 특이적인 모노클로날 항체를 담체에 담지시키고, 여기에 대강 정제된 MP52를 접촉시켜 사람 MP52를 결합시켜 단리하고, 그 후, 사람 MP52를 분리시킨다. 이 경우, 활성을 가진 다이머형의 MP52를 단리하기 위해서는 다이머형의 사람 MP52에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 사용하는 것이 유리하다는 것은 확실하다.Genetic engineering of human MP52 has been attempted. When purifying human MP52 produced by culturing a host cell into which a cDNA encoding human MP52 is inserted, purification using a monoclonal antibody that specifically binds to human MP52 is an effective method. That is, a monoclonal antibody specific for human MP52 is supported on a carrier, the purified MP52 is then contacted to bind the human MP52, and the human MP52 is isolated. In this case, in order to isolate the active dimeric MP52, it is clear that it is advantageous to use a monoclonal antibody that specifically binds to the dimeric human MP52.

이 사람 MP52에 대한 모노클로날 항체는, 사람 MP52 정량에 사용할 수 있다. 사람 MP52를 정량하는 것은 MP52 유도 인자의 해명 및 뼈 형성 메카니즘 해석에 유용하다. 이 경우, 다이머형의 MP52는 생체 내에서 분해 대사되어 활성이 없는 모노머 혹은 그 단편이 될 가능성이 있다. 다이머형 MP52에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 사용함으로써 활성을 가진 다이머형 MP52만을 검출하는 것이 가능해진다.This monoclonal antibody to human MP52 can be used for quantifying human MP52. Quantifying human MP52 is useful for the elucidation of MP52 inducers and for the interpretation of bone formation mechanisms. In this case, the dimeric MP52 may be decomposed and metabolized in vivo to become an inactive monomer or fragment thereof. By using a monoclonal antibody that specifically binds to dimer MP52, it becomes possible to detect only active dimer MP52.

또한, 본 발명은 사람 MP52의 생물 활성 부위에 결합하는 항체를 제공한다. 즉, 사람 MP52와 그 수용체의 결합을 저해하는 사람 MP52에 대한 마우스 모노클로날 항체를 제공하는 것이다. 이것은 MP52의 고차 구조를 특이적으로 인식하고, 사람 MP52의 활성 부위에 결합하여 그 활성을 저해하는 것이다. 사람 MP52의 활성 부위를 인식하는 항체이기 때문에, 다이머형의 MP52라도 불활성의 것이 존재했을 경우에는 그것을 인식하지 못한다. 이것은 분리, 정량에 사용했을 경우에 확실한 이점이 된다.The present invention also provides an antibody that binds to a biologically active site of human MP52. In other words, it provides a mouse monoclonal antibody against human MP52 that inhibits the binding of human MP52 and its receptor. This specifically recognizes the higher order structure of MP52 and binds to and inhibits the activity of the active site of human MP52. Since it is an antibody which recognizes the active site of human MP52, even if an inactive thing exists even in dimer type MP52, it is not recognized. This is a clear advantage when used for separation and quantification.

본 발명의 마우스 모노클로날 항체는 공지된 모노클로날 항체의 제법에 준하여 다음 공정에 따라 제조된다.The mouse monoclonal antibody of the present invention is prepared according to the following process according to the known monoclonal antibody production method.

(1) 사람 MP52를 면역원으로 하여 마우스를 장기간 감작하고,(1) a mouse was sensitized for a long time using human MP52 as an immunogen,

(2) 감작 마우스의 지라 세포와 마우스 골수종 세포를 세포 융합하고,(2) cell fusion of splenocytes and mouse myeloma cells of sensitized mice;

(3) 얻어진 하이브리도마로부터 사람 MP52에 대한 모노클로날 항체를 생산하고 있는 하이브리도마를 스크리닝하고,(3) Screening hybridomas producing monoclonal antibodies against human MP52 from the obtained hybridomas,

(4) 목적으로 하는 항체 생산 하이브리도마를 클로닝하고,(4) cloning the desired antibody-producing hybridoma;

(5) 클론화한 세포를 대량 배양하여 항체를 생산시키거나, 클론화된 세포를 마우스의 복강중에 이식함으로써 항체를 생산시키고,(5) mass production of cloned cells to produce antibodies, or the production of antibodies by transplanting the cloned cells in the abdominal cavity of the mouse,

(6) 배양상층물의 항체 혹은 복수중(腹水中)의 항체를 분리, 정제함으로써 조제한다.(6) It prepares by isolate | separating and refine | purifying the antibody of the culture supernatant, or the antibody in multiple.

상술한 공정을 더욱 상세히 설명하겠다.The above-described process will be described in more detail.

공정(1)의 면역 감작 마우스의 제작은, 사람 MP52를 용해시킨 10 mM 염산 수용액을 프로인트의 완전 보조제 (CFA)와 혼합, 유화시켜 에멀젼을 얻고, 이를 4개월간 4회의 빈도로 몇차례 마우스의 복강내에 투여한다. MP52의 함유량은 10에서 100 ㎍으로 하는 것이 적당하다. 그 후, 약 1개월 간격을 두고 10에서 100 ㎍의 사람 MP52를 포함하는 용액을 프로인트의 불완전 보조제 (IFA)로 동일하게 유화시킨 것을 복강내에 투여한다. 이와 같이 보조제와 함께 사람 MP52로 계속 감작시킨 마우스에, 다시 1에서 2개월 간격을 두고 보조제없이 10 내지 100 ㎍의 사람 MP52를 피하 투여하고, 다시 세포 융합의 며칠전에 10 내지 100 ㎍의 사람 MP52를 꼬리 정맥에서 투여하는 것이 바람직하다.In the preparation of the immunosensitized mouse of step (1), an aqueous 10 mM hydrochloric acid solution in which human MP52 was dissolved was mixed and emulsified with Freund's complete adjuvant (CFA) to obtain an emulsion. Administration intraperitoneally. The content of MP52 is appropriately set to 10 to 100 µg. Thereafter, the same emulsified solution of Freund's Incomplete Adjuvant (IFA) containing 10 to 100 μg of human MP52 at about one month interval is administered intraperitoneally. Thus, mice continually sensitized with human MP52 with adjuvant were subcutaneously administered 10-100 μg human MP52 without adjuvant at intervals of 1 to 2 months, and again 10-100 μg human MP52 a few days before cell fusion. Administration in the tail vein is preferred.

숙주로서 CHO 세포와 같은 동물 세포 및 대장균과 같은 세균을 사용하고, 사람 MP52를 코딩하는 cDNA가 삽입된 발현 벡터를 상기 숙주에 도입하여 사람 MP52를 생산하려는 시도가 계속되고 있다. 본 발명자들은 CHO 세포에서 생산된 사람 MP52 (이하, CHO-MP52라고 약칭) (사람 MP52 생산 동물주 MC-2는 1995년 6월 21일 통상 산업성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소 (일본국이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1방 3고)에 기탁 번호 FERM BP-5142로서 국제 기탁됨) 및 대장균에서 생산된 사람 MP52 (이하, rhMP52라고 약칭) (사람 MP52의 발현 벡터는 1995년 4월 14일 통상 산업성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소(일본국 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시1쪼메 1방 3고)에 기탁 번호 FERM BP-5499로서 국제 기탁됨)의 각각을 단독으로 감작원으로 사용하여 모노클로날 항체를 생산하는 것을 시도하였다. 그런데, 얻어진 항체는 모두 IgM이고, 특이성이 낮은 것밖에 얻지 못하였다. 그러나, CHO-MP52와 rhMP52 모두를 감작원으로 사용함으로써 IgG로 이루어지는 특이성이 큰 모노클로날 항체를 얻는 것에 성공하였다.Attempts have been made to produce human MP52 by using animal cells, such as CHO cells, and bacteria, such as E. coli, as a host, and introducing expression vectors into which the cDNA encoding human MP52 is inserted. The inventors of the present invention describe human MP52 produced in CHO cells (hereinafter, abbreviated as CHO-MP52) (human MP52 producing animal MC-2) on June 21, 1995. Internationally deposited as deposit No. FERM BP-5142 in Tsukubashi Higashi, 1 room, 3 rooms), and human MP52 produced by Escherichia coli (hereinafter abbreviated to rhMP52) (expression vector of human MP52 is 14 April 1995). Normally, each of the Ministry of Trade, Industry and Technology Institute of Biotechnology Industrial Technology Research Institute (Int'l Deposit No. FERM BP-5499, deposited in 1 room, 3 rooms in Higashi, Tsukuba City, Ibaraki, Japan) was used as a sensitizer alone. Tried to produce raw antibody. By the way, all the obtained antibodies were IgM and only the low specificity was obtained. However, by using both CHO-MP52 and rhMP52 as a sensitizer, it was successful to obtain a monoclonal antibody having a high specificity composed of IgG.

공정(2)의 세포 융합은, 우선 공정(1)에서 충분히 면역 감작된 마우스의 지라를 적출하고, 통상적인 방법으로 지라 세포의 현탁액을 조제한다. 이어서, 얻어진 지라 세포와 마우스 골수종 세포를 혼합한 것을 따뜻한 폴리에틸렌글리콜로 융합 처리한다. 융합 처리 후, 세포 혼합물을 태송아지 혈청 (FCS), HAT (히포크산틴(H), 아미노프테린 (A), 티미딘 (T))를 배지에 첨가한 것을 사용하여 비융합 세포를 제거한다. 저농도 (1웰 중에 1 클론이 증식할 수 있는 농도)로 96웰 플레이트에 분리 주사하고, 증식을 확인할 수 있는 웰의 상층물을 1주 후에 채취한다.In the cell fusion of the step (2), first, the spleen of the mouse sufficiently immunosensitized in the step (1) is removed, and a suspension of the spleen cells is prepared in a conventional manner. Subsequently, a mixture of the obtained spleen cells and mouse myeloma cells is fused with warm polyethylene glycol. After the fusion treatment, the non-fused cells are removed by adding the calf serum (FCS), HAT (hippoxanthin (H), aminopterin (A), thymidine (T)) to the medium. . The cells are separated and injected into 96-well plates at low concentration (concentration of 1 clone in 1 well), and the supernatant of the wells capable of confirming proliferation is collected after 1 week.

공정(3)의 상층물 중에 생산된 항사람 MP52항체의 분석은, 면역원인 사람 MP52를 코팅한 96웰 플레이트를 사용하여 통상의 ELISA법에 따라 행할 수 있다. 모노머형 사람 MP52에는 결합하지 않지만 다이머형 사람 MP52에는 결합하는 사람 MP52를 선택하기 위해서 (1) 미처리 (비환원) 다이머형 사람 MP52 (D- rhMP52)와 (2) 환원화 모노머형 사람 MP52 (M-rhMP52)를 사용하는 두개의 ELISA를 조합한다. 이 때, 환원 상태의 모노머 분자는 플레이트에 코팅할 때, 용이하게 다이머를 형성하기 때문에 코팅에 사용하는 모노머는 통상적인 방법으로 술폰화하여, 다이머 분자의 재구성이 일어나지 않도록 처리했다. 또한, 모노머형 사람 MP52와 다이머형 사람 MP52로의 반응성은 웨스턴 블롯법에 의해 그 특이성을 확인한다. 그 결과, M-rhMP52 또는 D-rhMP52 중 어느 하나에 강하게 반응하는 모노클로날 항체와 양자에 반응하는 모노클로날 항체를 얻을 수 있었다.Analysis of the anti-human MP52 antibody produced in the supernatant of step (3) can be carried out according to a conventional ELISA method using a 96-well plate coated with human MP52 as an immunogen. (1) untreated (non-reducing) dimer type MP52 (D-rhMP52) and (2) reducing monomer type human MP52 (M) -combine two ELISAs using rhMP52). At this time, since the monomer molecules in the reduced state easily form a dimer when the plate is coated on the plate, the monomer used for the coating is sulfonated by a conventional method, and the reconstituted dimer molecule is treated so as not to occur. In addition, the reactivity with monomeric human MP52 and dimeric human MP52 confirms its specificity by Western blot method. As a result, a monoclonal antibody that strongly reacts with either M-rhMP52 or D-rhMP52 and a monoclonal antibody that reacts with both were obtained.

모노클로날 항체의 특이성은 웨스턴 블롯법에 의해서도 확인할 수 있다. 즉, rhMP52를 비환원 조건 (D-rhMP로서 영동된다)과 환원 조건 (M-rhMP로서 영동된다)에서 SDS-PAGE를 행하고, 표준 방법에 의해 니트로셀룰로오스막으로 옮긴다. rhMP52가 옮겨진 니트로셀룰로오스막과 모노클로날 항체가 함유된 배양 상층물을 인큐베이션시킨 후, HRPO 표지 토끼 항마우스 면역 글로블린 항체로 검출한다. 그 결과는 ELISA를 통한 제1차 스크리닝의 결과와 일치하였다.Specificity of the monoclonal antibody can also be confirmed by Western blot method. In other words, rhMP52 is subjected to SDS-PAGE under non-reducing conditions (phorized as D-rhMP) and reducing conditions (phorized as M-rhMP), and transferred to the nitrocellulose membrane by standard methods. The culture supernatant containing the nitrocellulose membrane to which rhMP52 was transferred and the monoclonal antibody were incubated and then detected by HRPO-labeled rabbit anti-mouse immunoglobulin antibody. The results were consistent with the results of the first screening by ELISA.

그 외에 ELISA법에서 반응시키는 항원으로서, 사람 MP52와 유사 물질인 TGF-β2 및 BMP-2를 사용해도 특이성을 확인할 수 있다. 얻어진 모노클로날 항체 중 어느 하나도 TGF-β2 및 BMP-2와는 교차 반응하지 않았다.In addition, specificity can also be confirmed by using TGF-β2 and BMP-2, which are analogous to human MP52, as the antigen to be reacted by the ELISA method. None of the obtained monoclonal antibodies cross reacted with TGF-β2 and BMP-2.

공정(4)의 클로닝 조작은 한계 희석법에 의해 1웰에 0.5개의 세포가 들어가도록 분리 주사함으로써 행한다.The cloning operation of step (4) is carried out by separating and injecting 0.5 cells into one well by the limiting dilution method.

공정(5)는 공지된 방법에 따라서 행할 수 있다. 클론화된 하이브리도마를 통상의 배지에서 배양하고 그 배양상층물로부터 항체를 얻는 경우에 비해서, 하이브리도마를 마우스 복강내에 이식함으로써 수백배에서 수천배의 농도로 항체를 회수할 수 있다.The step (5) can be performed according to a known method. Compared to the case where the cloned hybridomas are cultured in a conventional medium and antibodies are obtained from the culture supernatant, the antibodies can be recovered at a concentration of several hundred to several thousand times by transplanting the hybridomas into the mouse abdominal cavity.

공정(6)은 공지된 방법에 따라서 행할 수 있다. 단백질 A 혹은 단백질 G를 사용한 친화성 크로마토그래피를 사용할 수 있다.The step (6) can be performed according to a known method. Affinity chromatography using Protein A or Protein G can be used.

본 발명의 모노클로날 항체의 특징은 다음과 같이 요약할 수 있다.The characteristics of the monoclonal antibodies of the present invention can be summarized as follows.

(1) 다이머형 MP52에 결합한다.(1) It is attached to the dimer type MP52.

(2) 모노머형 MP52에 결합하지 않는다.(2) It does not bind to monomer type MP52.

(3) H쇄의 서브 클래스는 γ이다.(3) The subclass of the H chain is γ.

(4) TGF-β 유전자 슈퍼 패밀리에 속하는 다른 뼈 형성 인자, 특히 아미노산 서열이 유사한 TGF-β 및 BMP-2와는 교차 반응하지 않는다.(4) It does not cross react with other bone forming factors belonging to the TGF-β gene superfamily, especially TGF-β and BMP-2, which have similar amino acid sequences.

본 발명의 모노클로날 항체를 사용하는 사람 MP52의 정제는 종래의 방법에 의해 행할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를, 예를 들어 세파덱스 (Pharmacia 제품)와 같은 흡착제에 흡착시킨다. 대강 정제된 사람 MP52 용액을 상기 흡착제로 통과시켜 사람 MP52를 흡착시킨다. 이어서, 흡착된 사람 MP52를 통상의 방법에 의해 적당한 용출액으로 처리하면 순도가 높은 사람 MP52를 얻을 수 있다.Purification of human MP52 using the monoclonal antibody of the present invention can be carried out by a conventional method. The monoclonal antibodies of the invention are adsorbed to an adsorbent such as, for example, Sephadex (Pharmacia). Roughly purified human MP52 solution is passed through the adsorbent to adsorb human MP52. Subsequently, when the adsorbed human MP52 is treated with a suitable eluate by a conventional method, a highly purified human MP52 can be obtained.

정제된 모노클로날 항체(aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22의 20종류)와, 각각을 HRPO 표지를 한 모노클로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA법에 의해 항체의 타입 (type)을 분류(군 분류)할 수 있다.Purified monoclonal antibodies (aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22, 20 Types) and the types of antibodies can be classified (group classification) by a sandwich ELISA method using monoclonal antibodies each labeled with an HRPO.

그 결과, rhMP52 분자상의 에피토프를 식별할 수 있는 10종류의 항체가 있는 것을 알았다. 이들을 타입 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J로 분류하였다.As a result, it was found that there are 10 types of antibodies that can identify epitopes on rhMP52 molecules. These were classified into types A, B, C, D, E, F, G, H, I and J.

래트 골아(骨芽) 세포주 ROB/C26은 사람 MP52의 수용체를 갖고 있는 것이 알려져 있고, 배양액 중에 MP52를 첨가하면 알칼리 포스파타제 (ALP)의 활성이 상승한다. 이 배양계에 얻어진 모노클로날 항체를 첨가하고, 이들이 ALP 활성을 억제하면 사람 MP52의 생물학적 활성을 저해하는 것으로 평가할 수 있다.It is known that the rat osteoblast cell line ROB / C26 has a receptor for human MP52, and the activity of alkaline phosphatase (ALP) increases when MP52 is added to the culture. If monoclonal antibodies obtained in this culture system are added and they inhibit ALP activity, it can be evaluated to inhibit the biological activity of human MP52.

결과적으로 aMP-4, 5, 8, 11 및 21에 강한 저해 활성이 확인되었다. 이 중, aMP-4 및 aMP-5는 D-rhMP52에 특이적으로 반응하는 항체이고, 실질적으로 MP52가 MP52의 수용체와 결합하는 것을 생리학 조건하에서 저해하는 모노클로날 항체라고 생각된다.As a result, strong inhibitory activity was confirmed for aMP-4, 5, 8, 11 and 21. Among these, aMP-4 and aMP-5 are antibodies that specifically respond to D-rhMP52, and are considered to be monoclonal antibodies that substantially inhibit the binding of MP52 to the receptor of MP52 under physiological conditions.

본 발명의 모노클로날 항체를 사용하는 사람 MP52의 정량은 공지된 ELISA법 등을 응용함으로써 정량할 수 있다. 그 구체예는 본 명세서의 실시예에도 기재되어 있다. 사람 MP52를 42.4 pg/ml 정도의 감도로 정량할 수 있다.Quantification of human MP52 using the monoclonal antibody of the present invention can be quantified by applying a known ELISA method or the like. Specific embodiments are also described in the Examples herein. Human MP52 can be quantified with a sensitivity of about 42.4 pg / ml.

본 발명은 사람 MP52에 대한 신규한 마우스 모노클로날 항체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 다이머형 사람 MP52에는 결합하지만 모노머형 사람 MP52에는 결합하지 않는, 사람 MP52에 대한 마우스 모노클로날 항체에 관한 것이다.The present invention relates to novel mouse monoclonal antibodies against human MP52. More specifically, the present invention relates to mouse monoclonal antibodies against human MP52 that bind to dimeric human MP52 but not to monomeric human MP52.

또한 본 발명은, 상기 사람 MP52에 대한 마우스 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 (hybridoma) 및 그 이용에 관한 것이다.The present invention also relates to hybridomas producing the mouse monoclonal antibodies against human MP52 and their use.

도 1은 참고예 1(2)에서 얻어진 rhMP52의 발현 벡터(pKOT245)의 플라스미드 지도이다.1 is a plasmid map of the expression vector (pKOT245) of rhMP52 obtained in Reference Example 1 (2).

도 2는 CHO-MP52 발현 벡터 pMSS99 (5.0 kb)의 플라스미드 지도이다. pMSS99에서의 CHO-MP52 DNA 염기 서열은 서열목록의 서열 번호 4로 나타낸 576번째에서 2279번째의 뉴클레오티드이다.2 is a plasmid map of the CHO-MP52 expression vector pMSS99 (5.0 kb). The CHO-MP52 DNA nucleotide sequence in pMSS99 is the 576th to 2279th nucleotides represented by SEQ ID NO: 4 in Sequence Listing.

도 3은 모노머형 rhMP52 (A) 및 다이머형 rhMP52 (B)와 rhMP52에 대한 모노클로날 항체 반응성의 웨스턴 블롯 해석도의 사진이다.3 is a photograph of a Western blot analysis of monoclonal antibody reactivity against monomeric rhMP52 (A) and dimeric rhMP52 (B) and rhMP52.

도 4는 모노클로날 항체의 이동성 (타입)을 조사했을 때의 도면이다. 예로서, aMP-1 및 aMP-4를 코팅한 것을 나타낸다.It is a figure when the mobility (type) of monoclonal antibody was investigated. By way of example, aMP-1 and aMP-4 are coated.

도 5는 모노클로날 항체를 사용하여 MP52의 정량 곡선을 나타낸 도면이다.FIG. 5 shows quantitative curves of MP52 using monoclonal antibodies. FIG.

<발명을 실시하기 위한 최량의 형태><Best Mode for Carrying Out the Invention>

이하에 참고예 및 실시예를 들어 본 발명을 설명하겠다.The present invention will be described below with reference to examples and examples.

<참고예 1> rhMP52의 조제Reference Example 1 Preparation of rhMP52

1. 발현 벡터의 제작1. Construction of Expression Vectors

(1) rhMP52 성숙형 부분의 단리(1) Isolation of the rhMP52 mature part

사람 MP52cDNA는 WO 93/16099에 기재된 cDNA를 포함한 플라스미드 벡터(pSK52s)를 주형 DNA로 사용하여, 성숙형 부분만을 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해 증폭하였다.Human MP52cDNA was amplified via polymerase chain reaction (PCR) using only the plasmid vector (pSK52s) containing cDNA described in WO 93/16099 as template DNA.

문헌 (M. Nobuhara 등, Agric. Biol. Chem., 52(6), 1331 내지 1338, 1988)에 기재된 단백질 생산성 증가 방법에 따라서, 성숙형의 MP52 유전자의 일부 DNA를, DNA 서열에 코딩된 아미노산 서열은 변화시키지 않으면서 개시 코돈 ATG 주변의 AT 함량을 높이는 고안된 DNA 서열로 치환시켰다.According to the method for increasing protein productivity described in M. Nobuhara et al., Agric. Biol. Chem., 52 (6), 1331 to 1338, 1988, some DNAs of mature MP52 genes are amino acids encoded in DNA sequences. The sequence was replaced with a designed DNA sequence that increased the AT content around the start codon ATG without changing it.

치환 방법은 서열 번호 2의 상류 PCR 플라이머를 사용하여 PCR법으로 행하였다. PCR 플라이머의 DNA 서열은 상류 플라이머로서 서열 번호 2, 및 하류 플라이머로서 서열 번호 3에 기재한 DNA를 사용하였다.Substitution was carried out by PCR using an upstream PCR primer of SEQ ID NO: 2. The DNA sequence of the PCR primers used the DNA set forth in SEQ ID NO: 2 as the upstream primer and SEQ ID NO: 3 as the downstream primer.

PCR은, 같은 시험관안에서 주형 DNA (10 ng), 순방향 및 역방향 PCR 플라이머 각각 50 pmol, dNTP(0.2 mmol), 및 MgCl₂(1.5 mmol)을 Taq DNA 중합효소 (5 U)와 함께 첨가함으로써 행하였다.PCR was performed by adding template DNA (10 ng), 50 pmol, dNTP (0.2 mmol), and MgCl ₂ (1.5 mmol) with Taq DNA polymerase (5 U), respectively, in the same in vitro. It was.

각 사이클이 변성(94 ℃, 1분간), 플라이머-어닐링(55 ℃, 1분간), 및 플라이머 신장(72 ℃, 2분간)으로 이루어지는 30 사이클의 PCR를 행하였다(이하의 PCR은 모두 이 조건에서 행하였다).Each cycle was subjected to 30 cycles of PCR consisting of denaturation (94 ° C. for 1 minute), primer-annealing (55 ° C. for 1 minute), and stretcher extension (72 ° C. for 2 minutes). Under these conditions).

PCR 반응에서의 생성물을 1.5 % 저융점 아가로스(FMC사)중에서 전기 영동시켜 분리하고, 서열 번호 1의 아미노산 서열에 상당하는 약 360 bp로 이루어지는 DNA를 잘라내었다(이것을 단편(1)이라고 한다).The product from the PCR reaction was separated by electrophoresis in 1.5% low melting agarose (FMC), and DNA of about 360 bp corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was cut out (this is called fragment (1)). .

(2) 본 단백질의 대장균 발현 벡터의 제작(2) Preparation of E. coli expression vector of the present protein

박테리아 하나당 플라스미드의 복제수를 높이기 위해서 복제 개시점을 pBR계에서 pUC계로 바꾸었다. 시판되고 있는 대장균 발현 벡터 pKK223-3 (파마시아·바이오텍 가부시끼가이샤로부터 구입)의 tac 프로모터 영역을 제한 효소 SspI와 EcoRI로 소화한 후, 뭉 빈 뉴클레아제 (Mung Bean Nuclease; 다까라 슈조 가부시끼가이샤, 카탈로그 번호 2420A)로 처리하고, 단편 1의 개시 코돈측에 T4 DNA 리가아제 (다까라 슈조 가부시끼 가이샤, 카탈로그 번호 2011A)로 라이게이션시키고, pKK223-3의 rrnBT₁T₂종결 영역을 제한 효소 SaII와 SspI로 소화하고, SaII로 소화한 단편 1의 종지 코돈측에 라이게이션시키고, 이를 pUC18 벡터의 SmaI 부위에 라이게이션시킴으로써, 본 단백질의 생산을 위한 발현 벡터 (pKOT245; 기탁 번호 FERM BP-5499)(도 1)를 제작하였다. pKOT245의 DNA 길이는 3.7 kb이다. 제작한 본 단백질 발현 벡터는 파마시아 (Pharmacia) ALF DNA 시퀀서에 의해 그 염기 서열을 결정하였다.The replication initiation point was changed from pBR to pUC to increase the number of copies of the plasmid per bacteria. After digesting the tac promoter region of a commercially available E. coli expression vector pKK223-3 (purchased from Pharmacia Biotech Co., Ltd.) with restriction enzymes SspI and EcoRI, Mung Bean Nuclease (Takara Shuzo Corp.) , Catalog number 2420A), and the initiation codon side of fragment 1 was ligated with T4 DNA ligase (Takara Shuzo Co., Ltd., catalog number 2011A), and the rrnBT ₁ T ₂ termination region of pKK223-3 was restricted. Expression vector for production of the present protein (pKOT245; Accession No. FERM BP-5499) by digesting with SaII and SspI, ligating to the end codon side of fragment 1 digested with SaII, and ligating to the SmaI site of the pUC18 vector. (FIG. 1) was produced. The DNA length of pKOT245 is 3.7 kb. The nucleotide sequence of the produced protein expression vector was determined by Pharmacia ALF DNA sequencer.

(3) 형질 전환(3) transformation

형질 전환은 염화 루비듐 형질전환법 (Kushner 등, Genetic Engineering, p.17, Elsevier(1978))에 따랐다. 즉, pKOT245를 숙주 대장균 W3110M으로 상기의 수법에 따라서 이입하고, 본 단백질 생산 대장균으로 하였다.Transformation was followed by rubidium chloride transformation (Kushner et al., Genetic Engineering, p. 17, Elsevier (1978)). That is, pKOT245 was introduced into the host E. coli W3110M according to the above-described method, and thus the protein-producing E. coli was obtained.

2. 배양2. Culture

(1) 배양(1) culture

본 단백질 발현 대장균를 변형 SOC 배지 (박토 트립톤 20 g/L, 박토 효모 추출물 5 g/L, NaCl 0.5 g/L, MgCl₂·6H₂O 2.03 g/L, 포도당 3.6 g/L)에서 전배양하고, 생산용 배지 (박토 트립톤 5 g/L, 시트르산 4.3 g/L, K₂HPO₄4.675 g/L, KH₂PO₄1.275 g/L, NaCl 0.865 g/L, FeSO₄·7H₂O 100 mg/L, CuSO₄·5H₂O 1 mg/L, MnSO₄·nH₂O 0.5 mg/L, CaCl₂·2H₂O 2 mg/L, Na₂B₄O₇·10H₂O 0.225 mg/L, (NH₄)6Mo₇O₂₄0.1 mg/L, ZnSO₄·7H₂O 2.25 mg/L, CoCl₂·6H₂O 6 mg/L, MgSO₄·7H₂O 2.2 g/L, 티아민 HCl 5.0 mg/L, 포도당 3 g/L) 5 L를 박테리아 현탁액 100 ml으로 접종하고, 10 L의 발효조에서 통기 교반하면서 배양하고, 대수 증식 전기(OD₅₅₀= 5.0)에 달한 단계에서 1 mM의 농도로 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드를 첨가하고, 다시 OD₅₅₀이 150에 달할 때까지 배양하였다. 배양 중, 온도는 32 ℃, pH는 암모니아를 첨가함으로써 7.15로 제어하고, 용존 산소 농도의 저하를 방지하기 위해서 교반 속도를 높임으로써 공기 포화의 50 %로 용존 산소 농도를 제어하였다. 또, 높은 균체 농도로 하기 위해서, 용존 산소 농도의 급격한 상승을 지표로 하여 50 % 포도당 용액을 0.2 %농도로 첨가하면서 배양하였다.This protein expressing Escherichia coli was precultured in modified SOC medium (20 g / L of Bacterial Tryptone, 5 g / L of Bacterial Yeast Extract, 0.5 g / L of NaCl, 2.03 g / L of MgCl ₂ · 6H ₂ O, 3.6 g / L of Glucose) And medium for production (bacto tryptone 5 g / L, citric acid 4.3 g / L, K ₂ HPO ₄ 4.675 g / L, KH ₂ PO ₄ 1.275 g / L, NaCl 0.865 g / L, FeSO ₄ · 7H ₂ O 100 mg / L, CuSO ₄ · 5H ₂ O 1 mg / L, MnSO ₄ · nH ₂ O 0.5 mg / L, CaCl ₂ · 2H ₂ O 2 mg / L, Na ₂ B ₄ O ₇ · 10H ₂ O 0.225 mg / L, (NH ₄ ) 6 Mo ₇ O ₂₄ 0.1 mg / L, ZnSO ₄ 7H ₂ O 2.25 mg / L, CoCl ₂ 6H ₂ O 6 mg / L, MgSO ₄ 7H ₂ O 2.2 g / L, thiamine 5 L of HCl 5.0 mg / L, glucose 3 g / L) were inoculated with 100 ml of the bacterial suspension, incubated with aeration and stirring in a 10 L fermenter, and 1 mM at a stage reaching logarithmic growth (OD ₅₅₀ = 5.0). Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside was added at the concentration and cultured again until OD ₅₅₀ reached 150. During the incubation, the temperature was controlled to 32 ° C. and the pH to 7.15 by adding ammonia, and the dissolved oxygen concentration was controlled to 50% of air saturation by increasing the stirring rate in order to prevent a decrease in the dissolved oxygen concentration. In addition, in order to make high cell concentration, 50% glucose solution was added at 0.2% concentration with the rapid rise of dissolved oxygen concentration as an index.

(2) 대장균 봉입체의 조제(2) Preparation of Escherichia coli inclusion body

상기 방법에 의해 얻어진 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 10 mM 에틸렌디아민 사아세트산을 함유하는 25 mM 트리스-HCl 완충액을 (pH 7.3)으로 현탁하고 균체 파쇄 장치 (APV Gaulin Inc. 제품)를 사용하여 세균을 파쇄하고 다시 원심분리하여 봉입체를 포함하는 침전물을 회수하였다.The cells obtained by the above method were centrifuged to recover the cells, and 25 mM Tris-HCl buffer containing 10 mM ethylenediamine tetraacetic acid was suspended with (pH 7.3) and a cell disruption apparatus (manufactured by APV Gaulin Inc.) was used. The bacteria were crushed and centrifuged again to recover precipitates containing inclusion bodies.

3. 정제3. Tablet

(1) 대장균 봉입체의 가용화(1) Solubilization of Escherichia Coli Inclusion Body

대장균 봉입체를 1 % 트리톤 X-100으로 3회 세척한 후, 3000 x g으로 30분간, 4 ℃로 원심분리하고 얻어진 침전물을 20 mM 트리스-HCl 완충액, pH 8.3, 8 M 요소, 10 mM DTT, 1 mM EDTA로 초음파를 가하면서 가용화하였다.The E. coli inclusions were washed three times with 1% Triton X-100, then centrifuged at 3000 xg for 30 minutes at 4 ° C. and the resulting precipitate was washed with 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.3, 8 M urea, 10 mM DTT, 1 Solubilization with sonication with mM EDTA.

(2) 모노머 정제(2) monomer purification

그 가용화액을 20000 x g으로 30분간, 4 ℃로 원심분리하고 그 상층물을 회수하였다. 얻어진 상층물을 20 mM 트리스-HCl 완충액, pH 8.3, 6 M 요소, 1 mM EDTA로 평형화한 SP-세파로오즈 FF (Pharmacia 제품)를 통과시킨 후 같은 용액으로 세척한 후, 0.5 M 식염을 포함하는 같은 용액으로 용출시켰다. 용출액에 Na₂SO₃과 Na₂S₄O₆를 각각 최종 농도가 111 mM, 13 mM가 되도록 첨가하고 4 ℃에서 15시간 술폰화하였다. 술폰화 용액을 20 mM 트리스-HCl 완충액, pH 8.3, 6 M 요소, 0.2 M 식염, 1 mM EDTA로 평형화한 세파크릴 S-200 (Pharmacia 제품)으로 겔 여과하고, 단일 술폰화된 본 단백질 모노머를 얻었다.The solubilized solution was centrifuged at 20000 xg for 30 minutes at 4 DEG C and the supernatant was recovered. The resulting supernatant was passed through SP-Sepharose FF (Pharmacia), equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.3, 6 M urea, 1 mM EDTA, washed with the same solution, followed by 0.5 M saline. Eluted with the same solution. Na ₂ SO ₃ and Na ₂ S ₄ O ₆ were added to the eluate so that their final concentration was 111 mM and 13 mM, respectively, and sulfonated at 4 ° C. for 15 hours. The sulfonated solution was gel filtered with Sephacryl S-200 (Pharmacia) equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.3, 6 M urea, 0.2 M salt, 1 mM EDTA, and a single sulfonated main protein monomer was obtained. Got it.

(3) 리폴딩(3) refolding

술폰화된 본 단백질 모노머 용액에 9배량의 50 mM Na-글리신 완충액 pH 9.8, 1 M 염화나트륨, 30 mM CHAPS, 5 mM EDTA, 2 mM GSH (환원형 글루타티온), 1 mM GSSG (산화형 글루타티온)를 첨가한 후, 3일간 4 ℃로 교반하여 본 발명의 단백질을 리폴딩시켰다.In a sulfonated protein monomer solution, 9 times of 50 mM Na-glycine buffer pH 9.8, 1 M sodium chloride, 30 mM CHAPS, 5 mM EDTA, 2 mM GSH (reduced glutathione), 1 mM GSSG (oxidized glutathione) After addition, the protein of the invention was refolded by stirring at 4 ° C. for 3 days.

(4) 다이머 정제(4) dimer tablets

리폴딩된 MP52를 0.05 % TFA 함유 25 % 아세토니트릴로 평형화시켜 둔 역상 HPLC의 리소스 (RESOURCE) RPC 칼럼 (Pharmacia 제품)에 통과시켜 0.05 % TFA 함유 25 내지 45 % 아세토니트릴 선형 구배에 의해 용출하였다. 용출액은 흡광도 광도계를 사용하여 280 nm의 흡광도에 의해 모니터하였다. MP52 다이머 분획을 회수하고, 동결 건조하였다. 이것을 20 mM 트리스-인산 완충액 (pH 8.0), 8 M 요소, 1 M 식염으로 평형화해 둔 세파크릴 S-200으로 겔 여과시킨 후, 본 단백질 다이머 분획을 상술한 것과 동일한 조건으로 역상 HPLC의 리소스 RPC 칼럼을 통과시켜 정제된 본 단백질 다이머 분획을 얻었다.The refolded MP52 was eluted by a 25-45% acetonitrile linear gradient containing 0.05% TFA by passing through a RESOURCE RPC column (Pharmacia) of reversed phase HPLC equilibrated with 25% acetonitrile containing 0.05% TFA. The eluate was monitored by absorbance at 280 nm using an absorbance photometer. MP52 dimer fractions were recovered and lyophilized. This was gel filtered with Sephacryl S-200 equilibrated with 20 mM Tris-Phosphate buffer (pH 8.0), 8 M urea, 1 M saline, and the protein dimer fraction was then subjected to reverse RPC resource RPC in reverse phase HPLC. Passing through the column yielded the purified present protein dimer fraction.

(5) 정제된 본 단백질의 물리 화학적 성질의 측정(5) Determination of Physicochemical Properties of Purified Protein

(가) N말단 아미노산 서열 분석(A) N-terminal amino acid sequence analysis

상기에서 얻어진 정제된 본 단백질에 대해서, N말단 아미노산 서열을 아미노산 시퀀서, 모델 476A(어플라이드 바이오 시스템즈사)에 의해 분석했더니, 서열목록 서열 번호 1로 표시한 N말단에서 30번째까지의 아미노산 서열이 확인되었다.About the purified this protein obtained above, the N terminal amino acid sequence was analyzed by the amino acid sequencer, model 476A (Applied Biosystems, Inc.), and the amino acid sequence from the N terminal to the 30th amino acid shown by SEQ ID NO: 1 is identified. It became.

(나) 아미노산 조성 분석(B) amino acid composition analysis

상기에서 얻어진 정제된 본 단백질의 아미노산 조성을 아미노산 분석기 (PICO TAG 시스템 (워터즈사 제품))에 의해 조사하였다. 그 결과를 표 1에 나타냈다. 표에 나타낸 수는 1 모노머당의 아미노산 잔기수를 나타낸다.The amino acid composition of the purified present protein obtained above was examined by an amino acid analyzer (PICO TAG system (manufactured by Waters)). The results are shown in Table 1. The numbers shown in the table indicate the number of amino acid residues per monomer.

아미노산amino acid 실측값Actual value 기대값Expected value AsxAsx 11.511.5 1212 GlxGlx 10.910.9 1111 SerSer 8.48.4 99 GlyGly 4.34.3 44 HisHis 4.04.0 44 ArgArg 7.77.7 77 ThrThr 5.45.4 66 AlaAla 7.37.3 77 ProPro 10.210.2 1010 TyrTyr 2.92.9 33 ValVal 5.75.7 77 MetMet 5.15.1 44 1/2Cys1 / 2Cys 2.62.6 77 IieIie 4.94.9 66 LeuLeu 10.010.0 1010 PhePhe 4.04.0 44 LysLys 5.95.9 66 TrpTrp -- 22 서열의 길이Sequence length 119119 -: 검출 불가능-: Not detectable

(다) 전기 영동에 의한 분석(C) analysis by electrophoresis

상기에서 얻어진 정제된 본 단백질의 분자량을 비환원 조건하의 SDS-PAGE 전기영동에 의해 확인했더니 약 28 KDa의 분자량을 나타냈다.The molecular weight of the purified present protein obtained above was confirmed by SDS-PAGE electrophoresis under non-reducing conditions, and showed a molecular weight of about 28 KDa.

상기 (가), (나) 및 (다)로 표시된 결과로부터 본 단백질은 N말단이 단일하게 Pro로부터 시작되는 119 잔기로 이루어지는 단백질인 것을 알았다.From the results indicated by (A), (B) and (C), it was found that the protein was a protein consisting of 119 residues whose N-terminals started from Pro alone.

<참고예 2> CHO-MP52의 제조Reference Example 2 Preparation of CHO-MP52

(1) CHO-MP52의 발현 벡터 제작(1) Preparation of expression vector of CHO-MP52

바이오팜 게엠베하 (Biopharm GmbH)의 회텐 박사 (Dr. Hoetten)에게서 제공받은 사람 MP52 유전자를 포함하는 pSK52s 벡터를 Hind III으로 소화한 후, 사람 MP52 유전자를 포함하는 DNA 단편을 0.8 % 저융점 아가로스 겔로부터의 추출에 의해 단리하고, 베링베르케 아게(Behringwerke AG)의 쩨틀마이쓸 박사(Dr. Gerd Zettlmeissl)에게서 제공받은 pABstop 벡터의 Hind III 부위에 라이게이션시켰다. 도 2에 나타낸 CHO-MP52 발현 벡터의 pMSS99(5.0 kb)의 구조를 DNA 염기 서열 결정 및 제한 효소 소화에 의해 확인하였다. pMSS99의 CHO-MP52 DNA염기 서열은 서열목록의 서열 번호 4로 나타낸 576번째에서 2279번째까지의 뉴클레오티드였다.After digesting the pSK52s vector containing the human MP52 gene provided by Dr. Hoetten of Biopharm GmbH with Hind III, the DNA fragment containing the human MP52 gene was 0.8% low melting point agarose. It was isolated by extraction from the gel and ligated to the Hind III site of the pABstop vector provided by Dr. Gerd Zettlmeissl of Behringwerke AG. The structure of pMSS99 (5.0 kb) of the CHO-MP52 expression vector shown in FIG. 2 was confirmed by DNA sequencing and restriction enzyme digestion. The CHO-MP52 DNA base sequence of pMSS99 was 576th to 2279th nucleotides represented by SEQ ID NO: 4 in Sequence Listing.

(2) CHO-MP52를 생산하는 CHO 클론의 확립(2) Establishment of CHO clones producing CHO-MP52

베링베르케 아게의 쩨틀마이쓸 박사에게서 제공받은 CHO-DUKX-B11 세포, 즉 CHO 세포의 돌연변이주에 pMSS99 및 쩨틀마이쓸 박사에게서 제공받은 pSVOAdhfr를 인산칼슘 매개 DNA 운반 방법으로 도입하였다. 다음에, CHO-MP52의 고생산 세포주를 메토트렉세이트(MTX)를 사용하는 유전자 증폭법에 의해 확립하였다.CHO-DUKX-B11 cells provided by Dr. Schöllmystle of Beringberge AG, ie, mutants of CHO cells, were introduced as a calcium phosphate mediated DNA transport method by pMSS99 and pSVOAdhfr provided by Dr. Schöllmystl. Next, a high production cell line of CHO-MP52 was established by gene amplification using methotrexate (MTX).

pMSS99의 10 ㎍ 및 pSVOAdhfr의 2 ㎍를 25 mM HEPES-140 mM NaCl-0.75 mM Na₂HPO₄(pH 7.05) 1 ml에 용해하고, 다음에 2.5 M CaCl₂50 ㎕와 혼합하였다. 얻어진 침전물을 10 cm 접시 중의 CHO-DUKX-B11세포에 언고, 실온에서 30분간 방치하였다. 다음에, 10 % 태송아지 혈청 (FBS)이 함유된 리보 및 데옥시리보뉴클레오티드 함유 MEM-알파 배지(MEMα+) 8 ml를 세포층에 첨가하고, CO₂인규베이터 중에서 4 내지 6시간 배양하였다. 세포를 10 % 글리세롤로 실온에서 3분간 처리한 후, 10% FBS를 포함하는 MEMα⁺배지에서 2일간 배양하였다. 다음에 10 % 투석 FBS를 포함하는 리보 및 데옥시리보뉴클레오티드 불포함 MEM 알파 배지(MEMα^-)중에 세포를 다시 뿌려 형질 전환주를 선택하였다. 형질 전환 클론을 단리하고, 다음에 기술하는 웨스턴 블로팅 분석에 의해 CHO-MP52의 발현을 검정하였다.10 μg of pMSS99 and 2 μg of pSVOAdhfr were dissolved in 1 ml of 25 mM HEPES-140 mM NaCl-0.75 mM Na ₂ HPO ₄ (pH 7.05) and then mixed with 50 μl of 2.5 M CaCl ₂ . The obtained precipitate was frozen in CHO-DUKX-B11 cells in a 10 cm dish and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Next, 8 ml of ribo and deoxyribonucleotide containing MEM-alpha medium (MEMα +) containing 10% calf serum (FBS) were added to the cell layer and incubated for 4-6 hours in a CO ₂ incubator. Cells were treated with 10% glycerol for 3 minutes at room temperature and then incubated for 2 days in MEMα ⁺ medium containing 10% FBS. Transformants were then selected by sprinkling the cells again in ribo and deoxyribonucleotide free MEM alpha medium (MEMα ⁻ ) containing 10% dialysis FBS. Transgenic clones were isolated and assayed for expression of CHO-MP52 by Western blotting analysis as described below.

CHO-MP52 생산 클론을 다시 메토트렉세이트(MTX)의 농도를 높임으로써 단계적으로 선택하고, pSVOAdhfr 유전자에 따라서 MP52 유전자를 증폭시켰다. 400 nM MTX로 1 내지 3 ㎍의 CHO-MP52/10⁶세포/24시간을 생산하는 몇개의 클론을 얻을 수 있었다.CHO-MP52 producing clones were again selected in stages by increasing the concentration of methotrexate (MTX) and the MP52 gene was amplified according to the pSVOAdhfr gene. Several clones were obtained that produced 1-3 μg CHO-MP52 / 10 ⁶ cells / 24 hours with 400 nM MTX.

(3) 배양 상층액 중의 CHO-MP52의 검출(3) Detection of CHO-MP52 in Culture Supernatant

다음과 같은 웨스턴 블롯 분석에 의해 CHO-MP52의 발현에 대해서 클론을 검정하였다 : 배양 상층액 (1 내지 15 ㎕)를 환원 조건하에 SDS-PAGE(15 내지 25 % 폴리아크릴아미드 구배 겔, 다이이찌 가가꾸)에 의해 분리하고, 다음에 단백질을 PVDF막(Clear Blot Membrane-P, ATTO)으로 옮겼다. 막을 블록 에이스 (Block Ace, 다이닛본 세야꾸 제품)로 1시간 블록킹하고, 트리스 완충 식염수(TBS)로 헹군 다음, 10배 희석된 블록 에이스 (Block Ace) 중의 CHO-MP52에 대한 닭 항체 10 ㎍/ml로 밤새 처리하였다. 막을 0.1 % 트윈 20을 함유하는 TBS (TTBS)로 씻은 후, 막을 10배 희석된 블록 에이스 중의 토끼 항-닭 IgG-ALP 복합체 (Sigma A9171)로 처리하였다. 막을 TTBS로 씻고, 알칼리성 포스파타제 복합체 기질 키트 (BIO-RAD)와 반응시켜 MP52에 해당하는 밴드를 가시화하였다.Clones were assayed for expression of CHO-MP52 by Western blot analysis as follows: Culture supernatant (1-15 μl) was subjected to SDS-PAGE (15-25% polyacrylamide gradient gel, Daiichi The protein was then transferred to a PVDF membrane (Clear Blot Membrane-P, ATTO). The membrane was blocked for 1 hour with Block Ace (Daininib Seiyaku), rinsed with Tris buffered saline (TBS), and then 10 μg / chicken antibody against CHO-MP52 in Block Ace diluted 10-fold. Treated with ml overnight. After washing the membrane with TBS (TTBS) containing 0.1% Tween 20, the membrane was treated with rabbit anti-chicken IgG-ALP complex (Sigma A9171) in 10-fold diluted block ace. The membrane was washed with TTBS and reacted with alkaline phosphatase complex substrate kit (BIO-RAD) to visualize the band corresponding to MP52.

(4) CHO-MP52 생산 CHO 세포주의 세포 배양(4) Cell Culture of CHO-MP52 Producing CHO Cell Line

CHO-MP52의 최고 생산성을 갖는 CHO 세포주의 MC-2 (기탁 번호 FERM BP-5142)를 10 % FBS, 400 nM MTX, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 첨가한 MEMα^-를 넣은 롤러 병에서 증식시켰다. MC-2 세포가 콘플루언시 (confluency)에 달한 후, 세포를 혈청을 포함하지 않는 MEMα-로 씻고, 이어서 10 mM HEPES(pH 7.3), 10 KIU 아프로티닌, 1 mM 부틸산나트륨, 6 ㎍/ml 셀렌산나트륨, 5 ㎍/ml 트랜스페린, 18 ㎍/ml 에탄올아민, 9 ㎍/ml 인슐린, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 첨가한 혈청을 포함하지 않는 DME/F12 중에서 배양하였다. 조절 배지를 1 주간 매일 채집하였다.Insert the ^- of the CHO cell line with the highest productivity of CHO-MP52 MC-2 (Deposit No. FERM BP-5142) to 10% FBS, 400 nM MTX, 100 U / ml penicillin, MEMα supplemented with 100 ㎍ / ml streptomycin Proliferation in roller bottles. After MC-2 cells reach confluency, cells are washed with MEMα- free of serum, followed by 10 mM HEPES (pH 7.3), 10 KIU aprotinine, 1 mM sodium butylate, 6 μg. culture in DME / F12 without serum with / ml sodium selenite, 5 μg / ml transferrin, 18 μg / ml ethanolamine, 9 μg / ml insulin, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin It was. Control medium was collected daily for 1 week.

(5) CHO-MP52의 정제(5) Purification of CHO-MP52

CHO 배양 상층액 및 0.1 용량 0.2 M 인산나트륨 완충제, pH 6.0를 혼합하고, 50 mM NaCl, 20 mM 인산나트륨 완충제, pH 6.0으로 미리 평형화해 둔 POROS HS칼럼 (10 ml, PerSeptive Biosystems)에 걸어주었다. 단백질을 0.05 내지 2 M 선형 구배 NaCl로 용출하고, 10 ml 분획 20개로 채집하였다. 용출된 MP52는 세가지 타입의 모노머로 확인되고, 그들의 겉보기 분자량은 환원 조건하에서 SDS-PAGE 분석에 의해 약 52, 40 및 14 kD로 측정되었다. 이들 모노머는 세가지 타입의 호모다이머 (104 kD, 80 kD 및 28 kD) 및 세가지 타입의 헤테로다이머 (92 kD: 40 kD 내지 52 kD, 66 kD: 14 kD 내지 52 kD, 및 54 kD: 14 kD 내지 40 kD)를 형성하고, 이들 다이머 모두를 CHO-MP52라고 명명하였다. 단, 28 kD 호모다이머는 사람 MP52의 성숙 호모다이머로서 알려져 있다 (WO 95/04819)고 생각되므로 제외한다. 따라서, 104 kD 호모다이머 및 80 kD 호모다이머를 상기의 분획에서 단리하여 N말단 아미노산 서열 및 생물활성을 검정하였다.CHO culture supernatant and 0.1 volume 0.2 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 were mixed and hung on POROS HS column (10 ml, PerSeptive Biosystems) previously equilibrated with 50 mM NaCl, 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6.0. Protein was eluted with 0.05-2 M linear gradient NaCl and collected in 20 10 ml fractions. Eluted MP52 was identified as three types of monomers, and their apparent molecular weights were determined to be about 52, 40 and 14 kD by SDS-PAGE analysis under reducing conditions. These monomers include three types of homodimers (104 kD, 80 kD and 28 kD) and three types of heterodimers (92 kD: 40 kD to 52 kD, 66 kD: 14 kD to 52 kD, and 54 kD: 14 kD to 40 kD) and all of these dimers were named CHO-MP52. However, 28 kD homodimer is excluded as it is thought to be known as a mature homodimer of human MP52 (WO 95/04819). Thus, 104 kD homodimer and 80 kD homodimer were isolated from the fractions above to assay the N-terminal amino acid sequence and bioactivity.

5번째에서 9번째까지의 분획을 모아서 약 10배로 농축하였다. 농축물을 1 M NaCl를 포함하는 20 mM 인산나트륨 완충제, pH 7.1로 미리 평형화한 슈퍼텍스 (Superdex) 200 pg (1.6 I.D. x 600 cm, Pharmacia 제품)에 충전하였다. 유속 0.5 ml/분으로 용출시켰다. 104 kD 호모다이머를 포함하는 분획과 80 kD 호모다이머를 포함하는 분획을 별개로 모았다. 각 분획을 역상 HPLC 칼럼 (RESOURCE RPC, 3 ml, Pharmacia)에 넣고 이들 단백질을 35 내지 40 %의 아세토니트릴로 용출하였다. 단리된 CHO-MP52의 농도를 SDS-PAGE 겔에서의 단백질 밴드의 밀도계 (densitometry)에 의해 측정하였다.The fifth to ninth fractions were collected and concentrated about 10-fold. The concentrate was charged into 200 pg (1.6 I.D. × 600 cm, Pharmacia) Superdex pre-equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer, 1 M NaCl, pH 7.1. Eluted at a flow rate of 0.5 ml / min. Fractions containing 104 kD homodimers and fractions containing 80 kD homodimers were collected separately. Each fraction was placed in a reverse phase HPLC column (RESOURCE RPC, 3 ml, Pharmacia) and eluted with 35-40% acetonitrile of these proteins. The concentration of isolated CHO-MP52 was measured by densitometry of protein bands on SDS-PAGE gels.

N말단 아미노산 서열 분석은 펄스액 가스상 시퀀서 (Applied Biosystems 모델 476)를 사용하여 80 kD 호모다이머 및 104 kD 호모다이머에 대해서 각각 행하였다. 결과를 표 2에 나타냈다.N-terminal amino acid sequencing was performed on 80 kD homodimer and 104 kD homodimer, respectively, using a pulsed gas phase sequencer (Applied Biosystems model 476). The results are shown in Table 2.

HMW MP52HMW MP52 N-말단 아미노산N-terminal amino acid 80 kD80 kD Lys Ala Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu ProAla Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro LysLys Ala Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu ProAla Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys 104 kD104 kD Ala Pro Asp Leu Gly Gln Arg Pro Gln Gly ThrAla Pro Asp Leu Gly Gln Arg Pro Gln Gly Thr

아미노산 서열 80 kD는 서열목록 서열 번호 4의 Lys 121 또는 Ala 122에서 Arg 474로 유래되고, 아미노산 서열 104 kD는 Ala 1에서 Arg 474로 유래되었다. CHO 세포는 세가지 타입의 호모다이머, 104 kD, 80 kD 및 28 kD, 및 세가지 타입의 헤테로다이머, 즉 92 kD, 66 kD 및 54 kD의 다이머를 생산하는 것을 새로이 알았다.Amino acid sequence 80 kD was derived from Ars 474 at Lys 121 or Ala 122 of SEQ ID NO: 4 and amino acid sequence 104 kD was derived from Arg 474 at Ala 1. CHO cells are new to produce three types of homodimers, 104 kD, 80 kD and 28 kD, and three types of heterodimers, 92 kD, 66 kD and 54 kD.

<실시예 1> 항원의 조제 및 감작법Example 1 Preparation and Sensitization of Antigens

사람 MP52의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA를 포함한 플라스미드 (pKOT 245)를 사용하여 대장균 (기탁 번호 FERM BP-5499호)에서 발현시키고, 그 봉입체 (Inclusion body)를 표준 방법으로 가용화하여 얻은 모노머형 rhMP52를 산화시킴으로써 다이머형(이하 D-rhMP52라고 칭한다. 참고예 1 참조)를 구성시키며 등전점(等電點) 침전법, 겔 여과 등의 정제 과정을 거쳐 최종적으로 약 0.5 mg/ml 농도의 rhMP52를 얻고, 이를 항원으로 사용하였다. 혹은 CHO 세포 (기탁 번호 FERM BP-5142호)에서 발현시킨 다이머형 (이하 CHO-MP52라고 약칭한다. 참고예2 참조)을 상술한 농도로, 항원으로 사용하였다. 면역 감작 마우스의 제작은 BALB/c 마우스에 CHO-MP52 (프로세싱이 불완전한 전구체를 80 % 이상 함유)를 용해시킨 10 mM 염산 수용액을 프로인트의 완전 보조제(CFA)와 1:1의 비율로 혼합, 유화하여 에멀젼을 얻고, 이를 0, 7, 16 및 112일째 각각 70, 20, 10 및 52 ㎍를, 또 그 사이 29일째에는 대장균 유래의 MP52 (모노머를 약간 포함한다) 18 ㎍를 마찬가지로 조제한 것을 복강내에 주사한 후, 약 1개월 간격을 두고 50 ㎍의 D-rhMP52를 포함하는 용액을 프로인트의 불완전 보조제 (IFA)와 1:1로 혼합, 유화한 것을 복강내에 주사함으로써 행하였다. 이렇게 6회 계속 감작을 행한 마우스에 대해서 최종 투여 후 42일째 60 ㎍의 D-rhMP52를 보조제없이 피하 투여하고, 다시 42일의 간격을 두고 (세포 융합 3일전에 해당한다), 50 ㎍의 D-rhMP52를 꼬리 정맥에서 투여하였다.The monomeric rhMP52 obtained by expressing in Escherichia coli (Accession No. FERM BP-5499) using a plasmid containing a cDNA encoding the amino acid sequence of human MP52 (Accession No. FERM BP-5499) and solubilizing the inclusion body by a standard method. Oxidation was carried out to form a dimer type (hereinafter referred to as D-rhMP52; see Reference Example 1), and finally, rhMP52 having a concentration of about 0.5 mg / ml was obtained through a purification process such as isoelectric point precipitation and gel filtration. It was used as an antigen. Alternatively, the dimer type expressed in CHO cells (Accession No. FERM BP-5142) (hereinafter abbreviated as CHO-MP52, see Reference Example 2) was used as an antigen at the above-mentioned concentration. Immunosensitized mice were prepared by mixing 10 mM aqueous hydrochloric acid solution containing CHO-MP52 (containing more than 80% of incompletely processed precursors) in BALB / c mice at a ratio of 1: 1 with Freund's complete adjuvant (CFA). Emulsification was carried out to obtain an emulsion, which was intraperitoneally prepared at 70, 20, 10 and 52 μg on days 0, 7, 16 and 112, and 18 μg of MP52 (including some monomer) derived from E. coli on the 29th day. After intraocular injection, a solution containing 50 μg of D-rhMP52 was mixed 1: 1 with Freund's Incomplete Adjuvant (IFA) at about 1 month interval and emulsified by intraperitoneal injection. Mice subjected to 6 sensitizations were subcutaneously administered with 60 μg of D-rhMP52 without adjuvant 42 days after the final administration, and again at 42 days apart (corresponding to 3 days before cell fusion), and 50 μg of D-. rhMP52 was administered in the tail vein.

<실시예 2> 세포 융합Example 2 Cell Fusion

최종 면역에서 3일 후에, 감작 마우스로부터 지라를 추출하고, 지라 세포를 조제하였다. 얻어진 지라 세포를 마우스 골수종 세포주(SP2/0)와 10:1의 비율로 혼합하고, 1500 rpm으로 원심하고, 그 세포의 펠렛을 40 % 폴리에틸렌글리콜 (PEG 1500)을 37 ℃로 보온 유지하면서 천천히 녹인다. 여기에 FCS를 제외한 1 ml의 RPMI 1640 배지 (닛스이 세야꾸 제품)를 천천히 부으면서 피펫의 끝으로 가볍게 교반하고, 그 후 약 6분간에 걸쳐 250 rpm에서 1000 rpm까지 서서히 원심 회전수를 올려 가고, 그 후 얻어진 펠렛을 FCS없는 배지에서 1회 세척한 후, 최종적으로는 20 %의 FCS를 넣은 RPMI 1640배지에 HAT (히폭크산틴 (H), 아미노푸테린 (A), 티미딘 (T))를 첨가한 액으로 96 웰 플레이트에 1 웰당 지라 세포수가 10,000개가 되도록 나누어 주사하였다.After 3 days in the final immunization, spleens were extracted from sensitized mice and splenocytes were prepared. The resulting splenic cells are mixed with a mouse myeloma cell line (SP2 / 0) at a ratio of 10: 1, centrifuged at 1500 rpm, and the pellets of the cells are slowly dissolved while maintaining 40% polyethylene glycol (PEG 1500) at 37 ° C. . Slowly pour 1 ml of RPMI 1640 medium (from Nisui Seyaku), except for FCS, gently stirring with the tip of the pipette, and then slowly increase the centrifugal speed from 250 rpm to 1000 rpm over about 6 minutes, The pellet was then washed once in FCS-free medium and finally HAT (Hipoxanthin (H), Aminoputerin (A), Thymidine (T)) in RPMI 1640 medium containing 20% FCS. The solution was added and injected into a 96 well plate so that the number of spleen cells per well was 10,000.

<실시예 3> ELISA법에 의한 제1차 스크리닝Example 3 First Screening by ELISA Method

약 6,000의 융합 세포 생산물에 대해서 사람 MP52에 대한 모노클로날 항체의 생산 유무를 이하의 순서로 조사하였다.About 6,000 fusion cell products were examined for the production of monoclonal antibodies against human MP52 in the following order.

1) 면역에 사용한 D-rhMP52와 그것을 환원하고, S-S 결합을 저해하기 위해서 SH기를 술폰화한 모노머형 rhMP52 (이하 M-rhMP52라 약칭)을 각각 1 ㎍/ml의 농도로 1 웰당 50 ㎕씩 플레이트(NUNC, MAXISORP)에 1시간 실온에서 인큐베이션함으로써 코팅하였다.1) Plate 50 μl / well of D-rhMP52 used for immunization, and reduce it, and monomer type rhMP52 sulfonated with SH group (hereinafter abbreviated as M-rhMP52) at a concentration of 1 μg / ml each to inhibit SS binding. (NUNC, MAXISORP) were coated by incubating for 1 hour at room temperature.

2) 트윈 20이 들어간 0.01 M 인산나트륨 완충제(PBS)(pH 7.2)로 세척한 후, 여기에 배양 상층물 원액을 50 ㎕씩 첨가하고 실온에서 1시간 인큐베이션하였다.2) After washing with 0.01 M sodium phosphate buffer (PBS) (pH 7.2) containing Tween 20, 50 μl of the culture supernatant was added thereto and incubated for 1 hour at room temperature.

3) 세척액으로 3회 세척한 후, 약 1 ㎍/ml의 농도로 각 웰에 45 ㎕의 HRPO 표지 토끼 항마우스 면역글로불린 항체(DAKO, F206)를 첨가하였다. 이 때 사용한 희석액은 2 mg/ml의 카세인 (간또 가가꾸 제품)을 0.1 M 트리스히드록시아미노메탄 완충액 (TBS, pH7.4)에 용해한 것을 사용하였다.3) After washing three times with the wash solution, 45 μl of HRPO-labeled rabbit anti-mouse immunoglobulin antibody (DAKO, F206) was added to each well at a concentration of about 1 μg / ml. The diluent used at this time used what melt | dissolved 2 mg / ml casein (made by Kanto Chemical Co., Ltd.) in 0.1 M trishydroxyaminomethane buffer (TBS, pH7.4).

4) 실온에서 1시간 인큐베이션하고, 3회 세척액으로 세척한 후 발색액(Chromogen-TMB, Behringwerke)를 50 ㎕씩 첨가하였다.4) Incubated at room temperature for 1 hour, washed with three washes, and 50 μl of a color developing solution (Chromogen-TMB, Behringwerke) was added.

5) 약 5분간 실온에서 발색 반응을 일으키게 한 후, 50 ㎕의 0.5 N 황산을 첨가함으로써 발색 반응을 정지시켰다.5) After causing the color reaction to occur at room temperature for about 5 minutes, the color reaction was stopped by adding 50 µl of 0.5 N sulfuric acid.

6) 반응 정지 후, 30분 이내에 흡광도 OD₄₅₀nm로 발색 정도를 측정하였다.6) After stopping the reaction, the degree of color development was measured by absorbance OD ₄₅₀ nm within 30 minutes.

aMP-1에서 aMP-23이라고 명명한 23개의 모노클로날 항체 중, 이후의 클로닝 과정에서 유지할 수 없었던 aMP-17, aMP-19 및 aMP-23를 제외한 20개의 모노클로날 항체에 대한 결과를 표 3에 나타냈다. 양성 음성의 판정은 음성 대조구의 평균±10 SD (OD₄₅₀nm=0.05)를 컷 오프값으로 하였다. aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 12, 14, 15, 18 및 22는 D-rhMP52에만 반응하고, aMP-8, 10, 11, 13, 16, 20 및 21은 D-rhMP52와 M-rhMP52의 양쪽에 반응하였다. 여기에서 20개의 모노클로날 항체는 특이성을 기준으로 적어도 2종류의 항체로 분류되었다.Of the 23 monoclonal antibodies labeled aMP-23 in aMP-1, the results for 20 monoclonal antibodies, except for aMP-17, aMP-19, and aMP-23, which could not be maintained during subsequent cloning 3 is shown. The determination of positive negative was made into the cut-off value by the average ± 10 SD (OD ₄₅₀ nm = 0.05) of the negative control. aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 12, 14, 15, 18 and 22 respond only to D-rhMP52 and aMP-8, 10, 11, 13, 16, 20 and 21 Reacted with both D-rhMP52 and M-rhMP52. Here, 20 monoclonal antibodies were classified into at least two types of antibodies based on specificity.

<실시예 4> 웨스턴 블롯법에 의한 특이성 확인Example 4 Confirmation of Specificity by Western Blot Method

1) rhMP52 (1 ㎍/레인/0.5 mm)를 비환원 조건 (D-rhMP52로서 영동된다)과 환원 조건 (M-rhMP52로서 영동된다)에서 15 내지 25 %의 구배 겔 (다이이찌 가가꾸사 제품)을 사용하여 SDS-PAGE를 행한 후, 표준 방법에 의해 니트로셀룰로오스막으로 옮겼다 (30 V, 2 시간).1) rhMP52 (1 μg / lane / 0.5 mm) is 15 to 25% gradient gel (from Daiichi Kagaku Co., Ltd.) under non-reducing conditions (phorized as D-rhMP52) and reducing conditions (as electrophoretic as M-rhMP52) ) Was subjected to SDS-PAGE, and then transferred to the nitrocellulose membrane by the standard method (30 V, 2 hours).

2) 이 니트로셀룰로오스막을 약 3 mg/ml의 카세인이 함유된 TBS 용액에 20분 이상 담구어 둠으로써 비특이적 반응을 차단시켰다.2) The non-specific reaction was blocked by immersing the nitrocellulose membrane in a TBS solution containing about 3 mg / ml of casein for at least 20 minutes.

3) 모노클로날 항체가 (4 ㎍/ml 내지 40 ㎍/ml의 범위로) 함유된 배양 상층물 원액 중에서 rhMP52를 보유한 니트로셀룰로오스막을 1시간 동안 실온에서 진탕시키면서 인큐베이션시켰다.3) The nitrocellulose membrane containing rhMP52 in the culture supernatant stock containing monoclonal antibody (in the range of 4 μg / ml to 40 μg / ml) was incubated with shaking for 1 hour at room temperature.

4) 대량의 PBS 완충액 (pH 7.2)으로 세척하였다 (5 분씩 3회 용액에 담금).4) Wash with a large amount of PBS buffer (pH 7.2) (immerse in solution 3 times 5 min).

5) 2차 항체로서 1 ㎍/ml의 HRPO 표지 토끼 항마우스 면역 글로블린 항체를 카세인/TBS의 희석액 중에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다.5) 1 μg / ml HRPO labeled rabbit antimouse immunoglobulin antibody as secondary antibody was incubated for 1 hour at room temperature in dilutions of casein / TBS.

6) 4)와 동일하게 인큐베이션된 항체를 세척하였다.6) The incubated antibody was washed in the same manner as 4).

7) 발색제(TrueBlue/Peroxidase 기질, Kirkegaard Perry Laboratories 제품)에 10분간 담가두어 정색(呈色) 반응을 일으켰다. 그 후, 흐르는 물로 충분히 세척하였다. 결과는 ELISA에 의한 제1차 스크리닝의 결과와 일치하였다. 결과를 도 3에 기재하였다.7) Soak for 10 minutes in a color developing agent (TrueBlue / Peroxidase substrate, manufactured by Kirkegaard Perry Laboratories) to give a color reaction. After that, it was sufficiently washed with running water. The results were consistent with the results of the primary screening by ELISA. The results are shown in FIG.

<실시예 5> 모노클로날 항체의 서브클래스 결정Example 5 Subclass Determination of Monoclonal Antibodies

클론이 생산하는 모노클로날 항체의 서브클래스는 마우스 모노클로날 항체 아이소타입 분류 키트(Mouse monoclonal antibody isotyping kit, Amersham사제, RPN29)를 사용하여 그 취급 설명서에 따라서 결정하였다. 모노클로날 항체의 서브클래스는 표 4에 나타내었다. 모든 모노클로날 항체의 L쇄의 서브클래스는 κ이고 H쇄의 서브클래스는 γ1 혹은 γ2a였다.Subclasses of the monoclonal antibodies produced by the clones were determined using the Mouse monoclonal antibody isotyping kit (manufactured by Amersham, RPN29) according to the instruction manual. Subclasses of monoclonal antibodies are shown in Table 4. The subclass of the L chain of all monoclonal antibodies was κ and the subclass of the H chain was γ1 or γ2a.

<실시예 6> 특이성의 확인Example 6 Confirmation of Specificity

사람 MP52는 TGF-β 유전자 슈퍼 패밀리에 속하는 분자로서,구조 및 아미노산 서열의 측면에서 여타의 TGF-β 유전자 슈퍼 패밀리, 특히 TGF-β2와 BMP-2와 유사하다는 것을 알았다. 본 발명의 모노클로날 항체가 사람 MP52에 특이적인가를 조사하기 위해서 사람 재조합 TGF-β2(rhTGFβ2)와 사람 재조합 BMP-2 (rhBMP-2)를 입수하고, 상술한 실시예 3과 동일한 방법으로 ELISA를 행하여 그 특이성을 조사하였다. 결과는 표 5에 나타내었다.Human MP52 is a molecule belonging to the TGF-β gene superfamily, and found to be similar to other TGF-β gene superfamily, especially TGF-β2 and BMP-2, in terms of structure and amino acid sequence. In order to examine whether the monoclonal antibody of the present invention is specific for human MP52, human recombinant TGF-β2 (rhTGFβ2) and human recombinant BMP-2 (rhBMP-2) were obtained, and ELISA was performed in the same manner as in Example 3 above. Was performed to investigate its specificity. The results are shown in Table 5.

이들 모든 모노클로날 항체는 TGF-β2 및 BMP-2와는 반응하지 않고 MP52에 특이적인 항체인 것이 확인되었다.All these monoclonal antibodies did not react with TGF-β2 and BMP-2 but were identified as antibodies specific for MP52.

<실시예 7> 항체의 정제Example 7 Purification of Antibodies

배양 상층물 및 마우스 복수로부터 모노클로날 항체의 정제는 단백질 A 또는 단백질 G의 칼럼 (Pharmacia 제품)을 사용하여 취급 설명서에 따라서 정제하였다. 배양 상층물로부터의 정제에는 단백질 A의 칼럼을 사용하고, 복수로부터의 정제에는 단백질 G 칼럼을 사용하였다.Purification of monoclonal antibodies from the culture supernatants and mouse ascites was purified according to the instruction manual using a column of Protein A or Protein G (Pharmacia). A column of Protein A was used for purification from the culture supernatant and a Protein G column was used for purification from the ascites.

<실시예 8> 샌드위치 ELISA법에 의한 제2차 스크리닝 (타입 분류)Example 8 Second Screening by Sandwich ELISA Method (Type Classification)

1) 정제된 모노클로날 항체 (aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22 등 20 종류)를 각각 96 웰 플레이트에 1 ㎍/ml의 농도로 각 웰에 50 ㎕씩 코팅한다 (1시간, 실온).1) Purified monoclonal antibodies (aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22 Etc.), 50 μl was coated in each well at a concentration of 1 μg / ml in 96 well plates (1 hour, room temperature).

2) 세척액 (BEP-II, Behringwerke 제품)으로 3회 세척한 후, 소정량의 D-rhMP52 (30 ng/ml)를 카세인/TBS으로 희석한 용액을 50 ㎕씩 나누어 주사하고, 1시간 실온에서 인큐베이션한다.2) After washing three times with the washing solution (BEP-II, Behringwerke), a predetermined amount of D-rhMP52 (30 ng / ml) diluted with casein / TBS was injected in 50 ㎕ divided injection, 1 hour at room temperature Incubate.

3) 세척 후, 바이오틴화 키트 (Antibody Labelling systems ; Biotinylation Kit, American Qualex 제품)를 사용하여 바이오틴화된 1)로 표시한 모노클로날 항체를 각각 1 ㎍/ml가 되도록 카세인/TBS에 희석시키고 이를 1)에서 코팅한 모든 모노클로날 항체에 대해서 반응시켰다. 예를 들어, aMP-1를 코팅한 플레이트와 바이오틴화된 모든 aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21 및 22를 각각 반응시키고 aMP-2 내지 22를 코팅한 플레이트에도 마찬가지로 모든 바이오틴화 모노클로날 항체를 반응시켰다 (1시간, 실온).3) After washing, the monoclonal antibodies labeled with biotinylated 1) were diluted in casein / TBS to 1 μg / ml each using Biotinylation Kit (Biotinylation Kit, product of American Qualex) and All monoclonal antibodies coated in 1) were reacted. For example, aMP-1 coated plates and all biotinylated aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21 and 22 were reacted respectively, and all biotinylated monoclonal antibodies were also reacted to plates coated with aMP-2 to 22 (1 hour, room temperature).

4) 세척 후, 카세인/TBS에 HRPO 표지된 아비딘 퍼록시다제 (AVIDIN-PEROXIDASE, Sigma 제품)를 1 ㎍/ml의 농도로 첨가하고 1시간 실온에서 인큐베이션시켰다.4) After washing, HRPO labeled avidin peroxidase (AVIDIN-PEROXIDASE, available from Sigma) was added to casein / TBS at a concentration of 1 μg / ml and incubated at room temperature for 1 hour.

5) 세척 후, 3), 4)와 동일하게 발색 반응을 일으켰다.5) After washing, the same color development reaction occurred as in 3) and 4).

6) 15분 인큐베이션시킨 후에 3), 5), 6)과 동일하게 반응을 중단하고 발색 정도를 측정하였다.6) After 15 minutes of incubation, the reaction was stopped in the same manner as in 3), 5) and 6) and the degree of color development was measured.

이 결과의 일부를 도 4에 나타냈다. 같은 모노클로날 항체라면 모든 조합에서 동일한 결과를 얻을 수 있을 것이다. 그러나, 예로서 도 4에 나타낸 aMP-1과 aMP-4는 전혀 다른 항체인 것을 알았다. 이들의 결과로부터 모든 모노클로날 항체의 유사점 및 차이점이 판명되고, 결과적으로 10종류의 에피토프에 대한 특이성이 다른 모노클로날 항체가 동정되었다. 이들을 표 6에 기재한 바와 같이 타입 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J로 분류하였다.Some of these results are shown in FIG. The same monoclonal antibody would yield the same results in all combinations. However, it was found that aMP-1 and aMP-4 shown in FIG. 4 are completely different antibodies. From these results, the similarities and differences of all monoclonal antibodies were found. As a result, monoclonal antibodies having different specificities for 10 kinds of epitopes were identified. These were classified into types A, B, C, D, E, F, G, H, I and J as described in Table 6.

<실시예 9> 모노클로날 항체에 의한 D-rhMP52의 생물활성의 저해Example 9 Inhibition of D-rhMP52 Bioactivity by Monoclonal Antibodies

토끼 골아 세포주 ROB/C26은 사람 MP52의 수용체를 갖고 있는 것이 알려져 있다. 이 세포주의 배양액에 사람 MP52를 첨가하면 알칼리 포스파타아제 (ALP)의 활성이 상승된다고 알려져 있다. rhMP52를 일정량 첨가할 때, 정제된 모든 모노클로날 항체를 최종적으로 20 ㎍/ml가 되도록 첨가했을 때의 ALP 활성 상승의 저해가 확인되는지의 여부를 검토하였다. 10 ng/ml의 농도로 rhMP52를 ROB/C26에 첨가하여, 며칠간 배양하였을 때, 세포 표면상의 MP52 수용체를 통해 자극이 전도되고, 결과적으로 ALP의 활성이 상승된다. 상승된 ALP활성은 ELISA와 동일한 방식으로 ALP에 특이적인 기질을 반응시켜 유발된 발색 반응으로 정량화할 수 있다 (단, 측정 파장은 OD₄₀₅nm). 결과는, 표 7에 나타냈지만 항체 없이 rhMP52 단독으로는 0.158의 ALP 활성을 나타내고, 거기에 모노클로날 항체를 공존시켰을 때 얻어지는 ALP 활성이 낮으면 낮을수록 저해 활성이 강하다고 판단된다. 결과적으로 aMP-4, 5, 8, 11, 20 및 21에 의한 강한 저해 활성이 확인되었다. 이 중 aMP-4 및 aMP-5는 D-rhMP52에 특이적으로 반응하는 항체이고(표 1), M-rhMP52에도 반응하는 aMP-8, 11, 20 및 21과는 달리, 실질적으로 MP52가 MP52 수용체에 결합하는 것을 생리적 조건하에서 저해하는 모노클로날 항체라고 생각된다. 모노클로날 항체 aMP-4 및 aMP-5를 생산하는 하이브리도마는 1997년 5월 9일 통상 산업성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소(일본국 이바라끼겡 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1방 3고)에 각각 기탁 번호 FERM BP-5939 및 FERM BP-5940으로서 국제 기탁되어 있다.The rabbit osteoblast line ROB / C26 is known to have a receptor of human MP52. The addition of human MP52 to the culture of this cell line is known to increase the activity of alkaline phosphatase (ALP). When a certain amount of rhMP52 was added, it was examined whether inhibition of ALP activity elevation was confirmed when all the purified monoclonal antibodies were finally added to be 20 µg / ml. RhMP52 was added to ROB / C26 at a concentration of 10 ng / ml, and when cultured for several days, stimulation was conducted through the MP52 receptor on the cell surface, and consequently the activity of ALP was elevated. Elevated ALP activity can be quantified by the colorimetric reaction induced by reacting ALP-specific substrates in the same manner as ELISA (measured wavelength OD ₄₀₅ nm). Although the result was shown in Table 7, the rhMP52 alone without an antibody showed the ALP activity of 0.158, and it is judged that the lower the ALP activity obtained when the monoclonal antibody coexists, the lower the inhibitory activity. As a result, strong inhibitory activity by aMP-4, 5, 8, 11, 20 and 21 was confirmed. Among these, aMP-4 and aMP-5 are antibodies that specifically react to D-rhMP52 (Table 1), and unlike aMP-8, 11, 20, and 21, which also respond to M-rhMP52, substantially MP52 is MP52. It is thought to be a monoclonal antibody that inhibits binding to the receptor under physiological conditions. Hybridomas producing the monoclonal antibodies aMP-4 and aMP-5 are commonly used on May 9, 1997, at the Institute of Industrial Technology, Japan Institute of Industrial Technology, Biotechnology Industrial Technology Research Institute (Higashi, Ibaraki, Tsukubashi, Japan). Are deposited internationally as Accession Nos. FERM BP-5939 and FERM BP-5940, respectively.

<실시예 10> 샌드위치 ELISA에 의한 MP52의 정량Example 10 Quantification of MP52 by Sandwich ELISA

실시예 8로부터 모노클로날 항체가 10종류로 분류되었다. 그 중, 타입 C의 aMP-4와 타입 D의 aMP-5에 의한 샌드위치 ELISA를 구축하였다. 즉,From Example 8, monoclonal antibodies were classified into 10 types. Among them, a sandwich ELISA using aMP-4 of type C and aMP-5 of type D was constructed. In other words,

1) 정제된 aMP-5를 96 웰 플레이트에 5 ㎍/ml의 농도로 각 웰에 50 ㎕씩 코팅 (1시간, 실온)한다.1) Coat purified aMP-5 in 96 well plate at a concentration of 5 μg / ml in 50 μl each well (1 hour, room temperature).

2) 세척액으로 세척한 후, 정제된 MP52를 1 ng/ml를 최고 농도로 하여 순서대로 카세인/트리스 완충액에 희석한 것을 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하고 1시간 실온에서 인큐베이션한다.2) After washing with the washing solution, diluted 50 mL of purified MP52 in casein / tris buffer in order to the highest concentration of 1 ng / ml to each well and incubated at room temperature for 1 hour.

3) 세척액으로 세척한 후, 바이오틴화된 aMP-4 정제 항체를 1 ㎍/ml의 농도로 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하고 1시간 실온에서 반응시킨다.3) After washing with the wash solution, 50 μl of the biotinylated aMP-4 purified antibody was added to each well at a concentration of 1 μg / ml and allowed to react at room temperature for 1 hour.

4) 세척액으로 세척한 후, 아비딘화 퍼옥시다아제 (SIGMA A-3151)를 1 ㎍/ml의 농도로 첨가하고 1시간 실온에서 반응시킨다.4) After washing with the washing solution, avidinated peroxidase (SIGMA A-3151) is added at a concentration of 1 μg / ml and reacted at room temperature for 1 hour.

5) 세척액으로 세척한 후, 3), 4)와 동일하게 발색 반응을 일으켰다.5) After washing with the washing solution, the color reaction was the same as 3), 4).

6) 30분 후, 50 ㎕의 0.5 N 황산을 첨가함으로써 발색 반응을 정지시켰다.6) After 30 minutes, the color reaction was stopped by adding 50 µl of 0.5 N sulfuric acid.

7) 반응 정지 후, 흡광도 OD₄₅₀nm으로 발색 정도를 측정하였다.7) After stopping the reaction, the degree of color development was measured by absorbance OD ₄₅₀ nm.

이들 결과는 도 5에 표시되어 있고, 검출 한계는 23.9 pg/ml, 정량 한계는 42.4 pg/ml였다.These results are shown in FIG. 5, with a detection limit of 23.9 pg / ml and a limit of quantitation of 42.4 pg / ml.

여기에서 검출 한계란 MP52를 포함하지 않는 완충액의 백 그라운드값보다는 의미있게 높은 MP52의 농도를, 또 정량 한계란 정량하는데 신뢰할 수 있는 MP52의 최저 농도를 말한다.The limit of detection here means a concentration of MP52 that is significantly higher than the background value of the buffer containing no MP52, and the limit of quantification refers to the lowest concentration of MP52 that is reliable for quantification.

ELISA에 의한 항MP52 항체값의 측정 결과Measurement result of anti-MP52 antibody value by ELISA 모노클로날 항체Monoclonal antibodies 사용한 항원Antigen used 모노머형 rhMP52Monomer rhMP52 다이머형 rhMP52Dimer type rhMP52 aMP-1aMP-1 0.030.03 1.351.35 aMP-2aMP-2 0.010.01 1.031.03 aMP-3aMP-3 0.010.01 0.920.92 aMP-4aMP-4 0.010.01 1.581.58 aMP-5aMP-5 0.010.01 1.031.03 aMP-6aMP-6 0.010.01 0.960.96 aMP-7aMP-7 0.010.01 1.531.53 aMP-8aMP-8 1.891.89 1.981.98 aMP-9aMP-9 0.040.04 1.151.15 aMP-10aMP-10 1.081.08 1.781.78 aMP-11aMP-11 1.811.81 1.951.95 aMP-12aMP-12 0.020.02 0.330.33 aMP-13aMP-13 0.260.26 1.481.48 aMP-14aMP-14 0.030.03 1.261.26 aMP-15aMP-15 0.010.01 1.351.35 aMP-16aMP-16 0.060.06 1.581.58 aMP-18aMP-18 0.010.01 1.191.19 aMP-20aMP-20 1.851.85 2.012.01 aMP-21aMP-21 1.411.41 1.861.86 aMP-22aMP-22 0.010.01 0.880.88 항MP52 항혈청Anti-MP52 antiserum 1.831.83 2.232.23 음성 대조구Negative control 0.010.01 0.010.01 단위: OD₄₅₀nmUnit: OD ₄₅₀ nm 컷 오프값: 0.05Cut off value: 0.05

모노클로날 항체의 서브클래스Subclasses of Monoclonal Antibodies 모노클로날 항체Monoclonal antibodies 서브클래스Subclass H쇄H chain L쇄L chain aMP-1aMP-1 γ1γ1 κκ aMP-2aMP-2 γ1γ1 κκ aMP-3aMP-3 γ1γ1 κκ aMP-4aMP-4 γ2aγ2a κκ aMP-5aMP-5 γ1γ1 κκ aMP-6aMP-6 γ1γ1 κκ aMP-7aMP-7 γ2aγ2a κκ aMP-8aMP-8 γ1γ1 κκ aMP-9aMP-9 γ1γ1 κκ aMP-10aMP-10 γ1γ1 κκ aMP-11aMP-11 γ1γ1 κκ aMP-12aMP-12 γ1γ1 κκ aMP-13aMP-13 γ1γ1 κκ aMP-14aMP-14 γ2aγ2a κκ aMP-15aMP-15 γ1γ1 κκ aMP-16aMP-16 γ1γ1 κκ aMP-18aMP-18 γ1γ1 κκ aMP-20aMP-20 γ1γ1 κκ aMP-21aMP-21 γ1γ1 κκ aMP-22aMP-22 γ2aγ2a κκ

모노클로날 항체의 특이성Specificity of Monoclonal Antibodies 모노클로날 항체Monoclonal antibodies 사용한 항원Antigen used rhTGFβ2rhTGFβ2 rhBMP-2rhBMP-2 aMP-1aMP-1 0.0160.016 0.060.06 aMP-2aMP-2 0.0140.014 0.0430.043 aMP-3aMP-3 0.0470.047 0.0550.055 aMP-4aMP-4 0.0460.046 0.0480.048 aMP-5aMP-5 0.0180.018 0.0240.024 aMP-6aMP-6 0.0290.029 0.0180.018 aMP-7aMP-7 0.0260.026 0.030.03 aMP-8aMP-8 0.0340.034 0.0320.032 aMP-9aMP-9 0.0110.011 0.0320.032 aMP-10aMP-10 0.0190.019 0.0280.028 aMP-11aMP-11 0.0190.019 0.0270.027 aMP-12aMP-12 0.0120.012 0.0180.018 aMP-13aMP-13 0.0350.035 0.0350.035 aMP-14aMP-14 0.0220.022 0.0240.024 aMP-15aMP-15 0.0150.015 0.0230.023 aMP-16aMP-16 0.0230.023 0.0280.028 aMP-18aMP-18 0.0350.035 0.0250.025 aMP-20aMP-20 0.0250.025 0.0180.018 aMP-21aMP-21 0.0290.029 0.0190.019 aMP-22aMP-22 0.0250.025 0.020.02 항TGFβ 항체Anti-TGFβ antibody 2.22.2 0.0250.025 항BMP-2 항체 함유 항혈청Antiserum with Anti-BMP-2 Antibody 1.51.5 1.3511.351 음성 대조구Negative control 0.0760.076 0.0650.065 단위 ; OD₄₅₀nmunit ; OD ₄₅₀ nm 컷 오프값 ; 음성 대조구 값Cut off value; Negative control value

모노클로날 항체의 분류Classification of Monoclonal Antibodies 타입type 동일 에피토프에 반응하는 모노클로날 항체Monoclonal Antibodies Responding to the Same Epitope AA aMP-1, aMP-15aMP-1, aMP-15 BB aMP-2, aMP-3, aMP-6, aMP-7, aMP-18aMP-2, aMP-3, aMP-6, aMP-7, aMP-18 CC aMP-4aMP-4 DD aMP-5aMP-5 EE aMP-8, aMP-11, aMP-20aMP-8, aMP-11, aMP-20 FF aMP-9, aMP-14aMP-9, aMP-14 GG aMP-10, aMP-21aMP-10, aMP-21 HH aMP-12aMP-12 II aMP-13, aMP-16aMP-13, aMP-16 JJ aMP-22aMP-22

모노클로날 항체에 의한 ALP 활성 저해 시험Inhibition of ALP Activity by Monoclonal Antibodies 첨가한 모노클로날 항체Added monoclonal antibody ALP 활성ALP activity aMP-1aMP-1 0.0980.098 aMP-2aMP-2 0.1250.125 aMP-3aMP-3 0.1430.143 aMP-4aMP-4 0.0140.014 aMP-5aMP-5 0.0220.022 aMP-6aMP-6 0.1420.142 aMP-7aMP-7 0.0270.027 aMP-8aMP-8 0.0210.021 aMP-9aMP-9 0.040.04 aMP-10aMP-10 0.0450.045 aMP-11aMP-11 0.0090.009 aMP-12aMP-12 0.1140.114 aMP-13aMP-13 0.060.06 aMP-14aMP-14 0.0790.079 aMP-15aMP-15 0.070.07 aMP-16aMP-16 0.0770.077 aMP-18aMP-18 0.0920.092 aMP-20aMP-20 0.0160.016 aMP-21aMP-21 0.0180.018 aMP-22aMP-22 0.1390.139 항체 미첨가No antibody added 0.1580.158 단위 : OD₄₀₅nmUnit: OD ₄₀₅ nm 측정치 : MP52가 없을 때의 대조구값을 뺀 값Measured value: Subtracted control value without MP52

본 발명의 사람 MP52에 대한 마우스 모노클로날 항체는 유전공학적으로 생산된 사람 MP52의 정제 및 정량 등에 유용하다.Mouse monoclonal antibodies against human MP52 of the present invention are useful for the purification and quantification of genetically produced human MP52.

〈서열목록〉〈Sequence List〉

(1) 서열 번호: 1(1) SEQ ID NO: 1

길이: 119Length: 119

유형: 아미노산Type: Amino Acid

토폴로지: 직쇄상Topology: linear

분자형태: 펩티드Molecular Form: Peptide

단편형: N 말단 단편Fragment: N terminal fragment

기원:origin:

생물명: 사람 (호모 사피엔스)Bio: Person (Homo Sapiens)

조직의 종류: 사람 태아Type of Tissue: Human Fetus

서열의 특징Characteristic of the sequence

존재 위치:Presence location:

기타 정보: MP52 아미노산 서열 중 383번부터 501번까지의 아미노산 서열Other information: Amino acid sequence of 383 to 501 of MP52 amino acid sequence

(2) 서열 번호: 2(2) SEQ ID NO: 2

길이: 27Length: 27

유형: 핵산Type: Nucleic Acid

가닥수: 단일쇄Number of strands: single chain

토폴로지: 직쇄상Topology: linear

분자 형태: 기타 핵산Molecular Form: Other Nucleic Acids

기원: 없음Origin: none

생물명: 없음Creature: None

균주명: 없음Strain name: None

서열의 특징 : MP52 성숙형의 PCR 상류 프라이머Characteristic of the sequence: PCR upstream primer of the MP52 mature type

(3) 서열 번호: 3(3) SEQ ID NO: 3

길이: 26Length: 26

유형: 핵산Type: Nucleic Acid

가닥수: 단일쇄Number of strands: single chain

토폴로지: 직쇄상Topology: linear

분자 형태: 기타 핵산Molecular Form: Other Nucleic Acids

기원: 없음Origin: none

생물명: 없음Creature: None

균주명: 없음Strain name: None

서열의 특징: MP52 성숙형의 PCR 하류 프라이머Characteristic of sequence: PCR downstream primer of MP52 mature

(4) 서열 번호: 4(4) SEQ ID NO: 4

서열의 형: 상응하는 단백질의 뉴클레오티드Type of sequence: nucleotide of the corresponding protein

길이: 2703Length: 2703

가닥수: 이중쇄Number of strands: double strand

토폴로지: 직쇄상Topology: linear

분자 형태: cDNA - mRNAMolecular Form: cDNA-mRNA

기원: 없음Origin: none

생물명: 없음Creature: None

640-720 bp: 신호 펩티드640-720 bp: signal peptide

1783-2142 bp: 성숙 펩티드1783-2142 bp: mature peptide

조직의 종류: 사람 지라Type of organization: People

Claims (11)

다이머형의 사람 MP52에 결합하지만 모노머형의 사람 MP52에는 결합하지 않는, 사람 MP52에 대한 마우스 모노클로날 항체.A mouse monoclonal antibody against human MP52 that binds to dimeric human MP52 but not to monomeric human MP52. (1) 다이머형 MP52에 결합하며,(1) coupled to the dimer type MP52, (2) 모노머형 MP52에 결합하지 않고,(2) does not bind to monomer type MP52, (3) H쇄의 서브클래스가 γ이고,(3) the subclass of the H chain is γ, (4) TGF-β 유전자 슈퍼 패밀리에 속하는 다른 뼈 형성 인자, 특히 아미노산 조성이 유사한 TGF-β 및 BMP-2와 교차 반응하지 않는 마우스 모노클로날 항체.(4) Mouse monoclonal antibodies that do not cross react with other bone forming factors belonging to the TGF-β gene superfamily, especially TGF-β and BMP-2, which have similar amino acid compositions. 제1 또는 2항에 있어서, 사람 MP52의 활성 부위에 결합하는 마우스 모노클로날 항체.The mouse monoclonal antibody according to claim 1 or 2, which binds to an active site of human MP52. 제1 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체 αMP-4인 마우스 모노클로날 항체.The mouse monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 3, which is a monoclonal antibody αMP-4. 제1 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체 αMP-5인 마우스 모노클로날 항체.The mouse monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 3, which is a monoclonal antibody αMP-5. 제1 내지 3항 중 어느 한 항에 기재된 사람 MP52에 대한 마우스 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마.A hybridoma capable of producing a mouse monoclonal antibody against human MP52 according to any one of claims 1 to 3. 제6항에 있어서, 모노클로날 항체 αMP-4 또는 αMP-5를 생산할 수 있는 하이브리도마.The hybridoma according to claim 6, which is capable of producing the monoclonal antibody αMP-4 or αMP-5. 제1 내지 3항 중 어느 한 항에 기재된 사람 MP52에 대한 마우스 모노클로날 항체를 사용하는 다이머형 사람 MP52의 정제 방법.A method for purifying dimeric human MP52 using a mouse monoclonal antibody against human MP52 according to any one of claims 1 to 3. 제8항에 있어서, 모노클로날 항체 αMP-4 또는 αMP-5를 사용하는 다이머형 사람 MP52의 정제 방법.The method for purifying dimeric human MP52 according to claim 8, wherein the monoclonal antibody αMP-4 or αMP-5 is used. 제1 내지 3항 중 어느 한 항에 기재된 사람 MP52에 대한 마우스 모노클로날 항체를 사용하는 다이머형 사람 MP52의 검출 방법.The detection method of dimeric human MP52 using the mouse monoclonal antibody to human MP52 of any one of Claims 1-3. 제10항에 있어서, 모노클로날 항체 αMP-4 또는 αMP-5를 사용하는 다이머형 사람 MP52의 검출 방법.The method for detecting dimeric human MP52 according to claim 10, wherein the monoclonal antibody αMP-4 or αMP-5 is used.