KR20000010875A - 마아커 유전자를 필요에 따라 제거할 수 있는, 식물에의 유전자도입용 벡터 - Google Patents

마아커 유전자를 필요에 따라 제거할 수 있는, 식물에의 유전자도입용 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 목적 유전자와 함께 식물세포에 도입된 마아커 유전자를, 발현 이후에 필요에 따라 존재하고 기능하는 염색체 등의 DNA로부터 제거하여 기능을 소실시킬 수 있고, 이러한 마아커 유전자의 기능의 발현 및 소실을, 도입된 식물세포에 유래하는 조직의 형태 변화에 의해 검출할 수 있는, 식물에의 유전자 도입용 벡터를 제공한다. 마아커 유전자로서 형태 이상 유도 유전자를 이용하는 한편, 탈리 기능을 가진 DNA 인자를 발현 유도형 조절 인자의 제어하에 두어, 형태 이상 유도 유전자가 상기 탈리 기능을 지닌 DNA 인자와 작용을 함께 하는 위치에 존재하고, 목적 유전자가 이와는 작용을 달리 하는 위치에 존재하도록 벡터를 구축한다.

Description

마아커 유전자를 필요에 따라 제거할 수 있는, 식물에의 유전자 도입용 벡터
유전 공학을 사용하는 미생물 및 배양 세포 등의 형질전환은 최근 의학 등에서 유용한 생리적 활성 물질을 제조하는 데 적용되어, 산업상 크게 기여하고 있다. 식물 재배 분야에서, 식물의 생명환(life cycle)은 미생물 등의 것보다 훨씬 길기 때문에 유전 공학 기술의 산업상 응용은 지체되고 있다. 그러나, 이러한 기술은 목적 유전자를 재배되는 식물에 직접 도입할 수 있기 때문에, 다수 교배를 요하는 고전적인 재배과 비교하여 (a) 개선시키려는 특성만을 도입할 수 있고, (b) 식물 이외의 종(예를 들어, 미생물 등과 같은)의 특징을 도입할 수 있으며, (c) 재배 기간을 상당히 단축시킬 수 있다는 이점이 있다. 따라서, 식물 재배를 위한 유전 공학적 방법이 활발하게 연구되어 왔다.
구체적으로, 형질전환 식물의 도입은 (1) 목적 유전자를 식물 세포에 도입시키는 단계(목적 유전자를 염색체, 핵등에 도입하는 것을 포함), (2) 목적 유전자가 도입된 세포로만 이루어진 식물 조직을 선택하는 단계 및 (3) 선택된 식물 조직으로부터 식물을 재생시키는 단계를 필요로 한다. 또한, 이들 단계 중에서, 목적 유전자가 도입된 조직을 선택함에 있어서, 일반적으로 마아커 유전자가 사용된다. 즉, 일반적으로, 마아커 유전자는 목적 유전자와 함께 식물 세포에 도입되며, 도입된 세포 뿐만 아니라 이 세포로부터 유도된 조직에서 마아커 유전자의 발현에 의해 나타나는 특징적인 특징은 목적 유전자의 도입에 대한 지수로서 사용된다. 따라서, 마아커 유전자는 지금까지 유전 공학 기술에 의해 형질전환된 거의 모든 경우의 식물에 목적 유전자 이외에 도입되어 발현된다.
그러나, 이러한 마아커로서 사용되는 유전자 산물에 관련하여, 인체에 대한 안정성이 확인된 것은 소수의 유전자 뿐이다. 따라서, 토마토 또는 감자가 마아커 유전자를 사용하여 유용한 특성을 도입하여 생산한다고 하더라도, 마아커 유전자가 발현되는 경우에 한하여 식용으로서 제공될 때 소비자들의 막연한 불안감을 포함하는 많은 문제점을 수반한다.
또한, 유전자 도입된 조직을 선택한 후, 마아커 유전자의 발현은 식물 재배를 연구하는 연구자들에게도 상당한 문제점을 유발할 것이다. 즉, 마아커 유전자를 사용하여 생산된 형질전환된 식물에 다른 유전자를 다시 도입시키려는 경우, 유전자의 도입은 동일한 마아커 유전자를 사용하여 수행될 수 없다는 것이다. 환언하면, 마아커 유전자는 식물에 이미 존재하고 있기 때문에, 마아커 유전자는 새로운 목적 유전자가 마아커 유전자와 함께 식물에 도입되든 안되든 간에 식물에서 항상 발현된다. 따라서, 이러한 마아커 유전자는 새로운 목적 유전자의 도입 지수로서 더 이상 사용될 수 없다는 것이다. 따라서, 특정 식물로의 반복되는 유전자 전달의 횟수는 식물에 유용한 상이한 마아커 유전자의 수에 의해 제한되는 것은 당연하다. 그러나, 지금까지 이용할 수 있는 마아커 유전자의 종류는 그다지 많지 않다. 또한, 모든 마아커 유전자가 목적하는 식물에 반드시 유용한 것도 아니다.
상기의 문제점을 해결하므로써 마아커 유전자의 영향을 전혀 받지 않는 유전자 도입된 조직 또는 식물을 효과적으로 생산하기 위해, 본 발명은 목적 유전자를 식물 세포에 도입하기 위한 신규한 벡터를 개발하였다(일본 특허 출원 제 H07-313432호). 이 벡터는 목적 유전자, 마아커 유전자로서 형태 이상 유도 유전자 및 분리가능한 DNA 인자를 포함하며, 여기서 형태 이상 유도 유전자는 분리가능한 DNA 인자와 일체하여 작용하도록 위치하고, 목적 유전자는 분리가능한 DNA 인자와 일체하여 작용하지 않도록 위치한다. 목적 유전자가 상기 벡터를 사용하여 식물에 도입되는 경우, 마아커 유전자는 형질전환 세포의 배양을 통한 발현 후, 이것이 존재하고 기능하는 DNA로부터 분리되고 이후 특정 비율로 기능을 소실하게 되고, 마아커 유전자의 발현 및 기능의 소실은 마아커 유전자가 도입되는 식물 세포로부터 유도된 조직의 형태 변화에 의해 검출될 수 있다. 즉, 이러한 마아커 유전자가 발현되는 세포로부터 유도된 조직은 특정의 이상 형태를 나타내며, 마아커 유전자의 기능이 이의 제거에 의해 소실된 세포(환원하면, 목적 유전자만이 도입된 세포)가 이후 조직으로부터 생성되는 경우, 정상 형태를 가지는 조직은 형성된 세포로부터 재생된다. 따라서, 이러한 벡터를 사용하므로써 목적 유전자만 도입된 세포를 포함하는 식물 조직 뿐만 아니라 후속 식물 개체는 유전자 도입된 세포의 배양과 배양에 의해 얻어진 조직의 시각적 선별을 단순히 반복하므로써 생산될 수 있다.
그러나, 마아커 유전자의 분리는 본 발명에 의해 개발된 벡터에 의해서도 자유스럽게 조절될 수 없었다. 따라서, 분리가능한 DNA 인자의 능력이 클 경우, 마아커 유전자는 매우 빨리 제거될 것이다. 예를 들어, 마아커 유전자는 목적 유전자와 함께 식물 세포에 도입된 후, 발현되기 전에 즉시 제거될 것이다. 이러한 경우, 목적 유전자만 도입된 세포로 구성된 조직이 얻어질 수 있지만, 유전자 도입된 조직의 마아커 유전자 유도 형태 변화는 일어나지 않고, 이 결과 이러한 조직은 선택될 수 없다.
또한, 마아커 유전자의 분리가 자유롭게 조절될 수 있는 경우, 목적 유전자만 도입된 세포의 생성과 이러한 세포로부터 유도된 식물 조직의 생성은 동시에 일어나거나 적절하게 조절될 수 있으며, 이에 따라 실질적으로 이러한 벡터를 사용하는 형질전환된 식물의 생산이 매우 용이하게 될 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 마아커 유전자를 함유하고, 목적 유전자와 함께 식물 세포에 도입된 마아커 유전자의 기능이 발현 후 이것이 존재하고 기능하는 염색체 등과 같은 DNA로부터 마아커 유전자를 분리시키므로써 선택적으로 분리될 수 있고, 마아커 유전자의 발현 및 기능의 소실이 유전자 도입된 식물 세포로부터 유도된 조직의 형태 변화에 의해 검출될 수 있는, 식물에 유전자를 도입하기 위한 벡터를 제공하는 데 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 마아커 유전자로서 형태 이상 유도 유전자를 사용하여 벡터를 구성하면서 유도성 프로모우터의 조절하에 두므로써 달성될 수 있으며, 여기서 형태 이상 유도 유전자는 분리가능한 DNA 인자와 일체하여 작용하도록 위치하고, 목적 유전자는 분리가능한 DNA 인자와 일체하여 작용하지 않도록 위치한다.
본 발명은 하기에서 상세하게 설명될 것이다.
본원에서 사용되는 형태 이상 유도 유전자는 왜화(dwarf), 정상 우세의 파괴, 색소의 변화, 근두암종의 형성, 모형근의 형성, 잎등의 파형과 같은 식물 형태의 비정상적 분화의 조직을 유도하는 유전자이다. 시토키닌 합성 유전자(예를 들어, ipt(이소펜테닐트랜스퍼라아제) 유전자(A.C. Smigocki, L.D. Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5131, 1988)), iaaM(트립토판 모노옥시게나아제) 유전자(H. J. Klee et al., GENES & DEVELOPMENT, 1:86, 1987), 유전자 5(H. Koerber et al., EMBO Journal, 10:3983, 1991), 유전자 6b(P.J.J. Hooyaas et al., Plant Mol. Biol., 11:791, 1988), ro1A 내지 D와 같은 ro1 유전자(F.F. White et al., J. Bacteriol., 164:33, 1985) 등과 같은 여러 형태 이상 유도 유전자가 여러 식물에서의 암종 또는 기형종(즉, 부정 싹 및 부정근의 형성)을 유도하는 아그로박테륨 속 등의 세균에 존재하는 것으로 보고되어 있다. 또한, 여러 식물에서의 슈도모나스 시린자에 아종(Pseudomonas syringae subsp. savastanoi)에서의 iaaL(인도아세트산 리신 합성효소) 유전자(A. Spena et al., Mol. Gen. Genet., 227:205, 1991) 및 호메오 박스(hemeo box) 유전자, 피토크롬(phytochrome) 유전자 등이 보고되어 있다.
이들 유전자중 어느 것도 본 발명에 사용될 수 있다. 이들중에서, 정상 우세의 파괴를 유도하는 ipt 유전자 및 모형근의 형성, 왜화, 모형근으로부터 재생된 식물의 잎 등의 파형을 유도하는 ro1 유전자는 여러 형태 이상 유도 유전자 중에서 특징적인 형태 이상을 유도하기 때문에 본 발명의 마아커 유전자로 바람직하다.
또한, 이들 마아커 유전자의 합쳐, 부정 싹, 부정근 등과 같은 특이적 구조가 이들 마아커 유전자가 도입되는 특이적 식물에서 재분화될 수 있다. 본 발명에서, 이러한 형태 이상 유도 유전자의 조합은 유전자가 도입되는 식물의 종류와 같은 형질전환 식물을 생산 조건에 따라 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 분리가능한 DNA 인자는 DNA 인자가 존재하고 기능하는 DNA로부터 자체 분리가능한 DNA 서열의 인자이다. 식물에서 염색체내 존재하는 트랜스포슨(transposon)이 이러한 인자로 공지되어 있다. 트랜스포슨의 구조, 활성 및 작용은 거의 완벽하게 확인되었다. 기능상의 트랜스포슨에 있어서, 이론상 두가지 요소가 요구되며, 이중 하나는 그 안에 존재하는 유전자로부터 발현되어 트랜스포슨 자체의 절단 및 전이를 촉매화하는 효소(트랜포사아제)이고, 나머지 하나는 트랜스포슨의 말단 영역에 존재하며, 트랜스포사아제가 작용하는 DNA 결합 서열이다. 이들 인자에 의해, 트랜스포슨은 이것이 존재하는 염색체로부터 삭제되고, 이후 일반적으로 DNA의 새로운 위치로 전이된다. 그러나, 특정 비율로, 트랜스포슨은 또한 전이되지 않고 사라진다. 본 발명은 이러한 트랜스포슨의 전이 에러를 이용한다.
트랜스포슨은 두가지 유형인 자율성 트랜스포슨 또는 비자율성 트랜스포슨중 하나일 수 있다. 자율성 트랜스포슨은 두가지 요소인 트랜스포사아제 및 DNA 결합 서열을 유지한다. 자율성 트랜스포슨에서, 트랜스포사아제는 작용하기 위해 발현되어 DNA 결합 서열에 결합하고, 이로써 트랜스포슨은 자율적으로 염색체로부터 삭제된다. 비자율성 트랜스포슨은 트랜스포사아제가 작용을 위해 결합된 말단 DNA 결합 서열을 보유한다. 비자율성 트랜스포슨에서, 트랜스포사아제 유전자는 트랜스포사아제가 발현되지 않도록 돌연변이를 유발하며, 이에 따라 트랜스포슨은 염색체로부터 자율적으로 삭제될 수 없다. 그러나, 트랜스포사아제가 자율성 트랜스포슨 또는 독립적인 트랜스포사아제 유전자로부터 비자율성 트랜스포슨에 공급되는 경우, 비자율성 트랜스포슨은 자율성 트랜스포슨과 유사하게 작용한다.
따라서, 본 발명에서 자율성 및 비자율성 트랜스포슨이 둘다 사용될 수 있다. 예를 들어, 비자율성 트랜스포슨은 그 안에 형태 이상 유도 유전자 및 자율성 트랜스포사아제로부터 얻은 또는 합성된 전이 효소 유전자를 삽입시키므로써 사용될 수 있다.
자율성 트랜스포슨의 예에는 옥수수로부터 분리된 Ac 및 Spm(A. Gierl and H. Saedler, Plant Mol. Biol., 19:39, 1992)이 포함된다. Ac는 제한 엔도누클레아제 Sau3A로 옥수수의 염색체에서 wx-m7 좌위를 분해시키므로써 얻어질 수 있다(U. Behrens et al., Mol. Gen. Genet., 194:346, 1984). 식물 트랜스포슨 중에서 가장 해석이 진전된 자율성 트랜스포슨으로서, DNA 서열도 이미 해명되어 있으므로(M.Mueller-Neumann et al.,Mol.Gen.Genet.,198:19,1984) , 당업자가 용이하게 취득할 수 있다는 점 때문에, 본 발명에 사용되는 DNA 인자로서 적합하다. 또한, 비 자율성 트랜스포슨으로는 각각 Ac, Spm의 내부영역이 결손된 Ds나 dSpm을 비롯한(H.-P.Doering and P.Starlinger, Ann.Rev.Genet.,20:175,1986) 등의 각종의 것이 옥수수 이외에도, 금어초, 나팔꽃 등의 많은 식물로부터 분리되어 있다(예를 들면, Y.Inagaki et al., Plant Cell, 6:375,1994). 또한, 이들 트랜스포슨은 유래가 되는 식물과는 다른 종류의 식물의 염색체에 도입되었을 경우에도, 능력을 발휘하여 탈리(脫離)하여 전이된다는 사실이 많은 예를 통해 알려져 있다(예를 들면, B.Baker et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA,83:4844,1986).
더욱이, 식물 이외에 존재하는 탈리 능력을 가진 DNA 인자로는, 부위 특이적 재조합계(site-specific recombination system)에서 유래하는 것이 알려져 있다. 상기 부위 특이적 재조합계는, 특징적인 DNA 배열을 가지는 재조합 부위(본 발명의 탈리 능력을 지닌 DNA 인자에 해당함), 및 상기 DNA 배열(재조합 배열)에 특이하게 결합되어 배열이 2개 이상 존재하였을 때, 배열간의 재조합을 촉매하는 2가지 요소로 되어 있고, 상기 재조합 배열이 동일 DNA 분자상에, 동일방향을 향해 일정간격으로 2곳에 존재할 경우에는, 여기에 샌드 위치되는 영역이 상기 DNA 분자(플라즈미드, 염색체 등)로부터 탈리되고, 상기 배열이 대향되는 방향을 향해 2곳에 존재할 경우에는, 영역이 반전하는 양상을 보인다. 본 발명에서는, 전자의 탈리 작용을 이용하지만, 이와 같은 재조합 부위의 탈리·반전은, 부위 특이적 재조합계에 의한 이른바 상동적(相同的) 재조합의 결과로서 발생되는 것이며, 이것이, 전이 과정으로서 탈리를 일으키는, 트랜스포슨을 이용한 경우의 기구와 가장 큰 차이점이다. 또한, 재조합 효소를 코드하는 유전자는 반드시 재조합 부위와 동일한 DNA 분자상에 존재할 필요는 없으며, 동일 세포내에 존재하고 발현되어 있기만 하다면, 상기 재조합 배열간의 탈리·반전을 발생시킬 수 있다고 알려져 있다(N.L.Craig Annu.Rev.Genet.,22:77,1988).
현재, 부위 특이적 재조합계는 퍼어지, 세균(예를 들어, 대장균), 효모 등의 미생물로부터 분리된 Cre/lox 계, pSRl계, FLP계, cer계, fim계 등이 알려져 있으나(총설로서, N.L.Craig, Annu.Rev.Genet.,22:17,1988), 고등 생물에서는 아직 존재가 알려져 있지 않다. 그러나, 이들 미생물로부터 분리된 부위 특이적 재조합계도, Pl퍼어지에서 유래된 Cre/lox계가 식물에 대한 유전자 도입용 벡터로 이용되어, 식물중에서도 기능을 발휘하는 등(국제 공개 공보 WO93/01283호), 유래하는 생물종과는 다른 생물종(식물을 포함함)에 도입된 경우에도, 원래의 생물내에서의 움직임과 동일한 움직임을 채택한다고 알려져 있다. 또한, 본 발명의 실시예에서는, 효모(Zygosaccharomyces rouxii)의 부위 특이적 재조합계인 pSRl계(H.Matsuzaki et al.,J.Bacteriology,172:610,1990)를, 재조합 부위에 재조합 효소를 삽입하여 이용하였으나, 상기 pSRl계 또한, 고등 식물에서 본래의 기능을 발휘하는 것이 이미 보고되어 있다(H.Onouchi et al,Nucleic Acid Res.,19:6373,1991).
본 발명에서는 상기 탈리 기능을 지닌 DNA 인자를 발현 유도형 조절 인자의 제어하에 둔다.
즉, 세균 등의 원핵(原核)생물로부터 효모, 곰팡이, 고등식물, 포유류 등의 진핵(眞核)생물에 이르는 모든 생물의 유전자에는, 구조 유전자의 상류영역에 발현 유도형 조절 인자가 존재하며, 이들이 단독으로 또는 여러 개가 협동하여 기능함으로써, 하나의 유전자나 유전자군의 발현을 제어하며, 예를 들어, 때로는 고체의 분화나 발육장소에 따라서, 때로는 열, 빛, 금속 등의 여러 환경요인에 따라 유전자 발현을 제어한다. 본 발명에서는 이러한 역할을 하는 발현 유도형 조절 인자를 이용하고 상기 하류 영역에 탈리 기능을 지닌 DNA 인자를 배치하여 발현, 결국은 탈리 기능을 제어하는 것이다.
이러한 발현 유도형 조절 인자로는 현재까지, 화학물질에 반응하는 것으로서 글루타티온-S-트랜스퍼라아제Ⅰ계 유전자의 프로모우터(일본 특허 공개 공보 제1993-268965호), 글루타티온-S-트랜스퍼라아제Ⅱ계(GST-Ⅱ) 유전자의 프로모우터(국제 공개 공보 WO93/01294호), Tet리프레서 융합형 콜리플라워(cauliflower)모자이크 바이러스 35S 프로모우터(C.Gatz et al., Mol.Gen.Genet.,227:229,1991), Lac오퍼레이터/리프레서계 프로모우터(R.J.Wilde et al., The EMBO Journal, 11:1251,1992), alcR/alcA계 프로모우터(국제공개공보WO94/03619호), 글루코코티코이드계 프로모우터(아오야마 다쿠시, 단백질 핵산 효소, 41:2559,1996)등이 알려져 있고, 열에 반응하는 것으로서 hsp80 프로모우터(일본 특허 공개 공보 제 1993-276951호) 등이 알려져 있으며, 또한 빛에 반응하는 것으로서 리불로오스 비스포스페이트 카르복실라아제 소 서브유니트 유전자(rbcS)의 프로모우터(R.Fluhr et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:2358,1986), 프락토스 1,6-비스포스파타아제 유전자의 프로모우터(일본 특허 공보 제 1995-501921호), 집광성 클로로필 a/b 결합단백질 유전자의 프로모우터(일본 특허 공개 공보 제 1993-89호)등이 알려져 있다.
이 중, 고등식물의 발현 유도형 조절 인자로서 가장 연구가 진전되어 있는 것은 rbcS의 프로모우터이며, 츄아(Chua)등에 의해 상세히 분석되어 왔다(예를 들면, 마츠오카, 식물 세포 공학 임시증간, 3:552,1991참조). 이로 인해, 본 발명의 실시예1에서도 상기 조절 인자를 이용하였으나, 상기 인자가 어떻게 빛에 의한 유전자 발현 조절을 수행하는지는, 현 상태에서는 아직 확정할 수 없다. 한편, GST-Ⅱ유전자의 프로모우터를 대표로 하는 화학물질반응성 프로모우터는, 유전자 발현의 유도를 화학물질의 존재량에 의해 비교적 자유롭게 제어할 수 있기 때문에, 열이나 빛을 조절하여 유전자 발현을 제어해야만 하는, 열이나 빛 반응성 프로모우터보다 실용적인 면에서 사용이 용이하다는 장점을 가진다.
또한 본 발명에서, 형태 이상 유도 유전자를 삽입하는 장소는, 탈리 기능을 지닌 DNA 인자와 함께, 탈리될 수 있는 위치이기만 하면 된다. 예를 들어, 탈리 기능을 지닌 DNA 인자로서 트랜스포슨을 이용한 경우에는, 전이효소 유전자의 프로모우터영역보다 상류이며 상기 전이효소가 결합되는 말단 영역보다는 하류인, 트랜스포슨의 탈리에 영향을 미치지 않는 위치에 삽입할 수 있다. 또한, pSRl계를 이용한 경우에는, 재조합 배열에 포함된 영역내에서, 재조합 효소의 발현을 저해하지 않는 위치라면, 어디에나 삽입가능하다.
본 발명의 벡터는 유전자 공학적 방법에 의해 유전자 도입이 가능한 어떠한 식물에서도 이용될 수 있으며, 본 발명의 벡터에 의해 식물에 도입될 수 있는 목적 유전자는 농업적으로 우수한 형질을 부여할 수 있는 유전자나, 농업적으로 우수한 형질을 부여하는 데 한정되지 않지만, 유전자 발현기구의 연구에 필요한 유전자 등, 목적에 따라서 다양하게 선택할 수 있다.
또한, 이러한 목적 유전자의 프로모우터, 터미네이터에 대해서는, 식물에서 기능하는 것이라면, 달리 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 프로모우터로는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모우터(J.T.Odell et al.,Nature(London),313:810,1985), 노펠린 합성효소의 프로모우터(W.H.R.Langridge et al.,Plant Cell Rep., 4:355,1985)등을 사용할 수 있고, 또한 터미네이터로는 노펠린 합성효소의 폴리아데닐화 시그날(A.Depicker et al.,J.Mol.Appl.Gen.,1:561,1982), 옥토핀 합성효소의 폴리아데닐화 시그날(J.Gielen et al.,EMBO J.,3:835,1984)등을 사용할 수 있다.
더욱이, 본 발명에서 사용되는 유전자, 즉 DNA는 cDNA 또는 게놈 DNA의 클로닝에 의해 얻을 수 있으나, 미리 서열이 명확하다면, 화학 합성을 통해 얻을 수도 있다.
본 발명의 벡터는 식물에 감염되는 바이러스나 세균을 통해, 식물 세포에 간접적으로 도입될 수 있다(I.Potrykus,Annu.Rev.Plant Physiol.PlaMol.Biol.,42:205,1991). 이러한 경우, 예를 들어 바이러스로는, 콜리플라워 모자이크 바이러스, 제미니(gemini)바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 브롬 모자이크 바이러스 등이 사용가능하며, 세균으로는, 아그로박테리움·투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens;이하, A.투메파시엔스로 약칭함), 아그로박테리움·리조게네스 등을 사용할 수 있다. 또한 아그로박테리움속(屬)은, 일반적으로 외떡잎 식물에는 감염되지 않고, 쌍떡잎 식물에만 감염된다고 되어 있으나 최근에는 이들을 외떡잎 식물에 감염시켜 유전자를 도입하는 예도 보고되어 있다(예를 들면, 국제 공개 공보 WO94/00977호).
본 발명의 벡터는 또한 마이크로인젝션법, 일렉트로포레이션법, 폴리에틸렌글리콜법, 융합법, 고속 비행침투법(ballistic penetration) 등의 물리적·화학적 방법에 의해서도, 식물세포에 직접 도입할 수 있다(I.Potrykus, Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,42:205,1991). 대부분의 외떡잎 식물이나 아그로박테리움이 감염되기 어려운 쌍떡잎 식물에 대해서는 유전자 도입법으로서 범용되고 있는 아그로박테리움을 이용한 간접 도입법이 사용될 수 없기 때문에, 이들의 직접 도입법이 유효하다.
본 발명은 유전 공학적 방법을 사용하여 식물에 목적 유전자를 도입하여 형질전환 식물을 얻는 신규한 벡터에 관한 것이다.
도 1은 pNPI206 구성중, pNPI201의 구성까지를 나타내는 개략도이다.
도 2는 pNPI206 구성중, pNPI201로부터 pNPI203의 구성까지를 나타낸 개략도이다.
도 3은 pNPI206 구성중, pNPI203로부터 pNPI204의 구성까지를 나타낸 개략도이다.
도 4는 pNPI206 구성중, pNPI204로부터 pNPI206의 구성까지를 나타낸 개략도이다.
도 5는 pNPI206의 구조중, T-DNA 영역의 제한 효소 지도이다.
도 6은 pNPI125의 구성도이다.
도 7은 pNPI128의 구성도이다.
도 8은 pNPI123의 구성중, pIPT2의 구성까지를 나타낸 개략도이다.
도 9는 pNPI123의 구성중, pIPT2로부터 pIPT3의 구성까지를 나타낸 개략도이다.
도 10은 pNPI123의 구성중, pIPT3로부터 pIPT4의 구성까지를 나타낸 개략도이다.
도 11은 pNPI123의 구성중, pIPT4로부터 pNPI123의 구성까지를 나타낸 개략도이다.
도 12는 pNPI303의 구성중, pNPI200 및 pGlE7로부터 pNPI301의 구성까지를 나타낸 개략도이다.
도 13은 pNPI303의 구성중, pNPI123 및 pNPI128로부터 pIPT8의 구성까지를 나타낸 개략도이다.
도 14는 pNPI303의 구성중, pNPI301 및 pIPT8로부터 pNPI302의 구성까지를 나타낸 개략도이다.
도 15는 pNPI303의 구성중, pNPI302로부터 pNPI303의 구성까지를 나타낸 개략도이다.
본 발명에 있어서, 마아커 유전자로서 이용된 형태 이상 유도 유전자는 발현에 의해, 도입된 식물세포에서, 식물 성장 호르몬의 이상 생산 등, 세포내의 생리상태에 이상을 일으키고, 결과적으로 증식·분화의 방향을 어지럽혀, 여기에 유래되어 형성되는 조직에 여러 형태 이상을 일으킨다. 결국, 여기서 생기는 이상 형태의 조직, 예를 들어 정상우세가 붕괴된 무질서한 싹의 집합체(다아체;多芽體)나 모형근 등은, 이러한 형태 이상 유도 유전자가 도입된 세포에 유래하며, 이것이 이상한 증식·분화한 결과 생성된 것이기 때문에, 상기 유전자를 지닌 세포만으로 이루어진다. 따라서, 이를 마아커 유전자로서 목적 유전자와 함께 벡터를 구축하고, 상기 벡터를 식물세포에 도입하여 상기 세포를 배양하기만 하면, 여기서 생겨나는 이상 형태의 조직을 육안으로 선별하므로써, 마아커 유전자, 즉 목적 유전자가 도입된 세포만으로 이루어진 조직을 선별할 수 있게 된다.
또한 본 발명에서는, 상기 형태 이상 유도 유전자를, 발현 유도형 조절 인자의 제어하에 둔 탈리 기능을 지닌 DNA 인자와 움직임을 같이 하는 위치에 두고 이용한다. 이러한 구성을 가지는 벡터를 이용하여 식물에 유전자를 도입하면, 도입 후, 식물세포에 열, 빛, 화학물질 등, 사용된 발현 유도형 조절 인자에 따른 적당한 자극을 인위적으로 부여하므로써 탈리 기능을 지닌 DNA 인자를 발현시킬 수 있으며, 이 결과, 마아커 유전자인 형태 이상 유도 유전자는 상기 DNA 인자와 함께, 이들이 도입되어 기능한 DNA 상에서 일정 확률로 탈리하여 기능을 상실하며, 한편, 움직임을 함께 하지 않는 목적 유전자는 같은 DNA상에 잔류하여 기능을 계속 유지하는, 결국, 목적 유전자만이 발현가능하게 도입된 세포가 얻어지게 된다.
또한 상기 마아커 유전자, 즉 형태 이상 유도 유전자의 기능 상실은 유전자 도입시와 마찬가지로, 유전자 도입 조직의 형태 변화로서 육안으로 검출될 수 있기 때문에, 마아커 유전자의 기능이 상실된 세포만으로 이루어진 조직, 다시 말해, 목적 유전자만이 발현가능하게 도입된 세포만으로 이루어진 조직은, 확실하고 용이하게 선별될 수 있게 된다. 즉, 이러한 세포만으로 이루어진 조직을 얻기 위해서는, 우선, 유전자 도입 처리 후의 세포를 배양하고, 형태 이상 유도 유전자의 발현에 의해 발생되는 다아체, 모형근 등, 이상 형태를 지닌 조직을 육안으로 선별하여 이를 분리한다. 그리고, 분리된 조직의 배양시에, 필요에 따라 사용된 발현 유도형 조절 인자에 따른 적당한 자극을 부여한다면, 이들 이상 형태의 조직으로부터 이번에는 정상적인 형태를 지닌 조직이 생겨나므로 이를 역시 육안으로 선별하면 된다.
이하에 본 발명을 실시예에 근거하여 설명한다. 또한, 이하의 실시예에서, 더욱 상세한 실험 조작은 특별하게 명시한 경우를 제외하고, 분자·클로닝 제 2 판(Sambrook et al.eds., Cold Spring Harbar Laboratory Press, New York,1989) 또는 제조업자의 취급설명서에 따라 실시되었다.
〔실시예1〕
Ⅰ. 벡터의 구성
일본 특허 출원 제 1995-313432호에서 얻어진 pNPI125로부터, 효모의 부위 특이적 재조합계(pSR1계)의 재조합 효소 유전자(이하, R유전자로 함)와 여기에 연결된 노펠린 합성효소 폴리아데닐화 시그날을 제한효소 XbaI 및 EcoRI에서 잘라내어 pHSG398(다카라주조(주)에서 구입)의 XbaI-EcoRI 제한효소부위 사이에 삽입하여 플라즈미드 pNPI200를 얻었다.
한편, 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라아제 소 서브유니트 유전자의 프로모우터(rbcS-3B)를 포함하는 플라즈미드(나고야대학의 스기타 마모루씨로부터 양도받음)를 제한효소 KpnI로 절단하여, 절단에 의해 생긴 돌출 말단을 T4 중합효소I(대 서브유니트)를 사용하여 평활화한 뒤, 여기에 5' 인산화 SalI 링커를 삽입하여 플라즈미드 pRBCS를 구성하고, 상기 pRBCS로부터 rbcS-3B를 제한효소 SalI에서 잘라내고 pNPI200의 SalI 제한효소 부위에 삽입하여, 플라즈미드 pNPI201를 얻었다. 또, 상기 rbcS-3B는, 토마토(Lycopersicon esculentum VFNT LA1221)에서 유래된 광반응성 프로모우터이다. 토마토는 rbcS의 발현 유도형 조절 인자로서, 이 밖에 5종의 동일한 프로모우터를 갖고 있고(rbcS-1, 2,-3,-3A,-3C), 발현양식은 스기타씨등에 의해 해석되어 있다(M. Sugita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7104,1987).
다음으로, 상기 pNPI201를 제한효소 PstI 및 BamHI에서 절단하고, 돌출 말단을 T4 중합효소 I(대 서브유니트)로써 평활화한 뒤 다시 연결하고, 이를 플라즈미드 pNPI202로 하였다. 상기 pNPI202로부터, rbcS-3B, R유전자 및 노펠린 합성효소 폴리아데닐화 시그날을 포함하는 단편을 제한효소 EcoRI와 HindⅢ에서 잘라내고, 이를 pUC 119(다카라주조(주)에서 구입)의 EcoRI-HindⅢ 제한효소 부위 사이에 삽입하여, 플라즈미드 pNPI203를 구성하고, 또한 상기 pNPI203로부터, 다시 rbcS-3B, R유전자 및 노펠린 합성효소 폴리아데닐화 시그날을 포함한 단편을 제한효소 EcoRI와 HindⅢ에서 잘라내어, 일본 특허 출원 제 1995-313432호에서 얻어진 pNPI128의 EcoRI-HindⅢ 제한효소 부위 사이에 삽입함으로써, 플라즈미드 pNPI204를 얻었다.
그리고, 상기 pNPI204의 HindⅢ 제한효소 부위에, 역시 일본 특허 출원 제 1995-313432호에서 얻어진 pNPI123에서 제한효소 HindⅢ에서 잘라 낸, 콜리플라워모자이크 바이러스 35S 프로모우터(CaMV35S 프로모우터)와 여기에 연결된 ipt유전자를 포함하는 단편을 삽입하여, 플라즈미드 pNPI205를 얻었다.
목적으로 하는 벡터는 상기 pNPI205로부터, CaMV35S 프로모우터에 연결된 ipt유전자, rbcS-3B에 연결된 R유전자 및 노펠린 합성효소 폴리아데닐화 시그날, 및 이들의 양단에 있는 효모의 부위 특이적 재조합계의 재조합 배열(Rs)을 제한효소 PstI에서 잘라내어, 식물에 유전자를 도입하기 위한 벡터 플라즈미드 pBI121(동양방적(주)에서 구입)의 SseI제한효소 부위에 삽입함으로써 얻어지며, 이를 플라즈미드 pNPI206로 명명하였다. 상기 플라즈미드를 갖는 A. 투메파시엔스를 식물에 감염시킨 경우, 구조 내부의, 이른바 T-DNA 영역이라고 불리우는 RB 사이트와 LB 사이트의 내측, 여기서는 nptⅡ유전자(네오마이신 인산화효소 유전자)부위로부터 GUS 유전자(β-갈락토시다아제 유전자)부위에 이르기까지의 약12.5kb의 영역이 식물염색체에 편성된다.
또, 상기 플라즈미드 pNPI206는, 대장균(Escherichia coli) JM109주(株)에 도입되어 대장균을 E. coli JM109(pNPI206)〔통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(우편번호 305, 일본 이바라기현 쯔쿠바시 히가시 1가 1번 3호), 국제수탁(受託)번호:FERM BP-5518, 평성 8년(1996년) 4월24일에 부다페스트조약에 근거한 원기탁]으로서, 국제기탁에 기탁되어 있다.
pNPI206의 개략적인 구성을 도 1 내지 4에 나타내고, T-DNA 영역의 제한효소 지도를 도 5에 도시하였다. 또한, pNPI125의 개략적인 구성은 도 6에 도시되었으며, pNPI128의 개략적인 구성은 도 7에, 그리고 pNPI123의 개략적인 구성은 도 8 내지 11에 도시하였다. 또, 이들 도면에서, 35S-P은 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모우터이고, N0S-P는 노펠린 합성효소의 프로모우터이며, T는 마찬가지로 노펠린 합성효소의 폴리아데닐화 시그날이고, 원으로 에워싼 T는 ipt유전자 자체의 폴리아데닐화 시그날이고, 그물 표시된 삼각형은 재조합 배열(Rs)과 배열 방향을 나타낸다.
도 5으로부터 알 수 있는 바와 같이, 이 플라즈미드는 T-DNA영역, 즉 식물염색체에 편성되는 영역내에, 마아커 유전자로서 ipt유전자를 가지고, 목적 유전자의 모델로서 nptⅡ유전자 및 GUS 유전자를 갖고 있다. 상기 ipt유전자는, 병원성 A. 투메파시엔스가 유지하는 종양화 유전자의 일원이고, 이를 식물세포에 도입하면, 식물 호르몬의 일종인 시토키닌이 과잉 생산되어, 세포 분화의 방향이 다아체 형성을 향하게 된다. 또한, nptⅡ유전자는 카나마이신 저항성에 기여하는 유전자로서, GUS 유전자는 이것이 포함된 세포가 특수한 기질을 신진대사하여 청색의 색소를 생산함으로써, 역시 식물에서 유전자 발현의 해석에 범용되고 있는 유전자이다.
그리고, 상기 플라즈미드에 있어서 탈리 기능을 갖는 DNA 인자로서 기능하는 것은, 효모의 부위 특이적 재조합계인 pSRl계의 재조합 배열, Rs간의 영역이고, 그 때문에, ipt유전자는, 동일 방향을 향한 상기 두 개의 재조합 배열(Rs)에 끼워진 형태로 삽입되어 있다. 그러나 동시에, Rs간의 탈리를 촉매하는 효소의 유전자인 R 유전자는 발현 유도형 조절 인자, 즉 광반응성 프로모우터(rbcS-3B)의 하류 영역에 연결되어 있고, 이 때문에 상기 프로모우터에 의해 제어되어 적당한 빛조건이 아니면 발현되지 않도록, 즉 Rs간의 탈리가 일어나지 않도록 되어 있다.
Ⅱ.아그로박테리움에 대한 pNPI206의 도입
A. 투메파시엔스 LBA4404(CLONTECH사에서 구입)주(株)를, 10ml의 YEB 액체 배지(비프엑기스 5g/ℓ, 효모엑기스1g/ℓ, 펩톤1g/ℓ, 자당5g/ℓ, 2mM Mg SO4, 22℃ 에서의 pH7.2(이하, 특별하게 명시하지 않는 경우에는, 22℃에서의 pH로 한다))에 접종하고, OD630가 0.4 내지 0.6에 이를때까지, 28℃에서 배양하였다. 배양액을 6900×g, 4℃에서 10분간 원심분리하여 집균(集菌)한 후, 균체를 20ml의 10mM Tris-Hcl(pH8.0)로 현탁하고, 다시 6900×g, 4℃에서, 10분간 원심분리으로 집균한 후 상기 균체를 200㎕의 YEB액체 배지에 현탁하여, 이것을 플라즈미드 도입용 균액으로 하였다.
아그로박테리움에 대한 플라즈미드 pNPI206의 도입은 15㎖ 튜브(팔콘사)내에서, 상기 플라즈미드 도입용 균액 200㎕과 Ⅰ에서 구성한 pNPI206 6㎍를 혼합하고, 이를 미리 액체 질소에서 30 내지 40분간 냉각된 에탄올에 튜브마다 5분간 담그어 냉각시킨 후, 29℃에서 25분간 물에 넣어둔 다음, 750㎕의 YEB 액체 배지를 첨가하여, 29℃에서 1시간 동안 진탕 배양하므로써 이루어졌다.
Ⅲ.아그로박테리움으로부터 담배의 pNPI206의 도입 및 PNPI206이 도입된 세포의 배양과 얻어진 조직의 형태
온실내에서 생육된 담배(Nicotiana tabacum cv. SRl)의 다 자란 잎을, 1 v/v % 차아(次亞) 염소산 나트륨 수용액에 5분간 침지 살균하고, 멸균된 물로 3회 세정한 후, 잎의 주맥을 제외하고 약 8mm 각의 잎 조각이 되도록 하였다.
상기 담배잎 조각을 Ⅱ에서 pNPI206를 도입한 A. 투메파시엔스 LBA4404의 균액(0D630=0.25, YEB 액체 배지에서 하룻밤 배양한 후, 멸균물로 희석하여 균체 농도를 조절)에 약 1분간 담구어 여기에 감염시키고, 멸균된 여과지 위에 두고 여분의 균액을 제거한 후, 아세트시린곤 50mg/ℓ을 첨가한 식물 호르몬을 포함하지 않은 (호르몬 무첨가) MS 한천 배지(T.Murashige and F.skoog,Physiol. Plant., 15:473,1962, 단, 한천 0.8 w/v%을 첨가)에, 잎의 뒷면이 위를 향하도록 배치하여, 어두운 곳에서 3일간, 25℃(이하, 특별하게 명시하지 않는 한, 식물조직의 배양 온도는 모두 25℃였다)에서 배양하였다. 이어서, 이를, 카르베니실린 500mg/ℓ만을 포함하는 호르몬 무첨가 MS 한천 배지에 이식하고, 광량이 약 7 내지 10μ mols-1m-2에서, 동조성 배지에 이후 심어 배양한 결과, 감염 3개월 후에는 다아체 225계통을 얻을 수 있었기 때문에, 그 중 126계통을 2분할하여, 각각, 광량이 약 7 내지 10μmolS-1m-2또는 광량이 약 70μ mols-1m-2의 조건하에서,동조성 배지를 사용하여 배양을 계속하였다.
그 결과, 광량이 약 70μ mols-1m-2에서 배양한 계통에서는, 감염으로부터 약6개월 후에 43계통의 다아체로부터, 육안으로 보아 정상적인 형태를 한 싹(이하, 정상체라고 한다)가 발생하였지만, 광량이 약 7 내지 10μ mols-1m-2에서 배양한 계통에서는, 같은 기간이 경과된 후에 12계통이 정상체를 발생시켰을 뿐이었다.
결과를 표 1에 도시한다.
표 1. pNPI206 형질전환 담배배양조직에서 정상체의 발생율과 빛조건
빛조건*1 빛조건을 검토한다아체의 계통수 정상체를 발생시킨 계통수 정상체 발생률(%)*2
L2→L1 126 43 34.1
L2→L2 126 12 9.5
L2조건에서 3개월 배양한 후, L1 또는 L2 조건에서 3개월 배양함
*1 빛조건 L2:광량이 약 7∼10μ mols-1m-2
L1:광량이 약 70μ mols-1m-2
*2 (정상체를 발생시킨 계통수/빛조건을 검토한 다아체의 계통수)×100
상기 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 벡터 pNPI206에 의해 유전자가 도입된 담배 배양 조직을 저광량의 조건에서 배양한 후, 고광량의 조건에서 배양한 경우에는 저광량의 조건에서 배양을 계속한 경우에 비해, 정상체의 발생율이 4배 가까이 높고, 상기 pNPI206에 의해 유전자가 도입된 조직에서, 마아커 유전자인 형태 이상 유도 유전자의 거동이, 탈리 기능을 갖는 DNA 인자의 제어에 사용된, 빛 반응성 프로모우터인 rbcS-3B에 의해 제어되어, 유전자 도입 조직을 저광량의 조건에서 고광량의 조건으로 옮김으로써, 탈리가 촉진된 것을 나타내고 있다.
〔실시예 2〕
I. 벡터의 구성
실시예 1에서 얻어진 pNPI200를 PstI에서 절단하여, 절단에 의해 생긴 2개의 돌출 말단을 T4 중합효소I(대 서브유니트)를 통해 평활화한 뒤, 여기에, pGlE7(ZENECA사로부터 양도)로부터 제한효소 NdeI로 잘라내고, 역시 2개의 돌출 말단을 T4 중합효소I(대 서브유니트)로써 평활화시킨, GST-II의 27kD 서브유니트 유전자(GST-II-27)의 프로모우터(일본 특허 공보 제1994-511385호, 제 7페이지, 우측아래란 제 15 내지 17행)를 삽입하여, 플라즈미드 pNPI300를 구성하였다. 계속해서, 상기 pNPI300로부터 GST-II-27 프로모우터, R유전자 및 노펠린 합성효소 폴리아데닐화 시그날을 포함하는 단편을 제한효소 EcoRI에서 잘라내고, 이를 pUC18(다까라주조(주)에서 구입)의 EcoRI 제한효소 부위에 삽입하여, 플라즈미드 pNPI301를 얻었다.
또, GST-Ⅱ란, 제초제 해독성에 관여하는 GST의 동위효소중 하나로서, 옥수수 등에 존재하는 효소이다. 또한, GST-Ⅱ-27 프로모우터는 상기 GST-Ⅱ의 서브유니트중, 27kD 서브유니트의 유전자 발현을 제어하며, 제초제 해독제, 예를 들면 2,2,5-트리메틸-3-(디클로로아세틸)-1,3-옥사졸리딘이나, 유연체(類緣體)등의 화학물질의 존재하에서, GST-II-27의 발현을 유도하므로써 GST-II의 활성을 극적으로 상승시켜, 제초제에 대한 저항성을 높이는 것이, 옥수수등에서 알려져 있다(특허 공보 제 1994-511385호).
한편, pNPI123로부터, CaMV 35S 프로모우터와 여기에 연결된 ipt유전자를 제한효소 HindⅢ에서 잘라내고, 이를 pNPI128의 HindⅢ 제한효소 부위에 삽입하여, 플라즈미드 pIPT8를 구성하였다. 그리고, 상기 PIPT8의 EcoRI 제한효소 부위에, pNPI301로부터 제한효소 EcoRI에서 잘라낸, GST-II-27 프로모우터, R유전자 및 노펠린 합성효소 폴리아데닐화 시그날을 포함하는 단편을 삽입하여, 플라즈미드 pNPI302를 얻었다.
목적으로 하는 벡터는, 상기 pNPI302로부터, CaMV35S 프로모우터에 연결된 ipt유전자, GST-Ⅱ-27 프로모우터에 연결된 R유전자 및 노펠린 합성효소 폴리아데닐화 시그날, 그리고 이들의 양단에 있는 효모의 부위 특이적 재조합계의 재조합 배열(Rs)을 제한효소 SseI에서 잘라내고, 식물에 대한 유전자 도입용 벡터 플라즈미드pBI121의 SseI 제한효소 부위에 삽입함으로써 얻어지며, 이를 플라즈미드 pNPI303로 명명하였다. 즉, 상기 pNPI303는 R유전자의 조절 인자로서, pNPI206로 사용된 rbcS-3B 대신에, GST-II-27 프로모우터를 사용한 것이다. 도 12 내지 15에, pNPI303의 구성도를 도시한 것이다. 이들 도면중, 사용된 기호는 도 1 내지 11에서 사용된 것과 같다.
또, 상기 플라즈미드 pNPI303도 또한 대장균 JM109주에 도입하고, 상기 대장균을 E.coli JM109(pNPI303)〔통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(우편번호 305, 일본국 이바라기현 쯔쿠바시 히가시 1가 1번 3호), 국제수탁번호: FERM BP-5927,평성 9년(1997년) 4월 23일에 부다페스트조약에 근거하는 원기탁〕으로서, 국제기탁에 기탁하였다.
Ⅱ, 담배에 대한 pNPI303의 도입 및 pNPI303이 도입된 담배의 해석
실시예 1의 Ⅱ, Ⅲ와 같이, 플라즈미드pNPI303를 A. 투메파시엔스 LBA4404주에 도입하고, 상기 A. 투메파시엔스를 담배잎 조각에 감염시켜, 감염된 잎을 아세토실린곤을 50mg/ℓ 함유한 호르몬 무첨가 MS 한천 배지에 놓아두고, 3일간 밝은 곳에서 배양하였다. 이어서, 상기 감염된 잎을, 카르베니실린만을 500mg/ℓ 함유한 호르몬 무첨가 MS 한천 배지에 이식하고, 동일 조성의 배지에 계속 심어 배양한 결과, 다아체를 얻을 수 있었기 때문에, 배양 개시로부터 2개월 후, 얻어진 다아체중 30계통을 4분할하고, 각각을, 2,2,5-트리메틸-3-(디클로로아세틸)-1,3-옥사졸리딘 0, 10, 20, 30 mg/ℓ를 첨가하고, 카르베니실린을 500 mg/ℓ 함유한 호르몬 무첨가 MS 한천배지에 놓고, 정상체의 발생 빈도를 검토하였다.
상기 2,2,5-트리메틸-3-(디클로로아세틸)-1,3-옥사졸리딘을 첨가하고 배양한 지 1개월 후의 결과가 표2에 도시되어 있다. 정상체가 육안으로 검출되었으며, 본 실시예에서 목적 유전자의 모델로서 사용한, GUS유전자의 발현을 확인하기 위한 GUS 활성시험은 제퍼슨(Jefferson)등의 방법에 준하여 실시하였다.
pNPI303 형질 전환 담배 배양 조직에서 정상체의 발생율과 2,2,5-트리메틸-3-(디클로로아세틸)-1,3-옥사졸리딘 첨가 농도
첨가농도 0[㎎/ℓ] 첨가농도 10[㎎/ℓ] 첨가농도 20[㎎/ℓ] 첨가농도 30[㎎/ℓ]
정상체발생수 계통수*1 0 5 7 6
슈트수*2 0(0*3) 5(2*3) 9(4*3) 9(5*3)
2,2,5-트리메틸-3-(디클로로아세틸)-1,3-옥사졸리딘 첨가 배양 1개월
*1 정상체를 발생시킨 계통의 수
* 2 정상체로서 발생된 싹의 수
* 3 정상체로서 발생된 싹 중, GUS활성을 나타낸 고체의 수
표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 2,2,5-트리메틸-3-(디클로로아세틸)-1,3-옥사졸리딘을 첨가하지 않은 경우에는, 정상체가 전혀 발생하지 않은 것에 비해, 이를 10mg/ℓ 첨가함으로써 정상체가 발생하고, 발생 빈도는 20mg/ℓ 첨가함으로써 더욱 상승하였다. 따라서, 이 경우에서도, 탈리 기능을 갖는 DNA 인자의 제어에 사용된, 화학물질 반응성 프로모우터인 GST-II-27 프로모우터는 적절히 기능하고, pNPI303에 의해 식물조직에 유전자를 도입하여 이를 적당한 화학물질의 존재하에 배양하면, 탈리 기능을 갖는 DNA 인자의 발현을 유도하고, 탈리, 나아가서는 마아커 유전자인 형태 이상 유도 유전자의 탈리를 촉진하는 것을 알았다.
한편, 정상체로서 발생된 싹중, 대략 반정도는 GUS 활성의 발현, 즉, 목적 유전자의 존재와 발현이 확인되었지만, 나머지의 반정도에서는 GUS 활성을 검출할 수 없었다. 그 이유에 대해서는, 아직 분명하지 않지만 예를 들어 상기 pNPI303의 T-DNA 영역이, 담배의 염색체 내부와 인접하여 몇가지가 도입되었다고 한다면, T-DNA 내의 재조합 배열(Rs)간이 아닌, 서로 다른 T-DNA에 존재하는 재조합 배열간에서 상동적 재조합이 일어나, 이 배열에 끼워진 영역이 탈리하는 것도 고려된다. 이 때문에, 탈리 기능을 갖는 DNA 인자와 함께 탈리되는 영역에, ipt유전자 뿐만 아니라, GUS 유전자가 결과적으로 포함될 수도 있겠으나, 이러한 경우에는, 본 실시예와 같이, 다아체로부터 얻어진 정상체로도, GUS 활성을 나타내지 않는 것이 출현할 것이다.
또, GUS 활성을 나타낸 정상체중 1개에 대해서는, PCR를 사용하고, DNA 분석에 의해, GUS 유전자의 존재와 마아커 유전자인 ipt유전자 및 탈리 기능을 갖는 DNA 인자의 탈리를, DNA 수준에서도 확인하였다.
본 발명의 벡터를 사용하여 식물세포에 유전자를 도입하면, 목적 유전자와 함께 도입된 마아커 유전자는 도입 후, 상기 세포에 열, 빛, 화학물질 등의 특정한 자극이 부여됨에 따라 일정한 확률로 존재하여 기능하는 DNA 상에서 탈리되어 기능을 상실하고, 목적 유전자만이 상기 DNA 상에 발현될 수 있도록 도입된 세포가 얻어진다. 이 때문에, 상기 벡터는, 도입하고자 하는 목적 유전자에 관계되는 부분을 변경하는 것만으로도, 마아커 유전자를 비롯한 다른 구성에 대하여 아무런 변경도 가함없이, 어느 하나의 식물체에 유전자를 다중 도입하기 위해, 몇번이라도 무제한으로 반복 사용할 수 있다.
더욱이, 마아커 유전자로서 형태 이상 유도 유전자를 사용함으로써, 마아커 유전자가 도입된 세포만으로 이루어지는 조직, 즉, 목적 유전자가 도입된 세포만으로 이루어지는 조직과, 마아커 유전자가 기능을 상실한 이후, 목적 유전자만이 발현될 수 있도록 도입된 세포만으로 이루어지는 조직 모두, 조직의 형태 변화를 지표로 하여 선별할 수 있다. 따라서, 목적 유전자만이 염색체 등에 도입된 세포만으로 이루어진 조직을, 확실하고 용이하게 선별할 수 있고, 선별을 위한 항생 물질 등을 배지에 첨가할 필요도 없기 때문에, 선별 도중에 식물세포의 활성저하를 초래할 우려도 없다. 이로 인해 유전자의 다중 도입은 효율적으로 이루어지며, 또한, 이와 같이 세포만으로 이루어진 유전자 도입 개체, 즉 마아커 유전자의 영향이 배제되고, 유전자 산물이 초래하는 위험으로부터 완전히 벗어난 개체도, 교배 과정 없이 얻을 수 있다.
더욱이, 본 발명의 벡터에서는, 마아커 유전자의 탈리를 인위적으로 조절할 수 있다. 따라서, 이러한 조절이 불가능한 경우에는, 마아커 유전자가 너무 조속히 탈리되기 때문에, 목적 유전자만 발현될 수 있도록 도입된 세포만으로 이루어진 조직의 취득이 도리어 곤란한, 대단히 탈리 능력이 뛰어난 DNA 인자도, 본 발명의 탈리능을 갖는 DNA 인자로서 능력을 살릴 수 있다. 또한, 그렇지 않더라도, 본 발명의 벡터를 사용하는 경우, 이러한 세포의 발생, 이러한 세포로 이루어진 식물조직의 발생을 필요에 따라 동기시키기거나, 적당히 조절할 수 있기 때문에, 실제로, 유전자 도입 식물을 구성할 때 대단히 편리해진다. 예를 들어, 마아커 유전자인 형태 이상 유도 유전자로서 ipt유전자를 사용한 경우에는, 이것이 도입된 세포는 작용에 의해, 식물 호르몬이 첨가되지 않은 조건에서 지극히 활발히 증식하고, 부정 싹 등을 분화하기 때문에, 목적 유전자만이 발현가능하게 도입되어 있는 세포를 언제든지 발생시킬 수 있는 조직을, 전단층의 마아커 유전자를 유지한 상태에서 배양을 계속함으로써 대량 생산될 수도 있게 된다.

Claims (9)

  1. 목적 유전자를 마아커 유전자와 함께 식물 세포에 도입하기 위한 벡터로서, 마아커 유전자가 발현 후에 필요에 따라, 존재하여 기능하는 DNA로부터 제거되어 기능을 상실하고, 마아커 유전자의 발현 및 기능의 소실이 도입된 식물 세포에 유도된 조직의 형태 변화를 통해 검출가능한, 식물에의 유전자 도입용 벡터.
  2. 목적 유전자, 마아커 유전자로서 형태 이상 유도 유전자 및 발현 유도형 조절 인자의 제어하에 있으며 탈리 기능을 갖는 DNA 인자를 포함하고, 형태 이상 유도 유전자는 탈리 기능을 갖는 DNA 인자와 작용을 함께 하는 위치에 존재하며, 목적 유전자는 탈리 기능을 갖는 DNA 인자와는 작용을 함께 하지 않는 위치에 존재하는, 식물에의 유전자 도입용 벡터.
  3. 제 2 항에 있어서, 형태 이상 유도 유전자가 탈리 기능을 갖는 DNA 인자 내부에 존재하는 벡터.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 탈리 기능을 갖는 DNA 인자를 제어하는 발현 유도형 조절 인자가 리불로오스 비스포스페이트 카르복실라아제의 소 서브유니트 유전자(rbcS)의 프로모우터인 벡터.
  5. 제 2 항 또는 제 3항에 있어서, 탈리 기능을 갖는 DNA 인자를 제어하는 발현 유도형 조절 인자가 글루타티온-S-트랜스퍼라아제Ⅱ계(GST-Ⅱ)유전자의 프로모우터인 벡터.
  6. 제 2항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 탈리 기능을 갖는 DNA 인자가 부위 특이적 재조합계에서 유도된 벡터.
  7. 제 2 항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 형태 이상 유도 유전자가 아그로박테리움속(屬) 세균이 유지하는 형태 이상 유도 인자인 벡터.
  8. 제 2항 내지 제 7항중 어느 한 항에 있어서, 형태 이상 유도 유전자가 시토키닌 합성 유전자인 벡터.
  9. 제 8항에 있어서, 시토키닌 합성 유전자가 아그로박테리움·투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 T-DNA 상에 존재하는 ipt(isopentenyl transferase)유전자인 벡터.
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