KR20000005058A

KR20000005058A - Method and apparatus for preparing an acellular red blood cell substitute

Info

Publication number: KR20000005058A
Application number: KR1019980707685A
Authority: KR
Inventors: 리차드 이. 데워스킨; 메어 디. 더블데이
Original assignee: 리차드 이. 데워스킨; 노쓰필드 라보라토리스, 인코포레이티드
Priority date: 1996-03-28
Filing date: 1997-03-27
Publication date: 2000-01-25
Also published as: KR100562762B1

Abstract

PURPOSE: A hemoglobin substitute and a preparation method thereof are provided, which has half life more than 15 hours when administered to human and no toxicity. CONSTITUTION: The hemoglobin substitute is free from tetramer, stroma and any toxic contaminating material, polymerized and pyridoxylated. Also the hemoglobin substitute is free from white blood cells and platelets. Preferably the hemoglobin substitute is glutaraldehyde-polymerized hemoglobin. The hemoglobin substitute is prepared by removing white blood cells and platelets from a blood; washing and performing the lysis of blood red cells; removing stroma and stroma contaminating material by filtration and heating; preparing hemoglobin in oxygen-free state; pyridoxylating and polymerizing it; purifying and concentrating it further; and deoxygenizing it at about 10-12°C to make the content of oxyhemoglobin below about 16 wt% based on the weight of the total hemoglobin.

Description

무세포성 적혈구 대체물을 제조하기 위한 방법 및 장치Methods and apparatus for preparing acellular red blood cell replacement

오랜 시간 동안, 혈액 은행은 외상으로 인한 수술동안 또는 다른 상황에서 대체용의 전혈을 제공해왔다. 그러나, 사람 혈액 제공자로부터 수득된 전혈은 다양한 사용에 적합하지 않다. 특히, 전혈의 사용은 혈액 제공자의 타입에 대한 요건, 안정성 및 저장 수명 문제, 및 바이러스 및 다른 오염물질 때문에 문제가 있다. 이러한 문제는 특히, 군대에서의 혈액의 사용과 같은 비상 사태와 관련있다. 따라서, 혈액 제공자로부터 수득된 전혈에 대한 대체물의 개발에 많은 노력을 기울여 왔다. 이러한 개발에 의해 사람으로부터 또는 다른 포유 동물 공급원으로부터의 혈액에 대한 다양한 변형물이 생성되었다. 산소 운반 및 가역적인 산소(또는 리간드) 결합력을 갖는 지질이 없는 헤모글로빈은 당해 분야에 공지되어 있다. 독성 문제가 혈액 대체물로서의 사용을 방해하기 때문에, 지질이 없는 헤모글로빈은 무독성이며 유용한 약제학적 생성물을 제공하기 위해 추가적인 변형을 필요로한다.For a long time, blood banks have provided replacement whole blood during surgery due to trauma or in other situations. However, whole blood obtained from human blood donors is not suitable for various uses. In particular, the use of whole blood is problematic because of requirements for the type of blood donor, stability and shelf life issues, and viruses and other contaminants. This problem is particularly related to emergencies such as the use of blood in the military. Therefore, much effort has been put into the development of substitutes for whole blood obtained from blood donors. This development has produced various modifications to the blood from humans or from other mammalian sources. Lipid-free hemoglobin with oxygen transport and reversible oxygen (or ligand) binding capacity is known in the art. Since toxicity issues interfere with their use as blood substitutes, hemoglobin without lipids requires additional modifications to provide nontoxic and useful pharmaceutical products.

이러한 변형은 (1) 지질 및 지질 오염물질이 없거나, 실질적으로 없는 헤모글로빈의 생성; (2) 피리독실화; (3) 중합 또는 교차 결합; (4) 테트라머의 제거; 및 (5) 일산화탄소 또는 그 밖의 리간드에 의한 변형을 포함한다.Such modifications include (1) production of hemoglobin free or substantially free of lipids and lipid contaminants; (2) pyridoxylation; (3) polymerization or crosslinking; (4) removal of tetramers; And (5) modification by carbon monoxide or other ligands.

그러나, 이러한 기술로 제조된 헤모글로빈 용액은 생명을 유지하는 데 충분한 산소량을 운반할 수 있는 반면에, 바람직하지 않은 많은 부작용 및 특성을 유발시킨다. 예를 들어, 주요 부작용은 신장 기능의 감소이다. 이러한 변화는 박테리아의 내독소 또는 적혈구 막(지질)의 단편과 같은 바람직하지 않은 오염물질의 존재에 기인한 것으로 여겨진다. 상기와 같은 오염물질이 실제로 신장 변화를 초래할 수 있지만, 상기 오염물질이 본질적으로 없는 헤모글로빈 용액도 여전히 상당한 신장 기능장애를 초래한다. 신장 기능장애의 원인은 생리학적으로 허용되지 않은 양의 비중합된 헤모글로빈 테트라머이다. 테트라머 헤모글로빈 주입으로 인한 또 다른 바람직하지 않은 부작용으로는 혈관 수축, 혈색소뇨증, 심장 박동수의 저하, 평균 동맥 혈압의 증가 및 특히, 복강으로의 주입물(infusate)의 유출이 있다.However, hemoglobin solutions made with this technique can carry enough oxygen to sustain life, while causing many undesirable side effects and properties. For example, the main side effect is a decrease in kidney function. This change is believed to be due to the presence of undesirable contaminants such as bacterial endotoxins or fragments of erythrocyte membranes (lipids). While such contaminants can actually cause kidney changes, hemoglobin solutions that are essentially free of these contaminants still cause significant kidney dysfunction. Causes of renal dysfunction are physiologically unacceptable amounts of unpolymerized hemoglobin tetramers. Other undesirable side effects due to tetramer hemoglobin infusion include vasoconstriction, hemoglobinuria, decreased heart rate, increased mean arterial blood pressure and, in particular, the outflow of infusion into the abdominal cavity.

실제로, 공지된 헤모글로빈 유도된 혈액 대체물중에서 전적으로 독성 문제를 피하는 데 성공적이었던 것은 없었다. 이러한 생성물은 또한, 환자에 투여된 후, 허용될 수 없을 정도의 낮은 반감기를 갖는다. 이러한 반감기는 짧은 기간에 걸쳐 반복적으로 혈액 용량의 교환을 필요로 한다. 따라서, 환자에게 무독성이고, 투여 후 상당한 반감기를 갖는 헤모글로빈 생성물이 실질적으로 필요하다. 물론, 이러한 생성물은 전혈에 의해 달성되는 것과 유사한 방식으로 산소를 조직에 가역적으로 운반할 수 있어야 한다.Indeed, none of the known hemoglobin-induced blood substitutes has been successful in entirely avoiding toxicity issues. Such products also have an unacceptably low half-life after administration to a patient. This half-life requires the exchange of blood doses repeatedly over a short period of time. Thus, there is a substantial need for hemoglobin products that are nontoxic to patients and have significant half-life after administration. Of course, these products must be able to reversibly transport oxygen to the tissue in a manner similar to that achieved by whole blood.

발명의 요약Summary of the Invention

본 발명은 사람에게 무독성이고, 사람에게 투여할 경우, 15시간 이상의 실질적인 반감기를 갖는 헤모글로빈 대체물을 제공하는 데에 있다. 본 발명의 헤모글로빈 생성물은 바이러스 및 다른 독성의 오염물질이 없을 뿐만 아니라 지질이 없으며, 피리독실화되고, 중합되어 있다. 또한, 이러한 생성물은 실질적으로 백혈구(화이트 블러드 셀(white blood cell) 및 혈소판이 없다.The present invention is directed to providing hemoglobin substitutes that are nontoxic to humans and have a substantial half-life of at least 15 hours when administered to humans. The hemoglobin product of the invention is not only free of viruses and other toxic contaminants, but also lipid-free, pyridoxylated and polymerized. In addition, these products are substantially free of white blood cells (white blood cells and platelets).

본 발명은 또한, 본 발명의 헤모글로빈 대체물을 제조하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 혈액으로부터 백혈구 및 혈소판을 제거하고; 적혈구를 세척하고, 용해시키고; 여과 및 열처리에 의해 지질 오염물질 및 지질을 제거하고; 탈산소 형태의 헤모글로빈을 제조하고; 피리독실화 및 중합시키고; 추가로 정제 및 농축시키고; 탈산소화시키는 단계를 포함한다. 그 후, 생성된 헤모글로빈 생성물은 제형화되어, 정상적인 생리학적 범위내에 다양한 수준의 전해질을 갖는 헤모글로빈 생성물을 제공한다.The invention also includes a method of making the hemoglobin substitute of the invention. The method removes leukocytes and platelets from the blood; Erythrocytes are washed and lysed; Filtration and heat treatment to remove lipid contaminants and lipids; Preparing hemoglobin in deoxygenated form; Pyridoxylation and polymerization; Further purification and concentration; Deoxygenation. The resulting hemoglobin product is then formulated to provide hemoglobin products having varying levels of electrolytes within normal physiological range.

본 발명은 또한 피리독실화되고, 중합된 헤모글로빈의 수성 제형을 제공하며, 여기에서, 헤모글로빈은 도 3에 도시된 분자량 프로필을 갖는 테트라머 물질을 함유하는 글루타르알데히드 중합된 헤모글로빈이다. 이러한 제형은 무세포성 적혈구 대체물을 제조하는 데에 사용될 수 있다. 이러한 양태에 있어서, 먼저 제형이 정제되어 테트라머가 제거된 후, 적당량의 전해질과 조합되어 생리학적으로 허용 되는 무세포성 적혈구 대체물이 생성되며, 그 후, 이 적혈구 대체물은 산소의 운반체의 주입을 필요로 하는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.The present invention also provides an aqueous formulation of pyridoxylated, polymerized hemoglobin, wherein hemoglobin is a glutaraldehyde polymerized hemoglobin containing a tetrameric material having a molecular weight profile shown in FIG. 3. Such formulations can be used to make acellular red blood cell replacements. In this embodiment, the formulation is first purified to remove the tetramer and then combined with the appropriate amount of electrolyte to produce a physiologically acceptable acellular erythrocyte substitute, which then requires injection of a carrier of oxygen. Can be used to treat patients.

도면의 간단한 설명Brief description of the drawings

도 1은 피리독실화 및 중합시키기 위해 제조되는 탈산소화된 헤모글로빈 용액을 생성시키기 위해 사용되는 방법 및 장치의 일부를 도시하는 개략도이다.1 is a schematic diagram showing a portion of a method and apparatus used to produce a deoxygenated hemoglobin solution prepared for pyridoxylation and polymerization.

도 2는 피리독실화 및 중합 반응으로 개시되어, 탈산소화되고, 정제되고, 피리독실화되고, 중합된 헤모글로빈 생성물을 생성시키는 방법 및 장치의 일부, 및 생리학적 수준의 전해질을 갖는 최종 헤모글로빈 생성물을 제형화하는 데에 사용된 방법 및 장치의 일부를 도시하는 개략도이다.FIG. 2 shows a portion of a method and apparatus for initiating pyridoxylation and polymerization reactions to produce deoxygenated, purified, pyridoxylated, and polymerized hemoglobin products, and final hemoglobin products with electrolytes at physiological levels. Schematic diagram showing some of the methods and apparatus used to formulate.

도 3은 정제 전에 글리신 처리 후, 중합된 물질의 HPLC 트레이싱(tracing)이다. 중합된 생성물은 체류 시간(RT) 15,57, 16.08, 17.00 및 18.19에서 피크를 나타낸다. 테트라머 물질은 RT 19.88 및 20.51에서 피크를 나타낸다. 이러한 물질의 76.2%가 중합체이다.3 is HPLC tracing of polymerized material after glycine treatment prior to purification. The polymerized product shows peaks at residence times (RT) 15,57, 16.08, 17.00 and 18.19. Tetramer material shows peaks at RT 19.88 and 20.51. 76.2% of these materials are polymers.

도 4는 본 발명의 헤모글로빈 생성물의 HPLC 트레이싱이다. 중합된 헤모글로빈은 RT 15.7, 16.33, 17.32 및 18.56에서 피크를 나타낸다. 테트라머는 RT 21.18에서 피크를 나타낸다.4 is an HPLC tracing of the hemoglobin product of the present invention. Polymerized hemoglobin shows peaks at RT 15.7, 16.33, 17.32 and 18.56. Tetramers peak at RT 21.18.

도 5는 본 발명에서 사용된 칼럼 크로마토그래피 정제 방법을 도시하는 개략도이다.5 is a schematic diagram illustrating a column chromatography purification method used in the present invention.

도 6은 본 발명에서 사용된 막 여과 정제 방법을 도시하는 개략도이다.6 is a schematic diagram illustrating a membrane filtration purification method used in the present invention.

바람직한 구체예의 상세한 설명Detailed Description of the Preferred Embodiments

본 발명은 실질적으로 지질, 지질 오염물질 및 그 밖의 오염물질을 함유하지 않는, 본질적으로 테트라머가 없으며, 교차결합되고, 중합되고, 피리독실화된 헤모글로빈을 포함하는 무세포성 적혈구 대체물에 관한 것이다.The present invention relates to cell-free erythrocyte substitutes that are essentially tetramer free, cross-linked, polymerized and pyridoxylated hemoglobin that is substantially free of lipids, lipid contaminants and other contaminants.

본 명세서에서 사용된 "교차결합된"이란 용어는 분자의 모양, 크기, 기능 또는 물리적 특성을 변화시키기 위해 분자 상에 또는 분자 내에, 또는 분자들 사이에 분자 "브릿지"가 화학적으로 생성됨을 의미한다. 교차결합된 분자는 중합되거나 비중합될 수 있는데, 즉 교차결합된 분자는 테트라머성일 것이다.As used herein, the term "crosslinked" means that a molecular "bridge" is chemically produced on or in a molecule, or between molecules, to change the shape, size, function, or physical properties of the molecule. . Crosslinked molecules may be polymerized or nonpolymerized, ie the crosslinked molecules will be tetrameric.

본 명세서에서 사용된 "테트라머"란 용어는 분자량이 64Kd인 헤모글로빈 분자를 의미한다; 즉, 천연 및 분자내적으로 교차결합된 헤모글로빈 분자 모두를 의미한다.As used herein, the term “tetramer” refers to a hemoglobin molecule having a molecular weight of 64 Kd; That is, it refers to both natural and intramolecularly crosslinked hemoglobin molecules.

본 명세서에서 사용된 "본질적으로 테트라머가 없는"이란 용어는 포유동물내에 투여된 테트라머에 대한 생물학적 반응이 더 이상 존재하지 않는 테트라머 오염에 대한 순도 수준을 의미한다. 주요 표준은 약제학적으로 유효량, 즉 약 99% 이상의 순도 수준(약 1% 미만의 테트라머가 존재함)이 주입되는 경우, 신장 기능 변화가 없는 것이다. 본 발명에 의해 제조된 바람직한 생성물은 전체 헤모글로빈(THb)의 중량을 기준으로 하여 약 0.8% 이하의 테트라머를 함유한다. 바꿔말하면, 본 발명에 따른 본질적으로 테트라머가 없는 생성물은 생리학적으로 허용되는 양의 중합되지 않은 헤모글로빈 테트라머를 함유한다. 특히, 본 발명의 바람직한 생성물으 약 0.5% 미만의 테트라머를 함유하며; 가장 특히, 본 발명의 바람직한 생성물은 약 0.3 내지 0.4%의 테트라머를 함유한다. 이러한 양의 테트라머는 생리학적으로 허용되는 것으로 밝혀졌다.As used herein, the term “essentially tetramer free” refers to the level of purity for tetramer contamination in which no biological response to tetramers administered in a mammal is no longer present. The main standard is that there is no change in renal function when a pharmaceutically effective amount, ie, a purity level of at least about 99% (with less than about 1% tetramer present) is injected. Preferred products prepared by the present invention contain up to about 0.8% tetramers based on the total weight of hemoglobin (THb). In other words, the essentially tetramer free product according to the present invention contains a physiologically acceptable amount of unpolymerized hemoglobin tetramer. In particular, preferred products of the invention contain less than about 0.5% tetramer; Most particularly, preferred products of the present invention contain about 0.3 to 0.4% of tetramers. This amount of tetramer has been found to be physiologically acceptable.

본 명세서에서 사용되는 "초정제된 생성물" 또는 "정제된 생성물"이란 용어는 "본질적으로 테트라머가 없는"이란 용어와 동일한 의미를 갖는다.As used herein, the term "super purified product" or "purified product" has the same meaning as the term "essentially tetramer free".

본 명세서에서 사용되는 % 전체 헤모글로빈(THb)이란 용액 100mL 당 헤모글로빈 그램 으로 정의된다.As used herein,% total hemoglobin (THb) is defined as grams of hemoglobin per 100 mL of solution.

본 명세서에서 사용되는 "중합성 용액"이란 용어는 생화학적으로 적합한 담체 중의 글루타르알데히드, 이미도 에스테르, 디아스피린 또는 그 밖의 물질과 같은 "교차결합성" 또는 중합성 제제를 함유하는 용액을 의미한다.As used herein, the term "polymerizable solution" means a solution containing a "crosslinkable" or polymerizable agent such as glutaraldehyde, imido esters, diaspirin or other substances in a biochemically suitable carrier. do.

본 명세서에서 사용되는 중합된이란 용어는 분자 또는 테트라머성 서브유닛 사이에 분자 브릿지가 생성됨을 의미하며, 이렇게 생성되는 중합된 분자의 크기 및 중량은 천연 또는 테트라머성 헤모글로빈에 대하여 증가된다.As used herein, the term polymerized means that molecular bridges are created between molecules or tetrameric subunits, and the size and weight of the resulting polymerized molecules is increased for natural or tetrameric hemoglobin.

본 명세서에서 사용되는 헤모글로빈 용액은 적혈구 내에 함유되어 있지 않은 테트라머성 헤모글로빈 또는 중합된 헤모글로빈 분자의 용액을 의미한다. 이러한 용액은 적혈구 지질 또는 지질 오염물질을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않을 필요가 없다. 그러나, 바람직한 중합된 헤모글로빈 용액은 적혈구 지질 및 지질 오염물질이 함유되어 있지 않다.Hemoglobin solution as used herein refers to a solution of tetrameric hemoglobin or polymerized hemoglobin molecules that are not contained in red blood cells. Such solutions need not be or substantially free of erythrocyte lipids or lipid contaminants. However, preferred polymerized hemoglobin solutions do not contain erythrocyte lipids and lipid contaminants.

"반투과성 막"이란 용어는 일부 분자 종은 투과가능하지만 그 밖의 종은 투과가능하지 않은 막을 의미하는데, 즉 특정 분자량을 배제시키는 선택적 필터로서 작용하는 막을 의미한다.The term “semi-permeable membrane” means a membrane that is permeable to some molecular species but not to others, ie, a membrane that acts as a selective filter to exclude certain molecular weights.

본 발명에 따른 방법의 생성물인, 열처리되고 바이러스적으로 불활성화된 테트라머 헤모글로빈으로부터 생성된, 테트라머(천연 또는 분자내 교차결합되어 있음) 헤모글로빈, 지질 및 다양한 그 밖의 오염물질이 본질적으로 없는 중합되고 피리독실화된 헤모글로빈 용액은 치료적으로 및 임상적으로 유용할 뿐만 아니라 생리학적으로 허용된다. 본 발명의 생성물은 산소 운반 특성에 필요한 가역성 산소 결합력을 갖는다. 가장 주목할 만하게도, 본 발명의 생성물은 전혈과 유사한 산소-헤모글로빈 해리 곡선(P₅₀)을 갖는 것과 서로관련된 용법에서의 양호한 로딩 및 언로딩 특성을 입증한다. 본 발명의 생성물은 폐를 통과하는 모세혈관 내에서 고친화력으로 산소와 결합한 다음, 산소를 체내 조직에 적절하게 방출시킨다. 본 발명의 생성물은 또한 수용자에 대한 적합성 실험을 필요로 하지 않는다.Polymerization essentially free of tetramer (natural or intramolecularly crosslinked) hemoglobin, lipids and various other contaminants, produced from heat treated and virally inactivated tetramer hemoglobin, the product of the process according to the invention And pyridoxylated hemoglobin solutions are not only therapeutically and clinically useful, but also physiologically acceptable. The product of the present invention has a reversible oxygen binding force necessary for oxygen transport properties. Most notably, the products of the present invention demonstrate good loading and unloading properties in applications correlated with having an oxygen-hemoglobin dissociation curve (P ₅₀ ) similar to whole blood. The product of the present invention binds to oxygen with high affinity in capillaries that pass through the lungs, and then releases oxygen appropriately into the body tissues. The product of the present invention also does not require suitability testing for the recipient.

본 발명의 생성물은 또한 사람에게 투여된 경우 약 15시간 이상 및 더욱 바람직하게는 약 24시간의 반감기를 갖는다. 이러한 헤모글로빈 생성물은 약 3.0L 이하 및 심지어 약 5.0L 이하의 양으로 환자에게 주입될 수 있다. 바꿔말하면, 본 발명의 헤모글로빈 생성물은 혈관 수축, 신독성, 혈색소뇨증, 또는 합성 또는 반합성 산소 담체 및 혈액 대체물의 정맥내 투여와 관련된 그 밖의 문제를 유발함이 없이 본질적으로 사람 환자의 혈액 부피 전부를 보충하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 환자에게 무독성이며, 지질 및 테트라머를 함유하지 않고, 중합되고, 피리독실화된 헤모글로빈 생성물을 적어도 약 5.0L 이하의 양으로 환자, 바람직하게는 사람 환자에게 수혈하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 주입 또는 수혈을 위해 주입 기기 또는 그 밖의 유사 장치에 환자 또는 피검자를 연결시키는 것을 포함한다.The product of the present invention also has a half-life of at least about 15 hours and more preferably about 24 hours when administered to humans. Such hemoglobin products may be injected into patients in amounts of up to about 3.0L and even up to about 5.0L. In other words, the hemoglobin product of the present invention essentially reduces the blood volume of a human patient without causing vasoconstriction, nephrotoxicity, hemochromatosis, or other problems associated with intravenous administration of synthetic or semisynthetic oxygen carriers and blood substitutes. Can be used to supplement. Accordingly, the present invention includes a method of transfusion to a patient, preferably a human patient, which is nontoxic to the patient, free of lipids and tetramers, and polymerized, pyridoxylated hemoglobin product in an amount of at least about 5.0 L or less. do. Such methods include connecting a patient or subject to an infusion device or other similar device for infusion or transfusion.

본 발명의 방법은 용액중의 전체 헤모글로빈의 중량을 기준으로 하여 약 1 중량% 이하, 및 더욱 바람직하게는 약 0.8 중량% 이하의 테트라머 수준을 갖는 생성물이 수득된다는 점에서 독특하다. 본 발명의 방법은 실질적으로 미생물 및 바이러스 항원 및 병원균을 함유하지 않는 최종 생성물이 생성될 수 있는 추가의 잇점을 제공한다. 즉, 이러한 미생물 및 바이러스 항원 및 병원균은 검출불가능한 수준까지 감소된다. 본 발명의 생성물은 미국 약전 XXIII장 <71>에 설명된 분석에 의해 측정된 바와 같이 무균성이다. 이러한 항원 및 병원균의 예로는 세균, 리케치아, 진균, 원생동물, 바이러스 및 그 밖의 생물체가 있다. 가장 중요한 것은, 본 발명의 방법이 간염 및 후천성 면역 결핍증 (AIDS)을 유발하는 바이러스를 함유하지 않는 생물학적 생성물을 제공한다는 것이다.The process of the invention is unique in that a product is obtained having a tetramer level of up to about 1% by weight, and more preferably up to about 0.8% by weight, based on the weight of total hemoglobin in the solution. The method of the present invention provides the further advantage that an end product can be produced that is substantially free of microbial and viral antigens and pathogens. That is, these microbial and viral antigens and pathogens are reduced to undetectable levels. The product of the present invention is sterile as measured by the assay described in US Pharmacopoeia XXIII Chapter <71>. Examples of such antigens and pathogens include bacteria, rickettsia, fungi, protozoa, viruses and other organisms. Most importantly, the method of the present invention provides a biological product that does not contain viruses that cause hepatitis and AIDS.

생리학적 특성에 관한 한은, 적어도 약 5.0L 이하의 양이 주입되는 경우 본 발명의 생물학적 생성물은 혈관수축, 신독성, 혈색소뇨증 및 생리학적으로 바람직하지 않은 양의 테트라머 헤모글로빈을 함유하는 공지된 헤모글로빈의 정맥내 투여와 관련된 그 밖의 문제를 유발시키지 않는다. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 생성물이 정맥내 투여되면 소변 생성의 유의할만한 감소, 사구체 여과율의 유의할 만한 감소, 복강 내로의 유의할만한 유출 및 생성된 소변 색깔의 유의할만한 변화를 일으키지 않는다.As far as the physiological properties are concerned, the biological products of the present invention, when injected with an amount of at least about 5.0 L or less, are known hemoglobin containing vasoconstriction, nephrotoxicity, hemochromatosis and physiologically undesirable amounts of tetramer hemoglobin. Does not cause any other problems associated with intravenous administration. Intravenous administration of a product prepared by the methods described herein does not result in a significant decrease in urine production, a significant decrease in glomerular filtration rate, a significant outflow into the abdominal cavity, and a significant change in the resulting urine color.

따라서, 본 발명의 방법은 외상, 심근 경색, 졸중, 급성 빈혈, 및 완전 산소화 혈액에 대한 폐의 손상 또는 부전으로 인한 저산소혈증, 저산소증 또는 말기 저산소증과 같은 산소 결핍 질환의 치료에 유용한 무세포성 적혈구 대체물을 제공한다. 본 발명의 생성물은 또한 소생용 유체 (예를 들어, 외상, 특히 출혈성 쇽), 혈관내 증량제 또는 치환수혈이 필요한 임의의 질병 또는 내과 질환의 치료에 유용하다. 내과 질환 뿐만 아니라, 본 발명의 생성물은 이식용 장기를 보존하는 데에 유용할 수 있다.Thus, the method of the present invention is an acellular red blood cell substitute useful for the treatment of oxygen deficiency disorders such as hypoxia, hypoxia or terminal hypoxia due to trauma, myocardial infarction, stroke, acute anemia, and damage or failure of the lung to full oxygenated blood. To provide. The products of the present invention are also useful for the treatment of resuscitation fluids (eg, trauma, in particular hemorrhagic shock), vascular extenders or any disease or medical condition requiring transfusion. In addition to medical diseases, the products of the present invention may be useful for preserving organs for transplantation.

본 발명의 방법은 하기 과정을 포함한다:The method of the present invention comprises the following procedure:

1. 적혈구 흡출 및 여과1. Red blood cell aspiration and filtration

2. 세포 세척/용해2. Cell Wash / Dissolve

3. 열처리3. Heat treatment

4. 한외여과 농축4. Ultrafiltration Concentration

5. 탈기5. Degassing

6. 화학적 변형6. Chemical modification

7. 정제7. Tablet

8. UP 폴리(poly) 농축8.UP poly enrichment

9. 탈산소화9. Deoxygenation

10. 제형화10. Formulation

본 발명의 방법에서 바람직한 출발 물질은 유효기간이 지난 사람 전혈 또는 패킹된 적혈구이다. 부가하여, 유효기간이 경과되지 않은 혈액(기간내)이 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, 백(bag) 상에 표시된 만료일을 지나서 2주 이상 동안 보관된 전혈은 본 발명의 방법에서 사용되지 않는다. 만료후 2주 이상 경과된 전혈이 사용되면 헤모글로빈을 추출하고 지질 단백질 및 오염물질을 제거하기가 더 어려워진다.Preferred starting materials in the process of the invention are expired human whole blood or packed red blood cells. In addition, blood (within period) that has not expired may also be used. Preferably, whole blood stored for two weeks or more beyond the expiry date indicated on the bag is not used in the method of the present invention. Whole blood more than two weeks after expiration is used, making it more difficult to extract hemoglobin and remove lipid proteins and contaminants.

본 명세서에 설명된 모든 방법은 당업 분야의 기술 내에서 가능한 약간의 변형을 가하여 그 밖의 포유동물 혈액에 적용할 수 있다. 대부분의 방법은 약 2℃ 내지 약 8℃, 바람직하게는 약 4℃에서 수행될 수 있다.All of the methods described herein can be applied to other mammalian blood with minor modifications as possible within the skill of the art. Most of the methods can be carried out at about 2 ° C to about 8 ° C, preferably about 4 ° C.

적혈구 흡출 및 여과 동안에, 적혈구(RBC)를 혈액 내에 공기를 도입시키지 않으면서 도너 백으로부터 추출하고, 백혈구 및 혈소판 양이 감소된 RBC 현탁액을 생성시키기 위하여 일련의 필터에 통과시킨다. 그런 다음, 생성되는 현탁액을 세포 세척/용해시킨다.During erythrocyte aspiration and filtration, red blood cells (RBCs) are extracted from the donor bag without introducing air into the blood and passed through a series of filters to produce an RBC suspension with reduced white blood cell and platelet amounts. The resulting suspension is then cell washed / lysed.

현탁액을 일산화탄소 분위기 하에서 약 1% NaCl 용액과 함께 세척하여 남아있는 혈장 단백질을 제거하였다. 그런 다음, 세척된 RBC를 주사용수(WFI)로 처리하여 세포를 용해시키고, 생성되는 혼합물을 직교류 여과 유닛을 사용하여 정화시켰다. 그런 다음, 정화된 생성물을 열처리하여 여과에 의해 분리된 추가의 지질 물질을 침전시켰다. 본 과정의 생성물은 THb가 약 3%(w/v)인 지질이 없는 헤모글로빈(SFH) 용액이다.The suspension was washed with about 1% NaCl solution under carbon monoxide atmosphere to remove remaining plasma protein. The washed RBCs were then treated with water for injection (WFI) to lyse the cells and the resulting mixture was clarified using a cross flow filtration unit. The clarified product was then heat treated to precipitate additional lipid material separated by filtration. The product of this process is a lipid-free hemoglobin (SFH) solution with THb of about 3% (w / v).

카르복시헤모글로빈을 함유하는 열처리된 지질이 없는 헤모글로빈 용액을 농축시키고 탈기시켜 데옥시헤모글로빈을 함유하는 SFH 용액을 수득하였다. 탈기는 먼저 카르복시헤모글로빈을 약 16시간 동안 산소로 포화시켜 산소화된 헤모글로빈 및 헤모글로빈 전체 중량을 기준으로 하여 약 7 중량% 카르복시헤모글로빈을 함유하는 용액을 수득하는 것을 포함한다. 이어서, 산소를 질소, 아르곤 또는 헬륨과 함께 배출시켜 유리 헤모글로빈(즉, 비복합체화 헤모글로빈) 및 헤모글로빈의 전체 중량을 기준으로 하여 약 7 중량%의 옥시헤모글로빈을 함유하는 용액을 형성시킨다. 생성되는 탈기된 용액을 여과하고 화학적 변형을 위해 용기 내로 옮긴다.The heat treated lipid-free hemoglobin solution containing carboxyhemoglobin was concentrated and degassed to give a SFH solution containing deoxyhemoglobin. Degassing involves first saturating the carboxyhemoglobin with oxygen for about 16 hours to obtain a solution containing about 7% by weight carboxyhemoglobin based on the total weight of oxygenated hemoglobin and hemoglobin. Oxygen is then discharged with nitrogen, argon or helium to form a solution containing about 7% by weight of oxyhemoglobin based on the total weight of free hemoglobin (ie, uncomplexed hemoglobin) and hemoglobin. The resulting degassed solution is filtered and transferred into the vessel for chemical modification.

탈기시킨 후에, 지질이 없는 헤모글로빈 용액을 약 1:1 내지 3:1의 피리독살-5´-포스페이트 대 헤모글로빈의 몰비로 피리독살-5´-포스페이트(P5P)를 사용하여 피리독실화시킨다. 다른 방법으로, 지질이 없는 헤모글로빈을 2-노르-2-포르밀 피리독살-5´-포스페이트를 사용하여 피리독실화시킬 수 있다. 시아노수소화붕소 나트륨 또는 바람직하게는 수소화붕소 나트륨과 같은 환원제를 피리독실화 혼합물에 첨가시킨다. 과량의 시약 및 염을 피로젠이 없는 물에 대한 투석 또는 바람직하게는 WFI에 의한 다이아필트레이팅에 의해 분리시킨다. 그런 다음, 피리독실화된 헤모글로빈을 글루타르알데히드 용액으로 중합시킨다.After degassing, the lipid-free hemoglobin solution is pyridoxylated using pyridoxal-5'-phosphate (P5P) at a molar ratio of pyridoxal-5'-phosphate to hemoglobin between about 1: 1 and 3: 1. Alternatively, hemoglobin without lipids can be pyridoxylated using 2-nor-2-formyl pyridoxal-5′-phosphate. A reducing agent such as sodium cyanoborohydride or preferably sodium borohydride is added to the pyridoxylation mixture. Excess reagents and salts are separated by dialysis against pyrogen-free water or, preferably, by diafiltration with WFI. The pyridoxylated hemoglobin is then polymerized with a glutaraldehyde solution.

지질이 없는 피리독실화된 헤모글로빈 용액을 수성 글루타르알데히드 용액을 사용하여 중합시킨다. 중합반응 시간 및 글루타르알데히드 첨가량은 헤모글로빈 용액의 부피, 소망하는 중합체 수율 및 소망하는 분자량 분포에 좌우된다. 일반적으로, 중합반응 시간이 증가하면 중합체의 수율 및 분자량 분포가 증가된다. 헤모글로빈의 전체 중량을 기준으로 한 약 75 중량%의 중합체의 수율은 약 16 내지 18시간 후에 수득된다. 중합반응의 바람직한 종말점은 크기별 배제 HPLC에 의해 모니터링된 바와 같이 용액이 약 75 중량%의 중합체를 함유하는 지점으로서 정의된다. 다른 식으로, 종말점은 용액이 헤모글로빈의 전체 중량을 기준으로 하여 중합체의 약 65%를 함유하는 지점, 즉 2.5시간으로서 정의된다.Lipid-free pyridoxylated hemoglobin solution is polymerized using aqueous glutaraldehyde solution. The polymerization time and the amount of glutaraldehyde added depend on the volume of the hemoglobin solution, the desired polymer yield and the desired molecular weight distribution. In general, increasing the polymerization time increases the yield and molecular weight distribution of the polymer. A yield of about 75% by weight of polymer, based on the total weight of hemoglobin, is obtained after about 16-18 hours. The preferred end point of the polymerization is defined as the point at which the solution contains about 75% by weight of polymer as monitored by size exclusion HPLC. Alternatively, the endpoint is defined as the point at which the solution contains about 65% of the polymer based on the total weight of hemoglobin, ie 2.5 hours.

중합반응은 수성 글리신을 첨가함으로써 켄칭(quench)된다. 완충액은 가능한 한 빨리 첨가되어야 한다. 그런 다음, 교차결합을 수소화붕소 나트륨 수용액을 가능한 한 빨리 첨가함으로써 안정화시킨다. 이어서, 이러한 중합된 용액을 농축시킨후, 산소 분위기 하에서 다이아필트레이팅시켜 용액을 산소화시킨다. 최종적으로, 용액이 약 4 중량%의 헤모글로빈을 함유할 때까지 물을 용액에 첨가시킨다.The polymerization is quenched by the addition of aqueous glycine. Buffer should be added as soon as possible. The crosslinks are then stabilized by adding aqueous sodium borohydride solution as soon as possible. This polymerized solution is then concentrated and then diatrified in an oxygen atmosphere to oxygenate the solution. Finally, water is added to the solution until the solution contains about 4% by weight hemoglobin.

본 발명에 따른 중합반응은 하기의 실시예 1 및 도 3에 나타난 바와 같이 분자량 범위가 협소한 높은 수율의 중합체를 생성시킨다.The polymerization reaction according to the invention yields high yield polymers with narrow molecular weight ranges as shown in Examples 1 and 3 below.

그런 다음, 중합되고 피리독실화된 헤모글로빈 용액을 칼럼 크로마토그래피, 예를 들어 막 여과와 같은 여과, 또는 둘 모두에 의해 정제시켜 용액으로부터 남아있는 미중합된(테트라머) 헤모글로빈을 제거시킨다. 그런 다음, 정제되고 중합된 헤모글로빈 용액을 기체 교환용으로 준비된 한외여과 장치를 사용하여 약 6%까지 농축시킨다.The polymerized and pyridoxylated hemoglobin solution is then purified by column chromatography, for example filtration, such as membrane filtration, or both to remove remaining unpolymerized (tetramer) hemoglobin from the solution. The purified and polymerized hemoglobin solution is then concentrated to about 6% using an ultrafiltration device prepared for gas exchange.

그런 다음, 농축된 용액을 질소로 탈산소화시킨다. 탈산소화는, 용액 중의 옥시헤모글로빈의 양이 전체 헤모글로빈의 약 16 중량% 미만이 될 때까지 약 10 내지 12℃에서 일어난다.The concentrated solution is then deoxygenated with nitrogen. Deoxygenation occurs at about 10-12 ° C. until the amount of oxyhemoglobin in the solution is less than about 16% by weight of the total hemoglobin.

그런 다음, 생성되는 탈산소화되고 정제되고 중합된 헤모글로빈 용액을 냉각된 용기 중에서 질소 분위기 하에서 한외여과에 의해 농축시킨다. pH를 약 8.8 내지 9.0으로 조정하고, 전해질의 양을 필요에 따라 정상 혈장의 전해질 양을 나타내는 수준으로 조정할 수 있다. 부가하여, 글루타티온, 아스코르베이트 또는 글루코오스와 같은 통상적인 산화방지제를 또한 임의로 첨가할 수 있다. 용액을 소망하는 수준, 바람직하게는 10 중량%의 중합되고, 피리독실화되고, 정제되고, 테트라머가 없으며 지질이 없는 헤모글로빈 까지 농축시킨 후, 용액을 여과에 의해 살균시키고 살균 이동 장치를 통해 적당한 약제학적으로 허용되는 용기내로 옮긴다.The resulting deoxygenated, purified and polymerized hemoglobin solution is then concentrated by ultrafiltration under a nitrogen atmosphere in a cooled vessel. The pH can be adjusted to about 8.8 to 9.0 and the amount of electrolyte can be adjusted to a level that indicates the amount of electrolyte in normal plasma as needed. In addition, conventional antioxidants such as glutathione, ascorbate or glucose may also optionally be added. The solution is concentrated to the desired level, preferably 10% by weight, polymerized, pyridoxylated, purified, tetramer-free and lipid-free hemoglobin, then the solution is sterilized by filtration and a suitable agent via a sterile transfer device. Transfer to a scientifically acceptable container.

생성된 헤모글로빈 용액의 특징을 하기에 기재한다:The characteristics of the resulting hemoglobin solution are described below:

중합된 헤모글로빈Polymerized Hemoglobin 전체 헤모글로빈(g/dl)¹ Total hemoglobin (g / dl) ¹ 9.5 - 12.09.5-12.0 메트헤모글로빈(전체 Hb 중의 비율, %)¹ Methemoglobin (% of total Hb,%) ¹ < 8.0<8.0 카르복실헤모글로빈(전체 Hb 중의 비율, %)¹ Carboxylhemoglobin (% of total Hb,%) ¹ < 5.0<5.0 P₅₀(토르(torr))¹ P ₅₀ (torr) ¹ 23 - 3223-32 몰랄삼투압 농도 (mmol/Kg)² Molar osmolality (mmol / Kg) ² 280 - 360280-360 나트륨 (mmol/L)³ Sodium (mmol / L) ³ 135 - 155135-155 칼륨 (mmol/L)³ Potassium (mmol / L) ³ 3.5 - 4.53.5-4.5 염화물 (mmol/L)³ Chloride (mmol / L) ³ 85 - 11085-110 유리 철 (ppm)⁴ Glass iron (ppm) ⁴ < 2.0<2.0 분자량 분포-128Kd 피크 (%)⁵ Molecular Weight Distribution-128Kd Peak (%) ⁵ 10 - 2410-24 분자량 분포-192Kd 피크 (%)⁵ Molecular Weight Distribution-192Kd Peak (%) ⁵ 18 - 3018-30 분자량 분포-256Kd 피크 (%)⁵ Molecular Weight Distribution-256 Kd Peak (%) ⁵ 45 - 7045-70 테트라머 (64K)(%)⁵ Tetramer (64K) (%) ⁵ < 0.8<0.8 내독소 (EU/ml)⁶ Endotoxin (EU / ml) ⁶ < 0.03<0.03 인지질 (ng/Hb)⁷ Phospholipids (ng / Hb) ⁷ < 50<50 당지질 (ng/Hb)⁷ Glycolipids (ng / Hb) ⁷ < 2<2 ¹분광 광도계로 측정된 중합된 헤모글로빈 중의 수준.²삼투압계에 의해 측정된 중합된 헤모글로빈 중의 수준.³이온 특이적인 전극에 의해 측정된 중합화된 헤모글로빈 중의 수준.⁴원자 흡수에 의해 측정된 중합된 헤모글로빈 중의 수준.⁵크기별 배제-HPLC에 의해 결정됨.⁶어소시에이트스 오브 케이프 코드(Associates of Cape Cod)로부터 시판되는 어세이(assay)를 사용하는 LAL에 의해 측정됨, 어세이 성분은 카탈로그 제 100-5호, 800-1호 및 3100-5호를 가짐.⁷HPTLC에 의해 측정됨. ¹ Level in polymerized hemoglobin measured by spectrophotometer. ² level in polymerized hemoglobin measured by osmotic pressure. Levels in polymerized hemoglobin measured by ³ ion specific electrodes. Level in polymerized hemoglobin measured by ⁴ atomic absorption. ⁵ Size Exclusion—determined by HPLC. ^{6 As} measured by LAL using an assay commercially available from Associates of Cape Cod, assay components are described in catalogs 100-5, 800-1 and 3100-5. Have. ⁷ Measured by HPTLC.

하기 실시예들은 본 발명의 특정한 일면을 입증한다. 그러나, 본 실시예들은 단지 예시를 위한 것이며 본 발명의 조건 및 범위를 완전히 한정하려는 것이 아님을 이해하여야 한다. 모든 온도는 다르게 기술하지 않는 한 섭씨 온도로 표현된다. 다르게 언급하지 않는 한, 전체 헤모글로빈(THb)의 모든 비율은 중량/부피(w/v)로서 표현된다. 또한 보편적인 반응 조건(예를 들어, 온도, 반응 시간)이 제공되는 경우, 일반적으로 그다지 편리하지 않을지라도, 이들의 특정 범위를 초과하는 조건 및 미만인 조건 모두가 사용될 수 있음이 인지되어야 한다.The following examples demonstrate certain aspects of the present invention. However, it is to be understood that the present embodiments are illustrative only and are not intended to fully limit the conditions and scope of the present invention. All temperatures are expressed in degrees Celsius unless stated otherwise. Unless stated otherwise, all ratios of total hemoglobin (THb) are expressed as weight / volume (w / v). It should also be appreciated that where universal reaction conditions (eg, temperature, reaction time) are provided, both conditions above and below their specific range may be used, although generally not very convenient.

대조적으로 언급되지 않는 한, 본 발명의 방법에서 사용되는 모든 용기 및 탱크는 316-L 스테인레스 스틸, 바람직하게는 매우 연마되어서 쉽고 빠르게 세정되는, 약제학적 등급의 스테인레스 스틸로 제조된다. 여러 가지 연결파이프 및 관은 동일한 스테인레스 스틸 또는 약제학적 등급의 테플론 또는 실리콘 관으로 제조된다. 이 과정에서 사용되는 필터 및 막은 밀리포어 인코포레이티드(Millipore, Inc.), 팔-필트론(Pall-Filtron), 또는 큐노 인코포레이티드(Cuno Inc.)로부터 구입할 수 있다.Unless stated to the contrary, all vessels and tanks used in the process of the present invention are made of 316-L stainless steel, preferably of pharmaceutical grade stainless steel, which is very polished and easily and quickly cleaned. Various connection pipes and tubes are made of the same stainless steel or pharmaceutical grade Teflon or silicone tubes. Filters and membranes used in this process can be purchased from Millipore, Inc., Pall-Filtron, or Cuno Inc.

본 발명의 생성된 생성물의 반감기는 포유동물, 예를 들어 사람의 생체내에서 결정된다. 전형적으로, 포유동물에게 생성물을 주입한후 일정한 간격으로 혈액 샘플을 포유동물로부터 채혈하였다. 그런 다음, 생성물의 양을 혈액 샘플을 원심분리하고, 혈장 부분을 압착시키고, 분광 광도계로 혈장 헤모글로빈 수준을 측정한 후, 포유동물에 남아있는 생성물의 양을 생성물의 반감기에 상호관련시킴으로써 결정한다.The half-life of the resulting product of the invention is determined in vivo in mammals, for example humans. Typically, blood samples are drawn from the mammals at regular intervals after the product is injected into the mammals. The amount of product is then determined by centrifuging the blood sample, compressing the plasma portion, measuring plasma hemoglobin levels with a spectrophotometer, and then correlating the amount of product remaining in the mammal with the half-life of the product.

본 발명에 따른 크기별 배제 크로마토그래피 HPLC를 하기와 같이 수행한다:Exclusion chromatographic HPLC according to the invention is carried out as follows:

샘플을 0.2M의 인산칼륨 완충액(pH 6.9)으로 0.2 g/dl까지 희석시키고, 0.2μ 필터를 통해 여과시키고 하기의 성분으로 이루어진 HPLC 시스템에 주입시킨다(시스템 흐름 순서대로):Samples are diluted to 0.2 g / dl with 0.2 M potassium phosphate buffer (pH 6.9), filtered through a 0.2 μ filter and injected into an HPLC system consisting of the following components (in system flow order):

1. 파마시아(Pharmacia) 모델 2248 펌프Pharmacia Model 2248 Pump

- 이동상은 0.2M 인산칼륨(pH 6.9)임Mobile phase is 0.2 M potassium phosphate (pH 6.9)

- 유속은 1.0ml/분임.Flow rate is 1.0 ml / min.

2. 45cm PEEK 또는 티타늄 관, 0.010 (I.D.)2. 45cm PEEK or titanium tube, 0.010 (I.D.)

3. 200㎕ PEEK 샘플 루프를 갖는 레오다인(Rheodyne) 모델 7725i 주입기3. Rheodyne Model 7725i Injector with 200 μl PEEK Sample Loop

4. 18cm PEEK 또는 티타늄 관, 0.010 (I.D.)4. 18cm PEEK or titanium tube, 0.010 (I.D.)

5. 업처치(Upchurch) 모델 A431 0.5μ 필터5. Upchurch Model A431 0.5μ Filter

6. 9cm PEEK 또는 타타늄 관, 0.010 (I.D.)6. 9cm PEEK or Titanium Tube, 0.010 (I.D.)

7. 페노메넥스 비오세프(Phenomenex Biosep) SEC S-3000 75 x 7.8mm 가아드(Gaurd) 칼럼7. Phenomenex Biosep SEC S-3000 75 x 7.8 mm Gaurd Column

8. 24cm PEEK 또는 타타늄 관, 0.010 (I.D.)8. 24cm PEEK or Titanium Tube, 0.010 (I.D.)

9. 페노메넥스 비오세프 SEC S-3000 600 x 7.8mm 분석 칼럼9. Phenomenex Biosef SEC S-3000 600 x 7.8 mm Analysis Column

10. 23cm PEEK 또는 타타늄 관, 0.010 (I.D.)10.23cm PEEK or Titanium Tube, 0.010 (I.D.)

11. 파마시아 우비코드(Uvicord) SD UV 검출기11.Pharmacia Uvicord SD UV Detector

- 파장: 280nmWavelength: 280nm

- 흐름 셀: 8㎕ 부피, 2.5mm 경로길이Flow cell: 8 μl volume, 2.5 mm path length

- 범위: 2 AUFSRange: 2 AUFS

- 시간 상수: 10초Time constant: 10 seconds

280nm에서의 피크 흡광도는 LKB 2221 적분기에 의해 기록되고, 이 적분기는 개개의 피크 영역을 적분하고 각각의 중합체 종에 대한 전체 헤모글로빈 영역을 계산한다.Peak absorbance at 280 nm is recorded by the LKB 2221 integrator, which integrates the individual peak areas and calculates the total hemoglobin area for each polymer species.

본 발명은 하기의 비제한적 실시예에 의해 추가로 이해될 수 있다.The invention can be further understood by the following non-limiting examples.

실시예 1Example 1

도 1과 관련하여, 유효기간이 지난 혈액(전혈 또는 패킹된 적혈구)의 도너 백(20)을 적합한 무균성 흡출 장치(22)에 넣는다. 적합한 흡출 장치의 예로는 두 개의 흡출 스테이션을 갖는 시스템이 있다. 도너 백(donor bag)을 흡출 스테이션에 위치시키게 되면, 흡출 장치의 바늘은 도너백에 구멍을 내고, 1%(w/v) 염화나트륨 수용액 약 150ml를 도입시키고 감압 또는 진공하에서 도너 백으로부터 혈액을 흡출시킨다. 흡출된 혈액은 폭이 100μ인 필터(24) 및 후속적으로 직렬로 연결된 폭이 5μ인 두 개의 필터(26)를 통과한다. 혈액이 폭이 5μ인 필터를 통과할 때, 백혈구가 혈액으로부터 제거된다. 전형적으로는, 전혈 중의 약 170 유닛이 도 1에 도시된 바와 같이 흡출되고 여과되고 후속적으로 탱크 1로 옮겨진다. 그런 다음, 필터는 1%(w/v) 염화나트륨 수용액 약 75리터로 세척된다.In connection with FIG. 1, the donor bag 20 of expired blood (whole blood or packed red blood cells) is placed in a suitable sterile aspiration device 22. An example of a suitable draft device is a system with two draft stations. When the donor bag is placed in the aspiration station, the needle of the aspiration device punctures the donor bag, introduces about 150 ml of a 1% (w / v) aqueous sodium chloride solution and withdraws blood from the donor bag under reduced pressure or vacuum. Let's do it. The aspirated blood passes through a filter 24 having a width of 100 mu and subsequently two filters 26 having a width of 5 mu in series. When the blood passes through a 5 μm wide filter, white blood cells are removed from the blood. Typically, about 170 units of whole blood are aspirated, filtered and subsequently transferred to tank 1 as shown in FIG. 1. The filter is then washed with about 75 liters of 1% (w / v) aqueous sodium chloride solution.

혈액을 탱크 1에 도입시키기 전에, 탱크 1을 1% 염화나트륨 수용액 약 70L로 채웠다. 전혈 170 유닛을 모두 흡출시키고, 여과시키고, 옮기고, 필터를 세정시킨 후, 탱크는 약 250리터의 4% 전체 헤모글로빈 용액을 함유하였다. 흡출 및 여과 단계 동안에, 탱크 1은 감압, 즉 20-28" Hg의 진공으로 유지시켰다. 일단 혈액이 탱크 1에 전달되면, 진공은 차단되고 일산화탄소가 탱크내로 도입되어 탱크는 일산화탄소의 분위기를 함유하였다.Before introducing blood into tank 1, tank 1 was filled with about 70 L of a 1% aqueous sodium chloride solution. After all 170 units of whole blood were aspirated, filtered, transferred and the filter washed, the tank contained about 250 liters of 4% total hemoglobin solution. During the aspirate and filtration step, tank 1 was maintained at reduced pressure, ie 20-28 "Hg vacuum. Once blood was delivered to tank 1, the vacuum was shut off and carbon monoxide was introduced into the tank so that the tank contained an atmosphere of carbon monoxide. .

탱크 1을 도 1에 도시된 바와 같이 0.65μ 접선 흐름 필터(28)에 결합시켰다. 250 리터의 4% 전체 헤모글로빈 용액의 초기 충전은 접선 흐름 필터를 통한 미소여과에 의해 약 125 리터의 8% 전체 헤모글로빈 용액으로 약 125L로 농축된다. 이러한 지점에서의 헤모글로빈 용액의 pH는 약 6 내지 6.5이다. 8% 전체 헤모글로빈으로 농축시킨 후, 1%(w/v) 염화나트륨 수용액을 첨가하고, 염화나트륨 용액이 첨가되는 속도와 동일한 속도로 여과물을 다이아필트레이팅 및 제거함으로써 용액을 세척한다. 헤모글로빈 용액 125L는 1% 염화나트륨 수용액 약 8배 용적(약 1,000L)으로 전형적으로 세척된다. 세척후에, 용액은 약 70L, 즉 약 14% 전체 헤모글로빈으로 농축되고, "주사용 물(WFI)"이 첨가되어 용액의 용적이 약 180L로 된다. WFI가 첨가됨에 따라, 세포가 팽창 및 파열되어, 용액내로 헤모글로빈이 방출된다. 생성된 헤모글로빈 용액의 농도는 약 5% 전체 헤모글로빈(THb)이었다.Tank 1 was coupled to a 0.65μ tangential flow filter 28 as shown in FIG. The initial charge of 250 liters of 4% total hemoglobin solution is concentrated to about 125 L with about 125 liters of 8% total hemoglobin solution by microfiltration through a tangential flow filter. The pH of the hemoglobin solution at this point is about 6 to 6.5. After concentrating to 8% total hemoglobin, the solution is washed by adding 1% (w / v) aqueous sodium chloride solution and diafiltering and removing the filtrate at the same rate as the sodium chloride solution is added. 125 L of hemoglobin solution is typically washed to about 8 times the volume (about 1,000 L) of a 1% aqueous sodium chloride solution. After washing, the solution is concentrated to about 70 L, ie about 14% total hemoglobin, and "injection water (WFI)" is added to bring the volume of the solution to about 180 L. As WFI is added, cells expand and rupture, releasing hemoglobin into solution. The concentration of resulting hemoglobin solution was about 5% total hemoglobin (THb).

생성된 용액은 탱크 1에 있는 동안 여전히 투명하였다. 용액을 먼저 약 50L로 농축시키고, 농축물을 탱크 2로 옮겼다. 용액을 필터를 가로질러 펌핑시킨 경우, 적혈구 지질 오염물질 및 세포벽 물질은 보유되고 필터에 의해 제거되었다. 탱크 1에 잔류하는 50L 용액을 약 2.5 용적의 WFI로 세척하였다. 이러한 2.5 용적의 세척액을 탱크 2에 첨가하였다. 그런 후, 탱크 1에 잔류하는 물질을 약 20L로 농축시키고 여과물을 탱크 2에 첨가하였다. 탱크 2에서 생성된 용적은 3.3% 전체 헤모글로빈 용액 280L였다.The resulting solution was still clear while in tank 1. The solution was first concentrated to about 50 L and the concentrate was transferred to tank 2. When the solution was pumped across the filter, erythrocyte lipid contaminants and cell wall material were retained and removed by the filter. The 50 L solution remaining in tank 1 was washed with about 2.5 volumes of WFI. This 2.5 volume of wash liquor was added to tank 2. The material remaining in tank 1 was then concentrated to about 20 L and the filtrate was added to tank 2. The volume produced in tank 2 was 280 L of 3.3% total hemoglobin solution.

그런 다음, 생성된 지질이 없는 헤모글로빈 용액을 약 10시간 이상 동안 약 60 내지 62℃의 온도로 탱크 2 중에서 열처리하였다. 열처리 동안에, 용액을 적당하게 교반시켰다. 용액이 가열되어 약 55℃를 통과할 때, 침전물이 형성된다.The resulting lipid-free hemoglobin solution was then heat treated in tank 2 at a temperature of about 60-62 ° C. for at least about 10 hours. During the heat treatment, the solution was stirred appropriately. When the solution is heated to pass about 55 ° C., a precipitate forms.

그런 다음, 생성된 3.3% THb(w/v) 스트로마 없는 열처리된 헤모글로빈 용액을 0.2μ 필터(30) 이어서 0.1μ 필터(32)를 통해 여과시키고 탱크 3으로 옮겼다. 그런 다음, 여과된 헤모글로빈 용액을 약 18% THb로 농축시키고, 후속적으로 4배 용적의 WFI(180L)로 디이아필터링시켰다. 10킬로달톤(kd) 분자량 한외필터(34)를 사용하여 농축 및 디이아필트레이션(diafiltration)을 수행하였다. 한외필터(34)와 결합된 배관(35)은 여과물을 수집한다. 이 지점에서, 18% 전체 헤모글로빈 용액 45L는 약 6 내지 6.5의 pH에서 헤모글로빈 1g 당 50ng 미만의 포스포리피드, 헤모글로빈 1g 당 2ng 미만의 글리코리피드, 내독소 1ml 당 약 0.03 미만의 내독소를 함유하였다. 용액중의 이러한 헤모글로빈은 카르복시헤모글로빈이다.The resulting 3.3% THb (w / v) stromal heat treated hemoglobin solution was then filtered through a 0.2 μ filter 30 followed by a 0.1 μ filter 32 and transferred to tank 3. The filtered hemoglobin solution was then concentrated to about 18% THb and subsequently diafiltered with 4 times the volume of WFI (180 L). Concentration and diafiltration were performed using a 10 kilodalton (kd) molecular weight ultrafilter (34). The pipe 35 coupled with the ultrafilter 34 collects the filtrate. At this point, 45L of 18% total hemoglobin solution contained less than 50ng of phospholipid per gram of hemoglobin, less than 2ng of glycolipid per gram of hemoglobin and less than about 0.03 of endotoxin per ml of endotoxin at a pH of about 6-6.5 . Such hemoglobin in solution is carboxyhemoglobin.

그런 다음, 생성된 카르복시헤모글로빈 용액을 카르복시헤모글로빈이 먼저 산소화되고 이어서 탈산소화되는 탱크 4로 옮겼다. 탱크 4는 산소 및 질소 가스 라인에 결합된 가스 분무 링, 탱크 바닥으로부터 탱크 4의 상부에 위치한 계량화된 분무 장치로의 공급물, 및 포움이 액체내로 농축되고 탱크 4로 다시 공급되는 포움 캔(36)내로 탱크 4에서 발생된 포움이 공급되도록 포움 캔(1)에 연결된 포움 오우버플로우 수집기를 갖추고 있다. 탱크 4는 탱크 용적의 거의 3분의 1을 채우는 한 세트의 폴 링(Pall Ring)을 포함한다. 포움 캔(36)은 가스 제거용 가스 구멍을 포함한다. 탱크 4내 용액은 13% 전체 헤모글로빈 용액이었다.The resulting carboxyhemoglobin solution was then transferred to tank 4 where the carboxyhemoglobin was first oxygenated and then deoxygenated. Tank 4 is a gas spray ring coupled to an oxygen and nitrogen gas line, a feed from the bottom of the tank to a metered spray device located at the top of tank 4, and a foam can (36) in which the foam is concentrated into the liquid and fed back to tank 4 (36). It is equipped with a foam overflow collector connected to the foam can 1 so that the foam generated in tank 4 is supplied into the tank. Tank 4 contains a set of Fall Rings that fill nearly one third of the tank's volume. The foam can 36 includes a gas hole for degassing. The solution in tank 4 was 13% total hemoglobin solution.

제 1 산소화 단계 동안에, 용기내에서 가스의 균일한 분포를 갖도록 하기에 충분한 속도로 용액을 통해 산소를 분포시켰다. 가스를 약 25L/분 속도로 용기(200L 용적)에 분무시켰다. 생성된 용액이 전체 헤모글로빈 중량을 기준으로 하여 5% 미만의 카르복시헤모글로빈을 함유하도록 약 16시간 동안 카르복시헤모글로빈의 산소화 반응을 수행하였다. 약 10℃의 온도에서 산소화 반응을 수행하였다. 탱크 4에서 발생된 포움을 포움 캔(36)에서 수집하고, 침전시킨 후, 생성된 용액을 탱크 4로 다시 옮겼다.During the first oxygenation step, oxygen was distributed through the solution at a rate sufficient to have a uniform distribution of gas in the vessel. Gas was sprayed into the vessel (200 L volume) at a rate of about 25 L / min. Oxygenation of carboxyhemoglobin was carried out for about 16 hours such that the resulting solution contained less than 5% of carboxyhemoglobin based on the total hemoglobin weight. The oxygenation reaction was carried out at a temperature of about 10 ° C. The foam generated in tank 4 was collected in foam can 36 and after precipitation, the resulting solution was transferred back to tank 4.

산소화 반응을 수행한 후, 약 6시간 동안 질소의 유사한 흐름으로 또는 전체 헤모글로빈의 중량을 기준으로 하여 10% 미만의 옥시헤모글로빈이 용액중에 잔류할 때까지 용액을 분무하였다. 약 10℃의 온도 및 약 6 내지 6.5의 pH에서 질소 분무를 수행하였다. 또한, 카르복시헤모글로빈을 막 교환기를 사용하여 데옥시헤모글로빈으로 전환시킬 수 있었다. 포움 단계로부터 일반적으로 예견될 수 있겠지만 실질적으로 어떠한 헤모글로빈의 변성도 없음에 주의하여야 한다. 생성된 탈산소화된 용액은 화학적인 개질을 위해 제조된다.After performing the oxygenation reaction, the solution was sprayed for about 6 hours with a similar flow of nitrogen or until less than 10% oxyhemoglobin remained in the solution based on the weight of the total hemoglobin. Nitrogen spraying was performed at a temperature of about 10 ° C. and a pH of about 6 to 6.5. In addition, carboxyhemoglobin could be converted to deoxyhemoglobin using a membrane exchanger. It may be generally foreseen from the foam stage, but it should be noted that there is virtually no hemoglobin denaturation. The resulting deoxygenated solution is prepared for chemical modification.

도 2를 보면, 데옥시헤모글로빈 용액을 화학적으로 개질시키기 위해 탱크 5로 옮겼다. 1:1 내지 3:1의 P5P 대 헤모글로빈 몰비로 피리독실-5-포스페이트(P5P)(93.75g/L) 수용액을 약 4℃ 용액에서 데옥시헤모글로빈을 함유하는 탱크 5에 첨가하였다. P5P 대 헤모글로빈의 몰비는 2:1이 바람직하다. 약 4℃의 온도에서 피리독실화 반응을 수행하였다. P5P 용액을 약 1분 이상 동안 첨가하고 약 15분 동안 혼합시킨 후, 수소화붕소 나트륨/수산화나트륨 용액을 수소화붕소 나트륨 대 헤모글로빈의 몰비 약 20:1로 헤모글로빈 용액에 첨가하였다. 적합한 수소화붕소 나트륨/수산화나트륨 수용액은 2리터 당 수산화나트륨 0.8g 및 2리터 당 수소화붕소 나트륨 90.8g을 함유하였다. 수소화붕소 용액을 약 1분 동안 가능한 한 신속하게 첨가한 후, 1시간 동안 교반시켰다. 생성된 피리독실화된 헤모글로빈 용액 50L를 10K 달톤 한외필터(38)를 사용하여 후속적으로 다이아필터링시켜서 4용적의 WFI로 과량의 반응물을 제거하였다. 한외필터(38)에 결합된 배관(40)을 사용하여 필터(38)로부터 여과물을 수거하였다.2, the deoxyhemoglobin solution was transferred to tank 5 for chemical modification. An aqueous solution of pyridoxyl-5-phosphate (P5P) (93.75 g / L) in a P5P to hemoglobin molar ratio of 1: 1 to 3: 1 was added to tank 5 containing deoxyhemoglobin in a solution of about 4 ° C. The molar ratio of P5P to hemoglobin is preferably 2: 1. The pyridoxylation reaction was carried out at a temperature of about 4 ° C. After the P5P solution was added for at least about 1 minute and mixed for about 15 minutes, a sodium borohydride / sodium hydroxide solution was added to the hemoglobin solution at a molar ratio of sodium borohydride to hemoglobin at about 20: 1. Suitable aqueous sodium borohydride / sodium hydroxide solution contained 0.8 g sodium hydroxide per 2 liters and 90.8 g sodium borohydride per liter. The boron hydride solution was added as quickly as possible for about 1 minute and then stirred for 1 hour. 50 L of the resulting pyridoxylated hemoglobin solution was subsequently diafiltered using a 10K Dalton ultrafilter 38 to remove excess reactant with 4 volumes of WFI. The filtrate was collected from the filter 38 using a tubing 40 coupled to the ultrafilter 38.

4용적, 즉 200L의 WFI로 다이아필터링시킨 후, 헤모글로빈을 중합시켰다. 피리독실화된 헤모글로빈을 함유하는 탱크 5에 4.5% 전체 헤모글로빈(약 175L의 헤모글로빈 용액)을 제조하기에 충분한 WFI를 첨가하였다. 글루타르알데히드 용액을 약 24:1의 글루타르알데히드 대 헤모글로빈의 몰비로 피리독실화된 헤모글로빈 용액에 첨가하였다. 약 18시간 동안 중합 반응을 지속시켰다. 목적하는 분자량 분포는 약 75% 중합체 및 25% 테트라였다. 목적하는 중합체는 약 600,000 미만의 분자량을 가지며, 분자량의 우세한 분획은 100,000 내지 350,000 이다.Hemoglobin was polymerized after diafiltering with 4 volumes, i.e. 200 L of WFI. Sufficient WFI was added to tank 5 containing pyridoxylated hemoglobin to prepare 4.5% total hemoglobin (a solution of about 175 L hemoglobin). A glutaraldehyde solution was added to a pyridoxylated hemoglobin solution at a molar ratio of glutaraldehyde to hemoglobin of about 24: 1. The polymerization was continued for about 18 hours. The desired molecular weight distribution was about 75% polymer and 25% tetra. The desired polymer has a molecular weight of less than about 600,000 and the predominant fraction of molecular weight is 100,000 to 350,000.

중합 반응이 목적하는 분자량 분포(약 18시간 이후)에 도달된 후, 글리신 수용액(약 166g/L)을 약 140:1의 글리신 대 헤모글로빈의 몰비로 헤모글로빈 용액에 첨가하였다. 생성된 중합되고 글리신-켄칭된 헤모글로빈 생성물의 HPLC 트레이싱을 도시하는 도 3을 참조하라. 이후, 형성된 용액을 약 10분 동안 혼합한 후, 나트륨 수소화붕소 나트륨/히드록사이드 용액(농도는 상기 확인된 것임)을 수소화붕소 대 헤모글로빈의 몰비를 28:1로 하여 헤모글로빈 용액에 첨가한다. 이 생성된 혼합물을 약 1 시간 동안 교반한다. 이후, 용액을 약 50ℓ로 농축시키고(한외필터 38), 4배 용적(200ℓ)의 WFI로 세척한다. 상기 기재된 바와 동일한 몰비로 수소화붕소 나트륨의 추가 분취액을 농축된 용액에 첨가하고 1 시간 동안 다시 혼합한다. 생성된 용액을 4배 용적(200ℓ)의 WFI로 세척하자, 중합되고, 피리독실화된 지질이 없는 헤모글로빈이 생성되었으며, 이를 열처리하였다.After the polymerization reaction reached the desired molecular weight distribution (after about 18 hours), an aqueous solution of glycine (about 166 g / L) was added to the hemoglobin solution at a molar ratio of glycine to hemoglobin of about 140: 1. See FIG. 3, which shows HPLC tracing of the resulting polymerized glycine-quenched hemoglobin product. The solution formed is then mixed for about 10 minutes, and then sodium borohydride sodium / hydroxide solution (concentrations identified above) is added to the hemoglobin solution with a molar ratio of boron hydride to hemoglobin of 28: 1. The resulting mixture is stirred for about 1 hour. The solution is then concentrated to about 50 L (ultrafilter 38) and washed with 4 times volume (200 L) of WFI. An additional aliquot of sodium borohydride is added to the concentrated solution in the same molar ratio as described above and mixed again for 1 hour. The resulting solution was washed with 4 times volume (200 L) of WFI, resulting in polymerized, pyridoxylated lipid free hemoglobin, which was heat treated.

생성된 용액을 산소 분위기 하에서 방치시킴으로써 산소화시킨 후, 정제 시스템(42)로 옮긴다. 정제는 크로마토그래피, 여과, 바람직하게는 막여과(다이아필트레이션), 또는 여과 및 칼럼 크로마토그래피를 결합하여 달성될 수 있다.The resulting solution is oxygenated by standing in an oxygen atmosphere and then transferred to a purification system 42. Purification can be accomplished by chromatography, filtration, preferably membrane filtration (diafiltration), or by combining filtration and column chromatography.

1가지 구체예에서, 용액을 도 5에 도시된 바와 같이, 크로마토그래피 공급 용기인 탱크(6)에 옮긴다. 이러한 구체예에서, 생성된 옥시헤모글로빈 용액을 이후 탱그(6)에서 약 200ℓ(총 헤모글로빈 4%)로 희석하고, 염화물의 농도는 염화나트륨 용액으로 22mM로 조정한다. 나트륨 용액의 조정은 필요하지 않다.In one embodiment, the solution is transferred to tank 6, which is a chromatography supply vessel, as shown in FIG. In this embodiment, the resulting oxyhemoglobin solution is then diluted to about 200 L (4% total hemoglobin) in the tank 6 and the concentration of chloride is adjusted to 22 mM with sodium chloride solution. No adjustment of the sodium solution is necessary.

이후, 생성된 헤모글로빈 용액의 40ℓ 분취액 5개를 칼럼(44)을 사용하여 크로마토그래피한다. 칼럼(44)은 테트라머보다 중합체에 친화성이 더 큰 황색 염료(미메틱 옐로우 넘버 1(Mimetic Yellow No.1)으로 어피니티 크로마토그래피 리미티드사(Affinity Chromatography, Ltd)로부터 입수할 수 있음)로 개질된 아가로우스 겔인 친화성 겔을 함유한다.Thereafter, five 40 L aliquots of the resulting hemoglobin solution are chromatographed using column 44. Column 44 is a yellow dye that is more affinity for the polymer than tetramer (available from Affinity Chromatography, Ltd. as Mimetic Yellow No. 1). Affinity gel, which is a modified agarose gel.

크로마토그래피는 하기와 같이 수행한다. 40ℓ의 산소화되고 중합되고 피리독실화된 지질이 없는 헤모글로빈 용액을 칼럼(44)에 로우딩시킨다. 칼럼을 30mM의 NaCl 완충액의 15 칼럼 용적(약 750ℓ)으로 세척하여 테트라머를 제거한다. 이후, 칼럼을 약 250ℓ의 300mM 염화나트륨 완충액으로 세척하여 중합체를 세척해낸다. 중합체 분획을 탱크(7)에서 수집한다. 원하지 않는 분획을 배관(46)에 보낸다. 각가의 분취액을 제거한 후, 칼럼을 15mM HCl 용액(150ℓ)로 재생성시키고, 30mM NaCl(250ℓ)로 재평형시키고, 공급 용액의 또 다른 분취액(40ℓ)를 칼럼에 로우딩시킨다. 칼럼을 다시 30mM NaCl로 세척한 후 300mM NaCl로 세척한다. 40ℓ 분취액의 헤모글로빈 용액을 칼럼에 첨가하고, 탱크(6)이 비워질 때까지 크로마토그래피한다.Chromatography is carried out as follows. 40 L of oxygenated, polymerized, pyridoxylated lipid-free hemoglobin solution is loaded into column 44. The column is washed with 15 column volumes (about 750 L) of 30 mM NaCl buffer to remove the tetramer. The column is then washed with about 250 L of 300 mM sodium chloride buffer to wash off the polymer. The polymer fraction is collected in tank 7. Unwanted fractions are sent to tubing 46. After removal of each aliquot, the column is regenerated with 15 mM HCl solution (150 L), rebalanced with 30 mM NaCl (250 L), and another aliquot (40 L) of feed solution is loaded onto the column. The column is washed again with 30 mM NaCl and then with 300 mM NaCl. A 40 L aliquot of hemoglobin solution is added to the column and chromatographed until tank 6 is empty.

탱크(7)에 수집된 분획을 배관(50)과 연결된 필터(48)를 사용하여 약 40ℓ(총 헤모글로빈의 6%)로 한외여과시킨다. 농축된 헤모글로빈 용액을 탈산소화하는 동안 기체 교환 탱크(8)로 옮긴다.The fraction collected in tank 7 is ultrafiltered to about 40 liters (6% of total hemoglobin) using filter 48 connected to tubing 50. The concentrated hemoglobin solution is transferred to the gas exchange tank 8 during deoxygenation.

다르게는, 용액을 도 6에 도시된 바와 같이 여과 재순환 용기(10)로 옮긴다. 이후, 헤모글로빈을 탱크(10)에서 약 4% THb로 희석한다. 이후 4% 용액을 10mM NaCl과 팔-필트론(Pall-Fltron)사에서 시판되는 분자량 300,000의 필터(52)를 사용하여 디이아필터링시킨다. 여과는 약 97%의 헤모글로빈이 필터를 용해 탱크(11)에 전달될 때까지 계속한다.(물질의 약 3%, 즉, 고분자량 중합체가 탱크(10)에 보유된다). 헤모글로빈의 양은 코옥시미터(cooximeter)를 사용하여 분광학적으로 측정한다.Alternatively, the solution is transferred to a filtration recycle vessel 10 as shown in FIG. 6. The hemoglobin is then diluted to about 4% THb in tank 10. The 4% solution is then dia-filtered using 10 mM NaCl and a filter 52 of molecular weight 300,000 available from Pall-Fltron. Filtration continues until about 97% of hemoglobin is delivered to the dissolution tank 11 (about 3% of the material, ie high molecular weight polymer is retained in tank 10). The amount of hemoglobin is measured spectroscopically using a cooximeter.

탱크(11) 중에 생성된 물질은 약 2 내지 4%의 THb이며, TH6을 기재로 하는 약 7 내지 10%의 테트라머를 함유한다. 이후, 2 내지 4%의 THb를 배관 또는 트랩(56)과 연결된 10mM NaCl과 팔-필트론사에서 시판되는 분자량 100,000의 필터(54)를 사용하여 다이아필터링시킨다. 여과는 바이오세프(BioSep) SEC-S3000 600 x 7.8㎜ 칼럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되는 테트라머의 수준이 헤모글로빈 중량의 0.8%가 될 때까지 계속한다. 생성된 정제된 헤모글로빈 용액은 초기에 탱크(11)에 잔류하며, 이후 탈산소화를 위해 기체 교환 탱크(8)에 옮겨진다.The material produced in tank 11 is about 2-4% THb and contains about 7-10% tetramers based on TH6. 2-4% THb is then diafiltered using 10 mM NaCl connected to tubing or trap 56 and a filter 54 of 100,000 molecular weight available from Pal-Piltron. Filtration is continued until the level of tetramer as determined by size exclusion chromatography using a BioSep SEC-S3000 600 × 7.8 mm column is 0.8% of the hemoglobin weight. The resulting purified hemoglobin solution initially remains in tank 11 and then transferred to gas exchange tank 8 for deoxygenation.

기체 교환 탱크(8)은 탱크(4)와 동일한 탱크, 또는 바람직하게는 상이한 탱크일 수 있다. 기체 교환 탱크(8)는 도 1의 기체 교환 탱크(4)와 실질적으로 동일하게 설치되며, 탱크(4)와 동일한 형태로 포움 캔(58) 및 포움 캔(36)에 부착될 수 있다. 탈산소화는 약 10℃에서 질소 살포 및 약 7.5의 pH 용액으로 약 2.5 시간 후에 달성된다. 질소 살포는 총 헤모글로빈의 중량을 기준으로 하여 옥시헤모글로빈의 약 16% 미만이 용액에 잔류할 때까지 계속한다. 생성된 데옥시헤모글로빈 용액은 이후 제형화를 위해 탱크(9)에 옮겨진다.The gas exchange tank 8 may be the same tank as the tank 4, or preferably a different tank. The gas exchange tank 8 is installed substantially the same as the gas exchange tank 4 of FIG. 1 and may be attached to the foam can 58 and the foam can 36 in the same form as the tank 4. Deoxygenation is achieved after about 2.5 hours with nitrogen sparging at about 10 ° C. and a pH solution of about 7.5. Nitrogen sparging continues until less than about 16% of oxyhemoglobin remains in solution based on the weight of total hemoglobin. The resulting deoxyhemoglobin solution is then transferred to tank 9 for formulation.

제형화 탱크(9)에서, 용액을 먼저 약 7%의 총 헤모글로빈으로 농축시키고, 4℃에서 pH를 약 8.8 내지 9.0으로 조절한다. pH는 0.2M NaOH를 사용하여 조절한다. 이후 전해질 용액을 pH 8.8 내지 9.0인 헤모글로빈 용액에 첨가한다. 글루코오스 및 글리신을 첨가하여 각각 약 5g/ℓ 및1.75g/ℓ의 최종 농도를 달성한다. 염화칼륨을 상기 용액에 첨가하여 약 3.5 내지 4.5mM의 칼륨 농도를 얻는다. 이후, 3M 염화나트륨을 첨가하여 85 내지 110 mM의 염화물 농도를 얻는다. 이후 락트산나트륨을 첨가하여 135-155mM 농도의 나트륨 이온을 얻는다. 끝으로, 0.45몰의 아스코르브산 용액을 첨가하여 아스코르브산 농도를 약 1000㎎/ℓ 이하로 증가시킨다. 아스코르브산은 저장용 방부제/산화방지제로서 첨가된다. 생성된 헤모글로빈 용액은 최종 몰랄삼투압농도가 ㎏당 약 280 내지 360 밀리몰이다.In the formulation tank 9, the solution is first concentrated to about 7% total hemoglobin and the pH is adjusted to about 8.8 to 9.0 at 4 ° C. pH is adjusted using 0.2 M NaOH. The electrolyte solution is then added to a hemoglobin solution with a pH of 8.8 to 9.0. Glucose and glycine are added to achieve final concentrations of about 5 g / l and 1.75 g / l, respectively. Potassium chloride is added to the solution to obtain a potassium concentration of about 3.5 to 4.5 mM. 3M sodium chloride is then added to obtain a chloride concentration of 85 to 110 mM. Sodium lactate is then added to obtain sodium ions at 135-155 mM concentration. Finally, 0.45 moles of ascorbic acid solution is added to increase the ascorbic acid concentration to about 1000 mg / l or less. Ascorbic acid is added as a preservative / antioxidant for storage. The resulting hemoglobin solution has a final molar osmolarity of about 280 to 360 millimoles per kilogram.

이후, 제형화된 헤모글로빈 용액을 트랩(62)에 연결된 필터(60)을 사용하여 약 10%의 총 헤모글로빈으로 농축하고, 10% 헤모글로빈 용액을 이후 필터(64)에 의해 여과하여 살균시키고, 예비살균된 백에 무균적으로 충전시킨다.The formulated hemoglobin solution is then concentrated to about 10% total hemoglobin using filter 60 connected to trap 62, and the 10% hemoglobin solution is then filtered by filter 64 to sterilize and presterilize Aseptically filled bags.

본 실시예, 배치 A에서 제조된 생성물의 특징은 표 1에 기재되어 있다. 또한, 모두 배치 A에 대해 상기 언급된 절차에 따라 제조된 배치 B 및 C의 특징은 표 1에 기재되어 있다.The properties of the product prepared in this example, batch A, are described in Table 1. In addition, the characteristics of batches B and C, both prepared according to the procedure mentioned above for batch A, are described in Table 1.

배치arrangement 시험exam AA BB CC 헤모글로빈 (g/㎗)Hemoglobin (g / ㎗) 10.410.4 10.210.2 10.210.2 메트헤모글로빈 (%)Methemoglobin (%) 4.64.6 6.06.0 5.65.6 카르복시헤모글로빈 (%)Carboxyhemoglobin (%) 0.20.2 1.41.4 1.51.5 P50(토르, pH 7.35-7.45, pCO₂35-40 토르)P50 (tor, pH 7.35-7.45, pCO ₂ 35-40 Torr) 28.528.5 26.826.8 27.027.0 몰랄삼투농도(밀리몰/ℓ)Molar osmotic concentration (millimoles / ℓ) 318318 320320 317317 나트륨(밀리몰/ℓ)Sodium (mmol / l) 142142 144144 142142 칼륨(밀리몰/ℓ)Potassium (mmol / l) 4.04.0 4.04.0 4.04.0 염화물(밀리몰/ℓ)Chloride (mmol / l) 9898 9999 9494 유리 철(ppm)Glass iron (ppm) 0.70.7 1.21.2 1.01.0 분자량 분포,각각의 분자량(Kd)에서의 %Molecular weight distribution,% at each molecular weight (Kd) 128:16192:26256⁸:58256 ⁸ : 58 128:11192:23256⁸:66128: 11192: 23256 ⁸ : 66 128:16192:26256⁸:58256 ⁸ : 58 테트라머(%)Tetramer (%) 0.40.4 0.30.3 0.40.4 내독소(EU/㎖)Endotoxin (EU / mL) <0.03<0.03 <0.03<0.03 <0.03<0.03

상기에서는 예시의 목적으로 본 발명의 바람직한 구체예가 상세하게 기재되었으나, 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 본 명세서를 기준으로 하여 당업자들에게 자명한 모든 변형, 분지 및 균등물은 하기 청구의 범위내에 포함되는 것으로 이해될 것이다.In the above, preferred embodiments of the present invention have been described in detail for purposes of illustration, but the present invention is not limited thereto. It will be understood that all modifications, branches, and equivalents apparent to those skilled in the art based on this specification are included within the scope of the following claims.

본 발명은 적혈구 대체 생성물 즉, 헤모글로빈 생성물을 제조하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본질적으로 테트라머가 없고, 교차 결합되고, 중합되고, 피리독실화된 헤모글로빈 용액을 포함하는 무세포성 적혈구 대체물에 관한 것이며, 이 헤모글로빈 용액은 지질 오염물질이 없다.The present invention relates to a method and an apparatus for preparing erythrocyte replacement products, ie hemoglobin products. In addition, the present invention is directed to acellular red blood cell replacements that are essentially tetramer free, cross-linked, polymerized, and pyridoxylated hemoglobin solution, which is free of lipid contaminants.

Claims

신장 기능의 감소를 유발함이 없이 약 1.5 리터 이하의 양으로 사람 환자에게 주입될 수 있는 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 수용액.An aqueous solution of pyridoxylated and polymerized hemoglobin that can be injected into a human patient in an amount of up to about 1.5 liters without causing a decrease in renal function.

제 1항에 있어서, 사람 환자 체내에서의 반감기가 약 15 시간임을 특징으로 하는 수용액.The aqueous solution of claim 1 wherein the half-life in the human patient's body is about 15 hours.

제 1항에 있어서, 사람 환자 체내에서의 반감기가 약 24 시간임을 특징으로 하는 수용액.The aqueous solution of claim 1 wherein the half-life in the human patient's body is about 24 hours.

제 1항에 있어서, 약 5 리터 이항의 양으로 주입될 수 있음을 특징으로 하는 수용액.The aqueous solution of claim 1 which can be injected in an amount of about 5 liters binomial.

제 1항에 있어서, 신장 기능의 감소를 유발함이 없이 약 3 리터 이항의 양으로 사람 환자에게 주입될 수 있고, 사람 체내에서의 반감기가 24 시간임을 특징으로 하는 수용액.The aqueous solution of claim 1 which can be infused into a human patient in an amount of about 3 liters binomial without causing a decrease in renal function and has a half-life in the human body of 24 hours.

약 3 리터 이하의 양으로 사람 환자에게 주입될 수 있는 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 용액을 제조하는 방법으로서,A method of making a pyridoxylated and polymerized hemoglobin solution that can be injected into a human patient in an amount of up to about 3 liters,

(a) 적혈구를 함유하는 혼합물을 최소 평균 구멍 크기가 백혈구의 통과를 억제하기에 충분한 필터에 통과시켜 백혈구를 제거하는 단계;(a) passing the mixture containing red blood cells through a filter with a minimum average pore size sufficient to inhibit the passage of white blood cells to remove white blood cells;

(b) 적혈구를 용해시키는 단계;(b) lysing red blood cells;

(c) (b)의 생성물에 일산화탄소를 첨가하고, 약 60 내지 62℃로 약 10시간 동안 가열하여, 열처리된 헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;(c) adding carbon monoxide to the product of (b) and heating to about 60 to 62 ° C. for about 10 hours to obtain a heat treated hemoglobin solution;

(d) 열처리된 헤모글로빈 용액을 여과시켜 가열에 의해 침전된 지질 및 지질 오염물질을 제거하는 단계;(d) filtering the heat treated hemoglobin solution to remove precipitated lipids and lipid contaminants by heating;

(e) 열처리된 용액에 약 10℃에서 산소를 스파징한후 질소를 스파징하여 포움을 생성시킴으로써 열처리된 헤모글로빈 용액을 탈기시켜, 탈기되고 열처리된 헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;(e) degassing the heat treated hemoglobin solution by sparging oxygen in the heat treated solution at about 10 ° C. followed by sparging with nitrogen to form a foam to obtain a degassed and heat treated hemoglobin solution;

(e) 탈기된 용액을 피리독실화시켜 피리독실화된 헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;(e) pyridoxylation of the degassed solution to obtain a pyridoxylated hemoglobin solution;

(f) 피리독실화된 헤모글로빈 용액을 중합시켜 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈을 생성시키는 단계;(f) polymerizing the pyridoxylated hemoglobin solution to produce pyridoxylated and polymerized hemoglobin;

(g) 용액을 산소화시키는 단계;(g) oxygenating the solution;

(g) 용액을 정제하여 테트라머 헤모글로빈을 제거하고, 정제된 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈을 수거하는 단계 (여기에서, 용액은 헤모글로빈의 전체 중량을 기준으로 하여 0.8% 미만의 테트라머를 함유함);(g) purifying the solution to remove tetramer hemoglobin and collecting purified pyridoxylated and polymerized hemoglobin, wherein the solution contains less than 0.8% tetramer based on the total weight of hemoglobin );

(h) 정제된 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈을 탈산소화시키는 단계; 및(h) deoxygenating the purified pyridoxylated and polymerized hemoglobin; And

(i) 정제된 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 용액의 pH 및 전해질 수준을 생리적 수준으로 조정하는 단계를 포함하는 방법.(i) adjusting the pH and electrolyte levels of the purified pyridoxylated and polymerized hemoglobin solution to physiological levels.

제 6항에 있어서, 탈기된 용액을 약 1:1 내지 3:1의 피리독살-5-포스페이트 대 헤모글로빈의 몰비로 피리독살-5-포스페이트와 접촉시킴으로써 탈기된 용액이 피리독실화됨을 특징으로 하는 방법.The degassed solution is pyridoxylated by contacting the degassed solution with pyridoxal-5-phosphate at a molar ratio of pyridoxal-5-phosphate to hemoglobin of about 1: 1 to 3: 1. Way.

제 6항에 있어서, 탈기된 용액을 약 2:1의 피리독살-5-포스페이트 대 헤모글로빈의 몰비로 피리독살-5-포스페이트와 접촉시킴으로써 탈기된 용액이 피리독실화됨을 특징으로 하는 방법.7. The method of claim 6, wherein the degassed solution is pyridoxylated by contacting the degassed solution with pyridoxal-5-phosphate in a molar ratio of pyridoxal-5-phosphate to hemoglobin of about 2: 1.

제 7항에 있어서, 피리독살-5-포스페이트가 약 1시간 동안 헤모글로빈 및 수소화붕소와 접촉됨을 특징으로 하는 방법.8. The method of claim 7, wherein the pyridoxal-5-phosphate is contacted with hemoglobin and boron hydride for about 1 hour.

제 9항에 있어서, 피리독실화된 용액을 약 24:1의 글루타르알데히드 대 헤모글로빈의 몰비로 글루타르알데히드와 접촉시킴으로써 피리독실화된 용액 중의 헤모글로빈이 중합됨을 특징으로 하는 방법.10. The method of claim 9, wherein the hemoglobin in the pyridoxylated solution is polymerized by contacting the pyridoxylated solution with glutaraldehyde at a molar ratio of glutaraldehyde to hemoglobin of about 24: 1.

제 10항에 있어서, 피리독실화된 용액이 약 18시간 동안 글루타르알데히드와 접촉한후 켄칭됨을 특징으로 하는 방법.The method of claim 10, wherein the pyridoxylated solution is quenched after contact with glutaraldehyde for about 18 hours.

환자에게 약 1.5 리터 미만의 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 용액을 투여하는 것을 포함하여, 수혈이 필요한 환자에게 수혈하는 방법.A method of transfusion to a patient in need thereof, comprising administering to the patient less than about 1.5 liters of a pyridoxylated and polymerized hemoglobin solution.

환자에게 약 3.0 리터 미만의 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 용액을 투여하는 것을 포함하여, 수혈이 필요한 환자에게 수혈하는 방법.A method of transfusion in a patient in need thereof, comprising administering to the patient less than about 3.0 liters of a pyridoxylated and polymerized hemoglobin solution.

환자에게 약 5.0 리터 미만의 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 용액을 투여하는 것을 포함하여, 수혈이 필요한 환자에게 수혈하는 방법.A method of transfusion in a patient in need thereof, comprising administering to the patient less than about 5.0 liters of a pyridoxylated and polymerized hemoglobin solution.

제 14항에 있어서, 헤모글로빈이 글루타르알데히드 중합된 헤모글로빈임을 특징으로 하는 방법.15. The method of claim 14, wherein the hemoglobin is glutaraldehyde polymerized hemoglobin.

제 15항에 있어서, 헤모글로빈이 도 4에 도시된 분자량 분포를 가짐을 특징으로 하는 방법.The method of claim 15, wherein the hemoglobin has a molecular weight distribution shown in FIG. 4.

제 1항에 있어서, 헤모글로빈이 도 4에 도시된 분자량 분포를 갖는 글루타르알데히드 중합된 헤모글로빈임을 특징으로 하는 용액.The solution of claim 1 wherein the hemoglobin is glutaraldehyde polymerized hemoglobin having a molecular weight distribution shown in FIG. 4.