KR19990087330A - 써모언에어로박터 에탄올리쿠스 39e의 2차 알콜 탈수소 효소를코딩하는 유전자의 클로닝 및 발현과 효소의 생화학적 특성화 - Google Patents

Abstract

써모언에어로박터 에탄올리쿠스 39E의 2차 알콜 탈수소 효소 (2-Adh)를 코딩하는 adhB 유전자를 클로닝하였고 서열결정하였으며 에스케리키아 콜라이에서 발현시켰다. 본 출원에는 이 효소를 코딩하는 핵산 서열 및 아미노산 서열 모두가 보고되어 있다. 정제된 재조합 효소는 37.7 kDa의 서브유닛들로 이루어진 호모사량체이고 90℃에서의 절반 수명이 약 1.7시간이며 90℃ 이상에서 최적 활성을 갖는다. 본 효소는 1차 알콜보다 2차 알콜의 산화를 실질적으로 더 우선한다.

Description

써모언에어로박터 에탄올리쿠스 39Ｅ의 2차 알콜 탈수소 효소를 코딩하는 유전자의 클로닝 및 발현과 효소의 생화학적 특성화

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 1996년 2월 27일에 출원된 미국 임시 출원 번호 제60/012,331호를 우선권 주장한다.

미 연방이 후원하는 연구 또는 개발에 대한 언급

적용 없음.

본 출원에서 사용되는 약어

Adh	알콜 탈수소 효소
1。 Adh	1차 알콜 탈수소 효소
2。 Adh	2차 알콜 탈수소 효소
DTNB	디티오니트로벤조에이트
DEPC	디에틸피로카르보네이트
HCA	소수성 집단 분석 (Hydrophobic Cluster Analysis)
DTT	디티오트레이톨
MALDI	매트릭스 관련 레이저 탈리 이온화 질량 분광법 (matrix associated laser desorption ionization mass spectrometry)
EDTA	(에틸렌디니트릴로)테트라아세트산 삼나트륨염
ORF	개봉 판독 프레임
RBS	리보좀 결합 부위

본 발명은 효소를 코딩하는 유전자의 클로닝 및 발현에 관한 것이다. 더 특별하게는 본 발명은 알콜 탈수소 효소를 코딩하는 유전자의 클로닝 및 발현에 관한 것이다.

알콜 탈수소 효소 (Adh, EC 1.1.1.1 [NADH] 또는 EC 1.1.1.2 [NADPH])는 구조적으로 보존된 효소류로서 충분히 연구되어 있다 [참고 문헌 1]. 말 간의 1차 알콜 탈수소 효소 (1^oAdh)의 X-선 구조가 공지되어 있으며 상기 효소의 특성이 널리 상술되어 있다 [참고 문헌 1, 2]. Adh들은 전형적으로 촉매 작용에 관계하는 아연 원자를 포함하는 피리딘 디뉴클레오티드에 의존적인 이량체성 또는 사량체성 금속효소이다. Adh 단백질은 1^o또는 2^o알콜에 대한 그들의 관련 활성을 기준으로 1^o또는 2^oAdh로 분류되어 왔다. 일반적으로 1^o및 2^oAdh는 구조적으로 유사하고 상기 Adh들의 기질 상이성은 그들의 활성 부위의 구조에서의 비교적 적은 변화에 기인하는 것으로 여겨졌었다. 다수의 미생물로부터 유래된 사량체성 2^oAdh가 보고되었다 [참고 문헌 3-7]. 써모언에어로박터 에탄올리쿠스 (Thermoanaerobacter ethanolicus) 39E의 2^oAdh는 두 기능을 갖는 Adh/아세틸 CoA 환원 티오에스테라제이다 [참고 문헌 7]. 상기 Adh는 에탄올 형성 동안 글리세르알데히드 탈수소 효소 단계에서 당분해 억제를 간접적으로 방지하면서 니코틴아미드 보조인자를 산화시킴으로써 생리학적으로 기능한다고 제안되었었다 [참고 문헌 8].

2^oAdh들은 특이성이 광범위하고 프로키랄 케톤을 알콜로 전환시킬 때의 거울상특이성이 크기 때문에 키랄의 화학적인 제조시의 촉매로서 사용하기 위한 매력적인 제재이다 [참고 문헌 9-12]. 키랄 합성에 있어서 2^oAdh들의 상업적 규모 적용시 직면하는 두가지 문제점은 값비싼 니코틴아미드 보조인자의 재생 및 유지가 어렵고 비싸지 않은 고도로 안정한 효소가 없다는 것이다. 보조인자의 재생 및 유지는 다수의 방법으로 극복되어 왔다 [참고 문헌 13, 14]. 고온성 효소는 일반적으로 그의 중온성 대응물보다 훨씬 더 안정한 반면 고온성의 2^oAdh를 생산하는 유기체는 서서히, 그리고 낮은 세포 밀도로 성장하기 때문에 상기 효소의 상업적 적용 및 단백질 구조-기능의 상세한 연구 모두에 중요한 그들의 별개의 발현 시스템을 만들어야 한다.

고온성 박테리아가 발견됨으로써 내열성 효소를 직접적으로 단리시킬 기회가 제공되었다. 고온성의 혐기성 미생물인 티. 에탄올리쿠스 및 써모언에어로박터 브록키이 (Thermoanaerobacter brockii) [참고 문헌 15]는 70℃ 이상에서 안정한 거울상특이성이 매우 큰 2^oAdh들을 발현한다. 상기 두 2^oAdh들은 유사한 분자량 및 동력학적 특성에 기초하여 구조적으로 매우 유사하다고 제안되었었다 [참고 문헌 16]. 중온성의 NADP(H) 의존성 2^oAdh를 코딩하는 클로스트리듐 베이예린키이 (Clostridium beijerinckii) 유전자 (adhB)가 클로닝 및 서열결정되었고 (젠뱅크 (Genbank) 접근 번호 제M84723번) 티. 브록키이의 2^oAdh의 아미노산 서열이 에드만 (Edman) 분해법에 의해 결정된 반면 [참고 문헌 17], 상세한 생화학적 연구를 위한 클로닝된 고온성 2^oAdh는 전혀 입수할 수 없다. 티. 에탄올리쿠스 39E의 2^oAdh의 아미노산 서열은 본 특허 출원의 우선일 전에는 공공연히 입수할 수 없었다.

본 발명의 간단한 요약

본 발명은 고온균인 티. 에탄올리쿠스의 2^oAdh를 코딩하는 유전자의 클로닝, 서열결정, 및 발현에 관한 것이다. 본 발명에서는 재조합 효소의 동력학적 특성 및 열 특성이 공개되어 있다. 본 발명에서는 효소의 불연속 아레니우스 (Arrhenius) 플롯에 대한 생화학적 근거가 기술되어 있다. 최종적으로 본 발명에서는 단백질 서열 정보를 사용하여 고온성 및 중온성의 1^oAdh와 2^oAdh 사이의 구조적 관계를 조사한다. 상기 비교를 사용하여 2^oAdh의 촉매적 Zn 리간드 잔기 및 2^oAdh의 내열성에서의 특정 프롤린의 잠재적인 관련성을 예측한다.

도 1은 티. 에탄올리쿠스 39E의 2^oAdh 클론(R35A25)의 제한효소 지도. 측면 제한효소 부위는 플라스미드의 폴리링커로부터 유래된 것이다. adhB 유전자 코딩 영역은 XbaI 부위의 하향에서 시작하여 SspI 부위를 지나 종결된다.

도 2는 티. 에탄올리쿠스 39E의 재조합 2^oAdh에 대한 아레니우스 플롯. (A) 55℃에서 예비인큐베이션시킨 재조합 효소를 사용한, 25℃와 90℃ 사이의 프로판-2-올 산화에 대한 온도-활성 데이터. 이 데이터에 가장 잘 맞는 선형 회귀치를 측정하였더니 y = 13.674 - 3.3694x (R²= 0.993)이었다. (B) 불연속 속도의 초과 (■) 및 미만 (●) 지점을 나타내는, 55℃에서 예비인큐베이션시킨 재조합 2^oAdh를 사용한, 25℃와 90℃ 사이의 에탄올 산화에 대한 온도-활성 데이터. 이 데이터에 가장 잘 맞는 선형 회귀치를 측정한 결과 불연속 속도의 초과 지점에 대한 것은 y = 9.7929 - 2.5036x (R²= 0.946)이었고 불연속 속도의 미만 지점에 대한 것은 y = 15.730 - 4.3899 x (R²= 0.969)이었다.

재료 및 방법

화학약품 및 시약

모든 화학 약품은 시약/분자 생물학 등급 이상의 것이었다. 기체는 미국 오하이오주 클리블랜드 소재의 에이지에이 스페셜티 가스 (AGA specialty gases)사로부터 제공되었으며 가열된 구리 줄밥을 통하여 통과시킴으로써 혐기성으로 만들었다. 올리고뉴클레오티드 합성 및 아미노산 서열 분석은 미국 미시간 스테이트 유니버시티 생화학과의 거대분자 구조 설비 (Macromolecular Structure Facility)를 사용하여 수행하였다. 발현 벡터 작제에 사용되는 카나마이신 내성 젠블록 (GenBlock) (EcoRI) DNA 카트리지는 스웨덴 웁살라 소재의 파마시아 (Pharmacia)사로부터 구매하였다 [참고 문헌 18].

배지 및 균주

티. 에탄올리쿠스 39E (ATCC #33223)는 TYE 배지에서 이전에 기술된 바와 같이 배양하였다 [참고 문헌 19]. 모든 회분식 배양물은 N₂공간 하에서 혐기적으로 배양하였다. 재조합 adhB 유전자를 포함하는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) DH5α는 25 mg/ml의 카나마이신 및 100 mg/ml의 암피실린의 존재 하에 37℃에서 복합 영양 배지 (20 g/l의 트립톤, 10 g/l의 효모 추출물, 5 g/l의 NaCl)에서 배양하였다.

DNA 조작 및 라이브러리 작제

플라스미드 DNA 정제, 제한효소 분석, PCR과, 콜로니 및 DNA 혼성화는 통상의 기술을 사용하여 수행하였다 [참고 문헌 20, 21]. 이전에 기술된 바와 같이 티. 에탄올리쿠스의 염색체 DNA를 정제하였다 [참고 문헌 22]. 부분 절단된 2 내지 5 kb의 Sau3A I 프래그먼트를 10 내지 40% 수크로스 구배로부터 크기 분류로 분류하였고 [참고 문헌 20] pUC18의 BamH I/BAP (스웨덴 웁살라 소재의 파마시아사) 내로 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 사용하여 전기천공법으로 이. 콜라이 DH5α를 형질전환시켰다 [참고 문헌 21]. 변형 (degenerate) 프라이머인 (1)및 (2)을 사용하여 콜로니 혼성화용의 상동성 프로브를 합성하였다. adhB 유전자를 포함하는 DNA 프래그먼트는 생거 (Sanger) 등의 방법을 사용하여 서열결정하였다 [참고 문헌 24].

효소 정제

천연 2^oAdh를 확립된 기술로 정제하였다 [참고 문헌 7]. 재조합 효소는 이. 콜라이 DH5α로부터 호기적으로 정제하였다. 5 mM의 DTT, 및 10 mM의 ZnCl₂를 함유하는 pH 8.0의 50 mM 트리스:HCl (완충제 A)에 회분식 배양물로부터의 펠렛화 세포를 ml 당 0.5 g (습윤중량)으로 재현탁시켰으며 프렌치 프레셔 셀 (French pressure cell)을 통하여 통과시킴으로써 용균시켰다. 맑아진 용균물을 65℃에서 25분 동안 인큐베이션시킨 후 15000g에서 30분 동안 원심분리시켰다. 완충제 A로 평형시킨 DEAE-세파크릴 (sephacryl) 칼럼 (2.5 cm x 15 cm)에 적용하여 250 ml의 NaCl 농도구배물 (0 내지 300 mM)을 사용하여 용출시켰다. 활성 분획을 완충제 A에 4배 희석시켰으며 완충제 A로 평형시킨 Q-세파로스 (sepharose) 칼럼 (2.5 cm x 10 cm)에 적용하였다. 정제 효소는 250 ml의 NaCl 농도구배물 (0 내지 300 mM)을 사용하여 용출시켰다.

>90% 순도의 2^oADH를 생성시키는 더 바람직한 정제 방법은 하기와 같다. DTT 및 ZnCl₂를 함유하는 상기에 나타낸 완충제 A에 세포를 재현탁시키고 85℃까지 15분 동안 가열하였다. 이 세포를 30분 동안 얼음에서 냉각시킨 후 15000 x g에서 30분 동안 원심분리시켰다. 4℃에서 교반시키면서 황산 암모늄을 상청액에 50% (w/v)까지 30분 동안 첨가하였다. 상청액을 다시 15000 x g에서 30분 동안 원심분리하였다. 4℃에서 교반시키면서 상청액 중 황산 암모늄을 30분 동안 70% (w/v)까지 증가시켰다. 상청액을 다시 15000 x g에서 30분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 동일 완충제에 재현탁시켰다.

분자량 측정

재조합 홀로효소의 분자량은 200 mM의 NaCl을 함유하는 완충제 A로 평형시킨 파마시아 S300 칼럼 (110 cm x 1.2 cm)을 사용한 겔 여과 크로마토그래피 (분 당 0.5 ml)를 사용하여 단백질 표준물 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 (Sigma)사)과 비교함으로써 측정하였다. 서브유닛의 분자량 값은 미시간 스테이트 유니버시티의 질량 분광법 설비 (Mass Spectrometry Facility)에서 매트릭스 관련 레이저 탈리 이온화 질량 분광법 (MALDI)으로 측정하였다.

동력학 및 내열성

이전에 기술된 바와 같이 2^oAdh의 표준 활성 분석은 60℃에서 프로판-2-올 산화와 커플링된 NADP^＋환원으로 정의하였다 [참고 문헌 7]. 다른 언급이 없는 한 효소는 활성 측정 직전에 55℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. Km_app및 Vmax_app를 측정하기 위한 분석은 20xKm_app와 0.2xKm_app사이의 기질 농도로 60℃에서 수행하였다. 동력학적 매개변수들은 킨자임 (Kinzyme) 소프트웨어를 사용하여 미켈리스-멘텐 방정식 (Michaelis-Menten equation)에 가장 잘 맞는 비선형 데이터로부터 계산하였다 [참고 문헌 26]. 단백질 농도는 비신코닌산 방법 (미국 일리노이주 록포드 소재의 피어스 (Pierce)사)을 사용하여 측정하였다 [참고 문헌 27].

2^oAdh의 내열성은 원하는 온도에서 일정시간 인큐베이션시킨 후의 잔류 활성으로서 측정하였다. 25℃에서 30분 동안 인큐베이션시킴으로써 열 불활성화를 중단시켰으며 시료들을 55℃에서 15분 동안 예비인큐베이션시킴으로써 활성 분석용으로 준비하였다. 100 ml의 완충제 A 중 ml 당 200 mg의 단백질을 사용하여 100 ml의 PCR 튜브 (미국 노쓰 캐롤라이나주 뉴톤 소재의 사스테트 (Sarstedt)사, 카탈로그 번호 72.733.050)에서 인큐베이션을 수행하였다. 활성은 비분획 시료를 사용하여 측정하였다. 기질인 프로판-2-올 또는 에탄올을 10xKm_app농도로 사용하여 효소 활성에 대한 온도의 효과를 연구하였다.

2^oAdh는 효소 반응 속도에 대한 효소의 예비인큐베이션 온도의 효과를 연구하기 위하여 30 내지 90℃의 온도 범위에서 활성을 측정하기 전에 0℃, 25℃, 또는 55℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 트리스-HCl 완충제의 pH 값들은 그들이 사용되는 온도에서 25℃에서의 pH가 8.0이 되도록 조정하였다 (열 보정 인수 = -0.031 △pH ℃^－1). 불연속 온도 초과 및 미만에서 아레니우스 플롯의 기울기 사이의 통계학적으로 현저한 상이함은 공분산 분석법으로 측정하였다 [참고 문헌 25].

화학적 변형

25℃ 및 60℃에서 디티오니트로벤조에이트 (DTNB)를 사용하여 시스테인 잔기들을 가역적으로 변형시켰다 [참고 문헌 28]. 0.01 mM 내지 1.0 mM의 금속 염 또는 0.5 mM 내지 3.0 mM의 EDTA의 존재하에 DTT를 사용하여 DTNB에 의해 불활성화된 2^oAdh를 재활성화시켰다. 히스티딘 잔기들은 25℃에서 1.0 시간 동안 50 mM의 인산 완충제 (pH 6.0) 중 20 mM 또는 40 mM의 디에틸피로카르보네이트 (DEPC)와 함께 인큐베이션시킴으로써 DEPC로 화학적으로 변형시켰고 이 반응은 0.5배 부피의 0.5 M 이미다졸 (pH 6.5)를 첨가함으로써 중지시켰다 [참고 문헌 29].

단백질 서열 비교

바실러스 스테아로써모필루스 (Bacillus stearothermophilus, 접근 번호 D90421), 술포로부스 솔파타리쿠스 (Sulfolobus solfataricus, 접근 번호 S51211), 및 지모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis, 접근 번호 M32100)의 1^oAdh들의 펩티드 서열 및 알칼리제네스 유트로푸스 (Alcaligenes eutrophus, 접근 번호 J03362) 및 클로스트리듐 베이예린키이 (접근 번호 M84723)의 2^oAdh들의 펩티드 서열 번호를 젠뱅크로부터 수득하였다. 말 간의 1^oAdh [참고 문헌 1] 및 티. 브록키이의 2^oAdh [참고 문헌 17]의 펩티드 서열은 문헌으로부터 수득하였다. 젠뱅크로의 접근, 서열의 표준 정렬, 및 아미노산 유사성/동일성의 퍼센트는 1994년 9월판인 더 위스콘신 패키지 (the Wisconsin Package), 버전 8 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group)사)을 위한 프로그램 안내서를 사용하여 수행하였다. 단백질 서열 정렬은 소수성 집단 분석법 (HCA)를 사용하여 수행하였다 [참고 문헌 30]. 개개의 단백질 서열의 HCA 플롯은 HCA-플롯 V2 컴퓨터 소프트웨어 (프랑스 르 쉐스네이 소재의 도리안 (Dorine)사)를 사용하여 만들었다.

뉴클레오티드 서열 접근 번호

본 명세서에서 공개되는 서열의 젠뱅크 접근 번호는 U49975이다.

결과

티. 에탄올리쿠스의 adhB 유전자의 클로닝 및 서열결정

티. 에탄올리쿠스의 2^oAdh는 티. 에탄올리쿠스의 염색체 DNA 라이브러리로부터 상동성 혼성화로 클로닝하였다. 티. 에탄올리쿠스의 천연 2^oAdh의 N-말단 서열을 결정하였으며 (MKGFAML), 이 서열은 씨. 베이예린키이 및 티. 브록키이의 2^oAdh와 동일하였다. 이 서열을 사용하여 프라이머 (1)를 만들었다. 씨. 베이예린키이 및 티. 브록키이의 2^oAdh 펩티드 서열을 정렬해 보았더니 변형이 적은 올리고뉴클레오티드 (프라이머 (2))로 역 번역되는 다른 보존 영역 (잔기 147 내지 153)이 나타났다. 프라이머 (1) 및 (2)를 사용하고 티. 에탄올리쿠스의 염색체 DNA를 주형으로 사용하여 씨. 베이예린키이 및 티. 브록키이의 2^oAdh에서 프라이머 (1) 및 (2)의 위치로부터 기대되는 470 bp의 PCR 생성물을 수득하였다. 상기 PCR 생성물을 상동성 프로브로 사용하여 티. 에탄올리쿠스의 게놈 라이브러리를 스크리닝하였다. 60℃에서 가장 높은 2^oAdh 활성을 나타내는 양성 클론을 선발하여 연구를 더 수행하였다. 플라스미드 pADHB25-C는 1.6 kb의 Sau3A I 인서트를 포함하였고 그 이후의 서열결정 및 펩티드 분석에 의해 완전한 adhB 유전자를 포함하는 것으로 나타났다. 1.6 kb의 인서트를 pBluescriptIIKS(+)의 Xba I 부위에 서브클로닝하여 발현 플라스미드인 pADHB25를 작제하였다. 티. 에탄올리쿠스 39E의 천연 전사 및 번역 신호 서열을 포함하는 pADHB25 인서트의 물리학적 지도를 도 1에 나타낸다. 플라스미드 pADHB25는 카나마이신 내성 카트리지를 벡터의 EcoRI 부위에 삽입시킴으로써 카나마이신 및 암피실린 상에서 이중 선발되도록 하여 안정화시켰다. pADHB25-kan 작제물로부터 2^oADH 코딩 영역을 PCR 증폭 후에 클로닝하였다. 사용된 PCR 프라이머는(5'-말단, 서열 번호 6) 및(3'-말단, 서열 번호 7)이었다. 5'-말단 프라이머는 KpnI 부위를 도입시킨다. 3'-말단 프라이머는 ApaI 부위를 도입시킨다. 동일한 코딩 영역을 포함하지만 천연의 전사 및 번역 신호 서열과 하향 ORF가 없는 KpnI/ApaI 프래그먼트를 증폭 생성물로부터 수득하였으며 Bluescript IIKS+ 벡터 내로 클로닝하여 2^oADH 유전자의 출발 코돈이 Lac 프로모터로부터 81 염기가 되게 하였다. 코딩 영역은 연속적인 2개의 ATG (Met) 코돈과 함께 시작하였다. 상기 클론을 pADHBKA4-kan이라고 칭하였다. N-말단에 2개의 Met 잔기를 갖는 단백질은 그렇지 않을 경우 동일한, 단지 1개의 Met 잔기를 갖는 단백질과 동력학적으로 구별불가능하다는 것이 알려져 있다.

pADHB25의 인서트의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 1로 첨부한다. 씨. 베이예린키이의 2^oAdh와 매우 상동성인, 티. 에탄올리쿠스의 천연 2^oAdh의 N-말단 서열에서 출발하는 폴리펩티드를 코딩하는 단일한 개봉 판독 프레임 (ORF)를 동정하였다. 2개의 연속 ATG 코돈 ("강력 출발")을 잠재적인 번역 개시 코돈으로서 동정하였다. 천연 2^oAdh 단백질의 N-말단은 단일 Met에서 출발하는데, 이는 첫 번째 ATG 코돈이 번역되지 않거나 또는 번역후 제거된다는 것을 나타낸다. 잠재적인 리보좀 결합 부위 (RBS, 223 내지 228 위치)는 출발 코돈의 상향 10 bp에 위치한다. 잠재적인 전사 프로모터를 RBS의 상향으로 대략 70 내지 100 bp에서 동정하였다. "-35" 및 "-10" 영역은 이. 콜라이의 콘센서스 (consensus) 프로모터 서열과 매우 유사하며 [참고 문헌 31], 16 bp로 분리되어 있다. "-10" 영역은 첫 번째 카피와 오버랩핑하는 두 번째 카피로 중복되어 있다. 상기 두 번째 카피는 "-35" 영역으로부터 부적당한 거리에 위치하기 때문에 단지 가닥 분리시 도움을 주는 A+T가 풍부한 서열을 제공할 수 있다. 티. 에탄올리쿠스 39E의 유전자는 그의 코딩 서열 내에 60% 이상, 바람직하게는 60%와 70% 사이의 A-T 쌍을 포함하는 것이 특징일 수 있다. adhB의 하향에서 전사 종결 부위가 전혀 동정되지 않았다. 대신 상기 영역에서 RBS가 앞에 존재하는 절단된 ORF가 동정되었다. 상기 ORF는 씨. 베이예린키이의 adhB 유전자의 하향에 위치하는 유사한 절단 ORF의 생성물과 46% 동일하고 68% 유사한 45개 아미노산의 펩티드 프래그먼트 (서열 번호 3)로 번역되었다. 이 ORF를 코딩하는 서열을 adhB의 염색체 영역 또는 인접한 DNA 영역에 대한 프로브로서 사용할 수 있다 해도, 젠뱅크에서 다른 서열과 불충분한 유사성이 발견되었기 때문에 상기 ORF의 기능은 알려지지 않은채로 남아있다.

1^o및 2^oAdh의 서열 비교

1^o및 2^oAdh의 아미노산 서열의 표준 정렬에서 절대 혐기성 미생물로부터 유래된 3종의 2^oAdh들 사이의 유사성이 고수준이라는 것이 나타났다 (표 1). 티. 에탄올리쿠스의 2^oAdh (서열 번호 2)는 티. 브록키이의 효소 (젠뱅크 X1771790)와 단지 3개의 잔기만이 달랐고 (서열 번호 1의 아미노산 잔기 91, 313 및 325), 중온균인 씨. 베이예린키이 (젠뱅크 X64841)로부터 유래된 효소와 75% 동일하였다. 절대 호기성 미생물인 에이. 유트로푸스로부터 유래된 2^oAdh와 비교하였더니 유사성이 더 낮았다. 1^oAdh들은 2^oAdh들보다 서열 보존성이 덜함이 나타났고 (25 내지 54%의 동일성 및 49 내지 71%의 유사성) 2^oAdh들에 대하여 단지 20 내지 27%의 동일성 (및 48 내지 51%의 유사성)을 나타내었다. 상기 표준 정렬에 기초하여 중요한 코어 도메인 잔기, 활성 부위 포켓에 존재하는 아미노산, 및 말 간 효소 [참고 문헌 1]에 있어서 동정된 구조적으로 보존된 글리신의 보존성은 모든 펩티드 사이에서 더 높았다.

HCA 비교는 유사하지 않은 아미노산 서열을 갖는 효소들 사이에서 잠재적으로 유사한 2^o또는 3^o구조 영역의 정렬을 가능하게 한다. 각각의 Adh 펩티드에서 동정된 로스만 (Rossmann) 폴드 콘센서스 서열 {Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly-(Xaa)_18-20[NAD(H) 의존성을 위한 음전하로 대전된 아미노산 또는 NAD(P)(H)를 위한 중성 아미노산]} [참고 문헌 32]을 사용하여 1^o및 2^oAdh의 HCA 정렬을 수행하였다. NADP(H)가 결합된 티. 에탄올리쿠스 및 씨. 베이예린키이의 2^oAdh의 콘센서스 모티프는 Gly¹⁷⁴-Xaa-Gly¹⁷⁶-Xaa-Xaa-Gly¹⁷⁹, GLY¹⁹⁸로서 동정되었고, NAD(H)에 의존적인 비. 스테아로써모필루스 및 말 간의 1^oAdh의 콘센서스 모티프는 각각 Gly¹⁷²-Xaa-Gly¹⁷⁴-Xaa-Xaa-Gly¹⁷⁷, Asp¹⁹⁵및 Gly¹⁹⁹-Xaa-Gly²⁰¹-Xaa-Xaa-Gly²⁰⁴, Asp²²³으로서 동정되었다. 상기 정렬에서 말 간 효소에서 동정된 중요한 소수성 코어 잔기 (71 내지 94%), 활성 부위 포켓 잔기 (71 내지 100%), 및 구조적으로 중요한 글리신 (모든 경우에 있어서 100%)에 대한 1^o와 2^oAdh 사이의 전체 유사성이 71 내지 94%라는 것이 또한 예상된다.

HCA 비교는 말 간 효소에 있어서 동정된 상응하는 잔기를 기초로 하여 모든 4종의 탈수소 효소에서 상응하는 집단 영역 및 촉매적으로 중요한 잔기들의 동정을 가능하게 하였다 [참고 문헌 1, 2]. 말 간의 1^oAdh는 하나는 구조적 서브유닛이고 다른 하나는 촉매적 서브유닛인 서브유닛 당 2개의 Zn 원자를 포함한다. 고온균인 비. 스테아로써모필루스의 1^oAdh는 말 간의 Adh에 존재하는 구조적인 Zn 결합 루프 (Cys⁹², Cys⁹⁵, Cys⁹⁸, 및 Cys¹⁰⁶을 포함함)와 유사한 시스테인 잔기 97, 100, 103, 및 111을 포함하는 영역을 포함하였다. 그러나 티. 에탄올리쿠스 및 씨. 베이예린키이의 2^oAdh에서는 유사한 구조적인 Zn 결합 루프 영역이 전혀 동정되지 않았다. 말 간의 효소에서 촉매적 Zn 리간드가 확립되었다 (Cys⁴⁶, His⁶⁸, 및 Cys¹⁷⁴). 촉매적 Zn 원자에 대한 N-말단의 시스테인 및 히스티딘 리간드는 1^o및 2^oAdh 서열 모두에서 보존되어 있는 것으로 나타났다. 그러나, 비. 스테아로써모필루스의 1^oAdh (Cys¹⁴⁸)에서 보존되어 있는, 말 간의 1^oAdh에 존재하는 두번째 시스테인 리간드 (Cys¹⁷⁴)가 티. 에탄올리쿠스 및 씨. 베이예린키이 단백질 모두에서 아스파르테이트 잔기 (Asp¹⁵⁰)로 치환되어 있다. 에이. 유트로푸스 및 티. 브록키이의 2^oAdh에서도 또한 상응하는 아스파르테이트 잔기가 보존되어 있었고 1^oAdh와 유사한 구조적 Zn 결합 루프는 없는 것으로 나타났다.

중온균 및 고온균 유래의 2^oAdh 효소의 서열 비교

프롤린 잔기에 의해 도입되는 구조적 강제성은 단백질 내열성에 관련되는 기작으로서 제안되어 왔다 [참고 문헌 33]. 중온균인 씨. 베이예린키이의 2^oAdh 및 고온균인 티. 에탄올리쿠스의 2^oAdh 사이의 12개의 비보존 서열 치환 중에서 9개의 서열이 티. 에탄올리쿠스의 단백질에서 프롤린 (22, 24, 149, 177, 222, 275, 313, 316, 및 347)의 도입에 상응하는 것이다. Pro³¹³을 제외한 모든 것이 고온균인 티. 브록키이의 2^oAdh에도 또한 존재한다. 중온성의 2^oAdh 서브유닛에는 전체 13개의 프롤린 (3.7%)이 포함되어 있는 반면 티. 에탄올리쿠스 및 티. 브록키이의 서브유닛에는 각각 22개의 프롤린 (6.2%) 및 21개의 프롤린 (6.0%)이 포함되어 있다. 프롤린 20, 22, 및 24는 촉매적 Zn 리간드로 추정되는 Cys³⁷근처의 친수성 아미노산의 9개의 잔기 스트레치 내에 존재한다. Pro¹⁴⁹는 소수성 집단을 방해하며 다른 Zn 리간드로 추정되는 Asp¹⁵⁰다음에 존재한다. 니코틴아미드 보조인자 결합 모티프는 소수성 집단 영역을 또한 방해하는 Pro¹⁷⁷을 포함한다. 프롤린 222, 275, 313, 316, 및 347은 턴 (turn) 영역으로 추정되는 영역을 형성하는 짧은 (2개 내지 4개의 잔기) 친수성 스트레치 내에 존재한다.

본 특허 출원에 있어서, 중온성 박테리아는 25℃와 45℃ 사이에서 최적 성장하는 것을 특징으로 하는 반면, 고온성 박테리아는 45℃와 80℃ 사이에서 최적 성장한다 (바일레, 씨. (Vieille, C.) 등의 문헌 [Biotechnology Annual Review, 2: 1-83 (1996)] 참조). 티. 에탄올리쿠스 39E의 2^oAdh는 티. 베이예린키이의 2^oAdh 또는 티. 브록키이의 2^oAdh보다 더 내열성이고 고온성이다. 내열성은 소정 온도 (예를 들어 85℃)까지 효소를 가열할 경우 효소의 활성이 완전히 회복될 수 있는 가열 시간을 측정하는 것이다. 고온성은 선택된 승온에서의 효소 활성을 유닛 단위로 측정하는 것이다.

티. 에탄올리쿠스 39E의 2^oAdh는 90℃에서 1시간 이상 동안 인큐베이션시킨 후에도 100%의 활성을 유지하는 반면, 티. 브록키이의 2^oAdh는 91℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후에 단지 40%의 활성만을 유지한다. 씨. 베이예린키이는 70℃에서 10분 내에 완전히 불활성화되었다 [참고 문헌 6]. 향상된 내열성 및 고온성은 티. 에탄올리쿠스 39E의 2^oAdh 효소가 공정 디자인에 있어서 더 우수한 선택이 되게 하는데, 더 긴 촉매 수명과 그에 따른 더 낮은 비용을 제공한다. 상기 효소의 안정성 때문에, 이 단백질은 또한 조합적 화학 공정에서의 사용을 위하여 쉽게 고정시킬 수도 있다. 이 단백질은 또한 산화 환원 염료에 결합시킬 수 있거나 또는 면역학적 담체로서 사용할 수 있다.

재조합 2^oAdh의 정제 및 특성화

티. 에탄올리쿠스의 재조합 2^oAdh를 이. 콜라이에서 유도 없이 고수준으로 발현시켰으며 5.0 mM의 이소프로필티오-β-D-갈락토시드로 유도시 현저한 증가는 전혀 나타나지 않았다. 클로닝된 2^oAdh 유전자를 코딩하는 바람직한 발현가능한 작제물 (pADHBKA4-kan)에는 천연의 전사 및 번역 지시 서열이 포함되어 있지 않았다. 대신 코딩 서열은 Lac 프로모터의 하향 81 염기에 위치하였다. 상기 작제물에서 전체 단백질의 15%의 높은 발현율이 관찰되었다. 덜 바람직한 작제물인 pADHB25로부터의 효소 발현 수준은 이. 콜라이 및 천연 유기체에서와 유사하였다 (전체 단백질의 1% 내지 5%). 재조합 효소는 36배로 정제하여 동질성으로 만들었다 (SDS-PAGE상에서의 단일 밴드의 존재로 측정함). 서브유닛의 분자량은 MALDI를 사용하여 평균 3회 (천연 효소) 및 5회 (재조합 효소) 측정함으로써 계산하여 천연 효소 및 재조합 효소의 서브유닛의 질량이 각각 37707 Da 및 37854 Da라는 것을 알아내었다. 상기 값들은 일반적으로 허용되는 기술 오차 이내였으며 (∼1%), 유전자 서열에 기초한 천연 효소의 이론적인 분자량 (37644 Da)과 일치하였다. 재조합 효소의 N-말단 아미노산 분석에서 72±5%의 재조합 단백질에서 2개의 N-말단 ATG 코돈이 번역된 반면 28±2%의 단백질이 천연 효소와 마찬가지로 단일한 N-말단 Met 잔기를 포함하는 것으로 나타났다. 재조합 효소에서 측정된 147 Da의 증가 질량은 상기 상이함이 MALDI와 관계된 측정 오차와 비교하여 적다 할지라도 1개의 Met 잔기의 질량 (149.2 Da)과 일관된 것이었다. 재조합 홀로단백질의 분자량을 겔 여과 크로마토그래피로 측정하였더니 160 kDa이었는데, 이는 천연 효소와 마찬가지로 티. 에탄올리쿠스의 재조합 2^oAdh가 호모사량체라는 것을 증명하는 것이다.

이 2^oAdh는 특정 시스테인 DTNB 변형에 의해 25℃ 및 60℃ 모두에서 완전히 불활성화되었다. 불활성화는 DTT를 첨가함으로써 60℃에서 전환되었는데, 이는 초기 활성의 34%가 회복되게 하였다 (초기 활성 = 54 ± 3.0 U/mg). CdSO₄, FeCl₂, MnCl₂, CaCl₂, MgCl₂, NaCl (0.01 mM 내지 1.0 mM), 또는 EDTA (0.5 mM 내지 3.0 mM)을 첨가할 경우 DTT에 의한 효소 재활성화에 영향을 주지 않았으며 CoCl₂또는 NiCl₂를 첨가하면 각각 초기 활성의 단지 10% 또는 15% 이하로 활성의 회복율을 감소시켰다. 아연은 재활성화율을 증가시키는 유일한 금속이었다 (100 mM의 ZnCl₂의 존재시 48% 이하의 활성 회복). 히스티딘 잔기의 DEPC 변형도 또한 효소를 완전히 불활성화시켰다.

티. 에탄올리쿠스의 재조합 2^oAdh의 열 특성 및 동력학적 특성의 특성화

Adh 기질에 대한 재조합 2^oAdh의 활성을 특성화하였다. 프로판-2-올에 대한 Vmax_app(47 U/mg)은 에탄올에 대한 것 (10 U/mg)보다 5배 더 컸으며 1^o알콜에 대한 Km_app(47 mM)은 2^o알콜에 대한 것 (1.1 mM)보다 거의 43배 더 컸다. 재조합 효소의 촉매 효율은 2^o알콜에 대하여 (0.29 ml/분/mg) 1^o알콜 (0.00021 ml/분/mg)보다 약 200배 더 큰 것으로 측정되었다. NADP^＋에 대한 Km_app는 0.011 mM이었고, NAD(H)에 의존적인 활성은 전혀 검출되지 않았다.

천연 및 재조합 효소의 활성의 온도 의존성은 유사한 것으로 측정되었다. 따라서 본 명세서에서는 재조합 효소를 사용하여 얻어진 데이터만을 보고한다. 티. 에탄올리쿠스의 2^oAdh의 활성은 25℃ 미만에서 검출되었으며 90℃를 초과하여 증가하였다 (도 2A). 90℃에서의 2^oAdh의 절반수명 (half-life)은 1.7 시간이었다. 프로판-2-올의 산화에 대한 아레니우스 플롯은 효소를 분석 전에 55℃에서 인큐베이션시켰을 경우 25℃ 내지 90℃에서 선형이었다. 그러나, 동일한 조건 하에서 에탄올 산화에 대한 아레니우스 플롯에서는 뚜렷한 불연속성이 관찰되었다 (도 2B). 효소를 0℃ 또는 25℃에서 예비인큐베이션시켰을 경우 프로판-2-올 및 에탄올 산화에 있어서 각각 ∼55℃ 및 ∼46℃에서 불연속성이 또한 관찰되었다 (표 2). 불연속점의 위와 아래에 가장 잘 맞는 회귀선의 기울기는 95% 신뢰 수준에서 회귀선의 기울기가 유사한, 55℃에서 예비인큐베이션시킨 효소에 의한 프로판-2-올의 산화에 대한 것을 제외하고 95% 신뢰 수준 이상에서 현저하게 달랐다. 프로판-2-올 및 에탄올 산화에 있어서의 활성화 에너지는 불연속점 초과의 분석 온도에서 유사하였지만 불연속 온도 미만의 온도에서 프로판-2-올 산화에 있어서의 활성화 에너지보다 에탄올 산화에 있어서의 활성화 에너지가 15 내지 20 kJ/몰 더 높았다 (표 2). 또한 불연속 온도 초과 및 미만에서의 활성화 에너지 사이의 차 (△)는 예비인큐베이션 온도가 증가할수록 감소하였고 에탄올 산화에 있어서의 차가 프로판-2-올 산화에 있어서의 차보다 3배 이상 높았다.

하기에서 효소 활성, 고온성, 및 불연속 아레니우스 플롯에 대한 분자적 기초의 증거를 상세히 설명한다. 단백질 서열을 비교해 보면 1^o및 2^oAdh가 촉매적 Zn 및 니코틴아미드 보조인자 결합과 관련된 몇몇 구조-기능 유사성을 가질 것으로 예상된다. 그러나 전체 1^o및 2^oAdh 서열에 존재하는 소수성 집단에서의 상이성은 상기 효소들의 전체 구조가 현저하게 상이할 것임을 예상하게 한다. 천연 효소의 동력학적 특성 [참고 문헌 6]과 유사한 동력학적 특성을 갖는 티. 에탄올리쿠스의 재조합 단백질은 더 작은 Km_app및 더 큰 Vmax_app값 모두에 기인하는, 1^o알콜 보다 2^o알콜에 대하여 현저하게 더 큰 촉매적 효율을 나타내는 고온성 및 내열성의 NADP(H) 의존성 효소이다. 화학적 변형 실험에서 효소 활성에 적어도 Cys 및 His 잔기와 단단히 결합된 Zn 원자가 요구됨이 나타난다. 마지막으로 아레니우스 플롯에서 벤드 (bend)의 크기는 효소의 예비인큐베이션 시간과 역비례하여 변화하였는데, 이는 본 효소에서 촉매적으로 현저한, 온도에 의존적인 구조적 변화가 있음을 나타낸다.

고온균인 티. 에탄올리쿠스의 2^oAdh를 코딩하는 adhB 유전자를 혼성화로 클로닝하였고 이. 콜라이에서 발현시켰다. 천연 효소와 재조합 효소의 N-말단 서열 및 분자량을 비교하였더니 재조합 효소는 N-말단에서의 메티오닌의 첨가만이 천연 단백질과 다르다는 것이 나타났다. 이. 콜라이에서 첫 번째 ATG가 주요 번역 출발 코돈이라 해도 상기 ATG가 유일한 개시 코돈인지 (그리고 첫 번째 메티오닌이 나중에 프로세싱되는지) 또는 두 번째 ATG가 개시 코돈으로서 또한 사용되는지는 알려져 있지 않다. adhB의 하향 180 뉴클레오티드에 절단 ORF (앞에 RBS가 존재함)가 존재하고 임의의 잠재적인 전사 종결 신호가 없다는 것은 adhB가 오페론의 제1 유전자일 수 있음을 나타내는 것이다. 본 명세서에 보고되는 절단 ORF와 씨. 베이예린키이의 adhB의 한 하향 사이의 유사성은 상기 가설을 더 뒷받침한다.

피리딘 디뉴클레오티드 결합 모티프에 의해 지시되는 1^o및 2^oAdh의 HCA 정렬에서 상기 효소류 사이에 약간의 구조적 유사성이 나타났다. 음전하로 대전된 Asp^{(223, 195, 215)}잔기는 각각 말 간, 비. 스테아로써모필루스, 및 에이. 유트로푸스 효소의 NAD(H) 의존성과 일치되는 반면, 티. 에탄올리쿠스, 티. 브록키이 및 씨. 베이예린키이의 2^oAdh 내의 유사한 위치에 대전되지 않은 잔기 (Gly¹⁹⁸)가 존재하는 것은 상기 효소의 NADP(H) 의존성과 일치한다 [참고 문헌 3, 6, 7]. 또한 말 간의 1^oAdh [참고 문헌 1]에서 이전에 동정된, 효소 소수성 코어에서 동정된 잔기, 활성 부위 공동 (空洞)에 존재하는 잔기, 및 구조적으로 중요한 글리신은 전체 펩티드 서열보다 상기 정렬에서 단백질 사이에 더 우수하게 보존되어 있었다. 다른 Adh 비교에 있어서 구조적으로 중요하다고 추정되는 영역의 유사성이 보고되었다 [참고 문헌 34]. 효소 구조-기능 특성과 상기 정렬에서의 예상 사이의 상관관계는 다른 Adh 구조-기능 연구에서의 그의 용도를 지지한다. 그러나 HCA 비교에 의해 예상되는 2^oAdh 내의 구조적 Zn 결합 루프의 외견상의 결핍, 사량체 및 이량체 모두의 1^oAdh가 아닌 단지 사량체 2^oAdh만의 보고, 및 1^oAdh와 2^oAdh 사이보다 현저하게 더 큰 2^oAdh 사이의 유사성에서 1^o및 2^oAdh가 기능적으로는 유사한 반면 이전에 생각된 것과는 구조적으로 덜 유사할 수 있다는 것이 또한 나타난다.

90℃에서 인큐베이션시킨 고온균인 티. 에탄올리쿠스 39E의 2^oAdh는 1시간 이상 동안 검출가능한 활성을 유지한 반면 중온균인 씨. 베이예린키이의 2^oAdh는 70℃에서 10분 내에 완전히 불활성화되었다 [참고 문헌 6]. 또한 상기 두 효소는 85% 이상의 서열 유사성을 공유하였다. 상기 단백질의 서브유닛 사이의 9개의 비보존 치환은 티. 에탄올리쿠스의 효소 내의 프롤린에 상응한다. 유사한 고온균인 티. 브록키이의 2^oAdh는 상기의 추가 프롤린을 8개 포함한다. 고온성 2^oAdh 대 중온성 2^oAdh의 프롤린 함량에서의 상기 차이는 단백질 안정화에 있어서의 프롤린의 역할에 관한 매튜 (Matthews) 등의 가설 [참고 문헌 33] 및 프롤린 삽입 [참고 문헌 35, 36], 강제된 루프 영역 [참고 문헌 37], 및 루프 내로의 프롤린 치환 [참고 문헌 38-40]에 기인하는 단백질 안정화에 대한 다수의 연구자들에 의한 관찰 결과와 일치한다. 티. 에탄올리쿠스의 2^oAdh 내의 치환 프롤린은 짧은 추정 루프 영역 내에 존재하거나 또는 다수의 프롤린을 포함하는 더 긴 추정 루프 영역 내에 존재하였는데, 이는 프롤린의 특정 배치 및 갯수가 그의 안정화 효과에 중요할 수 있음을 나타낸다. 티. 에탄올리쿠스와 씨. 베이예린키이의 효소 사이의 프롤린 함량에서의 차이 및 상기 효소의 큰 전체 서열 유사성은 상기 2^oAdh가 단백질 구조 안정화시 프롤린 삽입의 효과를 시험하기 위한 우수한 시스템이 되게 한다.

서열의 비교 분석에서 2^oAdh 촉매작용에서 특정 Cys, His, 및 Asp 잔기들이 관렴됨이 예상되었다. 티. 에탄올리쿠스의 재조합 및 천연 2^oAdh를 DTNB로 화학적으로 변형시키는 것은 촉매작용에서의 시스테인 잔기의 중요성을 확립하였다. Zn이 DTNB 변형 후 효소 재활성화를 증가시키는 유일한 금속이었다는 관찰결과는 이 효소가 Zn에 의존적이라는 것을 나타낸다. 상기 발견은 티. 브록키이의 2^oAdh가 설프히드릴 변형제인 p-클로로메르쿠리벤조에이트에 의해 일단 불활성화되면 단지 ZnCl₂의 존재하에서만 활성이 회복된다는 이전의 보고 [참고 문헌 3]와 일치한다. 본 명세서에서 심지어 60℃에서 첨가 금속 없이 DTNB 변형의 반전시 초기 활성의 34%가 회복되고 EDTA가 재활성화 비율을 감소시킬 수 없다는 것은 촉매 금속이 단백질에 단단히 결합된 채 남아있음을 나타낸다. DEPC에 의한 티. 에탄올리쿠스 효소의 히스티딘 특이 변형은 또한 완전한 효소 불활성화가 수반되었는데, 이는 촉매작용에서 히스티딘 잔기가 관계됨을 의미한다. 2^oAdh 서브유닛에서 구조적 Zn 결합 영역이 외견상 없다는 것은 DTNB 결합 불활성화 및 Zn에 의존적인 재활성화가 시스테인 리간드화 구조적 Zn의 손실 및 회복에 기인하지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서 촉매적으로 중요한 시스테인 및 히스티딘 잔기는 다른 Adh들에 대하여 기술된 바와 같이 [참고 문헌 1] 촉매적 Zn에 대한 리간드로서 작용할 수 있다. 2^oAdh 활성에 있어서의 Asp¹⁵⁰의 중요성의 측정은 돌연변이 유발 분석법, 결정 분석법, 또는 물리 생화학적 분석법으로 수행한다.

천연 및 재조합 효소에 있어서 촉매 활성의 온도 의존성은 유사하였다. 55℃에서 예비인큐베이션시킨 티. 에탄올리쿠스의 2^oAdh에 의한 프로판-2-올 산화에 대한 아레니우스 플롯은 이전에 보고된 티. 브록키이의 2^oAdh에 대한 것과는 달리 선형이었다 [참고 문헌 3]. 그러나, 티. 에탄올리쿠스의 효소에 의한 에탄올 및 프로판-2-올 산화 모두에 대한 아레니우스 플롯에서 통계학적으로 의미있는 불연속성이 더 낮은 온도에서 효소를 예비인큐베이션시킬 경우 관찰되었다. 전체 반응의 속도 결정 단계에서의 변화 및 촉매 구조에 변화를 야기하지 않는 다른 설명에서 아레니우스 플롯 불연속성이 예상된다 [참고 문헌 44, 45]. 효소 구조에서의 변화와 관련되어 있지 않은 반응을 느리게 하는 단계에서의 시프트 (shift)는 효소의 초기 온도에 독립적이며 효소의 예비인큐베이션 온도와 불연속점 초과 및 미만의 활성화 에너지의 차이 (D) 사이에서 본 명세서에서 관찰되는 역함수 관계와 일치하지 않는다. 불연속점 초과의 분석 온도에서 반응 활성화 에너지는 더 낮은 분석 온도에서의 활성화 에너지와는 달리 0℃, 25℃ 및 55℃에서 예비인큐베이션시킨 효소에 있어서 유사하였다. 상기 관찰결과는 측정되는 속도에는 영향을 주지 않고 더 높은 분석 온도에서 최적 활성을 갖는 구조를 충분히 빠르게 얻는 효소와 일치한다. 티. 에탄올리쿠스 성장을 위한 보고된 가장 낮은 온도 미만인 불연속 온도는 생리학적으로 무의미하지만 동력학적 분석을 수행할 때 중온성 효소와는 다르게 고온성 효소를 처리하는 것에 대한 중요성을 강조한다. 또한 에탄올 및 프로판-2-올에 대한 낮은 온도 활성화 에너지 사이의 차는 기질/생성물-단백질 상호작용이 촉매작용에서 속도 결정 단계에 중요하다는 것을 나타낸다.

아레니우스 플롯은 55℃에서 예비인큐베이션시킨 2^oAdh에 의한 프로판-2-올 산화에 있어서 선형이었는데, 이는 상기 조건 하에서 반응 속도의 온도 의존성은 기능적으로 현저한 구조적 변화보다는 기질 분자의 평균 에너지에서의 차이에 주로 기인한다는 것을 나타낸다. 상기 데이터가 결정적이지는 않다 해도 아레니우스 플롯 불연속점으로 나타나듯이 효소 구조에서 촉매적으로 현저한 변화가 없다는 것은 중온성 효소의 활성과 비교하여 중온성 온도에서 티. 에탄올리쿠스의 2^oAdh 활성이 낮다는 것을 설명할 필요 없이 고온성 단백질이 과도하게 경직하다는 것이다 (구조 변화에 내성을 가짐) [참고 문헌 6]. 따라서 티. 에탄올리쿠스의 2^oAdh에는 온도에 의존적인 촉매적으로 현저한 구조적 변화가 일어날 수 있는 반면 아레니우스 플롯 불연속성은 더 큰 고온성 단백질 강직성에 대한 증거로서 유발될 수 없다.

55℃에서 예비인큐베이션시킨 티. 에탄올리쿠스의 2^oAdh에 의한 프로판-2-올 산화에 대한 선형 아레니우스 플롯에서 상기 효소의 중온성 온도에서의 낮은 활성은 기질 에너지에 의해서만 설명될 수 있음이 나타난다. 아레니우스 이론에 의하면 온도가 증가할수록 Km_app및 Vmax_app가 증가한다는 것이 예상되고 [참고 문헌 44], 상기 효과는 써모토가 네오폴리타나 (Thermotoga neopolitana)의 D-크실로스 이소머라제에 있어서 확인되었다 [참고 문헌 46]. 고온성 2^oAdh는 25℃에서 중온성 효소 활성의 연장선으로부터 예상되는 Vmax_app값보다 더 작은 Vmax_app값을 갖는다. 사실 60℃에서 고온성 2^oAdh는 25℃에서의 중온성 효소에 대하여 보고된 Km_app및 Vmax_app값과 유사한 기질에 대한 Km_app및 Vmax_app값을 유지한다. 상기 유사한 동력학적 값들에서 고온성 효소는 더 과량의 기질 결합 에너지를 기질 결합에 전하고 더 적은 양의 에너지를 턴오버 (turnover)에 전한다는 것을 나타낸다 [참고 문헌 47]. 따라서 티. 에탄올리쿠스의 2^oAdh는 큰 턴오버 수를 희생시킴으로써 고온에서의 기질 친화성을 유지하는 것으로 여겨진다.

참고 문헌 (본 명세서에 모두 참고문헌으로 인용되어 있음)

〈서열표〉

(1) 일반적 정보 :

(i) 출원인: 버데트, 더글라스 에스; 제이쿠스, 조세프 지.

(ii) 발명의 명칭: 써모언에어로박터 에탄올리쿠스 39E의 2차 알콜 탈수소 효소를 코딩하는 유전자의 클로닝 및 발현과 효소의 생화학적 특성화

(iii) 서열수: 5

(iv) 통신 주소:

(A) 수신인: 퀄스 앤 브래디 (Quarles & Brady)

(B) 거리: 사우쓰 핀크니 스트리트 1

(C) 도시: 매디슨

(D) 주: 위스콘신주

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 53703

(v) 컴퓨터 판독 형태

(A) 매체 유형: 플로피 디스켓

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형

(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: 패턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.30

(vi) 현재 출원 데이터

(A) 출원 번호:

(B) 출원일:

(C) 분류:

(vii) 우선권 주장 데이터:

(A) 출원번호: 미국 제60/012,331호

(B) 출원일: 1996년 2월 27일

(viii) 변호사/대리인 정보:

(A) 성명: 베르슨, 베네트 제이

(B) 등록번호: 37094

(C) 참조/처리 번호: 660336.90608

(ix) 통신 정보

(A) 전화번호: 608-251-5000

(B) 텔레팩스: 608-251-9166

(2) 서열 1에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 1630 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 이중

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(vi) 유기체 원천:

(A) 유기체: 고온성 박테리아

(B) 균주: 써모언에어로박터 에탄올리쿠스 39E

(ix) 특징:

(A) 이름/키: CDS

(B) 위치: 238··1296

(D) 다른 정보: /생성물="2차 알콜 탈수소 효소"

(ix) 특징:

(A) 이름/키: CDS

(B) 위치: 1496··1630

(xi) 서열 설명: 서열 번호 1

(2) 서열 2에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 353개의 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(xi) 서열 설명: 서열 번호 2

(2) 서열 3에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 45개의 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(xi) 서열 설명: 서열 번호 3

(2) 서열 4에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 20 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc="프라이머"

(xi) 서열 설명: 서열 번호 4

(2) 서열 5에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 23 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc="프라이머"

(xi) 서열 설명: 서열 번호 5

(2) 서열 6에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 31 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc="프라이머"

(xi) 서열 설명: 서열 번호 6

(2) 서열 7에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 37 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc="프라이머"

(xi) 서열 설명: 서열 번호 7

1차 및 2차 알콜 탈수소 효소 사이의 1차 구조의 유사성 비교

하기 유기체로부터 유래된 서열과의 서열 동일성 % (유사성 %)
유기체	T. eth	T. bro	C. bei	A. eut	B. ste	B. sul	Z. mob	간
2oAdh
T. eth	1
T. bro	99.1(99.4)	1
C. bei	74.4(86.6)	75.0(86.9)	1
A. eut	35.6(61.5)	36.2(62.1)	36.2(59.5)	1
1oAdh
B. ste	26.7(50.6)	27.2(50.8)	24.1(50.6)	31.9(53.8)	1
S. sul	27.0(51.6)	26.4(51.0)	24.0(50.6)	25.8(49.0)	35.2(55.8)	1
Z. mob	24.2(48.2)	25.1(48.8)	20.5(48.4)	25.6(51.2)	54.0(71.0)	33.9(54.6)	1
간	28.8(53.8)	29.1(54.4)	27.4(52.6)	23.1(49.7)	32.8(55.4)	28.9(50.9)	31.1(50.4)	1
T. eth: 써모언에어로박터 에탄올리쿠스 39E; T. bro: 써모언에어로박터 브록키이; C. bei: 클로스트리듐 베이예린키이; A. eut: 알칼리제네스 유트로푸스; B. ste: 바실러스 스테아로써모필루스; S. sul: 술팔로부스 술파타리쿠스 (Sulfalobus sulfataricus); Z. mob: 지모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis); 고온성 Adh: 티. 에탄올리쿠스, 티. 브록키이, 비. 스테아로써모필루스, 및 에스. 술파타리쿠스; 중온성 Adh: 씨. 베이예린키이, 에이. 유트로푸스, 제트. 모빌리스, 말 간

Claims (11)

1. 서열 번호 1에 나타낸 서열의 238 위치와 1296 위치 사이의 서열을 포함하는, 2차 알콜 탈수소 효소를 코딩하는 단리 및 정제된 핵산 분자.
2. 제1항에 있어서, 서열 번호 1에 나타낸 서열을 포함하는 핵산 분자.
3. 고온성 박테리아로부터 유래된, 313 위치에 프롤린 잔기를 포함하는 2차 알콜 탈수소 효소의 정제물.
4. 325 위치에 글루타민 잔기를 포함하는 제3항에 따른 효소 제제.
5. 91 위치에 트립토판 잔기를 포함하는 제3항에 따른 탈수소 효소.
6. 고온성 박테리아가 써모언에로박터 에탄올리쿠스 (Thermoanaerobacter ethanolicus) 32E인 제10항에 따른 효소 제제.
7. 91 위치에 트립토판 잔기를 포함하고 313 위치에 프롤린 잔기를 포함하며 325 위치에 글루타민 잔기를 포함하는 써모언에어로박터 에탄올리쿠스 32E 유래의 2차 알콜 탈수소 효소의 정제물.
8. 서열이 각각 ATGAARGGNTTHGCNATGYT 및 GWNGTCATCATRTCNGKDATCAT인 제1 및 제2의 변형 (degenerate) 올리고뉴클레오티드 프라이머를 고온성 박테리아 유래의 염색체 DNA 주형에 혼성화시키는 단계;

   혼성화된 프라이머들 사이의 염색체 DNA의 단편을 증폭시켜 증폭 DNA 프래그먼트를 형성시키는 단계

   를 포함하는 DNA의 증폭 방법.
9. 제8항에 있어서, 고온성 박테리아가 써모언에어로박터 에탄올리쿠스 32E인 방법.
10. 고온성 박테리아 유래의 DNA 프래그먼트를 박테리아 클로닝 벡터에 라이게이션시켜 라이게이션 생성물을 형성시키는 단계;

    라이게이션 생성물로 박테리아 숙주를 형질전환시켜 고온성 박테리아 유래의 게놈 DNA의 라이브러리를 제조하는 단계;

    서열이 각각 ATGAARGGNTTHGCNATGYT 및 GWNGTCATCATRTCNGKDATCAT인 제1 및 제2의 변형 올리고뉴클레오티드 프라이머를 고온성 박테리아 유래의 염색체 DNA 주형에 혼성화시키는 단계;

    혼성화된 프라이머들 사이의 염색체 DNA의 단편을 증폭시켜 증폭 DNA 프래그먼트 프로브를 제조하는 단계; 및

    프로브로 라이브러리를 스크리닝하는 단계

    를 포함하는, 고온성 박테리아 유래의 2차 알콜 탈수소 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 박테리아 클론의 수득 방법.
11. 제10항에 있어서, 고온성 박테리아가 써모언에어로박터 에탄올리쿠스 32E인 방법.